Utilitatea Examenului Microscopic In Diagnosticul Infectiilor Tractului Genital Feminin

CUPRINS

INTRODUCERE

CAPITOLUL I

MICROBIOTA VAGINALĂ

INFECȚIILE TRACTULUI GENITAL

Clasificarea infecțiilor tractului genital

Factori favorizanți

Epidemiologie

Diagnosticul etiologic al infecțiilor genitale

Diagnosticul infecțiilor genitale joase

Diagnosticul infecțiilor genitale înalte

Microorganisme strict patogene

Neisseria gonorrhoeae

Chlamydia vaginalis

Trichomonas vaginalis

Microorganisme comensale, conditionat patogene

Candida spp

1.2.6.2 Gardnerella vaginalis

1.2.7 Profilaxie

CAPITOLUL II. Evaluarea etiologiei bacteriene a infecțiilor de tract genital feminin analizate în cadrul laboratorului de analize medicale Biogenesis IVF SRL

2.1 SCOP ȘI OBIECTIVE

2.2 MATERIALE ȘI METODE

2.2.1 Recoltarea produselor patologice

2.2.2 Metode de colorare a frotiurilor

2.2.1.1. Metoda de colorare Gram

2.2.1.2. Metoda de colorare Giemsa

2.2.1.3.Interpretarea microscopica

2.3. REZULTATE ȘI DISCUȚII

CONCLUZII

Bibliografie

INTRODUCERE

Câștigarea luptei impotriva microorganismelor patogene nu este facilă, deoarece acestea au o evoluție de peste 3 milioane de ani, iar “abilitatea și diversitatea răspunsurilor la adversități este uluitoare și înspăimântătoare” (Wax și colab., 2008).

În ultimii ani asistăm la amplificarea numărului infecțiilor cu transmitere sexuală, datorate în special debutului sexual precoce și al unei slabe educații sexuale, infecții care evoluează, datorită creșterii procentului tulpinilor rezistente, spre eșec terapeutic.

Este importantă conștientizarea faptului că infecțile genitale nu sunt infecții banale, deoarece netratate pot conduce către alte morbidități ginecologice dintre care, infertilitatea, boală cu un impact negativ din punct de vedere economic, social și emoțional este pe primul loc. Datele literaturii de specialitate, susțin o creștere că numărul cazurilor de steriliate, datorate unor infecții ale tractului genital, importanța acestui aspect fiind cu atât mai mare cu cât în prezent vârsta la prima sarcină tinde să depășească 30 de ani.

Scopul lucrării de față îl constituie diagnosticarea prin metode clasice de investigare, a unor dezechilibre ale microbiotei vaginale sau a unor stări patologice, a căror incidență este maxima la vârsta reproductivă, cu implicații nu numai asupra viitorului reproductiv al femeii, ci și asupra vieții.

De aceea, examenul microbiologic rapid, în vederea depistării etiologiei infecției este foarte important și are ca obiectiv, atât orientarea biologului sau a medicului de laborator în alegerea mediilor adecvate cultivării și a condițiilor optime de cultivare necesare identificării și izolării agentului infecțios, cât și orientarea medicului ginecolog, fie în vederea alegerii unei strategii terapeutice și a unei scheme profilactice optime fie în abordarea unor investigații mai costisitoare pentru pacient. Totodată examenul microscopic este util în aprecierea efectului tratamentului și în monitorizarea recidivelor. În aceste condiții, se impune monitorizarea pacienților și corelarea rezultatelor analizelor bacteriologice cu cele clinice pentru optimizarea diagnosticului și elaborarea unor strategii de profilaxie.

Examenul microscopic al secrețiilor vaginale, alături de testul Babeș-Ppanicolaou, trebuie efectuat cel puțin anual, costituind indicatori prețioși în monitorizarea stării de sănătate în rândul populației feminine.

Lucrare este structurată în două capitole. Astfel în prima parte a lucrării am realizat o rememorare a unor noțiuni referitoare la microbiota vaginală și a principalilor agenți etiologici implicați infecțiile tractului genital feminin, iar in cea de-a doua, am efectuat un studiu propriu, referitor la frecvența anumitor agenți infecțioși la paciente cu patologie unică sau asociată.

CAPITOLUL I

MICROBIOTA VAGINALĂ

Tractul genital feminin reprezintă o cale de comunicare între cavitatea peritoneală și exterior, la nivelul căreia sunt poziționate anumite “ bariere” anatomice ce împiedică ascensiunea microbiană cum ar fi:

închiderea vulvei prin apoziția latero-laterală labiilor și a vaginului prin apoziția antero- posterioară a pereților;

prezența unui epiteliu scuamos keratinizat la nivel vulvar și nekeratinizat la nivel vaginal, dar și prezența glandelor cu secreție acidă;

prezența “dopului” mucos la nivel cervical;

descuamarea lunară a endometrului în timpul menstruației;

mișcarea ciliară de la nivelul trompelor uterine.

Cu excepția vaginului, a vulvei și a exocolului, restul tractului genital este în mod fiziologic steril.

Secreția vaginală normală este de culoare albă, fără miros și este formată din produsul de secreție a epiteliului vaginal și/sau cervical, celule epiteliale vaginale și cervicale descuamate, microbiota bacteriană normală, apă,electroliți și alți compuși chimici.

Microbiota bacteriană vaginală normală formează biocenoza vaginală, considerată un ecosistem dinamic. Condițiile de dezvoltare propice sunt reprezentate de pH vaginal normal: 3,8 – 4,2 și de temperatura normală (Dorobăț O., 2006).

Microbiota vaginală este alcătuită în special din lactobacili ( Lactobacillus crispatus, L. gasseri, L. iners or L. jensenii) care se află în echilibru cu celelalte specii bacteriene, aceștia fiind principalii gardieni ai mucoasei vaginale (Buiuc D și colab., 2009).

Lactobacilii sunt bacterii Gram pozitive, nesporulate, imobile, facultativ anaerobe, catalazo-negative, oxidazo-negative, capabile să fermenteze glicogenul depozitat în celulele epiteliului vaginal sub stimul estrogenic, determinând astfel un pH acid (3,8-4,2), care are rolul de a păstra un echilibru optim între speciile coabitante (Candida, streptococi, stafilococi, Gardnerella, neisserii nepatogene). De asemenea, lactobacilii eliberează peroxid de hidrogen, care împiedică dezvoltarea agenti microbienilor anaerobi (Dorobăț O., 2006).

Pe lângă lactobacili, în secreția vaginală normală există în număr redus, bacterii condiționat patogene care pot fi aerobe, de tipul difteroizilor, streptococilor, stafilococilor sau anaerobe sau facultative anaerobe ca peptococi, peptostreptococi, Bacteroides sp, precum și mycoplasme sau tulpini izolate de Candida.

Microbiota vaginală joacă rolul unei bariere, care pentru a fi eficientă în prevenirea colonizării cu microorganisme exogene, trebuie să mențină populațiile de microorganisme endogene la densități mici (barieră permisivă) și într-un oarecare echilibru, în special al acelora care pot deveni patogene dacă numărul lor crește excesiv (Chifiriuc C. și colab., 2011).

Colonizarea tractului inferior are loc imediat după naștere, însă compoziția microbiotei este dependentă de vârstă, de statusul hormonal și de perioadele de imunosupresie. Astfel, de la naștere și până la vârsta de 6 săptamâni, datorită estrogenilor maternali, în microbiota vaginală a fetițelor predomină lactobacili, apoi până la prepubertar si postmenopauzal, predomină microbiota de la nivelul tegumentelor stafilococi, streptococi, enterobacterii. După pubertate, în microbiota vaginală sunt preponderenți lactobacilii (Dorobăț O., 2006).

Modificarea condițiilor ecologiei vaginale (valoarea pH vaginal, temperatură, impregnare hormonală etc.) determină perturbarea echilibrului dintre speciile bacteriene coabitante și colonizarea cu agenti microbieni condiționat sau obligatoriu patogeni.

INFECȚIILE TRACTULUI GENITAL

Infecțiile genitale reprezintă cel mai frecvent motiv de prezentare la medicul ginecolog. Diagnosticul corect impreună cu tratamentul țintit și cu explicarea regulilor minime de igienă genitală și sexuală, au consecințe favorabile, în rândul tinerelor, segmentul cel mai des afectat de această patologie.

Leucoreea sau “secreția vaginală” reprezintă unul din principalele simptome ginecologice și poate fi insoțită de disurie, dispareunie, senzație de arsură vulvo-vaginală, mâncărimi sau miros neplăcut.

1.2.1 Clasificarea infecțiilor tractului genital

După modul de apariție infecțiile genitale pot fi:

primare – sunt provocate de: contactul direct cu agentul infecțios

secundare – apar fie în cadrul altor afecțiuni sau ca o consecință a acestora (fistula rectovaginală, diabet, alergii la diverse substanțe chimice sau latex), fie in urma unor proceduri traumatice (corpi străini, manevre chirurgicale, D.I.U. etc), sau sunt o consecința a atrofiei care apare în postmenopauză ca o urmare a scăderii estrogenilor.

