Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară a Banatului Timişoara [310827]

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară a Banatului Timișoara

Specializarea: Inginerie genetică în agricultură

PROIECT DE DIPLOMĂ

Coordonator științific: Studentă:

Prof. dr. Petrescu Irina Cindisteanu Cristiana Cerasella

2017

[anonimizat] L.

CUPRINS

CAPITOLUL I Introducere………………………………………………………………………..3

CAPITOLUL 2 Organismul viu și metalelor grele……………………………………….4

2.1.Influența metalelor grele asupra organismelor …………………………………4

2.2 Toxicitatea cobaltului asupra plantelor animalelor și omului………………….4

CAPITOLUL 3. Allium cepa L. caracteristici morfologice……………………..

3.1. Origine importanță și răspândire……………………………………………………

3.2. Particularități botanice și biologice………………………………………………..

CAPITOLUL 4 Citologia la Allium ascalonicum L. utilizată în cercetările de genetică

4.1 Diviziunea mitotică sau diviziune indirectă…………………………………….

4.2. Indicele mitotic…………………………………………………………………………..

CAPITOLUL 5 Material și metada de lucru……………………………………………….

5.1. [anonimizat] (cupru) …………………………………………………………………………………….

5.1.1. Variantele experimentale……………………………………….

5.1.2 Obiectivele urmărite ………………………………………………

5.2. Metode de lucru…………………………………………………………………………..

5.3. Metodele de calcul utilizate…………………………………………………………..

CAPITOLUL 6 Rezultate și discuții……………………………………………………………

6.1. Efectul metalelor grele (cupru) asupra formării rădăcinilor la bulbul de Allium ascalonicum L. ………………………………………………………………………

6.2. Efectul metalelor grele (cupru) asupra formării lungimii rădăcinilor la bulbul de Allium ascalonicum L. …………………………………………………………

6.3. Efectul metalelor grele (cupru) asupra formării asupra diviziunii mitotice la Allium ascalonicum L. ……………………………………………………………………

Concluzii…………………………………………………………………………………………………….

Bibliografie………………………………………………………………………………………………..

CAPITOLUL I

[anonimizat], de la precursorii lor; [anonimizat]. Genetica urmărește să stabilească ce trăsături sunt moștenite și să explice cum sunt transmise aceste trăsături din generație în generație.

Unele trăsături se referă la înfățișarea fizică a organismului; [anonimizat], înălțimea sau greutatea. [anonimizat]. [anonimizat]i înalți și subțiri. Alte trăsături rezultă din interacția dintre caractere moștenite și mediul înconjurător. De exemplu, un copil poate moșteni tendința de a fi înalt, dar dacă este slab alimentat el va fi totuși scund. Modul în care genetica și mediul înconjurător interacționează pentru a produce o trăsătură poate fi complicat: de exemplu, șansele ca cineva să moară de cancer sau de o boală de inimă par a depinde atât de istoria familiei sale cât și de stilul său de viață.

Informația genetică e conținută într-o moleculă lungă numită ADN care e copiată și moștenită din generație în generație. Trăsăturile se găsesc în ADN sub forma de instrucțiuni pentru construirea și funcționarea unui organism. Aceste instrucțiuni sunt conținute în segmente de ADN numite gene. ADN constă dintr-o secvență de unități simple, iar ordinea acestor unități „scrie” instrucțiunile într-un cod genetic. Situația e similară cu a literelor care, într-o anumită ordine, compun cuvintele unui text. Organismul „citește” înșiruirea acestor unități și decodifică instrucțiunea.

Nu toate genele pentru o anumită instrucțiune sunt identice. Diferitele forme ale unui tip de genă se numesc alele ale acelei gene. De exemplu, o alelă a unei gene care determină culoarea părului poate conține instrucțiunea de a produce o mare cantitate de pigment pentru un păr negru, pe când o altă alelă ar putea conține o versiune alterată a acestei instrucțiuni, astfel că nu se produce deloc pigment și părul este alb. Mutațiile sunt evenimente aleatorii care modifică secvența unei anumite gene și deci creează a nouă alelă. Mutațiile pot produce o nouă trăsătură, de exemplu schimbând o alelă pentru păr negru într-o alelă pentru păr alb. Apariția de trăsături noi e importantă în evoluție.

Cum trăsăturile se datorează genelor dintr-o celulă, introducând o nouă porțiune de ADN într-o celulă poate fi produsă o nouă trăsătură. Așa procedează ingineria genetică. De exemplu, plantele de cultură pot primi o genă de la un pește arctic, ca frunzele lor să poată produce o proteină contra înghețului. Acest lucru servește la prevenirea pagubelor datorate gerului. Alte gene care pot fi introduse în plantele cultivate includ un insecticid natural din bacteria Bacillus thuringiensis. Insecticidul omoară insectele care se hrănesc cu plantele, dar e inofensiv pentru oameni.[19] Noile gene sunt introduse în aceste plante în stadiul inițial al creșterii, ca genele să se afle peste tot în plantă, inclusiv în semințe. Descendenții plantei moștenesc astfel noile gene – ceea ce a provocat îngrijorare relativ la răspândirea noilor trăsături la plantele sălbatice.

Tehnicile utilizate în ingineria genetică sunt aplicate și la tratamentul bolilor genetice, într-un experiment medical numit terapie genică.[20] În acest caz însă, noua genă e introdusă când persoana are o anumită vârstă și s-a îmbolnăvit, pentru ca ea să nu fie moștenită de copii. În terapia genică se încearcă înlocuirea alelei care produce boala cu o alelă care funcționează corect.

