Utilitatea clinică a metodelor de hibridizare genomică comparată Candidat, MOROȘANU ARIADNA ȘTEFANA Coordonatori, Prof. Univ. Dr. Eusebiu Vlad… [607039]

LUCRARE DE LICENȚĂ
UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE
GRIGORE T. POPA IAȘI
Utilitatea clinică a metodelor de
hibridizare genomică comparată
Candidat: [anonimizat],
Prof. Univ. Dr. Eusebiu Vlad Gorduza
Asist. Univ. Dr. Setalia Popa

Facultatea de Medicină

Specializarea: Medicină
Disciplina: Genetică
2017

3
Cuprins
I. INTRODUCERE – NECESITATEA CLINICĂ A UTILIZĂRII TEHNICI LOR DE
CGH ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………… 5
1. CARIOTIP –DEFINIȚIE , ISTORIC , PRINCIPIUL METODEI , TEHNICI DE COLORARE ………………… 6
1.a). Marcaj G ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………….. 7
1.b). Marcaj C ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………….. 7
1.c). Marcaj R și T ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 8
2. HIBRIDIZARE FLUORESCE NTĂ IN SITU (FISH) ………………………….. ………………………….. …… 9
3. FISH MULTICOLOR , CARIOTIPARE SPECTRAL Ă ………………………….. ………………………….. .. 13
4. HIBRIDIZARE GENOMICĂ COMPARATĂ ………………………….. ………………………….. …………… 14
II. ISTORIC – EVOLUȚIA TEMPORALĂ A TEHNICILOR DE CARIOT IPARE ȘI
APARIȚIA TEHNICILOR DE CARIOTIPARE MOLEC ULARĂ ………………………….. …….. 16
1. PRIMELE DESCOPERIRI ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 16
2. CARIOTIP , TEHNICI DE BANDARE ………………………….. ………………………….. ………………. 17
3. FISH ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………….. 18
4. HIBRIDIZAREA GENOMICĂ COMPARATĂ ………………………….. ………………………….. ……… 19
III. CITOGENETICA CLASICĂ – DEFINIȚIE, PRINCIPIU , INDICAȚII, LIMITE ….. 21
1. DEFINIȚIE ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 21
2. PRINCIPIU ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 21
3. INDICAȚII ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 22
4. LIMITE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………… 23
IV. CGH CONVENȚIONAL – DEFINIȚIE, PRINCIPIU , INDICAȚII, LIMITE ………… 25
1. DEFINIȚIE ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 25
2. PRINCIPIU ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 26
3. INDICAȚII ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 28
4. LIMITE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………… 31
V. BAC -CGH – DEFINIȚIE, PRINCIPIU , INDICAȚII, LIMITE ………………………….. ……. 38
1. DEFINIȚIE ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 38
2. PRINCIPIU ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 39
3. INDICAȚII ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 41
4. LIMITE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………… 41
VI. MICROREȚELE OLIGONUCLEOTIDICE (C U DENSITATE MICĂ ȘI CU
DENSITATE MARE) – DEFINIȚIE, PRINCIPIU , INDICAȚII, LIMITE ……………………….. 44
1. DEFINIȚIE ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 44
2. PRINCIPIU ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 46
3. INDICAȚII ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 48
4. LIMITE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………… 58
VII. UTILIZAREA METODELOR DE CGH ÎN DIAGNOSTICUL PRENATA L
(ETIOLOGIA AVORTURIL OR SPONTANE, ETIOLOG IA MORȚII IN UTERO,
ANOMALIILOR FETALE) ………………………….. ………………………….. ………………………….. ….. 62
VIII. UTILIZAREA METODELOR DE CGH ÎN DIAGNOSTIC UL POSTNATAL
(SINDROAMELOR PLURIM ALFORMATIVE, DIZABIL ITĂȚILOR INTELECTUAL E ȘI

4
ÎNTÂRZIERILOR ÎN DEZ VOLTARE, BOLILOR NEU ROPSIHICE, TUMORI, B OLILOR
MENDELIENE) ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 82
IX. AVANTAJELE ȘI DEZAVA NTAJELE METODELOR DE HIBRIDIZARE
GENOMICĂ COMPARATĂ ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 95
X. STAREA ACTUALĂ ȘI PE RSPECTIVELE DESCHISE DE METODELE DE
HIBRIDIZARE GENOMICĂ COMPARATĂ ………………………….. ………………………….. …….. 99
BIBLIOGRAFIE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………….. 104

5

I. Introducere – necesitatea clinică a utilizării tehnicilor de
CGH

Celulele eucariote sunt formate din două compartimente separate: citoplasm ă și
nucleu. Materialul genetic sau cromatina din interiorul nucleului este separat de componentele
citoplasmei p rin intermediul membranei nucleare. Cromatina este un material care se
colorează intens fiind form at din fibre pliate de cromatină . Este o structură complexă formată
din aproximativ 60% proteine (histone), 35% acid deoxiribonucleic (ADN) și 5% acid
ribonuc leic (ARN).
Atunci când o celulă începe diviziunea fibrele pliate de cromatină se condensează
pentru a forma cromozomi. Fibrele de cromatină sunt formate la rândul lor din complexe
numite nucleosomi. Fiecare nucleosom este compus dintr -un nucleu de protei ne de bază
globulare de tip histone și înconjurat de un lanț ADN. Materialul genetic este compus din
perechi de cromozomi de aceeași lungime numiți cromozomi omologi.
Etapele ciclului celular const au din diviziunea mitotică și interfază. Diviziunea
mitotică este un proces care asigură transferarea exactă a copiilor ADN de la celula mamă la
celula fiică. Interfaza este stadiul dintre două diviziuni mitotice succesive și este formată la
rândul ei din trei fa ze: faza G1 (prima fază gap), faza S (de sinteză) și faza G2 (a doua fază
gap). În faza G1, celulele își cresc activitatea și încep sinteza unor enzime necesare pentru
replicarea ADN -ului. În a doua fază a interfazei, faza S, începe replicarea ADN -ului și fiecare
cromozom este format din două cromatide surori cuplate împreună la nivelul centromeri lor. În
plus, celulele sintetizează activ proteine cromozomial e necesare pentru replicarea ADN -ului.
În a doua fază gap (faza G2) celula se pregătește pentru următ oarea diviziune celulară
(mitoza). Celulele își cresc sinteza proteică necesară în timpul diviziunii celul are.
Diviziunea mitotică este o diviziune nucleară în care celulele eucariote își divid
materialul genetic rezultând două seturi identice de cromozomi organizați în doi nuclei.
Diviziunea mitotică este formată din următoarele patru faze succesive: profaza,
metafaza, anafaza și telofaza. În prima fază a mitozei, profaza, fibrele de cromatină a
substanței genetic e se condensează pentru a forma cromozom ii. La mijlocul profazei are loc
sinteza fusului mitotic, în timpul căreia fiecare centromer al cromatidelor se atașează la
microtubulii fusului mitotic în dezvoltare. La sfârșitul profazei membrana nucleară și

6
nucleolul se degradează , iar fiecare cromozom e ste format din două cromatide surori ambele
fiind cuplate prin intermediul centromerilor. În met afază cromozomii apar atașați la fusul de
diviziune și migrează către planul ecuatorial al celulei. Datorită bunei delimitări a
cromozomilor, această etapă este cea mai potrivită pentru analiza cariotipului uman. La
începutul anafazei cele două cromatide surori se separă una de cealaltă și acum fiecare
cromatidă reprezintă un cromozom. La sfârșitul anafazei fiecare pol celular primește un set
nou format de cromoz omi. Fiecare set este format din același număr original de cromozomi
care poartă același material genetic a celulei mamă. Telofaza începe în momentul în care
fiecare grup de cromozomi ajunge la polul celular respectiv și încep refacerea nucleului. De
aseme nea, fusul mitotic se degradează, iar cromozomii se alungesc și se transformă în fibre
de cromatină. (1)
În prezent există diverse metode utilizate pentru analiza cromozomilor și depistarea
anomaliilor cromozomice. În funcție de scopul propus, cromozomii pot fi analizați atât în
interfază cât și în timpul diviziunii. Studiul cromozomilor metafazici este facilitat de marcajul
în benzi (G, R, C, T). Analiza cromozomii interfazici se poare realiza cu ajutorul hibridizării
fluorescente in situ (FISH), FISH multicolor , cariotipare spectrală (SKY) și hibridizare
genomică comparată (CGH).

1. Cariotip –definiție, istoric, principiul metodei, tehnici de colorare

Analiza cromozomi lor este ajutată de construirea unui cariotip, o hartă în care
cromozomii unei celule obținuți în timpul metafazei, sunt aliniați în perechi, în general de la
cei mai mari la cei mai mici, având brațele mici orientate în sus. Constituția cromozomială a
unui individ este referită ca fiind cariotipul ei/lu i. (2)
Numărul corect de cromozomi pentru om a fost identificat după aplicarea tehnicilor de
citogenetică la culturi tisulare . Înainte de 1956, numărul cromozomilor umani la om s -a crezut
a fi 48. Tijo și Levan (1956), analizând culturi de fibroblaști embrionici din plămâni umani,
au găsit un număr constant de 46 de cromozomi. În același timp și independent, Ford și
Hamerton (1956), folosind celule meiotice obținute din material biopsic testicular, au găsit
doar 23 de perechi de cromozomi. Celule mitotice din aceleași specimene conțineau 46 de
cromozomi. Aceste descoperiri marchează începutul citogeneticii umane moderne. Perioada
de 15 ani dintre 1956 și 1971 a fost marcată de dezvoltarea unui sistem de nomenclatură

7
standardizat c are a devenit mai rafinat pe măsură ce identificarea cromozomilor a devenit mai
precisă. (3)
Un pas înainte decisiv pentru citogenetica umană a fost descoperirea tehnicilor de
bandare cromozomială care relevă modele distincte și reproduc tibile ale benzilor
cromozomiale. Aceste tehnici permit identificarea cu acuratețe a tuturor cromozomilor,
recunoașterea rearanjamente lor structurale și identificarea punctelor de ruptură . Benzile
cromozomiale au o mare i mporta nță teoretică și practică . Au făcut posibile identificarea
rapidă a unei game enorme de anomalii cariotipice și a condus la formarea unor hărți
nomenclatoare cromozomiale detaliate .

1.a). Marcaj G

Bandarea G a fost descoperită accidental în timpul încerc ărilor de a îmbunătăți
bandarea C. Benzile G sunt obținute atunci când cromozomii sunt pretratați cu o soluție salină
la 60° C sau cu o enzimă proteolitică, cum ar fi tripsina, înaintea colorării cu Giemsa sau cu o
colorație comparabilă care pune în eviden ță cromatina. Bandarea G aduce în general acelea și
informații ca și bandarea Q (Fig. 1). Benzile care sunt fluorescente cu quinacrină se colorează
intens cu colorație Giemsa (sunt G -închise), pe când regiunile Q șterse sunt G -deschise.
Fiecare metodă are a vantajele sale. Bandarea G este permanentă și prin urmare mai potrivită
pentru munca de rutină decât efemera bandare Q. Prin oricare tehnică, câte 300 de benzi sunt
ușor de distins în metafază (Conferința de la Paris: 1971 [1972]) în genomul haploid și 850 –
1250 în prometafază și profază (ISCN, 1995).

1.b). Marcaj C

Bandarea C a fost d escoperită accident al când au fost încălzite pentru a denatura
ADN -ul în vederea realizării hibridizării în situ. Colorația Giemsa a cromozomilor a fost
redusă considerabil, e xceptând regiunile centromerice ale majorității cromozomilor și partea
distală a cromozomului Y (Fig. 4 ). Bandarea C se poate efectua în multiple felu ri. Cel mai
comun este tratarea pentru scurt timp a cromozomilor cu acid apoi cu o substanță alcalin ă cum
ar fi hidroxidul de bariu , anterior colorării cu Giemsa. Benzi C proeminente se găsesc pe
cromozomii 1, 9 , 16 și porțiunea distală a lui Y (Fig. 1).

8
Benzile C variază considerabil în mărime în rândul populație i. Cea mai mare
variabilitate este demonstrată la nivelul sateliților și pe brațele scurte ale cromozomilor
acrocentrici. Aceste variații sunt în general numite heteromorfisme, deoarece termenul de
polimorfism este limitat de geneticieni la o variantă care se transmite ereditar și care are o
frecevență de cel puțin 1 % în populație. Heteromorfismele cromozomiale au fost folosite ca
markeri în cartografierea genelor, testele de paternitate și în distingerea gemenilor
monozigotici de cei dizigotici sau al părin telui care poartă trisomii sau triploidii. Acestea au
ajutat la înțelegerea molelor hidatiforme și a originii diferitelor linii celulare în himere,
inclusiv la persoane care au transplant de măduvă osoasă. Cu toate acestea, cele mai multe din
aceste aplica ții au fost suplinite de către metode mai precise de citogenetică moleculară.

Fig. 1. Cariotip prin bandare -C a unei celule XY.

1.c). Marcaj R și T

Bandarea inversă sau bandarea R (reverse banding) a fost descoperită de către
Dutrillaux și Lejeune ( 1971). Tehnica lor implica pretratarea cu substanțe alcaline încălzite
(80-90° C) urmată de colorația cu Giemsa sau cu fluorocromul acridin -oranj. După cum
indică și numele , modelul bandării R este inversul modelului bandării Q sau G, cu alte

9
cuvinte, benz ile care sunt colorate intens prin bandare R sunt stinse prin bandare Q sau G și
vice versa.
Bandarea R colorează capetele cromozomilor mai pronunțat ș i este adesea folositoare în
studiul schimbărilor structurale care implică capetele cromozomilor și care ar putea rămâne
nedetectate de bandarea Q sau G. O modificare a bandării R, numită bandare T, colorează în
principal regiunile situate aproape de vârfurile cromozomilor (Dutrillaux, 1973).
Toate benzile G și R, fie că sunt fluorescente fie că se colorează puternic sau slab,
conțin ADN și gene în abundență și toate benzile sunt numărate pentru a determina numărul
total de benzi. Termenii de bandă G, R, T și C se referă în mod obișnuit la benzi care sunt
colorate mai intens sau fluorescente în funcție de met oda particul ară folosită. (4)

2. Hibridizare fluorescentă in situ (FISH)

Citogenetica convențională permite identificarea schimbărilor ADN de dimensiuni
mari (cel puțin 1 milion perechi de baze) care sunt vizibile pe un cromozom, fie că anomalia
genetică este echilibrată sau nu. Reprezintă în continuare metoda preferată pentru multe tipuri
de indicații de testare genetică, cum ar fi diagnosticul și prognosticul cancerului, istoric de
avorturi spontane, dismorfologie neonatală, diagnostic prenatal și tulburări endocrinologice.
Există limitări ale citogeneticii convenționale, dint re care una din ele este imposibilitatea de a
vizualiza anomalii mici la microscop, mai mici de 1 -5 milioane perechi de baze (pb),
eliminând posibilitatea identificării anomaliilor genetice submicroscopice. Această limitare a
condus la dezvoltarea de noi t ehnologii, ce include hibridizarea fluorescentă in situ (FISH)
care permite identificarea schimbărilor genetice mai mici și nu depinde de morfologia sau
nivelul bandării cromozomiale. Această analiză utilizează markeri fluorescenți atașați la un
segment mi c de ADN, lung de sute până la mii de pb, care este specific regiunilor
cromozomiale de interes. Hibridizarea fluorescentă in situ (FISH) este foarte folositoare
pentru identificarea schimbărilor ADN pe cromozomul care este specific unei regiuni care
deter mină boala, o regiune locus -specifică sau o parte a unui cromozom care este folosită
pentru identificarea cromozomială, cum ar fi probele marcate centromerice, subtelomerice sau
a cromozomului întreg. FISH este foarte utilă pentru identificarea delețiilor, duplicațiilor și
rearanjărilor unor regiuni mici care determină boala unde pot fi făcute sonde ADN, sau pentru
identificarea cromozomilor, atunci când prezența unui cromozom nu poate fi identificată prin
analiza cromozomială standard. Analiza FISH prezint ă de asemenea și limitări, datorită

10

dimensiunii mici de ADN care suportă o probă pentru hibridizare. Altă limitare o reprezintă
nevoia de a cunoaște care regiune a cromozomului cu care să probeze. (5)
Hibridizarea fluorescentă in situ implică, de regulă, denaturarea unui fragment ADN
clonat și marcarea sa cu un trasor fluorescent și hibridizarea sa la ADN denaturat în
cromozomi metafazici fixați.
Bromodeoxiuracil, digoxigenin, dinitrofenol și alte subcategorii p ot fi folosite p entru a
marca probele de ADN, iar site -urile de hibridizare pot fi detectate de către anticorpi
fluorescenți sau complexe enzimă -anticorp înalt specific e. Puterea și frumusețea acestor noi
tehnici este reflectată de folosirea lor tot mai vastă și ilustrate în figurile 2 (a, b, c, d) .

Fig. 2. Hibridizare fluorescentă in situ – tehnică utilizată în diagnosticul prenatal al
aneuploidiilor cromosomiale cele mai frecvente: a). Se evidențiază trei semnale fluorescente
pentru cromosomul 21 și două semnale fluorescente pentru cromosomul 13. b) . Făt de sex
feminin. c). Făt de sex feminin cu trisomie 18. d). Făt de sex masculin

11

Fig. 3. FISH metafazic cu utilizarea sondelor pentru sindromul VCF specifice cromosomului
22 (verde – sonda de control, roșu – sonda de investigat) a). test FISH ne gativ pentru VCF, b).
test FISH pozitiv pentru VCF

Fragmente foarte lungi de ADN pot fi folosite ca probe pentru hibridizare după blocarea
hibridizării repetărilor amestecate, astfelt reducând considerabil zgomotul de fundal generat
de o astfel de hibridi zare. Acest lucru este folositor deoarece probele lungi dau semnale
fluorescente puternice care sunt ușor detectabile în microscopie fluorescentă. Rezultatele nu
necesită o analiză statistică a distribuției semnalelor în cuprinsul genomului integral, deoar ece
fundalul este atât de scăzut încât, practic, fiec are semnal fluorescent contează (Fig. 3)
Camere digitale CCD (charge -coupled device) foarte sensibile și metode de
achiziționare și procesare a datelor computer asistate permit detectarea de rutină chiar și a
semnalelor fluorescente slabe. Cu ajutorul lor FISH poate detecta hibridizarea secvențelor
scurte de 1 kb.
Probe pentru secvențe telomerice înalt repetitive (TTAGGG)n sunt cele mai frecvent
utilizate în cele mai variate scopuri. Ele au fost folosite pentru a arăta că delețiile terminale
aparente au fost stabilizate prin captura repetițiilor TTAGGG. Inversiile pericentrice pot fi
detectate printr -o metodă fascinantă numită Chromosome Orientation and Direction FISH sau
COD -FISH.

12

Fig. 4. Cromozomi în metafază (sus) și un cariotip (jos) după hibridizare in situ și detectarea
probelor multiplex. Benzile roșii și verzi reprezintă regiuni care au hibridizat în fragmente
într-o singură probă, iar benzile galbene reprezintă regiuni care au hibridizat egal în fragmente
în ambele probe. Culorile amestecate apar datorită suprareprezentării fragmentelor dintr -un
eșantion. Regiuni care eșuează în a hibridiza în fragmente din oricare eșantion prezintă
fluorescență albastră DAPI.

Această metod ă beneficia ză de faptul că repetițiile telomerice (TTAGGG în lanțul bogat în
guanină, CCCTAA în lanțul bogat în citozină) au aceeași orientare respectând capetele
cromozomilor, la fel cum o fac și secvențele α -satelit centromerice. Celulele cresc pentru u n
ciclu în prezența BrdU (bromodeoxiuridina) , acesta fiind încorporat în locul timinei în fiecare
lanț nou replicat al ADN -ului. Lumina ultravioletă fragmentează selectiv ADN -ul BrdU
substituit, iar exonucleaza III poate distruge pe urmă tot lanțul afectat , lăsând un singur lanț de
ADN în fiecare cromatidă. Proba cu un singur lanț complementar cu un lanț de ADN
centromeric sau telomeric va găsi astfel o secevență hibridizabilă (complementară) în una din
cele două cromatide surori. Proba cu un singur lanț t elomeric va hibridiza la brațul telomeric
scurt al unei cromatide și la brațul lung telomeric al celei lalte cromatid e; proba centromerică
va hibridiza doa r la una din aceste cromatide. Însă, dacă a avut loc o inversiune pericentrică ,
proba centromerică va hibridiza la cealaltă cromatidă.

13
3. FISH multicolor , cariotipare spectrală

Detectarea simultană a fiecărui cromozom într -un preparat cromozomial folosind fie
FISH multicolor (M -FISH) fie ca riotipare a spectrală (SKY) este de rutină. Aceste metode
foloses c 24 de probe de colorare cromozomială și cinci fluorocromi într -o schemă de
etichetare combinată care etichetează fiecare din cei 22 de autosomi și cromozomii X și Y
separat. M -FISH necesită o serie de achiziții imagistice cu o schimbare a filtrelor optic e, în
timp ce SKY folosește spectroscopia Fourier și un interferometru pentru a evalua modele de
emisie fluorescentă intr -o singură achi ziție lungă a imaginii (Fig. 4 ). Nici una din metode nu
detectează rearanjamente intracromozomiale cum ar fi delețiile, duplicații sau inversii, dar ele
sunt foarte utile pentru a detecta alte schimbări struct urale precum si numerice (Fig. 5).
Folosind M -FISH cu probe de colorare cromozomială specifică pot fi detectate chiar și
rearanjamente cromozomiale minore.

Fig. 5 . (A) Bandare C parțială și cariotipare spectrală a tatălui unui copil cu retard mental, ce
prezintă o transolcație criptică t(1;11). (B) Bandare G parțială a unui pacient ataxic, se
notează materialul în plus pe cromozomul 11, cariotiparea spectrală arată originea sa de pe
cromozomul 4. (C) Șase markeri cromozomiali de la o linie celulară de cancer mamar,
cariotiparea spectrală arată cromozomii implicați în aceste rearanjări complexe. (6)

14
4. Hibridizare genomică comparată

Hibridizarea genomică comparată (CGH) este o abordare a citogenetic ii moleculare ce
efectuează screening -ul întregului genom a diferențelor numărului de copii de la oricare
secvență ADN al unui individ și care necesită doar câteva nanograme de ADN ca probe FISH.
CGH a fost introdusă pentru a identifica alterări segmentare cromozomiale în celule
tumorale solide fără a fi necesară prepararea celulelor canceroase în metafază după realizarea
culturii.

Fig. 6 . Analiza schimbărilor cromozomiale într -un cancer m amar prin hibridizare genomică
comparată (CGH). Regiunile care apar verzi reprezintă câștiguri de ADN și amplificări în
tumoră (de ex. 8q, 14, 17q22 -q24 și 20q). Regiunile care apar roșii reprezintă pierderi de
ADN și deleții (de ex. 1p21 -p31, 8p, 11q14 -qter și 116q12 -q21). (7)

Cantități egale de ADN marcate diferit de la individul de testat (verde) și ADN de
referință (roșu) sunt cohibridizate la frotiuri metafazice normale. Diferențe ale numărului de
copii apar ca și alterări ale proporției intensității fluorescente verde -roșu (Fig. 6 ). Această
proporție este calculată de -alungul fiecărui cromozom de către un sistem digital de analiză a
imaginilor. O creștere a numărului de copii determină creșterea proporției, în timp ce

15
pierderile sau delețiile determină o scădere a proporției. Levy et al. (1997) au folosit CGH
pentru a determina originea unei translocații de novo la un nou născut cu anomalii congenitale
multiple și un cariotip instabil ( Fig. 7). Această metodă a fost aplicat ă pe mai mult de 1500
mostre de ADN tumoral și a arătat șase amplificări genice necunoscute până în prezent.

Fig. 7 . (a) Cariotip parțial și ideograma a doi cromozomi 5, unul cu material în plus pe
el. (b) Ideogramele și profilurile CGH (hibridizare geno mică comparativă) indică originea
materialului în plus de la 11q23 -qter. (c) Confirmarea FISH folosind o probă marcată
cromozom 11 -specifică. (7)

16
II. Istoric – evoluția temporală a tehnicilor de cariotipare și
apariția tehni cilor de cariotipare moleculară

1. Primele descoperiri

Primul om de știință care a descris în detaliu procesul de mitoză și implicarea "figurii
cromatice nucleare" (cromozomii) a fost zoologul german Anton Schenider în 1873
(Zacharias, 2001). Descrieri clare și detaliate ale cromozomilor mitotici la plante și animale
au fost publicate de către Strasburger în 1875 și respectiv, Flemming în 1879 -1882.
Descoperirile lor au pus bazele tehnicilor moderne de studiu a cromozomilor. Cromozomii au
fost descoperiți după ce Gregor Mendel a publicat legile eredității, dar s -a realizat că acestea
erau necesare pentru a explica distribuția factorilor ereditari (genele) la celulele fiice.
În 1868, Miescher in Basel a izolat ceea ce el a numit nucleină, care aparent era o
formă impură de ADN. Această descoperire a marcat începutul studii lor acizilor nucleici.
Flemming a speculat că substanța colorabilă a nucleului (prin urmare a cromozomilor),
cromatina, ar putea fi asemănătoare cu nucleina descoperită de Miescher. Prezența ADN -ului
în cromozomi și în nucleu a fost stabilită în mod echivo c când Feulgen a introdus metoda sa
histochimică pentru detectarea ADN -ului (Feulgen și Rossenbeck, 1924), care mai târziu a
devenit o cale pentru măsurarea conținutului de ADN al nucleilor și cromozomilor.
Modelul ADN propus de Watson și Crick în 1953, care arăta că acesta era un dublu
helix complementar, a pus bazele înțelegerii mecanismelor de replicare a materialului genetic.
Acest model reprezentând structura ADN -ului poate fi considerat începutul erei biologiei
moleculare.
Cromozomii rămân importan ți nu numai pentru că ei poartă genele, dar și deoarece
comportamentul lor determină mecanismul eredității. Distribuția genelor la celulele fiice în
timpul mitozei și meiozei este o consecință directă a comportamentului cromozomilor.
Comportamentul ADN -ului și al genelor este constrâns de faptul că aceștia sunt
încorporați în cromozomi și cromatină (care reprezintă, de fapt, cromozomi interfazici).
ADN -ul poate funcționa în replicare și transcripție deoarece este asociat cu proteine care
controlează și cat alizează aceste procese. Expresia genică este controlată prin modificări ale
histonelor și prin complexe cromatinice modelatoare. Chiar și un lucru aparent banal precum

17
poziția unei gene în cromozom poate avea un impact major asupra comportamentului acelui
cromozom. Heterocromatina constă din seg mente cromozomiale care nu reușesc să se
decondenseze la sfârșitul mitozei și care sunt genetic inactive și reprezintă secvențe de ADN
înalt repetitive incapabile de a codifica proteine. Plasarea unei gene în apropi erea
heterocromatinei ar putea inactiva acea genă, produc ând efectul cunoscut sub numele de
variabilitatea efectului de poziție , în care o genă particulară poate fi activată în anumite celule
și dezactivată în altele. Asemenea efecte s -au dovedit a fi surp rinzător de răspândite.
Erori ale comportamentului cromozomilor constituie o cauză importantă de boală. La
oameni, o proporție substanțială din avorturi se datorează anomaliilor cromozomiale, în
special trisomiile și alte aneuploidii. Trisomia 21 (sindro mul Down) și aneuploidii legate de
cromozomii sexuali dau naștere unor indivizi care ajung la maturitate dar care prezintă o serie
de anomalii. Dezvoltarea unor anomalii cromozomiale este comună în cancere, iar o anomalie
cromozomială specifică reprezintă deseori una din primele evenimente din dezvoltarea unui
cancer.
Cromozomii sunt determinanții supremi ai organ izării tuturor organismelor vii,
studierea lor este așadar imperativă . (8)

2. Cariotip, tehnici de bandare

Cromozomii sunt analizați prin recoltarea de țesut viu (de regulă sânge), cultivarea
țesutului pentru câteva ore/zile (48 până la 72 de ore pentru limfocite periferice), adăugând
colchicin ă pentru a produce oprirea diviziunii celulare în metafază, recoltarea celulelo r,
plasarea sedimentului celular pe un frotiu, producerea rupturii nucleului celular cu ajutorul
unei soluții saline hipotone, colorarea cu un colorant desemnat, și fotografierea cromozomilor
metafazici de pe frotiu. Imaginile cu cei 22 de autosomi sunt ar anjate în funcție de lungime,
cromozomii sexuali fiind plasați în colțul din dreapta. Această dispunere ordonată a
cromozomilor se numește cariogramă sau cariotip (termenul de cariotip se referă la numărul și
tipul de cromozomi prezenți la un individ, iar cariograma este acum folosită pentru a desemna
expunerea printată a cromozomilor). În prezent , analiz a imagistică computerizată este de
regulă folos ită pentru a afișa cromozomii.
Primele cariotipuri făcute au fost utile pentru numărarea cromozomilor, dar anomaliile
structurale cum ar fi rearanjări cromozomiale echilibrate s au mici deleții cromozomiale
rămâneau adesea nedetectabile.

18
Tehnicile de bandare cromozomială au apărut prin a nul 1970, pentru a produce benzile
cromozomiale caracteristice cariotipurilor moderne. Bandarea cromozomială ajută prin
detectarea delețiilor, duplicațiilor, și a altor anomalii cromozomiale și facilitează identificarea
corectă și individuală a cromozomil or.
Multiple tehnici de bandare cromozomială sunt folosite în prezent în laboratoarele de
citogenetică. Bandarea cu quinacrină (bandare Q) a fost prima metodă folosită pentru a obține
un șablon specific de benzi cromozomiale. Această metodă necesită un mi croscop cu
fluorescență și nu mai este la fel de folosită ca bandarea cu Giemsa (bandare G). Pentru a
produce benzi G, colorația cu Giemsa se aplică după ce proteinele cromozomiale sunt parțial
digerate de tripsină. Bandarea inversă (bandare R) necesită tr atament termic și inversează
modelul normal alb -negru prezent în benzile G și benzile Q. Această metodă este utilă în mod
particular pentru colorarea capetelor distale a cromozomilor. Alte tehnici de bandare includ
bandarea C și evidențierea regiunilor de organizare nucleară (colorația NOR). Aceste metode
colorează în mod specific anumite porțiuni ale cromozomilor. Bandarea C colorează
heterocromatina constitutivă, care este situată de regulă în apropierea centromerului, iar
colorația NOR evidențiază sateli ții și coada cromozomilor acrocentrici.
Bandarea de înaltă rezoluție implică colorarea cromozomilor în timpul profazei sau
metafazei timpurii (prometafază), înainte de a ajunge la condensarea maximă. Cromozomii
din profază și prometafază sunt mai lungi dec ât cei din metafază, de aceea numărul de benzi
observabile pentru toți cromozomii poate crește de la 300 -450 până la 800. Detecția unor
anomalii mai puțin evidente, care de regulă nu sunt vizualizate prin bandare convențională
este astfel posibilă.

3. FISH

În tehnica de hibridizare fluorescentă in situ (FISH) un segment marcat de ADN
mono -catenar (proba) este expus cromozomilor denaturați din metafază, profază sau interfază.
Proba suferă o cuplare a bazelor complementare doar la secvența ADN complementară într-un
loc specific la unul din cromozomii denaturați. Deoarece proba este marcată cu un marker
fluorescent locația la care hibridizează cu cromozomul pacientului poate fi vizualizată cu
ajutorul microscopiei fluorescente. FISH este frecvent utilizată pentr u a determina dacă există
deleții ale unor porțiuni cromozomiale la pacienți. La o persoană normală o probă
hibridizează în două locuri, reflectând prezența a doi cromozomi omologi în nucleul celulei

19
somatice. Dacă o probă din segmentul cromozomial în disc uție hibridizează la doar unul din
cromozo mii pacientului atunci acesta are, probabil , o deleție a copiei cromozomului la care
proba nu hibridizează. FISH oferă o rezoluție mai bună decât tehnicile de bandare de înaltă
rezoluție, putând detecta deleții mic i de 1 milion de perechi de baze (1 Mb).
Copii în plus a unei regiuni cromozomiale pot de asemenea fi detectate utilizând FISH.
În acest caz proba hibridizează în trei sau mai multe locuri în loc de două. Combinații de
probe FISH pot fi de asemenea folosi te pentru a detecta rearanjări cromozomiale cum ar fi
translocațiile. Deoarece detecția FISH a cromozomilor lipsă sau în plus, poate fi efectuată cu
cromozomi interfazici, nu este necesară stimularea celulelor pentru a se divide pentru a obține
cromozomi m etafazici (procedură consumatoare de timp necesară în abordările microscopice
tradiționale). Acest lucru permite completarea analizelor si diagnosticelor într -un timp mai
scurt. Analiza FISH a cromozomilor interfazici permite detectarea prenatală a anomal iilor
cromozomiale fetale și a rearanjărilor cromozomiale din celule tumorale.
Tehn ica FISH a fost extinsă prin folosirea mai multor probe, fiecare marcată cu o
culoare diferită, astfel încât câteva din tre cele mai comune anomalii de număr (spre exemplu
cele ale cromozomilor 13, 18, 21, X și Y) pot fi testate simultan în aceeași celulă. În plus,
tehnici precum cariotiparea spectrală folosesc combinații variabile a cinci probe fluorescente
diferite care cu ajutorul camere lor speciale și a software -ului de pr ocesare a imaginilor fiecare
cromozom are astfel o culoare unică în scopul identific ării rapid e. Astfel de imagini sunt în
mod special folositoare pentru identificarea rearanjărilor cromozomiale.

