Vitamina B12

UNIVERSITATEA “TRANSILVANIA” DIN BRAȘOV

FACULTATEA DE ALIMENTAȚIE ȘI TURISM

PROIECT

VITAMINA B12

Indrumător : Prof.univ.dr.Angela MARCULESCU

Student: Glava Teodora Luciana

CUPRINS

CAPITOLUL I. Noțiuni introductive

1.1.Generalități…………………………………………………………………………………………………… pag.4

1.1.1.Clasificarea vitaminelor…………………………………………………………………………………pag.4

1.2.1.Vitamine hidrosolubile……………………………………………………………………….pag.5

1.2.2.Vitamine liposolubile………………………………………………………………………….pag.5

1.1.2.Principalele funcții a vitaminei B12 in organism………………………………………………..pag.6

1.1.3.Compoziție chimică………………………………………………………………………………………pag.7

1.1.4.Anolagi ai vitaminei B12 ………………………………………………………………………………pag.8

1.1.5.Răspândire în natură……………………………………………………………………………………..pag.9

CAPITOLUL II.Identificarea și dozarea vitaminei B12

2.1. Mecanisme de biosinteză a vitaminei B12 ………………………………………………………….pag.10

2.2.Biotehnologia fabricării vitaminei B12 ……………………………………………………………….pag.12

2.3.Separarea și purificarea vitaminei B12 ……………………………………………………………….pag.20

CONCLUZII
BIBLIOGRAFIE

CAPITOLUL I. Noțiuni introductive

1.1.Generalități

Vitaminele sunt substanțe organice necesare în cantități minime organismului, care provin din rația alimentară. Unele sunt produse și de flora intestinală. Vitaminele reglează una sau mai multe faze ale metabolismului intermediar, influențează activitatea enzimelor sau intervin direct în procese redox și chiar în sinteza enzimelor. Lipsa accentuată de vitamine duce la avitaminoze. Tulburările care apar sunt caracteristice pentru fiecare vitamină în parte și pot duce până la moartea omului sau animalului. Denumirea de vitamine se datorează lui Funck care prepară în anul 1911 din tărâțele de orez substanța curativă a polinevritei și consideră greșit că ea conține o grupă –NH2, fiind numită de autor „vitamină” (amină indispensabilă vieții). Cei care respectă criteriile unei alimentații raționale au cele mai clare indicii de păstrare a sănătății. Înțelepții antichității, precum și cercetătorii moderni au consacrat tratate voluminoase consecințelor pe care le are hrana considerată ca sursă de sănătate fizică și morală, de frumusețe chiar. Lipsa unei alimentații variate, adecvate, provoacă boli grave, numite boli carențiale. Istoricul acestor boli este mai vechi decât istoria vitaminelor, care a început doar cu câteva decenii mai devreme, pe la începutul secolului trecut. Vitaminele sunt factori indispensabili vieții în cantități mici, uneori fracțiuni de miligram, întâlnindu-se sub formă de factori nutriționali esențiali. Mecanismul lor de acțiune bazându-se pe încorporarea acestora în structura enzimelor, ele intervin în multiple procese metabolice esențiale pentru viață. Aminele vieții-vitaminele- sunt prietenii cei mai fideli și necesari organismului uman. Referitor la maladiile de diferite tipuri, trebuie semnalat faptul că ele au fost menționate cu mai mult timp înaintea depistării cauzelor lor precum și a descoperirii vitaminelor și a necesității vitale a acestora în procesul creșterii și dezvoltării viețuitoarelor. Cele mai vechi date sunt deținute despre scorbut, ca fiind o maladie carențială dată de avitaminoza C.

Vitaminele nu por fi sintetizate în organism, sau sunt sintetizate în cantități insuficiente, și trebuie introduse prin alimentație. S-a scris foarte mult despre aceste substanțe, dar ele mai dețin destule enigme nedescifrate încă. Cercetările în domeniul vitaminologiei continuă și în prezent în diferite laboratoare specializate efectuate de oameni competenți, capabili să lămurească noi aspecte legate de mecanismul intermediar.

1.1.1.Clasificarea vitaminelor

1.Vitaminele liposolubile

Vitamina A (retinolul), Provitamina A (carotenul), Vitamina D (calciferolul),Vitamina E (tocoferolul) Vitamina K (filochinonul).

2.Vitaminele hidrosolubile

Vitamina B1 (tiamina), Vitamina B2 (riboflavina), Vitamina B6 (piridoxina), Vitamina B12 (ciancobalamina), Vitamina Bc (acidul folic), Vitamina B3 (acidul pantotenic), Vitamina H (biotina), Vitamina C (acidul ascorbic), Vitamina P (citrina), Vitamina PP (niacina, nicotinamida)

3.Substanțele cu efecte vitaminice

Acidul pangamic (vitamina B15), Acidul paraaminobenzoic (vitamina H1), Colina (vitamina B4), Inozitolul (vitamina B8), Carnitina (vitamina BT), Vitamina F, vitamina U.

