Utilitatea Antibioticoterapiei Clasice Si a Terapiei Alternative In Mamite

Cercetari comparative privind utilitatea antibioticoterapiei clasice si a terapiei alternative in mamite

CUPRINS

CUPRINS

INTRODUCERE

PARTEA I – CERCETĂRI BIBLIOGRAFICE

CAP. I MORFOLOGIA GLANDEI MAMARE LA BOVINE

1.1. Anatomia glandei mamare

1.2. Histologia și citologia glandei mamare

1.3. Fiziologia glandei mamare

CAP.II SISTEMUL IMUN LA BOVINE. FIZIOPATOLOGIA INFLAMAȚIEI GLANDEI MAMARE

CAP.III MAMITELE BACTERIENE LA VACI

3.1. Clasificarea mamitelor

3.2. Căile de infecție

CAP.IV TERAPIA MAMITELOR

PARTEA a II-a – CERCETĂRI PROPRII

SCOPUL LUCRĂRII

CAP.V DATE DESPRE EFECTIV. MATERIAL BIOLOGIC

CAP.VI INVESTIGAȚII MICROBIOLOGICE

6.1. Materiale și metode

6.2. Rezultate și discuții

6.2.1. Aspecte bacteriologice și bacterioscopice

6.2.2.Rezultate ale antibiogramelor

CAP.VII EVALUAREA SENSIBILITĂȚII/REZISTENȚEI LA ANTIBIOTICE A REPREZENTANȚILOR GENULUI STAPHYLOCOCCUS IZOLAȚI DE LA VACI CU MASTITE CLINIC MANIFESTE

7.1. Materiale și metode

7.2. Rezultate și discuții

CAP.VIII TESTAREA IN VITRO A SENSIBILITĂȚII/REZISTENȚEI TULPINILOR DE STAPHYLOCOCCUS IZOLATE FAȚĂ DE MIERE ȘI PROPOLIS

8.1. Materiale și metode

8.2. Rezultate și discuții

CAP.IX ACTIVITATEA ANTISTAFILOCOCICĂ A TINCTURII DE PROPOLIS DEPENDENT DE CONCENTRAȚIE

9.1. Materiale și metode

9.2. Rezultate și discuții

CONCLUZII

BIBLIOGRAFIE

INTRODUCERE

Bovinele au o importanță socio-economică particulară.în cadrul economiei în general și a agriculturii în special. Ele furnizează un volum crescut și divers de materii prime pentru industriile prelucrătoare și de producții și produse animaliere, de primă importanță pentru consumul populației. Totodată, creșterea bovinelor constituie o ramură de producție agricolă intensivă, o piață de desfacere pentru mijloacele de producție și produsele industriale, o sursă de venituri pentru economie și un mijloc de valorificare superioară a unor resurse naturale (Georgescu, 1995).

Principalul rolul al bovinelor este însă acela de a asigura mijloacele de subzistență necesare omului. Astfel, bovinele furnizează 96% din cantitatea totală de lapte ce se consumă pe glob, 33% din cea de carne și 90% din totalul pieilor grele prelucrate în industria mondială de tăbăcărie; în alimentația omului, bovinele participă cu cca. 12% în aportul energetic alimentar, iar în cazul proteinelor cu peste 56% din totalul de proteine animale din alimentație. Valoarea biologică a proteinelor furnizate de bovine variază între 74-82%, coeficientul de digestibilitate este de 97%, având o calitate deosebită datorită prezenței și echilibrului în aminoacizi esențiali (Morar și Dana Pusta, 2005). Sănătatea consumatorilor depinde de calitatea laptelui, deoarece acesta este unul din produsele animaliere cu importanță majoră în alimentația adulților copiilor sau vârstei a treia, consumat atât ca atare sau ca produse lactate, cum ar fii brânzeturile sau iaurturile.

Transformarea cea mai eficientă a fitomasei ingerate în proteină animală se realizează prin lapte. Necesarul de suprafață de teren pentru a produce 1 Kg de proteină animală prin producția de lapte este de 87 m2, iar pentru producerea aceleiași cantități prin carne este de 450-500 m2 (Velea și col., 1990).

Din păcate în întreaga lume mamita este încă una dintre cele mai importante boli care afectează cantitatea și calitatea laptelui, deoarece este o boală multifactorială, dificil de controlat. Mamita afectează nu numai sănătatea animalelor producătoare de lapte ci are și consecințe directe și asupra bunăstării animalelor și a profitabilității fermei. Mamitele influențează negativ calitatea laptelui, cu impact direct asupra industriei producătoare de lapte. Mamitele la vaci determină pierderi economice importante in special in cazul formelor subclinice, care apar frecvent în efectivele de bovine. Pierderile sunt înregistrate atât de crescători cât și de procesatori. Nu în ultimul rând trebuie trebuie luată în considerare sănătatea consumatorilor, care poate fi pusă în pericol, existând riscul de îmbolnăvire. Siguranța produselor alimentare este în principal asigurată prin metode de prevenire, așa cum sunt implementarea unor bune tehnici de igienă și aplicarea unor proceduri bazate pe principiul analizei riscurilor și a punctelor critice de control. Criteriile microbiologice pot fi folosite pentru validarea și verificarea procedurilor HACCP ale fiecărei fabrici de procesare a laptelui. Standardul ISO 2200 din septembrie 2005 subliniază cerințele pentru certificarea HACCP și contribuie la standardizarea și armonizarea sistemelor HACCP din întreaga lume. Controlul caIității laptelui materie primă trebuie să fie integrat în sistemul HACCP al fiecărei fabrici de procesare a laptelui.

Plecând de la faptul că mamitele la bovine cunosc o incidență crescută pe tot parcursul anului, în majoritatea țărilor în care se practică creșterea vacilor de lapte, tratamentul acestora reprezintă o problemă majoră. În ceea ce privește protocolul terapeutic al mamitelor, la ora actuală acesta se bazează pe utilizarea antibioticelor. Acest tip de terapie, efectuat incorect sau excesiv, făra investigarea sensibilității la antibiotice a dus la insuccese terapeutice și pierderi economice datorate antibiorezistenței și implicit a costurilor ridicate (Rotaru și Diana Sabău, 2006).

Apariția pe plan larg a antibioticorezistenței obligă la ora actuală la investigarea unor soluții terapeutice eficace, medicamentele antibacteriene nereușind să combată eficient infecția, să readucă sănătatea pacientului, ridicând costurile terapiei. În medicina bovinelor producătoare de lapte apare aspectul reziduurilor de antibiotice în produsul final. Rezultatul consumului unor astfel de produse duce la creșterea numărului de bacterii multirezistente la antibiotice. Din aceste considerente, în ultima perioadă s-a conturat tot mai mult necesitatea obținerii unor preparate alternative care să protejeze și să trateze cu succes acestă afecțiune a glandei mamare la bovine care cunoaște o incidență crescută pe tot parcursul anului.

Preparatele oficinale, obținute din produse naturale cum sunt plantele medicinale (infuzii, decocturi, uleiuri esențiale, tincturi, etc.), mierea și propolisul precum și altele, pentru a fi transformate dintr-un remediu empiric într-un medicament, trebuie purificate, standardizate și supuse la toate etapele de cercetare și control: chimic, tehnologic, toxicologic, preclinic și clinic.

Progresul realizat în domeniul chimiei, farmacodinamiei și a tehnologiilor farmaceutice au condus la stabilirea relației ce trebuie să existe între produsul respectiv și efectele sale asupra organismelor. În vedera instituirii unor tratamente este, în consecință, nevoie de stabilirea dozei terapeutice, de standardizarea/uniformizarea concentrației în principii active din produsele finite.

PARTEA I – CERCETĂRI BIBLIOGRAFICE

Capitolul 1

MORFOLOGIA GLANDEI MAMARE LA BOVINE

Glanda mamară este o glandă anexă a aparatului genital femel, de origine ectodermică, având rol decisiv în dezvoltarea nou-născutului atât prin asigurarea necesarului alimentar cat și prin transmiterea de elemente necesare pentru dezvoltarea sistemului său imun ( Ioana Chirilean,2013). Prin ductul galactofor, mai ales dacă acesta este deschis sau lezionat glanda mamară este expusă agresiunilor patogene, permițând accesul agenților bacterieni în țesutul mamar (Ioana Chirilean,2013).

1.1. Anatomia glandei mamare

Glanda mamară se dezvoltă și funcționează sub influența sistemului neuroendocrin. Este considerată o glanda anexă a aparatul genital datorită legăturile hormonale intime pe care le are cu acesta. Influența hormonilor sexuali, determină dezvoltarea completă a glandei mamare la femele și rămânerea ei doar ca un rudiment la mascul (Groza, 2006).

Funcțiile glandei mamare sunt reprezentate pe de o parte de asigurarea alimentației produșilor în perioada postnatală, iar pe de altă parte ca sursă de anticorpi în timpul vieții extrauterine timpurii a acestora (Boitor și col., 1988).

Glanda mamară la vacă, este poziționată în regiunea inghinală, având o formă globuloasă și alungită în jos. Este formată din patru sferturi (cartiere), fiecare terminându-se cu câte un mamelon. Deși baza ugerului pare să formeze un singur organ, între cele patru sferturi există o independență. Corpul mamelei (corpus mamae) are aspect conoid sau semisferic, forma și volumul variind în raport cu rasa și starea funcțională. În multe cazuri (aproximativ 50%) pot să aparä mameloane suplimentare, pe lângă cele patru sferturi cărora le corespunde câte un mamelon. Dacă la baza acestor mameloane suplimentare există țesut glandular, poartă denumirea de polimastie, iar dacă sunt lipsite de țesut secretor-politelie (Hurley, 2005).

Glanda mamară este îmbrăcată la exterior de o piele fină acoperită cu peri. La nivelul mameloanelor pielea, spre deosebire de restul glandei, este mai îngroată și este lipsită de peri. Această zonă este de asemenea lipsită de glande sudoripare și sebacee care se găsesc cu precădere la baza mamelei (Groza, 2006).

Glanda mamară este susținută în zona inghinală de trei ligamente suspensoare, dintre care două sunt situate lateral iar unul este situat median.

Ligamentul suspensor median este constituit cu preponderență din fibre elastice și mai puțin țesut conjunctiv fibros, fapt ce-i oferă posibilitatea măririi în volum în momentul umplerii cu lapte ( Schams și col., 2003).

Ligamentele suspensoare laterale sunt structuri în care primează colagenul în defavoarea elastinei, ceea ce îi asigură rezistența necesară susținerii glandei (Groza, 2006).

Vascularizația glandei mamare este complexă. Arterele care provin din arterele pudende exteme se ramifică în două artere mamare, una cranială și alta caudală care se continuă cu artera profundă a sinusului, ajungând până la baza mamelonului. Artera cranială emite o arteră bazilară care se ramifică formând un plex în jurul sinusului galactofor. Circulația de întoarcere își are originea în plexul venos papilar de unde pleacă venule ce confluează în cercul venos de la baza mamelonului. De aici pleacă vene ce conflueazã cu venele corpului mamelei formând venele mamare cranială și caudală. Acestea se unesc în vena bazală prin care sângele se scurge în vena pudendă externă, vena subcutanată abdominală și vena pudendă internă (Turker, 2002).

Vasele limfatice sunt dispuse sub forma unui plex superficial care pornește de la baza mamelonului distribuindu-se în țesutul cutanat.

Rețeaua parenchimatoasă începe din spațiile periacinoase, urmează traiectul vaselor sangvine și apoi confluează în cele două limfonoduri retromamare dispuse în partea superoposterioară a glandei (regiunea perineală). Rolul vaseor limfatice este acela de a transporta atât limfa cat și unele componente absorbite din intestine (lipide)(De Laval, 2005).

Transportul limfei este asigurat de:

Diferențele de presiune cauzate de respirație;

Presiunea capilarelor sangvine;

Contractura musculară.

Inervația glandei mamare este asigurată de către nervi senzitivi și nervi motori care se termină pe fibrele musculare netede. Originea filetelor nervoase este în nervii: ilioinghinali, iliohipogastrici, spermatici externi și perineali.

Fig. 1.1 . Structura glandei mamare

(Boitor și col., 1988)

Nu există o inervație la nivelul sistemului secretor ca de altfel nici la nivelul celulelor mioepiteliale, care nu se contractă ca răspuns la inervația directă ci la stimulare prin intermediul ocitocinei. Unii dintre nervi au traiect spre interiorul glandei, ceea ce conferă posibilitatea realizării biopsiei doar prin intermediul anesteziei locale (De Laval, 2005).

1.2. Histologia și citologia glandei mamare

Stroma glandei este formată pe de o parte din travee fibro-conjunctive care se desprind de pe fața profundă a capsulei fibroelastice și care împart parenchimul în lobi și lobuli și țesut adipos (Miclauș, 2006).

