Utilizarea Plantelor In Medicina Aromaterapie Ulei Volatil

CAPITOLUL I

INTRODUCERE

Încă din cele mai vechi timpuri omul a utilizat plantele atât în terapie cât și în obținerea de produse cosmetice sau de uz alimentar. Accidental, oamenii primitivi au constata că unele ierburi, rădăcini, frunze, fructe sau sucurile lor au proprietăți tămăduitoare în multe maladii.

Utilizarea plantelor în medicină a fost de asemenea singurul punct comun al medicinii tradiționale de pe întreaga planetă: în China ca și în Europa, în Oceania ca și în Africa, magicienii, vracii și doctorii au conștientizat și utilizat avantajele proprietăților terapeutice ale vegetalelor. Prima mentionare scrisa despre ierburi datează de acum aproximativ 3.000 de ani, în China. De atunci ierburile și rețetele pe baza de ierburi au aparut în scrierile din Grecia antica, Roma antica și Egiptul antic.

Reprezentanții medicinii traditionale nu s-au rezumat doar la administreze plantelor sub forma în care se găsesc în natură pentru tratarea bolilor ci s-au descoperit forme mult mai practice și mai eficace, atenția fiind concentrată asupra metodelor de extragerea principiilor active sau alcaloizilor conținute de plante.[….]

Conceptul de principiu activ a fost prima data definit de medicul elvețian Paracelsus (1493-1541), care arată că numai o mică parte din plantă este activă și o numește Quinta Essentia sau Arcanum care se găsește în cantitate de 1g în 20 kg principii secundare.[….]

În prezent medicina naturistă și homeopată, care utilizează preparate pe bază de extracte vegetale, câștigă teren în fața medicinei naturiste alopate, care folosește produși sintetizați pe cale chimică.

Noțiunea de “Aromaterapie” a fost folosită pentru prima dată în Franța anului 1928 de către Henri Maurice Gattefosse, pentru a descrie știința pe care începuse să o studieze.

În antichitate, egiptenii știau cum să folosească numeroasele medicamente extrase din plante, știau să anestezieze prin macerarea plantelor în vin. Mai târziu numeroși doctori au denumit în lucrările lor plantele pe care le foloseau abundent: Hippocrate a menționat mai mult de 250 de plante utilizate în terapeutică, Dioscoride a descris în “of material medice” aproximativ 800. Și romanii, Pline și Caton au descris în lucrările lor numeroase plante și utilizările medicale ale acestora.

Esențele sau uleiurile se extrag din rădăcina, scoarța, frunzele sau florile plantelor aromatice, prin diferite metode de preparare. Când sunt extrase prima dată, aceste esențe se găsesc în starea cea mai concentrată și volatilă. Unele uleiuri sunt chiar toxice în concentratie ridicată și trebuie folosite întotdeauna într-o formulă mult diluată. Cantitatea de ulei volatil care poate fi extrasă dintr-o plantă variaza între 0,01% și peste 10%. Ele se găsesc sub forma unor picaturi mici, care își schimbă compoziția chimică constant în interiorul plantei în funcție de perioada zilei sau a anotimpului și de aceea se evaporă repede.

Scopul principiilor active, care au fost prescrise, este evident același cu cel al medicamentelor chimice, dar primele sunt complete și aduc doar beneficii prin complexitatea lor elaborată de natură, celelalte, adică medicamentele sintetice, sunt simple, beneficiile lor fiind aduse de virulenta lor, ce poate deveni uneori exagerată.

Pentru ca un produs natural să acționeze cu forță dar în același timp cu delicatețe, trebuie să conțină plante întregi, adică să conțină toate elementele necesare misiunii lui. Mulți factori se completează unul pe altul, unii acționează în forță alții moderat.

Este ușor de înteles de ce o plantă formată din numeroși constituenți, prezintă numeroase reacții: stimulator, tonic, diuretic, expectorant, tonic cardiac, vermifug, relaxarea sistemului nervos

Forma uzuală a remediilor medicale naturiste:

1) Infuziile

Reprezintă o cale simplă de extragere a principiilor active din plante prin acțiunea apei fierbinți asupra acestora. Prepararea infuziilor este asemănatoare cu prepararea unui ceai. Această metodă se utilizează prin extracția componenților volatili din părțile aeriene ale plantei verzi sau uscate: frunze și flori.

Infuzia poate fi facută dintr-o singură plantă sau din mai multe plante și se consumă caldă sau rece. Aceasta reprezintă cea mai ușor de realizat, comună și ieftină extracție a compușilor medicinali din plante.

2) Decoctul

Rădăcinile, scoarța (coaja) și fructele fiind mai puțin permeabile decât părțile aeriene ale plantelor medicinale, nu vor elibera principiile lor active printr-o simplă infuzie.

Materialul vegetal trebuie tăiat sau rupt în bucăți mici. Pentru a nu se pierde uleiurile volatile se acoperă vasul de fierbere. După ce vasul este răcit și părțile solide sunt separate de lichid, decoctul poate fi folosit rece sau cald.

3) Tincturile

Cele mai multe dintre componentele volatile ale plantei medicinale sunt solubile în alcool. Prin imersia părților uscate sau proaspete ale plantei în alcool, principiile active sunt ușor extrase în concentrații ce le depășesc pe cele obținute prin infuzie sau decoct.

Soluțiile foarte concentrate reprezintă un mod de păstrare și utilizare a compușilor plantei medicinale, de la 1 la 2 ani.

Tincturile ideale se obțin folosind alcool etilic pur distilat din cereale. Deoarece acest produs nu este disponibil publicului, se poate folosi Vodka cu 45-35% alcool. Extracția este foarte rapidă. 50% mixtură de plante și alcool ținută într-un vas de sticlă etanș va păstra tinctura gata pentru a fi folosită în dozajul prescris. Niciodată nu se va folosi alcool metilic, spirt metilat, alcool izopropilic sau alte tipuri de spirturi necunoscute pentru a face tincturi.

4) Siropurile

Cu câteva rare excepții, ca de exemplu menta reprezentânt un agent de aromatizare în pasta de dinți și în guma de mestecat, infuzile sau decocturile din plante nu sunt plăcute la gust în special pentru copii. Pentru a se masca gustul lor, infuziile și decocturile pot fi amestecate cu miere de albine sau cu zahăr nerafinat din trestie. Aceste siropuri combină acțiunea solvenților cu proprietățile medicale ale infuziilor și decocturilor rezultând beneficii în special pentru tratarea tusei și durerea în gât.

5) Uleiurile infuzabile

Uleiurile vegetale pure extrase din floarea-soarelui, migdale și uleiul de măsline se pot găsi ușor la magazine. Acestea au proprietatea de a dizolva grăsimile solubile principiile active ale plantelor medicinale. Acest proces se numește infuzie și se poate desfășura la temperatura camerei sau chiar la temperaturi mai mari.

Infuzia este un proces mai lent decât extracția în alcool dar are avantajul că soluția uleioasă rezultată, conținând componenții medicinali, poate fi utilizată pentru prepararea cremelor și a alifiilor. Infuzia fierbinte este recomandată pentru părțile tari ale plantei în timp ce infuzia rece este mult mai utilă frunzelor și florilor.

6) Uleiuri esențiale

Uleiurile esențiale reprezintă componentele uleioase volatile ale plantelor, copacilor și ierbii aromatice. Se găsesc în glande mici localizate în flori, frunze (eucalipt), rădăcini, lemn (santal) și rășini (tămâie). Uleiurile esențiale sunt extrase prin patru metode: distilarea cu vapori, expression, extracția cu sovenți și efleurage. În prima metodă uleiul este extras prin acțiunea vaporilor fierbinți și apoi condensare selectivă cu apa din care este separate. În cea de-a doua metodă uleiul este extras prin centrifugare sau prin supunere la presiune. În cea de-a treia metoda uleiul este dizolvat într-un solvent volatil, care după evaporare va lăsa o substanță naturală de consistență asemănătoare cerii numită beton. După ce este separat de ceară, lichidul rezultat poate fi considerat forma cea mai concentrată de aromă disponibilă. Efleurage este un proces mai lung ce presupune disoluția uleiului în grasime animală și separat din aceasta cu ajutorul alcoolului.

Uleiurile esențiale pe lângă utilizarea lor în fabricarea cosmeticelor și a parfumurilor, mai prezintă și proprietăți terapeutice.

7) Alifiile

Alifiile sunt preparate ca și uleiurile infuzabile fierbinți, cu deosebirea că plantele sunt fierte în ceară sau grăsimi care nu conțin apă. După separarea plantelor fierte prin strecurare și răcire, va rezulta un amestec solid compus din ceară sau grăsimi și constituenții medicinali ai plantei.

Parafina moală și ceara de albine sunt utilizate în mod frecvent. Alifiile formează o bariera uleiuoasă pe suprafața rănită, favorizând astfel pătrunderea principiilor active în zona afectată.

8) Cremele

Cremele sunt mixturi alcătuite din uleiuri sau grăsimi și apă. Deoarece apa și uleiul nu sunt miscibile, este necesară introducerea unui agent de emulsie pentru a preveni separarea. Cremele sunt prin urmare emulsii stabile de grăsimi sau uleiuri. Proprietățile curative ale cremelor sunt date de introducerea, în procesul de preparare, a tincturilor, infuziilor, uleiurilor infuzabile, uleiurilor esentiale sau decocturilor. Cremele sunt permeabile, permițând pielii să respire și să transpire. Apa conținută precum și unii agenți hidrofobi, ca de exemplu glicerina, ajută la o mai bună hidratare a pielii.[1]

2.Principiile active vegetale (natura chimică și clasificarea lor)

Plantele își datorează acțiunea terapeutică uneia sau mai multor substanțe chimice elaborate de celulele lor denumite principii active vegetale.

Principiile active fac parte din așa numitul metabolism secundar (Fig.1) fiind substanțe cu greutate moleculară mică, de regulă între 200-700 D (daltoni).

Fig.1 Metabolism primar/secundar

Metabolismul secundar este specific fiecărei specii și reprezintă rezultatul evoluției sale multimilenare.

Prezența unora dintre substanțele sintetizate de respectiva specie reprezintă o caracteristică (o amprentă) chimică a acesteia. Din punct de vedere cantitativ raportul acestor “componente amprentă” variază uneori pentru aceeași specie în funcție de proveniență, de momentul de recoltare, condiții de depozitare și conservare.

Tocmai din acest motiv se pune problema obligativității standardizării fitopreparatelor pentru a asigura constanța și reproductibilitatea actiunii și activității lor.

Principiile active nu reprezintă de fapt mai mult de 0,5-5 % (rareori ating valori de 16-22 %) din greutatea materialului vegetal uscat, restul fiind, din punct de vedere farmaceutic și farmacologic, substanțe de balast sau de rezervă.[3]

Studiile efectuate fără întrerupere din 1817, când a fost obținut în stare pură primul principiu activ vegetal, adica morfina din opiu, și pana în prezent, s-au finalizat cu izolarea a o multitudine de asemenea substanțe din diversele specii de plante medicinale folosite în terapeutică, unele dintre ele având o repartizare mai limitată altele mult mai largă.

În funcție de structura lor și de grupările grefate pe molecula lor, principiile active se pot încadra în clasele de substanțe ale chimiei organice.

Principii active de natură fenolică

Fenolii, din punct de vedere chimic, sunt definiti ca derivați hidroxilați ai hidrocarburilor aromatice. Aceasta grupa de principii active are o largă răspândire în țesuturile vegetale sub formă mono-,di-, tri- și polifenolică, atât în stare liberă cât și combinată; dintre monofenoli amintim timolul și izomerul său carvacrolul din uleiul volatil de cimbru și cimbrișor cât și anetolul din uleiul de fenicul. Dintre difenoli prezintă importanță hidrochinolul care se gasește întotdeauna combinat, sub formă glucozidică, combinție cunoscută sub denumirea de arbutozida din fructele diverselor specii de Vaccinum și de Arbutus staphylos.

Tot în această grupă de principii active se pot încadra și acizii fenolici cum sunt acizii salicilici, protocatehic și galic, ultimii fiind constituenți principali ai taninurilor, precum și acizii cafeic și cinarina, cât și alcooli fenoli, ca saligenolul (alcolul salicilic).

Deși flavonoidele, antocianozidele și taninurile se pot încadra tot în aceasta clasă de principii active de natură polifenolică, totuși, ținând seama de anumite particularități ale structurii lor, vor fi prezentate în grupe independente.

Principiile active de natură fenolică prezinta activități farmacologice multiple și importanță; unele sunt antiseptice, carminative, antidiaeice iar altele colagoge și coleretice.

Principii active de natură glucidică

Din această mare grupă de substanțe medicamentoase prezintă importanță următoarele subgrupe:

-ozele, având ca reprezentant principal glucoza;

-holozidele sau poliholozidele, produși cu greutate moleculară mare, rezultați din condensarea mai multor molecule de hexoze. Acestui subgrup de principii activii îi aparțin:

Pectinele-constituenți normali ai membranei celulare vegetale, și care sunt importante din punct de vedere terapeutic prin acțiunea lor coagulantă și hemostatică;

Mucilagiile și gumele-produși rezultați din transformarea membranei celulare vegetale, folosite în medicină atât pentru proprietățile lor emoliente cât și pentru eficacitatea lor în tratamentul constipației.

-heterozidele sau glicozidele rezultate din combinarea unei fracțiuni glucidice cu o fracțiune neglucidică, numită aglicon sau genină (în cazul glucozidelor cardiotonice și saponozidele). Heterozidele obținute în stare pură, cât și plantele care le conțin, ocupă un loc important în terapeutică, deoarece sunt înzestrate cu multiple și variate proprietăți farmacologice, datorate structurii chimice a agliconilor lor, însă, din punct de vedere terapeutic, interesează în special:

Glicozidele cardiotonice- a caror genină este de natură steroidică, purtând o lactonă nesaturată;

Glicozidele antracenice sau antracenozidele care datorită agliconului lor, în majoritatea cazurilor de natură oxilmetil-antrachinonică, au acțiune, în funcție de doză, laxativă și purgativă;

Saponozidele (saponidele) sunt heterozide care au genina fie de natură steroidică, fie de natură triterpenică prin agitare cu apa dau o spumă abundentă persistentă, ca și săpunul și hemolizează globulele roșii; saponozidele a căror genină este de natură triterpenică au proprietăți expectorante și depurativă;

Tioglicozidele al căror aglicon conține în molecula lui sulf și constituie esențele de muștar interesează terapeutica prin proprietățile lor revulsive;

Glicozidele cianogenetice dau, prin hidroliza acid cianhidric;

Flavonoidele și antocianozidele sunt pigmenți răspunzători de culoarea galbenă, galben-portocalie a petalelor (flavonoidele) și de coloarea lor roșie, albastră și violet (antocianozidele). Flavonoidele se bucură de proprietați diuretice și de vitamina P (rutozida) utilizate în afecțiunile capilarelor și ale venelor, iar antocianozidele pe langă proprietățile lor de vitamina P, ameliorează adaptarea vederii la întuneric;

Taninurile sau substanțele tanante sunt substanțe de natură polifenolică în majoritatea cazurilor combinate cu fracțiuni glucidice, sunt foarte răspândite, înzestrate cu acțiuni astringente, antidiareică și antiseptică.

Alcaloizii

Sunt substanțe organice azotate cu reactivitate mai mult sau mai puțin pronunțat alcalină; sunt raspândite în plantele toxice se bucura de importante proprietăți terapeutice dar unele dintre ale sunt toxice. Acțiunea fiziologică și farmacodinamică a alcaloizilor se datoreaza, pe de o parte, nucleului lor de bază, iar pe de altă parte funcțiunilor și radicalilor grefați pe nucleu.

Principii amare

Sunt substante cu gust amar, unele insuficient precizate din punct de vedere chimic, altele având structură glucozidică. Datorită gustului lor amar, aceste principii stimulează terminațiile nervoase gustative, care, pe cale reflexă, declanșează sau intensifică secrețiile digestive și măresc pofta de mâncare.

Vitaminele

Prima definiție dată în 1911 de către Funk – „amine care participă la secretul vieții”

Astăzi sunt acceptate două definiții:

– Definiția dată de Karrer- “vitaminele sunt substanțe a căror absență din organism provoacă maladii și manifestări de carență”

– Definiția lui Javillier – “vitaminele sunt substanțe pe care organismul animal, în general, nu este capabil să le biosintetizeze și a căror prezență, în cantități foarte mici, este necesară creșterii, echilibrului fiziologic și aptitudinii de reproducere”.

Numeroase plante medicinale își datorează utilizarea lor în terapeutica existenței în compoziția chimică a acestor vitamine și în special provitaminei A (β-caroten), complexul B și vitaminele C, E, K, P și PP.

Uleiuri volatile (eterice) sau esențiale

Acestea din punct de vedere chimic, nu sunt principii active definite, ci amestecuri de produși chimici volatili mirositori, lor datorându-li-se, în marea majoritate a cazurilor, mirosul plăcut al plantelor.

Se bucură în primul rând de proprietăți antiseptice, având o acțiune microbicidă, care variază de la un ulei la altul și care se datorează în special substanțelor de natură fenolică care intră în compoziția lor.

În majoritatea cazurilor, uleiurile volatile, după un timp mai îndelungat, în contact cu aerul suferă o serie de procese de oxidare, transformându-se în produși semilichizi și chiar solizi, amorfi. Asemenea precese chimice au loc însă și în anumite țesuturi ale unor specii de plante, iar produsele rezultate denumite prin termenul general de rezine sau rășine sunt înzestrate, uneori, cu activități terapeutice. [4]

Activitatea terapeutică a unui produs vegetal nu se datorează numai principiului sau principiilor active ce le conține, ci și altor substanțe care există în acest produs denumite adjuvante; aceste adjuvante pot amplifica activitatea sau pot să o prelungească și chiar să o modifice cum este cazul taninurilor din frunzele de ceai care moderează și prelungesc acțiunea brutală a cafeinei.

Este important de reținut ca polifenolii (în special taninurile și flavonozidele) alături de holozide (pectine, gume și mucilagii) sunt principiile active cele mai frecvente în compoziția chimică a plantelor. Lor, în cea mai mare măsură, li se datorează acțiunea terapeutică multiplă a unor specii de plante folosite în medicina tradițională.[5]

3.Metodologia de cercetare farmacognostică și fitochimică

a produselor vegetale

Cu ajutorul metodelor de analize calitative și canitative se urmărește stabilirea purității produselor vegetale și determinarea calității acestora în funcție de conținutul în principii active.

În final, pe baza rezultatelor acestui complex de analize se poate stabili dacă produsele cercetate îndeplinesc conditiile necesare pentru a fi folosite la prepararea de produse farmaceutice.

Metodele folosite pentru studiul produselor vegetale se clasifică în:

Metode calitative

Examenul macroscopic necesare identificării

Examenul microscopic produselor vegetale

Examenul microchimic necesare identificării grupelor de

Examenul chimic-calitativ a compușilor principii active din produsele

extrași cu diferiți solvenți analizate

Metode cantitative

Determinarea impurităților necesare stabilirii

Determinarea corpurilor străine purității și calității

Determinarea umidității produselor vegetale

Determinarea cenușei

Determinarea extractului necesare stabilirii purității și

Determinarea principiilor active calității produselor vegetale

Metodele de analize menționate se aplic în mod diferențiat în funcție de produsele vegetale care pot fi: cunoscute, cum sunt cele folosite în terapeutică sau necunoscute, adică produse noi provenite de la plante încă necunoscute.

În cazul analizei unui produs vegetal cunoscut se efectuează numai determinările necesare pentru verificarea identității, stabilirea purității și determinarea cantitativă a principiilor active.

Identificarea și caracterizarea produselor vegetale

Aceste obiective se realizează prin aplicarea metodelor calitative de analiză (examene: macroscopice, microscopice și chimice).

Examenul macroscopic

Prin acest examen, care reprezintă primul stadiu de investigare al produselor noi sau cunoscute, se urmărește stabilirea caracterelor morfologice observate cu ochiul liber sau la lupă și cele organoleptice percepute prin miros și gust. În acest mod sunt analizate întreaga varietate de produse vegetale a căror caracteristici sunt determinate de natura organelor din care sunt constituite, poziția taxonomică a plantelor de la care provin și de forma lor de prezentare: produse întregi (in toto), fragmentate (concissum) sau pulverizate (pulveratum).

Examenul macroscopic se efectueaza în ordinea precizării următoarelor elemente:

Aspectul Prin care se stabilește:

forma produsului (întreg sau fragmentat),

aspectul exterior și interior,

particularitățile feței superioare și inferioare,

consistența și particularitățile la pipăit,

iar la unele produse tipul secțiunii transversale și

raportul dintre țesuturi (la lupă)

Dimensiunile Se apreciază în :

cm pentru majoritatea produselor (folosind rigla),

mm pentru fructele și semințele mici (folosind hârtia milimetrică),

nm pentru cellule, incluziuni celulare (granule de amidon, cristale

folosind micrometrul ocular sau obiectiv)

Culoarea La exterior și la interior, pe ambele fețe

Mirosul Pe produsul ca atare, zdrobit între degete (frunze, flori), sau

pulverizat

Gustul Pe produsul ca atare sau pe decoct.

Examenele macroscopice ale produselor vegetale întregi sunt de cele mai multe ori suficiente pentru determinarea identității acestora. Caracterele organoleptice oferă unele informații orientative asupra compoziției chimice a produselor analizate. Pentru produsele vegetale fragmentate sau pulverizate examenul macroscopic dă unele indicații care adeseori nu sunt suficiente identificării, în care caz investigarea se continuă prin examenul microscopic.

Culoarea galbenă, roșie, albastă, portocalie a florilor și fructelor presupune prezența pigmenților flavonoidici sau compușilor carotenoidici, culoarea portocalie la scoarțe și organe subterane indică prezența derivaților antrachinonici, culoarea brună la frunze, organe subterane, scoarțe și unele cotiledonate este explicată de conținutul în taninuri catehice a acestor produse.

Gustul amar al produselor se poate datora prezenței substanțelor amare, heterozidelor cardiotonice sau unor alcaloizi, gustul astringent taninurilor, gustul aromat uleiurilor volatile, rezinelor, iar cel dulce glucidelor.

Examenul microscopic

Acest examen ce reprezintă o fază mai avansată a analizei calitative a produselor vegetale, urmărește stabilirea țesuturilor și elementelor anatomice caracteristice ale secțiunilor și preparatelor clasificate din pulberi sau produse fragmentate.

Caracterele anatomice ale diferitelor organe de plantă servesc în unele cazuri și la precizarea poziției taxonomice a speciilor producătoare.

Un produs vegetal poate fi supus examenului microscopic în urma unei anumite prelucrări în vederea obținerii unor preparate ce pot fi analizate la microscop.

Preparatele microscopice se realizează prin metode diferite în funcție de natura, starea produsului (întreg, fragmentat sau pulverizat), după consistența și chiar compozitia sa chimică.

Obținea preparatelor microscopice sub formă de secțiuni. Secționarea unui produs vegetal întreg sau fragmentat se face de obicei în plan transversal și dacă este nevoie în plan longitudinal (radial sau tangențial).

Pentru secționarea produselor vegetale uscate și fragmentate convenabil, acestea se aduc la consistența necesară prin înmuierea în apă fierbinte (frunzele și florile) sau prin fierbere timp mai îndelungat (rădăcinile, scoarțele, tulpinile). În cazul produselor cu mucilagii se foloseste macerarea (24 ore) într-un amestec se alcool și glicerină.

Secțiunile se obțin cu ajutorul unui brici sau a unui microtom (produsul fiind inclus în parafină).

Secțiunile transversale ale rădăcinilor și tulpinilor cu un diametru până la 1 cm pot să cuprindă întreaga suprafață, în cazul când sunt mai groase ele trebuie să fie alcătuite din fragmente care să conțină țesături și din zona centrală a produselor.

Dacă fragmentele ce trebuie secționate sunt subțiri cum sunt frunzele și unele scoarțe, sau sunt mici (fructe sau semințe), se include între două fragmente de maduvă de soc secționată longitudinal.

Pentru obținerea unei secțiuni transversale într-o frunză , se separă un fragment care să cuprindă nervura mediană și o parte a mezofilului din apropierea pețiolului. Secționarea se realizează printr-o mișcare uniformă a lamei briciului de la bază spre vârf, fără opriri, pentru obținerea de secțiuni subțiri și de aceiași grosime.

a) Examenul microscopic al produselor vegetale pulverizate

Produsele vegetale se pulverizează prin zdrobire sau măcinare, urmată de omogenizare prin cernerea pulverii (sită cu 30 ochiuri pe cm2).

Preparatul microscopic se obține utilizându-se un reactiv sau o soluție de clarificare a cărui alegere se face fie pentru clarificarea pulverii vegetale fie pentru obținerea unor reacții caracteristice compușilor chimici ai pereților celulari sau a conținutului celulelor.

Examenul microscopic al unei pulveri vegetale are ca scop stabilirea organului din care este constituit produsul vegetal, prin identificarea elementelor anatomice dominante specifice organului și stabilirea celor caracteristice.

b) Examenul microscopic al produselor vegetale “concissum” clarificate.

Această metodă se utilizează în examenul microscopic al fragmentelor produselor vegetale provenite din organe vegetale subțiri (frunze, flori, herba).

Identificarea compușilor chimici în țesuturile produselor vegetale se poate realiza prin reacții specifice de culoare sau precipitare. În acest scop se utilizează mai ales examenul histochimic și microsublimarea.

Examenul chimic

Prin acest examen se pot identifica compușii chimici dintr-un produs vegetal, direct în celulele țesuturilor cu ajutorul unor reacții specifice. Ținând seama de caracterul selectiv al acestor reacții, examenul histochimic care se efectuează pe secțiuni (transversale sau longitudinale), mai rar pe pulveri vegetale, permite localizarea unor principii active în produsele studiate.

În vederea efectuării acestui examen, produsele vegetale sunt astfel pregătite încât să se asigure menținerea compușilor chimici în tesuturi.

În general se aplică procedeul următor: fragmentele de produs vegetal se fierb într-o capsulă cu soluție saturată de clorură de sodium sau sulfat de sodiu până la consistența necesară secționării. Secțiunile obținute se aduc pe o lamă de microscop sau într-un cristalizor, se acoperă cu reactivul necesar. După câteva minute secțiunile se spală cu un solvent adecvat și se examinează la microscop pentru observarea țesuturilor și celulelor în care substanțe active au fost localizate cu ajutorul reactivului utilizat.

Se reprezintă schema secțiunii și desenul detaliat al celulelor în care a avut loc reacția de localizare.

În cazul pulverilor acestea pot fi tratate pe o lamă de microscop cu câteva picături de reactiv. Urmează spălarea ca în cazul secțiunilor.

Reactivii utilizați in examenul histochimic sunt foarte variați. Ei pot fi reactivi pentru identificarea unei singure substanțe sau reactivi pentru identificarea unui numar mare de substanțe, de exemplu reactivul Steinmetz (R).

În tabelul 1 sunt prezentate unele substanțe chimice care pot fi identificate pe această cale cu ajutorul unor reactivi de culoare.

Microsublimarea este o metodă de separare a unor compuși naturali din produsele vegetale. Această metodă se poate aplica numai în cazul substanțelor care au proprietatea să treacă sub formă de vapori, prin încălzire și apoi să cristalizeze (sublimeze) pe o suprafață rece.

Tehnica de lucru folosită este următoarea: pe o lamă de microscop situată pe o sită de azbest, așezată pe un trepied, se aduce cca. 0,10g produs vegetal pulverizat. La unul din capetele lamei se pune o baghetă de sticlă lungă de 5-6 cm și diametrul de 5mm pe care se sprijină o altă lamă de microscop. Pe lama superioară (înclinată) se aduce un tampon de vată îmbibat cu apă, care are rol de refrigerent. Se încălzește sistemul cu ajutorul unui bec de gaz la flacără mică, situată la cca. 10 cm de sita de azbest. În aceste condiții anumite substanțe din produsul vegetal pot sublima pe lama superioară, în dreptul tamponului de vată, unde apare un sublimat, de obicei, sub forma unor cristale.

În analiza sublimatului se va preciza aspectul, culoarea, sistemul de cristalizare, apoi solubilitatea, eventual fluorescența in UV, punctul de topire, după care se trece la reacții de identificare.

Tabel 1 Reactivii de culoare utilizați pentru identificarea unor grupe de compuși din produse vegetale

Prin microsublimare pot fi identificate principiile active înscrise în tabelul 2

Tabelul 2 Reactivii de culoare folosiți pentru identificarea unor principii active din produse vegetale.

Analiza chimică calitativă a produselor vegetale

Examenul chimic calitativ al compușilor extrași cu solvenți

Stabilirea compoziției chimice a unei specii vegetale nestudiate se poate realiza cu ajutorul analizei chimice calitative originale, folosind extracția cu solvenți.

Separarea principalelor grupe de compuși naturali (principii active) se face prin extracția succesivă și selectivă a produsului vegetal cu solvenți de polarități diferite. În primul rând produsul vegetal este extras cu un solvent nepolar: eter etilic, eter de petrol, benzen, hexan, cloroform, apoi cu un solvent polar ca etanol, metanol și în cele din urmă cu apă. Se obțin următoarele 3 extracte:

Extractul eteric.

Extractul alcoolic.

Extractul apos.

În extractul eteric se găsesc compuși chimici lipofili, iar în celelalte 2 extracte, compuși chimici hidrofili.

Pentru identificarea compușilor chimici din cele 3 extracte, acestea sunt analizate separat, folosind metode corespunzătoare proprietăților fizico-chimice ale fiecărui grup de principii active.

Modul de lucru:

A.Extractul eteric

10-20 g produs vegetal pulverizat se extrag cu eter etilic într-un aparat cu extracție continuă (tip Soxhlet) sau prin agitare mecanică ori manuală, în repetate rânduri, la temperatura mediului ambiant, într-un vas adecvat, până ce soluția eterică nu mai lasă reziduu prin evaporare.

Extractele eterice reunite și filtrate se concentrează la 50 ml într-un aparat de distilare.

Acest extract conține compușii chimici liposolubili:

-uleiuri volatile

-substanțe grase

-steroli, triterpene

-carotenoide

-acizi grași, acizi rezinici

-alcaloizi baze

-agliconi flavonici

-agliconi ai antracenozidelor (emodine, emodoli)

-cumarine

-clorofilă

Identificarea acestor compuși chimici se face după următorul mers de analiză:

Identificarea uleiurilor volatile și a substanțelor grase

Identificarea uleiurilor volatile

20 ml extract eteric se aduc într-un aparat adecvat și se distilă la sec. Dacă reziduul obținut are un miros plăcut, aromat, uleiul volatil se extrage cu cantități mici de alcool, prin eluții repetate. În cazul în care prin concentrarea soluțiilor alcoolice se obține un reziduu cu miros aromat, produsul vegetal analizat poate conține ulei volatil.

Confirmarea prezenței uleiului volatil

10-50 g produs vegetal uscat și mărunțit se antrenează cu vapori de apă sau se distilă cu apă într-un aparat tip Neo-Clevenger (prevăzut de farmacopee). Uleiul volatil astfel obținut poate fi caracterizat organoleptic (aspect, culoare, miros) și fizico-chimic (densitate, indice de refracție, putere rotatorie, indice de acetil).

În cazul studiului produselor vegetale cu uleiuri volatile este indicată extracția acestora și din materialul vegetal proaspăt recoltat pentru a aprecia calitatea uleiului obținut și randamentul față de cel din produsul uscat.

Pentru determinările calitative și cantitative ale constituenților acestor uleiuri se utilizează frecvent cromatografia pe strat subțire, dar mai ales cromatografia în fază gazoasă.

În extractul alcoolic, pe lângă ulei volatil, se mai pot găsi alcaloizi baze și diverși agliconi liberi.

Pentru identificarea acestor compuși se folosesc metodele prevăzute în mersul analitic al extractului eteric prezentat în continuare.

Substanțele grase se găsesc în reziduul extractului eteric după extracția uleiului volatil cu etanol.

Identificarea compușilor din substanțele grase se face astfel: reziduul se tratează cu 10 ml soluție alcoolică 0,5 N de hidroxid de potasiu și se fierbe la reflux pe baia de apă până ce la suprafață nu se mai observă picături de ulei (1-2 ore). Se distilă alcoolul, iar reziduul se dizolvă în 15-20 ml apă distilată fierbinte, care se aduce într-o pâlnie de separare. Balonul se spală de mai multe ori cu cantități mici de apă distilată fierbinte care se aduc în aceiași pâlnie de separare. După răcirea balonului se spală de 2 ori cu eter. Soluțiile eterice se aduc în pâlnia de separare peste soluția apoasă răcită și se agită pentru extragerea compușilor insaponifiabili. Extracția se repetă de 2 ori câte 8 ml eter. Extractele eterice reunite se usucă cu sulfat de sodiu anhidru.