1.2.1.Vitaminele hidrosolubile

Deoarece sunt solubile în apă, ele se pot pierde ușor în timpul preparării culinare sau industriale: spălarea, păstrarea și fierberea în apă și nefolosirea acestei ape. Se absorb relativ ușor și în mare proporție din tubul digestiv, dar pentru majoritatea dintre ele este necesară prezența acidului clorhidric în sucul gastric. După ce sângele și țesuturile primesc cantități adecvate de vitamine, excesul lor se elimină prin urină. În general, organismul nu-și face rezerve importante de aceste vitamine. În caz de aport alimentar insuficient, semnele carenței apar destul de repede. Și transpirațiile abundente și repetate sunt o importantă cale de pierdere vitaminică. Din punct de vedere metabolic, o mare parte din vitaminele hidrosolubile intră în structura unor enzime, fiind cofermentul acestora. Majoritatea intervin în catalizarea proceselor eliberatoare de energie. Necesitatea de aceste vitamine este influențată de intensitatea cheltuielii de energie și pentru o parte din ele rația se și exprimă la 1000 kcal. Vitaminele grupei B. Din vitaminele grupei B fac parte vitamina B1 (tiamina), vitamina B2 (riboflavina), vitamina PP (niacina), vitamina B6 (piridoxina), acidul folic, vitamina B12 (ciancobalamina)

1.2.2.Vitaminele liposolubile

Aceste vitamine sunt solubile în lipide și în solvenții acestora și practic insolubile în apă. Din această cauză, ele se găsesc numai în alimentele grase. Excluderea lipidelor din alimentație duce implicit la sărăcirea în aceste vitamine. Insolubilitatea lor în apă explică pierderile minime în timpul operațiilor de spălare și menținere în apă a alimentelor fragmentate. Coeficientul de utilizare digestivă a vitaminelor liposolubile este dependent de digestia și absorbția grăsimilor alimentare. Orice perturbare a acestui proces periclitează aprovizionarea organismului cu vitaminele respective. Așa se întâmplă în cazul insuficienței de lipază și în afecțiunile hepato-biliare care scad secreția de bilă și de săruri biliare sau împiedică ajungerea acestora în duoden. Dacă sunt ingerate în cantități mai mari decât necesarul zilnic, excesul se depozitează în lipidele tisulare, mai ales în cele hepatice, formând astfel rezerve care pot fi folosite în perioadele de carență alimentară. În acest caz, semnele clinice ale insuficienței vitaminelor apar după o perioadă mai îndelungată de aport alimentar deficitar.

Tezaurizarea vitaminelor liposolubile explică apariția fenomenelor patologice de hipervitaminoză, atunci când se consumă alimente foarte bogate în vitamine, mai ales dacă se administrează, parenteral, cantități foarte mari de produse farmaceutice. Referitor la modul de acțiune, putem spune că vitaminele liposolubile participă mai ales la procesele anabolice, acționând oarecum asemănător cu hormonii. Din acest motiv, copiii, adolescenții și femeile în perioada maternității au necesități mai mari și sunt mai sensibili la carență decât alte grupe de populație.

1.1.2.Principalele funcții a vitaminei B12 in organism

Vitamina B12 constituie cel mai puternic factor antianemic cunoscut pana in prezent. Desi este hidrosolubila, B12 se acumuleaza totusi, intr-o masura oarecare, in ficat, rinichi, plamani si splina. Cantitatea de vitamina ramasa nu este importanta si nu poate avea un efect toxic.

Surse de vitamina B12

Vitamina B12 se gaseste cu precadere in produsele de origine animala
–    carne de pui, vita, porc, mai ales in ficat; 
–    lapte, produse lactate; 
–    oua; 
–    fructe de mare: crabi, stridii, scoici;
–    somon, ton.
Cantitatea zilnic necesara pentru un adult este de 2,4 mcg vitamina B12 pe zi.

Functiile vitaminei B12

-Joaca un rol decisiv in buna functionare a sistemului nervos, ajutand la formarea tecii de mielina ce inveleste fibrele nervoase, esentiale pentru transmiterea de impulsuri nervoase in tot corpul. Datorita acestei functii, vitamina B12 constituie un aliat pretios in mentinerea acuitatii simtului tactil si auditiv, in perceptia durerii, in echilibru, ca si pentru sporirea capacitatii de invatare, impiedicarea pierderilor de memorie si pastrarea aplombului mental;
-Participa la procesul de reinnoire celulara, la sinteza AND-ului, a fierului, a vitaminei C, a acidului pantotenic, folic si la sinteza vitaminei B15;
– Intervine in procesul de maturizare a globulelor rosii, inlaturand astfel oboseala si anemia.
-Participa activ la metabolismul proteinelor, lipidelor si glucidelor;
– Contribuie la functionarea normala a celulelor, in special a celor din maduva osoasa;
– Are rol benefic asupra tractului gastrointestinal.
-In plus, aceasta vitamina are un rol important si in protejarea celulelor hepatice, datorita proprietatii ei de a impiedica depunerea grasimilor in ficat.