Unitatea morfo-funcțională a glandei este reprezentată de acinii glandulari constituiți din celule epiteliale secretorii dispuse monostratificat pe membrana bazală sferoidală. Mai mulți acini formează un lobul, iar mai mulți lobuli dau naștere unui lob (Groza, 2006).

Conturul lobulior este delimitat de septumuri interlobulare, iar cel al lobilor de cele interlobare. Aceste unități morfo-funcționale sunt străbătute de structuri vasculare și colectoare ale laptelui (Groza, 2006).

Acinii glandulari sunt structuri saciforme în care se sintetizează și se secretă laptele. Eliminarea produsului de excreție ale acinilor se realizează prin următoarele căi de excreție: (ducte de transport): canalele intralobulare, canale interlobulare, canale intralobare, canale interlobulare, canale galactofore ce se desehid în unghi ascuțit în sinusul galactofor (cisterna de lapte) care se continuă cu sinusul mamelonar terminându-se prin canalul papilar (Boitor și col., 1988). Mucoasa sinusului galactofor formează numeroase pliuri longitudinale și transversale, care realizează la nivelul trecerii spre sinusul mamelonar inelul cricoid numit faldul anular (Accorsi și col., 2002).

Mucoasa sinusului mamelonar realizează la nivelul trecerii spre canalul papilar pliuri longitudinale numite rozeta Furstenberg, cu rol de a împiedica eliminarea laptelui chiar și atunci când cantitatea acumulată este mare, deasemenea este implicată în mecamismul de apărare locală (Boitor și col., 1988).

1.3. Fiziologia glandei mamare

Glanda mamară la vacă este un organ a cărui dezvoltare și funcții sunt strâns legate de dezvoltarea și funcțiile aparatului genital. Totodată, este într-o puternică dependență față de sistemul hormonal, putându-se spune că funcționarea sa este endocrino-dependentă (Constantin și col., 1998).

Spre sfârșitul gestației începe diferențierea în celulele secretorii ale glandei mamare, iar cu câteva zile înainte de parturiție are loc, declanșarea procesului de secreție lactată. Epiteliul alveolar, suferă transformări importante prin hipertrofia reticulului endoplasmic și aparatului Golgi, apariția de vezicule proteice, creșterea mitocondriilor și a numărului de picături de grăsimi citoplasmatice ( Sanda Andrei și Groza , 2010).

În prima zi post partum, se constată o bipolarizare celulară: în zona apicală fiind cuprinse aparatul Golgi, vezicule cu micelii proteici și picături de lipide, iar în zona bazală aflându-se nucleul și reticulul endoplasmic hipertrofiat. Picăturile lipidice din zona apicală fuzionează dând celulei un aspect piramidal (Sanda Andrei și Groza , 2010).

Faza secretorie începe prin decapitarea bobului apical al celulei și eliminarea vacuolelor, picăturilor lipidice și a unei părți din citoplasmă, în lumenul acinar, unde are loc dezintegrarea și transformarea lor în lapte. Secreția glandei mamare este una holo-merocrină: holocrină prin decapitarea apicală a celulei secretorii și merocrină prin faptul că celula nu este distrusă integral, ea se regenerează și reîncepe ciclul secretor (Groza, 2006).

Un rol important în secreția lactată îl are prezența glucozei, care este folosită la nivelul celulelor secretorii ca sursă directă de energie sau în scopul sintetizării lactozei respectiv grăsimii. Aminoacizii proveniți din sânge, determină sinteza proteinelor la nivelul acinilor, iar sinteza grăsimilor se realizează pe baza acizilor grași și a glicerolului (Groza, 2006).

În perioada colostrală, permeabilitatea celulelor epiteliului secretor glandular este mare, dar scade rapid după trecerea acestei perioade.

Orice factor ce influențează negativ procesul de fermentație rumenală și în special cantitățile insuficiente de furaje fibroase din hrana vacilor are ca rezultat sinteza de lapte cu grăsime redusă (Bogdan și Groza, 2009).

Procesul de ejecție a laptelui este un proces complex și constă în eliminarea laptelui acumulat în conductele secretorii, canalele galactofore și cisterna mamară. Pe măsură ce laptele elaborat conținut de celulele secretorii se acumulează, are loc creșterea presiunii intramamare, care poate atinge 20-30 mm col.Hg dar nu poate învinge rezistența sfincterelor papilare (De Laval, 2005).

Proces de ejecție a laptelui este într-o strânsă corelație cu activitatea neuroendocrină, în cadrul căreia cei doi hormoni retrohipofizari ocitocina și vasopresina au rol predominant. Pe lângă aceștia, mai intervin prolactina și somatotropina. Factorii de stres ce intervin în timpul mulsului au o acțiune inhibantă prin determinarea descărcărilor de adrenalină și perturbarea procesului de ejecție (Groza, 2006; De Laval, 2005).

Capitolul 2

SISTEMUL IMUN LA BOVINE. FIZIOPATOLOGIA INFLAMAȚIEI GLANDEI MAMARE

Ca și în cazul altor boli infecțioase, în cazul mastitelor, reacția glandei mamare poate fi mediată de efectori înnăscuți, în cazul primei linii a apărării, respectiv efectori imuni adaptativi, ca o barieră reactivă secundară (Moraru, 1984).

Sistemul imun și structura acestuia la bovine. Sistemul imun la bovine este alcătuit din organe limfoide primare și organe limfoide secundare. Organele limfoide primare sunt: măduva osoasă hematogenă, timusul și ficatul embrionar (Răpuntean, 1997).

Măduva osoasă hematogenă este localizată în areolele oaselor spongioase și în canalul medular al oaselor lungi, începându-și activitatea hematopoetică în perioada embrio-fetală târzie. Postnatal în ea se formează elementele seriei eritrocitare, granulocitare, trombocitele și tot aici are loc maturarea limfocitelor B pe care o părăsesc sub formă de limfocite B mature (Victor și col., 2002).

Timusul este o glandă cu structură mixtă cu rol de epiteliu secretor și organ limfatic. Rolul principal al timusului este de organ limfatic centaral aici având loc maturarea limfocitelor T (Day și Schultz 2009).

Ficatul embrionar în etapele timpurii ale dezvoltării embrionare este precursorul tuturor elementelor figurate ale sângelui (Bajenoff, 2012).

Organele limfoide secundare sunt: splina, ganglionii limfatici și MALT- țesuturi limfoide asociate mucoaselor (Răpuntean, 1997).

Splina cuprinde două zone: pulpa albă și pulpa roșie. Pulpa albă este regiunea limfoidă a splinei și conține compartimente de limfocite B și T grupate în vecinătatea ramificațiilor arteriale. În structura pulpei albe se disting trei zone distincte, fiecare dintre ele venind cu particularități importante în cadrul răspunsului imun, zona marginală, conținând macrofage limfocite B IgM IgD, și respectiv PALS (periarteriolar lymphoid sheaths), conțănând limfocite T (Mebius și Kraal, 2005).

Ganglionii limfatici sunt organe limfopoetice aflate pe traiectul vaselor limfatice formate dintr-o aglomerare de celule limfoide care au rolul de a produce și stoca limfocite și au rol în fagocitoză (Day și Schultz 2009). Componenta celulară a ganglionului limfatic este constituită din trei categorii de celule:

1) celule ale sistemului limfoid (limfocite T, B, și plasmocite);

2) celule ale sistemului fagocitic mononuclear (fagocite sinusale, fagocite cu corpi tangibil din centrii germinativi) și

3) sistemul celulelor tesutului conjunctiv (fibrocite, fibroblaste, celule reticulare dendritice).

MALT (țesuturi limfoide asociate mucoaselor) aceste structuri limfoide neîncapsulate se găsesc în majoritatea organelor și în suprafețele submucoase ale tractului intestinal și a celui respirator și urogenital. Aceste sisteme protejează în mod normal porțile principale ale organismului de pătrunderea și atacul microorganismelor (Răpuntean, 1997).

În cazul glandei mamare, prima linie defensivă a glandei împotriva atacului agenilor patogeni este canalul galactofor. Mușchiul sfincterului oprește contaminarea bacteriană, menținând orificiul închis. Pierderea tonusului muscular crește sensibilitatea la infecțiile mamare. Keratina care se găsește la suprafața canalului îl obturează, împiedicând pătrunderea bacteriilor. În mamite se pierde integritatea canalului prin subțierea keratinei.

Limfa drenată prin vasele limfatice constuie calea de penetrare a antigenelor străine stimulând limfocitele din ganglion. Răspunsul imun nespecific față de agresorii microbieni este rapid și se concentrează asupra componentelor peretelui celular bacterian în timp ce răspunsul imun specific necesită o perioadă mai lungă de elaborare. Celulele asociate primului tip de răspuns sunt neutrofilele, macrofagele și celulele NK aparținând sistemului imun nespecific. Limfocitele T și B aparțin sistemului imun adaptativ sunt cele care intervin în linia a doua a apărării, consecutiv stimulării antigenice, prin markeri de suprafață exprimați de macrofage sau alte celule prezentatoare de antigen. Există o interacțiune considerabilă între cele două sisteme, finalizată prin asigurarea homeostaziei imunologice (Randolph, 1999).

Efectorii imuni umorali nespecifici. Lizozimul este o hidrolază care distruge bacteriile prin lizarea peretelui de peptidoglicani, având activitate antimicrobianä. O deficiență în lizozim predispune glanda mamară la infecții (Moraru, 1984).

Lactoferina este o glicoproteină cu Fe, sintetizată în țesutul mamar (70%) și în leucocite (30%), având concentrații variabile în funcție de faza de lactație și sănătatea glandei mamare. Concentrația ei crește odată cu involuția glandei mamare și în infecții precum și în perioada colostrală, având efect bacteriostatic și antiinflamator, find un factor major nespecific de rezistența la boli. Lactoferina este eficientã împotriva stafilococilor și coliformilor dar nu este eficace împotriva streptococilor care conțin puțin Fe (Rotaru și Diana Sabău, 2006).

Sistemul lactoperoxidază-tiocianat-hidroperoxid în lapte împiedică creșterea S. aureus și a celei mai mari părți de streptococi și coliformi.

Complementul, compus dintr-o serie de proteine, activat pe cale clasică sau alternativă, dă naștere complexului de atac al membranei, cu rol în liza celulelor străine (Bachmann, 1999).

Efectori imuni umorali specifici. Toate tipurile de imunoglobuline sunt prezente în lapte, predominante find Ig G1 și IgG2 cu rol în legarea complementului de receptorii Fc de pe celulele mononucleare, citotoxice și neutrofile. Imunoglobulina M și imunoglobulina G sunt derivate din ser, în timp ce imunoglobulina A și imunoglobulina M sunt secretate local (Bourry și Poutrel 1996). Rolul principal al anticorpilor din lapte este de opsonizare a bacteriei invadante și de facilitare a fagocitozei acesteia prin celulele polimorfonucleare (Balaban și Rasooly 2000).

Efectorii imuni celulari nespecifici. Celulele somatice cel mai adesea regăsite în secrețiile mamare sunt neutrofilele, macrofagele, leucocitele, plasmocitele, eozinofilele și celulele epiteliale. Proporțiile acestor celule variază în funcție de stadiul lactației, de loc și de individ (Bassoe și col., 2003). Celulele reticulare din sistemul țesutului conjunctiv, fără putere de fagocitoză, au rolul de a capta și reține pe suprafața lor antigene.

În procesele inflamatorii ale glandei mamare celulele polimorfonucleare au rolul de a fagocita bacteriile, distrugându-le (Diez Fraille și col. 2003). Celulele sistemului fagocitic mononuclear asigură apărarea și clearance-ul organismului de antigene străine și autolog alterate prin procesul de fagocitoză și intervin în cooperarea macrofag-limfocit T-limfocit B în elaborarea răspunsului imun (Moraru,1984).

Efectori imuni celulari specifici. Principalele categorii de celule implicate în răspunsul imun adaptativ sunt: celulele prezentatoare de antigen, APC (macrofage, celule interdigitate, astrocite, celule gliale, etc.), limfocite T (timodependente) și limfocite B (bursodependente sau dependente de echivalentul bursal la mamifere). Celulele limfoide sunt celule imunocompetente care sub influența stimulării antigenice sunt apte să producă efectori ai imunității specifice (atât umorali- Ig cât și celulari- celule T și B activate). Celulele B asociate epiteliului mamar iau contact cu antigenele bacteriene prin intermediul limfocitelor TH. În laptele neinfectat, cea mai mare parte din celulele imunocompetente sunt macrofage, care intervin în fagocitoza și în liza bacteriilor la fel ca și în inducția imună mediată celular, prezentând antigenul bacterian limfocitelor (Sharif și col. 1998).

Capitolul 3

MAMITELE BACTERIENE LA VACI

Mamitele sunt inflamații ale glandei mamare apărute ca răspuns la infecțiile intramamare, la traumatismele mecanice sau termice și la diverși factori chimici și reprezintă o cauză a reducerii producției de lapte (Groza, 2006).