În funcție de agenții etiologici implicați, infecțiile genitale sunt :

bacteriene – provocate de: Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus vaginalis, Staphylococcus aureus, Streptococcus spp, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Gardnerella vaginalis, E. coli, Chlamydia trachomatis

micotice – Candida sp.- reprezintă 30-35% dintre infecțiile vaginale

virale – Papillomavirus, Herpes virus

parazitare – Trichomonas vaginalis – reprezintă 5-10% din infecțiile vaginale

După sursa de infecție, infecțiile tractului genital pot fi:

endogene – produse de microorganisme comensale condiționat patogene, în condițiile unui dezechilibru al microbiotei microbiene ex. Candida albicans, Gardnerella vaginalis, Mobiluncus sp, Staphylococcus aureus, Streptococcus spp, Enterobacteriaceae.

exogene – produse de agenți microbieni strict patogeni contactați:

în urma contactului sexual cu o persoană infectată;

în condițiile unei imunități scăzute ce insoțește sarcina, nașterea, lăuzia sau avortul spontan;

datorită lipsei condițiilor de asepsie în explorări sau manevre chirurgicale ca histerosalpingografia, instilații utero-tubare, avort provocat, etc.

În funcție de segmentul tractului genital afectat, infecțiile genitale se clasifică în:

infecții genitale joase

vulvite, vaginite, vulvovaginite – pot fi specifice, de natură bacteriană, micotică, parazitară,virală sau nespecifice, produse prin multiplicarea microbiotei vaginale normale. Vaginoza bacteriană, consta în dezvoltarea anormală a microbiotei comensale, condiționat patogene, predominant anaerobe din vagin (specii de Bacteroides sp., Peptostreptococcus, Prevotella, Gardenella vaginalis și Mobiluncus sp.) în detrimentul lactobacililor;

bartholinite, skeenite – pot fi determinate de N.gonorrhoeae, C. trachomatis sau prin exacerbarea microbiotei genitale. Blocarea canalului glandular datorită inflamației, poate determina un abces din care se pot izola agenti microbieni aerobi si anaerobi;

cervicite – exocolul poate fi afectat de T. vaginalis, C. albicans în cervico-vaginite; Papillomavirus, implicat în etiologia neoplaziilor cervicale intraepiteliale; Herpes simplex tip 2 ce evolueaza cu leziuni ulcerative endo si exocervicale. Epiteliul columnar al endocolului posedă tropism pentru N. gonorrhoeae, C. trachomatis, Mycoplasma homins și Ureaplasma urealyticum, considerați agenți patogeni ai endocervicitelor. Datorita evoluției silențioase a acestor infecții, cervicita se poate complica spre boală inflamatorie pelvină cu sechelele bine cunoscute ca infertilitatea, sarcina ectopică și sindromul algic pelvin (Rusu M., 2006).

infecții genitale înalte

endometrite, salpingite, ovarite, salpingo-ovarite, parametrite, abcesul tubo-ovarian ,peritonita –apar ca și complicații ale infecțiilor genitale joase.

boala inflamatorie pelvină reprezintă infecția și inflamația organelor tractului genital feminin superior (uter, trompe uterine, ovar) și este fie consecința unei infecții de tract genital inferior, incorect tratată, fie a instrumentării cavitații uterine în condiții improprii de asepsie. Se apreciază că ~ 60% din toate cazurile de boală inflamatorie pelvină se datorează C.trachomatis, N.gonorrhoeae, M.hominis și U. urealyticum. Boala inflamatorie pelvină apare frecvent la femeile < 35 ani și reprezină una din cauzele majore de morbiditate ginecologică, cum ar fi infertilitatea, sarcina ectopică și durerea cronică pelvină (Beers M.H. și colab., 2002).

În funcție de numărul agenților etiologici implicați sunt:

monofactoriale – determinateromul algic pelvin (Rusu M., 2006).

infecții genitale înalte

endometrite, salpingite, ovarite, salpingo-ovarite, parametrite, abcesul tubo-ovarian ,peritonita –apar ca și complicații ale infecțiilor genitale joase.

boala inflamatorie pelvină reprezintă infecția și inflamația organelor tractului genital feminin superior (uter, trompe uterine, ovar) și este fie consecința unei infecții de tract genital inferior, incorect tratată, fie a instrumentării cavitații uterine în condiții improprii de asepsie. Se apreciază că ~ 60% din toate cazurile de boală inflamatorie pelvină se datorează C.trachomatis, N.gonorrhoeae, M.hominis și U. urealyticum. Boala inflamatorie pelvină apare frecvent la femeile < 35 ani și reprezină una din cauzele majore de morbiditate ginecologică, cum ar fi infertilitatea, sarcina ectopică și durerea cronică pelvină (Beers M.H. și colab., 2002).

În funcție de numărul agenților etiologici implicați sunt:

monofactoriale – determinate de un singur agent etiologic;

plurifactoriale – determinate de un cumul de factori;

După simptomatologie pot fi:

simptomatice – caracterizate prin simptome locale ca: leucorea (caracterul acesteia diferă în funcție de agentul etiologic), senzația de arsură, dispereunia, pruritul, însoțite sau nu și de manifestări urinare ca disuria, polachiuria. În formele complicate, diseminate apar și durerea, febra, frisonul, alterarea stării generale.

asimptomatice – simptomele lipsesc, dar indivizii sunt purtători.

După evoluție se clasifică în :

acute – tabloul clinic este caracteristic

cronice – tabloul clinic are simptomatologie ștearsă, apar de obicei datorită rezistenței la antibiotice.

1.2.2. Factori favorizanți

Contactul cu patogenii nu provoacă imediat o infecție în organism, totul depinde de răspunsul imun gazdei, de cantitatea microorganismelor inoculate, de capacitatea lor de virulență și de rezistența lor la antibiotice (Custodio H., 2013).

Efectul de bariera al microbiotei vaginale este influentat de o serie de factori:

vârsta femeii – incidența cea mai mare a infecțiilor vaginale este întalnită la grupa cu vârsta cuprinsă între 20-40 ani.

contactul sexual neprotejat – boli cu transmitere sexuală

debutul precoce al vieții sexuale

parteneri sexuali multiplii

toaleta vaginală excesivă – determina dezechilibrul microbiotei vaginale și favorizează inmulțirea agenti microbienilor oportuniști.

igiena precară

contracepția orală- prin aportul necorespunzător de estrogeni sau cea locală (spermicide), prin modificarea Ph-ului vaginal.

folosirea nerațională a antibioticelor- favorizează colpitele micotice

sistemul imunitar – scăderea imunității în sarcină favorizează în special colpitele, al căror tratament se impune, datorită riscului de corio-amniotită, rupere prematură de membrane și naștere prematură.

bolile cronice – diabetul (favorizează colpita micotică), infecția cu HIV( favorizează infecțiile genitale datorită imunosupresiei)

folosirea instrumentarului nesteril în diverse intervenții asupra tractului genital

statusul hormonal – în postmenopauză și la femeile castrate chimic sau chirurgical, datorită scăderii rolului protector al estrogenilor.

malnutriția, carențele vitaminice în special ale vitaminei E

stresul

1.2.3. Epidemiologie

Vulvo-vaginita cu T.vaginalis are o incidența de 20-25%. Poate evolua în asociere cu alte infecții transmise pe cale sexuala.

Vaginita nespecifică (vaginoza) reprezintă reprezintă 60% dintre infecțiile vulvo-vaginale și este un sindrom infecțios neinflamator determinat de inlocuitea lactobacililor de catre microbiota comensală, condiționat patogenă. G. vaginalis care inițial a fost considerat singurul agent etiologic, este specia cea mai constant intâlnită. Desi infecția evoluează cu precădare în perioada de activitate sexuală, ea poate aparea și la adolescente și preadolescente. Nefiind determinată de un agent patogen exogen, nu este considerată boală cu transmitere sexuala (Buiuc D și colab., 2009).

Vulvo-vaginita candidozică este frecventă la femeile aflate în perioada maturității sexuale și rară prepubertar și postmenopauză, datorită absenței hormonilor ovarieni. S-a constatat că 15-20% dintre femei au mucoasa vaginală colonizată cu specii de Candida, iar frecvența speciilor intâlnite este C. albicans -79,1%, C. glabrata 9,3%, C. parapsilosis 6,97% și C.tropicalis 4,7% (Sudbery P.E. și colab, 2011).

Staphylococcus aureus, întâlnit la 5-10% dintre femeile sănătoase are poate cauza scurgeri purulente și șoc toxic în condițiile utilizarii tampoanelor intravaginale în perioada menstruală. La fetițe sunt posibile vulvovaginite cu N. gonorrhoeae, C. trachomatis sau Streptococcus pyogenes (Grigoriu C., 2005).

Chlamydia trachomatis este un microorganism cu implicații majore în infertilitate, iar incidența reală a acestei boli nu poate fi apreciată datorită faptului că evoluția este cel mai frecvent asimptomatică. OMS apreciază aproximativ 100 de milioane de noi cazuri anual. La noi în țară, în anul 2012 au fost raportate un numar de 57 cazuri de infectie cu Chlamydia, reprezentând o incidență de 0.26 %000 (CNSCBT, 2012).

Este important de remarcat faptul că în ultimul deceniu, în Romania, incidența pentru cazurile de sifilis este în continuă scădere, dar ramâne totuși una din cele mai ridicate din țările din UE. În anul 2012, pentru cazurile de sifilis s-a inregistrat o incidență de 7,97%000 față de 10,34%000 în 2011(CNSCBT, 2012).

Incidența infecției gonococice în România în ultimii 10 ani are o tendința descrescatoare, astfel că în anul 2012 a fost de 1.47%000 in scadere cu 61% față de incidența anului 2011. (CNSCBT, 2012)

1.2.3. Diagnosticul etiologic al infecțiilor genitale

Pentru stabilirea etiologiei se corelează aspectele clinice cu datele obținute în laborator. Deoarece lucrarea de față se referă doar la utilitatea examenul microscopic, voi ține cont în continuare de acest aspect, dar și de incidența crescută a unor agenți patogeni.

