Vitamine Hidrosolubile DIN Drojdia DE Bere

Cuprins

I. INTRODUCERE……………………………………………………………………………………………………………..2

II. STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII ÎN DOMENIUL TEMEI ABORDATE………………..3

2.1. Generalități………………………………………………………………………………………………………………….3

2.2. Clasificarea vitaminelor…………………………………………………………………………………………………5

2.2.1. vitamina B1…………………………………………………………………………………………………..6

2.2.2. Vitamina B2 …………………………………………………………………………………………………9

2.2.3. Vitamina B3………………………………………………………………………………………………..12

2.2.4. Vitamina B5………………………………………………………………………………………………..14

2.2.5.Vitamina B6…………………………………………………………………………………………………15

2.2.6. Vitamina B9………………………………………………………………………………………………..18

2.2.7.Vitamina B12………………………………………………………………….……20

2.2.8.Vitamina C…………………………………………………………………………23

2.2.9.Vitamina H…………………………………………………………………………26

III . CONTRIBUȚII ORIGINALE………………………………………………………………………………………28

3.1. Scopul și obiectivele lucrării………………………………………………………………………………………..28

3.2. Materiale…………………………………………………………………………………………………………………….28

3.3.Metode de analiză…………………………………………………………………………………………………………31

3.3.1. Spectrometria de absorbție în UV-VIS………………………………………….31

3.3.2. Spectrometria de absorbție în IR………………………………………………..38

3.3.3. Cromatografia …………………………………………………………………………………………41

3.3.3.1. Clasifisicarea metodelor cromatografice de analiză………………………………41

3.3.3.2. Cromatografia lichidă de înaltă performanță HPLC…………………………….50

3.4.Rezultate și discuții……………………………………………………………………………………………………….54

3.4.1.Analiza HPLC a vitaminelor B din drojdia de bere……………………………………….55

3.4.1.1. Separarea și identificarea vitaminelor B prin metoda HPLC…………………56

3.4.1.2.Analiza HPLC a vitaminelor din tablete de drojdie de bere……………………59

3.5.Concluzii și recomandări……………………………………………………………………………………………….69

IV.BIBLIOGRAFIE……………………………………………………………………………………………………………70

I INTRODUCERE

Drojdia de bere este o ciupercă microscopică din familia Saccharomycetacee. Formată dintr-o singură celulă, are proprietatea de a se dezvolta rapid, mai ales în alimentele dulci și făinoase.

Este importantă în alimentația umană pentru influența pozitivă asupra imunității intestinale și sangvine. Unii o recomandă, alții nu, spunând că nu poate fi asimilată.

Există drojdii “înalte”, numite drojdii de panificație, care au activitate optimă la 15-20° C, obținută ca urmare a tratamentului de uscare prin sodă caustică, carbonat de sodiu sau acid clorhidric (astfel pierzându-se 70 % din vitamine) și drojdii “joase”, cu activitate optimă la 5-6° C, cultivate pe cereale (orz) malțate (drojdia obținută în timpul fabricării berii). Acestea din urmă sunt singurele recomandate în terapeutica alimentară.

Drojdia de bere conține: 50% proteine care sunt ușor digerabile; toți acizii aminați indispensabili vieții; gluten și peptide în cantitate foarte ridicată; 14 săruri minerale esențiale; oligoelemente; 17 vitamine; ergosterol.

Datorită conținutului mare de vitamine din grupul B, este indicată în afecțiuni  neurologice (nevrite) și în special, neuromusculare sau în manifestările nervoase ale alcoolicilor.

În drojdia de bere se găsesc vitamine hidrosolubile ca : complexul de vitamine B; vitamina C și vitamina H.

Vitaminele hidrosolubile sunt substanțe biologic active foarte diferite sub aspect structural.Ele au proprietatea fizică comună de a fi solubile în apă și insolubile în solvenți organici.Din această grupă fac parte “Complexul vitaminic B; vitamina C; vitaminele H.

Din complexul vitaminic B fac parte mai multe substanțe cu structură diferită, care au însă un

rol fundamental asupra creșterii și dezvoltării organismelor, fiind într-o strânsă interfuncționalitate.

Vitaminele B se găsesc în general împreună, în aceleași produse vegetale, iar deficiența vitaminică B nu e în cele mai multe cazuri vindecată de o singură vitamină, ci de mai multe vitamine B, care au acțiune sinergică, fapt pentru care poartă denumirea de “complexul vitaminic B”.

Din grupa sau complexul vitaminelor B fac parte vitaminele B1, B2, B6, B12, acidul pantotenic (vitamina B5), nicotinamida (vitamina B3), vitamina H (vitamina B8,biotina), colina.

Lipsa din hrană a vitaminelor din complexul B se manifestă în diferite moduri, predominând stările de insomnie, nervozitate, depresiune nervoasă, albirea și căderea părului, tulburări cutanate și digestive, constipație, inapetență, anemii, modificări la nivelul limbii.

II STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII ÎN DOMENIUL TEMEI ABORDATE

VITAMINELE HIDROSOLUBILE DIN DROJDIA DE BERE

Fig.2.1. Cuburi de drojdie de bere

2.1. GENERALITĂȚI

Drojdia de bere este o ciupercă microscopică din familia Saccharomycetacee, subspecia S. Cerevisiae.Este formată dintr-o singură celulă, are proprietatea de a se dezvolta rapid, mai ales în alimentele dulci și făinoase.

Folosirea ei în preparate supuse focului distruge parțial vitaminele din celulele drojdiei. Drojdia nu se va bea sau mânca cu suc de fructe, biscuiți sau pâine, deoarece se formează bere în stomac. Pe lângă fermentația alocoolică se mai formează ulei de fusel, alcooli toxici și acizi nocivi pentru ficat și rinichi care au efect daunător asupra vitaminelor din drojdie.

Drojdia are proprietăți antianemice, antitoxice, stimulante, remineralizante. În drojdia de bere există complexul de vitamine hidrosolubile B și vitamina C.

Întărește sistemul imunitar și combate bolile infecțioase. Este bogată în elemente alcaline, ca sodiu și potasiu. Favorizează asimilarea alimentară și este un catalizator pentru substanțele hidrocarbonate. Combate tulburările digestive: constipație, diaree, colite. Este foarte eficientă în avitaminoze, denutriție, slăbiciune. Ajută la creștere, rahitism. Sportivilor le mărește rezistenta la oboseală, favorizând travaliul muscular și ușurând eliminarea de toxine.

În categoria vitaminelor hidrosolubile intră complexul vitaminc B, vitamina H și vitamina C. În stare crudă, drojdia de bere conține o combinație perfectă de substanțe nutritive: 50 % proteine, 30 % glucide, 5 % lipide, toti acizii indispensabili vietii, diastaze, mult gluten si peptide (cu acțiune preponderentă în fenomenele vitale, în reacțiile de oxido-reducere, în dezintoxicare), lecitină sau grăsimi fosfarate, zaharuri, săruri minerale, vitamine.

Vitaminele din complexul B nu se depozitează în cantități mari în diferite organe și țesuturi,

cu excepția vitaminei B12 care se depozitează în ficat.Restul vitaminelor B se mențin în circulația sanguină la un conținut necesar funcțiilor biologice pe care le îndeplinesc, excesele fiind eliminate prin urină.

Vitaminele hidrosolubile sunt substanțe biologic active foarte diferite sub aspect structural.Ele au proprietatea fizică comună de a fi solubile în apă și insolubile în solvenți organici.

Din complexul vitaminic B fac parte mai multe substanțe cu structură diferită, care au însă un rol fundamental asupra creșterii și dezvoltării organismelor, fiind într-o strânsă interfuncționalitate. Numeroase vitamine B îndeplinesc rolul de coenzime, participând activ la infăptuirea metabolismului intermediar, luând parte la numeroase procese metabolice din organismele vegetale și animale.

Vitaminele B se găsesc în general impreună, în aceleași produse vegetale, iar deficiența vitaminică B nu e în cele mai multe cazuri vindecată de o singură vitamină, ci de mai multe vitamine B, care au acțiune sinergică, fapt pentru care poartă denumirea de “complexul vitaminic B”.

Activitatea biochimică a acestor vitamine se datorează în principal îndeplinirii rolului de coenzime, care participă la înfăptuirea unor procese biologice fundamentale pentru viața organismelor (respirație , biosinteză, metabolism energetic, înmagazinarea și transmiterea informației genetice).

Vitaminele hidrosolubile se deosebesc de cele liposolubile sub mai multe aspecte.Excesul de vitamine hidrosolubile din celule și lichidele biologice este ușor excretat prin urină, astfel încât cazurile de toxicitate sunt rare în comparație cu vitaminele liposolubile.

În popor se spune că vitaminele hidrosolubile nu se depozitează în corp, ceea ce nu este tocmai corect deoarece și aceste vitamine se depozitează în diferite țesuturi și organe, dar în cantități foarte mici. În timp ce vitaminele liposolubile nu îndeplinesc rolul de coenzime, cele hidrosolubile iau parte la numeroase procese metabolice sub formă de coenzime cu rol însemnat atât în reacțiile de oxidoreducere, carboxilare și decarboxilare, hidrogenare-dehidrogenare, în reacții de transfer, cât și în hematopoieză.

Pe baza a numeroase cercetări, efectuate în diferite țări, în secolele XVII și XIX s-a constatat că vitaminele B1 și B2 nu se găsesc în general singure, în diferite surse vegetale sau animale, ci asociate cu alte vitamine, dintre care unele și-au dezvăluit cu greu “înrudirea”. Totodată s-a remarcat că unele vitamine din complexul B acționează în același sens, se completează și se influențează reciproc, că fac parte dintr-un “ansamblu”(complex) vitaminic, indispensabil metabolismul celular (nutriție, catabolism , anabolism).Unele vitamine din complexul B nu au eficiență maximă dacă se administrează singure în diferite tratamente, ci numai asociate cu alte vitamine cu acțiune sinergetică.

Fiecare vitamină B pare să indeplinească rolul de catalizator și reglator pentru activitatea celorlalte vitamine B, cu acțiune sinergetică. Vitaminele B se completează unele pe altele în diversele lor funcții, nu numai între ele, ci și cu alte vitamine (A, C, D). Experimental s-a demonstrat că o alimentație sănătoasă, echilibrată în substanțe nutritive, asigură nevoile zilnice în vitamine ale organismului uman.

Este convingător să amintim că 20g de drojdie uscată conțin 10-20 mg vitamină PP, doza zilnică necesară pentru om, iar 2g de pătrunjel proaspăt conțin aproximativ 20 mg vitamină C, aproximativ 25% din nevoile zilnice ale omului.

2.2. CLASIFICAREA VITAMINELOR HIDROSOLUBILE

În categoria vitaminelor hidrosolubile intră complexul vitaminic B, vitamina C și vitamina H.

Vitaminele hidrosolubile sunt substanțe foarte diferite sub aspect structural.

Vitaminele hidrosolubile din drojdia de bere sunt:

Complexul Vitaminic B

Vitamina C

Vitamina H

Complexul vitaminic B cuprinde toate vitaminele din grupa B: B1, B 2, B3, B5, B6, B9, B12, vitamina H (biotină).

Termenul diferită, care au însă un rol fundamental asupra creșterii și dezvoltării organismelor, fiind într-o strânsă interfuncționalitate. Numeroase vitamine B îndeplinesc rolul de coenzime, participând activ la infăptuirea metabolismului intermediar, luând parte la numeroase procese metabolice din organismele vegetale și animale.

Vitaminele B se găsesc în general impreună, în aceleași produse vegetale, iar deficiența vitaminică B nu e în cele mai multe cazuri vindecată de o singură vitamină, ci de mai multe vitamine B, care au acțiune sinergică, fapt pentru care poartă denumirea de “complexul vitaminic B”.

Activitatea biochimică a acestor vitamine se datorează în principal îndeplinirii rolului de coenzime, care participă la înfăptuirea unor procese biologice fundamentale pentru viața organismelor (respirație , biosinteză, metabolism energetic, înmagazinarea și transmiterea informației genetice).

Vitaminele hidrosolubile se deosebesc de cele liposolubile sub mai multe aspecte.Excesul de vitamine hidrosolubile din celule și lichidele biologice este ușor excretat prin urină, astfel încât cazurile de toxicitate sunt rare în comparație cu vitaminele liposolubile.

În popor se spune că vitaminele hidrosolubile nu se depozitează în corp, ceea ce nu este tocmai corect deoarece și aceste vitamine se depozitează în diferite țesuturi și organe, dar în cantități foarte mici. În timp ce vitaminele liposolubile nu îndeplinesc rolul de coenzime, cele hidrosolubile iau parte la numeroase procese metabolice sub formă de coenzime cu rol însemnat atât în reacțiile de oxidoreducere, carboxilare și decarboxilare, hidrogenare-dehidrogenare, în reacții de transfer, cât și în hematopoieză.

Pe baza a numeroase cercetări, efectuate în diferite țări, în secolele XVII și XIX s-a constatat că vitaminele B1 și B2 nu se găsesc în general singure, în diferite surse vegetale sau animale, ci asociate cu alte vitamine, dintre care unele și-au dezvăluit cu greu “înrudirea”. Totodată s-a remarcat că unele vitamine din complexul B acționează în același sens, se completează și se influențează reciproc, că fac parte dintr-un “ansamblu”(complex) vitaminic, indispensabil metabolismul celular (nutriție, catabolism , anabolism).Unele vitamine din complexul B nu au eficiență maximă dacă se administrează singure în diferite tratamente, ci numai asociate cu alte vitamine cu acțiune sinergetică.

Fiecare vitamină B pare să indeplinească rolul de catalizator și reglator pentru activitatea celorlalte vitamine B, cu acțiune sinergetică. Vitaminele B se completează unele pe altele în diversele lor funcții, nu numai între ele, ci și cu alte vitamine (A, C, D). Experimental s-a demonstrat că o alimentație sănătoasă, echilibrată în substanțe nutritive, asigură nevoile zilnice în vitamine ale organismului uman.

Este convingător să amintim că 20g de drojdie uscată conțin 10-20 mg vitamină PP, doza zilnică necesară pentru om, iar 2g de pătrunjel proaspăt conțin aproximativ 20 mg vitamină C, aproximativ 25% din nevoile zilnice ale omului.

2.2. CLASIFICAREA VITAMINELOR HIDROSOLUBILE

În categoria vitaminelor hidrosolubile intră complexul vitaminic B, vitamina C și vitamina H.

Vitaminele hidrosolubile sunt substanțe foarte diferite sub aspect structural.

Vitaminele hidrosolubile din drojdia de bere sunt:

Complexul Vitaminic B

Vitamina C

Vitamina H

Complexul vitaminic B cuprinde toate vitaminele din grupa B: B1, B 2, B3, B5, B6, B9, B12, vitamina H (biotină).

Termenul de vitamina B a fost folosit la începutul secolului nostru pentru a denumi factorul carențial al bolii beri-beri ,extras din orezul nedecorticat.

În prezent se știe că nu este vorba despre o vitamină B ci despre un complex de vitamine B substanțe ce au următoarele particularități comune:

● proveniența (drojdia de bere);

● solubilitatea în apă;

● rolul nutrițional fundamental în activitatea metabolismului celular

Vitamina B1 (tiamina)

A fost izolată în anul 1911 de Funk, din tărâțele de grâu.

Vitamina B1 se mai numește tiamina, deoarece conține sulf și azot

aminic în molecula sa, aneurina și vitamina antiberiberi, pentru că vindecă boala beri-beri.

Are un rol însemnat în metabolismul intermediar, în procesele de creștere și dezvoltare, în procesele de biosinteză și catabolism, în prevenirea și tratarea unor afecțiuni digestive, hepatice, ale sistemului nervos, endocrin și muscular, fiind totodată un factor de creștere pentru numeroase microorganisme. Are un miros caracteristic care îl imprimă și drojdiei.În lumina UV prezintă spectre de absorbție caracteristice. Este stabilă la o temperatură obișnuită, peste 100 grade C se descompune.

Vitamina B1 are formula generală C12H17ON4S, iar formula structurală este următoarea:

fig.2.2. Structura moleculară a tiaminei

Vitamina B1,3-(4-amino-2-metil-pirimidil-5-metilen)-5’-(beta-hidroxi-etil)-4’-metiltiazol, este formată dintr-un nucleu pirimidinic și unul tiazolic, unite printr-o punte metilenică (-CH2-) care se leagă de atomul C-5 din nucleul pirimidinic și de atomul de azot (N-3’) din nucleul tiazolic.Pe nucleul pirimidinic se găseste un radical metil la C-2 și o grupare aminică la C-4,iar pe nucleul tiazolic se găsește un radical metil la C-4’ și o grupare hidroxietil la C-5’.