În contrast, glanda mamară sănătoasă se caracterizează prin lipsa germenilor patogeni din secreția sa, în condițiile în care examenele clinice ale ugerului și examenele caracterelor organoleptice și fizico-chimice ale secreției mamare, nu depistează modificări caracteristice proceselor inflamatorii ( Sanda Andrei și Groza , 2010).

Etiologia mamitelor este plurifactorială, factorii care pot induce apariția și evoluția mastitelor pot fi numeroși, fizici, chimici sau biologici. Dintre aceștia, factorii microbiologici au o importanță deosebită.

La vacă spre deosebire de alte specii de animale domestice, se înregistrează o incidență crescută a mamitelor, apreciindu-se că 40-50% dintre vacile de lapte, prezintă mamite, într-un ciclu de lactație, la cel puțin unul din compartimentele ugerului (Bogdan și Groza, 2009).

3.1. Clasificarea mamitelor

Criteriile care au stat la baza clasificării mamitelor au fost diferite. Astfel, s-a făcut o clasificare după aspectul evolutiv și anatomoclinic. Folosind acest criteriu, mamitele se clasifică conform tabelului 1 (după Moriu și colab., 2002):

Clasificarea mamitelor

Tabelul 3.1

(după Moriu și colab., 2002)

Având în vedere că mamitele determină modificări ale compoziției laptelui (Cheng și col., 2008), depistarea și tratamentul mamitelor clinice și subclinice interesează atât grupul de animale cât și fiecare animal în parte, descoperirea lor precoce permitând adoptarea unor măsuri eficiente de profilaxie și combatere.

Clasificarea mamitelor de natură infecțioasă sau neinfecțioasă

Tabelul 3.2

(după Boitor, 1988; Groza, 2006)

După natura lor infecțioasă sau nu, mamitele se clasifică conform tabelului nr. 2. Cunoașterea agentului etiologic permite o interpretare rațională a evoluției clinice și aplicarea unui tratament adecvat (după Boitor, 1988; Groza, 2006).

În țara noastră, incidența mamitelor a fost evaluată la 49,6% din care doar 5,6% reprezintă formele clinice de boală.

3.2. Căile de infecție

Pătrunderea microorganismelor în mamelă se realizează pe cale ascendentă sau pe cale descendentă.

Calea ascendentă este reprezentată de canalul mamelonar, pe unde pătrunde în mod obișnuit microfora saprofită (gen Micrococcus, Streptococcus etc.). Perianu și col.(2003) consideră că orificiul și canalul papilar reprezintă poarta cea mai importantă de pătrundere a g ermenilor în glanda mamară.

Pe cale descendentă (endogenă) germenii ajung în mamelă pe cale sanguină, se cantonează aici producând diverse leziuni (M. tuberculosis, Brucella spp., Ricketsia spp. etc).

Mamita tuberculoasă este importantă pentru sănătatea publică și pentru transmiterea tuberculozei la viței și la om prin consumul laptelui crud (Doran și col. 2009).

Sursele primare de infecție sunt reprezentate în primul rând de vacile cu mamite clinice sau subclinice, cele sănătoase dar purtătoare sau cele cu infecții purulente localizate. Germenii se pot dezvolta pe pielea ugerului și a mameloanelor, pe părul și pielea din regiunea abdominală. Condiții favorabile pentru grefarea și multiplicarea germenilor și apariția mamitelor sunt oferite de leziunile pielii glandei mamare produse prin traumatisme sau substanțe iritante și de asemenea de mulsul neregulat.

Sursele secundare de infecție sunt numeroase putând fii reprezentate de aparatele de muls, așternutul, îngrijitorii, apa, gălețile, obiectele din grajd contaminate.

În mamitele cu surse exogene, infecția se produce cel mai frecvent pe cale ascendentă, dar este posibilă și calea limfo-hematogenă, în timp ce în cazul mamitelor cu surse endogene crește posibilitatea transmiterii limfohematogene, find posibile însă și celelalte căi (Ognean L. 1997, Ungureanu și Minciună, 1983).

Capitolul 4

TERAPIA MAMITELOR

Mastita clinică este o boala complexa care implica diferiți factori biologici. Factori legați de vaca, cum ar fi paritate, etapă de lactație, numărul de trimestre glandei mamare infectate, și antecedente mastitei clinice și subclinice sunt cunoscute pentru asocierea cu rezultatele tratamentului (Sol și col., 2000, Constable și Morin, 2003; Deluyker și col., 2005, Bradley și Green, 2009; Pinzón-Sánchez și Ruegg, 2011).

Cercetări numeroase au fost axate pe terapia mastitelor contagioase cauzate de agenți microbieni (Makovec și Ruegg, 2003; Milne și col., 2005; Pinzón-Sánchez și Ruegg, 2011).

Terapia cu antibiotice. În medie, 40-50% din vacile unui efectiv pot suferi de infecții bacteriene subclinice ale ugerului. Laptele are aspect normal, dar în cazul efectuării unor culturi în laborator, pot fi evidențiați germenii care produc, de obicei, mamite.

Tratamentul trebuie instituit cât mai precoce și se face pe cale generală cu antibiotice ca și antiinflamatoare. Concomitent se introduc în sferturile afectate, mulse complet, diferite preparate medicamentoase, conținând diferite combinații de antibiotice cu sau fără adaus de corticosteroizi.

Având în vedere acest lucru, este foarte utilă tratarea preventivă a vacilor cu prilejul înțărcării. După ultima mulsoare se introduce în fiecare sfert o suspensie de antibiotice. Înaintea introducerii medicației trebuie șters mamelonul cu soluție alcoolică, iar după administrarea medicației, mamelonul trebuie scufundat în dezinfectant. Există multe antibiotice care pot fi folosite în tratamentele aplicate la înțărcare, dovedindu-se eficiente dozele mari de penicilină și dihidrostreptomicina, cloxacilina, cefalosporinele etc.

Tratamentul aplicat la înțărcare este eficient 90-93% împotriva infecțiilor subclinice cu Streptococcus agalactie, 70-80% împotriva Staphylococcus aureus și 70-90% împotriva streptococilor prezenți în mediu înconjurător. Tratamentul infecțiilor generate de stafilococi pe parcursul lactației este eficient în cel mult 50% din cazuri. Acest tip de tratament este acceptat deoarece antibioticele pot fi înglobate în substanțe care le eliberează treptat, asigurând astfel prezența lor în uger pentru o perioadă îndelungată. Antibioticele nu vor fi eliminate din uger așa cum se întâmplă în cazul terapiei aplicate în cursul lactației. Antibioticele pot fi administrate în doze mari deoarece în perioada de repaus mamar nu se pune problema nivelului producției de lapte sau a prezenței reziduurilor de antibiotice.

Tratamentul administrat la înțărcare este eficient dacă se aplică corect și dacă vaca este întreținută în condiții corespunzătoare. Este obligatorie curățarea sfârcurilor cu vată îmbibată în soluție alcoolică înaintea aplicării antibioticelor intramamar. În caz contrar, se va introduce în uger o cantitate mare de bacterii, care vor anihila antibioticul tocmai introdus. Tratamentele neigienice vor produce mamita, în loc să o elimine.

Tratamentele aplicate pentru combaterea mamitelor în timpul lactației trebuie să dureze – în funcție de gravitatea mamitei și medicamentul folosit – între 5 și 7 zile. De obicei tratamentul constă în administrarea intramamara de antibiotice, după ce vaca a fost mulsă. Antibioticul se alege în funcție de rezultatul examenului de laborator care ne indică ce fel de antibiotic este eficient împotriva bacteriei care a produs mamita. Pe toată durata tratamentului cu antibiotice, laptele muls va fi distrus și sub nici un motiv nu va fi consumat de oameni sau dat spre prelucrare.

Terapii alternative. Medicina veterinară alternativă acoperă o gamă largă de abordări și terapii de vindecare (homeopatia, fitoterapia, apiterapia, acupunctura). Terapia alternativă include practici terapeutice utilizate de sine stătărtor, în timp ce “medicină complementară” combină utilizarea practicilor alternative și a celor convenționale.

Pe plan mondial, există studii (Noua Zeelandă) referitoare la utilizarea unei terapiei alternative în tratarea mamitelor la bovine. Rezultatele obținute în tratamentul mamitei clinice post-partum, unde s-a izolat cel mai frecvent S. uberis, au arătat că remediile homeopatice au indus rate semnificativ scăzute de vindecare clinică și bacteriologică, față de substanțele antimicrobiene. Proporția vacilor la care a fost necesară reluarea tratamentului a fost semnificativ crescută la cele tratate homeopatic (Williamson și colab., 2014).

Un studiu efectuat pentru evaluarea comparativă a eficacitatății strategiei clasice de terapie homeopată, comparativ cu tratamentul cu antibiotice sau placebo, prin utilizarea unor efective de animale cu mamite clinice (ușoare sau moderate) cauzate de agenți ubicvitari respectiv negative din punct de vedere bacteriologic a arătat că în cazurile de mastite pozitive bacteriologic, rata de vindecare după 4 și 8 săptămâni a fost similară atât în cazul tratamentului homeopat cât și a celui cu antibiotic, în schimb diferența dintre tratamentul homeopat și cel placebo a fost semnificativă (P<0.05). Ratele de vindecare atât în tratamentul homeopat cat si în cel cu antibiotice au fost comparativ scăzute, arătând o eficacitate limitată pentru ambele strategii. Cu toate acestea, strategia de tratament homeopat ar putea fi o alternativă la utilizarea antibioticelor în cazurile de mastita clinică ușoară și moderată (Werner și colab., 2010).

Alte studii cu rezultate încurajatoare, au fost axate pe evaluarea efectului lactoferinei asupra sistemului imun al bovinelor, arătând că aceasta poate contribui de asemenea la tratamentul mastitelor. Lactoferina este o proteină care are o arie de acțiune mai mare decât simpla legare a fierului. Rezultatele in vitro si in vivo ne indică faptul că lactoferina este activă împotriva agenților patogeni din glanda mamară, dar activitatea sa intrinsecă este probabil mult prea scăzută pentru a constitui, utilizată de una singură, un tratament viabil (Lacasse și colab.2008).

Kai și colaboratorii (2002) au tratat sferturile mamare infectate cu S. aureus în timpul repausului mamar cu lactoferină bovină (bLf) comparativ cu antibioticul cefazolin. Ambele tratamente au cauzat o reducere rapidă a populației bacteriene, dar după 14 zile, numărul bacteriilor era mai scăzut în cazul tratamentului cu bLf.

Kutila și colaboratorii (2004) au comparat eficacitatea bLf și a antibioticului enrofloxacin în tratamentul mastitei produsă de către E. coli. Ei au observat o tendință spre o eliminare bacteriană mai rapidă la sferturile tratate cu enrofloxacin decât la cele tratate cu bLf. Cu toate acestea, lactoferina este considerată o moleculă eficace contra patogenilor majori ai glandei mamare la bovine.

PARTEA a II-a – CERCETĂRI PROPRII

SCOPUL LUCRĂRII

Sănătatea animalelor de fermă reprezintă un deziderat obligatoriu pentru asigurarea producțiilor la nivelul dorit. Bolile care se pot diagnostica, preveni și trata cu ajutorul vaccinurilor, serurilor și medicamentelor clasice sunt în momentul actual în regres, locul lor fiind luat de alte entități morbide cu o evoluție cronică și insidioasă. Unele dintre aceste boli sunt cauzate de microorganisme care pot fi identificate la bovine sănătoase, dar care în condițiile prezenței unor factori favorizanți devin patogene. Dificil de diagnosticat, aceste boli sunt determinate de un număr mare de agenți și factori favorizanți, determinând pierderi economice considerabile.

Este cunoscută importanța economică pe care o au bovinele, mai ales prin producțiile lor (Georgescu, 1995) dintre care un produs cu o utilizare extrem de largă, agreat pentru valoarea sa nutritivă și digestibilitate, este laptele (Morar și Dana Pusta 2005). Producția de lapte este influențată de factori foarte numeroși, dintre care se pot cita fondul genetic dar și factorii de mediu. Stabulația prelungită sau exclusivă, norme dimensionale de cazare reduse, colectivități mari, bioclimat deficitar, înțărcare precoce, stresuri psihice, însămânțări artificiale reprezintă tot atâția factori de stres, care pot influența negativ starea de sănătate sau pot duce la exacerbarea patogenității microflorei epifite. Toți acești factori influențează implicit apariția și evoluția unor boli tehnologice, cum ar fi mamitele.

