Universitatea de Medicină și Farmacie Târgu-Mureș [302985]

[anonimizat]. Bogdana Dorcioman

Medic primar de laborator

Masterand: [anonimizat]

2018

[anonimizat]. Bogdana Dorcioman

Medic primar de laborator

Masterand: [anonimizat]

2018

CUPRINS

CAPITOLUL 1 PARTEA GENERALĂ 6

SINDROAMELE LIMFOPROLIFERATIVE CRONICE 6

1.1 Date generale 6

1.2 Epidemiologie 6

Clasificarea sindroamelor limfoprofilerative cronice 6

1.3. Clasificarea neoplasmelor limfoide (OMS 2008) 6

1.4 Incidența 8

1.5 Diagnosticul SDR LIMFOPROLIFERATIVE CRONICE 8

1.6 Examenul citogenetic 12

1.7 Stadializare 12

1.8 Clasificarea Rai 12

1.9. Clasificarea Binet 13

1.10 Leucemia limfatica cronică (LLC) 15

1.11 Tablou clinic 15

1.12 Examen de laborator 16

CAPITOLUL 2 PARTEA SPECIALĂ ÎN LEUCEMIA LIMFATICĂ CRONICĂ 20

2.1 Scopul lucrării 20

2.2 Ipoteza de lucru 20

2.3. Metoda prelucrarii statistice 20

2.4 Material și metodă 20

2.5 Metoda 21

2.6 Tehnici 22

2.7 Principiul determinării hemoleucogramei 23

2.7.1 Realizarea frotiului din sânge capilar 24

2.7.2 Realizarea frotiului din sânge venos recoltat pe anticoagulant 24

2.7.3 Colorația May Grunwald Giemsa(MGG) 25

2.7.4 Imunofenotiparea 26

2.8. Rezultate 27

2.9. Discuții 38

CAPITOLUL 3 CONCLUZII 40

BILBLIOGRAFIE 41

[anonimizat] – limfom cu limfocite mici

B (B-[anonimizat]) lanțurilor grele de imunoglobuline (IgVH)

Ig- Imunoglobulinaregiunii variabile – (IgV)

MZ – [anonimizat]- [anonimizat] – [anonimizat] – [anonimizat] – [anonimizat]-[anonimizat] A [anonimizat]-[anonimizat] – limfomul zonei marginale splenice

MM / pcl – [anonimizat]1

TP53

BIRC3

ATM

CAPITOLUL 1 PARTEA GENERALĂ

SINDROAMELE LIMFOPROLIFERATIVE CRONICE

1.1 Date generale

Sindroamele limfoproliferative reprezintă boli neoplazice ale sistemului limfoid. Proliferarea neoplazică interesează limfocitele mature sau precursorii acestora. Limfoamele maligne reprezintă o [anonimizat].

[anonimizat] a markerilor de la suprafața celulelor și este principala tehnică de diferențiere a [anonimizat], dar cu specificitate mai redusă.

1.2 Epidemiologie

În conformitate cu World Cancer Report 2014 peste 566000 de noi cazuri de limfoame au fost diagnosticate în anul 2012 și peste 305 000 de decese. În anul 2014 neoplasmele cu celule mature B reprezenta peste 90 la sută din totalul neoplasmelor limfoide și aproximativ 400 din toate cazurile noi de cancer în fiecare an. Acestea sunt mai frecvente în țările dezvoltate, în special în America de N, Australia precum și în N și V- ul Europei. Incidența limfoamelor, mai ales acelor cu celule B, a fost în continuă creștere la nivel mondial în ultima decadă. Vârsta medie pentru toate tipurile de neoplasme cu celule mature B reprezintă a 6-a și a 7-a decadă de viață. Un factor de risc major al neoplasmelor cu celule B reprezintă anomaliile sistemului imun, în special imunodeficiențele și bolile autoimune.

Clasificarea sindroamelor limfoprofilerative cronice

1.3. Clasificarea neoplasmelor limfoide (OMS 2008)

Abordarea actuală a neoplasmelor limfoide, bazată pe caracterele morfologice, fenotipice, genetice si clinice, permite identificarea unor entități distincte. Clasificarea WHO a fost publicată prima dată în anul 2001, urmând ulterior sa fie abgradată în anul 2008.

Clasificarea WHO

Neoplasme cu celule B

Neoplazii cu precursori limfocitari B

Limfom/leucemie limfoblastică B, nespecificat

Leucemia/limfomul cu celule B limfoblastică cu anomalii gen

Neoplazii cu celule B mature

Leucemie limfatica cronica/limfomul linfocitic B

Leucemie prolimfocitară B

Limfomul splenic de zona marginală

Leucemia cu celule păroase

Limfom limfoplasmicitic/Macroglobulinemie Waldenstrom

Boala lanțurilor grele

Mielomul

Plasmocitomul( al osului sau extra-osos)

Limfoamele Malt( Limfomul extra-nodal de zona marginală asociat mucoaselor)

Limfomul nodal marginal cu cel B

Limfom cu celule din manta

Limfom folicular

Limfom difuz cu celule mari B

Limfomul mediastinala( timic ,cu celule mari B)

