​ UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ Ș I FARMACIE “VICTOR BABE Ș ” DIN TIMI Ș OARA FACULTATEA DE MEDICINĂ Departamentul de Medicină Generală Disciplina de… [606016]

​ UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ Ș I FARMACIE
“VICTOR BABE Ș ” DIN TIMI Ș OARA

FACULTATEA DE MEDICINĂ
Departamentul de Medicină Generală
Disciplina de Imunologie

​ PETRI Ș OR ANDREEA FELICIA

​ LUCRARE DE LIC EN Ț Ă

Conducător Ș tiin ț ific
PROF.DR. BOJIN FLORINA

Timi ș oara
2018

​ UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ Ș I FARMACIE
“VICTOR BABE Ș ” DIN TIMI Ș OARA

FACULTATEA DE MEDICINĂ
Departamentul de Medicină Generală
Disciplina de Imunologie

​ PETRI Ș OR ANDREEA FELICIA

​ LUCRARE DE LICEN Ț Ă
MODIFICAREA LIMFOCITELOR T ÎN VEDEREA INDUCERII
UNUI RĂSPUNS ANTI-TUMORAL SPECIFIC

Conducător Ș tiin ț ific
PROF.DR. BOJIN FLORINA

Timi ș oara
2018
1

CUPRINS

LISTA DE ABREVIERI Ș I SIMBOLURI………………………………………………………………3
MUL Ț UMIRI…………………………………………………………………………………………….4
PARTEA I. ​ NO Ț IUNI GENERALE………………………………………………………………….5
1. SCURT ISTORIC. IPOTEZE……………………………………………………………………5
2. CERCETĂRIILE ACTUALE………………………………………………………………….7
2.1 “HALLMARKS OF CANCER”……………………………………………………………..7
3. CANCERUL Ș I SUPRAVEGHEREA IMUNĂ……………………………………………….10
3.1 IMUNOGENITATEA TUMORALĂ……………………………………………………….10
4. IMUNITATEA TUMORALĂ……………………………………………………………………14
PARTEA II
​ 5. Caracterizarea morfo-funcțională a fibroblastelor peri-tumorale (TAF) obținute din tumori
solide
5.1. Identificarea markerilor imunofenotipici caracteristici fibroblastelor peri-tumorale..17
5.1.1. Imunocitochimie………………………………………………………………………..17
5.1.1.1. Metoda de lucru………………………………………………………………………17
5.1.1.2. Rezultate………………………………………………………………………………18
5.1.2. Imunofenotipare prin flow-citometrie…………………………………………………22
5.1.2.1. Metoda de lucru………………………………………………………………………22
5.1.2.2. Rezultate………………………………………………………………………………23
6. Evaluarea celulelor mononucleare obținute din sângele periferic al pacienților cu tumori
solide…………………………………………………………………………………………….33
6.1. Izolarea mononuclearelor din sânge periferic………………………………………….33
6.2. Caracterizarea flowcitometrică a populațiilor limfocitare izolate……………………..33
7. Identificarea și izolarea clonelor de limfocite T citotoxice active funcțional împotriva
antigenelor din micromediul tumoral………………………………………………………….35
7.1. Tipizarea HLA a sângelui periferic a pacienților cu tumori solide…………………….35
7.2. Tehnologia streptamerilor ca metodă de izolare ​ in vitro ​ a limfocitelor T citotoxice…37
7.2.1. Materiale, reactivi. Metoda de lucru……………………………………………………37
7.2.2. Rezultate………………………………………………………………………………….39
Concluzii…………………………………………………………………………………………40
Bibliografie………………………………………………………………………………………41

2

LISTA DE ABREVIERI Ș I SIMBOLURI

ADN- acid deoxiribonucleic
RB-gena retinoblastomului
TP53- tumor protein p53
Bcl-2-B cell lymphoma type 2
Bcl-xL- B cell lymphoma extra large
Igf- insulin-like growth factor
VEGF- factorul endotelial vascular de cre ș tere
TSP-1-trombospondin type 1
MHC- major histocompatibility complex
MICA- polypeptide related sequence A
MICB- polypetide related sequence B
NKG2D- natural killer group 2D
Cel NK- celula natural killer
IFN-y- interferonul gamma
HSP-70- 70 kilodalton heat shock proteins
HMGB1- high mobility group box 1 protein
TLR- toll-like receptor
IL-12- interleukina 12
IL-10-interleukina 10
TGF-ß- factorul transformator de crestere beta
TSTA- tumor specific transplantation antigens
TATA-tumor associated transplantation antigens
Cel Treg-celula T reglatoare
CCL12- chemokine ligand type 12
CCR4-chemokine receptor type 4
RLO- radicali liberi de oxigen
IDO- indolamin 2,3 dioxigenaza
PDL-1- programmed cell death ligand
CTLA-4- cytotoxic T-lymphocyte antigen 4

3

MUL Ț UMIRI

4

PARTEA I.
I.NO Ț IUNI GENERALE
​ 1. SCURT ISTORIC. IPOTEZE

Termenul de „cancer” provine din cuvantul latin ​ cancrum ​ ș i din grecescul ​ karkinos ​ , ace ș ti
termeni fiind pentru prima dată utiliza ț i de părintele medicinei, Hipocrate. Cuvintele fac referire
la animalul crab, realizându-se o analogie între membrele animalului ș i modul de extindere a
tumorii.
În secolul I Galen propune termenul de “ ​ oncos ​ ”, fiind denumirea grecească pentru umflatură.
Cancerul pare la o primă vedere boala omului modern, având în vedere prevalen ț a crescută în
ț ăriile bine dezvoltate, da r termenul de „cancer” este men ț ionat înca din anii 3000-1500 î. e.n,
fiind descoperit pentru prima data la mumiile egiptene.
Se poate observa de-a lungul istoriei că în ciuda îmbunătă ț iriilor care au aparut în domeniul
medical, descoperiri care au dus la cre ș terea speran ț ei de via ț ă, prevalen ț a cancerului continuă să
crească din ce în ce mai mult.
Spre exemplu, Societatea Americană împotriva cancerului a declarat ca în anul 2008 la nivel
mondial s-au înregistrat 12,7 milioane de cazuri noi de cancer, dintre care 7,6 milioane au
decedat.
În trecut decesele apareau din cauza unei îngrijiri medicale insuficiente, dar în prezent cu toate
posibilita ț iile medicale de care dispunem popula ț ia continuă să fie decimată de epidemia
secolului nostru “cancerul”. Mai mult, speciali ș tii speculează că până în anul 2030, ca urmare a
cre ș terii speran ț ei de via ț ă, se vor înregistra anual 21,4 milioane de cazuri noi de cancer, dintre
care 13,2 milioane de mor ț i din cauza cancerului.(0)
În urma numeroaselor cercetări ș tiin ț ifice, care aveau ca tema com ună “ce este cancerul? Ș i de ce
apare el?”, oamenii de ș tiin ț ă au ajuns la concluzia că la baza tutu ror cancerelor stă cre ș terea
necontrolată a unei singure celule.
La ora actuală cercetăriile se focusează pe organele ș i tesuturile cu un turnover celular crescut,
cum sunt intestinul sub ț ire ș i elementele hematopoetice, încercan d să se găsească o legatură între
cre ș terea proliferării celu lare ș i apari ț ia neoplasmelor.
5