Deficienta de vitamina B12

Cand sistemul digestiv este inapt sa absoarba aceasta vitamina, apare un deficit, iar un regim alimentar inadecvat – tipic mai ales pentru vegetarienii convinsi, care nu consuma nici produse lactate si nici oua, poate genera carente de vitamina B12. De asemenea, persoanele in varsta sunt predispuse la deficitul mentionat.
Simptomele comune asociate cu deficienta de vitamina B12 pot include constipatie, pierderi de memorie, dificultati in mersul pe jos sau cand faci miscare, anemie, tulburari ale starii de spirit, amorteala, inflamarea limbii, dezorientare, deteriorarea tecii de mielina si dementa.
O cantitate insuficienta de vitamina B12 ar permite eliminarea unei substante numita homocistina care, atunci cand depaseste un anumit nivel, devine nociva pentru celulele cerebrale.
In acelasi timp, pe baza proprietatii sale procoagulante, care reprezinta un pericol pentru peretii arterelor, homocistina ar putea fi legata si de maladiile cardiovasculare.

1.1.3.Compoziție chimică

Fig.1 Vitamina B 12 (Cianocobalamina)

Formulă chimică:

C63H88CoN14O14P

Greutate moleculară:

1355,4 g/mol

Vitamina B12 (Fig.1) conține cobalt și joacă un rol important în producerea globulelor roșii ale sângelui. Această vitamină este una din cele mai cunoscute din complexul de vitamine B. În literatura de specialitate se întâlnește sub denumirea de cobalamină. Vitamina B12 este necesară pentru orice organism, reprezentând factori necesari pentru creșterea unor microorganisme. Se găsește în drojdia de bere,ficat, gălbenuș de ou, rinichi. Lipsa vitaminei B12 produce încetarea sintezei ADN și deci a diviziunii celulare. Dacă această vitamină nu poate să fie asimilată de organismele anumitor animale, se ajunge la tulburări digestive, neurologice, hematologice- tulburări ce pot fi îndepărtate prin administrarea produsului farmaceutic cu același nume

1.1.4.Analogi ai vitaminei B12

Analogii vitaminei B12 cunoscuti în prezent pot fi clasificați:

Analogi sintetici

Analogi naturali

Analogii sintetici provin din vitamina B12, prin înlocuirea ligandului CN cu alți liganzi anorganici. Stabilitatea deosebită a legăturii Co – CN a determinat utilizarea aquocobalaminei ca intermediar în obținerea cobalaminelor modificate. Aquacobolamina (vitamina B12a sau B12b hidroxi-cobalamina) conține în locul grupei CN o grupare OH sau o moleculă de apă. Ea se obține din surse naturale în absența ionilor CN, precum și prin reducerea sau fotoliza vitaminei B12. Prin tratarea aquacobolaminei cu acizii respectivi se obține clor-, brom-, sulfat-, tiocianat- și nitrit-cobalamine (ultima se mai numește și vitamina B12c) care sunt puțin stabile, iar în prezența ionilor cian trec cantitativ în vitamină B12.Tot din grupa analogilor sintetici fac parte și vitaminele B12r (cu cobalt bivalent) și B12s (cu cobalt monovalent) obținute prin reducerea vitaminei B12 în mediu acid sau bazic.

Din grupa analogilor naturali ai vitaminei B12 fac parte analogii fără nucleotid (de ex. acidul cobiric sau factorul Vla, cobinamida sau factorul B etc), analogii cu nucleotid, coenzime și analogi biosintetici (dehidrovitamina B12 etc).Analogii cu nucleotid conțin o altă bază în locul 5,6-dimetil-benzimidazolului. Astfel, pseudovitamina B12 conține un rest de adenină, factorul A un rest de 2-metil-adenină, factorul G un rest de α-hipoxantină, factorul H un rest de 2-metil-hipoxantină etc.

Coenzima vitaminei B12, analog natural al vitaminei B12, se caracterizează prin faptul că în locul ligandului cian are un ligand adeninic. Structura coenzimei vitaminei B12 (formă sub care vitamina B12 se găsește în ficat) poate fi reprezentată schematic prin structura (XV), în care cobalamina s-a reprezentat printr-un paralelogram.

Prin tratarea coenzimei vitaminei B12 cu cianură alcalină se obține ciancobalamină, adenină și dihidroxipentenal.Coenzima vitaminei B12, substanță de culoare roșie, are proprietăți fizico-chimice similare vitaminei B12, iar în soluție acidă se comportă ca un cation datorită protonizării.

1.1.5.Răspândire în natură

Vitamina B12 este unul dintre compusii necesari sintezei hemoglobinei, pigmentul care leaga oxigenul, o proteina din sange. Vitamina B12 este necesara pentru sinteza ADNului din celulele (care se divid rapid) din maduva spinarii. Lipsa vitaminei B12 sau folatului determina producerea de celule rosii imature, cu un continut redus de hemoglobina. Lipsa vitaminei B12 din organism produce anemie pernicioasă (cauzata de distrugerea celulelor stomacului), o maladie a sângelui însoțită de tulburări nervoase. Injecțiile cu vitamina B12 restabilesc numărul de celule (globule) roșii și reechilibrează sistemul nervos central în anemia pernicioasă. Vitamina B12 se gaseste numai in alimente de origine animala (carne, lapte sau oua). Cobalamina este produsă și de bacteriile din colon. Vitamina B12 este distrusă la incalzire.Vitamina B12 se găsește exclusiv în surse alimentare de origine animală: ficat, rinichi, carne slabă, ouă, lapte și brânză. Vitamina B12 nu suferă modificări în timpul preparării termice.

