Voicu Elena -Diana [628753]

Voicu Elena -Diana
Master GeneticăAplicatășiBiotehnologie
Next
–
generation
sequencing
în
clinică

progrese semnificative înultimii
ani
impact important asupra
cercetărilor îndomeniu
medical, înspecial încancer
aplicabilitate îndiagnosticul
clinic șiînterapii
utilizateîndescoperirea unor
variante alelice rare, profilarea
transcriptomului celulelor ,
țesuturilor , organismelor ,
identificarea markerilor
epigenetici îndiagnosticul unor
boli
Sursa : http ://circgenetics.ahajournals.org/content/4/2/110

Roche / 454
•combină emPCR (emulsion PCR)
șitehnologia de pirosecvențiere
•se monitorizează întimp real
emisialuminiscenței prineliberarea
pirofosfatului , dupăîncorporarea
nucleotidelor
•problemeîndetectarea
homopolimerilor : incorporări
multiple de nucleotide identice
•ratăde eroare relativ mare încazul
inserțiilorșideletiilor
Sursa : http://www.cell.com/trends/genetics/fulltext/S0168 -9525(08)00023 -1

•librărie ADN prinemPCR : secvențierea are locprincicluri
succesive de ligare
•fiecare primer este ligat de un octamer marcat
fluorescent, pebază de complementaritate între di-
bazele (AG, GA, TC, CT) probeișimatriță
•întimpul ciclurilor de ligare , di-nucleotidele sunt citite la
intervale de 5 baze
•ceamaimicăratăde eroare dintre toate tehnicile NGS
actualeSOLiD

Illumina / Solexa
•secvențiere prinsintezăbazată pearray
•fragmentele ADN sunt hibridizate într-o
cameră de reacție , peo suprafață solidă
transparentă
•sinteza ADN: terminatori reversibili =>
clustere
•extinderea incompletă sauspraextinderea
catenei ; încorporarea nucleotidelor fără
markerul fluorescent; îndepărtarea
incompletă a markerilor fluorescenți

•secvențierea directă a unei singure molecule ADN / ARN, fărăa maifi
necesară amplificarea => cuantificarea cu acuratețe a moleculelor de acid
nucleic
•Helicos Genetic Analisys System
•PacBio RS Emerging technologies
-utilizează primeri oligonucleotidici
-secvențiere princicluri repetate de sinteză cu ajutorul ADN pol
-generează o secvență de până la 21 -35 gb
-ratăde eroare de 3-5%
-viteză mare de secvențiere
-încorporarea nucleotidelor marcate fluorescent esteînregistrată optic întimp real
-colorantul esteîndepărtat princlivaj enzimatic
-ratăde eroare de 3-5%

•Secvențiere prinnanopori : molecule monocatenare de acid nucleic trec
electroforetic printr -un pornanometric , fiind detectate prinefectul lorasupra
unui curent ionic sausemnal optic
•Altetehnici :
•Platformele Ion Torrent șiProton sunt diferite de celelalte NGS: măsoară
schimbările de pH șisunt utilizateîndetectarea SNP-urilor , secvențierea
genomurilor mici-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
-Ion semiconductor (Ion Torrent)
-DNA nanoball sequencing
Ion Torrent

descoperiri ale variantelor genomice : 1000 Genomes Project -catalog de variante
genetice cu frecvențe de până la 1% înpopulațiile umane
secvențierea țintită : metode bazate pePCR (ex. RainStorm , Acces Array); metode
bazate pehibridizare (ex. Sure Select, SeqCap , Ilumina True Seq)
RNA -Seq: profilarea calitativășicantitativă a întregul transcriptom , inclusiv ARN -ul
mesager , ARN -urile micișialteARN -urinecodificatoare
identificarea patternurilor de expresiegenicășia elementelor reglatoare
detectarea expresieitranscripților șiARN -urilor necodificatoare
identificarea fuziunilor genice asociate cu cancerul (de prostată , de sân, limfom ,
melanom )Aplicații

Profilarea epigenetica : modificările epigenetice ale ADN sunt
implicate înprogresia cancerului , înspecial metilarea ADN
Bioinformatică : principala problemă înaliniere ~multi -reads (citiri
ceaparînmultiple locații pesecvența de referință )
* 3 strategii posibile :
-îndepărtarea tuturor multi -reads -urilor (utilizarea doar a
citirilor unice )
-ceamaibună potrivire (fiecare citire esteasociatălocației cu
cele maipuține mismatch -uri)
-elaborarea tuturor alinierilor posibile , până se atingenumărul
maxim.

Tehnologiile NGS au progresat semnificativ înultimii ani.
Cu toate acestea , deși prinsecventierea întregului genom se pot
descoperii maimulte variante genetice printrepaciențișivoluntari
sănătoși , estedificilă asocierea semnificativă genotip -fenotip ,
întrucât profilul genetic al unei persoane nu este unicul determinant
al riscului de apariție a unei bolisaupotențialul răspuns la
tratament .
Intervinșialțifactori , precumvârsta , sexul , etnia , stadiul patologic ,
istoricul medical.
De asemenea , erorile de secventiere sunt semnificative șinu pot fi
distinse de variantele genetice , putând fi identificate greșit . Concluzii

Xuan J., Yu Y ., 2013 , Next -generation sequencing in the clinic: Promises and challenges, Cancer
Letters 340, 284 -295
Liu L., Li Y ., 2012, Comparison of Next -Generation Sequencing Systems, Journal of Biomedicine and
Biotechnology, doi:10.1155/2012/251364
Reis-Filho J. S., 2009, Next -generation sequencing, Breast Cancer Research, doi:10.1186/bcr2431Bibliografie