Virusul Bvd

INTRODUCERE

Virusul BVD, agentul cauzal al diareei virale bovine este unul dintre cei mai răspândiți agenți patogeni ai bovinelor la nivel mondial, prezența sa fiind marcată de apariția unor forme clinice ce se pot manifesta variat, de la apariția și evoluția inaparentă a infecției până la o formă complicată fatală Boala Mucoaselor. Ca urmare a particularităților evolutive și de manifestare prin care se caracterizează boala, atât la nivel mondial cât și în țara noastră, lupta împotriva acestei boli a constituit un prilej pentru controverse. Aspectele legate de apariția bolii atât în cadrul fermelor cât și la nivelul exploatațiilor nesistematizate sunt dificile de individualizat și de recunoscut într-un interval optim de timp.

Pentru o intervenție promptă, sunt necesare cunoștințe și informații de esență pentru a lua decizii specifice, ce ulterior se doresc a fi implementate în mod individualizat în fiecare exploatație cu scopul de a atinge țelul propus. Un pas important în atingerea obiectivului ce prevede eliminarea virusului Diareei virale bovine îl constituie gradul avansat de tehnologizare a laboratoarelor de referință care folosind tehnici avansate biomoleculare pun astfel bazele unor noi începuturi în această direcție.

Diareea virală a bovinelor este o boală infecțioasă fiind considerată una dintre cele mai importante entități ce determină pierderi remarcabile în rândul crescătorilor de bovine, atât financiare cât și de efectiv. Pentru exploatațiile afectate, aceste pierderi sunt mult mai mari decât valoarea medie, care include și fermele fără probleme în evaluare. Deși efectivul de animale nu pare bolnav, pagubele apar ca urmare a unei evoluții insidioase și îndelungate a diareei virale bovine. Atât fermele specializate în producția de lapte, cât și cele specializate în producția de carne întâmpină probleme de fertilitate ce determină un bilanț anual negative. Astfel, pentru a împiedica o parte din pierderi și agravarea problemelor se pot aplica prin măsuri de profilaxie specifică.

Condiționați de asigurarea normelor de sănătate și bunăstare în ferme, e necesar a se adopta o modalitate eficientă pentru înțelegerea mecanismului de acțiune al Diareei virale bovine și pentru a acționa deopotrivă în rezolvarea situației.

Înainte de implementarea oricărui program de combatere sau de control, e recomandat a se realiza o evaluare a statusului imun al efectivului, precum și a prevalenței bolii în cadrul grupului respectiv. Pentru a realiza acest obiectiv este necesară testarea a unui număr minim de 10 seruri provenite de la naimale cu vârste între 6 și 24 luni. Dacă în urma testării se remarcă prezența anticorpilor est necesară identificarea animalelor eliminatoare, precum și îndepărtarea lor din efectivele respective. De asemeni, se recomandă și testarea tuturor animalelor cu o vârstă mai mică de 3 ani. Dacă animalele infectate, nu sunt eliminate, vaccinarea nu va avea efectul scontat. Prezența uni singur animal prezintă un risc major pentru înteg efectivul exploatației respective.

Amploarea problemelor dintr-o fermă depinde de mulți factori suplimentari precum: numărul de animale sensibile în momentul prezenței virusului în efectiv, stadiul gestației al animalelor afectate și de numărul de indivizi PI. Astfel se explică faptul că în fiecare fermă evoluția bolii este diferită.

În funcție de abordarea situației, există multe opțiuni ce pot prezenta atât avantaje cât și dezavantaje, iar pentru a soluționa corect problemele, se impune a se alege metoda optimă.

În cazul BVD-MD este de reținut faptul că animalele infectate persistent constituie rezervorul permanent de virus, iar în timpul unui episod clinic poate elimina o cantitate mică de material viral dar care este suficientă pentru infectarea altor 30 de animale. Animalul gazdă poate elimina aproximativ două sute de mii de doze infecțioase pe gramul de infecție nazală, ceea ce este sufficient pentru a infecta jumătate din populația de bovine din Europa. Se deduce astfel, că un procent relativ scăzut de astfel de animale gazdă (1-2%) pot menține și difuza virusul în efectivele de bovine.

Adresez mulțumiri colectivului de la disciplina de Boli Infecțioase pentru ajutorul acordat la întocmirea lucrării de față și în mod deosebit domnului Prof. dr. Gheorghe Săvuța.

PARTEA I

DATE BIBLIOGRAFICE PRIVIND DIAREEA VIRALĂ BOVINĂ-BOALA MUCOASELOR (BVD-MD)

CAPITOLUL 1

DATE BIBLIOGRAFICE PRIVIND DIAREEA VIRALĂ BOVINĂ-BOALA MUCOASELOR (BVD-MD)

Definiție. Istoric. Răspândire geografică și importanță

Definiție: Diareea virală – Boala Mucoaselor (BVD-MD) este un complex morbid

infecțios și contagios al bovinelor, ce evoluează clinic prin febră, tulburări digestive, respiratorii și reproductive iar anatomopatologic prezintă leziuni erozive sau ulcerative ale mucoasei tubului digestiv și ale altor organe.

Istoric

Complexul BVD-MD, în comparație cu alte boli de natură virală, are un istoric scurt dar în același timp dinamic. Prima entitate din acest complex morbid, a fost descrisă pentru prima dată în 1946 de către Childs care remarcă faptul că un efectiv de bovine din Saskatchewan, Canada este afectat de o boală de origine necunoscută ,,X” caracterizată de un procent de morbiditate scăzut, dar unul de mortalitate crescut. Bovinele afectate prezentau febră, deshidratare ca urmare a unori descărcări diareice apoase sanguinolente, eroziuni și ulcere la nivelul mucoasei nazale, a botului și cavității bucale precum și alte semne (din perspectiva de azi) tipice simptomelor de BVD. În raportul inițial descris erau prezentate de asemeni și leziuni ale pielii situate la nivelul urechilor, a regiunilor inghinale, perianale, precum și partea interioară a coapselor.

În decursul aceluaiși an, medici și oameni de știință de la Universitatea Cornell au raportat prezența unui focar de boală în staul New York/SUA similar celui din vestul Canadei. Deși o mare parte din semnele clinice erau asemănătorii bolii ,,X” din Canada, Peter Olafson a remarcat și prezența unei componente respiratorii, leucopenie, un randament scăzut al producției de lapte și o rată crescută a avorturilor.

În anii cincizeci, fermierii și medicii veterinari din Iowa/SUA, constată apariția unei alte forme de manifestare a virusului diareei, caracterizată prin hemoragii și eroziuni intestinale (Xue, Minocha, 1993). Astfel, această formă de manifestare a primit numele de ,,boala mucoaselor de Iowa”. În 1956, Hoag și col. descriu ,,boala mucoaselor de Virginia”. Spre deosebire de virusul diareei virale, cel care determină boala mucoaselor nu a putut fi reprodus experimental. Astfel, s-a stabilit că ,,diareea virală” și ,,boala mucoaselor” sunt două boli diferite.

Trei ani mai târziu, la Universitatea din Cornell, se reușește izolarea virală a tulpinii citopatice de la un caz de diaree virală (VD) din Oregon. Acest virus a fost denumit Oregon C24V. În urma examinării proprietăților fizice și a celor antigenice, rezultatele au concluzionat că ambele tipuri virale dețin structuri asemănătoare, dar sunt și strâns înrudite de virusul pestei porcine clasice (la acea dată, cunoscut ca holera porcină).

În 1961, tulpina virală Oregon C24V a fost supusă la 32 de pasaje pe culturi celulare de bovine, până când s-a confirmat capacitatea sa de a produce seroconversia fără semne clinice. Acest virus atenuat a devenit asfel primul vaccin comercial. Datorită patologiei aproximativ similare, precum și a reactivității încrucișate uimitoare a anticorpilor împotriva celor doi agenți a patogeni, diareea virală (VD) și boala mucoaselor (MD) au fost considerate a fi un complex de boli. Diareea virală (VD) se caracterizează prin morbiditate ridicată și mortalitate scăzută la toate grupele de vârstă, în timp ce boala mucoaselor (MD), apare cu preponderență la animalele tinere, cu o morbiditate scăzută, dar letalitate mare. La sfârșitul anilor șaizeci, Gillespie și col. au dovedit identitatea agenților etiologici, arătând că, de fapt, este vorba numai de două forme de manifestare întrucâtva diferite ale unei și aceleiași boli, denumită ,,boala mucoaselor” și ,,diareea virală bovină”. Din acest motiv, majoritatea autorilor folosesc în mod obișnuit denumirea de BVD-MD.

În urma studiilor efectuate, s-a confirmat că BVD-MD poate produce avorturi, malformații congenitale și viței neviabili. Ca urmare a complicației survenite în urma infecției cu tulpina virală necitopatică în timpul vieții intrauterine ce a dus la apariția formei de ,,MD cronic”, vițeii nu au trăit mult timp. Find infectați persistent, aceștia au prezentat o particularitate imunologică specială și anume că organismul lor nu a reușit să producă anticorpi împotriva virusului BVD-MD (Rijn și col.,1997).

În anul 1984, Brownlie și col., au reușit reproducerea experimentală a bolii mucoaselor (MD) prin inocularea virusului citopatic, acesta fiind din punct de vedere antigenic omolog virusului necitopatic care determină infecții persistente. La sfârșitul anilor ’80, virusul Diareei Virale Bovine (BVDV) a fost clasificat ca fiind un Pestivirus, care împreună cu virusul Pestei Porcine Clasice (CSFV) și virusul Bolii de Frontieră (BDV) au fost încadrați ca aparținând familiei Togaviridae. Tot în perioada anilor optzeci, au apărut primele cazuri înregistrate la bovine și viței manifestate printr-un sindrom hemoragic sever determinat de BVDV-ul necitopatic. Această formă severă de BVD a fost însoțită de febră și trombocitopenie și marcată de prezența diareei hemoragice, epistaxis precum hemoragii peteșiale și echimoze la nivelul mucoaselor. Pentru a se elucida dilemele apărute, cercetarea la nivel imunologic, molecular și genetic a fost propulsată viguros astfel că în 1991 virusul diareei virale bovine a fost încadrat ca aparținând familie Flaviviridae.

În România, boala a fost identificată serologic și virusologic de Coman (1968), Perianu și col., (2005). Boala este răspândită pe toate continentele, dar este mai frecventă și mai păgubitoare în țările în carese practică creșterea intensivăa bovinelor. Pentru efectivele mari, boala este considerată cea mai gravă dintre virozele enteropulmonare ale bovinelor. După Coman (1971), în efectivele din România a fost găsită o incidență a infecției de aproximativ 80 %.

Importanța economică a bolii rezidă din datele ce demonstrează că pierderile înregistrate sunt costisioare ca urmare a ratei mari de avorturi, a fătărilor de viței neviabili, a sacrificărilor de necesitate, a anomaliilor produse și a nerealizării sporului în greutate. La acestea se adaugă și costul tratamentelor animalelor bolnave precum și cheltuielile privind aplicarea măsurilor de prevenire și combaterea bolii.

Pierderile economice datorate prezenței și activității virusului BVD sunt considerabile, deși uneori gradul pierderilor este destul de dificil de calculat și reprezentat, deoarece trebuie să se plece de la premisa că o parte din infecțiile datorate BVD-lui rămân nediagnosticate sau pierderile asociate acestor infecții nu sunt recunoscute ca fiind cauzate de virus. În completarea celor prezentate, intervin o serie de factori ce prin prisma potențialului intervin marcant în pierderile reale. O serie dintre aceștia se referă atât la structura exploatației cât și la cea a efectivului de animale (procentul de viței, de juninci și vaci în diferite stadii de gestație), procentul de animale susceptibile (seronegative) din diferite categorii de vârstă, riscul expunerii, amploarea pierderilor cauzate de infectarea unui animal susceptibil (virulența virusului, cofactori) sau costul pierderilor fiecărei categorii. Ponderea pierderilor nu se datorează manifestărilor clinice ale bolii, deși acest aspect poate fi raportat și calculat cu cea mai mare exactitate,ci datorită pierderilor cauzate de reducerea fertilității și a producției de lapte a animalelor.

Astfel, în anul 1990, în urma unor studii efectuate în Țările de Jos, cunoscute la nivel european pentru sectorul de activitate dedicat creșterii bovinelor s-a reușit concretizarea pierderilor prin cifre exacte. Studiul a cuprins un număr de 14 ferme afectate de evoluția BVD-lui prin pierderi remarcabile de avorturi spontane, fătări de produși morți, defecte congenitale, leziuni la copite, animale PI și MD. Autorii studiului au constatat că pierderile pe cap de bovină de lapte s-au situat în medie în jurul cifrei de 136 de guldeni (aprox. 61,2 euro). Această sumă a suferit variații de la o fermă la alta cuprinzând valori între 42-285 de guldeni ( aprox.18,9-128,3 euro) la acea vreme (Wentink și col.,1990).