CAPITOLUL II

ORGANISMUL VIU ȘI METALELOR GRELE

2. Efectul metalelor grele asupra organismelor vii

2.1. Influența metalelor grele asupra plantelor, animalelor și omului

Metalele grele cu implicare majoră în organism sunt elemente chimice existente în natură și care realizează un circuit biologic complet adică sol – plantă – animal – om, fiind prezente în organismele vii sau în sol în concentrații foarte mici. Ele au o influență importantă asupra creșterii plantelor, dezvoltării și existenței normale a animalelor și oamenilor. Din punct de vedere al compoziție chimice, aceste metale nu depășesc în medie 0,01 % din sistemul analizat, dar rolulu lor fiziologic este esențial în desfășurarea normală a circuitului biologic.

Metalele in cantitati foarte mici sunt necesare tuturor formelor vitale. Ele patrund in celula vie sub forma de cationi, dar inglobarea lor este strict reglata, deoarece in cantitati mari practic toate metalele sunt toxice.
Există 35 de metale care sunt în atenția organizațiilor internaționale din cauza prezenței lor la locul de muncă sau în locuințe.

Din cele 35 de metale, 23 sunt metale grele: antimoniu, arsenic, bismut, cadmiu, ceriu, crom, cobalt, cupru, galiu, aur, fier, plumb, magneziu, mercur, nichel, platină, argint, teluriu, taliu, staniu, uraniu, vanadiu și zinc.

Nu toate metalele sunt sunt dăunatoare organismului uman. Anumite metale sunt esențiale în desfășurarea proceselor metabolice.

Metalele sunt diferite față de celelalte toxine din mediu prin faptul că organismul nu are capacitatea de a elimina metalele grele prin metodele uzuale.

În cantități mici anumite metale grele sunt esențiale în desfășurarea proceselor metabolice.

Aceste metale sunt: cobaltul , fierul, cuprul, magneziul și zincul. Aceste metale sau diferite forme ale lor se găsesc în mod natural în alimente, fructe și legume și în diferite suplimente nutritive.

Aceste elemente se găsesc și în produse industriale cum ar fi: baterii, aliaje, componente electronice, vopsea, oțel etc.

.

2.2. Influența cobaltului asupra plantelor, animalelor și omului

Cobaltul face parte dintre metalele care deși sunt relativ puțin răspândite în natura au un rol foarte important în aliarea cu alte metale dure. Importanta cobaltului se datorează în primul rând valorii sale, drept component al așa-numitelor aliaje dure: aliaje metaloceramice și aliaje de turnare de tipul stelitilor, cum și aliaje cu proprietăți specifice deosebite, magnetice, refractare și antiacide.

Chiar dacă organismul folosește o cantitate foarte mică, cobaltul este un mineral important pentru sănătatea umană, acesta fiind găsit în structura vitaminei B12 (cobalamina). Aceasta participă la formarea hematiilor, la sinteza ADN și la transmiterea impulsurilor nervoase.

Plantele pot acumula cantități foarte mici de cobalt din sol, în principal în fructe și semințe. În organismul uman acesta se poate acumula, dar nu în cantități foarte mari.

Cobaltul are funcții similare cu zincul, astfel putând lua locul acestuia în diferite reacții enzimatice.

Deși nu există o doză zilnică recomandată pentru cobalt, se presupune că o alimentație echilibrată poate asigura necesarul zilnic.

Simptomele carenței de cobalt sunt similare cu cele ale carenței de vitamina B12 și includ oboseală, memorie slabă, pierderea poftei de mâncare, anemie, depresie etc.

Cobaltul este inclus foarte rar în suplimentele alimentare și astfel o cantitate mare de cobalt poate fi obținută doar în zonele poluate cu compuși ce îl conțin. Cantitatea prezentă în alimente nu este dăunătoare decât dacă acestea provin din zone poluate.

Cele mai importante efecte ale excesului de cobalt sunt: scăderea fertilității bărbaților și afecțiuni ale mușchiului cardiac.

În anii ’60 sărurile de cobalt erau folosite la fabricarea berii. Acestea au produs efecte negative asupra consumatorilor, în unele cazuri producând chiar și decesul acestora. În prezent sărurile de cobalt nu mai sunt folosite în acest scop și astfel nu mai puteți ingera cantități mari de cobalt din aceasta sursă.

Cobaltul inhalat produce astm, pneumonie, alergii, iritații la nivelul pielii, etc. Aceste simptome apar de obicei la concentrații cuprinse între 0.005-0.007 mg cobalt per metru cub de aer.

Cobaltul este folosit și pentru tratarea anemiei (0.16-1 mg per kgc). În acest caz nu au fost observate efecte negative importante. Totuși, folosirea unei cantități de 0.5 mg de cobalt per kgc, timp de câteva săptămâni a produs efecte negative la nivelul tiroidei.

Expunerea la doze mari de cobalt afectează rinichii, ficatul, inima, sângele și comportamentul persoanelor intoxicate.

Un izotop al cobaltului numit Co-60 este folosit în industriile alimentară și farmaceutică pentru sterilizarea alimentelor și a echipamentelor medicale.

Iradierea cu CO-60 este folosită și pentru întârzierea coacerii fructelor și legumelor și pentru prevenirea încolțirii (cartofi, ceapă etc.).

Deși este o metodă controversată de procesare a alimentelor, iradierea cu cobalt 60 este considerată foarte sigură dacă se respectă bunele practici. Totuși, există posibilitatea contaminării accidentale a alimentelor cu cobalt 60, iar iradierea are efecte mai puternice asupra structurii alimentelor decât tratarea termică (diferențele nu sunt foarte mari).