4. Hibridizare a genomică comparată

Dezvoltarea tehnologiei microarray la începutul anilor 1990 la Universitatea Stanford
(Schena et al., 1995) s -a desprins din șase discipline majore: biologie, chimie, fizică,
inginerie, matematică și informatică. Pe lângă faptul că nici o altă tehnologie nu a implicat
vreodată o așa mare complexitate tehnologică, combinând expertiza din atât de multe
discipline, aceasta a adus o perspectivă cantitativă și sistematică asupra unui sistem biologic.
Această știință nouă și revoluționară folosește matrici de sticlă microscopice
(micro matrici) pentru analiza cantitativă a genelor (sau părți din ele) și produșii genelor. Își
are rădăcinile în progresele făcute în perioada dintre descoperirea ADN -ului din anii 1950 și
Proiectul Genomului Uman în anii 1990.

20
Primele experimente de hibridi zare pe sticlă au avut loc între sfârșitul anilor 1980 și
începutul anilor 1990 (Khrapko et al., 1989, Fodor et al., 1991, Maskos and Southern, 1992,
Lamture et al., 1994, Guo et al., 1994) . (9)
O limitare importantă a CGH când sunt folosiți cromozomii metafazici este aceea că
delețiile sau duplicațiile mai mici de 5 până la 10 Mb nu pot fi detectate microscopic. Array
CGH oferă o rezoluție mai înaltă, în care ADN test și de control este hibridizat cu ajutorul
unui microarray ca re conține probe a căror secvențe ADN corespund unor regiuni specifice
din genom. Un microarray CGH folosit în mod curent conține aproximativ 3000 de probe de
cromozomi bacterieni artificiali (BAC) și fiecare probă conține inserții ADN de aproximativ
150 k b. Deoarece probele BAC sunt de regulă la 1Mb distanță unele de altele, această
versiune de array CGH poate detecta duplicații sau deleții de aproximativ 1 Mb (rezoluție de 5
până la 10 ori mai bună decât CGH clasic). Alte microarray BAC sunt țintite, astf el încât
rezoluții mai mari să fie obținute în regiuni în care duplicațiile sau delețiile sunt cunoscute ca
fiind asociate cu anumite boli (microdeleții cum ar fi în sindromul Williams). O limitare a
microarray BAC este aceea că alterări mai mici decât ins ertul BAC în sine (150 kb) nu pot fi
detectate cu ușurință.
Recent însă, CGH a fost elaborat folosind microarray care conțin sute de mii de probe
oligonucleotidice mici. Aceste microarray oferă o rezoluție de 50 până la 100 kb sau chiar mai
puțin, permițâ nd detectarea duplicațiilor și delețiilor care pot afecta o singură genă.
În plus față de o rezoluție mai bună, array CGH oferă o multitudine de alte avantaje
față de tradiționala analiză a cariotipului. Întregul proces este automatizat, necesitând mai
puțin timp din partea personalului de laborator. Diviziunea celulară nu este necesară (în
contrast cu analiza cromozomilor metafazici), și o cantitate minimă de ADN este suficientă
pentru analiza întregului genom. Array CGh, pentru aceste motive, devine una d in tehnicile
cele mai folosite în laboratoarele de citogenetică. Dezavantajul principal al CGH este că nu
poate detecta rearanjări balansate la nivelul cromozomilor. (10)

21
III. Citogenetica clasică – definiție, principiu, indicații,
limite

1. Definiție

Citogenetica reprezintă studiul cromozomilor, a structurii și eredității lor fiind utilizată în
identificarea anoma liilor generatoare de boală. Pe lângă precizarea diagnosticului clinic,
citogenetica a fost de asemenea folosită în cercetarea genomică de bază. Unii autori consideră
că este mai bine ca citogenetica să fie inc lusă în termenul "citomică", ceea ce înseamnă că
informația structurală și funcțională este ob ținută prin analiza moleculară a fenotipului celular
al țesuturilor, organelor și organismelor la nivel de celulă unică prin citometrie în flux în
combinație cu extracția cunoștințelor de bioinformatică în ceea ce privește acizii nucleici,
proteine și meta boliți (genomică celulară, proteomică, și metabolomică), precum și parametrii
de funcționare celulară cum ar fi ph -ul intracelular, potențiale transmembranare și gradiente
ionice. )

2. Principiu

Cromozomii sunt vizualizați, cel mai frecvent, din limfocite o bținute din sângele periferic.
Acestea sunt puse în culturi și forțate să se dividă și apoi sunt blocate în metafază. Odată
intrate în metafază, microtubulii fusului de diviziune sunt opriți, celulele sunt lizate și etalate
pe lamă. Metafazele obținute pe lamă pot fi colorate cu Giemsa, care reprezintă bandarea G
clasică găsită în majoritatea protocoalelor de cariotipare. În funcție de poziția centromerului,
pot fi distinse trei tipuri de cromozomi: cromozomi metacentrici, cu un centromer situat
aproximativ în mijloc; cromozomi submetacentrici, având două brațe de lungime inegală și
cromozomi acrocentrici cu centromeri la sau aproape de capete. Fiecare cromozom are un braț
lung, numit braț q și un braț scurt numit braț p. Benzile vizibile după bandarea G
caracterizează fiecare cromozom individual ceea ce permite clasificar ea și numerotarea
cromozomilor și în consecință identificarea posibilelor rearanjări.

22
Citogenetica clasică a evoluat de la imagini în alb negru la imagini color a
cromozomilor ca rezultat a l progresului tehnicilor FISH, numită acum citogenetică clasică.
Îmbunătățirile în calitatea și diversitatea probelor potrivite pentru FISH, împreună cu
progresul analizei compute rizate a imaginilor, permit analizarea în detaliu pe lamă a
genomul ui sau a țesutul ui de interes. Este evident că lista crescătoare de opțiuni pentru analiza
citogenetică a îmbunătățit înțelegerea schimbărilor cromozomiale implicate în inițierea bolii,
progresia și răspunsul la tratament.
Arhitectura genomului uman, destăinuit de proiectul de secvențiere a genomului uman,
explică recurența microdelețiilor și microduplicațiilor cauzate de o recombinare homologă
non-alelică care implică duplicații segmentare create în timpul evoluției primatelor.
Citogenetica moleculară va permite e valuarea mai departe a fundamentelor moleculare
implicate în apariția anomaliilor cromozomiale structurale. (11)

3. Indicații

Citogenetica constituie o unealtă de diagnostic importantă pentru a determina și/sau a
confirma sindroame specifice, utilitatea acesteia este îndreptată către selectarea tratamentelor
și monitorizarea pacienților folosind proceduri diferite. Aceste proceduri sunt realizate pentru
a obține un cariotip din sânge periferic sau câteva biopsii tisulare (s pre exemplu pacienți cu
melanom, cancer de sân, biopsii de piele, ș.a). Cu toate acestea, studiul anomaliilor
cromozomiale în culturi celulare este limitat de procese complexe cum ar fi obținerea crește rii
celulare și a unui număr suficient de metafaze, ca re în schimb împiedică șansa de a obține un
număr practic de împrăștieri metafazice pentru a putea desfășura o analiză citogenetică
adecvată, ca re trebuie să prezinte o morfologie bună, o dispersie adecvată și bandare corectă.
Având în v edere importanța m odelul ui folosit pentru a examina și manipula procese
moleculare și celulare potențial relevante care stau la baza neoplaziilor, este necesară
obținerea unui cariotip precis și cuprinzător pentru culturile diferitelor linii celulare. În
schimb, cariotipare a oferă o înțelegere a mecanismelor moleculare care duc la t ransformare
celulară și permite clarificarea posibilelor aberații citogenetice asociate cu expunerea la
drogu ri și dezvoltarea și progresia diferitelor tipuri de cancer. Creșterea rapidă observată în
incidența cancerului a forțat realizarea a numeroase studii de identificare a biomarkerilor

23
citogenetici asociați dezvoltării acestei boli, care ar putea contribui la o înțelegere mai bună a
procesului carcinogenic și care ar putea de asemenea avea imp licații enorme în ceea ce
privește d ezvoltarea terapiilor eficace antitumoral e.
Obținerea celulelor metafazice pentru analiza cromozomială necesită folosirea unor
serii de reactivi, protocoale, și condiții de mediu, pe lângă altele, care vor permite adunar ea
cromozomilor. Celulele metafazice trebuie cultiv ate în anumite condiții pentru a putea obține
un număr corespunzător de celule în diviziune, care trebuie să crească și să se dividă rapid în
acest mediu. Luând în considerare toate aceste probleme, cunoșt ințele exacte referitoare la
mediul de cultură și condițiile sale, precum și tehnicile și protocoalele necesare în general, vor
permite o bună creștere celulară în cultură și colectarea cromozomilor pentru desfășurarea
caracterizării citogenetice și ident ificarea anomaliilor cromozomiale prezente în celulele
studiate.
Aplicarea studiilor de citogenetică pe linii celulare tisulare sau canceroase a devenit
importantă în ultimii ani, deoarece prezența unor anomalii cromozomiale indică prognosticul
bolii și r ăspunsul la terapie. Cele mai c omune aplicații ale studiilor citogenetice pe linii
celulare sunt: stabilirea tipului de anomalii cromozomiale și frecvența acesteia ; identificarea
genelor localizate în regiunile cromozomiale afectate , posibil implicate în d ezvoltarea
neoplaziilor; studierea proceselor tumorigene și metastatice, apoptozei și funcționalității
celulare ; identific area mecanismelor de acțiune al hormonilor; elaborarea modelelor pentru
studii de rezistență la medicamente; determinarea potențialelo r terapeutice ale diferitelor
tratamente; permiterea cercetărilor ulterioare.
Cunoștințele în legătură cu noile rearanjări și puncte de ruptură cromozomiale
identificate ar putea fi folositoare pentru studiile moleculare, genetice și epigenetice ulterioar e
asupra cancerului și care ar putea ajuta în înțelegerea mecanismelor implicate în dezvoltarea și
progresia ace stei boli. (12)

4. Limite

Obținerea celulelor met afazice în vederea analizei cromozomilor necesită folosirea unor
reactivi care vor permite adunarea cromozomilor. Celulele metafazice trebuie crescute in vitro
în anumite condiții pentru a putea obține un număr adecvat de celule în diviziune. Celulele
utilizate pentru captarea cromozomilor trebu ie să fie capabile de creștere și diviziune rapidă în

24
mediul de cultură. Diferite tipuri de celule pot necesita factori de creștere specifici, odată ce
necesitățile de bază pentru fiecare tip de celulă sunt cunoscute, este selectat mediul de cultură
potriv it și verificată sterilitatea. După ce cultura a atins 80% din confluență, celulele sunt
culese și fixate pentru a obține o suspensie citogenetică. Culturile sunt oprite în metafază sau
prometafază prin inhibarea polimeri zării tubulinei, astfel fiind preve nită formarea fusului
mitotic (folosind colcemid sau velbe). După expunerea la colcemid sau velbe, celulele sunt
tratate cu o soluție hipotonică pentru a facilita dispersia cromozomilor și ulterior fixate cu
acid acetic. Celulele fixate sunt răspândite pe lamă și uscate la aer, pentru ca î n final să fie
folosite tehnici de bandare în scopul identificării corecte a cromozomilor. Numă rul de
metafaze obținut este câ teodată inadecvat pentru analiza cromozomială, astfel că este necesară
creșterea continuă a lini ei celulare.
Pentru a asigura creșterea celulelor obținute din mostre d e țesut tumoral și obținerea
celulelor în metafază este important să se țină cont de toate condițiile de prelevare. Mostre
sterile de țesut tumoral non -necrotic sunt colectate într -un recipient de transport folosind
condiții optime de sterilitate ; de exemplu, un tub steril ce conține mediu de cultură steril, un
antimicotic și o concentrație dublă de antibiotice, ce va fi transportată la laborator în condiții
de temperatură controlată.
Mostra de țesut tumoral trebuie să fie reprezentativă, sterilă și viabilă. În vederea
asigurării creșterii celulare rapide și prevenirea contaminării cu alte tipuri celulare, culturile
vor fi incubate într -un flacon mic de cultură sau direct pe lame montate în camere multi -well.
Atașarea celulară, proliferarea și rata mitotică trebuie monitorizate prin examinare zilnică cu
ajutorul unui microscop inversat. (13)
Pentru a obține preparatele metafazice , culturile pot fi tratate cu Colcemid sau Velbe,
tripsinizate, centrifugate, bal onizate în mediu hipoton și fixate. Lamele sunt pe urmă gata
pentru analiză citogenetică convențională sau moleculară.
Aplicația citogeneticii în domeniul oncologiei a dobândit în ultimele două decade o
importanță mare nu numai ca o unealtă de diagnostic inestimabilă dar și ca o puternică unealtă
de cercetare. Ca unealtă de diagnostic a permis identificarea și înțelegerea aberațiilor
cromozomiale printre multe altele, a transformărilor maligne în multe can cere, lucru care a
adus informații importante despre biologia cancerului. Ca unealtă de cercetare citogenetica
aduce informații despre aberații specifice ale unui nou tip de oncogene posibil implicate în
transformarea malignă, ce poate fi analizat în detal iu cu ajutorul cercetărilor moleculare, astfel
permițând o înțelegere mai bună a mecanismelor molecul are implicate în carcinogeneză.

25
Date fiind cele de mai sus, cunoștințele și utilizarea tehnicilor de citogenetică permit aplicarea
corectă atât în domeniul diagnosticului cât și cerc etării direcționate către îmbunătățirea
cunoștințelor noastre a diferitelor patologii asociate cu anomalii cromozomiale. (14)

IV. CGH convențional – definiție, principiu, indicații,
limite

1. Definiție

Hibridizarea genomică comparată (CGH) a fost o metodă dezvoltată pentru a realiza o
scanare completă a genomului uman, într -o tentativă de a identifica modificări ale numărului
de copii ADN, mai precis instabilitatea genomică. Dezvoltată în 1992, tehnica CGH
reprezintă hibridizarea competitivă a unui ADN test și a unui ADN normal, marcați cu diferiți
fluorocromi. Tehnica originală folosea metafaze normale pe lamă fixă și este cunoscută ca
CGH metafazică, cromozomială sau convențională. (9)
Deleții sau duplicații ale unor regiuni cromozomiale specifice sau a întregului cromozom
pot fi detectate cu ajutorul unei tehnici numite hibridizare genomică comparată (CGH). ADN
este extras dintr -o sursă de testat, cum ar fi celulele dintr -o tumoră sau celulele din sângele
unui pacient. ADN -ul astfel obținut este marcat cu o substanță care văzută prin microscopie
fluorescentă emite o culoare (roșu); ADN -ul obținut din celule normale de control este marcat
cu altă culoare (verde). În prima vers iune de CGH, ambele seturi de ADN sunt hibridizate la
cromozomi metafazici normali pe un frotiu. Dacă oricare regiune cromozomială este duplicată
în celula tumorală, atunci regiunea corespunzătoare a cromozomului metafazic va hibridiza cu
cantități excesiv e de ADN marcat cu roșu. Această regiune va apărea roșie privită la
microscop. Pe de altă parte, dacă o regiune este deletată în celula tumorală, atunci regiunea
corespunzătoare cromozomului metafazic va hibridiza doar cu ADN -ul de control marcat cu
verde, iar regiunea va apărea verde la microscop. CGH este folositoare în special pentru

26
scanarea delețiilor și duplicațiilor materialului cromozomial în celulele canceroase, unde
detecția unor asemenea alterații pot ajuta la aprecierea tipului și/sau severități i cancerului.
(10)

2. Principiu

Prin această tehnică, cantități egale de ADN de testat (de regulă marcat cu un
fluorocrom verde) și ADN normal de referință (marcat cu fluorocrom roșu) sunt co –
hibridizate pe preparate de cromozomi umani obținuți în metafază. În tim pul procesului de
hibridizare, cele două populații ADN concurează pentru secvențele lor echivalente pe
substratul cromozomilor. Cantitatea relativă de ADN test și de referință atașată de o regiune
cromozomială da tă reflectă relativa abundență a acestor secvențe în ambele probe. Prin
urmare, semnalele fluorescente diferențiale emise de cromozomii metafazici indică câștig sau
pierdere de material genetic (modificări ale numărului de copii) în ADN -ul testat relativ cu
ADN -ul de referință. Semnalele sunt citite cu ajutorul microscopului cu fluorescență și
cuantificate prin analiză imagistică pentru a genera profilul raportului verde -roșu.
Intensitatea crescută a fluorescenței verzi sau proporția verde -roșu crescută ( >1.0)
reprezintă câștig de ADN pe un locus particular în proba test, în timp ce intensitatea crescută a
fluorescenței roșii sau proporția verde -roșu scăzută (<1.0) indică deleție ADN pe un locus
particular în proba test (Fig. 8 ). O regiune cromozomială făr ă modificări ale numărului de
copii (proporție 1.0) se va colora în mod egal pentru verde și roșu, producând un semnal
galben fluorescent. (15)
În tehnica CGH convențională folosind ADN extras din sute sau mii de celule,
dezechi librele cromozomiale sunt detectate doar dacă sunt prezente în majoritatea celulelor
din specimen. Astfel că informația despre heterogenitate poate fi pierdută. În plus, evenimente
celulare rare, cum ar fi boala reziduală minimală, unde o singură celulă sa u puține celule sunt
valabile pentru studiu, nu au putut fi inițial analizate prin tehnica CGH convențională.
Cu toate acestea, au fost dezvoltate protocoale pentru analiza CGH monocelulară. O
premisă pentru analiza CGH monocelulară sunt metodele pentru am plificarea ADN
monocelulară care dau produși de amplificare ce rețin diferențele numărului de copii al
genomului original. Astfel de abordări au fost aplicate pentru facilitarea diagnosticului
prenatal sau pentru analiza bolii reziduale minime. (16)

27

Fig. 8 . Reprezentare schematică a tehnicii CGH. ADN test și de referință sunt etichetate
direfențial (verde, respectiv roșu) și co -hibridizate la preparate metafazice umane normale.
Vizualizarea cromozomilor cu ajutorul miscroscop iei fluorescente relevă diferențe ale
semnalelor fluorescente în rândul cromozomilor, reprezentată de abundența secvențelor de
ADN test comparativ cu secvențele de referință. Analiza imaginilor capturate oferă un profil
al proporției culorilor indicativ al schimbărilor numărului de copii în ADN -ul test comparativ
cu cel de referință. (17)

28
3. Indicații

Tehnica CGH metafazică își are aplicabilitatea principală în domeniul geneticii
oncologice (Albertson and Pinkel, 2003, Weiss et al., 2003a, Weiss et al., 2003b). Au fost de
asemenea testate și alte aplicații clinice cum ar fi dismorfolo gia, dizabilităț ile intelectuale și
de învățare, demonstrând o creștere în diagnosticarea delețiilor sau duplicațiilor neidentificate
de bandarea G (Kirchhoff et al., 2001, Ness et al., 2002). Pentru diagnosticul prenatal,
studiind fetuși cunoscuți ca fiind purtători de aneuploidii, tehnica a fost validată retrospectiv
ca fiind echivalentă cu tehnici citogenetice de înaltă rezoluție, dar cu avantajul de a nu
necesita culturi celulare. Un alt studiu a dem onstrat utilitatea acesteia ca unealtă
complementară la cariotiparea convențională la un grup de fetuși cu defec te de perete
abdominal. Cu toat e acestea delimitarea regiunilor și benzilor specifice în tehnica CGH
convențională este limitată de rezoluția cromozomilor metafazici și este estimată a fi între 3 și
10 Mb, fiind cea mai limitată (Kallioniemi et al., 1992, Bryndorf et al., 1995, Kirchhoff et al.,
1999). (18)
Aplica țiile CGH în domeniul ce rcetării oncologice include screening -ul tumorilor
pentru detectarea aberațiilor genetice, cercetarea genelor implicate în carcinogeneza unui
subset particular de cancere, analiza tumorilor în modele experimentale pentru facilitarea
înțelegerii progresiei tumorale, clasificarea diagnosticului și stabilirea prognosticului. În
prezent CGH este efectuat într -un număr mare de laboratoare și o varietate mare de tumori au
fost analizate. Pe lângă aplicațiile oncologice, analiza CGH a fost de asemenea utilizată pentru
studierea aberațiilor cromozomiale în genomul fetal și neonatal.
Tehnica CGH a fost utilizată pentru a defini regiuni cromozomale câștigate sau
pierdute într -o varietate de specimene tumorale, linii celulare derivate și specim ene arhivate.
În cazul specimenelor tumorale primare, raporturi recente au documentat schimbări ale
numărului de copii cromozomale în carcinoame mamare , carcinoame pulmonare cu celule
mici, glioame maligne și melanoame uveale. Pentru cancerul mamar , un stu diu a efectuat
analiza CGH a 33 de specimene tumorale primare din care 28 au prezentat creșteri ale
numărului de copii ale cromozomilor în întregime, brațelor cromozomilor și/sau regiuni.
Câteva din aceste câștiguri cromozomale (1q, 8q) au fost găsite ante rior ca fiind anomalii
citogenetice recurente în cancerul mamar , iar studii de genetică moleculară au documentat
amplificări ale anumitor gene și anume: ERBB2 (17q12), MYC (8q24), PAD1/CCND1
(11q13), FLG (8p12) și IGFR -I/FES (15q25). Totuși, multe din tre câștigurile identificate prin

29
analiza CGH au fost de novo și au inlcus o amplificare de nivel înalt, observată frecvent, a
secvențelor ADN derivate din 17q22 -24 și 20q13. Identitatea genelor amplificate din această
regiune rămâne a fi determinată. De asem enea, aceste regiuni au fost raportate a fi
suprareprezentate într -o serie de linii celulare ale cancerului mamar . Pentru a confirma aceste
amplificări (17q22 -24, 20q13), a fost efectuată hibridizarea fluorescentă in situ (FISH) a
nucleilor interfazici din liniile ceululare tumorale folosind ca probe cosmide obținute din
librării de cosmide cromozom -specifice. În fiecare caz, au fost identificate două cosmide
amplificate. Acest studiu asupra cancerului mamar s-a concentrat în primul rând pe câștigurile
de secvențe ADN în ADN -ul test. (19)
Studii CGH recente efectuate pe ADN -ul obținut din carcinoame pulmonare cu celule
mici (SCLC), glioame maligne și melanoame uveale, au identificat, fiecare, loci noi
cromozomali din care provin secvențele ADN ampli ficate . Pentru 13 cazuri de SCLC, banda
cea mai frecvent implicată în evenimente de amplificare de nivel înalt a fost 19q13.1, în timp
ce câștiguri ale brațelor întregi ale cromozomilor au fost observate pentru 3p, 5p, 8q și 17q.
Acest studiu a identificat de asemenea pierderi ale brațelor cromozomale (3p, 5q, 10q, 13q,
17p) cu situsurile 13q și 17p posibil reprezentând pierderea genelor supresoare tumorale RB1
și respectiv TP53. Glioamele maligne, după analiza CGH, au prezentat amplifi carea
secvențelor ADN derivate din 7p12 (EGFR), precum și al altor situsuri care nu se cunoșteau a
purta gene amplificate. Pierderi ale unor regiuni cromozomiale au fost de asemenea detectate,
iar în câteva cazuri rezultatele CGH au fost confirmate fie pri n FISH a nuclei lor tumorali
interfazici cu YAC (Yeast Artificial Chromosomes , folosit ca un sistem vector pentru
clonarea fragmentelor de ADN ) marcați adecvat, FISH a cromozomilor metafazici tumorali
cu probe colorante cromozom -specifice și/sau analiza amp rentei ADN. Anali za CGH a 11
melanoame uveale, a indicat că cele mai comune alterații genetice în aceste tumori sunt
pierderea cromozomilor 3 și 6q, precum și câștigul secvențelor ADN provenind din 6p și 8q.
(20)
Pe lângă util izarea tehnicii CGH pentru a scana complemente genomice tumorale
pentru câștiguri sau pierderi, au existat trei rapoarte a utilizării tehnicii pentru a identifica
originea unor secvențe ADN implicate în mod specific într -o anomalie citogenetică raportată.
Într-un raport, au fost observate dmins (double minutes , fragmente mici de ADN
extracromozomal, marca citogenetică a amplificărilor genomice în cancer ) după analiza
cariotipului unei leucemii acute mielo ide, dar gena amplificată nu a fost cunoscută. Aplica ția
CGH la ADN -ul tumoral a demonstrat un semnal fluorescent crescut al ADN -ului test pe
8q24. Ulterior, un test PCR semi -cantitativ a fost utilizat pentru a confirma că gena candidată

30
(MYC) cartată pe 8q24, a fost într -adevăr amplificată în această leucem ie. CGH a identificat
amplificarea secvențe lor ADN provenind din doi loci ai cromozomului 12 (în loc de cel
așteptat) în cromozomii inelari supranumerari caracteristici liposarcoamelor bine diferențiate.
Un alt studiu pe specimene de cancer mamar primar a modificat tehnica CGH astfel în cât doar
câștigurile să fie detectate. În această serie de 17 specimene, după analiza car iotipului,
prezența dmins și HRS s (regiuni colorate omogen) au reprezentat dovada amplificărilor
genice. Câștiguri similare de material cromozomal au fost detectate după descrierea de mai
sus, pentru cele 33 de carcinoame mamare, cu puține diferențe. Aplicarea unui test CGH
modificat similar la o serie de tumori ale celulelor germinale masculine, a condus la
identifi carea derivației cromoz omale HRS s și a cromozomilor marker neidentificați până
atunci. În toate cazurile, copii în plus ale cromozomului 12p au fost detectate de CGH, iar
regiunile cromozomale 16p, 20q și 1p 32 -36 și benzile cromozomale 11q13 și 12q24 au fost
găsite suprarepreze ntate în aceste tumori.
Întrucât analiza CGH a specimenelor tumo rale solide identifică derivate câștigate și
pierdute ale secvențelor ADN în celulele tumorale, strategii de genetică moleculară pot fi
folosite pentru a izola noi secvențe genice din acești loci cromozomali. Un număr de regiuni
găsite a fi câștigate/pierdute în tipurile tumorale descri se mai sus (de exemplu amplificarea
8q24 în cancerul mamar și pierderile 13q, 17p în SCLC) sunt locații ale genelor cunoscute
deja ca fiind implicate într -o măsu ră în carcinogeneză și progresie tumorală (MYC, RB1 și
respectiv TP53). Totuși analiza CGH a id entificat schimbări în numărul de copii a multor loci
cromozomali noi ale tumorilor studiate până în prezent. Este evident că celulele tumorale
prezintă multiple câștiguri și pierderi de material genetic care au rămas nedetectate de către
tehnicile citogen etice tradiționale. CGH, însă, nu este capabil să detecteze cea mai comună
anomalie cromozomală nealeatorie identificată citogenetic, și anume rearanjarea. Prin urmare,
nu sunt testate prin CGH o c lasă de perturbări cromozomale, care, cel puțin în tumorile
hematopoietice și mezenchimale, sunt cunoscute a fi asociate cu anumite etiologii tumorale .
De departe, cea mai importantă informație care a fost obținută prin analiza CGH, a fost
identificarea regiunilor cromozomale amplificate în tumori. Multe regiuni noi s -au demonstrat
a fi câștigate în mod frecvent în tumori și justifică analize suplimentare. Corelați ile regiunilor
câștigate (și posibil a altor anomalii cromozomale) cu trăsături le clinice ale tumorii pot
dezvălui situsuri genice implicate în progresi a tumorală care pot oferi indicatori de prognostic
clinic a bolii. Astfel de regiuni cromozomale reprezintă ținta studiilor suplimentare de
genetică moleculară. Caracterizarea moleculară a genelor implicate în aceste locații
cromozomale poate implica testa rea alterațiilor genelor candidate cartate în tumora respectivă,

31
FISH a cosmidelor cartate și YAC a cromozomilor metafazici tumorali sau a nucleilor
interfazici pentru a testa schimbările în numărul de copii, precum și aplicarea unor tehnici
variate de gen etică moleculară pentru izolarea și caraterizarea secvențelor de ADN alterat din
cosmide și YAC. În cancerul mamar , două cosmide au fost deja identificate a fi conținute în
ampliconii derivați din 17q22 -24 și 20q13. Studii suplimentare sunt în derulare în scopul
folosirii acestor cosmide pentru a defini regiunea amplificată în detaliu și pentru a identifica
secvențele exprimate. Capacitatea CGH de a efectua o scanare globală a complementului
genomic aparținând unei tumori pentru depis tarea secvențelor ADN c âștigate a mărit în mo d
considerabil lungimea complementului ce poate fi testat pentru amplificare, care anterior era
limitat la gene cunoscute ce puteau fi folosite ca probe în hibridizarea Southern.
Deleții ale regiunilor cromozomale sunt mai dificil de detectat de analiza CGH decât
câștiguri de material genetic. După cum a fost descris mai sus, abilitatea de a detecta
pierderile de secvențe ADN depinde foarte mult de mărimea regiunii implicate. În Figura 11,
este vizibilă o deleție pe 9p13, corelată cu studii recente ce indică pierderea heterozigozității
pentru markeri din această regiune î n LNH (limfoame non -Hodgkin) difuze cu celule mari.
Detectarea celor mai des întâlnite regiuni deletate în rândul tumorilor prin analiza CGH
semnalează regiuni cromozo male care trebuie analizate prin studii ale pierderii
heterozigozității ce utilizează probe polimorfice cartate fie pin analiza polimorfismului
lungimii fragmentelor restricționate sau testarea polimorfismului di- sau trinucleotidelor
bazată pe PCR. Foarte probabil, specimene din cadrul acelui tip tumoral ce nu prezintă o
pierdere a secvențelor ADN după analiza CGH vor fi ținta acestor studii p entru a defini o
regiune deletată minimal și potențial rezultând în izolarea unor noi gene supresoare tumorale.
(17)

4. Limite

CGH este o tehnică relativ dificilă și consumatoarea de timp cu o serie de limitări. Aceasta
nu poate detecta aberații cromozomiale structurale fără schimbări ale numărului de copii, cum
ar fi translocații cromoz omiale echilibrate, inversiuni sau cromozomi inelari și nu oferă
informații referitoare la arhitectura tisulară. CGH detectează câștigurile și pierderile de
material genetic în relație cu nivelul de ploidie. Are de asemenea dezavantajul de a fi mai
puțin s ensibilă în detectarea delețiilor decât metodele bazate pe PCR (Polymerase Chain

32
Reaction). Rezultatele CGH nu sunt distribuite linear. Teoretic, din câștigul sau pierderea unei
copii a unui cromozom anume într -un genom diploid ar trebui să rezulte o propo rție
fluorescentă de 0.5 sau 1.5. Cu toate acestea, în experimente ce compară ADN -ul feminin cu
cel masculin, unde proporția fluorescentă pentru cromozomul X ar trebui să fie 0.5 sau 2.0,
aceste proporții nu sunt găsite în practică.
Sensibilitatea tehnici i CGH poate fi afectată prin contaminerea materialului tumoral cu
celule normale, în plus sensibilitatea CGH depinde de nivelul și dimensiunea variațiilor
numărului de copii. Pe baza simulărilor experimentale, o creștere cu 50% a numărului de
copii ar fi detectabilă dacă regiunea este de 2 perechi de megabaze sau mai mare, iar o regiune
amplificată (amplicon) de 25 perechi de kilobaze ar avea nevoie de o creștere cu 400% a
numărului de copii. Limita minimă de detecție este determinată de produsul excesului
numărului de copii și dimensiunea regiunii amplificate. Atunci când deleția este 100% (nu
este prezentă nici o copie), poate fi obținută o rezoluție de 1 -2 Mb. În urma experimentelor
CGH dimensiunea critică de detecție a fost estimată a fi între 10 -20 Mb.
Prepararea cromozomilor metafazici, în concordanță cu protocoalele standard, se face
folosind limfocitele obținute din sângele periferic stimulat cu fitohemaglutinină de la un
bărbat sau o femeie normali cariotipic. Deoarece femeile au doi cromozomi X, ia r
cromozomul Y nu conține prea multă informație genetică, se preferă folosirea preparatelor
obținute de la femeie. Preparatele de înaltă calitate pentru analiza CGH este ideal să prezinte
citoplasmă puțină (citoplasma abundentă previne denaturarea optimă) , suprapunere minimă a
cromozomilor (cromozomii ce se suprapun trebuie excluși din analiza CGH) precum și o
densitate celulară scăzută cuplată cu un index mitotic crecut. Pe lângă acestea, cromozomii
trebuie să prezinte o lungime adecvată (400 -500 benzi) f ără să conțină cromatide separate. În
final pentru a obține o bandare bună, cromozomii trebuie să apară întunecați și nu strălucitori
priviți la microscopul în contrast de fază.
Pe scurt, 1 ml de ser heparinat este adăugat la 10 ml mediu de cultură Ham F1 0 ce
conține ser de vițel (10%), L -glutamină (1%), penicilină și streptomicină (1%) și
fitohemaglutinină (1.5% în apă distilată) ce este apoi incubat la 37șC în atmosferă 5% CO₂
pentru 72 de ore. Celulele sunt blocate în metafază prin adăugare de colchicin ă la o
concentrație finală recoltată de 0,01 µg/ml, sunt apoi recoltate, tratate cu KCl hipotonă și
fixate în metanol/acid acetic 3:1. O etapă esențială a procedurii este picurarea pe lamă a
suspensiei celulare fixate. Succesul acestei etape depinde de num eroși factori (cum ar fi
temperatura, calitatea suspensiei celulare și condțiile de laborator), iar picurarea suspensiei
celulare este cel mai bine să se facă de la o distanță de aproximativ 30 cm pe lame curățate cu