Vitamina B1 este deci un derivat de pirimidină și de tiazol conținând în moleculă două cicluri, un heterociclu hexagonal cu doi atomi de azot și un heterociclu pentagonal cu un atom de azot și unul de sulf. În comerț , vitamina B1 se găsește sub formă de clorhidrat de tiamină (C12H18ON4SCl2), forma curentă sub care această vitamină se găsește în farmacii. Se extrage sub formă cristalină din cojile boabelor de orez și se obține și pe cale de sinteză.

Proprietăți fizice și chimice:

Vitamina B1 pură se prezintă sub formă de pulbere albă sau de cristale aciculare, incolore, care cristalizează cu o moleculă de apă. Cristalizează în sistem monochimic, are punctul de topire la 221˚C, iar în soluție prezintă un punct izoelectric la pH 9,2.

Este sensibilă la acțiunea luminii ultraviolete, în special la radiații cu lungimi de undă la 256 nm, care o inactivează rapid la pH 7.Rezistența la caldură este mult influențată de condițiile mediului în care se află. Pulberea cristalină uscată suportă o temperatură de 100˚C timp de 24 de ore, fară să se degradeze.Tiamina este optic inactivată și se distruge sub acțiunea radiațiilor ultraviolete.

Vitamina B1 este solubilă în acetonă și cloroform. Solubilitatea sa crește în mediu bazic.Tiamina are un miros caracteristic, pe care îl imprimă drojdiei de bere. În soluții alcaline, tiamina se transformă instantaneu într-un produs de culoare galbenă cu o fluorescență albastră, care sub aspect chimic corespunde unui amestec de substanțe colorate, reunite sub numele de chinccrome.

Surse de vitamina B1:

Vitamina B1 are o largă răspandire în natură fiind prezentă în toate organismele vegetale și animale.Ea se găsește de asemenea în toate alimentele de origine vegetală și animală,dar conținutul său este diferit de la un produs la altul. Printre sursele naturale bogate in vitamina B1 fac parte drojdia de bere, semințele cerealelor nedecorticate (orez, grâu, orz, porumb, ovăz), ficatul, rinichii, mușchiul de porc.Deosebit de bogate în vitamina B1 sunt extractele apoase din drojdia de bere, drojdia alimentară, cojile cerealelor, unele ciuperci.

Conținutul vitaminei B1 din plantele verzi variază intre 2,5 și 10mg/g. În germenii de grâu și tărâțe de orez, vitamina B1 are un conținut de 1,6-2,4mg%, iar în produsele animale între 0,1-0,4mg%.

În drojdia de bere conținutul vitaminei B1 variază între 5 și 25 mg/100g, în germenii de orez între 2,8-3,5 mg/100g, iar în extract de drojdie de 30 mg/100g.

Conținutul mediu al vitaminei B1 în alimente de origine animală, exprimat în mg/100g se prezintă astfel: 0,6 la carnea de vită, 0,1-0,2 la carnea de miel, 0,8-1 la carnea de porc, 0,1 la pasăre, 0,02 la laptele uman, 0,04 la lapte de vacă si capră, 0,3-0,5 la gălbenușul de ou.

Fructele, produsele lactate și peștele sunt surse sărace în vitamina B1.Aportul adus de fructe, legume, lactate, produse din carne în vitamina B1 este totuși însemnat având în vedere masa mare din aceste produse care intră zilnic în consumul alimentar al oamenilor.

Pâinea albă este foarte săracă în vitamina B1, deoarece aceasta se pierde în procesul de obținere a făinii albe, tratată cu oxidanți. Păinea integrală și cea dietetică au un conținut cu mult mai mare de vitamina B1 decât pâinea albă.

În stabilirea dietei alimentare este neceasar să se țină seama că prin fierberea alimentelor cu apă, aproximativ 30% din conținutul vitaminei B1 trece în soluție, iar acest procent crește dacă se aruncă apa de la prima fiertură.Adăugarea de bicarbonat sau alte săruri alcaline mărește degradarea cantității de vitamină.La prepararea conservelor în cutii și încălzirea acestora în autoclave la 120˚C, pierderile se ridică până la 70-80%.

Conservarea prin uscare cauzează pierderi relativ mici în vitamina B1, pănă la 10-15%.

Rolul tiaminei

Acțiunea biologică a tiaminei, la fel ca și a altor vitamine din complexul B, se datorează în cea mai mare parte contribuției acestora la formarea unor enzime .

Este necesară bunei funcționări a sistemului nervos central și mai ales al celui periferic.Joacă rol însemnat în mecanismul umoral al excitației nervoase împreună cu acetilcolina.Tratamente efectuate cu vitamina B1 duc la vindecarea unor tulburări biochimice.Timpul de înjumătățire a „vieții” tiaminei în corp este de 5,5-19,5 zile. Majoritatea produșilor săi de degradare se elimină prin urină.

Tiamina favorizează, pe de altă parte, absorbția oxigenului, metabolizarea glucidelor și biosinteza lipidelor din glucide. Stimulează pofta de mâncare și activează mișcările peristaltice ale intestinelor.

2.2.2. Vitamina B2(riboflavina)

Denumirea oficială actuală a vitaminei B2 este de riboflavină. Anterior riboflavina se numea vitamina G și respectiv lactoflavină, ovoflavină, hepatoflavină, etc.Cei mai mulți din acești termeni derivă de la sursa din care vitamina a fost inițial izolată, respectiv din lapte, ouă, ficat, plante.

Existența vitaminei B2 în lapte a fost remarcată prima dată în 1879, când s-a extras din zerul de lapte un pigment galben-verzui, puternic fluorescent, căruia i-a fost atribuit numele de lactoflavină.

Ulterior, în perioada anilor 1920-1932 același compus s-a extras din albușul de ou, fiind numit ovoflavină, din ficat s-a extras hepatoflavina, iar din drojdii și unele plante ierboase s-a extras verdoflavina numită și liocrom, care ulterior s-a dovedit a fi identic cu „fermentul galben”,izolat din drojdia de bere, menționându-se rolul important al acestei enzime în respirația celulară.

După stabilirea structurii moleculare a vitaminei B2, confirmată și prin sinteza totală a acesteia, Consiliul Farmaciștilor și a Chimiștilor din S.U.A. îi atribuie denumirea generică de riboflavină, termen în care se includ toate flavinele naturale izolate anterior (lactoflavina, ovoflavina,hepatoflavina, verdoflavina, liocrom, uroflavina), fiind compuși identici, extrași din surse naturale diferite.

Termenul de riboflavină se datorează prezenței în moleculă a ribitolului, culorii galben-verzui și proprietăților sale fluorescente.

Vitamina B2 are formula elementară C17H20N4O6, iar sub aspect structural este formată dintr-un nucleu izoaloxazinic și ribitol (6,7-di-metil-9-(D-1’-ribitil)-izoaloxazina) de la care îi provine și numele de riboflavină . Sub aspect chimic, riboflavina este un derivat al izoaloxazinei, având ca substituenți două grupări metil la C-6 și C-7, iar la N-9 un ribitil. Nucleul izoaloxazinic determină culoarea galben-verzuie și fluorescentă a riboflavinei, la un pH cuprins între valorile 3-9.

Substituirea hidrogenului de la N-3 determină dispariția flourescenței fapt ce explică de ce unele flavinenzime nu au fluorescență, deoarece hidrogenul de la N-3 este substituit prin legarea proteinelor de coenzime.

fig.2.3. Structura moleculară a riboflavinei

Pe cale industrială vitamina B2 se obține prin fermentarea zerului sau a laptelui smântânit cu Clostridium acetobutylicum, Candida guillermondia, C. Tropicalis, obținându-se între 50-60 mg riboflavină dintr-un litru de lichid fermentativ,cu condiția ca sursa de carbon utilizată să fie glucoza.

Proprietăți fizice și chimice:

Riboflavina este o substanță solidă, cristalină, de culoare galbenă sau galben-portocalie, cu gust amar, optic activă. Prezintă 3 forme polimorfe cristaline, cu puncte de topire diferite, cuprinse intre 280-290ºC, cu descompunere. La 240ºC începe să se înegrească.

Riboflavina cristalizată sub formă aciculară (ace fine) are punctul de topire la 290ºC, iar cea cristalizată sub formă de plăcuțe (lamele) se topește la 280 ºC.

Este ușor solubilă în soluții alcaline, piridină, acid acetic, alcool amilic, ciclohexanol, fenol și practic insolubilă în cloroform, benzen, acetonă, eter de petrol, etanol. În apă este puțin solubilă, dizolvându-se 10-13 mg/100 ml de apă la 25 ºC

și 250mg la 100 ºC. Are un caracter amfoter, cu punctul izoelectric la pH 6.

Este rezistentă față de acizi și agenții oxidanți mai slabi, dar se degradează foarte ușor sub acțiunea luminii, în special a radiațiilor ultraviolete.

Surse de vitamină B2

Vitamina B2 este larg răspândită în natură fiind prezentă în toate celulele organismelor vegetale, animale, precum și în microorganisme.Conținutul vitaminei B2 din țesuturile verzi este relativ ridicat, variind de la 2,5 la 25 mg/g.Cele mai bogate produse horticole în vitamina B2 sunt migdalele,alunele, ciupercile, pătrunjelul, țelina.Cantități mari de vitamina B2 conțin bacteriile anaerobe și drojdiile cu mare putere de fermentare,în medie 3mg/100g. La mamifere ficatul, rinichiul, inima, splina, creierul sunt organele în care riboflavina se găsește în cantitate mai mare(1-3 mg%).

Conținutul de vitamina B2 din drojdia de bere variază între 1 800-3 000 mg/100g.

Laptele proaspăt de vacă conține 135-300 mg/100ml, colostrul 400-600mg/100ml, laptele praf

1600 mg/100ml. Untul este sărac în riboflavină 12mg/100g, oul intreg conține 250-440 mg/100g, albușul 230mg/100g, iar gălbenusul 285-520 mg/100g.

Cantități însemnate de riboflavină produc unele microorganisme din prestomacele ierbivorelor și din flora intestinală cum sunt:Escherichia coli,Bacillus proteus vulgaris,B. Lactis aerogenes,B. Mesentericus,B. Vulgaris.

Rolul vitaminei B2

Vitamina B2 are un rol important în reacțiile de oxidoreducere, în procesele de creștere și dezvoltare, fiind prezentă în stare liberă sau sub formă de compuși în toate celulele organismelor vegetale și animale. În stare liberă este un factor de creștere pentru organismele tinere și pentru numeroase microorganisme.Ea stimulează secreția acidului clorhidric în stomac.

Riboflavina participă alături de vitamina A în procesul vederii, fapt ce justifică conținutul ridicat al acestei vitamine în retină.Este unul dintre constituenții celulari, esențiali care acționează sub forma de combinație proteică în fenomenele de respirație celulară și intervine în procesele de dehidrogenare este indicat în caz de perles și de crampe musculare.

2.2.3. Vitamina B3 (nicotinamida)

Vitamina B3 cuprinde acidul nicotinic și amida acidului nicotinic cu proprietăți aproape identice precum și o serie de derivați ai acidului nicotinic. Nucleul de baza al vitaminei este nucleul pirimidinic cu 5 atomi de C și un atom de N. Acidul nicotinic și amida nicotinica sunt substanțe cristaline, incolore, solubile în apa, alcool, termostabile.

În anul 1913 se reușește izolarea acidul nicotinic din drojdii.Acidul nicotinic a fost obținut prin sinteză de în anul 1887, prin oxidarea nicotinei. Acidul nicotinic vindecă pelagra umană, boală apărută la bolnavii din azile hrăniți cu multe preparate din porumb și cu puțină carne.

În drojdia de bere conținutul de vitamină B3 variază între 34-93 mg/100g.

Acidul nicotinic, numit și niacină, are formula moleculară C6H5O2N, iar nicotinamida C6H6ON2.Nicotinamida rezultă din amidarea directă a acidului nicotinic sau a esterilor săi.

Fig.2.4. Structura moleculară a niacinei

Proprietăți fizice și chimice:

Acidul nicotinic și amida nicotinică sunt substanțe cristaline, incolore, solubile în apa, alcool, termostabile.Sub aspect farmaceutic acidul nicotinic și nicotinamida sunt considerate cele mai stabile vitamine.Vitamina B3 este incompatibilă cu substanțe acide sau bazice, nicotinamida hidrolizează, iar acidul nicotinic formează săruri în mediu bazic.Cu sărurile de argint formează precipitate.În solutie apoasă reacționează cu acidul ascorbic, cu formarea unui complex de culoare galben-verde, favorizat la pH de 3,8 cu punct de topire diferit de a celor două componente.

Surse de vitamină B3

Vitamina B3 se găsește sub diferitele sale forme structurale larg răspândită în natură atât în organismele vegetale, cât și în cele animale.În plante conținutul vitaminelor piridinice este mai mic decât la animale.Există totuși surse vegetale, ca drojdia de bere, care conțin o cantitate mai mare de acid nicotinic, fapt ce a determinat utilizarea acestor surse în tratamentul pelagrei.

Într-o drojdie selecționată folosită la fabricarea berii s-a gasit acid nicotinic cu un conținut de 106mg/100g s.u., iar în drojdiile folosite la fabricarea pâinii 30mg/100g s.u.

La plante sunt mai bogate în vitamina B3 frunzele și mai sărace legumele, fructele și semințele unor cereale (secară,porumb).La cereale, coaja bobului conține mai mult acid nicotinic decât miezul. Întrucât acidul nicotinic și amida sa nu sunt sensibili la fierbere și sterilizare, face ca cea mai mare parte din vitamina B3 să se păstreze în alimente și după prepararea acestora.În general, în timpul preparării hranei, pierderea de vitamină este în jur de 30%.

Continutul vitaminei B3 în drojdia de bere variază între 30-106 mg/100g, tărâțe de orez 42-96mg/100g, în extract de malț 8-10mg/100g, lapte de vacă 0,15-0,25mg/100g, fasole1,45-1,47mg/100g.Nicotinamida se găsește la om și la animale predominant sub formă de coenzimă, în ficat în stare liberă sau combinată.

Conținutul mediu al unor alimente,exprimat în echivalenți de niacină/1000kcal:lapte de vacă 12,4(1,2 mg niacină și 673 mg triptofan),lapte de mamă 9,9(2,5mg niacină și 443 mg triptofan),carne 46(24,7 mg niacină și 1280 mg triptofan),ou integral 19,8(0,6 mg niacina și 1150 mg triptofan),faină albă de grâu 7,4(2,5 mg niacină și 297 mg triptofan),porumb 6,7(5,0 mg niacină și 106 mg triptofan).

Rolul vitaminei B3

Se elimină prin urină, fecale, tranpirație. Vitamina B3 previne și vindecă pelagra, caracterizată prin tabloul simptotic a celor “trei D” (demența, diaree, dermatită). Ele participă și la procesele de oxireducere, la metabolismul glucidelor, proteinelor, a produșilor pigmentari și influențează sistemul nervos și activitatea unor glande cu secreție internă.E binecunoscută și acțiunea vasodilatatoare a vitaminei B3.

2.2.4. Vitamina B5 (acidul pantotenic)

Acidul pantotenic face parte din “Complexul de vitamine B “, fiind unul din cei mai răspândiți reprezentanți.Denumirea sa actuală provine de la semnificația cuvintelor grecești “pas pantos-peste tot”, care reflectă larga sa răspândire în natură, fiind prezent în toate organismele animale și vegetale .Are un rol însemnat, luând parte activă la numeroase procese metabolice din celule și țesuturi.

Acidul pantotenic a fost considerat un component al complexului” Bios” ,descoperit în 1901, care stimulează creșterea drojdiilor pe medii artificiale.Se găsește natură în stare liberă, sub forma unor complexe cu proteinele și e component în structura coenzimei A (HSCoA). În stare carențială a acidului pantotenic apar la animale afecțiuni reflectând rolul metabiloc important ce revine acestei vitamine în diferite procese metabolice.

Acidul pantotenic are formula moleculară C9H17O5N și masa moleculară 219,2. În molecula acidului pantotenic s-a pus în evidență o grupare carboxil,prin esterificare,două grupări hidroxil libere,iar prin hidroliză s-a pus în evidență încă un atom de oxigen și unul de azot.

fig.2.5. Structura moleculară a acidului pantotenic

Proprietăți fizico-chimice

Vitamina B5 se prezintă ca un ulei galben-deschis, vâscos, solubil în apă și acid acetic, puțin solubil în etanol, benzen, cloroform. Prezintă o mare adsorbție de afinitate față de cărbunele activ.

Este substanță optic activă, dextrogiră(+37,5º), stabilă în mediu acid la pH 5,5-7, dar instabilă la încălzire.

Acidul pantotenic este unul din cei mai stabili componenți care fac parte din complexul B.

În medii mai acide și în cele alcaline este instabil, fiind repede hidrolizat.Acidul pantotenic în soluție apoasă , la pH 5,5-7 suportă autoclavarea la 120ºC, timp de 30 minute, fără descompunere.