CAPITOLUL II. Identificarea și dozarea vitaminei B12

Pentru identificarea vitaminei B12 se utilizează curent metoda spectrofotometrică. Spectrul în ultraviolet al unei soluții apoase de vitamină B12 cu concentrația 0,003 – 0,004 % prezintă maxime de absorbție la 278 nm, 361 nm și 550 nm, iar rapoartele maximelor de absorbție trebuie să fie cuprinse între următoarele limite:

A361/A278 = 1,6 – 1,9; A361/A550 = 2,8 – 3,45.

Dozarea cantitativă a vitaminei B12 poate fi realizată prin metode microbiologice, metode spectrofotometrice directe și indirecte; metode polarografice, metode fluorimetrice, metode cromatografice și cu izotopi radioactivi.

În industrie se folosesc de obicei metodele spectrofotometrice, polarografice și microbiologice, iar pentru determinări cantitative rapide se folosește spectroscopia în ultraviolet.

2.1. Mecanisme de biosinteză a vitaminei B12

Cunoașterea mecanismului de biosinteză a vitaminei B12 și a sistemului corinic prezintă o deosebită importanță teoretică și practică, pentru stabilirea condițiilor optime de realizare a procesului de fermentație din tehnologia acestei vitamine. Din datele existente în literatură rezultă că în mecanismul de biosinteză a vitaminei B12 intervin două etape fundamentale:

1) formarea ciclului corinic

2) încorporarea restului nucleotidic cu formarea vitaminei B12.

Ciclul corinic se formează din radicalii pirolici, sintetizați – în același mod ca și în porfirine – din succinat și glicină, prin fazele intermediare de acid aminolevulinic (AAL), porfobilinogen și uroporfirinogen, conform schemei:

În procesul de transformare a porfobilinogenului în cobinamidă au loc reacții de metilare a ciclului corinic, formarea legăturii între atomii de carbon α – α din ciclurile A și D prin dehidrogenare în prezența cobaltului și introducerea grupelor amidice.

Cobinamida (sau factorul B) a fost izolată din culturile microorganismelor, confirmându-se astfel schema de formare prezentată mai sus.

Etapa a doua, în care are loc încorporarea nucleotidului în ciclul corinic cu formarea vitaminei B12 poate fi schematizată astfel:

În acest mecanism 5,6-dimetilbenzimidazol- α -d-ribozida este încorporată ca o componentă unitară. Formarea acestei componente nu este pe deplin elucidată, deși există o serie de date experimentale în favoarea mecanismului prezentat mai sus.

Cu toate acestea, schemele de mai sus reflectă corect mecanismul de biosinteză a vitaminei B12, fiind susținute de datele practice care au condus la separarea din biomasă atât a cobinamidei, cât și a nucleotidei (riboză-benzimidazol) și a unor intermediari (cobinamidă-fosfat, cobalamină-5'-fosfat etc.)

2.2.Biotehnologia fabricării vitaminei B12

Vitamina B19 este produsul de metabolism al unor actinomicete (Streptomyces grizeus, S. olivaceus, S. aureofacieus) sau a unor bacterii (Bacillus megatherium, Propionibacterium freudenreichi, Propionibacterium shermani, Propionibacterium technicum), fiind obținută prin fermentații specifice și nespecifice. În fermentația nespecifică produsul principal de biosinteză este un antibiotic, iar ca produs secundar rezultă vitamina B12.

Avantajul acestui tip de fermentație constă în faptul că materiile prime utilizate sunt ieftine, iar separarea vitaminei B12 din apele reziduale de la biosinteza tetraciclinelor și streptomicinei se face prin absorbția pe cărbune activ sau alt suport adsorbant.

Dezavantajul principal al acestui tip de fermentație îl constituie randamentul foarte scăzut în vitamina B12 și costul ridicat al procesului de separare și purificare.

În fermentațiile specifice sau dirijate se obține aproape în exclusivitate vitamina B12 asigurându-se randamente sporite în produs util. Acest procedeu este utilizat curent în fabricarea industrială a vitaminei B12, iar activitatea obținută este determinată de natura microorganismului și compoziția mediului utilizat. Rețelele principale ale mediilor pentru câteva specii de microorganisme sunt prezentate în tabelul 1.

În practică, pentru obținerea vitaminei B12, se utilizează curent Streptomyces olivaceus, Propionibacterium shermanii, Propionibacterium freudenreichii și Propionibacterium technicum, iar procesul de biosinteză este influențat de temperatură, pH, compoziția mediului, gradul de aerare, precursori și modul de sterilizare a mediului de cultură.