Limfom intravascular cu celule mari B

Limfomul ALK- pozitiv cu celule mari B

Limfomul Plasmablastic

Limfomul/ Leucemia Burkitt

Neoplazii cu celule T și NK

Neoplazii cu limfocite T precursoare

Limfom cu celule T/NK periferice

Limfomul Blastic cu celule NK

Neoplasmele mature cu celule T și NK

Leucemia prolimfocitară cu celule T

Leucemia cu limfocite T mari granulare

Leucemia cu celule NK

Sindroame limfoproliferative cu celule T și EBV pozitiv

Leucemia/ Limfomul cu celule T al adultului

Limfoamele extra-nodal

NK/T tipul nazal

Limfoamele cu celule T asociate enteropatiei

Limfomul Hepatosplenic cu celule T

Limfoame subcutanate cu celule T

Micozis fugoides

Sindormul Sezary

Limfom primar cutanat anaplastic

Limfom primar cutanat gamma delta cu celule T

Limfomul periferic cu celule T nespecificat

Limfomul cu celule T angioimunoblastic

Limfom anaplastic cu celule mari

SINDROMUL Hodgkin

Sindrom H cu predominanta nodulară

Limfomul clasic H

Forma cu scleroză nodulară

Forma bogată în limfocite

Forma cu celularitate mixtă

Forma cu depleție limfocitară

1.4 Incidența

Incidența LLC crește odată cu vârsta. 75% din cazuri sunt diagnosticate la pacienții peste 60 de ani. Ca si frecventa a bolii, LLC, este cunoscută ca fiind de 2 ori mai frecventă la bărbați versus femei. Deși cauza nu este cunoscută si demonstrata, unele cazuri par a avea o trăsătură si componentă ereditară. Este relativ mai puțin frecventă la asiatici, chiar și la imigranții din  Asia în emisfera vestică, sugerând posibilitatea unei predispoziții genetice. LLC este rară în Japonia și China și nu pare să crească incidența printre japonezii din SUA sugerând un factor genetic. LLC este mai frecventă printre evreii cu descendență din Europa de est, mai frecventă ca și formă de leucemie în țările vestice. Vârsta medie la diagnostic este de 70 de ani cu o frecvență la persoanele de sex masculin 1,7:1 fața de cel feminin. Aproximativ 30 % din cazuri au vârsta sub 65 ani. Cazurile sub 45 de ani sunt foarte rare.

Celulele neoplazice sunt limfocite mature, în peste 80% din cazuri limfocite B. Evoluția bolii este lentă. Transformarea pe parcursul evoluției într-o boală agresivă apare în 5-10% din cazuri.( Lab. Medicine,The diagnostic of disease…).

1.5 Diagnosticul SDR LIMFOPROLIFERATIVE CRONICE

Diagnosticul limfoamelor necesită biopsie ganglionară sau tisulară, examinarea citologică a sângelui, măduvei, exudatelor sau aspiratelor. Aspectul citologic și histologic depinde de tipul sindromului limfoproliferativ. Diagnosticul imunologic prin imunohistochimie sau imunofenotipare stabilește tipul celulei proliferate și indică monoclonalitatea. Clonalitatea în limfomul cu cel B este indicată de prezența unui singur tip de lanț usor K sau (Lamda). Examenele citogenetice evidențiază o serie de anomalii cromozomiale cu valoare diagnostică și prognostică.

TABEL nr.1

Markeri membranari în afecțiunile mature ale celulelor B. (CD2-)

Imunoglobulină citoplasmatică expresă (restricționată cu catenă ușoară, CD38, CD79a, CD138 și, cu o frecvență variabilă, alți markeri ai celulelor B; CD19 și CD45 sunt negativi.

Scor: (-), negativ sau pozitiv în <10% din cazuri (+/-), pozitiv în 10-25% din cazuri; (+), pozitiv în 25-75% din cazuri și (++) pozitiv în> 75% din cazuri.

Smog – imunoglobulină de suprafață. CLL – leucemie limfocitară cronică. B-PLL-B-prolymphocytic leucemie. HCL – limfomul zonei marginale splenice. FL-limfom folicular. MM / pcl, mielom multiplu / leucemie cu celule plasmatice

TABEL nr.2

Markeri imunologici în afecțiuni ale celulelor T mature. (CD2+)

Fig.1

LLC-B

1.6 Examenul citogenetic

Anomaliile citogenetice din LLC au semnificație prognostică. Del 11q și 17p sunt asociate cu scurtarea duratei de supraviețuire. Del 13q este asociată cu un prognostic favorabil.

1.7 Stadializare

LLC se prezintă sub un spectru foarte larg în ceea ce privește durata de supraviețuire. Astfel , sunt cazuri cu boală avansată, simtomatică, asociind insuficiența medulară și cu o durata de supraviețuire mai mica de doi ani, până la cazuri ce pot rămâne asimptomatice si stabile pe durată mai mare de 20 de ani. Această legătură între masa tumorală și durata de supraviețuire a determinat crearea unor sisteme de stadializare a bolii (ca bază pentru atitudinea terapeutică), dintre care două au rămas în uzul general. Sistemul de stadializare Rai a realizat în anul 1975 un sistem cu cinci stadii, ținând cont de limfocitoza, prezența sau absența adenopatiilor, splenomegaliei, anemiei și trombocitopeniei. Stadiul zero reprezintă 30%, stadiile I și II 60%, iar stadiile III și IV doar 10% din cazuri.

Două sisteme de stadializare, sistemele Rai și Binet sunt utilizate în prezent în evaluarea pacienților cu LLC, atât în ​​rutina clinica cât și în studiile clinice. Ambele sisteme se bazează exclusiv pe examenul fizic (prezența invaziei ganglionilor limfatici, splină mărită și/sau hepatice) și parametrii sanguini (prezența anemiei sau trombocitopeniei), pentru a evalua gradul încărcăturii tumorale.

1.8 Clasificarea Rai

Clasificarea Rai modificată, stratifică pacienții în 3 grupe de risc.

-Supraviețuirea pacienților cu boală cu risc scăzut, stadiul „Rai 0” au o rată a supraviețuirii medie de aproximativ 150 luni.

-Pacienții cu boală cu risc intermediar (stadiul ”Rai I-II„ supraviețuire medie 71-101 luni) au supraviețuire mai scurtă, în special atunci când alți factori adverși coexistă, cum ar fi: timpul de dublare al limfocitelor mai mic de un an.

-Pacienții cu caracteristici de risc crescut (stadiul Rai III-IV; supraviețuire medie 19 luni) au prognostic prost.