Surse de vitamină B5

Acidul pantotenic se găsește în toate organismele vegetale și animale.În cantitate mai mare se află în lăptișorul de matcă, drojdia de bere, făina de fasole, soia, arahide, conopidă, migdale, în medie 4-40μg∕g s.u. În lăptișorul de matcă se găsește între 150-500 μg∕g, iar în produsele horticole conținutul variază între 0,3-20 μg∕g.

Ficatul conține 25-60 μg∕g s.u., iar rinichiul 32-49 μg∕g s.u. În sângele uman, concentrația de acid pantotenic este de 18-34 μg∕100ml, cu o medie la diferite specii de 20 μg∕100ml,care scade în stări de carență. Acidul pantotenic s-a pus în evidență în cantități mai mari decât în sânge, în glandele suprarenale, inimă, splină, creier, pancreas și plămîni.

Alimentele preparate au un conținut mai redus de acid pantotenic decât sursele primare, datorită pierderilor care se produc în timpul proceselor tehnologice și culinare de obținere a hranei. Pasteurizarea laptelui cauzează pierderi minore de acid pantotenic, dar în timpul fierberii și prăjirii alimentelor la temperaturi mai înalte, pierderile pot fi de peste 50%.

Rolul vitaminei B5

Forma activă acidului pantotenic o reprezintă coenzima A, numită și coenzima de acetilare, care are un rol esențial în metabolismul lipidelor, glucidelor, protidelor, în biosinteza sterolilor, a hormonilor steroidici, în funcționarea sistemului nervos și a aparatului imunitar.Un rol fundamental îl are acetilceoenzima A în biosinteza și degradarea acizilor grași, a sterolilor, acizilor biliari, a numeroase substanțe terpenice, carotenoide, în ciclu Krebs.

2.2.5. Vitamina B6(piridoxina)

Numele de piridoxină provine de la structura sa moleculara deoarece este un alcool cu nucleu piridinic.Denumirile de adermină sau de vitamină antipelagroasă a șobolanului derivă de la proprietatea sa de a vindeca o dermatită specifică a șobolanului.

În natură vitamina B6 se găseste sub trei forme vitamere, care se deosebesc între ele printr-o grupare functională caracteristică , legată de C-4 al nucleului piridinic.

Astfel forma piridoxol sau piridoxină conține o grupare hidroxilică, piridoxalul conține o grupare aldehidică, iar piridoxamina conține o grupare aminică.

Izolarea vitaminei B6 s-a realizat din tarâțe de orez, drojdii, extracte din boabe de orez nedecorticat. Vitamina B6 cuprinde piridoxina, piridoxalul și piridoxamina. În mediu alcalin și acid sunt sensibile la lumină.

Piridoxina este un derivat de piridină substituit la C-2 cu o grupare metil, la C-3 cu o grupare hidroxil, iar la C-4 si C-5 cu câte o grupare hidroximetil.Ea conține în moleculă un nucleu piridinic și are formula moleculară C8H11O3N.

Sub aspectul structurii chimice piridoxina este 2-metil-3-hidroxi-4,5-dihidroximetil-piridina.

fig.2.6.Structura moleculară a piridoxinei

Proprietăți fizico-chimice

Piridoxina în stare liberă se prezintă sub formă de pulbere cristalină, incoloră, cu gust ușor amar și punct de topire la 160ºC. Are masa moleculară 169,2 UMA.În mediu acid se comportă ca un fenol, iar în mediu bazic formează un anion fenolat cu N terțiar, iar în mediu neutru se prezintă ca un amfion.

Piridoxina este optic inactivată, iar cu clorura ferică formează un compus de culoare galben-roșie.Dă o colorație roșie prin încălzirea sa cu cloroform și etilat de sodiu.Se distruge ușor sub acțiunea radiațiilor ultraviolete.Toate formele vitaminei B6 sunt sensibile la acțiunea luminii.Ele prezintă în UV spectre de absorbție caracteristice care depind de pH.

Vitaminele B6 sunt rezistente la fierbere la 100ºC, atât în mediu acid cât și în mediu bazic,cu excepția piridoxalului, care este sensibil în soluție alcalină.

Surse de vitamină B6

Vitamina B6 este larg răspândită în organismele vegetale și animale.Sursele cu conținut ridicat de vitamina B6 sunt drojdia de bere, coaja bobului de orez, polen, semințele cerealelor, ficatul animalelor, carnea de pește, gălbenușul de ou.

În general vitamina B6 apare în natură sub formă de complexe, egată de proteine sau amidon , precum și sub formă de complexe organo-metalice și mai puțin în stare liberă.

Din mușchiul de pește, prin extractie cu apă, nu se poate obține decât 25% din totalul vitaminei B 6, fiind nevoie de o hidroliză papainică pentru extragerea cantității totale.

În cantitate mai mare se găsește în ficat, care se pare că reprezintă principalul organ de depozit.

Conținutul mediu de vitamină B6 al unor alimente raportat la 100g aliment:mușchi de vită 0,5 mg, somon 1 mg, pâine integrală 0,36mg, ou de găină 0,12mg, nuci 0,87mg.

Prin prelucrarea alimentelor se pierd cantități mari de vitamină B6.Astfel prin fierberea sau frigerea cărnii se pierd 50% din vitaminele B6, iar la obținerea unor preparate lactate între 36-70%.La prepararea conservelor de legume se pierd 77% din vitaminele B6, iar la obținerea făinii foarte fine între 50-93%.

Rolul vitaminei B6

Vitamina B6, sub cele trei forme structurale,are un rol multiplu și complex în organismele vegetale și animale.

Mai ales sub formă de piridoxalfosfat, cu rol de coenzimă, ia parte în numeroase procese metabolice ale proteinelor, glucidelor, lipidelor și a altor substanțe, contribuind atât la biosinteza, cât și la degradarea unor compuși (aminoacizi, monoglucide, acizi organici, compuși heterociclici), precum și la stabilirea unor interconversiuni și a unor interrelații metabolice între diferite grupe de substanțe, dând posibilitatea organismului să utilizeze cât mai eficient substanțele existente în hrană. Intervine în formarea adrenalinei.

Are o atribuție importantă în reglarea activității nervoase.

2.2.6.Vitamina B9 (acidul folic)

Grupul generic al” acizilor folici “este constituit dintr-un “complex de vitamine B”,care din punct de vedere chimic sunt corelate cu acidul pteroiglutamic, au acțiune hematopoietică și leucopoietică, dar se deosebesc între ele prin acțiunea specifică pe care o au asupra diferitelor microorganisme și specii de animale.

Acizii folici au un rol însemnat în formarea globulelor roșii și albe din sânge,în prevenirea și tratarea anemiilor,sunt factori de creștere pentru numeroase organisme.

Acidul folic se poate obține în stare cristalină din diferite surse naturale (ficat, spanac, drojdiile, cojile cerealelor) prin extracție cu apă la pH 3, adsorbție pe cărbune activ, eluție cu soluție amoniacală 2,8%, purificat prin readsorbție pe cărbune, eluare cu anilină și precipitare cu acetat de plumb, AgNO3, acid picric, baritină.În produsele naturale acidul folic se găsește în stare liberă în cantitate relativ redusă deoarece se găsește în cantitate mai mare sub formă de compuși chimici diferiți, unii cu mai multe resturi de acid glutamic, care au însă aceeași importanță nutritivă pentru organismele vii.

Acidul folic se mai numește și acid pteroiglutamic, denumire ce provine de la structura sa chimică. Acidul folic are o structură complexă, fiind format dintr-un nucleu pteridinic, o moleculă de acid p-aminobenzoic și una de acid glutamic. Legătura dintre nucleul pteridinic și acidul p-aminobenzoic se realizează printr-o punte metalică, iar legătura dintre acizii p-aminobenzoic și glutamic se face printr-o legătură peptidică.

fig.2.7.Structura moleculară a acidului folic

Proprietățile fizico-chimice

Acidul folic este o substanță solidă, cristalină, de culoare galbenă, greu solubilă în apă, piridină, fenol, metanol și insolubil în cloroform, benzen, eter și acetonă. Este optic activ dextrogir(+)16º, iar în mediu acid, la pH 4-12 este stabil. Acidul folic se descompune sub influența luminii și a razelor UV, rezultând acid pteridoxamin-6-carboxilic și alți compuși proveniți din catena laterală.

Acidul folic se prezintă sub formă de plăcuțe galbene, lenticulare, subțiri, birefrigerente, cu punct de topire la 250ºC.Prin autoclavare 30 minute, pierde 70% din activitate la pH 1.

Este incompatibil cu substanțe oxidante sau reducătoare deoarece se degradează.

Surse de vitamină B9

Acidul folic și derivații acestuia au o largă răspândire în alimente.Se găsesc în cantitate mai mare în ficatul animalelor, în frunzele plantelor superioare, în special în spanac, mazăre, germenii de grâu, drojdii, sfeclă, lămâi și în unele microorganisme.Conținutul acidului folic din plantele de porumb este de 11,5μg∕g,i ar în frunzele mature de 6-7μg∕g.

În ficatul de pui 370 μg%, iar în cel de porc 220 μg% acid folic.Cerealele conțin în medie 35μg% ,iar dintre fructe, lămâile 80μg%, bananele 30μg%, portocalele 23 μg%.Legumele au un conținut mai redus, fiind cuprins între 8 și 25 μg%.

Laptele de vacă conține cantități mici de acid folic.În timpul preparării alimentelor o parte din folați se distrug, dar în același timp se eliberează cele aflate în complexe inactive sau sub formă conjugată. Cantități mari de folați se pierd în timpul extragerii,la prepararea hranei în soluții apoase și prin fierbere.Uneori pierderile totale se ridică până la 85-90%.

Rolul vitaminei B9

Este un factor important pentru creșterea animalelor tinere și pentru diferite microorganisme.Este utilizat tot mai mult în lupta împotriva cancerului.Asigură funcționarea optimă a sistemului nervos.A manifestat efecte antiteratogene la animale tratate cu pirimetamină.

Acidul folic este utilizat cu succes în tratamentul anemiilor nutriționale la gravide.

El stimulează biosinteza globulelor albe și roșii, dar nu are acțiune asupra afecțiunilor nervoase ale acestor boli. Stimulează absorbția vitaminelor liposolubile.

Acidul folic se adaugă în numeroase produse alimentare pentru a le mări valoarea biologică, prevenirea anemiilor, buna funcționare a eritrocitelor și a sitemului nervos.

Se adaugă în special în produse de patiserie, pâine, sucuri, băuturi nealcoolice, cereale pentru micul dejun.

2.2.7. Vitamina B12 (cobalamina)

Vitamina B12 este indispensabilă pentru viața omului și a animalelor. Ea are o deosebită importanță în ce privește creșterea, hematopoieza și funcționarea celulei nervoase. În 1949, se reușește izolarea a două forme cristaline de vitamină B12 cu același efect în vindecarea anemiei pernicioase.O formă conținea gruparea cian și s-a numit cianocobalamina,iar altă formă conținea gruparea hidroxil și s-a numit hidroxicobalamina.Este un factor de creștere pentru numeroase microorganisme.Denumirea de cianocobalamină derivă din structura sa moleculară întrucât conține gruparea cian-,un atom de cobalt și grupări amidice.

Vitamina B12 se mai numește și cianocobalamina, antianemică, vitamina antipernicioasă, corinoidă, factor antipenicios, factor anemic extrinsec, factorul proteinelor la animale.

Dintre diverșii compuși de cobalamină care prezintă activitatea vitaminică, formele cele mai active sunt ciancobalamina și hidroxicobalamina.

Stabilirea structurii moleculare a vitaminei B12 s-a efectuat cu multă greutate, pe baza colaborării unor renumiți cercetători din mai multe domenii de activitate, folosind diferite metode moderne de cercetare ,o perioadă îndelungată de timp, din 1948 și până în 1973, când s-a realizat sinteza chimică totală a acestei vitamine.

Vitamina B12 are formula moleculară C68H90N14PCo și are masa moleculară 1490±140 în funcție de grupările funcționale legate de atomul de cobalt.Pe baza analizei compoziției chimice a vitaminei B12 s-a stabilit că în molecula acesteia se găsește un atom de Co(4,5%), un atom de P(2,34%), un număr egal de atomi de azot și de oxigen, precum și numeroși atomi de carbon și hidrogen, așa după cum reiese din formula menționată.

Din punct de vedere chimic vitamina B12 conține un nucleu porfirinic modificat numit nucleu corinic, o ribonucleotidă ce are ca bază azotată 5,6-dimetilbenzimidazolul și aminopropanol.

Compușii corinici cu Co³+ au culoare roșie, cei cu Co²+ au culoarea portocalie-brună, iar cei cu Co¹+ au culoarea verzuie, fiind instabili, ușori reoxidați la aer.

fig.2.8. Structura moleculară a cobalaminei

Proprietățile fizico-chimice

Cobalamidele sunt substanțe solide, cristaline, de culoare roșie, solubile în apă, etanol, metanol și insolubile în mediu acid (pH 4,5) și la cald. Nu rezistă la acțiunea oxidanților puternici, a acizilor și bazelor tari și a luminii.În soluție apoasă , vitamina B12 prezintă un spectru de absorbție caracteristic, cu maxime la 272,361 și 550 nm.Este optic activă, levogiră(-59º) și rezistă la încălzire 20 minute la 120ºC.Vitamina B12 se prezintă sub foma unor cristale aciculare, birefrigerente, de culoare roșu-închis, care conțin 8-12 % apă de cristalizare, fără punct de topire bine determinat.

Lumina, în special razele ultraviolete, descompun vitamina B12 aflată în soluție.

Este incompatibilă cu substanțe cu reacție puternic acidă sau alcalină, cu agenți oxidanți sau reducători, cu sărurile unor metale grele.

Surse de vitamină B12

Dintre sursele alimentare folosite de om mai bogate în vitamina B12 sunt ficatul (35-50μg∕100g s.u.), rinichiul(15-20μg∕100g), carnea(5μg∕100g), ouăle(3μg∕100g) și laptele(2μg∕100g), restul alimentelor au un conținut foarte mic de vitamină.

Ficatul de vițel, ficatul peștilor și al crustaceelor conține aproximativ 2,4 ppm∕g s.u..Un conținut relativ mai mare de vitamina B12 se găsește de asemenea în splină și în culturile unui mare număr de actinomicete și bacterii.

Produsele de origine vegetală sunt lipsite de această vitamină.Conținutul total al vitaminelor B12 se apreciază la oamenii adulți între 1 și 11 mg, cu o valoare medie de 3-5mg. Vitamina B12 este depozitată predominant în ficat, cu un conținut total de 1-10mg, iar o valoare medie de 1,5-2mg.În rinichi, inimă, splină, creier conținutul total al vitaminelor B12 este cuprins între 20-30 μg pentru fiecare organ.

Rolul vitaminei B12

Vitamina B12 împreună cu formele sale coenzimatice (5’-dezoxiadenozincobamida ,metilcobamida) au un rol esențial pentru om și animale în procesele de creștere, hematopoieză, menținerea integrității celulei nervoase precum și în reacțiile metabolice ale proteinelor, lipidelor și glucidelor.

Are un rol important în biosinteza porfirinelor inclusiv a hemoglobinei. Stimulează biosinteza fosfolipidelor la om și animale,are un rol însemnat și în metabolismul glucidelor, favorizând gluconeogeneza, stimulează metabolizarea fructozei, a glicogenului și a glicerolului.Vitamina B12 îndeplinește rolul unui compus intermediar în formarea globulelor sanguine, a tecii nervilor și a numeroase proteine.Această vitamină este esențială pentru formarea și dezvoltarea eritrocitelor, maturarea celulelor epiteliale, în special cele din tubul digestiv, precum și în biosonteza acizilor folici și în regenerarea acidului folic în timpul formării eritrocitelor.

2.2.8. Vitamina C (acidul ascorbic)

Vitamina C se mai numește acid ascorbic ,acid hexuronic,vitamină antiscorbutică.Este cea mai veche sesizată și mai bine cunoscută vitamină.

Denumită așa deoarece lipsa ei determină boala numită scorbut, ce se manifestă prin anemie, gingivite și diateză hemoragică (hemoragii articulare sau în organele interne).

Acidul ascorbic este lactona acidului L-glucuronic,pe care plantele și multe mamifere îl pot sintetiza pornind de la glucoză și galactoză.În organism se poate găsi sub formă redusă (acid ascorbic) și sub formă oxidată (acid dehidroascorbic).

Factorul hidrosolubil C a fost izolat prima dată din sucul de lămâie de către S.S. Yilva în perioada 1923-1925.

În 1932 se stabilește structura chimică a vitaminei C.În 1975 mai mulți cercetători din diferite țări arată caracterul antioxidant al vitaminei C și proprietatea acesteia de a neutraliza oxigenul singlet.