Un alt studiu efectuat în anul 1998 de către Stelwagen și Dijkhuizen la o fermă de bovine de lapte din Olanda relevă pierderi generale ale exploatației respective în valoare de 96,000 de guldeni (43.200 euro) datorate în principal vițeilor persistent infectați (PI).

1.2. Etiologie

Agentul etiologic al diareei virale bovine – boala mucoaselor este un virus filtrabil, încadrat în genul Pestivirus, familia Flaviviridae, alături de virusul pestei porcine clasice (CSFV) și cel al bolii Border ( Coleet și col., 1988). Aceeași familie are în subordine și genurile Flavivirus și Hepacivirus. Particulele virale apar ca formațiuni sferoidale, având un diametru de 40-60 nm și conțin ARN monocatenar (Murphy și col.,1990). Dimensiunea genomului viral a fost estimată prin electroforeză în gel la 12-13 Kb. Virusul se prezintă sub două forme biologice sau biotipuri, identice din punct de vedere antigenic (Mc Clurkin, 1985), diferențiabile numai ,,in vitro”; biotipul citopatogen (CP) induce în culturi celulare (rinichi, testicul, intestin, embrion bovin, etc.) vacuolizare citoplasmatică, rotunjire celulară, detașarea pereților celulari cu distrucția acestora și liză celulară. Biotipul necitopatogen (NCP) nu determină liză.

Diferențele între sușele citopatogene, sunt de ordin pur cultural și nu în ceea ce privește patogenitatea pentru animal. Biotipul citopatogen este asociat cu formele evolutive de boală și se menține în efectivul de bovine prin derivarea sa directă din virusul necitopatogen, probabil prin mutații. Uneori au fost semnalate și episoade letale, produse de virusuri necitopatogene (Bolin și col., 1985).

Perechile antigenice izolate de la cazurile mortale ale sindromului trombocitopenic de la bovine sunt toate, până în prezent, descrise ca necitopatogene. Animalele infectate persistent cu virusul BVD-MD, găzduiesc numai biotipul necitopatogen, în timp ce ambele biotipuri, citopatogen și necitopatogen, pot fi izolate de la animale afectate de boala mucoaselor.

În ceea ce privește diversitatea fenotipică, referitoare la variațiile antigenice, la gradul de infectivitate, precum și la rata de replicare, acestea pot fi atribuite fenomenelor de rearanjare, mutație sau recombinare ce au loc la nivel de genom. Cu ajutorul anticorpilor monoclonali s-a demonstrat că există o mare simiitudine antigenică, mai ales în ceea ce privește glicoproteinele majore gp 53 și gp 48, între cele două biotipuri izolate de la același animal mort de boala mucoaselor, în timp ce variațiile sunt mult mai marcante la tulpinile izolate de la animale diferite. Această constatare întărește ipoteza ce susține că forma citopatică a virusului BVD-MD derivă prin mutații ale formei necitopatogene găzduită de animalele purtătoare asimptomatic (Brownlie, 1992). Mutația este totdeauna situată la nivelul genei care codează proteina nestructurală 125 Kd (NS 2-3) și prin clivare va da naștere proteinei Kd (NS 3) observată în celulele lizate de tulpina citopatogenă.

NS 3 este considerată o proteină marker pentru BVDV citopatogen. Actualmente diferite studii întăresc faptul că diferite alterații genetice severe permit identificarea biotipului citopatic datorită exprimării proteinei NS3. Aceste alterații includ: introducerea ARN-ului în regiunea de codificare NS2-3, duplicare și rearanjarea secvențelor virale la nivelul NS2-3, duplicarea câtorva baze din regiunea de codificare și în afara cadrului de citire, eliminarea genelor care codifică proteinele virale strucuturale ce sintetizează particule defecte citopatice, precum și mutații punctiforme ce au loc la nivelul regiunii de codificare a NS2 și recombinarea cu secvențele NS2-3 ale subtipului citopatic. Cazul inversat ( mutație de la citopatogen la necitopatogen) a fost descris de (Nakamura și col., 1997), însă acesta rămâne controversat

În natură se constată existența de cupluri citopatogene/necitopatogene antigenic identice (Paton, 1995). Analiza diversității antigenice a dmonstrat că există două grupe I și II, ce pot fi diferențate la nivel genotipic (Ridpath și col., 1995). Cele două genotipuri sunt considerate acum ca specii diferite: BVDV I (Classical BVDV isolates) și BVDV II (Atypical BVDV isolates).

Tulpinile descrise ca responsabile de ,,Sindromul hemoragic grav” în America de Nord aparțin grupului II (Pellerin și col., 1994), în timp ce tulpinile implicate în forma clasică de BVD-MD, grupului I. Totuși au fost semnalate focare de boală cu evoluție acută severă, determinate de tipul II de virus BVD-MD (Paul H.W., și col). Virusul BVD – MD se poate asocia cu virusul rinotraheitei infecțioase bovine și cu virusul sincițial respirator bovin ( cu acesta din urmă având efect sinergici) și are efect imunosupresor putând favoriza în îngrășătorii apariția pasteurelozei.

1.3. Caractere epidemiologice

1.3.1. Receptivitate

În mod natural sunt receptive taurinele de toate vârstele, dar o sensibilitate crescută se remarcă la tineretul cu vârstă între 2 luni și 2 ani și la rasele perfecționate. De asemeni factori precum, alimentația deficitară și sezoanele reci influențează gradul de receptivitate. Infecția a fost observată și la bubaline, mai rar la cerbi și căprioare (Neetleton, 1990). Oile, caprele și suinele fac forme inaparente, cu producere de anticorpi ce pot fi depistați ulterior serologic: la bovine (15,29%), la bubaline (23,21%), în India (Sudharshana și col., 1999), la ovine (37,6%) în Germania și la reni în America de Nord (Rijn și col., 1997).

1.3.2. Factori de impact

Diareea virală – boala mucoaselor are o distribuție mondială și este caracterizată de o rată înaltă a prevalenței și o rată relativ scăzută a morbidității. Deoarece virusurile ARN sunt mai sensibile la mutații, este importantă monitorizarea tulpinilor de BVD pentru a facilita implementarea măsurilor de control.

Astfel, în urma cercetărilor efectuate în SUA în perioada Iunie 2012 – Februarie 2013 s-au înregistrat următoarele date: din 515 probe analizate, subtipul 1b a avut o rată de prevalență de 73 %, urmat de subtipul 2a cu o rată de 17 %.

Fig. 1.3 Prevalența subtipurilor virale implicate în apariția BVD-MD (www.elanco.us)

În ceea ce privește incidența tipurilor de tulpini virale identificate la vițeii infectați persisent (PI), aceasta a fost în proporție de 78 % atribuită subtipului 1b. Un alt studiu efectuat în SUA, arată că în anul 1988, subtipul viral 1a era întâlnit în proporție de 51 %, iar subtipul b 41%. După 20 de ani mai târziu, s-a remarcat că subtipul 1b a ajuns la o pondere de 61 %, în timp ce subtipul 1a de doar 18 %. Deși procentul apariției subtipului 1a este în scădere, incidența BVD – ului nu a scăzut.

Diareea virală bovină-boala mucoaselor, apare enzootic, mai ales iarna și are o mare difuzibilitate în focar. Morbiditatea și mortalitatea diferă în funcție de vechimea infecției și forma de evoluție. Astfel, în formele primare de boala mucoaselor, morbiditatea variază între 2 și 50%, sau mai mult, iar mortalitatea atinge 90% din cazurile de boală. În unitățile în care animalele au trecut prin boală, rareoari mai reapar cazuri clinice. În schimb, în forma de diaree virală bovină, morbiditatea este mai ridcată (80-100%) dar mortalitatea rareori depășește 10% din cazurile de boală (Rodostis și col., 1988).

1.3.3. Rezistența

Este scăzută în mediul exterior, virusul fiind sensibil la eter, tripsină, cloroform și este distrus ușor de solvenții organici. Pestivirusurile au diametrul de 40-60 nanometri și sunt, prin urmare, printre cele mai mici virusuri. Ele prezintă o structură a capsidei icosaedrală (constituită dintr-o singură proteină capsidală) și sunt acoperite cu o anvelopă (codificată de 3 proteine membranare virale). Ca atare, ele pot fi inactivate de toți dezinfectații comuni. Rezistența lor este scăzută: la 37̊ C pierd capacitatea de a infecta după circa 4 zile, la 5̊ C, după aproximativ 45 de minute.

1.3.4. Sursa principală de infecție

Este reprezentată de animalul bolnav și de cele care prezintă forme latente, inaparente sau avortate. Difuzarea naturală are loc ca urmare a contactului direct între animale. Există o viremie trecătoare în care virusul este eliminat din organism pe cale nazală, lacrimală și urinară, timp de 4-10 zile, iar prin pulmoni și limfoganglionii bronșici, până la 56 zile (Coggins și col., 1961, 2002).

Aceste efective indemne, dar și libere de anticorpi (în decurs de o generație), sunt foarte receptive la introducerea virusului. În mod frecvent, infecția este introdusă prin junincile recent achiziționate sau printr-un nou taur, care au viremie trecătoare sau persistentă. Un rol important în întreținerea infecției în efectiv o are transmiterea transplacentară, transferul de embrion și materialul seminal. Astfel, dacă femelele se infectezaă în cursul celei de a 2-a treimi de gestație, vițeii vor fi imunotoleranți și infectați persistent, constituind surse permanente de infecție (Dufour, 1988).

Infecția se realizează pe cale respiratorie, digestivă, conjunctivală sau transplacentară, mai ales în primul an de viață. De cele mai multe ori, virusul este preluat digestiv sau nasofaringeal. Cel puțin o oră de contact între animale, poate fi suficientă pentru transmitere (Traven și col., 1991). Astfel, după Gastrucci (1987), nivelul seroconversiei demonstrează că peste 70% din taurine s-au infectat până la vârsta de un an, iar după Harkness (1987) aproximativ 25% din viței. Vacile ca și taurii infectați persistent pot transmite virusul prin transfer de embrioni, respectiv prin materialul seminal, fără a le influența gradul de fertilitate (Barlow și col., 1986).

Totuși acest aspect poate fi evitat prin aplicarea și respectarea unor măsuri de igienă corespunzătoare. Astfel, un studiu realizat în America în 1994, descrie că în urma unui examen transrectal efectuat la 8 juninci, prin utilizarea unei mănuși contaminate de la un animal PI a determinat o infecție acută a acestora. Infecția indirectă se poate realiza și prin tehnici de vaccinare nesterile. În urma contaminării membranei de cauciuc a unui flacon cu vaccin care a fost străpuns de 2 ori cu un ac hipodermic, au rezultat 2 viței infectați cu virusul BVD. O altă situație întâlnită în teren menționează că în urma populării unui grajd, care înainte fusese ocupat de către un animal PI, din cei 3 viței seronegativi introduși, 2 au fost infectați.

Modalități de infectare au fost raportate și în cazul utilizării vaccinurilor vii contaminate. În cazul unor focare de boală înregistrate în Olanda și Belgia, în anul 1999, ce ulterior au fost vaccinate cu un vaccin având marker BHV-1, anumite loturi au fost raportate ca fiind infectate în urma acestei acțiuni cu virusul BVD, genotipul 2. Explicația constă în faptul că, serul de vițel este folosit pentru cultivarea tulpinilor vaccinale în culturile de celule

De asemeni, trebuie luată în vedere și transmiterea vectorială raportată de către (Tarry și col., 1991) în urma transmiterii experimentale prin sângele supt de muște (S. Calcitrans, H.pluvialis). O atenție deosebită trebuie acordată tuturor acelor situații ce implică efective mari de animale. Târgurile de animale, expozițiile, pășunatul comun și transhumanța acolo unde încă se mai practică reprezintă puncte cheie în transmiterea virală. În urma contactului direct (imediat), precum și a celui indirect (prin intermediul personalului) se permite circularea virusului de la o turmă la alta.

În țări precum Elveția, transhumanța joacă un rol important în epidemiologia infecției cu BVD (Braun, 1999). Diferite efective de animale pasc împreună în Alpi, iar junincile gestante sunt cele mai predipuse, deoarece pot fi infectate și implicit va afecta și fătul, atrăgând cu sine consecințele deja binecunoscute. Ca măsură preventivă se poate aplica vaccinarea împotriva BVD înainte de fătare, doar că este incertă situația privind eficacitatea vaccinurilor pentru BVD astăzi.

În ceea ce privește achiziția vițeilor dedicați producției de carne, se dorește a se lua în calcul riscul acestei tranzacții, deoarece există posibilitatea ca acești viței să provină din juninci ce au fost inseminate de tauri asimptomatici, precum și din acele juninci ce au trecut prin perioada de transhumanță. Conform unor statistici (Houe, 1999), riscul de import a unui animal PI, atunci când se cumpără 20 de viței necontrolați se ridică la aproximativ 33% (PI la o prevalență de 2 %) .