Clasificarea leucemiei limfoide cronice în cinci stadii, între 0 și IV, în funcție de numărul de plachete sangvine de globule roșii și în funcție de inflamațiile splinei, ficatului sau ganglionilor limfatici. Tabel nr.3

Tabel nr.3

Clasificare Rai

1.9. Clasificarea Binet

Clasificarea Sistemul Binet prezentată în trei stadii de la A la C în funcție de numărul de plachete sangvine și de globule roșii precum și de numărul ganglionilor limfatici din zona inghinală, axială, etc. Tabel nr.4

Tabel nr.4

Clasificarea Binet

Sistemul de stadializare Binet se bazează pe numărul de zone implicate și nivelul de hemoglobină, trombocite și similar cu sistemul de stadializare Rai, asigură corelarea semnificativă cu rezultatele clinice.

Fig.2 Limfom leucemizat, frotiu periferic

Fig.3 Limfom leucemizat, frotiu periferic

Biopsia osteomedulară evidențiază prezența determinărilor medulare.

Anomalii biochimice: LDH crescut, teste hepatice, renale alterate în unele cazuri. Determinarea Ig serie și electroforeza proteinelor serice pot evidenția prezența de proteine monoclonale și hipogamaglobulinemie. Nivelul β2 microglobulinemiei se corelează cu volumul tumoral. Anomaliile genetice sunt foarte variate și sunt corelate cu prognosticul bolii.

Diagnosticul LNH se bazează pe examenul histologic și imunohistochimic. Biopsia ganglionară este metoda preferată pentru diagnosticul limfoamelor, permițând aprecierea arhitecturii tisulare. Imunofenotiparea pe secțiuni histologice sau prin flowcitometrie în cazul prezenței de celule limfomatoase în circulație permite identificarea liniei celulare implicate în procesul de proliferare malignă.

1.10 Leucemia limfatica cronică (LLC)

LLC reprezintă cea mai frecventă formă de leucemie la adulți în țările vestice. Incidența anuală este de aproximativ 5/100.000 și crește odată cu vârsta ajungând la peste 20 cazuri/100.000 exprimat la pacienții peste 70 de ani. Există o predominanță a bolii la sexul M -B/F 2.5/ 2. LLC reprezintă 7% din totalul limfoamelor non hodgkin.

Majoritatea cazurilor sunt diagnosticate la examinări de laborator de rutină, pacienții fiind asimptomatici. LLC implică sângele, măduva osoasă și țesutul limfoid (splina, nodulii limfatici, inelul Waldeyer).

1.11 Tablou clinic

Cei mai mulți pacienți sunt asimptomatici la diagnostic și sunt diagnosticați ca urmare a constatării accidentale a limfadenopatiei și limfocitozei de etiologie incertă, ca parte a unei evaluări fără legătură cu LLC. Marea majoritate a pacienților nu au nici un simptom semnificativ legat de boală, doar unii pacienți pot prezenta oboseală ușoară sau limitări minore în activitățile de zi cu zi. Un subgrup de pacienți poate prezenta complicații infecțioase recurente, în special infecții respiratorii superioare. Pacienții cu boală avansată pot prezenta mai rar  transpirații nocturne, febra și pierdere în greutate(simptome B) semne și simptome legate de anemie, trombocitopenie și limfadenopatii. Limfadenopatia observată de obicei la pacienți cu LLC nu este, în general, fixată ​​sau sensibilă și foarte rar provoacă simptome de disfuncție organică sau determină limfedem la nivelul membrelor. Pacienții pot avea exacerbări ale limfadenopatiei în timpul unui episod acut infecțios, dar aceasta se remite de obicei, după tratarea complicațiilor infecțioase.

Adenopatiile sunt prezente în 80% din cazuri, fiind de obicei generalizate; consistența ganglionilor este variabilă de la caz la caz, putându-se întâlni ganglioni de consistenta moale, pufoasă sau ganglioni mai fermi.

Splenomegalia este identificată frecvent la pacienții cu LLC determinând hipersplenism și trombocitopenie, prezenta în 50-75% din cazuri, dominând uneori tabloul clinic.

Hepatomegalia semnificativa din cauza infitrarii leucemice este neobișnuită. Infiltrarea limfocitară în organe multiple a fost descrisă, dar aceasta este de obicei observată la pacienții cu boală avansată și va provoca ocazional simptome, întâlnita în 50% din cazuri. S-a observat că în stadiile avansate ale bolii apare paloarea și manifestările hemoragice cutaneomucoase ca expresie a anemiei, respectiv a trombocitopeniei.

Implicarea pulmonară a fost observată la pacienți cu limfocitoza marcată și în mod tipic, se prezintă ca un infiltrat interstițial pe radiografia toracică, a fost de asemenea raportata și pleurezia chiloasă și hemoragica. În mod similar, infiltrarea leucemică a tractului gastro-intestinal poate duce la  diaree cronică sau anemie prin deficit de fier secundară la sângerarea cronică sau sindromul de malabsorbție. Cu toate acestea, această infiltrare la nivelul mucoasei este mai frecvent observată la pacienții cu limfom cu celule ale  mantalei foliculare.

Implicarea Sistemul Nervos Central este rară și poate duce la cefalee, confuzie, meningism sau paralizii de nervi cranieni. Mai frecvent, acești pacienți prezintă un risc mai mare pentru infecții oportuniste la nivelul SNC datorita  sistemului lor imunitar deficitar. Pacienții prezintă în mod tipic erupții recurente, eritematoase, dureroase de obicei pe partea expusă a extremităților. Evaluarea biopsiei cutanate la acești pacienți au evidențiat o infiltrare mixta de celule T, B și eozinofile. Acestea se rezolvă în timp și pot fi în mod eficient tratate cu glucocorticoterapie.

1.12 Examen de laborator

Leucocitoza cu limfocitoza absolută este întotdeauna prezenta. IWCLL definește LLC prin prezența de limfocite maligne monoclonale >5000/µL. Anemia, trombocitopenia apar în cursul evoluției datorită infiltrației măduvei osoase și terapiei administrate. În 10-25% din cazuri TCD (testul Combs direct) pozitiv, confirmă AHAI(anemia hemolitică autoimună). Trombocitopenia și neutropenia autoimună care pot fi de asemenea prezente în LLC.