Vitamina C sau acidul ascorbic are formula moleculară C6H8O6, care sub aspect structural este γ-lactona acidului 2,3-dienol-L-gulonic ce se formează din acidul 2-ceto-gulonic.

Deși este un acid hexozic monocarboxilic nu are gruparea carboxilică liberă deoarece este blocată sub forma unei legături-OH enolice,de la carbonii C-2 și C-3, al căror atom de hidrogen poate fi ușor substituit cu metale.

Structura moleculară a vitaminei C se caracterizează prin prezența a două grupări –OH enolice vecine,la C-2 și C-3, între care există o dublă legătură, prezența unei grupări alcoolice primare la C-6 ți a unui hidroxil secundar la C-5 în poziție L,un ciclu furanic cu funcție lactonică format între atomii C-1 și C-4 și o catenă laterală formată din 2 carboni,legată de C-4.

fig.2.9.Structura moleculară a acidului ascorbic

Proprietăți fizico-chimice

Acidul ascorbic este o substanță solidă, se prezintă sub formă de pulbere albă cristalină, cu punct de topire la 192ºC(cu descompunere) fără miros și cu gust acru.Cristalizează din soluții apoase saturate sub formă de cristale monoclinice incolore.

Este o substanță optic activă dextrogiră, are un spectru de absorbție caracteristic, cu un maxim la 245 nm în soluție slab acidă și la 265 nm în mediu alcalin, fapt ce explică prezența unui sistem de duble legături conjugate, cu o grupare –OH enolizabilă.Este ușor solubilă în apă și metanol, greu solubilă în alcool etilic, acetonă și glocerină și insolubilă în eter , hidrocarburi alifatice și aromatice.

Principala proprietate a acidului ascorbic este caracterul său puternic reducător, adică ușurința cu care se poate oxida.Reprezintă cel mai puternic agent reducător din țesuturi.Creșterea metabolizării vitaminei C produce sporirea oxalatului și a uraților din urină.

Surse de vitamina C

Vitamina C este cea mai răspândită vitamină din natură. Se găsește atât în zarzavaturi cât și în citrice, sursa naturală principală constituind-o măceșele în care se găsește împreună cu așa-numitele flavonide care sporesc efectele acidului asboric.

În sucul fructelor citrice o bună parte din acidul ascorbic este combinată cu unii aminoacizi, vitamina PP și alte substanțe.În cantitate mai mare, acidul ascorbic se găsește în fructele citrice (lămâi, portocale, mandarine, rodii),măceșe, coarne, coacăze negre, fructe de cătină, nuci necoapte, frunze, mere.Conținutul acidului ascorbic variază la plantele furajere tinere între 4,25-5,66mg∕g, iar la cele mature între 0,7-1,1mg∕g .Cerealele au un conținut de acid ascorbic mult redus.

Un conținut ridicat în acid ascorbic îl au glandele suprarenale, hipofiza, ficatul, rinichii.În suprarenalele de bou, acidul ascorbic se găsește în cantitate de 150-270mg%, iar la porc de 90-200mg%. Conținutul mediu de vitamina C al unor alimente raportat la 200g aliment:brocoli 90mg, lămâi 53mg, portocale 50mg, coacăze negre 177mg, măceșe 1250mg, ardei 139mg.

Produsele vegetale pierd prin păstrare o cantitate însemnată de acid ascorbic.În cazul păstrării acestora la temperaturi scăzute, degradarea vitaminei C este minimă. Cartofii prin păstrare la temperatura camerei pierd aproximativ 15% din conținutul vitaminei C la fiecare lună, iar prin fierbere decojiți pierd 30-50%.

Rolul vitaminei C

Vitamina C are un rol multiplu și complex în organismele animale și vegetale.Ea are un rol esențial în formarea și menținerea integrității colagenului, în hematopoieză și metabolismul fierului, influențează activitatea deferitelor sisteme enzimatice cu rol fundamental în metabolismul glucidelor, lipidelor, protidelor, a aminoacizilor aromatici ,hormonilor steroidici, în biosinteza și funcționarea acizilor folici.

Are de asemenea un rol deosebit de important în reacțiile de oxidoreducere, din organism, în activitatea creierului, ficatului, glandelor endocrine, în metabolismul acizilor grași, a colesterolului și a acizilor biliari, mărește imunitatea organismului și rezistența la infecții, previne formarea unor substanțe cancerigene, inclusiv a nitrozaminelor în stomac.Vitamina C are un rol important în calcifierea dinților, în creșterea tonusului mușchilor netezi și în scăderea contractibilitășii mușchilor striați.Mărește rezistența organismelor la oboseală, frig, infecții, intoxicații.Are rol important în biosinteza hormonilor steroidici sexuali și corticosuprarenali.Vitamina C are efecte favorabile în tratarea alergiilor,intoleranța la unele medicamente pentru mamrirea rezistenței organismului la infecții,intoxicări,agenți poluanți,agenți mutageni și cancerigeni.

2.2.9. Vitamina H (biotina)

Biotina este o vitamină importantă pentru om,majoritatea animalelor și pentru numeroase microorganisme.În decursul timpului biotina a fost denumită bios II,bios II B,factorul X, factorul W , vitamina B8,vitamina H,coenzima R,denumiri vechi scoase din actuala nomenclatură ,având doar o semnificație istorică.Cu toate că se cunosc opt forme de biotină, numai D-biotina se găsește larg răspândită în natură și prezintă activitate vitaminică.Reprezintă un extract total de drojdii, practic un amestec de substanțe, care stimulează creșterea drojdiilor, a unor ciuperci și a numeroase microorganisme. Denumirea de vitamina H atribuită biotinei, s-a datorat proprietății acesteia de a împiedica intoxicarea animalelor cu ou crud și de a proteja pielea,fiind numită și vitamina de protecție a pielii.

Sub aspect structural se cunosc două biotine naturale,cu activitate vitaminică, numite α- și β-biotina.Ele sunt substanțe izomere cu aceeași formulă moleculară C10H16O3N2S, dar se deosebesc prin punctul de topire, activitatea optică și structura catenei laterale.

Biotina extrasă din ou se numește α-biotina , iar cea extrasă din ficat β-biotina.

Ambele biotine au o structură complexă, fiind formate prin condensarea unui heterociclu imidazolic,cu un ciclu tiofenic,la care se găsește o catenă laterală de acid valerianic pentru β-biotină și respectiv acid izovalerianic pentru α-biotina.Ambele biotine conțin o grupare carboxilică liberă,un ciclu pirimidinic cu 2 atomi de azot,un ciclu tiofenic cu un atom de sulf,care provin dintr-o legătură tioeterică.

fig.2.10. Structura moleculară a biotinei.

Proprietăți fizico-chimice

Biotina se prezintă sub formă de cristale aciculare incolore,cu puncte de topire diferite pentru α- și β-biotina, α-biotina are punctul de topire la 230ºC,iar unghiul de rotație a luminii monocromatice de (+)51º, β-biotina are punctul de topire la 232-233ºC în mediu bazic(NaOH 0,1n).Biotina liberă este ușor solubilă în apă caldă și în soluții bazice diluate.

Biotinele sunt inactivate de către baze alcaline și acizi tari, sub acțiunea cărora se transformă în sulfoxizi sau sulfone.Biotina are caracter de acid slab.Biotina are capacitatea de-a se uni cu proteine și peptide ,formând complexe stabile , neabsorbite prin intestin.

Surse de vitamină H

Biotina este una din vitaminele cele mai răspândite în produsele alimentare naturale,neprelucrate industrial.Gălbenușul de ou,rinichii,ficatul,drojdiile,cojile cerealelor,carnea de morun,reprezintă surse importante de biotină.

În plante,cu excepția boabelor de cereale și a nucilor, biotina se găsește predominant în stare liberă, solubilă în apă, în timp ce în carne, drojdii, nuci, cojile cerealelor se găsește predominant sub formă de complexe proteice,insolubile în apă.Conținutul de biotină din galbenușul de ou este de 300μg∕100g, în ficat de porc și vacă de 250μg∕100g, în drojdia de bere de 7 μg∕100g, mazăre verde 1,1 μg∕100g, struguri 3,5μg∕100gConținutul biotinei din plantele furajere uscate este de 16-40 μg∕100g,iar în fructe între 0,01 și 19 μg∕100g.În timpul preparării alimentelor,conținutul de biotină scade cu aproximativ 20%,dar în același timp prin fierberea și prăjirea alimentelor,proteinele se degradează și nu pot forma cu biotina complexe naebsorbabile, rezistente la acțiunea enzimelor hidrolitice din tubul digestiv.

Rolul vitaminei H

Vitamina H are un rol important în creșterea și funcționarea normală a organismelor animale și vegetale.Are un rol cheie în metabolismul glucidelor, lipidelor și al proteinelor, precum și în metabolismul energetic celular. Are de asemenea un rol însemnat în stimularea biosintezei vitaminei C.

Biotina contribuie la biosinteza acidului oleic.Are un rol biochimic multiplu,putând să catalizeze reacții de carboxilare,decarboxilare,dehidrogenare și dezaminare,în funcție de sistemul enzimatic în care este inclusă.

III .CONTRIBUȚII ORIGINALE

3.1.SCOP ȘI OBIECTIVE

Am ales drojdia de bere datorită proprietăților sale antianemice, antitoxice, stimulante, remineralizante etc. întărește sistemul imunitar și combate bolile infecțioase. Favorizează asimilarea alimentară și este un catalizator pentru substanțele hidrocarbonate. Combate tulburările digestive: constipație, diaree, colite. Este foarte eficientă în avitaminoze, denutriție, slăbiciune. Ajută la creștere, rahitism, sportivilor le mărește rezistența la oboseală, favorizând travaliul muscular și ușurând eliminarea de toxine.

Scopul acestei lucrări a fost

În primul rând stabilirea unui protocol HPLC de separare a vitaminelor hidrosolubile din complexul vitaminic B, utilizând diferite sisteme de eluare și diferite metode de extracție a acestor compuși.În acest sens s-au testat trei sisteme de separare a vitaminelor ,dintre care s-a ales unul singur pentru experimentele următoare.

În al doilea rând s-a încercat separarea vitaminelor hidrosolubile din drojdia de bere de fermentație primară și secundară,deoarece această matrice este bogată în acești compuși.

3.2. MATERIALE

Babilonienii au fost primii oameni care au fabricat bere din boabe de orz măcinate și tot ei au fost primii care au descoperit efectele benefice asupra pielii ale sedimentelor din ulcioarele de fermentație, cu alte cuvinte efectele benefice ale drojdiei de bere.

Răspindirea berii în Egipt, Etiopia, Europa, a însemnat și descoperirea altor beneficii pe care le poate oferi drojdia de bere. Hipocrate recomanda drojdia de bere ca diuretic, iar în Evul Mediu, era utilizată în scopul prevenirii leprei.

Abia în secolul al XIX-lea, drojdia de bere a început să fie prescrisă de către medici pentru combaterea furunculozei, revigorarea organismului la adulți sau copiilor anemici.

Babilonienii aveau o zeiță a berii și a drojdiei de bere, Nidaba, recunoscută prin puterile ei terapeutice. Egiptenii și celții foloseau drojdia de bere pentru prepararea băuturilor slab alcoolizate, dar cunoșteau și acțiunile benefice ale acesteia asupra tenului și a pielii în general.

Mai tîrziu, Pliniu, marele naturalist român, povestește că Hipocrate, celebrul medic grec, ar fi descoperit, în jurul anului 370 î.e.n, acțiunea diuretică a drojdiei de bere, pe care o recomanda ca remediu. În Evul Mediu, călugării care îi supravegheau pe leproși luau drojdie de bere în scop preventiv. Era folosită și contra scarlatinei și rujeolei .

Tab.3.1. Aportul enegetic al drojdiei de bere comparativ cu diferite produse alimentare

Căldura mare și lumina duc la degradarea drojdiei. În stare crudă, drojdia de bere conține o combinație perfectă de substanțe nutritive: 50 % proteine, 30 % glucide, 5 % lipide, toti acizii indispensabili vietii, diastaze, mult gluten si peptide (cu acțiune preponderentă în fenomenele vitale, în reacțiile de oxido-reducere, în dezintoxicare), lecitină sau grăsimi fosfarate, zaharuri, săruri minerale, vitamine.

Termenul de vitamine a fost introdus în 1912 de Casimir Funk, pentru a denumi anumiți microfactori ai alimentelor, necesari pentru viață. Denumirea vitaminelor s-a făcut inițial cu majuscule și/sau printr-o nomenclatură care descria funcția pe care o îndeplineau, denumirea corectă este în prezent cea corespunzătoare structurii lor chimice, deși varianta cu litere este adeseori preferată deoarece ea poate grupa diverși compuși, așa cum este cazul vitaminelor din complexul B sau al majorității vitaminelor liposolubile.

Toate vitaminele B sunt necesare înmulțirii și funcționării normale a celulelor.Din grupa sau complexul vitaminelor B fac parte vitaminele B1, B2, B6, B12, acidul pantotenic (vitamina B5) , nicotinamida (vitamina B3), vitamina H (vitamina B8,biotina), colina.

După rolul și activitatea lor biologică, vitaminele din complexul B se pot clasifica în:

Vitamine de creștere (vitaminele B1 și B2)

Vitaminele dermatrope (vitamina PP pentru om, B6 pentru șobolani, acidul pantotenic pentru păsări)

Factori de creștere a microorganismelor (biotina, vitamina H)

Antiaminice (vitamina B12, acizii folici și folinici)

Pentru vitamina B1 se poate folosi ca metodă de analiză și metoda fluorimetrică, care se bazează pe măsurarea fluorescenței tiocromatului în lumină ultravioletă.Tiocromul se obține prin oxidarea vitaminei B1 cu K3[Fe(CN)6] și alți oxidanți stabili în soluție alcalină(pH 10),iar la lumină ultravioletă prezintă o fluorescență albastră.La 1 ml soluție de vitamina B1 se adaugă 0,5 ml fericianură de potasiu 2%,1 ml sol. NaOH 30% și 1 ml soluție de butanol.După ce se agită conținutul acestora se pune eprubeta în lumină ultravioletă și se observă că stratul alcoolic prezintă o intensă fluorescență albastră,care dispare prin acidulare și reapare la alcanizare.

În afară de metoda fluorimetrică, se mai poate utiliza,ca metodă de analiză, și metoda spectrofotometrică.Aceasta se bazează pe determinarea spectrului de absorbție a vitaminei B1 care în lumină ultravioletă prezintă un maxim la 265 nm.În soluție de NaOH 4% vitamina B1 dă un maxim de absorbție instabil la 340 nm.

Dintre metodele fizice de analiză,pentru analiza vitaminei B2,sunt frecvent utilizate metodele spectrofotometrice.Ele se bazează pe înregistrarea spectrului de absorbție care prezintă maxime de absorbție la 445, 372, 369 și 225 nm,caracteristice riboflavinei.Se mai utilizează și metodele cromatografice pe coloană,în strat subțire sau pe hârtie .

Acidul nicotinic prezintă în soluție apoasă un spectru de absorbție caracteristic,cu maxime de absorbție la 237-262 nm.

La analiza cu ajutorul metodelor spectrofotometrice. vitaminele B6 prezintă spectre de absorbție caracteristice, având absorbția maximă la 291 nm în UV și în soluție de HCl 0,1N, în soluție tampon la pH 7 prezintă maxime de absorbție la 254 și 324nm.

Acidul folic se poate determina fluorimetric în urma transformării sale într-un compus fluorescent,prin oxidare cu KMnO4 și iradiere cu lumină UV,având maxim de absorbție la 265 nm.

Vitaminele B12 se pot identifica prin metode fizice, chimice,biologice și microbiologice.

Dintre metodele fizice o utilizare mai mare o au metodele spectrofotometrice și cele polarimetrice.Vitamina B12 prezintă în soluție, maxime de absorbție la 278, 361 și 550 nm.

Cele mai utilizate metode fizice de analiză pentru vitamina C sunt cele spectrofotometrice, polarometrice, fotometrice, cromatografice și radiometrie.În soluții slab acide,vitamina C are un maxim de absorbție la 254 nm,iar în soluții alcaline la 265 nm.

Metodele fizice și chimice sunt puțin utilizate pentru identificarea biotinei.Uneori se folosesc metode polarografice,cromatografice și spectrofotometrice, în reacția cu 4-dimetilaminobenzaldehida.

3.3 METODE DE ANALIZĂ

3.3.1. Spectrometria de absorbție în UV-VIS

Una dintre primele metode instrumentale apărute și utilizate frecvent în practica

laboratoarelor de analize chimice din zilele noastre este metoda bazată pe absorbția luminii din domeniul vizibil (domeniu notat în literatura internaționala VIS). Se cunosc mai multe variante importante pentru această metodă: colorimetria, fotometria și spectrofotometria.