CAPITOLUL III

MORFOLOGIA ALLIUM cepaL.

3.1. Origine importanță și răspândire

Allium ascalonicum – Familia Liliaceae

Genul Allium cuprinde aproape 600 de specii repartizate in patru subgenuri, dintre care, Rhizirideum cuprinde patru sectii, printre care si sectia Cepa. Dupa Prokhanov, exista 9 specii importante reunite in 2 grupe. Prima grupa cuprinde speciile A.cepa (ceapa propiuzisa), A. ascalonicum (ceapa esalota), A. pskemense, A.oschaninii, A. vavilovii, A. farctum.

Cea de a doua grupa cuprinde speciile A. fistulosum (ceapa de iarna), A. altaicum, A. microbulbum.

După metoda de cultivare, există "ceapa de vară" și "ceapa de iarnă" . Ceapa de vară este semănată primăvara timpuriu și recoltată în luna august și septembrie. E poate fi depozitată până în luna martie a anului următor. Ceapa de iarnă, mai zemoasă și mai puțin iute, este semănată în august, devine adultă numai în primăvara următoare și poate fi recoltată în luna iunie, însă nu poate fi depozitată pentru o perioadă de timp îndelungată.

În bucătărie este folosită ca și condiment. În medicină, împreună cu usturoiul, ajută la restabilirea și normalizarea circulației sanguine. Are o acțiune antimicrobiană, reglează metabolismul și mai ales a lipidele, stimulează sistemulu imunitar, ajută la combaterea răcelii.

Aliment apreciat în antichitate pentru virtuțile sale terapeutice (Dioscoride, Pliniu…), tonice și antiinfecțioase, ceapa este un factor de sănătate și de longevitate.

De semnalat – sau de reamintit – ceapa albă (dulce) de Tournon, în Ardèche, una dintre "capitalele" acestei legume-condiment-medicament, cu târgurile ei anuale speciale, ca și marile cepe trandafirii de Toulouges

.

Fig. 3.1 Bulbi de Allium cepa L. după recoltare

În cazul culturii de toamnă, primavara timpuriu se poate recolta sub forma de ceapă verde. Dacă bulbii au fost plantați primavara, ceapa se lasa până în luna iulie-august, cand se scot din pământ cepele mature și se lasă să se usuce la soare câteva zile, apoi se pot păstra vreme îndelungata (3.2).

Fig. 3.2 Bulbi de Allium cepa L. (www. google.com)

Ceapa eșalotă înfloreste rar, de aceea, chiar daca este o plantă perenă, în condițiile de climă din țara noastră este tratată cel mai adesea ca o plantă de cultură anuală, cu înmultire vegetativă, prin desparțirea bulbilor (3.3).

Fig. 3.3 Infloresceță de Allium cepa L. (www. google.com)

Hibridarile naturale între aceste specii sau între ele și Allium ascalonicum L. sunt foarte rare, Hibrizii daca nu apar, sunt sterili datorită diferențelor morfologice.

Luarea în cultură a cepei a avut loc foarte de mult timp, cultivarea punandu-și amprenta asupra unor caractere ale acestei specii. Luarea în cultură se pare ca s-a realizat asemănator unor practici actuale aplicată la A. Pskemense care este colectată periodic din natură și transplantată în gradini pentru a se asigura necesarul de-a lungul anului. Domesticirea cepei s-a realizat urmarind dezvoltarea părților utilizate de om. Astfel, bulbul a fost modificat cel mai profund. Astfel au fost diversificate forma, culoarea și dimensiunile bulbului, specia rămânând bianuală. După luarea în cultură, ceapa s-a extis rapid în zonele limitrofe arealului de origine și diversificarea s-a intensificat. Asa au aparut primele populații locale unele dintre ele pastrandu-se și astăzi. Diversificare a continuat prin procese de ameliorare științifica, astfel că numarul soiurilor cunoscute este foarte mare.

Ceapa se cultiva pentru bulbi, frunze și tulpina falsă. Bulbii se folosesc pentru prepararea unei game foarte diversificate de mancaruri si condiment. În bucătărie este folosită ca și condiment. În medicină, împreună cu usturoiul, ajută la restabilirea și normalizarea circulației sanguine. Are o acțiune antimicrobiană, reglează metabolismul și mai ales a lipidelor, stimulează sistemulu imunitar, ajută la combaterea răcelii.

3.2. Particularități botanice și biologice

Majoritate speciilor de ceapa sunt normal diploide (2n=16), dar structurile cromozomiale ale celor 2 grupe sunt total diferite.

Studii genomice foarte precise în cadrul genului Allium nu sunt realizate. Se știe ca țn cadrul genului Alium apare o serie poliploidă, speciile avâd un număr cromozomial de baza 7, 8 sau 9. Cele mai multe prezintă 8 cromozomi în setul de bază (cele mai cunoscute sunt A. cepa, A. sativum, A. fistulosum, A.ascalonicum, A. scorodoprasum, A. schoenoprasum, A. porrum). În grupa cu 7 cromozomi in setul de baza se întalnesc atât forme diploide (Cele mai raspândite sunt A. stellatum, A. mily, A. narcissifolium) cât și forme tetrapolide (cele mai cunoscute A. macranthum, A. neapolitanum, A. validum). Din grupa cu numarul cromozomial de 9, sunt mai raspândite A. karatawiense și A. triquetrum.

Studiile referitoare la determinismul al genetic al caracterelor urmarite în ameliorare sunt destul de puține. Cele mai importante caractere, cum sunt capacitatea de producție, calitatea și unele însușiri de rezistentă sunt determinate poligenic cu efecte de aditivitate sau dominantă.