Diagnosticul LLC se bazează pe:

Examenul morfologic al sângelui periferic: limfocitele din LLC sunt limfocite mici, bine diferențiate, aparent mature, dificil de diferențiat față de limfocitele normale. Foarte caracteristică este prezența pe frotiul periferic de umbre nucleare. În 3% din cazuri, LLC se transformă în sindromul Richter, cu grad crescut de malignitate. Un alt tip de transformare este cea prolimfocitară, cu creșterea marcată a numărului de leucocite și prezența caracteristică de prolimfocite cu nucleoli proeminenți. ( Lab. Medicine,The diagnostic of disease…).

Fig.4

Frotiu periferic, LLC

Examenul imunofenotipic: profilul imunofenotipic caracteristic cuprinde expresia diminuata a Ig de suprafata IgM/IgD, CD19+,CD20+ cu expresie diminuată, CD23+, CD5+, FMC7 negativ, expresie diminuată a markerilor CD22 si CD79b.

Markerul CD19, prezent pe limfocitele B încă din primele stadii de maturație a fost evidențiat în toate cazurile cu expresie de intensitate crescută. Prezența acestui marker indică originea celulara B a neoplasmului.

CD20 este un antigen prezent de asemenea din stadii tinere de maturație pe limfocitele B. Acest nivel scăzut de expresie este considerat o caracteristică dinstinctă a celulelor LLC-B.

CD23 este o proteină transmembranară care promovează și activează proliferarea limfocitelor B normale. Are un rol important în procesul de transformare malignă în LLC-B. Pozitivitatea CD23 de intensitate moderată sau crescută este caracteristică pentru celulele LLC-B.

CD5 este un marker exprimat pe timocitele tinere, limfocitele T mature și un subset de limfocite B (B1a) implicate în producerea de autoanticorpi. Prezenta CD5 pe limfocitele maligne este un criteriu de diagnostic în LLC-B. FMC7 detectează un epitop conformațional pe molecula CD20, format atunci când expresia acestuia este de intensitate crescuta. In mod tipic în LLC-B, acesta nu reacționează cu celulele leucemice, reflectând nivelul scăzut de expresie al CD20. Detecția prin flowcitometrie a populațiilor monoclonale de celule B permite stabilirea cu exactitate a diagnosticului LLC. Limfocitele în număr absolut >5000/microlitri, exprima CD19, CD5, CD23.CD20 este slab exprimat FMC7 este negativ, Ig de suprafață slab exprimate negativ.

CD79b si CD22 slab exprimat negativ (198)

Markerul CD19, prezent pe limfocitele B înca din primele stadii de maturație a fost evidențiat în toate cazurile cu expresie de intensitate crescută. Prezența acestui marker indică originea celulară B a neoplasmului.

CD20 este un antigen prezent de asemenea din stadii tinere de maturație pe limfocitele B. Acest nivel scăzut de expresie este considerat o caracteristică dinstinctivă a celulelor LLC-B.

CD38 pe celulele leucemice a fost primul marker ce a putut fi corelat cu statusul mutațional al Ig VH. Analizele kinetice, fenotipice și funcționale indică faptul că fracțiunea CD38+ este mai activă decât componenta CD38-, celulele CD38+ coexprimând markeri de activare CD69, CD62L, KI-67. Întrucât celulele CD38 reprezintă componenta majora proliferativa, acestea sunt mai susceptibile de a dezvolta anomalii cromozomiale cu prognostic nefavorabil(130).

Tabel nr.5

Stabilirea scorului pentru diagnosticul LLC

Tabel nr.6

Înlocuirea markerului FMC7 cu CD20 în sistemul de scor a fost sugerată. Aceasta scade sensibilitatea scorului deoarece, în majoritatea cazurilor CD20 este pozitiv, slab exprimat. Acest marker trebuie inclus în panelul de markeri, din considerente terapeutice, anticorpii monoclonali anti CD20 fiind utilizați în tratamentul sindroamelor limfoproliferative cu celule B.

Un alt marker este CD200. Foarte important în diagnosticul diferențial cu alte limfoproliferări cu celule B, CD5+, ca limfomul de manta. CD200 este pozitiv în LLC și negativ în limfomul de manta.

CD38 este un marker de prognostic nefavorabil în LLC. CD38 pe celulele leucemice a fost primul marker ce a putut fi corelat cu statusul mutațional al Ig VH. Analizele kinetice, fenotipice și funcționale indică faptul că fracțiunea CD38+ este mai activă decât componenta CD38-, celulele CD38+ coexprimând markeri de activare CD69, CD62L, KI-67. Întrucât celulele CD38 reprezintă componența majoră proliferativă, acestea sunt mai susceptibile de a dezvolta anomalii cromozomiale cu prognostic nefavorabil(130). ZAP-70 se corelează cu statusul mutațional al genelor care codifică porțiunea variabilă a lanțurilor de imunoglobuline IgVH. Prezența acestui marker indică un risc crescut de progresie a bolii.

Limfoamele Non Hodgkin (LNH)

LNH sunt proliferari neoplazice, monoclonale ale limfocitelor B,T sau NK.

CAPITOLUL 2 PARTEA SPECIALĂ ÎN LEUCEMIA LIMFATICĂ CRONICĂ

2.1 Scopul lucrării

Prin prezentarea lucrarii am dorit sa testez, pe baza datelor deja existente in literatura medicala de specialitate, impotrtanta corelatiei dintre examenul citologic, citochimic si imunofenotipare in diagnosticul initial al leucemiilor limfatice cronice. Aceasta diferentiere este foarte importanta in ceea ce priveste prognosticul bolii si de mare ajutor in selectarea tratamentului.