Colorimetria, una dintre tehnicile extrem de mult utilizate în practica analitică,

reprezintă varianta în care intensitatea culorii probei se compară vizual sau instrumental, în lumină albă, cu un set de soluții etalon – preparate în condiții absolut identice cu proba.

Aceasta este o metodă subiectivă și mai puțin selectivă, pentru că rezultatele depind mult de persoana care execută analiza. Se remarcă faptul că sensibilitatea maximă a ochiului omenesc atinge maximul pentru domeniul 550-560 nm (domeniul culorii verzi), lucru important când compararea probei cu etalonul se face vizual. În această tehnică se pot realiza măsurători, prin comparație vizuală, chiar în eprubetă la lumina zilei, rezultând analize chimice cu exactități mai slabe decât 1%. Cu cât există mai multe soluții etalon, pentru comparație, cu atât metoda este mai exactă.

Există, după cum am amintit și metode colorimetrice instrumentale, obiective, dar acestea sunt tot mai puțin folosite. În schimb se folosesc aparate ieftine care utilizează metode colorimetrice bazate pe reacții executate pe hârtie de filtru, pe substanțe aflate în stare adsorbită pe suporturi granulare – în cazul gazelor – și chiar pe reacții de culoare în soluții.

Fotometria și spectrofotometria măsoară instrumental lumina transmisă de o soluție colorată lucrând cu o sursă de lumină monocromatică. Când lumina incidentă este filtrată, prin filtre optice, având un spectru mai larg, avem de a face cu o fotometrie iar când domeniul filtrat este mai îngust (utilizând monocromatoare) vorbim de spectrofotometrie. În ultima variantă, este posibilă fixarea mai precisă a lungimii de undă la care se lucrează.

Cu ambele variante se poate chiar trasa un spectru de absorbție, adică o curbă, obținută prin măsurarea semnalului în funcție de lungimea de undă a radiației incidente. În literatura de specialitate uneori se folosește pentru ambele metode și denumirea de metodă colorimetrică (sau chiar spectrocolorimetrică), ceea ce uneori poate crea confuzii. În domeniul UV, ochiul omenesc nepercepând lumina, se utilizează doar spectrofotometria.

Întrucât principiile sunt identice iar aparatele sunt în multe privințe similare în cele două domenii, în ultimul timp, în afară de aparatele dedicate domeniului VIS sau a celor pentru UV, de multe ori se utilizează un singur instrument pentru ambele intervale de lungimi de undă, ceea ce a dus la denumirea din titlu.

Construcția instrumentelor are în general două variante anume spectrofotometrele monocanal, cu un singur drum optic și cele comparative, prevăzute cu două canale. În spectrometrele comparative printr-o singură măsurătoare, proba etalon cu cea de analizat se compară utilizând două radiații care-și au originea în aceeași sursă (coerente).

Se observă (fig. 3.1.) că radiația incidentă, monocromatică, realizată cu ajutorul

monocromatorului M, trece prin cuveta cu probă, C, unde intensitatea scade față de situația în care în locul probei de analizat se pune o așa-numită probă martor (sau probă oarbă) – o probă de referință de concentrație zero.

Apoi fascicolul cade pe detectorul D, unde semnalul optic este transformat în semnal electric. Semnalul rezultat, după o amplificare, poate fi în final măsurat și înregistrat.

Înregistrat nu mai înseamnă astăzi întotdeauna preluarea semnalului cu un înregistrator ci mai degrabă introducerea acestuia în memoria unui calculator urmând de regulă prelucrarea automată a datelor.

fig.3.1.Redarea schematică a unui spectrofotometru de absorbție cu elementele sale componente

Materialele din care se confecționează diferitele părți componente ale spectrofotometrelor sunt prezentate în tabelul 3.1.

Tab.3.1. Componentele unui spectrofotometru de absorbșie în vizibil și ultraviolet

Se poate remarca faptul că detectorii sunt identici iar cuva de cuarț permite lucrul în ambele domenii. Doar sursele diferă. Prin înglobarea ambelor surse – lampa cu deuteriu și cea cu wolfram – în același instrument, funcționând consecutiv, s-a reușit realizarea spectrofotometrelor UV-VIS.

Legea Lambert – Beer

Această lege reprezintă legea de bază folosită în analizele sau determinările spectrofotometrice.Să considerăm o radiație incidentă monocromatică, Io, care cade pe o celulă conținând proba. Celula are lungimea l iar concentrația substanței ce absoarbe lumina, C. Conform schiței din fig.3.2., intensitatea finală, I, este mai mică decât cea inițială, Io în urma absorbției luminii, la trecerea prin celulă.

Fig.3.2.Absorbția luminii ăn cazul legii Lambert-Beer

Dacă lungimea l provoacă o reducere cu un anumit procent a intensității inițiale, Io, de

exemplu cu 50%, un nou strat de lungime l, egală cu primul, va acționa, conform legii Lamber- Beer, în același mod, adică va diminua tot la jumătate noua radiație incidentă.

Forma cea mai utilizată dar și cea mai simplă a legii Lambert – Beer este:

A = εlC

Coeficientul molar de extincție reprezintă absorbanța unei soluții de concentrație 1 mol/l dacă lungimea celulei cu probă este 1 cm. Legea este riguros respectată doar pentru o radiație monocromatică. Deci, cu cât filtrul optic este mai îngust, ca domeniu spectral, cu atât liniaritatea dreptei se respectă pe un domeniu mai larg de concentrații.Dar un filtru cu domeniu spectral îngust lasă să treacă puțină lumină și performanțele metodei sunt condiționate și de performanțele detectorului.

În general, peste nivele de concentrație de 10-2 mol·L-1 curba de etalonare își modifică panta (de regulă aceasta scade).

De aceea, metoda este adecvată mai ales pentru soluții diluate și nu este o metodă potrivită pentru analize de componente majore (adică substanțe aflate în concentrații de peste 10%) din orice fel de probe.

Spectre de absorbție

Spectrele de absorbție reprezintă dependența semnalului de lungimea de undă, λ.Există mai multe variante de prezentare dar cea mai utilizată este varianta reprezentării absorbanței în funcție de lungimea de undă: A = f(λ). Celelalte variante, mai puțin utilizate -numite toate spectre de absorbție – sunt T = f(λ), log A = f(λ), ε = f(λ) sau log ε = f(λ).

Ultimele două servesc în special pentru caracterizarea speciilor moleculare întrucât nu mai depind de condițiile experimentale în care se fac determinările acestor spectre.

Fiecare substanță are un spectru de absorbție caracteristic, ca formă generală, ca domeniu spectral, ca număr de maxime (denumite picuri) precum și ca raporturi între intensitățile diverselor picuri. Poziția picului este caracterizată de valoarea sa maximă, λmax . Se numește maxim de absorbție atât vârful ca atare cât și lungimea de undă care corespunde maximului. Pot exista unul sau mai multe maxime de absorbție. Numărul de maxime precum și forma generală a curbei, reprezintă caracteristica calitativă după care se pot identifica substanțele.

Analiza chimică calitativă se bazează pe compararea spectrelor de absorbție ale substanțelor sau materialelor în domeniul UV-VIS, adică 180-1100 nm cu spectre cunoscute.

Acest procedeu permite identificarea unui anumit număr de specii chimice, dar numai pentru acele substanțe care absorb în acest domeniu. În chimia organică, de exemplu, absorb în acest domeniu perechile de electroni de valență angajați în legături σ și π precum și perechile de electroni neparticipanți. Pentru că în cursul acestor tranziții apar modificări ale polarității legăturii respective, aceste spectre au primit numele de spectre cu transfer de sarcină. Fiecare tranziție are asociată o lungime de undă caracteristică (unde va apărea un maxim) și un coeficient molar de absorbție, ε, corespunzător. Acestea se datorează unor „salturi” ale electronilor de valență, adică a electronilor situați pe straturile exterioare ale atomilor angajați în legături chimice.

În substanțele formate din molecule covalente se cunosc așa-numitele grupări cromofore sau auxocrome, care sunt grupări de atomi care dau întregii molecule calitatea de a absorbi lumina – în cazul de față, în domeniul UV-VIS. O grupare cromoforă reprezintă locul din moleculă unde-și au originea tranzițiile electronice. S-a mai introdus și termenul de cromogen care constituie ansamblul dintr-un schelet molecular pe care se găsesc grefați mai mulți cromofori. Pentru o serie de molecule, toate având legate același cromofor, poziția și intensitatea benzilor de absorbție rămân în mare aceleași. Mai mult, dacă o moleculă conține mai multe grupe cromofore izolate, mai exact separate între ele prin cel puțin două legături simple, se poate observa suprapunerea efectelor individuale.

Sursele luminoase cele mai obișnuite utilizate în domeniul UV-VIS, sunt lampa cu

incandescență prevăzută de obicei cu filament incandescent de W – deosebindu-se de becurile

electrice obișnuite prin aceea că zona de ieșire a radiației este confecționată din sticlă de cuarț

– și lampa cu deuteriu prevăzută cu arc de descărcare în deuteriu, aflat la o presiune medie

(ceea ce asigură un spectru continuu). Un spectrometru prevăzut cu ambele surse, poate acoperi tot domeniul UV-VIS.

Instrumentația

Așa cum s-a arătat, orice spectrofotometru reprezintă o reuniune de 4 părți componente distincte: (1) sursa, (2)sistemul dispersiv sau monocromatorul, (3) detectorul și(4) înregistratorul.

Ultimul, poate fi un simplu dispozitiv de citire a rezultatului înregistrarea făcându-se manual. Există o gamă foarte largă de spectrofotometre, deosebirea constând în domeniul de lungimi de undă acoperit, în puterea de dispersie a monocromatorului, în natura detectorului, în mediul optic traversat sau chiar în principiul de construcție al instrumentului în ansamblu.

Sursele luminoase cele mai obișnuite utilizate în domeniul UV-VIS, sunt lampa cu incandescență prevăzută de obicei cu filament incandescent de W – deosebindu-se de becurile electrice obișnuite prin aceea că zona de ieșire a radiației este confecționată din sticlă de cuarț – și lampa cu deuteriu prevăzută cu arc de descărcare în deuteriu, aflat la o presiune medie (ceea ce asigură un spectru continuu). O astfel de lampă, a cărui punct de descărcare este zona cenușie din interiorul cutiei mari,permite obținerea unui spectru continuu pe domeniul 160-400nm, care se completează foarte bine cu spectrul becului cu incandescență. Un spectrometru prevăzut cu ambele surse, poate acoperi tot domeniul UV-VIS. Razele de lumină trec prin aer, dar mai nou dirijarea acestora se face și prin fibre optice.

Sistemul dispersiv sau monocromatorul poate fi, în vizibil, un filtru colorat din sticlă sau material plastic transparent dar și un filtru cu interferență, iar în UV-VIS o prismă confecționată din cuarț sau, în ultimul timp, sisteme bazate pe rețele plane sau concave cu circa 1200 trăsături per mm. Aceste rețele sunt integrate în monocromatoare care permit extragerea unei zone înguste din spectrul UV-VIS, printr-o simplă deplasare a oglinzii .

Lățimea domeniului spectral care trece prin monocromator depinde mult de lățimea fantelor de intrare și ieșire. Cele mai bune rezoluții se obțin prin utilizarea unor oglinzi prevăzute cu distanțe focale mari (0.2-0.5m). Detectorul transformă semnalul luminos în semnal electric.

Acest dispozitiv dă așadar un semnal proporțional cu intensitatea care iese din celula de măsură. Intensitatea semnalului recepționat va depinde de lungimea de undă – deci de lungimea de undă selecționată prin poziția oglinzii – dar și prin deschiderea fantelor de intrare, respectiv de ieșire, din monocromator.

Acestea din urmă, limitează domeniul spectral dar și intensitatea luminii, în ansamblu. De aceea fiecare modificare de deschidere a fantelor sau de lungime de undă modifică și intensitatea măsurată de spectrofotometru.

De-a lungul timpului s-au impus două tipuri de detectori: tuburile fotomultiplicatoare și dispozitivele semiconductoare (care pot fi, la rândul lor, detectori cu transfer de sarcină -CCD , în l. engl.- sau fotodiode cu siliciu – CID).

Fotomultiplicatoarele sunt niște dispozitive ultrasensibile al cărui domeniu liniar se întinde pe 7 decade și care au fost până nu demult cele mai utilizate. Pentru spectrofotometrele de rutină, fotodiodele sunt cele mai utilizate. În ultimul timp au apărut detectoarele cu rețelele de diode care constituie de fapt niște diode de dimensiuni mici înșirate pe aceeași placă. În acest caz nu mai este nevoie de fanta de ieșire, ceea ce a simplificat întrucâtva instrumentația (fig.3.3.).

fig.3.3.reprezentarea schematică a unui spectrofotometru cu rețea de diode

fig.3.4.schema bloc a unui spectrofotometru monocanal.Prin proba(3) se înțelege atât proba de analizat ,cât și cea de referință

Spectrometrele monocanal, a căror schemă bloc este prezentată în fig. 14, sunt cele mai utilizate în aplicațiile de rutină. De regulă în calea razei incidente se plasează succesiv proba martor sau de referință (care conține solventul plus eventual reactivii necesari pentru analiză) și proba de analizat.

Spectrometrul cu rețea de diode care are avantajul că permite recepția simultană a întregii game spectrale într-un interval de timp decâteva milisecunde.

Spectrometrele bazate pe comparație (cu dublu canal) sunt cele mai performante spectrofotometre cunoscute. În acestea, după despărțirea razei incidente, monocromatice în două fascicule, una dintre acestea traversează proba iar alta, simultan sau secvențial, traversează celula de referință care conține proba martor.

Spectrometria fotoacustică

O variantă indirectă a spectrometriei de absorbție nu măsoară lumina absorbită de

către probă ci schimbarea stării termice a acesteia în urma procesului de absorbție. În fond

este tot o măsurătoare indirectă a luminii absorbite, cu singura deosebire că mărimea măsurată

nu este una optică.

Modificarea ce are loc în probă nu este doar termică, ci termodinamică, adică sunt

implicați toți parametrii legați de temperatură, de exemplu, presiunea sau densitatea probei.

Metodele fotoacustice fac apel tocmai la modificările de presiune sau de densitate ale probei

ca urmare a absorbției luminii. De aceea nu are importanță dacă gazul, lichidul sau solidul

supus măsurătorii provoacă o modificare a direcției luminii din drumul optic, de exemplu

conține neomogenități sau particule opace (fum, ceață, pulberi în suspensie etc.), precizia

metodei rămânând neafectată.

Cu ajutorul acestei tehnici, soluțiile de coloranți pot fi analizate pe domenii liniare de

circa 10 ori mai largi decât măsurând absorbanța optică la aceeași lungime de undă (de ex.

la 523nm ) și s-au pus la punct metode pentru analiza fumului rezultat din motoarele

Diesel (lucrându-se la 800nm). De asemenea, s-a mai constatat că semnalul crește liniar cu

energia pulsului de energie a radiației laser.

3.3.2. Spectrometria de absorbție în IR

Domeniul infraroșu (IR) al spectrului undelor electromagnetice conține radiații cu lungimi de undă cuprinse între 0.8 și 1000 μm.

La ora actuală se cunosc și se aplică un grup de metode de analiză chimică care valorifică semnalele obținute prin absorbția radiațiilor din acest domeniu. Domeniul amintit, poate fi divizat la rândul său în trei subdomenii: IR apropiat (între 0.8 și 2.5μm), IR-mediu (între 2.5-25μm) și IR-îndepărtat (peste 25μm).

Domeniul mediu se mai numește și IR fundamental. Acesta este cel mai bogat în informații și cel mai accesibil experimental. În vorbirea obișnuită este domeniul IR care servește în mod curent atât pentru analiza chimică cât și pentru recunoașterea calitativă a combinațiilor anorganice, organice sau naturale dar și în determinări de structură chimică.

Domeniul IR apropiat, destul de sărac în benzi de absorbție specifice anumitor legături, are o importanță mare tocmai în aplicații cantitative ale lichidelor. Domeniul IR îndepărtat este încă în studiu.

Există la ora actuală o diversitate de metode de analiză bazate pe spectrele IR. Astfel

există spectrometre bazate pe dispersie după lungimea de undă, sau bazate pe transformata Fourier, diverse analizoare industriale simple, nedispersive – ultimele specializate doar pe anumite combinații chimice – precum și spectrometre de proces care fac analize, în mod continuu, pe anumite linii tehnologice de gaze sau lichide. În fine, există spectrometre IR portabile care permit analiza unor poluanți ai mediului.