În extractul eteric uscat (b1) se pot identifica: steroli, triterpene și carotenoide.

În pâlnia de separare rămâne soluția apoasă alcalină (b2), care conține sărurile de potasiu ale acizilor grași superiori, flavonelor și antrachinonelor (ultimele două componente pot colora soluția alcalină în galben-flavone sau în roșu-derivați antrachinonici).

Identificarea sterolilor și triterpenelor

3-10 ml extract eteric (b1) se evaporă într-o capsulă de porțelan pe baie de apă (la nișă). Reziduul se dizolvă în 0,5 ml cloroform, apoi se adaugă 0,5 ml anhidridă acetică. Soluția rezultată se trece într-o eprubetă uscată, după care cu ajutorul unei pipete se aduce la fundul eprubetei, 1-2 ml acid sulfuric concentrat.

În zona de contact a celor două lichide apare un inel roșu-brun sau violet, iar stratul superior se colorează, după 5-10 min., în verde-albastru sau violet, dacă sunt prezenți sterolii sau triterpenele (reacția Liebermann-Burchard).

În cazul în care soluția rezultată prin dizolvarea reziduului (în cloroform și anhidridă acetică) este de culoare verde (clorofilă), se împarte în două eprubete. Una din eprubete se folosește pentru efectuarea reacției, iar cealaltă ca martor de culoare.

Identificarea carotenoidelor

3-10 ml extract eteric (b1) se evaporă într-o capsulă de porțelan pe baie de apă (la nișă). Reziduul se tratează cu 2-3 picături de reaciv Carr-Price. Pigmenții carotenoidici dau cu acest reactiv o culoare albastră care trece în roșu. Cu acid sulfuric concentrat carotenoidele se colorează în albastru intens sau verde-albastru.

Identificarea acizilor grași

Soluția apoasă alcalină (b2) din pâlnia de separare se tratează cu acid clorhidric concentrat până la pH=3-4. Soluția apoasă acidă devine opalescentă datorită acizilor grași care se extrag prin agitare repetată cu eter etilic sau de petrol (3x25ml). Extractele eterice reunite se deshidratează cu sulfat de sodiu anhidru. Dacă prin concentrarea extractului eteric (într-un aparat de distilare) se obține un reziduu onctuos, sunt prezenți acizii grași.

Pentru identificarea acestor acizi se poate folosi cromatografia pe hârtie sau cromatografia pe strat subțire.

Identificarea acizilor rezinici

Dacă prin acidularea soluției apoase alcaline care a fost epuizată de substanțele insaponifiable apare un precipitat, o mică porțiune din acest precipitat se dizolvă în eter de petrol (10 ml) și se încearcă prezența acizilor rezinici. Soluția eterică se agită într-o eprubetă cu 5 ml soluție 1% de acetat de cupru. Dacă sunt prezenți acizi rezinici, stratul eteric se colorează în albastru-verde până la albastru datorită rezinaților de cupru (reacția Hirschsohn). Reacția se poate executa și direct, utilizând 5-10 ml extract eteric inițial (A), care se evaporă și reziduul se extrage de două ori cu câte 5 ml eter de petrol. După filtrarea soluției se efectuează reacția Hirschsohn ca mai sus.

Extractul eteric inițial rămas (30 ml) se folosește pentru identificarea: bazelor alcaloidice, agliconilor liberi, sterolilor, triterpenelor și pigmenților carotenoidici.

Identificarea alcaloizilor baze

10 ml extract se evaporă într-o capsulă de porțelan pe baia de apă. Reziduul se dizolvă în 1,5 ml acid clorhidric 2% prin amestecare cu o mică baghetă de sticlă la cald (pe baia de apă). Soluția decantată sau filtrată se împarte în trei eprubete, în volume egale. La una din probe se adaugă 2-3 picături de reactiv Mayer. La a doua probă se adaugă 2-3 picături de reactiv Bertrand. Ultima eprubetă servește ca probă martor.

Dacă probele tratate cu reactivi dau precipitate evidente (de culoare alb-gălbuie), alcaloizii sunt prezenți.

Identificarea agliconilor flavonici

3-5 ml extract eteric se evaporă într-o capsulă pe baia de apaă. Reziduul se dizolvă în 1-2 ml metanol 500 la cald (pe baia de apă). Soluția de culoare galbenă se aduce într-o eprubetă, se adaugă puțină pulvere sau 2-3 bucăți de span de magneziu si 10 picături de acid clorhidric concentrat.

Apariția unei colorații roșii-prtocalii indică prezența agliconilor flavonici (reacția Shibata sau reacția cianidolului).

Identificarea emodolilor (agliconii antracenozidelor)

3 ml extract eteric se aduc într-o eprubetă, se adaugă 1 ml hidroxid de sodiu 10% și se agită. Dacă soluția alcalină se colorează în roșu-vișiniu sunt prezenți derivații antrachinonici (emodolii) liberi sub formă oxidată (reacția Bontrager).

Identificarea cumarinelor

3 ml extract eteric se evaporă într-o capsulă de porțelan pe baia de apă. Reziduul se dizolvă în 2 ml apă distilată fierbinte. După răcire, soluția se împarte în 2 eprubete. Una din eprubete servește ca probă martor. În cealaltă se adaugă 0,5 ml amoniac 10%. Ambele eprubete se examinează la lumina ultravioletă filtrată.

Apariția unei fluorescențe (albastră-verzuie sau violetă) mai intensă în proba alcalinizată confirmă prezența cumarinelor.

Verificarea se face prin reacția Feigl.

Identificarea sterolilor, triterpenelor și carotenoidelor din produsul vegetal se face pein reacțiile descrise anterior.

Înlăturarea pigmenților clorofilieni din extractul eteric se poate realiza prin trecerea acestuia printr-o coloană cu adsorbant (silicagel, oxid de aluminiu).

B. Extractul alcoolic

Produsul vegetal rămas de la extracția cu eter, se aduce într-un vas conic de capacitate potrivită sau într-un balon prevăzut cu refrigerent ascendent. Se adaugă 100-150 ml metanol sau etanol, se pune în gâtul balonului o pâlnie (sau un refrigerent ascendent cu balon) și se extrage la pe baia de apă timp de 20-40 min. Dacă este necesar, extracția se repetă. Extractul alcoolic se filtrează prin hârtie într-un vas potrivit. Produsul vegetal se spală cu cantități mici de alcool cald și se filtrează prin același filtru.

Extractul alcoolic obținut se concentrează într-un aparat de distilare la 50 ml. Etanolul și metanolul extrag din produsele vegetale degresate importante grupuri de compuși naturali (principii active):

-polifenoli

-compuși reducători

-alcaloizi săruri

-aminoacizi

-glicozidele polifenolice (antracenozide, cumarine, flavonoide)

-glicozide sterolice (cardiotonice, saponozide)

-glicozide triterpenice

Rezultate foarte bune se obțin și prin extracția cu alcool diluat (70-800).

Principiile active extrase se identifică cu ajutorul unor reacții specifice din extractul alcoolic ca atare sau din extractul alcoolic prealabil hidrolizat.

Reacții efectuate în extractul alcoolic

Identificarea taninurilor

1 ml extract alcoolic adus într-o eprubetă, se diluează cu 2 ml apă distilată și se adaugă 2-3 pic. de clorură ferică 1% diluata 1/10.

Apariția unui colorații albastre-negricioase indică prezența taninurilor galice, iar o colorație verde-închisă atestă prezența taninurilor catechice.

În cazul unui amestec de taninuri galice și taninuri catechice se recurge la separarea lor cu ajutorul reactivului Styassny.

10 ml extract apos se fierbe la reflux cu 3 ml reactiv Styassny timp de 30 minute. În aceste condiții taninurile catehice se condensează, se depune un precipitat roșu care se separă prin filtrare. În soluția filtrată, după neutralizare cu acetat de sodiu în exces, se adaugă soluție de clorură ferică diluată (2-3 picături). Apariția unei colorații albastre confirmă prezența taninurilor galice.

Identificarea compușilor reducători

1 ml extract alcoolic se aduce într-o eprubetă, se diluează cu 2 ml apă distilată, se adaugă 1 ml soluție Fehling (I+II) și se încălzește la fierbere.

Apariția la fundul eprubetei a unui precipitat roșu cărămiziu (oxidul cupros) indică prezența compușilor reducători.

Identificarea alcaloizilor săruri

15 ml extract alcoolic se evaporă într-o capsulă pe baia de apă (sau baie de nisip). Reziduul se dizolvă în 5-10 ml de acid clorhidric 2%, prin amestecarea cu o baghetă de sticlă, la cald (pe baia de apă). Soluția acidă decantată sau filtrată se aduce într-o pâlnie mică de separare și se adaugă amoniac concentrat (pH:8-10). Soluția alcalină se extrage cu eter sau cloroform (3x8ml).

Extractul eteric sau cloroformic spălat cu apă distilată (în pâlnie de separare) se separă, se anhidrizează (sulfat de sodiu anhidru) și se evaporă într-o capsulă pe baie de apă (la nișă). Reziduul se dizolvă în 1,5 ml acid clorhidric 2%. Soluția acidă decantată se împarte în 3 eprubete, în volume egale. La una din probe se adaugă 2-3 pic. reactiv Mayer. La altă probă se adaugă 2-3 pic.reactiv Bertrand, iar a treia eprubetă servește ca probă martor..

Dacă probele tratate cu reactivi dau precipitate (alb-gălbui) alcaloizii sunt prezenți în produsul vegetal analizat.

Identificarea bazelor alcaloidice cuaternare și a aminelor oxidate

Soluția apoasă alcalină rămasă după extracția alcaloizilor cu eter sau cloroform se acidulează cu acid clorhidric concentrat la pH=3, se filtreză după care se efectuează reactiile de precipitare cu reactivii Mayer și Bertrand ca mai sus. Apariția unui precipitat indică prezența bazelor alcaloidice cuaternare sau aminelor oxidate.

Având în vedere importanța terapeutică a alcaloizilor, precum și procedeele curente de extracție (cu soluții hidroalcolice de concentrații diferite), pentru a preîntâmpina erori la identificarea acestor principii active se poate proceda în modul următor:

20 g produs vegetal degresat, se extrage cu o soluție hidroalcoolica utilizând tehnica de lucru descrisă la obținerea extractului alcoolic (B)

Dacă se folosește extracția cu alcool de 80%, extractele hidroalcoolice obținute se concentrează la o consistență sirupoasă. Se acidulează cu acid clorhidric 2% (10 ml) prin amestecarea la cald cu o baghetă de sticlă. După răcire se adaugă clorură de sodiu (0,5 g) și se amestecă. Soluția se filtreză pe hârtie de filtru, apoi se spală filtrul cu 2-3 ml acid clorhidric 2%. Din extractul acid apos se iau probe de 1 ml și se fac reacțiile cu reactiv Mayer și reactiv Bertrand.

Apariția unor precipitate abundente poate indica prezența alcaloizilor, baze alcaloidice cuaternare și aminelor oxidate.

Pentru confirmarea prezentei alcaloizilor extractul acid apos rămas se aduce într-o pâlnie de separare. Se adaugă amoniac concentrat (pH:8-10) după care se agită cu cantități mici de ater sau cloroform. Se separă cele două soluții: extractul eteric sau clororformic și soluția apoasă alcalină.

În extractul eteric sau cloroformic se identifică alcaloizii după procedeul descris anterior, iar în soluția apoasă alcalină după acidulare se identifică bazele alcaloidice cuaternare și aminele oxidate.

Identificarea aminoacizilor

5 ml extract se evaporă într-o capsulă la sec. Reziduul se reia cu 1,5 ml apă la cald, se filtrează într-o eprubetă și se adaugă 10 picături soluție acetonică de ninhidrină 1%. Se încălzește într-o baie de apă fierbinte 20-25 minute.

Apariția unei culori violete sau albastru-violet indică prezența aminoacizilor.

Reacții efectuate în extractul alcoolic hidrolizat.

25 ml extract alcoolic se aduce într-un balon cu refrigerent ascendent și i se adaugă 15 ml acid clorhidric 10 %, apoi se fierbe la reflux timp de 30 minute. Se distilă alcoolul într-un aparat adecvat. Soluția apoasă acidă care adeseori devine opalescentă, se aduce într-o pâlnie de separare și se agită repetat cu eter (3x15ml).

Prin separare rezultă : a) extractul eteric care se deshidratează cu sulfat de sodiu anhidru și b) soluția apoasă acidă.

Extractul eteric (40 ml)

În acest extract se pot identifica următoarele grupe de principii active: antracenozide, cumarine, glicozide sterolice și triterpenice, prin reacții caracteristice agliconilor obținuți prin hidroliză.

Identificarea antracenozidelor

3 ml extract eteric se aduce într-o eprubetă, se adaugă 1 ml amoniac 25 % și se agită. Dacă soluția alcalină se colorează în roșu-vișiniu sunt prezenți emodolii (agliconii antracenozidelor).

Identificarea cumarinelor

5 ml extract eteric se evaporă într-o capsulă de porțelan pe baia de apa (la nișă). Reziduul se dizolvă în 2 ml apă distilată fierbinte. După răcire soluția se împarte în 2 eprubete. Una din eprubete servește ca probă martor. În cealaltă eprubetă se adaugă 0,5 ml soluție de amoniac diluat. Ambele eprubete se examinează la lumina ultraviolet filtrată.

Apariția unei fluorescențe (albastră, verde sau violetă) mai intensă la soluția alcalinizată indică prezența cumarinelor.

Prin reacția Feigl-Frehden-Angel se poate pune în evidență lactona hexaatomică din structura cumarinelor astfel: extractele apoase cercetate la UV se aduc Într-o capsulă, se adaugă clorhidrat de hidroxilamină (3-5 picături soluție 0,5 N) și hidroxid de potasiu 10% până la pH=8-9. se concentrează pe baie de nisip. Reziduul se tratează cu acid clorhidric 10% până la pH=3-4 și cu 1-2 picături de soluție 3% clorură ferică.

Prezența derivaților lactonici determină apariția unei colorații violetă-fugace.

Identificarea glicozidelor sterolice (cardiotonice, saponice)

Heterozidele cardiotonice

Pentru identificarea nucleului sterolic se face reacția Liebermann-Burchard descrisă la extractul eteric. Pentru identificarea lactonei pentaatomice nesaturate caracteristică glicozidelor cardenolidice se efectuează reacția Kedde:

10 ml extract eteric se evaporă într-o capsulă pe baia de apă. Reziduul se dizolvă în 1-2 ml metanol, se adaugă 1-2 ml soluție alcoolică de hidroxid de potasiu 1N și 3-4 picături de soluție 1% de acid 3,5-dinitrobenzoic. Prin încălzire se obține o colorație violetă fugace.

În același scop se poate folosi reactivul Baljet (2,4,5-trinitrofenol în mediu alcalin), reactivul Legal (sodium nitroprusiat în mediu alcalin), reactivul Raymond (m-dinitrobenzen în mediu alcalin) care dau reacții de culoare.

Pentru partea glucidică se poate efectua reacția Keller-Kiliani (clorura ferică-acid acetic-acid sulfuric), reacția Pesez (xanthydrol), care sunt caracteristice 2-dezoxiozelor.

Identificarea saponinelor sterolice și triterpenice

Pentru nucleul sterolic (triterpenic) se face reacția Libermann-Burchard. În continuare se poate face testul Salkowski (cu acid sulfuric) pentru sterolii nesaturați. Apariția unei colorații roșie-vișinie la limita celor două lichide (inel) indică prezența sterolilor nesaturați.

Identificarea saponinelor se face prin proba se spumificare și proba de hemoliză, folosind soluția apoasă a reziduului extractului alcoolic nehidrolizat.

Identificarea flavonozidelor

5 ml extract eteric se evaporă într-o capsulă de porțelan pe baia de apă. Reziduul se dizolvă în 2 ml metanol 500, la cald. Soluția de coloare galbenă se aduce într-o eprubetă, se adaugă puțină pulvere sau 2-3 bucăți de span de magneziu și 10 picături de acid clorhidric concentrat (reacția Shibata). Apariția unei colorații roșii sau portocalii indică prezența agliconilor flavonozidelor. Culoarea roșie este caracteristică flavonolilor, iar culoarea portocalie flavonelor.

Identificarea flavonozidelor se poate face și în extractul alcoolic nehidrolizat: se evaporă extractul (3ml) într-o capsulă pe baia de apă. Dacă reziduul este verde, se triturează de mai multe ori cu eter de petrol (3x12ml) pentru extragerea clorofilei și rezinelor.

Reziduul astfel purificat se dizolvă în alcool metilic 500 (2ml) și se face reacția Shibata.

Identificarea proantocianidolilor (leucoantocianilor).

Într-o probă de 5 ml extract alcoolic 80% se adaugă acid clorhidric concentrat 0,5 ml și se încălzește 5 minute. Dacă apare o luloare roșie-violet sunt prezenți proantocianidolii (leucoantocianii).

b) Soluția apoasă acidă

Identificarea antocianozidelor.

Dacă soluția acidă are culoarea roșie, care la pH 7 trece în violet, iar în mediul alcalin în albastru sau verde, sunt prezente antocianozidele.

C. Extractul apos

Produsul vegetal rămas de la extracția cu alcool, este uscat și extras cu apă distilată (50-100 ml) la cald, 15-20 minute. Extractul apos filtrat se concentrează la 50 ml.

Apa extrage din produsele vegetale următorii compuși chimici:

glucide (oze, polioze, poliuronide)

glicozide (heterozide)

taninuri

substanțe proteice

alcaloizi săruri

În general, în cazul când extracția cu etanol sau metanol a produsului vegetal a fost totală, în extractul apos nu mai pot fi identificați aceiași compuși chimici.

Extracția cu apă este preferată în cazul produselor verzi, deoarece nu extrage clorofila.

Principiile active extrase se identifică prin reacții specifice, folosind extractul apos ca atare și extractul apos hidrolizat.

Reacții efectuate în extractul apos

Identificarea poliuronidelor (mucilagii, pectine și gume)

2 ml extract apos se toarnă în fir subțire într-o eprubetă cu 10 ml alcool sau acetonă. Dacă se formează un precipitat voluminos (floconos), aceasta se separă prin filtrare sau centrifugare. Se spală cu alcool sau acetonă și se colorează cu un reactiv specific (hematoxilină, albastru de toluidină). Culoarea precipitatului în violet sau albastru indică prezența mucilagiilor (care sunt foarte răspândite).

Identificarea compușilor reducători

Într-o eprubetă se aduc 1 ml extract apos, se adaugă 1 ml soluție Fehling (I+II) și se încălzește la fierbere.

Apariția pe fundul eprubetei a unui precipitat roșu cărămiziu atestă prezența compușilor reducători.

Identificarea unor glucide (oze si polioze)

2 ml extract apos se evaporă într-o capsulă de porțelan. Reziduul se tratează cu 2-3 picături de acid sulfuric concentrat. După un repaus de 3-4 minute, se adaugă3-4 picături de soluție saturată de timol. Apariția unei colorații roșii indică prezența ozelor sau poliozelor.

1 ml extract apos obținut prin decantare se tratează cu reactiv Lugol (1-3 picături). Apariția unei colorații albastre, atestă prezența amidonului.

Identificarea saponinelor (saponozidelor)

a) Reacția Liebermann-Burchard 10-20 g produs vegetal pulverizat se extrag cu eter etilic într-un aparat cu extracție continuă (tip Soxhlet) sau prin agitare mecanică ori manuală, în repetate rânduri, la temperatura mediului ambiant, într-un vas adecvat, până ce soluția eterică nu mai lasă reziduu prin evaporare.

b)Test spumă: 1 ml extract apos se diluează cu 9 ml apă. 4 ml extract apos diluat, se aduce într-o eprubetă (ø 1,5 cm) și se agită 15 secunde. Formarea unei coloane de spumă înaltă de minimum 1 cm și persistentă minimum 15 minute, ne indică prezumtiv prezența saponinelor.

c) În continuare se face proba de hemoliză prin metoda gelatin- sânge.

Dacă cele trei reacții sunt pozitive saponinele sunt prezente în produsul vegetal analizat.

Identificarea taninurilor.

1 ml extract apos adus într-o eprubetă se tratează cu 1-2 picături clorură ferică 1% diluată 1/10.

Apariția unei culori albastre indică prezența taninurilor galice, iar o colorație verde închis confirmă prezența taninurilor catehice.

În cazul unui amestec de taninuri galice și catehice se folosește reactivul Styassny (vezi extractul alcoolic)

Identificarea alcaloizilor săruri

15 ml extract apos se alcalinizează cu amoniac 10 % (pH=8-10) și se extrage cu eter sau cloroform în pâlnia de separare de (3×15 ml). În continuare se aplică aceiași tehnică de lucru folosită pentru identificarea alcaloizilor în extractul alcoolic.

2) Reacții efectuate în extractul apos hidrolizat

Se procedează după tehnicile de lucru descrise la extractul alcoolic atât pentru hidroliza extractului apos cât și pentru identificarea: antracenozidelor, cumarinelor, glicozidelor sterolice și triterpenice, flavonozidelor și antocianozidelor. Aceste reacții se efectuează în cazul în care ele nu au fost pozitive în extractul alcoolic.

În cazul asocierii unor compuși care pot da suprapuneri de culori ce nu permit identificarea lor, se recurge la alte metode ca microsublimarea, dar mai ales la cele cromatografice.

Analiza cromatografică

Cromatografia este o metodă fizico-chimică de separare a substanțelor dintr-un amestec, bazată pe capacitatea de distribuție a acestora între o fază staționară și una mobilă.

După natura fazelor mobile metodele cromatografice se împart în cromatografie de lichide și cromatografie în fază gazoasă, iar după factorii fizico-chimici care stau la baza separării cromatografice se clasifică în cromatografie de adsorbție, cromatografie de repartiție, cromatografie chimică (prin schimbători de ioni, prin precipitare, etc).

a) Cromatografia pe coloană (CC) se folosește în mod curent pentru separarea principiilor active din extracte vegetale. În acest caz adsorbantul solid constituind faza staționară (oxid de aluminiu, silicagel, oxid de magneziu) se aduce într-un tub de sticlă, de dimensiunile necesare, prevăzut în partea inferioară cu un robinet. Peste adsorbant se adaugă extractul vegetal care urmează a fi supus separării.

Separarea substanțelor se poate realiza, în mod general, prin:

-scoaterea coloanei de adsorbție, din tub (după ce acesta a fost irigată cu solventul în care s-a solubilizat extractul vegetal) și separarea în porțiunile corespunzătoare zonelor de adsorbție urmată de eluarea acestora cu solvenți adecvați;

-eluarea coloanei cromatografice cu amestecuri de solvenți în gradient de polaritate.

Fiecare fracțiune se colectează în vase separate; se evaporă și se identifică substanțele separate. Pentru o mai bună separare în unele cazuri fracțiunile colectate sunt recromatografiate. Această metodă de separare este folosită și în scopuri industriale.

b) Cromatografia pe hârtie (CH)

După mecanismul de separare este o metodă cromatografică de repartiție.

-Faza staționară este constituită din hârtie cromatografică (preparată din fibre de celuloză), de grosime și porozitate adecvată, îmbibată adeseori cu apă, formaldehidă etc.

Tipurile de hârtie mai folosite sunt Whatman 1, 2, 3 și 4, Schleicher-Schüll 2040 (a, b), 2043 (a, b), Archer Binzen, Munkell.

-Faza mobilă (developantul) este constituită dintr+un solvent sau amestec de solvenți. După sensul migrării fazei mobile, se deosebesc mai multe metode de analiză cromatografică (circulară, ascendentă, descendentă, unidimensională, bidimensională).

Hârtia perfect întinsă se taie de-a lungul fibrelor în benzi de lățimi convenabile, după care se aleg camerele cromatografice de developare din sticlă, ermetic închise, prevăzute cu dispozitive de fixare a hârtiei și cuvă pentru faza mobilă.

Modul de lucru: saturarea atmosferei din camera cromatografică se face în principiu cu solvenții fazei mobile timp de 24 ore.

Pregătirea benzilor de hârtie cromatografică diferă de la caz la caz. În continuare se pregătesc extractele de cercetat și soluțiile etalon în concentratiile prevăzute în tehnicile folosite. Aplicarea acestor soluții se face prin picurare cu ajutorul unei micropipete de 0,1 ml divizată în 0,001 ml sau capilare de sticlă de anumite capacități (în cazul cromatografiei cantitative); startul se fixează la 5 cm (ascendentă) sau 10 cm (descendentă) de marginea benzii de hârtie.

Distanța dintre punctele de aplicare 3-4 cm, iar la marginea laterală a hârtiei de 2,5 cm.

Cantitatea de soluție pipetată este de 20-05 µml, iar diametrul spotului de cel mult 0,6 cm.

Hârtia cromatografică astfel pregătită se introduce cu capătul la care este trasată linia de start în cuva cu developant din camera cromatografică, astfel ca lichidul să nu vină în contact cu spoturile. Dacă nu se precizează tehnica de developare, se va folosi cea ascendentă.

Developarea se face la o temperatură de 20-250C.

Când frontul fazei mobile a parcurs distanța prevăzută în tehnica de lucru , se scoate cromatograma, se înseamnă frontul solventului și se usucă la aer sau în etuvă la temperatura necesară, funcție de sistemul de solvenți folosit.

Identificarea spoturilor se face prin examinarea cromatogramei ca atre sau după tratare cu reactivii necesari, la lumina zilei sau în ultraviolet la λ=254 nm și λ=365 nm.

Pentru identificarea substanțelor se compară pe aceiași cromatogramă Rf-rile probei de analizat cu valorile Rf-rilor obținute la substanțele etelaon folosite. De asemenea se ține seama de culoarea și forma spoturilor obținute și a substanțelor etalon.

Rf = distanța dintre linia de start și centrul spotului

Distanța dintre linia de start și frontul de solvent trecând prin centrul

Cromatografia circulară pe hârtie

Prin această metodă substanțele se separă în zone concentrice.

Se folosesc pătrate de hârtie cu latura de 20 cm. Pe cele două diagonale la distanța de 1-1,5 cm de centru, se marchează patru puncte de start în care cu ajutorul unei micropipete, se aduc extractele de analizat și soluțiile substanțelor etalon.

Faza mobilă (solventul sau sistemul de solvenți) irigă cromatograa cu ajutorul unei mese de vată care străbate hârtia printr-un orificiu central, capătul fiind introdus în faza mobilă din cutia Petri (Ø 16-18 cm).

Se acoperă cutia cu capacul ei. Developarea durează 1-2 ore. Când frontul de solvent ajunge la marginea cutiei (1,5-2 cm) se ridică capacul, se scoate cromatograma, se îndepărtează meșa, se notează frontul de solvent și se usucă la temperatura camerei.

În continuare se procedează ca în cadrul cromatografiei ascendente sau descendente menționate anterior.

Cromatografia pe strat subțire (CSS)

Cromatografia pe strat subțire este o metodă prin care pot fi separate, identificate și determinate cantitativ sau semicantitativ serie de substanțele chimice dintr-un amestec, îndeosebi din extractele vegetale. Acestă metodă prezintă mari avantaje față de celelalte metode cromatografice dintre care menționăm următoarele:

Posibilitatea de separare superioară cromatografiei pe hârtie și coloană, datorată structurii adsorbanților, care prin suprafețele mari oferite, permit separarea și identificarea unor substațe care se găsesc în cantități mici, în amestecul analizat.

Simplitatea, rapiditatea (durata 15-60 min.) și universalitatea metodei (cromatografie de adsorbție, cromatografie de repartiție).

Posibilitatea de analiză simultană a mai multor probe pe aceiași placă, inclusiv substanțele etalon.

Reproductibilitatea rezultatelor în condiții de lucru standard.

Posibilitatea de analiză cantitativă sau semicantitativă.

Rezistență mecanică și chimică față de reactivi, în comparație cu cromatografia pe hârtie.

Cromatografia pe strat subțire are o fază staționară constituită dintr-un strat de adsorbant (silicagel, oxid de aluminiu, kieseegur, silicat de magneziu, celuloză, poliamidă, sefadex) cu sau fără liant (amidon, gips, carboximetil-celuloză) aplicat pe o placă de sticlă și o fază mobilă formată din unul sau mai mulți solvenți.

Mecanismul de separare se bazează pe distribuția diferită a substanțelor unui amestec, între cele două faze, staționară și mobilă. Substanțele antrenate de faza mobilă sunt trecute prin faza staționară.

Viteza de migrare a substanțelor este dependentă de natura lor chimică, care influențează distribuția acestora în cele două faze. Cu cât o substanță este mai puțin adsorbită de faza staționară, viteza sa de migrare este mai mare, deci, și Rf-ul spotului este mare și invers.

În funcție de natura fazei staționare se determină tipul cromatografiei: de adsorbție (solid ↔ lichid) sau de repartiție (lichid ↔solid).

Adsorbanții și lianții trebuie să îndeplinească anumite condiții de granulație și de puritate.

Developarea cromatoplăcilor are loc în camere de sticlă ermetic închise de diferite tipuri.

Cromatografia pe strat subțire, după direcția de migrare a solventului, poate fi ascendentă, descendentă, orizontală, bidimensională.

Modul de lucru: Pulberea de adsorbant se agită cu apa (1g/2ml) sau alt solvent prevăzut, într-un vas conic, timp de 1 min, după care se întinde în strat subțire pe plăci de sticlă de mărimi diferite (5x20cm, 10x20cm,20x20cm), spălate în prealabil cu detergent și uscate cu alcool.

Există mai multe tipuri de dispozitive prin care se poate realiza un strat de adsorbant uniform și de o anumită grosime (de obicei 0,25mm).

După întinderea stratului, plăcile se usucă la aer 30 minute, apoi se activează timp de 45-60 minute în etuvă la 1100C, după care se lasă să se răcească într-un exicator cu clorură de calciu anhidră.

Plăcile astfel pregătite se păstrează în exicator. Dacă păstrarea durează mai multe zile ele trebuie activate din nou în același condițiuni.

Aplicarea soluțiilor de analizat se face cu ajutorul unei micropipete sau cu tuburi capilare de anumite capacități. Limita de start este situată la 2 cm de marginea plăcii, distanța dintre punctele de start trebuie să fie de cel putin 1,5 cm, iar dintre punctele marginale și latura plăcii de 2 cm.

După aplicarea soluțiilor la start și evaporarea solventului, placa se introduce în camera de develoare care conține faza mobilă formată din unul sau mai mulți solvenți (indicată de tehnică). Introducerea developantului (faza mobilă) se face cu cel puțin 30 minute înainte de cromatografie. Pentru o mai bună saturare se pot căptuși 3 din pereții camerei cu o bandă de hârtie îmbibată în developant. Se introduce placa astfel ca spoturile de la start să nu atingă suprafața developantului.

Developarea se face la temperatură constantă de 20-250C. În condițiile în care developantul a parcurs distanța prevăzută în tehnică se scoate placa și se usucă la aer sau în etuvă, la o temperatură corespunzătoare, în funcție de solventul sau amestecul de solvenți utilizat.

Identificarea spoturilor se face cu reactivi specifici folosind același procedeu descris la cromatografia pe hârtie.

La determinarea cantitativă sau semicantitativă a substanțelor cromatografiate sunt utilizați adsorbanți și solvenți cu un înalt grad de puritate.

Metodele folosite pentru determinarea cantitativă pot fi directe sau indirecte:

metoda densiometrică care se bazează pe deplasarea cu o viteză constantă a cromatoplăcii între o sursă de lumină și o celulă fotoelectrică cuplată cu un înregistrator al atenuărilor de lumină. Curba obținută se compară cu curbele unor substanțe etalon;

metoda măsurării suprafețelor la baza căreia stă relația de proporționalitate între suprafață și logaritmul concentrației substanței (este mai puțin exactă);

metodele indirecte care se aplică după eluarea zonelor de pe stratul subțire, urmate de determinarea substanțelor prin metode chimice, fizico-chimice sau biologice;

d) Cromatografia în fază gazoasă (CG) (gaz-solid, gaz-lichid) necesită o aparatură de înaltă performanță cu ajutorul căreia se efectuează atât analize calitative cât și determinări cantitative a substanțelor dintr-un amestec.

Determinarea purității

După identificarea produselor vegetale, prin metodele prezentate anterior urmează stabilirea purității acestora.

Determinarea purității se face conform normelor prevăzute de farmacopee sau fișe tehnice care prevăd următoarele:

a) Determinarea impurităților din plantă

Aceste impurități pot fi constituite din părți din alte organe ale plantei producătoare sau produse degradate.