CAPITOLUL IV

CITOLOGIA LA Allium cepa L.

4.1 Diviziunea mitotică sau diviziune indirectă

În procesele de creștere și dezvoltare a plantelor superioare intervine diviziunea mitotică.

Diviziunea mitotică sau diviziune indirectă (cariochinetică) este tipul de diviziune celulară care asigură creșterea în lungime și grosime a organismelor pornind de la o singură celulă inițială, care poate fi celula diploidă zigotică (2n), sau o celulă mamă din meristemul primar.

Pornind de la o celulă mamă cu 2n cromozomi, rezultă două celule fiice cu același număr de cromozomi (2n), realizându-se reproducerea fidelă atât a componentelor nucleului cât și ale citoplasmei. Fazele diviziunii mitotice sunt interfaza, profaza, metafaza, anafaza, telofaza.

Interfaza deși considerată ca o fază a mitozei, interfaza este faptic intermediară între două mitoze sau o fază premergătoare pentru diviziunea mitotică. În interfază nucleul apare în general omogen cu membrană și nucleolii foarte clar conturați, vizibili la microscopul optic (fig. 4.1). Cromozomii nu se observă datorită unei puternice despiralizări. Activitatea metabolică intensă în interfază se caracterizează prin sinteza replicativă a ADN-ului (G1, S, G2), ARN-ului și a proteinelor care la sfârșitul interfazei determină o structură bicromatidică a cromozomilor.

Datorită proceselor complexe de sinteză, care duc la autoreproducerea materialului genetic, interfaza este cea mai lungă fază a mitozei.

SHAPE \* MERGEFORMAT

Fig. 4.1 Interfaza la Allium ascalonicum L.

Profaza este faza de pregătire a mitozei nucleul se mărește, iar granulele de cromatină se condensează suferind un proces de spiralizare și de formare a unor filamente lungi și subțiri care se încolăcesc sub forma unui ghem numit spirem (fig. 4.2).

Fig. 4.2. Profaza la Allium ascalonicum L.

Spiremul se condensează și se spiralizează în continuare după care începe să se scurteze, îngroașe, lărgească, și individualizeze prin fragmentarea în mai multe segmente ce individualizează cromozomi cu număr diploid (2n), care prin dizolvarea membranei nucleare, devin liberi în citoplasmă. Fiecare cromozom delimitat pe parcursul profazei este format din două cromatide răsucite una în jurul celeilalte. Centromerul apare în locul său specific, delimitând cele două brațe ale cromozomului. Membrana nucleară și nucleolii dispar treptat, odată cu apariția cromozomilor. Către sfârșitul profazei se formează fusul de diviziune format dintr-un număr de filamente egal cu numărul cromozomilor, iar nucleul nu se mai observă. Centriolii ajunși la polii celulei, fiind de natură proteică, emit formațiuni filamentoase, care se dezvoltă în sens convergent, de la un pol al celulei către celălalt și astfel se formează filamentele fusului nuclear, câte un filament pentru fiecare cromozom. În momentul în care s-a format fusul nuclear și s-a distrus membrana nucleară, s-a terminat profaza.

Metafaza începe după ce membrana nucleară dispare și permite dispersarea cromozomilor în citoplasmă, aceștia se fixează cu ajutorul centromerului pe filamentele fusului celular în regiunea mediană într-un singur plan formând placa ecuatorială sau metafazică (fig. 4.3).

Fig, 4.3 Metafaza la Allium ascalonicum L

Prin inserarea centromerului pe axul longitudinal al fusului cu cromatidele proiectate lateral, cromozomii se orientează pe placa ecuatorială.

Cromozomii sunt bine conturați, îngroșați și se colorează intens, oferind posibilități optime de a fi numărați și studiați la microscop. Cromatidele, care alcătuiesc cromozomul, rămân legate între ele prin centromer, însă părțile lor terminale devin libere. Către sfârșitul metafazei fiecare cromozom clivează longitudinal; mai întâi se separă cele două cromatide surori care rămân unite în regiunea centromerului și apoi se divide și centromerul, iar odată cu orientarea lor spre cei doi poli ai celulei se sfârșește metafaza și începe anafaza.

La începutul anafazei cele două cromatide ale fiecărui cromozom se separă și în regiunea centromerului. O cromatidă migrează spre un pol, iar cealaltă cromatidă spre celălalt pol al celulei, astfel încât la fiecare pol al celulei migrează câte un set diploid (2n) de cromozomi monocromatidici. Se separă complet în cele două cromatide doar cromozomii scurți, iar cei lungi rămân în contact un timp mai îndelungat. Anafaza se încheie în momentul când cromozomii monocromatidici au ajuns la cei doi poli ai celulei (fig. 4.4).

Fig. 4.4 Anafaza la Allium ascalonicum L.

În telofază cromozomii suferă procese opuse celor din profază, are loc dispariția fusului de diviziune, reapariția nucleolilor, refacerea membranei nucleare, iar cromozomii se regrupează într-o structură nucleară cu membrană proprie.

Cromozomii devin mai puțin denși și capătă aspectul filamentos din ce în ce mai puțin vizibil are loc despiralizarea și decondensarea (Fig. 4.5).

Fig. 4.5. Telofaza la Allium ceapă L

Din materialul genetic al cromozomilor, care au ajuns la poli, se organizează câte un nucleu fiu, după care în jurul fiecărua apare o membrană nucleară nouă și nucleol. După separare, cele două celule fiice intră în interfaza următoare în care celulele se pregătesc pentru o nouă diviziune.

Rolul genetic al mitozei este acela de a asigura reproducerea de celule cu același număr de cromozomi ca și celula mamă din care provin.