Absorbția în IR se datorează interacțiunilor dintre radiația electromagnetică incidentă și anume componenta electrică a acesteia, cu dipolii electrici ai unei molecule. Se admite astăzi că energia radiațiilor IR provoacă o amplificare a energiei de vibrație a moleculelor datorită faptului că dipolul corespunzător legăturii oscilează cu o frecvență apropiată cu cea a componentei electrice amintite. Amintim că într-o moleculă, în mod natural, atomii componenți execută mișcări de vibrație de-a lungul legăturii în timp ce molecula se rotește.

O intensificare a mișcării de vibrație duce la o alungire și simultan, la o slăbire a legăturii dar și la o intensificare a mișcării de rotație. În acest fel se explică de ce, în absența oricărui dipole permanent, nu apare nici un cuplaj cu unda electromagnetică și nu are loc nici o diminuare a intensității radiației IR incidente.

Sau, altfel spus, gazele monoatomice (gazele rare) și substanțele cu moleculele simetrice (ca de exemplu O2, N2, Cl2), având legături nepolare, sunt perfect transparente la radiațiile din domeniu IR. În moleculele poliatomice posibilitățile de apariție ale spectrelor IR sunt mai mari deoarece aici vibrațiile asimetrice pot duce, chiar în moleculele nepolare, la apariția unor dipoli electrici, iar posibilitățile de apariție ale unor vibrații de deformare (de modificare a unghiurilor dintre legături în afara celor de alungire) se măresc.

Pe de altă parte, intensitatea unei benzi de absorbție în IR este proporțională cu pătratul variației momentului dipolar al moleculei, datorită absorbției. Se știe că în general grupele polare (C-O, C=O, C-Br etc.) generează benzi de absorbție mai intense decât cele slab polare (C-N, C=N, C-H etc.).

Se mai știe din studiul fizic al spectrelor că energia mecanică totală, a unei molecule

izolate, poate fi aproximată printr-o reuniune de trei termeni (toți cuantificați) -corespunzând energiilor de rotație, de vibrație și a electronilor de legătură – care se poate reda prin ecuația:

Despre mișcarea de vibrație am amintit câte ceva în aliniatele precedente. Energia de rotație se referă la rotația moleculei în jurul centrului de greutate și valorile cu care variază această energie sunt cu mult mai mici decât în cazul vibrației, care la rândul ei este mai mică decât cea a electronilor de legătură.

Aceștia din urmă interacționează în special cu radiația din domeniul UV-VIS. Cei trei termeni, care apar adesea simultan în spectre, sunt foarte diferiți ca valoare energetică și se poate considera că cei trei variază independent unii de alții.

Această aproximație este posibilă pe baza teoremei Born – Oppenheimer, care permite o abordare simplificată a problemei .

Mișcarea de vibrație a unei legături dintr-o moleculă poate să fie asimilată unei deplasări asemănănătoare cu un arc spiral – situat în direcția legăturii. Mișcarea ritmică a acestuia, de-a lungul legăturii, duce la creșterea, respectiv scurtarea distanței interatomice.

Totodată, poate să ia și aspectul unei deformări (sau îndoiri) a legăturii, care implică deplasarea atomilor în afara axei dintre aceștia. Numărul mare de legături duce implcit la un număr mare de benzi.

Amintim de asemenea, că experimental nu s-au observat spectre de linii pentru compuși în fazele condensate (lichidă sau solidă), în schimb sunt frecvente astfel de linii în fază gazoasă. Motivele sunt tocmai interacțiunile dipol-dipol, dintre molecule aflate în fază condensată, precum și solvatarea reciprocă între acestea, lucru care implică, foarte probabil, perturbații ale nivelelor energetice ale legăturilor chimice individuale.

Pe de altă parte, lărgirea unei linii este invers proporțională cu durata stării excitate. Această durată fiind mai scurtă în stările condensate, liniile spectrale IR ale lichidelor și solidelor se lărgesc suplimentar, predominând benzile de absorbție.

fig.3.5. Cele două tipuri de vibrații a unei legături covalente polare implicate în absorbție IR

Aparatura

Primele instrumente comerciale pentru domeniul IR au apărut încă din anii 1940.Diversitatea extraordinară de aparate utilizate astăzi în cele mai diferite domenii se poate

împărții în trei categorii:

Fotometre nedispersive bazate pe filtre simple formate uneori chiar din gazele de analizat.Aceste pot fi monocanal sau comparative.

Spectrometre bazate pe dispersia luminii (folosind prisme sau monocromatoare bazate pe difracție și interferență) și care pot fi prevăzute cu două canale sau monocanal (cu sau fără chopper).

Spectrometre bazate pe transformata Fourier, care permit intrarea în celulă a întregului domeniu spectral și care sesizează interferometric liniile caracteristice de absorbție. Aceste instrumente, datorită unei rezoluții mai bune și a rapidității, datorate cuplării cu calculatorul, în ultimul timp au devenit preferate.

3.3.3.Cromatografie

Cromatografia este o metodă fizico-chimică modernă, considerată nu doar o metodă de

separare, în majoritatea variantelor ea prezintă o metodă analitică hibridă, care îmbină separarea cu

identificarea ulterioară și dozarea componenților depistați în amestecurile complexe.

Conform aprecierii experților, cromatografia se consideră una din cele 20 descoperiri

importante ale secolului XX, care au contribuit cel mai mult la reformarea științei, iar prin prisma ei

se determină nivelul de dezvoltare al industriei și tehnicii, civilizației în întregime . Totodată,

prezintă o ramură a analizei instrumentale cu un larg spectru aplicativ în majoritatea domeniilor și

nici o metodă analitică nu concurează cu cea cromatografică, la momentul dat, după aplicarea

universală și eficacitatea separării celor mai compuse amestecuri.

Primele descrieri ale procesului de separare sunt întâlnite în lucrările chimistului german Runge

de prin anul 1850 și ale altor savanți, dar în fine ei n-au reușit să formeze o disciplină științifică. Fondatorul metodei cromatografice se consideră Mihail Țvet, botanic și chimist rus, dotat cu

anul 1903, care a efectuat primele încercări de separare în domeniul coloranților vegetali pe o

coloană de oxid de aluminiu .

În multe surse literare se întâlnește anul 1906, unde pentru prima

dată în articolul autorului M. Țvet apare termenul “cromatografie”, în care se dezvăluie conceptul

“experiență cromatografică”.

Etapă importantă în cercetare, în 1938, a devenit descrierea cromatografiei pe strat subțire de

savanții N. A. Izmailov și M. S. Shraiber, metodă care astăzi are o răspândire universală, datorită

unui cost redus, a vitezei mari de eluare și a rezoluției lejere.

Bazându-se pe fenomenul deja cunoscut, descris în lucrările lui M. Țvet, și aplicându-l în cazul

aminoacizilor, în 1941 savanții englezi A. D. Martin și R. Synge au elaborat metoda cromatografică

de repartiție, pentru care în 1952 au fost decernați cu premiul Nobel. În timpul cercetărilor, aceiași

savanți și colegii lor Consden, Gordon au depistat că în afară de silicagel, apa este reținută și de celuloză. Astfel în 1944 a fost elaborată o nouă metodă cromatografică − pe hârtie, utilizându-se ca

sorbent al fazei staționare hârtia de filtru.

Un mare succes al savantului Martin în colaborare cu E. T. James a urmat de asemenea în anul

1952 cu punerea bazelor cromatografiei de gaze (GC), apoi în 1959 savantul Golay a introdus

noțiunea cromatografia de gaze pe coloane capilare. Metoda dată este larg răspândită și până în

prezent .

În timp cromatografia de lichide s-a dezvoltat datorită perfecționării detectorilor, pompelor și ca rezultat s-au construit cromatografe de lichide de performanță înaltă (HPLC). Cu apariția

metodei HPLC (an. 1968) autorii Giddings și Kirkland au propus utilizarea unor faze staționare cu

particule foarte mici, cu trecerea fazei mobile sub presiune .

Un aport colosal la dezvoltarea cromatografiei au depus și savanții A. V. Kiseliov, A. A.

Jucovski, C. I. Sacadînscki, destinși cu medalia internațională M. Țvet “Pentru descoperirile

distinse în domeniul cromatografiei” și mulți alți specialiști în acest domeniu .

Cromatografia ca metodă de separare se încadrează în grupul de procedee bazate pe migrarea

diferențiată a componenților din amestecul studiat dintre două faze, adică migrare diferențiată a

diferitor molecule .Ea cercetează starea termodinamică a sistemelor dintre

două faze, studiază natura interacțiunii intramoleculare, cinetica proceselor interne și schimbului de

masă între faze, proceselor formatoare de complecși, asociații și multe altele.

Datorită complexității proceselor de separare, subînțelegerii deosebit de multilaterale a

termenului “cromatografie” este dificilă formularea unei definiții generale. Însă se poate spune că

toate tehnicile cromatografice au ca elemente comune o “fază staționară” și o “fază mobilă”, iar

componenții amestecului de analizat sunt antrenați în lungul coloanei de un flux de fază mobilă

(gazoase sau lichide), cu viteze diferite, ceea ce constituie principiul fundamental al separării. Pe de

altă parte, la baza majorității metodelor cromatografice de separare stau patru procese

fundamentale: adsorbția pe suporturi solide, repartiția între faza staționară și aceea mobilă, schimbul

ionic și de excluziune. Astfel, principiul separării poate fi diferit, dar etapele analizei

cromatografice sunt aceleași.

Luând în considerație cele expuse, totodată și numeroșii factori implicați în separare, în asigurarea selectivității și rezoluției, precum și caracteristicile detectorilor utilizați, respectiv de sensibilitatea lor, reproductibilitatea proceselor de separare, detecție și dozare, este greu de dat o clasificare atotcuprinzătoare.

De aceea cromatografia se poate clasifica: având în

vedere natura fazelor staționară și a celei mobile (în fază gazoasă, lichidă și fază supercritică); în

funcție de procesele fizico-chimice care stau la baza separării (cromatografie de adsorbție, de

repartiție, de schimb ionic, de excluziune, cu formare de perechi de ioni, de afinitate); în funcție de

modalitatea de imobilizare a fazei staționare (cromatografie pe coloană și planară); în funcție de

starea fizică a celor două faze (cromatografie gaz-lichid, gaz-solid, lichid-lichid, lichid-solid) și

altele .

Poziția privilegiată a cromatografiei se datorează faptului că la baza migrării se găsește

repetarea echilibrului de repartiție dintre două faze (staționară și mobilă), care pentru un singur

proces se poate realiza extrem de rapid, de repetate ori într-un interval de timp scurt .

1.2. Etapele analizei cromatografice

Analiza HPLC este un proces complicat, cu multe etape, rezultatul cărei depinde de designarea

optimă și scrupulozitatea efectuării fiecărei etape în parte. Se pot evidenția 3 etape de bază ale

acestui proces:

Prepararea probelor – toate operațiile de preparare a mostrelor de analizat, care se finisează cu

obținerea probelor, injectate direct în coloana cromatografică, inclusiv și derivatizarea precoloană,

în caz de utilizare.

Analiza cromatografică propriu zisă – din momentul injectării probei până la înregistrarea

semnalului electric la ieșirea din detector, inclusiv și derivatizarea pe coloană sau postcoloană, unde

ea este prezentă.

Prelucrarea informației cromatografice primare, rezultatul căreia constă în obținerea

mărimilor ce caracterizează componența calitativă și cantitativă a probelor de analizat.

Oricare din etapele enumerate are specificul său de realizare și cere o tratare individuală de

optimizare. În lucrarea dată problemele optimizării fiecărei etape vor fi examinate coerent, însă ne

vom abate puțin de la cronologia obișnuită și vom examina optimizarea separării cromatografice în

ultimul rând. Schimbarea este legată de faptul, că pentru a pătrunde în esența principiilor optimizării

selectivității de separare în general și a metodelor model în particular mai întâi este necesar de a

examina parametrii de bază a semnalelor cromatografice și algoritmii lor de prelucrare.

O atenție aparte trebuie acordată problemei de compatibilitate între etape, care persistă într-o

formă vădită sau nevădită permanent. Și dacă problema compatibilității algoritmilor de prelucrare a

informației cu parametrii semnalelor cromatografice se rezolvă de obicei de developeri de program

și de aparataj, fapt care există pentru analitic într-o formă nevădită, pe când asigurarea

compatibilității probelor preparate cu sistemul cromatografic se extinde pe umerii celor ce

elaborează metodele analitice. În fond asigurarea acestei compatibilități și este una din sarcinile

etapei de preparare a probelor. Aceasta înseamnă că optimizarea preparării probelor și condițiilor

separării cromatografice să nu se execute separat, dar în contextul unui proces unic. Astfel,

utilizarea variantei cromatografie de adsorbție necesită înlăturarea completă a apei din componența

mostrelor de analizat, in cazul cromatografiei cu fază inversă, din contra, trebuie înlăturați solvenții

organici nepolari; schimbarea tipului detectorului poate să ceară excluderea unor componenți din

faza mobilă și din probele de injectat. În unele cazuri chiar și schimbarea componenței fazei mobile

necesită corectarea metodei de preparare a probelor.

Analiza lucrărilor publicate denotă faptul că, autorii, în majoritatea cazurilor, rezolvă

problemele date satisfăcător, dar, cu regret, ele se discută rar, ce duce la subestimarea semnificației

lor nu doar de începători, dar și de unii cercetători cu experiență.

Cromatografia grupează o variată și importantă grupă de metode care permit cercetătorului să separe compuși foarte asemănători din amestecuri complexe. În toate separările cromatografice proba este dizolvată într-o fază mobilă: gaz, lichid sau fluid supercritic. Această fază este frecvent numită eluent, iar după ce trece de capătul coloanei se numește eluat.

Metoda cromatografică a fost descoperită de botanistul rus Mihail Tswet, în 1906 și a fost folosită întâi pentru separarea unor substanțe colorate pe coloană sau ca eluate colorate. Dacă substanțele sunt incolore, prezența lor pe coloană sau în eluate se recunoaște prin alte metode .

3.3.3.1.Clasificarea metodelor cromatografice

Metodele cromatrografice pot fi clasificate în funcție de :

faza staționară și mobilă,

performanța tehnică

mecanismele de separare.

Faza staționară este o substanță sau amestec de substanțe solide, un film subțire sau lichid aplicat pe suprafața unui suport solid prin legături chimice. Faza staționară este o pulbere fină, are porozitate și o suprafață specifică mare. Dimensiunile particulelor depind de varianta tehnică aleasă.

Exemple de faze staționare: silicagelul, oxidul de aluminiu, oxidul de magneziu, carbonatul de calciu, hidroxidul de calciu. Utilizat ca atare, acest tip de suport a folosit la separarea pe baza unui proces de adsorbție diferențiat pe diferitele componente din amestec. Acest tip de suport definește cromatografia cu fază directă.

Faza staționară poate fi impregnată prin legarea chimică a unor derivați nepolari ai silanului, și anume, octasilanul și octadecilsilan. Acest tip de suport cu fază inversă este bazat pe procesul de repartiție a componentelor între faza staționară nepolară și faza mobilă și se numește separare cu fază inversă.

Faza mobilă sau eluentul au rolul de a realiza deplasarea diferențiată a componentelor amestecului, în funcție de solubilitatea lor în eluent și de afinitatea componentelor pentru faza staționară.

Metodele cromatografice sunt bazate pe adsorbția amestecului de substanțe (solid-lichid; lichid-lichid; gaz-lichid) pe un material adsorbant, urmată de desorbția succesivă (cu ajutorul unui dizolvant adecvat – eluant) a componentelor din amestec.

Coloana de adsorbant poate fi înlocuită, în unele variante cu o foaie de hârtie poroasă preparată în mod special (cromatografie pe hârtie) sau cu un strat subțire de adsorbant fixat pe o placă de sticlă, cu ajutorul unui liant (cromatografie în strat subțire).

Separarea compusului de analizat de potențialele interferențe este unul din pașii esențiali în analiza chimică.

Cromatografia este una dintre cele mai frecvent utilizate metode pentru a realiza aceste separări analitice. Aplicațiile cromatografiei cresc exponențial cu timpul, în mare parte datorită faptului că ea își găsește aplicații în toate ramurile științei. Este rapidă, simplă, cu costuri relativ reduse și variabilitate mare relativ la alegerea metodei de separare.

O analiză cromatografică se rezumă în general la următoarele concepte fundamentale:

• proba este dizolvată în faza mobilă;

• faza staționară este cel mai frecvent un lichid adsorbit la suprafața unor particule de solid utilizate pentru a împacheta coloana;

• faza mobilă este trecută peste faza staționară nemiscibilă; aceasta se numește eluție;

• solutul care are o mare afinitate față de faza mobilă se va mișca prin coloană foarte încet;

• componenții probei se vor separa în benzi discrete vizibile la detector, și rezultă cromatograma.

Cromatografia a devenit principalul instrument pentru separarea speciilor asemănătoare. Ea poate fi de asemenea utilizată pentru determinări cantitative și calitative ale speciilor separate.