2.2 Ipoteza de lucru

Examenul morfologic al sângelui periferic și în special examenul imunofenotipic sunt examinări esențiale în diagnosticul pozitiv și diferențial al sindroamelor limfoproliferative cronice. Stabilirea diagnosticului corect precum și diferențierea LLC-B de alte sindroame limfoproliferative sunt aspecte majore în ceea ce privește prognosticul bolii si stabilirea unui plan terapeutic corect.

2.3. Metoda prelucrarii statistice

Datele și rezultatele au fost prelucrate grafic în baza programului Microsoft Excel (Office2007) și softul SPSS. Rezultatele sunt considerate semnificativ statistic dacă p<0,05.

2.4 Material și metodă

Au fost examinati pacienti, pentru care s-au realizat îndeplinirea condițiilor de diagnosticare în leucemia limfatică cronică, anume: examinarea frotiului de sânge și imunofenotiparea.

Material

Avem în studiu un număr de 55 pacienți în Laboratorul Central de analize medicale a Spitalului Clinic Județean de Urgență TG-Mureș au fost diagnosticate 55 de cazuri cu leucemie limfatică cronică.

Proba: sânge recoltat pe anticoagulant EDTA.

Fig.5

Imagine frotiu citologic a leucemiei limfocitare cronice

Frotiurile sanguine efectuate din sânge capilar și sânge venos au fost colorate May Grunwald Giemsa conform procedurii standard și examinate cu microscop Nikon Eclipse E200.

Imunofenotiparea s-a efectuat pe citometrul FASCALIBUR, florocromii utilizați fiind următorii: FITC, PE, Per CP, APC.

Probele utilizate pentru imunofenotipare au fost din sânge periferic și maduva osoasă și recoltate pe anticoagulant EDTA.

2.5 Metoda

Pentru toate cazurile luate in studiu s-a identificat la 55 de pacienti(98,18) sindromul limfoproliferativ cu celule B. Dupa efectuarea analizelor frotiului periferic sau al aspiratului medular, s-au continuat cu secventele de investigatie propuse de Consiliul International de Standardizare in Hematologie(ISCH) pentru un diagnostic corect de leucemie limfatica cronica si anume imunofenotiparea si citometria in flux.

2.6 Tehnici

S-a efectuat hemograma din sânge venos recoltat în tuburi standarnizate cu anicoagulant EDTA. Hemogramele au fost efectuate pe analizorul automat SYMEX XT400.

1 LLC: frotiu de sange periferic, col MGG, 40X; se observa limfocite mici cu aspect morologic matur si umbre nucleare

2 limfom al zonei de manta: frotiu de sange periferic, col MGG, 100X; se observa limfocite cu aspect atipic

3 boala Sezary:frotiu de sange periferic, col MGG, 100X; limfocit atipic cu nucleu cerebriform

Fig.6 SEZARY

Fig.7

LLC

Fig.7 Limfom de manta

2.7 Principiul determinării hemoleucogramei

Principiul acestei determinări constă în măsurarea și calcularea parametrilor hematologici prin metoda de focusare hidrodinamică (DC Detection), citometrie în flux (cu laser semiconductor) și metoda spectrofotometrică cu sodiu lauril sulfat (pentru hemoglobină). Leucocitele sunt examinate prin metoda citometriei în flux cu laser semiconductor. Examinarea 4DIFF este utilizată pentru identificarea subpopulațiilor de leucocite: neutrofile, limfocite, monocite, eozinofile și bazofile.

Fig.8

2.7.1 Realizarea frotiului din sânge capilar

Frotiul de sânge, mai corect arteriolar, este realizat prin etalarea pe lamă a unei picături de sânge, obținută prin puncționarea pulpei degetului, în strat subțire în așa fel încât elementele să nu fie suprapuse pentru a putea cerceta elementele figurate după colorarea

Frotiurile efectuate din sânge nativ sunt lipsite de artefacte datorită conservării anticoagulantului, de aceea sunt cele mai indicate pentru examenul morfologic al elementelor figurate.

Tehnica întinderii frotiului

Frotiul trebuie sa fie subțire, pentru ca elementele să nu suprapună. Obținerea unui frotiu corect necesită în primul rând un material de sticla curat, bine degresat. Acesta s-a efectuat din a doua picătură de sânge, prima picătură de sânge s-a îndepărtat pentru că poate fi diluată cu fluid tisular. După recoltare frotiul trebuie colorat cat mai curând. In lamele nefixate si necolorate celulele se alterează pierzându-și afinitatea tinctoriala.

2.7.2 Realizarea frotiului din sânge venos recoltat pe anticoagulant

Frotiurile sanguine pot fi efectuate din sânge venos recoltat pe anticoagulant EDTA, anticoagulantul recomandat de Consiliul Internațional de Standardizare în Hematologie pentru laboratoarele de hematologie, deoarece conservă cel mai bine morfologia elementelor.

Locul de elecție pentru flebotomie este vena cubitală mediană sau cefalică a brațului. După dezinfecția în prealabil se puncționează vena până la umplerea tubului de recoltare ce conține anticoagulant. Tubul se răstoarnă ușor, pentru omogenizarea sângelui cu anticoagulantul, în scopul prevenirii coagulării.

Efectuarea preparatului pentru examenul citologic al frotiului sanguin presupune etalarea unei picaturi de sânge pe o lamă de sticlă și colorarea frotiului astfel încât să poată fi examinat la microscopul optic.

Colorarea frotiului de sânge

Se utilizeaza aproape exclusiv colorarea dubla cu solutia May Grunwald Giemsa(MGG) care dă unele indicatii asupra compozitiei chimice a substantei vii celulare.

Metoda de colorație panoptică May Grunwald Giemsa(MGG) indica PH-ul componentelor celulare.

Compozitia colorantului panoptic

Soluția May Grunwald:

Eozinat de albastru de metilen ––-1g

Glicerina neutră p.a. –––––-50ml

Alcool metilic p.a. –––––-100 ml

Soluția Giemsa:

Eozinat de azur de metilen.––––3gr

Azur de metilen ––––––––0,8gr

Glicerina neutră p.a.––––––250ml

Alcool metilic ––––––––200ml

2.7.3 Colorația May Grunwald Giemsa(MGG)

Colorația MGG este o colorație panoptică cu ajutorul căreia celulele sanguine se coloreaza în functie de tinctorialitatea componentelor.