4.2. Indicele mitotic

Studiul mitozei permite calcularea indicelui mitotic (Im), care indică procentul de celule aflate în diviziune față de numărul total al celulelor. Se calculează după relația:

Nm x 100

Im% =

Nt

NP x 100

IP % =

Nm

NM x 100

IM % =

Nm

NA x 100

IA % =

Nm

NT x 100

IT % =

Nm

CAPITOLUL V

MATERIAL ȘI METODA DE LUCRU

5.1. Materialul biologic, condițiile de creștere și tratamentul cu metale grele (cupru)

Pentru realizarea experimentului au fost aleși bulbi de ceapă eșalotă (Allium cepa) de mărime egală, de la populații locale din zona de vest a României (Altringen) județul Timiș, (Secusigiu) județul Arad.

Experimentul s-a realizat în două folosindu-se:

– bulbii de ceapă care au fost crescuți direct în soluțiile cu metale grele (cupru) (V2-V4);

5.1.1. Variantele experimentale

V1 – control apă;

V2 – 0/5 ml/l;

V3 – 1 ml/l;

V4 – 2 ml/l.

5.1.2 Obiectivele urmărite

stabilirea formării rădăcinilor de ceapă în metale grele (cobalt);

stabilirea dinamicii de creștere a rădăcinilor în prezența metale grele (cobalt);

stabilirea formării frunzelor de ceapă în metale grele (cobalt);

stabilirea modificărilor induse de metale grele (cobalt) asupra diviziunii celulare;

Fig. 5.1.2.a Bulbi de Allium cepa L. in solutie cu

metale grele (cobalt) in primele zile ale experimentului (original)

Fig. 5.1.2.b Bulbi de Allium cepa L.populatia de Cărpiniș (Timiș)

in perioada I de observație (original)

Punerea în evidență a fazelor mitozei s-a realizat prin colorare cu acetocarmin, folosind metodă descrisă de Butnaru și Moisuc (1979).

5.2. Metode de lucru

a. Reactivi și coloranți:

– pentru fixare: alcool : acid acetic glacial 3:1

– coloranți: CAR.

b. Prepararea reactivilor și coloranților:

Soluția fixatoare s-a obținut din amestecul a trei părți alcool de 960 sau absolut și 1 parte acid acetic glacial.

Obținerea reactivului CARR:

Solutie stoc A: 3g fluxina bazica se dizolva în alcool etilic 70% și se complecteaza pana la 100 ml. Înainte de a aduce la 100 ml cu alcool etilic 70%, este necesara agitarea susținuta, pentru dizolvarea fuxinei. Aceasta solutie se poate pastra pe o perioada nelimitata.

Solutia stoc B: se prepara mai întai solutia de fenol 5% în apa distilata (5g fenol se dizolva în apă distilata, apio se complecteaza la 100 ml cu apă distilata); 10 ml din solutia stoc A se adauga peste 90 ml din solutia de fenol 5%. Aceasta este solutia stocB, care poate fi pastrata 2 saptamani.

Solutia stoc C: peste 90 ml solutie stoc B se adauga 12 ml acid acetic glacial și 12 ml aldehida formica (37%).

Solutia de colorare (100 ml) se cantaresc 18g sorbitolui, peste care se adauga 100ml din solutia C. Se pastreaza 2 saptamani la întuneric, la temperatura camerei, apio se poate pastra pentru 2 ani la frigider.

c.Tehnica de lucru

– Pregătirea materialului:

După creșterea rădăcinilor în soluți soluțiile cu metale grele (cupru) , au fost recoltate rădăcini care au fost prelucrate în vederea observării și studierii diviziunii mitotice.

– Fixarea s-a realizat în amestec alcool – acid acetic, timpul de 24 ore la temperatură scăzută de 20-40C

– Hidroliza se face la temperatura camerei:

cu HCL 1N – timp de 5 min;

cu HCL 50% – timp (în functie de materialul vegetal; ex: la Brassica era suficent 10 min)

Dupa hidroliza radacinile sunt ținute timp de 15 min în reactivul Carr pentru scoaterea HCL din țesuturi. Datorita Hcl, colorantul capata o culoare mov-albastruie (solutia Carr nefolosita are culoarea mov)

Dupa 15 minute, se înlatura colorant adaugandu-se peste radacini solutie proaspata și se incubeaza la temperatura camerei, pentru 14-24 de ore, în vederea realizarii unei colorații optime.

Solutia folosita pentru colorare ( și care au stat radacinile la imersat 24h) se poare refolosi pentru spălarea altor radacni. Cand solutia primește acea tentă mov-albastrui se poate arunca.

Materialul poate fi ținut 5-6 zile în aceasta solutie.

Spre deosebire de rectivul Schiff, cu reactivul Carr radacina se coloreaza în totalitate, iar în zona meristematica a radacinii se evidenteaza printr o colorație mai intensa.

d. Etalarea materialului

– pe o lamă microscopică s-a pus o picătură de reactiv CARR.

– în picătură s-a pus vârful de creștere (1-2 mm).

– lama s-a încălzit la flacăra unei lămpi de spirt.

– s-a acoperit cu o lamelă.

– s-a presat lamela cu un bețișor pentru realizarea etalării.

– s-a înlăturat surplusul de colorant cu o bucată de hârtie de filtru prin presare.

Observațiile microscopice au permis calcularea indicelui mitotic (Im). Indicele mitotic (Im) reprezintă procentul celulelor aflate în diviziune față de numărul total al celulelor.