În termeni de informație calitativă, o cromatogramă furnizează timpul de retenție al speciilor sau pozițiile acestora pe faza staționară după un timp de eluție specific. Cromatografia poate fi extrem de utilă pentru recunoașterea prezenței sau absenței unor componenți în amestec ce conține un număr limitat de specii cunoscute. Confirmarea identității servește și pentru alte investigații, și nu în ultimul rând cromatografia servește ca precursor pentru alte analize chimice calitative sau pentru analize spectroscopice.După performanța tehnică și tipul de suport, cromatografia poate fi: cromatografie pe coloană deschisă și cromatografie pe coloană închisă, iar în funcție de faza staționară sau sistemul experimental folosit la separare, cromatografia pe coloană se subclasifică în:

Cromatografia pe coloană deschisă:

– cromatografia pe hârtie;

– cromatografia pe strat subțire;

– cromatografia pe coloane deschise de sticlă;

Cromatografia pe coloană închisă:

– cromatografia de gaze pe coloane de sticlă sau metalice,normale sau capilare;

– cromatografia de lichide pe coloane de sticlă sau de oțel, la presiuni joase (FPLC) sau înalte (HPLC).

Separările pe hârtie și strat subțire se bazează pe fenomenul de capilaritate, eluentul se deplasează prin porozitatea suportului. Separările pe coloană dechisă de sticlă se fac sub presiune atmosferică, sub presiuni mai mari decât cea atmosferică sau sub vid. Cele mai performante separări se fac pe coloane de oțel închise, unde eluentul este deplasat sub presiuni mari. Această tehnică a primit numele de cromatografie lichidă sub presiune înaltă (HPLC).

După mecanismul de separare, cromatografia se calasifică în: cromatografie de adsorbție, de repartiție lichid-lichid, de schimb ionic, de excluziune sterică sau de afinitate.

Informația cantitativă este principalul motiv pentru care cromatografia are o atât de largă folosință. Ea se bazează pe compararea mai multor înălțimi sau suprafețe ale picurilor analitice cu etaloane. Analiza bazată pe aria picurilor, care este independentă de efectele de deformare este mult mai precisă și de aceea mult mai comună.

Oricum, toate datele cantitative sunt dependente de prepararea standardelor și calibrările succesive ale coloanei folosind aceste standarde.

Fără exactitate și calibrare precisă a datelor, nici o dată cromatografică nu poate fi considerată exactă.

Sunt 5 categorii de cromatografii:

de adsorbție;

de partiție;

cu schimb de ioni;

prin excluziune moleculară;

de afinitate.

Metodele de cromatografie pot fi de asemenea clasificate în două moduri:

cromatografia planară

cromatografia pe coloană.

Ele sunt bazate pe interacțiunea fizică, ceea ce înseamnă că faza staționară și faza mobilă sunt în contact. În cromatografia pe coloană, faza staționară este introdusă în interiorul unui tub îngust și faza mobilă este introdusă în tub cu ajutorul presiunii sau a greutății proprii.

În contrast, cromatografia plană folosește o fază staționară care este depusă pe o suprafață plană sau în hârtie. Faza mobilă se deplasează prin faza staționară datorită acțiunii capilare sau a greutății .

Cromatografia de lichide, gaze și de fluide supercritice sunt 3 clase generale bazate atât pe tipurile de faze mobile și staționare cât și tipurile de echilibre implicate în transferul solutului între faze. Fazele mobile sunt gaze, lichide și fluide supercritice. Fazele staționare variază și tipul de echilibru este dependent de alegerea acestei faze.

Cromatografia de adsorbție utilizează o fază staționară solidă și o fază mobilă care este un lichid sau un gaz. Solutul poate fi adsorbit la suprafața particulelor solide, unde echilibrul dintre starea adsorbită și soluție produce separarea moleculelor solutului.

În cromatografia de partiție faza staționară este un film subțire pe suprafața unui suport solid. Solutul stabilește un echilibru între lichidul staționar și faza mobilă (lichidă sau gazoasă).

În cromatografia de schimb ionic anionii sau cationii sunt legați covalent de o fază staționară solidă, frecvent o rășină sau o fază solidă tare și amorfă. O fază mobilă lichidă este utilizată. Ionii solutului de sarcină opusă sunt atrași de faza staționară datorită forțelor electrostatice.

Cromatografia de excluziune moleculară este mai comun denumită de gel permeabil sau de filtrare cu gel. Această tehnică separă moleculele după mărime și moleculele mari trec cu o viteză mai mare decât moleculele mici. Nu există interacțiuni atractive. În loc, faza mobilă gazoasă sau lichidă este trecută printr-un gel poros, care exclude moleculele mari, dar nu și pe cele mici. Moleculele mari curg peste fără a intra în gel, și ele eluează primele .

Cromatografia de afinitate este bazată pe interacțiunea între un tip de molecule de solut și un al doilea tip, acestea legate covalent de faza staționară. Când un amestec este trecut prin coloană, doar un tip de molecule de solut reacționează cu moleculele legate și formează legături la rășină. Moleculele de solut dorite sunt dislocate apoi de moleculele legate variind pH-ul sau tăria ionică a solventului .

Cromatografia de gaze, lichide și pe strat subțire

În cromatografia de gaze (GC) lichidul volatil este injectat cu ajutorul unei pompe de cauciuc într-un port injector, care vaporizează proba.

Probele gazoase pot fi injectate folosind o siringă adecvată. Un gaz inert purtător poartă proba prin coloana ce conține faza staționară.

Gazul purtător servește ca fază mobilă. După traversarea coloanei, particulele separate de solut intră într-un detector.

Răspunsul este afișat pe un calculator ca funcție de timp.

Fig.3.6. schema principalelor etape în cromatografia de gaze

În figura 3.7. este ilustrată structura coloanei de separare, într-o perspectivă din secțiune

si construcția unei coloane de separare.

Fig.3.7.. Secțiune prin coloana de separare și construcția sa toroidală în GC

Figura 3.8. ilustrează asamblarea părților componente ale unei instalații de cromatografie de gaze.

fig.3.8. aparatura pentru cromatografia de gaze

În cromatografia pe strat subțire (TLC), un spot de probă este aplicat peste o bucată de hârtie sau sticlă având faza staționară impregnată. Capătul suprafeței de hârtie sau sticlă este apoi scufundată într-o cantitate de solvent, care servește ca fază mobilă. Solventul migrează de-a lungul fazei staționare,

separând componenții probei în lungul drumului său (fig.3.9.).

Cromatografia de lichide de înaltă performanță (HPLC) referă noile proceduri de cromatografie de lichide bazate pe o instrumentație sofisticată .

Fig.3.9.Faze înTLC

. Când solventul ajunge în vecinătatea părții superioare, este înlăturată cantitatea suplimentară de solvent și este lăsat să se usuce.

Câțiva dintre componenții probei sunt vizibili în acest moment .

Alte măsurători sunt în mod curent efectuate pentru a detecta toți componenții probei .

Acestea sunt cele mai mult folosite dintre toate metodele de separare (fig. 3.10.).

Fig.3.10. Schema Bloc a HPLC

Detecție

Foarte multe detectoare sunt angajate în separările cromatografice . Detecția absorbanței moleculare UV-VIS este cea mai comună. Detectorul ideal este necesar să aibă: sensibilitate adecvată; bună stabilitate și reproductibilitate; timp de răspuns scurt; răspuns liniar la diferite ordine de concentrație; stabilitate pe un larg domeniu de temperatură; durată lungă de viață și ușurință în utilizare.

Monocromatorul este adesea o componentă a instrumentului UV-VIS. El permite scanări spectrale, ceea ce înseamnă capacitatea de a varia lungimea de undă a radiației în mod continuu într-un domeniu larg.

Fantele monocromatorului joacă un rol important. Fanta de intrare servește ca sursă de radiație. Fantele largi sunt tipic utilizate pentru determinări cantitative în care detaliul spectral este important, în comparație cu analiza calitativă.

Metode de prelucrare a informației cromatografice

Metoda standardului intern furnizează cea mai mare precizie pentru cromatografia cantitativă deoarece ea elimină incertitudinile introduse de simpla injecție. În această metodă, o cantitate exact măsurată de substanță este adăugată fiecărui standard sau probe. Standardul intern trebuie să fie ales astfel încât el să se separe foarte bine de celelalte picuri componente ale probei.

De asemenea, picul standard trebuie să fie aproape de picul analitic. Cantitatea de substanță din picul de standard intern servește apoi ca parametru analitic.

Metoda normalizării ariilor este o altă aproximare utilizată pentru eliminarea incertitudinilor asociate cu simpla injecție. În această metodă, aria tuturor picurilor complet eluate este calculată.

Concentrația analitică este găsită ca raport al ariei de pic la aria totală a tuturor picurilor.

Lărgimea benzii în cromatografie

O cromatogramă:

• ilustrează răspunsul detectorului la un compus de analizat din probă la ieșirea acestuia din coloană ca funcție de timp sau de volum de fază mobilă adăugată;

• este utilă atât pentru determinările cantitative cât și calitative;

• furnizează o serie de picuri, unde aria de sub picuri furnizează informația cantitativă despre cantitatea de component iar poziția picului servește pentru identificarea compusului din probă;

Câteva forme de bandă pe cromatogramă este posibil să depindă de concentrația compusului de analizat în fazele mobilă și staționară și de comportamentul fiecărui compus în parte (fig.3.11.).

fig.3.11.Forme de picuri-(a)Gaussian, (b)deplasat dreapta, (c)deplasat stânga

Un pic Gaussian este ideal (a). Mai mult, oricum picurile pot avea o creștere progresivă urmată de o cădere abruptă datorată supraîncărcării coloanei (b) sau o formă cu coadă care rezultă din faptul că unele lăcașe ale coloanei rețin solutul mai mult decât altele (c).

Lărgimea benzii poate fi explicată din punct de vedere cantitativ.

O particulă individuală suportă multe transformări în timpul migrării, în consecință, timpul de staționare în coloană este extrem de diferit precum și migrarea particulelor de-a lungul coloanei este neregulată. Odată cu creșterea timpului, lățimea benzii crește în timp ce se parcurge coloana, timpul de staționare în coloană va fi mai mare, iar viteza de curgere a fazei mobile scade .

Există patru parametri care caracterizează în general viteza de migrare: timpul de retenție, coeficientul de partiție, factorul de capacitate și factorul de separare. Acești parametri descriu echilibrul de distribuție care există și implicit, transferul soluției în cele două faze (fig.3.12.).

fig.3.12.Elementele unei cromatograme

Timpul tR la care apare maximul unui pic, măsurat din momentul introducerii probei se numește timp de reținere sau retenție și este o caracteristică calitativă a componentului respectiv. Înălțimea picului h sau aria lui, A, sunt caracteristici cantitative, proporționale cu cantitatea componentului din probă. Se notează cu tM timpul în care eluentul și componentele care nu interacționează cu faza staționară parcurg distanța până la detector.

Astfel putem exprima viteza componentului din faza staționară (v) și a eluentului (u) prin următoarele ecuații:

v = L/tR

u = L/tM

unde L este lungimea coloanei.

3.3.3.2.Cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC)

Această tehnică a devenit cea mai performantă în analiza chimică, biomedicală și diagnostic de laborator. Este utilizată pentru separarea și detecția unor compuși biologic activi, instabili termic, în concentrații extrem de mici, cu o viteză și precizie mult mărite în raport cu metodele clasice amintite mai sus.

Părțile componente ale unui cromatograf de lichide de înaltă performanță (HPLC) și modul de funcționare.

Este format din două pompe atașate la un rezervor de unde preiau eluentl, un injector de introducere a probei, o coloană de separare atașată la un detector care identifică componentele pe baza unei proprietăți, în ordinea ieșirii din coloană și un înregistrator care vizualizează cromatograma.

Separarea poate avea scop analitic și atunci are loc pe o coloană de oțel de dimensiuni mici sau preparativ, pe coloane de dimensiuni mai mari. Proba este injectată în coloană printr-un sistem de injecție special construit atașat la o pompă care trimite solventul de eluare a coloanei cu o presiune mare. Debitul de curgere depinde de această presiune și este, de obicei, cuprinsă între 0,2 și 2 ml/min. Uneori, pentru o separare mai performantă, eluția se poate face cu amestecuri de solvenți a căror concentrație variază în timp, și aceasta necesită utilizarea a două pompe și a unei camere de amestecare.

Faza staționară. În funcție de umplerea coloanelor există HPLC:

cu fază normală (NP-HPLC), în care faza staționară este polară: silicagel, alumină, celuloză;

cu fază inversă (RP-HPLC), în care faza staționară este nepolară de tip octadecilsilan sau octasilan.

Mecanismul pe baza căruia are loc separarea în aceste cazuri este diferit, dacă pentru sistemele NP-HPLC, separarea are la bază adsorbția diferită a componentelor amestecului pe faza staționară, pentru sistemele RP-HPLC, procesul de separare are la bază repartiția componentelor amestecului între faza staționară nepolară și eluentul polar.

Tipul fazei mobile este dependent de natura fazei de staționare, astfel:

în sistemele cu fază normală unde faza staționară este polară se folosesc eluenți nepolari;

iar unde faza staționară este nepolară, în sistemele cu fază inversă se folosesc amestecuri de solvenți polari, cum sunt: acetonitrilul, metanolul, acetatul de etil, apa.

În funcție de tipul probei de analizat se alege unul din aceste sisteme:

dacă proba este preponderent nepolară se recomandă utilizarea sistemului NP-HPLC unde coloana conține faza staționară polară cu afinitate diferită pentru moleculele nepolare, care vor fi primele eluate, cu solventul preponderent nepolar;

dacă proba este preponderent polară, se recomandă utilizarea sistemului RP-HPLC, cu faza staționară nepolară și afinitate diferită pentru moleculare polare, ce vor fi eluate primele, cu solvenți polari.

Detecția componentelor separate din amestec se face prin metode fizico-chimice, de obicei, cu ajutorul unor spectofotometre UV-VIS, cu detectori conductometrici, electrochimici sau refractometrici. Aceștia preiau continuu fluxul de solvent conținând componentele separate pe coloană și transformă semnalul chimic în semnal electric, înregistrat sub forma unei cromatograme. Un tip de detector cu performanță înaltă, introdus recent în uz, este detectorul de tip PDA, care are posibilitatea să înregistreze concomitent absorbțiile fiecărei componente la toate lungimile de undă baleiate.

Există situații când substanțele structural diferite au aceiași timpi de retenție, deci nu pot fi separate. În acest caz, este necesară schimbarea unor parametri cromatografici. Eficiența separării nu este caracterizată numai de diferențele dintre valorile tk , ea depinde și de lățimea picului, conform formulei

R=2(tR2-tR1/w1+w2),

iar semnificația termenilor este următoarea:

R-rezoluție

tR-timpi de retenție

w-lățimea picurilor

dacă doi picuri au lățimea mare (w), ele se suprapun și rezoluția R scade. Dacă t0 reprezintă timpul de retenție al frontului fazei mobile, cu cât curgerea pe coloane HPLC este mai lentă și coloana este mai lungă, timpul t0 este mai mare. În consecință, tk este dependent de lungimea coloanei și de viteza de curgere a eluentului. Pentru a calcula factorul de capacitate k', se utilizează formula:

k'=tk-t0/t0

De regulă, factorul k' să fie cuprins între 1 și 5, pentru o separare performantă.

Figura 3.13. Diagrama sistemului HPLC

Figura 3.14. Sistem HPLC

3.4. REZULTATE ȘI DISCUȚII

Așa cum este cunoscut ,vitaminele B sunt factori metabolici și regulatori esențiali,necesari în sănătatea și cresterea umană. Măsurătorile cantitative precise ale vitaminelor din mâncare sunt folositoare ca cerință necesară de introducere suficientă a vitaminelor.

Luând în considerare lipsa unor asemenea vitamine ,prezența lor în prepararea mâncării trebuie să fie verificată pentru a se asigura alimentarea corectă și precizia celor scrise pe etichetă.

Pierderea de vitamine în mâncare se poate datora tehnologiei de fabricare și depozitării.

Tabelul nr.3.2. prezintă principalele caracteristici ale 5 vitamine hidrosolubile reprezentative din grupa B .

Tabelul nr.3.2. Structurile chimice,activitățile biologice primare și dozele zilnice recomandate de vitamine hidrosolubile (grupa B)

Tehnicile noi, ca și cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC) care are legătură cu diferite detectări, sunt instrumente analitice de seamă pentru identificarea,separarea și cuantificarea vitaminelor din complexul B, cât și pentru ațti analiți datorită posibilității lor de separare și cuantificare precisă.