Adeseori odata cu recoltarea diverselor organe de plante care constituie produsele vegetale sunt recoltate și alte organe care nu conțin principii active.

Tot în această categorie intră produsele alterate (atacate de boli, insecte) sau degradate (fructe zdrobite, frunze brunificate).

Normele de calitate prevăzute pentru fiecare produs vegetal privind anumite procentaje din aceste impurități sau exclud prezența lor.

b) Determinarea corpurilor străine

același norme prevăd sau exclud prezența în produse vegetale a unor corpuri străine (părți din alte plante, substanțe minerale, pământ, pietre).

Normele existente prevăd prelevarea pentru determinarea impurităților și a corpurilor străine din produse vegetale, a următoarelor cantități de probe de analizat:

– pentru semințe și fructe foarte mici 2-5g

– pentru alte semințe și fructe mici 20g

– pentru produse vegetale fragmentate 50g

– pentru flori, frunze, ierburi, scoarțe 100g

Impuritățile din plantă sau părți din alte plante și substanțe minerale (pământ, praf, nisip, pietricele), indicate în monografia produsului vegetal respectiv, se aleg cu o pensetă, se cântăresc separat, iar rezultatele se exprimă în procente.

Determinarea calității produselor vegetale

Determinarea calității produselor vegetale este o condiție absolut necesară pentru avizarea folosirii acestora în terapeutică sau ca materie primă în laboratoare galenice ori în industria farmaceutică.

Determinări preliminare

Stabilirea compoziției chimice, sub aspect cantitativ și calitativ, a unui produs vegetal este precedată de efectuarea unor probe preliminare, care prezintă o importantă valoare orientativă pentru investigațiile chimice ce urmează a fi aplicate.

-Determinarea umidității

după cum este cunoscut, gradul de umiditate al produselor vegetale trebuie să se încadreze în anumite limite care permit asigurarea conservării lor.

Cantitatea de apă din produse vegetale este influențată de mediul ambiant. Determinarea conținutului în apă se încadrează în analiza preliminară, deoarece cantitatea de reziduu uscat sau fix (masa vegetală rezultată din îndepărtarea la cca. 1000C a componentelor volatile) reprezintă o valoare de referință pentru alte date analitice cantitative. În aceste cazuri, prin urmare, determinarea reziduului uscat este identică cu determinarea conținutului în apă.

Procedeele de determinare a conținutului în apă din produse vegetale sunt diferite. Materialul vegetal trebuie, în prealabil, mărunțit sau pulverizat.

a)Uscarea la etuvă

Într-o fiolă de cântărire adusă la greutate constantă prin încălzire în etuvă (la aceeași temperatură la care urmează să se facă și uscarea), răcită în exicator, se introduc 5-10 g din proba de analizat. În cazul în care se prevede și determinarea uleiurilor volatile, din pierderea totală se va scădea cantitatea în grame de ulei volatil determinat în prealabil. Diametrul fiolei se alege în așa fel încât cantitatea de material vegetal luat în lucru să nu formeze un strat mai gros de 5 mm.

Fiola cu conținut, dacă nu se precizează altfel în monografie, se menține 4 ore în etuvă la 100-1050C, se răcește în exicator, se închide și se cântărește. Se continuă uscarea câte 60 minute, răcirea în exicator și cântărirea, până la greutatea constantă. Pentru produsele grase se adaugă nisip, cântărit în prealabil, se amestecă cu o baghetă de sticlă, apoi se usucă la 100-1050C până la greutate constantă.

b)Uscarea la vid (sub presiunea redusă)

În cazurile speciale, indicate pentru uscarea unor produse vegetale, în care unele principii active se alterează la temperatura de peste 1000C, se face la temperaturi mai scăzute, în etuve de vid.

c)Uscarea în exicator

În cazul substanțelor termolabile indicate in monografii, uscarea se face în exicatoare, în prezența unor substanțe deshidratate ca: H2SO4, HP2O5 sau CaCl2 anhidru. Fiola de cântărire cu substanța de analizat se menține în exicator 24 ore și apoi se cântărește. Se menține în continuare și se cântărește din 6 în 6 ore până ajunge la greutate constantă.

d)Antrenarea cu vapori de dizolvanți organici

Principiul constă în extragerea apei prin antrenarea cu vapori de solvenți organici nemiscibili, cu puncte de fierbere mai ridicate și determinarea cantității de apă separată din amestecul de lichide nemiscibile condensate.

Se aplică în cazul substanțelor moi, cum sunt grăsimile și uleiurile. Determinarea se execută într-un aparat adecvat. Se cântărește exact o cantitate de produs vegetal și se introduce în balonul uscat. Se adaugă 100 ml xilen sau toluen și câteva fragmente de porțelan poros.

Încălzirea se face pe baia de ulei sau la o sursă electrică. Distilarea se conduce la început cu o viteză de aproximativ 100 picături/min, apoi se mărește viteza de distilare la aproximativ 200 picături/min. Distilarea se continuă până ce volumul de apă separat rămâne constant.

Picăturile de apă, care eventual ar adera pe pereții refrigerentului, se antrenează într-o eprubetă gradată prin spălare cu 5 ml dizolvant.

Antrenarea durează cel puțin 2 ore, se citește apoi volumul apei colectate în eprubetă și se raportează la sută.

e)Determinarea cenușei

Cenușa reprezintă substanțele anorganice dintr-un material vegetal. Raportul dintre compușii organici și anorganici poate constitui o valoare ce caracterizează un produs vegetal, deși convențională și reproductibilă numai în anumite condiții date.

Creuzetele folosite pentru determinarea cenușei trebuie să fie aduse la greutate constantă, prin în călzirea la aceiași temperatură la care se face determinarea reziduului sau a cenușei.

Într-un creuzet de mărime convenabilă, cântărit în prealabil, se introduce cantitatea de produs vegetal pulverizat, indicat în monografie și se cântărește exact. Dacă nu este indicată cantitatea se ia 1-2 g produs. Creuzetul se încălzește pe sită până la carbonizare, apoi se calcinează până la greutate constantă.

Dacă reziduul după răcire mai conține particule de cărbune se adaugă câteva picături de perhidrol, acid azotic concentrat sau soluție concentrată de azotat de amoniu. Se încălzește până la evaporarea lichidului, apoi se calcinează până când reziduul devine alb sau colorat uniform.

Cenușa obținută după calcinare se tratează cu 2-3 ml acid clorhidric diluat. Creuzetul se acoperă cu o sticlă de ceas și se încălzește 10 minute pe baia de apă. Se adaugă 5 ml apă fierbinte cu care se spală și sticla de ceas, lichidul se filtrează printr-un filtru cantitativ, se aduce precipitatul pe filtru și se spală cu apă fierbinte, până când filtratul nu mai dă reacția pentru cloruri. Filtrul cu precipitatul se usucă la 1050C, se aduce în creuzetul inițial și se calculează până la greutatea constantă.

Determinarea extractibilului

Extractibilul reprezintă cantitatea de constituenți chimici dintr-un produs vegetal, dizolvată într-un anumit solvent (alcool, apă, eter). În general se folosește extracția alcoolică. Este necesar a se specifica solventul utilizat precum și modul de lucru. [6]

Determinarea cantitativă a principiilor active

Este faza finală și totodată hotărâtoare în determinarea calității produselor vegetale. Stabilirea conținutului în principii active se face prin metode chimice, fizice și biologice.

Principiul acestor metode este prezentat în continuare.

1. Metode gravimetrice

Analiza gravimetrică se bazează pe transformarea speciei chimice studiate, într.un precipitat greu solubil în solventul folosit.

În acest scop trebuie parcurse câteva etape:

precipitarea componentului studiat cu un reactiv bine ales;

filtrarea cantitativă și spălarea precipitatului;

uscarea și calcinarea precipitatului până la masă constantă;

cântărirea precipitatului calcinat și calculul conținutului în componentul de analizat.

Pentru ca rezultatul analizei gravimetrice să fie exact, fiecare etapă necesită condiții specifice.

i.Precipitatul trebuie să aibă produsul de solubilitate cât mai mic (minim 10-8), iar reactivul folosit la precipitare (precipitatul) , se adaugă în exces (aprox. 1,5 ori cantitatea stoechiometric necesară) pentru a asigura o precipitare practic completă. Se recomandă ca precipitatul să fie volatil sau ușor solubil pentru a asigura îndepărtarea excesului în etapele următoare. Condițiile experimentale necesare precipitării cantitative (pH, temperatură, cantitatea de reactiv, agenți auxiliari), trebuie respectate riguros.

ii.Structura precipitatului trebuie să favorizeze filtrarea și spălarea cât mai rapidă. Precipitatele cristaline cu cristale mari, se filtrează și se spală ușor. Cele cu cristale fine, necesită precauții speciale și alegerea corespunzătoare a materialului filtrant. Precipitatele coloidale sunt dificil de manipulat și rețin ușor reactivi din soluție. Forma de precipitare poate fi controlată prin alegerea condițiilor experimentale care favorizează creșterea cristalelor.

iii.O condiție esențială a aplicării metodei gravimetrice, este ca precipitatul să aibă o compoziție bine definită și corespunzătoare formulei chimice. Dacă precipitatul obținut după uscare și calcinare este un amestec nedefinit, nu se poate aplica metoda gravimetrică în analiza cantitativă.

Este necesar ca precipitatul depus-compusul care a precipitat din soluția de analizat la adăugarea reactivului, să se transforme relativ ușor și complet în precipitatul cântărit-compusul rezultat după calcinare. Produsul final trebuie să aibă o bună stabilitate chimică.

iiii.Conținutul în componentul analizat al precipitatului cântărit trebuie să fie cât mai mic, pentru ca eventualele erori să fie minime.

Metode gravimetrice aplicate analizei produselor vegetale

1).Separarea taninurilor catechice de cele galice.

Taninurile, denumite și tananți vegetali, sunt compuși cu structură polifenolică. Ei formează combinații insolubile și neputrescibile cu proteinele din piele. Pe această proprietate se bazează folosirea lor la tăbăcirea pielii, căreia îi conferă flexibilitate și rezistență.

În funcție de structura chimică se împart în taninuri catechice-produși de condensare ai flavan-3-olului cu hidroxiacizi aromatici cu diferite grade de condensare și taninuri galice-esteri ai acidului galic, digalic și luteolic.

Taninurile catechice nu hidrolizează, în timp ce taninurile galice pot fi hidrolizate în mediu acid sau enzimatic. Pe această proprietate se bazează analiza gravimetrică a taninurilor catechice și separarea lor de cele galice. Astfel, taninurile catechice extrase prin fierberea produsului vegetal cu apă formează precipitate galben-brune cu un amestec de formaldehidă 40% și acid clorhidric concentrat și precipitate galbene cu apa de brom acidulată cu acid acetic. Precipitarea cu formaldehidă în mediu acid se bazează pe formarea produșilor de condensare între taninurile catechice și formaldehidă, produși insolubili în mediul de reacție care pot fi analizați gravimetric.

2).Determinarea alcaloizilor cu nucleu purinic.

Alcaloizii cu nucleu purinic (cafeina, teobromina, teofilina) au bazicitate slabă. Analiza cantitativă se bazează pe transformarea compușilor purinici în săruri de amoniu care precipită din mediu apos.

3).Determinarea saponozidelor triterpenice (saponine acide).

Saponozidele triterpenice sunt O-heterozide ale unor agliconi pentaciclici conținând 30 de atomi de carbon în moleculă. Una din metodele de determinare se bazează pe precipitarea lor cu ferocianura de zinc și analiza gravimetrică a precipitatului.

Analiza termogravimetrică

Prin cercetarea comportării precipitatelor la încălzire (tratament termic) s-a urmărit îmbunătățirea și mărirea preciziei analizei gravimetrice. Este necesar să se determine domeniul de temperatură în care un precipitat dat, rămâne cu masa constantă și compoziție precisă. În acest scop, s-au construit termobalanțe speciale, care înregistrează variația masei precipitatului în timpul încălzirii sau calcinării.

Analiza termogravimetrică (TGA) urmărește variația masei substanțelor solide la diferite temperaturi și intervale de timp, prin cântărirea lor după fiecare etapă. Într-un cuptor în care creșterea temperaturii se realizează cu viteză constantă. Termobalanțele moderne înregistrează variația masei probei în funcție de temperatură m=f(T) automat. Se obțin astfel indicații asupra transformărilor însoțite de pierderi de masă, mai rar creșteri (oxidare), pe care le-a suferit substanța cercetată pe fiecare interval de temperatură și de timp.

Analiza termică diferențială (DTA) urmărește diferența de temperatură dintre o probă și un material de referință inert când sunt încălzite uniform. Procesele exo și endotermice din probă, determină modificări caracteristice ale temperaturii probei care pot fi folosite în analiza calitativă și cantitativă.

Determinările se fac cu un cuptor electric cu posibilitatea programării ratei de creștere a temperaturii, în care se introduc proba și referința. Se măsoară diferența de temperatură între probă și referință (ΔT) și se reprezintă grafic în funcție de temperatura T.

Metoda se folosește pentru studiul unui mare număr de materiale într-un interval de temperatură de la –1750C la +10000C și chiar mai mult.

Concluzia este că tehnica termogravimetrică este cea mai modernă metodă de analiză cantitativă a compușilor și a amestecurilor multicomponente, cu aplicații în analiza produșilor naturali, a medicamentelor, a polimerilor.

2.Analiza volumetrică

Clasificarea metodelor de analiză volumetrică se face în funcție de natura titrantului în:

volumetria prin reacții de neutralizare;

volumetria prin reacții redox;

volumetria prin reacții de precipitare;

volumetria prin reacții de complexare.

Alegerea metodei de analiză se face în funcție de natura soluției de analizat și de proprietățile chimice ale speciei chimice de determinat.

Scopul metodelor de analiză volumetrică este determinarea concentrației, a echivalentului-gram sau al conținutului de substanță dintr-un amestec în funcție de volumul de titrant consumat până la echivalență, factorul de corecție al soluției de titrant și volumul sau masa de analit. Pentru determinarea concentrației normale a soluției de analizat se aplică legea echivalenței:

etitrant = eanalit

Cn,titrant* Ftitrant* Vs,titrant,echiv.= Cn analit* Vs, analit

Cn,analit= Cn titrant* VS titrant,echiv. * Ftitrant

Vs,analit

Se poate calcula echivalentul-gram al analitului când substanța este în stare pură și are o formulă moleculară bine definită:

etitrant= esubstanță

Cn titrant * VS titrant,echiv. * Ftitrant = msubstanta

Egsubstanta

Egsubstanță = Cn,titrant * Ftitrant * Vs,titrant, echiv. * msubstanță

Determinarea cantității de substanță conținută într-o probă se face tot din legea echivalenței:

etitrant= esubstanță

Cn titrant * VS titrant,echiv. * Ftitrant = msubstanta

Egsubstanta

msubstanță = Cn titrant * VS titrant * Ftitrant * Egsubstanță

%Substanță = msubstanță * 100

mprobă

%Substanță = Cn titrant * VS titrant * Ftitrant * Eg substanță

mprobă

Algoritmul de calcul pentru fiecare caz în parte este valabil pentru orice analit și orice titrant.

Volumetria prin reacții de neutralizare

Principiul metodei. Volumetria prin reacții de neutralizare cuprinde toate determinările bazate pe o reacție de neutralizare:

H+ + HO- ↔ H2O

Volumetria prin reacții redox

Principiul metodei. Metodele de analiză volumetrică bazate pe reacții cu transfer de electroni, au multew aplicații analitice. În funcție de caracterul redox al analitului și al titrantului, ele pot fi împărțite în:

-titrări cu agenți oxidanți;

-titrări cu agenți reducători.

Titranții reducători sunt mai puțin folosiți, datorită ușurinței lor de a se oxida. Determinările cu titranți reducători necesită instalații speciale: titrantul este trecut printr-o coloană cu umplutură reducătoare și apoi adăugat soluției de analizat.

Titranții oxidanți sunt mai ușor de păstrat în soluție și de aceea au mai multe aplicații practice. Printre cei mai utilizați se numără: soluțiile standard de dicromat de potasiu, de iod, de iodat.

Volumetria prin reacții de precipitare

Principiul metodei. Metodele de precipitare se bazează pe utilizarea în cursul titrării a reacțiilor din care rezultă compuși greu solubili.

Cele mai multe metode folosesc soluția standard de azotat de argint ca titrant, determinări denumite metode argentometrice.

Volumetria prin reacții de complexare

Principiul metodei. Titranții folosiți în reacțiile de complexare sunt liganzi polidentați chelatizați, derivați aminocarboxilici.

Cei mai utilizați titranți complexonometrici sunt EDTA acid (complexon II) și sarea sa disodică Na2H2Y•2H2O (complexon III).

Reacția generală cu un ion metalic Mn+ se poate scrie:

Mn+ + Y4- ↔ MYn – 4

Soluția standardizată de EDTA se folosește la analiza cantitativă a majorității ionilor metalici grei în prezența unui indicator adecvat și are multiple aplicații analitice, biochimice, clinice.

3.Metode optice de analiză

Radiația electromagnetică

Conform teoriei ondulatorii, radiația electromagnetică este un câmp electromagnetic cu doi vectori, unul electric și unul magnetic, perpendiculari între ei și pe direcția de propagare.

Conform teoriei corpusculare radiația electromagnetică este un flux de particule (fotoni) cu energie E.

Energia fotonului este direct proporțională cu frecvența și invers proporțională cu lungimea de undă. Cu cât crește lungimea de undă cu atât scade energia.

Spectrul electromagnetic este continuu și fiecare regiune se întrepătrunde cu rmătoarea.

Un fascicul de radiație care întâlnește un obiect poate fi absorbit, transmis, refractat, reflectat, descompus sau poate induce emisia fluorescentă sau fosforescentă.

Fiecare fenomen este folosit în analiză. În acest scop au fost realizate instrumente specifice și dezvoltate metode corespunzătoare fiecărui fenomen. Astfel, absorbția radiației din domeniu UV-VIS constituie principiul metodei spectrometrice prin măsurarea radiației transmise cu ajutorul spectrometrului de absorbție moleculară. Interceptarea radiației reflectate stă la baza metodei reflectometrice pentru a cărei aplicare au fost concepute aparate accesibile și utile mai ales la analiza pe teren- reflectometre.

Radiația refractată stă la baza metodei refractometrice. Aparatele folosite (refractometrele) măsoară indicele de refracție pentru soluții și gradul de dispersie pentru probe solide.

Emisia fluorescentă sau fosforescentă este consecutivă a absorbției. Spectrofluorimetrele măsoară intensitatea radiației emise care este direct proporțională cu concentrația speciei fluorescente sau fosforescente.

b) Spectrometria UV-VIS

Spectrometria UV-VIS este una din cele mai vechi tehnici analitice iar în ultimii ani a devenit una din cele mai importante metode de analiză datorită simplității, acurateței, rapidității și reproductibilității sale. Evoluția rapidă a tehnologiei a făcut aparatura performantă și din ce în ce mai accesibilă.

Metoda folosește radiația ultravioletă (UV) și vizibilă (VIZ) care reprezintă o fracțiune a spectrului electromagnetic. Definiția diferitelor regiuni spectrale a fost stabilită prin convenție de J.C.N.A.S. (The Joint Commitee of Nomenclature în Applied Spectroscopy).

Procesele considerate în spectrometria de absorbție moleculară sunt absorbția și transmisia. Condițiile în care este examinată proba se aleg astfel încât reflexia, refracția, descompunerea și emisia să fie minime.

În domeniul UV și VIS ale spectrului electromagnetic benzile de absorbție observate nu sunt specifice pentru a permite o bună identificare a unei probe necunoscute, în schimb spectrometria UV-VIS este extrem de utilă în analiza cantitativă (determinarea conținutlui în compusul cunoscut al probei).

În general, studiul se aplică probelor în soluție.

Aparatura folosită în spectrometria UV-VIS

Spectrometrul – UV-VIS cuprinde următoarele componente:

a) sursa de radiație-furnizează radiații cu lungimea de undă în domeniul 190-1000 nm.

b) monocromatorul-selectează cu precizie lungimea de undă de interes

c) compartimentul probei

d) sistemul amplificator-detector măsoară intensitatea radiației transmisă prin probă

Lățimea benzii spectrale-depinde de performanțele aparatului. Când instrumentul are posibilitatea selectării benzii spectrale, acesta se alege cu respectarea următoarelor condiții:

a) lățimea benzii spectrale să nu depășească jumătate din lungimea benzii de absorbție

b) lațimea benzii spectrale să surprindă valoarea maximă a absorbției.

Cuvele-folosite trebuie să fie complet transparente pentru radiația din domeniul studiat. Sunt disponibile cuve standard cu secțiune pătrată cu latura de 1cm sau cu secțiune rotundă cu diametrul de 1cm, cu capacitatea de 3-10 ml și cuve micro cu volume mult mai mici.

Aplicațiile spectrometriei UV-VIS în farmacognozie

1) Măsurarea absorbției

În studiile spectrofotometrice trebuie să se țină cont de următoarele recomandări:

Pentru prepararea soluțiilor etalon se folosesc substanțe de puritate analitică;

Se lucrează la temperaturi de 19-210C iar diferențele de temperatură între soluții nu trebuie să depășească 0,5 0C;

Soluțiile etalon și probele se studiază în aceleași condiții experimentale (același instrument, cuve identice, aceeași temperatură și lățime a benzii spectrale. Pentru a cuantifica radiația absorbită de solvent se folosește o cuvă cu solvent numită referință sau blank . Radiația transmisă prin această cuvă este valoarea practică pentru I0);

Blank-ul se prepară folosind solventul sau amestec de solvenți folosit și la prepararea probei, la care se adaugă toți reactivii mai putin specia chimică absorbantă;

Pentru probele preparate în solvenți volatili se folosesc cuve cu capac sau cu dop. În lipsa acestora, se poate adăuga un volum mic de apă distilată doar pentru solvenții mai grei decât apa.

Cuvele trebuie să fie perfect curate, manipuate cu grijă și atinse cu mâna doar pe laturile mate ale materiaului. Toleranța pentru dimensiunea cuvelor este de ±0,005 cm.

Trebuie evitate interacțiunile speciei chimice absorbante cu solventul sau cu soluțiile tampon folosite pentru reglarea pH-ului.

Pentru fiecare specie chimică se va determina domeniu de valabilitate al legii Lambert-Beer, adică domeniul de concentrație pentru care absorbția crește liniar cu concentrația. Pentru majoritatea compușilor acest domeniu este 10-3-10-5 M.

2) Analiza calitativă- are drept scop:

identificarea componentului pur

determinarea unei anumite specii chimice în amestec

identificarea unei anumite grupări funcționale (amino, carbonil, nitro, compuși aromati)

Identificarea unui compus pur se face comparând spectrul de absorbție al probei (maximele, minimele și punctele de inflexiune) cu cel al compusului pur, în aceleași condiții experimentale.

3) Analiza cantitativă are drept scop determinarea uneia sau mai multor specii chimice dintr-un amestec. Pentru alte concentrații se pot folosii mai multe metode de analiză cantitativă. Toate se bazează pe legea Lambert-Beer.

c) Refractometrie și interferometrie

Principiul metodei. Indicele de refracție este o constantă fizică ce caracterzează substanțele anorganice și organice. Se determină ușor prin măsurare directă cu aparatură relativ simplă și accesibilă folosind o cantitate foarte mică de substanță.

Aparatura

Aparatele folosite se numesc refractometre.

Refractometrul Abbe. Determinarea indicelui de refracție n se face pe baza măsurării unghiului limită între probă și prisma de sticlă cu indice de refracție cunoscut.

Refractometrul de imersie. Prisma de măsurare este secționată oblic și se introduce în soluția de analizat. Indicele de refracție se citește direct pe scala ocularului.

Interferometrele. Interferometrele se bazează pe fenomenul de interferență. Aceste instrumente măsoară diferențe mici între indicii de refracție.

Aplicații

Determinarea indicelui de refracție n , se folosește la :

-identificări

-determinarea gradului de puritate

-determinarea compoziției sistemelor binare și ternare

-stabilirea structurii combinațiilor organice și anorganice

Măsurând valoarea indicelui de refracție n , în timpul unei titrări se poate determina concentrația. Se realizează astfel titrări refractometrice și interferometrice.

d) Reflectometria

Principiul metodei. Reflectometria se bazează pe măsurarea intensității radiației reflectate de probă. Aparatul folosit, reflectometrul, măsoară diferența dintre intensitatea radiației incidente și a celei reflectate.

Determinarea permite analiza cantitativă a unor anumiți componenți și are mai multe avantaje:

-este foarte rapidă (durata unei determinări este de 15-60 secunde);

-se pot analiza probe cu conținut scăzut în ionul studiat (0,1-100m/l);

-instrumentele sunt accesibile și concepute pentru determinări de laborator și de teren;

-interferențele se pot elimina prin reglarea pH-ului și folosirea agenților de mascare.

Metoda se bazează pe transformarea ionului de analizat într-un compus colorat prin reacția cu un reactiv organic.

e)Determinări cromatografice

1) Cromatografia de gaze (CG) este o metodă fizico-chimică de separare cromatografică în care faza mobilă este un gaz (gaz purtător), iar faza staționară este un solid sau un lichid cu care este impregnat un suport solid inert sau un lichid repartizat uniform pe pereții unei coloane capilare.

Faza staționară se află într-o coloană cromatografică confecționată, de obicei, din sticlă sau din oțel inoxidabil. Faza mobilă se deplasează continuu prin coloană, iar la ieșire, gazul-purtător trece prin detector.

2) Cromatografia de lichide sub presiune (HPLC) este o metodă fizico-chimică de separare cromatografică în care faza mobilă este un lichid iar faza staționară, conținută într-o coloană, este constituită dintr-un solid impregnat cu un lichid sau un solid pe care sunt grefate grupări organice.

f) Metode biologice de analiză

În determinarea calității produselor vegetale, pentru aprecierea efectului terapeutic, se folosesc și diferite metode biologice, ca de exemplu la determinarea :

1) Cardiotoxicității heterozidelor cardiotonice pe cobai, comparativ cu activitatea cardiotoxică a unui standard;

2) Acțiuni hemolitice a saponozidelor triterpenice pe suspensie de hematii(indice hemolitic), pe pești din specia Carassius vulgaris (indice pește) sau pe râme Tubifex tubifex) indice viermi;

3) Conținutului de substanțe amare, prin indicele de amăreală (efectuat de un verificator specializat, comparativ cu o soluție etalon de chinină clorhidrică).

Rezultatele tuturor determinărilor biologice se prelucrează statistic prin diferite metode, de cele mai multe ori calculându-se coeficientul de activitate (r) și abaterea standard (p). Coeficientul de activitate reprezintă raportul dintre activitatea probei de analizat și activitatea standardului respectiv. Activitatea propriu-zisă a probei de analizat se obține înmulțind acest coeficient cu activitatea standardului. Activitatea respectivă trebuie să se încadreze în limitele de toleranță ale activității cerute de monografii.[7]

4.Fazele principale pentru obtinerea și introducerea

în terapeutică a unui medicament

de origine vegetală

Realizarea și introducerea unui nou medicament vegetal în terapeutică necesită efectuarea unor studii complexe bazate pe colaborări între diverși specialiști din domeniile: științelor farmaceutice, agronomice, biologice, chimice si medicale.

În alegerea materialului de cercetat date importante ne furnizează practica medicinii populare și cercetările de chemotaxonomie.

Se va acorda prioritate plantelor din flora spontană care se găsesc în cantități necesare stabilite prin lucrările de cartare.

După precizarea pozitiei sistematice a speciei selecțonate se urmărește testarea valorii ei terapeutice. În acest scop se realizeză extracte apoase sau hidroalcoolice care sunt testate farmacodinamic. Dacă în urma screeningului efectuat se constată prezența unei acțiuni farmacodinamice certe, se determină gradul de toxicitate și se trece la stabilirea compoziției chimice cu ajutorul metodelor de analiză prezentate.

Odată cunoscute importantele grupe de principii active de produsul vegetal se stabilește compusul farmacodinamic activ și se dozează. În continuare se extrage substanța activă pură sau se obține un extract purificat și se verifică acțiunea farmacodinamică, toxicitatea, efectele teratogene, cancerigene, apoi se stabilesc:

-constantele fizico-chimice

-pentru principii active structura chimică

-metodologia de control fizico-chimic și

-se testează biologic.

Cu substanța activă izolată sau cu fitocomplexul obținut din produsul vegetal se elaborează cea mai adecvată formă farmaceutică de administrare pentru care se stabilește metodologia de testare microbiologică și control fizico-chimic.[6]

Unul dintre testele folosite pentru a demonstra propritățile fiziologice ale plantelor asupra omului este aromatograma.

Aromatograma-denumește un test care constă în introducerea unei colonii de bacterii într-o cutie Pètri. Se adaugă o anumită doză din uleiul esențial ales și după una, trei sau 24 de ore se numără coloniile de bacterii care au reușit să se dezvolte ori cele care au fost distruse.

Metodă simplă care ar garante sănătatea tuturor, dacă n-ar interveni un alt factor:terenul.

Terenul-definește ansamblul eredității, forțelor și slabiciunilor fizice, mentale și spirituale, ale factorilor de mediu care constituie, pe scurt, amprenta digitală a sănătății unui individ. Ca și amprentele, terenul variază de la o persoană la alta.[8]

Asupra produsului farmaceutic realizat se fac cercetări de stabilitate și de biodisponibilitate.

Urmează transpunerea metodei de extracție și condiționare la scară pilot și apoi stabilirea tehnologiei de industrializare.

Produsul farmaceutic realizat la scară pilot, în urma cercetărilor farmacologice preclinice (farmacodinamice și toxicologice) este supus unei largi examinări clinice pentru cunoașterea proprietăților farmacologice la om și a indicațiilor terapeutice.

Pe baza rezultatelor verificărilor și experimentărilor făcute, se acordă avizul de fabricație. Produsul farmaceutic se realizează la scară industrială și se difuzează ca medicament prin rețeaua farmaceutică. Pentru asigurarea unui produs uniform și de calitate, în cantități programate de industria farmaceutică, se întreprind cercetări pentru introducerea în culturi a plantei respective.

Subliniem că cercetarea științifică a produselor vegetale destinate introducerii în terapeutică este mult mai complexă. Ea are implicații multiple începând cu aspectele de folosire rațională a resurselor naturale, continuându-se cu cele de agrobiologie și agrotehnică a speciilor cultivate, aspecte legate de studiile fitochimice, microbiologice și farmacologice ale principiilor active sau extractelor concentrate obținute.

Un rol deosebit revine cercetării științifice în găsirea celor mai potrivite forme farmaceutice care să asigure stabilitatea medicamentului și o bună biodisponibilitate. La fel de importante sunt și cercetările pentru elaborarea și îmbunătățirea controlului calitativ, chimic și farmacodinamic, al formelor farmaceutice condiționate.[6]

II. ULEIURI ESENTIALE (VOLATILE, ETERICE)

Generalități:

Uleiurile volatile sunt amestecuri complexe de hidrocarburi alifatice, aromatice și hidroaromatice, aldehide, alcooli, acizi, esteri și alti comstituienți în care, în general predomină compuși din clasa terpenoidelor. Uleiurile volatile (denumite anterior esențiale) sunt lichide cu un miros caracteristic, aromatic și plăcut, antrenabile cu vapori de apă.

Denumirea de ulei volatil este adecvată deoarece exprimă proprietatea caracteristică a acestor compuși: tensiunea de vapori ridicată și faptul că se volatilizează la temperatură atmosferică.

Celelate denumiri precum: uleiuri eterice, uleiuri esențiale sunt improprii și nesemnificateive deoarece ele nu sunt formate numai din combinații eterice și nici denumirea de esență nu este totdeauna corespunzătoare.

Proprietățile antibacteriene ale plantelor aromatice au făcut ca oamenii să caute diferite posibilități pentru a obține concetrate în principiu aromatic, ulei volatil. In acest sens oamenii au eleborat metode de extractie a uleiurilor volatile din plante prin obtinerea de macerate de plante aromatice cu uleiuri grase vegetale, uleiuri cu care locuitorii tinuturilor tropicale sau din zonele mediteraneene, îndeosebi cei din clasele sociale superioare, își ungeau corpul ca măsură preventivă împotriva infecțiilor și a degradării pielei.

Hippokrates (460 î.e.n.) și Theophrast (370 î.e.n.) pun bazele științifice ale utilizărilor terapeutice ale plantelor aromatice, pentru ca mai apoi grecii și arabii să dezvolte comerțul internațional cu produse aromatice și condimente.

În Evul Mediu s-au înființat în Europa primele culturi de plante aromatice care ulterior s-au răspândit în toată lumea, pe suprafețe tot mai întinse.