Principalii factori restrictivi sunt:

a) dimensionarea medie sau chiar extrem de mică a exploatațiilor, de aici rezultând dezavantaje ca:

– imposibilitatea aplicării unor tehnologii moderne de exploatare pentru asigurarea factorilor calitativi în obținerea, depozitarea și valorificarea produselor;

– cadrul deficitar în aplicarea unor rații furajere moderne și echilibrate, necesare exprimării potențialului genetic al animalelor;

– piedici în realizarea selecției și aplicarea biotehnologiei în reproducție;

– dificultăți în aplicarea Programului strategic de supraveghere a sănătății animalelor și combaterea bolilor la animale;

– nivel redus al cunoștințelor profesionale ale crescătorilor legate de exploatarea animalelor, obținerea și valorificarea unor producții înalte și de calitate.

b) cantitate scăzută de lapte pe cap de vacă furajată,

c) sănătatea precară a glandei mamare, fapt ce determină atât scăderea producției de lapte cât și obținerea unui lapte necorespunzător.

Glanda mamară, prin dispunerea topografică și caracteristicile morfofuncționale, este expusă continuu la cele mai diverse agresiuni, printre care cele microbiene ocupă o pondere majoră. Pentru ca laptele să-și păstreze calitățile nutritive și desigur, pentru a nu fi inclus în categoria surselor de infecție pentru om, el trebuie obținut în condiții de maximă igienă, fiind importante condițiile de igienă în care se practică mulsul, depozitarea și transportul laptelui crud materie primă – și nu în ultimul sănătatea glandei mamare. Bacteriile prezente la bovinele sănătoase, în tubul digestiv sau în aparatul respirator, sunt epifite sau comensale (bacteriile și protozooarele din prestomace). În condiții de viață artificializate, o multitudine de factori (stres, tratamente îndelungate cu antibiotice etc.) pot cauza exacerbarea patogenității acestor microorganisme, realizându-se generalizarea distribuției lor chiar la nivelul unor organe inedite ca habitat, cum este glanda mamară. O consecință relativ frecventă a acestui fenomen este mamita colibacilară, una dintre cele mai grave mamite ale bovinelor, produsă de un agent bacterian cu habitat obișnuit intestinal, E. coli (Vasiu, 2001). Integritatea anatomică și funcțională a mecanismelor imunologice de apărare este extrem de importantă și ea depinde de natura dinamicii interrelației gazdă-agresor.

Mastitele, considerate procese inflamatorii ale glandei mamare produc modificări (patologice, fizico-chimice și bacteriologice) ale țesutului glandular și ale laptelui. Ele reprezintă cele mai costisitoare afecțiuni întâlnite în cadrul creșterii vacilor de lapte. Pagubele pot atinge peste 200 de USD per vacă /an. Se apreciază că pierderile economice totale cauzate de mastitele clinice și subclinice pot fi repartizate astfel:

– 70% în producția de lapte;

– 10% prin reformă și mortalitate ca urmare a mastitelor cronice, incurabile;

– 10% din cauza prezenței în lapte a reziduurilor de antibiotice care influențează negativ procesele din industria prelucrării laptelui;

– 10% reprezintă cheltuieli cu costul tratamentului -medicamente folosite în tratamentul mastitelor (http://issuu.com/nationalmastitiscouncil/docs/commemorativebooklet).

Mastitele reprezintă o problemă și din cauza restricțiilor de consum și de prelucrare a laptelui și a costurilor substanțiale alocate tratamentului, examenelor de depistare sau a acțiunilor de profilaxie și combatere, respectiv vaccinărilor profilactice sau de necesitate. Modificările apărute la nivel local sunt deseori complicate cu implicarea întregului organism, uneori animalul devenind irecuperabil productiv. Aceste boli fac parte dintre bolile cu apariție insidioasă și nu rareori evoluție cronică. Pentru controlul lor este nevoie de o bună organizare în domeniul administrației, igienei, adăpostirii și al managementului mai degrabă decât recurgerea la produse biologice și medicamente. Terapiile „alternative”, mai apropiate de biologic, pot fi în aceste cazuri opțiunea viabilă.

Scopul urmărit în realizarea acestei lucrări a fost acela de a evalua comparativ, pe baze științifice, eficacitatea terapiei alternative prin utilizarea mierii și propolisului de diferite origini, prin comparație cu terapia clasică implicând utilizarea antibioticelor în tratamentul mamitelor la bovine.

Obiectivele stabilite pentru atingerea scopului propus au constat în:

1. Izolarea și identificarea tulpinilor bacteriene implicate în mamite clinice la vaci;

2. Evaluarea sensibilității/rezistenței la antibioticele uzuale pentru terapia mamitelor in vitro;

3. Stabilirea eficienței mierii și a propolisului în diferite concentrații, asupra tulpinilor bacteriene izolate de la vaci cu mastite crescute în sistem intensiv.

Capitolul 5

DATE DESPRE EFECTIV. MATERIAL BIOLOGIC

Studiul inclus în prezenta lucrare de licență s-a desfășurat în perioada decembrie 2013-mai 2014. Animalele cu mamite au fost identificate în cadrul unei ferme de vaci din centrul țării, în județul Sibiu. Au fost considerate 28 animale prezentând simptomatologia de mamită, acestea aparținând raselor Bălțată Romanească și Red Holstein cu varste cuprinse între 3 și 11 ani. Efectivul de bovine din fermă este constituit la ora actuală din 265 de bovine din care 220 sunt Bălțată Romanească și 45 sunt Red Holstein și se împart în:

115 vaci lactante;

34 de vaci in repaus mamar;

46 juninci peste 18 luni gestante;

25 juninci cu vârsta cuprinsă între 12 și 18 luni;

45 tineret cu vârsta sub 1 an.

Toate animalele au fost supuse acțiunilor sanitar-veterinare obligatorii stabilite de ANSVSA și anume tuberculinare acțiune realizată în toamna anului 2013, vaccinare anticarbunoasă care s-a realizat in cursul lunii aprilie a anului în curs și acțiunea de recoltare a sângelui la toate bovinele care au depașit vârsta de 24 de luni, în vederea supravegherii serologice a LEB, brucelozei și paratuberculozei în luna martie a anului 2014.De asemenea toate bovinele au fost deparazitate 3 ori în decursul anului 2013 astfel: în primavară cu Douvistome, vara cu Gardal iar toamna cu Fasciocid.

Factori tehnologici. Vacile sunt întreținute în stabulație permanentă, in sistem liber. În interiorul adăpostului se disting 3 zone funcționale și anume:de odihnă,de furajere și de mișcare, iar adăparea se face cu adăpători.

Fig.5.1. Zona de odihnă

Fig.5.2. Zona de furajare

Zona de odihnă este reprezentată de cușetele individuale cu limitator de greabăn (o bară metalică în partea superioară a cușetei). Rolul acestei bare este de a obliga vaca să facă un pas înapoi, astfel încât va defeca și va urina în afara cușetei și astfel locul de odihnă va fi în permanență curat.

Zona de furajare este amplasată în imediata apropiere a padocului. Hrana animalelor este constituită din fân de lucernă, siloz de porumb, tărâțe de grâu, șrot de floarea-soarelui și de rapiță, iar furajarea se face cu remorcă tehnologică.

Zona de mișcare este situată între zona de odihnă și cea de furajare aceasta fiind desparțită de cea de odihnă printr-un perete. Zona de plimbare și suprafața padocului sunt prevăzute cu o pantă de 5% pentru scurgerea urinei spre un sifon central de colectare care face legătura cu fosa de la capătul adăpostului. Aleea de mișcare și acces la iesle are o lățime de 400 cm, evacuarea dejecțiilor se face cu ajutorul unui bobcat în fosa de la capătul adăpostului. Tot la nivelul acestei zone sunt amplasate adapatorile cu nivel constant.

Iluminarea fermei este naturală și artificială ,realizată de către ferestre respectiv lămpi de iluminat.Ventilația se realizează pe cale naturală iar pardoseala este din beton.

Fig.5.3. Adapători

Mulsul se face mecanic într-o sală specială de muls cu 12 locuri de tip brăduleț. Înainte să ajungă în sala de muls, vacile ajung pe un culoar în sala de așteptare.

Fig.5.4. Sala de muls

Mulsul este efectuat de către 2 mulgători, care spală ugerul cu apa călduță și de asemenea ei șterg ugerul înainte de a incepe mulsul, acesta se face cu ajutorul aparatelor de muls automate, mulgători cu vid de aer, care se spală și se dezinfectează după fiecare vacă. Laptele se colectează în tancuri speciale, prevăzute cu sistem de răcire.

Capitolul 6

INVESTIGAȚII MICROBIOLOGICE

6.1. Materiale și metode

Probele biologice utilizate în acest experiment au fost reprezentate de probe de lapte mamitic, prelevate de la animalele cu mamită clinică din ferma descrisă și care s-au însămânțat într-o primă etapă pe bulion simplu, după care s-au termostat 24 de ore la temperatura de 37ºC. De pe bulion probele s-au însămânțat apoi pe agar nutritiv pentru obținerea de colonii izolate, efectuându-se totodată frotiuri din acestea iar mai apoi examenul bacterioscopic. Pentru probele de lapte luate in studiu, in vederea obținerii de culturi primare, s-a utilizat metoda de insămânțare prin epuizare.

În cazul germenilor care au prezentat gruparea și forma/dimensiunile tipice pentru genul Staphylococcus spp. s-a trecut la reînsămânțare pe agar pe mediul Chapman în vederea obținerii culturilor pure. Prin utilizarea testului API Staph 20, s-a efectuat identificarea stafilococilor din culturile pure. Însămânțarea pe agar cu sânge s-a realizat pentru investigarea capacității hemolitice a tulpinilor izolate. Ca metode de însămânțare, pentru medii lichide s-a folosit omogenizarea unei colonii în mediu iar pentru medii solide, însămânțare prin epuizare.

Examenul bacterioscopic a facilitat identificarea parțială a bacteriilor izolate, colorarea făcându-se prin metoda Gram. Evidențierea caracteristicilor fermentative s-a realizat pe mediu Chapman (mediul Chapman – pt. stafilococi: NaCl 7,5% + manitol + roșu fenol). Fermentarea manitei se face cu producere de acid, culoarea indicatorului (roșu fenol) virează în galben.

Pe acest mediu, stafilococii patogeni sunt manitopozitivi iar cei nepatogeni sunt manitonegativi. ca și caracter de patogenitate, evidențierea hemolizei s-a realizat pe agar cu sânge, fiind diferențiate hemoliza α, incompletă (hemoglobina este descompusă doar până la methemoglobină, apare ca o zonă verzuie în jurul coloniei), hemoliza β, completă (sângele este descompus total, în jurul coloniei este o zonă clară, transparentă).

Fig. 6.1. Însămânțare prin epuizare (1, 2, 3 – pași succesivi de însămânțare)

Testarea sensibilității față de antibiotice are la bază inhibarea dezvoltării unor culturi microbiene însămânțate pe medii de cultură solide în contact cu diferite antibiotice. Testarea sensibilității față de antbiotice s-a efectuat prin metoda difuzimetrică Kirby Bauer, utilizând microcomprimate de antibiotice standardizate.

Fig. 6.2 Aspecte culturale ale tulpinilor izolate pe diferite medii cromogene

Materiale necesare: culturi bacteriene de 24 de ore, plăci Petri cu agar Mueller-Hinton, tampoane sterile, microcomprimate standardizate cu diferite antibiotice, pensetă pentru distribuirea microcomprimatelor.

Metoda de lucru. Pentru efectuarea antibiogramei s-au folosit culturi bacteriene de 24 de ore. În plăci Petri sterile în care s-a turnat agar Muller-Hinton s-au însămânțat prin metoda inundării tupinile bacteriene luate în studiu. Repartizarea microcomprimatelor s-a efectuat cu ajutorul unei pensete flambate în prealabil, iar repartizarea mierii și propolisului în diferite concentrații, în experimentele care au urmărit evaluarea comparativă a efectelor acestora in vitro, s-a efectuat cu ajutorul pipetelor. Plăcile s-au incubat la termostat timp de 24 de ore la 37°C. Citirea s-a facut prin aprecierea diametrului zonelor de inhibiție induse de antibiotice, propolis și miere. Diametrul acestor zone este direct proporțional cu sensibilitatea germenului la antibiotic. Cu cât antibioticul, mierea sau propolisul sunt mai active, cu atât zona de inhibiție a dezvoltării microbiene este mai extinsă.

În acest experiment s-au utilizat următoarele antibiotice: amoxiclav (AMC), enrofloxacin (ENF), cefoperazone (CFP), oxitetraciclină (OT), ampicilină (AMP), cloxacilină (CX), polimixină B (PB), streptomicină (S), neomicină (N), cefotaxim (CTX), cefquinome (CEQ), sulfametoxazol trimetoprim (SXT), penicilină (P) și tinctură de propolis în diferite concentrații, respectiv miere de diferite origini. Tinctura de propolis este recunoscută pentru activitatea sa antimicrobiană, această proprietate datorându-se în special conținutului sau în flavonoide, care se presupune că acționează schimbând permeabilitatea peretelui microbian.