Tehnica de lucru:

Fixarea frotiurilor se va efectua cât mai repede posibil după uscarea lor neforțată la aer. Frotiul sanguin așezat pe un suport special se acoperă cu soluție May Grunwald pentru 2-3 minute.

Colorarea de 15 minute cu soluție May Grunwald diluată proaspăt 1/1 cu apă distilată tamponată cu un PH 6,8.

Colorarea de 10 minute cu soluție May Grunwald proaspăt diluată 1/9 cu apă distilată tamponată cu PH 6,8.

Spălare în apa curentă, apoi 3-4 minute în apa distilată.

Uscare.

Fig.9

Imagine frotiu sanguin coloratie May Grunwald Giemsa.

2.7.4 Imunofenotiparea

Imunofenotiparea prin citometrie de flux IFCF reprezintă o metodă indispensabilă pentru diagnosticul standardizarea și monitorizarea neoplaziilor hematologice, dar totodată și monitorizarea răspunsului la tratament, a recăderii și a progresiei bolii.

Furnizarea unor informaii imunofenotipice care pot avea valoare prognostică suplimentară.

Imunofenotiparea s-a efectuat în laboratorul de biologie moleculară din cadrul Spitalului Clinic Județean de Urgență Tg-Mureș, pe citometrul FACS Calibur, Becton Dikinson.

Fluorocromii utilizați au fost:

FITC (Fluorescein isothiocyanate)

PE (Phycoerythrin)

Per CP (Perdin Chlorphyl Protein)

-Probele de sânge periferic s-au recoltat pe anticoagulant (EDTA).

Prelucrarea și analizarea au fost efectuate în ziua recoltarii. S-a folosit protocolul de lucru liza-spalare, tehnica imunofluorescenta directă.

În panel s-au utilizat combinații de trei anticorpi monoclonali:

CD3FITC/CD19PE/CD45PerCP

CD20FITC/CD5PE/CD45PerCP

FMC7FITC/CD23PE/CD19PerCP

CD22FITC/CD200PE/CD45PerCP

CD10FITC/CD38PE/CD45PerCP

CD7FITC/CD5PE/CD45PerCP

CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP

CD2FITC/CD5PE/CD45PerCP

KAPPA FITC/LAMBDA PE/CD19Per CP

2.7.4.1 Etapele de pregătire a probelor :

Se recoltează sânge periferic prin puncție venoasă în vacutainer steril cu EDTA K3. 50/100 microlitri de sânge periferic (vortexat în prealabil) se amestecă cu 10 microlitri de anticorpi monoclonali conjugați cu fluorocromi. Se vortexează și se incubează la temperatura camerei, la întuneric, 15 minute. Se adaugă 0.5militri de soluție de liza (FACS LYSING). Se vortexează și se incubează la temperatura camerei 15-20 de minute, până la liza completă a hematiilor. Spălarea celulelor: se adaugă 2 mililitri de tampon PBS și se centrifughează 5 minute la 2500 turații/minut, se îndepărtează supernatantul. Se efectuează două spălări. După îndepărtarea supernatantului se adugă o cantitate mică (150-200 microlitri) de PBS și se vortexează. Se efectuează achiziția pe citometru în flux, cu programul CELLQUEST.

2.7.4.2 Interpretarea datelor

Flow citometria permite analiza într-un timp scurt a unui număr mare de celule și evidențiază simultan mai multe antigene pe aceași celulă. Pentru imunofenotiparea limfocitelor din sângele periferic s-au achiziționat 10000 de celule. Conjugatele IgG1-FITC și IgG2-PE au fost utilizate pentru controlul negativ, cursorul fiind plasat astfel încât 95% din evenimente să fie negative.

Populația limfocitară s-a selectat utilizând expresia CD45 și SSC. În figura de mai jos, limfocitele sunt selecționate în gate-ul R3. Se observă nivelul crescut de expresie al marker-ului CD45.

2.8. Rezultate

Au fost analizați un lot de 55 de pacienți, 19 de sex feminin și 36 de sex masculin, investigați în perioada 2017-2018, la care s-a ridicat suspiciunea de SLPC distribuiți pe categorii de vârstă astfel:

31-39 de ani: 2 pacienți (3,63%);

40-49 de ani: 2 pacienți (3,63%);

50-69 de ani: 17 pacienți (30,90%);

≥70 de ani: 34 pacienți (61,81%).

Fig.10

Repartiția pacienților pe sexe

Fig.11

Raportul pacienților analizați, pe grupe de vârstă

Dintre acești pacienți,

42 au fost diagnosticați cu LLC-B (76,36%)

5 LNH sdr.de Manta (9,09%);

3 LNH zona marginală (5,45%);

1 pacient cu SLPC-T (1,81%);

pentru 4 pacienți nu s-a putut demonstra patologia limfoproliferativă (7,27%).

Fig.12

Repartiția pacienților analizați, în funcție de diagnostic

Din aceste patologii, putem concluziona că 54 de pacienti (98,18%) au fost diagnosticați cu sindromul limfoproliferativ cu celule B si 1 pacient (1,8%) cu sindromul cu celule T.

Numărul leucocitelor identificate la acesti pacienți a fost între 7,5-365,84 x 109/L și s-au repartizat astfel:

7,5-49,99 x 109/L: 40 pacienti (72,72%);

50-99,99 x 109/L: 7 pacienti (12,72%);

≥100.000 x 109/L: 7 pacienti (12,72%).