În perioada modernă, plantele cu conținut în ulei volatil cunosc o extindere a utilizărilor lor, pătrunzând numeroase domenii de activitate. În ce privește fitoterapia, printre ultimele realizări în acest domeniu sunt aromoterapia, fructoterapia și legumoterapia.

Răspândire: Uleiurile volatile sunt răspândite în regnul vegetal, unele familii de plante fiind bogate în astfel de substanțe, atât ca număr de specii cât și cantitativ. Dintre aceste familii de plante reprezentative sunt: Pinaceae, Labiatae, Umbelifere, Myrtaceae, Lauraceae, Rutaceae, Caryophylaceae, Compositae, Zingiberaceae.

Denumirea de plante aromate este atribuită acelor specii care conțin o cantitate mare de ulei volatil (cel puțin 0.1-0.2 %), care au un miros suficient de perceptibil sau care pretează unele expoatări rentabil economic. Alături de acestea mai sunt și acele specii de plante care nu au miros caracteristic dar care conțin substante terpenice care intră în compoziția uleiului volatil.

Cultura plantelor aromatice reprezintă una din preocupările de vârf în obținerea de soiuri și rase chimice, prin ameliorări și inginerie genetică, astfel ca sa se obțină producători de uleiuri volatile cu randament cât mai înalt și de o calitate stabilă, care să furnizeze produse cât mai fine.

Uleiurile volatile sunt produși finali ai metabolismului plantelor. Aceste substanțe sunt depuse în anumite țesuturi ale plantei, pentru a nu afecta cursul proceselor metabolice. Astfel, pot fi întâlnite în vacuole, pungi intercelulare, solzi, sub scoarță sau la suprafața scoarței copacilor.

ULEIURILE VOLATILE sunt substanțe lichide, volatile, cu miros parfumat, aromat, insolubile în apă, solubile în solvenți organici sau grăsimi. Au rol de condiment, rol antiseptic, antispasmodic, stomachic etc.

Uleiurile esențiale se extrag din flori, frunze, fructe, coajă și uneori din partea lemnoasă (lemnul de camfor), folosind solvenți organici sau prin distilare și antrenare cu vapori de apă. Numărul uleiurilor eterice vegetale este foarte mare (peste o mie). Din punct de vedere chimic, uleiurile volatile reprezintă amestecuri de substanțe constituite din hidrocarburi terpenice, hidrocarburi aromatice, alcooli, aldehide, cetone, acizi organici, pigmenți, eteri, esteri etc. Unul și același ulei eteric poate conține până la 50 de substanțe diferite. Dintre acești compuși, cei mai importanți sunt hidrocarburile terpenice sau terpenele și derivații lor (mircenul, geraniolul, limonenul,

mentolul, camforul, borneolul etc.).

Mircenul se găsește în hamei, geraniolul în florile de trandafiri, limonenul în chimion, mentolul în mentă,

camforul în lemnul de Laurus camfora și în pelin, borneolul în lavandă etc.

Biosinteza uleiurilor volatile

Unul dintre cei mai interesanți produși de autocondensare ai acetil-coenzimei A este un corp de 5 atomi, o unitate biogenetică [C5], și anume izoprenoil polifosfat. Biosinteza izoprenoil polifosfatlui poate fi întâlnită în toate organismele vii.(fig…)

S-a demonstrat că în toate celulele vii, capabile de acestă sinteză, izopentil-porifosfatul este izomerizat la dimetilpirofosfatul.

Izomerizarea are loc prin intermediul unei structuri de trecere, un carbocation instabil, dar care perimite, totodată, reversibilitatea reacției, care are loc sub influiența unei izopentil-pirofosfat-izomeraze. (Fig…).

Cei doi izomeri hemiterpenici au calitatea de a se condensa, după același sistem cap-coadă, pentru a furniza un dimer cu 10 atomi de carbon, în spață, dar care în realitate reprezintă prima grupă de substanțe terpenoide și anume monoterpenele. Prin eliminarea unui radical pirofosfat se formează geranil-pirofosfatul.

Biosinteza monoterpenelor aciclice

Monoterpenele aciclice reperezintă partea cea mai volatilă a grupului de substanțe dintre uleiurile volatile.

Pentru formarea moleculei geranionului, respectiv geranilpiroposfatului, o deosebită importanță o are poziția sterică a celor doi ractanți, funcție de acesta rezultând substanțe cu proprietăți diferite, deși au aceeași formulă brută.

Astfel, după orientarea spațială diferită a IPP față de DAP, pot rezulta fie geranilpirofosfat, fie nerilpirofosfat.

Condensarea celor două hemiterpene are loc în mai multe faze intermediare, neelucidate incă definitiv, și care sunt dirijate de enzime specifice care determină și trensporturile corespunzătoare de energie.

Astfel, se pare ca, în primul rând DAP pierde restul de pirofosfil cu formarea unui carbocation. Hidrogenul din poziția 2 a IPP este expulzat și captat de către radicalul pirofosfil. Dubla legătură din poziția 3-4 a IPP migrează în poziția 2-3, iar cei doi radicali CH2 rămași liberi, realizează legătura C-C centrală, iar molecula geranionului, ca urmare a atacului electrofil la centrul cationic. Se pare că ionizarea legăturii carbon-pirofosfat este energetic favorabilă, dacă ținem seama de stabilitatea anionului pirofosfat față de cationul alil. În mare, aceste reacții sunt redate în figura…

După un mecanism asemănător, ar putea fi explicată formarea linalolului, monoterpenă aciclică atât de frecventă în compoziția uleiurilor volatile și însoțite aproape fără excepție geranionul și nerolul.

Formarea citralului are loc prin procese de hidrogenare, iar citronelalul rezultă în urma proceselor de hidrogenare și oxidare.

Biosinteza monoterpenelor ciclice

Precursorul monoterpenelor ciclice este tot geranil- sau neril-pirofosfatul. Prin intermediul unui carbocation ciclic, ipotetic, se poate explica biosinteza limonenului (dipentenului).

Monoterpenele sunt compușii cei mai bine reprezentați cantitativ în compoziția uleiurilor volatile, aceștia sun produși rezultați din metabolismul secundar al plantelor. În figura…sunt redate schematic posibilele relații biogenetice dintre cele mai importante terpene aciclice și ciclice.

Din geranil-pirofosfat rezultă, prin condensarea cu o moleculă de izopentil-pirofosfat, farnesil-pirofosfat (C15). Terpenele de 15 atomi de carbon în moleculă, denumite sescviterpene (aciclice și ciclice) reprezintă uneori, constituienții principali ai uleiurilor volatile în figura… este redată schema formării acestor substanțe.

Structura chimică.

Majoritatea uleiurilor volatile aparțin clasei terpenoidelor. Pentru anumite particularități pe care le prezintă fiecare substanță inclusă în această grupă, toate se numesc terpenoide, dar termenul de terpenă se acordă. În general, numai compușilor cu 10 atomi de carbon.

O serie de terpenoide cum ar fi: carotenoidele, acizii rezinici, acizii triterpenici sau saponozidele, nu sunt incluse în grupul uleiurilor volatile datorită greutății moleculare mari, a stării de agregare solide și deci a lipsei de volatilitate. Numai monoterpenele și unele sescviterpene sunt constituienți ai uleiurilor volatile. În afară de aceasta, în categoria uleiurilor volatile sunt incluse și o serie de combinații aromatice, antrenabile cu vapori de apă, dotate cu un miros plăcut, cu origine biogenetică fie din acetilcoenzina A, dar și de origine fenil propanoică. Așa este cazul timolului, eugenolului, anetolului.

Un fenomen des întâlnit este faptul că, în timpul degradărilor metabolice din plantă, sau din altă natură, o serie de compuși nu mai corespund denumirii de ulei volatil căci, prin noile lor proprietăți sa apropie de rezine și balsamuri.

În compoziția diferitelor uleiuri volatile apar numeroase combinații care reprezintă grupe de izomeri derivați de la aceiași structură de bază.

Monotepenele aciclice. Monoterpenele aciclice sunt combinații alifatice cu zece aomi de carbon în moleculă, derivați ai 3,7-dimetil-octanului.

Față de modul de prezentare al formulei de mai sus, trebuie specificat că, în general, se obișnuiește a se prezenta structurile monoterpenice aciclice, în forma lor pseudociclică. Sub acest aspect deosebim patru structuri diferite după cum urmează:

De fapt, aceste structuri saturate, hidrocarburi alifatice cu catene ramificate, nu au fost în natură.

Hidrocarburile nesaturate care se gasesc în compoziția uleiurilor volatile cele mai frecvent întălnite sunt urmatoarele:

Dintre monoterpenele aciclice care au fost identificate in compoziția uleiului volatile din diferite plante cele mai numeroase sunt combinațiile oxigenate între care putem întâlni, după gradul de oxidare, alcooli, aldehide, cetone sau acizi. Cu toate acestea, în mod curent, în compoziția uleiului volatil vom constata prezența numai a câtorva dintre aceste combinații, cum ar fi:

Monoterpenele ciclice. Monoterpenele ciclice sunt mult mai numeroase decât monoterpenele aciclice, deoarece posibilitățile de ciclizare din structurile pseudociclice permit închiderea unui ciclohexan, cu sau fără participarea catenei de izopropil. Aceasta face ca în interiorul sau în afara hexaciclului să se formeze alte noi cicluri, incluse adiacente. Din această cauză se cunosc trei grupe de astfel de monoterpene ciclice: monociclice, biciclice și triciclice.

Structurile monociclice sunt derivate de la p-mentan, substanță inexistentă în natură. În schimb combinațiile mono-, di- și triciclice sunt mai numeroase:

Hidrocarburi monociclice oxigenate:

Combinații biciclice:

Sescviterpenele aciclice.

Toate combinatiile din această clasa își au originea biogenetică în structura farnesil-pirofosfatului care, într-o primă etapă, suferă o izomerizare trecând în nerilidil-pirofosfat. Ambii izomeri pot da, prin ciclizare, structuri sescviterpenice ciclice.

Sescviterpene ciclice:

În afara nucleelor sescviterpenice prezentate mai sus mai există și alte structuri de natură terpenoidică și având un număr de 15 atomi de carbon în moleculă, dar se întâlnesc mai puțin frecvent în compoziția plantelor aromatice.Astfel de structuri derivă din formurele următoare:

În afara structurilor standard, în diferite speciivegetale au fost identificate și alte substanțe sescvterpenice care se încadrează mai puțin în tiparele de mai sus, fiind derivați structurali ai acestora sau presentând structuri diferite.

Componentele aromatice care intra în compoziția uleiurilor volatile pe lângă mirosul lor plăcut au și proprietatea de ai fi antrenate cu vapori de apă. Din punct de vedere biogenetic ele au origine terpenoidică sau fenil-propanică:

Terpenoidele halogenate se întâlnesc frecvent în specii aparținând familiei Compositae sau în algele marine.

În afara proprietăților toxice care s-au constatat la unele extracte din alge, sau unele citotoxice, extractele din alge au mai reținut atenția pentru parfumerie și cosmetologie.

Din licheni este cunoscută cloratranorina, izolată din spaciile Parmelia furfuracea și Everinia prunastri.

1.Caracterizarea organoleptica a uleiului volatil

Uleiul volatil extras din plante se caracterizează organoleptic precum și fizico-chimic:

Din punct de vedere organoleptic se urmărește aspectul, claritatea, mirosul, gustul și culoarea.

Claritatea preparatelor lichide este o caracteristică relativă. Cele mai multe tincturi și extracte fluide separă în timp sedimente mai mult sau mai puțin abundente, indiferent de modul de conservare. În orice caz, în sticle incolore care nu sunt pline și la lumină sedimentele care se formează sunt mai abundente decât tincturile păstrate în sticle pline, bine închise și la întuneric.

Mirosul și gustul sunt indicate în vederea identificării produselor.

Farmacopeea prevede ca soluțiile extractive să prezinte mirosul și gustul specific produsului extras.Tot aceasta prevede ca, în cazul în care produsele au un miros puternic, determinarea să se facă pe o sticlă de ceas cu o cantitate mică de produs.

Când substanțele au un miros slab, cum este cazul la extractul fluid de camomila (1 :1500), tinctura de portocale (1 :750) sau tinctura de valeriană (1 :2000) se prevede o diluție limită înscrisă între paranteze, la care să se mai perceapă mirosul ; se îmbibă o hârtie de filtru de 10 :10 cm în 2 ml produs și se miroase de la o distanță de 2-4 cm.

Prin acest procedeu se poate percepe mai bine mirosul substanței extrase, deoarece alcoolul se evaporă și nu mai acoperă mirosul.

Gustul se verifică pe cantități mici sau în cazul preparatelor cu gust pronunțat amar sau iute arzător se face o soluție de 0,1 g în 10 ml apă ; cu această soluție se îmbibă o fâșie de hârtie de filtru de 5/50 mm și se atinge hârtia de filtru cu vârful limbii.

Culoarea a fost mai mult studiată pentru identificarea tincturilor deși variază în timp destul de mult sub acțiunea diferiților factori: calitatea produsului vegetal care a servit la preparare, gradul de mărunțire, raportul între frunze și ramuri la ierburi, procentul de rădăcini față de rizomi și modul de conservare al produsului vegetal. Lumina duce uneori la o intensificare, alteori la o scădere a intensității culorii soluțiilor extractive. Stabilirea organoleptică a culorii este destul de subiectivă, chiar în cazul când se face în condiții identice. Pentru mai multă exactitate s-a propus compararea cu etaloane de culori.[9]

Obtinerea uleiului esențial

Uleiurile esențiale reprezintă componentele uleioase volatile ale plantelor, copacilor și ierbii aromatice. Se găsesc în glande mici localizate în flori, frunze (eucalipt), rădăcini, lemn (santal) și rășini (tămâie). Uleiurile esențiale sunt extrase prin patru metode: distilarea cu vapori, expression, extracția cu sovenți și efleurage. În prima metodă uleiul este extras prin acțiunea vaporilor fierbinți și apoi condensare selectivă cu apa din care este separate.

În cea de-a doua metodă uleiul este extras prin centrifugare sau prin supunere la presiune. În cea de-a treia metoda uleiul este dizolvat într-un solvent volatil, care după evaporare va lăsa o substanță naturală de consistență asemănătoare cerii numită beton. După ce este separat de ceară, lichidul rezultat poate fi considerat forma cea mai concentrată de aromă disponibilă.

Efleurage este un proces mai lung ce presupune disoluția uleiului în grasime animală și separat din aceasta cu ajutorul alcoolului.

Uleiurile esențiale pe lângă utilizarea lor în fabricarea cosmeticelor și a parfumurilor, mai prezintă și proprietăți terapeutice.

Identificarea uleiurilor volatile

20 ml extract eteric se aduc într-un aparat adecvat și se distilă la sec. Dacă reziduul obținut are un miros plăcut, aromat, uleiul volatil se extrage cu cantități mici de alcool, prin eluții repetate. În cazul în care prin concentrarea soluțiilor alcoolice se obține un reziduu cu miros aromat, produsul vegetal analizat poate conține ulei volatil.

Confirmarea prezenței uleiului volatil

10-50 g produs vegetal uscat și mărunțit se antrenează cu vapori de apă sau se distilă cu apă într-un aparat tip Neo-Clevenger (prevăzut de farmacopee). Uleiul volatil astfel obținut poate fi caracterizat organoleptic (aspect, culoare, miros) și fizico-chimic (densitate, indice de refracție, putere rotatorie, indice de acetil).

În cazul studiului produselor vegetale cu uleiuri volatile este indicată extracția acestora și din materialul vegetal proaspăt recoltat pentru a aprecia calitatea uleiului obținut și randamentul față de cel din produsul uscat.

Pentru determinările calitative și cantitative ale constituenților acestor uleiuri se utilizează frecvent cromatografia pe strat subțire, dar mai ales cromatografia în fază gazoasă.

2.Caracterizarea fizico-chimica a uleiului eteric

Caracterizarea fizico-chimică indică: densitatea, indicele de refracție, puterea de rotație optică, indicele de acetil, indice carbonil, indice de ester.

Uleiurile eterice sunt lichide incolore sau galbene până la brune, cu densități variate, greutate specifică între 0,8-1.07, temperatura de fierbere între 150-3000C și indice de refracție între 1,45-1,60. sunt compuși insolubili în apă dar solubili în solvenți organici în deosebi în alcool atilic și în grăsimi.[10]

Determinarea indicelui carbonil- metode potențiometrice care utilizează clorura de hidroxilamoniu.

Indice carbonil al unui ulei esențial: numărul de miligrame de hidroxid de potasiu, necesare pentru a neutraliza acidul clorhidric eliberat în reacția de oximare cu clorura de hidroxilamoniu, raportat la un gram de ulei esențial.

Metoda I: Metodă de oximare la rece a aldehidelor cu clorură de hidroxilamoniu

Principiu

Transformare a compușilor carbonil în oxime prin reacția cu clorura de hidroxilamoniu. Determinarea potențiometrică a acidului clorhidric eliberat în această reacție cu soluția standard de hidroxid de potasiu.

Conținutul de compuși carbonil, exprimat în procente de masă, pentru aldehide de referință specificate, este dat de formula:

Mr x V x c

10m

în care:

Mr masa moleculară relativă a aldehidei, indicată în standardul specific al uleiului esențial

analizat;

V volumul soluției de hidroxid de potasiu folosit la titrare, în mililitri;

c concentrația exactă a soluției de hidroxid de potasiu, în moli pe litru;

m masa porțiunii de analizat, în grame.

Indicele carbonil, exprimat in miligrame de hidroxid de potasiu pe gram de ulei esențial, este dat de formula:

56,1 V x c

m

Metoda II: Metoda de oximare la cald a cetonelor cu clorură de hidroxilamoniu

Principiu

Transformare a compușilor carbonil în oxime prin reacția cu clorură de hidroxilamoniu. Determinare prin titrare cu soluție de hidroxid de potasiu a acidului clorhidric eliberat în reacție.

Se trasează curba de pH ca o funcție a volumului de hidroxid de potasiu V utilizat la titrare

pH = f (V)

[11]

Determinarea indicelui de ester înainte și după acetilare și evaluarea conținutului de alcooli liberi și alcooli totali

Acetilarea uleiului esențial cu anhidridă acetică în prezență de acetat de sodiu. Izolare și uscare a uleiului acetilat și determinarea indicelui de ester al acestuia.

Indicele de ester după acetilare este dat de formula:

E2 = 28.05 (V0-V1) (a)

m

Conținutul de alcooli liberi, exprimat în procente de masă, față de un alcool dat este dat de formula:

Mr (E2 – E1) (b)

561-0.42E2

Această formulă ia în considerare creșterea de masă a probei de analizat de-a lungul acetilării.

Conținutul de alcooli combinați, exprimat în procente de masă, față de un alcool dat, este dat de formula:

Mr x E1 (c)

561

Conținutul de alcooli totali, exprimat în procente de masă, față de un alcool dat, este obținut prin adunarea celor două procente obținute la b și c.

În formulele de mai înainte:

m masa eșantionului de analizat din uleiul acetilat, în grame;

V0 volumul de soluție de acid corhidric folosit pentru proba oarbă, în mililitri;

V1 volumul de soluție de acid corhidric folosit pentru determinarea indicelui de ester după acetilare, în mililitri;

Mr masa moleculară relativă a alcoolului folosit la exprimarea convențională a rezultatelor și care este menționată în standardul internațional al uleiului esențial de analizat;

E1 indicele de ester al uleiului înaintea acetilării calculat conform ISO 709

E2 indicele de ester al uleiului după acetilării calculat conform ISO 709 [12]

Evaluarea miscibilității cu etanol

Principiu

Adăugarea gradată la o probă de încercat, de ulei eteric, la temperatura de 200C, de etanol cu titru alcoolmetric convenabil. Evaluarea miscibilității și evantual, a opalescenței.

Miscibilitatea uleiului eteric cu etanol de titru t la temperatura de 200C, este exprimată în următorul mod.

Cazul I: 1 volum de ulei eteric în V volume de etanol de titru t.

Cazul II: 1 volum de ulei eteric in V volume de etanol de titru t, cu tulburare plecând de la V` volume de etanol de același titru.

Cazul III: 1 volum de ulei eteric in V volume de etanol de titru t, cu tulburare între V` și V„ volume de etanol de același titru, în care:

V volumul etanolului de titru t necesar pentru obținerea soluției limpede, în mililitri;

V` volumul etanolului de titru t necesar pentru obținerea tulburării, dacă are loc, care urmează după starea limpede a soluției, în mililitri;

V„ volumul etanolului cu același titru t la care dispare tulburarea dacă are loc, în mililitri.

Dacă se obține numai opalescență se indică dacă aceasta este “superioră”, “egală” sau “inferioară” celei a soluției etalon.[13]

Determinarea rotației optice

Rotația optică a unui ulei esențial, αtD unghi exprimat în miliradiani și/sau grade de unghi, pentru care rotirea planului de polarizare a unei radiații luminoase de lungime de undă 589,3 nm ±0,3 nm, corespunde radiației D a sodiului, atunci când parcurge un drum optic de 100 mm de ulei esențial, în condiții de temperatură determinate.

Rotația optică, exprimată în miliradiani și/sau grade de unghi, este dată de ecuația:

αtD= A . 100 (a)

I

În care:

A valoarea unghiului de rotație în miliradiani și/sau grade de unghi;

I lungimea tubului utilizat, în milimetri.

Se notează cu plus (+) rotațiile optice dextrogire și cu minus (-) cele levogire.

Rotația optică a unui ulei în soluție, așa-numita “rotație specifică”

Rotația specifică, exprimată în miliradiani și/sau grade de unghi, este dată de ecuația:

[α]= αtD (b)

c

αtD rotația optică a uleiului în soluție, calculată conform (a)

c concentrația soluției de ulei, în grame pe mililitru de soluție.[14]

Analiza prin cromatografie de lichide de înaltă performanță

metodă generală

Principiu

Cromatografia de lichide este o metodă de separare bazată pe fenomene de adsorbție, partiție, schimb ionic și/sau excluziune. Ea permite analiza unor cantități mici de ulei aromatic esențial sau altă materie primă pentru parfumerie, pe o coloană cromatografică umplută cu o fază staționară adecvată și în condiții corespunzătoare, identificarea posibilă a diverșilor constituenți și determinarea cantitativă a componenților specifici prin măsurarea ariei sau înălțimii picurilor respective.

Metode de determinare

1. Metoda standardului intern

Cromatograma uleiului esențial și cea a standardului intern se înregistrează în aceleași condiții de operare.

Exprimarea rezultatelor:

Concentrația compusului ce se determină, cx , exprimată în procente de masă, se calculează cu formula

AxmE x K x 100 (a)

AEmx

În care

Ax aria picului corespunzător compusului determinat, exprimată în unitățile de măsură ale integratorului;

AE aria picului corespunzător standardului intern, exprimată în unitățile de măsură ale integratorului;

mx masa uleiului esențial, exprimată în miligrame;

mE masa standardului intern, exprimată în miligrame;

K factorul de răspuns al compusului determinat, în raport cu standardul intern.

2. Metoda adaosurilor

Dacă pentru o anumită determinare nu se poate folosi metoda standardului intern, se aplică metoda adaosurilor. În acest scop, se injectează o cantitate adecvată din uleiul esențial în care X este compusul ce trebuie determinat, iar Y este un compus al cărui pic, pe cromatograma “D” obținută, se învecinează cu picul compusului X.

Apoi se prepară, prin cântărire cu o exactitate de 0,1 mg, un amestec de m g probă de analizat și mx g substanță de referință corespunzătoare compusului X ce trebuie determinat.

Se injectează o cantitate adecvată din amestecul respectiv. Se obține astfel cromatograma “E”.

Exprimarea rezultatelor:

Concentrația compusului ce se determină, cx, exprimată în procente de masă, se calculează cu formula

mR x r x 100 (r`>r) (b)

m r` -r

în care:

mR masa substanței de referință, în grame;

m masa uleiului esențial, în grame;

r =Ax

Ay

În care:

Ax aria picului corespunzător compusului X pe cromatograma “D”;

Ay aria picului corespunzător compusului Y, apropiat de X, pe cromatograma “D”;

r`=A`x

A`y

În care:

A`x aria picului corespunzător compusului X pe cromatograma “E”;

A`y aria picului corespunzător compusului Y, apropiat de X, pe cromatograma “E”;

3.Metoda standardului extern

Dacă nu este posibil a utiliza metodele descrise la punctele 1 și 2, se aplică metoda standardului extern.

Această metodă este utilizată numai dacă aparatura folosită posedă un sistem de injectare care permite injectarea unor volume identice (de exemplu valvă cu buclă calibrată).

Se prepară o serie de soluții cu concentrații crescătoare ale substanței de referință. Se injectează succesiv aceeași cantitate din fiecare dintre soluțiile respective. Se reprezintă grafic suprafețele picurilor în funție de concentrația substanțelor de referință în diverse soluții. Se obține astfel graficul care redă variația suprafeței picului substanței de referință în funcție de concentrația acesteia în soluții.

Se injectează aceeași cantitate din uleiul esențial, în care “Z” reprezintă compusul ce urmează a fi determinat. Se măsoară suprafața picului corespunzător compusului “Z”. utilizând suprafața picului “Z” și graficul trasat în prealabil, se determină concentrația corespunzătoare a compusului “Z”.[15]

Analiza prin cromatografie în fază gazoasă pe coloană umplută

Metodă generală

Principiu

Analiza prin cromatografie în fază gazoasă pe coloană umplută a unei cantități mici de ulei eteric pe o coloană cu umplutură specifică. Localizarea diferiților componenți prin măsurarea indicilor de retenție. Determinarea cantitativă a componenților specifici prin măsurarea ariei picurilor lor.[20]

III. TEUCRIUM POLIUM

1.Descriere

Denumirea populară: Închegătoare, Dâmbat, Mușețel de băut sau Sugărelul alb.[17]

Alte denumiri: Germ. Kropf-Gamander; Magh. Rozmarin gamandor; Rus. Dubrovnik belâi.

Plantă subfrutescentă, perenă, manefită, medicinală, întalnită prin locuri aride din regiunea de câmpie, coline, stepă – subzona stejarului, pajiști, coaste pietroase; Xerofită, calcicolă, subtermofită- Jud. Mehedinți, Dolj, Ialomița, Prahova, Buzău, Constanța, Tulcea, Galați, Vaslui, Neamț, Iași, Suceava, Europa de Sud, Africa de Nord, Asia de Sud-Vest.[18]

Genetic: 2n=26,52,78.

Istoric

Planta este cunoscută din antichitate. Numele plantei Teucrium este dedicat lui Teucer, regele Troiei, căruia i se atribuie descoperirea proprietăților medicinale ale acestei plante și ale altora înrudite care aparțin acestui gen. A fost folosită împotriva diareei la om și la animale. Planta cu flori se punea deasupra apei de baut. Numele de închegătoare a fost dat datorită proprietăților sala stiptice.

Ecologie

Specie subtermofitla, xerofită, slab acid-neutrofilă spre neutro-bazifilă. Are cerințe mijlocii spre mari față de căldură, răspândită între izotermele 7,5 și 10,50C. Vegetează pe soluri reavane până la reavăn-jilave, cu pH-ul 6,0-7,8.

Descrierea speciei

Rădăcina pivotantă, puternică. Tulpini subfructescente lungi de 10-40 cm, erecte sau ascendente, foarte ramificate de la bază, rotunde, alb tumentoase. Frunze sesile, alungite sau lineare, rar mai mult sau mai puțin obovate în partea superioară, cu margini revolute. Pe fața superioară des-pubescente, până la tomentoase. Pe fața inferioară, alb-tomentoase cu peri stelați.

Flori alb-gălbui sau alb-purpurii, grupate în capitule densiforme, globuloase sau alungite, solitare sau dispuse la vârful tulpinii, paniculat sau corimbiform; caliciu tubulos campanulat, alb tomentos, cu 5 dinți aproape de 3 ori mai scurți decât tubul, cel superior putin mai mare; corola puțin mai lungă decât caliciul, pe partea externă mai mult sau mai puțin mai puțin pubescentă, cu lobii ovali și obtuzi, cel median mai mare; androcen din stamine putin exserte. Înflorire:VII-VIII. Fructe: nucule brune, cu ornamentație reticulată. Plantă plăcut mirositoare.

Recoltare

Părțile aeriene înflorite (Teucrium herba) se recolteaza pe timp însorit, în jurul orei 14. Se usucă la umbră, în strat subțire.

Compoziție chimică

Conține ulei eteric, alcaloizi, picropolină și alte substanțe amare, flavone. [19]

În frunzele de Teucrium species se găsesc cantități până la 1% de harpagozidă și harpagid [20].

harpagozida R=cinamil

harpagid R=H

procumbid R=OH

Fitoterapie

Medicina populară îi acordă proprietați antidiareice si stimulante. Intervine favorabil împotriva afecțiunilor inflamatorii ale intestinului și pielii. Acționeaza ca hepatoprotector și stimulator al secreției de bilă.

Medicină umană-uz intern

Pentru tratarea de diaree, enterită, afecțiuni hepatice, infuzie din o linguriță plantă uscată și mărunțită peste care se toarnă o cană (200 ml) cu apă clocotită. Se lasă acoperită 20 min. Se strecoară. Se bea conținutul a 2-3 căni pe zi.

Uz extern. Pentru tratarea inflamațiilor de piele; infuzie din 2 lingurițe plantă uscată și mărunțită la o cană (250 ml) cu apa clocotită. Se lasă acoperită 20 min. Se strecoară. Se spală local, folosindu-se un pansament steril.

Medicină veterinară. Uz intern.

Pentru tratarea de enterită: decoct din părțile aeriene ale plantei uscate. Se fierbe 10 min. Se strecoară. Se răcește. Se administrează prin beuvaj bucal (se toarnă pe gât).

Spații dendrofloricole.

Planta se poate cultiva în parcurile și grădinile publice pentru borduri în locurile însorite aride. Decorativă prin port, frunze și mai ales florile sale mici, galbene sau purpurii dispuse în capitule rotunde sau ovale.

Înmulțire prin semințe în seră sau răsadniță.[19]

2.Proprietăți chimice ale speciei Teucrium

Compoziția chimică și diferite extracte în dietil eter, acetat de etil și n-butanol au fost analizate cu ajutorul tehnicilor HPLC și spectrofotometrie. Activitatea antioxidantă a fost evaluată folosind trei tehnici complementare în vitro: inhibarea radicalului 1,1-difenil-2-picrilhidrazil, inhibarea radicalului hidroxil și protecția sistemului model acid linoleic-β-caroten. În primele două sisteme de analize au prezentat o activitate antioxidantă puternică extractele din speciile Teucrium montanum și Teucrium Chamaedrys. În sistemul model acid linoleic-β-caroten a avut o activitate remarcabilă extractul din specia Teucrium polium.

Compușii responsabili de proprietățile antioxidante sunt flavonoidele: luteolina, diosmetina și/sau apigenină.[21]

LUTEOLINĂ

diosmetina

APIGENINĂ

Apigenina este flavonoidul responsabil de activitățile antibacteriale, antiinflamatorii, diuretice și hipotensive.

Luteolina inhibă reductanța aldozei și prezintă proprietăți antibacteriale și antiinflamatoare.

Prin administreare de Luteolină este posibil să se prevină acumularea de sorbitol și a apariției cataractei diabetice. [22]

Uleiurile esențiale din Teucrium polium conțin numeroși produși activi; prin analiză GLC-MS, TLS și prin metode spectrometrice s-au putut evidenția 10 compuși terpenoizi incluzând : hidrocarburi β-pirene, limonene, α-fenantrene, γ-și δ-cadine și alcooli: linalol, 4-terpinol, cedrol, cedrenol și guaiol.

Uleiul este bogat in alcool și lipsit de esteri. Teste farmaceutice au scos la iveală o puternică activitate antispasmodică.[23]

Speciile din Fam. Lamiaceae, din care face parte și Teucrium polium, conțin doi compuși chimici în uleiurile lor volatile, cu proprietăți antimicrobiale carvacol (isopropil-o-crezol) și timol (isopropil-crezol). Aceștia luptă împotriva bacteriilor, fungilor și a protozoarelor patogene. Se crede ca distrugerea organismelor se face începând cu distrugerea peretelui celular [24]

Flavonoidele prezente în Teucrium polium prezintă proprietăți hipogligemice. Una dintre aceste flavonoide este Quercitina ce ajută la eliberarea insulinei secretată de celulele beta din pancreas și implicit la scăderea glicemiei. S-au înregistrat și manifestări negative asupra ficatului; necrozarea celulelor acestuia a fost pusă pe seama diferenței de elemente chimice prezente în solul de pe care a fost recoltată planta.[25]

=== l ===

CAPITOLUL I

INTRODUCERE

Încă din cele mai vechi timpuri omul a utilizat plantele atât în terapie cât și în obținerea de produse cosmetice sau de uz alimentar. Accidental, oamenii primitivi au constata că unele ierburi, rădăcini, frunze, fructe sau sucurile lor au proprietăți tămăduitoare în multe maladii.