1.2.3.1. Diagnosticul infecțiilor genitale joase

Investigația microscopică a prelevatelor de la nivelul leziunilor vulvare, urmărește în primul rând stabilirea etiologiei luetice. Produsul patologic se analizează în microscopie cu fond întunecat, unde Treponema pallidum poate fi recunoscut după mobilitate și aspectul morfologic caracteristic. Se confirmă prin serologie sau prin imunofluorescență directă. Datorită incidenței reduse a acestui agent etiologic, nu va fi dezbătut pe larg în capitolele ulterioare.

La nivel vulvar se mai întâlnesc leziuni produse de virusuri ca Herpes virus și Papillomavirus, care însă nu sunt identificabili în frotiu, dar și leziuni datorate infecției cu Candida.

Pentru diagnosticul vaginitelor se pot efectua următoarele teste:

determinarea pH-ului secreției vaginale. Este un indicator indirect, când este mai mare de 5, indică o infecție cu T. vaginalis sau vaginoză cu Gardnerella vaginalis;

testul aminelor volatile Whiff – se realizează cu KOH 10%, care determină degajarea unui miros dezagreabil în caz de vaginoză cu anaerobi sau infecție cu T. vaginalis;

pentru analiza microscopică se recoltează secreție vaginală care se etalează pe 2 lame ce se colorează Gram și permite aprecierea microbiotei vaginale și Giemsa pentru aprecierea reacției inflamatorii. Comportarea diferită a bacteriilor la colorația Gram este dependentă de structura peretelui celular. Bacteriile Gram pozitive apar colorate în albastru – violet, datorită violetului de gențiana care reacționează cu componenții acizi din citoplasmă și formează un complex stabil după tratarea cu Lugol, în timp ce bacteriile Gram negative apar decolorate deoarece nu formează acest complex stabil și necesită recolorare cu fucsina bazică sau roșu neutru, astfel încât în final apar colorate în roz până la roșu. Cea de-a treia categorie, bacteriile Gram variabile sunt cele cu perete Gram pozitiv, care în anumite condiții se colorează Gram negativ (Buiuc D și colab., 2009).

În cazul unei microbiote vaginale normale, pe frotiul colorat Gram se vor observa lactobacili care sunt Gram pozitivi, drepți sau ușor incurbați, dispuși izolat în diplo sau lanțuri scurte.

În vaginoze, lactobacilii sunt substituiți de bacili Gram variabili ca Gardnerella vaginalis sau bacili Gram negativi și bacili ca Mobiluncus sp.Totodată se observă și prezența celulelor epiteliale cu numeroși bacili prezenți pe suprafața, celule numite  “clue cells”.

În micozele vaginale pe frotiul colorat Gram se pot idenifica celule levurice și pseudomicelii colorate Gram pozitiv. Pentru identificare și izolare se cultiva pe mediu Saboureau.

Streptococii și stafilococii apar colorați Gram pozitiv, streptococii grupați în lanțuri, iar stafilococii grupați in ciorchine, diferențierea se realizează prin teste biochimice (stafilococii sunt catalazo – pozitivi) și însămânțare pe geloză –sânge. La fetițe, se urmărește în special diagnosticarea vulvo-vaginitelor cu S. pyogenes, iar la gravide Streptococul de grup B, in ultimul trimestru de sarcină (Buiuc D și colab., 2009).

Enterobacteriaceele sunt Gram negative, iar identificarea speciei se face prin teste biochimice și insămânțări pe medii special (mediu lactozat).

Trichomonas vaginalis se poate observa pe frotiul colorat Gram, dar este indicat ca în cazul suspiciunii unei infecții cu acest parazit, examinarea să se efectueze pe un preparat nativ.

Colorația Giemsa permite aprecierea reacției inflamatorii (citoplasma PMN apare roz, a limfocitelor și macrofagelor albastră). Reacția inflamatorie este intensă in cazul infecției cu T.vaginalis, discretă în candidoză și absentă în vaginoză. Colorația evidențiează gonococii, prezenți în special intraleucocitar, grupați în diplo, sub forma boabelor de cafea, dar și incluziunile de C. trachomatis situate în intracelular în celulele epiteliale, de culoare albastră- corpii reticulați sau roșie-corpii elementari. Diagnosticul infecției clamidiene prin intermediul colorației Giemsa decelează aproximativ 15% din infecțiile confirmate prin alte metode. Pentru stabilirea diagnosticului de infecție cu C. trachomatis se preferă imunofluorescența directă sau detectarea anticorpilor specifici, iar pentru cea cu gonococ se preferă însămânțarea pe geloză-chocolat (Forbes B.A și colab, 2002).

Investigația microscopică a prelevatelor de la nivelul colului, urmărește depistarea gonococului, a C. trachomatis, prin metodele descrise anterior, dar și a Streptococcus agalactiae la femeile gravide în ultimul trimestru de sarcină. Pentru depistarea Mycoplasma hominis și Ureaplasma urealyticum se efectuează însămânțarea pe medii îmbogățite cu ser bovin (Buiuc D. și colab., 2009).

În bartholinite se urmărește în special prezența N. gonorrhoeae. În cazul unei colecții purulente se suspicionează infecția cu C. trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis sau anaerobi.

1.2.3.2. Diagnosticul infecțiilor genitale înalte

Formele severe ale infecțiilor genitale înalte apar post-partum sau post –abortum, în ruptură prelungită de membrane și operații în sfera genitală. Etiologia lor este variată, fiind implicate bacterii ca: Streptococ grup B, Enterococi, Enterobacteriaceae, Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis, Clostridium perfringens (în avort septic provocat), Streptococcus pyogenes etc. Probele prelevate se examinează la microscop pe frotiuri colorate Gram și Giemsa și se însămânțează pe agar Columbia cu 5% sange de berbec (o placă pentru incubare aerobă și una pentru incubare anaerobă) și agar Mac Conkey (Forbes B.A și colab, 2002).

Datorită faptului că în 10 – 20% din cazuri, infectiile acute acute pot evolua cu bacteriemie,se efectuează și hemoculturi pe medii aerobe și anaerobe.

Formele cronice pot fi determinate de infecții cu C. trachomatis sau Mycobacterium tuberculosis (pe cale hematogenă).

Pentru diagnosticul bacteriologic al tuberculozei genitale se recoltează sânge menstrual sau mucoasă uterină chiuretată în perioada premenstruală.

1.2.4. Microorganisme strict patogene

1.2.4.1. Neisseria gonorrhoeae

Este un coc gram negativ, aerob, patogen, care este încadrat în Beta Proteobacteria, familia Neisseriaceae, genul Neisseria.

Este patogent exclusiv uman, calitate demonstată de capacitatea de preluare a Fe , doar din transferina și lactoferina de origine umană.

Are dimensiuni reduse de până la 1micrometru și este grupat în perechi – diplococi, având aspectul asemănător unor boabe de cafea.

Figura 1. Aspectul celulei de Neisseria gonorrhoeae (www.textbookofbacteriology.net) (imagine de microscopie electronica de scanning)

Este o bacterie foarte sensibilă la schimbări de temperatură, lumină și uscăciune, radiații ionizante, motiv pentru care este necesară însămânțarea imediat după recoltare (Kenneth Todar,2004).

Având necesități nutritive mari, pentru cultivare se folosesc medii îmbogațite cu sânge, hemoglobină, NAD, extract de levuri, cum ar fi: Geloză-chocolat, Peizer–Steffen (mediu cu hemoglobină și cisteină), Thayer-Martin (agar Mueller- Hinton îmbogațit cu sânge ovin și antibiotice), mediul HYL (selectiv prin colimicină, vancomicină).

Se cultivă în atmosferă de 3-10 % CO2 și la temperaturi de 35-36ºC, temperatura fiind un criteriu de diferențiere față de neisseriile saprofite. Formează colonii cu dimensiuni de 0,5-1 mm, nepigmentate, opace sau transparente, roz- gri, la 24-48 ore de la însămânțare. Gonococii izolati din probele clinice sunt piliati. Prin cultivare pe medii neselective, formeaza colonii mai mari, iar celulele își pierd pilii (Chifiriuc C. și colab., 2011).

Metabolizează glucoza și produce acidifierea mediului, fără producție de gaz. Principalul test biochimic de identificare este reacția oxidazei,care este intotdeauna pozitivă (Chifiriuc C. și colab., 2011).

Caracterul gram negativ este dat de membrana bogată în proteine, fosfolipide și lipopolizaharide, acestea din urmă, având o structură particulară, fiind de fapt lipooligozaharide (LOS) alcătuite din oligozaharidul regiunii intermediare și lipidul A. Unicitatea LOS se datorează structurii oligozaharidice bazale ramificate și absenței subunitaților antigenice repetitive O (Todar K., 2004).

Deși nu produce exotoxine, Neisseria gonorrhoeae prezintă factori de virulentă, majoritatea asociați peretelui celular.

Un prim factor de virulența este reprezentat proteina fimbrială PilE, care prezintă un rol major în atașarea bacteriei la celulele epiteliului gazdă (Fix D., 2007).