Deși compoziția mediului este determinată de natura microorganismului producător, totuși, din nici un mediu nu poate lipsi glucoza, săruri de cobalt, surse de aminoacizi și săruri anorganice. Proporțiile în care aceste componente intră în mediul de cultură sunt: amidon 2 % sau glucoza 5 – 10 %, extract de porumb 2 – 4 %, azotat de amoniu 0,6 – 1,2%, clorura de sodiu 0,2 – 0,3%, carbonat de calciu 0,4 – 0,5% și clorură de cobalt 0,04 – 0,06 %. Literatura recomandă utilizarea unui amestec de glucoză și lactoză care oferă randamente superioare în faza de biosinteză.

Tabel.1.Microorganismele utilizate în producția vitaminei B12 și rețetele corespunzătoare

Glucoza constituie sursa de carbon și de energie, reglând în același timp și pH-ul mediului la valori optime. Sursele de aminoacizi furnizate de uleiul de soia, borhoturi de spirt, făină de pește, extract de drojdie, extract de porumb, cazeină, hidroliat de cazeină etc., influențează direct asupra randamentului în vitamina B12. Astfel serina, glicina și metionina au un efect pozitiv asupra procesului de biosinteză a vitaminei B12, iar treonina, valina, leucina și acidul aspartic stimulează dezvoltarea bacteriilor. De asemenea, unele vitamine (colina, vitamina B2) influențează pozitiv creșterea biomasei, iar altele (biotina și vitamina B12) sinteza de vitamină B12. Trebuie să subliniem că produsele de degradare ale mediului de cultură în timpul sterilizării, ca și prezența ionilor de cupru reduc foarte mult randamentul în vitamina B12. Pentru evitarea acestui neajuns, se recomandă ca procesul de sterilizare să se efectueze în aparatură care să nu cedeze în mediu ioni de cupru la pH 7 și la temperatura de 120 – 125oC în proces discontinuu, sau la 140°C în proces continuu.

În biosinteza optimă a vitaminei B12 pH-ul are o importanță deosebită, iar menținerea lui la valoarea optimă este absolut necesară. Acest parametru variază în timpul fermentației funcție de gradul de aerație, tipul fermentatorului, concentrația hidraților de carbon etc. Se apreciază că valoarea pH-ului trebuie să fie sub 8, limitele optime fiind 7 – 7,5, iar menținerea la această valoare se face prin adăugare de acizi sau baze.

Intensitatea aerației și agitării influențează în primul rând asupra duratei de fermentație. Un aport de 0,4 milimoli oxigen/l mediu/min permite terminarea fermentației în 90 ore. Dacă aerația crește până la 0,7 milimoli oxigen/l mediu/min, durata procesului de fermentație scade până la 70 ore. Durata optimă a fermentației trebuie reglată în așa fel încât să se termine în 100 ore când, folosind Propionibacterium freudenreichii la 30ºC și pH 7, se obține o activitate de 9 gr cianocobalamină/ml mediu.

Există suficiente dovezi că unele microelemente, având rolul unor catalizatori biologici, favorizează procesul de biosinteză a vitaminei B12. Astfel, sărurile de cobalt și în mod deosebit clorura de cobalt (CoCl2 ∙ 6H20) în concentrație de 200 ppm dublează cantitatea de vitamină B12 în fermentația S. Olivaceus, iar în fermentația Propionobacterium freudenreichii se obține același efect cu numai 3 ppm. Alte microelemente, printre care zincul, fierul, magneziul, favorizează procesul de formare a vitaminei B12, în timp ce cuprul, mercurul, bismutul inhibă acest proces.

Efectul unor microelemente asupra procesului de biosinteză a vitaminei B12 este redat în tabelul 2, din care rezultă că adăugarea carbonatului de zinc produce o creștere a producției cu 50 %, în timp ce adăugarea sărurilor de crom și argint are un efect foarte redus.

Tabelul 2.Efectul microelementelor asupra biosintezei vitaminei B12

În dirijarea procesului de fermentație un rol deosebit îl au precursorii, care influențează direct asupra randamentului în vitamina B12. Dacă în fermentația nespecifică adaosul de precursor (5,6-dimetilbenzimidazol) nu intensifică producția de ciancobalamină, în fermentație dirijată precursorul determină o creștere substanțială a randamentului. Pentru a obține un efect maxim, se recomandă adăugarea precursorului în intervalul de 48 – 72 ore de fermentație; cantitatea optimă de precursor fiind 0,5 – 7 mg/l.

Un alt factor care influențează randamentul în vitamină B12 este temperatura. Din studiile existente în literatură rezultă ca randamente maxime în vitamină se obțin la 28 – 30oC.

Parametrii procesului de fermentație a vitaminei B12 depind în mare măsură și de natura microorganismului producător și de cantitatea și calitatea inoculului. Dacă în procesul de fermentație se dezvoltă bacterii propionice atunci aerația trebuie redusă foarte mult, deoarece în mediu puternic aerat se ajunge repede la liza bacteriilor și distrugerea produsului format. De asemenea, utilizarea unui inocul concentrat și a unui mediu de cultură cu un conținut de 2 % lactat de sodiu sau acid lactic permite reducerea duratei de fermentație și ridicarea conținutului de vitamină B12, ca rezultat al simbiozei bacteriilor lactice și propionice.