Infecția cu virusul diareei virale poate coexista, în acelasți efectiv și chiar pe pe același individ, cu alte infecții virale (rinotraheită, parainfluența, adenoviroze, etc.), sau bacteriene (pasteureloza, salmoneloza, etc.). În special, în condițiile creșterii intensive, aglomerate, în funcție de vârstă, animalele vor trece succesiv prin diferite tipuri de infecții virale, astfel că de obicei ele prezintă anticorpi față de mai multe entități morbide.

1.4. Patogeneză

Mecanismul de producere al bolii depinde atât de virulența și biotipul virusului, cât și de susceptibilitatea gazdei. Virusul poate pătrunde în organism pe diferite căi, dar cea mai frecventă este calea oro-nazală și se multiplică la nivelul acestei porți de intrare, în special la nivelul tonsilelor și al bronhiolelor.

Ulterior acestei multiplicări se instalează o stare de viremie, caracterizată de diseminarea particulelor virale prin intermediul monocitelor circulante către organe și țesuturi limfoide țintă. În doar câteva zile de la infecție virusul este găsit în celulele dendritice foliculare, în limfocitele B și în plăcile Peyer. Perioada de incubație este de 1-3 săptămâni. Mecanismul de producere al bolii depinde de virulența și biotipul viral, precum și de susceptibilitatea gazdei.

În cazuri speciale, replicarea virală poate fi însoțită de apariția efectului citopatic. De cele mai multe ori virusul induce în celulă o înfecție lentă care nu se manifestă clinic, dar potențează un răspuns imunitar, mai ales de tip celular. Aceasta face ca virusul să rămână în stare latentă în organismul gazdei. Uneori poate produce și o formă severă de boală cu sfârșit letal.

Fig. 1.4 Replicarea virală a BVD-MD

(www.bvd-info.ch)

Din punct de vedere epidemiologic, virusul diareei virale bovine-boala mucoaselor se remarcă printr-un succes surpinzător. Virusul ocupă un loc special printre agenții patogeni virali, datorită distribuției la nivel mondial și al ratei mari de infecție. Succesul se datorează combinației a două strategii foarte cunoscute și anume ,,hit and run” (lovește și fugi) și ,,infect and persist” (infectează și persistă). Ambele strategii sunt populare în rândul virusurilor, dar foarte rar se întâmplă să acționeze concomitent.

În cazul BVD strategia ,,hit and run” se manifestă printr-o infecție tranzitorie, care adesea evoluează fără simptome. Animalele dezvoltă anticorpi ce le protejează față de o infecție repetată a virusului, dar pe o perioadă scurtă. Această strategie s-a dovedit a fi ineficientă de sine stătătoare, deoarece nu asigură supraviețuirea virusului, astfel că fără animalele PI, virusul va dispărea mai devreme sau mai târziu.

În ceea ce privește a doua strategie, virusul beneficiază de avantajul că persistând în gazdă, poate aștepta o nouă oportunitate de a da naștere unei infecții. Astfel, infecția persistentă cauzată de BVD este unică, deoarece virusul pur și simplu se sustrage sistemului imunitar al gazdei, înainte de instalarea imunocompetenței. Virusul nu determină modificări în interiorul gazdei iar astfel gazda dezvoltă o imunotoleranță față de virus, considerând virusului ca fiind parte a organismului.

Prezența acestor strategii corelată cu momentul contactării infecției au o importanță deosebită, deoarece la o concentrație redusă de anticorpi din organsim, virusul are posibilități majore de difuziune în organism și să determine forme evolutive grave. Infecția vacilor gestante, întotdeauna determină și infecția transplacentară a fetusului.

Infecția uterină are consecințe diferite, în funcție de momentul pătrunderii virusului. Dacă infecția survine în prima fază de gestație, are loc un fenomen de resorbție a embrionului ce duce la reducerea fertilității. În intervalul cuprins între 40 de zile și aproximativ 120 de zile, infecția cu un virus citopatic poate determina avort, în timp ce prezența unui virus necitopatic determină infecția persistentă a fătului.

De obicei, fetușii se nasc anormali, și reprezintă ,,candidați” pentru Boala Mucoaselor. Infecția fie cu virusul citopatogen sau necitopatogen, în jurul perioadei de 160 de zile de gestație, determină malformații congenitale. În urma infectării fetușilor în acea perioadă, aceștia sunt fie avortați, slabi sau sunt mumifiați și în cele din urmă avortați. Fetușii infectați mai târziu dezvoltă anticorpi neutralizanți, care pot fi detectați prin analizarea serurilor pre-colostrale. Aceste animale se nasc normale și sunt imune.

Dacă infecția se realizează la mijlocul perioadei de gestație (sfârșitul primului trimestru și începutul ultimului trimestru de gestație), aceasta determină apariția de malformații, hipoplazie cerebeloasă, etc. Alte anomalii atribuite BVD-ului sunt cele referitoare de malformațiile oculare (hipoplazie, cataractă, degenerescența retinei), deformări scheletice, hipotrichozăm hidrocefalie și dezvoltare insuficientă. Mecanismul implicat direct în apariția acestor forme este nu este cunoscut.

O parte din explicații se referă la deteriorarea directă a celulelor sau deteriorarea indirectă a celulelor determinate de reacțiile sistemului imunitar.

Infecțiile intrauterine cu BVD-ul necitopatic între zilele 40 și 120 de gestație generează animale infectate persistent. Animalele PI joacă un rol important în răspândirea BVD. Acestea elimină virusul în secreții și excreții (salivă, secreții nazale, urină, spermă, etc.), în concentrații mari. Ele nu reușesc să producă anticorpi detectabili împotriva virusului, fiind imunotolerante. În mare parte, animalele PI pot fi detectate doar prin tehnici de laborator, deoarece semnele clinice lipsesc. Indivizii PI sunt predispuși pentru apariția Bolii mucoaselor. Femelele PI vor produc întotdeauna urmași cu infecție persistentă. Pentru a stopa acest fenomen, indivizii detectați ca fiind PI, ar trebui sacrificați.

1.5. Manifestări clinice

Complexitatea mecanismului etiologic a determinat și o variabilitate a evoluției și gravității formelor clinice. Literatura de specialitate, în speță Brownlie (1985) clasifică formele clinice ca fiind grupate în: forma acută, forma fetală, forma cronică și boala mucoaselor.

Forma acută- se caracterizează prin apariția stării febrile (39,5-42̊ C) însoțită de un jetaj seros, seromucos ce evoluează până la mucopurulent și de tulburări digestive. Acestea determină apariția unor leziuni cu aspect circular sau alungit la nivelul mucoasei bucale, periocular și la nivelul buzelor care se transformă ulterior în eroziuni. Astfel de leziuni pot apărea și la nivelul spațiului interdigital, pe mucoasa organelor genitale și glanda mamară. La un interval de 7-9 zile de la debutul bolii, apare diareea cu fecale inițial dure și încărcate cu mucus și cheaguri de sânge, apoi diareice, urât mirositoare cu aspectul albușului de ou și culoare brună sau gri. Totodată apare și o conjunctivită cu epiforă excesivă, iar la 10 % din cazuri se observă opacifierea corneei. Animalele slăbesc, se deshidratează și mor în de curs de 2 săptămâni. Cele care au supraviețuit, devin imune pentru toată viața.

Forma fetală- sau infecția intrauterină se manifestă prin avorturi, fătări premature sau infecții congenitale care persistă și la vițelul nou născut, în funcție de momentul producerii infecției. Femelele care au avortat se comportă ca și cum gestația ar decurge normal, sindromul fiind cunoscut de sub denumirea de ,, moarte embrionară timpurie”. În cazul fătărilor de produși neviabili, aceștia aparent sunt sănătoși dar slăbesc și frecvent apar tulburări nervoase și orbire. Acestea se pot manifesta încă din prima zi de naștere, iar sindromul este cunoscut sub numele de ,,sindromul vițelului slab”. De asemeni, vițeii infectați intrauterin pot prezenta diverse anomalii congenitale.

Forma cronică- sau de viremie persistentă, apare atunci când femelele gestante s-au infectat cu virusul diareei bovine după a 110-zi de gestație și înaintea apariției imunocompetenței. Astfel, embrionul se dezvoltă în continuare, gestația este dusă la termen, dar produsul, aparent sănătos este purtător și eliminator de virus, incapabil să producă anticorpi specifici anti BVD-MD. Evoluția durează câteva luni, animalele slăbesc, devin neeconomice și în final mor de inaniție sau datorităinfecțiilor secundare. Alteori, evouția este scurtă, moartea producându-se brusc. În mod obișnuit animalul moare în 3-10 zile de la debutul bolii.

Forma inaparentă sau subclinică, manifestată uneori prin hipertermie moderată, leucopenie, inapatență și diaree ușoară, urmate de revenirea la normal în 3-5 zile. Animalele prezintă anticorpi neutralizanți.

Boala mucoaselor, în forma sa clasică se manifestă exploziv, atunci când în organismul unui animal deja purtător al unei infecții în stare latentă, pătrunde o mutantă a virusului, eliminată în mediul înconjurător de un animal imunotolerant, dar care are capacitatea de a induce un un efect citopatogen. Se știe că animalele cu viremie persistentă fac ulterior și forma denumită ,,boala mucoaselor”, dacă se infectează cu biotipul citopatogen.

Inițial, se constată anorexie, apoi semnele digestive manifestate printr-o diaree profuză și deshidratare continuă. Apar eroziuni la nivelul botului, în special pe mucoasa gingivală, epiforă și salivație abundentă, durere în regiunea abdominală, slăbire și greutate în deplasare. Evouția durează câteva luni, timp în care animalele slăbesc, devin neeconomice și mor în final de inaniție sau datorită infecțiilor secundare. Alteori, evoluția bolii este scurtă, moartea producându-se brusc, încât constituie primul semn clinic, suspicionând o intoxicație.

1.6. Tablou anatomopatologic

În formele de evoluție clasice, se întâlnesc eroziuni și ulcerații pe mucoasa bucală, a limbii și a buzelor. La nivelul mucoasei esofagiene apar hemoragii lineare, iar pe mucoasă duodenală se observă ulcerații de dimensiuni variabile care pot fi superficiale sau pot interesa și capilarele sangvine din submucoasă. Formațiunile limfoide și plăcile Peyer sunt hipertrofiate și ulcerate. De asemeni, la nivelul intestinului se constată inflamația catarală, crupală sau difteroidă, mai accentuată în jejun și ileon.

Leziuni asemănătoare se observă și la nivelul mucoasei aparatului respirator (rinită, traheită). La avortoni, ca și la vițeii în vârstă de câteva zile, se constată leziuni asemănătoare, cel mai adesea la nivelul sistemului nervos central, reprezentate de hipoplazie cerebrală și demielinizare, iar la nivel ocular cataractă.

Histologic, se observă zone de liză ale țesutului limfoid din plăcile Peyer și limfonodulii intestinali, ca și a epiteliului din criptele lui Lieberkün. Aceste zone sunt înconjrate de o reacție inflamatorie cu detritusuri celulare din epiteliul afectat. Un alt aspect marcant se referă la hipoplazia cerebeloasă care poate fi de grade diferite, uneori până la lipsa aproape totală a acestuia. La nivel microscopic, se constată reducerea în grosime a straturilor molecular și granular, precum și reducerea numărului de celule din aceste straturi ca și a celulelor Purkinje.

1.7. Diagnostic

Stabilirea unui diagnostic cu precizie pe baza semnelor clinice este greu de stabilit datorită similitudinii cu alte boli al bovinelor. Date precise și concrete se pot obține în urma investigațiilor realizate prin tehnici și metode minuțioase de laborator (serologie, virusologie, etc.). Fiecare din metodele utilizate prezintă atât avantaje cât și dezavantaje determinând astfel gradul lor de aplicabilitate. De asemeni, trebuie menționate și noțiunile de specificitate și sensibilitate, două caracteristici importante pentru testele serologice și antigenice.

Pentru a determina specificitatea, respectiv sensibilitatea unui test, grupuri suplimentare de animale sunt sunt supuse unei noi examinări, folosind un test comparativ standard. Factorii care pot afecta eficiența unei anumite metode de diagnostic includ diversitatea antigenică și/sau genetică a virusului, variații ale sarcinii virale și interferența cu anticorpii maternali obținuți prin colostru.

1.7.1. Determinarea directă a antigenului

În privința utilizării metodelor specifice detectării directe a antigenului din probele prelevate, acestea prezintă avantajul că sunt rapide și au un grad relativ ridicat de sensibilitate față de alte metode. De asemeni trebuie menționat că de multe ori prezența antigenului viral în țesuturi, în special în infețiile subclinice și persistente nu este asociată leziunilor. Cînd leziunile sunt prezente, acestea au pondere crescută în țesuturile limfoide, unde prezența antigenului viral este asociată cu depleția limfoidă. În infecțiile persistente și în boala mucoaselor, virusul poate fi izolat din aproape toate țesuturile ca urmare a diseminării antigenului viral în țesuturile gazdei. Astfel, pentru determinarea directă a antigenului din țesuturi proaspete, congelate sau fixate, sunt utilizate tehnici precum ELISA, IHC și Imunoflorescența.