Alti factori de virulență sunt proteinele membranare P.II (Opa), prin intermediul cărora se realizează atât legătura între proteina unei bacterii și lipooligozaharihul bacteriei adiacente, dar și invazia celulelor epiteliale. Aceaste proteine cu rol de adezine, suferă fenomenul de variație de fază, astfel încât în diferite momente, bacteria poate exprima sau nu una sau mai multe proteine Opa(Kenneth Todar, 2004).

O altă proteină membranară cu rol în virulența este P.I. (Por), care mediază patrunderea bacteriei în celula epitelială, inhibă formarea fagolizozomilor și permite supraviețuierea gonococilor în interiorul fagocitelor (Chifiriuc C. și colab., 2011).

Fiecare tulpina de N . gonorrhoeae exprimă un singur tip de proteină Por, care însă poate suferi variație de fază.

Lipooligozaharidele (LOS) sunt factorii de virulentă cu rol în inițierea reacției inflamatorii, prin: activarea complementului, atracția fagocitară, liza fagocitelor și inducerea producției TNF. În plus, se leagă de acidul sialic din ser, determinând formarea unor microcapsule de LOS sializate, care asigură supraviețuirea extracelulară, acestea nefiind recunoscute și distruse de sistemul imunitar al gazdei. Acest mecanism al evaziunii sistemului imunitar se numește mimetism molecular (Chifiriuc C. și colab., 2011).

Bacteria fie poate exprima mai multe tipuri antigenice de LOS, fie poate altera prin mecanisme necunoscute tipul de LOS pe care-l exprimă.

Proteina P.III (Rmp) este tot o proteină membranară, care nu suferă fenomenul de variație de fază și are rol în blocarea anticorpilor anti P.I și LOS. Astfel, în mod obișnuit, ea este recunoscută de către sistemul imunitar, are loc formarea de anticorpi anti P.III, însă reacția antigen – anticorp are ca efect blocarea anticorpilor anti LOS și anti P.I și protecția bacteriei de liza mediată de către complement (Todar K., 2004).

La nivelul membranei se mai află doi receptori pentru transferina umană a Tbp1 și Tbp2 și un receptor de lactoferină umană, care sunt exprimați în cursul creșterii și care conferă bacteriei capacitatea de a sustrage fierul de la gazda (Todar K., 2004).

Mecanismul patogenic implică intr-o primă etapă, atașarea bacteriei prin intermediul pililor și proteinelor Opa, de celulele neciliate ale epiteliului columnar al gazdei. Apoi, prin endocitoză are loc pătrunderea bacteriilor intracelular, sub formă de fagozomi, urmată de multiplicare și transport până la baza celulei, de unde bacteriile sunt eliberate prin exocitoză în țesutul subepitelial (Todar K., 2004).

Infecțiile gonococice repetate sunt favorizate de procesul de variație antigenică de fază, suferit de antigenele de suprafață (pilina, LOS și Opa), care fac ca bacteria să nu fie depistată de sistemele de apărare ale gazdei (Chifiriuc C. și colab., 2011).

Indivizii cu deficiențe ale complementului moștenite, sunt candidați perfecți pentru episoadele de recurență sau generalizare a infecției.

Este cunoscut faptul că nu orice persoană se infectează. Acest fapt se datorează pe de-o parte variațiilor date de mărimea și virulența inoculului, iar pe de alte parte rezistenței naturale (pH urinar , concentrația în uree a urinii, pH vaginal, etapa ciclului menstrual,) și imunității.

Un rol important în scăderea riscului de infecție cu gonococ îl are microbiota vaginală. Ultimele studii arată că lactobacilii, inhibă aderența gonococului la epiteliu, prin intermediul a două proteine cu rol de biosurfactant, enolaza și gliceraldehid -3- fosfat dehidrogenaza, ușurând astfel indepărtarea bacteriei prin intermediul mucusului (Spurbeck R. și colab., 2010). .

Infecția gonococică este o boală cu transmitere sexuală, care afectează ambele sexe, de obicei limitată la mucoasele tapetate cu epiteliu columnar ca epiteliul uretral, cervical, rectal, faringian și conjunctival. Epiteliul pavimentos stratificat ce tapetează vaginul, nu este susceptibil la infecția cu N. gonorrhoeae, însă în literatură sunt citate cazuri de infecție la adolescente, datorate insuficientei keratinizari, influențată de nivelul estrogenic scăzut.

Perioada de incubație este de 2- 3 zile. Din punct de vedere clinic boala evoluează simptomatic la barbați în 95% din cazuri și se manifestă ca o uretrită, insoțită de secreții purulente, edem, indurație, hiperemie, senzație de arsură, disurie. Netratată, boala poate evolua către orhită, epididimită, prostatită (Onofriescu M., 2002).

La femei boala poate evolua fie asimptomatic în 80% din cazuri, fie simptomatic, cu manifestări de uretrită și endocervicită, caracterizate prin leucoree abundentă, senzație de arsură și disurie. În lipsa tratamentului de specialitate, boala poate evolua către salpingită, ovarită, boală inflamatorie pelvină. Datorita afectarii gonadelor, în 15% din cazuri se poate instala infertilitatea (Onofriescu M., 2002).

La nou născuți, infectarea se produce în timpul nașterii, afectarea fiind oftalmică (ophthalmia neonatorum) și poate evolua către desprinderea corneei și orbire (Chifiriuc și colab. 2011).

În literatura de specialitate sunt citate cazuri de bacteriemie cu Neisseria gonorrhoeae, datorate pătrunderii bacteriei în circulația sangvină, care pot conduce către infecții bacteriene diseminate, care cuprind sindromul dermatită-artrită, endocardita și meningita (Chifiriuc C. și colab. 2011) Bacteriemiile sunt agravate de liza celulelor bacteriene și eliberarea lipopolizaharidelor solubile (Todar K., 2004).

Diagnosticul de laborator se stabilește prin analiza microscopică a frotiului colorat Giemsa din secreție vaginală, izolarea, identificarea pe medii de cultură și testarea sensibilității la antibiotice.

Figura 2. Diplococi Gram negativi localizați în interiorul neutrofilelor (www. Microbelibrary)

Tratamentul de elecție este reprezentat de cefalosporine de generația a III a sau fluorochinolone și se aplică inclusiv partenerilor sexuali asimptomatici.

În S.U.A., infectia gonococică, are o incidență crescută, fiind raportate >300.000 cazuri în 2011. În Europa, incidenta este mai scazuta, intre 1-25%000.

1.2.4.2. Chlamydia trachomatis

Chlamidiile sunt bacterii gram negative, obligat parazite, cu localizare intracelulară. Depind energetic de gazdă, dar posedă echipamentul enzimatic necesar pentru glicoliză, respiratie si biosinteza pentozelor.

Pentru sinteza de ADN, ARN si proteine folosesc precursori elaborați de gazdă(nucleotide, aminoacizi, vitamine, etc).

Ciclul de dezvoltare este bifazic si constă în alternarea a două tipuri celulare:

– corpul elementar are, mici dimensiuni, inactiv metabolic și caracterizează faza extracelulară a ciclului replicativ. Prezintă un nucleoid cu localizare centrală, ribozomi și un perete celular lipsit de peptidoglican, a cărui rigiditate e asigurată de legături S-S numeroase ( proteina majora MOMP,alte proteine bogate in cisteina). Cantitatea ADN/ARN este echilibrata (Becker Y, 1996).

-corpul reticulat – este forma intracelulară, cu dimensiuni mai mari și activitate metabolică. Nu supraviețuiește extracelular și nu poate infecta noi celule. Peretele celular este mai putin rigid, datorită alterării structurii membranei externe, prin clivarea legaturilor S-S. Nucleoidul nu este vizibil, iar cantitatea de ADN este de 4 ori mai mare decât în corpusculul elementar. Este structura în care are loc transcrierea, sinteza proteică și replicarea ADN. Se divide prin fisiune binară (Chifiriuc C. și colab. 2011).

Figura 3. Corpi reticulați situați intracelular (www. Microbelibrary)

Patogenitatea chlamidiilor se manifestă prin virulență (posedă viscerotropism, având afinitate pentru endoteliul vascular, țesutul pulmonar, ganglionii limfatici și mucoasa conjuctivală și genitală) și toxinogeneză (realizată printr-un compus endotoxin-like, termolabil, ce determină leziuni hemoragice cu hemoconcentrație și chiar șoc) (Buiuc D. și colab., 2009).

Mecanismele patogenice ale chlamidiilor sunt incomplet elucidate. Reacția inflamatorie este declanșată de un lipopolizaharid de membrana (LPS), care determină eliberarea interleukinei Il-1 (alfa si beta).

Ciclul de dezvoltare este bifazic si constă in alternarea celor două tipuri celulare. Forma infecțioasă reprezentată de corpul elementar, se fixează pe membrana celulei ținta și interactionează cu receptori specifici. Pătrunderea în celulă se realizează prin înglobarea într-o veziculă de fagocitoză. Chlamidiile rămân sechestrate în vacuolă pe tot parcursul ciclului celular, fuziunea acesteia cu lizozomii fiind inhibată prin mecanisme necunoscute.

Imediat după pătrunderea în celula gazdă sunt activate enzimele necesare sintezei de ADN,ARN,precum și cele necesare catabolismului glucozei.