Pentru o bună func ț ionare organismul are nevoie atât de diviziune celulară, care ne ajută să
cre ș tem, să ne adaptăm, s ă ne refacem dupa traumatisme ș i să trăim, cât ș i de apoptoza celulară,
care elimină din organism acele celule îmbătrânite de care nu mai avem trebuin ț ă.
În celula canceroasă mecanismul de apoptoză este eradicat din cauza unor muta ț ii care apar în
structura ADN-ului, astfel încat apare o cre ș tere celulară necontrolată.
Celulele neoplazice, sunt celule independente, care cresc ș i se adaptează oricărui mediu. Ele nu
mai raspund controlului homeostatic. A ș a se explică de ce organismul nu reu ș e ș te să înlăture
agentul perturbator, care în cazul acesta este celula canceroasă.
Carcinogeneza, reprezinta procesul de apari ț ie ș i dezvoltare a neoplasmului. Principalul
mecanism de apari ț ie a ce lulei neoplazice fiind muta ț iile succesive, care apar la nivelul celulei
somatice normale având drept consecin ț ă cre ș terea proliferării ș i reducerea diferen ț ieri ș i a
apoptozei celulare. Proliferarea rapidă a celulelor duce în timp la pierderea caracterului matur a
acestora ș i înlocuirea cu u n fenotip de tip imatur.(1)
La adult se gasesc la nivelul unor organe “rezerve” de celule stem cu capacitate de diviziune ș i
proliferare, care se activează în cazul unei injurii; restul celulelor pierzându- ș i această
proprietate.
Ipoteza celulei stem canceroase s-a formulat în urma unor studii pe modele murine. În urma unor
experimente s-a demonstrat că celulele mieloide leucemice pot produce boala la ș oareci, numai
dacă de ț in fenotipul celul elor stem hematopoetice CD34+CD38- ș i sunt apte de
auto-reînnoire.(2)(3)(4)
Durata lungă de via ț ă a ce lulelor stem, diviziunea asimetrică pe care o realizează, dând na ș tere
unei alte celule stem-self renewal-pe de-o parte ș i la al ț i progenitori diferen ț ia ț i, pe de altă parte;
rezistă la apoptoză, au o abilitate crescută de reparare a ADN-ului. Toate aceste caracteristici
expun celulele stem la ac ț iunea factorilor de agresiune rezultând multiple muta ț ii.(5)(6)(7)(8).
Se ș tie că terapia tradi ț ională administrată în cancer, ț inte ș te specific celula canceroasă, astfel se
pot explica e ș ecurile care apar în tratamentul anti-tumoral sau chiar recidivele ș i apari ț ia
metastazelor. Deoarece, celulele stem canceroase se afla într-o stare dormantă, acestea nu pot fi
afectate de agentii farmacologici, astfel nu se poate vorbii de eradicare tumorală(9).

6

2. CERCETĂRIILE ACTUALE

2.1”HALLMARKS OF CANCER “
În anul 2000, cercetătorii Hannahan ș i Weinberg publică 6 caracteristici pe care orice celulă
neoplazică ar trebui să le îndeplinească (Figura):
-men ț inerea semnalului p roliferativ
-autonomie fa ț ă de semna lele de cre ș tere anti-celulară
-rezisten ț ă la apoptoză
-replicare continuă
-angiogeneză
-invazie ș i metastazare la distan ț ă(Figura).

​ Figura “Hallmarks of cancer”
7

Mai târziu, au fost adaugate încă două elemente caracteristice: scăparea de sub controlul
sistemului imun ș i resetar ea metabolismului energetic.
“Hallmarks of cancer” permit celulelor tumorale să supravie ț uiască, să prolifereze ș i să
disemineze.
În procesul de tumorigeneză caracteristicile neoplazice sunt câ ș tigate/dobândite prin mecanisme
si în momente evolutive diferite.
Principalele mecanisme sunt:
-instalarea instabilita ț ii genomice
-starea inflamatorie premaligna, deoarece celulele inflamatorii pun la dispozi ț ia micromediului
tumoral molecule bioactive, precum factori de crestere care sus ț in proliferarea celulelor maligne;
apar modifcări enzimatice; angiogeneză ; invazie ș i metastazare.
Se discută implicarea micromediului tumoral în procesul de tumorigeneză. Acesta ac ț ionează în
mare parte prin intermediul genelor supresoare, a căror rol primoridial este de a inhiba cre ș tera ș i
proliferarea celulara.
Exemple de astfel de supresoare tumorale sunt RB ș i TP53. În neoplazie aceste gene supresoare
sunt inactivate.
Factorii apoptotici sunt înlocui ț i cu factori regaltori anti-apototici (Bcl-2, Bcl-xL, Igf).
Pentru a ajunge la stadiul de tumoră macroscopică, celulele canceroase au nevoie de un poten ț ial
replicativ nelimitat. În mod normal, celulele au un număr limitat de replicări. Se crede că
telomerii, care protejează cromozomii, sunt cei implica ț i în proliferarea nelimitată. La celula
non-malignă, telomerii se scurtează cu fiecare diviziune, ajungând într-un final să- ș i piardă
capacitatea de protec ț ie a cromozomiilor, ceea ce duce implicit la moartea celulară.
În ț esuturile tumorale sun t supra-exprimate genele VEGF ș i TSP-1, deoarece acestea contribuie
la procesul de angiogeneză.
Angiogeneza este esentială pentru cre ș terea ș i dezvoltarea ț esutul malign, oferind suport nutritiv
ș i oxigen, dar ș i pentru evacuarea resturilor metabolice ș i a dioxidului de carbon, la fel ca într-un
ț esut normal(hallmarks).
8

Invazia ș i metastazarea ar e loc prin reducerea sau inactivarea muta ț ională a E-caderinei, care
realizează adeziunea celulară (Figura).