33
etanol. De obicei, o picătură de suspen sie celulară este de ajuns pentru a obține preparate
metafazice pentru un experiment CGH. Este de preferat ca lamele s ă fie evaluate cu un
microscop în contrast de fază. Dacă pe lame încă sunt vizibile cantități mari de citoplasmă
reziduală, este indicat c a etapa de fixare (3:1 metanol/acid acetic) să fie repetată de câteva ori.
În pregătirea experimentelor CGH este importantă testarea mai multor loturi de preparate
metafazice de la donatori diferiți, deoarece comportamentul acestora poate varia în timpul
hibridizării. Ca o alternativă, preparate metafazice complete gata pregătite sunt comercial
valabile. Dar chiar și acestea trebuie testate înainte de folosire, iar calitatea nu este neapărat
mai bună decăt cea a preparatelor realizate în laborator ul propriu .
Calitatea ADN -ului reprezintă o problemă importantă în efectuarea analizei CGH.
ADN -ul extras din țesut proaspăt sau înghețat este de regulă de mărime moleculară mare
(nedegradat) și de cea mai bună calitatea în scopul etichetării. În timpul procesului de
etichetare, prin intermediul translației crestăturii (deschiderea ADN prin producerea de
crestă turi și substituirea nucleotidelor neetichetate cu digoxigenină, biotină sau nucleotide
marcate cu fluorocrom), ADN -ul devine mai scurt, iar în cazul materialelor fixate în formol,
fragmentele ADN devin prea mici pentru analiza CGH optimă. Legarea încrucișată a ADN –
ului cauzată de agentul fixator poate împiedica funcționarea normală a enzimelor, ADN
polimeraza și ADN -aza, rezultând în încorporarea defectuoasă a nucleotidelor modificate.
Acest lucru va conduce la un model neregulat de hibridizare a cromozomilor metafazici. În
consecință, diferențele de intensitate a semnalului dintre ADN -ul test și de referință vor fi mai
puțin pronunțate.
Contaminarea (sau diluția) ADN -ului tumoral cu ADN normal (spre exemplu din
celule stromale și inflamatorii) preprezintă o problemă nedorită dar inevitabilă întâmpinată în
analiza tumorilor. Efectul asupra rezultatelor CGH va fi schimbarea proporției verde -roșu
către 1.0, astfel încât , dacă mostra tumorală conține prea mult ADN normal, aberațiile
cromozomiale pot rămâne nedetectate. Într-o tumoră triploidă, câștigul (4:3) sau pierderea
(2:3) unei singure copii devine nedectabilă la un proce nt de 50% contaminare, în timp ce într –
o tumoră diploidă câștigul (3:2) sau pierderea (1:2) unei singure copii rămânde nedectată la
75% contaminare. Prin urmare, atunci când peste 75% din celule sunt neoplazice, pot fi
procesate secțiuni întregi . În cazuri le ce prezintă mai puțin de 75% conținut tumoral, se pot
realiza microdisecții din secțiunile realizate din țesutul tumoral, prin demarcarea limitelor cu
un marker , raclarea cu un cuțit chirurgical și recoltarea în tuburi Eppendorf. În plus,
echipament ava nsat de microdisecție cu laser poate fi folosit, dar acesta este scump și adesea
nu este necesar. Celulele inflamatorii sunt în mod particular mai greu de secționat, deoarece

34
de multe ori acestea au infiltrat țesutul tumoral. Tehnici de sortare celulară (d e exemplu
anticorpi atașați la bile magnetice sau sortarea citometrică în flux) permit selectarea (și
extracția) celulelor tumorale sau eliminarea celulelor inflamatorii, pentru a produce o mostră
mai pură de ADN tumoral.
Sunt necesare aproximativ 0.5 -1 µg de ADN pentru o analiză CGH. În cazul
carcinoamelor aceasta nu reprezintă de obicei o problemă. Mostre mici, în schimb,de exemplu
biopsii din leziuni premaligne ar putea să nu conțină ADN suficient. În această situație DOP –
PCR și alte tehnici au fost fol osite în scopul amplificării ADN -ului. Datorită modului
nealeatoriu în care DOP -PCR poate amplifica ADN -ul acesta ar putea da rezultate nefiabile.
Prin urmare tehnici de control adiționale (cum ar fi experimente CGH repetate cu probe
marcate invers) trebui e inluse în fiecare experiment CGH.
O metodă standard, translația incizurii este folosită pentru a eticheta și digera ADN -ul
la fragmente de dimensiunea optimă de 500 -1500 pb. O cantitate mică de ADN (0.5 -1.0 µg)
este suficientă. Când deoxinucleotide (dT UP) biotinilate și digoxigenin conjugate sunt
încorporate ADN -ului (etichetare indirectă) după hibridizare, este necesară o etapă de
detectare cu anticorpi fluorocrom conjugați – avidin -fluorescein izotiocianat (FITC) și
antidigoxigenin de oaie – tetrameti l rodamină izotiocianat (TRITC). Deoxinucleotidele care
au fost conjugate direct cu fluorocromi dau o hibridizare mai ușoară dar cu un semnal mai
slab în rândul cromozomilor. Este important ca fragmentele ADN marcate atât test cât și de
referință să fie de aceeași lungime și cu limite între 500 -1500 pb. Acest lucru poate fi verificat
prin electroforeză pe gel de agaroză 1% colorat cu bromură de etil.
Regiuni cromozomale cu secvențe ADN scurte și repetitive apar la nivelul întregului
genom, dar în număr mai mare la nivelul centromerilor, telomerilor și în câteva regiuni
specifice (brațele 1p și 16p ale cromozomilor și cromozomii 19 și 22). Dimensiunea acestor
regiuni variază mult cu fiecare individ (și în concluzie între ADN -ul test și cel de referință),
iar acest lucru poate interfera cu analiza CGH. Așadar, regiunile ADN repetitive sunt blocate
cu ADN Cot -1 (ADN placentar de 50 -100 pb, care este îmbogățit pentru secvențe ADN
repetitive). Blocarea suboptimală poate duce la o amplitudine redusă a proporției v erde-roșu,
iar câștigurile sau pierderile de material genetic po t rămâne nedetectate. Ca o alternativă la
blocare, îndepărtarea secvențelor repetitive din probă poate fi o altă soluție pentru acestă
problemă.
Alicoturi de 300 -350 ng de ADN tumoral și de r eferință marcate (probele) sunt
amestecate cu 100 de ori cantitate a de ADN Cot -1 uman necesară , precipitată și solvită în tr-un
mix de hibridizare de 6 µl ce conține 50% formamidă (care scade temperatura de topire a

35
ADN -ului) și 10% dextran sulfat (ce creșt e concentrația efectivă a probei) în 2x citrat de
sodiu, pH 7.0. Potrivirea pe sexe a ADN -ului test și de referință nu este necesar. De fapt,
proporția fluorescentă inegală rezultată pentru cromozomul X poate funcționa ca un control în
plus a calității exp erimentului. Totuși , potrivirea pe sexe ar trebui luată în vedere în analiza
cromozomului X. Proba și preparatele metafazice normale sunt denaturate separat: preparatele
în 70% formamidă/2x citrat de sodiu la 72șC pentru 5 -10 minute, ia probele în baie de apă la
80șC pentru 10 minute. Hibridizarea are loc într -un incubator cu umiditate la 40șC pentru
două până la patru zile. După hibridizare lamele sunt spălate și colorate cu DAPI (0.35 µg/ml
în soluție anti -decolorare) pentru a produce un model de banding ce permite identificarea
cromozomilor și cariotiparea.
Pe scurt, analiza preparatelor CGH cuprinde următoarele etape.
Vizualizarea fluorescenței unei metafaze pentru DAPI (albastru; pentru identificarea
cromozomilor), TRITC (roșu , ADN normal de referință ) si FITC ( ADN test, tumoral) se face
folosind un microscop cu fluorescență. Sursele de lumină tip lampă cu arc de mercur sunt
adecvate dacă sunt stabile și pot fi aliniate pentru a ilumina uniform fără a determina variații
cromatice. Obiectivul trebuie să fie de tip plan, apocromatic, cu puterea de mărire x65 sau
x100, în funcție de rezoluția camerei. Obiectivul tr ebuie să po ată transmite lumina UV și nu
trebui e să existe autofluore scență a lentilelor. Filtrele folosite trebuie să minimizeze
întrepătrunderea celor trei fluorocromi, ceea ce înseamnă că filtrele cu benzi înguste sunt
necesare pentru excitare și emisie. Totuși, pe măsură ce banda filtrului devine mai îngustă,
luminozitat ea semnalelor restante diminuă, ceea ce poate rezulta în timpi lungi de expunere.
Așadar, filtrele asigură cel mai bun compromis dintre întrepătrunderea semnalelor și
luminozitate. Deplasarea laterală cauzată de schimbarea filtrelor trebuie să fie minimă, o roată
de filtru automată sau corectarea software pot rezolva această problemă. Camera ar trebui să
ofere o rezoluție spațială de 0.01 µm la nivel de specimen, pentru a da o imagine de
aproximativ 600×600 pixeli pentru o metafază obișnuită. Un ecran color de înaltă calitate de
dimensiuni suficiente (17 inci) este necesar pentru afișarea adecvată a imaginilor color și a
interfeței grafice a sistemului. În selectarea metafazelor pentru captură, trebuie luate în
considerare următoarele criterii: semnalele de hibridizare trebuie să fie puternice și omogene,
și nu granulare; fundalul trebuie să fie minim (fără citoplasmă reziduală); cromozomii tuturor
metfazelor trebuie să fie de aceeași lungime (nu prea lungi sau prea scurți). Captura poate fi
făcută atât autom at cât și manual în cele mai multe programe software. Software -ul dedicat
analizei CGH permite efectuarea următoarelor etape: (1) ștergerea fundalului; (2) segmentarea
și ștergerea obiectelor non -cromozomiale; (3) normalizarea proporției FITC:TRITC pentru

36
întreaga metafază; (4) cariotipare interactivă; (5) scalarea cromozomilor la o lungime
standard, fie pentru întregul cromozom, fie independent pentru fiecare braț.
Proporția medie a metafazelor bine selectate sunt reprezentate pe ideograme (arătând
schem atic modelul de bandare G) a cromozomilor corespunzători într -un așa numit cariotip a
numărului de copii, prezentând regiuni cromozomiale pierdute (deleții) sau câștigate
(amplifică ri). Interpretarea profilului rapoartelor poate fi realizată folosind pragu ri fixe sau
statistice. Limite fixate de 0.75 și 1.25 sau 0.85 și 1.15 pot fi folosite pentru a detecta
pierderile sau câștigurile, în timp ce alții folosesc limitele intervalul de confidență (CI) de
95% a profilului. În ultima situație, deviațiile de la n ormal sunt interpretate ca pierderi sau
câștiguri când CI de 95% a raportului fluorescent nu conține 1.0. Regiunile cromozomale
1p32 -pter, 16p și 19p trebuie interpretate cu multă grijă și pentru a confirma descoperirile
CGH în aceste regiuni, este recoman dată repetarea experimentului cu probe marcate invers.
Această instabilitate este determinată de cantitatea mare de secvențe repetitive în aceste
regiuni, care sunt variabile la fiecare individ. ADN -ul Cot -1 ar trebui să blocheze aceste
secvențe, dar de mu lte ori această abordare nu este încununată de succes. (21)
Figura 9 ilustrează un model fluorescent de hibridizare obținut după ce ADN obținut
dintr-un limfom non -Hodgkin (LNH) marcat cu fluorocrom portocaliu (test) a hibridi zat
competitiv cu ADN uman placentar marcat cu fluorocrom verde (referință). În acest caz
câștigurile de material genetic de către tumoră comparativ cu ADN -ul de referință sunt
detectate ca fluorescență roșie crescută și delețiile ca fluorescență verde cre scută.
În cazul ilustrat în F ig. 9, singura anom alie citogenetică nealeatorie ra portată, pe lângă
o translocație t(14;18)(q32;q21) caracteristică limfoamelor foliculare, a fost prezența dmins
(double minutes – echivalentul citogenetic al amplificărilor genice). Prin analiza vizuală, s -au
găsit a fi suprareprezentate secvențe ADN derivate din 2p 13 -15, 6p, 7, 11q13, 11q 24 -25,
12q24, 16, 17q, 19 și 20 q și secvențe din 9p13 deletate în această tumoră.
Păstrând același principiu de comparare al ADN -ului test (mostră) și ADN -ului normal
(de referință) și cuplarea cu tehnologia microarray, a fost dezvoltată o nouă tehnică de analiză
genomică comparată care se bazează pe micromatrici (microarrays) și cunoscută ca array
CGH. Ca principiu tehnica folosește fragmente multiple de ADN pre -selectat și atașat la o
suprafață de sticlă cu un locus specific (lamă de microscop). ADN -ul atașat poate fi fragmente
de ADN clonat ce provine de la bact erii (BAC – Bacterial Artificial Chromosomes) sau P1
(PAC – P1 Artificial Chromosomes), cDNA, oligonucleotide sintetice sau fragmente PCR.
Tipul de ADN folosit și cantitatea ariilor măsurate variază între diferitele protocoale
sau platforme valabile. Alege rea regiunilor incluse în observație definește clasificarea

37

acestora în două categorii: array CGH reprezentativ al întregului genom și array CGH țintit pe
anumite regiuni specifice, de regulă implicate în aranjările cromozomiale deja descrise.
Rezoluția ob ținută prin diferitele tipuri de array CGH depinde de numărul și dimensiunea
clonelor studiate precum și de distanța dintre clone consecutive. Cele construite din clone
BAC au rezoluția între 50 -150 Kb, iar matricile oligonucleotidice pot avea o rezoluție de 25
pb până la 85 pb. (22)

Fig. 9 . Analiza CGH a unui limfom non -Hodgkin. Aplicația CGH la ADN -ul unui LNH, unde
regiuni câștigate prezintă fluorescență roșie și regiuni pierdute prezintă fluorescență verde.
Ambele omologe cromozomale sunt denotate pentru fiecare pierdere/câștig detectat, cu
excepția cromozomului 20q (17).

Tehnic, cantități identice de ADN test și de referință sunt marcate cu fluorocromi
(cianină) și după co -hibridiza re, diferența dintre intensitățile emise de cianină pentru fiecare
arie observată este măsurată. Atunci când intensitatea fluorescentă este mai scăzută în
intensitate în AND -ul test comparativ cu ADN -ul de referință, deducem că există o pierdere î n
zona genomică respectivă (deleție) iar în situația opusă există un câștig genomic (dublură).
Limitarea acestei tehnici con stă în inabilitiatea acesteia de a identifica anomalii
cromozomiale care nu determină schimbări în numărul total de copii al unui segment ADN

38
din genom, cum ar fi translocări echilibrate și inversiuni. În plus, CGH nu oferă informații
privind felul în care sunt aranjate segmentele cromozomiale implicate în pierderile sau
câștigurile de material genetic . (22)
De asemenea normalizarea intensității fluorescente dublate generate în euploidie
determină dificultăți de identificare. Te hnica are de asemenea utilizare limitată în cazurile de
mozaicism. Această ultimă limitare a fost depășită prin creșterea experienței în interpretarea
rezultatelor și este considerată posibilitatea detectării rearanjărilor cromozomiale prezente în
cel puți n 20% (Vermeesch et al., 2005) sau 50% din celule (Shaw and Lupski, 2004). Există
dovezi recente că tehnica array CGH poate diagnostica cazuri de mozaicism ca re nu au putut
fi detectate de cariotiparea convențională. (Ballif et al., 2006, Cheung et al., 20 07, Shinawi et
al., 2008, Wood et al., 2008).

V. BAC -CGH – definiție, principiu, indicații, limite

1. Definiție

Progresul cheie către o metodă de citogenetică moleculară a genomului integral a venit în
1998, când Pinkel și asociații au demonstrat abilitatea de a efectua CGH folosind
micromatrici conținând clone genomice mari pentru detectarea precisă a pierderilor s au
câștigurilor de mono -copii. Această descoperire a dus la dezvoltarea rapidă a matricilor BAC
țintite, în care sute sau mii de clone BAC corespunzătoare regiunilor cunoscute de
microdeleție/microduplicație, regiunilor telomerice, regiunilor pericentromer ice și altor
regiuni clinic relevante pot fi simultan testate pentru variații ale numărului de copii.
Utilizarea pentru testări clinice a micromatricilor țintite a tranziționat rapid la modele de
matrici ce acoperă întregul genom uman. Deși au existat îng rijorări în ceea ce privește modul
interpretării dezechilibrelor detectate din analiza întregului genom care nu includea regiuni
implicate anterior în sindroame clinice , beneficiul diagnostic al matricilor întregului genom a
fost anticipat să depășească cu mult abordarea țintită, mai conservatoare.

39
Matricile timpurii ale întregului genom au început cu plasarea clonelor BAC la intervale
de aproximativ 1 Mb la nivelul genomului. Lacunele interpuse fără acoperirea clonelor au
devenit din ce în ce mai mici, fiind cuprinse în mod continuu de o acoperire mai densă a bazei
genomice. (23)

2. Principiu

Cromozomi artificiali bacterieni (Bacterial Artificial Chromosomes/BACs) împreună cu
cromozomi artificiali P1 -derivați (PACs) și cromoz omi artificiali de drojdie (YACs) sunt
clone genice cu inserție mare ce au fost folosiți pe larg în studii aCGH (CGH cu matrici) .
Matricile BAC sunt platforme punctate cu canal dual, unde ADN test (tumoral) și de referință
sunt marcate diferențial înaintea hibridizării pe micromatrice. Probele BAC variază în
lungime de la 100 la 200 kb, iar rezoluția fiecărei matrici BAC este definită de numărul de
probe unice pe care le conține. Conținutul de probe al matricilor BAC variază de la câteva
sute până la 32000 de elemente unice (matrice cu suprapuneri). Matricile cu suprapuneri
(matrici în care fiecare BAC se suprapune peste BAC -ul alăturat) oferă o rezoluție de până la
50 kb, dat fiind faptul că o schimbare genomică poate fi detectată doar dacă este suficient d e
mare pentru a schimba semnificativ intensitatea hibridizării pe unul din canale (de exemplu
schimbarea raportului roșu:verde) (Fig. 11) . Aceste platforme oferă semnale suficient de
intense pentru detectarea variațiilor numărului de copii sunt și sunt cap abile să definească cu
acuratețe limitele aberațiil or genomice și de asemenea , pot fi aplicate ADN -ului extras din
țesut inclus la parafină și fixat în formol. Unul din cele mai mari inconveniente ale matricilor
BAC este acela că disponibilitatea acestora din surse comerciale este limitată, iar producerea
lor în lab oratorul propriu presupune muncă intensivă și este de asemenea costisitoare. În plus,
cum probele BAC sunt reprezentative genomului uman, acestea vor conține de asemenea și
secvențe repetitive, c e poate rezulta în hibridizare nonspecifică. Pentru a preveni hibridizarea
nonspecifică la aceste secvențe repetitive, ADN Cot -1 este frecvent adăugat la reacția de
hibridizare, crescând costul total al testului. (24)
Sistemele de clonare BAC și PAC (cromozom artificial P1 -derivat) au fost dezvoltate
folosind replicarea plasmidului F -factor al E. coli, respectiv al plasmidei P1 bacteriofage
pentru a menține dimensiunea (100 -250 kb). (25)

40

În prezent s unt cunoscute mai mult de 8800 clone, cu cel puțin o clonă valabilă pe fiecare
cromozom în medie per megabază. Această resursă permite oportunitatea de a genera o
matrice ordonată de secvențe ADN la o rezoluție înaltă și de a înlocui preparatele metafazice
cu un șablon de hibridizare. Astfel de CGH bazate pe micromatrici (array CGH/ aCGH)
ocolește limitările considerabile asociate folos irii preparatelor cromozomiale (Fig. 10).
Un scaner fluorescent de înaltă rezoluție este folosit pentru a captura intensit atea
fluorescentă a fiecărui punct în matrice și le convertește într -o proporție de intensitate.
Proporția fluorescentă a celor două culori poate fi comparată printre puncte diferite
reprezintând regiuni genomice diferite. Aceasta oferă un profil molecular al genomului
integral al probei, inclusiv regiuni ale genomului care sunt șterse sau amplificate. Rezoluția
acestei abordări depinde de o combinație dintre numărul, dimensiunea și poziția pe hartă a
elementelor ADN în matrice. Matricile BAC oferă oportuni tatea de a efectua scanări de înaltă
rezoluție ale genomului integral într -un mod rapid și complet reproductibil.

Fig. 10 . Principiul array -CGH. ADN test și de referință marcate diferit (sfere verzi, respectiv
roșii) sunt cohibridizate pe o matrice cu sp oturi ADN printate pe o lamă de sticlă. În cazul
delețiilor în ADN -ul test, mai puțin ADN test se va atașa la spoturile corespunzătoare, iar
eticheta roșie a ADN -ului de referință va predomina; câștigurile în genomul test pot fi
identificate prin predomina nța etichetei verzi a ADN -ului test. Spoturile ce prezintă secvențe
cu același număr de copii în genomul test comparativ cu genomul de referință apar galbene.
Pentru matricile BAC, un exces de ADN Cot -1 repetitiv (sfere albastre) trebuie adăugat
pentru a s uprima secvențe repetitive care se atașează nespecific. (26)

41
3. Indicații

Intensitatea semnalelor oferite de BAC a permis explorarea neoplasmelor umane în
numeroase studii de la descrierea sa originală de Pinkel et al. În studii recente, aceste matrici
au fost folosite pentru a identifica alterații genomice importante ale numărului de copii într-o
varietate de neoplasme, ce cuprind cancerul de sân, cancer gastric , glioblastom multiform,
neuroblastom, rabdomiosarcom, carcinom nazo faringial, osteosarcom, tumori adrenocorticale
precum și cancer ova rian, de prostată și vezică urinară.
Rezoluția aCGH s -a îmbunătățit considerabil în ultima decadă. Abbot Molecular a produs
o matrice ce conține 300 BACs, ce oferă o rezoluție destul de sc ăzută, dar reprezintă o
abordare mai standardizată pentru clasificarea datelor folosind scaner și pachet software
brevetate. Spectral Genomics a produs o matrice BAC de 2500 clone capabilă de o rezoluție
de aproximativ 1 Mb, ce a fost folosită cu succes pe ntru analiza alterațiilor numărului de copii
ADN într -o varietate de studii. Institutul Oncologic Roswell Park și Centrul Oncologic de
Cercetare Fred Hutchinson au construit matrici BAC de 6000 și 20000 de clone cu rezoluții de
500 kb, respectiv 200 kb, de monstrate a identifica pierderi caracteristice de material a
cromozomilor 1p și 19 q în oligodendroglioame. O matrice BAC de 32000 clone, cu o
rezoluție de 45 kb a demonstrat identificarea de alterații ale numărului de copii în carcinoame
scuamoase orale.
Un avantaj al acestei metode constă în faptul că matrici BAC există deja pentru multe
organisme și pot fi adaptate ușor la studii de metilare. BAC oferă de asemenea acoperirea
regiunilor din genom unde este dificil să proiectezi probe mai mici din cauza conținutului de
secvențe repetitive. În plus, datorită lungimii probelor, expunerea asociată cu datele BAC este
scăzută comparativ cu alte tehnologii microarray. (27)

4. Limite

Atașarea multiplelor fragmente de ADN distincte di n regiuni cromozomale adiacente,
reduce influența artefactelor care pot apărea în timpul amplificării întregului genom.
Artefactele de anplificare sunt comune atunci când sunt folosite celule unice care au
potențialul de a produce pierderi și câștiguri fal se de material genetic. Însă, în cazul probelor

42

BAC, fiecare spot pe micromatrice oferă un rezultat mediu pentru sutele de fragmente
amplificate care au hibridizat, diluând influența oricărui fragment individual cu anomalii ale
caracteristicilor de amplifi care. În plus, diagnosticele celulelor unice nu sunt niciodată bazate
pe rezultatele unui singur BAC, ci depind de raportul fluorescent mediu obținut pentru câteva
probe vecine, determinând reducerea suplimentară a efectelor oricărui artefact al amplificării
întregului genom. Această nevoie de a combina rezultatele de la mai multe probe limitează
rezoluția potențială a matricilor BAC aplicate celulelor unice, împiedicând detectarea
anomaliilor submicroscopice (de exemplu microdelețiile). (28)

Figura 11 . Matrice BAC (Bacterial Artificial Chromosome). Fiecare spot pe o matrice BAC
reprezintă partea specifică din genom care este conținută în BAC. O matrice BAC cu
suprapuneri a întregului genom cuprinde atât de multe clone BAC pe cât este necesar pentru a
acoperi întregul genom într -o manieră care se suprapune (32,400 pentru genomul uman).
Partea de sus a imaginii reprezintă un instantaneu de ecran a Browser -ului UCSC al
Genomului Uman. Liniile roșii ilustrează selecția de clone ce se suprapun, dintr -o bibliotecă
BAC cuprinzătoare. (26)

43
Folosind o matrice BAC cu 6000 de clone și o rezoluție de 750 Mb, cercetătorii au
identificat deleții de 32 până la 64 Mb în gena esterazei D (ESD) la pacienți cu retinobl astom.
Gena ESD în mod normal este localizată centromeric la 650 de kb de gena RB1. Dimensiunea
deleției și genotipul (homozigozitate) au fost asociate cu reducerea activității enzimei ESD și
severitatea trăsăturilor fenotipice.
După elaborarea profiluri lor genomice prin intermediul matricilor, anomaliile
descoperite pot fi validate de alte tehnici de genetică moleculară. PCR cantitativ și
hibridizarea fluorescentă in situ (FISH) sunt două metode folosite frecvent pentru atingerea
acestui scop. FISH este o tehnologie simplă și directă ce poate fi efectuată în majoritatea
laboratoarelor de citogenetică. Una dintre cele mai mari provocări în validarea prin FISH este
disponibilitatea (sau lipsa ei) probelor de bună calitate pentru regiuni de interes, folosite în
experimentele de validare prin FISH.
Pentru a efectua o validare cu succes, trebuie obținută o clonă BAC corectă, iar ADN –
ul trebuie extras din această clonă. Rezultatul a CGH este definit de alterațiile genomice
(amplificare sau deleție) observate într-un BAC dat. Brow sere ale genomului uman oferă o
expunere rapidă și sigură a oricărei porțiuni din genomul uman la scara dorită. În plus, ele
dezvăluie o mulțime de piste adnotate ce conțin informații în legătură cu gene cunoscute,
secvențe etichetă ex primate, ARN mesager, insule CpG, goluri de assamblare și poziția exactă
a unei clonei pe un cromozom la o locație corespunzătoare pe o bandă cromozomală. După
care se poate comanda un BAC adecvat de interes pentru validarea suplimentară a
descoperirilor A -CGH. BAC -ul achiziționat poate fi recuperat prin creșterea clonei într -o
placă agar adecvată și propagarea într -un mediu. ADN -ul poate fi extras cu ajutorul unui kit
de extracție proiectat special pentru lucrul cu BAC. Deși acest proces necesită muncă int ensă,
producția este mare (în jur de 100 mg de ADN din 1 L de mediu de cultură lăsat peste
noapte), iar calitatea este pură, oferind o cantitate suficientă de ADN de specificitate înaltă
pentru prepararea probelor FISH. O serie de metode de etichetare sun t valabile în prezent, dar
translația incizurii reprezintă abordarea cea mai practică pentru etichetarea ADN -ului BAC.
(29)

44
VI. Microrețele oligonucleotidice (cu densitate mică și cu
densitate mare) – definiție, principiu, indi cații, limite

1. Definiție

CGH bazat pe micromatrici (microarrays) este o metodă puternică de a detecta și analiza
modificări genomice care se află cu mult sub posibilitatea de detecție a analizei cariotipului
prin tehnici de bandare de înaltă rezoluție, oferind oport unități mai bune pentru corelarea
genotip/fenotip la alți indivizi cu afecțuni similare. Aplicația clinică a array CGH ca metodă
de diagnostic la pacienți cu dizabilități mentale și de învățare asociate cu trăsături dismorfice
a fost îndelung studiată (Bejjani et al., 2005, Cheung et al., 2005 Jul -Aug, Shaffer et al., 2006,
Lu et al., 2007, Stankiewicz and Beaudet, 2007) și s -a dovedit utilă și reproductibilă pentru
diagnosticarea și caracterizarea moleculară a acestui grup. Aceste studii au a rătat că tehnica
array CGH poate crește rata diagnosticării cu 20% până la 30% comparativ cu studiile de
citogenetică convențională, culminând cu includerea sa în diagramele de cercetare genetică a
acestui grup de pacienți. Analiza genomică a numărului de copii bazată pe micromatrici este
acum un test genetic solicitat frecvent pentru pacienți cu diagnostice ce includ întârziere
inexplicabilă în dezvoltarea/dizabilitate intelectuală, dizabilități din spectrul autismului, și
multiple anomalii congenitale. Ac eastă tehnică mai este cunoscută și sub numele de
micromatrice cromozom ală (CMA) și cariotipare moleculară.
Creșterea acoperirii regiunilor genomice în platformele array CGH reprezentative
întregului genom este responsabilă de o creștere adițională cu 5 % în detecția micro matricilor
cromozom ale comparativ cu platformele array CGH țintite pe regiuni specifice. Cu toate
acestea, în timp ce analiza de înaltă rezoluție poate identifica anomaliile patologice, acestea
prezintă problema identificării pierderilor și a câștigurilor de material genetic în regiuni cu
semnificație necunoscută clinic. În acest sens intervine balanța delicată dintre rezoluț ia
metodei, potențialul diagnos ticului clinic și abilitatea de a interpreta rezultatele. Aceasta
reprezintă princip ala problemă în determinarea întrebuințării microarray CGH în scop
diagnostic în practica medicală.
Variația numărului de copii (CNV) poate fi dificil de evaluat și interpretat. O varietate
de metodologii folosite în generarea informației valabile electro nic care constituie bazele de

45
date în cercetare a CNV face imposibilă distingerea dimensiunii exacte a fiecărei CNV găsite.
Lipsa uniformității metodologice derutează interpretarea corectă a descoperirii cromozomilor
anormali prezenți la un individ anormal fenotipic, mai puțin suprapunerea unei părți sau unei
regiu ni întregi cu CNV descrisă. Altă problemă este reprezentată de găsirea unui câștig de
material genetic într -o regiune care este descrisă ca fiind deleție sau pierdere CNV și vice
versa. În astfel d e situații nu putem deduce că rearanjarea este o descoperire benignă.
Identificarea CNV -urilor poate varia în funcție de platforma CGH array folosită. Un
studiu a demonstrat că folosind tehnica array CGH ce conțin clone BAC numărul de CNV
găsite a fost ma i mare comparativ cu cele găsite după aplicarea tehnicii array CGH cu
oligonucleotide. Această discrepanță poate fi explicată prin următorul fenomen: clonele
generate din bacterie conține fragmente mai mari comparativ cu probele oligonucleotidice. În
plus clonele BAC pot cuprinde regiuni de ADN repetitiv, cunoscut a fi asociate cu variații ale
numărului de copii.
Cu toate acestea, în prezent , matrici ale întregului genom detectează multiple variații
ale numărului de copii cu semnificație clinică necunoscută. Experiența clinică în creștere cu
ajutorul matricilor precum și dezvoltarea bazelor de date a variațiilor numărului de copii atât a
indivizilor sănătoși cât și bolnavi vor reduc e numărul de CNV cu semnificație clinică
necunoscută și vor face matricile mai folositoare în practica clinică. (23)
Secvențierea recentă a genomului uman a deschis o nouă eră a cercetării biomedicale.
Însă, energia creativă al ocată completării acestei sarcini a fost acum reorientată pe o întrebare
centrală și esențială, și anume cum se poate converti secvența lineară de date generate de
Proiectul Genomu l Uman în scop practic, de exemplu pentru înțelegerea funcțiilor celulare ,
cum ar fi caracterizarea rolului genelor în fiziologie și patologie.
Dezvoltate inițial prin date obținute prin Proiectul Genomul Uman, m icromatricile ADN
au apărut ca o tehnologie cheie, puternică ce a legat informația secvențelor genelor de
perspectivel e funcționale în mecanismele biologice. Matrici cu probe ADN de densitate mare
transformă rapid cercetarea biomedicală a genelor și devin unelte de rutină pentru analiza cu
rată crescută a expresiei genelor într -o varietate mare de sisteme biologice. (30)
Tehnologia microrețelelor a trecut prin câteva generații caracterizate prin îmbunătățiri în
multe arii, care includ o acoperire mai mare a transcriptomului, o cartografiere mai bună și
informații ale secvențelor de înaltă calitate , adnotări îmbunătățite a structurii genelor și a
limitelor exonilor , precum și îmbunătățiri software și a modelelor fizice pentru designul
probelor. Datorită acestor îmbunătățiri, sunt așteptate ca matrici de generație nouă să ofere o
acope rire și o acura tețe a genomului mai ridicate . (31)

46

2. Principiu

BAC s nu sunt singurele platforme folosite pentru construcția matricilor CGH. Similar
utilității lor în studierea expresiei genelor, matricile ADN complementare (cADN) pot servi,
de asemenea, drept șabloane pentru hibridizarea genomică comparată. Micromatricile cADN
dispuse sub forma secvențelor individuale mai lungi de 100 de nucleotide oferă avantajul de a
fi mai disponibile pentru construirea unor asemenea matrici prin secvenție rea produșilor PCR.
Bazate pe experiențele acestor matrici în literatura de specialitate, ar putea permite studierea
delețiilor și amplificărilor de mici dimensiuni (rezoluție înaltă). Totuși, matricile cADN sunt
limitate de inabilitatea acestora de a măs ura eficient delețiile din cauza zgomotului de fundal
care apare în cazul folosirii probelor unice. Matricile cADN au fost recent folosite pentru
studierea carcinoamelor mamare bilaterale și a osteosarcoamelor pediatrice, precum și pentru
detectarea altera țiilor numărului de copii ADN, al ături de anomaliile de metilare (Fig. 12).