Fig.13

Repartiția pacienților în funcție de numărul leucocitelor identificate la pacienții diagniosticați cu sindromul limfoproliferativ cu celule B si dromul cu celule T

Numărul absolut de limfocitelori identificate la pacienți a fost între 2,79-327×109/L, repartizate astfel:

2,79-9,9 x 109/L: 14 pacienți (25,45%);

10-39,9 x 109/L: 25 pacienți (45,45%);

≥40 x 109/L: 16 pacienți (29,09%).

Fig.14

Repartiția pacienților în funcție de numărul limfocitelor identificate

În cazul LLC-B au fost diagnosticați 42 pacienți dintotalul de 55, reprezetând 76,36% din numarul total de pacienți avuți în evidență.

Repartiția pacienților pe categorii de vârstă poatesă fie efectuată astfel:

40-49 ani: 2 pacienti (4,76%);

50-69 ani: 15 pacienti (35,71%);

≥70 ani: 25 pacienti (59,52%).

Fig.15

Repartiția pacienților pe sexe în cazul LLC-B

Fig. 16

Repartiția pacienților diagnosticai cu LLC-B, pe categorii de vârstă

Numărul de leucocite în cazul acestor pacienți a fost cuprins între 7,5 și 365,84 x 109/L corelate din punct de vedere al vârstei și sexului astfel:

Au fost înregistrate 7 cazuri, din numărul total de 42 de cazuri (16,66%) cu leucocitoză marcată (≥100 x 109/L), dintre care 5 au fost pacienți de sex masculin (71,42%) cu vârsta cuprinsă între 50-70 de ani și 2 pacienți de sex feminin (29,58%) cu vârste de 71 de ani, respectiv 93 de ani.

În restul cazurilor studiate, numărul de leucocite a putut fi încadrat astfel:

7,5-49,99 x 109/L: 28 pacienți (66,66%);

50-99,99 x 109/L: 7 pacienți (16,66%).

Fig.17

Repartiția pacienților diagnosticati cu LLC-B în funcție de numărul de leucocite

Numărul de limfocite a acestor pacienți diagnosticați cu LLC-B a fost cuprins între 5,3-327 x 109/L, valori ≥100 x 109/L regăsindu-se pe buletinele de analize a 6 pacienți (14,28%), restul pacienților fiind repartizați astfel:

5,3-9,9 x 109/L: 8 pacienți (19,04%);

10-99,9 x 109/L: 30 pacienți (71,42%).

Fig.18

Numărul absolut de limfocite, exprimat în procente, în cazul pacienților

diagnosticați cu LLC-B

În cazul LLC-B, au fost evidențiați mai mulți markeri, după cum urmează:

CD 19: apartenența la linia limfoidă B a fost demonstrată cu acest marker, prezent într-o proporție de 50-98,7% din totalul limfocitelor.

Dubla pozitivitate CD20/CD5 a fost efectuat în toate cazurile înregistrându-se în 41 de cazuri (97,61%).

Fig.19

Dubla pozitivitate CD20/CD5

În cazul CD23, acesta a fost efectuat în toate cazurile, rezultatele fiind următoarele:

39 cazuri (92,85%) CD23 a fost pozitiv;

3 cazuri (7,14%) acesta a fost negativ.

Fig.20

Rezultate privind markerul CD23

CD200, efectuat la 30 de pacienți din numărul total de 42 (71.42%), fiind pozitiv în toate cazurile.

Fig.21

Procentul de pacienți la care s-a efectuat CD200

FMC7 a fost

pozitiv în 9 cazuri (21,42%) din numărul total de pacienți;

33 de cazuri (78,57%), a fost negativ din numărul total de pacienți;

Fig.22

Raportul, exprimat în procente, în cazul FMC7

LNH sdr. de Manta, a fost diagnosticat în 5 cazuri din numărul total de 55 de pacienți (9,09%), 2 cazuri fiind pacienți de sex feminin (40%) și 3 de sex masculin (60%), vârsta pacienților fiind între 52-85 de ani.

Numărul leucocitelor a variat între 9,6 și 30,00 x 109/L.

Numărul absolut de limfocite a variat între 2,79 si25,5 x 109/L.

în aceste cazuri au fost efectuate mai multe teste, prin care au fost evaluate următorii markeri:

CD19 a fost evidentiat fiind pozitiv în toate cele 5 cazuri diagnosticate;

CD23 a fiind negativ în toate cazurile confirmând originea B a celulelor maligne;

CD200 a fost negativ în toate cazurile diagnosticate cu LNH sdr.de Manta;

Fig.23

Rezultatele testelor cu markerii CD19, CD23, CD200

FMC7 a fost examinat în toate cazurile; pentru 4 pacienți a fost pozitiv (80%), iar într-un caz, negativ (20%); Valorile FMC7 au fost între 73-97%.

Fig.24

Rezultatele obținute în cazul FMC7

NH zona marginală:

Au fost diagnosticați cu această patologie 3 pacienți cu vârsta cuprinsă între 80-90 de ani dintre care 2 pacienți de sex masculin (66,66%) și unul de sex feminin(33,33%);

Fig.25

Raportul pe sexe în cazul pacienților diagnosticați cu LNH zona marginală

În cazul acestor pacienți, numărul leucocitelor a fost între 18,00- 42,30 x 109/L, iar numărul limfocitelor a fost între 15,9-35,8 x 109/L;

CD19 a fost exprimat pozitiv pentru toți cei 3 pacienți cu această patologie (82,00-85,00%);

CD23 a fost negativ pentru toate cele 3 cazuri;

FMC7 a fost pozitiv pentru toți pacienții (70,00-84,00%);

CD200 a fost pozitiv pentru toți pacienții (75,00-97,00%).

Fig.26

Rezultatele testelor cu markerii CD19, Cd23, FMC7, CD200

pentru LNH zona marginală

În cazul sindroamelor limfoproliferative cronice, cu celule T (Sdr.Sezary) a fost diagnosticat un singur pacient cu vârsta de 83 ani de sex feminin. Acesta a avut un număr de 18,00 x 109/L leucocite; 10,80 x 109/L limfocite.