Testele biochimice moderne API, beneficiind și de un soft special pentru citire, sunt utile pentru identificarea stafilococilor (testul API Staph 20), și identificarea bacteriilor Gram negative (testul Api 20 E. fig.6.3).

Fig. 6.3. Api 20 E cu interpretare

Interpretarea acestor teste se poate face prin comparare cu tabelele de referință, dar munca este mult ușurată de softul specific.

Principiul testului API constă în evidențierea caracterelor biochimice ale bacteriilor cercetate folosind o bandă care conține substraturi deshidratate de mediu de testare în microtuburi individuale. Testele sunt reconstituite prin adăugare în fiecare microtub a unei picături dintr-un amestec de API Staph mediu care a fost inoculat cu tulpina ce urmează sa fie studiată.

Fig. 6.4. Aspectul standard al testelor API pentru reacții pozitive sau negative

Benzile sunt apoi incubate timp de 18-24 de ore la 35-37°C. Rezultatele se cititsc și se interpretează confrom informațiilor conținute în prospect. Indexului analitic al profilelor API sau software-ul de identificare bazat pe clasificarea lui Kloos și Schleifer (1975) ușurează identificarea.

API 20 E este un sistem de identificare pentru Enterobacteriaceeae, utilizând teste standardizate care evidențiază proprietățile biochimice ale tulpinilor studiate. API Staph este un sistem de identificare pentru genurile Staphylococcus, Koccuria și Micrococcus, utilizând teste standardizate care evidențiază proprietățile biochimice ale tulpinilor studiate, citirea rezultatelor facându-se cu ajutorul unui program de recunoaștere și identificare în funcție de aceste proprietăți, ca și în cazul testului API 20 E.

6.2. Rezultate și discuții

Laptele mamitic a prezentat de asemenea următoarele modificări de aspect: grunji, flocoane de cazeină, aspect citrin sau apos. prezentând miros neplăcut fetid sau putrid. Unele eșantioane de lapte au prezentat și modificări de culoare: gri murdar (suspiciune de infecție stafilococică și/sau streptococică), gălbui, roșiatică (suspiciune de infecție cu E.coli).

6.2.1. Aspecte bacteriologice și bacteriscopice

Atât examenul bacteriologic, prin evidențierea aspectelor culturale cât și examenul bacterioscopic (colorație, aspect morfologic, grupare) pot orienta examinatorul în procesul de identificare al genurilor bacteriene studiate.

Caracterele culturale ale tulpinilor izolate în cultură pură sunt prezentate în tabelul 6.1. În urma examinării frotiurilor la microscop observând aspectele morfologice și tinctoriale s-a considerat probabilă prezența următoarelor specii bacteriene: Staphylococcus spp., Streptococcus spp., E. coli, Pseudomonas spp., Klebsiella spp., Lysteria spp., Fusobacterium necrophorum, Pasteurella spp,. Corynebacterium spp.

În urma examenului microbiologic, s-au izolat și identificat 9 genuri bacteriene diferite (tabel 6.1). Pe baza rezultatelor obținute se poate afirma că, bacteria cea mai frecvent izolată din laptele vacilor cu mamită este Staphylococcus spp. (32%), urmată de E. coli (26%), Streptococcus spp. (21%), Corynebacterium spp. (8%), Pseudomonas spp. (6%), Fusobacterium necrophorum (3%), Klebsiella (2%), Listeria spp. (1%) și Pasteurella spp. (1%). Speciile de stafilococi, izolate în număr mare, au fost supuse identificării ulterioare prin aplicarea testelor API STAPH, până la nivel de specie.

Fig.6.5. Repartiția procentuală a germenilor izolați din laptele mamitic

În figura 6.5 sunt prezentate principalele genuri de bacterii izolate din probele de lapte, fiind incluse totodată diferitele specii de stafilococi.

Fig.6.6. Repartiția procentuală a tulpinilor de Staphylococcus spp. izolate

Urmărind cele două grafice, se poate observa că proporția bacteriilor Gram negative, pe specii, este una mai scăzută decât a bacteriilor Gram pozitive, ceea ce confirmă datele de literatură, mamitele produse de aceștia fiind cele mai frecvente.

Aspecte culturale ale germenilor izolați din probele de lapte mamitic

Tabel 6.1.

Tabelul 6.1. include rezultatele examenului cultural ca o orientare preliminară în identificarea genurilor bacteriene implicate în etiologia mamitelor luate în studiu.

Flora microbiană totală a fost încadrată pe baza utilizării testelor API 20E, API NON E, API STAPH in 16 specii bacteriene diferite. Repartiția procentuală pe aceste specii este prezentată în figura 6.5. Din această figură se poate observa că microflora totală este dominată de Staphylococcus aureus (13.26 %) urmat de Staphylococcus xylosus (13.16%), pe următoarele locuri fiind situate alte specii de stafilococi respectiv streptococi. Bacteriile Gram negative, deși prezente, sunt în proporție mult mai redusă (între 0.5 și 3%). Singura excepție este reprezentată de E. coli, care este prezentă într-un procent foarte mare comparativ cu ceilalți Gram negativi. Urmărind prezența speciilor de Staphylococcus (fig. 6.6), se poate constata prezența unui număr mare de specii, dintre care cea mai importantă ca incidență este S. xylosus, care devine din ce în ce mai frecvent citat în etiologia mamitelor la bovine.

6.2.2.Rezultate ale antibiogramelor

În tabelul sunt prezentate rezultatele antibiogramelor efectuate pe floră totală. Dată fiind varietatea germenilor componenți, se poate observa că există la toate fermele colonii rezistente. Este demnă de remarcat rezistența totală a mixturii de tulpini izolate, chiar la antibiotice cu spectru mai larg și de generații mai noi (amoxicilină cu acid clavulanic). Se poate observa prezența unor diametre de inhibiție variabile, în funcție de unitatea de la care au provenit probele. Urmărind comparativ toate valorile, enrofloxacina pare a fi cea mai eficace.

Antibioticorezistența florei totale izolate

Tabel 6.2.

Antibioticorezistența florei totale izolate (continuare)

Tabel 6.2.

Probele 2, 3, 12, 15, 18, 20, 24 și 27 nu au fost testate în acest experiment. Microcomprimatele utilizate au fost adaptate la terapiile efectuate pe parcursul perioadei în unitate, din acest motiv nu s-a efectuat testarea tuturor probelor cu toată gama de antibiotice.

Analiza florei bacteriene, izolată din laptele provenit de la vaci cu mastită, a evidențiat aspecte diferite în funcție de gradul de afectare a glandei mamare. De la vacile cu mastită acută s-au izolat Staphylococcus aureus în 30% din probe, Streptococcus agalactiae în 15% din probe, Streptococcus dysgalactiae în 12,5% din probe, iar Escherichia coli în 10% din probe. Din laptele provenit de la vacile cu mastite cronice s-au izolat în 33,3% din cazuri Escherichia coli, în câte 16,6% din cazuri s-au izolat Streptococcus agalactiae și Staphylococcus aureus, iar în 8% din cazuri s-a izolat Streptococcus dysgalactiae (Hromei, 2006). În majoritatea probelor de lapte mamitic germenii din genul Staphylococcus spp. s-au regăsit în combinație cu germeni din genul Streptococcus spp.

Cu toate că în această etapă antibiogramele au foste efectuate pe floră totală, cumulând numeroase specii bacteriene, se poate constata că rezistența la antibiotice este crescută. Acolo unde rezistența nu este totală, se observă în majoritatea cazurilor, colonii rezistente, ceea ce sugerează ineficacitatea parțială a antibioticului, flora inductoare nefiind distrusă prin aplicarea tratamentului respectiv. Chiar dacă terapiile cu antibiotice utilizate in vivo au fost mai simple rezistența la antibiotice este remarcabilă. Aceste date sugerează implementarea nejudicioasă a terapiei cu antibiotice pe parcursul vieții economice a animalelor investigate și susțin obligativitatea efectuării antibiogramei în toate cazurile de mamită, de preferat prin teste rapide.

Capitolul 7

EVALUAREA SENSIBILITĂȚII/REZISTENȚEI LA ANTIBIOTICE A REPREZENTANȚILOR GENULUI STAPHYLOCOCCUS IZOLAȚI DE LA VACI CU MASTITE CLINIC MANIFESTE

Mamitele cauzează pierderi economice majore în industria de obținere și prelucrare a laptelui în toată lumea.(Kudinha și Simango, 2002; Gentilini și col., 2002; Oliver și col., 2005). Mamitele având ca agent cauzal bacterii din genul Staphylococcus spp. duc la scăderea producției de lapte și reprezintă un risc de îmbolnăvire pentru populația umană (Sawant și col., 2005).

Utilizarea nerațională și excesivă a antibioticelor în ferme a dus la apariția antibioticorezistenței, de aceea este foarte importantă monitorizarea susceptibilității germenilor la diferite antibiotice și aplicarea tratamentelor conform antibiogramei (Gentilini și col., 2002; Luthje și Schwarz, 2006).

7.1. Materiale și metode

În cazul acestui experiment, testarea sensibilității față de antibiotice s-a efectuat prin metoda difuzimetrică, utilizând microcomprimate de antibiotice standardizate. Pentru efectuarea antibiogramei s-a folosit suspensie cu densitatea de 0,5 pe scara McFarland, obținută din culturi bacteriene de 24 de ore. S-au folosit următoarele antibiotice: penicilină (P), oxitetraciclină (OT), trimethoprim (SXT), enrofloxacină (ENF), cloxacilină (CX), ampicilină (AMP) și amoxiclav (AMC). Tehnica aplicată a fost cea descrisă în capitolul 6. În plăci Petri sterile în care s-a turnat agar Muller-Hinton s-au însămânțat tulpinile bacteriene luate în studiu prin metoda hașurării cu un tampon steril. După repartizarea microcomprimatelor, plăcile s-au incubat la termostat timp de 24 de ore la 37ºC. Citirea s-a făcut prin aprecierea diametrului zonelor de inhibiție induse de antibiotice.

7.2. Rezultate și discuții

Rezultatele obținute prin testarea antibiotico-rezistenței tulpinilor de Staphylococcus spp. izolate din laptele mastitic sunt prezentate în tabelul 7.1 și fig. 7.1.

Conform rezultatelor antibiogramelor efectuate pe tulpinile luate în studiu antibioticul cu eficiența cea mai mare s-a dovedit a fi cloxacilina, care are un număr mare de tulpini sensibile, cu toate că diametrul de inhibare nu este maxim. Ca număr de tulpini sensibile, dar ca și în cazul cloxacilinei, cu un diametru mediu mai mic de inhibiție este oxitetraciclina. Penicilina are diametru maxim de inhibare dar numărul de tulpini sensibile este mai mic. În cazul antibioticelor pentru care, deși zonele de inhibiție corespund valorilor indicate ca fiind terapeutice conform criteriilor de interpretare NCCLS, sunt prezente colonii rezistente, nu se recomandă utilizarea în terapie. Șapte dintre tulpinile bacteriene studiate au prezentat rezistență la 3-5 antibiotice dintre cele 7 studiate, opt dintre tulpini au fost sensibile la toate antibioticele, restul prezentând sensibilitate moderată.

Staphylococcus aureus este una dintre cauzele majore ale mastitelor subclinice, clinice, recurente și cronice la vacile pentru lapte. Aceste infecții sunt tratate de obicei cu agenți antimicrobieni și se știe, bazat pe studii epidemiologice, că există doar o corelație moderată între susceptibilitatea S. aureus in vitro și eliminarea sa terapeutică după tratarea cu antibiotice a pacientului (Sol și col., 1997, 2000).

Valori ce caracterizează antibiograma efectuată pentru tulpinile de Staphylococcus

Tabel 7.1.

Din rezultatele obținute în experiment frapează rezistența crescută la antibiotice, fie sub forma rezistenței totale sau a prezenței coloniilor rezistente, la toate antibioticele testate. De fapt, tratamentul vacilor suferind de mamite cronice datorate infecției cu S. aureus este de foarte multe ori lipsit de succes, independent de susceptibilitatea antimicrobiană determinată în diagnosticul de laborator (Taponen și col., 2003; Wilson și col., 1999). O potențială cauză, similar cu ceea ce se întâmplă în medicina omului, este legată de creșterea acestor bacterii în biofilme (Dunne, 2002; Vuong și Otto, 2002).

Fig. 7.1 Exprimarea procentuală a mediei zonelor de inhibiție înregistrate pentru Staphylococcus prin utilizarea antibioticelor

Tot mai multe date indică faptul că formarea de biofilme la locul infecției este explicația pentru aparenta rezistență la terapie a izolatelor S. aureus implicate în mastite (Cucarella și col., 2004; Melchior și col., 2006a,b; Oliveira și col., 2006; Melchior și col., 2007).