Utilizarea plantelor în medicină a fost de asemenea singurul punct comun al medicinii tradiționale de pe întreaga planetă: în China ca și în Europa, în Oceania ca și în Africa, magicienii, vracii și doctorii au conștientizat și utilizat avantajele proprietăților terapeutice ale vegetalelor. Prima mentionare scrisa despre ierburi datează de acum aproximativ 3.000 de ani, în China. De atunci ierburile și rețetele pe baza de ierburi au aparut în scrierile din Grecia antica, Roma antica și Egiptul antic.

Reprezentanții medicinii traditionale nu s-au rezumat doar la administreze plantelor sub forma în care se găsesc în natură pentru tratarea bolilor ci s-au descoperit forme mult mai practice și mai eficace, atenția fiind concentrată asupra metodelor de extragerea principiilor active sau alcaloizilor conținute de plante.[….]

Conceptul de principiu activ a fost prima data definit de medicul elvețian Paracelsus (1493-1541), care arată că numai o mică parte din plantă este activă și o numește Quinta Essentia sau Arcanum care se găsește în cantitate de 1g în 20 kg principii secundare.[….]

În prezent medicina naturistă și homeopată, care utilizează preparate pe bază de extracte vegetale, câștigă teren în fața medicinei naturiste alopate, care folosește produși sintetizați pe cale chimică.

Noțiunea de “Aromaterapie” a fost folosită pentru prima dată în Franța anului 1928 de către Henri Maurice Gattefosse, pentru a descrie știința pe care începuse să o studieze.

În antichitate, egiptenii știau cum să folosească numeroasele medicamente extrase din plante, știau să anestezieze prin macerarea plantelor în vin. Mai târziu numeroși doctori au denumit în lucrările lor plantele pe care le foloseau abundent: Hippocrate a menționat mai mult de 250 de plante utilizate în terapeutică, Dioscoride a descris în “of material medice” aproximativ 800. Și romanii, Pline și Caton au descris în lucrările lor numeroase plante și utilizările medicale ale acestora.

Esențele sau uleiurile se extrag din rădăcina, scoarța, frunzele sau florile plantelor aromatice, prin diferite metode de preparare. Când sunt extrase prima dată, aceste esențe se găsesc în starea cea mai concentrată și volatilă. Unele uleiuri sunt chiar toxice în concentratie ridicată și trebuie folosite întotdeauna într-o formulă mult diluată. Cantitatea de ulei volatil care poate fi extrasă dintr-o plantă variaza între 0,01% și peste 10%. Ele se găsesc sub forma unor picaturi mici, care își schimbă compoziția chimică constant în interiorul plantei în funcție de perioada zilei sau a anotimpului și de aceea se evaporă repede.

Scopul principiilor active, care au fost prescrise, este evident același cu cel al medicamentelor chimice, dar primele sunt complete și aduc doar beneficii prin complexitatea lor elaborată de natură, celelalte, adică medicamentele sintetice, sunt simple, beneficiile lor fiind aduse de virulenta lor, ce poate deveni uneori exagerată.

Pentru ca un produs natural să acționeze cu forță dar în același timp cu delicatețe, trebuie să conțină plante întregi, adică să conțină toate elementele necesare misiunii lui. Mulți factori se completează unul pe altul, unii acționează în forță alții moderat.

Este ușor de înteles de ce o plantă formată din numeroși constituenți, prezintă numeroase reacții: stimulator, tonic, diuretic, expectorant, tonic cardiac, vermifug, relaxarea sistemului nervos

Forma uzuală a remediilor medicale naturiste:

1) Infuziile

Reprezintă o cale simplă de extragere a principiilor active din plante prin acțiunea apei fierbinți asupra acestora. Prepararea infuziilor este asemănatoare cu prepararea unui ceai. Această metodă se utilizează prin extracția componenților volatili din părțile aeriene ale plantei verzi sau uscate: frunze și flori.

Infuzia poate fi facută dintr-o singură plantă sau din mai multe plante și se consumă caldă sau rece. Aceasta reprezintă cea mai ușor de realizat, comună și ieftină extracție a compușilor medicinali din plante.

2) Decoctul

Rădăcinile, scoarța (coaja) și fructele fiind mai puțin permeabile decât părțile aeriene ale plantelor medicinale, nu vor elibera principiile lor active printr-o simplă infuzie.

Materialul vegetal trebuie tăiat sau rupt în bucăți mici. Pentru a nu se pierde uleiurile volatile se acoperă vasul de fierbere. După ce vasul este răcit și părțile solide sunt separate de lichid, decoctul poate fi folosit rece sau cald.

3) Tincturile

Cele mai multe dintre componentele volatile ale plantei medicinale sunt solubile în alcool. Prin imersia părților uscate sau proaspete ale plantei în alcool, principiile active sunt ușor extrase în concentrații ce le depășesc pe cele obținute prin infuzie sau decoct.

Soluțiile foarte concentrate reprezintă un mod de păstrare și utilizare a compușilor plantei medicinale, de la 1 la 2 ani.

Tincturile ideale se obțin folosind alcool etilic pur distilat din cereale. Deoarece acest produs nu este disponibil publicului, se poate folosi Vodka cu 45-35% alcool. Extracția este foarte rapidă. 50% mixtură de plante și alcool ținută într-un vas de sticlă etanș va păstra tinctura gata pentru a fi folosită în dozajul prescris. Niciodată nu se va folosi alcool metilic, spirt metilat, alcool izopropilic sau alte tipuri de spirturi necunoscute pentru a face tincturi.

4) Siropurile

Cu câteva rare excepții, ca de exemplu menta reprezentânt un agent de aromatizare în pasta de dinți și în guma de mestecat, infuzile sau decocturile din plante nu sunt plăcute la gust în special pentru copii. Pentru a se masca gustul lor, infuziile și decocturile pot fi amestecate cu miere de albine sau cu zahăr nerafinat din trestie. Aceste siropuri combină acțiunea solvenților cu proprietățile medicale ale infuziilor și decocturilor rezultând beneficii în special pentru tratarea tusei și durerea în gât.

5) Uleiurile infuzabile

Uleiurile vegetale pure extrase din floarea-soarelui, migdale și uleiul de măsline se pot găsi ușor la magazine. Acestea au proprietatea de a dizolva grăsimile solubile principiile active ale plantelor medicinale. Acest proces se numește infuzie și se poate desfășura la temperatura camerei sau chiar la temperaturi mai mari.

Infuzia este un proces mai lent decât extracția în alcool dar are avantajul că soluția uleioasă rezultată, conținând componenții medicinali, poate fi utilizată pentru prepararea cremelor și a alifiilor. Infuzia fierbinte este recomandată pentru părțile tari ale plantei în timp ce infuzia rece este mult mai utilă frunzelor și florilor.

6) Uleiuri esențiale

Uleiurile esențiale reprezintă componentele uleioase volatile ale plantelor, copacilor și ierbii aromatice. Se găsesc în glande mici localizate în flori, frunze (eucalipt), rădăcini, lemn (santal) și rășini (tămâie). Uleiurile esențiale sunt extrase prin patru metode: distilarea cu vapori, expression, extracția cu sovenți și efleurage. În prima metodă uleiul este extras prin acțiunea vaporilor fierbinți și apoi condensare selectivă cu apa din care este separate. În cea de-a doua metodă uleiul este extras prin centrifugare sau prin supunere la presiune. În cea de-a treia metoda uleiul este dizolvat într-un solvent volatil, care după evaporare va lăsa o substanță naturală de consistență asemănătoare cerii numită beton. După ce este separat de ceară, lichidul rezultat poate fi considerat forma cea mai concentrată de aromă disponibilă. Efleurage este un proces mai lung ce presupune disoluția uleiului în grasime animală și separat din aceasta cu ajutorul alcoolului.

Uleiurile esențiale pe lângă utilizarea lor în fabricarea cosmeticelor și a parfumurilor, mai prezintă și proprietăți terapeutice.

7) Alifiile

Alifiile sunt preparate ca și uleiurile infuzabile fierbinți, cu deosebirea că plantele sunt fierte în ceară sau grăsimi care nu conțin apă. După separarea plantelor fierte prin strecurare și răcire, va rezulta un amestec solid compus din ceară sau grăsimi și constituenții medicinali ai plantei.

Parafina moală și ceara de albine sunt utilizate în mod frecvent. Alifiile formează o bariera uleiuoasă pe suprafața rănită, favorizând astfel pătrunderea principiilor active în zona afectată.

8) Cremele

Cremele sunt mixturi alcătuite din uleiuri sau grăsimi și apă. Deoarece apa și uleiul nu sunt miscibile, este necesară introducerea unui agent de emulsie pentru a preveni separarea. Cremele sunt prin urmare emulsii stabile de grăsimi sau uleiuri. Proprietățile curative ale cremelor sunt date de introducerea, în procesul de preparare, a tincturilor, infuziilor, uleiurilor infuzabile, uleiurilor esentiale sau decocturilor. Cremele sunt permeabile, permițând pielii să respire și să transpire. Apa conținută precum și unii agenți hidrofobi, ca de exemplu glicerina, ajută la o mai bună hidratare a pielii.[1]

2.Principiile active vegetale (natura chimică și clasificarea lor)

Plantele își datorează acțiunea terapeutică uneia sau mai multor substanțe chimice elaborate de celulele lor denumite principii active vegetale.

Principiile active fac parte din așa numitul metabolism secundar (Fig.1) fiind substanțe cu greutate moleculară mică, de regulă între 200-700 D (daltoni).

Fig.1 Metabolism primar/secundar

Metabolismul secundar este specific fiecărei specii și reprezintă rezultatul evoluției sale multimilenare.

Prezența unora dintre substanțele sintetizate de respectiva specie reprezintă o caracteristică (o amprentă) chimică a acesteia. Din punct de vedere cantitativ raportul acestor “componente amprentă” variază uneori pentru aceeași specie în funcție de proveniență, de momentul de recoltare, condiții de depozitare și conservare.

Tocmai din acest motiv se pune problema obligativității standardizării fitopreparatelor pentru a asigura constanța și reproductibilitatea actiunii și activității lor.

Principiile active nu reprezintă de fapt mai mult de 0,5-5 % (rareori ating valori de 16-22 %) din greutatea materialului vegetal uscat, restul fiind, din punct de vedere farmaceutic și farmacologic, substanțe de balast sau de rezervă.[3]

Studiile efectuate fără întrerupere din 1817, când a fost obținut în stare pură primul principiu activ vegetal, adica morfina din opiu, și pana în prezent, s-au finalizat cu izolarea a o multitudine de asemenea substanțe din diversele specii de plante medicinale folosite în terapeutică, unele dintre ele având o repartizare mai limitată altele mult mai largă.

În funcție de structura lor și de grupările grefate pe molecula lor, principiile active se pot încadra în clasele de substanțe ale chimiei organice.

Principii active de natură fenolică

Fenolii, din punct de vedere chimic, sunt definiti ca derivați hidroxilați ai hidrocarburilor aromatice. Aceasta grupa de principii active are o largă răspândire în țesuturile vegetale sub formă mono-,di-, tri- și polifenolică, atât în stare liberă cât și combinată; dintre monofenoli amintim timolul și izomerul său carvacrolul din uleiul volatil de cimbru și cimbrișor cât și anetolul din uleiul de fenicul. Dintre difenoli prezintă importanță hidrochinolul care se gasește întotdeauna combinat, sub formă glucozidică, combinție cunoscută sub denumirea de arbutozida din fructele diverselor specii de Vaccinum și de Arbutus staphylos.

Tot în această grupă de principii active se pot încadra și acizii fenolici cum sunt acizii salicilici, protocatehic și galic, ultimii fiind constituenți principali ai taninurilor, precum și acizii cafeic și cinarina, cât și alcooli fenoli, ca saligenolul (alcolul salicilic).

Deși flavonoidele, antocianozidele și taninurile se pot încadra tot în aceasta clasă de principii active de natură polifenolică, totuși, ținând seama de anumite particularități ale structurii lor, vor fi prezentate în grupe independente.

Principiile active de natură fenolică prezinta activități farmacologice multiple și importanță; unele sunt antiseptice, carminative, antidiaeice iar altele colagoge și coleretice.

Principii active de natură glucidică

Din această mare grupă de substanțe medicamentoase prezintă importanță următoarele subgrupe:

-ozele, având ca reprezentant principal glucoza;

-holozidele sau poliholozidele, produși cu greutate moleculară mare, rezultați din condensarea mai multor molecule de hexoze. Acestui subgrup de principii activii îi aparțin:

Pectinele-constituenți normali ai membranei celulare vegetale, și care sunt importante din punct de vedere terapeutic prin acțiunea lor coagulantă și hemostatică;

Mucilagiile și gumele-produși rezultați din transformarea membranei celulare vegetale, folosite în medicină atât pentru proprietățile lor emoliente cât și pentru eficacitatea lor în tratamentul constipației.

-heterozidele sau glicozidele rezultate din combinarea unei fracțiuni glucidice cu o fracțiune neglucidică, numită aglicon sau genină (în cazul glucozidelor cardiotonice și saponozidele). Heterozidele obținute în stare pură, cât și plantele care le conțin, ocupă un loc important în terapeutică, deoarece sunt înzestrate cu multiple și variate proprietăți farmacologice, datorate structurii chimice a agliconilor lor, însă, din punct de vedere terapeutic, interesează în special:

Glicozidele cardiotonice- a caror genină este de natură steroidică, purtând o lactonă nesaturată;

Glicozidele antracenice sau antracenozidele care datorită agliconului lor, în majoritatea cazurilor de natură oxilmetil-antrachinonică, au acțiune, în funcție de doză, laxativă și purgativă;

Saponozidele (saponidele) sunt heterozide care au genina fie de natură steroidică, fie de natură triterpenică prin agitare cu apa dau o spumă abundentă persistentă, ca și săpunul și hemolizează globulele roșii; saponozidele a căror genină este de natură triterpenică au proprietăți expectorante și depurativă;

Tioglicozidele al căror aglicon conține în molecula lui sulf și constituie esențele de muștar interesează terapeutica prin proprietățile lor revulsive;

Glicozidele cianogenetice dau, prin hidroliza acid cianhidric;

Flavonoidele și antocianozidele sunt pigmenți răspunzători de culoarea galbenă, galben-portocalie a petalelor (flavonoidele) și de coloarea lor roșie, albastră și violet (antocianozidele). Flavonoidele se bucură de proprietați diuretice și de vitamina P (rutozida) utilizate în afecțiunile capilarelor și ale venelor, iar antocianozidele pe langă proprietățile lor de vitamina P, ameliorează adaptarea vederii la întuneric;

Taninurile sau substanțele tanante sunt substanțe de natură polifenolică în majoritatea cazurilor combinate cu fracțiuni glucidice, sunt foarte răspândite, înzestrate cu acțiuni astringente, antidiareică și antiseptică.

Alcaloizii

Sunt substanțe organice azotate cu reactivitate mai mult sau mai puțin pronunțat alcalină; sunt raspândite în plantele toxice se bucura de importante proprietăți terapeutice dar unele dintre ale sunt toxice. Acțiunea fiziologică și farmacodinamică a alcaloizilor se datoreaza, pe de o parte, nucleului lor de bază, iar pe de altă parte funcțiunilor și radicalilor grefați pe nucleu.

Principii amare

Sunt substante cu gust amar, unele insuficient precizate din punct de vedere chimic, altele având structură glucozidică. Datorită gustului lor amar, aceste principii stimulează terminațiile nervoase gustative, care, pe cale reflexă, declanșează sau intensifică secrețiile digestive și măresc pofta de mâncare.

Vitaminele

Prima definiție dată în 1911 de către Funk – „amine care participă la secretul vieții”

Astăzi sunt acceptate două definiții:

– Definiția dată de Karrer- “vitaminele sunt substanțe a căror absență din organism provoacă maladii și manifestări de carență”

– Definiția lui Javillier – “vitaminele sunt substanțe pe care organismul animal, în general, nu este capabil să le biosintetizeze și a căror prezență, în cantități foarte mici, este necesară creșterii, echilibrului fiziologic și aptitudinii de reproducere”.

Numeroase plante medicinale își datorează utilizarea lor în terapeutica existenței în compoziția chimică a acestor vitamine și în special provitaminei A (β-caroten), complexul B și vitaminele C, E, K, P și PP.

Uleiuri volatile (eterice) sau esențiale

Acestea din punct de vedere chimic, nu sunt principii active definite, ci amestecuri de produși chimici volatili mirositori, lor datorându-li-se, în marea majoritate a cazurilor, mirosul plăcut al plantelor.

Se bucură în primul rând de proprietăți antiseptice, având o acțiune microbicidă, care variază de la un ulei la altul și care se datorează în special substanțelor de natură fenolică care intră în compoziția lor.

În majoritatea cazurilor, uleiurile volatile, după un timp mai îndelungat, în contact cu aerul suferă o serie de procese de oxidare, transformându-se în produși semilichizi și chiar solizi, amorfi. Asemenea precese chimice au loc însă și în anumite țesuturi ale unor specii de plante, iar produsele rezultate denumite prin termenul general de rezine sau rășine sunt înzestrate, uneori, cu activități terapeutice. [4]

Activitatea terapeutică a unui produs vegetal nu se datorează numai principiului sau principiilor active ce le conține, ci și altor substanțe care există în acest produs denumite adjuvante; aceste adjuvante pot amplifica activitatea sau pot să o prelungească și chiar să o modifice cum este cazul taninurilor din frunzele de ceai care moderează și prelungesc acțiunea brutală a cafeinei.

Este important de reținut ca polifenolii (în special taninurile și flavonozidele) alături de holozide (pectine, gume și mucilagii) sunt principiile active cele mai frecvente în compoziția chimică a plantelor. Lor, în cea mai mare măsură, li se datorează acțiunea terapeutică multiplă a unor specii de plante folosite în medicina tradițională.[5]

3.Metodologia de cercetare farmacognostică și fitochimică

a produselor vegetale

Cu ajutorul metodelor de analize calitative și canitative se urmărește stabilirea purității produselor vegetale și determinarea calității acestora în funcție de conținutul în principii active.

În final, pe baza rezultatelor acestui complex de analize se poate stabili dacă produsele cercetate îndeplinesc conditiile necesare pentru a fi folosite la prepararea de produse farmaceutice.

Metodele folosite pentru studiul produselor vegetale se clasifică în:

Metode calitative

Examenul macroscopic necesare identificării

Examenul microscopic produselor vegetale

Examenul microchimic necesare identificării grupelor de

Examenul chimic-calitativ a compușilor principii active din produsele

extrași cu diferiți solvenți analizate

Metode cantitative

Determinarea impurităților necesare stabilirii

Determinarea corpurilor străine purității și calității

Determinarea umidității produselor vegetale

Determinarea cenușei

Determinarea extractului necesare stabilirii purității și

Determinarea principiilor active calității produselor vegetale

Metodele de analize menționate se aplic în mod diferențiat în funcție de produsele vegetale care pot fi: cunoscute, cum sunt cele folosite în terapeutică sau necunoscute, adică produse noi provenite de la plante încă necunoscute.

În cazul analizei unui produs vegetal cunoscut se efectuează numai determinările necesare pentru verificarea identității, stabilirea purității și determinarea cantitativă a principiilor active.

Identificarea și caracterizarea produselor vegetale

Aceste obiective se realizează prin aplicarea metodelor calitative de analiză (examene: macroscopice, microscopice și chimice).

Examenul macroscopic

Prin acest examen, care reprezintă primul stadiu de investigare al produselor noi sau cunoscute, se urmărește stabilirea caracterelor morfologice observate cu ochiul liber sau la lupă și cele organoleptice percepute prin miros și gust. În acest mod sunt analizate întreaga varietate de produse vegetale a căror caracteristici sunt determinate de natura organelor din care sunt constituite, poziția taxonomică a plantelor de la care provin și de forma lor de prezentare: produse întregi (in toto), fragmentate (concissum) sau pulverizate (pulveratum).

Examenul macroscopic se efectueaza în ordinea precizării următoarelor elemente:

Aspectul Prin care se stabilește:

forma produsului (întreg sau fragmentat),

aspectul exterior și interior,

particularitățile feței superioare și inferioare,

consistența și particularitățile la pipăit,

iar la unele produse tipul secțiunii transversale și

raportul dintre țesuturi (la lupă)

Dimensiunile Se apreciază în :

cm pentru majoritatea produselor (folosind rigla),

mm pentru fructele și semințele mici (folosind hârtia milimetrică),

nm pentru cellule, incluziuni celulare (granule de amidon, cristale

folosind micrometrul ocular sau obiectiv)

Culoarea La exterior și la interior, pe ambele fețe

Mirosul Pe produsul ca atare, zdrobit între degete (frunze, flori), sau

pulverizat

Gustul Pe produsul ca atare sau pe decoct.

Examenele macroscopice ale produselor vegetale întregi sunt de cele mai multe ori suficiente pentru determinarea identității acestora. Caracterele organoleptice oferă unele informații orientative asupra compoziției chimice a produselor analizate. Pentru produsele vegetale fragmentate sau pulverizate examenul macroscopic dă unele indicații care adeseori nu sunt suficiente identificării, în care caz investigarea se continuă prin examenul microscopic.

Culoarea galbenă, roșie, albastă, portocalie a florilor și fructelor presupune prezența pigmenților flavonoidici sau compușilor carotenoidici, culoarea portocalie la scoarțe și organe subterane indică prezența derivaților antrachinonici, culoarea brună la frunze, organe subterane, scoarțe și unele cotiledonate este explicată de conținutul în taninuri catehice a acestor produse.

Gustul amar al produselor se poate datora prezenței substanțelor amare, heterozidelor cardiotonice sau unor alcaloizi, gustul astringent taninurilor, gustul aromat uleiurilor volatile, rezinelor, iar cel dulce glucidelor.

Examenul microscopic

Acest examen ce reprezintă o fază mai avansată a analizei calitative a produselor vegetale, urmărește stabilirea țesuturilor și elementelor anatomice caracteristice ale secțiunilor și preparatelor clasificate din pulberi sau produse fragmentate.

Caracterele anatomice ale diferitelor organe de plantă servesc în unele cazuri și la precizarea poziției taxonomice a speciilor producătoare.

Un produs vegetal poate fi supus examenului microscopic în urma unei anumite prelucrări în vederea obținerii unor preparate ce pot fi analizate la microscop.

Preparatele microscopice se realizează prin metode diferite în funcție de natura, starea produsului (întreg, fragmentat sau pulverizat), după consistența și chiar compozitia sa chimică.

Obținea preparatelor microscopice sub formă de secțiuni. Secționarea unui produs vegetal întreg sau fragmentat se face de obicei în plan transversal și dacă este nevoie în plan longitudinal (radial sau tangențial).

Pentru secționarea produselor vegetale uscate și fragmentate convenabil, acestea se aduc la consistența necesară prin înmuierea în apă fierbinte (frunzele și florile) sau prin fierbere timp mai îndelungat (rădăcinile, scoarțele, tulpinile). În cazul produselor cu mucilagii se foloseste macerarea (24 ore) într-un amestec se alcool și glicerină.

Secțiunile se obțin cu ajutorul unui brici sau a unui microtom (produsul fiind inclus în parafină).

Secțiunile transversale ale rădăcinilor și tulpinilor cu un diametru până la 1 cm pot să cuprindă întreaga suprafață, în cazul când sunt mai groase ele trebuie să fie alcătuite din fragmente care să conțină țesături și din zona centrală a produselor.

Dacă fragmentele ce trebuie secționate sunt subțiri cum sunt frunzele și unele scoarțe, sau sunt mici (fructe sau semințe), se include între două fragmente de maduvă de soc secționată longitudinal.

Pentru obținerea unei secțiuni transversale într-o frunză , se separă un fragment care să cuprindă nervura mediană și o parte a mezofilului din apropierea pețiolului. Secționarea se realizează printr-o mișcare uniformă a lamei briciului de la bază spre vârf, fără opriri, pentru obținerea de secțiuni subțiri și de aceiași grosime.

a) Examenul microscopic al produselor vegetale pulverizate

Produsele vegetale se pulverizează prin zdrobire sau măcinare, urmată de omogenizare prin cernerea pulverii (sită cu 30 ochiuri pe cm2).

Preparatul microscopic se obține utilizându-se un reactiv sau o soluție de clarificare a cărui alegere se face fie pentru clarificarea pulverii vegetale fie pentru obținerea unor reacții caracteristice compușilor chimici ai pereților celulari sau a conținutului celulelor.

Examenul microscopic al unei pulveri vegetale are ca scop stabilirea organului din care este constituit produsul vegetal, prin identificarea elementelor anatomice dominante specifice organului și stabilirea celor caracteristice.

b) Examenul microscopic al produselor vegetale “concissum” clarificate.

Această metodă se utilizează în examenul microscopic al fragmentelor produselor vegetale provenite din organe vegetale subțiri (frunze, flori, herba).

Identificarea compușilor chimici în țesuturile produselor vegetale se poate realiza prin reacții specifice de culoare sau precipitare. În acest scop se utilizează mai ales examenul histochimic și microsublimarea.

Examenul chimic

Prin acest examen se pot identifica compușii chimici dintr-un produs vegetal, direct în celulele țesuturilor cu ajutorul unor reacții specifice. Ținând seama de caracterul selectiv al acestor reacții, examenul histochimic care se efectuează pe secțiuni (transversale sau longitudinale), mai rar pe pulveri vegetale, permite localizarea unor principii active în produsele studiate.

În vederea efectuării acestui examen, produsele vegetale sunt astfel pregătite încât să se asigure menținerea compușilor chimici în tesuturi.

În general se aplică procedeul următor: fragmentele de produs vegetal se fierb într-o capsulă cu soluție saturată de clorură de sodium sau sulfat de sodiu până la consistența necesară secționării. Secțiunile obținute se aduc pe o lamă de microscop sau într-un cristalizor, se acoperă cu reactivul necesar. După câteva minute secțiunile se spală cu un solvent adecvat și se examinează la microscop pentru observarea țesuturilor și celulelor în care substanțe active au fost localizate cu ajutorul reactivului utilizat.

Se reprezintă schema secțiunii și desenul detaliat al celulelor în care a avut loc reacția de localizare.

În cazul pulverilor acestea pot fi tratate pe o lamă de microscop cu câteva picături de reactiv. Urmează spălarea ca în cazul secțiunilor.

Reactivii utilizați in examenul histochimic sunt foarte variați. Ei pot fi reactivi pentru identificarea unei singure substanțe sau reactivi pentru identificarea unui numar mare de substanțe, de exemplu reactivul Steinmetz (R).

În tabelul 1 sunt prezentate unele substanțe chimice care pot fi identificate pe această cale cu ajutorul unor reactivi de culoare.

Microsublimarea este o metodă de separare a unor compuși naturali din produsele vegetale. Această metodă se poate aplica numai în cazul substanțelor care au proprietatea să treacă sub formă de vapori, prin încălzire și apoi să cristalizeze (sublimeze) pe o suprafață rece.

Tehnica de lucru folosită este următoarea: pe o lamă de microscop situată pe o sită de azbest, așezată pe un trepied, se aduce cca. 0,10g produs vegetal pulverizat. La unul din capetele lamei se pune o baghetă de sticlă lungă de 5-6 cm și diametrul de 5mm pe care se sprijină o altă lamă de microscop. Pe lama superioară (înclinată) se aduce un tampon de vată îmbibat cu apă, care are rol de refrigerent. Se încălzește sistemul cu ajutorul unui bec de gaz la flacără mică, situată la cca. 10 cm de sita de azbest. În aceste condiții anumite substanțe din produsul vegetal pot sublima pe lama superioară, în dreptul tamponului de vată, unde apare un sublimat, de obicei, sub forma unor cristale.

În analiza sublimatului se va preciza aspectul, culoarea, sistemul de cristalizare, apoi solubilitatea, eventual fluorescența in UV, punctul de topire, după care se trece la reacții de identificare.

Tabel 1 Reactivii de culoare utilizați pentru identificarea unor grupe de compuși din produse vegetale

Prin microsublimare pot fi identificate principiile active înscrise în tabelul 2

Tabelul 2 Reactivii de culoare folosiți pentru identificarea unor principii active din produse vegetale.

Analiza chimică calitativă a produselor vegetale

Examenul chimic calitativ al compușilor extrași cu solvenți

Stabilirea compoziției chimice a unei specii vegetale nestudiate se poate realiza cu ajutorul analizei chimice calitative originale, folosind extracția cu solvenți.

Separarea principalelor grupe de compuși naturali (principii active) se face prin extracția succesivă și selectivă a produsului vegetal cu solvenți de polarități diferite. În primul rând produsul vegetal este extras cu un solvent nepolar: eter etilic, eter de petrol, benzen, hexan, cloroform, apoi cu un solvent polar ca etanol, metanol și în cele din urmă cu apă. Se obțin următoarele 3 extracte:

Extractul eteric.

Extractul alcoolic.

Extractul apos.

În extractul eteric se găsesc compuși chimici lipofili, iar în celelalte 2 extracte, compuși chimici hidrofili.

Pentru identificarea compușilor chimici din cele 3 extracte, acestea sunt analizate separat, folosind metode corespunzătoare proprietăților fizico-chimice ale fiecărui grup de principii active.

Modul de lucru:

A.Extractul eteric

10-20 g produs vegetal pulverizat se extrag cu eter etilic într-un aparat cu extracție continuă (tip Soxhlet) sau prin agitare mecanică ori manuală, în repetate rânduri, la temperatura mediului ambiant, într-un vas adecvat, până ce soluția eterică nu mai lasă reziduu prin evaporare.

Extractele eterice reunite și filtrate se concentrează la 50 ml într-un aparat de distilare.

Acest extract conține compușii chimici liposolubili:

-uleiuri volatile

-substanțe grase

-steroli, triterpene

-carotenoide

-acizi grași, acizi rezinici

-alcaloizi baze

-agliconi flavonici

-agliconi ai antracenozidelor (emodine, emodoli)

-cumarine

-clorofilă

Identificarea acestor compuși chimici se face după următorul mers de analiză:

Identificarea uleiurilor volatile și a substanțelor grase

Identificarea uleiurilor volatile

20 ml extract eteric se aduc într-un aparat adecvat și se distilă la sec. Dacă reziduul obținut are un miros plăcut, aromat, uleiul volatil se extrage cu cantități mici de alcool, prin eluții repetate. În cazul în care prin concentrarea soluțiilor alcoolice se obține un reziduu cu miros aromat, produsul vegetal analizat poate conține ulei volatil.

Confirmarea prezenței uleiului volatil

10-50 g produs vegetal uscat și mărunțit se antrenează cu vapori de apă sau se distilă cu apă într-un aparat tip Neo-Clevenger (prevăzut de farmacopee). Uleiul volatil astfel obținut poate fi caracterizat organoleptic (aspect, culoare, miros) și fizico-chimic (densitate, indice de refracție, putere rotatorie, indice de acetil).

În cazul studiului produselor vegetale cu uleiuri volatile este indicată extracția acestora și din materialul vegetal proaspăt recoltat pentru a aprecia calitatea uleiului obținut și randamentul față de cel din produsul uscat.

Pentru determinările calitative și cantitative ale constituenților acestor uleiuri se utilizează frecvent cromatografia pe strat subțire, dar mai ales cromatografia în fază gazoasă.

În extractul alcoolic, pe lângă ulei volatil, se mai pot găsi alcaloizi baze și diverși agliconi liberi.

Pentru identificarea acestor compuși se folosesc metodele prevăzute în mersul analitic al extractului eteric prezentat în continuare.

Substanțele grase se găsesc în reziduul extractului eteric după extracția uleiului volatil cu etanol.

Identificarea compușilor din substanțele grase se face astfel: reziduul se tratează cu 10 ml soluție alcoolică 0,5 N de hidroxid de potasiu și se fierbe la reflux pe baia de apă până ce la suprafață nu se mai observă picături de ulei (1-2 ore). Se distilă alcoolul, iar reziduul se dizolvă în 15-20 ml apă distilată fierbinte, care se aduce într-o pâlnie de separare. Balonul se spală de mai multe ori cu cantități mici de apă distilată fierbinte care se aduc în aceiași pâlnie de separare. După răcirea balonului se spală de 2 ori cu eter. Soluțiile eterice se aduc în pâlnia de separare peste soluția apoasă răcită și se agită pentru extragerea compușilor insaponifiabili. Extracția se repetă de 2 ori câte 8 ml eter. Extractele eterice reunite se usucă cu sulfat de sodiu anhidru.