Figura: “Hallmarks of cancer” asociat cu reac ț iile biologice

9

3 ​ . ​ CANCERUL SI SUPRAVEGHEREA IMUNA

Sistemul imun reprezintă o re ț ea anatomică ș i func ț ională compusă atât din celule, cât ș i din
ț esuturi, care interac ț ionează în vederea protejării organismului de agresiunile biologice externe,
precum: virusuri, bacterii, parazi ț i.
Înca din secolul XIX cercetătorii au pus sub semnul întrebării legătura dintre sistemul imun ș i
cancerigeneză. Primul care a realizat că, anticorpii au capacitatea sa anihileze atat microbi, cat ș i
celulele neoplazice, a fost cercetătorul german Paul Ehrlich. Acesta a denumit fenomenul
„glon ț ul magic”, facând o analogie între glon ț , care merge direct la ț intă ș i anticorpii
organismului, care ac ț ionează specific asupra agentului infec ț ios sau asupra celulei canceroase.
Teoria supravegherii imune sus ț ine că sistemul imun, veghează permanent asupra
organismului,pentru a depista eventualele celule tumorale, iar majoritatea acestor celule o dată
detectate sunt lizate înainte de a produce tumori manifeste clinic. Drept pentru care, cancerul
clinic manifest apare datorită scăparii celulelor neoplazice,de ac ț iunea mecanismelor protectoare.
Această teorie ar putea explica inciden ț a crescută a neoplaziilor în rândul popula ț iei vârstnice,
deoarece o dată cu vârsta sistemul imun nu mai este competent 100%. La fel se poate explica ș i
frecven ț a crescută a tumo rilor la persoanele imunocompromise.
Totu ș i, mai exista încă o explica ț ie, care ar putea justifica apari ț ia cancerului la vârstele extreme,
mai ales la vârste mici, sunt anomaliile celulare apărute în urma diviziuniilor repetate, iar la
vârstele înaintate ar putea fi factorii carcionogenici acumula ț i de-a lungul vie ț ii.
Prin urmare, dereglarea apărării imune, nu ar putea justifica de una singura apari ț ia numai a
anumitor tipuri de cancere la diferite vârste, fapt valabil ș i pentru cei imunodeprima ț i.
Să demonstrezi autenticitatea teoriei supravegherii imune este greu de realizat. Într-adevăr există
câteva date care sus ț in această teorie, dar nu o pot garanta, cum sunt tumorile asimptomatice
descoperite la pacien ț i post-mortem, care ar putea sugera implicarea sistemului imunitar.
Studiile ne demonstrează că sistemul imun nu este pe deplin capabil sa inhibe proliferarea
tumorală ș i mai ales, sa lizeze celulele maligne. Dar, cu toate acestea ș tiim că există un raspuns
imun la contactul cu antigenele tumorale.
Pe această imunogenitate se bazeaza ș i imunoterapia din cancer. Teoria duala stă la baza
imunoterapiei, deoarece conform acestei teorii, celula tumorală are o expresie antigenică diferită
de celula normală , astfel încât sistemul imun o poate identifica ș i anihila, dar totodată acest
profil antigenic favorizează ș i progresia tumorală.(10)
Această teorie duală se mai nume ș te ș i teoria imunoeditării tumor ale.(11)(12)
Etapele imunoeditării tumorale sunt reprezentate de a ș a-zi ș ii „cei 3 „E”:(12)(13)(14)
– ​ Eliminarea ​ : constituie prima etapă, dar ș i cea mai importantă, implicând atât mecanismele
imunită ț ii înnăscute, cât ș i cele adaptative. În această etapă sistemul imun recunoaste ș i distruge
celulele tumorale înainte ca acestea sa se exprime clinic.
10

Specific fenotipului malign este instabilitatea genică, care determină apari ț ia de antigene
tumoral-specifice. A ș a cum bine se cunoa ș te, muta ț ia este cea mai comună alterare genetică care
poate să apară în cancer, aceasta se datorează, în principal, defectelor de reparare a ADN-ului în
celulele tumorale. Toate aceste modificări fac ca celula tumorală să apară drept o celulă
anormală, element fundamental în stimularea imună.
În cursul imunită ț ii înnas cute, celulele afectate vor prezenta la suprafa ț a lor molecule MHC clasa
I MICA ș i MICB ș i proteinele UL16, care constituie liganzi NKG2D. Aceste molecule
declan ș ează activarea celulelor NK ș i a limfocitelor T CD8+. Celulele NK ș i limfocitele T CD8+
inhibă cre ș tera tumorală prin intermediul secre ț iei de IFN-y ș i prin mecanism citotoxic. În plus ,
se mai eliberează ș i ni ș te molecule (HSP-70, HMGB1) ,care ac ț ionează prin intermediul
receptorului TLR, activând macrofagele ș i celulele dendritice cu eliberare de IL-12.(15)(16)

Figura: Fazele imunoeditarii cancerului

11

În ceea ce prive ș te răspunsul imun adaptativ, aici intervin celulele dendritice, care preiau ș i
procesează antigenele celulelor tumorale, migrând către nodulii limfatici regionali. Prezentarea
antigenului asociat cu moleculele MHC clasa I ș i II declan ș ează activarea celulelor limfatice B ș i
T. Citokinele TGF-β, VEGF, IL-10 sunt secretate de celulele stromale, acestea ac ț ionează
supresiv asupra celulelor dendritice ș i cresc activitatea celulelor T reglatoare(17).
O infiltrare tumorală cu limfocite T se asociază cu un prognostic favorabil, o speran ț ă la via ț ă
mai mare ș i un procent mic de metastaze timpurii. Ceea ce ne demonstrează că Limfocitele T
joaca un rol important în apărarea anti-tumorală.
Dar, există ș i o parte negativă în apărarea imuna adaptativă, în sensul că poate favoriza
tumorigeneza, daca vorbim de existen ț a unei inflama ț ii cronice. Un exemplu de acest gen este
cancerul hepatic, care se poate forma pe fondul unei infec ț ii cu virus hepatitic B fapt demonstrat
în urma unor experimente pe modele murine(18).
– ​ Echilibrarea ​ – în această fază sistemul imun împiedică dezvoltarea tumorii. Este o etapă de
lungă durată, care are două posibile urmări: sistemul imun poate să reu ș ească să elimine celulele
tumorale, sau, din contră: se poate ajunge la o modificare fenotipică a tumorii, dobândind
rezisten ț ă împotriva meca nismelor imune(19)(20).
– ​ Eludarea ​ -în această etapă mecanismele imune nu mai au nici un control asupra tumorii.
Tumora progresează, apar simptomele ș i manifestariile clinice.

3.1 Imunogenitatea tumorală
Probabil întrebarea pe care toată lumea ș i-o pune este „dacă tumorile sunt imunogenice, de ce
sistemul nostru imun nu reu ș e ș te de unul singur să înlăture o form a ț iune tumorală?”
După cum vom vedea în cele ce urmează, sistemul imun natural de supraveghere joacă un rol
minor în preven ț ia cancer ului.
Neoplasmele au dezvoltat un fenomen numit ​ toleran ț ă imună. Celula tumorală împreună cu
micromediul tumoral operează sincron pentru a se autoproteja fa ț ă de sistemul imun al gazdei,
prin:

a) ​ Mecanisme de supravie ț uire a celulei tumorale.