O posibilă explicație a acestui fapt se poate lega de datele din literatură care susțin prezența unei susceptibilități crescute la bacteriile capabile de a forma biofilme, mai degrabă decât de a adopta o creștere tip „plancton”. Se poate de asemenea deduce faptul că antibioticele care înregistrează o rezistență sporită (ex., enrofloxacina și ampicilina) sunt cele utilizate cu frecvența cea mai mare în teritoriu pentru terapia diferitelor afecțiuni la bovine, determinând astfel rezistența tulpinilor purtate de aceste animale. În favoarea acestei ipoteze vine sensibilitatea crescută înregistrată la cloxacilină, care este un antibitic de uz mai restrâns. Efectuarea antibiogramei suplimentar anchetei epidemiologice în privința antibioticoterapiei efectuate asupra animalului cu mastită, pot eficientiza tratamentul cu antibiotice.

Capitolul 8

TESTAREA IN VITRO A SENSIBILITĂȚII/REZISTENȚEI TULPINILOR DE STAPHYLOCOCCUS IZOLATE FAȚĂ DE MIERE ȘI PROPOLIS

Bacteriile multirezistente la antibiotice reprezintă în continuare un motiv serios de îngrijorare în întreaga lume .Conform Raportului OMS ne situăm în era post-antibioticoterapie, adică doar puține mai sunt antibioticele care pot fi utilizate cu succes la ora actuală. De aceea s-au făcut eforturi științifice fundamentate de a studia noi compuși utili dincolo de terapia convențională, din sfera medicinei tradiționale sau complementare (Thomas și col., 2002). Interesul pentru aceste sisteme este partajat între comunitatea științifică și cea medicală.

Activitatea antimicrobiană a mierii este atribuită în general acidității sale, osmolarității și generării enzimatice de hidroperoxid prin oxidarea glucozei (Azevedo și col., 1963; Dustmann, 1979; Molan, 1992a,b,c, Beretta și col., 2005; Cowan, 1999). Componentele suplimentare ale mierii, cum sunt acizii aromatici sau compușii fenolici pot contribui de asemenea și activitatea antimicrobiană și biologică generală (Weston, 1999;Zumla și Lulat 1989).

8.1. Materiale și metode

În scopul testării efectelor antistafilococice ale mierii s-au folosit probe de miere polifloră și miere de mană testate pentru compoziția chimică. Pentru evaluarea concentrației minime inhibitorii și minime bactericide s-au aplicat metoda difuzimetrică cu comprimate în placă, metoda difuzimetrică cu godeuri și metoda în diluții. Mierea polifloră respectiv cea de mană au fost de proveniență transilvană. Probele au fost prelevate în sticle sterile și păstrate la (23-25˚C, într-un loc întunecos. Probele au fost folosite nediluate. Conținutul în polifenoli a variat după cum urmează (mg GAE/100g miere): polifloră – 101,45±4,48; mană- 126,73±19,16. Conținutul total de flavonoide (mgCE/100g miere) a fost cel mai ridicat pentru mierea de mană (1673±074), în timp ce mierile florale au conținut cantități mai mici (16,11±2,45 și respectiv 10,50±1,15).

Tulpini de Staphylococcus aureus (12), Escherichia coli (7), Pseudomonas aeruginosa (7), au provenit din probele de lapte prelevate din fermă. Toate tulpinile bacteriene au fost cultivate 24h la 37°C pe agar Mueller Hinton. Culturile de 24 ore au fost diluate în ser fiziologic steril, densitatea lor optică fiind ajustată la tubul 1 (0.5) pe scara McFarland’s, pentru standardizarea inoculului (1.5x 108 cfu/ml). Antibiograma s-a realizat după metoda descrisă în capitolul 6.

Pentru stabilirea concentrației minime inhibitorii (CMI) și respectiv a concentrației minime bactericide (CMB) s-a utilizat metoda microdiluției seriate în mediu nutritiv lichid după protocolul descris de Carson și col. (1995). Concentrația minimă inhibitorie (CMI) s-a determinat considerând cea mai mică concentrație de substanță antimicrobiană care nu permite creșterea vizibilă a germenilor.

Inițial s-au realizat 8 diluții v/v succesive ale produselor de testat în mediu de cultură lichid, respectiv bulion Muller Hinton: D1 (4%), D2 (2%), D3 (1%), D4 (0.5%), D5 (0.25%), D6 (0.125%), D7 (0,0625%) și D8 (0,031%), după care s-a adăugat un volum egal de suspensie bacteriană (inoculul bacterian realizat anterior) și plăcile s-au incubat timp de 18 – 24 ore la 37°C. Pentru citirea rezultatelor s-a observat apariția turbidității în mediul lichid, considerând ca și concentrație minimă inhibitorie (CMI) cea mai mică concentrație care nu a permis creșterea vizibilă a germenilor (în godeu aspect de cultură limpede). Valorile finale ale concentrației minime inhibitorii (CMI) s-au exprimat sub formă de medie aritmetică ± deviația standard.

Concentrație minimă bactericidă (CMB) este cea mai mică concentrație de produs care nu permite dezvoltarea vizibilă a germenilor (nici o colonie pe stria de însămânțare). Pentru a determina acest parametru, din fiecare godeu efectuat pentru dozarea CMI s-au preluat câte 10 μl și s-au însămânțat pe plăci cu agar Müeller – Hinton. După incubare 18 – 24 ore la 37°C, s-au vizualizat aceste plăci (fig. 31), urmărindu-se prezența sau absența coloniilor. În baza valorilor stabilite pentru CMI și CMB, a fost posibilă aprecierea indexului bactericid, care se calculează prin raportarea concentrației minime bactericide la concentrația minimă inhibitorie (CMB/CMI) (Pavithra și col., 2010). Se apreciază că produsul testat manifestă efect bacteriostatic dacă CMB/CMI este cuprins între 4 și 32 sau are efect bactericid dacă valoarea CMB/CMI este sub 4 (tabel 8.1).

Pentru investigarea efectelor mierii sau propolisului în mediu solid, s-a recurs la efectuarea metodei difuzimetrice în placă. Au fost aplicate două variante, cu godeuri și respectiv cu comprimate, similară tehnici Kirby-Bauer. Metoda godeurilor presupune turnarea agarului Muller-Hinton în condiții asemănătoare cu cele pentru antibiogramele obișnuite, iar după solidificare și însămânțarea cu inoculul bacterian standardizat după cum s-a arătat deja, practicarea unor godeuri în condiții sterile, cu ștanța de 3,5 mm. Diametrele zonelor de inhibiție s-au citit după o incubare a plăcilor de 24 ore la temperatura de 37C.

Amoxicilina cu acid clavulanic (AMC) si respectiv enrofloxacina (ENF) au reprezentat în acest experiment martorii pentru activitatea antibacteriană.

8.2. Rezultate și discuții

a) Valorile bacteriostatice (CMI) și bactericide (CMB) obținute față de stafilococi prin micrometoda diluțiilor sunt interconectate (tabel 8.1). Aceste valori sugerează că mierea de mană, mierea polifloră și propolisul au avut efecte bacteriostatice și bactericide în concentrații similare.

CMB, CMI și indicele bactericid față de tulpinile de S. aureus izolate de la vaci cu mastite

Tabel 8.1

După cum se arată în tabelul 8.1, tulpinile de Staphylococcus izolate din această unitate au fost sensibile la ambele tipuri de apiproduse, miere sau propolis. Valorile MIC și MBC sunt prezentate ca valori medii.

Urmărind rezultatele obținute față de tulpinile Gram negative, comparativ cu cele două antibiotice, frapează rezistența înregistrată față de AMC, frecvent aplicat în terapie atât la om cât și la animale, considerat fiind un antibiotic cu spectru de acțiune larg.

Efectul mierii față de E. coli a fost similar cu cel al enrofloxacinei, în timp ce Pseudomonas aeruginosa a fost rezistent la antibiotice dar sensibil parțial la miere.

Evaluarea comparativă a efectelor antibioticelor și mierii de mană față de tulpini izolate din laptele mastitic

Tabel 8.2.

Eficacitatea mierii de mană depinde de origine dar și de tulpina bacteriană testată, astfel rezultatele investigațiilor privind eficiența antimicrobiană a mai multe probe de miere de mană (n=20) provenind din diferite zone ale Transilvaniei, arată că (figurile 8.1. și 8.2.) diametrele de inhibiție sunt mult mai mari în cazul E. coli și Staphylococcus aureus decât în cazul Pseudomonas aeruginosa respectiv Salmonella typhymurium.

Fig. 8.1. Eficiența in vitro al mierii de mană față de Escherichia coli și Staphylococcus aureus

Fig. 8.2. Eficiența in vitro al mierii de mană față de Pseudomonas aeruginosa și Salmonella typhymurium

Numărul mierilor de mană active față de Pseudomonas a fost cel mai mic.

Efectul antibacterian exprimat prin dimensiunile crescute ale zonelor de inhibiție nu depinde de conținutul crescut în melezitoză (de ex., la un conținut de melezitoză de 0,73% inhibiția este de 12,33 mm iar la un conținut de melezitoză de 5,23% inhibiția este de 16,33 mm).

Rezistenței antimicrobienă, ca rezultat al utilizării iraționale și excesive a antibioticoterapiei reprezintă un motiv major de îngrijorare atât pentru medicina omului cât și pentru medicina veterinară (Delamare și col., 2007; Sarac și Ugur, 2007)

Numeroși cercetători lucrează de aceea în direcția obținerii de protocoale neconvenționale, ca alternativă la trapia clasică, deseori ineficace în tratarea mastitelor. Astfel de protocoale își găsesc utilitatea în special în cazul infecțiilor determinate de bacterii multirezistente de tipul Staphylococcus aureus.

Apiprodusele pot reprezenta o astfel de alternativă, care posedă de asemenea efecte suplimentare ca cele antiinflamatoare, antioxidante, regenerative pentru epitelii, endotelii și membrane celulare, depurative, imunostimulante, laxative, imunostimulatoare, cunoscute pentru miere. Efectul antibacterian poate fi suplimentat de astfel de acțiuni benefice.

Proprietățile mierii de mană, datorită bogatei sale compoziții în minerale și în bioflavonoide, sunt mai pronunțate decât în cazul mierilor florale. Astfel, concentrația și tipul de compuși fenolici depind de origine aflorală a mierii și factorii majori responsabili de activitatea biologică, incluzând-o pe cea antioxidantă, antimicrobiană, antivirală, și anticanceroasă (Al-Mamary și col., 2002; Wei și Zhirong, 2003).

Variabilitatea legată de tulpina bacteriană poate fi influențată de o susceptibilitate intrinsecă față de apiprodusele testate. Acest studiu a relevant unele diferențe între activitățile antibacteriene ale produselor testate. Nivelul de inhibare a creșterii bacteriene stabilit prin metoda microdiluțiilor în bulion s-a dovedit a depinde de tipul de produs și mai puțin de tulpina bacteriană. Efectele bactericide demonstrate prin calcularea indicelui bactericid, dovedesc utilitatea, mierii poliflore dar și de mană, în combaterea infecțiilor persistente, împiedicând perpetuarea germenilor după încheierea curei cu miere (efect cid).

Rezultatele acestui studiu dovedesc că există un potențial substanțial pentru aplicarea mierii de mană în mediul clinic de aceea investigarea mierilor locale este foarte importantă fiind necesară continuarea evaluării activităților biologice și chimice ale mierilor din România, în special a mierii de mană.

Capitolul 9

ACTIVITATEA ANTISTAFILOCOCICĂ A TINCTURII DE PROPOLIS DEPENDENT DE CONCENTRAȚIE

Tinctura (extractul alcoolic) de propolis este recunoscut pentru activitatea sa antibacteriană, datorându-se în special conținutului său în flavonoide. Se presupune că această flavonoidele acționează asupra peretelui microbian schimbându-i permeabilitatea.

În cadrul acestei cercetări s-a studiat efectul antibacterian in vitro asupra unor tulpini de Staphylococcus spp., al propolisului de diferite origini, în diferite concentrații asupra tulpinilor izolate din laptele mamitic utilizând metoda difuzimetrică și alcoolul de 70º martor.

9.1. Materiale și metode

Extractele alcoolice de propolis au fost preparate prin extracție la rece în alcool 70º, propolisul utilizat pentru obținerea extractelor a fost colectat din diferite regiuni al Transilvaniei. Pentru testarea efectelor antibacteriene ale propolisului față de tulpinile de stafilococi izolate, s-au utilizat 2 tipuri de propolis (PP și PS, fiecare în două variante 1 și 2) în fiecare placă, în concentrații de 1, 20, și 40% și s-a recurs la aplicarea metodei difuzimetrice, deja descrisă în capitolul 6. Repartizarea propolisului în godeuri s-a realizat cu ajutorul pipetei automate, folosindu-se vârfuri sterile. Plăcile s-au incubat la termostat timp de 24 de ore la 37ºC.