CD5 a fost pozitiv (97,00%);

CD3 pozitiv (96,50%);

CD 4 pozitiv(95,00%);

CD 7 pozitiv(57,00%).

2.9. Discuții

În cadrul sindroamelor limfoproliferative cronice predomină formele cu proliferarea limfocitelor B.

În urma acestui studiu s-a constatat că leucemia limfatica cronică este cea mai frecventă formă de leucemie în țările vestice. Vârsta medie la diagnostic este de 70 de ani cu o frecvență mai mare la persoanele de sex masculin 1,7:1. Aproximativ 30 % din cazuri au vârsta <65 ani. Cazurile <45 de ani sunt foarte rare, incidenta creste odata cu vârsta.

Celulele neoplazice sunt limfocite mature, în peste 80% din cazuri sunt limfocite B, evoluția bolii este lentă. Transformarea pe parcursul evoluției într-o boală agresivă apare în 5-10% din cazuri. ((Michael Laposata – LaboratoryMedicine-Thediagnosis of disease in theClinicalLaboratory. second edition, Mc Graw Hill Education, 2014, p.321).

Examenul imonofenotipic este o metodă esentiala de diagnostic, însa s-au evindențiat cazuri în care CD23 a fost negativ iar FMC7 a fost exprimat pozitiv.

CD200 este foarte util în aceste cazuri de diferențiere în diagnostic.

LLC se diferențiază față de alte sindroame limfoproliferative cronice, în special de limfomul de manta, în cazul în care CD200 este negativ. Frecvența limfomului de manta și al limfomului de zona marginală au fost asemanatoare.(Limfoame Maligne, Ed:1997, Galafteon Oltean, George Simu.)In aceste cazuri a fost recomandata confirmarea diagnosticului histopatologic în completarea celui imunifenotipic. Așa cum prevede și literatura de specialitate: CD200 IS A USEFUL DIAGNOSTIC MARKER FOR IDENTIFYING ATYPICAL CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKEMIA BY FLOW CYTOMETRY Original article ( Y.S. Ting, S.A.B.C. Smith , D.A.Brown, A.J. Dodds, K.C. Fay, D.D.F.Ma, S. Milliken, J.J. Moore,W. A. Sewell. Firstpublished: 27 May 2018.)

Sindroamele proliferative cu celule T sunt forme rare de leucemie. Examenul imunofenotipic a evidențiat prezența markerilor de celule T, evidențierea morfologiei caracteristice a limfomului limfoproliferativ pe frotiul periferic fiind esențial pentru diagnostic(limfocitelor cu nucleu cerebriform).

În cazurile cu morfologie caracteristica a fost evidențiat un fenotip tipic pentru LLC CD23 pozitiv, dubla pozitivitate 20 cu 5 FMC7 pozitiv, CD200 pozitiv. În cazul limfomului de manta și al limfomului de zona marginală morfologia atipica limfocitelor din sângele periferic a ridicat suspiciunea de sindrom limfoproliferativ cronic altul decât leucemia limfatică cronică.

CAPITOLUL 3 CONCLUZII

Referitor la aceasta lucrare, pe baza analizei statistice, s-a observat și demonstrat că incidența în leucemia limfatică cronică crește odată cu vârsta precum și faptul că este de două ori mai frecventă la barbați față de femei, predominând aparteneța liniei limfocitare B deși, cauza nu este cunoscută până în prezent.

Prognosticul individual al pacientilor cu limfoproliferări cronice maligne, variază foarte mult. Gradul de malignitate și stadiul clinic stau la baza stabilirii prognosticului printre care și expresia anumitor antigene de suprafață pe celulele tumorale ce pot oferi informații importante în prognosticul independent, iar markerul CD200 este foarte important în diferențierea leucemiei limfatice cronice.

S-a observat că imunofenotiparea prin citometrie în flux este o metodă care permite analiza multiparametrică a caracteristicilor fizice și biologice ale celulelor având la bază folosirea anticorpilor monoclonali care se fixează pe antigenele corespunzătoare permițând astfel identificarea marcherilor de suprafața și a unor antigene, procedura indispensabilă pentru diagnosticarea, clasificarea și stadializarea bolii.

BILBLIOGRAFIE

Galafteon Oltean, George Simu, Limfoame Maligne, Ed.1997

Ljubomir Petrov, Andrei Cucuianu, Anca Ghiurtz, Manual de hematologie clinică, Ediția 1997.

Ljubomir Petrov, Andrei Cucuianu, Anca Ghiurtz, Manual de hematologie clinică, Ediția aV-a 1997.

Maria Titeica, Speranta Halunga-Marinescu, Practica Laboratorului Clinic, editura Academiei 1984.

Michael Laposata – LaboratoryMedicine-Thediagnosis of disease in theClinicalLaboratory. second edition, Mc Graw Hill Education, 2014, p.321

Original article ( Y.S. Ting, S.A.B.C. Smith , D.A.Brown, A.J. Dodds, K.C. Fay, D.D.F.Ma, S. Milliken, J.J. Moore,W. A. Sewell. Firstpublished: 27 May 2018

Robert S Hillman,Kennetth A Ault., Michael Leporrier, Henry M. Rinderet all,Hemology in Clinical Practice, Mc Graw in Education, 2011, p. 280-283

Dacie and Lewis, Practicalhematology,2012 (hematology, Basic Principlesand Practice, Ed. 6, 2013)

Steve H. Swerdlow, Elias Campo, Nancy Lee Harris andall,WHO Classification of Tumours of HaematopoieticandLympfoidTissues, International Agency for Research on Cancer ( IARC) , Ediția 4-2017, p. 196-197.

www.bendo.ro/leucemie-limfatica-cronica

www.esanatos.com/ghid-medical

https://www.synevo.ro/imunofenotipare-limfocitara-profil-de-baza/

https://doi.org/10.1111/ijlh.12857

https://clinicaoncologieseverin.ro/ro/despre-cancer/tipuri-de-cancer-pentru-medici/leucemia-limfatica-cronicallc/