1. ​ Produc ț ia de citokine im unosupresoare:
Factorul transformant de crestere β-TGFβ, IL-10, factorul endotelial vascular de cre ș tere-VEGF,
sunt câteva din citokinele imunosupresive secretate de tumori.
Aceste citokine au efecte precum:
-inhibarea maturarii celulelor T
-inhibarea procesului de prezentare antigenice
-induc ț ia anergiei celulelo r T
12

-supresia produc ț iei de ac tivatori ai citokinelor

2. ​ Lipsa exprimării moleculelor MHC pe suprafa ț a celulelor tumorale:
Celulele canceroase au capacitatea de a- ș i inhiba expresia moleculelor MHC de pe suprafa ț a lor.
Acesta fiind un mecanism de scăpare de sub controlul limfocitelor T CD8+, rezultând o evadare
tumoarală.
Această „evadare” poate fi datorată unor alterari de secven ț ă a proteinelor MHC de clasa I,
precum ș i datorită defecte lor care pot să apară în mecanismele de procesare a antigenelor.

3. ​ Pierderea sau reducerea expresiei antigenelor asociate tumoral:
În urma muta ț iilor gene tice, care apar la nivelul celulelor neoplazice, tumorile exprimă la
suprafa ț a lor neo-antige ne (care sunt caracteristice doar celulelor tumorale) sau antigene
pre-existente modificate. Două astfel de antigene sunt: TSTA ș i TATA.
TATA sunt antigene care se găsesc atât la nivelul celulei normale, cât ș i pe suprafa ț a celulelor
tumorale, fiind supraexprimate la nivelul celor din urmă.
TSTA sunt definitorii pentru celulele tumorale, ne fiind exprimate de celulele normale.
Dar, cum am mai subliniat, celulele canceroase de ț in mecanisme de scăpare de sub controlul
sistemului imun, acestea reu ș esc să se sustragă ac ț iunii imune prin neexprimarea la suprafa ț a
celulei a antigenelor specific-tumorale. Sunt suficiente doar câteva celule, care să- ș i poate
suprima expresia de antigene, pentru ca respectiva tumoră să fie omisă de sistemul imun. Iar prin
diviziune această abilitate este transmisă ș i progenitorilor, în final rezultând clone celulare ce nu
pot fi depistate de mecanisme imune.

4. ​ Suprimarea apoptozei;
Cel mai comun mecanism este prin supraexpresia genelor antiapoptotice, precum Bcl-2 ș i v-Rel.
Mai mult decat atât, ligandul Fas, care se găse ș te pe suprafa ț a unor celule tumorale poate
provoca apoptoza limfocitelor-tumoral specifice. Astfel, celulele tumorale pot fi lizate prin
intermediul caii caspazelor, care se activează în urma interac ț iunii moleculei Fas-ligand de pe
suprafa ț a celulelor LT-C D8+ cu molecula Fas de pe suprafa ț a celulelor tumorale. Dar a ș a cum
bine ș tiim, celulele tumo rale se adaptează mai bine ca noi, prin urmare unele dintre ele pot
exprima c-Flip, această moleculă inhibând activită ț iile citotoxice ale LT-CD8+.(21)

5. ​ Func ț ia celulelor T reg latorii (Treg):
Nu se cunoa ș te exact prin ce mecanism celulele Treg ajung să fie supraexprimate în cancer. Ceea
ce se cunoa ș te, de pe urma unor studii clinice, este că celulele Treg sunt crescute în sangele
periferic ș i peritumoral la pacien ț ii cu cancer. Aceste celulele au poten ț ialul de a realiza supresia
13

celulelor T prin eliberare de citokine inhibitorii (IL-10,TGF-β), dar ș i prin contact direct cu
celulele T efectoare.
Un număr crescut de limfocite Treg în neoplasmul gastric, ovarian ș i cancerul de sân este
considerat un prognostic negativ. Acumularea Treg este posibilă prin interac ț iunea CCL12,
secretat de celulele maligne, cu receptorul CCR4.(22)(23)
Treg ar putea fi o ț intă terapeutică, dacă efectul său s-ar restric ț iona doar la nivel tumoral ș i nu ar
activa mecanisme autoimune în alte organe(10)(24)(25).

b) ​ Mecanisme ale microclimatului tumoral

Micromediul tumoral joacă un rol-cheie în toleran ț a imună, deoarece acesta are un rol inhibitor
asupra raspunsurilor celulelor T, promovează apoptoza, cresc vasculariza ț ia ș i împiedica
activitatea limfocitelor T citotoxice, prin intermediul:
-radicalilor liberi de oxigen(RLO)
-indolamin-2,3 dioxigenază(IDO)-inhibi ț ia celulelor T se efectuează prin catabolismul
triptofanului.
-TGF-β
-calea de semnal STAT3: care odată activată inhibă produc ț ia citokinelor proinflamatorii cu
efecte imunosupresive , elibereaza factorii inhibitori a mai multor tipuri de celule din
micromediul tumoral (DC, NK)(26)(27).

4.Imunoterapia antitumorală

Imunoterapia este un subiect pe larg dezbătut. În prezent se încearcă să se clarifice rela ț ionarea
dintre tumoră-gazdă ș i celulă tumorală-micromediul tumoral, astfel încat să se identifice cea mai
bună op ț iune terapeutică.
Cercetăriile ne arată că tumorile se pot divide în func ț ie de imunofenotip, astfel există neoplazii
cu infiltrat limfocitar cu celule T CD8+, acestea având un prognostic bun. Dar, în acela ș i timp,
a ș a cum am mai spus, cel ulele tumorale prezintă mecanisme de scăpare de sub ac ț iunea de
apărare anti-tumoarală, prin inhibarea ac ț iunii Limfocitelor T CD8+.
Atunci când inten ț ionăm să abordăm un tratament imunologic este important să cunoa ș tem
natura tumorii.
În literatura de specialitate, sunt men ț iona ț i o serie de factori inhibitori ai func ț iei limfocitelor T.
Printre ace ș tia se numără : PDL-1, IDO ș i limfocitele Treg.
14