La aproximativ 2 ore postinfecție, nucleoidul corpului elementar nu mai este vizibil.Corpul elementar devine activ metabolic. Începe dezorganizarea peretui celular. La aproximativ 15 ore de la infectare, se atinge maximul sintezei de ARN, urmată de convertirea corpului elementar în corp reticulat, care începe să se dividă prin fisiune binară. La 20 de ore de la infecție, are loc mărirea în dimensiuni a endosomului care devine vizibil în citoplasma celulei gazdă (incluzie chlamidiană).Începe sinteza de glicogen, care durează în medie 10 ore. La 30 de ore postinfecție are loc reorganizarea corpului reticulat și formarea corpilor elementari.Ciclul de dezvoltare se finalizează cu liza celulei sau exocitarea corpilor infecțiosi (Forbes B.A., 2007).

În celulele gazdă deficiente în substanțe nutritive, în special in izoleucină, chlamidiile intra într-o stare latenta, neinfecțioasă, dar reversibilă(forma aberantă). Aceasta stare este asociată cu persistența (cronicizarea) infecției. Eliminarea factorilor determinanți ai persistentei determina reluarea creșterii active. Reactivarea infecției in vivo se produce în condiții de imunosupresie .

Chlamydia trachomatis include urmatoarele biovaruri:

Ab, B, Ba, si C – produc trachoma – este o keratoconjunctivită cronică care progresează către orbire.

serovarurile D-K – se transmit prin contact sexual și produc la barbați uretrite, epididimite, prostatite și infertilitate, iar la femei uretrite, vaginite, cervicite, salpingo-ovarite, boala inflamatorie pelvină, avorturi spontane, naștere prematură și infertilitate. Infecția chlamidiană reprezintă un factor favorizant pentru apariția sarcinii ectopice. În majoritatea cazurilor infecția este asimptomatică.

serovarurile L1, L2 si L3 – produc limfogranuloma venerum manifestata prin febra, inflamatia limfonodurilor, ulceratii genitale.

Diagnosticul de laborator se realizează prin:

– metode directe ce constau în: vizualizarea microscopică a incluziilor clamidiene direct din frotiu sau prin cultivare pe fibroblaste de șoarece (Mc Coy) sau celule maligne (linia celulara HeLa 229) și colorare Giemsa modificată cu iod, detectarea antigenelor clamidiale prin imunofluorescenta directa sau ELISA, detectarea acizilor nucleici prin PCR si hibridizare .Dintre acesteteste, ultimul are sensibilitatea cea mai mare.

– metode indirecte presupun detectarea anticorpilor specifici IgM(infectia acuta), IgA si IgG(infectia cronica)

Tratamentul constă în administrarea de antibiotice macrolide (eritromicina, azitromicina, claritromicina, josamicina), tetracicline (doxiciclina, tetraciclina) timp de 10-14 zile. Deși chlamidiile nu conțin peptidoglican, tratamentul cu antibiotice betalactamice(penicilina, ampicilina), nu influențează diferențierea corpilor elementari în corpi reticulați, dar inhibă diviziunea, contribuind astfel la cronicizarea infecției (Onofriescu M., 2002).

Riscul de infertilitate de cauză tubară dupa salpingită chlamidiană este de 15-20%. La adolescenți rata reinfecției este 10-30% (Veldhuijzen și colab., 2005; LaMontagne și colab., 2007).

1.2.4.4. Trichomonas vaginalis

Trichomonas vaginalis este un parazit al tractului genito-urinar, care afectează ambele sexe, cu o largă răspândire datorată modului de transmitere venerian.

Este un protozoar unicelular flagelat, facultativ anaerob, cu proprietate de fagocitoză, încadrat în regnul Protista, clasa Parabasalia, ordinul Trichomonadida.

Figura 4. Aspectul morphologic al trofozoitilor de Trichomonas vaginalis pe frotiu colorat Gram (www.studyblue.com)

Parazitul este întâlnit sub 3 forme:

trofozoitul- celula piriformă, flagelată, ce reprezintă forma infectantă. Are un complex chinetosomal situat anterior din care pornesc 3-5 flageli egali în dimensiune, un flagel recurent parțial fixat pe marginea membranei ondulante și un axostil care strabate logitudinal parazitul și care are rol de susținere ( Hobbs MM, 2008).

forma ameoboidă – apare dupa contactul parazitului cu celulele epiteliale umane

pseudochistul- este forma de rezistența a parazitului în condiții nefavorabile (Pereira-Neves A, 2003).

Metabolismul energetic se desfașoară în hidrogenozomi și implică transformarea piruvatului în lactat.

Se multiplică la temperaturi de 35-37 ºC. Forma și dimensiunile parazitului sunt dependente de valoarea pH-ului, astfel că exemplarele mici și mobile întâlnite în formele simptomatice ale bolii apar la un pH optim de 5.5-5.8, iar exemplarele mari și mai puțin mobile ce se intâlnesc în formele asimptomatice, apar la valori ale pH mai mici de 4,9 sau mai mari de 6.5 (Ryan CM,2011).

Patogenitatea se manifestă numai prin contactul direct al parazitului cu celulele epiteliului vaginal, cervical sau uretral. Parazitul aderă la celulele epiteliale prin intermediul adezinelor, dintre care cele mai importante sunt lipoglicanii, iar cu ajutorul cisteinproteinazelor, își manifestă activitatea proteolitică, activitate care va culmina cu degenerarea și descuamarea epiteliului vaginal (Hirt RP., 2013).

Patogenia parazitului implică interacțiuni directe și indirect între epiteliul gazdă, bacteria și virusuri (Ryan C.M., 2011).

Față de agresiunea parazitară, organismul răspunde printr-un infiltrat inflamator, caracterizat prin prezența PMN și a a exudatului. Totodată a fost demonstrată prezența în secreția vaginală a anticorpilor IgA , nivelul crescut al acestora fiind corelat cu încarcarea parazitară scazută.

Apariția vaginitei cu T. vaginalis este influențată de variațiile de virulență ale tulpinilor, de scăderea pH vaginal și implicit a lactobacililor, de sarcina sau menstruație.

Parazitul afectează la femei vaginul, uretra, rar cervixul și glandele Bartholin , iar la bărbat uretra și rar prostata. Manifestările clinice apar la câteva zile post-infecție și variază de la starea de purtator asimptomatică până la vaginite și uretrite severe (Onofriescu M., 2002).

Simptomatologia constă în prurit vulvar și secreție vaginală spumoasă, de culoare galben verzuie, exacerbate postmenstrual, dispareunie, insoțite sau nu de disurie, polakiurie. În cazuri severe se constată limfadenopatie, endometrită, salpingită trichomoniazică (Onofriescu M, 2002). Netratată, infecția se cronicizeză, simptomatologia scade în intensitate sau devine intermitentă.

Diagnosticul de laborator se bazează pe identificarea parazitului în secretia vaginală sau uretrală, prin examinarea frotiului proaspat sau colorat Giemsa, immunodiagnostic și cultivare.

Recoltarea se efectuează in primele zile postmenstrual, când parazitul este în faza maximă de multiplicare. În preparatele native se recomandă fie examinarea în contrast de fază, când flagelii devin clar vizibili, fie adaugarea unor coloranți ca safranina, care face ca paraziții vii să rămană necolorați.

În frotiurile colorate Giemsa, citoplasma se colorează albastru pal, nucleul în roșu violet, flagelii și axostilul în roșu carmin. Șansa de evidențiere a parazitului în frotiu este mai mare pentru formele simptomatice.

Tratamentul constă în administrarea derivaților de imidazol, atât oral cât și vaginal.Se trateaza toți partenerii sexuali recenți, indiferent de simptomatologie.

Incidența maximă a infecției este între 16-35 ani. În țara noastră, prevalența este de 20-25%.

1.2.5. Microorganisme comensale, conditionat patogene

1.2.5.1. Candida sp.

Candida este o ascomicetă ce aparține familiei Saccharomycetaceae care face parte din microbiota normală a tractului gastrointestinal, a tegumentelor și mucoaselor, dar poate deveni patogenă în anumite condiții favorizante. În mod normal, colonizarea are loc imediat după naștere.

La nivelul tractului genitor-urinar se întâlnesc mai multe specii ale genului Candida și anume: C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis, C.krusei. Dintre acestea, cea mai frecvent izolată este C albicans, incidența fiind de 79%

Este o specie dimorfică, ce se reproduce prin înmugurire, formând în mediu neprielnic blastospori și blastoconidii, iar in mediu favorabil tubi de germinație, pseudohife si hife ce formează miceliul. Ea se distinge de alte specii de Candida prin faptul că după incubare la 37 ºC timp de aproximativ 2 ore în ser ,celulele încep sa formeze hife adevarate, iar pe mediu cu deficit nutritiv produce spori mari, sferici.

Analiza C. albicans tulpina WO-1, a arătat că prezintă două tipuri de creștere: una sub formă de celule rotunde și cu formare de colonii netede, albe și alta sub forma unor celule elongate și cu formarea unor colonii rugoase, aplatizate de culoare gri, opace (Sudbery P, 2011).

Cele două tipuri de creștere se pot converti spontan unul în celălalt, fiind identificate gene cu exprimare diferită în funcție de tipul de colonie ( Sonneborn A. și colab,1999).

A-levuri B-hife

C-pseudohife

Acest proces de comutare fenotipică este reversibil și este controlat de gena SIR 2 – silențiator al unor regiuni cromozomale ce conțin gene implicate în controlul formării coloniilor mate și factorul reglator Efg1p, ce se exprimă doar în coloniile albe (Srikantha T.și colab, 2000).

Sir 2 joacă un rol important în procesul de formare al hifelor și în virulență. Comutarea morfologică între tipul rotund și cel hifal este reglată atât de interacția cu alte celule de C. albicans, dar și de interacția cu celulele bacteriene prezente în microbiota mucoaselor (Sudbery P, 2011).