5.3. Metodele de calcul utilizate

În cercetările privind determinismul genetic, genele și acțiunile lor nu pot fi evidențiate ca atare decât prin studierea efectelor acestora, efecte ce se exteriorizează prin fenotip. Dacă genotipul prezintă totalitatea posibilităților ereditae, fie că acestea se manifestă, fie că sunt latente, fenotipul cuprinde totalitatea caracterelor și însușirilor unui organism, exteriorizate la un moment dat, în anumite condiții concrete de mediu. Ca atare, fenotipul este rezultatul interacțiunii genotipului (zestrea ereditară) cu mediul.

Variația unui caracter la mai mulți indivizi din aceeași populație are cauze ereditare (variație genotipică) sau de influență a mediului în care există acei indivizi (variație de mediu), cele două putând fi separate prin procedee de calcul.

Pentru a avea suficiente informații despre studiul făcut, trebuie calculate o serie de valori numerice, respectiv indici statistici.

Statistica are două tipuri de constante descriptive:

– de poziție, din care în această lucrare se va calcula media aritmetică;

– de dispersie: varianța și abaterea standard, coeficientul de variabilitate, abaterea standard a mediei și abaterea standard a diferenței.

În studiul distribuției frecvențelor s-a folosit media aritmetică eroarea medie (sx), varianța (s2) și coeficientul de variabilitate (s%).

Media aritmetică (x) este indicele de pozițe cel mai cunoscut și cel mai frecvent folosit, care se definește ca mijlocirea unui șir de valori. Formula generală de calcul este:

, unde: -x = media aritmetică;

= suma valorilor individuale;

n = numărul de indivizi (cazuri).

Indicii cei mai siguri de exprimare a dispersiei în jurul mediei sunt varianța și abaterea standard, deoarece ei reprezintă abaterea fiecărei variabile față de medie.

Deoarece suma abaterilor este egală cu = (Σ(x-x)=0), aceasta se ridică la pătrat (Σ(x-x)2≠0). Abaterea standard și varianța se calculează împreună, fiindcă abaterea standard (s) este rădăcina pătrată a varianței (s2).

Varianța (abaterea medie pătratică) (s2) este o măsură a dispersiei valorilor în cadrul probei, formula ei de calcul fiind:

S2 = = ,

adică raportul dintre suma pătratelor abaterilor (SPA) și gradele de libertate (GL). Gradele de libertate (GL) reprezintă numărul valorilor ce pot varia independent (liber) și este egal cu numărul de observații mai puțin una (n-1).

Ceoficientul de variație (s%, v)

Pentru a obține un termen de comparație privind mărimea variabilității în cazul diferitelor populații și caractere se procedează la calcularea și compararea coeficientului de variabilitate. Coeficientul de variabilitate nu este altceva decât abaterea standard, expresie procentuală a mediei sau simpla raportare a abaterii standard a mediei. Se calculează după formula de calcul:

S% (v) =

Abaterea standard a mediei pătratice (s) pentru șiruri statistice mici este

Sx =

Abaterea standard a mediei aritmetice (sx). se mai numește și eroarea mediei aritmetice.

CAPITOLUL VI

REZULTATE ȘI DISPBTII

6.1. Efectul cupruului asupra formării rădăcinilor la bulbul de Allium cepaL.

În cadrul populația de Allium cepa L. din Cărpiniș (Timiș) la varianta V4 Cu 100 ppm în prima perioada s-a înregistrat o medie de 0,00 ± 0,00, în perioada a doua valorile statistice au fost de 1,00 ± 0,58 urmând ca din perioada a treia sa fie de 1,67 ± 0,88, în perioada a patra sa ajunga la o valoare de 2,00 ± 0,47.

Pentru varianta V2 Cu 0,5 g/l din perioada a treia de observație s-a constatat media și abaterea standard a mediei de 2,00± 0,47, iar din în ziua a patra s-au înregistrat valori in mediei de 2,33 ± 0,27.

La varianta cu concentrația cea mai mare respectiv V4 Cu 2 g/l s-a inregistrat o valoare de 0,00 ± 0,00 pana la 2,00 ± 0,47 . Varianta martor V1 apă din prima zi s-a înregistrat o valoare medie de 2,00 ±0,45 si 3,00 ± 0,26 ( tabelul 6.1.a., fig. 6.1.a). Este evident efectul inhibator dar și stimulator al cuprului asupra dezvoltarii radacinilor de Alllium cepa L., mai ales atunci când concentrația de cupru a fost mai mare atat la populația de Carpinis

La varianta cu concentrația mai mică V2 Cu 1 g/l s-a remarcat faptul ca pe parcursul perioadei de observație apariția radacinii a fost diferită. Din prima perioadă și pînă în perioada a IV numărul de radăcini formate a variat în medie între 1,00± 0,00și 2,67 ± 0,27.

Tabelul 6.1. Dinamica formării numărului de rădăcini la Allium cepaL., în soluții cu metalelor grele (cupru) în diferite concentrații la populația de Cărpiniș (Timiș).

6.2. Efectul metalelor grele (cobalt) asupra lungimii rădăcinilor la bulbul de Allium cepa L.

Lungimea radacinilor la populația de ceapă eșalotă de Altringen (Timiș) a fost diferita atat la variantele cu diferite concentrații de cupru cat și la varianta control.