1.7.2. Imunoflorescența

Imunofluorescența reprezintă o tehnică de imunohistochimie prin marcare cu compuși fluorescenți, utilizată pentru demonstrarea prezenței anticorpilor fixați la nivelul țesuturilor sau circulanți în fluidele organismului. Această procedură determină identificarea anticorpilor legați de antigene în secțiunile criostat din țesuturi proaspete sau frotiuri din straturi de culturi celulare. Antigenele sunt puse în contact cu anticorpi anti-BVDV conjugați cu fluoresceină și apoi examinate la microscopul imunofluorescent. Această metodă directă aplicată straturilor de celule din biopsia de piele este utilizată pentru detecția animalelor cu infecție persistentă.

1.7.3. Imunohistochimia leucocitelor din sângele periferic

Tehnicile de imunohistochimie au la bază reacția antigen-anticorp, antigenul urmărit aflându-se în materialul bioptic, iar anticorpii utilizați în scopul evidențierii acestora sunt comercializați sub diverse forme – mono- sau policlonali, concentrați sau diluați (gata de a fi utilizați „ready-to-use”). Situsul legării cu anticorpul poate fi identificat fie prin legarea directă a antigenului de un anticorp marcat, deci vizibil (de exemplu fluorescent), fie printr-o metodă indirectă de legare, prin intermediul unui lanț de alte reacții, cu anticorpi secundari marcați prin reacție indirectă în 2 sau mai multe faze.

În anul 1989, Deregt și Prins au elaborat o tehnică bazată pe acțiunea imnoperoxidazei în monostrat bazat pe anticorpi monoclonali Mab (IPMA) pentru a detecta virusul BVD, care ulterior a fost comparată cu tehnica bazată pe anticorpi bovini policlonați Pab (IPMA). În urma studiilor interprinse, au fost alese metodele care folosesc anticopri monoclonali, ca urmare a reacției la diferite proteine ale BVDV, precum și a lipsei de competiție pentru situsurile de legare sau legarea de BVDV neobișnuite/rar izolate. Așadar, Mab-IPMA sunt mai performante decât Pab-IPMA din punct de vedere al colorării, ușurinței de interpretare a rezultatelor și sensibilității relative.

1.7.4. Imunohistochimia biopsiilor din piele

Testarea imunohistologică a biopsiilor din piele (probe din ureche) este folosită pentru depistarea animalelor cu infecții persistente. În prezent este cel mai fiabil test de detectare a antigenului și poate fi aplicat și animalelor decedate, de la care se recoltează probe din glanda tiroidă, piele, mucoasa orală, esofag și abomasum. Realizarea examenului histochimic din țesuturi colorate, fixate în formol și încorporate la parafină reprezintă o metodă eficientă de detecție a BVDV și de multe ori se dovedește a fi mai bună decât examenul histopatologic.

Unele studii (Bolin și col., 1994) efectuate pe 41 de linii celulare pentru a detecta antigenul viral al BVD sau ARN-ul, au demonstrat o excelentă corelație între examenul imunohistochimic și RT-PCR. Prezența anticorpilor din colostru nu a interferat cu IHC efectuat pe biopsiile din piele. Alte studii realizate pe diferite probe provenite de la un număr de 322 de bovine, au avut ca scop compararea tehnicii IHC cu tehnica izolării virale. Astfel, în urma colorării prin IHC a biopsiilor din piele fixate în formol și a izolării virale, s-a reusșit izolarea acestuia. Metodele ce folosesc anticorpii monoclonali pentru IHC trebuie alese cu grijă deoarece doar 32 din metodele cu anticorpi monoclonali anti-proteine BVDV și anti-glicoproteine sunt capabile să detecteze BVDV din țesuturile fixate în formol prin IHC.

1.7.5. ELISA directă

De-a lungul timpului, o multitudine de antigeni detectați prin ELISA au fost supuși unor etape de metodice de dezvoltare pentru detecția directă a antigenului BVDV din ser sau bioprobe de ureche. Principiul de bază constă în folosirea anticorpilor monoclonali care captează antigenul viral urmat de detecția complexului antigen-anticorp cu ajutorul anticorpilor conjugați cu enzime. Pentru situația dată, cea mai utilizată metodă este ELISA de capturare a antigenilor (AC-ELISA) care folosește anticorpi monoclonali dirijați împotriva unui anumit domeniu antigenic format dintro proteină nestructurată (NS2/3) de pestivirus. Antigenul capturat este ulterior detectat cu ajutorul unui pestivirus policlonat specific conjugat cu peroxidază. Serul reprezintă o probă bună de detectare a animalelor cu infecție persistentă folosind această tehnică de capturare a antigenilor.

Animalele de la care s-au prelevat probe în faza acută sunt rar detectate, deoarece virusul este prezent în sângele animalelor cu infecție acută pentru o perioadă scurtă de timp. Anticorpii monoclonali anti-NS2/3 au fost folosiți în testele de capturare a antigenilor (AC-ELISA). Aceste teste au un randament crescut, comparativ cu testele de izolare virală (VI). În anul 1995, Entrican și col. au creat un test dublu ELISA cu anticorpi monoclonali pentru detecția antigenului viral din probele de sânge. Două metodde ce utilizează antigenii monoclonali anti-P125/P80 au fost folosite pentru a capta antigenii virali din sânge și alte două metode au fost folosite pentru detecția antigenului captat. Tehnica ELISA ce utilizează anticorpii monoclonali, are un grad mai mare de sensibilitate decât ELISA care folosește anticorpii policlonali.

1.7.6. ELISA Indirectă

Antigenii folosiți în testele ELISA includ întregul antigen viral, proteine nestructurate, anticorpi monoclonali și peptide. Rezultatele testului ELISA pot fi influențate de antigeni, anticorpi conjugați, probe, etc. Tehnica abordată pentru prepararea întregului antigen viral poate influența de asemeni gradul de specificitate și de sensibilitate a testului. Astfel, cercetătorul Pilinkiene și col. (1991) descoperă că antigenii preparați prin tratamente ușoare au fost mai specifici și mai activi. Cho și col. tot în același an au preparat antigeni din virus crescut pe MDBK.

Antigenul a fost solubilizat cu MEGA-10 (decanonyl-N-metylglucamide) urmată de îndepărtarea proteinelor hidrofobe prin tratament cu Triton X-100. În comparație cu testul de neutralizare virală, acest test are specificitate de 100% și sensibilitate de 97%. Moennig și col. (1991) reușește elaborarea unui test ELISA ce folosește ca antigen proteina nestructurată p125/80 din BVDV. Rezultatele obținute au fost comparabile cu cele obținute la testul de neutralizare virală.

Gradul de specificitate al serodiagnosticului a fost îmbunătățit datorită folosirii anticorpilor monoclonali în sisteme ELISA competitive și îmbunătățiri viitoare sunt posibile prin folosirea antigenilor definiți, derivați din tehnici de recombinare a ADN-ului. Lecomte și col. (1990) au reușit realizarea unor anticorpi monoclonali care recunosc antigeni 80 de kDa (NS3) ce aparțin tulpinilor citopatogene de BVDV. Testul ELISA competitiv a fost elaborat folosind anticorpi monoclonali și proteine recombinate exprimate în tulpini de Escherichia coli ca o proteină de fuziune cu β-galactozidază. Beaudeau și col. (2001) au elaborat o metodă de blocare a testului ELISA folosind anticorpi monoclonali anti-NS2-3 și au folosit acest test la scanarea în masă a probelor de lapte și ser cu o sensibilitate și o specificitate de aproximativ 97% comparativ cu testul de neutralizare virală (VI).

În schimb faza lichidă a testului ELISA folosește peptide CSFV marcate specific și o peptidă BVDV nemarcată (pentru a bloca reacțiile încrucișate) facilitează detecția unui tip specific de anticorpi. Acest test poate fi folosit pentru a diferenția animalel vaccinate de cele infectate dacă, vaccinul este bazat pe o altă proteină capsulară (E2).

O singură diluție a serului poate fi folosită în testul ELISA pentru a determina cantitativ anticorpii. Graham și col. (1997) au standardizat un test ELISA comercial ce determină anticorpii anti-BVDV din ser astfel încât o singură diluție a serului să poată fi testată iar rezultatul să fie exprimat cantitativ folosind un grafic standard.

1.7.7. Izolarea virală

Izolarea virusului diareei virale bovine din culturile celulare a constitutit cea mai fiabilă metodă urmată de identificarea virusului izolat prin imunofluorescență sau imunoperoxidază în monostrat sau RT-PCR (Ridpath și col., 1994). În timpul viremiei, virusul poate fi izolat din descărcări nazale, sânge, ser, fetuși, fecale și material seminal. Totuși s-a observat că prezența anticorpilor anti-BVDV oate interfera cu izolarea virusului din probele de ser.

Pentru cultivarea virusului, cele mai folosite celule sunt cele de origine bovină și în special cele turbinale sau cele ale corneților nazali deoarece sunt cele mai sensibile la efectul citopatic produs de BVDV, ceea ce face facilitează diferențierea tulpinilor citopatogene față de cele necitopatogene. Pentru determinarea susceptibilității celulare față de virusul BVD a fost efectuat un studiu ce a luat în calcul 5 tipuri celulare, respectiv celule testiculare de porc (ST), pulmon de nurcă (ML), celule ale corneților nazali de bovine (BT), celule renale de porc (PK 15) și celule dermice de cal (ED). În urma interpretării și analizării titrurilor obșinute, celule corneților nazali de bovine (BT) și celulele pulmonuli de nurcă (ML) s-au dovedit a fi optime pentru propagarea BVDV.

Virusul izolat astfel poate fi confirmat printr-un test DFA (test direct cu anticorpi fluorescenți), imunoperoxidază, AC-ELISA sau RT-PCR. Celulele pozitive se caracterizează printr-o fluorescență verde. În testele de imunoperoxidază, un conjugat de imunoperoxidază marcat este folosit în locul FITC marcați și celulele colorate sunt examinate la microscop.

Saliki și col., (2004) a comparat două tehnici de identificare a BVDV izolat în culturile de celule. Probele de ser au fost inoculate în celulele indicator conținute în 96 de plăci urmată de colorarea celulelor infectate într-o baie de anticorpi monoclonali, folosind fie IPMA, fie M-ELISA. De altfel, ambele tehnici utilizate au avut un grad ridicat de specificitate și sensibilitate, dar autorii au preferat M-ELISA datorită rapidității și obiectivității ridicate. Sensibilitatea acestor teste se datorează izolării componentelor virale asociate acestora (Ridpath și col., 1994).

1.7.8. Detecția de anticorpi

O metodă indirectă de măsurare a infecției virale reprezintă detecția anticorpilor virali specifici din serul animalelor. Din păcate, adesea este dificil de diferențiat anticorpii produși ca răspuns la infecția acută, vaccinare sau de anticorpii maternali transferați produșilor de concepție. La bovine, vițeii se nasc fără anticorpi, însă seroconversia se produce după ce aceștia consumă colostrul vacilor. Acești anticorpi descresc după 3-8 săptămâni. Totuși, prezența anticorpilor în colostrul bovinelor se poate datora unei posibile infecții active (în uter sau postnatal) sau a vaccinării. Seroconversia animalelor santinelă poate fi folosită ca o dovadă a expunerii la animale cu infecție persistentă. Multe teste sunt disonibile pentru detecția anticorpilor anti-BVDV, și anume neutralizarea virală (VN), imunofluorescența indirectă (IIF), imunoperoxidaza indirectă (IIP) și ELISA.

1.7.9. Testul de neutralizare virală (VN)

Neutralizarea virală (VN) sau neutralizarea serică (SN) este considerată ca fiind un test standard pentru detecția anticorpilor anti-BVDV și este folosit pe scară largă. Acest teste prevede o serie de diluții seriate duble efectuate din probe de ser ce sunt incubate cu o cantitate constantă de virus (200-500 TCID-50) timp de o oră, urmată de adăugarea celulelor indicator. După o perioadă de incubare la 37̊ C timp de 4-5 zile, se efectuează citirea testului. Astfel, titrul anticorpilor din ser este determinat de cea mai mare diluție a serului care inhibă efectele citopatice produse de virus în aproximativ 50% din celulele inoculate. Testul poate fi folosit la determinarea anticorpilor anti-BVDV 1 sau BVDV 2 în funcție de virusul folosit în test. Totuși, testul poate fi de asemeni utilizat cu tulpini necitopatogen, caz în care inhibiția infecției virale este măsurată prin imunoperoxidază.