Citirea s-a făcut prin aprecierea diametrului zonelor de inhibiție, ca și în cazul antibiogramei clasice.

9.2. Rezultate și discuții

După citirea zonelor de inhibiție s-au comparat efectele diferitelor concentrații între ele precum și efectul diferitelor tipuri de propolis. Conform datelor, eficiența cea mai ridicată a fost prezentată de extractul de propolis PP1 in cazul căruia zonele de inhibiție au fost net superioare față de celelalte extracte. Totodată s-a observat că în concentrație de 1 % efectul antibacterian este mai scăzut și cu valori apropiate atât pentru PP1 cât și pentru PP2. Zonele de inhibiție la concentrații de 20, și 40% nu au prezentat diferențe majore (tabelul 9.1).

Staphylococcus sciuri iar cel mai puțin sensibil au fost tulpinile de Staphylococcus lentus și Stahylococcus simulans s-au dovedit a fi cu susceptibilitate maximă la acțiunea extractelor de propolis. În majoritatea cazurilor, alcoolul nu este inhibitor de creștere, zona de inhibiție fiind de 0 mm.

Fig. 9.1 Plăci utilizate pentru evaluarea capacității inhibitorii a creșterii bacteriene de către diferitele concentrații de propolis

Evaluarea comparativă a efectelor propolisului în diferite concentrații față de tulpini de Staphylococcus izolate din laptele mastitic

Tabel 9.1

Din tabelul 9.1 se poate observa că activitatea propolisului depinde de concentrație dar și de tulpina testată. Astfel, cel mai activ este PP1, în concentrație de 20%, cu 13 tulpini sensibile din 16 (81,25%), cu diametrul mediu de inhibiție maxim (14,46 mm). Similar acționează același compus la concentrație de 40%. CR s-au întâlnit fără excepție, în timp ce rezistența totală față de propolis a lipsit la PS1, PP1și PP2 la concentrații de 20% respectiv 40%. Activitatea propolisului, în caz de eficacitate, a fost comparabilă cu cea a cloxacilinei respectiv a oxitetraciclinei (tabel 7.1) sub raportul numărului de tulpini inhibate din totalul celor testate.

Urmărind activitatea propolisului față de diferitele specii de staficlococi (tabel 9.2) se poate vedea că alcoolul nu are efect inhibitor, deci activitatea biologică față de tulpinile bacteriene aparține în exclusivitate compușilor activi extrași de acest solvent din propolis.

Media zonelor de inhibiție asupra tulpinilor de Staphylococcus studiate

Tabel 9.2.

Se poate observa că eficacitatea maximă o are concentrația de 20%, fără însă ca diferențele să fie statistic semnificative. Efectul pare a fi oarecum homeopat.

Legendă: culorile diferite reprezintă diferitele probe

Fig. 9.2. Efect global al concentrațiilor de propolis asupra stafilococilor studiați

S-a observat că propolisul induce inhibiția cea mai mare asupra tulpinilor de Staphylococcus sciuri, urmată de Staphylococcus intermedius.

Datorită popularității sale în medicina tradițională, propolisul a devenit subiectul unor studii farmacologice și chimice intense în ultimii 30 de ani. Numeroase studii au demonstrate activitățile sale farmacologice versatile: antibacteriene, antifungice, antivirale, antiinflamatorii, hepatoprotective, antioxidante, antitumorale etc. (Banskota și col., 2001a, b; Rindt și col., 2009).

S-au publicat un număr mare de lucrări referitoare al compoziția chimică a propolisului și cercetătorii au început să înțeleagă cât de variabilă este compoziția propolisului și cât de mult depinde aceasta de flora locală de la locul colectării (Marcucci, 1995; Bankova și col., 2000).

Deși activitatea biologică a propolisului și în special activitatea antibacteriană a fost întotdeauna prezentă, această activitate a fost, la probe provenite din regiuni geografice diferite, rezultanta unei compoziții chimice complet diferite (Kujumgiev și col., 1999). Extractele de propolis pot fi comparate în raport cu diferitele concentrații ale lor și în funcție de componentele lor majore. Mecanismul de acțiune a propolisului nu este încă pe deplin cunoscut.

S-a dovedit că termenul de „propolis” nu este până la urmă unul definitoriu pentru compoziția chimică, cum ar fi de exemplu termenul de „venin de albine”. S-a pus întrebarea dacă există vreun sens în studii biologice efectuate cu acest propolis, fără caracterizarea compoziției chimice a materialului folosit. S-a dovedit că a compara probe de propolis provenite din părți diferite ale lumii cum sunt de ex., Bulgaria și Brazilia, este echivalent cu a compara două extracte de vegetale ce provin din plante aparținând unor familii diferite. În consecință, publicațiile recente despre activitățile biologice ale propolisului include într-un mod oarecare analize chimice pentru caracterizarea propolisului utilizat (Bankova, 2005). Cu toate acestea, pentru a fi acceptat oficial în fluxul terapeutic principal, propolisul necesită standardizare chimică ce poate garanta calitatea, siguranța și eficacitatea sa (Rindt și col., 2009a; Rindt și col., 2009b).

Rezultatele cercetărilor au evidențiat efectul antistafilococic al extractelor de propolis. Diametrul zonelor de inhibiție a variat intre 0 și 20 de mm. Valorile obținute sunt comparabile cu cele măsurate în cazul antibiogramelor efectuate cu microcomprimate cu antibiotice. Alcoolul nu a avut nici un efect inhibitor asupra tulpinilor luate în studiu. De aici putem deduce că efectul antibacterian al extractelor de propolis se datorează principiilor active din propolis. Din păcate nu există metode de standardizare ale propolisului, compoziția acestuia variind în funcție de zona geografică, condițiile de mediu, perioada de cules și de flora locală, de aceea orice tratament cu propolis presupune caracterizarea acestuia și stabilirea dozelor optime pentru situația clinică individuală.

În ceea ce privește efectul diferitelor concentrații ale extractelor alcoolice de propolis se poate afirma că prin creșterea concentrației (de la 10 la 40%) nu se obțin rezultate mai bune.

CONCLUZII

Din cercetările efectuate se desprind cel puțin următoarele concluzii:

în cazul fermei luate în studiu agenți etiologici ai mamitelor izolați cu frecvența cea mai mare, au fost cei aparținând genului Staphylococcus spp., prezenți în aproape toate probele de lapte monitorizate bacteriologic,

utilizarea frecventă și nejudicioasă a antibioticoterapiei în terapia mamitelor duce la dezvoltarea rezistenței, respectiv a coloniilor rezistente față de cele mai multe antibiotice așa cum s-a dovedit în acest studiu; astfel, efectele maxime pot fi apreciate în fie funcție de numărul de tulpini sensibile, fie prin diametrele maxime de inhibiție,

prezența antibioticorezistenței la 17,03% dintre tulpinile testate reprezintă un procent însemnat, ceea ce indică utilizarea excesivă a antibioticelor in terapia afecțiunilor la animale, tulpinile rezistente permanentizându-se la indivizii respectivi,

mierea respectiv propolisul reprezintă alternative terapeutice veridice în cazul tulpinilor bacteriene multi- sau total rezistente la antibiotice, în special în cazul stafilococilor care reprezintă flora majoritară în laptele mastitic.

studiul comparativ al eficienței diferitelor concentrații de propolis în tinctură, dovedește efecte maxime pentru concentrația de 20%, efectele descrescătoare la concentrații mai mari nejustificând ipoteza conform căreia concentrații crescute determină efecte sporite,

eficacitatea apiproduselor este dependentă de concentrație dar și de tulpina bacteriană, fiind necesară elaborarea unor tratamente individualizate.

RECOMANDĂRI

se impune standardizarea produselor utilizate, fiind necesară în acest sens continuarea cercetării,

rezultatele obținute sunt încurajatoare în ceea ce privește punerea în practica clinică a tratamentelor cu propolis sau în combinație cu antibioticele,

cu condiția găsirii unei metode de atenuare a efectelor iritante ale tincturii de propolis, tratamentul se poate efectua după identificarea germenului patogen și realizarea antibiogramei la cazurile cu mamite clinice sau subclinice,

introducerea în terapeutică curentă a tincturii de propolis trebuie precedată de studii in vivo, la început pe cale experimentală restrânsă apoi pe loturi de animale convenționale din ferme.

BIBLIOGRAFIE

Accorsi P.A., Pacioni B., Pezzi C., 2002, Role of prolactine growth hormone and insuline-like growth factor in mammary gland involution, J.Dairy Sci., 85: pag.507-513.

Al-Mamary, M., A-Meerri, A., Al-Habori, M. , 2002, Antioxidant activities and total phenolics of different types of honey, Nutrition Research, 22, pag.1041–1047.

Azevedo, J.L., Flechtmann, C.H.W. and Prado Filho, I.G., 1963, Ocorreˆncias de substaˆncias antimicrobianas em produtos de alguns insetos sociais. Revista de agricultura 38, pag. 129–136.

Bachmann, M.F., and Kopf, M.,1999 ,The role of B cells in acute and chronic infections. Curr. Opin. Immunol. 11: pag. 332-339.

Bajenoff, M., 2012, Stromal cells control soluible material and cellular transport in limphnodes, Frantimunol pag. 304.

Balaban, N., Rasooly, A.,2000, Staphylococcal enterotoxins. mt. . Food Microbiol. 61, pag.1—10.

Bankova V., De Castro S.L., Marcucci M.C., 2000, Propolis: recent advances in chemistry and plant origin. Apidologie 31, pag.3–15.

Banskota A.H., Tezuka Y., Kadota S., 2001b, Phytotherapy Research,;15, pag.561–571

Banskota A.H., Tezuka Y., Kadota SH.,2001a, Recent progress in pharmacological research of propolis. Phytotherapy Research 15, 561–571.

Bassoe, C. F., Smith, I., Sornes, S., Haistensen, A., Lehmarin, A. K., 2003, Concurrent measurement of antigen- and antibody-dependent oxidative burst and phagocytosis in monocytes and neutrophils. Methods 21, pag.203—220

Berreta G., Granata P., Ferrero M., Orioli M., Maffei, Facino R., 2005, Standardization of antioxidant properties of honey by a combination of spectrophotometric/fluorimetric assays and chemometrics, Analytica Chimica Acta, 533, pag.185-191

Bogdan Liviu Marian, Ioan Ștefan Groza , 2009, Obstetrică veterinară. Editura Academic Pres, Cluj-Napoca

Boitor I., Munteanu M., Groza I., Muscă M. , 1988, Îndrumãtor de activități practice la Patologia Reproducției și Clinica Obstetricală, Tipo Agronomia Cluj-Napoca

Bourry, A., and B. Poutrel., 1996, Bovine mastitis caused by Listeria monocytogenes:

Bradley AJ, Green MJ , 2009,Factors affecting cure when treating bovine clinical mastitis with cephalosporin-based intramammary preparations. J Dairy Sci. May;92(5): pag.1941-53

Carson C.F., Hammer K.A., Riley T.V, 1995, Broth micro-dilution method for determining the susceptibility of Escherichia coli and Staphylococcus aureus to the essential oil of Melaleuca alternifolia (tea tree oil). Microbios, 82, pag.181–185.

Cheng, J. B., J. Q. Wang, D. P. Bu, G. L. Liu, C. G. Zhang, H. Y. Wei, L. Y. Zhou, and J. Z. Wang., 2008, Factors affecting the lactoferrin concentration in bovine milk. J. Dairy Sci. 91: pag.970–976.

Chirilean Ioana Daniela , 2013, Anatomie comparată splanchnologie.Editura Academicpres

Christina Werner, Axel Sobiraj and Albert Sundrum, 2010, Efficacy of homeopathic and antibiotic treatment strategies in cases of mild and moderate bovine clinical mastitis, Journal of Dairy Research) 77 pag.460–467

Constable PD, Morin DE. , 2003, Treatment of clinical mastitis. Using antimicrobial susceptibility profiles for treatment decisions. Vet Clin North Am Food Anim Pract.;19(1): pag.139-155.

Constantin N., Cotrut M., Sonea A., 1998, Fiziologia animalelor domestice, Vol. 1. Ed. Coral Sanivet, Bucureti

Cowan M. M., 1999, Plant products as antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews, 12, pag.564–582.

Cucarella C., Tormo M.A., Ubeda C., Trotonda M.P., Monzon M., Peris C., Amorena B., Lasa I., Penades J.R., 2004, Role of biofilm-associated protein bap in the patogenesis of bovine Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 72, pag. 2177–2185.

Day, M.J., R.D. Schultz, 2009, Veterinary Imunology Principles and Practice Manson Publishing, pag. 77-79.

De Laval , 2005, The mammary gland Anatomy of the mammary gland, Dairy Knowledge pag.1-6.,Department of Anatomy, University of Bristol,Tutorial. The surface anatomy of the bovine udder.