Fig. 1 2. Analiza cADN microarray. ARN -ul total a fost extras dintr -o cultură de celule
tumorale, transcrisă în cADN și hibridizată cu o micromatrice cADN particularizată. Expresia
genică a fost măsurată prin detectarea chemiluminescenței și normalizată împotriva genelor
house -keeping pe micromatrice.

O p robă de ADN genomic sau cAD N marcat cu o etichetă fluoresc entă sau
chemiluminescentă este hibridizată pe matrice. Prezența ADN -ului legat este afișată prin
fluorescență sau chemiluminescență. Matricea este scanată cu un laser, iar imaginea este

47

analizată pentru pattern -ul și intensitatea semnalului. Intensitatea fluorescentă sau
chemiluminescentă este afișată drept un punct colorat per locație genică, un singur experiment
fiind capabil de profilarea simultană a sute până la mii de gene. Micromatr icile sunt folosite
pentru a evalua modele ale expresiei genelor cu scopul de a extrage semnale asociate bolii și
de a identifica ținte terapeutice posibile.
Melanomul a fost unul din primele cancere de piele analizat folosind tehnologia
micromatricilor A DN. Tumori non -melanocite, cum ar fi carcinomul bazocelular și cel
scuamocelular, precum și limfomul cutanat cu celule T, au fost de asemenea studiate.
Micromatricile ADN au fost folosite pentru a ilustra diferențe în elaborarea citokinelor într -o
serie de boli inflamatorii ale pielii (de exemplu psoriazis și dermatită atopică) și corelează
aceste schimbări cu disproporții în patofiziologia și predispoziția pentru infecțiie microbiene
între aceste boli. (32)

Fig. 13 . Schema matricii cu oligonucleotide. Pentru această abordare este crucială folosirea a
multiple oligonucleotide cu secvențe diferite proiectate pentru a hibridiza la regiuni diferite
ale aceluiași ARN. Pentru fiecare genă monitorizată, o serie de oligonuc leotide sunt
sintetizate folosind fotolitografie direct pe cip. Oligonucleotidele sunt aranjate ca perechi:
fiecare pereche include o potrivire perfectă de 25 -mer care este complementară secvenței
genice, și o nucleotidă control care diferă de oligonucleot idele potrivite perfect la a
treisprezecea bază. Intensitatea hibridizării raportată este o adunare a diferențelor potrivire
perfectă -nepotrivire per genă.

48
Matricile oligonucleotidice sunt similare matricilor cADN cu excepția că șabloanele
acestora de hib ridizare sunt scurte, compuse tipic din 25 de nucleotide. Avantajul matricilor
oligonucleotidice constă în faptul că un număr infinit de oligonucleotide pot fi sintetizate
pentru o regiune specifică de interes, în timp ce rezoluția BAC este limitată de dim ensiunea
acestora. Modelul oligonucleotidelor oferă specificitate și sensibilitate crescute chiar și când
sunt fol osite drept probe oligonucleotidice mai lungi. Pe lângă potențialul lor de a atinge o
densitate mare a probelor pe matrice, oferă și flexibili tate în alegerea și aranjarea probelor ce
poate fi particularizată (Fig. 13) . (33)

3. Indicații

Oligonucleotidele nu numai că sunt capabile să detecteze alterații ale numărului de
copii, sunt de asemenea folosite pentru a det ecta polimorfisme mononucleotidice (SNPs),
determinând expansiunea utilității lor viitoare. Matricile SNP au fost folosite pentru a detecta
14 mutații pe exonul 11 a genei BRCA1 sau pentru studierea pierderii heterozigozității în
carcinomul de prostată. O matrice SNP oligonucleotidică cu 1500 de probe a fost comparată
favorabil cu PCR microsatelit convențional într -un studiu al carcinoamelor cu celule
tranziționale concentrat pe detectarea pierderii heterozigozității pe 9p și 9q. În plus, abordarea
bazată p e matrici a fost demonstrată a oferi avantaje distincte pe lângă analiza convențională a
microsateliților în acest studiu. (29)
Tehnologia microarray a fost folosită cu succes în multiple studii privind
vascularizația, inclu siv identificarea transcriptelor celulare îmbogățite, baza patologică a
bolilor, și răspunsul extern la stimuli într -o manieră specific celulară.
De exemplu, tehnologia microarray a fost folosită cu succes în investigarea
mecanismului rezistenței celular e la efectele apoptotice ale bolii fatale : purpura trombotică
trombocitopenică idiopatică (TTP). TTP este o boală caraterizată prin injuria apoptotică a
tuturor celulelor endoteliale microvasculare (MVEC) cu excepția celor de origine pulmonară.
Tehnologia cipurilor genice oligonucleotidice a identificat gene supraexprimate diferențial în
MVEC TTP -rezistente (plămân) comparativ cu MVEC TTP -sensibile (piele) și prin urmare
care pot contribui la rezistența la apoptoză indusă de plasma TTP a MVEC pulmonare. Ace st
studiu a arătat că expunerea celulelor la plasma TTP a obținut 157 de gene care erau

49
supraexprimate în MVEC pulmonare, inclusiv semnale specifice pro -supraviețuire cum ar fi
antagonistul TRAIL ( ligandul inductor al apoptozei asociat cu factorul de necro ză tumorală ),
osteoprogerina și factorii de creștere vasculară endotelială , VEGF/ VPF și VEGF -C și
receptorii săi VEGFR -2 (KDR) și VEGFR -3 (Flt4).
Studii similare au identificat gene supraexprimate în angiogeneză. Angiogeneza este
un proces cheie într -o varietate de boli, inclusiv în cancer. Abilitatea de a ținti selectiv
vascularizația tumorală este utilă pentru diagnoticul și tratamentul cancerului . Celule
endoteliale tumorale (TEC), în contrast cu celule endoteliale normale, sunt rezistente la
apoptoză, sunt proadezive pentru celule carcinomatoase renale, și sunt capabile de creștere și
organizare în absența serului în structuri persistente capilar -like. A fost utilizată recent
tehnologia cADN array pentru a identifica markeri specifici pentru TEC. Într -un studiu,
IGFBP -3 a fost găsită a fi resticționată exclusiv celulelor endoteliale, care indică IGFBP -3 ca
un potențial marker nou pentru angiogenez ă. Într -un alt studiu, expresia angiopoietinei -1 și
factorului de creștere vasculară endotelială (VEGF) -D și căii de supraviețuire Akt au fost
găsite marcat reglate pozitiv în TEC. Aceste rezultate sugerează posibilitatea utilizării IGFBP –
3, VEGF -D sau cal ea Akt drept ținte terapeutice pentru strategii angiogenice. Tehnologia
matricilor ADN a fost utilizată recent pentru a stabili o legătură molecular ă între
hiperhomocisteinemia (H HCy) și ateroscleroză. Analiza microar ray a arătat că homocisteina
(Hcy) este legată de probleme în reglarea colesterolemiei pri n demonstrarea că tratamentul
Hcy a celulelor endoteliale ale venei ombilicale a rezultat în reglarea pozitivă a 3 -hidroxi -3-
metilglutaril coenzima A reductaza, o enzimă implicată în sinteza colesterolului . Analize
biochimice suplimentare efectuate în acest studiu, au confirmat că Hcy a rezultat într -o
creștere celulară a nivelului de colesterol, ceea ce sugerează o explicație nouă solidă a
efectul ui proaterogenic observat al homocisteinei .
În plus, siste me array genice au fost folosite pentru a studia răspunsul celular a
celulelor endoteliale la stimuli externi. Într -un studiu, a fost analizat răspunsul culturilor de
celule endoteliale dermale microvasculare umane la infecția cu herpes virus asociat cu
sarcomul Kaposi. A fost observată dereglarea semnificativă a unor gene sau receptori citokin –
legate, precum și markeri celulari endoteliali și macrofage și alte gene asociate cu
angiogeneză sau transformare. Microrețelele au fost utilizate de asemenea pentru analiza
schimbărilor în expresia genelor după stimularea celulelor endometriale miometriale
microvasculare cu factor de creștere vasculară endotelială (VEGF). În acest studiu, un total de
110 gene au fost identificate ca reglate pozitiv de către VEGF, din care marea majoritate

50
(81%) nu au fost raportate anterior ca fiind reglate pozitiv de către VEGF sau angiogeneză.
(34)
Alterările moleculare critice în terapeutica cancerului include alterări ale numărului de
copii (CNA) cum a r fi amplificările genice și delețiile precum și rearanjările genomice ce
rezultă în fuziuni genice. Amplificările ADN au fost demonstrate să conțină oncongene
importante, cum ar fi gene ce codifică receptorii HER2 și EGF. Descoperirea translocărilor
cromo zomiale în tumori solide, cum ar fi cea care implică gena ALK rezultând într -o nouă
proteină oncogenică de fuziune în adenocarcinom ul pulmonar, a condus de asemenea la noi
terapii țintite împotriva acestor schimbări.
Array CGH (aCGH) este o tehnologie a genomului integral folosită pentru a detecta
CNA asociate cancerului. Array CGH permite caracterizarea cu acuratețe a numărului de
copii genice folosind doar 0.5 µg de ADN genomic.
În prezent, microrețele cu densitate mare conțin 200,000 de probe și interoghează
genomul cu o rezoluție medie de 10 -50 kb. Rezoluția înaltă permite demarcarea mai bună a
punctelor de rupere ADN în regiuni ale CNA precum și identificarea CNA foarte mici, focale
în plus față de regiuni cromoz omale mari implicând câteva Mb, ce umple astfel golul dintre
tehnologiile de citogenetică convențională care se adresează aberațiilor cromozomiale
microscopice grosiere (>1 Mb) și tehnologiile de secvențiere care detectează variații la nivelul
unei singure nucleotide.
Progresele recente făcute în înțelegerea biologiei leucemiei mieloide cronice (LMC )
au dus la dezvoltarea unor terapii remarcabil de efective împotriva acestei boli a celulelor
clonale stem. Di n punct de vedere citogenetic LMC este carateriza tă de o translocație
cromozomială specifică t(9;22)(q34;q11), care rezultă într -un cromozom 22 mai scurt, numit
cromozomul Philadelphia (Ph). Pentru 90% din pacienții cu LMC , apariția cromozomului Ph
rezultă în dezvoltarea unei secvențe genice noi compusă din regiunea cluster a punctelor de
rupere ( regiune cluster de ruptură -BCR) a cromozomului 22 și c -Abl ( omologul oncogenei
virale de leucemie murină Abelson I) a cromozomului 9. Prin urmare, gena de fuzi une BCR –
ABL1 reprezintă marca LMC , iar produsul său r eprezintă o țintă terapeutică.
Într-un grup de studiu de 45 pacienți care au fost înscriși într -un test de escaladare a
dozei de imatinib pentru răspunsurile slabe la terapia de primă linie în doze standard, s -a
efectuat screening -ul genomului integral p entru regiuni cu câștig sau pierderi de material
genetic folosind array -CGH. Răspunsul molecular rapid (EMR) definit ca o reducere cu peste
50% a proporției BCR -ABL1 la ABL1 în 6 luni de la creșterea do zei a reprezentat un punct
major al analizei. Douăzeci și nouă de regiuni alterate în mod recurent au fost găsite: 23 cu

51
câștiguri și 6 cu pierderi. Au fost comparate modificări regionale ale numărului de copii între
pacienții cu EMR și cei fără și trei regiuni alterate în mod recurent au fost găsite cu valoa rea P
<0.1. Câștig al numărului de copii pe 16p11.2 a fost observat predominant la pacienții cu
EMR, comparativ cu pacienții fără EMR (P=0.034). A fost observată o tendință pentru
creșterea numărului de copii pe 12q11.23 la pacienții fără EMR și o scădere a numărului de
copii pe 17q12 la pacienți cu EMR, deși descoperirile nu sunt semnificative din punct de
vedere statistic (P=0.072 și respectiv 0.070).
După analiza array -CGH, a fost efectuată o recenzie a literaturii folosind hărți
genomice aprov izionate de Centrul Național de Informație Biotehnologică US. Genele din
regiunile cu alterări ale numărului de copii au fost identificate, iar cele raportate a fi implicate
în dezvoltarea sau progresia cancerului au fost selectate printre ele. Această procedură a
raportat patru gene candidate: glutation S -transferaza theta 1 (GSTT1); sulfotransferaza 1A1
(SULT1A1); domeniile conținătoare PYD și CARD (PYCARD) și adaptorul transcripțional
2A (TADA2A).
Studii de validare pentru aceste patru gene au fost efectuate fo losind test PCR
cantitativ în timp real la 52 de pacienți ale căror probe de bază au fost valabile, dintre care 44
au fost supu se analizei array -CGH. Câștig al numărului de copii a GSTT1 pe 22q11.23, a fost
corelat cu câștig al numărului de copii pe 22q11. 23 (P <0.001). Câștig al numărului de copii
GSTT1 a prezis de asemenea timp median scurt pentru eșecul tratamentului (TTFx). Când
analiza a fost efectuată pentru 24 de pacienții fără mutația genei BCR -ABL1, TTFx a fost
semnificativ mai scurtă la pacienți c u câștig al numărului de copii GSTT1 (10.6 luni vs. 18.0
luni; P=0.007).
În LMC , analiza array -CGH este folositoare în cel puțin două grupuri de pacienți.
Primul grup de pacienți la care se așteaptă să prezinte alterări importante ale numărului de
copii este cel al pacienților cu rezistență la ABL1 TKI (inhibitorii tirozin kinazici).
Mecanismele care stau l a baza rezistenței celulelor LMC la ABL1 TKI nu sunt pe deplin
înțelese. S -a propus că aproximativ 50% din pacienți cu rezistență dobândită la imatinib au
mutații punctiforme în domeniul kinazelor BRC -ABL1. Cu toate acestea, pentru restul de
50% de pacienți care prezintă rezistență dobândtiă la imatinib, mecanismul nu este clar
elucidat. Au fost sugerate pentru acești pacienți defectele în transportul dr ogurilor și activarea
altor căi cum ar fi calea Lyn, dar fără dovezi definitive. Prezența mutațiilor în kinaza BCR –
ABL1 a fost asociată cu o evoluție citogenetică clonală, care ar putea facilita progresia bolii.
În concordanță, prezența mutațiilor în kinaz a BCR -ABL1 a fost asociată cu o posibilitate mai
mare de progresie către faza de blast, fapt ce sugerează instabilitatea genomică crescută în

52
aceste celule. Luând în considerare cele de mai sus, se poate afirma că celulele LMC cu
rezistență la TKI ar putea prezenta instabilități genetice profunde. Aceste instabilități genetice
pot duce la formarea mutațiilor în kinaza BCR -ABL1 și acumularea de leziuni genetice
adiționale. Leziunile genetice adiționale pot include mutații punctiforme, amplificări genice,
pierderi genice și translocații cromozomiale care sunt crezute a conduce procesul malign. Prin
urmare, identificarea acestor alterări și elucidarea genelor implicate în aceste regiuni ar oferi o
înțelegere suplimentară a TKI și rezultate îmbunătățite pentru pacienții cu LMC .
Array -CGH poate juca un rol important în căutarea modificărilor genetice potențiale
responsabile de rezistența la TKI.
S-a efectuat a naliza array -CGH la pacienți LMC care urmau să primească doze
crescute de imatinib pentru rezistența lor la doza standard (400 mz/zi) de imatinib. În acest
studiu, câștig în numărul de copii pe 16p11.2 a fost mai frecevnt observat la pacienți care au
avut răspuns favorabil la dozele cres cute de imatinib. De asemenea, a fost observată o
tendință pentru creșteri frecvente în numărul de copii pe 17q12 la pacienți care au avut
răspuns slab la dozele crescute de imatinib. A putut fi demonstrat de asemenea creșterea
numărului de copii GSTT1 pe 22q11.23 observată frecvent la pacienți care nu au răspuns
favorabil la dozele crescute de imatinib prin test PCR cantitativ în timp real pentru validarea
rezultatelor array -CGH. Câștig în numărul de copii GSTT1 a fos un factor predictiv
indenpendent pent ru supraviețuirea scurtă fără progresie la acești pacienți.
Al doilea grup de p acienți este a celor cu LMC -AP (faza accelerată) sau LMC -BC
(criza blastică). Analiza recentă array -CGH de înaltă rezoluție cu probe extrem de dense a
genomului integral a det ectat aberații gene tice multiple la pacienți cu LMC -CP (faza cronică).
Pacienț ii cu LMC -BC prezintă cariotipuri mult mai complexe. Așadar, instabilitatea genomică
este un evenim ent timpuriu la pacienții cu LMC -CP, care evoluează în LMC -BC. Totuși, încă
nu se cunosc prea multe despre modificări le genetice care stau la baza LMC -AP și LMC -BC.
Cercetările anterioare folosind array -CGH la acești pacienți au dezvăluit următoarele. La
pacienții cu LMC -AP tratați cu imatinib, alterări ce flanchează genele ABL1 și B CR pe
cromozomii 9 și respectiv 22, au reprezentat leziunile cele mai comune identificate. Cinci
pacienți din 15 au prezentat pierderea porțiunilor variabile a 9q34.11, proximal de ABL1.
Pierderile ce implică 1p36, 5q31, 17q25, Y și câștigurile pe 3q21, 8q 24, 22q11, Xp11 au fost
printre alte leziuni recurente identificate. De asemenea, folosind array -CGH, Nacheva et al. au
studiat mecanismul care determină transformarea LMC -CP la LMC -BC. Cercetătorii au
descoperit o semnătură unică de deleții genomice în re giunea receptorilor imunoglobulinelor

53
cu lanț greu și a receptorilor celulelor T, însoțite frecvent de pierderea concomitentă a
secvențelor în regiunile de pe brațul scurt al cromozomilor 7 și 9, inclusiv genele IKZF1,
HOXA7, CDKN2A/2B, MLLT3, IFNA/B, RNF3 8, PAX5, JMJD2C și PDCD1LG2. (35)
Cancerul pulmonar este principala cauză de mortalitate legată de cancer în lume la
bărbați și a doua cauză la femei. Sunt recunoscute două tipuri histologice majore cu biologie
și răspuns ter apeutic diferit: cancer pulmonar microcelular (SCLC) și cancer pulmonar non-
microcelular (NSCLC). SCLC este un cancer foarte agresiv în care aproape toții pacienții se
prezintă cu metastaze în momentul diagnosticului. Prin urmare, pacienții cu SCLC sunt tr atați
prin chemoterapie, la care este înalt sensibilă. În contrast, aproximativ o treime din pacienții
cu NSCLC sunt diagnosticați cu tumora localizată strict la nivel pulmonar și cu posibilitatea
rezecției chirurgicale. Prin urmare, cel mai mare potenția l de reducere a mortalității cancerului
pulmonar este dat de un program screening eficace, pentru a descoperi cancerul în stadiul cât
mai incipient.
Similar altor malignități epiteliale, cariotipul NSCLC prezintă poliploidie (în spectrul
de 58 -102 cromoz omi per celulă) și multiple aberații cromozomiale complexe, rezultând în
câștig sau pierdere netă de material genetic ce indică instabilitate genomică. Cancerul
pulmonar este o boală înalt heterogenă, și totuși profilurile CNA (alterări ale numărului de
copii) a subtipurilor histologice majore de NSCLC sunt remarcabil de similare, cu frecvente
câștiguri ce implică 5p, 8q, 3q, și 1q, pierderi frecvente pe 3p, 8p, 9p, 13q și 17p.
Amplificările sunt observate frecvent în forma double minutes (dmins). Cunoașter ea ordinii
sau progresiei acestor aberații ramân preliminare; câțiva cercetători au speculat că
evenimentele incipiente inlcud trisomia 7, pierderea pe 3p și trisomia 12.
Array -CGH a permis cercetătorilor să identifice și să prezinte CNA în cancerul
pulm onar în detaliu. Rezoluția înaltă a acestei tehnici clarifică amplificările și delețiile
genomice în regiuni care adesea conțin doar câteva gene, și identifică de asemenea aberații
mici nedetectate anterior. Drept rezultat, lista genelor implicate în patob iologia NSCLC crește
rapid. Tonon et al. a identificat 93 regiuni comune minimale (MCR) de aberație în 44 tumori
NSCLC și linii celulare, dintre care 21 cuprindeau mai puțin de 0.5 Mb cu o medie de 5 gene
în fiecare, cu aproape toate genele implicate anter ior în patogeneza NSCLC prezente în aceste
regiuni, precum și multe gene candi date noi. Într -un studiu mare, 371 de adenocarcinoame au
fost analizate folosind SNP array -CGH, Weir et al. a identificat 26 evenimente recurente de
scară mare ce implică câștigu l sau pierderea a cel puțin jumătate de cromozom, împreună
formând mai mult de jumătate din genomul uman. În plus, au fost identificate 31 de

54
amplificări focale și deleții homozigote, inclusiv multiple gene noi. Cele mai comune regiuni
amplificate în cance rul pulmonar includ MYC, TERT, CCND1 și EGFR, dar multe alte ținte
de amplificare au fost identificate într -un procent mai mic de cazuri. Figura 14 prezintă
frecvența câștigurilor și pierderilor în genomul NSCLC.
Multe studii aCGH au axat analiza pe detec tarea diferențelor în profilul genomic al
numărului de copii între tipuri histologice diferite de cancer pulmonar. Majoritatea studiilor
au examinat specific carcinomul cu celule scuamoase și adenocarcinomul, cele două tipuri
mai comune de NSCLC. În total, structura aberațiilor a fost similară între adenocarcinom
(ADC) și carcinomul cu celule scuamoase (SCC); metodele de grupare supervizate sau
nesupervizate nu au putut face difere nța di ntre cele două. Cu toate acestea, un număr distinct
de asocieri a u fost identificate.
De departe ceea mai frapantă diferență a fost câștigul de material genetic pe brațul
lung al cromozomului 3 ce se întinde pe o regiune largă de 30 Mb, inclusiv benzile q25 până
la q29. Pe lângă faptul că sunt destul de specifice pentru SC C, câștigurile pe 3q au loc cel mai
probabil în stadiile incipiente ale cancerului.

Fig. 14 . Variații ale numărului de copii ADN comune în NSCLC. Frecvența câștigurilor și a
pierderilor sunt plasate la dreapta și respectiv la stânga locației cromozomului .

55
Asocierea câștigului pe 3q cu SCC a fost recunoscută anterior de CGH cromozomal
clasic și de alte experimente de citogenetică moleculară. Studiile microarray au co nfirmat
aceste descoperiri, și î n plus, au permis cercetătorilor să definească segmentel e implicate la o
rezoluție suficient de înaltă pentru a începe identificarea cu încredere a oncogenelor
individuale care reprezintă țintele cele mai probabile ale amplificării. Oncogene candidate în
această regiune includ PIK3CA, TP63, SOX2, DCUN1D1, EV11, MDS1, TP73L, FGF12,
SST, TGFA și GLUT2. Totuși, pentru multe din tre acestea, rolul oncogenic rămâne a fi
determinat.
O regiune a 8p12 a fost raportată ca fiind amplificat ă în 10 -15% din SCC, în timp ce,
în contrast, probe ADC prezintă frecvent pierderi c e implică 8p. Alte variații ale numărului de
copii raportate de mai multe studii c a fiind asociate semnific ativ cu SCC , includ câștig 2q,
pierdere 3p și câștig 12q.
Pentru ADC, principala CNA specifică tipului histologic descrisă, a fost recent
recunoscută cu ajutorul tehnologiei aCGH de către două studii mari concomitente și
cuprinzătoare. Weir et al. a descoperit, prin analiza aCGH, amplificări 14q13.3 ce conțineau
NKX2 -1 (TITF1) în 6 -12% din 528 de probe ADC, și 12% dintr -un set separat de 33 0 ADC
prin analiza FISH. Kwei et al. a găsit o proporție similară, 11% din 36 ADC, în timp ce numai
1 din 40 SCC prezentau această amplificare prin aCGH. Remarcabil, acestă amplificare nu a
fost identificată într -un total de 385 cancere mamare, de prostată , colon și pancreas, oferind
dovezi suplimentare în ceea ce privește specificitatea sa pentru ADC pulmonar.
Kang et al. a aplicat o matrice BAC țintită la 36 NSCLC primare și a găsit alterări în
următorii loci a fi semnficativ asociate cu histologia ADC: câștig pe 1q, 6p și 7q; și pierderi
pe 9q, 10p și 15q. Garnis et al. a folosit matrici BAC SMRT de 32 k pentru a studia 28 de linii
celulare NSCLC. Alterările specifice liniilor ADC -derivate identificate includ câștiguri pe
3q22 (proximal de regiunea SCC -asociată pe 3q26 -29), 12 și 14; și pierderi pe 2q și 13q.
Newnham et al. au studiat 69 eșantioane NSCLC înghețate din leziuni în stadiile I -IIIA
excizate cu intenție curativă, folosind matrici BAC. Alterațiil e numărului de copii găsite
asociate semnificativ cu ADC în setul lor de date au fost câștig pe 6p21.31 -25.1, și pierderi pe
6q13 -27. În plus, au găsit o tendință semnificativă la schimbări de magnitudine mare în câteva
regiuni cu alterări comune cu SCC: câștiguri pe 7p, 7q și 8q; și pierderi pe 9p, 13q, 17p, 18q,
19p, 19q și 22q.
Au fost folosite de asemenea metode statistice avansate în analiza variațiilor numărului
de copii între subtipurile histologice. Massion et al. a aplicat gruparea aglomerată ierarhizată

56
folosind 100 din cele mai informative elem ente array pentru a discrimina cu acuratețe între
ADC și SCC. Shibata et al. a aplicat gruparea ierarhizată nesupravegheată la date aCGH de la
o serie de 55 mostre ADC în diferite stadii (I -III), microsecționate, fixate cu metanol și
incluse la parafină ș i au descoperit trei subcategorii distincte de ADC. Una dintre acestea a
prezentat semnificativ mai puține aberații ale numărului de cromozomi (CNA), dar câștiguri
mai frecvente pe 19q13.1 și pierderi pe 22q12.2. Celelalte două grupuri au prezentat multe
aberații ale numărului de copii suprapuse, dar unul a prezentat câștiguri mai frecvente pe
1p25 -32, 4p16.3, 11p.15, 12q13 -14, 16p11.2 -13.3, 17q11.1 -25, 19q13.2, 20p11, 20q11.2, și
22q12.2 și pierderi pe 1p22, 6q26, 10q24 -26, 13q22.1 -34, 15q21 -25, și 18p11.2 ; iar celălalt
grup a prezenta t câștiguri mai frecvente pe 5p12 -14.3, 7p12.3 -21.1, 7q22, 7q31, 8q12 -21 și
4q11 -24, și pierderi pe 1q23.3 -41, 10q22.1 și Xq. Aceste grupuri au fost semnificativ asociate
cu fumatul dar nu și cu alte aspecte clinic opatologice, inclusiv histologice , stadiu sau
supraviețuire. Validarea acestor grupuri pe un set de date separat nu a fost efectuată în nici
una din studiile menționate anterior.
Boelens et al. a interogat mostre tumorale microsecționate cu laser de la 34 de pacienți
ce prezentau SCC localizat central, care au fost urmăriți cel puțin 5 ani, inclusiv 15 pacienți
fără metastaze, 8 cu metastaze strict în ganglionii limfatici regionali și 11 cu metastaze
exclusiv în organe la distanță la 2 ani de la operație. Folosind o m atrice BAC UMCG 65 K, au
găsit asocieri semnificative cu metastaze la distanță pentru câștiguri 8q, pierderi 8p și 13q.
Câștiguri în loci diferiți ale regiunii 8q22 -q24 se găseau în 50 până la 60% din pacienți cu
metastaze la distanță, și la doar 7 -20% din pacienți fără metastaze. Genele candidate pe 8q
comentate de autori, fundamentate de genele supraexprimate raportate anterior au inclus
CDH17, SPAG1, RAD21, MTBP, HAS2 și ANGPT1, în timp ce MYC a fost menționat a fi
localizat înafara regiunii semnificativ e. Prezența metstazelor în ganglionii limfatici a fost
asociată cu câștiguri pe 7q, 8p, 10q și 12p și pierderi pe 4p și 4q. Tumorile fără metastaze la 5
ani au prezentat asocieri cu câștiguri pe 2p și pierderi pe 11p.
Oferind sprijin suplimentar pentru valoarea prognosticului câștigurilor 8q, Iwakawa et
al. au demonstrat o asociere a unui amplicon 8q, inclusiv MYC și PVT1, cu prognostic prost
la 105 pacienți cu ADC de dimensiuni mici în st adiile I -III. Ei au continuat validarea acestei
descoperiri pe un alt set mare de 162 ADC pulmonare stadiul I, și au găsit o asociere între
câștigul 8q și supraviețuire a fără recurențe scăzută .
Peng et al. au folosit o matrice BAC particularizată MCG țintită cu 800 de clone
pentru a studia 41 carcinoame neuroendocrine d e grad înalt în stadiile I -III (10 SCLC și 31

