Vectori de Clonare de Tip Bacteriofag Si Cosmida

Vectorul de clonare (vehiculul) reprezintă un element extracromozomial capabil să se multiplice și să exprime o genă străină atașată de el in vitro, independent de cromozomul celulei gazdă.

Vectorul trebuie aă posede o serie de proprietăți esențiale de care se ține seama în alegerea și construcția lui:

capacitatea de a se replica rapid și într-un număr cât mai mare de copii în celula gazdă (30 – 50 copii/celulă);

dimensiune cât mai redusă (pentru a facilita pătrunderea în celula gazdă);

capacitate cât mai ridicată de acceptare (vehiculare) a unei gene străine;

să nu conțină în structura sa gene generatoare de efecte nedorite (de exemplu, gene inductoare de tumori);

să posede cel puțin un marker genic (de exemplu, gena rezistenței la anumite antibiotice) care să permită selecția celulelor ce conțin ADN recombinat;

să prezinte în structura sa un număr limitat de locuri de clivare pentru enzimele de restricție;

să conțină elemente de reglaj ale unui operon procariot tipic, inclusiv o mică porțiune dintr-o genă structurală aparținând operonului respectiv.

În tehnologia ADN recombinat se folosesc mai multe tipuri de vectori de clonare: plasmide, bacteriofagi, cosmide, și chiar cromozomi.

BACTERIOFAGUL LAMBDA

Bacteriofagul este un vehicul de clonare care poate fi folosit pantru a clona molecule de ADN care au mărimi mai mari de 16 000 perechi de baze. A fost numit și bacteriofagul gt (gt = generalized transduction).

Acesta are un mecanism foarte eficace pentru a introduce într-o bacterie cele 48 500 perechi de baze (48,5 kb) ale ADN propriu. Mecanismul general de clonare de ADN în bacteriofagul este bazat pe două proprietăți cheie ale genomului :

în jur de o treime din genomul este neesențial și deci poate fi înlocuit cu ADN străin;

ADN străin (gena de interes) va fi “împachetat” (înserat) în particulele infecțioase numai dacă mărimea lui este cuprinsă între 40 000 – 50 000 de perechi de baze.

Au fost dezvoltați vectori bacteriofagi care pot fi ușor clivați în trei fragmente, dintre care două conțin gene esențiale și care împreună sunt lungi de aproximativ 30 000 perechi de baze. ADN adițional (gena de interes) trebuie deci să fie inserat între ele pentru a produce particule viabile. Astfel, vectorii permit clonarea de fragmente de ADN de până la 23000 perechi de baze. Prin construirea acestor vectori se asigură faptul că toate particulele viabile vor conține fragmentul de ADN străin.

Odată ce fragmentele de bacteriofag sunt legate de fragmentul de ADN străin de mărime potrivită, ADN recombinat rezultat poate fi împachetat în particule de fagi prin adăugarea lor într-un extract de celule bacteriene ce conțin toate proteinele necesare pentru asamblarea unui fag complet. Acest proces este denumit “împachetare in vitro”. Pregătit astfel vectorul bacteriofag e gata pentru a insera ADN recombinat în Escherichia coli.

Utilizarea virusurilor in clonarea ADN

COSMIDELE

Cosmidele sunt construcții artificiale rezultate din asamblarea unor plasmide de dimensiuni mari cu unele secvențe de ADN din bacteriofagul . Cosmidele sunt deci plasmide recombinate care combină trăsături utile ale plasmidelor și ale bacteriofagului . Ele sunt proiectate pentru a permite clonarea unor fragmente de ADN foarte mari (până la 45 000 perechi de baze).

Cosmidele sunt molecule de ADN circulare mici (5000 – 7000 perechi de baze).

Ele conțin mai multe secvențe importante:

un fragment numit origine plasmidică de replicare (“ori”)

unul sau mai mulți markeri de selecție

câteva situsuri de restricție specifice unde ADN străin (gena de interes) poate fi inserat

un situs numit cos (o secvență de ADN, din bacteriofagul necesară pentru împachetare).

Cosmidele nu conțin alte gene și pot fi propagate în Escherichia coli ca și plasmidele. Când un fragment mare de ADN străin este clonat pe ele, transformarea bacteriei E.coli cu aceste construcții de ADN recombinat devine dificilă știind că transformarea este introducerea plasmidei în celule bacteriene. Când cosmida conține destul ADN inserat pentru a fi înpachetat într-un fag, sistemele de împachetare in vitro permit bacteriofagului să fie vehicul eficace pentru introducerea ADN al cosmidei în celula bacteriană. În interiorul celulei bacteriene, cosmida se propagă din nou ca o plasmidă deoarece nu are genele necesare pentru înmulțirea particulelor în celule.

Utilizarea cosmidelor in clonarea ADN