Testele de neutralizare încrucișată sunt des utilizate pentru a observa diferențele antigenice dintre pestivirusuri și pentru a deosebi titrurile din infecțiile active față de titrurile obținute în urma vaccinării. Acestea rezultă prin clătirea de patru ori în titruri de anticorpi folosind eșantioane perechi de ser. În mod fiziologic, anticorpii își fac apariția la un interval de 3-4 săptămâni postnfecție și persistă ani de zile. De asemeni în urma vaccinării, rezultă anticorpii vaccinali care și ei la rândul lor pot persista un timp îndelungat. Cei pasivi descresc după 105-230 de zile (dar pot persista mai mult alți).

1.7.10. RT-PCR

De-a lungul timpului au fost descrise mai multe tehnici de detectare a infecțiilor datorate virusului diareei virale a bovinelor și de cele mai multe ori s-au acestea s-au efectuat în paralel pentru a crește calitatea rezultatelor. În anul 1991, cercetătorul Brock, în urma comparării a două tehnici și anume hibridizarea ADN-ului dot blot și a RT-PCR pentru detecția BVD folosind probe de ser și sânge, a observat că tehnica RT-PCR a oferit rezultate mai clare în identificarea animalelor cu infecții persistente comparativ cu hibridizarea ADN-ului.

RT-PCR se remarcă printr-un grad ridicat de sensibilitate și reprezintă o alternativă la metodele curente utilizate pentru depistarea BVD-ului, în special în probele de grup, cum este cazul laptelui din rezervoarele de colectare. Gradul de sensibilitate, este influențat și de selecția atentă a primerilor folosiți, ca urmare a variațiilor secvențelor de nucleotide (Ridpath și col., 1993). Comparativ cu tehnica izolării virale, tehnica RT-PCR, are un grad crescut de sensibilitate și este mai rapidă decât precedenta. Totuși, această tehnică prezintă și dezavantaje. S-a observat că testul nu reușește să diferențieze acidul nucleic al unui virus viu, față de unul provenit de la un virus inactivat și poate da astfel rezultate fals pozitive. În anul 2002 ( Givens și col.), au reușit diagnosticarea BVD-ului în serul bovin fetal și în celulele tubare uterine primare folosite la fertilizarea embrionară in vitro, folosind tehnica RT-PCR.

Ca urmare a stabilității prelungite a acidului nucleic viral, s-a reușit implementarea unei metode simple de colectare, depozitare, transport și testare a probelor de sânge. Metoda constă în adăugarea a 10 μl de sânge sau ser pe o foaie Whatman nr.1, ulterior uscată și supusă testării. Prin folosirea acestei tehnici, Vilcek și col. (2001), au reușit detectarea ARN-ului viral după 6 luni prin RT-PCR, în timp ce izolarea virală a fost pozitivă doar câteva zile.

Majoritatea testelor ce au fost descrise pentru detecția ARN-ului viral din ser, celule, țesuturi (inclusiv probe de ureche) proaspete sau fixate în formol se bazează pe detecția zonei 5’ netraduse (5’ UTR) și a genei E2 aparținând BVD. Diferite forme de RT-PCR au fost descrise, inclusive PCR nested (RT-nPCR) și PCR multiplex. Atât izolarea virală cât și ELISA sunt nesigure în prezența nivelelor ridicate de anticorpi din probe, pe când RT-PCR nu este afectat (ZIMMER și col., 2004).

Pentru studiile retrospective, este necesară izolarea și amplificarea ARN-ului viral din țesuturile fixate în formol și incorporate în parafină. Gruber și col. (1993) au folosit digestia cu proteinaza K a secțiunilor de țesut deparafinate urmată de nPCR. Această procedură facilitează detecția fragmentului 803bp al genei ce codează proteina nestructurală p 125 și este capabilă să determine ARN-ul viral din creier proaspăt după 10 zile de la autoliză.

1.7.11 PCR Nested

Datorită sensibilității crescute a testului, Gruber și col. (1994) a recomandat utilizarea RT-PCR în locul celui clasic. Deregt și col. (2002) au descris tehnica rPCR (RT-PCR convențional după extracția ARN-ului) și dPCR (RT-PCR direct fără extragerea ARN-ului) și au descoperit că ambele erau comparabile cu izolarea virală

1.7.12 Taq Man

În 2001, Bhudevi și Weinstock au elaborat un test RT-PCR fluorigenic cu un singur tub, care este de 10-100 de ori mai sensibil decât TaqMan cu două tuburi și decât testul RT-PCR cu un singur tub. De asemeni, au reușit să diferențieze biotipul viral 1 de biotipul viral 2 folosind două gene diferite, marcate specific fluorigenic pentru regiunea 5’ UTR.

Pentru elaborarea RT-PCR TaqMan, (El-Kholz și col. 1998) au folosit o tehnică ce determină degenerarea anumitor situsuri de nucleotide, ce permite deopotrivă adaptarea la o scară mai largă de tulpini BVDV. Acești primeri (5’GGGNAGTCGTCATG-GTTCG-3’) și (5’GTGCCCATGTACAGCAGGWATTTT-3’) amplifică un fragment de aproximativ 190 de baze din tipul 1 și 2 BVDV.

Sonda TaqMan (5’-6-FAM-CCAZGTGGAC-GAGGGCAZGC-TAMRA-3’) include 6-FAM (6-carbixi-fluoresceină), o moleculă fluorescent la capătul 5’ și TAMRA (6-carboxi-tetrametil-rodamina) o moleculă la capătul 3’. S-a demonstrat că acest test este mai sensibil decât izolarea virusului și decât IPMA în diagnosticarea BVDV din ser și mult mai sensibil decât izolarea virală și IHC în diagnosticarea BVDV din probele de țesut. Testul de față este utilizat cu frecvență în Laboratorul de Diagnostic Veterinar din Minesota și este considerat a fi rapid, cu grad rdicat de sensibilitate și specificitate.

1.7.13 Diferențierea tulpinilor

Variabilitatea antigenică și genetică a virusului diareei virale a bovinelor-boala mucoaselor au o implicație majoră asupra diagnosticului bolii. Teste precum (ELISA, RT-PCR) ar trebui să detecteze toate tulpinile predominante de virus din regiune. Sullivan și Akkina (1995) au elaborat un test PCR pentru identificarea și diferențierea biotipurilor virale ale BVD-MD. Ridpath și col. (1998) au descris o tehnică de PCR diferențial (bazat pe anașiza filogenetică a 5’ UTR) pentru segregarea tipurilor 1a, 1b și 2 ale BVD.

Fulton și col.(1999) au elaborat un test RT-PCR în 2 pași pentru tipizarea pestivirusurilor la rumegătoare, de exemplu biotipurile 1a,1b și 2. Amplificarea produsului PCR printr-un al doilea PCR (nested), care folosește primeri specifici tipului, a condus la diferențierea celor trei virusuri. Gilbert și col. (1999) a pus bazele unui PCR multiplex nested pentru a tipiza genotipul BVD cu sau fără extracția ARN-ului.

Detecția și tipizarea genotipului viral de BVD-MD a fost detectat și tipizat în genotipurile 1 și 2 de către Letellier și Kerkhofs în 2003. Ei au folosit primeri pereche specifici pentru regiunile foarte conservate ale 5’ UTR și două sonde TaqMan marcate cu FAM și VIC. Utilizând această metodă ei au detectat 1000 de copii ale BVD biotipul 1 și 100 ale BVD biotipul 2.

1.7.14 Depistarea animalelor persistent infectate (PI)

Animalele persistent infectate reprezintă un rezervor important de virus și totodată un pion principal în transmiterea acestuia către alte bovine deoarece elimină mari cantități de virus de-a lungul vieții. Pentru acest motiv întemeiat, e necesar a se implementa programe de control care să identifice și să elimine aceste animale din efectiv. Urmând ordinea firească a lucrurilor, după îndepărtarea animalelor PI și a celorlalte suspecte, toate animalele ce vor fi nou aduse, vor fi izolate și testate până ce vor fi diagnosticate ca fiind libere de BVD-MD.

Majoritatea testelor de diagnostic sunt validate pe baza detectării indivizilor persistent infectați. Din moment ce infecțiile acute pot determina reacții pozitive la probele de ser, material seminal și biopsii de piele, este important a se reuși deosebirea între infecțiile acute și cele persistente (Ridhpath și col., 2002). În majoritatea situațiilor de testare a unui efectiv de bovine, imunohistochimia este metoda aleasă cu predilecție, deoarece poate fi efectuată cu precizie pe animale de orice vârstă și de obicei este suficientă o singură probă. Probele prelevate din țesutul urechii sunt ușor de obținut și sunt relativ stabile, iar testul nu este influențat de prezența anticorpilor maternali. Din analizarea a 42 de probe prin izolări virale repetae, 41 dintre acestea au rezultat pozitive la aplicarea metodei IHC. La animalele persistent infectate, colorarea a fost mai evidentă la nivelul cheratocitelor, foliculilor piloși, celulelor matrice ale bulbului pilos și la nivelul papilei dermice.

Pentru detectarea virusului de la animalele persistent infectate s-a folosit și tehnica PBL (identificarea virusului la nivelul leucocitelor periferice din sânge). Conform tehnicii de izolare a PBL, sângele heparinizat este sedimentat, stratul de plasmă ce conține leucocite mononucleare și polimorfonucleare este aspirat și apoi centrifugat la 160 de rotații timp de 5-10 minute. Granula cu celule este suspendată în 0,5 ml-1,0 ml de MEM Eagle urmată de inocularea pe culture de celule în vederea izolării virale. Serul este preferat uneori în cazul folosirii tehnicii de izolare virală, deoarece timpul de supraviețuiere al virusului este mai mare în ser și totodată poate fi colectat și depozitat mai ușor. Uneori, prezența anticorpilor în ser poate interfera cu izolarea virală.

Lindberg și col. (2001) au utilizat tehnica Elisa indirect pentru identificarea vacilor gestante cu viței PI și au obținut o specificitate și o sensibilitate bună după 7 luni de gestație. O altă metodă folosită de practicieni este serologia asociată pentru a detecta animalele persistent infetate (PI). Procedeul se caracterizează prin recoltarea de sânge dntr-un efectiv și identificarea animalelor cu titruri scăzute sau lipsă de anticorpi neutralizanți. Următorul pas este revaccinarea și repetarea recoltării de sânge de la întreg efectivul.

Animalele care nu răspund prin seroconversie la vaccinare sau care mor în urma complicării cu boala mucoaselor sunt considerate a fi animale cu infecție persistentă (PI). Cu toate acestea trebuie precizat aspectul legat de tulpina vaccinală care dacă este foarte diferită de tulpina persistent, animalele PI post suferi serocnversia la tulpina vaccinală și pot fi declarate ca nefiind PI deși ele sunt infectate. Astfel, animalele respective nu vor fi înlăturate din efectiv și vor continua să fie o sursă de virus pentru efectivul de proveniență. Sarcina virală nu poate suficientă pentru identificare, iar identificarea prin PCR și ELISA poate să nu fie eficientă dacă testul nu are valabilitate universală.

1.8 Prevenire și Combatere

Natura globală a bolii, împreună cu ușurința transmiterii și a purtătorilor asimptomatici prezidă o provocare formidabilă pentru realizarea și implementarea unor strategii de combatere și de control eficace. Astfel, recomandările să practicile de prevenire a BVD se individualizează pe fiecare categorie de producție. Nu există nici un program de prevenire care să acopere toate cerințele și de aceea este crucial ca fiecare responsabil de sector al creșterii bovinelor de lapte sau de carne să adapteze în mod continu un program specific conform datelor din realitate cu care se confruntă.

În condițiile prezente, scopul primar al profilaxiei este evitarea infecției prenatale. Dacă indivizii persistent infectați din efectivele de bovine, nu pot fi depistate sau eliminate, pentru atingerea obiectivelor propuse se va apela pe alte căi. Astfel în acest scop Harkness (1999) a propus trei tipuri de strategii pentru prevenirea bolii:

Prima strategie este consolidată pe ,,neintervenție”, aplicabilă numai în unitățile de reproducție, unde virusul diareeii virale bovine a difuzat rapid în efectiv, reușind astfel stimularea unui imunității, deși sunt pierderi probabile ulterior. Metoda reprezintă un risc, deoarece apar rapid situații imunologice diferențiate pe măsură ce vacile sun înlocuite, iar cele ce vin sunt expuse infectării. Ca urmare a consecințelor imprevizibile, este o soluție doar pe termen scurt de timp.

A doua strategie îți concentrează forțele pentru a apela la toate măsurile necesare în vederea depistării și îndepărtării, precum și a izolării animalelor PI, precum și menținerea efectivului liber de infecție. Tactica adoptată ,,testează și elimină” pune accent în principal pe izolarea și testarea bovinelor care intră în efectiv, pentru a păstra indemnitatea. Succesul acestei metode, este condiționat de existența unor teste de laborator rapide, ieftine și precise pentru decelarea la timp a infecției.