57
LCNEC) și au găsit 10 loci a căror aberații prezentau asocieri semnificative cu prognosticul
pacienților, inclusiv câștigurile pe 8q. Alte alterări cu asocieri semnificative au fost localizate
pe 10q, 18q, 20p și 20q. O analiză multivariabilă ce include sexul, vârsta, mărimea tumorală,
metastazele la nivelul ganglionil or limfatici și stadiul, a dezvăluit asocierea pierderii 10q cu
prognosticul prost în aceste tumori.
În concordanță cu descoperirea unei asocieri între pierderile 4q și metastazele
ganglionilor limfatici în SCC, Wrage et al. a raportat dovezi ce sprijină utilitatea prognostică a
pierderilor 4q prin studierea tumorilor NSCLC primare de la 30 de pacienți folosind matrici
oligonucleotidice umane VUMC și MACF 30 K. Aceștia au găsit asocierea între pierderi pe
4q21, 10p, 10q și câștiguri pe 17q și 20q cu prezența celulelor tumorale diseminate la nivelul
măduvei osoase și au validat asocierea pierderilor 4q prin FISH pe 29 tumori NSCLC
adiționale și 36 me tastaze cerebrale. Pierderea 4q a fost găsită de FISH în 50% din pacienții
cu măduva osoasă pozitivă comparativ cu 6% din pacienții cu măduva osoasă negativă.
Pierderile pe 4q au fost asociate cu histologia SCC și stadiul tumoral, iar în analize
multivaria bile doar statusul măduvei osoase și stadiul tumoral au rămas drept factori
independe nți. Studiul nu a identificat o genă supresoare tumorală specifică în această locație,
dar a marcat că gene exprimate diferit erau grupate în această regiune în cinci hot -spot-uri
diferite în regiune. Genele candidate în această regiune remarcate de Weiss et al. includ
MAPK10, GPR103, PCDH18, RAPGEF2 și FSTL5.
Kang et al. au folosit un cip BAC MacArray™ Karyo4000K pentru a realiza profilul
ADN extras din 22 preparate SCC î n stadiile I -III, și au găsit asocierea puternică a pierderilor
pe 9p, în aproximativ 35% din tumori cu metastaze la nivelul ganglionilor limfatici, histologie
slab diferențiată și stadiu avansat. Platforma array le -a permis definirea a două regiuni
distin cte recurente de deleție homozigotă pe 9p: una ce se întinde pe o regiune de 128 kb pe
9p21.2 ce conține genele supresoare tumorale presupuse CDKN2A/p16, MTAP și TEK, iar
cealaltă cuprinde o regiune de 200 kb pe 9p24.3 ce conține 18 ținte posibile inclusiv genele
tumorale presupuse DOCK8, DMRT1 și DMRT3.
Aplicațiile aCGH ca marker predictiv pentru cancerul pulmonar sunt limitate în
prezent; totuși acest lucru se va schimba cel mai probabil în viitorul apropiat, pe măsură ce
din ce în ce mai multe terapii moleculare țintite sunt dezvoltate pentru eficacitatea crescută a
acestora împotriva leziunilor genetice specifice. Aceste terapii includ activarea mutațiilor
și/sau amplificărilor ce implică oncogene care redau dependența celulelor tumorale la aceste
aberații. Exemplele următoare ilustrează felul în care amplificările focale pot expune

58
oncogene specifice care determină creșterea unui anumit cancer pulmonar și cum prin
înlăturarea determinantului folosind terapie țintită poate determina un răspuns impresion ant la
tratament .
Mutațiile și amplificările EGFR în ADC pulmonar au fost stabilite drept predictive
pentru rata mai crescută a răspunsului la tratament de către inhibitorii tirozin kinazei EGFR
(TKI). Atât mutațiile cât și amplificările sunt asociate cu o demografie specifică: as iaticii de
est, femei, ne fumătoare, cu adenocarcinoame care prezintă un model histologic
bronhioloalveolar. Cele mai multe studii ale numărului de copii au recurs la FISH pentru a
detecta prezența amplificărilor.
Li et al. au te stat abilitatea aCGH de a detecta amplificări EGFR în 77 de pacienți cu
ADC, folosind micromatrici Affymetrix Genome -Wide Human SNP array 6.0. Ei au raportat
că atât amplificările detectate de FISH cât și de aCGH erau puternic corelate cu prezența
mutației EGFR în domeniul tirozin kinazei (exonii 18 -21) prin secvențierea directă (p=0.001
și respectiv p< 0.001), demonstrând că aCGH este o metodă validă în detectarea
amplificărilor EGFR. Câștig al numărului de copii a fost detectat de aCGH în 42/50 (80%)
din cazurile cu mutații EGFR, iar 7/24 (29%) din cazurile cu tip sălbatic, sugerând că detecția
doar a mutațiilor EGFR comune poate scăpa un subset de pacienți care ar putea răspunde la
terapia TKI. (36)

4. Limite

Tehnica array C GH oferă avantaje importante comparativ cu alte metode citogenetice de
diagnostic. În primul rând pentru că nu este necesar obținerea de metafaze și permite analiza
ADN -ului extras din diferite țesuturi, inclusiv țesuturi inluse în parafină. Alte avantaje includ
abilitatea de a căuta sute de regiuni cromozomiale într -o singura analiză, într -o perioadă
scurtă de timp și cu rezoluție înaltă, depășind limitările cariotipării convenționale și CGH
metafazic. Alte avantaje ale acestei metode moleculare include fa ptul că nu este necesară
cunoașterea în avans a regiunii genomice implicate și în plus abilitatea de a studia cazuri în
care este valabil doar ADN -ul, fără a putea obține cromozomi. Metoda poate fi reprodusă din
punct de vedere clinic, cu rezultate fiabil e în 48 de ore. (22)
Microrețelele oligonucleotidice au înlocuit în mare parte matricile cADN pentru
studierea genomului uman și a organismelor model, deoarece ele permit definirea flexibilă a

59
unei platforme de hibridizare controlate și atent proiectate. Acuratețea în designul rețelelor
oligonucleotidice a fost îmbunătățită considerabil de la completarea secvențierii genomului
uman în 2003. A devenit astfel valabilă o secvență cartografiată de î naltă calitate pentru întreg
transcriptomul , iar o bază de date bine adnotată a structurii genelor a fost dezvoltată .
Progresul în ceeea ce privește eficacitatea și nivelul sintezei chimice de ADN, a creat o
metodă economică pentru producerea pe scară la rgă a probelor oligonucleotidice. Sinteza
chimică depinde de adăugarea etapizată a nucleotidelor protejate la catene ADN emergente,
care sunt de regulă an corate la un suport solid de că tre primul nucleotid. Nucleotidul protejat
previne adăugarea grupurilor subsecvente, iar la fiecare pas catenele emergente trebuie
deprotejate înainte ca nucleotide suplimentare să poată fi atașate. Așadar, la fiecare pas
catenele emergente sunt mai întâi deprotejate, apoi sunt scăldate într -o soluție ce conține nu
mai specii le de nucleotide dorite. Secvențele dorite pentru probe sunt construite literă cu literă
în această manieră etapizată.
Affymetrix Technologies este un furnizor de top de microrețele oligonucleotidice
comerciale, iar compania oferă o metodă care este cea m ai precisă spațial pentru depunerea
probei pe bine -cunoscutele sale matrici GeneChip™. Affymetrix sintetizează probe
oligonucleotidice 25 -mer direct pe substraturi de silicon căptușite folosind microfotolitografie
pentru a deproteja catenele oligonucleotid ice în locații definite precis. Probele sunt sintetizate
in situ înăuntrul probelor celulare la concentrații ce variază de la 100,000 la 1 milion de
oligonucleotide per probă celulară.
Strategia designului Affymetrix postulează specificitate crescută folosind probe scurte
oligonucleotidice de 25 -mer, care include o probă nepotrivită utilizată drept control pentru
fiecare potrivire perfectă. Proba nepotrivită este diferită prin prezența u nei singure baze în
poziția celui de -al 13 -lea nucleotid. Unsprezece probe potrivite perfect sunt oferite în puncte
diferite în regiunea 3´ a fiecărei genă, care sunt referite colectiv ca set de probe.
Limitarea importantă a acestui design include variaț ia afinităților de hibridizare
folosind probe 25 -mer, care de regulă nu pot fi potrivite la aceeași temperatură de topire.
Așadar, sensibilitatea probei poate varia larg în rândul seturilor de probe. În plus, un model
satisfăcător a strategiei de nepotrivi re a fost greu de dezvoltat, o modelare statistică extensivă
este necesară pentru a putea interpreta rezultatele acestei platforme.
Argumente pro și contra folosirii probelor oligonucleotidice mai lungi s -au acumulat
după ani de experiență cu matrici Aff ymetrix, cu multe alte grupuri preconizând probe de
lungimi între 60 și 70 perechi de baze. Agilent Technologies, un alt producător de top,
sintetizează oligonucleotide in situ folosind tehnologie ink -jet pentru a distribui nucleotidele

60
în poziții precise pe matricile sale. Oligonucleotidele de 60 -mer astfel rezultate pot fi
modificate folosind algoritmi software pentru a satisface cerințele teoretice pentru temperaturi
de topire echivalente, unicitatea secvenței, și lipsa elementelor repetitve și a structu rii
secundare. Totuși, acești algoritmi nu sunt perfecți, așa că Agilent raportează validarea și
selectarea empirică pentru majoritatea probelor sale.
Agilent a efectuat comparații una lângă alta pe platforma sa și raportează că
oligonucleotidele 60 -mer sunt la fel de specifice dar de cinci până la opt ori mai sensibile
comparate cu probe -control de oligonucleotide 25 -mer. În contrast, Affymetrix a indicat că
sunt necesare probe multiple per transcript pentru a implementa matrici cu oli gonucleotide
scurte și a oferit date proprii pentru a susține această strategie. (31)
Toate matricile sunt folosite drept unelte pentru a determina interacțiunile dintre
molecule imobilizate la o suprafață solidă și molecule care sunt într -o mixt ură complexă într -o
soluție, care se află în contact cu matricea. Aceste interacțiuni care se petrec sunt pe urmă
detectate și cuantificate. Toate matricile ADN , în condiții favorabile, prezintă abilitatea de a
hibridiza între ei acizii nucleici cu secvenț e complementare. În matricile ADN, un acid
nucleic este imobilizat pe o suprafață solidă, iar acidul nucleic din soluția de hibridizare este
marcat cu un izotop radioactiv, cu o moleculă chimică sau de culoare, care poate fi detectată
cantitativ. Acidul nu cleic legat de suprafața solidă a micromatricii este numită probă, iar
acidul nucleic care este marcată de o moleculă reporter cum ar fi izotop sau de c uloare va fi
numită țintă. Teor ia în spatele acestei nomenclaturi constă în faptul că acizii nucleici pr obă
imobilizați pe suprafața matricii sunt folosiți pentru a interoga mixtura compl exă de acizi
nucleici marcați pentru acizi nucleici din soluția de hibridizare care sunt complementari cu și
care se vor asocia cu proba imobilizată (legată).
Cheia tehnolo giei micromatricilor ADN o reprezintă hibridizarea acizilor nucleici,
care apare când acizi nucleici mono -catenari (denaturați) sunt incubați împreună în condiții
care promovează formarea de molecule perechi de baze duplex prin cuplarea bazelor C:G sau
A:T. Acizii nucleici hibrizi dublu -catenari sunt, prin urmare, compuși din secvențe care sunt
complementare una cu alta. Condiții care favorizează hibridizarea acizilor nucleici pot fi
promovate prin manipularea timpului, temperaturii și puter ii ionic e a amortizorului de
hibridizare (stringență) și va fi afectată de concentrația și complexitatea probei. Hibridizările
sunt efectuate de obicei la stringență scăzută (concentrație crescută de săruri), frecvent în
prezența formamidei, deoarece formamida perm ite efectuarea hibridizării la temperaturi
relativ scăzute (42șC). Stabilitatea hibrizilor ADN depinde de existența unor nepotriviri ale
duplexului de acizi nucleici, aceasta scăzând pe măsură ce numărul de nepotriviri crește.

61
Stabilitatea duplexului de a cizi nucleici determină cât de puternic este atașat ADN -ul țintă la
acidul nucleic probă imobilizat, și cât de ușoară sau dificilă este spălarea ADN -ului țintă
marcat din legarea nonspecifică la probele atașate. Spălările pentru a destabiliza și, în
consec ință, pentru a înlătura hibrizii nepotriviți, sunt efectuate în condiții de stringență
crescută (în scop practic, în general înseamnă scăderea concentrației de săruri și/sau creșterea
temperaturii) , astfel că hibridizarea nonspecifică este minimizată.
Macromatricile Panorama® (macroarrays) comercializate de Sigma -Genosys constau
în produși PCR imobilizați pe membrane de nailon, unde fiecare produs PCR reprezintă o
parte dintr -o genă sau o singură genă în totalitate. În experimente transcriptomice, acești
produși PCR imobilizați sunt hibridizați cu produși cADN marcați radioactiv și spălați, iar
membrana rezultată este scanată folosind un sistem de imagerie cu fosfor. Pentru
macromatrici, trebuie condusă compararea între două probe folosind două hibridizări separate,
deoarece probele test și control sunt marcate cu aceeași moleculă reporter. Pe lângă
miniaturizare, diferența cheie dintre un experiment ADN microarray standard pe lamă de
sticlă și experimentele conduse folosind sisteme cum sunt macromatricile P anorama®, este
accea că matricile pe lamă de sticlă folosesc hibridizarea competitivă dintre cADN -urile
derivate din două surse și proba ADN imobilizată. În aceste experimente, fiecare cADN din
surse diferite este marcat cu o culoa re fluorescentă diferită. Hibridizarea competitivă are mai
multe avantaje: permite compararea directă între două probe, de exemplu tip sălbatic (control)
și un mutant (test) pe aceeași matrice, iar din punct de vedere al fiabilității și al
reproductibilității, hibridizarea competi tivă învinge iregularitățile proprietăților spoturilor
probei sau ale condițiilor locale de hibridizare pe matrice, care ar putea afecta în mod negativ
intensitățile semnalelor de hibridizare. În hibridizarea competitivă, semnalul din fiecare spot
de pe ma trice este, așadar, o proporție a semnalelor atât a probelor control cât și a probelor
test, unde probele control și test au suferit condiții de potrivire. Acest lucru înseamnă că
indiferent dacă depunerea probelor sau condițiile de hibridizare sunt neregu late, proporții ale
intensității semnalelor pot fi obținute cu acuratețe.
Modurile majore de folosire a micromatricilor ADN sunt: profilarea expresiei genelor,
detecția și caracterizarea patogenilor, hibridizarea genomică comparativă (CGH), genotiparea,
resecvențierea genomului integral. (37)
Micromatricile ADN sunt o unealtă puternică pentru monitorizarea simultană a sute de
nivele transcript. Însă, multe transcripte importante în funcții au nivele de expresie scăzute sau
sunt exprimate în relativ puține celule, fiind astfel dificil de detectat în fundalul complex al
țesutului întreg. Așadar, rezultate mai fiabile pot fi obținute folosind celule cultivate decât

62
probe de țesut. În plus, cipurile genice, în general detectează fi abil numai transcripte cu
abundență medie -crescută, deoarece detecția transcriptelor cu abundență scăzută, din care
multe au relevanță importantă pentru funcția biologică, este inconsistentă. Este esențială
confirmarea concluziilor experimentale derivate d in datele generate de analiza array folosind
metode suplimentare mai sensib ile, cum ar fi tehnologia PCR. (38)

VII. Utilizarea metodelor de CGH în diagnosticul
prenatal (etiologia avorturilor spontane, etiologia
morții in utero, anomaliilor fetale)

Aproximativ 2% până la 5% din nou născuții vii au cel puțin o anomalie congenitală
identificabilă la naștere, clasificându -se de la anomalii ușoare la cele severe ce compromit
supraviețuirea. Malformațiile congenitale sunt de o importanță în creștere fiin d cauze de
suferință și daună a sănătății populației, reprezentând un procentaj mare din morbiditatea și
mortalitatea perinatală.
Introducerea ultrasonografiei în îngrijirea prenatală a permis identificarea malformațiilor
congeni tale chiar din mediul intrauterin. Identificarea malformațiilor se realizează direct prin
detectarea schimbărilor morfologice sau indirect prin semne cum ar fi întârziere în creșterea
intrauterină și schimbările de volum ale fluidului amniotic. Progresele tehnologice în
ultrasonografie, experiența crescută în serviciile specializate și accesul mai facil la serviciile
de ecografie au contribuit la o creștere semnificativă a detecției fetușilor cu malformații
congenitale în populații cu risc scăzut, devenind o rutină în îngrijirea prenatală.
Ultra sonografia pentu a detecta feț ii cu anomalii cromozomiale este o metodă cu valoare
predictivă negativă mare, ceea ce înseamnă că în absența defectelor d etectate, posibilitatea ca
fătul să prezinte o anomalie cromozomi ală este mică.
Cauzele genetice, singure sau impreună cu cele de mediu, sunt implicate în cel puțin o
treime din malformațiile congenitale. Printre cauzele genetice, anomaliile cromozomiale
numerice sau structurale sunt prezente în aproximativ 0.9% din gr upuri neselectate de nou –
născuți și în mai mult de 10% din nașterile cu feți morți. Frecvența totală a anomaliilor

63
citogenetice în fetușii cu malformații este de aproximativ 10% până la 15%. Dintre acestea,
aproximativ 80% sunt trisomii ale cromozomilor 13 , 18 sau 21. Restul anomaliilor implică
schimbări numerice în cromozomii sexuali și rearanjări cromozomiale structurale. În
concluzie, este justificabilă conduita de a indica analiza cromozomială la toate nașterile cu feți
morți și în morți neonatale, cu s au fără fenotip uri dismorfice, și la toți feți i cu malformații, în
special când sunt prezente mai mult de o anomalie sau când există istoric familial de
malformații congenitale.
Dezvoltarea tehnicilor moleculare moderne a permis analiza genomului uman la rezoluție
înaltă, fiind folositoarea în mod special în identificarea noilor schimbări genomice,
neidentificate anterior de analiza cromozomială de rutină. (39)
Folosind tehnica CGH în 2004, Schaeffer et al. a observat o creștere a ratei de detecție a
anomaliilor cromozomiale care nu au fost identificate de analiza cromozomială convențională
în 9.8% din 41 de cazuri de avorturi spontane. În țesutul pulmonar crioge nat obținut de la 49
de fetuși cu malformații multiple și cariotip normal care au suferit avort spontan sau
terminarea electivă a sarcinii, Le Caignec et al. a identificat o rată crescută de 16.3% folosind
tehnica array CGH. Alt studiu retrospectiv a valid at două platforme array CGH în 30 de
eșantioane de fluid amniotic și vilozități coriale.
După ce studiile inițiale au introdus validarea retrospectivă a tehnicii array CGH pentru
diagnosticul prenatal, au apărut și primele studii prospective. În publicați i recente, Van den
Veyner et al. au găsit 4.8% ano malii descoperite în 84 de fetuși cu malformații evidențiate la
ultrasonografie, iar Kleeman et al. au descoperit procent ul de 8%, considerând doar feț ii ce
prezentau cariotip normal, demonstrând astfel că tehnica array CGH este o unealtă
promițătoare utilă în diagnosticul prenatal. (40)
În primul studiu prospectiv în diagnosticul prenatal, Sahoo et al. au raportat o rată de
detecție a anomaliilor cromozo miale de 43% din cei 98 de feț i studiați. Într -un grup neselectat
de 50 de feț i malformați cu cariotip normal, Kleeman et al. au găsit 4 fetuși (8%) cu rezultate
array anormale. Studiind un număr comparabil de c azuri folosind o matrice țintită de 287
clone, prin includerea exclus iv a feț ilor cu cel puțin trei anomalii , Le Caignec et al. au
descoperit anom alii în 16.3% din cei 49 de feț i investigați. Utilizând aceeași matrice CGH
țintită pentru a studia retrospectiv 37 de malformații fetale cu cel puțin două anomalii și
cariotip no rmal, Vialard et al. au gă sit rezultate anormale în 4 feț i, ce corespunde la un
procent de 10.8%. În studiul lui Machado et al., deși numărul de fetuși cu variații ale
numărului de copii era mult mai mare dec ât în alte rapoarte, numărul fetuș ilor cu CNV

64
descrise printre dezechilibrele genomice detectate nu a putut arăta o asemenea diferență
(Tabel I).

Studiu N de fetuși incluși în
studiu Fetuși cu anomalii
cromozomiale Fetuși cu CNV
Le Caignec et al. 49 8 (16%) NL
Sahoo et al. 98 42 (43%) 30 (71%)
Shaffer et al. 151* 15 (10%) 12 (80%)
Kleeman et al. 50 4 (8%) 3 (75%)
Vialard et al. 37** 4 (10%) NL
Van der Veyner et
al. 300 58 (19%) 40 (69%)
Machado et al. 48 45 (94%) 39 (87%)

*Considerând doar specimenele prenatale
**Considerând doar fetușii cu cariotip normal
NL= nelistate
Tabel I . Numărul de fetuși cu anomalii ale numărului de copii și variații ale numărului de
copii (CNV) în studii array CGH prenatale recente.

Indiferent că tehnicile array CGH au un principiu teoretic și abordări molecular e comune,
studiile publicate au o metodologie diferită în selecția fetușilor; de asemenea designul
studiului, platformele array CGH, analiza bioinformatică și interpretarea rezultatelor diferă,
astfel că realizarea unei comparații între diferitele lucrări nu este în totalitate lipsită de erori.
Acest lucru poate explica diferența între ratele de detecție observate în diferitele studii.
O diferență cu impact semnificativ pe compararea rezultatelor este prezentată de
selecția feților, cuprinzând feți care au murit cu mai mult de trei malformații indicate în
diagnosticul prenatal, cum ar anxietatea maternă. Un studiu a inclus 367 de indicații diferite
pentru analiza moleculară, inclusiv 20 de cazuri în care indicația nu a fost specificată.
Machado et al. a sel ectat doar feții cu malformații congenitale ce prezentau un teren genetic
puternic și feți cu multiple malformații congenitale. În ambele situații este așteptată o
prevalență crescută a anomaliilor genetice și acest lucru poate explica rata crescută de det ecție
a feților cu variații ale numărului de copii în acel studiu. (41)

65
Încă nu există un consens între grupurile de cercetători în privința interpretării
rezultatelor. Definiția "rezultatelor cu semnificație neprecizată" nu e ste clară în metodologia
adoptată de unele studii. Acest lucru se poate întâmpla datorită faptului că există puține
cunoștințe în ceea ce privește istoria naturală și spectrul variabilității clinice asociate cu
delețiile si duplicațiile submicroscopice des crise recent, detectate de array CGH. Merită
menționat faptul că prezența doar a unei deleții sau duplicații nu înseamnă neapărat că alterări
ale numărului de copii cauzează fenotipul observat, de asemenea, nu se poate considera un
dezechilibru al numărul ui de copii ca fiind patogenic doar pe baza asocierii cu malformații
fetale identificate prin analiza ecografică . Însă, fetusul ce prezintă o anomalie structurală
semnificativă are un risc a priori crescut de a avea o anomalie genetică patogenă, iar după
cum este adevărat pentru orice test, dezechilibrul numărului de copii găsit este cel mai
probabil unul cu adevărat patogenic.
În evaluarea domeniilor și a conținutului regiunilor afectate de alterări genomice,
Machado et al. a u indentificat în 13 din 48 de fetuși (27%) studiați prin CGH , amplificări sau
deleții genomice care ar putea conduce la modificări ale rezultatelor citogenetice inițiale cu
impact clinic. Pentru aceste cazuri, consecințele diagnosticului molecular implică experți de
referință la intervenții terapeutice pentru sindroame specifice. Consecințele se extind de
asemenea spre reducerea numărului de proceduri diagnostice la care pacientul ar putea fi
supus. Pentru familie, diagnosticul poate reduce anxietatea si pe rmite o consiliere adecvată a
riscurilor și planificarea pentru a avea un copil. Schimbările citogenetice considerate clinic
semnificative sunt cuprinse între 80Kb -30Mb și sunt cel mai frecvent pierderi genomice.
Aplicabilitatea clinică a tehnicii array C GH în diagnosticul prenatal este bine stabilită
pentru rafinarea diagnosticului în cazurile cu diagnostic suspicios sau neconcluziv al
schimbărilor structurale cromozomiale. În literatura recentă, există un număr crescut de cazuri
descrise care întăresc ac estă aplicabilitate clinică a array CGH în diagnosticul prenatal. Alte
situații includ studiul translocațiilor echilibrate prin cariotipare convențională, dar care au
dovedit a avea un model neechilibrat după analiza CGH, cu specificarea dimensiunilor exac te
și locația anomaliilor cromozomiale structurale. (42)
Alte aplicații clinice pot fi verificate selectând feții în funcție de un defect specific,
după cum a fost demonstrat ă pentru caracterizarea moleculară a feților cu holoprozencefalie și
hernie diafragmatică congenitală. Tehnica array CGH poate contribui la cunoașterea și
caracterizarea instabilității genomice submicroscopice a anomaliilor congenitale specifice.
Sunt susți nute regiunile cromozomiale semnificative indicate când se consideră că un

66
dezechilibru al numărului de copii într -o astfel de regiune este recurent în feți cu același
fenotip și când a fost descrisă aceeași corelare genotip -fenotip. În acest mod, pot fi
identificate câteva clone cu semnificație necunoscută dar presupusă care au oferit o listă a
regiunilor cromozomiale de interes clinic pentru evaluarea moleculară suplimentară. Cercetări
adiționale și de confirmare sunt necesare pentru a stabili în continua re rolul genelor din acea
regiune cromozomială în patogeneza fiecărui defect congenital specific.
Identificarea CNV poate complica foarte mult interpretarea rezultatelor tehnicii array
CGH. Printre feții cu schimbări în numărul de copii, 70% până la 87% a u avut cel puțin o
clonă ce conținea o regiune cromozomială alterată cu CNV , descrisă în bazele de date
valabile. Această problemă este în mod particular critică pentru diagnosticul prenatal, unde
obținerea unui rezultat "normal" sau nu, definește abordare a perinatală. Discriminarea
adecvată dintre aberațiile inofensive și cele reale este esențială pentru consilierea potrivită.
(43)

Recomandări ACOG: (ACOG, 2009)
›› Cariotiparea convențion ală rămâne principala unealtă citogenetică în diagnosticul prenatal
›› Array CGH țintit, coroborat cu consilierea genetică, poate fi oferit drept unealtă ajutătoare
în cazurile prenatale cu defecte anatomice descoperite la ultrasonografie și cariotip norm al,
precum și în cazurile de moarte fetală cu anomalii congenitale și imposibilitatea obținerii unui
cariotip convențional.
›› Cuplurile ce aleg array CGH țintit ar trebui să primească consiliere genetică atât pretest cât
și posttest. Urmărirea cuplului prin consiliere genetică este necesară pentru interpretarea
rezultatelor array CGH. Cuplului trebuie explicat că array CGH nu va detecta toate patologiile
genetice și că rezultatele array CGH pot fi dificil de interpretat.
›› Array CGH țintit poate fi uti lă ca unealtă pentru screening; însă, studii suplimentare sunt
necesare pentru a determina pe deplin utilitatea și limitările sale.

Tabel II . Recomandările ACOG pentru array CGH în diagnosticul prenatal.

Luând în considerare cele de mai sus și bazate pe Declarația Colegiului American de
Obstetrică și Ginecologie publicat în 2009 (ACOG, 2009), tehnica array CGH nu poate
substitui citogenetica clasică în diagnosticul prenatal. Conform opiniei ACOG, utilitatea
tehnicii array CGH ca unealtă de primă linie în detectarea anomaliilor cromozomiale în toate

67
mostrele de amniocenteză sau vilozități coriale este încă necunoscută. Rata adițională de
detecție a anomaliilor cromozomiale folosind array CGH, comparativ cu cariotiparea
convenționlă pentru analiza de rut ină a cromozomilor fetali, așteaptă un studiu pe o populație
mai mare (Tabel II). (44)
Un grup internațional de experți în domeniul array CGH, Consorțiul ISCA
(International Standard Cytogenomic Array), a ținut două seminare internaționale și a condus
o recenzie de literatură a 33 de studii, ce a inclus 21,698 de pacienți testați prin tehnica
micromatricilor cromozomiale (CMA) . Aceștia au furnizat un rezumat bazat pe dovezi a
testărilor clinice citogenetice ce au comparat CMA cu cariotiparea prin bandarea G,
respectând avantajele și limitările tehnice, diagnosticul oferit pentru variate tipuri de aberații
cromozomiale și problemele care afectează interpretarea testului. Au conclus că dovezile
valabile sprijină puternic folosire a CMA în locul cariotipării G -banded drept testul citogenetic
diagnostic de primă linie pentru pacienți cu întârziere de creștere/dizabilități intelectuale,
tulburări din spectrul autismului sau multiple anomalii congenitale (MCA). Însă, Consorțiul
ISCA re cunoaște că dovezile actuale nu sunt suficiente pentru a permite recomandări privind
anomaliile congenitale multiple prenatale, iar metodele citogenetice tradiționale, cum ar fi
cariotiparea prin bandare G și hibridizarea fluorescentă in situ sunt încă sta ndarde pentru
diagnosticul prenatal.
Este recunoscut că aray CGH poate detecta schimbări submiscroscopice care pot fi
ratate de analiza cromozomială de rutină, în special în mostrele prenatale unde rezoluția
benzilor este compromisă. Cu toate acestea, ro lul exact al array CGH în diagrama
diagnosticului prenatal nu a fost stabilit. Sunt necesare studii multicentrice care să realizeze o
comparare directă a tehnicii array CGH la analiza citogenetică convențională într -un cadru
prenatal. Până acum nu există n ici o dovadă că ar putea substitui analiza convențională a
cariotipului prin bandare G, dar poate completa și extinde metodele actuale pentru un
diagnostic prenatal și o caracterizare a sindroamelor precise.
Disponibilitatea platformelor array CGH recent e pentru investigarea cromozomială
fetală, inclusiv matricile oligonucleotidice, a adus alte provocări controversate în privința
testării genetice ideale pentru diagnosticul prenatal. Până acum, matricile oligonucleotidice nu
au fost dovedite benefice în c onformitate cu protocoale ale clonelor BAC pentru diagnosticul
prenatal. Multe dintre tulburările genetice cunoscute care pot fi detectate pe matrici țintite nu
determină anomalii fetale detectabile la examinarea ecografică fetală. Solicitarea array CGH
doar în prezența anomaliilor ecografice limitează potențialul diagnostic al acestui test. În plus,

68
sunt necesare cercetări suplimentare pentru a ajunge la un consens asupra unei platforme array
optime pentru practica clinică în diagnosticul prenatal. Se dore ște ca, în viitor, să se proiecteze
cipuri particularizate cu markeri peste loci pentru diagnosticul prenatal.
De asemenea, sunt necesare studii complementare pentru a valida aplicabilitatea
clinică a matricilor CGH pentru diferite situații clinice ale d iagnosticului prenatal, cum ar fi
vârsta maternă avansată, screening biochimic modificat, markeri ecografici de prim trimestru
și în situații de anxietate familială în prezența screening -ului biochimic sau ecografic normale.
Altă provocare de învins este proiectare unei strategii uniforme și eficiente pentru
interpretarea rezultatelor ce implică variantele numărului de copii. Timpul și efortul necesar
pentru a distinge descoperirile patogenice de cele benigne cresc pe măsură ce rezoluția array
CGH crește, dar rezultate neinterpretabile apar la toate platformele array CGH.
În ciuda provocărilor rămase de învins, este clar că CGH reprezintă o unealtă
valoroasă în identificarea și caracterizarea moleculară a anomaliilor cromozomiale în feții cu
defecte la na ștere, ce deschide un nou capitol în interfața istorică dintre citogenetică și
medicina fetală. (45)
Nu există bariere tehnice în efectuarea array CGH ca test prenatal. Într -un experiment
care dovedește principiul, Rickman et al. au demonstrat fiabilitatea efectuării array CGH
pentru diagnosticul prenatal pe ADN extras din celulele lichidului amniotic. Cu excepția unei
triploidii, 29/30 din rezultate erau în conformitate completă cu cariotipul. A fost mai departe
ilustrată f iabilitatea utilizării matricilor CGH BAC și matricilor oligonucleotidice pe
amniocite necultivate pentru detectarea dezechilibrelor c romozomiale . (46)
Aplicarea array CGH la diagnosticul prenatal oferă câteva avantaje. Deoarece array
CGH poate fi automatizată și nu necesită culturi celulare, rezultă un timp mai rapid de
completare a procesului. Rezoluția cr escută permite detectarea majorității dezechilibrelor
cromozomiale , inclusiv aneuploidii și toate dezechilibrele genomice recurente cunoscute
cauzatoare de anomalii congenitale multiple/retard mental, care sunt testate actual în
diagnosticul prenatal. Nu e ste suprinzător că tehnologia este implementată în câteva centre de
diagnostic și diferite rapoarte au sugerat că este pregătită pentru utilizarea curentă. (47)
Inerent tehnicii, nu poate detecta rearanjări cromozomiale echili brate (inversiuni și
translocații echilibrate). Când sunt detectate prenatal rearanjări echilibrate pe cariotip, părinții
sunt de obicei testați, iar dacă un părinte "normal" poarăt aceaași rearanjare, translocația este
considerată benignă. Dacă rearanjare a este de novo, consilierea este mai dificilă, iar riscul
pentru anomalii de creștere este estimat a fi de 6%. Analiza array CGH a pacienților cu

69
anomalii de creștere și translocații de novo a dezvăluit că aproximativ 45% din acestea sunt de
fapt neechilib rate. Considerând că translocațiile de novo apar la aproximatv 1/1,000 de
nașteri, din care 6% prezintă fenotip anormal, iar jumătate dintre aceștia pot fi detectați prin
array CGH, ar rămâne 0.003% translocații patogene nedectate fără efectuarea cariotipu lui. 94
Array CGH nu detectează nici triploidiile (69,XXX și 69,XXY) și nici tetraploidiile.
Totuși, folosirea ADN -ului unui pacient cu sindrom Klinefelter (47,XXY) pentru analiza
CGH, rezultă în proporții aberante ale cromozomilor X și Y. O excepție o r eprezintă folosirea
matricilor SNP care ar permite detectarea poliploidiilo r.
În plus față de valoarea predictivă limitată a câtorva dezechilibre recurente noi, alte
povocări împiedică introducerea rapidă a acestei tehnologii noi într -un cadru de diagnost ic
clinic.
Prima provocare este dată de stabilirea cărei pla tforme este optimă sau ce rezoluție să
fie folosite în dianosticul prenatal. Pe de o parte, diferite grupuri sugerează folosirea
matricilor genomului integral, în timp ce alții sugerează că matr icile țintite sunt cele mai bune
pentru diagnosticul prenatal. Matricile genomului integral oferă beneficiul de a detecta toate
dezechilibrele posibile și substituie matricile țintite mai vechi în practica clinică postnatală.
Într-un studiu care a folosit matrici oligonucleotidice de 500K, a fost observată o medie de 30
CNV per individ. Matricile țintite ce includ doar loci cunoscuți a fi cauza anomaliilor de
creștere acoperă mai puțin din genom dar pot rezulta în mai puține dezechilibre de
semnificație nec unoscută. În plus, pentru câteva deleții cunoscute a fi cauza anomaliilor de
creștere, consecințele duplicațiilor pot fi mai puțin severe. De exemplu, duplicația 22q11 este
mai puțin penetrantă decât microdeleția 22q11. Atât pentru matricile țintite cât și pentru cele
ale genomului integral, estimarea consecințelor fenotipice după detectarea unui dezechilibru
cu penetranță și expresivitate variabile la făt este, în prezent, o sarcină imposibilă.
A doua provocare a introducerii array CGH se bazează pe desc operirea rezultatelor
"nedorite/neașteptate ". Rezultatele array CGH oferă o bogăție de informații și aceste
descoperiri pot fi clasificate în diferite categorii: diagnostic prenatal al condițiilor ce vor
debuta la vârsta adultă; dezechilibre ce cauzează an omalii congenitale care pot fi tratate
eficient sau sunt relativ ușoare vor fi identificate. (48)
Un studiu efectuat de Universitatea Națională din Taiwan a evaluat valoarea clinică a
tehnicii array CGH drept unealtă de screening prenatal pentru dezechilibre genomice
submicroscopice. Între 2008 și 2011, 3171 de femei au fost supuse testării array CGH ș i

70
cariotipării într -un centru din Taiwan. Indicațiile pentru diagnotic prenatal invaziv au inclus
vârsta maternă avansată, anxietatea părinților, ecografie și caritotip anormale.