Asfel, la varianta V1-apă medie și abaterea standard a mediei lungimii radacinilor în prima perioada a fost de 0,67 ± 0,20 având un caracter ascendent în perioada a patra fiind o medie de 3,65 ± 0,15. La varianta experimentala –Co0,5 g/l se observa din prima perioada pana in perioada a patra o valoare constanta a lungimii radacinilor si doar in ultimele 3 perioade o crestere de 2,90±0,21 . La varianta –Co 1 g/l s-a înregistrat o medie și abaterea standard a mediei de 0,10 ± 0,02 incepand cu perioada a doua și care s-a menținut constantă până în perioada a patra ajungand la o valoare de 0,50 ± 0,35. La varianta V4-Co 2 g/l în primele perioade de observație creșterea în lungime a radăcinilor a fost la o valoare medie și abaterea standard a mediei de 0,09±0,00 (perioada 1), după care creșterea în lungime a rădăcinilor a fost în medie de 1,00 ±0,00 în perioada a patra (tabelul 6.2.a., fig. 6.2.a).

Pentru ambele populații analizate (Altringen și Secusigiu) influența cobaltului asupra creșterii în lungime a radacinilor a fost diferita de la cea mai mare la cea mai mica concentrație, comparativ cu varianta control apă.

Tab. 6.2. Lungimea rădăcinilor la Allium cepa L, crescute în soluții cu metalelor grele (cobalt) în diferite concentrații la populația de Cărpiniș (Timiș).

6.3. Efectul metalelor grele (cobalt ) asupra numarului de frunze la Allium cepa L.

Numărul de frunze formate la populația de Cărpiniș din Timiș a fost diferit, de la o variantă la alta. La sfarșitul perioadei de observație variantele cu concentrația mai mare de cupru (V2, V3) se observă că numarul de frunze a fost redus, comparative cu varianta V1 apă și V4-Cu 10 -4 (varianta cu concentrația cea mai mica) care au avut o medie și abaterea standard a medieie de 0,0±0,0 pana la medie și abaterea standard a mediei a de 2,00±0,00( tabelul 5.3.a., fig. 5.3.a)..

În cadrul variantei V1 apă s-a înregistrat o medie și o abatere standard a mediei de 0,0 ±0,0 în primele zile de observație iar în ziua a opta 1 ± 0,0 iar la varianta cu concentrația cea mai mica V4 care a avut medie și abaterea standard a medieia în ziua a patra de 2,00 ± 0,00, iar în ziua a opta 2,00 ± 0,00.(tabelele 6.3.a și 6.3.b)

Lungimea și lațimea a fost redusa și a variat între valori reduse pentru ambele populații analizate la toate variantele observate.

În cadrul variantei V1 apă s-a înregistrat o medie și abaterea standard a mediei de 2,00 ± 1,00 în ziua a opta, iar la varianta cu concentrația cea mai mica V4 care a avut media și abaterea standard a mediei în ziua a opta de 3,00 ± 1,00.

Lungimea și lațimea a fost redusa și a variat între valori reduse pentru ambele populații analizate la toate variantele observate.

Se poate concluziona faptul că formarea frunzelor a fost influențată de prezența cupruului atât la populația de Altringen (Timiș) cât și la populația de Secusigiu (Arad), la concentrația cea mai mare luata în observație V2-Cu 10-2 comparativ cu varianta V1-apă.

Tab. 6.3.a. Numarul frunzelor la Allium cepa L, crescute în soluții cu metalelor grele (cupru) în diferite concentrații la la populația de Cărpiniș (Timiș)

6.4. Efectul metalelor grele (cobalt ) asupra diviziunii mitotice la Allium cepa L.

Activitatea profazică este diferită în funție de variantele martor dar și de variantele Cu diferitele concentrații, după cum urmează indicele profazic are o valoare maximă diferita pentru varianta control pentru populația de Altringen (Timiș) și (54,43%) pentru populația de Secusigiu (Arad) iar pentru celelalte variante valoarea acestuia variază de la 0,0 % pentru V2- Cu 10-2 și 11,10 % pentru V3-Cu10-3 la 20,24 % pentru V2- Cu 10-4 pentru populația de Altringen (Timiș). Indicele profazic pentru pentru populația de Secusigiu (Arad) a fost diferit variind de la 0,80 % pentru varianta V2- Cu 10-2 până la 90,96 % varianta V3- Cu 10-3. Indicele metafizic cel mai mare îl are varianta control apă de (V1 0,12 % comparativ cu variantele cu metale grele (Cu), pentru populația de Altringen (Timiș) a fost de 0,47 % pentru varianta V2- Cu 10-2 și de 38,8 % în cazul variantei V3- Cu 10-3 pentru populația de Secusigiu (Arad) cea mai mică valoare îl are varianta V3- Cu 10-2 0,0 %, iar cea mai mare V2- Cu 10-2 Cu 15,75 %. Influența cupruului asupa indicelui anafazic este foarte diferită variind în funcție de concentrația și de populația analizată. Astfel, că pentru populația de Altringen (Timiș) activitatea anafazică a fost mai intensă la varianta V2- Cu 10-2 de de 9,48 % și lipsește la varianta V2- Cu 10-2 și este redusa la varianta V4- Cu 10-4 (0,94) pentru populația de Secusigiu (Arad) se remarcă varianta V2- Cu 10-2 1,37 % și V4- Cu 10-4 cu 1,30% comparativ cu V1-apă (1,19%) și V2- Cu 10-3 (0,0) (tabele 6.4, fig 6.4 ).