A treia metodă se referă la implementarea și importanța programelor de vaccinare. Deși eliminarea unui animal PI este principala formă de stopare a transmiterii și evoluției unui focar de BVD-MD, s-a demonstrat că transmiterea bolii poate fi împiedicată de un program de vaccinare adecvat. Vaccinarea poate fi folosită atât în efectivele de reproducție, cât și în cele de creștere, și constă în folosirea produselor biologice specifice, inactivate sau vii, cu tulpini atenuate.

La ora actuală, sunt disponibile pe piață, două tipuri diferite de vaccinuri, vaccine viu modificat și vaccin inactivat. Datorită problemelor de securitate, există tendința de a se dezvolta noi tipuri vaccinale obținute prin tehnici moderne și anume, vaccinuri subunitare, recombinante, vectoriale și vaccinuri pe bază de ADN.

1.8.1 Vaccinul viu modificat (MLV)

Vaccinurile vii modificate conțin agentul viabil, care este modificat astfel încât odată pătruns în interiorul organismului să nu declanșeze boala. Aceste vaccinuri sunt ușor de procurat, asigură o protecție relative de lungă durată, ca urmare a administrării în 2 doze successive. Acestea provoacă un răspuns imunitar cuprinzător cu reactivitate încrucișată pentru diferite tulpini de BVD. Protecția fătului (provenit de la o mamă vaccinată cu acest tip vaccinal) este adecvată, cu condiția ca imunizarea să fi fost la timp și cu atenție. Cu toate acestea nu este 100% eficientă.

Ca dezavantaje se remarcă aspectul legat de efectul negativ ce apare la administrarea vacilor gestante. Poate induce avort, sau pot infecta fătul transplacentar cu consecințe similar celor ce urmează infecției cu un virus de tip sălbatic. Cel puțin, acest tip vaccinal (MLV), deși citopatigen nu va genera animale PI, spre deosebire de tulpinile necitopatogene. Animalele persistent infectate care nu au fost depistate și supuse vaccinării, la acestea vaccinarea se comportă ca o suprainfecție cu BVD citopatogen, determinând astfel apariția Bolii Mucoaselor. Un alt dezavantaj este constituit de efectul lor imunosupresiv.

1.8.2. Vaccinurile inactivate

Vaccinurile inactivate conțin virusuri inactivate sau părți ale acestora. Ele sunt considerate din punct de vedere al biosecurității, mai sigure decât cele vii. Mai mult, cele inactivate sunt mai puțin predispuse la contaminare decât cele vii modificate (MLV). În același timp, efectul lor de imunizare este mai mic. În mod normal, se adaugă un adjvant (hidroxid de aluminiu) la vaccinurile inactivate care asigură că întreaga cantitate de material antigenic, deși mică este prezentată optim sistemului imunitar. Un dezavantaj de importanță economic, este faptul că acestea au eficacitate de scurtă durată, necesitând astfel vaccinări periodice.

În România, se folosește vaccinul ,,BVD-MD-VAC”. Vaccinul este preparat din masa virală, obținută prin cultivarea pe culturi celulare renale sau testiculare bovine a virusului BVD/MD viu. Se poate administra din prima zi de viață în doză de 2 ml intramuscular indiferent de vârstă cu rapel la 21 de zile la efectivele de reproducție nevaccinate anterior și la 7 zile la celelalte categorii de vârstă, dacă prima vaccinare s-a adminsitrat prina aerosoli sau prin instilare nazală, și apoi anual, intramuscular în doză de 2 ml. Se mai pot folosi și preparatele: ,,Triviral-B”, ,,Tetravac B”, ,,Resvac 4”. Sunt vaccinuri vii și atenuate ce conțin un amestec de suspensii de virus IBR/IPV, de virus BVD/MD, PI3, BRSV care se folosește la tineretul de peste 3 luni în doză de 2 ml intramuscular cu rapel la 2-4 săptămâni. Nu se administrează vacilor gestante, deoarece poate provoca avort.

1.8.3 Este vaccinarea BVD o soluție ?

În SUA, programele de vaccinare împotriva BVD sunt foarte populare în rândul crescătorilor de animale, drept urmare se explică gama largă de tipuri vaccinale (150), dar rezultatele anchetelor epidemiologice sunt contrarii. Europenii, sunt mai reticenți în privința utilizării vaccinurilor la scară largă. Dacă aceste vaccinuri au din start și dezavantaje, iar la acestea se adaugă și o aplicare greșită, consecințele sunt negative.

Un vaccin administrat împotriva BVD-ului presupune asigurarea unei protecții imunitare a individului respectiv și în același timp protejează și fătul de o infecție intrauterină și de asemeni previne problemele de fertilitate. Această protecție nu este una totală, cel puțin în cazul fetal și al fertilității, deoarece virusul natural se poate prezenta sub diverse variante antigenice.

Vaccinurile vii modificate, conțin o tulpină virală citopatogenă care nu este capabilă să determina apariția de indivizi persistent infectați, dar administrat la indivizi nedipistați ca fiind PI, induce complicații ce coincide cu apariția Bolii mucoaselor. Așadar, vaccinarea în cazul celor infectate, nu este doar inutilă, ci chiar riscantă. Totodată, vaccinurile vii cauzează un efect imunosupresor similar tulpinilor sălbatice. Acest aspect înseamnă o sensibilitate mai mare la alți agenți patogeni sau o posibilă agravare a condițiilor medicale deja existente.

Vaccinurile inactivate sunt mai sigure din punct de vedere al biosecurității, dar mai puțin eficace decât cele vii și necesită rapeluri frecvente (minim de 2 ori pe an).Vaccinurile BVD sunt cele mai eficiente în prevenirea bolilor acute, dar beneficiul lor este îndoielnic privind protecția fetală și prevenirea tulburărilor de fertilitate. Tocmai de aceea, acești factori din urmă au cel mai mare impact și sunt cel mai adesea incriminați în pierderile economice datorate BVD-MD, pe când infecțiile acute nu produc nici un simptom la 70-90% din toate cazurile.

Pentru toate acestea, nu putem considera ca unică măsură profilactică vaccinarea. Ar trebui să fie însoțită și de o serie de alte procedure eficiente precum screening-ul efectivului, eliminarea indivizilor PI, respectarea normelor de bunăstare și igienă a animalelor, precum și asigurarea biosecurității în fermă.

1.9. Combatere

Odată depistat un focar de boală, se instituie un protocol de urgență ce cuprinde următoarele activități: se înlătură de urgență deficiențele tehnologice, se izolează și se supraveghează clinic animalele în scopul depistării cazurilor de îmbolnăvire, se aplică dezinfecții riguroase, animalel bolnave se tratează simptomatic cu antibiotic și chimioterapice, iar cele sănătoase din efectivele contaminate se vaccinează de necessitate. Astfel, administrarea va avea loc pe cale intramusculară cu 2 ml din diluția 1/5, iar tineretul, pe cale nazală sau intramusculară, cu 2 ml. Totodată se are în vedere îmbunătățirea condițiilor de creștere și furajare, iar în cazul achiziționării de noi animale, acestea vor fi aduse din ferme idemne, fiind vaccinate la furnizor.

CAPITOLUL 2

DESCRIEREA CADRULUI NATURAL ÎN CARE S-AU EFECTUAT INVESTIGAȚIILE

Diareea virală – Boala Mucoaselor (BVD-MD) este un complex morbid infecțios și contagios al bovinelor, ce evoluează clinic prin febră, tulburări digestive, respiratorii și reproductive iar anatomopatologic prezintă leziuni erozive sau ulcerative ale mucoasei tubului digestiv și ale altor organe.

Datorită variatelor forme de manifestare și ca urmare a impactului economic negativ ce îl determină în rândul crescătorilor de bovine, această boală a fost studiată încă din anii cincizeci. La acea vreme, sub termenul de complexul bolii mucoaselor, erau cunoscute: boala mucoaselor de Iowa, respectiv Virginia, cele două diareei virale (New York și Indiana), precum și Rinotraheita infecțioasă a bovinelor.

Ulterioare cercetări serologice și genomice au concluzionat că atât Diarrea Virală, cât și forma complicată a acesteia Boala Mucoaselor sunt produse de un virus identic, cu mențiunea că fiecărei boli i se atribuie un biotip viral distinct. Totoadată s-a stabilit ca Rinotraheita Infecțioasă este produsă de un virus distinct de cel al BVD-MD.

Având în vedere prevalența crescută a infecților cu virusul diareei virale bovine la taurine în Europa și faptul că în România, investigațiile referitoate la infecțiile cu BVDV sunt insuficiente în special în rândul crescătorilor ce dețin efective mici, prin cercetarea de față s-a încercat depistarea bovinelor infectate, utilizând tehnici serologice moderne, provenite din diferite zone ale județului Iași.

Cercetările s-au axat pe testarea probelor de sânge recoltate, în vedere evidențierii anticorpilor specifici anti-virusul diarrei virale bovine folosind metoda imunoenzimatică ELISA.

Pentru determinarea seroprevalenței infecției s-a utilizat linia ELISA Tecan Sunrise (lungimea de undă pentru citire: 340-750 nm, cu 6 filtre incluse (340, 405, 450, 655, 540, 570), agitare liniară în 4 moduri diferite; soft specializat pentru interpretare date și posibilitate de interpretare calitativă; spălător de plăci; incubator cu agitare orbitală pentru plăci ELISA.

Prelucrarea, condiționarea și testarea probelor biologice s-a realizat în cadrul laboratorului disciplinei de Boli Infecțioase din cadrul Facultății de Medicină Veterinară Iași. Laboratorul disciplinei este dotat cu echipamente și aparatură performante, omologate și standardizate, reagenți și consumabile pentru diferite metode de diagnostic virale, precum și cu kituri speciale de diagnostic.

Ca urmare a testărilor serologice efectuate în România, s-a constatat prezența anticorpilor anti-diareea virală bovină-boala mucoaselor iar acest aspect corelat cu libertatea de mișcare a efectivelor de bovine și cu un grad ridicat de difuziune a virusului explică apariția cazurilor de boală în diferite zone ale țării.

Pe parcursul celor doi ani de zile luați în studiu 2012, respectiv 2013 s-au recoltat probe de sânge de la bovinele din diferite circumscripții sanitar veterinare ale județului Iași, respectiv Mogoșești-Siret, Țigănași, Șcheia, Tomești, Moșnia, Vânători, Chicerea, Trifești și Erbiceni. Aceste localități au fost alese ca urmare a unor anchete epidemiologice ce au înregistrat cazuri de mortalitate la viței după fătare și probleme de fertitilitate în zonele respective. De asemeni, menționez că efectivele de bovine provin din exploatații individuale caracterizate de condiții de zooigienă și sisteme de management diferite.

PARTEA a II-a

CONTRIBUȚII PROPRII

CAPITOLUL 3

SITUAȚIA EPIDEMIOLOGICĂ LA NIVEL MONDIAL ȘI EUROPEAN A BVD-MD

Complexul BVD-MD este o entitate ce evoluează pe toate continentele, având un caracter cosmopolit. În Elveția, seroprevalența în rândul junincilor este de aproximativ 60%, iar în rândul efectivelor de bovine de 80%. Prevalența indivizilor cu infecție persistentă (PI) este de 1-2% din populația luată în studiu.

La nivel european, majoritatea țărilor crescătoare de bovine sunt afectate în mod similar de BVD-MD. În Germania, prevalența este de 75-80% la bovinele de lapte și de 1-2% în rândul animalelor persistent infectate. În Italia seroprevalența este estimată a fi în jur de 62%, iar în Norvegia de 37% (2003). Diferențele între valorile prevalenței pentru fiecare țară pot fi explicate prin factori precum: densitatea populației, sisteme de creștere și practici de management.

Date recente arată că numărul de focare diagnosticate în 2013 în țările cu tradiție în creșterea bovinelor au fost de 34 în Austria, 1138 în Germania, 106 în Spania și 65 în Spania, ceea ce evidențiază o persistență a biotipurilor virale la nivel european, menținând astfel un risc crescut de difuzare a bolii, ca urmare a comerțului intracomunitar de animale, precum și a celui de produse de origine animală.

Se constată din această imagine că într-adevăr boala se manifestă clinic în special în țările ce au tradiție în creșterea bovinelor de lapte, respectiv de carne, acest domeniu zootehnic reprezentând un punct important în economia de piață a acestora.

Conform imaginilor, se constată că pe perioada anilor luați în studiu la nivel mondial și european, complexul BVD-MD evoluează pe întreg mapamondul, cu precădere în America și partea Euroasiatică. De menționat ar fi situațiile din acele țări, care datorită lipsei de resurse logistice, nu pot furniza date despre statutul lor actual privind boala. Cu toate acestea, numărul țărilor declarate indemne de această boală este destul de redus.