PDL-1 este o proteină a cărui rol primordial e de a suprima ac ț iunea sistemului imun. Această
proteină ligand operează prin intermediul receptorului PD-1 , care se găse ș te pe suprafa ț a
limfocitelor B, T ș i a celu lelor mieloide, rezultând inhibarea activită ț ii celulelor T CD8+ aflate în
micromediul tumoral.
Iar enzima indolamina 2,3 deoxigenază, degradează L-triptofanul, rezultând activarea celulelor
Treg, care suprimă mecanismele de anihilare ale limfocitelor T CD8+(28)(29)(30).
Un alt antigen important cu ac ț iune anti-tumorală este molecula co-receptor CTLA-4, care se
gase ș te pe suprafa ț a limfocitelor T helper, inhibând activitatea lim focitelor T. În imunoterapie se
utilizează anticorpii monoclonali anti CTLA-4 (ipilimumab), terapie folosită cu succes în
melanoame.
Ac ț iunea sa se bazează pe cre ș terea celulelor CD4+ ș i CD8+ antigen-dependente ș i scăderea
CD4+ ș i CD8+ naive(31) .
Imunoterapia este în momentul de fa ț ă cea mai nouă abordare terapeutică în cancer. Principalul
ș i poate chiar unicul inco nvenient îl reprezintă costul prea mare al acestei terapii, dar pe cealaltă
parte, avantajele sunt nenumărate: toxicitate redusă ș i faptul că ac ț ionează prin poten ț area unei
arme pe care noi deja o de ț inem “sistemul imun”.
Bineînteles, rezultatele bune, cel pu ț in momentan, apar când este asociată cu terapiile tradi ț ionale
(chirurgie, radioterapie, chimioterapie).
Cunoscând toate metodele de “scăpare” a celulelor tumorale este esen ț ial să abordăm o terapie
personalizată pentru a ob ț ine rezultatele cele mai bune.
Imunoterapia prezintă mai multe op ț iuni:
-imunoterapia pasivă- care în momentul de fa ț ă nu are rezultate spectaculoase.
Această terapie presupune administrarea de anticorpi monoclonali, care ac ț ionează asupra unei
“ ț inte” precise din compo nen ț a celulei tumorale (antigen, recepto r, proteină, enzimă).
Exemple de anticorpi monoclonali frecvent utiliza ț i în tratamentele medicale sunt: ​ rituximab ș ​ i
alemtuzumab î ​ n limfoamele non-Hodgkin de tip B ​ , centuximab, tastuzumab ș i bevacizumab î ​ n
tumorile solide.
-imunoterapia activă: vaccinuri, terapia adjuvantă, terapia celulară.
15

Vaccinoterapia , a cărui rol este să stimuleze imunitatea pacien ț iilor, nu a avut rezultate prea
bune. Singurele vaccinuri care au avut rezultate mai bune sunt cele folosite cu scopul de a
prevenii cancerul, cum este vaccinarea anti human papiloma virus (HPV), dar care devine
ineficient în prezen ț a boli i.
Terapia celulară, presupune prelevarea de celule limfocitare de la pacient ș i prelucrarea lor în
laborator, astfel încat poten ț ialul lor imunologic să crească, să recunoască celula tumorală ș i să o
distrugă. Ca la oricare terapie ș i aceasta implică numeroase riscuri, pre ț ul crescut, riscul de
hipersensibilizare, dificultă ț i în prelevarea celulelor.
Prin urmare, sistemul imun cu toate că are abilită ț i nemaipomenite în identificarea celulelor
anormale, cu ajutorul antigenelor specifice sau cele supraexprimate ș i anihilarea forma ț iunilor
tumorale; cu toate acestea cancerul reu ș e ș te să se adapteze ș i să supravie ț uiască mai bine decât
noi. Dezvoltând diferite mecanisme de mascare sau chiar neexprimare a antigenelor tumorale,
apărând acel fenomen de “toleran ț ă imună”.
De aceea este important să identificăm rela ț ionarea dintre celulele tumorale, stromale ș i cele ale
sistemului imun, pentru o abordare profilactică ș i terapeutică optimă pentru fiecare pacient în
parte.

16

5.1 ​ IDENTIFICAREA ​ . ​ MARKERILOR ​ . ​ IMUNOFENOTIPICI ​ . ​ CARACTERISTICI
FIBROBLASTELOR ​ . ​ PERI-TUMORALE

5.1.1 ​ IMUNOCITOCHIMIE

5.1.1.1 Metoda de lucru

Pentru analiza imunocitochimică, fibroblastele peri-tumorale (TAF) au fost cultivate în plăci de
sticlă cu 4 godeuri. Celulele au fost spălate cu PBS ș i fixate în paraformaldehidă 4%, apoi fiind
permeabilizate cu soluție 0,1% Triton X-100.

Materiale, reactivi necesari:
Culturi de celule pe plăci de sticlă cu godeuri
PBS
Soluție paraformaldehidă 4%
Soluție 0,1% Triton X-100
Apă distilată, apă de robinet
Anticorp primar
Kit LSAB2® System-HRP (Ready to use) DakoCytomation: Peroxidase blocker, Biotinilated
link, Streptavidin-HRP, AEC/DAB substrate
Hematoxilină 5%
Pipete, vârfuri, lamele
Mediu de montare [Sigma]
Microscop, agitator

Mod de lucru:
1. După spălare cu PBS, culturile de celule pe plăci de sticlă se fixează în paraformaldehidă timp
de exact 10 minute
2. Se spală cu PBS de 2 ori, câte 2 minute
3. Se permeabilizează cu soluție 0,1% Triton X-100 timp de 15-20 minute.
4. Se spală cu PBS de 2 ori, câte 2 minute
5. Se pune anticorpul primar, 10 minute la temperatura camerei
6. Se spală PBS de 2 ori câte 2 minute
7. Se pune anticorpul secundar (biotinilat), 10 minute la temperatura camerei
8. Se spală cu PBS de 2 ori câte 2 minute
9. Se pune Streptavidina-HRP, 10 minute la temperatura camerei;
10. Se spală cu PBS de 2 ori câte 2 minute
17

11. Se pune substratul (AEC), 10 minute, până când specimenul devine roșiatic. În cazul folosirii
substratului DAB, incubarea este de 5-10 minute, iar colorația este maronie
12. Se spală cu apă de robinet 5 minute
13. Se pune Hematoxilina 30 secunde, fără a se depăși acest timp (în caz contrar nucleii vor
deveni negri)
14. Se spală cu apă de la robinet 10 minute
15. Se aplică mediul de montare + lamela și se vizualizeaza la microscop.

Au fost investigate:
vimentina – componentă a citoscheletului celulei stem mezenchimale;
α ​ -SMA și VEGF – eviden ț iază activitatea ș i gradul de agresivitate a TAF, mai mult, arată
contribu ț ia TAF în neova sculariza ț ia tumorală.
CD105 (endoglina) – parte componentă a receptorului TGF- ​ β, ​ contribuie la
neo-angiogeneză ș i în mo dularea căii de semnalizare TGF- ​ β ​ ;
CD117 (proto-oncogena c-kit) – tirozin-kinază transmembranară, folosit pentru
indetificare celulară, precum ș i a gradului de diferen ț iere si activitate celulară.
CD26 (dipeptidil/peptidaza-4) – enzimă de suprafață,care se gase ș te pe suprafa ț a
majorita ț i celulelor, fiin implicată în reglarea activității imune, are rol în inhibarea proliferării
tumorale. Este înrudită cu FAP (fibroblast activation ​ alpha ​ ).
Au fost utiliza ț i anticorpi în vederea eviden ț ierii proliferării celulare; astfel de anticorpi sunt Ac
nuclear monoclonal mouse anti-human Ki67 Antigen (MIB-1, Dako), Ac monoclonal mouse
anti-human Vimentin (V9, Dako), acesta eviden ț iază MSC ș i TAF nediferen ț iate. Activitatea
TAF a fost evaluată prin Anticorpii primari mouse anti-human vascular endothelial growth factor
(clone VG1).
În vederea analizei imunocitochimice s-a utilizat ș i anticorpul secundar biotilinat.
Analiza microscopica s-a efectuat la microscopul Nikon Eclipse E800.