Analiza vitaminelor B a fost realizată în general pe amestecuri pure, tablete, formule farmaceutice, dar și pe produse de consum. Luând în considerare faptul că vitaminele sunt legate de structurile supramoleculare complexe ca proteinele în mâncare,extragerea lor din matricele de hrană complexe și analiza lor devine dificilă.

Am dezvoltat și optimizat proceduri diferite pentru extragerea ,separarea și identificarea a 5 vitamnine B,cum ar fi:acidul nicotinic(vit.B3), piridoxina(vit.B6), acidul folic, cianocobalamina(vit.B12) si riboflavina(vit.B2) găsite în produsele de drojdie de bere.

3.4.1.Analiza HPLC a vitaminelor B din drojdia de bere

La analiza HPLC a vitaminelor B din drojdia de bere s-a folosit:

un cromatograf lichid de înaltă performanță(HPLC Szimatsu) cuplat la un detector PDA.

Solvenții organici de gradul HPLC ,cum ar fi metanolul și acetatul de amoniu .

Apa folosită ca eluent pentru analiză a fost filtrată de un sistem Millipore.

Toate vitaminele hidrosolubile :acid nicotinic,piridoxina,acidul folic,cianocobalamina și riboflavina au fost achiziționate ,îndeplinind standardul de puritate.

Pregătirea soluțiilor standard și curbele

Soluțiile de stoc apoase (1,2 mg/ml) ale fiecărei vitamine au fost pregătite în fiecare săptămână,păstrate în frigider,într-o folie de aluminiu,ferite de lumină și concentratiile luate in lucru au fost între 0,15mg/ml-1,2 mg/ml .

Curbele standard au fost realizate prin introducerea a minim 4 concentrații ale fiecărei vitamine într-un sistem HPLC.

3.4.1.1.Separarea și identificarea vitaminelor hidrosolubile din drojdia de bere prin metoda HPLC

Experimentele au fost efectuate in Laboratoarele Disciplinelor de Chimie si Biochimie din cadrul catedrei V TPPA.

Pentru separarea celor 5 vitamine B a fost utilizată o coloană C18 Restek Ultra Aqueous(250× 4,6 mm, 5µm) , iar separarea a avut loc la temperatura camerei.

Faza mobilă a constat din 0,05 M CH3COONH4/CH3OH (99/1) (solvent A) și H2O/CH3OH (50/50) (solvent B) cu o viteza de 0,8 ml/min. Volumul de injecție a fost de 20 µL .

În vederea obținerii unei cât mai bune separări ale vitaminelor hidrosolubile s-au încercat trei sisteme de faze mobile în diferite proporții volumetrice.

Primul sistem (I) a folosit solvenții A:B (99/1) și a fost eluat izocratic timp de 4 minute, apoi a crescut liniar pentru a atinge procentul din solventul B timp de 18 min. În cele din urmă eluția a fost din nou izocratică timp de 8 minute.

Între injectări s-a păstrat un timp de echilibrare de 5 minute. Al doilea sistem(II) a început cu aceeași compoziție A: B (99/1) ,izocratic pentru 3 minute, apoi solventul B a crescut liniar până la 100% ,timp de 12 min și în cele din urmă izocratic timp de 10 min.

Al treilea sistem (III) a început la A:B (99/1) izocratic timp de 3 min ,apoi solventul B a crescut liniar până la 100%, timp de 10 min și a scăzut liniar pentru a atinge 100% A timp de 3 min .

Detectia PDA a fost monitorizată la 265 nm pentru riboflavină, 260 nm pentru acidul nicotinic și piridoxină , 230 nm pentru cianocobalamină și 280 nm pentru acidul folic.

Identificarea picurilor caracteristice fiecărei vitamine a fost realizată prin compararea spectrelor lor cu cele rezultate din soluțiile standard.

Optimizarea separării HPLC a 5 vitamine B folosind standarde pure

După testarea celor 3 protocoale de separare (I-III) rezultatele optime cu picuri simetrice bine separate a vitaminelor B individuale au fost obținute pentru sistemul II.

Fig. 3.4.1. reprezintă cromatograma HPLC-PDA a standardelor mixte (vitaminele B1, B3, B6, B2 și acidul folic) conținând 1,2 mg/ mL din fiecare vitamină.

Fig.3.4.1. Cromatograma HPLC amestecului de standarde pure al vitaminelor la 260 nm

Tabel nr.3.3.absorbția maximă spectrală specifică și timpul de retenție pentru 5 vitamine B

La început analiza HPLC a fost realizată folosind soluții standard individuale și apoi standarde mixte așa cum sunt prezentate în Fig.3.16.

S-a ales lungimea de undă cea mai potrivită pentru a obține detectarea și separarea lor simultană, deoarece proprietățile lor spectrale diferă foarte mult.

Pentru aceeași concentrație, datorită coeficientului molar de absorbtie individual diferit intensitatea picului a fost diferită la 260 nm, cea mai bună absorbție fiind pentru acidul folic și cea mai scăzută pentru vitamina B12.

De aceea au fost testate cele mai bune lungimi de undă pentru fiecare absorbție a vitaminelor în gamele de raze spectrale ale UV (190-400 nm) pentru detectarea vitaminelor B3, B6, acid folic și B12 potrivit timpului lor de retenție și a caracteristicilor lor spectrale după cum s-a arătat în tabelul 3.2.

3.4.1.2. Analiza HPLC a vitaminelor din tablete de drojdie de berendizolvate în apă și extractele hidrolizate

În acest studiu au fost folosite două tipuri de drojdie de bere proaspătă: drojdie de bere de fermentație primară (PF) și drojdie de bere de fermentație secundară (SF).

Ambele au fost păstrate la temperature de 8˚C și au fost scoase afară chiar înaintea începerii experimentului pentru a evita contaminarea și reducerea activităților sale enzimatice.

Mostrele de tablete de drojdie de bere au fost și ele analizate, fie ca extract in apă sau după hidroliză acidă sau bazică

Hidroliza mostrelor a fost realizată în hidroxid de sodiu(NaOH) 1N (hidroliză alcalină) sau în acid tricloracetic 5% (TCA) (hidoliză acidă) timp de 1 oră, 6 ore și 24 ore la început la temperatura camerei și mai apoi la 50˚C .

După hidroliza vitaminelor pH-ul a fost ajustat la 6,8 folosind NaOH 1N în faza mobilă și cu HCl 1N după hidroliza alcalină. Înaintea injectării mostrele au fost centrifugate și filtrate cu ajutorul filtrelor Teknokroma(0,2 µm).

Fig.3.4.2. (A și B) prezintă cromatograma HPLC a extractului tabletei de drojdie de bere în apă la temperature camerei (A) și după hidroliză acidă sau alcalină (B).

Când a fost folosită apa ca și extractant ( fig.3.4.2. A) , cromatograma a fost foarte complexă și dificil de identificat, numai una din vitamine (în formă liberă) poate fi identificată, aceasta fiind vitamina B3..Pentru a determina conținutul total de vitamină, prin eliberarea vitaminelor din complecșii cu proteine, extracția a fost făcută după hidroliza acidă sau alcalină.

Rezultatele bune au fost obținute în cazul extractelor cu NaOH 1N (hidroliză alcalină) , acid tricloracetic 5% la 50˚C (hidroliză acidă) timp de o oră ,așa cum este arătat în fig. 3.4.2.B.

O comparație între fig.3.4.2.A și fig.3.4.2.B indică faptul că cea mai bună separare cromatografică a vitaminelor B a fost obținută când tabletele de drojdie de bere au fost extrase în condiții alcaline.

În continuare sunt prezentate cromatogramele obținute în urma analizelor făcute.

Fig.3.4.2.A. Cromatograma HPLC a vitaminelor libere și altor componente din tableta de drojdie de bere extrasă în apă

După cum se observă din cromatogramă singura vitamină care poate fi pusă în evidență comparativ cu cromatograma standardelor este vitamina B3. Acest lucru demonstrează că dintre toate cele cinci vitamine analizate numai aceasta se găsește în stare liberă și poate fi identificată în urma dizolvării probei în apă. Celelalte vitamine se găsesc legate de alte componente biochimice, cel mai adesea de glucide , de aceea identificarea lor necesită o hidroliză prealabilă.

Tabel 3.3.timpul de retenție al vitaminelor din extractul tabletei de drojdie în apă

Fig.3.4.2.B. Cromatogramele comparative ale extractelor acide, respective alcaline din drojdia de bere

Tab.3.4. Timpii de retenție a vitaminelor din extractul tabletei de drojdie după hidroliză alcalină

Comparând cele două cromatograme se observă absorbții mult mai intense în cazul tabletei de drojdie hidrolizată alcalin față de cea hidrolizată acid, ceea ce demonstrează faptul că primul tip de hidroliză este mai eficient pentru aceste vitamine.În cazul acidului folic hidroliza acidă nu este eficientă, ceea ce înseamnă că nu a fost separate de complecșii în care se găsește în drojdie. Același lucru se poate afirma și în cazul vitaminelor B12 și B2 , la care absorbțiile sunt foarte mici, iar picurile cromatografice slab reprezentate.

Fig.3.4.3.Cromatograma vitaminelor din drojdie (fermentație secundară) obținută prin hidroliza alcalină la 257 nm

Fig.3.4.4.Cromatograma vitaminelor din drojdia (fermentație secundară) obținută prin hidroliza alcalină după 1h și 50˚C (257nm)

Se observă și în cazul acestei hidrolize o separare eficientă a celor cinci vitamine, dar deosebirea față de hidroliza alcalină anterioară nu este prea mare așa cum ar fi fost de așteptat avand în vedere că în acest caz s-a mărit timpul de hidroliză și temperatura .

Fig.3.4.5. Cromatograma vitaminelor din drojdia (fermentație secundară) obținută prin hidroliza acidă la 24h

Hidroliza acidă a fost ineficientă, la fel ca și în cazul tabletelor de drojdie. După cum se poate observa din cromatogramă două dintre vitamine n-au putut fi puse în evidență ceea ce înseamnă că nu s-au hidrolizat în aceste condiții.

De asemenea s-au efectuat analizele spectrale ale celor cinci vitamine pentru confirmarea timpului de retentie. Analizele de spectre sunt prezentate in figurile urmatoare:

Analiza spectrală a vitaminei B3

Analiza spectrală a vitaminei B6

Analiza spectrală a vitaminei B9

Analiza spectrală a vitaminei B12

Analiza spectrală a vitaminei B2

Analizele spectrale ale picurilor cromatografice corespunzătoare celor cinci vitamine confirmă faptul că în probe au fost identificate aceste componente.

Hidroliza alcalină a dat cele mai sigure date, fiind detectate toate vitaminele,exceptând acidul folic(fig.3.4.2.B).

. Comparația amprentelor HPLC ale drojdiei de bere provenită din PF și SF.

Mostrele PF și SF au fost hidrolizate și identificarea tuturor celor 5 vitamine potrivit cromatogramelor lor HPLC sunt arătate în fig.3.4.3.

Amprentele extractelor din drojdia de bere arată o bună aemănare între cromatogramele suprapuse. Diferențele au fost observate la intensitățile picurilor, mai înalte în cazul extractului de drojdie de bere PF. Vitaminele B3 au avut cele mai intense semnale urmate de acidul folic și vitamina B6.

Vitaminele B12 și B2 cu picurile foarte scăzute indică cantități mici în extractul PF și numai urme în extractul de drojdie de bere SF.

Identificarea vitaminelor s-a bazat pe absorbția maximă a spectrului lor, pe timpul lor de retenție și confirmat de co-cromatografia mostrelor cu standarde pure.

Fig.3.4.3.. Cromatogramele HPLC caracteristice a PF și SF după hidroliza alcalină.

În ambele cazuri au fost identificate cele cinci vitamine, ceea ce demonstrează că aceste vitamine se găsesc atat în drojdia de fermentatie primară, cat și secundară.

3.5.CONCLUZII ȘI RECOMANDĂRI

În această lucrare au fost optimizate protocoalele pentru separarea HPLC a 5 vitamine B solubile în apă : acid nicotinic, piridoxină, acid folic, cianocobalamină și riboflavină ca soluții standard pure, folosind un protocol original și optimizat.

Aceleași vitamine au fost analizate diferit , fiind extrase in apă,acid sau hidrolizate alcalin.

Extractele în apă conțin cantități mici de vitamine libere (în principal vitamina B3), ceea ce sugerează faptul ca aceste vitamine se găsesc sub formă de complecși cu alte substanțe si necesită hidroliză pentru a fi identificate. Extracte hidrolizate au dat amprente complexe și diferite.

Prin dizolvare în apă singura vitamină care poate fi pusă în evidență comparativ cu cromatograma standardelor este vitamina B3. Acest lucru demonstrează că dintre toate cele cinci vitamine analizate numai aceasta se găsește în stare liberă și poate fi identificată în urma dizolvării probei în apă. Celelalte vitamine se găsesc legate de alte componente biochimice, cel mai adesea de glucide , de aceea identificarea lor necesită o hidroliză prealabilă.

În cazul tabletelor de drojdie, comparând cele două cromatograme se observă absorbții mult mai intense în cazul tabletei de drojdie hidrolizată alcalin față de cea hidrolizată acid, ceea ce demonstrează faptul că primul tip de hidroliză este mai eficient pentru aceste vitamine.În cazul acidului folic hidroliza acidă nu este eficientă, ceea ce înseamnă că nu a fost separat de complecșii în care se gasește în drojdie. Același lucru se poate afirma și în cazul vitaminelor B12 și B2 , la care absorbțiile sunt foarte mici, iar picurile cromatografice slab reprezentate.

Pentru drojdia de fermentație secundară se observă o separare eficientă a celor cinci vitamine în cazul hidrolizei alcaline.

Hidroliza acidă a fost ineficientă, la fel ca și în cazul tabletelor de drojdie. În urma analizelor s-a constatat că două dintre vitamine n-au putut fi puse în evidență ceea ce înseamnă că nu s-au hidrolizat în aceste condiții. Extractul hidrolizat acid a fost sărac în vitamine în timp ce extractul alcalin a conținut toate cele 5 vitamine într-o concentrație mare.Vitaminele B3 au dat picuri majore în comparație cu acidul folic și B6 și vitaminele B12 și B2 cu semnale foarte slabe.

În general, vitaminele B au fost într-o concentrație mai mare în extractul drojdiei provenită de la fermentația primară față de cel al drojdiei de extracție secundară.

Se recomandă optimizarea separării HPLC și pentru celelalte vitamine hidrosolubile și a protocolului de hidroliză acidă în vederea îmbunătățirii separării acestor compuși.

De asemenea se recomandă hidroliza enzimatică pentru separarea si cuantificarea vitaminelor din diferite matrici biologice.

IV. BIBLIOGRAFIE

Banu, C., Biochimia produselor alimentare, 1971, Editura Tehnică, București

Bodea,C. și colab., Tratat de biochimie vegetală, 1982, Editura Academiei, București;

Neamț, G. și colaboratorii, Biochimie vegetală, 1995, Editura Academică, București;

Neamțu, G., Substanțe naturale biologic active(volumul I),vitamine, 1996, Editura Ceres, Buc.

5. Neamțu G., Cîmpeanu,Gh., Socaciu C., Biochimie vegetală(partea structurală), 1993, Ed. Didactică și pedagogică,Buc,

6. Andrei Sanda, Pintea Adela, Vitamine,Enzime ,Hormoni,Analiza biochimică, 2004, Ed. Clusium,București

7. Măruțoiu, Tofană, Cromatografia pe strat subțire,analiza produselor alimentare, 2005, Ed. Etnograph,Cluj-Napoca

8. Miere Doina, Chimia și igiena alimentelor, Vol I, 2002, Ed. Med. Univ. Iuliu Hațegan, Buc.

9. Nedelcu Mariana, Chimia organică, 2002, Ed. Crepuscul,București

10. Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, VCH, Weinhem, 1996.

11. Amidzic R., J. Brboric, O. Cudina, et al., 2005, RP-HPLC Determination of vitamins B1, B 3, B6, folic acid and B12 in multivitamin tablets, J. Serb. Chem. Soc., 70(10), 1229–1235.

12. Jedlicka A., J. Klimes, 2005, Determination of Water- and Fat-Soluble Vitamins in Different Matrices Using High-Performance Liquid Chromatography, Chem. Pap., 59(3), 202—222.

13. Klejdus B., Jitka Petrlova, D. Potesil, et al., 2004, Simultaneous determination of water- and fat- soluble vitamins in pharmaceutical preparations by high-performance liquid chromatography coupled with diode array detection, Anal. Chim. Acta, 520, 57-67.

14. Nașcu Horia Iustin , Lorentz Jäntschi, Chimie analitică și instrumentală, 2006, Ed. Academic Pres & AcademicDirect,Cluj-Napoca.

15. Lorentz Jäntschi, Chimie Fizică. Analize Chimice și Instrumentale, 2004, Editura AcademicDirect, Cluj-Napoca.