CAPITOLUL 4

MATERIAL ȘI METODĂ

Pentru atingerea și îndeplinirea obietivelor propuse s-au prelevat și analizat probe de sânge ce ulterior au exprimat serul în vederea efectuării examenului serologic. Probele provin de la bovine din circumscripțiile sanitar veterinare ale județului Iași, cu vârstă cuprinsă între 6 luni și 6 ani, crescute în diferite sisteme de exploatare, precum și în condiții diferite de zooigienă.

În vederea efectuării acestui studiu s-a utilizat un kit comercial ELISA utilizat atât în România, cât și în celelalte țări ale Uniunii Europene cu scopul de a depista cât mai rapid și cât mai precoce bovinele seropozitive. Kitul disponibil pe piață, întrunește cerințele de rigoare ale instituțiilor din România și din Uniunea Europeamă, privind normele calității și cele tehnice pe care trebuie să le îndeplinească orice astfel de kit înainte de folosire.

4.1. Metodologia de lucru utilizată în investigațiile serologice

Prezentând o serie de avantaje precum: gradul înalt de sensibilitate, ușor reproductibilă, necesită un volum mic de probă, automată și rapidă, poate prelucra simultan un număr mare de probe și fiind noniradiantă, tehnica ELISA se folosește pe scară largă.

Pentru efectuare testelor conform protocolului, e necesar a se obține o cantitate de aproximativ 1 ml. Probele de sânge s-au recoltat în eprubete cu vacuum de 6, respectiv 9 ml în urma abordării a trei locuri de elecție: vena jugulară, vena mamară și vena coccigienă. Vacutainerele s-au numerotat și ulterior au fost expediate la laboratorul de serologie din cadrul Facultății de Medicină Veterinară din Iași pentru efectuarea examenului serologic, cu mențiunea că acestea s-au păstrat la o temperatură adecvată, ferite de căldură în vederea exprimării serului. După exprimare, serul s-a recoltat în micronixuri de 1 ml și păstrat la temperatura de (+4̊ C) pentru examinare. La temperatura de refrigerare, serul se poate păstra maxim 7 zile iar atunci când nu se poate evalua, se poate stoca perioade lungi de timp la congelator (-18̊ C).

În urma recoltării probelor de sânge, o parte din acestea au suferit fenomene de hemoliză. Astfel, pentru clarificarea serului, probele au fost supuse centrifugării. Probele de sânge cu hemoliză puternică, contaminate bacterian sau fungic, nu s-au folosit pentru efectuarea examenului serologic. Hemoliza apare ca urmare a prelevării incorecte a probelor de sânge, datorită fenomenului de coagulare, manipulării incorecte a acestora și păstrării probelor la temperaturi necorspunzătoare. Șocurile de transport, precum și trecerea unei perioade mari până la separarea coagului determină de asemeni apariția hemolizei.

Pentru efectuarea examenului serologic efectuat prin metoda ELISA indirectă, s-a utilizat următoarea trusă de lucru: Kit de detecție a anticorpilor Diareii Virale Bovine (BVDV) la bovine HerdCheck*BVDV Ab, IDEXX.

Kit de detecție a anticorpilor Diareii Virale Bovine (BVDV) la bovine HerdCheck *BVDV Ab, IDEXX

Herd Chek BVDV Ab este un kit bazat pe o metodă imunoenzimatică indirectă de detecție a anticorpilor anti BVDV (Ac) în probe de ser, plasmă sau lapte provenite de la bovine.

Un format de placă de microtitrare căptușită cu antigen viral a fost concepută pentru detecția anticorpilor. Anticorpii prezenți în probă se vor lega de antigenul viral capturat de placă. După incubarea probei în godeu, anticorpii anti BVDV sunt detectați de către conjugatul marcat cu peroxidază. Conjugatul nelegat la complexul antigen-anticorp este îndepărtat la etapele de spălare după care este adăugată o soluție de substrat/cromogen.

În prezența enzimei, substratul este convertit într-un compus ce reacționează cu cromogenul pentru a da o culoare albastră. După adăugarea soluției de stopare, culoarea dvine galbenă. Absorbanța culorii generate se va citi la o lungime de undă de 450nm (A 450) sau la o lungime de undă duală, 450 nm, respectiv 650 nm, utilizând un spectofotometru.

Raportul Probă/Control Pozitiv este calculat utilizând absorbantele obținute la 450, respectiv dual la 450 și 650 nm corectate pentru absorbanța controlului negativ. Culoarea dezvoltată indică prezența anticorpilor în proba testată.

Reagenți

Toți reagenții se păstrează la 2-8̊ C.

Plăci microtitrare/Stripuri căptușite cu antigen BVDV…………………………………..5 plăci

Control pozitiv…………………………………………………………………………………………..1 ml

Control negativ…………………………………………………………………………………………..1 ml

Conjugat marcat cu peroxidază……………………………………………………………………60 ml

Diluant pentru probe…………………………………………………………………………………..60 ml

A. Soluție de splare concentrată (10X)………………………………………………………..480 ml

B. Soluție substrat TMB/H2O2…………………………………………………………………….60 ml

C. Soluție Stopare- 1M HCL………………………………………………………………………..60 ml

4.2. Prepararea Reagenților

1. Soluția de spălare

Soluția de spălare concentrată de 10x s-a adus la temperatura camerei și s-a agitat pentru a se dizolva sărurile precipitate. Soluția concentrată s-a diluat 1 parte la 10 părți apă distilată/ deionizată înainte de utilizare (ex. 30 ml soluție concentrată cu 270 ml de apă pentru o placă). Dacă soluția este preparată în condiții sterile aceasta poate fi păstrată o săptămâna la 2-8̊ C.

2. Probele

Probele proaspete sau congelate de ser, plasmă sau lapte se utilizează în acest test.

3. Protocol de testare

Toți reagenții s-au adus la temperatura camerei pentru echilibrare termică. Aceștia s-au omogenizat prin mișcări ușoare pe vortex. S-a folosit un vârf de pipetă pentru fiecare probă.

4. Protocol de ser sau plasmă

S-a scos o placă din folia protectoare, și s-a marcat pe fișa de lucru poziția probelor.

S-au pus 100 μl de probă în fiecare godeu folosind pipeta multicanal cu 8-12 canale;

S-au pipetat 25 μl control negativ în godeurile destinate;

S-au pipetat 25 μl control pozitiv în godeurile destinate;

S-au pipetat 25 μl de probă în godeurile rămase disponibile; pentru fiecare

probă s-a folosit un nou vârf de pipetă. S-a continuat cu pasul din Protocolul de Testare

Etapă premergătoate ce constă în adiția diluantului și a serurilor de control, acești reactivi find anterior reechilibrați termic conform protocolului pentru a nu modifica rezultatul reacției.

4.3. Procedură comună de testare pentru probele de ser, plasmă și lapte

Conținutul godeurilor s-a omogenizat ușor prin agitare pe vortex;

S-a incubat pentru 90 de minute la temperatura camerei sau peste noapte

(12-18 ore) la frigider (2-8̊ C). Protocolul cu timpul de incubare peste noapte este recomandat pentru comasatele de lapte. Indiferent de protocol, placa se va sigila pentru a se evita desicarea acesteia;

Conținutul godeurilor a fost aspirat și se elimină într-un recipient de deșeuri;

Fiecare godeu s-a spălat cu aproximativ 300μl de spălare, de 5 ori;

Conținutul godeurilor se elimină după fiecare spălare. După ultima spălare și respectiv eliminare a conținutului, placa se scutură bine pe o hârtie de filtru pentru a nu rămâne nici o urmă de lichid. Se evită desicarea plăcii între etapele de spălare și înainte de adăugarea următorului reagent.

S-au adăugat 100μl de conjugat în fiecare godeu;

S-a incubat pentru 30 de minute la temperatura camerei (18-25̊ C);

S-au adăugat 100 μl TB în fiecare godeu;

S-a incubat 10 minute la temperatura camerei (18-25̊ C) la întuneric. S-a început cronometrarea după ce primul godeu a fost umplut;

S-au adăugat 100 μl de soluție de stopare în fiecare godeu pentru a stopa reacția. Soluția stopare va fi adugată în aceeași ordine ca și substratul;

Blankarea spectofotometrului s-a făcut față de aer.

S-au măsurat și înregistrat absorbantele obținute la 450 nm sau la o lungime de undă duală de 450 nm, respectiv 620 nm.

S-au calculat rezultatele;

Rezultatele

Pentru ca metoda să fie validată, diferența dintre media controlului pozitiv i cea a controlului neagtiv trebuie să fie mai mare sau egală cu 0.150 D.O. Mai mult, media controlului negativ trebuie să fie mai mică sau egală cu 0.250 D.O. Pentru rezultatele invalidate, trebuie să se suspecteze o tehnică defectuoasă iar testul se va repeta urmărind cu atenție protocolul de lucru. Prezența sau absența anticorpilor anti BVD-MD în probă este exprimată prin raportul Probă/Control Pozitiv pentru fiecare probă.

CALCUL

Calcularea mediei controlului negativ

NCx = NC1 (A450) + NC2 (A450)/2

Calcularea mediei controlului pozitiv

PCx = PC1 (A450) + PC2 (A450)/2

Calcul pentru probe

S/P = PROBA (A450) – NCx (A450)/PCx (A450)- NCx (A450)

Interpretarea rezultatelor

Ser, plasmă, probe de lapte individuale

Probe cu un raport Probă/Pozitiv mai mic de 0.2 sunt clasificate ca negative;

Probe cu un raport Probă/Pozitiv este mai mare sau egal cu 0.2 dar mai mic de 0.3 sunt

sunt clasificate ca dubioase. Animalele trebuiesc retestate.

Probe cu un raport Probă/Pozitiv mai mare sau egal de 0.3 sunt clasificate ca pozitive.

4.4. Metodologia de lucru utilizată în investigațiile virusologice

4.4.1. Punerea în evidență a virusului BVD-MD prin tehnica de imunofluorescență directă (ID).

Metoda constă în evidențierea prin examen microscopic în U.V. a celulelor infectate cu virusul BVD-MD, ce rețin prin legături specifice antigen-anticorp, un conjugat ce conține anticorpi marcați cu izotiocianat de fluoresceină (FITC), ce acționează ca marker de vizualizare a antigenului în citoplasma acestor celule.

Această procedură vizează identificarea antigenului viral prin imunofluorescență directă pe frotiuri din diferite organe, în infecții cu virusul BVD-MD.

Tehnica de lucru

Pentru a lucra într-un laborator de virusologie, în vederea asigurării condițiilor de sterilitate, este obligatorie purtarea halatului, bonetei, măștii, mănușilor chirurgicale, ciupicilor (echipament de protecție de unică folosință).

Se vor purta mănuși de unică folosință la manipularea reactivilor și a probelor,

iar spălarea mâinilor cu grijă după încetarea lucrului este obligatorie;

Nu se pipetează cu gura;

Mesele de lucru trebuiesc curățate și dezinfectate după terminarea lucrului sau

ori de câte ori s-a produs contaminarea acestora.

Suprafețele contaminate sunt curățate cu vanosept 1% sau virkon 2%. Suprafețele vor fi

clătite cu apă distilată, uscate cu alcool și șterse cu hârtie absorbantă. Materialul folosit pentru curățenie trebuie aruncat într-un recipient special pentru deșeuri solide contaminate.

Instrumentarul: foarfeci, bisturie, pense ce se sterilizează prin imersie în soluții

dezinfectante (vanosept 2% și virkons 2%).

Pregătirea sticlăriei pentru lucru s-a realizat zilnic utilizând o soluție de detergent de 3% (aproximativ 100g detergent/4L apă); apoi se clătește cu apă curentă și ultima clătire se face cu apa distilată, ulterior introducându-se în etuvă pentru sterilizare. Recipientele de plastic se pot reutiliza, cu condiția să se folosească pentru același reagent și să fie bine clătite de conținut, spălate, clătite temeinic cu apă distilată și perfect uscate.

Fragmentele de organe provenite de la animalele sacrificate în abator au fost recoltate în pungi sterile și introduse în lada frigorifică pentru menținerea acestora la o temperatură de

+4̊ C-6̊ C pentru evitarea degradării probelor. Fiecare eșantion de organ parenchimatos (pulmon, limfonod) s-a secționat cu foarfeca după care s-a prins în vârful unei pense. Cu vârful unui bisturiu, s-a prelevat o cantitate mică de țesut care s-a depus pe o lamă de microscop, iar utilizând un trasor sau o lamă s-au preparat frotiuri subțiri și uniforme.