Fig. 15 . Caz cu deleție de 1.58 Mb pe 17p.12. a) Rezultat dat de array CGH BAC. Au fost
evidențiate semnale reduse de trei clone BAC. b) Rezultat dat de matrice oligonucleotidică
105K. c) Rezultate mărite ale matricii oligonucleotidice. Regiunea ștearsă a inclus și gena
PMP22. d) Rezultatele au fost confirmate de metoda amplifi cării simultane a sondelor
ligaturate (MLPA).

Din 3171 de feți, 2497 de mostre au fost examinate cu array CGH BAC de 1 Mb și 674 cu
matrici oligonucleotidice de 60K. Principalul rezultat al studiului măsurat a fost CNV. Array

71
CGH a identificat cu succes 84 de feți cu anomalii patologice, inclusiv 37 (1.2%) cu anomalii
cromozomiale numerice, din care 18 cu trisomie 21, cinci cu trisomie 13, doi cu 45,X, patru
cu 47,XXY, unul cu 47,XXX și unul cu trisomie 2 în mozaic . Array CGH a detectat
microdeleții și mi croduplicații în 34 (1.1%) feți și deleții/duplicații mari în 13 (0.4%) feți .
Modificări benigne ale numărului de copii au fost identificate în 13 feți (0.4%) și variații cu
semnificație clinică necunoscută în 5 feți (0.2%). Array CGH a detectat dezechilib re
genomice submicroscopice în 2 (1.8%) din 17 feți cu translocații echilibrate de novo, 3 (50%)
din 6 feți cu cromozomi markeri supranumerari și 33 (17%) din 194 feți cu rezultate anormale
la ecografia prenatală. Din cei 972 feți fără factori de risc pren atali demonstrabili, array CGH
a detectat anomalii cromozomiale numerice la șase feți, microdeleții și microduplicații la 3,
respectiv 2 feți și anomalii cu semnificație necunoscută la 2 feți. Microdelețiile au interesat
regiuni de 1.58 Mb pe 17p12, de 0.9 4 Mb pe Xp22.3 și de 4.35 Mb pe Xp21.1. Primul caz a
prezentat o deleție interstițială pe 17p12 ce implică gena PMP22 (Fig. 15). Această deleție
poate determina neuropatie ereditară cu predispoziție la paralizii de presiune. Mama purta de
asemenea această microdeleție, deși nu a fost notată nici o modificare fenotipică. După
consiliere genetică, cuplul a decis continuarea sarcinii; nu au fost observate nici un
dismorfism facial sau neuropatie la naștere sau la controlul după un an. Ultimul caz de
microdeleț ie, a fost un făt de sex masculin cu o deleție parțială a genei distrofinei, extinsă de
la regiunea promotoare la cel de -al 44 -lea exon, o descoperire compatibilă cu distrofia
musculară Duchenne. Sarcina a fost terminată în urma consilierii genetice.
În studiul de cohortă, trei feți au moștenit o deleție interstițială de 0.94 Mb pe Xp22.3,
ce include gena steroid sulfatazei (STS) de la mamele non -consanguine (Fig. 16 ).
Microdeleția Xp22.3 poate determina ihtioză X -linkată. Toți trei nou -născuții prezentau piele
cu aspect solzos la naștere, deși toți au ajuns la dezvoltarea corectă conform vârstei observată
la controlul după un an.
În acest s tudiu, doi feți neînrudiți prezentau sindromul microduplicațiilor 22q11.2, o
tulburare extrem de variabilă, cu un f enotip ce poate fi normal sau care poate prezenta
dizabilități de învățare și cu defecte congenitale asociate. Însă, cele două cupluri au decis
terminarea sarcinii în urma consilierii genetice.
Array CGH a identificat câștig de material genetic în trei d in șase feți (50%) cu
cromozomi marker supranumerari, iar variații la doi din aceștia au fost clasificate drept
variații cu semnificcație necunoscută (VOUS). Array CGH poate asista la identificarea
originii și conținutlui genetic a cromozomilor marker, în funcție de mărime, implicarea

72
eucromatinei și acoperirea array. Tehnica poate îmbunătăți acuratețea diagnostică a
cromozomilor markeri, pentru care originea cromozomală este definită de citogenetică, iar
prognosticul bazat doar pe literatura de specialitat e și datele obținute la ecografie.

Fig. 16 . Caz cu deleție de 0.94 Mb pe Xp22.31. a) Rezultat BAC array CGH. Au fost
evidențiate semnale reduse de trei clone BAC. b) Rezultat dat de matrice oligonucleotidică
105K. c) Rezultat mărit al array CGH oligon ucleotidic. Regiunea ștearsă includ genele VCX,
HDHD1A, STS, PNLPA4. d) Rezultatul a fost confirmat de PCR multiplex. Genele FGFR2 și
KRIT1 au fost folosite drept control. Exonul 1 al g enei STS (STSE1) a fost deletat la băiatul
afectat.

73
Cariotiparea prenatală necesită culturi de lichid amniotic. În acest studiu, au fost
identificați doi feți cu duplicații mari raportate de array CGH dar nu și de cariotiparea
convențională. Spre exemplu, un caz prezenta cariotip normal dar era mic pentru v ârsta
gestațională. Analiza lichidului amniotic necultivat de către array CGH a dezvăluit o trisomie
2 în mozaic. Examinarea suplimentară de către FISH interfazic a demonstrat de asemenea
mos 47,XY, +2 [15]/46,XY, [35]. La 26 de săptămâni de gestație, s -a născut un făt de 448 g
cu urechi joc implantate, mac roglosie, mâini încleștate și mort .
Un alt caz prezenta multiple anomalii detectate de ecografia prenatală. Cariotipul fetal
a fost 46,XX; însă analiza array CGH atât a sângelui din cordonul ombilical c ât și a lichidului
amniotic necultivat a arătat duplicația brațului scurt al cromozomului 12.

Fig. 17 . a) Imaginile prenatale de rezonanță magnetică cerebrală a unui caz au dezvăluit o
suprafață cerebrală netedă, fără șanțuri și o joncțiune materie cenușie -materie albă în
emisferele cerebrale frontale și parietale. b) O deleție de 2.4 Mb pe 22q11.21 a fost
identificată de BAC și array CGH oligonucleotidic.

74
Aceste cazuri au oferit dovezi în ceea ce privește discrepanța în diagnosticul citogenetic a
trisomiei în mozaic dintre amniocite cultivate și necultivate. Cariotiparea convențională
necesită cultivarea amniocitelor, dar celulele anormale pot dispărea după cultivarea pe termen
lung. Așadar, a naliza array CGH a ADN -ului din celule necultivate oferă un avantaj față de
cariotipare în condiții similare.
Rata la care array CGH poate detecta alterații ale numărului de copii semnificative
clinic în feți cu anomalii ecografice variază de la 2% la 16%. Într -un studiu al feților cu
anomalii ecografice majore și cariotipuri normale, s -a demonstrat că rata de detecție a fost de
10.5% la feții cu o singură anomalie și de 15.4% la feții care prezentau anomalii care implicau
două sau mai multe sisteme de organe. Un diagnostic genetic specific facilitează îngrijire a
medicală completă și consilierea precisă a riscului de recurență pentru familie. Anomaliile
fizice izolate pot fi corectate chirurgical după naștere, dar anomaliile structurale ce rezultă din
dezechilibrele genetice pot fi acompaniate de o funcție cognit ivă anormală, întârziere
psihomotorie sau alte defecte de sistem nedetectabile de ecografia prenatală. Doi feți dintr -un
studiu au fost diagnosticați cu lis sencefalie. Un caz prezenta o microdeleție de 2.1 Mb pe
17p13.3, compatibilă cu sindromul Miller -Dieker, iar cel de -al doilea avea o deleție 22q11.2.
În ultim ul făt, imagistica cerebrală prin rezonanță magnetică prenatală a dezvăluit o suprafață
cerebrală netedă, fără șa nțuri și o joncțiune materie cenușie -materie albă în emisferele
cerebrale frontale câ t și parietale (Fig. 17 ). Dovezile sugerează că sindromul microdeleției
22q11.2 se asociază cu disfun cție cognitivă. Schaer et al. au raportat că feții cu microdeleție
22q11.2 și defecte cardiace congenitale aveau girificarea redusă în joncțiunea parieto –
temporo -occipitală. În feți cu dovadă ecografică de lisencefalie, rezultatele unui studiu FISH
ar putea diagnostic a sidromul Miller -Dieker; totuși studiul a demonstrat că pentru cei doi feți
cu lis sencefalie, analiza genomului integral folosind array CGH a oferit un diagnostic precis
pentru fiecare.
Array CGH prenatal este o unealtă valoroasă pentru screening -ul microdelețiilor și
microduplicațiilor cromozomiale, în special la feți cu cariotip normal și rezultate ecografice
anormale. În plus, datele studiul ui arată că există un risc de 0.52% de a avea dezechilibre
genomice submicroscopice, chiar și la femei cu c u examinare prenatală normală. Prin urmare,
cercetătorii recomandă includerea array CGH în examinarea prenatală de rutină drept unealtă
de screening. O altă recomandare constă în efectuarea analizei CGH la toate femeile ale căror
făt prezintă anomalii ecografice sau anomalii cromozomiale de novo. (49)

75
Într-un studiu, Chih -Ping Chen et al. au prezentat diagnosticul prenatal al unui caz cu
sindrom de deleție 1p32 -p31 cu haploinsuficiență NFIA (factor nuclear 1 A) ,
ventriculomegalie, hipogeneza corpului calos, organe genitale externe anormale și limitarea
creșterii intrauterine.
O femeie de 26 de ani, primigestă a efectuat amniocenteză la 30 de săptămâni în urma
descoperirii hidrocefaliei și a membrelor scurte la ecografie. Nu exista istoric familial de
malformații congenitale. Ecografia efectuată la 30 de săptamâni a evidențiat d e asemenea o
frunte proeminentă, micrognație, ambiguitatea organelor genitale externe, ventriculomegalie
și hipog eneza corpului calos (Fig. 18 ).

Fig. 18 . (A) Ventriculomegalie; (B) Macrocefalie cu frunte proeminentă și micrognație; (C)
Hipogeneza corpului calos cu absența cavum septum pellucidum pe ecografia la 30 săptămâni
de gestație.

Fluidul amniotic extras prin amniocenteză a fost supus analizei array CGH folosind amniocite
necultivate și analizei citogenetice convenționale folosind amniocite cultivat e. Analiza aCGH
a dezvăluit o deleție de 22.2 Mb pe 1p32.3 -p31.1, ce cuprinde genele NFIA, GPR177 și 89 de
gene adiționale (Fig. 19 ). Analiza FISH folosită drept control a arătat absența semnlului roșu
în cromozomul del(1) (p31.1p32.3). Rezultatul FISH a f ost compatibil cu haploinsuficiența
genei NFIA. La 33 de săptămâni de gestație, s -a născut un făt mort cu o greutate de 1536 g;

76

macrocefalie; o față lată; frunte proeminentă; hipertelorism; narine anteversate; micrognație;
urechi jos implantate și organe genitale externe ambigui cu fuziunea labiilor, hipertrofie
labială, absența orificiului vaginal și hipertrofia clitorisului. Analiza markerului ADN
polimorfic a determinat origine a paternă a deleției (Fig. 20 ).
Deleția de novo ce cuprinde 22,2 Mb pe 1p32. 3-p31.1 în cazul acesta , afectează în
principal regiunea proximală pe 1p32.3, regiuni întregi ale 1p32.2, 1p32.1, 1p31.3 și 1p31.2 și
regiunea distală pe 1p31.1.

Fig. 19 . aCGH oligonucleotidic arată o deleție de 22.2 Mb de la 1p32.3 la 1p31.1.

77

Cazul prezenta haploinsuficiența genei NFIA. Sunt patru gene NFIA independente la
mamifere: NFIA, NFIB, NFIC și NFIX. Proteinele NFI se comportă precum factori de
transcripție/replicare celulară și joacă un rol major în dezvoltarea siste mului nervos central,
inclusiv în creșterea axonală precum și în ghidarea și diferențierea celulelor gliale și
neuronale. S-a arătat că NFIA este foarte exprimată la nivelul cordului, ficatului, în creier,
plămân, ovar, mușchi scheletal, rinichi, testicule , pancreas, splină și la nivelul ficatului și
creierului fetal. Deneen et al. au descoperit că NFIA reglează gliogeneza și diferențierea
oligodendrocitelor la nivelul măduvei spinării în dezvoltare. Plachez et al. au descoperit că pe
lângă reglarea formări i substratelor pentru ghidarea axonală, NFIA are un rol celular -autonom
în dezvoltarea corticală. Lu et al. au descoperit în plus că haploinsuficiența NFIA poate cauze
malformații ale sistemului nervos central și defecte ale tractului urinar.
Cazul prezen ta de asemenea haploinsuficiența genei GPR177, care este necesară
pentru formarea axei embrionare. Fu et al. au descoperit că pierderea GPR177 cauzează
anomalii cerebrale și defecte craniofaciale.

Fig. 2 0. Electroforetograme reprezentative analizei PCR
cantitativă fluorescentă (QF-PCR) . Markerul D1S1195
arată doar o alelă maternă (136 bp) la făt ce indică
originea paternă a deleției.

În acest caz, deleția c romozomului 1p32 -p31 cu haploins uficiența genei NFIA a fost
rapid diagnosticată de aCGH folosind amniocite necultivate obținute prin amniocenteza târzie
în al treilea trimestru. Aplicația aCGH în sarcina avansată, cum a fost demonstrată în acest
caz, este mai puțin invazivă și mai eficientă în diagnosticarea rapidă a aneuploidiilor și

78

aberațiilor cromozomiale subtile precum și în identificarea genei candidate responsabile de
fenotipul specific. (50)
Alt studiu efectuat demonstrează utilitatea aCGH în diagnosticu l prenatal al unei
deleții terminale 2q și a unei duplicații distale . Cazul unei femei de 35 de ani, 3 gestă, 2 pară,
trimisă la spital la 18 săptămâni de gestație pentru efectuarea unei amniocenteze din cauza
vârstei materne avansate și istoricului famili al de translocații cromozomiale echilibrate și
neechilibrate. Cariotipul femeii era normal. Ecografia prenatală efectuată în cursul sarcinii nu
a arătat nici o anomalie structurală. Analiza aCGH cu clone BAC efectuată pe amniocite
necultivate obținute prin amniocenteză a demonstrat o monosomie 2q parțială și trisomie 15q
parțială (Fig. 2 1). Analiza citogenetică convențională a dezvăluit cariotipul
46,XX,der(2)t;(2;15)(q37.3;q24.3)pat. Analiza aCGH oligonucleotidică a demonstrat mai
departe monosomie 2q parț ială (2q37.3 → qter) și trisomie parțială 15q (15q24.3 → qter) .
Acest caz a demonstrat că aCGH poate fi folosit pentru diagnosticul prenatal a
anomaliilor cromozomiale folosind o procedură standard reproductibilă care poate da
rezultate fiabile într -o perioadă scurtă de timp.

Fig. 21 . BAC array CGH arată o
deleție terminală 2q și o duplicație
distală 15q. (51)

Un alt studiu efectuat în scopul diagnosticării rapide a aneuploidiilor folosind aCGH
subliniază utilitatea acesteia în sarcinile din ultima jumătate a trimestrului doi și trimestrul trei

79

cu rezu ltate ecografice anormale. Primul caz este al unei femei de 3 2 de ani, 2 gestă, 1 pară,
care a fost trimisă la spital la vârsta de gestație de 23 săptămâni în urma detec tării ecografice
de anomalii cardiace. Ambii părinți erau sănătoși și non -consanguini, de asemenea nu exista
nici un istoric familial de anomalii ca rdiace congenitale. Mama avea un văr care suferea de
retard mental și sindrom Down. A fost efectuată amniocenteza pentru prelevarea de lichid
amniotic folosit pentru analiza citogenetică convențională și array CGH. Array CGH BAC a
arătat o trisomie 21 (Fig . 22.A). La 8 zile după efectuarea amniocentezei analiza citogenetică
convențională a dezvăluit un cariotip 47,XX,+21 . Analiza markerului ADN polimorfic prin
QF-PCR a arătat că trisomia 21 din acel fetus a fost cel mai probabil cauza nondisjuncției
paterne a meiozei II sau nondisjuncției mitotice postzigotice.
Al doilea caz din studiu, o femeie de 33 de ani, 2 gestă, 1 pară, a fost trimisă la spital
la vărsta de gestație de 30 de săptămâni din cauza anomaliilor cerebrale detectate la ecografie.
Ambii părinți erau sănătoși și non -consanguini, de asemenea nu exista nici un istoric familial
de anomalii congenitale. După ef ectuarea amniocentezei și analiza amniocitelor prin aCGH
folosind clone BAC, aceasta a dezvă luit o trisomie 21 (Fig. 22 .B). La 13 zile după
amniocenteză, analiza citogenetică convențională arăta un cariotip 47,XX+21. Conform
analizei markerului ADN polimor fic, trisomia 21 la acel făt a fost cel mai probabil cauzată de
nondisjuncția meiozei I.

Fig. 22 . Analiza array CGH BAC. (A) Cazul 1
și (B) Cazul 2 prezintă duplicația
cromozomului 21 compatibilă cu diagnosticul
de trisomie 21 (Sindrom Down).

80
Cele două cazuri demonstrează că amniocenteza pentru analiza întregului genom
folosind amniocite necultivate și aCGH reprezintă o alternativă utilă la cordonocenteză pentru
un diagnostic rapid al aneuploidiilor în sarcinile cu rezultate anormale la ecograf ie detectate în
timpul ultimei jumătăți a trimestrului doi și trimestrului trei. (52)
Alt studiu efectuat de Universitatea Națională din Taiwan evidențiază utilitatea
analizei aCGH în cazul unui făt diagnosticat cu sindrom Wol f-Hirschhorn asociat cu
microduplicații pe 8p și 10p și cu o deleție 4p aparent pură.
Mama în vârstă de 35 de ani, 2 gestă, 1 pară a fost trimisă pentru a efectua
amniocenteză la 18 săptămâni de gestație din cauza vârstei materne avansate. Amniocenteza a
dezvăluit un cariotip 46,XY,del(4p16.1). Cariotipurile ambilor părinți erau normale.
Amniocenteza a fost repetată la 21 săptămâni de gestație, iar analiza aCGH a arătat o deleție
de 6.5 Mb pe 4p16.3 -p16.1, o microduplicație de 1.2 Mb pe 8p22 -21.3 și o micr oduplicație de
1.1 Mb pe 10p15.3 (Fig. 23 ). Amaliza markerului ADN polimorfic a confirmat originea
paternă a deleției. Ecografia prenatală a evidențiat hipoplazia feței mijlocii, micrognație,
hipertelorism și hipospadias. Analiza aCGH a părinților nu a ev idențiat nici o anomalie
genomică.
Regiunea critică WHS pe 4p16.3 include genele candidate WHSC1 (gena candidată
WHS 1), WHSC2 (gena candidată WHS 2) și LETM1 (proteina transmembranară 1 ce
conține fermoarul leucinei/brațul EF). WHSC 1 funcționează în reg larea transcripțională
împreună cu factorii transcripționali de dezvoltare pentru a preveni transcripția nepotrivită și
patofiziologia rezultată.
Cazul din studiu prezenta o deleție de 6.5 Mb pe 4p16.3 -p16.1 de origine paternă și
haploinsuficiența genelor WHSC1, WHSC2 și LETM1. Descoperirile ecografice ale WHS
includ restricția de creștere intrauterină (IUGR), dismorfism facial al hipoplaziei feței mijlocii
și aspectul nasului în "cască de războinic grec", defecte ale fuziunii liniei mediene cum ar fi
despicătura facială, hipospadias, agenezia corpului calos și defecte septale cardiace, hernie
diafragmatică congenitală, hipoplazie renală, deformări a le piciorului, translucență nucală
mare și higrome chistice. Cazul prezenta dismorfism facial și hipo spadias la ecografia
prenatală. Aspectul particular al cazului este dat de asocierea cu o microduplicație 8p de 1.2
Mb pe 8p22 -p21.3, o microduplicație 10p de 1.1 Mb pe 10p15.3 și o translocație reciprocă
neechilibrată între cromozomii 4 și 10 pe benzile 4p16.1 și 10p15.3. Translocațiile
neechilibrate sunt responsabile de 22% din cazurile de WHS.

81

Fig. 23. Analiza aCGH cu matrici oligonucleotidice arată o deleție de 6.5 Mb pe 4p16.3 –
p16.1, o microduplicație de 1.2Mb pe 8p22 -p21.3 și o microduplicație de 1.5 Mb pe10p15.3.

În cazurile translocațiilor neechilibrate asociate WHS, aberațiile își au originea în meioza
paternă și trisomia 8p parțială cauzată de t(4;8)(p16;p23) este cea mai frecventă aneuploidie
concomitentă.
Apariția frecventă a translocației t(4;8)(p16;p23) s-a presupus a fi datorită locației
grupurilor de gene ale receptorilor olfactivi (OR) pe 4p16 și 8p23, recombinarării omologe
non-alelice d intre grupurile de gene OR și variația normală extensivă a numărului de copii a

82
unui grup de gene β-defensin antimicrobian DEFB4, DEFB103, DEFB104 pe 8p23.1. Cazul
din studiu a dovedit că o deleție 4p aparent pură de origine paternă poate fi asociată cu
dezechilibre cromozomiale subtile ale altor cromozomi. De asemenea studiul subliniază
utilitatea aCGH în analiza genetică a aberațiilor cromozomiale detectate prenatal. (53)

VIII. Utilizarea metodelor de CGH în diagnosticul
postnat al (sindroamelor plurimalformative,
dizabilităților intelectuale și întârzierilor în
dezvoltare, bolilor neuropsihice, tumori, bolilor
mendeliene)

Organizația Mondială a Sănătății definește retardul mental ca o dezvoltare a minții oprită
în evoluție sau incompletă, caracterizată prin compromiterea abilităților intelectuale care sunt
manifestate în timpul etapei de dezvoltare și care contribuie la niv elul general al inteligenței.
Întârzierea în dezvoltare este un termen folosit frecvent înainte de vârsta de cinci ani, iar
întârzierea poate implica funcția motorie, abilități cognitive, limbaj sau combinări ale
acestora. Poate fi util de determinat dacă aceste dizabilități sunt asociate cu malformații sau
anomalii congenitale multiple și/sau aspecte dismorfice deoarece câteodată poate sugera un
diagnostic clinic al unui sindrom și poate ghida selectarea testelor diagnostice de efectuat.
Retardul mental es te estimat că afectează 2 -3% din populație.
Anomaliile genetice sunt cele mai comune cauze identificabile de întârziere în dezvoltare –
retard mental. Însă, există o discrepanță considerabilă în estimarea procentului de cazuri cu
întârziere în dezvoltare -retard mental în care un diagnostic etiologic poate fi stabilit. Raportul
unei Conferințe a Institu tului Național de Sănătate (NIH) din 1995 a concluzionat că un
diagnostic sau o cauză a retardului mental poate fi identificat în 40 -60% din pacienții supuși
evaluării, deși un studiu a raportat un diagnostic genetic/de sindrom specific în doar 19.9%
din cazuri.

83
Diferite noi descoperiri și metode cum ar fi secvențierea genelor X -linkate ce determină
retard mental și hibridizarea genomică comparată folosind matri ci (aCGH), actual permit
identificarea unei cauze moleculare specifice ce determină întârziere în dezvoltare -retard
mental, cu cel puțin 10% mai frecvent decât a fost cazul pe timpul Conferinței NIH acum 12
ani.
În ultimii 7 -8 ani diagnosticul întârzierii în dezvoltare -retardului mental a fost îmbunătățit
de folosirea FISH multi -subtelomeric și metode specifice de amplificare cum ar fi
amplificarea simultană a sondelor ligaturate (MLPA) pentru a căuta în primul rând
dezechilibre subtelomerice. Aceste teste și dezvoltarea metodei de hibridizare genomică
comparată a cromozomilor metafazici au servit drept pietre de temelie în evoluția array CGH.
Frecvența cu care sunt detectate anomaliile cromozomiale și/sau rearanjările genomice la
pacienții cu întârziere în dezvoltare -retard mental este mai crescută în prezența malformațiilor
sau caracterelor dismorfice și se asociază de regulă cu un retard mai sever. Conform unei
recenzii a literaturii, van Karnebeek et al. au calculat rezultatul mediu al aberațiilor
cromozomiale de 9.5%. Shevell et al. au estimat rata de detecție a anomaliilor cromozomiale
vizibile în pacienții cu retard mental ca fiind 3.7%. A naliza regiunii subtelomerice la pacienții
cu retard mental și trăsături dismorfice folosind FISH sau alte tehnici moleculare au detectat
anomalii cromozomiale în 5 -6% din cazuri. Așadar, analiza combinată a cariotipului și a
regiunilor subtelomerice pot i dentifica anomaliile cromozomiale în aproximativ 8 -10% din
pacienții cu întârziere în dezvoltare -retard mental. Conform informațiilor anterioare, altor
rapoarte și a datelelor din Tabelul 1, se estimează folosind toate analizele că rata generală de
detecți e a anomaliilor genetice la sugari și copii mici cu multiple anomalii congenitale și/sau
întârziere în dezvoltare -retard mental este 12 -18%, din care 3 -5% detectate de cariotipare prin
bandare, 5 -6% detectate de FISH subtelomeric dau nu și de cariotip și 4 -7% detectate de array
CGH (mai crescut pentru matricile suprapuse decât pentru matricile țintite) dar nu și de
carriotip sau FISH subtelomeric. Aceasta ar echivala cu 9 -13% detectate de array CGH dar nu
de cariotip deoarece aCGH este superior metodei FISH subtelomerice pentru detectarea
anomaliilor telomerice. Folosind matrici cu acoperire de 1 -3 Mb a brațelor cromozomiale se
observă rar o anomalie cauzatoare de boală care este detectată de cariotip și nu de matrice, dar
translocațiile sau inversiunile ech ilibrate care perturbă o genă sensibilă la dozaj sunt atfel de
exemple.
Sharp et al. au folosit analiza bioinformatică a duplicațiilor segementale din genom pentru
a proiecta o micromatrice cu 2007 clone specifice pentru 130 regiuni genomice care au fost
găsite flancate de repetări low -copy orientate direct (LCR). Folosind această micromatrice,

84
autorii au investigat 290 de indivizi cu retard mental. Aceștia au identificat 16 rearanjări
patogene care includ cinci dezechilibre noi pe cromozomii 1q21.1, 15q13 , 15q24, 17q12 și
17q21.31. Microdeleția 17q21.31 de aproximativ 1.5 Mb a fost identificată independent de
alte două grupuri care au folosit micromatrici a întregului genom cu rețele suprapuse pentru a
studia mai mult de 360 de pacienți cu retard mental id iopatic. Fenotipul acestei noi tulburări
genetice poate rezulta din expresia redusă a genelor MAPT și/sau CRHR1 și este definită prin
hipotonie, comportament prietenos, anomalii cerebrale ( lărgirea ventriculilor la IRM) și
trăsături dismorfice faciale cara cteristice. S -a estimat că microdeleția 17q21.31 ar putea fi
responsabilă de până la 1% din cazurile cu retard mental. Array CGH a identificat o deleție
rară care a dus la descoperirea că sindromul CHARGE (colobom, tulburări cardiace, atrezie
coanală, întâ rziere în dezvoltare, defecte genitale, anomalii ale urechii) este cel mai frecvent
cauzat de mutații punctiforme ale genei CHD7.
Delețiile subtelomerice pe 22q13 sunt comune și asociate cu întârziere globală în
dezvoltare, limbaj absent sau întârziat, hi potonie și comportamente autistice; acestea sunt
detectate în mod fiabil de array CGH. Gena SHANK3 din această regiune codifică o proteină
sinaptică, aceasta fiind suspectată a fi o genă sensibilă la dozaj. Un raport recent a descoperit
că mutațiile puncti forme ale SHANK3 sunt asociate cu întârziere în dezvoltare -retard mental
și tulburări din spectrul autismului. O duplicație reciprocă ce corespunde sindromului
Williams -Beuren a fost raportată pentru prima dată în 2005 și este detectată frecvent folosind
aray CGH. Duplicații ale genei MECP2 la băieți se dovedesc a fi destul de comune, la fel și
duplicațiile reciproce DSG1 a sindromului DiGeorge și regiunile Smith -Magensis.
Treisprezece studii au fost identificate, care au efectuat array CGH pe 40 până la 3 600 de
pacienți cu întârziere în dezv oltare -retard mental idiopatic. Aceste studii includ un raport care
a folosit matrici Affymetrix oligonucleotidice 100K și doisprezece studii care au folosit
matrici BAC. Dintre studiile care au folosit matrici BAC, cin ci au folosit BAC la intervale de
aproximativ 1 Mb de -alungul genomului (aproximativ 3000 clone BAC), una a folosit o
matrice țintită pentru regiuni genomice susceptibile la rearanjări (aproximativ 2000 clone
BAC), două au folosit matrici suprapuse cu 3244 7 clone BAC, iar trei au folosit o matrice
țintită de aproximativ 200 până la 3000 clone BAC care au sondat telomerii și alte regiuni
susceptibile la rearanjări. Interpretarea căror pierderi sau câștiguri sunt cauzative este
complexă, dar un standard mai u til și folosit mai pe larg este de a presupune că pierderile și
câștigurile de novo sunt cauzat ive. Interpretarea este și mai dificilă dacă nu sunt disponibile
mostre de la părinți sau când câștigurile și pierderile sunt familale și nu este clar dacă exist ă
anomalii fenotipice asociate modificării genomice în familii diferite. Luând în considerare toți