Delamare, Ana Paula Longaray ; Pistorello, Ivete T Moschen ; Artico, Liane de Oliveira ; Serafini, Luciana Atti ; Echeverrigaray, Sergio , 2007, Antibacterial activity of the essential oils of Salvia officinalis L. and Salvia triloba L. cultivated in South Brazil.. Food Chemistry, v. 100, pag.603-608,

Deluyker HA, Van Oye SN, Boucher JF. 2005, Factors affecting cure and somatic cell count after pirlimycin treatment of subclinical mastitis in lactating cows. J Dairy Sci. Feb;88(2): pag.604-14.

Diez-Fraile, A., Meyer, E., Paape, M. J., Burvenich, C. (2003) Analysis of selective mobilization- of L-selectin and Mac-i reservoirs in bovine neutrophils and eosinophils. Vet. Res. 34, 57—70

Doran P, Carson J, Costello E, More SJ (2009) An outbreak of tuberculosis affecting cattle and people on an irish dairy farm, following the consumption of raw milk, Irish Veterinary Journal, 62(6) 390-397

Dunne JR. W.M., 2002, Bacterial adhesion: seen any good biofilms lately Clin. Microbiol. Rev. 15, pag. 155–166

Dustmann J.H., 1979, Antibacterial efect of honey. Apiacta 14, pag.7–11.

Gentilini E., Denamiel G., Betancor A., Rebuelto M., Rodriguez M., De Torrest R.A., 2002, Antimicrobial susceptibility of coagulase-negative staphylococci isolated from bovine mastitis in Argentina. J. Dairy Sci. 85, pag.1913–1917

Georgescu G., 1995, Tratat de creștere a bovinelor, Vol I, II, III, Editura Ceres, București,

Groza Ioan Ștefan , 2006, Compendiu – Ginecologie, reproducție și andrologie veterinară. Editura Academiei Române

Hromei N., 2006, Cercetări asupra etiopatogeniei, simptomatologiei și terapiei mastitelor la vaci, teză de doctorat, USAMV Iași

Hurley W.L., 2005, Comparative mammary gland anatomy, Animal Sciences no. 308.

Kai K., Y. Komine, K. Komine, K. Asai, T. Kuroishi, T. Kozutsumi, M. Itagaki, M. Ohta, and K. Kumagai, 2002, Effects of bovine lactoferrin by the intramammary infusion in cows with staphylococcal mastitis during the early non-lactating period. J. Vet.Med.Sci. 64: pag.873–878.

Kloos W.E. ,Schleifer K.H., 1975, Simplified scheme for routine identification of human Staphylococcus species. J. Clin. Microbiol. vol. 1 no. 182-88

Kudinha T., Simango C., 2002, Prevalence of coagulase-negative staphylococci in bovine mastitis in Zimbabwe. J. S. Afr. Vet. Assoc. 73, pag.62–65.

Kujumgiev A., Tsvetkova, I., Serkedjieva, Yu., Bankova V., Christov R., Popov S., 1999, Antibacterial, antifungal and antiviral activity of propolis from different geographic origin. Journal of Ethnopharmacology 64, pag.235–240.

Kutila, T., S. Pyorala,H. Saloniemi, and L.Kaartinen , 2004, Antibacterial effect of bovine lactoferrin against udder pathogens. Acta Vet.Scand. 44: pag.35–42.

Lacasse P., K. Lauzon, M. S. Diarra and D. Petitclerc , 2008, Utilization of lactoferrin to fight antibiotic-resistant mammary gland pathogens J ANIM SCI 2008, 86: pag.66-71.

Luthje P., Schwarz S., 2006, Antimicrobial resistance of coagulase-negative staphylococci from bovine subclinical mastitis with particular reference to macrolide-lincosamide resistance phenotypes and genotypes.J. Antimicrob. Chemother. 57, pag.966–969.

Makovec JA, Ruegg PL ,2003, Antimicrobial resistance of bacteria isolated from dairy cow milk samples submitted for bacterial culture: 8,905 samples (1994-2001). J Am Vet Med Assoc. Jun 1;222(11): pag.1582-1589.

Marcucci M.C., 1995, Propolis: chemical composition, biological properties and terapeutic activity. Apidologie 26, pag.83–99.

Mebius, R.E., G. Kraal, 2005, Structure and function of the spleen, Amsterdam pag. 115.

Melchior M.B., Fink-Gremmel S J., Gaastra W., 2006b, Comparative assessment of the antimicrobial susceptibility of Staphylococcus aureus isolates from bovine mastitis in biofilm versus planktonic culture. J. Vet. Med. B Infect. Dis. Vet. Public Health 53, pag.326–332.

Melchior M.B., Fink-Gremmel S J., Gaastra W., 2007, Extended antimicrobial susceptibility assay for Staphylococcus aureus isolates from bovine mastitis growing in biofilms, Veterinary Microbiology 125, pag.141–149

Melchior M.B., VaarkampH., Fink-Gremmels J., 2006a, Biofilms: a role in recurrent mastitis infections? Vet. J. 171, pag.398–407.

Miclăuș V. , 2006, Histologie. Editura Risoprint Cluj-Napoca

Milne MH, Biggs AM, Barrett DC, Young FJ, Doherty S, Innocent GT, Fitzpatrick JL , 2005, Treatment of persistent intramammary infections with Streptococcus uberis in dairy cows. Vet Rec. Aug 27;157(9): pag.245-250.

Molan P. C., 1992c, The antibacterial activity of honey. 2. Variation in the potency of the antibacterial activity. Bee World 73 (2) pag. 59-76

Molan P. C., 1992a,The antibacterial activity of honey. Cardiff, UK; International Bee Research Association (No. M124) 42 pp.

Molan P. C., 1992b, The antibacterial activity of honey. 1. The nature of the antibacterial activity. Bee World 73 (1) pag. 5-28

Morar R., Pusta D. , 2005, Ghidul crescătorului de vaci cu lapte, Editura Risoprint, Cluj-Napoca

Moraru L., 1984, Imunologia- Bazele imunologice ale stãrii de sănãtate și boalã.Editura Medicala, București

Ognean L. , 1997, Mamitele micotice la bovine, Ed. Casa Carții de Stiință

Oliveira M., Bexiga R., Nunes S.F., Carneiro C., Cavaco, L.M., Bernardo F., Vilela C.L., 2006, Biofilm-forming ability profiling of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis mastitis isolates. Vet. Microbiol. 118, pag.133–140

Oliver S.P., Gillespie B.E., Headrick S.J., Lewis M.J., Dowlen H.H., 2005, Prevalence, risk factors and strategies for controlling mastitis in heifers during the periparturient period. Intl. J. Appl. Res. Vet. Med.3, pag. 150–162

Pinzón-Sánchez C, Ruegg PL. , 2011, Risk factors associated with short-term post-treatment outcomes of clinical mastitis. J Dairy Sci. Jul;94(7): pag.3397-3410

Randolph, G. J., Inaba, K., Robbiani, D. F., Steinman, R. M., Muller,W. A. , 1999, Differentiation of phagocytic monocytes into lymph node dendritic cells in vivo. Immunity 11, pag.753—761

Rãpuntean, G. , 1997, Imunologie și imunopatologie, Ed. Genesis

Rindt Iulia Krisztina, Marina Spînu, Mihaela Niculae, 2009, The Immunomodulatory Efect Of Propolis: A Review, Lucrări științifice Medicină veterinară Timișoara, vol. XLII(1), pag. 346-349

Rindt Iulia Krisztina, Spînu Marina, Brudașcă F., Niculae Mihaela, Szakacs Bianca, Kiss Timea, Uricaru A., Bianu G. T., 2009a, Antibacterial Activity of Honey, Honeydew Honey and Propolis From Different Regions of Transilvania Against Staphylococcus Aureus, Lucrări științifice Medicină veterinară Iasi, vol. 52(11), pag.1093- 1095

Rindt Iulia Krizstina, Spînu Marina, Șandru Carmen Dana, Brudașcă G.F., Niculae Mihaela, Kobolkuti L.B., Cadar D., Uricaru A., Kiss Timea, Ungvari NA., Laslo Laura, Mihai C.M., 2009b, Propolis, from different origin and composition, antibacterial activity against Staphylococcus aureus stains isolated from bovine mastitis, Proceedings of the 16th Scientific Conference with International Participation Animal Protection and Welfare Brno, Czech Republic,partea B, pag. 210-212

Rotaru O., Sabau Diana , 2006, Celule somatice și sănãtatea laptelui. Editura Academic Press, Cluj Napoca

Sanda Andrei, Ioan Ștefan Groza , 2010, Fiziologia și patologia glandei mamare la vacă. Editura AcademicPres

Sarac N, Ugur A. , 2007, Antimicrobial activities and usage in folkloric medicine of some Lamiaceae species growing in Mugla, Turkey EurAsia J BioSci 4, pag.28-37

Sawant A.A., Sordillo L.M., Jayarao B.M. , 2005, A survey on antibiotic usage in dairy herds in Pennsylvania. J Dairy Sci, 88: pag.2991-2999

Schams D., Kohlemberg S., Amseigruber W., 2003, Expression and localisation of estrogen and progesterone receptors in the bovine mammary gland during development, function and involution J. Of Endocrinology, 177, pag.305-317.

Sharif, S., Mallard, B.A., Wilkie, B.N., Sargeant, J.M., Scott, H.M., Dekkers, J.C. and Leslie, K.E. , 1998, Associations of the bovine major histocompatibility complex DRB3

Sol J, Sampimon OC, Barkema HW, Schukken YH., 2000, Factors associated with cure after therapy of clinical mastitis caused by Staphylococcus aureus. J Dairy Sci. Feb;83(2):278-284

Sol J., Sampimon O.C., Snoep J.J., Schukken Y.H., 1997, Factors associated with bacteriological cure during lactation after therapy for subclinical mastitis caused by Staphylococcus aureus. J. Dairy Sci. 80, pag.2803–2808.

Taponen S., Jantunen A., Pyorala E., Pyorala S., 2003, Efficacy of targeted 5-day combined parenteral and intramammary treatment of clinical mastitis caused by penicillin-susceptible or penicillin-resistant Staphylococcus aureus. Acta Vet. Scand. 44, pag.53–62.

Thomas Maria-Litran, Kropec A., Abeygunawardana C., 2002, Immunochemical properties of the staphylococcal poly-N-acetylglucosamine surface polysaccharide, Infect. Immun., 70(8): pag.4433–4440.

Turker H.A. , 2002, Mammary gland Function and anatomy, DASC 4374: pag.1-8.

Ungureanu C.; Minciunã V. , 1983, Afecțiunile glandei mamare la vaci, Ed. Ceres București

Velea C., Stanciu G., Ujică V., Georgescu D., 1990, Tehnologia creșterii bovinelor, Editura Didactică și pedagogică, București, , pag.252-280

Victor, C., G. Răpuntean, Monica Crian, T.Vaida, 2002, Imunologie Fundamentală Baze Teoretice și Aplicate, Ed. Casa Cãrții de Științe

Vuong C., Otto M., 2002, Staphylococcus epidermidis infections. Microbes Infect. 4, pag.481–489.

Wei C., Zhirong, S., 2003, Determination of total phenolic acid in honey by Folin-Ciocalteu colorimetry. Shipin Yu Fajiao Gongye, 29(12).

Weston R.J., Mitchell Kevin R., Allen Kerry L., 1999, Antibacterial phenolic components of New Zealand manuka honey. Journal of Food Chemistry 64, pag.295– 301.

Williamson JH, Lacy-Hulbert SJ., 2014, Lack of efficacy of homeopathic therapy against post-calving clinical mastitis in dairy herds in the Waikato region of New Zealand. N Z Vet J. Jan;62(1): pag.8-14

Wilson D.J., Gonzalez R.N., Case K.L., Garrison L.L., Grohn Y.T., 1999, Comparison of seven antibiotic treatments with no treatment for bacteriological efficacy against bovine mastitis patogens. J. Dairy Sci. 82, pag.1664–1670

Zumla A.și Lulat A., 1989, Honey – a remedy rediscovered. Journal of Royal Society of Medicine 82, pag.384–385.

Pavithra P.S., Janani V.S., Charumathi K.H., Indumathy R., Potala S., Verma R.S., 2010, Antibacterial activity of plants used in Indian herbal medicine, Int J Green Pharm, 4, 1, pag.22-28

Vasiu C. , 2001, Bacterioze la animale, Editura Academicpres Cluj-Napoca

Perianu T.,Carp-Cărare M., Tănase Irina Oana , 2003, Boli infecțioase ale animalelor,Bacterioze vol. I, Editura Venus Iași

. Moriu D.E, Hurley W.L., 2002,Mastitis, LessonB,ANSCI 308:1-6

*** http://issuu.com/nationalmastitiscouncil/docs/commemorativebooklet