Protocolul de lucru s-a respectat conform instrucțiunilor date de către producătorul reactivilor (VMRD-USA). Reactivii necesari reacției de imunofluorescență directă sunt:

Conjugatul ce conține anticorpi policlonali împotriva virusului Diareei Virale Bovine

(BVD-MD) , conjugat cu izotiocianat de fluoresceină de origine porcină. Acest conjugat este folosit pentru detectarea tulpinilor virale atât citopatogene cât și necitopatogene, genotipul I și II în țesuturile animale sau culturi de celule, acestea nu reacționează cu alte virusuri comune ale bovinelor (IBR, PI-3, BRSV). Numărul de catalog 210-61-BVD.

Lamă cu martor pozitiv și negativ. Numărul de catalog 210-88-2-BVD

Soluția de spălare. Numărul de catalog 210-90-RB.(Fig 4.11)

Lichidul de fixare. Numărul d catalog 210-92-MF. (Fig 4.12)

Metoda de lucru

Uscarea la aer a frotiurilor sau a secțiunilor din țesut pentru cel puțin 20 minute la

temperatura camerei. (fig. 4.14) și (fig 4.15).

Fixarea frotiurilor sau a secțiunilor din țesut pe plan înclinat în soluție de methanol-acetonă (25/75) la temperatura camerei. Frotiurile au fost clătite cu PBS și fixate cu acetonă pură timp d 10 minute la temperatura camerei. După fixare și înainte de colorare, frotiurile sunt uscate timp de 10 minute la 37̊ C la incubator.

În vederea colorării, pe fiecare frotiu s-a marcat cu un marker permanent rezistent la apă o zonă de colorare care trebuie să prezinte materialul întins în strat cât mai subțire și cât mai uniform. Zonele marcate de pe lamă se acoperă cu 50-75 μl conjugat și s-au lăsat în contact 30 de minute la temperatura de 37̊ C. Lamele astfel preparate s-au introdus în băile de incubare care după închidere au asigurat atmosferă umedă suprasaturată.

După incubare, s-a îndepărtat serul pozitiv iar lamele s-au spălat în baie cu soluție FA rinse buffer, după care se lasă timp de 10 min în soluția de spălare. (fig 5.10)

După realizarea manoperei de scufundare în soluția FA rinse buffer, frotiurile au fost scurse, ulterior fiind șterse cu un prosop de hârtie. Se evită clătirea acestora cu apă.

În urma fixării cu lichidul de fixare FA, s-a adăugat lamela și s-a observat la microscopul cu fluorescență la 100X-250X. Confirmarea s-a realizat la 400X. (fig. 5.12, fig. 5.13)

Validarea testului de imunofluorescență

Validarea testului s-a realizat prin compararea probelor de testat cu martoti pozitivi și negativi prezenți în kitul de lucru.

CAPITOLUL 5

REZULTATE ȘI DISCUȚII

5.1. Rezultatele investigațiilor serologice

Rezultatele anchetei seroepidemiologice desfășurată în perioada 2012-2013 pe efective de bovine ce au provenit din circumscripțiile sanitar veterinare, nouă la număr ale județului Iași au evidențiat prezența animalelor seropozitive în rândul taurinelor ce au fost luate în studiu.

Materialul biologic utilizat a fost reprezentat de 155 de probe de sânge venos obținut în urma puncționării venei jugulare, coccigiene și respectiv mamare pe o perioadă de 2 ani. Probele de sânge au fost recoltate în vacutainere sterile de 9 ml ce conțin o substanță numită accelerator de coagulare (cloth activator factor) ce ajută la exprimarea serului. Probele de ser, ce au constituit obiectul studiului au fost alese prin sondaj din gospodăriile populației în care au apărut semne clinice specifice manifestării bolii..

Pentru elucidarea și certificarea rezultatelor, o parte din animalele care au fost depistate ca fiind pozitive în urma examenelor serologice, au fost supuse retestării, reușindu-se ulterior confirmarea pozitivității în urma analizării noilor probe.

Tabelul 5.1

Rezultatele obținute în urma examenelor serologice ELISA anti-BVDV în perioada 2012-2013

Fig 5.1 Numărul total de seruri recoltate și testate prin metoda serologică ELISA în perioada 2012-2013 în județul Iași

În urma testărilor serologice s-a constatat că din totalul celor 155 de probe testate serologic, respectiv 80 în anul 2012 și 75 în anul 2013, un număr de 107 de probe au prezentat anticorpi specifici anti-virusului diareei virale bovine-boala mucoaselor (BVDV), rezultatul serologic fiind pozitiv.

Prevalența răspunsurilor pozitive, pe perioada celor doi ani luați în studiu a fost de 69.03% iar proporția răspunsurilor negative a fost de 30.97%, ceea ce ne arată o prezență în populația de taurine la nivelul județului Iași a unui număr semnificativ de ridicat de animale seropozitive.

Tabelul 5.2

Rezultatele obținute în urma examenelor serologice ELISA anti-BVDV în județul Iași

Anul 2012

Fig 5.2 Rezultatele obținute în anul 2012 în urma examenelor serologice ELISA anti-BVDV în județul Iași

Analizând rezultatele testelor serologice pentru depistarea anticorpilor specifici anti diareea virală bovină-boala mucoaselor obținute în anul 2012, se observă că din totalul celor a 80 de probe de sânge prelevate din diferite localități ale județului Iași, se remarcă o seroprevalență pozitivă de 100 % în localitățile Țigănași , respectiv Șcheia iar la capătul opus se află localitatea Tomești cu o seroprevalență negativă de 100%. (tabelul 5.2 și figura 5.2).

Tabel 5.3

Rezultatele obținute în urma examenelor serologice ELISA anti- BVDV în județul Iași

Anul 2013

În anul 2013, din totalul celor 75 de probe analizate au rezultat un număr de 55 de probe pozitive ceea ce reprezintă o prevalență a rezultatelor serologice pozitive de 67.6% și un număr de 20 probe negative, reprezentând 34.2% din totalul numărului de probe analizat. De asemeni se observă că procentul cel mai ridicat de seropozitivitate s-a înregistrat în localitatea Chicerea unde din totalul de 14 probe analizate, toate au fost determinate ca fiind pozitive (100%).

Referitor la interpretarea rezultatelor negative, valabil și pentru datele obținute în anul 2013, ancheta seroepidemioogică trebuie privită cu rezervă datorită existenței animalelor imunotolerante, animale PI (infectate persistent) deoarece în cazul acestora, răspunsul la un examen serologic este negativ.

Fig 5.4 Rezultatele obținute în anul 2013 în urma examenelor serologice ELISA anti-BVDV în județul Iași

Conform acestei localizări se observă că probele au fost prelevate din zone diferite ale județului Iași iar rezultatele obținute ne oferă posibilitatea de a constata o seroprevalență pozitivă de 69.03%, iar această situație poate fi explicată prin faptul că animalele din gospodăriile populației (GP) nu sunt vaccinate contra principalelor viroze respiratorii ale taurinelor și în special anti-diareei virale bovine.

Așa cum s-a observat și în harta anterioară din anule 2012, sunt și localități indemne (Tomești) având o seroprevalență de 100 % negativă. Trebuie menționat faptul că în sistemul tradițional de creștere a bovinelor nu există o evidență clară a mișcării și ieșirii animalelor din efective. Având în vedere acest aspect, riscul apariției de cazuri noi, precum și difuzia bolii în efectivele indemne este foarte crescut.

5.2. Rezultatele investigațiilor virusologice

Având în vedere limitările testelor serologice în privința animalelor infectate persistentcu virusul diareei virale bovine, se recomandă aplicarea unor metode mai performante de a depista prezența virală la nivelul unui animal catalogat ca fiind seronegativ. Astfel s-a încercat testarea unei metode moderne de diagnostic și anume imunofluorescența directă.

Știind că boala afectează toate categoriile de vârstă și că majoritatea cazurilor clinice nu sunt tipice, apariția bolii poate fi suspectată ca urmare a evaluării datelor epidemiologice, a semnelor clinice și a modificărilor anatomopatologice.

Cu toate acestea, în multe cazuri semnele clinice și leziunile sunt neconcludente și boala nu este diagnosticată ca atare ci ca făcând parte din ,,complexul de boli respiratorii ale bovinelor”. Astfel, având în vedere limitările examenului serologic deoarece nu reușește să detecteze animalele cu viremie persistentă care au rezultat din infecția congenitală, examenul virusologic joacă un rol decisiv în diagnosticarea corectă a animalelor infectate.

5.2.1. Rezultatele investigațiilor virusologice utilizând tehnica de imunofluorescență directă

Pentru examenul virusologic efectuat prin imunofluorescență directă au fost recoltate din abator un număr de 15 de probe ce provin de la 5 animale aparținând fermelor și 10 din gospodăriile populației. Pentru fiecare animal, fragmentele de țesut au provenit din intestin și limfonodurile aferente. Fiecare probă a fost înregistrată și prelucrată în laboratorul de virusologie din cadrul FMV Iași. De asemeni au fost păstrate contraprobe pentru fiecare animal la -80̊ C pentru efectuarea de analize de biologie moleculară.

Tabelul 5.4

Proveniența animalelor testate prin metoda de imunofluorescență directă pentru virusul BVD

De la animalele sacrificate au fost colectate probe de țesut, cum ar fi: limfonoduri traheo-bronșici, limfonoduri mezenterici, ganglionii limfatici și intestin subțire. Vârsta animalelor testate a fost cuprinsă între 10 și 14 luni.

Tabelul 5.5

Rezultatele imunofluorescenței directe pentru virusul BVD

Din analiza datelor obținute s-au identificat ca răspunsuri pozitive un număr de 3 animale din totalul de ce au fost supuse testării, ceea ce reprezintă 20%. În urma analizării probelor provenite din ferme zootehnice, din cele 5 animale testate nu a rezultat nici un răspuns pozitiv.

Tabelul 5.6

Rezultatele imunofluorescenței în funcție de tipul de probe de țesuturi prelevate de la animale din gospodăriile populației

Legendă

Rezultat pozitiv IFD: +

Rezultat negativ IFD: –

Probă netestată: 0

În toate cele 3 cazuri (animalele 1, 4 și 6) au fost observate modificări la examenul morfopatologic al intestinului subțire. Acestea au fost reprezentate de hemoragii mici la nivelul mucoasei intestinale localizate pe toată suprafața acestui segment. (fig 5.7)

Se pot observa diferite porțiuni ale segmetului intestinal ce cuprind zone hiperemiate și hemoragii punctiforme la nivelul mucoasei.

Dintre animalele ce au fost supuse testării pentru virusul diareei virale bovine prin IFD, trei au rezultat pozitive, virusul fiind prezent atât în limfonoduluii traheobronșici și mezenterici precum și în intestin. Pentru validarea rezultatelor s-au folosit martori pozitivi și negativi.

CAPITOLUL 6

CONCLUZII ȘI RECOMANDĂRI

6.1. Concluzii

În urma investigațiilor serologice și epidemiologice efectuate în localitățile: Mogoșești-

Siret, Țigănași, Șcheia, Tomești, Moșnia, Vânători, Chicerea, Trifești și Erbiceni au fost identificate ca fiind pozitive pentru anticorpi anti-BVDV 69.03% dintre bovinele testate.

În zonele județului Iași luate în studiu în anul 2012, prevalența seropozitivă a fost de

67%, iar în anul 2013 de 67.6%, în ușoară creștere cu 0.6 procente față de anul precedent.

Investigațiile virusologice utilizând metoda de imunofluorescență directă au evidențiat

reacții pozitive doar în sistemul gospodăresc la un număr de 3 animale din totalul de 15 supuse testării, ceea ce reprezintă 20%.

Rezultatele acestei anchete seroepidemiologice efectuată în județul Iași, ne arată existența

animalelor seropozitive, însă aceste rezultate trebuei privite cu o anumită rezervă din cauza existenței animalelor imunotolerante PI (persistent infectate), deoarece în cazul lor răspunsul la un examen serologic este negativ.

La nici una din bovinele provenite din ferme, testate pentru prezența BVDV, utilizând

reacția de imunofluorescență directă, nu au fost identificate reacții pozitive.

Rezultatele obținute indică faptul că în sistemul gospodăresc există animale

imunotolerante, acestea determinând persistența și diseminarea virusului diareei virale bovine în efective.

6.2. Recomandări pentru reducerea riscului de introducere a infecției cu BVDV în fermă:

Păstrarea ,,închisă” a fermei ( nu întotdeauna practică);

Achiziționarea de animale din fermele libere de animale PI pentru BVDV;

Carantina animalelor nou achiziționate timp de 30 de zile, cu testarea lor pentru infecțiile

persistente cu BVD.

Testarea animalelor gestante și a vițeilor după fătare;

Asigurarea unei evidențe clare privind apariția problemelor reproductive și respiratorii;

Diagnosticarea cazurilor de avort, a afecțiunilor apărute la viței și orice mortalitate din

Fermă.

O altă posibilitate de limitare a infecției este realizarea unui protocol de vaccinare pentru

a reduce riscul de transmitere fetală a infecției în cazul expunerii animalelor la contacul cu un animal viremic și excretor de virus.