18

5.1.1.2 Rezultate

Figura Nu s-a evidențiat prezența citokeratinei la nivelul TAF (Ob. 10x)

Figura Expresie crescută a vimentinei la nivelul TAF, localizată citoplasmatic și perinuclear (Ob 20x)

Figura Expresie semnificativă a ​ α ​ -SMA la pasaje incipiente (dreapta) și expresia marcat redusă la pasaje
tardive (Ob 20x)

19

Figura Expresia VEGF la nivelul TAF (Ob 40x)

Figura Expresia CD105 la nivelul TAF (Ob 20x)

20

Figura Expresia CD117 la nivelul TAF (Ob 20x)

Figura Expresia CD26 la nivelul TAF (Ob 20x)

21

5.1.2 ​ IMUNOFENOTIPARE PRIN FLOWCITOMETRIE

5.1.2.1 Metoda de lucru

La diverse pasaje, TAF și MSC au fost însaman ț ate pe plăci de cultură aderente cu 6 godeuri
până în momentul în care s-a atins o confluență de 80-90%,timp în care au fost resuspendate cu
anticorpii monoclonali în vederea evaluării flowcitometrice.
1. Celulele se centrifughează 7 min la 1500 rpm și se spală cu PBS de 2 ori.
2. Celulele se resuspendă în 800 μl PBS, pentru fiecare tub de analiză flowcitometrică
adăugându-se 100 μl celule și 4 μl din anticorpii mouse anti-human conjugați cu
fluorocrom.
3. Se vortexează celulele împreună cu anticorpii și sunt lăsate în incubator timp de 30 min
la temperatura camerei, la întuneric.
4. După incubare, celulele sunt spălate cu 2 ml soluție de spălare (Cell-Wash Solution, BD
Biosciences), centrifugate 10 minute la 1500 rpm, supernatantul se aruncă iar celulele se
resuspendă în 500 μl Cell-wash și se analizează flowcitometric.

Achiziția probelor s-a realizat prin intermediul sistemului FACSCalibur (Becton-Dickinson), iar
analizarea s-a efectuat prin soft-ul specializat Flowing Software 2.5.
Analiza statistică a fost efectuată utilizând Excel Microsoft Office 2003 (Microsoft Corporation).
Tabelul. Prezintă anticorpii monoclonali mouse anti-human conjuga ț i cu fluorocromi.

Tabelul Anticorpii monoclonali și fluorocromii utilizați în analiza TAF și MSC

FITC CD34 CD44 CD90 CD106 HLA-D
R CD26 CD95 HLA-A
2 CK
PE CD31 CD73 CD49d CD109 CD117 Bcrp1
ABCG2 CD26
APC CD45

5.1.2.2 Rezultate

În urma analizei flowcitometrice se poate obseva o oscila ț ie notabilă a expresiei markerilor de pe
suprafa ț a popula ț iilor de celule investivate. Rezultatele ob ț inute se pot observa in figurile de mai
jos, precum ș i în valorile medii si deriva ț iile standard calculate.
O explica ț ie pentru aceasta variabilitate, ar putea fi faptul că, odată cu cre ș terea numărului de
pasaje, scade expresia antigenică.

22

A.

23

B.

24

C.

Figura Expresia unor antigeni de suprafață la nivelul MSC (A), TAF izolate din tumori mamare (B) și TAF izolate
din tumori de corp uterin (C)

Tabel Variația expresiei markerilor la nivelul MSC

MSC1 MSC2 MSC3 Media
aritmetica Devia ț ia
standard
NM 68.61 76.59 25.68
CD34 7.99 7.99 0.00
CD45 0.18 0.18 0.00
CD44 0.03 0.13 15.87 5.34 7.44
CD29 96.81 80.14 35.55 70.83 25.86
CD73 89.49 49.13 69.31 20.18
CD90 89.49 31.46 22.46 47.80 29.71
25

Figura. Variația ​ . ​ expresiei ​ . ​ markerilor ​ . ​ la nivelul MSC

TAF
sân1 TAF
sân 2 TAF
sân 3 TAF
sân 4 TAF
sân 5 TAF
sân 6 TAF
sân 7 TAF
sân 8 TAF
sân 9
NM 60.34 34.85 59.46 36.2 52.5 57.84 76.33 58.36
CD34 0.2 0.2 0.44 0.73 0.1 0.1 0.58
CD45 0.17 0.1 0 0 0 0 0
CD44 3.71 0.91 0.04 0.14 0.33 0.35 0.02 1.44 1.29
CD29 82.2 58.09 2.12 95.68 93.36 97.51 89.75 95.24 92.12
CD73 84.22 92.22 92.03 97.79 97.25 90.36
CD90 49.86 32.12 24.37 93.84 95.88 61.39 15.26
CD106 0 1.07 0.46 0 0.33 0.05 0 0
CD146 0 0
CD95 0 0.83 2.57 0.31 2.89
CD31 0 0 0 0 0
CD49 0 0.23 3.87 1.22 0
CD109 0 0 4.69 0.04 0.62
CD26 0.07 5.07 0.74 0.01 0.31

Tabel. Varia ț ia expresiei markerilor la nivelul TAF izolate din tumori mamare

26

27

Figura .Reprezentare grafică a expresiei markerilor CD44, CD73, CD90 și CD29 la nivelul celor 10
populații de TAF izolate din tumori mamare.