Patogenitatea tulpinilor de Candida depinde de complexitatea unor factori de virulență ca plasticitatea morfologică (dimorfismul celular, în special formarea hifelor joacă un rol important în procesul infecțios), variabilitatea antigenică, adeziunea la țesuturile gazdei, caracterul hidrofob al suprafeței celulare și producerea de enzime extracelulare (Rusu E., 2011).

După adeziunea la țesuturile gazdă începe etapa de creștere hifală. Etapa de adeziune este mediată de proteine ale peretelui celular exprimate pe suprafața hifelor și anume proteine aglutinin –like ca adezinele Als3 si Als5, proteina peretelui hifal Hwp1 care formează legături covalente cu celulele epiteliale , reprezentând un substrat pentru transglutaminazele gazdei și proteina Eap1 care este o proteină hifa-specifică care conferă proprietăți adezive. Astfel, în celulele epiteliale infectate sunt observate hife și nu forma rotundă (Sudbery P., 2011).

S-a constatat că fungii patogeni produc în urma metabolizării acidului arahidonic, eicosanoide. Cercetările asupra C. albicans au arătat că dintre eicosanoide, aceasta sintetizează doar prostaglandine și leucotriene, iar aportul de prostaglandinele (PG) exogene dar și endogene determină amplificarea procesului de formare a tubilor germinativi (Rusu E., 2011).

Candidoza vaginală este o boală comună ce afectează aproximativ 75% dintre femei, cel puțin o data în viață, care se manifestă prin iritație, prurit și leucoree albă, de consistență crescută, aderentă la peretii vaginali. Simptomatologia se accentuează premenstrual și după contact sexual. În cazuri rare se poate produce infecția sistemică (Onofriescu M., 2002).

Rezistența la infecția cu Candida este realizată cu ajutorul neutrofilelor și limfocitelor TCD4 prin interleukinele stimulatoare de IMH si IMC. La pacientii normo-reactivi, Candida este epurată din sânge, însa la pacienții imunosuprimați, (corticoizi sau leucemii , limfom, HIV) se dezvoltă leziuni în alte organe ca inima, ficatul, meningele (Chifiriuc și colab., 2011).

Diagnosticul de laborator se bazează pe examenul microscopic pe preparate proaspete sau în solutie de KOH 20% și pe frotiuri colorate Gram sau May –Grunwald-Giemsa și constă în vizualizarea pseudohifelor, hifelor sau levurilor inmugurite. Pentru identificarea speciei și orientarea tratamentului se cultivă pe medii speciale.

Tratamentul local constă în toalete vaginale cu bicarbonat de sodiu și aplicarea de ovule sau creme ce conțin tioconazol, miconazol, ketoconazol, clotrimazol. În cazul candidozelor cronice și recurente se administrează preparate orale ca fluconazol și ketoconazol. Înfecția sistemică se tratează cu Amfotericina B.

Studiile in vitro ale acțiunii inhibitorilor de ciclooxigenază (enzima implicată în metabolismul acidului arahidonic) au demonstrat că determină inhibiția biosintezei prostaglandinelor fungice și dezvoltarea celulelor de C.albicans doar sub formă de blastospori, formă care nu prezintă implicații patologice (Rusu E., 2011).

1.2.5.2. Gardnerella vaginalis

Este un cocobacil Gram variabil, facultativ anaerob, necapsulat, nesporulat și imobil, ce aparține clasei Actinobacteria, Familia Bifidobacteriaceae. Sunt pretențioase din punct de vedere nutritiv, fiind catalază, oxidază, urează si indol negative. Metabolizează zaharurile cu formare de acid acetic .Este agentul principal al vaginozelor bacteriene.

Formează colonii circulare, convexe de culoare albă, cultivată pe agar chocolate.

Peretele celular al bacteriei conține peptidoglicani, dar din cauză că este subțire apare colorat fie Gram pozitiv, fie Gram negativ.

Studiile referitoare la compoziția peretelui celular au arătat că acesta conține alanina, acid glutamic, glicină, lizină, glucoză, galactoză și 6-deoxitaloză și nu conține acid diaminopimelic, care este întâlnit la majoritatea speciilor gram negative (Harper J.J. și colab., 1982).

G.vaginalis este aderentă la celulele epiteliului vaginal, aspectul microscopic caracteristic fiind de “clue cells”(indicator al vaginozei bacteriene). Se colorează în albastru la adaugarea de albastru de metilen 0,1%, fiind astfel diferențiată de lactobacilli. În frotiu apare sub formă de cocobacili sau bacilli izolați sau dispuși în V, perechi sau palisade, Gram negativi sau Gram variabili ( Buiuc D și colab., 2009).

Factorul de virulență cel mai important este reprezentat de vaginolizin, o toxină ce face parte din familia citolizinelor cholesterol-dependente (CDC), a cărei specificitate de gazdă, se manifestă prin recunoașterea unei molecule reglatoare a complementului CD59 (Shari E. si colab., 2008).

Simptomatologia este caracterizată de iritație vaginală, prurit, leucoree cenușie sau galben – verzuie cu miros fetid (testul aminelor volatile Whiff cu soluție de KOH 10% este pozitiv). Boala poate evolua și asimptomatic.

Tratamentul constă în administrarea atât local cât și sistemic a derivaților de imidazol sau clindamicină.

1.2.6. Profilaxia infecțiilor genitale

Profilaxia infecțiilor genitale, trebuie aplicată atât de către pacienți cât și de către cadrele sanitare și conține o serie de reguli generale de igienă cât și metode speciale de asepsie și antisepsie.

Ținând cont de faptul că educația stă la baza societății, aceasta trebuie începută încă din perioada copilariei, prin învățarea regulilor minime de igiena corporală și igiena regiunii ano- genitale și continuate în școli prin educația sexuală a tinerilor.

În scopul prevenirii bolilor cu transmitere sexuală, trebuie evitate: debutul sexual precoce, conatctele sexuale cu parteneri multipli, contactele sexuale neprotejate. Se impune prezentarea la medic la apariția primului disconfort genital, în scopul prevenirii cronicizării infecției. Este indicat ca tratamentul să se institue conform antibiogramei pentre prevenirea prevenirea antibiorezistenței și cronicizării bolii și să includă atât schema terapeutică pentru persoana depistată pozitiv, dar și pentru toți partenerii sexuali ai acesteia.

Dezechilibrele microbiotei vaginale se previn prin evitarea tratamentelor abuzive, nejustificate cu antibiotice precum și evitarea toaletelor și dușurilor vaginale zilnice.

Este necesar screeningul gravidelor pentru streptococul de grup B, gonococ, sifilis, chalamydia , inceperea tratamentului cât mai curând posibil, pentru gravidele depistate cu BTS și profilaxia nou –născuților proveniți din mame infectate.

Tratarea altor patologii ca : alergii provocate de spermicide sau substanțe chimice dezinfectante, fistula recto/vezico-vaginală, diabet (menținerea la o valoare acceptabilă a glicemiei), vaginita atrofica (tratament de subtituție hormonală în menopauză prin administrarea de preparate locale cu estrogeni), HIV etc.

În vederea depistării bolilor transmisibile sexual, în special a celor asimptomatice, este necesar consultul ginecologic periodic cu recoltarea secreției vaginale pentru analiza bacteriologică și testul Babeș Papanicolaou (pentru screeningul displaziilor cervicale).

În spitale și clinici se vor aplica regulile de prevenire a infecțiilor nosocomiale, referitoare la asepsie și antisepsie (sterilizarea instrumentarului, purtarea echipamentului de protecție și a manușilor, spălarea mâinilor, dezinfecția suprafețelor, neutralizarea deșeurilor, instruirea personalului medical).

CAPITOLUL II

A doua parte a lucrării se bazează pe un studiu propriu efectuat în cadru Centrului Medical Biogenesis IVF, în perioada ianuarie – mai 2014.

2.1. SCOP ȘI OBIECTIVE

Scopul lucrării constă în evaluarea etiologiei bacteriene a infecțiilor de tract genital feminin analizate în cadrul laboratorului de analize medicale Biogenesis IVF SRL.

Obiectivul lucrării a fost evaluarea analizei microscopice a frotiului secreției vaginale ca metodă optimă de diferențiere a dezechilibrelor microbiotei vaginale provocate de agenti microbieni comensali, de stările patogene provocate de agenți infecțioși obligat patogeni și stabilirea unui protocol de investigații care să aducă informații maxime cu un cost redus.

Trebuie menționat, că examenul microscopic este limitat la orientarea diagnosticului, identificarea de certitudine a speciei microbiene realizandu-se prin izolare și cultivare pe medii speciale.

2.2. MATERIALE ȘI METODE DE LUCRU

2.2.1. Recoltarea produselor patologice

În cadrul clinicii, în perioada mai sus menționată, produsele patologice au fost reprezentate de secreții vaginale, a căror recoltare a fost efectuată în cabinetele de ginecologie proprii, de către asistenții medicali sau medicii ginecologi.

Recoltarea a fost efectuată cu instrumentar special, valve sau specul ginecologic. Prelevarea și etalarea secrețiilor pe lame s-a realizat cu ajutorul unei spatule de lemn sau tampon, de unica folosință. Pentru fiecare pacient se recoltează 2 lame.

După etalarea produsului biologic lame în strat subțire, se lasă la uscat, se identifică pe zona rugoasă cu numele pacientului și data de naștere a acestuia, se impachetează în hârtie și se trimit în laborator.