La fel ca și în cazul celorlalți indici se observă că indicele telofazic prezintă un minim în cazul variantei V2- Cu 10-2 cu 0,0 % și de 16,98 % pentru varianta V4- Cu 10-4 pentru populația de Altringen (Timiș). O activiate telofazică redusă a prezentat variantele V2 și V3 Cu 0,0 % pentru varianta control apă V1-apă comparativ cu variantele cu cupru la care varianta V2- Cu 10-2 la care indicele telofazic a fost 1,33 % pentru populația de Secusigiu (Arad). Valorile indicilor mitotici indică o activitate mitotică situate în limitele normale. La populația de Altringen (Timiș) la varianta cu diferite concentrații de cupru V2- Cu 10-2 0,0 V3- Cu 10-3 (5,50%) și V4- Cu 10-4 aproximativ 44,83% mitoza se desfășoară în limite normale, coparativ cu V1-apă 70,71% pentru populația de Secusigiu (Arad) se evidențiază cu o valoare maximă a Im (53,47%) la varianta V4- Cu 10-4, comparativ cu varianta apă cu o valoare de 85, 11% a indicelui mitotic.

Tabelul 6.4.a Indicii mitotici stabiliți în urma acțiunii metalelor grele (cupru) în diferite concentrații la Allium cepa L. pentru populația de Cărpiniș (Timiș) 24 ore

Fig. 6.4.a Metafază, anafază la concentrații Cu 10ppm (original 40x) Fig.6.4.Anafaza concentrații Cu 10 ppm (original 40x)

Tabelul 6.4.a Indicii mitotici stabiliți în urma acțiunii metalelor grele (cupru) în diferite concentrații la Allium cepa L. pentru populația de Cărpiniș (Timiș) 48 ore

Fig. 6.4.c Metafaza la concentrații Cu 50 ppm (original 40x) Fig. 6.4.d Anafaza la concentrații Cu 50 ppm (original40x)

Tabelul 6.4.a Indicii mitotici stabiliți în urma acțiunii metalelor grele (cupru) în diferite concentrații la Allium cepa L. pentru populația de Cărpiniș (Timiș) 72 ore

Fig. 6.4.c Metafaza la concentrații Cu 100 ppm (original 40x) Fig. 6.4.d Anafaza la concentrații Cu 100 ppm (original40x)

Bibliografie

1. Baker, A.J.M., Metal Tolerance, New Phytol., 106, 93-111,1987.

Banu, C. și colab., 1982 – Produsele alimentare și inocuitatea lor, Edit. Tehnică, București;

Beceanu, D., 2002 – Tehnologia produselor horticole, Vol. I, Edit. PIM, Iași;

Bouguerra, Mohamed Larbi, 1997 – La pollution invisible, Presses Universitaires de France, Paris;

Butnaru, Gallia, Moisuc, A., 1979. Genetică – Lucrări practice, I:A:T.

Catană, Luminița, 2002 – Posibilități de reducere a conținutului de metale grele din produsele horticole industrializate, Hortinform 7/119; 5

Cumming, J.R. and Tomsset, A.B., Metal tolerance in plants: signal transduction and acclimation mechanisms. In Biogeochemistry of Trace Metals, Eds. By Adriano, C.D., 329 – 364, 1992.

R. Ciofu și colab, 2004 – Tratat de legumicultura Editura Ceres

Denny, H.J. & Wilkins, D.A.., Cupru tolerance in Betula ssp. I. Effect of external concentration of cupru on growth and uptake. New Phytol, 106, 517 – 524, 1987.

Derache, R. și colab., 1986 – Toxicologie et sécurité des aliments, Edit. Technique et Documentation – Lavoisier, Paris;

Farago, E. Margaret, 1994 – Plants and the Chemical Elements; VCH Weinheim, Germania;

Gherghi, A. și colab., 2001 – Biochimia și fiziologia legumelor și fructelor, Edit. Academiei Române, București

Giosan, N., Săulescu, N., 1969. Principii de genetică, Editura Agrosilvică

Lee, M. Susan, 1990 – Metals in foods. A literature survey, No. 12, The British Food Manufacturing Industries Research Association, Surrey, UK;

Kalkman E.R.- 1984-Cytotaxonomic studies in the genus Allium ascalonicum L. Usefulness of C-banding for description and classification, 3- Eucarpia symp:74

Maximilian, C., Ioan, D.N., 1984. Dicționar enciclopedic de genetică, Editura Științifică și Enciclopedică.

Measnicov, M., 1998 – Poluarea cu cupru, Hortinform 8/27;

Measnicov, M., 1998 – Poluarea cu alte metale grele, Hortinform 10/74;

Meharg, A.A., The role of plasmalemma in metal tolerance in angiospermes. Physiol. Plant., 88, 191-198, 1993.

Nicolae, I., 1993. Genetică lucrări practice, Editura Academiei Universitare Bioterra.

Pamfil, C., 1980. Întrebări și răspunsuri din genetică, Editura Dacia.

Pîrvu, Teodora, 1975. Genetica – Lucrări practice, I.A.N.B București.

Petrescu, Irina, Avramescu, Alina., 2003 – Genetică- practici citogenetice, Ed. Eurobit

Petrescu, Irina, 2006 – Genetică, Editura Eurobit

Raicu, P., Anghel, I., Popescu, Constanța, Duma, Doina, Nicolaescu,

Mariuca,Taisescu, Elena, 1973. Lucrări practice de genetică, Editura Centrul de multiplicare al Universității din București

Roșca, C. și colab., 2003 – Cercetări privind influența poluării cu metale grele asupra

.Streitwieser Jr., Molecular Orbital Theory for Organic Chemists, Wiley, New York, 1961

Turner, A.P. & Dickinson, N.M., Survival of Aces pseudoplatanus L. seedlings on matalliferous soil. New Phytol. 123,509 – 521, 1993.

Van der Meer Q., P., Van Bennekom J. L.-1971- Frequencies of genetical factors determining male steility in onion (Allium ascalonicum L.) and their signifiance for the breeding of hybrids, Euphytica 20: 51-56