În extractul eteric uscat (b1) se pot identifica: steroli, triterpene și carotenoide.

În pâlnia de separare rămâne soluția apoasă alcalină (b2), care conține sărurile de potasiu ale acizilor grași superiori, flavonelor și antrachinonelor (ultimele două componente pot colora soluția alcalină în galben-flavone sau în roșu-derivați antrachinonici).

Identificarea sterolilor și triterpenelor

3-10 ml extract eteric (b1) se evaporă într-o capsulă de porțelan pe baie de apă (la nișă). Reziduul se dizolvă în 0,5 ml cloroform, apoi se adaugă 0,5 ml anhidridă acetică. Soluția rezultată se trece într-o eprubetă uscată, după care cu ajutorul unei pipete se aduce la fundul eprubetei, 1-2 ml acid sulfuric concentrat.

În zona de contact a celor două lichide apare un inel roșu-brun sau violet, iar stratul superior se colorează, după 5-10 min., în verde-albastru sau violet, dacă sunt prezenți sterolii sau triterpenele (reacția Liebermann-Burchard).

În cazul în care soluția rezultată prin dizolvarea reziduului (în cloroform și anhidridă acetică) este de culoare verde (clorofilă), se împarte în două eprubete. Una din eprubete se folosește pentru efectuarea reacției, iar cealaltă ca martor de culoare.

Identificarea carotenoidelor

3-10 ml extract eteric (b1) se evaporă într-o capsulă de porțelan pe baie de apă (la nișă). Reziduul se tratează cu 2-3 picături de reaciv Carr-Price. Pigmenții carotenoidici dau cu acest reactiv o culoare albastră care trece în roșu. Cu acid sulfuric concentrat carotenoidele se colorează în albastru intens sau verde-albastru.

Identificarea acizilor grași

Soluția apoasă alcalină (b2) din pâlnia de separare se tratează cu acid clorhidric concentrat până la pH=3-4. Soluția apoasă acidă devine opalescentă datorită acizilor grași care se extrag prin agitare repetată cu eter etilic sau de petrol (3x25ml). Extractele eterice reunite se deshidratează cu sulfat de sodiu anhidru. Dacă prin concentrarea extractului eteric (într-un aparat de distilare) se obține un reziduu onctuos, sunt prezenți acizii grași.

Pentru identificarea acestor acizi se poate folosi cromatografia pe hârtie sau cromatografia pe strat subțire.

Identificarea acizilor rezinici

Dacă prin acidularea soluției apoase alcaline care a fost epuizată de substanțele insaponifiable apare un precipitat, o mică porțiune din acest precipitat se dizolvă în eter de petrol (10 ml) și se încearcă prezența acizilor rezinici. Soluția eterică se agită într-o eprubetă cu 5 ml soluție 1% de acetat de cupru. Dacă sunt prezenți acizi rezinici, stratul eteric se colorează în albastru-verde până la albastru datorită rezinaților de cupru (reacția Hirschsohn). Reacția se poate executa și direct, utilizând 5-10 ml extract eteric inițial (A), care se evaporă și reziduul se extrage de două ori cu câte 5 ml eter de petrol. După filtrarea soluției se efectuează reacția Hirschsohn ca mai sus.

Extractul eteric inițial rămas (30 ml) se folosește pentru identificarea: bazelor alcaloidice, agliconilor liberi, sterolilor, triterpenelor și pigmenților carotenoidici.

Identificarea alcaloizilor baze

10 ml extract se evaporă într-o capsulă de porțelan pe baia de apă. Reziduul se dizolvă în 1,5 ml acid clorhidric 2% prin amestecare cu o mică baghetă de sticlă la cald (pe baia de apă). Soluția decantată sau filtrată se împarte în trei eprubete, în volume egale. La una din probe se adaugă 2-3 picături de reactiv Mayer. La a doua probă se adaugă 2-3 picături de reactiv Bertrand. Ultima eprubetă servește ca probă martor.

Dacă probele tratate cu reactivi dau precipitate evidente (de culoare alb-gălbuie), alcaloizii sunt prezenți.

Identificarea agliconilor flavonici

3-5 ml extract eteric se evaporă într-o capsulă pe baia de apaă. Reziduul se dizolvă în 1-2 ml metanol 500 la cald (pe baia de apă). Soluția de culoare galbenă se aduce într-o eprubetă, se adaugă puțină pulvere sau 2-3 bucăți de span de magneziu si 10 picături de acid clorhidric concentrat.

Apariția unei colorații roșii-prtocalii indică prezența agliconilor flavonici (reacția Shibata sau reacția cianidolului).

Identificarea emodolilor (agliconii antracenozidelor)

3 ml extract eteric se aduc într-o eprubetă, se adaugă 1 ml hidroxid de sodiu 10% și se agită. Dacă soluția alcalină se colorează în roșu-vișiniu sunt prezenți derivații antrachinonici (emodolii) liberi sub formă oxidată (reacția Bontrager).

Identificarea cumarinelor

3 ml extract eteric se evaporă într-o capsulă de porțelan pe baia de apă. Reziduul se dizolvă în 2 ml apă distilată fierbinte. După răcire, soluția se împarte în 2 eprubete. Una din eprubete servește ca probă martor. În cealaltă se adaugă 0,5 ml amoniac 10%. Ambele eprubete se examinează la lumina ultravioletă filtrată.

Apariția unei fluorescențe (albastră-verzuie sau violetă) mai intensă în proba alcalinizată confirmă prezența cumarinelor.

Verificarea se face prin reacția Feigl.

Identificarea sterolilor, triterpenelor și carotenoidelor din produsul vegetal se face pein reacțiile descrise anterior.

Înlăturarea pigmenților clorofilieni din extractul eteric se poate realiza prin trecerea acestuia printr-o coloană cu adsorbant (silicagel, oxid de aluminiu).

B. Extractul alcoolic

Produsul vegetal rămas de la extracția cu eter, se aduce într-un vas conic de capacitate potrivită sau într-un balon prevăzut cu refrigerent ascendent. Se adaugă 100-150 ml metanol sau etanol, se pune în gâtul balonului o pâlnie (sau un refrigerent ascendent cu balon) și se extrage la pe baia de apă timp de 20-40 min. Dacă este necesar, extracția se repetă. Extractul alcoolic se filtrează prin hârtie într-un vas potrivit. Produsul vegetal se spală cu cantități mici de alcool cald și se filtrează prin același filtru.

Extractul alcoolic obținut se concentrează într-un aparat de distilare la 50 ml. Etanolul și metanolul extrag din produsele vegetale degresate importante grupuri de compuși naturali (principii active):

-polifenoli

-compuși reducători

-alcaloizi săruri

-aminoacizi

-glicozidele polifenolice (antracenozide, cumarine, flavonoide)

-glicozide sterolice (cardiotonice, saponozide)

-glicozide triterpenice

Rezultate foarte bune se obțin și prin extracția cu alcool diluat (70-800).

Principiile active extrase se identifică cu ajutorul unor reacții specifice din extractul alcoolic ca atare sau din extractul alcoolic prealabil hidrolizat.

Reacții efectuate în extractul alcoolic

Identificarea taninurilor

1 ml extract alcoolic adus într-o eprubetă, se diluează cu 2 ml apă distilată și se adaugă 2-3 pic. de clorură ferică 1% diluata 1/10.

Apariția unui colorații albastre-negricioase indică prezența taninurilor galice, iar o colorație verde-închisă atestă prezența taninurilor catechice.

În cazul unui amestec de taninuri galice și taninuri catechice se recurge la separarea lor cu ajutorul reactivului Styassny.

10 ml extract apos se fierbe la reflux cu 3 ml reactiv Styassny timp de 30 minute. În aceste condiții taninurile catehice se condensează, se depune un precipitat roșu care se separă prin filtrare. În soluția filtrată, după neutralizare cu acetat de sodiu în exces, se adaugă soluție de clorură ferică diluată (2-3 picături). Apariția unei colorații albastre confirmă prezența taninurilor galice.

Identificarea compușilor reducători

1 ml extract alcoolic se aduce într-o eprubetă, se diluează cu 2 ml apă distilată, se adaugă 1 ml soluție Fehling (I+II) și se încălzește la fierbere.

Apariția la fundul eprubetei a unui precipitat roșu cărămiziu (oxidul cupros) indică prezența compușilor reducători.

Identificarea alcaloizilor săruri

15 ml extract alcoolic se evaporă într-o capsulă pe baia de apă (sau baie de nisip). Reziduul se dizolvă în 5-10 ml de acid clorhidric 2%, prin amestecarea cu o baghetă de sticlă, la cald (pe baia de apă). Soluția acidă decantată sau filtrată se aduce într-o pâlnie mică de separare și se adaugă amoniac concentrat (pH:8-10). Soluția alcalină se extrage cu eter sau cloroform (3x8ml).

Extractul eteric sau cloroformic spălat cu apă distilată (în pâlnie de separare) se separă, se anhidrizează (sulfat de sodiu anhidru) și se evaporă într-o capsulă pe baie de apă (la nișă). Reziduul se dizolvă în 1,5 ml acid clorhidric 2%. Soluția acidă decantată se împarte în 3 eprubete, în volume egale. La una din probe se adaugă 2-3 pic. reactiv Mayer. La altă probă se adaugă 2-3 pic.reactiv Bertrand, iar a treia eprubetă servește ca probă martor..

Dacă probele tratate cu reactivi dau precipitate (alb-gălbui) alcaloizii sunt prezenți în produsul vegetal analizat.

Identificarea bazelor alcaloidice cuaternare și a aminelor oxidate

Soluția apoasă alcalină rămasă după extracția alcaloizilor cu eter sau cloroform se acidulează cu acid clorhidric concentrat la pH=3, se filtreză după care se efectuează reactiile de precipitare cu reactivii Mayer și Bertrand ca mai sus. Apariția unui precipitat indică prezența bazelor alcaloidice cuaternare sau aminelor oxidate.

Având în vedere importanța terapeutică a alcaloizilor, precum și procedeele curente de extracție (cu soluții hidroalcolice de concentrații diferite), pentru a preîntâmpina erori la identificarea acestor principii active se poate proceda în modul următor:

20 g produs vegetal degresat, se extrage cu o soluție hidroalcoolica utilizând tehnica de lucru descrisă la obținerea extractului alcoolic (B)

Dacă se folosește extracția cu alcool de 80%, extractele hidroalcoolice obținute se concentrează la o consistență sirupoasă. Se acidulează cu acid clorhidric 2% (10 ml) prin amestecarea la cald cu o baghetă de sticlă. După răcire se adaugă clorură de sodiu (0,5 g) și se amestecă. Soluția se filtreză pe hârtie de filtru, apoi se spală filtrul cu 2-3 ml acid clorhidric 2%. Din extractul acid apos se iau probe de 1 ml și se fac reacțiile cu reactiv Mayer și reactiv Bertrand.

Apariția unor precipitate abundente poate indica prezența alcaloizilor, baze alcaloidice cuaternare și aminelor oxidate.

Pentru confirmarea prezentei alcaloizilor extractul acid apos rămas se aduce într-o pâlnie de separare. Se adaugă amoniac concentrat (pH:8-10) după care se agită cu cantități mici de ater sau cloroform. Se separă cele două soluții: extractul eteric sau clororformic și soluția apoasă alcalină.

În extractul eteric sau cloroformic se identifică alcaloizii după procedeul descris anterior, iar în soluția apoasă alcalină după acidulare se identifică bazele alcaloidice cuaternare și aminele oxidate.

Identificarea aminoacizilor

5 ml extract se evaporă într-o capsulă la sec. Reziduul se reia cu 1,5 ml apă la cald, se filtrează într-o eprubetă și se adaugă 10 picături soluție acetonică de ninhidrină 1%. Se încălzește într-o baie de apă fierbinte 20-25 minute.

Apariția unei culori violete sau albastru-violet indică prezența aminoacizilor.

Reacții efectuate în extractul alcoolic hidrolizat.

25 ml extract alcoolic se aduce într-un balon cu refrigerent ascendent și i se adaugă 15 ml acid clorhidric 10 %, apoi se fierbe la reflux timp de 30 minute. Se distilă alcoolul într-un aparat adecvat. Soluția apoasă acidă care adeseori devine opalescentă, se aduce într-o pâlnie de separare și se agită repetat cu eter (3x15ml).

Prin separare rezultă : a) extractul eteric care se deshidratează cu sulfat de sodiu anhidru și b) soluția apoasă acidă.

Extractul eteric (40 ml)

În acest extract se pot identifica următoarele grupe de principii active: antracenozide, cumarine, glicozide sterolice și triterpenice, prin reacții caracteristice agliconilor obținuți prin hidroliză.

Identificarea antracenozidelor

3 ml extract eteric se aduce într-o eprubetă, se adaugă 1 ml amoniac 25 % și se agită. Dacă soluția alcalină se colorează în roșu-vișiniu sunt prezenți emodolii (agliconii antracenozidelor).

Identificarea cumarinelor

5 ml extract eteric se evaporă într-o capsulă de porțelan pe baia de apa (la nișă). Reziduul se dizolvă în 2 ml apă distilată fierbinte. După răcire soluția se împarte în 2 eprubete. Una din eprubete servește ca probă martor. În cealaltă eprubetă se adaugă 0,5 ml soluție de amoniac diluat. Ambele eprubete se examinează la lumina ultraviolet filtrată.

Apariția unei fluorescențe (albastră, verde sau violetă) mai intensă la soluția alcalinizată indică prezența cumarinelor.

Prin reacția Feigl-Frehden-Angel se poate pune în evidență lactona hexaatomică din structura cumarinelor astfel: extractele apoase cercetate la UV se aduc Într-o capsulă, se adaugă clorhidrat de hidroxilamină (3-5 picături soluție 0,5 N) și hidroxid de potasiu 10% până la pH=8-9. se concentrează pe baie de nisip. Reziduul se tratează cu acid clorhidric 10% până la pH=3-4 și cu 1-2 picături de soluție 3% clorură ferică.

Prezența derivaților lactonici determină apariția unei colorații violetă-fugace.

Identificarea glicozidelor sterolice (cardiotonice, saponice)

Heterozidele cardiotonice

Pentru identificarea nucleului sterolic se face reacția Liebermann-Burchard descrisă la extractul eteric. Pentru identificarea lactonei pentaatomice nesaturate caracteristică glicozidelor cardenolidice se efectuează reacția Kedde:

10 ml extract eteric se evaporă într-o capsulă pe baia de apă. Reziduul se dizolvă în 1-2 ml metanol, se adaugă 1-2 ml soluție alcoolică de hidroxid de potasiu 1N și 3-4 picături de soluție 1% de acid 3,5-dinitrobenzoic. Prin încălzire se obține o colorație violetă fugace.

În același scop se poate folosi reactivul Baljet (2,4,5-trinitrofenol în mediu alcalin), reactivul Legal (sodium nitroprusiat în mediu alcalin), reactivul Raymond (m-dinitrobenzen în mediu alcalin) care dau reacții de culoare.

Pentru partea glucidică se poate efectua reacția Keller-Kiliani (clorura ferică-acid acetic-acid sulfuric), reacția Pesez (xanthydrol), care sunt caracteristice 2-dezoxiozelor.

Identificarea saponinelor sterolice și triterpenice

Pentru nucleul sterolic (triterpenic) se face reacția Libermann-Burchard. În continuare se poate face testul Salkowski (cu acid sulfuric) pentru sterolii nesaturați. Apariția unei colorații roșie-vișinie la limita celor două lichide (inel) indică prezența sterolilor nesaturați.

Identificarea saponinelor se face prin proba se spumificare și proba de hemoliză, folosind soluția apoasă a reziduului extractului alcoolic nehidrolizat.

Identificarea flavonozidelor

5 ml extract eteric se evaporă într-o capsulă de porțelan pe baia de apă. Reziduul se dizolvă în 2 ml metanol 500, la cald. Soluția de coloare galbenă se aduce într-o eprubetă, se adaugă puțină pulvere sau 2-3 bucăți de span de magneziu și 10 picături de acid clorhidric concentrat (reacția Shibata). Apariția unei colorații roșii sau portocalii indică prezența agliconilor flavonozidelor. Culoarea roșie este caracteristică flavonolilor, iar culoarea portocalie flavonelor.

Identificarea flavonozidelor se poate face și în extractul alcoolic nehidrolizat: se evaporă extractul (3ml) într-o capsulă pe baia de apă. Dacă reziduul este verde, se triturează de mai multe ori cu eter de petrol (3x12ml) pentru extragerea clorofilei și rezinelor.

Reziduul astfel purificat se dizolvă în alcool metilic 500 (2ml) și se face reacția Shibata.

Identificarea proantocianidolilor (leucoantocianilor).

Într-o probă de 5 ml extract alcoolic 80% se adaugă acid clorhidric concentrat 0,5 ml și se încălzește 5 minute. Dacă apare o luloare roșie-violet sunt prezenți proantocianidolii (leucoantocianii).

b) Soluția apoasă acidă

Identificarea antocianozidelor.

Dacă soluția acidă are culoarea roșie, care la pH 7 trece în violet, iar în mediul alcalin în albastru sau verde, sunt prezente antocianozidele.

C. Extractul apos

Produsul vegetal rămas de la extracția cu alcool, este uscat și extras cu apă distilată (50-100 ml) la cald, 15-20 minute. Extractul apos filtrat se concentrează la 50 ml.

Apa extrage din produsele vegetale următorii compuși chimici:

glucide (oze, polioze, poliuronide)

glicozide (heterozide)

taninuri

substanțe proteice

alcaloizi săruri

În general, în cazul când extracția cu etanol sau metanol a produsului vegetal a fost totală, în extractul apos nu mai pot fi identificați aceiași compuși chimici.

Extracția cu apă este preferată în cazul produselor verzi, deoarece nu extrage clorofila.

Principiile active extrase se identifică prin reacții specifice, folosind extractul apos ca atare și extractul apos hidrolizat.

Reacții efectuate în extractul apos

Identificarea poliuronidelor (mucilagii, pectine și gume)

2 ml extract apos se toarnă în fir subțire într-o eprubetă cu 10 ml alcool sau acetonă. Dacă se formează un precipitat voluminos (floconos), aceasta se separă prin filtrare sau centrifugare. Se spală cu alcool sau acetonă și se colorează cu un reactiv specific (hematoxilină, albastru de toluidină). Culoarea precipitatului în violet sau albastru indică prezența mucilagiilor (care sunt foarte răspândite).

Identificarea compușilor reducători

Într-o eprubetă se aduc 1 ml extract apos, se adaugă 1 ml soluție Fehling (I+II) și se încălzește la fierbere.

Apariția pe fundul eprubetei a unui precipitat roșu cărămiziu atestă prezența compușilor reducători.

Identificarea unor glucide (oze si polioze)

2 ml extract apos se evaporă într-o capsulă de porțelan. Reziduul se tratează cu 2-3 picături de acid sulfuric concentrat. După un repaus de 3-4 minute, se adaugă3-4 picături de soluție saturată de timol. Apariția unei colorații roșii indică prezența ozelor sau poliozelor.

1 ml extract apos obținut prin decantare se tratează cu reactiv Lugol (1-3 picături). Apariția unei colorații albastre, atestă prezența amidonului.

Identificarea saponinelor (saponozidelor)

a) Reacția Liebermann-Burchard 10-20 g produs vegetal pulverizat se extrag cu eter etilic într-un aparat cu extracție continuă (tip Soxhlet) sau prin agitare mecanică ori manuală, în repetate rânduri, la temperatura mediului ambiant, într-un vas adecvat, până ce soluția eterică nu mai lasă reziduu prin evaporare.

b)Test spumă: 1 ml extract apos se diluează cu 9 ml apă. 4 ml extract apos diluat, se aduce într-o eprubetă (ø 1,5 cm) și se agită 15 secunde. Formarea unei coloane de spumă înaltă de minimum 1 cm și persistentă minimum 15 minute, ne indică prezumtiv prezența saponinelor.

c) În continuare se face proba de hemoliză prin metoda gelatin- sânge.

Dacă cele trei reacții sunt pozitive saponinele sunt prezente în produsul vegetal analizat.

Identificarea taninurilor.

1 ml extract apos adus într-o eprubetă se tratează cu 1-2 picături clorură ferică 1% diluată 1/10.

Apariția unei culori albastre indică prezența taninurilor galice, iar o colorație verde închis confirmă prezența taninurilor catehice.

În cazul unui amestec de taninuri galice și catehice se folosește reactivul Styassny (vezi extractul alcoolic)

Identificarea alcaloizilor săruri

15 ml extract apos se alcalinizează cu amoniac 10 % (pH=8-10) și se extrage cu eter sau cloroform în pâlnia de separare de (3×15 ml). În continuare se aplică aceiași tehnică de lucru folosită pentru identificarea alcaloizilor în extractul alcoolic.

2) Reacții efectuate în extractul apos hidrolizat

Se procedează după tehnicile de lucru descrise la extractul alcoolic atât pentru hidroliza extractului apos cât și pentru identificarea: antracenozidelor, cumarinelor, glicozidelor sterolice și triterpenice, flavonozidelor și antocianozidelor. Aceste reacții se efectuează în cazul în care ele nu au fost pozitive în extractul alcoolic.

În cazul asocierii unor compuși care pot da suprapuneri de culori ce nu permit identificarea lor, se recurge la alte metode ca microsublimarea, dar mai ales la cele cromatografice.

Analiza cromatografică

Cromatografia este o metodă fizico-chimică de separare a substanțelor dintr-un amestec, bazată pe capacitatea de distribuție a acestora între o fază staționară și una mobilă.

După natura fazelor mobile metodele cromatografice se împart în cromatografie de lichide și cromatografie în fază gazoasă, iar după factorii fizico-chimici care stau la baza separării cromatografice se clasifică în cromatografie de adsorbție, cromatografie de repartiție, cromatografie chimică (prin schimbători de ioni, prin precipitare, etc).

a) Cromatografia pe coloană (CC) se folosește în mod curent pentru separarea principiilor active din extracte vegetale. În acest caz adsorbantul solid constituind faza staționară (oxid de aluminiu, silicagel, oxid de magneziu) se aduce într-un tub de sticlă, de dimensiunile necesare, prevăzut în partea inferioară cu un robinet. Peste adsorbant se adaugă extractul vegetal care urmează a fi supus separării.

Separarea substanțelor se poate realiza, în mod general, prin:

-scoaterea coloanei de adsorbție, din tub (după ce acesta a fost irigată cu solventul în care s-a solubilizat extractul vegetal) și separarea în porțiunile corespunzătoare zonelor de adsorbție urmată de eluarea acestora cu solvenți adecvați;

-eluarea coloanei cromatografice cu amestecuri de solvenți în gradient de polaritate.

Fiecare fracțiune se colectează în vase separate; se evaporă și se identifică substanțele separate. Pentru o mai bună separare în unele cazuri fracțiunile colectate sunt recromatografiate. Această metodă de separare este folosită și în scopuri industriale.

b) Cromatografia pe hârtie (CH)

După mecanismul de separare este o metodă cromatografică de repartiție.

-Faza staționară este constituită din hârtie cromatografică (preparată din fibre de celuloză), de grosime și porozitate adecvată, îmbibată adeseori cu apă, formaldehidă etc.

Tipurile de hârtie mai folosite sunt Whatman 1, 2, 3 și 4, Schleicher-Schüll 2040 (a, b), 2043 (a, b), Archer Binzen, Munkell.

-Faza mobilă (developantul) este constituită dintr+un solvent sau amestec de solvenți. După sensul migrării fazei mobile, se deosebesc mai multe metode de analiză cromatografică (circulară, ascendentă, descendentă, unidimensională, bidimensională).

Hârtia perfect întinsă se taie de-a lungul fibrelor în benzi de lățimi convenabile, după care se aleg camerele cromatografice de developare din sticlă, ermetic închise, prevăzute cu dispozitive de fixare a hârtiei și cuvă pentru faza mobilă.

Modul de lucru: saturarea atmosferei din camera cromatografică se face în principiu cu solvenții fazei mobile timp de 24 ore.

Pregătirea benzilor de hârtie cromatografică diferă de la caz la caz. În continuare se pregătesc extractele de cercetat și soluțiile etalon în concentratiile prevăzute în tehnicile folosite. Aplicarea acestor soluții se face prin picurare cu ajutorul unei micropipete de 0,1 ml divizată în 0,001 ml sau capilare de sticlă de anumite capacități (în cazul cromatografiei cantitative); startul se fixează la 5 cm (ascendentă) sau 10 cm (descendentă) de marginea benzii de hârtie.

Distanța dintre punctele de aplicare 3-4 cm, iar la marginea laterală a hârtiei de 2,5 cm.

Cantitatea de soluție pipetată este de 20-05 µml, iar diametrul spotului de cel mult 0,6 cm.

Hârtia cromatografică astfel pregătită se introduce cu capătul la care este trasată linia de start în cuva cu developant din camera cromatografică, astfel ca lichidul să nu vină în contact cu spoturile. Dacă nu se precizează tehnica de developare, se va folosi cea ascendentă.

Developarea se face la o temperatură de 20-250C.

Când frontul fazei mobile a parcurs distanța prevăzută în tehnica de lucru , se scoate cromatograma, se înseamnă frontul solventului și se usucă la aer sau în etuvă la temperatura necesară, funcție de sistemul de solvenți folosit.

Identificarea spoturilor se face prin examinarea cromatogramei ca atre sau după tratare cu reactivii necesari, la lumina zilei sau în ultraviolet la λ=254 nm și λ=365 nm.

Pentru identificarea substanțelor se compară pe aceiași cromatogramă Rf-rile probei de analizat cu valorile Rf-rilor obținute la substanțele etelaon folosite. De asemenea se ține seama de culoarea și forma spoturilor obținute și a substanțelor etalon.

Rf = distanța dintre linia de start și centrul spotului

Distanța dintre linia de start și frontul de solvent trecând prin centrul

Cromatografia circulară pe hârtie

Prin această metodă substanțele se separă în zone concentrice.

Se folosesc pătrate de hârtie cu latura de 20 cm. Pe cele două diagonale la distanța de 1-1,5 cm de centru, se marchează patru puncte de start în care cu ajutorul unei micropipete, se aduc extractele de analizat și soluțiile substanțelor etalon.

Faza mobilă (solventul sau sistemul de solvenți) irigă cromatograa cu ajutorul unei mese de vată care străbate hârtia printr-un orificiu central, capătul fiind introdus în faza mobilă din cutia Petri (Ø 16-18 cm).

Se acoperă cutia cu capacul ei. Developarea durează 1-2 ore. Când frontul de solvent ajunge la marginea cutiei (1,5-2 cm) se ridică capacul, se scoate cromatograma, se îndepărtează meșa, se notează frontul de solvent și se usucă la temperatura camerei.

În continuare se procedează ca în cadrul cromatografiei ascendente sau descendente menționate anterior.

Cromatografia pe strat subțire (CSS)

Cromatografia pe strat subțire este o metodă prin care pot fi separate, identificate și determinate cantitativ sau semicantitativ serie de substanțele chimice dintr-un amestec, îndeosebi din extractele vegetale. Acestă metodă prezintă mari avantaje față de celelalte metode cromatografice dintre care menționăm următoarele:

Posibilitatea de separare superioară cromatografiei pe hârtie și coloană, datorată structurii adsorbanților, care prin suprafețele mari oferite, permit separarea și identificarea unor substațe care se găsesc în cantități mici, în amestecul analizat.

Simplitatea, rapiditatea (durata 15-60 min.) și universalitatea metodei (cromatografie de adsorbție, cromatografie de repartiție).

Posibilitatea de analiză simultană a mai multor probe pe aceiași placă, inclusiv substanțele etalon.

Reproductibilitatea rezultatelor în condiții de lucru standard.

Posibilitatea de analiză cantitativă sau semicantitativă.

Rezistență mecanică și chimică față de reactivi, în comparație cu cromatografia pe hârtie.

Cromatografia pe strat subțire are o fază staționară constituită dintr-un strat de adsorbant (silicagel, oxid de aluminiu, kieseegur, silicat de magneziu, celuloză, poliamidă, sefadex) cu sau fără liant (amidon, gips, carboximetil-celuloză) aplicat pe o placă de sticlă și o fază mobilă formată din unul sau mai mulți solvenți.

Mecanismul de separare se bazează pe distribuția diferită a substanțelor unui amestec, între cele două faze, staționară și mobilă. Substanțele antrenate de faza mobilă sunt trecute prin faza staționară.

Viteza de migrare a substanțelor este dependentă de natura lor chimică, care influențează distribuția acestora în cele două faze. Cu cât o substanță este mai puțin adsorbită de faza staționară, viteza sa de migrare este mai mare, deci, și Rf-ul spotului este mare și invers.

În funcție de natura fazei staționare se determină tipul cromatografiei: de adsorbție (solid ↔ lichid) sau de repartiție (lichid ↔solid).

Adsorbanții și lianții trebuie să îndeplinească anumite condiții de granulație și de puritate.

Developarea cromatoplăcilor are loc în camere de sticlă ermetic închise de diferite tipuri.

Cromatografia pe strat subțire, după direcția de migrare a solventului, poate fi ascendentă, descendentă, orizontală, bidimensională.

Modul de lucru: Pulberea de adsorbant se agită cu apa (1g/2ml) sau alt solvent prevăzut, într-un vas conic, timp de 1 min, după care se întinde în strat subțire pe plăci de sticlă de mărimi diferite (5x20cm, 10x20cm,20x20cm), spălate în prealabil cu detergent și uscate cu alcool.

Există mai multe tipuri de dispozitive prin care se poate realiza un strat de adsorbant uniform și de o anumită grosime (de obicei 0,25mm).

După întinderea stratului, plăcile se usucă la aer 30 minute, apoi se activează timp de 45-60 minute în etuvă la 1100C, după care se lasă să se răcească într-un exicator cu clorură de calciu anhidră.

Plăcile astfel pregătite se păstrează în exicator. Dacă păstrarea durează mai multe zile ele trebuie activate din nou în același condițiuni.

Aplicarea soluțiilor de analizat se face cu ajutorul unei micropipete sau cu tuburi capilare de anumite capacități. Limita de start este situată la 2 cm de marginea plăcii, distanța dintre punctele de start trebuie să fie de cel putin 1,5 cm, iar dintre punctele marginale și latura plăcii de 2 cm.

După aplicarea soluțiilor la start și evaporarea solventului, placa se introduce în camera de develoare care conține faza mobilă formată din unul sau mai mulți solvenți (indicată de tehnică). Introducerea developantului (faza mobilă) se face cu cel puțin 30 minute înainte de cromatografie. Pentru o mai bună saturare se pot căptuși 3 din pereții camerei cu o bandă de hârtie îmbibată în developant. Se introduce placa astfel ca spoturile de la start să nu atingă suprafața developantului.

Developarea se face la temperatură constantă de 20-250C. În condițiile în care developantul a parcurs distanța prevăzută în tehnică se scoate placa și se usucă la aer sau în etuvă, la o temperatură corespunzătoare, în funcție de solventul sau amestecul de solvenți utilizat.

Identificarea spoturilor se face cu reactivi specifici folosind același procedeu descris la cromatografia pe hârtie.

La determinarea cantitativă sau semicantitativă a substanțelor cromatografiate sunt utilizați adsorbanți și solvenți cu un înalt grad de puritate.

Metodele folosite pentru determinarea cantitativă pot fi directe sau indirecte:

metoda densiometrică care se bazează pe deplasarea cu o viteză constantă a cromatoplăcii între o sursă de lumină și o celulă fotoelectrică cuplată cu un înregistrator al atenuărilor de lumină. Curba obținută se compară cu curbele unor substanțe etalon;

metoda măsurării suprafețelor la baza căreia stă relația de proporționalitate între suprafață și logaritmul concentrației substanței (este mai puțin exactă);

metodele indirecte care se aplică după eluarea zonelor de pe stratul subțire, urmate de determinarea substanțelor prin metode chimice, fizico-chimice sau biologice;

d) Cromatografia în fază gazoasă (CG) (gaz-solid, gaz-lichid) necesită o aparatură de înaltă performanță cu ajutorul căreia se efectuează atât analize calitative cât și determinări cantitative a substanțelor dintr-un amestec.

Determinarea purității

După identificarea produselor vegetale, prin metodele prezentate anterior urmează stabilirea purității acestora.

Determinarea purității se face conform normelor prevăzute de farmacopee sau fișe tehnice care prevăd următoarele:

a) Determinarea impurităților din plantă

Aceste impurități pot fi constituite din părți din alte organe ale plantei producătoare sau produse degradate.