Tabel. Variația expresiei markerilor la nivelul TAF izolate din tumori de corp uterin

TAF
uter 1 TAF
uter 2 TAF
uter 3 TAF
uter 4 TAF
uter 5 TAF
uter 6 TAF
uter 7 TAF
uter 8 Media
aritmeti
că

NM 80.02 70.68 76.74 38.47 37.94 58.75 61.18 41.10
CD34 0.21 0.10 0.06 0.00 1.11 0.00 0.00 0.47 0.24
CD45 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
CD44 0.14 18.53 21.85 22.57 19.99 1.52 20.98 11.25 14.60
CD29 94.60 72.63 91.61 68.08 80.67 49.75 91.30 74.79 77.93
CD73 93.43 93.42 88.72 46.15 58.07 69.64 69.74 80.13 74.91
CD90 97.56 83.20 57.42 12.94 87.09 65.57 34.79 43.80 60.30
CD106 0.36 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.05

28

29

Figura. Reprezentare grafică a expresiei markerilor CD44, CD73, CD90 și CD29 la nivelul celor 8 populații de TAF
izolate din tumori mamare

În graficele de mai jos sunt prezentate aspecte comparative între MSC ș i TAF izolate din tumori
de corp uterin, dar ș i TAF izolate din tumori mamare. Observându-se gradul de expresie al
markerului, pentru fiecare celulă.
Histogramele suprapuse eviden ț iază tendințele de expresie dar și variabilitatea expresiei între
populațiile de celule studiate (Figura).

30

Figura. Expresia CD44, CD73, CD90 și CD29 pe tipuri de populații celulare
Legenda: 1–MSC; 1-2 TAF sân; 3-TAF uter

31

TAF sân TAF uter MSC
Figura. Histogramele suprapuse ale tuturor populațiilor de celule analizate.

6. Evaluarea celulelor mononucleare obținute din sângele periferic al
pacienților cu tumori solide

În cadrul acestui subcapitol interesul principal este de a investiga celulele sangvine nucleate
izolate din sângele periferic al pacien ț ilor cu tumori solide la nivelul carora s-a eviden ț iat
prezen ț a TAF peri-tumor ale. Obiectivul nostru este de a identifica limfocitele T citotoxice active
împotriva antigenului FAP (fibroblast activation protein), care se gase ș te la suprafa ț a
fibroblastelor peri-tumorale.
Atât monocitele, izolate din sângele periferic, cât ș i limfocitele T CD8- pentru FAP ș i limfocitele
T CD8+ pentru FAP au fost incubate cu fibroblastele peri-tumorale ale pacien ț ilor, urmarindu-se
gradul de proliferare.

32

6.1 Izolarea mononuclearelor din sânge periferic

Materiale și reactivi, mod de lucru

Materiale si reactivi
Sânge venos periferic recoltat pe anticoagulant
Soluție Ficoll, PBS
Mediu de cultură pentru expansionarea limfocitelor (Stem T-cell media)
Tuburi Falcon 50 mL, plăci de cultură Falcon T-75

1. Se recoltează 10 ml de sange, care se transferă în tuburi sterile Falcon de 16 ml și se diluează
în proporție de 1:1 cu PBS
2. Pentru fiecare probă se pregătesc tuburi Falcon de 50 ml, sterile, cu Ficoll – Paque (GE
Healthcare), la temperatura camerei, astfel încât proporția față de sângele diluat să fie 1:1
3. Materialul diluat se scurge ușor pe pereții tubului ținut la început ușor înclinat, pentru a nu
amesteca cele două componente care trebuie să formeze în final două straturi separate
4. Probele se centrifughează la 1160g (se poate opta și pentru 1800g, conform altor protocoale de
lucru), timp de 30 minute, la temperatura camerei. Decelerația trebuie să se realizeze fără frână
5. Dupa centrifugare, se recoltează „inelul” de celule mononucleare de la interfața
componentelor și se transferă în tuburi sterile Falcon de 50 ml
6. Se diluează fiecare probă cu tampon fosfat salin până la un volum total de 25 ml, urmând o
ușoară omogenizare; probele se centrifughează la 400g, timp de 10 minute, la temperatura
camerei, cu frână la decelerare (prima spălare)
7. Dupa omogenizarea mecanică a butonului rezultat după îndepărtarea supernatantului, se
adaugă din nou tampon fosfat salin, pentru a doua spălare; suspensiile celulare se centrifughează
la 400g timp de 10 minute, la temperatura camerei, cu frâna la decelerare
8. După a doua centrifugare se îndepărtează supernatantul iar butonul rezultat prin sedimentarea
celulelor se omogenizează cu 1 ml de mediu de cultură.

După cele 2 spălări consecutive, celulele au fost fie cultivate 1-2 săptămâni în vederea
expansionării acestora în mediul Stemline T-Cell expansion media (Sigma Aldrich) la care s-a
adăugat 10 ml L-Glutamină 200 mM/500 ml mediu, fie au fost supuse criogenării în vederea
utilizării în experimente ulterioare.

6.2 Caracterizarea flowcitometrică a populațiilor limfocitare izolate

Cu ajutorul flowcitometriei s-au determinat markerii de suprafa ț ă, după ce au fost pregătite în
prealabil celulele.La o concentrație de 10 ​ 5 ​ celule/ml, acestea au fost spălate ș i resuspendate în
PBS, apoi incubate, împreună cu anticorpi monoclonali conjuga ț i cu florocromi ,30 minute la
33

întuneric, se diluează conform indica ț iilor oferite de producător. Se spală cu soluția dedicată
(Cell Wash Solution – BD Biosciences), iar celulele se resuspendează în 500 µl Cell Wash și
sunt supuse analizei flowcitometrice, utilizându-se dispozitivului FACSCalibur
(Becton-Dickinson). Achiziția probelor a fost ob ț inută prin folosirea programul CellQuest Pro
software (Becton-Dickinson), iar analiza datelor s-a evaluat prin – Flowing Software 2.5.

Anticorpii utilizați au fost următorii (BD Pharmingen):
– CD3 (FITC)/CD16+56 (PE)/CD45 (PerCP)/CD19 (APC)
– CD3 (FITC)/CD8 (PE)/CD45 (PerCP)/CD4 (APC)
– CD45RA (FITC)/CD45RO (PE)/CD3 (PerCP)/CD4 (APC)

Figura. Evaluarea zilnică, timp de 6 zile, a creșterii numărului de limfocite T în cultură cu mediul Stemline
T-cell media

34

Figura. Evaluarea subpopulațiilor limfocitare

7. Identificarea și izolarea clonelor de limfocite T citotoxice active funcțional
împotriva antigenelor din micromediul tumoral

Scopul studiului este de a identifica ș i izola limfocitele T CD8+ pentru FAP.
FAP esto o proteină care contribuie la proteoliza matricei extra celulare, permi ț ând migrarea
celulelor endoteliale, fiind specifică ț esutului epitelial.
FAP se gase ș te la nivelul TAF.

7.1 Tipizarea HLA a sângelui periferic a pacienților cu tumori solide

Aceasta parte din experiment a avut rolul de a identifica profilul HLA adecvat in vederea izolarii,
prin tehnica streptamerilor, a limfocitelor CD8 citotoxice. Aceste peptide având profilul tipului
HLA-A *0201.
Prin metoda Promega Quick Protocol s-a extras ADN-ul din mononuclearele izolate din sangele
periferic al pacien ț ilor cu tumori solide la nivel mamar si corp uterin.
Analiza ADN-ului s-a realizat cu instrumentul Genetic Analyzer (Applied Biosystems), conform
indica ț ilor din protocol.