În cazul suspicionării infecției cu T. vaginalis, secreția se recoltează pe un tampon ce se introduce într-un recipient cu 0,5 ml soluție salină isotonă. Se efectuează apoi, un preparat umed, între lamă și lamelă, ce se examinează la microscopul optic x100, x400.

Metoda permite vizualizarea T. vaginalis, prin observarea mișcărilor membranei ondulante, a levurilor înmugurite și a pseudofilamentelor, aprecierea raportului PMN/celule epiteliale și aprecierea reacției inflamatorii (intensă în infecția cu T. vaginalis, discretă în candidoză și absentă în vaginoză).

2.2.1. Colorarea frotiurilor

În laborator, după verificarea integrității lamelor, se trece la etapa de fixare a frotiului. Aceasta se realizeză prin: uscarea la flacără (trecerea lamei prin flacără), fixare prin imersarea lamei în alcool metilic urmată de clătire cu apă, sau folosirea de lichide fixatoare (câteva picături de alcool etilic sau alcool eter lăsate pe lamă până la evaporarea completă.

Colorarea se realizează prin metodele Gram și Giemsa. Preparatele colorate permit aprecierea morfologiei, dispoziției agenti microbienilor și afinităților tinctoriale.

2.2.1.1. Metoda de colorare Gram

Se utilizează pentru a diferenția bacteriile intacte, în două grupuri, în funcție de culoarea celulelor dupã colorație.

În plus, sunt evidențiate forma, dimensiunile și detaliile structurale ale celulelor. Astfel de informații preliminare furnizează indicii importante pentru tipul organismelor prezente și pentru tehnicile suplimentare necesare descrierii lor.

Kiturile folosite, diferă de formula originală a lui Gram, prin înlocuirea iodului anorganic (se oxidează rapid și își pierde eficiența ca mordant) cu iod L-polivinilpirolidonă (formează un complex mai stabil).

Principiul metodei se bazează pe formarea unui complex cristal violet-iod în citoplasmă. Organismele care rețin acest complex după decolorare sunt Gram pozitive, iar cele care necesită recolorare sunt gram negative. Principiul metodei este în strânsă corelație cu prezența peretelui celular intact, care funcționează ca o barieră pentru agenții decoloranți. Se presupune că peretele organismelor Gram-pozitive se deshidratează sub acțiunea agentului decolorant și își pierde permeabilitatea păstrând colorația inițială, iar peretele organismelor Gram negative, datorită conținutului mare în lipide, devine permeabil în urma decolorării, ceea ce duce la pierderea colorației primare.

Pentru efectuarea colorației Gram sunt necesare:

kitul de colorare – conține violet de gențiana, lugol, alcool – acetonă și fuxină sau safranină;

apa de robinet- folosită pentru indepărtarea coloranților de pe lamă;

ceas, pipete;

hărtie de filtru- pentru îndepărterea apei în exces.

Etapele de lucru sunt următoarele:

1. Se inundă lama cu violet de gențiana și se lasă să se coloreze timp de 2 minute;

2. Se îndepărtează colorantul prin spălare cu apă de la robinet;

3. Se inundă lama cu lugol (mordantare) timp de 2 minute;

4. Se îndepărtează mordantul prin spălare cu apă rece de la robinet;

5. Decolorare cu alcool –acetonă până când solventul care curge de pe lamă devine incolor, timp de 10-15-30 secunde;

6. Se spală lama cu apă rece de la robinet;

7. Se inundă lama cu safranină sau fuxină timp de 2 minute;

8. Se spală lama cu apă rece de la robinet;

9. Cu hârtie de filtru se absoarbe apa de pe lamă, apoi se lasă la uscat la aer;

10.Se examinează frotiul cu obiectiv de imersie.

În urma colorării, celulele Gram pozitive se coloreză în nuanțe de violet, iar celulele Gram negative se colorează în nuanțe de roz până la roșu.

2.2.1.2. Metoda de colorare Giemsa și May Grümwald-Giemsa

Metode de colorare Giemsa, permite aprecierea recției inflamatorii, dar și evidențierea parazitului T.vaginalis, a gonococului prezent intraleucocitar grupat în diplo și a incluziilor chlamidiene intracelulare.

Tehnica de colorare este simplă, rapidă și necesită un minim de materiale:

soluția de colorare Giemsa care se găsește gata preparată în comerț;

apă distilată;

ceas, pipete;

hărtie de filtru- pentru îndepărterea apei în exces;

Tehnica de lucru are următoarele etape:

1. Se acoperă lama cu soluție Giemsa diluată și se așteaptă 25-30 minute;

2. Se îndepărtează colorantul de pe lamă și se spală lama cu apă distilată;

3. Se absoarbe apa de pe lamă,cu hârtie de filtru, apoi se lasă la uscat la aer;

4. Se examinează frotiul cu obiectiv de imersie.

Pentru colorația May Grümwald – Giemsa, sunt necesare următoarele materiale:

soluție fixatoare și colorantă May Grümwald, soluția de colorare Giemsa, tampon fosfat;

apă distilată;

ceas, pipete, hărtie de filtru.

Diferența dintre cele două tehnici nu este foarte mare, în sensul că tehnica descrisă anterior este precedată de încă trei etape și anume:

1. Se acoperă frotiul cu soluția May Grümwald 3 minute;

2. Se adaugă pe lamă o cantitate egală de tampon fosfat și se lasă timp de 2 minute;

3. Se îndepartează colorantul de pe lamă și se continuă f ără clătire cu tehnica Giemsa.

În urma colorării,T. vaginalis apare cu citoplasma colorată albastru- violet și nucleul roșu –violet, incluziile chlamidiene apar de culoare albastră – corpii reticulați sau roșie-corpii elementari, gonococul apare colorat violet, PNM apar colorate roz, iar macrofagele albastru.

2.2.1.4. Interpretarea microscopică în vaginozele bacteriene

Sensibilitatea și specificitatea microscopiei în vaginoze variază între 0,80-0,98. Un diagnostic obiectiv în vaginoză se realizează prin acordarea unui scor de pozivitate pentru microbiota bacteriană vaginală, evaluată din punct de vedere morfo- tinctorial (Buiuc D. și colab., 2009).

Tabel 1. Evaluarea microbiotei vaginale – scor Nugent

Scorurile obținute pentru fiecare categorie de microorganisme, se adună pentru obținerea scorului final, a cărui interpretare se găsește în tabelul 2.

Tabel 2 Interpretarea scorului Nugent

Alte criterii de evaluare sunt cele stabilite de C. A. Ison și P.E. Hay în 2002, conform cărora, aspectul frotiului se poate clasifica :

Frotiu grad 1 (normal): predomină lactobacilii.

Frotiu grad 2 (intermediar): microbiota mixtă cu lactobacili, G.vaginalis și Mobiluncus sp.

Frotiu grad 3 (vaginoză bacteriană): predomină G.vaginalis și Mobiluncus sp., lactobacili în cantitate redusă sau absenți.

În mod uzual, în practica clinică, pentru stabilirea diagnosticului clinic de vaginoză bacteriană, trebuie îndeplinite cel puțin două din criteriile Amsel:

Prezența secreției vaginale omogene, de culoare albă sau galbenă.

Identificarea de clue cells la examenul microscopic.

pH vaginal >4.5.

miros de pește alterat al secreției degajat în urma efectuării testului aminelor volatile Whiff.

Interpretarea microscopică este însă limitată, deoarece nu poate substitui studierea microorganismului prin cultivare, iar tratamentul corect trebuie instituit conform antibiogramei.

Morfologia celulară și apariția reacțiilor false, sunt influențate de vechimea izolatului, de prezența enzimelor autolitice la nivelul bacteriilor și de recoltarea probelor de la pacienți tratați recent cu antibiotic.

Pentru frotiurile din culturi, se recomandă utilizarea culturilor cu o vechime de 18 -24 h, deoarece celulele batrâne au o afinitate scazută pentru coloranți.(reacție fals Gram negativă).

Tratamentul prealabil cu medicamente antibacteriene poate determina unele bacterii gram-pozitive să apară drept gram-negative.

2.3. REZULTATE ȘI DISCUȚII

În perioada ianuarie – mai 2014, în cadrul laboratorului de analize medicale al clinicii Biogenesis IVF au fost analizate microscopic probe de secreție vaginală, provenite de la 752 de femei cu vârste cuprinse între 18- 65 ani.

Lotul de studiu a fost impărțit în funcție de vârstă în trei loturi:

Lotul 1- cuprinde 212 de femei cu vârsta între 18-27 ani

Lotul 2- cuprinde 387 de femei cu vârsta între 28-41 ani

Lotul 3- cuprinde 153 de femei cu vârsta între 42-65 ani

Din cadrul primului lot de studiu, în urma analizei microscopice a secreției vaginale, 159 de paciente au prezentat frotiu vaginal modificat (sublot 1a) și 53 de paciente au avut rezultate ce se încadrează în parametrii normali (sublot 1b).

În cadrul celui de-al doilea lot de studiu, am identificat în urma analizei microscopice a secreției vaginale, 291 de paciente cu microbiotă vaginală modificată (sublot 2a) și 96 de paciente cu microbiotă normală (sublot 2b).

În cel de-al treilea lot de studiu, 67 de paciente au prezentat un frotiu vaginal anormal (sublot 3a) și 86 de paciente au avut rezultate ce se încadrează in parametri normali (sublot 3b).

Aceste date sunt schematizate în figura 11.