Adeseori odata cu recoltarea diverselor organe de plante care constituie produsele vegetale sunt recoltate și alte organe care nu conțin principii active.

Tot în această categorie intră produsele alterate (atacate de boli, insecte) sau degradate (fructe zdrobite, frunze brunificate).

Normele de calitate prevăzute pentru fiecare produs vegetal privind anumite procentaje din aceste impurități sau exclud prezența lor.

b) Determinarea corpurilor străine

același norme prevăd sau exclud prezența în produse vegetale a unor corpuri străine (părți din alte plante, substanțe minerale, pământ, pietre).

Normele existente prevăd prelevarea pentru determinarea impurităților și a corpurilor străine din produse vegetale, a următoarelor cantități de probe de analizat:

– pentru semințe și fructe foarte mici 2-5g

– pentru alte semințe și fructe mici 20g

– pentru produse vegetale fragmentate 50g

– pentru flori, frunze, ierburi, scoarțe 100g

Impuritățile din plantă sau părți din alte plante și substanțe minerale (pământ, praf, nisip, pietricele), indicate în monografia produsului vegetal respectiv, se aleg cu o pensetă, se cântăresc separat, iar rezultatele se exprimă în procente.

Determinarea calității produselor vegetale

Determinarea calității produselor vegetale este o condiție absolut necesară pentru avizarea folosirii acestora în terapeutică sau ca materie primă în laboratoare galenice ori în industria farmaceutică.

Determinări preliminare

Stabilirea compoziției chimice, sub aspect cantitativ și calitativ, a unui produs vegetal este precedată de efectuarea unor probe preliminare, care prezintă o importantă valoare orientativă pentru investigațiile chimice ce urmează a fi aplicate.

-Determinarea umidității

după cum este cunoscut, gradul de umiditate al produselor vegetale trebuie să se încadreze în anumite limite care permit asigurarea conservării lor.

Cantitatea de apă din produse vegetale este influențată de mediul ambiant. Determinarea conținutului în apă se încadrează în analiza preliminară, deoarece cantitatea de reziduu uscat sau fix (masa vegetală rezultată din îndepărtarea la cca. 1000C a componentelor volatile) reprezintă o valoare de referință pentru alte date analitice cantitative. În aceste cazuri, prin urmare, determinarea reziduului uscat este identică cu determinarea conținutului în apă.

Procedeele de determinare a conținutului în apă din produse vegetale sunt diferite. Materialul vegetal trebuie, în prealabil, mărunțit sau pulverizat.

a)Uscarea la etuvă

Într-o fiolă de cântărire adusă la greutate constantă prin încălzire în etuvă (la aceeași temperatură la care urmează să se facă și uscarea), răcită în exicator, se introduc 5-10 g din proba de analizat. În cazul în care se prevede și determinarea uleiurilor volatile, din pierderea totală se va scădea cantitatea în grame de ulei volatil determinat în prealabil. Diametrul fiolei se alege în așa fel încât cantitatea de material vegetal luat în lucru să nu formeze un strat mai gros de 5 mm.

Fiola cu conținut, dacă nu se precizează altfel în monografie, se menține 4 ore în etuvă la 100-1050C, se răcește în exicator, se închide și se cântărește. Se continuă uscarea câte 60 minute, răcirea în exicator și cântărirea, până la greutatea constantă. Pentru produsele grase se adaugă nisip, cântărit în prealabil, se amestecă cu o baghetă de sticlă, apoi se usucă la 100-1050C până la greutate constantă.

b)Uscarea la vid (sub presiunea redusă)

În cazurile speciale, indicate pentru uscarea unor produse vegetale, în care unele principii active se alterează la temperatura de peste 1000C, se face la temperaturi mai scăzute, în etuve de vid.

c)Uscarea în exicator

În cazul substanțelor termolabile indicate in monografii, uscarea se face în exicatoare, în prezența unor substanțe deshidratate ca: H2SO4, HP2O5 sau CaCl2 anhidru. Fiola de cântărire cu substanța de analizat se menține în exicator 24 ore și apoi se cântărește. Se menține în continuare și se cântărește din 6 în 6 ore până ajunge la greutate constantă.

d)Antrenarea cu vapori de dizolvanți organici

Principiul constă în extragerea apei prin antrenarea cu vapori de solvenți organici nemiscibili, cu puncte de fierbere mai ridicate și determinarea cantității de apă separată din amestecul de lichide nemiscibile condensate.

Se aplică în cazul substanțelor moi, cum sunt grăsimile și uleiurile. Determinarea se execută într-un aparat adecvat. Se cântărește exact o cantitate de produs vegetal și se introduce în balonul uscat. Se adaugă 100 ml xilen sau toluen și câteva fragmente de porțelan poros.

Încălzirea se face pe baia de ulei sau la o sursă electrică. Distilarea se conduce la început cu o viteză de aproximativ 100 picături/min, apoi se mărește viteza de distilare la aproximativ 200 picături/min. Distilarea se continuă până ce volumul de apă separat rămâne constant.

Picăturile de apă, care eventual ar adera pe pereții refrigerentului, se antrenează într-o eprubetă gradată prin spălare cu 5 ml dizolvant.

Antrenarea durează cel puțin 2 ore, se citește apoi volumul apei colectate în eprubetă și se raportează la sută.

e)Determinarea cenușei

Cenușa reprezintă substanțele anorganice dintr-un material vegetal. Raportul dintre compușii organici și anorganici poate constitui o valoare ce caracterizează un produs vegetal, deși convențională și reproductibilă numai în anumite condiții date.

Creuzetele folosite pentru determinarea cenușei trebuie să fie aduse la greutate constantă, prin în călzirea la aceiași temperatură la care se face determinarea reziduului sau a cenușei.

Într-un creuzet de mărime convenabilă, cântărit în prealabil, se introduce cantitatea de produs vegetal pulverizat, indicat în monografie și se cântărește exact. Dacă nu este indicată cantitatea se ia 1-2 g produs. Creuzetul se încălzește pe sită până la carbonizare, apoi se calcinează până la greutate constantă.

Dacă reziduul după răcire mai conține particule de cărbune se adaugă câteva picături de perhidrol, acid azotic concentrat sau soluție concentrată de azotat de amoniu. Se încălzește până la evaporarea lichidului, apoi se calcinează până când reziduul devine alb sau colorat uniform.

Cenușa obținută după calcinare se tratează cu 2-3 ml acid clorhidric diluat. Creuzetul se acoperă cu o sticlă de ceas și se încălzește 10 minute pe baia de apă. Se adaugă 5 ml apă fierbinte cu care se spală și sticla de ceas, lichidul se filtrează printr-un filtru cantitativ, se aduce precipitatul pe filtru și se spală cu apă fierbinte, până când filtratul nu mai dă reacția pentru cloruri. Filtrul cu precipitatul se usucă la 1050C, se aduce în creuzetul inițial și se calculează până la greutatea constantă.

Determinarea extractibilului

Extractibilul reprezintă cantitatea de constituenți chimici dintr-un produs vegetal, dizolvată într-un anumit solvent (alcool, apă, eter). În general se folosește extracția alcoolică. Este necesar a se specifica solventul utilizat precum și modul de lucru. [6]

Determinarea cantitativă a principiilor active

Este faza finală și totodată hotărâtoare în determinarea calității produselor vegetale. Stabilirea conținutului în principii active se face prin metode chimice, fizice și biologice.

Principiul acestor metode este prezentat în continuare.

1. Metode gravimetrice

Analiza gravimetrică se bazează pe transformarea speciei chimice studiate, într.un precipitat greu solubil în solventul folosit.

În acest scop trebuie parcurse câteva etape:

precipitarea componentului studiat cu un reactiv bine ales;

filtrarea cantitativă și spălarea precipitatului;

uscarea și calcinarea precipitatului până la masă constantă;

cântărirea precipitatului calcinat și calculul conținutului în componentul de analizat.

Pentru ca rezultatul analizei gravimetrice să fie exact, fiecare etapă necesită condiții specifice.

i.Precipitatul trebuie să aibă produsul de solubilitate cât mai mic (minim 10-8), iar reactivul folosit la precipitare (precipitatul) , se adaugă în exces (aprox. 1,5 ori cantitatea stoechiometric necesară) pentru a asigura o precipitare practic completă. Se recomandă ca precipitatul să fie volatil sau ușor solubil pentru a asigura îndepărtarea excesului în etapele următoare. Condițiile experimentale necesare precipitării cantitative (pH, temperatură, cantitatea de reactiv, agenți auxiliari), trebuie respectate riguros.

ii.Structura precipitatului trebuie să favorizeze filtrarea și spălarea cât mai rapidă. Precipitatele cristaline cu cristale mari, se filtrează și se spală ușor. Cele cu cristale fine, necesită precauții speciale și alegerea corespunzătoare a materialului filtrant. Precipitatele coloidale sunt dificil de manipulat și rețin ușor reactivi din soluție. Forma de precipitare poate fi controlată prin alegerea condițiilor experimentale care favorizează creșterea cristalelor.

iii.O condiție esențială a aplicării metodei gravimetrice, este ca precipitatul să aibă o compoziție bine definită și corespunzătoare formulei chimice. Dacă precipitatul obținut după uscare și calcinare este un amestec nedefinit, nu se poate aplica metoda gravimetrică în analiza cantitativă.

Este necesar ca precipitatul depus-compusul care a precipitat din soluția de analizat la adăugarea reactivului, să se transforme relativ ușor și complet în precipitatul cântărit-compusul rezultat după calcinare. Produsul final trebuie să aibă o bună stabilitate chimică.

iiii.Conținutul în componentul analizat al precipitatului cântărit trebuie să fie cât mai mic, pentru ca eventualele erori să fie minime.

Metode gravimetrice aplicate analizei produselor vegetale

1).Separarea taninurilor catechice de cele galice.

Taninurile, denumite și tananți vegetali, sunt compuși cu structură polifenolică. Ei formează combinații insolubile și neputrescibile cu proteinele din piele. Pe această proprietate se bazează folosirea lor la tăbăcirea pielii, căreia îi conferă flexibilitate și rezistență.

În funcție de structura chimică se împart în taninuri catechice-produși de condensare ai flavan-3-olului cu hidroxiacizi aromatici cu diferite grade de condensare și taninuri galice-esteri ai acidului galic, digalic și luteolic.

Taninurile catechice nu hidrolizează, în timp ce taninurile galice pot fi hidrolizate în mediu acid sau enzimatic. Pe această proprietate se bazează analiza gravimetrică a taninurilor catechice și separarea lor de cele galice. Astfel, taninurile catechice extrase prin fierberea produsului vegetal cu apă formează precipitate galben-brune cu un amestec de formaldehidă 40% și acid clorhidric concentrat și precipitate galbene cu apa de brom acidulată cu acid acetic. Precipitarea cu formaldehidă în mediu acid se bazează pe formarea produșilor de condensare între taninurile catechice și formaldehidă, produși insolubili în mediul de reacție care pot fi analizați gravimetric.

2).Determinarea alcaloizilor cu nucleu purinic.

Alcaloizii cu nucleu purinic (cafeina, teobromina, teofilina) au bazicitate slabă. Analiza cantitativă se bazează pe transformarea compușilor purinici în săruri de amoniu care precipită din mediu apos.

3).Determinarea saponozidelor triterpenice (saponine acide).

Saponozidele triterpenice sunt O-heterozide ale unor agliconi pentaciclici conținând 30 de atomi de carbon în moleculă. Una din metodele de determinare se bazează pe precipitarea lor cu ferocianura de zinc și analiza gravimetrică a precipitatului.

Analiza termogravimetrică

Prin cercetarea comportării precipitatelor la încălzire (tratament termic) s-a urmărit îmbunătățirea și mărirea preciziei analizei gravimetrice. Este necesar să se determine domeniul de temperatură în care un precipitat dat, rămâne cu masa constantă și compoziție precisă. În acest scop, s-au construit termobalanțe speciale, care înregistrează variația masei precipitatului în timpul încălzirii sau calcinării.

Analiza termogravimetrică (TGA) urmărește variația masei substanțelor solide la diferite temperaturi și intervale de timp, prin cântărirea lor după fiecare etapă. Într-un cuptor în care creșterea temperaturii se realizează cu viteză constantă. Termobalanțele moderne înregistrează variația masei probei în funcție de temperatură m=f(T) automat. Se obțin astfel indicații asupra transformărilor însoțite de pierderi de masă, mai rar creșteri (oxidare), pe care le-a suferit substanța cercetată pe fiecare interval de temperatură și de timp.

Analiza termică diferențială (DTA) urmărește diferența de temperatură dintre o probă și un material de referință inert când sunt încălzite uniform. Procesele exo și endotermice din probă, determină modificări caracteristice ale temperaturii probei care pot fi folosite în analiza calitativă și cantitativă.

Determinările se fac cu un cuptor electric cu posibilitatea programării ratei de creștere a temperaturii, în care se introduc proba și referința. Se măsoară diferența de temperatură între probă și referință (ΔT) și se reprezintă grafic în funcție de temperatura T.

Metoda se folosește pentru studiul unui mare număr de materiale într-un interval de temperatură de la –1750C la +10000C și chiar mai mult.

Concluzia este că tehnica termogravimetrică este cea mai modernă metodă de analiză cantitativă a compușilor și a amestecurilor multicomponente, cu aplicații în analiza produșilor naturali, a medicamentelor, a polimerilor.

2.Analiza volumetrică

Clasificarea metodelor de analiză volumetrică se face în funcție de natura titrantului în:

volumetria prin reacții de neutralizare;

volumetria prin reacții redox;

volumetria prin reacții de precipitare;

volumetria prin reacții de complexare.

Alegerea metodei de analiză se face în funcție de natura soluției de analizat și de proprietățile chimice ale speciei chimice de determinat.

Scopul metodelor de analiză volumetrică este determinarea concentrației, a echivalentului-gram sau al conținutului de substanță dintr-un amestec în funcție de volumul de titrant consumat până la echivalență, factorul de corecție al soluției de titrant și volumul sau masa de analit. Pentru determinarea concentrației normale a soluției de analizat se aplică legea echivalenței:

etitrant = eanalit

Cn,titrant* Ftitrant* Vs,titrant,echiv.= Cn analit* Vs, analit

Cn,analit= Cn titrant* VS titrant,echiv. * Ftitrant

Vs,analit

Se poate calcula echivalentul-gram al analitului când substanța este în stare pură și are o formulă moleculară bine definită:

etitrant= esubstanță

Cn titrant * VS titrant,echiv. * Ftitrant = msubstanta

Egsubstanta

Egsubstanță = Cn,titrant * Ftitrant * Vs,titrant, echiv. * msubstanță

Determinarea cantității de substanță conținută într-o probă se face tot din legea echivalenței:

etitrant= esubstanță

Cn titrant * VS titrant,echiv. * Ftitrant = msubstanta

Egsubstanta

msubstanță = Cn titrant * VS titrant * Ftitrant * Egsubstanță

%Substanță = msubstanță * 100

mprobă

%Substanță = Cn titrant * VS titrant * Ftitrant * Eg substanță

mprobă

Algoritmul de calcul pentru fiecare caz în parte este valabil pentru orice analit și orice titrant.

Volumetria prin reacții de neutralizare

Principiul metodei. Volumetria prin reacții de neutralizare cuprinde toate determinările bazate pe o reacție de neutralizare:

H+ + HO- ↔ H2O

Volumetria prin reacții redox

Principiul metodei. Metodele de analiză volumetrică bazate pe reacții cu transfer de electroni, au multew aplicații analitice. În funcție de caracterul redox al analitului și al titrantului, ele pot fi împărțite în:

-titrări cu agenți oxidanți;

-titrări cu agenți reducători.

Titranții reducători sunt mai puțin folosiți, datorită ușurinței lor de a se oxida. Determinările cu titranți reducători necesită instalații speciale: titrantul este trecut printr-o coloană cu umplutură reducătoare și apoi adăugat soluției de analizat.

Titranții oxidanți sunt mai ușor de păstrat în soluție și de aceea au mai multe aplicații practice. Printre cei mai utilizați se numără: soluțiile standard de dicromat de potasiu, de iod, de iodat.

Volumetria prin reacții de precipitare

Principiul metodei. Metodele de precipitare se bazează pe utilizarea în cursul titrării a reacțiilor din care rezultă compuși greu solubili.

Cele mai multe metode folosesc soluția standard de azotat de argint ca titrant, determinări denumite metode argentometrice.

Volumetria prin reacții de complexare

Principiul metodei. Titranții folosiți în reacțiile de complexare sunt liganzi polidentați chelatizați, derivați aminocarboxilici.

Cei mai utilizați titranți complexonometrici sunt EDTA acid (complexon II) și sarea sa disodică Na2H2Y•2H2O (complexon III).

Reacția generală cu un ion metalic Mn+ se poate scrie:

Mn+ + Y4- ↔ MYn – 4

Soluția standardizată de EDTA se folosește la analiza cantitativă a majorității ionilor metalici grei în prezența unui indicator adecvat și are multiple aplicații analitice, biochimice, clinice.

3.Metode optice de analiză

Radiația electromagnetică

Conform teoriei ondulatorii, radiația electromagnetică este un câmp electromagnetic cu doi vectori, unul electric și unul magnetic, perpendiculari între ei și pe direcția de propagare.

Conform teoriei corpusculare radiația electromagnetică este un flux de particule (fotoni) cu energie E.

Energia fotonului este direct proporțională cu frecvența și invers proporțională cu lungimea de undă. Cu cât crește lungimea de undă cu atât scade energia.

Spectrul electromagnetic este continuu și fiecare regiune se întrepătrunde cu rmătoarea.

Un fascicul de radiație care întâlnește un obiect poate fi absorbit, transmis, refractat, reflectat, descompus sau poate induce emisia fluorescentă sau fosforescentă.

Fiecare fenomen este folosit în analiză. În acest scop au fost realizate instrumente specifice și dezvoltate metode corespunzătoare fiecărui fenomen. Astfel, absorbția radiației din domeniu UV-VIS constituie principiul metodei spectrometrice prin măsurarea radiației transmise cu ajutorul spectrometrului de absorbție moleculară. Interceptarea radiației reflectate stă la baza metodei reflectometrice pentru a cărei aplicare au fost concepute aparate accesibile și utile mai ales la analiza pe teren- reflectometre.

Radiația refractată stă la baza metodei refractometrice. Aparatele folosite (refractometrele) măsoară indicele de refracție pentru soluții și gradul de dispersie pentru probe solide.

Emisia fluorescentă sau fosforescentă este consecutivă a absorbției. Spectrofluorimetrele măsoară intensitatea radiației emise care este direct proporțională cu concentrația speciei fluorescente sau fosforescente.

b) Spectrometria UV-VIS

Spectrometria UV-VIS este una din cele mai vechi tehnici analitice iar în ultimii ani a devenit una din cele mai importante metode de analiză datorită simplității, acurateței, rapidității și reproductibilității sale. Evoluția rapidă a tehnologiei a făcut aparatura performantă și din ce în ce mai accesibilă.

Metoda folosește radiația ultravioletă (UV) și vizibilă (VIZ) care reprezintă o fracțiune a spectrului electromagnetic. Definiția diferitelor regiuni spectrale a fost stabilită prin convenție de J.C.N.A.S. (The Joint Commitee of Nomenclature în Applied Spectroscopy).

Procesele considerate în spectrometria de absorbție moleculară sunt absorbția și transmisia. Condițiile în care este examinată proba se aleg astfel încât reflexia, refracția, descompunerea și emisia să fie minime.

În domeniul UV și VIS ale spectrului electromagnetic benzile de absorbție observate nu sunt specifice pentru a permite o bună identificare a unei probe necunoscute, în schimb spectrometria UV-VIS este extrem de utilă în analiza cantitativă (determinarea conținutlui în compusul cunoscut al probei).

În general, studiul se aplică probelor în soluție.

Aparatura folosită în spectrometria UV-VIS

Spectrometrul – UV-VIS cuprinde următoarele componente:

a) sursa de radiație-furnizează radiații cu lungimea de undă în domeniul 190-1000 nm.

b) monocromatorul-selectează cu precizie lungimea de undă de interes

c) compartimentul probei

d) sistemul amplificator-detector măsoară intensitatea radiației transmisă prin probă

Lățimea benzii spectrale-depinde de performanțele aparatului. Când instrumentul are posibilitatea selectării benzii spectrale, acesta se alege cu respectarea următoarelor condiții:

a) lățimea benzii spectrale să nu depășească jumătate din lungimea benzii de absorbție

b) lațimea benzii spectrale să surprindă valoarea maximă a absorbției.

Cuvele-folosite trebuie să fie complet transparente pentru radiația din domeniul studiat. Sunt disponibile cuve standard cu secțiune pătrată cu latura de 1cm sau cu secțiune rotundă cu diametrul de 1cm, cu capacitatea de 3-10 ml și cuve micro cu volume mult mai mici.

Aplicațiile spectrometriei UV-VIS în farmacognozie

1) Măsurarea absorbției

În studiile spectrofotometrice trebuie să se țină cont de următoarele recomandări:

Pentru prepararea soluțiilor etalon se folosesc substanțe de puritate analitică;

Se lucrează la temperaturi de 19-210C iar diferențele de temperatură între soluții nu trebuie să depășească 0,5 0C;

Soluțiile etalon și probele se studiază în aceleași condiții experimentale (același instrument, cuve identice, aceeași temperatură și lățime a benzii spectrale. Pentru a cuantifica radiația absorbită de solvent se folosește o cuvă cu solvent numită referință sau blank . Radiația transmisă prin această cuvă este valoarea practică pentru I0);

Blank-ul se prepară folosind solventul sau amestec de solvenți folosit și la prepararea probei, la care se adaugă toți reactivii mai putin specia chimică absorbantă;

Pentru probele preparate în solvenți volatili se folosesc cuve cu capac sau cu dop. În lipsa acestora, se poate adăuga un volum mic de apă distilată doar pentru solvenții mai grei decât apa.

Cuvele trebuie să fie perfect curate, manipuate cu grijă și atinse cu mâna doar pe laturile mate ale materiaului. Toleranța pentru dimensiunea cuvelor este de ±0,005 cm.

Trebuie evitate interacțiunile speciei chimice absorbante cu solventul sau cu soluțiile tampon folosite pentru reglarea pH-ului.

Pentru fiecare specie chimică se va determina domeniu de valabilitate al legii Lambert-Beer, adică domeniul de concentrație pentru care absorbția crește liniar cu concentrația. Pentru majoritatea compușilor acest domeniu este 10-3-10-5 M.

2) Analiza calitativă- are drept scop:

identificarea componentului pur

determinarea unei anumite specii chimice în amestec

identificarea unei anumite grupări funcționale (amino, carbonil, nitro, compuși aromati)

Identificarea unui compus pur se face comparând spectrul de absorbție al probei (maximele, minimele și punctele de inflexiune) cu cel al compusului pur, în aceleași condiții experimentale.

3) Analiza cantitativă are drept scop determinarea uneia sau mai multor specii chimice dintr-un amestec. Pentru alte concentrații se pot folosii mai multe metode de analiză cantitativă. Toate se bazează pe legea Lambert-Beer.

c) Refractometrie și interferometrie

Principiul metodei. Indicele de refracție este o constantă fizică ce caracterzează substanțele anorganice și organice. Se determină ușor prin măsurare directă cu aparatură relativ simplă și accesibilă folosind o cantitate foarte mică de substanță.

Aparatura

Aparatele folosite se numesc refractometre.

Refractometrul Abbe. Determinarea indicelui de refracție n se face pe baza măsurării unghiului limită între probă și prisma de sticlă cu indice de refracție cunoscut.

Refractometrul de imersie. Prisma de măsurare este secționată oblic și se introduce în soluția de analizat. Indicele de refracție se citește direct pe scala ocularului.

Interferometrele. Interferometrele se bazează pe fenomenul de interferență. Aceste instrumente măsoară diferențe mici între indicii de refracție.

Aplicații

Determinarea indicelui de refracție n , se folosește la :

-identificări

-determinarea gradului de puritate

-determinarea compoziției sistemelor binare și ternare

-stabilirea structurii combinațiilor organice și anorganice

Măsurând valoarea indicelui de refracție n , în timpul unei titrări se poate determina concentrația. Se realizează astfel titrări refractometrice și interferometrice.

d) Reflectometria

Principiul metodei. Reflectometria se bazează pe măsurarea intensității radiației reflectate de probă. Aparatul folosit, reflectometrul, măsoară diferența dintre intensitatea radiației incidente și a celei reflectate.

Determinarea permite analiza cantitativă a unor anumiți componenți și are mai multe avantaje:

-este foarte rapidă (durata unei determinări este de 15-60 secunde);

-se pot analiza probe cu conținut scăzut în ionul studiat (0,1-100m/l);

-instrumentele sunt accesibile și concepute pentru determinări de laborator și de teren;

-interferențele se pot elimina prin reglarea pH-ului și folosirea agenților de mascare.

Metoda se bazează pe transformarea ionului de analizat într-un compus colorat prin reacția cu un reactiv organic.

e)Determinări cromatografice

1) Cromatografia de gaze (CG) este o metodă fizico-chimică de separare cromatografică în care faza mobilă este un gaz (gaz purtător), iar faza staționară este un solid sau un lichid cu care este impregnat un suport solid inert sau un lichid repartizat uniform pe pereții unei coloane capilare.

Faza staționară se află într-o coloană cromatografică confecționată, de obicei, din sticlă sau din oțel inoxidabil. Faza mobilă se deplasează continuu prin coloană, iar la ieșire, gazul-purtător trece prin detector.

2) Cromatografia de lichide sub presiune (HPLC) este o metodă fizico-chimică de separare cromatografică în care faza mobilă este un lichid iar faza staționară, conținută într-o coloană, este constituită dintr-un solid impregnat cu un lichid sau un solid pe care sunt grefate grupări organice.

f) Metode biologice de analiză

În determinarea calității produselor vegetale, pentru aprecierea efectului terapeutic, se folosesc și diferite metode biologice, ca de exemplu la determinarea :

1) Cardiotoxicității heterozidelor cardiotonice pe cobai, comparativ cu activitatea cardiotoxică a unui standard;

2) Acțiuni hemolitice a saponozidelor triterpenice pe suspensie de hematii(indice hemolitic), pe pești din specia Carassius vulgaris (indice pește) sau pe râme Tubifex tubifex) indice viermi;

3) Conținutului de substanțe amare, prin indicele de amăreală (efectuat de un verificator specializat, comparativ cu o soluție etalon de chinină clorhidrică).

Rezultatele tuturor determinărilor biologice se prelucrează statistic prin diferite metode, de cele mai multe ori calculându-se coeficientul de activitate (r) și abaterea standard (p). Coeficientul de activitate reprezintă raportul dintre activitatea probei de analizat și activitatea standardului respectiv. Activitatea propriu-zisă a probei de analizat se obține înmulțind acest coeficient cu activitatea standardului. Activitatea respectivă trebuie să se încadreze în limitele de toleranță ale activității cerute de monografii.[7]

4.Fazele principale pentru obtinerea și introducerea

în terapeutică a unui medicament

de origine vegetală

Realizarea și introducerea unui nou medicament vegetal în terapeutică necesită efectuarea unor studii complexe bazate pe colaborări între diverși specialiști din domeniile: științelor farmaceutice, agronomice, biologice, chimice si medicale.

În alegerea materialului de cercetat date importante ne furnizează practica medicinii populare și cercetările de chemotaxonomie.

Se va acorda prioritate plantelor din flora spontană care se găsesc în cantități necesare stabilite prin lucrările de cartare.

După precizarea pozitiei sistematice a speciei selecțonate se urmărește testarea valorii ei terapeutice. În acest scop se realizeză extracte apoase sau hidroalcoolice care sunt testate farmacodinamic. Dacă în urma screeningului efectuat se constată prezența unei acțiuni farmacodinamice certe, se determină gradul de toxicitate și se trece la stabilirea compoziției chimice cu ajutorul metodelor de analiză prezentate.

Odată cunoscute importantele grupe de principii active de produsul vegetal se stabilește compusul farmacodinamic activ și se dozează. În continuare se extrage substanța activă pură sau se obține un extract purificat și se verifică acțiunea farmacodinamică, toxicitatea, efectele teratogene, cancerigene, apoi se stabilesc:

-constantele fizico-chimice

-pentru principii active structura chimică

-metodologia de control fizico-chimic și

-se testează biologic.

Cu substanța activă izolată sau cu fitocomplexul obținut din produsul vegetal se elaborează cea mai adecvată formă farmaceutică de administrare pentru care se stabilește metodologia de testare microbiologică și control fizico-chimic.[6]

Unul dintre testele folosite pentru a demonstra propritățile fiziologice ale plantelor asupra omului este aromatograma.

Aromatograma-denumește un test care constă în introducerea unei colonii de bacterii într-o cutie Pètri. Se adaugă o anumită doză din uleiul esențial ales și după una, trei sau 24 de ore se numără coloniile de bacterii care au reușit să se dezvolte ori cele care au fost distruse.

Metodă simplă care ar garante sănătatea tuturor, dacă n-ar interveni un alt factor:terenul.

Terenul-definește ansamblul eredității, forțelor și slabiciunilor fizice, mentale și spirituale, ale factorilor de mediu care constituie, pe scurt, amprenta digitală a sănătății unui individ. Ca și amprentele, terenul variază de la o persoană la alta.[8]

Asupra produsului farmaceutic realizat se fac cercetări de stabilitate și de biodisponibilitate.

Urmează transpunerea metodei de extracție și condiționare la scară pilot și apoi stabilirea tehnologiei de industrializare.

Produsul farmaceutic realizat la scară pilot, în urma cercetărilor farmacologice preclinice (farmacodinamice și toxicologice) este supus unei largi examinări clinice pentru cunoașterea proprietăților farmacologice la om și a indicațiilor terapeutice.

Pe baza rezultatelor verificărilor și experimentărilor făcute, se acordă avizul de fabricație. Produsul farmaceutic se realizează la scară industrială și se difuzează ca medicament prin rețeaua farmaceutică. Pentru asigurarea unui produs uniform și de calitate, în cantități programate de industria farmaceutică, se întreprind cercetări pentru introducerea în culturi a plantei respective.

Subliniem că cercetarea științifică a produselor vegetale destinate introducerii în terapeutică este mult mai complexă. Ea are implicații multiple începând cu aspectele de folosire rațională a resurselor naturale, continuându-se cu cele de agrobiologie și agrotehnică a speciilor cultivate, aspecte legate de studiile fitochimice, microbiologice și farmacologice ale principiilor active sau extractelor concentrate obținute.

Un rol deosebit revine cercetării științifice în găsirea celor mai potrivite forme farmaceutice care să asigure stabilitatea medicamentului și o bună biodisponibilitate. La fel de importante sunt și cercetările pentru elaborarea și îmbunătățirea controlului calitativ, chimic și farmacodinamic, al formelor farmaceutice condiționate.[6]

II. ULEIURI ESENTIALE (VOLATILE, ETERICE)

Generalități:

Uleiurile volatile sunt amestecuri complexe de hidrocarburi alifatice, aromatice și hidroaromatice, aldehide, alcooli, acizi, esteri și alti comstituienți în care, în general predomină compuși din clasa terpenoidelor. Uleiurile volatile (denumite anterior esențiale) sunt lichide cu un miros caracteristic, aromatic și plăcut, antrenabile cu vapori de apă.

Denumirea de ulei volatil este adecvată deoarece exprimă proprietatea caracteristică a acestor compuși: tensiunea de vapori ridicată și faptul că se volatilizează la temperatură atmosferică.

Celelate denumiri precum: uleiuri eterice, uleiuri esențiale sunt improprii și nesemnificateive deoarece ele nu sunt formate numai din combinații eterice și nici denumirea de esență nu este totdeauna corespunzătoare.

Proprietățile antibacteriene ale plantelor aromatice au făcut ca oamenii să caute diferite posibilități pentru a obține concetrate în principiu aromatic, ulei volatil. In acest sens oamenii au eleborat metode de extractie a uleiurilor volatile din plante prin obtinerea de macerate de plante aromatice cu uleiuri grase vegetale, uleiuri cu care locuitorii tinuturilor tropicale sau din zonele mediteraneene, îndeosebi cei din clasele sociale superioare, își ungeau corpul ca măsură preventivă împotriva infecțiilor și a degradării pielei.

Hippokrates (460 î.e.n.) și Theophrast (370 î.e.n.) pun bazele științifice ale utilizărilor terapeutice ale plantelor aromatice, pentru ca mai apoi grecii și arabii să dezvolte comerțul internațional cu produse aromatice și condimente.

În Evul Mediu s-au înființat în Europa primele culturi de plante aromatice care ulterior s-au răspândit în toată lumea, pe suprafețe tot mai întinse.