Industrial, procesul de fermentație se realizează ca și la antibiotice, în trei stadii: inoculator, intermediar, regim. În tot timpul procesului de fermentație se păstrează riguros temperatura optimă și o suprapresiune de 0,2 – 0,3 at, care asigură sterilitatea biomasei.

În mersul normal al procesului de fermentație valoarea pH-ului coboară în primele 24 ore până la 5 (datorită formării acidului acetic, propionic și CO2), iar apoi începe să crească repede, încât în cursul altor 48 de ore trece de valoarea 8. Pentru menținerea pH-ului la valoarea optimă de 7 – 7,5 se face corecția prin adăugarea de acizi minerali sau hidroxizi alcalini.

Glucoza, care se consumă în timpul fermentației, se adaugă în porțiuni, astfel încât concentrația să fie în permanență peste l%, iar precursorul 5,6-dimetil-benzimidazol se adaugă în porțiuni în perioada dintre 48 și 72 ore. După cum rezultă din diagrama ce descrie dinamica procesului de biosinteză a vitaminei B12 , glucoza se adaugă treptat, începând din ziua a doua de fermentație.

Urmărindu-se evoluția în timp a procesului de biosinteză, s-a stabilit că în culturile de Propionibacterium shermanii (principalul producător de vitamină B12 la scară industrială) după prima zi se formează factorul B, iar după a doua zi se formează factorul C și vitamină B12. Prin adăugarea de precursor toate produsele de fermentație trec în vitamină B12.

După cum s-a arătat mai sus, atât vitamina B12 cât și porfirinele se formează din acidul δ-amino-levulinic, iar deplasarea procesului spre deformarea de vitamină B12 se poate realiza prin adaos de săruri de cobalt, de microelemente (Zn, Mi, Mg) și de fosfat de amoniu.

Pentru a evidenția rolul hotărâtor al cobaltului în dirijarea transformării acidului δ-amino-levulinic în vitamină B12 s-au efectuat culturi în prezența și absența cobaltului. În prezența cobaltului se formează intensiv vitamină B12, iar cantitatea de porfirine extracelulare este foarte mică (Fig.2) comparativ cu cea din culturile lipsite de cobalt (Fig.3)

Fig.2. Biosinteza vitaminei B12 și a porfirinelor de către P. Shermanii pe medii cu Co2+:

1 – vitamina B12, γ / g; 2 – biomasa, g / l;

3 – porfirine intracelulare, γ / g; 4 – porfirine extracelulare, γ / g

Fig.3.Biosinteza porfirinelor de către P. Shermanii pe medii fără Co2+:

1 – vitamina B12, γ / g; 2 – biomasa, g / l;

3 – porfirine intracelulare, γ / g; 4 – porfirine extracelulare, γ / g

În ambele cazuri, cantitatea de porfirine intracelulare și extracelulare scade pe măsură ce procesul de fermentație avansează. Acest fapt este datorat scăderii conținutului de acid δ-amino-levulinic(Fig.4) acid produs numai de celulele tinere

Fig.4 Elaborarea acidului δ-amino-levulinic intracellular

în culturile de P. shermanii:

1 – pe medii cu cobalt;

2 – pe medii fără cobalt.

Studiul acumulării vitaminei B12, în funcție de perioada de introducere a cobaltului, demonstrează că introducerea acestuia la începutul dezvoltării masei celulare și după 24 sau 48 de ore nu are o influență prea mare asupra procesului de biosinteză dar, dacă adăugarea cobaltului se face după 72 de ore, se observă o scădere a vitezei de acumulare a vitaminei B12, iar această scădere este cu atât mai pronunțată cu cât vârsta masei celulare este mai mare(Fig.5)

Fig.5.Efectul vârstei microorganismelor asupra biosintezei vitamine B12 în culturile de P. Shermanii

Adăugarea concomitentă a cobaltului și a acidului δ-amino-levulinic, în stadiile avansate de fermentație, produce o intensă stimulare a procesului de biosinteză a vitaminei B12 (Tabel 3)

Tabelul.3 Efectul cobaltului și acidului δ-amino-levulinic asupra biosintezei vitaminei B12

Prin urmare, introducerea cobaltului în culturile de P. shermanii încă de la inoculare și adăugarea acidului δ-amino-levulinic spre sfârșitul perioadei de fermentație permit obținerea unor concentrații mari în vitamină.Corelarea principalilor parametrii, din procesul de fermentație a Propionibacterium shermani, este redată in figura 6.

Fig.6.Dinamica procesului de biosinteză a vitaminei B12 de către P. Shermanii

Vitamina B12 rezultată în urma procesului de fermentație a bacteriilor propionice se găsește în masa celulară, fiind legată de partea proteică. Pentru izolarea vitaminei B12 masa celulară se separă de lichidul de cultură, tratat în prealabil termic și cu coagulanți, prin centrifugare sau filtrare pe filtru presă și se prelucrează prin extracție.