85
acești factori, și datele din studii s-a putut deduce că anomaliile cauzative au fost detectate în
aproximativ 10% din cazuri cu praguri de la 4.2% la 17%. A ceste numere sunt compatibile în
general cu experiența nepublicată a laboratoarelor de diagnostic din Colegiul de Medicină
Baylor, cu peste 6500 mostre neselectate în care matrici țintite de 356, 853 și 1475 clone BAC
au dat rate de detecție de 4.2%, 6.5%, respectiv 8%. Aceste rate de detecție sunt de asemenea
imprecise deoarece pacienții incluși a u avut realizate anterior studii diagnostice variate și o
serie de fenotipuri variate. Însă, o estimare generală ar fi că matricile țintite detectează o
modificar e cauzativă în 6 -10% din pacienții cu întârziere în dezvoltare -retard mental idiopatic
și un cariotip normal și că matricile suprapuse sau de 1 Mb pot detecta modificări cauzative în
10-15% din pacienți. Printre cele mai comune anomalii raportate au fost d eleții și duplicații
ale regiunilor deja identificate cu tulburări genetice cum ar fi regiunea DSG1 din sindromul
DiGeorge, regiunea PWS/AS a sindroamelor Prader -Willi/Angelman și regiunea WBS; deleții
ale cromozomului 1p36 și duplicații ale MECP2 și regiu nii adiacente la băieți.
Au fost raportate un spectru larg de anomalii cromozomiale în autism, după recenzia
făcută de Vorstman et al. Diversitatea regiunilor implicate dovedește că efectuarea testelor
FISH este nepractică. Cele mai comune anomalii în rec enzia Vorstman et al. au fost delețiile
2qter, deleții 22qter și duplicații ale regiunii PWS/AS pe 15q11 -q13. De asemenea, două
rapoarte separate care au folosit array CGH au descoperit aceste trei anomalii ca fiind cele
mai comune. Duplicațiile 15q11 -q13 sunt cele mai comune anomalii, iar abilitatea de a le
detecta prin cariotipare diferă în funcție de natura câștigului, unde cromozomii extra dicentrici
sunt ușor detectați de această tehnică, în timp ce duplicațiile interstițiale sunt aproape
niciodată det ectate. Până a devenit disponibilă aCGH, duplicațiile interstițiale au fost ratate
probabil în marea majoritate a cazurilor chiar și când a fost efectuat FISH metafazic pentru
regiunea PWS/AS, deoarece este necesară pentru detecție analiza FISH minuțioasă a
cromozomilor interfazici.
În rezumat, multiple studii recente au demonstrat că array CGH este o metodă puternică și
eficientă pentru diagnosticul și în cercetarea retardului mental. S -a demonstrat că array CGH
are o rată generală de detecție a anomaliilo r genomice de 10 -15%, în principal a delețiilor și
duplicațiilor interstițiale, la pacienții cu retard mental. Micromatrici de înaltă rezoluție a
întregului genom cu mai mult de 300.000 de probe oligonucleotidice, valabile comercial,
probabil că vor substi tui matricile BAC în laboratoarele clinice. (54)
Un studiu a utilizat array CGH drept test de diagnostic postnatal de primă linie în locul
cariotipării convenționale, iar rezutatele obținute prin aplicațiile clinice la peste 8, 700 de
pacienți pe o perioadă de patru ani au demonstrat că aCGH este o alternativă robustă și

86
rentabilă a cariotipării prin bandare G. Pacienții primiți în studiu făceau parte din populații
pediatrice , neonatale și adulți cu dizabilități, din aria regiona lă NHS din jurul
Departamentului de Citogenetică din Londra, precum și din alte centre din UK dar și din afara
țării; motivele trimiterii erau pentru întârziere în dezvoltare, neurodizabilități specifice
(autism, ADHD), anomalii congenitale, dismorfism sau alte fenotipuri specifice (pete café au
lait).
Analiza ADN -ului genomic extras din sângele periferic sau salivă a fost efectuată folosind
inițial o platformă array oligonucleotidică 4x44K, care a fost înlocuită ulterior cu o platformă
8x60K care a inclus probe adiționale în regiunile de interes clinic și regiunile
pseudoautosomale.
Toți indivizii ce prezentau trăsături sugestive pentru sindroamele Down, Edwards, Patau
sau Turner au f ost testați mai întâi cu QF -PCR, iar cei cu rezultat pozitiv nu au conti nuat cu
analiza aCGH; prin urmare, prevalența acestor sindroame poate apărea mai mică în acest grup
de pacienți comparativ cu alte rapoarte. 25% din pacienți prezentau CNV fie în regiuni
patogene cunoscute, fie în alte regiuni în care dezechilibrele nu au fost raportate în populația
normală. Din aceste CNV, 46% au fost deleții sau nulisomii, 53% au fost duplicații sau
triplicații, iar dezechilibrele în mozaic alcătuiau restul; 87% au fost mai mici de 5Mb și cel
mai probabil nu puteau fi detectatate de cario tiparea tradițională. Pentru cazurile cu studii
ereditare completate, 20% din dezechilibre au fost de novo.
Cele mai comune descoperiri în setul de date al studiului au fost dezechilibre în regiunea
sindromului de deleție 22q11.2 și deleția sau duplicația în locusul de susceptibilitate la autism
16p11.2. Dimensiunile dezechilibrelor varia u de la <25 Kb la cromozomi în tregi, cu cele mai
multe dezechilibre patogene, sindromice și ale locusurilor de susceptibilitate fiind
submicroscopice, în timp ce dezechilibrele "private" variau de la <25 Kb la 105 Mb (69% <5
Mb).
Mărimea dezechilibrelor cu semnificație clinică potențială a fost corelată, în general, cu
severitatea fenotipului, cu toate că au existat excepții. De exemplu, a fost găsită o duplicație
de aproximativ 7 Mb, în doi frați, din care doar unul prezenta un fenotipic clinic. Așadar, pare
puțin probabil că numai duplicația a fost cauzativă în fratele afectat. La capătul celălalt al
scarei de mărimi, a fost găsită o deleție de 157 Kb care a incl us o parte a genei SALL1 la un
sugar cu microcefalie , malformații ale urechii externe și anus imperforat; mutația SALL1 este
asociată cu sindromul Townes -Brocks.
Studiul a reușit completarea studiilor de ereditate pentru 50% din pacienții cu
dezechilibre; 20% prezentau dezechilibre apărute de novo. Dintre descoperirile de novo, 8%

87
(21/226) nu păreau a fi asociate cu trăsă turile clinice ale pacientului; câteva dintre ele nu au
inclus nici o genă sau elemente reglatoare fiind, așadar, puțin probabil semnific ative clinic. Pe
altă parte, cel puțin 20% din dezechilibrele moștenite au prezentat loci susceptibili, fiind, prin
urmare, considerate semnificative clini c; statusul clinic al părintelui purtător nu a fost
cunoscut. Penetranța fenotipului asociată acestor loci susceptibili este frecvent variabilă; spre
exemplu, dezechilibrul sindromul de deleție 15q13.3 a fost raportat cu diferite prezentări
clinice în cadrul aceleași familii.
Analiza aCGH nu oferă informa ții asupra locației în genom a regiunilor duplicat e sau
asupra structurii cromozomilor. Însă, tipare ale dezechilibrelor pot fi folosite pentru a deduce
această informație în unele cazuri; spre exemplu, deleția terminală a unui cromozom cu
duplicația materialului terminal de pe alt cromozom demonstrează e xistența unui cromozom
derivat, iar analiza cromozomilor prin bandare G și/sau FISH a părinților este recomandată în
aceste cazuri. Inversiuni, duplicații și deleții pot fi de asemenea deduse, precum și
cromozomii inelari, cromozomi inelari supranumerari ș i inversiuni recombinante. Când aCGH
este folosită ca test de primă linie, este posibil ca material cultivat obținut de la pacienți să nu
fie valabil pentru confirmarea imediată a oricărei rearanjări structurale suspectate de
cariotipare sau FISH. Așadar, este critică interpretarea corectă a descoperirilor făcute de array,
de vreme ce aceasta va oferi informații ajutătoare în privința celor mai adecvate studii
ulterioare de efectuat. Pentru dezechili brele interstițiale non -LCR mediate aparent de novo,
este necesară analiza cariotipului sau FISH a părinților pentru a exclude o translocație
inserțională echilibrată, a cărei prezență ar reprezenta un risc de 50% pentru părinți în
sarcinile viitoare. Nowakowska et al. au raportat o frecvență de aproximativ 2.1% a
translocațiilor inserționale în rândul familiilor pacienților cu CNV de novo. În experiența
celor care au realizat studiul , sunt obținute rareori eșantioane ale părinților pentru studii ale
rearanjărilor cromozomiale; au fost capabili să termine studii F ISH doar la 12/226 (5%) din
familii cu descoperiri de novo și au găsit o translocație inserțională parentală.
Descoperirile întâmplătoare sunt inevitabile pentru orice test al întreg genomului și pot dificil
de rezolvat din punct de vedere clinic, în spec ial în ceea ce privește condițiile de debut tardiv
și genele cu susceptibilitare la cancer, unde se cunosc puține despre prevalența sau penetranța
trăsăturilor clinice asociate cu dezechilibre. În ciuda rezoluției și randamentului diagnostic
crescut asocia te analizei aCGH, pot exista preocupări legate de faptul că în absența
vizualizării cromozomilor prin tehnici tradiționale de citogenetică, rearanjările echilibrate nu
vor fi detectate. Aceste rearanjări pot perturba funcția genei fără a determina pierdere a
materialului de codare, și ar putea fi importante din punct de vedere diagnostic. Însă,

88
prevalența rearanjărilor echilibrate aparent de novo asociate cu un fenotip anormal detectat de
analiza cromozomilor prin bandare B este foarte scăzută, iar câteva di ntre el e ar putea fi de
fapt neechilibrate la nivel submicroscopic; testarea aCGH poate dezvălui un astfel de
dezechilibru fără a mai fi nevoie de analiza cariotipului în prealabil. Creșterea randamentului
diagnostic prin folosirea aCGH reprezintă un benef iciu pentru pacient mult mai mare decât
numărul extrem de mic de cazuri în care o rearanjare echilibrată poate perturba o genă
importantă. Rezultatele acestui raport demonstrează că aCGH poate înlocui cariotipare a prin
bandare G, fiind o metodă puternică ș i rentabilă și care oferă o rată crescută de diagnostic.
(55)
Schizofrenia (SZ) este o boală mentală cronică cu un risc aferent duratei de viață de
aproximativ 1%. Prezintă o componentă genetică puternică cu o capacitate ereditară de până
la 85% și un risc de recurență ce crește de zece ori la rudele de gradul I. Au fost raportate
diferite anomalii cromozomiale la pacienții cu SZ, dar relevanța etiologică a multor dintre
acestea este neclară. Descoperirea cea mai bine consacrată implică sindromul de deleție a
cromozomului 22q11, cunoscută și ca sindromul DiGeorge/velocardiofacial, car e este asociată
cu SZ în 20 -30% din purtătorii adulți și găsită în 0.6% din pacienții cu SZ. Aceasta sugerează
că variații ale numărului de copii în genomul uman ar putea avea o relevanță etiologică mai
mare în această boală.
SZ prezintă anumite trăsătur i care sugereză o etiologie ce se suprapune parțial cu
retardul mental (MR) și autismul, inclusiv o tendință de a prezenta întârziere în dezvoltare și
un IQ scăzut, probleme de limbaj și comunicare și o rată mai crescută de anomalii fizice
minore. Pacienți i cu retard mental prezintă un risc crescut de a dezvolta boli psihice, iar
pacienții cu sindrom de deleție 22q11 prezintă mai frecvent autism și retard mental, precum și
SZ.
Kirov et al. au căutat variații ale numărului de copii în 93 de pacienți cu SZ, folosind
matrici BAC de înaltă rezoluție și au comparat rezultatele cu cele ale pacienților cu boli
neînrudite obținute folosind aceeașă platformă. Două aberații detectate în studiu sunt foarte
probabil patogene: una apărută de novo, iar cealaltă se segreg ă cu boala în familie. În plus,
cele două aberații cuprind gene care codifică proteine sinaptice ce interacționează direct, din
care nici una nu a fost implicată anterior în patogeneza SZ. Aceste noi descoperiri au
implicații importante în înțelegerea pato genezei SZ și sugerează mecanisme patogene comune
cu autismul și retardul mental.

89
În studiu au fost selectați 93 din aproximativ 600 de pacienți recrutați cu SZ. Au fost
selectate intenționat cazuri sporadice severe (n=51) și cazuri cu o rudă de gradul I afectată
(n=42, din care 22 au avut un frate cu SZ) în scopul creșterii șanselor de a detecta aberații de
novo și respectiv recurente . Pentru a estima relevanța oricărei aberații detectate cu
schizofrenia a fost folosit un eșantion de control mare de 372 de pacienți cu tulburări
neînrudite cu schizofrenia care a fost studiat folosind aceeași metodologie. În total, array
CGH a descoperit 13 CNV corelate cu SZ care au fost ulterior validate cu o platformă array
SNP de 250K.
Două modificări prezintă cel mai probabil relevanță din punct de vedere etiologic.
Prima este o duplicație de 1.4 Mb pe cromozomul 15q13.1 . Această modificare a fost
confirmată cu matrici Affymetrix și Agilent și a fost absentă la părinții neafectați, însemnând
că a apărut de novo. Canti tatea realtiv redusă de aberații apărute de novo în shizofrenie nu ar
trebui să fie surprinzătoare, conderând că aberațiile mari, în speciale cele de novo sunt
asociate cu fenotipuri mai severe din punct de vedere a dezvoltării neurologice cum ar fi cel al
retardului mental și autismului și sunt frecvent acompaniate de o varietate de anomalii fizice
mai pronunțate. Au fost excluși din studiu pacienți cu IQ <70, pentru a putea stabili asocieri
cu schizofrenia care sunt indenpendente de retardul mental.
Prima aberație potențial patogenă este o deleție de 0.25 Mb pe 2p16.3. Cuprinde
promotorul și primul exon al genei neurexin 1 (NRXN1). Se crede că neurexinele joacă un rol
important în eliberarea neurotransmițătorilor din veziculele presinaptice, iar împre ună cu
neuroliginele sunt implicate în formarea sinapselor și validarea circuitelor neuronale prin care
este determinată proporția neurotransmisiei excitatorii -inhibitorii. Deleții suprapuse parțial
care perturbă aceeași genă au fost identificate anterior la un pacient cu retard mental și doi
frați cu autism. Nu au identificate alte deleții sau duplicații ce implică această genă în
populația de control a studiului.
A doua anomalie considerată patogenă este duplicația de novo pe 15q13.1. Această
regiune este situată telomeric față de HERC2 și distal față de regiunea critică Prader -Willi și
față de duplicațiile 15q11 -q13 care pot fi de asemenea observate în 1 -3% din cazurile cu
autism. Intervalul duplicat descoperit conține trei gene: gena proteinei de legare a
precursorului amiloidului A2 (APBA2), gena Needin -like 2 (NDNL2) și gena proteinei
joncțiunilor strânse 1 (TJP1) . Această regiune se suprapune parțial peste o deleție de 3.95 Mb,
identificată de Sharp et al. ca fiind un determinant al retardului mental. În mod remarcabil,
APBA2 interacționează direct cu neurexine prin legarea directă la acestea, funcționând ca un

90
mediator în neurotransmisia prin fuzionarea veziculelor sinaptice. Există multiple dovezi și
date din studii genetice care indică că schizofreni a este o boală a sinapselor.
Trei aberații (toate duplicații) pe 3q22.3, 9q21.22 și 22q11.23 nu au apărut la frații
schizofrenici ale cazurilor, astfel sunt puțin probabil patogene. Duplicațiile pe 4q35.2 și
15q26.1 și deleția pe 17q22 nu conțin gene cu noscute sau elemente ultra -conservate. Un
pacient purta o deleție de 480 Kb a cromozomului 16p12.2. Această regiune conține două
gene candidate, EEF2K și CDR2 care sunt implicate în semnalizarea intracelulară în creier și
respectiv neuroimunologie.
Schiz ofrenia, autismul și retardul mental împărtășesc un număr de trăsături fenotipice
și toate trei au o bază neurologică comună. Similar, sindromul de deleție 22q11 este de
asemenea asociat cu un risc crescut de retard mental, schizofrenie și autism , fapt ce
demonstrează că aceeași deleție poate cauza fenotipuri distincte care împărtășesc anumite
trăsături. Rezultatele studiului aduc și mai multe dovezi în susținerea existenței unei baze
comune în etiologia și patogeneza acestor tulburări și sugerează că aceas ta ar putea implica
perturbarea neurexinelor și a proteinelor asociate cu consecințe asupra dezvoltării și funcției
sinaptice.
Descoperirile studiului sugerează necesitatea efectuării unor studii mai ample în
scopul descoperirii altor CNV în schizofrenie . Descoperirea suplimentară a variantelor de
novo bazată pe disponibilitatea recentă a matricilor de > 1 milion de probe ar trebui să permită
identificarea unor aberații patogene mai mici. Este foarte probabil că aceste vor identifica mai
departe gene cu r elevanță patogenă potențială. Este de asemenea posibil că polimorfismul
numărului de copii să dovedească a juca un rol în conferirea susceptibilității la schizofrenie
precum o fac și în alte condiții. Aceste studii vor necesita dezvoltarea unor platforme n oi
capabile de genotiparea de calitate înalt rentabilă, precum și de folosirea eșantioanelor mari de
pacienți și populație control. (56)
Bolile mendeliene reprezintă o ext remă a spectrului arhitecturii genetice posibile.
Alelele responsabile de bolile mendeliene se regăsesc într -un număr redus de gene, sunt rare
(<1:1000), sunt înalt penetrante și urmează modele simple de moștenire dominantă, recesivă
sau X -linkată. Sunt considerate monogenice, în sensu l că mutația unei singure gene determină
boala într -un individ sau familie. (57)
Majoritatea mutațiilor din bolile mendeliene sunt detectate prin secvențiere ADN.
Însă, în ultimii ani semnificația și frecvența delețiilor sau d uplcațiilor patogene intragenice
(mutații ale numărului de copii) au devenit tot mai evidente. Hibridizarea genomică

91
comparată s -a dovedit a fi o unealtă puternică pentru analiza numărului de copii dar a fost
folosită mai mult pentru analiza citogenetică î n scopul detectării delețiilor și duplicațiilor
genomice mari care se întind pe sute de kilobaze până la megabaze. Swaroop et al. au
construit o matrice oligonucleotidică particularizată de înaltă densitate cu probe țintite către
exonii individuali a 589 d e gene asociate cu tulburări genetice cunoscute pentru a identifica
deleții sau duplicații genice întregi și parțiale. Rezultatele studiului în urma testării a 3,018
pacienți cu ajutorul acestei matrici au demonstrat că array CGH a exonilor completează
secvențierea ADN și crește rata de detecție a mutațiilor în diagnosticul molecular a bolilor
mendeliene autosomale și X -linkate.
Exon array CGH a fost folosită pentru a examina 3,018 pacienți pentru deleții și
duplicații în 219 gene. Au fost analizate mai mu lte gene în 307 indivizi afectați de o tulburare
heterogenă genetic. Prin urmare, un total de 4,354 de gene au fost analizate în 3,018 indivizi.
Exon array CGH a identificat 98 deleții parțiale sau ale genomului în întregime și două
duplicații, ce corespun de unei rate de detecție de 3.3% în indivizii testați. QF -PCR, MLPA
sau array CGH a întregului genom au confirmat variațiile numărului de copii detectate de
exon array CGH. Mutații ale numărului de copii au fost identificate în 53 din 219 gene testate.
Nici o deleție sau duplicație nu au fost găsite în restul de 166 gene, deși multe dintre aceastea
au fost evaluate în 10 cazuri sau mai puține. Patruzeci la sută din cele 3,018 cazuri au fost
trimise pentru a efectua testarea pseudogenei PTEN (proteină omolog ă a fosfatazei și
tensinei). Rata generală de detecție a mutațiilor numărului de copii prin exon array CGH
pentru bolile mendeliene din studiu, după excluderea cazurilor PTEN a fost de 5.3%.
Un total de 2,567 de pacienți au fost testați pentru tulburări autosomale dominante,
multe dintre ele determinate de o haploinsuficiență. Aproape jumătate din toți acești indivizi
(n=1,231) au fost trimiși special pentru a face testarea PTEN. Cei 1,336 de indivizi rămași
diagnosticați cu alte tulburări autosomale domi nante au fost testați pentru mutații ale
numărului de copii într -o varietate de gene. Pentru 13 din aceste gene, testarea array a fost
efectuată concomitent cu secvențierea ADN, în timp ce alte gene au fost testate după
excluderea unei mutații prin secvenț iere. Șaizeci și nouă din cei 1,336 indivizi purtau o deleție
a unei gene, determinând o rată pozitivă de 5.2% pentru acest grup de tulbuări dominante.
Majoritatea indivizilor care au obținut un test pozitiv prezentau deleții parțiale ale genelor
care impl ică unul sau mai mulți exoni; deleții ale genei în întregime au fost responsabile de
34% din toate mutațiile observate.

92

Frecvența delețiilor și duplicațiilor întregi sau parțiale la pacienții trimiși pentru
analiza PTEN cu indicații pentru sindromul Bann ayan -Riley -Ruvalcaba (BRRS), sindromul
Cowden (CS), macrocefalie și/sau tulburări din spectrul autismului a fost de 0.5%. Deleții ale
genei PTEN au fost observate în trei pacienți cu BRRS, CS sau creștere excesivă
sindromSotos -like. Un pacient cu întârzier e în dezvoltare și lipoame multiple prezenta o
deleție genică parțială care a inclus exonii 3 -9, iar doi pacienți cu CS suspectat prezentau
mozaicism pentru o deleție parțială a exonilor 6 -9 și o duplicație parțială a ge nei PTE N ce
implica exonii 1 -5 (Fig. 24).
O rată crescută a delețiilor genice patogene a fost identificată în multiple tulburări
autosomal dominante din setul de date a stiudiului. Pentru sindromul Peutz -Jeghers, 10 din 31
de pacienți (32%) cu rezultate de secvențiere negative, purtau o del eție detectată de exon array
CGH în gena STK11. Au fost observate două deleții întregi și opt deleții parțiale ale genei
STK11, inclusiv patru cazuri cu o deleție aparent recurentă a exonului 1. Rata pozitivă de
9.3% pentru delețiile intragenice CREBBP la 75 de pacienți cu sindrom Rubinstein -Taybi și
de 7.3% pentru delețiile EXT1 și EXT2 la 55 de pacienți cu multiple exostoze este
compatibilă cu variațiile raportate de alte studii.

Fig. 24 . Exemple din date a patru gene diferite
obținute prin exon CGH . Săgețile marchează
probele care au identificat deleții sau
duplicații. (a) O deleție heterozigotă a
exonului 5 pe NSD1 la un pacient cu sindrom
Sotos. (b) O duplicație genică parțială ce
include exonii 3 -4 în MECP2 la o pacien tă cu
sindromul Rett. (c) O deleție heterozigotă a
exonului 31 în VPS13B (COH1) la un pacient
cu sindrom Cohen. (d) O duplicație genică
parțială ce include exonii 1-5 în PTEN la un
pacient cu si ndrom Cowden.

93
Au fost de asemenea identificate șapte deleții ale genei PTCH1, inclusiv două mutații în
mozaic la 128 de pacienți diagnosticați cu sindrom Gorlin. Incidența delețiilor PTCH1 a fost
peste 5%, iar multe dintre acestea au fost mutații private. Acesta reprezintă cel mai mare
număr de pacienți testați concomitent prin secvențiere ș i pentru mutații ale numărului de copii
ale genei PTCH1.
Pentru câteva tulburări rata pozitivă în setul de date a studiului a fost mai scăzută decât
cea publicată de alte studii. De exeplu, doar 3 din 116 pacienți (2.6%) cu sindrom von Hippel –
Lindau prez entau o deleție a genei VHL, în timp ce rata de deleție publicată este de până la
30%. Această discrepanță este cel mai probabil atribuită faptului că testarea moleculară este
necesară după excluderea unei deleții genice prin hibridizarea fluorescentă in s itu. De
asemenea, doar 3 din 204 pacienți (1.5%) cu sindrom Alagille testați prin secvențiere și exon
array CGH, prezentau o deleție genică, în timp ce analiza FISH din alt studiu a evidențiat
deleții brute, inclusiv JAG1 șa 5.7% din pacienți.
Au fost de asemenea identificate deleții unice în multe alte tulburări autosomal
dominante după ce secvențierea ADN a eșuat să dezvăluie o mutație patogenă. Testări pentru
tulburări ale dezvoltării oculare au evidențiat patru deleții exonice ce cuprind genele SOX2 ș i
OTX2 la 26 de indivizi (15.4%) cu anoftalmie sau microftalmie și două deleții FOXC1 la 12
pacienți (17%) cu sindrom Axenfeld -Riger. De asemenea, 7 din 36 de pacienți (19%) cu
indicație clinică de aniridie prezentau o deleție în gena PAX6. Remarcabil, ma i mult de
jumătate din delețiile PAX6 descoperite sau extins până la gena vecină ELP4 dar fără să
includă și gena WT1. Au fost detectate deleții la indivizi cu sindrom Birt -Hogg -Dube (FLCN:
1/15 sau 6.7%), sindrom Holt -Oram (TBX5: 1/21 sau 4.5%) sau sindro m de QT lung
(KCNQ1: 2/71 SAU 2.8%) și neoplazii endocrine multiple (MEN1: 1/43 sau 2.3%). Delețiile
patogene în tulburările menționate anterior sunt rare, iar testarea lor nu este efectuată de
rutină.
Au fost testați 138 de indivizi prin analiza exon ar ray CGH pentru tulburări autosomal
recesive și identificate 14 deleții a unui sau mai multor exoni. Nu a fost identificată nici o
duplicație. Cincizeci și cinci de cazuri au fost trimise cu indicație de eroare înnăscută de
metabolism (IEM). Șapte din acest e cazuri au pozitive pentru o deleție și au reprezentat o rată
pozitivă de 13%, comparativ cu 5.3% pentru alte indicații.
Majoritatea din cele 138 de cazuri au avut efectuate secvențierea ADN -ului anterior
sau concomitent cu testarea pentru deleții/dupli cații. Din 93 de indivizi cu o mutație patogenă
unică indentificată prin secvențiere, au fost identificați 10 cu deleții genice întregi sau parțiale,

94
care a corespuns cu o rată pozitivă de 10.8%. În 45 de cazuri cu eroare înnăscută de
metabolism cu o singu ră mutație descoperită de secvențiere, au fost identificate 7 deleții
(15.6%). Din cele 48 de cazuri trimise pentru alte indicații, numai trei au fost pozitive (6.3%).
Patruzeci și cinci de indivizi care nu au efectuat secvențierea anterior sau cu rezultat e de
secvențiere negative au fost testaț i pentru deleții/duplicații, au fost descoperiți patru (10.1%)
homozigoți pentru deleții intragenice.
Exon array CGH a fost efectuat în 313 indivizi pentru detectarea delețiilor sau
duplicațiilor în gene X -linkate. Unsprezece pacienți au prezentat o mutație a numărului de
copii patogenă, reprezentând o rată pozitivă de 3.5%. Un pacient prezenta o duplicație genică
parțială, iar restul erau purtători de deleții genice întregi sau parțiale. Opt din cei 11 indivizi
cu un rezultat exon array CGH pozitiv erau fete diagnosticate cu una din următoarele condiții:
displazie ectodermală hipohidrotică, hipoplazie dermală focală, retinoschizis juvenil, sindrom
Rett, sindrom Coffin -Lowry și deficiența ornitin transcarbamilazei. Ce le trei deleții rămase au
fost găsite la băieții cu agamaglobulinemie, cardiomiopatie dilatativă sau boală Norrie.
Rezultatele studiului ilustrează utilitatea unei metode exon array CGH robuste pentru
detectarea mutațiilor intragenice ale numărului de copii în bolile mendeliene. Datele
prezentate în studiu subliniază sensibilitatea crescută a testării pentru bolile mendeliene
efectuată concomitent sau după secvențiere. Aceste date sugerează că exon array CGH ar
trebui folosită de rutină pentru tulburări le autosomal recesive, în mod particular pentru IEM
care prezintă doar o mutație identificată de secvențiere sau pentru condiții în care mutațiile cu
pierdere a funcției genice sau dosaj genic anormal explică fenotipul asociat. Deși studiul a
țintit doar 5 89 de gene cu semnificație clinică cunoscută și a examinat doar o singură genă sau
un panou mic de gene în fiecare individ, array CGH la nivel de exoni poate fi de asemenea
fabricat ca o testare screening. De asemenea, este rentabilă și relativ n ecostisito are efectuarea
analizei whole -exom e a numărului de copii prin array CGH pentru a completa secvențierea
exomilor până când devin disponibili algoritmi puternici pentru calcularea numărului de copii
din date de secvențiere de ultimă generație. (58)

95
IX. Avantajele și dezavantajele metodelor de hibridizare
genomică comparată

Principalele avantaje ale CGH sunt: (1) cartografiază modificări ale numărului de copii la
nivelul unui genom complex pe un genom de referi nță normal pentru ca aberațiile să poată fi
ușor raportate la hărți existente, gene și secvențe ADN genomice, și (2) folosește ADN
genomic, astfel că nu sunt necesare culturi celulare. Ultimul aspect este în mod particular util
în patologia endocrină, din moment ce multe tumori neuroendocrine sunt dificil de cultivat.
Înlocuirea cromozomilor metafazici drept substratul pe care sunt cartografiate aberațiile cu
matrici ale secvențelor de acizi nucleici clonate și bine cartografiate poate elimina câteva
dintre aceste limitări. (59)
Analiza CGH face posibilă detectarea și cartografierea creșterilor și scăderilor numărului
de copii a secvențelor ADN oriunde în genom, oferind informații generale asupra frecvenței
câștigurilor și pierde rilor de material genetic, oricărei grupări ale acestor modificări în sub –
regiuni cromozomale și asupra mărimii și numărului de regiuni afectate în orice eșantion
tumoral dat. Abilitatea de a studia genomul în întregime într -un singur experiment este un
avantaj important pentru studierea pierderilor alelice, care țintesc un locus pe rând. CGH nu
necesită efectuarea de preparate metafazice din celule pentru a fi analizate, lucru care se
dovedește a fi dificil în analiza cromozomilor prin bandare a tumorilor solide, așadar CGH
este ideală pentru analiza tumorilor solide, mai ales de când tehnicile de extracție ADN
îmbunătățite și amplificarea PCR permit achiziționarea de cantități mai mari de ADN din
aproape orice tip de specimen , chiar și țesut uri fixate în formol și inclus e în parafină.
Din moment ce nu necesită probe specifice și cunoștințe anterioare ale alterațiilor
genetice, CGH este foarte potrivită pentru identificarea și cartografierea aberațiilor
necunoscute până în prezent, lucru care a condus la des coperirea locațiilor unor gene
importante. (60)
Principalele limitări ale CGH sunt: (1) are o rezoluție limitată de 10 -20 Mb, (2) nu oferă
informații cantitative despre dozajul genic, iar (3) nu este sensibilă la aberații struc turale care
nu rezultă în modificări ale numărului de copii ale secvenței ADN. (59)
CGH se dovedește a fi o unealtă importantă; însă, nu este o tehnică perfectă . În primul
rând, poate detecta doar câștig uri și pierderi de copii . Nu poate detecta nici o modificare

96
cromozomală structurală care nu implică pierderi sau câștiguri de copii, de exemplu
translocații sau inversiuni echilibrate. Așadar, este mai potrivită pentru analiza tumorilor
epiteliale, în care tipurile majore de ins tabilitate genetică sunt dezechilibrele cromozomale, în
timp ce în analiza tumorilor hematologice sau mezenchimale nu este la fel de utilă. În al
doilea rând, din cauză că ADN -ul țintă a cromozomului este super -compactat , dimensiunea
minimă a aberației ADN care poate fi detectată prezintă o problemă și anume rezoluția pen tru
pierderi este de 10 Mb, iar din cauză că aceste nivel de detectare este o funcție atât a mărimii
aberațiilor cât și a numărului de copii în exces, rezoluția pentru câștiguri este de 2 M b.
Această limitare împiedică localizarea precisă a secvențelor de interes. O altă observație
demnă de menționat este că în analiza tumorilor solide este dificil de a detecta modificări mici
ale numărului de copii din cauza contaminării celulelor tumorale cu celule normale. Este
recomandată i zolarea populațiilor celulare pure prin microdisecție pentru a reduce
contaminarea și pentru a crește astfel sensibilitatea detectării. (60)
CGH oferă avantaje față de multe tehnici comune f olosite. Folosirea ADN -ului genomic al
celulelor tumorale drept probe pe preparate metafazice normale în CGH elimină nevoia pentru
probe și secvențe ADN specifice care sunt necesare pentru tehnici cum ar fi hibridizarea
fluorescentă in situ, metode bazate pe reacția în lanț a polimerazei și polimorfismul lungimii
fragmentelor de restri cție. Aceste avantaje fac ca tehnica CGH să fie potrivită pentru analiza
liniilor celulare tumorale care prezintă rearanjări cromozomiale complexe.
Regiunile pericentromerice , telomerice și heterocromatice nu pot fi evaluate deoarece
hibridizarea CGH implică blocarea secvențelor repetitive. Câteva regiuni specifice ale
cromozomilor 1p32 -pter, 16p, 19 și 22 sunt în mod special conflictuale, determinând frecvent
rezultate fals -pozitive. În plus, deoarece CGH folosește ADN -ul tuturor celulelor din
specimen , rezultatele nu pot fi sigure în cazul polisomiilor, clonelor diferite genetic și
celulelor normale prezente în specimen într-un procent de până la 50% . (61)
Îmbunătățiri ale tehnicii CGH a condus la apariția diferitelor subtipuri de CGH cum ar fi
CGH cu micromatrici. CGH cu micromatrici (microarrays) sunt un subset a tehnologiei CGH
care permite screening rapid al cromozomilor și funcționează similar tehnicii CGH
convenționale. Micromatricile prezintă avantaje față de CGH metafazic deoarece necesită mai
puțin timp pentru hibridizare (< 48 ore sau doar 24 de ore în unele cazuri), iar evaluarea
proporției fluorescente este simplă și poate fi automatizat ă. Experimente preliminare au arătat
că rezultate le CGH pot fi obținute în 10 ore de la primirea probelor, existând astfel
posibilitatea efectuării screening -ului la embrioni în stadii mai avansate (biopsie din celulele