Figura 6.- Frotiu de secreție vaginală colorat Giemsa -aspect de frotiu normal (x1500)

Figura 7.- Frotiu de secreție vaginală colorat Gram – Coci gram pozitivi (x1500)

Figura 8.- Frotiu de secreție vaginală colorat Gram – filamente de Candida (x1500)

Figura 9.- Frotiu de secreție vaginală colorat Giemsa -T.vaginalis (x1000)

Figura 10. – Frotiu de secreție vaginală colorat Gram – aspect de “clue cells

Figura 11. Distribuția procentuală în cadrul grupelor de vârstă a pacientelor cu secreții vaginale normale și modificate.

Raportat la numărul total de paciente, distribuția procentuală a fost schematizată în figura numărul 12.

Figura 12. Distribuția procentuală pe grupe de vârstă a pacientelor cu secreții vaginale normale și modificate raportate la totalul pacientelor studiate

S-a continuat studiul doar pe subloturile de paciente cu frotiul secreției vaginale modificat, respectiv subloturile 1a, 2a și 3a. În continuare s-a analizat repartiția tipurilor de frotiu, în funcție de starea fiziologică a pacientelor (ciclu menstrual prezent, sarcină în evoluție, menopauză).

Tabelul. 3 Distribuția pe loturi a pacientelor, în funcție de vârstă și stare fiziologică

Am analizat în cadrul fiecărui lot, în funcție de starea fiziologică a pacientelor, distribuția cu precădere a următoarelor patologii: infecția cu T. vaginalis, infecții micotice, vaginoze cu G. vaginalis și vaginite/ vaginoze cu alte specii bacteriene.

Astfel în cadrul lotului cu vârste între 18-27 ani și frotiu modificat (Lot 1a), în cele 2 subloturi s-au înregistrat următoarele date:

În sublotul 1aa1, ce conține 136 de paciente cu vârsta între 18-27 ani și cu ciclul menstrual prezervat , au fost înregistrate (figura numărul 13):

94 cazuri cu etiologie determinată de un singur agent patogen, din care:

17 cazuri de infecție cu T.vaginalis;

43 cazuri de vaginoză cu G. vaginalis;

21 cazuri de micoză;

13 cazuri de infecție cu alte bacterii.

42 cazuri cu etiologie determinată de mai mulți agenți patogeni din care:

12 cazuri infecție combinată T.vaginalis și G.vaginalis;

30 cazuri infecție combinată G.vaginalis și micoză;

Figura 13. Distribuția numerică în funcție de etiologie, în cadrul lotului pacientelor cu vârsta între 18-27 ani și cu ciclul menstrual prezervat.

În sublotului 1aa2 ce conține 23 de paciente cu vârsta între 18-27 ani cu sarcină în evoluție, s-au înregistrat ( figura numărul 14):

14 cazuri cu etiologie determinată de un sigur agent etiologic, din care :

1 caz de infecție cu T.vaginalis;

4 cazuri de vaginoză cu G. vaginalis;

8 infecție micotică;

2 cazuri de infecție cu alte bacterii.

9 cazuri cu etiologie multiplă:

2 cazuri infecție combinată G.vaginalis și micoză;

7 cazuri infecție combinată micoză și alte bacterii;

Figura 14. Distribuția numerică în funcție etiologie asociată sarcinii, în cadrul pacientelor cu vârsta între 18-27 ani.

În cadrul lotului cu vârste între 28-41 ani și frotiu modificat ( Lot 2a), în cele 2 subloturi am înregistrat următoarele date:

În cadrul sublotului 2aa1 ce conține 213 paciente cu ciclu menstrual prezent, s-au inregistrat (figura numărul 15):

149 cazuri cu etiologie unică:

22 cazuri de infecție cu T.vaginalis;

57 cazuri de vaginoză cu G. vaginalis;

49 cazuri de micoză;

21 cazuri de infecție cu alte bacterii.

64 cazuri cu etiologie determinată de mai mulți agenți patogeni din care:

11 cazuri infecție combinată T.vaginalis și G.vaginalis;

36 cazuri infecție combinată G.vaginalis și micoză;

9 cazuri infecție combinată G.vaginalis și alte bacterii;

8 cazuri infecție combinată micoză și alte bacterii.

Figura 15. Distribuția numerică în funcție etiologie, în cadrul lotului pacientelor cu vârsta între 28-41 ani și ciclul menstrual prezervat.

În cadrul sublotului 2aa2 , ce conține 73 de cazuri cu patologie asociată sarcinii, s- au înregistrat (figura numărul 16):

46 cazuri cu etiologie unică, din care:

10 cazuri de vaginoză cu G. vaginalis;

27 cazuri cu micoză;

9 cazuri de infecție cu alte bacterii.

27 cazuri cu etiologie multiplă:

2 cazuri infecție combinată T.vaginalis și G.vaginalis;

3 cazuri infecție combinată G.vaginalis și micoză;

18 cazuri infecție combinată micoză și alte bacterii;

4 cazuri infecție combinată G.vaginalis și alte bacterii.

În cadrul sublotului 2aa3, cu patologie asociată menopauzei precoce distribuția cazurilor în funcție de agentul etiologic a fost:

2 cazuri cu micoză;

3 cazuri cu G.vaginalis.

Figura 16. Distribuția numerică în funcție patologia asociată sarcinii, în cadrul lotului pacientelor cu vârsta între 28-41 ani.

În cadrul lotului cu vârste între 42-65 ani și frotiu modificat (Lot 3aa1), în cele 2 subloturi s-au înregistrat următoarele rezultate:

În cadrul sublotului 3aa1 ce conține 55 paciente cu ciclul menstrual prezervat, s-au inregistrat (figura numărul 17):

29 cazuri cu etiologie unică, din care:

2 cazuri de infecție cu T.vaginalis;

9 cazuri de vaginoză cu G. vaginalis;

11 cazuri cu micoză;

7 cazuri de infecție cu alte bacterii.

26 cazuri cu etiologie multiplă:

5 cazuri infecție combinată G.vaginalis și micoză;

14 cazuri infecție combinată micoză și alte bacterii;

7 cazuri infecție combinată G.vaginalis și alte bacterii.

Figura 17. Distribuția numerică în funcție de etiologie, în cadrul lotului pacientelor cu vârsta între 42-65 ani și ciclul menstrual prezervat.

În cadrul sublotului 3aa3, ce conține 12 paciente cu patologie asociată menopauzei, distribuția cazurilor în funcție de agentul etiologic a fost (fig. 18):

7 cazuri cu etiologie unică, din care:

1 caz de vaginoză cu G. vaginalis;

2 cazuri cu micoză;

4 cazuri de infecție cu alte bacterii.

5 cazuri cu etiologie multiplă:

3 cazuri infecție combinată micoză și alte bacterii;

2 cazuri infecție combinată G.vaginalis și micoză.

Figura 18. Distribuția numerică în funcție de etiologie, în cadrul lotului pacientelor cu vârsta între 42-65 ani și la menopauză

În final, analizând toate datele, am observat că frecventa cazurilor per agent patogen a fost următoarea: 67 de cazuri cu infecție determinată de T. vaginalis, 250 de cazuri au prezentat vaginoză cu G.vaginalis, 247 au fost încadrați în micoze și 137 de paciente au avut incriminate in patogenie alte bacteria (Streptococcus sp., E.coli, stafilococ etc.).

CONCLUZII

În cadrul studiului efectuat în perioada ianuarie – mai 2014, pe baza analizei informațiilor prelucrate din baza de date a laboratorului Centrului Medical Biogenesis IVF, au fost investigate 517 paciente cu disbioză vaginală, care au fost analizate după următoarele variabile: vârstă, stare fiziologică și agentul etiologic al disbiozei.

Studiul a arătat că numărul pacientelor cu frotiu vaginal modificat este semnificativ mai mare în grupele cu vârstă 18-27 și 28-41 ani.

S-a constatat ca ponderea infecțiilor micotice și a infecției cu G.vaginalis, în rândul populatiei analizate este crescută și aproximativ egală, pentru cele două microorganisme.

Studiul a arătat o prevalență ridicată a infecțiilor micotice și a vaginozelor provocate de G.vaginalis, incidența maximă find inregistrată în cadrul grupelor cu vârstă 18-27 și 28-41.

Astfel s-a observat o incidență ridicată a infecțiilor provocate de G. vaginalis în rândul femeilor cu ciclul menstrual, semnificativ crescută, față de cele aflate în amenoree, fie determinată de sarcină, fie de menopauză.

S-a constatat că la pacientele cu sarcină evolutivă, infecția micotică are o prevalență semnificativ crescută comparativ cu celelalte patologii, fiind favorizată asocierea micozei cu alte tipuri bacteriene decât cele identificate în studiu, în special cu Streptococcus sp.

O situație asemănătoare a fost obtinuta si pentru segmentul de vârstă 42-65 ani, prevalența infecției micotice fiind cea mai ridicată, în special a asocierii micozei cu alte infecții bacteriene.

Incidența infecțiilor determinate de T. vaginalis este în scădere proporțional cu înaintarea în vârstă, iar cea a infecțiilor cu alte tipuri bacteriene, în special Enterobacteriaceae se află în creștere, pe segmentul de vârstă 42-65 ani.

Astfel, examenul microscopic al secrețiilor tractului genital iși dovedește utilitatea în diagnosticul precoce al unor patologii de natură bacteriană, fungică sau parazitară, care reprezintă o cauză frecventă de diminuare a calității vieții.

Bibliografie