2.3.Separarea și purificarea vitaminei B12

Separarea și purificarea vitaminei B12 este una din operațiile foarte costisitoare datorită diluției mari în care se găsește ea în soluție. Metodele utilizate, asemănătoare metodelor de separare a antibioticelor, cuprind următoarele etape:

coagularea și denaturarea proteinelor celulare

adsorbția vitaminei B12

purificarea prin extracții cu solvenți;

cianurarea;

concentrarea și purificarea finală;

cristalizarea produsului obținut

Separarea vitaminei B12 obținută prin fermentații nespecifice se face prin adsorbția pe cărbune activ, bentonită sau talc, apoi se eluiază cu alcooli alifatici, iar din soluția alcoolică se extrage cu solvenți, se reextrage în apă și se purifică prin cromatografiere.

Procesul de separare și purificare a vitaminei B12 obținute prin fermentații dirijate cuprinde mai multe etape de extracție urmate de cromatografiere, cristalizare și filtrare. În prima etapă masa microbiană obținută la filtrare se suspendă în apă și se acidulează cu HCl, sub agitare și încălzire la 80 – 90°C, pentru eliberarea vitaminei B12 și trecerea ei în soluție apoasă. După aceasta soluția se salifiază cu NaCl și se filtrează pentru separarea masei celulare.

Tanaka și colaboratorii separă vitamina B12 din biomasă prin tratarea lichidului de cultură cu sulfit de sodiu sau sulfit acid de sodiu la pH 6 și temperatura de 80°C, iar Rolovich și Devescovi încălzesc masa bacteriană suspendată în apă la 100 -120°C.

Din soluția apoasă clară, rezultată de la filtrare, se extrage vitamina B12 cu un amestec fenolbutanol (1:1), folosind un raport între soluția apoasă și amestec de solvenți de 20:1. Extractul organic conținând vitamina B12 se tratează cu apă (raport 20:1), pentru reextracția acesteia din solvenți în apă. Soluția apoasă de vitamină B12, obținută după separarea fazelor, se tratează cu cianură de sodiu la pH 7,5 – 8 pentru transformarea cobalaminelor în ciancobalamine și se supune purificării. Purificarea vitaminei B12 pentru obținerea ciancobalaminei – vitamina B12 adevărată – este unul din marile secrete industriale ale acestei tehnologii, motiv pentru care procedeele respective sunt în majoritatea cazurilor acoperite de brevete, iar altele, sumar descrise în literatură, sunt foarte greu, dacă nu chiar imposibil de reprodus.

Acesta este și motivul pentru care în ultimii ani – având în vedere creșterea continuă a producției de vitamină B12 și prețul de cost foarte ridicat în comparație cu alte produse medicamentoase – au apărut puține lucrări descriind tehnologii noi de purificare care să fie raționale și din punct de vedere economic. În principiu, purificarea se realizează în două etape: extracții succesive cu solvenți urmate de reextracții în apă și apoi, purificarea finală, care se realizează prin cromatografie preparativă, schimbători de ioni sau prin alte metode.

Pentru purificarea vitaminei B12 cu solvenți se folosește un amestec de crezol-tetraclorură de carbon. Operația se repetă de două ori, după care urmează o purificare suplimentară cu KAl(SO4)2 sau se precipită vitamina B12 sub formă de complex cuprocianic. După eliminarea pseudovitaminelor, printr-o nouă reextracție cu amestec de crezol-tetraclorură de carbon la pH 8,0 rezultă o soluție cu vitamină B12 parțial purificată. Din soluția organică vitamina B12 se extrage în apă, iar soluția apoasă se prelucrează prin cromatografiere.

După un brevet canadian, pentru purificarea vitaminei B12 se folosește un dizolvant alcoolic în prezența unei sări minerale neutre și solubile (de exemplu Na2SO4). Din soluția alcoolică vitamina B12 este extrasă în apă și apoi, cu un acid monocarbonic alifatic care conține 4 -14 atomi de carbon (de ex. acid ciclohexil-acetic), se îndepărtază ultimele impurități care însoțesc vitamina B12, după care se prelucrează prin cromatografie.

Cromatografia are un rol esențial în întreaga fabricație de vitamină B12, fiind faza tehnologică care asigură purificarea avansată a vitaminei B12 și separarea analogiilor ei (pseudovitamine). Procedeele de cromatografie care sunt practicate actualmente, folosesc drept material adsorbant oxidul de aluminiu, celuloze speciale, silicagel, schimbători de ioni cu proprietăți adsorbante etc.

Cromatografia pe oxid de aluminiu s-a impus cu autoritate încă de la începutul fabricației vitaminei B12, fiind citată de Lester Smith și Goferman, care au efectuat studii sistematice în acest sens, ca metodă deosebit de eficace.

Oxidul de aluminiu folosit are activitatea I sau II (după metoda Brockman) și o umiditate de 1- 6%.