97
trophectoderm a blastocistului). Mic roarray CGH poate fi împărțită mai departe în funcție de
cipul ADN fixat pe lama microscopului. Aceste subseturi diferite de microarray CGH include
probe BAC, biblioteci ADN și probe oligonucleotidice. Deși fiecare din aceste subtipuri
prezintă avatanje sp ecifice, toate subtipurile au avantaje clare asupra tehnicilor de analiză
FISH. Un astfel de avantaj este acela că CGH permite evaluarea exactă a tuturor celor 24 de
cromozomi fără a necesita ture multiple de hibridizare.
O limitare a tehnicii a CGH constă în complexitatea metodei. Tehnica aCGH necesită
expertiza în metode citogenetică și metode de genetică moleculară, aplicația clinică este
realizată în centre înalt specializate care efectuează analiza aCGH. (62)
Micromatricea țintită este un cip prin care probele genomice cuprind arii de anomalii
cromozomiale cunoscute și includ de asemenea probe ce scanează genomul la o rezoluție mai
mare decât o matrice oligonucleotidică. Această matrice țintită este preferată pentru analiza
prenatală în prezența anomaliilor congenitale multiple la ecografie sau a unui istoric familial
care poate suspecta un sindrom de deleție submicroscopică (22q11.2). Avantajul unei abordări
țintite este acela că scade probabilitatea de a identifica o varian tă a numărului de copii cu
semnificație necunoscută.
O matrice oligonucleotidică de înaltă rezoluție este matricea aleasă pentru analiza
postnatală, dar nu reprezintă prima linie de anali ză cromozomială în diagnosticul prenatal,
decât dacă există o anomal ie cromozomială specifică identificată în familie (translocație
aparent echilibrată) sau un cariotip anormal (cromozom marker, rearanjare neechilibrată) care
a fost identificat și se dorește obținerea mai multor informații. Micromatricea este capabilă să
identifice deleții și duplicații submicroscopice pe care analiza convențională a cromozomilor
nu le poate identifica. Comparativ cu cariotiparea convențională, timpul de terminare a
procesului este mai rapid. Micromatricilor le este necesar câteva zile și nu săptămâni pentru a
da rezultate. (63)
Avantajul micromaticilor CGH asupra CGH normal e ste rezoluția și viteza mult mai mare.
Matricile CGH au o rezoluție mai mare de aproximativ 1,000 de ori și generează informație
mult mai rapid. (64)
Cele mai obișnuite micromatrici utilizate conțin aproximativ 3000 de probe cromozomi
bacterieni artificiali (BAC) care conțin fiecare inserții ADN de aproximativ 150 Kb. Deoarece
probele BAC se află la o distanță de aproximativ 1 Mb între ele, această versiune de array
CGH poate detecta duplicații și deleții de aproximativ 100 Kb (o rezoluție de 5 până la 10 ori
mai bună decât CGH cu cromozomi metafazici). Alte micromatrici BAC sunt țintite, astfel

98
încât să fie realizată o rezoluție mai mare în regiuni în care duplicații și deleții se cunosc a fi
asociate cu boli specifice. O limita re a matricilor BAC este aceea că alterațiile mai mici decât
insertul BAC în sine (aproximativ 150 Kb) nu pot fi ușor detectate.
Recent, o altă metodă CGH a fost dezvoltată folosind micromatrici care conțin sute de mii
de probe oligonucleotidice mici. Aces te micromatrici oferă o rezoluție de 50 până la 100 Kb
sau chiar mai puțin, fapt care permite detectarea duplicațiilor și delețiilor care afectează doar o
singură genă.
Pe lângă rezoluția foarte bună, array CGH oferă alte nenumărate avantaje față de anali za
tradițională a cariotipului. Procesul este înalt automatizat, necesitând mai puțin timp din
partea personalului de laborator. Nu sunt necesare celule în diviziune (în contrast cu analiza
cromozomilor metafazici), iar o cantitate infimă de ADN este sufic ientă pentru analiza
întregului genom. Din aceste motive, array CGH devin rapid una dintre cele mai folosite
tehnici în laboratoarele de citogenetică. (10)

99
X. Starea actuală și perspectivele deschise de metodele
de hibridizare genomică comparată

Hibridizarea genomică comparată este o metodă proiectată pentru a identifica segmente
cromozomale cu aberații ale numărului de copii, descrisă pentru prima oară în 1992 de
Kallioniemi et al. În această tehnologie, mostre de ADN genomic marcate diferit și denaturate
sunt hibridizate simultan la cromozomi metafazici imobilizați și denaturați. După hibridizare,
proporția fluorescentă este măsurată în lungul axei fiecărui cromozom, cu realizarea unui
profil a întregului genom ale numărului relativ de copii în mostrele ADN.
Avantajul principal al CGH este acela că poate interoga întreg genomul pentru modificări
ale numărului de copii ADN într -un singur experiment. După analizarea unui număr mare de
tumori, pot fi definite regi uni recurente cu alterații ale numărului de copii, așadar pot fi
identificate regiunile ce conțin gene implicate în dezvoltarea cancerului. Un dezavantaj al
CGH metafazic este rezoluția limitată la care aberațiile numărului de copii ADN pot fi
identificate . De obicei, limita de detecție pentru pierderi ale numărului de copii este de 10 Mb,
dar poate fi mai mică pentru câștiguri ale numărului de copii, în funcție de mărimea regiunii
implicate și nivelul creșterii numărului de copii. Aplicarea metodelor stati stice pentru
corectarea variației în profilul CGH poate oferi de asemenea o rezoluție mai bună. (65)
Aplicația diagnostică a metodelor de hibridizare genomică comparată a transformat
domeniul citogeneticii clinice. Utilizarea C GH în cercetare a acce lerat ritmul descoperirilor
genice în genetica umană, a aprofundat înțelegerea schimbărilor genomice din cancer și a
grăbit studiul conceptelor fundamentale legate de conformația cromozomilor, metilarea ADN,
acetilarea histonelor, sil ențiere a genelor, timp ul de replicare și multe alte mecanisme de bază
referitoare la structura și funcția ADN -ului.
CGH s -a dovedit utilă deoarece oferă profiluri specifice ale numărului de copii ADN
pentru o varietate de cancere. Multe cancere sunt asociate cu o varietate de câștiguri și
pierderi cromozomiale și ale segmentelor cromozomiale. Date fiind dificultățile asociate cu
obținerea culturilor și a cromozomilor metafazi ci de calitate din majoritatea tumorilor solide,
abordările dorite sunt cele care examinează direct conținutul ADN și care leagă orice
modificare de doz aj de anomaliile cromozomiale. CGH a fost aplicată unui număr mare de
studii ale cancere lor cu rezultate reproductibile.

100
CGH prezintă multiple utlizări în cercetare inclusiv elaborarea profilurilor tumorale ,
descoperirea genelor și înțelegerea modificărilor epigenetice și a conformației cromatinei.
Rezultatele unor astfel de investigații pot fi corelate dir ect cu locații genomice și expresia
genică. Așadar, ca unealtă de cercetare, CGH are un potențial mare.
Pentru aplicații diagnostice, CGH ar trebui abordată dintr -o altă perspectivă. Deoarece
fiecare eșantion clinic nu trebuie văzut ca un proiect de cercet are, metodele de diagnostic
trebuie construite într -o manieră în care maximizează capacitatea de diagnostic în timp ce
minimizează rezultatele fals -pozitive pentru a putea oferi clinicienilor diagnosticele și
informațiile de care au nevoie pentru a putea g hida îngrijirea clinică a indivizilor cu anomalii
cromozomiale identificate.
Alternativa la metodele CGH și anume experimentele FISH multiple este prohibitivă în
costuri și resurse. Așadar, CGH cu potențialul său de a identifica cele mai multe rearanjări
neechilibrate microscopice și submicroscopice, va deveni cel mai probabil prima abordare în
testarea citogenetică și va înlocui majoritatea analizelor cromozomiale prin bandare și FISH
în laboratoarele clinice în viitorul apropiat. (66)
Metodele de hibridizare genomică comparată ce folosesc tehnologia micromatricilor este
folosită de câțiva ani pentru diagnosticul clinic al copiilor și adulților suspectați cu sindro ame
genetic e de etiologie necunosc ută. Mai mult de 70 de tulbur ări sunt cunoscute ca fiind
asociate cu defecte la naștere sau probleme de dezvoltare care sunt cauzate de duplicația sau
deleția de material genetic, numite variații ale numărului de copii (CNV). Hibridizarea
genomică comparată a crescut rezoluția cromozo mială pentru detectarea CNV, și ca rezultat a
crescut randamentul diagnostic și detaliile genomice peste cele obținute prin metode
convenționale. Acest lucru a condus la dianosticarea mai multor pacienți și la identificarea
unor noi sindroame de microdeleț ie și microduplicație.
Dezvoltarea tehnologiei micromatricilor (microarray) a deschis o cale pentru depășirea
multor limitări ale CGH, deoarece preparatele metafazice au putut fi înlocuite de clone ADN
cartografiate, care a oferit o cale de conecta aberațiile direct la secvența genomică. Multiple
abordări au fost întreprinse pentru a implementa CGH bazat pe micromatrici. Diferitele
abordări pot fi categorisite în funcție de proprietățile ADN -ului depozitat pe substrat și de
proprietățile genomului care urmează a fi interogat de m atrice.
Micromatricile sunt de obicei create de robotică de înaltă precizie, care depozitează și
imobilizează cantități mici de ADN (spoturi) spațiate strâns pe un substrat (de obicei o
suprafață de sticlă) într -o manieră uniformă și/sau ordonată. Mostrel e ADN sunt marcate in

101
vitro prin încorporarea de nucleotide marcate fluorescent, de regulă Cy3 și Cy5. După
hibridizare, pot fi obținute imagini digitale a fiecărui fluorocrom hibridizat folosind diferite
tipuri de sisteme de obținere a imaginii. Rezoluția genomică la care pot fi detectate aberațiile
este determinată de trei factori majori: distanța genomică dintre elementele ADN analizate;
dimensiunea elementelor; iar dacă proporțiile obținute din media datelor aparținând clonelor
vecine, atunci numărul cl onelor folosite vor afecta și ele rezoluția.
Pentru ca micromatricile CGH să fie utile din punct de vedere clinc ca unelte de
diagnostic/prognostic, este necesar un sistem robust cu sensibilitatea de a detecta cantitativ un
spectru mare de modificări ale numărului de copii, de la deleții homozigote și aberații ale
numărului de copii de nivel jos, la amplificări de nivel înalt. (65)
Array CGH este o tehnologie relativ nouă utilizată în scopul diagnosticării sindroamelor
genetice , atât postnatal cât și prenatal. Aceasta poate fi efectuată folosind o matrice țintită care
evaluează loci cunoscuți a fi asociați cu o condiție sau fenotipuri specifice, sau poate fi
efectuată cu o matrice a genomului întreg, având clone cu o densitate s pecificată localizate de –
alungul genomului. Array CGH a fost de asemenea folosită pentru a detecta mozaicismul de
nivel jos și pentru a caracteriza cariotipuri neclare sau aparent echilibrate. (67)
Array CGH a fost validată în nenumărate studii care au folosit eșantioane cu dezechilibre
cromozomale cunoscute. Această tehnică demonstrează în mod constant sensibilitate și
specificitate înalte în aproape toate dezechilibrele segmentare sau ale cromozomului în
întregime existente. A rray CGH poate de asemenea caracteriza anomalii neclare identificate
de citogenetica convențională, cum ar fi identificarea originii unei SMC (menten anța
structurală a cromozomilor) sau definirea punctelor de rupere a unei rearanjări. (68)
Studii în privința utilității clinice a tehnicii aCGH sugerează că diagnosticul unui
dezechilibru cromozomal folosind această tehnică poate conduce la schimbări în
managementul medical al pacientului, inclusiv trimiterea l a alți specialiști, inițierea
protocoalelor de screening, evitarea testelor de diagnostic adiționale și îmbunătățirea
accesului la servicii. În plus, stabilirea unui diagnostic specific permite consilierea genetică și
estimarea riscului de recurență cu mai multă acuratețe și luarea unor decizii mai informate în
ceea ce privește reproducerea. (69)
Array CGH a întregului genom poate fi folosit pentru a cartografia regiuni recurente cu
aberații ale numărului de copii când sunt anal izate un număr mare de mostre tumorale.
Ulterior, asamblarea matricilor cu acoperire de înaltă densitate a clonelor de -alungul unei
regiuni permite definirea aberațiilor recurente. De exemplu, Albertson et al. a folosit array

102
CGH pentru a cartografia canti tativ și precis structuri amplicon în tumori, care au ajutat la
identificarea oncogenelor. În plus, datorită preciziei și sensibilității, folosirea array CGH
permite nu numai clasificarea tumorilor în funcție de tip și numărul de aberații ale numărului
de copii, permite de asemenea și elaborarea unor întrebări specifice în legătură cu defectele
genetice de fond care permit selectarea acestor aberații. În plus, din cauză că multe anomalii
de dezvoltare sunt caracterizate de prezența dezechilibrelor genomice de nivel jos, multe
dintre care rezultă în alterații ale numărului de copii, array CGH poate fi folosită pentru a
detecta mărimea și locația acestor aberații și corelarea lor cu fenotipul clinic observat.
Veltman et al. a descris utilitatea array CGH în de tectarea aberațiilor genomice în regiuni
(sub) -telomerice, care sunt adesea șterse la pacienții cu retard mental. La ora actuală, aceste
aberații sunt detectate în laboratoarele clinice prin teste de hibridizare fluorescentă in situ cu
probe telomerice ind ividuale. În viitor, rezultatele acestor teste pot fi îmbunătățite prin
aplicarea array CGH pentru a testa toți telomerii simultan.
Formatul array CGH a fost de asemenea aplicat împreună cu alte teste pentru a realiza
profilul schimbărilor epigenetice. De exemplu, Zardo et al. a folosit array CGH în combinație
cu scanarea genomică a punctelor de restricție pentru evaluarea statusului numărului de copii
ADN cât și a statusului de metilare în scopul identificării genelor inactivate de deleția unei
singure co pii și metilarea copiei rămase. Într-o altă abordare, Shi et al. a asamblat matrici ce
conțin clone CpG islands și ulterior a hibridizat specimene ADN tumorale tratate cu bisulfit și
specimene de ADN normal pentru a dezvălui diferențele în statusul de meti lare la acei loci.
Alte studii au folosit array CGH pentru a cartografia situsuri de legare a proteinelor în genom.
În această tehnologie, ADN genomic este imunoprecipitat folosind anticorpi specifici pentru
proteine de legare la ADN. Prin hibridizarea com petitivă a două eșantioane de ADN genomic
imunoprecipitate și marcate diferit, pot fi identificate regiuni de legare la ADN din genom și
pot fi comparate modele de situsuri de legare proteine -ADN în, de exemplu, ADN tumoral și
normal. (65)
Duplicații le și deleții le segmentale au fost bine documentate în tulburările moștenite.
Progresele făcute de array CGH au facilitat descoperirea unor astfel de alterații genetice.
Matrici genomice la interval de megabaze a fost un mijloc folos it pentru stabilirea regiunilor
afectate într -o varietate de boli genetice. Deleții și duplicații cromozomiale submicroscopice
au fost identificate la pacienți normal din punct de vedere citogenetic care prezentau retard
mental și dismorfisme. În plus, mod ificări ale numărului de copii au fost definite în sindromul
Cri-du-Chat, hernia diafragmatică congenitală și sindromul Prader -Willi folosind array CGH.
Aceste exemple ilustrează valoarea tehnicii array CGH în identificarea aberațiilor care au

103
scăpat anali zei citogenetice tradiționale și în rafinarea aberațiilor caracterizate anterior în
variate boli.
Tehnologia array CGH a avansat foarte mult în ultima decadă, prin dezvoltarea unei
multitudini de platforme array, mărind aplicabilitatea sa la multe aspecte ale cercetării
genetice. Noi designuri de matrici vor continua să îmbunătățească rezoluția și sensibilitatea
detecției, în timp ce strategiile de producție mai eficiente și protocoalele experimentale
raționale vor reduce costurile și eforturile necesare. În plus, apariția de noi programe software
care țintesc automatizarea detecției punctelor de rupere și analizei statistice, vor simplifica
sarcina dificilă de a interpreta seturi de date array CGH. Progresele tehnice continue și
creșterea bazelor de date a profilurilor specifice de boală, vor lărgi aplic abilitatea array CGH
atât în domeniul cercetării cât și clinic. (70)

104
Bibliogra fie

1. Ahmed Abouelmagd, H. M. A. Cell Division. In: Basic genetics. Universal -Publishers
Boca Raton, 2013, 1 -10.
2. M.A., Ferguson -Smith. Genetic analysis by chromosome sorting and painting:
phylogenetic and diagnostic applications. Eur J Hum Genet, 1997; 5:253 -265.
3. Yunis, Jorge J. Hum an Chromosome Methodology. Academic Press, 1974, 1.
4. Orlando J. Miller, E. T. Chromosome Bands. In:Human Chromosome. Springer, 2001, 80 –
84.
5. Zneimer, Susan Mahler. Cytogenetic Abnormalities: Chromosomal, FISH, and Microarray –
Based Clinical Reporting. Wiley Blackwell, 2014, 4.
6. Knight S.J.L., Horsley S.W., Regan R. et al. Development and clinical application of an
innovative fluorescence in situ hybridization technique which detects submicroscopic
rearrangements involving telomeres. Eur J Hum Genet, 19 97; 5:1 -8.
7. Orlando J. Miller, E.T. Human Chromosome. Springer, 2001, 120, 369.
8. Summer, Adrian T. Why Study Chromosomes?. In: Chromosome: Organization and
Function. Blackell Publishing, 2003, 1 -4.
9. Guo, Z, Guilfoyle, RA, Thiel, AJ, Wang, R & Smith. Direct fluorescence analysis of
genetic polymorphisms by hybridization with oligonucleotide arrays on glass. Nucleic Acids
Res, 1994, 22: 5456 -65. ISBN.
10. Lynn B. Jorde, John C. Carey, Michael J. Bamshad. Clincal Cytogenetics: The
Chromosomal Basis of Hu man Disease. In: Medical Genetics. Elsevier, 2010, 103 -107.
11. Jain, Kewal K. Basic Aspects. In: Textbook of Personalized Medicine. Springer, 2009, 18.
12. Daly, E. M., & Taylor, R.E. Entropy and Enthalpy in the Activity of Tubulin -Based
Antimitotic Agent s. Current Chemical Biology, 2009; 3: 367 -379.
13. Marcovic, O., & Marcovic, N. Cell cross -contamination in cell cultures: the silent and
neglected danger. In Vitro Cell Dev Biol, 1998; 34: 108.
14. Masters, J. R., Thomson, J. A., Daly -Burns, B., Reid, Y. A., Dirks, W. G., Packer, P., et
al. Short tandem repeat profiling provides an international reference standard for human cell
lines. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001; 98(14): 8012 -8017.
15. Murphy, Michael J. Technologies in the Molecular Diagnostics Labora tory. In:
Molecular Diagnostics in Dermatology and Dermatopathology. Humana Press, 2011, 46.

105
16. M.R. Speicher, S.E. Antonarakis, A.G. Motulsky. Chromosomes. In: Vogel and
Motulsky's Human Genetics: Problems and Approaches. Springer Heidelberg Dordrecht
London New York, 2010, 86 -87.
17. Jane Houldsworth, R.S.K. Chaganti. Comparative Genomic Hybridization: An Overview.
American Journal of Pathology, 1994; 6: 1256.
18. S. Aradhya, M. Manning, A. Splendore, A. Cherry. Whole -genome array CGH identifies
novel co ntiguous gene deletions and duplications associated with developmental delay,
mental retardation, and dysmorphic features. Am J Med Genet A, 2007; 143A: 1431 -1441.
19. A. Kallioniemi, O. -P. Kallioniemi, J. Piper, M. Tanner, T. Stokke et al. Detection and
mapping of amplified DNA sequences in breast cancer by comparative genomic hybridization.
Proc Natl Acad Sci USA, 1994; 91:2156 -2160.
20. M.R. Speicher, G. Prescher, S. du Manoir, A. Jauch et al. Chromosomal gains and losses
in uveal melanomas detected by c omparative genomic hybridization. Cancer Res, 1994;
54:3817 -3823.
21. M.M. Weiss, M.A.J.A. Hermsen, G.A. Meijer, N.C.T. van Grieken et al. Comparative
Genomic Hybridisation. Mol Pathol , 1999; 52: 244 -250.
22. Kirchhoff, M, Rose, H & Lundsteen. High resolut ion comparative genomic hybridisation
in clinical cytogenetics. J Med Genet, 2001; 38: 740 -4.
23. Geoffrey S. Ginsburg, Huntigton F. Willard. Genome -based Approaches to Biology and
Medicine. In: Genomic and Personalized Medicine. Elsevier, 2009, 135.
24. Mary Hannon -Fletcher, Perry Maxwell. Microarray -based Comparative Genomic
Hybridization. In: Advanced Techniques in Diagnostic Cellular Pathology. Wiley -Blackwell,
2009, 141.
25. Shaying Zhao, Marvin Stodolsky. BAC Library Construction. In: Bacterial Artificial
Chromosomes: Library Construction, Physical Mapping, and Sequencing. Humana Press
Totowa, New Jersey, 2004, 1.
26. Philip T. Cagle, Timothy Craig Allen. Basic Concepts of Molecular Pathology. Springer,
2009, 88.
27. Hardiman, Gary. DNA Methylation Arrays: Methods and Analysis. In: Microarray
Innovations: Technology and Experimentation. CRC Press Taylor & Francis Group, 2009,
191.
28. David K. Gardner, Denny Sakkas, Emre Seli, Dagan Wells. Human Gametes and
Preimplantation Embryos: Assessment and Diagnosis. Springer, 2013, 150 -151.

106
29. Raymond R. Tubbs, Mark H. Stoler. Aray -based Comparative Genomic Hybridization in
the Analysis of Genomic Alterations in Human Disease. Cell and Tissue Based Molecular
Patholog y: A Volume in the Foundations in Diagnostic Pathology. Churchill Livingstone
Elsevier, 2009, 64.
30. David Shepro, Patricia A. D'Amore, Dame Carol Black, Joe G.N. Garcia et al.
Microvascular Research: Biology and Pathology. Elsevier Academic Press, 2006, 1065.
31. Raymond R. Tubbs, Mark H. Stoler. Microarray Platforms. In: Cell and Tissue Based
Molecular Pathology: A Volume in the Foundations in Diagnostic Pathology. Churchill
Livingstone Elsevier, 2009, 71 -72.
32. Murphy, Michael J. Molecular Diagnostics in Dermatology and Dermatopathology.
Springer New York Dordrecht Heidelberg London, 2011, 47 -48.
33. Mocellin, Simone. Microarray Technology and Cancer Gene Profiling. Landes
Bioscience and Springer Science , 2007, 15.
34. David Shepro, Patricia A. D'Amore , Dame Carol Black, Joe G.N. Garcia et al.
Microvascular Research: Biology and Pathology. Elsevier Academic Press, 2006, 1067.
35. S. Park, Y. Koh, S.H. Jung, Y.J. Chung. Application of Array Comparative Genomic
Hybridization in Chronic Myeloid Leukemia. Methods Mol Biol., 2013; 973:55 -68.
36. Kenneth J. Craddock, Wan L. Lam, Ming -Sound Tsao. Applications of array -CGH for
lung cancer. Methods Mol Biol., 2013; 973:297 -324.
37. Falciani, Francesco. Microarray Technology Through Applications. Taylor & Francis
Group, 2007, 6 -8.
38. David Shepro, Patricia A. D'Amore, Dame Carol Black, Joe G.N. Garcia et al.
Microvascular Research: Biology and Pathology. Elsevier Academic Press, 2006, 1066.
39. K. Nicolaides, R. Snijders, C. Gosden, C. Berry, S. Campbell. Ultrasonographically
detectable markers of fetal chromosome abnormalities. Lancet, 1992; 340:740 -707.
40. L. Rickman, H. Fiegler, C. Shaw -Smith, R. Nash, V. Cirigliano et al. Prenatal detection of
unbalanced chromosomal rearrangements by array CGH. J Med G enet, 2006;43:353 -361.
41. I.N. Machado, J.K. Heinrich, C. Campanhol, R.M. Rodrigues -Peres, F.M. Oliveira, R.
Barini. Prenatal diagnosis of a partial trisomy 13q (q14 –>qter): phenotype, cytogenetics and
molecular characterization by spectral karyotyping a nd array comparative genomic
hybridization. Genet Mol Res, 2010; 9: 441 -8.
42. I.N. Machado, J.K. Heinrich, R. Barini, C.F. Peralta. Copy number imbalances detected
with a BAC -based array comparative genomic hybridization platform in congenital
diaphragmat ic hernia fetuses. Genet Mol Res, 2010; 10: 261 -267.

107
43. I.N. Machado, J.K. Heinrich, R. Barini. Genomic imbalances detected through array CGH
in fetuses with holoprosencephaly. Arq Neuropsiquiatr, 2011; 69: 3 -8.
44. ACOG. ACOG Committee Opinion No. 446: a rray comparative genomic hybridization in
prenatal diagnosis. Obstet Gynecol, 2009; 114: 1161 -1163.
45. Pergament, E. Controversies and challenges of array comparative genomic hybridization
in prenatal genetic diagnosis. Genet Med, 2007; 10: 262 -6.
46. W. Bi, A.M. Breman, S.F. Venable et al. Rapid prenatal diagnosis using uncultured
amniocytes and oligonucleotide array CGH. Prenat Diagn, 2008; 28: 943.
47. S. Darilek, P. Ward, A. Pursley et al. Pre-and postnatal genetic testing by array –
comparative genomic hybridization: genetic counseling perspectives. Genet Med, 2008;
10:13.
48. Aubrey Milunsky, Jeff M. Milunsky. Molecular Genetics and Prenatal Diagnosis. In:
Genetic Disorders and the Fetus: Diagn osis, Prevention and Treatment. Wiley -Blackwell,
2010.
49. C. Lee, S. Lin, C. Lin, J. Shih, T. Lin, Y. Su. Clinical utility of array comparative
genomic hybridisation for prenatal diagnosis: a cohort study of 3171 pregnancies. BJOG,
2012;119:614 –625.
50. C.P. Chen, Y.N. Su, Y.Y. Chen, S.R. Chern et al. Chromosome 1 p32-p31 deletion
syndrome: Prenatal diagnosis by array comparative genomic hybridization using uncultured
amniocytes and association with NFIA haploinsufficiency. TJOG, 2011; 50: 345 -352.
51. C.P. Chen, Y.N. Su, F.J. Tsai, H.H. Lin, S.R. Chern et al. Termi nal 2q deletion and distal
15 duplication: prenatal diagnosis by array comparative genomic hybridization using
uncultured amniocytes. TJOG, 2009; 48: 441 -445.
52. C.P. Chen, Y.N. Su, F.J. Tsai, S.R. Chern, C.Y. Hsu, M.C. Huang, Wayseen Wang. Rapid
genome -wide aneuploidy diagnosis using uncultured amniocytes and array comparative
genomic hybridization in pregnancies with abnormal ultrasound findings detected in late
second and third trimesters. TJOG, 2009; 49: 120 -123.
53. Chih -Ping Chen, Yi -Ning Su, Yi -Yung Chen, Jun -Wei Su, Schu -Rern Chern et al. Wolf –
Hirschhorn (4p -) syndrome: Prenatal diagnosis, molecular cytogenetic characterization and
association with a 1.2 -Mb microduplication at 8p22 -p21.3 and a 1.1 -Mb microduplication at
10p15.3 in a fe tus with an apparently pure 4p deletion. TJOG, 2011; 50: 506 -511.
54. Pawel Stankiewicz, Arthur L. Beaudet. Use of array CGH in the evaluation of
dysmorphology, malformations, developmental delay, and idiopathic mental retardationl.
Current Opinion in Gene tics & Development, 2007; 17:1 -11.

108
55. Joo Wook Ahn, Susan Bint, Kathy Mann, Richard P. Hall, Caroline Mackie Ogilvie.
Array CGH as a first line diagnostic test in place of karyotyping for postnatal referrals –
results from four years’ clinical application for over 8,700 patients. Molecular Cytogenetics,
2013; 6:1 -6.
56. George Kirov, Dilihan Gumus, Wei Chen, Nadine Norton, Lyudmila Georgieva, Murat
Sari, Michael C. O’Donovan et al. Comparative genome hybridization suggests a role for
NRXN1 and APBA2 in sch izophrenia. Human Molecular Genetics, 2007; 17:468 -475.
57. Shlomo Melmed, Kenneth S. Polonsky, P. Reed Larsen, Hnery M. Kronenberg. Gentics în
Endocrinology. In: Williams Textbook of Endocrinology. Elsevier, 2016, 55.
58. Swaroop Aradhya, Rachel Lewis, Ta hrra Bonaga, Nnenna Nwokekeh, Amanda Stafford et
al. Exon -level array CGH in a large clinical cohort demonstrates increased sensitivity of
diagnostic testing for Mendelian disorders. Genet Med, 2012; 14:594 -603.
59. Lloyd, Ricardo V. Endocrine Pathology: D ifferential Diagnosis and Molecular Advances.
Springer, 2010, 33.
60. John Crocker, David Burnett. CGH array analysis of human tissues. In: The Science of
Laboratory Diagnosis. Jon Wiley & Sons, 2005, 524.
61. Hayat, M.A. Handbook of Immunohistochemistry a nd in Situ Hybridization of Human
Carcinomas, Volume 2. Elsevier, 2005, 327.
62. Mala Aurora, Siladitya, Bhattacharay, Vijaya Kumari. World Clinics: Obstetrics &
Gynecology: Recurrent Miscarriage. Jaypee Brothers Medical Publishers, 2011, 99.
63. Philip J. Di Saia, Gautam Chaudhuri, Linda C. Giudice, Thomas R. Moore, Manuel Porto,
Lloyd H. Smith. Women's Health Review: A Clinical Update in Obstetrics -gynecology.
Elsevier, 2012, 11 -12.
64. Stella Pelengaris, Michael Khan. The Molecular Biology of Cancer. Blackwell Publishing,
2006, 484.
65. Antoine M. Snijders, Daniel Pinkel, Donna G. Albertson. Current status and future
prospects of array -based comparative genomic hybridisation. Briefings in functional
genomics and proteomics, 2003; 2:37 -45.
66. Bassem A. Beijani, Lisa G. Shaffer. Application of Array -Based Comparative Genomic
Hybridization to Clinical Diagnostics. Journal of Molecular Diagnostics, 2006; 8:528 -533.
67. B. A. Bejjani, L.G Shaffer. Clinical utility of conte mporary molecular cytogenetics. Annu
Rev Genomics Hum Genet, 2008;9:71 -86.
68. B. Xiang, A. Li, D. Valentin, N.J. Nowak, H. Zhao, P. Li. Analytical and clinical validity
of whole -genome oligonucleotide array comparative genomic hybridization for pediatric

109
patients with mental retardation and developmental delay. Am J Med Genet A,
2008;146A(15):1942 -1954.
69. J. Saam, J. Gudgeon, E. Aston, A.R. Brothman. How physicians use array comparative
genomic hybridization results to guide patient management in children with developmental
delay. Genet Me d, 2008;10(3):181 -186.
70. William W. Lockwood, Raj Chari, Bryan Chi, Wan L. Lam. Recent advances in array
comparative genomic hybridization technologies and their applications in human genetics.
European Journal of Human Genetics, 2006; 14:139 -148.