În perioada modernă, plantele cu conținut în ulei volatil cunosc o extindere a utilizărilor lor, pătrunzând numeroase domenii de activitate. În ce privește fitoterapia, printre ultimele realizări în acest domeniu sunt aromoterapia, fructoterapia și legumoterapia.

Răspândire: Uleiurile volatile sunt răspândite în regnul vegetal, unele familii de plante fiind bogate în astfel de substanțe, atât ca număr de specii cât și cantitativ. Dintre aceste familii de plante reprezentative sunt: Pinaceae, Labiatae, Umbelifere, Myrtaceae, Lauraceae, Rutaceae, Caryophylaceae, Compositae, Zingiberaceae.

Denumirea de plante aromate este atribuită acelor specii care conțin o cantitate mare de ulei volatil (cel puțin 0.1-0.2 %), care au un miros suficient de perceptibil sau care pretează unele expoatări rentabil economic. Alături de acestea mai sunt și acele specii de plante care nu au miros caracteristic dar care conțin substante terpenice care intră în compoziția uleiului volatil.

Cultura plantelor aromatice reprezintă una din preocupările de vârf în obținerea de soiuri și rase chimice, prin ameliorări și inginerie genetică, astfel ca sa se obțină producători de uleiuri volatile cu randament cât mai înalt și de o calitate stabilă, care să furnizeze produse cât mai fine.

Uleiurile volatile sunt produși finali ai metabolismului plantelor. Aceste substanțe sunt depuse în anumite țesuturi ale plantei, pentru a nu afecta cursul proceselor metabolice. Astfel, pot fi întâlnite în vacuole, pungi intercelulare, solzi, sub scoarță sau la suprafața scoarței copacilor.

ULEIURILE VOLATILE sunt substanțe lichide, volatile, cu miros parfumat, aromat, insolubile în apă, solubile în solvenți organici sau grăsimi. Au rol de condiment, rol antiseptic, antispasmodic, stomachic etc.

Uleiurile esențiale se extrag din flori, frunze, fructe, coajă și uneori din partea lemnoasă (lemnul de camfor), folosind solvenți organici sau prin distilare și antrenare cu vapori de apă. Numărul uleiurilor eterice vegetale este foarte mare (peste o mie). Din punct de vedere chimic, uleiurile volatile reprezintă amestecuri de substanțe constituite din hidrocarburi terpenice, hidrocarburi aromatice, alcooli, aldehide, cetone, acizi organici, pigmenți, eteri, esteri etc. Unul și același ulei eteric poate conține până la 50 de substanțe diferite. Dintre acești compuși, cei mai importanți sunt hidrocarburile terpenice sau terpenele și derivații lor (mircenul, geraniolul, limonenul,

mentolul, camforul, borneolul etc.).

Mircenul se găsește în hamei, geraniolul în florile de trandafiri, limonenul în chimion, mentolul în mentă,

camforul în lemnul de Laurus camfora și în pelin, borneolul în lavandă etc.

Biosinteza uleiurilor volatile

Unul dintre cei mai interesanți produși de autocondensare ai acetil-coenzimei A este un corp de 5 atomi, o unitate biogenetică [C5], și anume izoprenoil polifosfat. Biosinteza izoprenoil polifosfatlui poate fi întâlnită în toate organismele vii.(fig…)

S-a demonstrat că în toate celulele vii, capabile de acestă sinteză, izopentil-porifosfatul este izomerizat la dimetilpirofosfatul.

Izomerizarea are loc prin intermediul unei structuri de trecere, un carbocation instabil, dar care perimite, totodată, reversibilitatea reacției, care are loc sub influiența unei izopentil-pirofosfat-izomeraze. (Fig…).

Cei doi izomeri hemiterpenici au calitatea de a se condensa, după același sistem cap-coadă, pentru a furniza un dimer cu 10 atomi de carbon, în spață, dar care în realitate reprezintă prima grupă de substanțe terpenoide și anume monoterpenele. Prin eliminarea unui radical pirofosfat se formează geranil-pirofosfatul.

Biosinteza monoterpenelor aciclice

Monoterpenele aciclice reperezintă partea cea mai volatilă a grupului de substanțe dintre uleiurile volatile.

Pentru formarea moleculei geranionului, respectiv geranilpiroposfatului, o deosebită importanță o are poziția sterică a celor doi ractanți, funcție de acesta rezultând substanțe cu proprietăți diferite, deși au aceeași formulă brută.

Astfel, după orientarea spațială diferită a IPP față de DAP, pot rezulta fie geranilpirofosfat, fie nerilpirofosfat.

Condensarea celor două hemiterpene are loc în mai multe faze intermediare, neelucidate incă definitiv, și care sunt dirijate de enzime specifice care determină și trensporturile corespunzătoare de energie.

Astfel, se pare ca, în primul rând DAP pierde restul de pirofosfil cu formarea unui carbocation. Hidrogenul din poziția 2 a IPP este expulzat și captat de către radicalul pirofosfil. Dubla legătură din poziția 3-4 a IPP migrează în poziția 2-3, iar cei doi radicali CH2 rămași liberi, realizează legătura C-C centrală, iar molecula geranionului, ca urmare a atacului electrofil la centrul cationic. Se pare că ionizarea legăturii carbon-pirofosfat este energetic favorabilă, dacă ținem seama de stabilitatea anionului pirofosfat față de cationul alil. În mare, aceste reacții sunt redate în figura…

După un mecanism asemănător, ar putea fi explicată formarea linalolului, monoterpenă aciclică atât de frecventă în compoziția uleiurilor volatile și însoțite aproape fără excepție geranionul și nerolul.

Formarea citralului are loc prin procese de hidrogenare, iar citronelalul rezultă în urma proceselor de hidrogenare și oxidare.

Biosinteza monoterpenelor ciclice

Precursorul monoterpenelor ciclice este tot geranil- sau neril-pirofosfatul. Prin intermediul unui carbocation ciclic, ipotetic, se poate explica biosinteza limonenului (dipentenului).

Monoterpenele sunt compușii cei mai bine reprezentați cantitativ în compoziția uleiurilor volatile, aceștia sun produși rezultați din metabolismul secundar al plantelor. În figura…sunt redate schematic posibilele relații biogenetice dintre cele mai importante terpene aciclice și ciclice.

Din geranil-pirofosfat rezultă, prin condensarea cu o moleculă de izopentil-pirofosfat, farnesil-pirofosfat (C15). Terpenele de 15 atomi de carbon în moleculă, denumite sescviterpene (aciclice și ciclice) reprezintă uneori, constituienții principali ai uleiurilor volatile în figura… este redată schema formării acestor substanțe.

Structura chimică.

Majoritatea uleiurilor volatile aparțin clasei terpenoidelor. Pentru anumite particularități pe care le prezintă fiecare substanță inclusă în această grupă, toate se numesc terpenoide, dar termenul de terpenă se acordă. În general, numai compușilor cu 10 atomi de carbon.

O serie de terpenoide cum ar fi: carotenoidele, acizii rezinici, acizii triterpenici sau saponozidele, nu sunt incluse în grupul uleiurilor volatile datorită greutății moleculare mari, a stării de agregare solide și deci a lipsei de volatilitate. Numai monoterpenele și unele sescviterpene sunt constituienți ai uleiurilor volatile. În afară de aceasta, în categoria uleiurilor volatile sunt incluse și o serie de combinații aromatice, antrenabile cu vapori de apă, dotate cu un miros plăcut, cu origine biogenetică fie din acetilcoenzina A, dar și de origine fenil propanoică. Așa este cazul timolului, eugenolului, anetolului.

Un fenomen des întâlnit este faptul că, în timpul degradărilor metabolice din plantă, sau din altă natură, o serie de compuși nu mai corespund denumirii de ulei volatil căci, prin noile lor proprietăți sa apropie de rezine și balsamuri.

În compoziția diferitelor uleiuri volatile apar numeroase combinații care reprezintă grupe de izomeri derivați de la aceiași structură de bază.

Monotepenele aciclice. Monoterpenele aciclice sunt combinații alifatice cu zece aomi de carbon în moleculă, derivați ai 3,7-dimetil-octanului.

Față de modul de prezentare al formulei de mai sus, trebuie specificat că, în general, se obișnuiește a se prezenta structurile monoterpenice aciclice, în forma lor pseudociclică. Sub acest aspect deosebim patru structuri diferite după cum urmează:

De fapt, aceste structuri saturate, hidrocarburi alifatice cu catene ramificate, nu au fost în natură.

Hidrocarburile nesaturate care se gasesc în compoziția uleiurilor volatile cele mai frecvent întălnite sunt urmatoarele:

Dintre monoterpenele aciclice care au fost identificate in compoziția uleiului volatile din diferite plante cele mai numeroase sunt combinațiile oxigenate între care putem întâlni, după gradul de oxidare, alcooli, aldehide, cetone sau acizi. Cu toate acestea, în mod curent, în compoziția uleiului volatil vom constata prezența numai a câtorva dintre aceste combinații, cum ar fi:

Monoterpenele ciclice. Monoterpenele ciclice sunt mult mai numeroase decât monoterpenele aciclice, deoarece posibilitățile de ciclizare din structurile pseudociclice permit închiderea unui ciclohexan, cu sau fără participarea catenei de izopropil. Aceasta face ca în interiorul sau în afara hexaciclului să se formeze alte noi cicluri, incluse adiacente. Din această cauză se cunosc trei grupe de astfel de monoterpene ciclice: monociclice, biciclice și triciclice.

Structurile monociclice sunt derivate de la p-mentan, substanță inexistentă în natură. În schimb combinațiile mono-, di- și triciclice sunt mai numeroase:

Hidrocarburi monociclice oxigenate:

Combinații biciclice:

Sescviterpenele aciclice.

Toate combinatiile din această clasa își au originea biogenetică în structura farnesil-pirofosfatului care, într-o primă etapă, suferă o izomerizare trecând în nerilidil-pirofosfat. Ambii izomeri pot da, prin ciclizare, structuri sescviterpenice ciclice.

Sescviterpene ciclice:

În afara nucleelor sescviterpenice prezentate mai sus mai există și alte structuri de natură terpenoidică și având un număr de 15 atomi de carbon în moleculă, dar se întâlnesc mai puțin frecvent în compoziția plantelor aromatice.Astfel de structuri derivă din formurele următoare:

În afara structurilor standard, în diferite speciivegetale au fost identificate și alte substanțe sescvterpenice care se încadrează mai puțin în tiparele de mai sus, fiind derivați structurali ai acestora sau presentând structuri diferite.

Componentele aromatice care intra în compoziția uleiurilor volatile pe lângă mirosul lor plăcut au și proprietatea de ai fi antrenate cu vapori de apă. Din punct de vedere biogenetic ele au origine terpenoidică sau fenil-propanică:

Terpenoidele halogenate se întâlnesc frecvent în specii aparținând familiei Compositae sau în algele marine.

În afara proprietăților toxice care s-au constatat la unele extracte din alge, sau unele citotoxice, extractele din alge au mai reținut atenția pentru parfumerie și cosmetologie.

Din licheni este cunoscută cloratranorina, izolată din spaciile Parmelia furfuracea și Everinia prunastri.

1.Caracterizarea organoleptica a uleiului volatil

Uleiul volatil extras din plante se caracterizează organoleptic precum și fizico-chimic:

Din punct de vedere organoleptic se urmărește aspectul, claritatea, mirosul, gustul și culoarea.

Claritatea preparatelor lichide este o caracteristică relativă. Cele mai multe tincturi și extracte fluide separă în timp sedimente mai mult sau mai puțin abundente, indiferent de modul de conservare. În orice caz, în sticle incolore care nu sunt pline și la lumină sedimentele care se formează sunt mai abundente decât tincturile păstrate în sticle pline, bine închise și la întuneric.

Mirosul și gustul sunt indicate în vederea identificării produselor.

Farmacopeea prevede ca soluțiile extractive să prezinte mirosul și gustul specific produsului extras.Tot aceasta prevede ca, în cazul în care produsele au un miros puternic, determinarea să se facă pe o sticlă de ceas cu o cantitate mică de produs.

Când substanțele au un miros slab, cum este cazul la extractul fluid de camomila (1 :1500), tinctura de portocale (1 :750) sau tinctura de valeriană (1 :2000) se prevede o diluție limită înscrisă între paranteze, la care să se mai perceapă mirosul ; se îmbibă o hârtie de filtru de 10 :10 cm în 2 ml produs și se miroase de la o distanță de 2-4 cm.

Prin acest procedeu se poate percepe mai bine mirosul substanței extrase, deoarece alcoolul se evaporă și nu mai acoperă mirosul.

Gustul se verifică pe cantități mici sau în cazul preparatelor cu gust pronunțat amar sau iute arzător se face o soluție de 0,1 g în 10 ml apă ; cu această soluție se îmbibă o fâșie de hârtie de filtru de 5/50 mm și se atinge hârtia de filtru cu vârful limbii.

Culoarea a fost mai mult studiată pentru identificarea tincturilor deși variază în timp destul de mult sub acțiunea diferiților factori: calitatea produsului vegetal care a servit la preparare, gradul de mărunțire, raportul între frunze și ramuri la ierburi, procentul de rădăcini față de rizomi și modul de conservare al produsului vegetal. Lumina duce uneori la o intensificare, alteori la o scădere a intensității culorii soluțiilor extractive. Stabilirea organoleptică a culorii este destul de subiectivă, chiar în cazul când se face în condiții identice. Pentru mai multă exactitate s-a propus compararea cu etaloane de culori.[9]

Obtinerea uleiului esențial

Uleiurile esențiale reprezintă componentele uleioase volatile ale plantelor, copacilor și ierbii aromatice. Se găsesc în glande mici localizate în flori, frunze (eucalipt), rădăcini, lemn (santal) și rășini (tămâie). Uleiurile esențiale sunt extrase prin patru metode: distilarea cu vapori, expression, extracția cu sovenți și efleurage. În prima metodă uleiul este extras prin acțiunea vaporilor fierbinți și apoi condensare selectivă cu apa din care este separate.

În cea de-a doua metodă uleiul este extras prin centrifugare sau prin supunere la presiune. În cea de-a treia metoda uleiul este dizolvat într-un solvent volatil, care după evaporare va lăsa o substanță naturală de consistență asemănătoare cerii numită beton. După ce este separat de ceară, lichidul rezultat poate fi considerat forma cea mai concentrată de aromă disponibilă.

Efleurage este un proces mai lung ce presupune disoluția uleiului în grasime animală și separat din aceasta cu ajutorul alcoolului.

Uleiurile esențiale pe lângă utilizarea lor în fabricarea cosmeticelor și a parfumurilor, mai prezintă și proprietăți terapeutice.

Identificarea uleiurilor volatile

20 ml extract eteric se aduc într-un aparat adecvat și se distilă la sec. Dacă reziduul obținut are un miros plăcut, aromat, uleiul volatil se extrage cu cantități mici de alcool, prin eluții repetate. În cazul în care prin concentrarea soluțiilor alcoolice se obține un reziduu cu miros aromat, produsul vegetal analizat poate conține ulei volatil.

Confirmarea prezenței uleiului volatil

10-50 g produs vegetal uscat și mărunțit se antrenează cu vapori de apă sau se distilă cu apă într-un aparat tip Neo-Clevenger (prevăzut de farmacopee). Uleiul volatil astfel obținut poate fi caracterizat organoleptic (aspect, culoare, miros) și fizico-chimic (densitate, indice de refracție, putere rotatorie, indice de acetil).

În cazul studiului produselor vegetale cu uleiuri volatile este indicată extracția acestora și din materialul vegetal proaspăt recoltat pentru a aprecia calitatea uleiului obținut și randamentul față de cel din produsul uscat.

Pentru determinările calitative și cantitative ale constituenților acestor uleiuri se utilizează frecvent cromatografia pe strat subțire, dar mai ales cromatografia în fază gazoasă.

2.Caracterizarea fizico-chimica a uleiului eteric

Caracterizarea fizico-chimică indică: densitatea, indicele de refracție, puterea de rotație optică, indicele de acetil, indice carbonil, indice de ester.

Uleiurile eterice sunt lichide incolore sau galbene până la brune, cu densități variate, greutate specifică între 0,8-1.07, temperatura de fierbere între 150-3000C și indice de refracție între 1,45-1,60. sunt compuși insolubili în apă dar solubili în solvenți organici în deosebi în alcool atilic și în grăsimi.[10]

Determinarea indicelui carbonil- metode potențiometrice care utilizează clorura de hidroxilamoniu.

Indice carbonil al unui ulei esențial: numărul de miligrame de hidroxid de potasiu, necesare pentru a neutraliza acidul clorhidric eliberat în reacția de oximare cu clorura de hidroxilamoniu, raportat la un gram de ulei esențial.

Metoda I: Metodă de oximare la rece a aldehidelor cu clorură de hidroxilamoniu

Principiu

Transformare a compușilor carbonil în oxime prin reacția cu clorura de hidroxilamoniu. Determinarea potențiometrică a acidului clorhidric eliberat în această reacție cu soluția standard de hidroxid de potasiu.

Conținutul de compuși carbonil, exprimat în procente de masă, pentru aldehide de referință specificate, este dat de formula:

Mr x V x c

10m

în care:

Mr masa moleculară relativă a aldehidei, indicată în standardul specific al uleiului esențial

analizat;

V volumul soluției de hidroxid de potasiu folosit la titrare, în mililitri;

c concentrația exactă a soluției de hidroxid de potasiu, în moli pe litru;

m masa porțiunii de analizat, în grame.

Indicele carbonil, exprimat in miligrame de hidroxid de potasiu pe gram de ulei esențial, este dat de formula:

56,1 V x c

m

Metoda II: Metoda de oximare la cald a cetonelor cu clorură de hidroxilamoniu

Principiu

Transformare a compușilor carbonil în oxime prin reacția cu clorură de hidroxilamoniu. Determinare prin titrare cu soluție de hidroxid de potasiu a acidului clorhidric eliberat în reacție.

Se trasează curba de pH ca o funcție a volumului de hidroxid de potasiu V utilizat la titrare

pH = f (V)

[11]

Determinarea indicelui de ester înainte și după acetilare și evaluarea conținutului de alcooli liberi și alcooli totali

Acetilarea uleiului esențial cu anhidridă acetică în prezență de acetat de sodiu. Izolare și uscare a uleiului acetilat și determinarea indicelui de ester al acestuia.

Indicele de ester după acetilare este dat de formula:

E2 = 28.05 (V0-V1) (a)

m

Conținutul de alcooli liberi, exprimat în procente de masă, față de un alcool dat este dat de formula:

Mr (E2 – E1) (b)

561-0.42E2

Această formulă ia în considerare creșterea de masă a probei de analizat de-a lungul acetilării.

Conținutul de alcooli combinați, exprimat în procente de masă, față de un alcool dat, este dat de formula:

Mr x E1 (c)

561

Conținutul de alcooli totali, exprimat în procente de masă, față de un alcool dat, este obținut prin adunarea celor două procente obținute la b și c.

În formulele de mai înainte:

m masa eșantionului de analizat din uleiul acetilat, în grame;

V0 volumul de soluție de acid corhidric folosit pentru proba oarbă, în mililitri;

V1 volumul de soluție de acid corhidric folosit pentru determinarea indicelui de ester după acetilare, în mililitri;

Mr masa moleculară relativă a alcoolului folosit la exprimarea convențională a rezultatelor și care este menționată în standardul internațional al uleiului esențial de analizat;

E1 indicele de ester al uleiului înaintea acetilării calculat conform ISO 709

E2 indicele de ester al uleiului după acetilării calculat conform ISO 709 [12]

Evaluarea miscibilității cu etanol

Principiu

Adăugarea gradată la o probă de încercat, de ulei eteric, la temperatura de 200C, de etanol cu titru alcoolmetric convenabil. Evaluarea miscibilității și evantual, a opalescenței.

Miscibilitatea uleiului eteric cu etanol de titru t la temperatura de 200C, este exprimată în următorul mod.

Cazul I: 1 volum de ulei eteric în V volume de etanol de titru t.

Cazul II: 1 volum de ulei eteric in V volume de etanol de titru t, cu tulburare plecând de la V` volume de etanol de același titru.

Cazul III: 1 volum de ulei eteric in V volume de etanol de titru t, cu tulburare între V` și V„ volume de etanol de același titru, în care:

V volumul etanolului de titru t necesar pentru obținerea soluției limpede, în mililitri;

V` volumul etanolului de titru t necesar pentru obținerea tulburării, dacă are loc, care urmează după starea limpede a soluției, în mililitri;

V„ volumul etanolului cu același titru t la care dispare tulburarea dacă are loc, în mililitri.

Dacă se obține numai opalescență se indică dacă aceasta este “superioră”, “egală” sau “inferioară” celei a soluției etalon.[13]

Determinarea rotației optice

Rotația optică a unui ulei esențial, αtD unghi exprimat în miliradiani și/sau grade de unghi, pentru care rotirea planului de polarizare a unei radiații luminoase de lungime de undă 589,3 nm ±0,3 nm, corespunde radiației D a sodiului, atunci când parcurge un drum optic de 100 mm de ulei esențial, în condiții de temperatură determinate.

Rotația optică, exprimată în miliradiani și/sau grade de unghi, este dată de ecuația:

αtD= A . 100 (a)

I

În care:

A valoarea unghiului de rotație în miliradiani și/sau grade de unghi;

I lungimea tubului utilizat, în milimetri.

Se notează cu plus (+) rotațiile optice dextrogire și cu minus (-) cele levogire.

Rotația optică a unui ulei în soluție, așa-numita “rotație specifică”

Rotația specifică, exprimată în miliradiani și/sau grade de unghi, este dată de ecuația:

[α]= αtD (b)

c

αtD rotația optică a uleiului în soluție, calculată conform (a)

c concentrația soluției de ulei, în grame pe mililitru de soluție.[14]

Analiza prin cromatografie de lichide de înaltă performanță

metodă generală

Principiu

Cromatografia de lichide este o metodă de separare bazată pe fenomene de adsorbție, partiție, schimb ionic și/sau excluziune. Ea permite analiza unor cantități mici de ulei aromatic esențial sau altă materie primă pentru parfumerie, pe o coloană cromatografică umplută cu o fază staționară adecvată și în condiții corespunzătoare, identificarea posibilă a diverșilor constituenți și determinarea cantitativă a componenților specifici prin măsurarea ariei sau înălțimii picurilor respective.

Metode de determinare

1. Metoda standardului intern

Cromatograma uleiului esențial și cea a standardului intern se înregistrează în aceleași condiții de operare.

Exprimarea rezultatelor:

Concentrația compusului ce se determină, cx , exprimată în procente de masă, se calculează cu formula

AxmE x K x 100 (a)

AEmx

În care

Ax aria picului corespunzător compusului determinat, exprimată în unitățile de măsură ale integratorului;

AE aria picului corespunzător standardului intern, exprimată în unitățile de măsură ale integratorului;

mx masa uleiului esențial, exprimată în miligrame;

mE masa standardului intern, exprimată în miligrame;

K factorul de răspuns al compusului determinat, în raport cu standardul intern.

2. Metoda adaosurilor

Dacă pentru o anumită determinare nu se poate folosi metoda standardului intern, se aplică metoda adaosurilor. În acest scop, se injectează o cantitate adecvată din uleiul esențial în care X este compusul ce trebuie determinat, iar Y este un compus al cărui pic, pe cromatograma “D” obținută, se învecinează cu picul compusului X.

Apoi se prepară, prin cântărire cu o exactitate de 0,1 mg, un amestec de m g probă de analizat și mx g substanță de referință corespunzătoare compusului X ce trebuie determinat.

Se injectează o cantitate adecvată din amestecul respectiv. Se obține astfel cromatograma “E”.

Exprimarea rezultatelor:

Concentrația compusului ce se determină, cx, exprimată în procente de masă, se calculează cu formula

mR x r x 100 (r`>r) (b)

m r` -r

în care:

mR masa substanței de referință, în grame;

m masa uleiului esențial, în grame;

r =Ax

Ay

În care:

Ax aria picului corespunzător compusului X pe cromatograma “D”;

Ay aria picului corespunzător compusului Y, apropiat de X, pe cromatograma “D”;

r`=A`x

A`y

În care:

A`x aria picului corespunzător compusului X pe cromatograma “E”;

A`y aria picului corespunzător compusului Y, apropiat de X, pe cromatograma “E”;

3.Metoda standardului extern

Dacă nu este posibil a utiliza metodele descrise la punctele 1 și 2, se aplică metoda standardului extern.

Această metodă este utilizată numai dacă aparatura folosită posedă un sistem de injectare care permite injectarea unor volume identice (de exemplu valvă cu buclă calibrată).

Se prepară o serie de soluții cu concentrații crescătoare ale substanței de referință. Se injectează succesiv aceeași cantitate din fiecare dintre soluțiile respective. Se reprezintă grafic suprafețele picurilor în funție de concentrația substanțelor de referință în diverse soluții. Se obține astfel graficul care redă variația suprafeței picului substanței de referință în funcție de concentrația acesteia în soluții.

Se injectează aceeași cantitate din uleiul esențial, în care “Z” reprezintă compusul ce urmează a fi determinat. Se măsoară suprafața picului corespunzător compusului “Z”. utilizând suprafața picului “Z” și graficul trasat în prealabil, se determină concentrația corespunzătoare a compusului “Z”.[15]

Analiza prin cromatografie în fază gazoasă pe coloană umplută

Metodă generală

Principiu

Analiza prin cromatografie în fază gazoasă pe coloană umplută a unei cantități mici de ulei eteric pe o coloană cu umplutură specifică. Localizarea diferiților componenți prin măsurarea indicilor de retenție. Determinarea cantitativă a componenților specifici prin măsurarea ariei picurilor lor.[20]

III. TEUCRIUM POLIUM

1.Descriere

Denumirea populară: Închegătoare, Dâmbat, Mușețel de băut sau Sugărelul alb.[17]

Alte denumiri: Germ. Kropf-Gamander; Magh. Rozmarin gamandor; Rus. Dubrovnik belâi.

Plantă subfrutescentă, perenă, manefită, medicinală, întalnită prin locuri aride din regiunea de câmpie, coline, stepă – subzona stejarului, pajiști, coaste pietroase; Xerofită, calcicolă, subtermofită- Jud. Mehedinți, Dolj, Ialomița, Prahova, Buzău, Constanța, Tulcea, Galați, Vaslui, Neamț, Iași, Suceava, Europa de Sud, Africa de Nord, Asia de Sud-Vest.[18]

Genetic: 2n=26,52,78.

Istoric

Planta este cunoscută din antichitate. Numele plantei Teucrium este dedicat lui Teucer, regele Troiei, căruia i se atribuie descoperirea proprietăților medicinale ale acestei plante și ale altora înrudite care aparțin acestui gen. A fost folosită împotriva diareei la om și la animale. Planta cu flori se punea deasupra apei de baut. Numele de închegătoare a fost dat datorită proprietăților sala stiptice.

Ecologie

Specie subtermofitla, xerofită, slab acid-neutrofilă spre neutro-bazifilă. Are cerințe mijlocii spre mari față de căldură, răspândită între izotermele 7,5 și 10,50C. Vegetează pe soluri reavane până la reavăn-jilave, cu pH-ul 6,0-7,8.

Descrierea speciei

Rădăcina pivotantă, puternică. Tulpini subfructescente lungi de 10-40 cm, erecte sau ascendente, foarte ramificate de la bază, rotunde, alb tumentoase. Frunze sesile, alungite sau lineare, rar mai mult sau mai puțin obovate în partea superioară, cu margini revolute. Pe fața superioară des-pubescente, până la tomentoase. Pe fața inferioară, alb-tomentoase cu peri stelați.

Flori alb-gălbui sau alb-purpurii, grupate în capitule densiforme, globuloase sau alungite, solitare sau dispuse la vârful tulpinii, paniculat sau corimbiform; caliciu tubulos campanulat, alb tomentos, cu 5 dinți aproape de 3 ori mai scurți decât tubul, cel superior putin mai mare; corola puțin mai lungă decât caliciul, pe partea externă mai mult sau mai puțin mai puțin pubescentă, cu lobii ovali și obtuzi, cel median mai mare; androcen din stamine putin exserte. Înflorire:VII-VIII. Fructe: nucule brune, cu ornamentație reticulată. Plantă plăcut mirositoare.

Recoltare

Părțile aeriene înflorite (Teucrium herba) se recolteaza pe timp însorit, în jurul orei 14. Se usucă la umbră, în strat subțire.

Compoziție chimică

Conține ulei eteric, alcaloizi, picropolină și alte substanțe amare, flavone. [19]

În frunzele de Teucrium species se găsesc cantități până la 1% de harpagozidă și harpagid [20].

harpagozida R=cinamil

harpagid R=H

procumbid R=OH

Fitoterapie

Medicina populară îi acordă proprietați antidiareice si stimulante. Intervine favorabil împotriva afecțiunilor inflamatorii ale intestinului și pielii. Acționeaza ca hepatoprotector și stimulator al secreției de bilă.

Medicină umană-uz intern

Pentru tratarea de diaree, enterită, afecțiuni hepatice, infuzie din o linguriță plantă uscată și mărunțită peste care se toarnă o cană (200 ml) cu apă clocotită. Se lasă acoperită 20 min. Se strecoară. Se bea conținutul a 2-3 căni pe zi.

Uz extern. Pentru tratarea inflamațiilor de piele; infuzie din 2 lingurițe plantă uscată și mărunțită la o cană (250 ml) cu apa clocotită. Se lasă acoperită 20 min. Se strecoară. Se spală local, folosindu-se un pansament steril.

Medicină veterinară. Uz intern.

Pentru tratarea de enterită: decoct din părțile aeriene ale plantei uscate. Se fierbe 10 min. Se strecoară. Se răcește. Se administrează prin beuvaj bucal (se toarnă pe gât).

Spații dendrofloricole.

Planta se poate cultiva în parcurile și grădinile publice pentru borduri în locurile însorite aride. Decorativă prin port, frunze și mai ales florile sale mici, galbene sau purpurii dispuse în capitule rotunde sau ovale.

Înmulțire prin semințe în seră sau răsadniță.[19]

2.Proprietăți chimice ale speciei Teucrium

Compoziția chimică și diferite extracte în dietil eter, acetat de etil și n-butanol au fost analizate cu ajutorul tehnicilor HPLC și spectrofotometrie. Activitatea antioxidantă a fost evaluată folosind trei tehnici complementare în vitro: inhibarea radicalului 1,1-difenil-2-picrilhidrazil, inhibarea radicalului hidroxil și protecția sistemului model acid linoleic-β-caroten. În primele două sisteme de analize au prezentat o activitate antioxidantă puternică extractele din speciile Teucrium montanum și Teucrium Chamaedrys. În sistemul model acid linoleic-β-caroten a avut o activitate remarcabilă extractul din specia Teucrium polium.

Compușii responsabili de proprietățile antioxidante sunt flavonoidele: luteolina, diosmetina și/sau apigenină.[21]

LUTEOLINĂ

diosmetina

APIGENINĂ

Apigenina este flavonoidul responsabil de activitățile antibacteriale, antiinflamatorii, diuretice și hipotensive.

Luteolina inhibă reductanța aldozei și prezintă proprietăți antibacteriale și antiinflamatoare.

Prin administreare de Luteolină este posibil să se prevină acumularea de sorbitol și a apariției cataractei diabetice. [22]

Uleiurile esențiale din Teucrium polium conțin numeroși produși activi; prin analiză GLC-MS, TLS și prin metode spectrometrice s-au putut evidenția 10 compuși terpenoizi incluzând : hidrocarburi β-pirene, limonene, α-fenantrene, γ-și δ-cadine și alcooli: linalol, 4-terpinol, cedrol, cedrenol și guaiol.

Uleiul este bogat in alcool și lipsit de esteri. Teste farmaceutice au scos la iveală o puternică activitate antispasmodică.[23]

Speciile din Fam. Lamiaceae, din care face parte și Teucrium polium, conțin doi compuși chimici în uleiurile lor volatile, cu proprietăți antimicrobiale carvacol (isopropil-o-crezol) și timol (isopropil-crezol). Aceștia luptă împotriva bacteriilor, fungilor și a protozoarelor patogene. Se crede ca distrugerea organismelor se face începând cu distrugerea peretelui celular [24]

Flavonoidele prezente în Teucrium polium prezintă proprietăți hipogligemice. Una dintre aceste flavonoide este Quercitina ce ajută la eliberarea insulinei secretată de celulele beta din pancreas și implicit la scăderea glicemiei. S-au înregistrat și manifestări negative asupra ficatului; necrozarea celulelor acestuia a fost pusă pe seama diferenței de elemente chimice prezente în solul de pe care a fost recoltată planta.[25]