Concentratul purificat după extracție cu solvenți, având o concentrație în vitamina B12 de 5 – 8 000 γ/ml, prin trecerea pe coloană cromatografică și eluție ajunge la circa 20 000 γ/ml și este suficient de pur pentru cristalizarea vitaminei B12. Pentru aceasta se adaugă acetonă până la apariția opalescenței, care indică începerea procesului de cristalizare a vitaminei B12, se lasă 20 – 30 ore pentru creșterea cristalelor, după care acestea se filtrează, se spală cu acetonă și eter farmaceutic și se usucă la vid.

Separarea vitaminei B12 din soluția apoasă se poate face și prin complexare cu acid metilendisalicilic, acid oxinaftalincarboxilic, acid 5-brom sau clor-salicilic, acid 5-nitrosalicilic, acid fenilsalicilic etc.

Acidul metilendisalicilic este cel mai economic, iar randamentele complexării sunt cuprinse între 90 și 100%.

Complexul vitaminei B12 cu acidul metilen-disalicilic precipită la pH acid, iar prin redizolvarea complexului în soluție acetonică la pH alcalin se separă acidul de complexare și precipită vitamina B12 pură.

CONCLUZII

Vitaminele sunt substanțe organice cu greutatea moleculară mică, cu o activitate biologică importantă. Vitaminele, în majoritatea cazurilor, nu se sintetizează în organism; ele sunt aduse odată cu alimentele. Aceste substanțe, în cantități mici, îndeplinesc funcția de coenzime. După gradul de solubilitate, vitaminele se împart în două grupe: hidrosolubile (B1, B2, B6, B12, Bc, H, N, C, PP, P) și liposolubile (A, D, E, K). Substanțe asemănătoare cu vitaminele sunt acidul pangamic (vitamina B15), acidul paraaminobenzoic (H), holina (B4), inozita (B8), carnitina (Bt), acizii grași polienici (vitaminele F, U), acidul orotic (B13). Vitaminele participă la multe procese biochimice, sporind rezistența organismului la mulți factori externi nefavorabili: infecții, frig, toxine etc. De asemenea, ele favorizează capacitatea de muncă fizică și intelectuală, sporesc funcția glandelor endocrine și activitatea hormonilor. Carența sau surplusul de vitamine în alimentație cauzează astfel de patologii ca avitaminozele, hipovitaminozele sau hipervitaminozele. Necesitățile de vitamine depind de sex, vârstă, greutate corporală, gradul de efort fizic, respectarea echilibrului de substanțe nutritive, starea fiziologică a organismului, starea sănătății, condițiile climaterice și de alți factori. Necesitatea în vitamine crește la o muncă intelectuală intensă, la eforturi fizice mari, în caz de insuficiență de insolație, la expunere la frig. Necesarul de vitamine trebuie să fie asigurat de produsele alimentare. În fructe și legume, cantitățile de vitamine depind de condițiile de cultivare, de păstrare, de tehnologia preparării culinare etc. Vitaminele ca preparate farmaceutice pot fi recomandate în perioada iarnă– primăvară, în cazuri de alimentație dietetică strictă sau de condiții climaterice nefavorabile.

Unul dintre principiile alimentației raționale este asigurarea organismului cu substanțe nutritive în cantitățile și compoziția chimică adecvate necesităților fiziologice. Nerespectarea acestui principiu generează anumite modificări funcționale în organism, diverse stări patologice, uneori poate cauza chiar moartea. O condiție obligatorie a alimentației echilibrate este asigurarea organismului cu cantitățile necesare de nutrimente și substanțe biologice active – proteine, lipide, glucide, vitamine, săruri minerale – în raporturi optime. La o alimentație echilibrată se va ține cont de vârstă, sex, de specificul activității profesionale și de modul de viață. Actualmente, este bine stabilit echilibrul dintre nutrimentele energogene, respectându-se raportul dintre proteine, lipide și glucide (1:1,2:4,6). Compoziția chimică a alimentelor depinde de prezența în ele a proteinelor, lipidelor, glucidelor, vitaminelor, sărurilor minerale și a apei. În corespundere cu funcțiile biologice ale substanțelor nutritive, ele pot fi clasificate în: a) substanțe energogene – lipide, glucide; b) preponderent plastice – proteine, un șir de săruri minerale; c) apă; d) substanțe catalitice – vitamine, microelemente. În funcție de importanță, substanțele nutritive pot fi indispensabile sau esențiale

BIBLIOGRAFIE

Burlui V.,Silvaș MS.Clinica și Terapia Edentației Totale, Iași,Editura Apollonia, 2003

Anusavice KJ. Phillips’s Science of Dental Materials.11thEdition ,Philadelphia, PA. Saunders,2003

Andrès E.,Fothergill H.,Mecili M. Efficacy of oral cobalamin (vitamin B12) therapy, 2010

Bachmann SP.,Ramage G.,VandeWalle K.et al.Antifungal combinations against Candida albicans biofilms in vitro. Antimicrob Agents Chemother,2003

http://www.umfiasi.ro/ScoalaDoctorala/TezeDoctorat/Teze%20Doctorat/Rezumat%20BUDAL%C4%82%20DANA%20GABRIELA.pdf

Vitamina B12 – surse, functii si efecte

http://library.usmf.md/old/downloads/ebooks/Ostrofet.Curs.de.igiena/5.vitaminele.pdf

.