35

Figura Identificarea probelor pozitive pentru profilul HLA-A*0201 (printscreen) – banda verde

36

7.2 Tehnologia streptamerilor ca metodă de izolare ​ in vitro ​ a limfocitelor T
citotoxice

Limfocitele T au rol primordial în imunitatea mediată celular, spre deosebire de celelalte celule
limfocitare, acestea prezintă pe suprafa ț a lor receptorul TCR.
Izolarea limfocitului T se realizează prin intermediul complexului major de histocompatibilitate,
care prezintă antigenul limfocitului T, prin interac ț iunea cu receptorul TCR.
Deoarece această legatură are o afinitate scazută s-a implementat sistemul de ​ . ​ utilizare a
multimerilor ​ . ​ de epitopi MHC, care cresc aviditatea ș i stabilitatea de legare.
Mecanismul de operare a streptamerilor implică tehnologia Strep-Tag/Strep-Tactin.
Strep-Tag fiind un peptid cu lan ț scurt, posedă o afinitate crescută ș i selectivă pentru
Strep-Tactin.
Prin procesul de oligomerizare a proteinelor de fuziune MHC I- Strep-Tag, rezultă formarea
multimerilor, care, mai apoi sunt complexa ț i cu Strep-Tactina marcată fluorescent sau
complexată cu nanoparticule magnetice.
Desfacerea legăturilor Strep-Tactin–MHC I-Strep-tag se face prin adăugarea biotinei, fiind
îndeparta ț i prin spălare.(F igură)
Prin aceasta metodă limfocitele sunt identificate ș i izolate fără să le fie alterată func ț ionalitatea.

Figura Principiul metodei streptamerilor (tradus după „Streptamer technology” by Beckman Coulter)

7.2.1 Materiale, reactivi. Metoda de lucru

În experimentele ce urmează s-a procedat la izolarea limfocitelor T citotoxice active funcțional
împotriva FAP, utilizând reactivii IBA – Solutions for Life Sciences, Germania:
– MHC I-Strep HLA-A*0201 FAP soluție 200 µl, 250 µg/ml, alicotată în 25 tuburi a 8 µl și
păstrată la -80 grade Celsius
– Strep-Tactin PE soluție 250 µl
– Strep-Tactin Magnetic Nanobeads, soluție 250 µl
– Buffer IS 10x, soluție 50 ml (a fost diluat până la 1x înainte de utilizare)
– D-biotin 100 mM, soluție 1 ml (a fost diluat până la 1 mM cu buffer IS înainte de
utilizare)
37

– Coloane de separare magnetică MS (MACS, Miltenyi Biotec)
– Suport și separator magnetic Midi (MACS, Miltenyi Biotec)

Etapele procedurii s-au efectuat pe gheață și au constat din:
– punerea în contact a 8 µl MHC I-Strep HLA-A*0201 FAP cu 50 µl Strep-Tactin
Magnetic Nanobeads și 90 µl buffer IS și menținerea amestecului pe gheață timpde 45
minute
– mononuclearele (aproximativ 2×10 ​ 7 celule) au fost resuspendate în 10 ml buffer IS,
centrifugate 8 minute/300 g și resuspendate în 100 µl buffer IS
– cei cca 148 µl soluție amestec au fost combinați cu 100 µl suspensia de celule, amestecul
rezultat fiind incubat pe gheață timp de 45 minute
– s-au adăgat 1,5 ml buffer IS, apoi s-au centrifugat 8 minute/300 g; după îndepărtarea
supernatantului, amestecul s-a resuspendat în 2 ml buffer IS.

Pa ș ii următori s-au realizat cu ajutorul separatorului magnetic și al coloanelor de separare
magnetică, în condiții sterile (sub hotă).

– inițial, coloana MS a fost spălată cu 2 ml buffer IS
– apoi s-a introdus suspensia de celule în coloană
– s-a spălat coloana de 3 ori cu câte 1 ml buffer IS

lichidul care s-a scurs prin coloană conținea limfocitele T CD8 negative pentru FAP
– s-a scos coloana din suport și deci din câmpul magnetic, iar suspensia colectată în această
etapă conținea limfocitele T FAP CD8 pozitive.
– peste această suspensie a fost adăugată D-Biotin 1 mM, incubându-se 10 minute la
temperatura camerei
– după adăugarea a 5 ml buffer IS, suspensia a fost centrifugată 5 minute/300 g; pellet-ul
celular a fost resuspendat în mediu de cultură (pentru efectuarea experimentului cu
ajutorul sistemului xCelligence) și în buffer IS pentru analiza prin flowcitometrie.
38

Etapa următoare a constat din analiza prin flowcitometrie a subpopulațiilor de limfocite T după
cum urmează:
– în 3 tuburi s-au introdus suspensii conținând:
o mononucleare din cultură (aproximativ 5×10 ​ 6 ​ celule) – tub 1
o limfocite T CD8 negative pentru FAP – tub 2
o limfocite T CD8 pozitive pentru FAP – tub 3
(tuburile 2 și 3 conținând celule obținute în urma separării magnetice)
– ​ s-au combinat 5 µl Strep-Tactin PE cu 4 µl MHC I-Strep HLA-A*0201 FAP și cu 41 µl
buffer IS, rezultând un amestec ce a fost incubat 45 minute pe gheață
– Acest amestec a fost combinat cu suspensiile celulare și menținut la incubare 45 minute
– celulele au fost apoi spălate cu câte 200 µl buffer IS
– s-au adăugat anticorpii monoclonali cuplați cu fluorocromi: CD8(FITC)/CD45(APC)
(BD Pharmingen) care au fost incubați 20 minute la întuneric
– după spălare cu buffer IS, celulele au fost resuspendate în câte 200 µl buffer IS și
analizate cu ajutorul aparatului FACSCalibur, iar datele au fost evaluate prin software-ul
Flowing Software 2.5.

7.2.2 Rezultate

Flowcitometria a identificat o reac ț ie atât la nivelul tubului 1, unde a fost studiată întreaga
popula ț ie de mononuclea re din sângele periferic, precum ș i la nivelul tubului 3, unde se regăseau
limfocite T CD8+ FAP pozitive, izolate prin separare magnetică.

Figura Evaluarea flowcitometrică a limfocitelor T citotoxice CD8 negative și CD8 pozitive pentru FAP după
marcare cu streptameri și separare magnetică (recoltate de la pacientă cu tumoră mamară)

39

Figura Evaluarea flowcitometrică a limfocitelor T citotoxice CD8 negative și CD8 pozitive pentru FAP după
marcare cu streptameri și separare magnetică (recoltate de la pacientă cu tumoră de corp uterin)

CONCLUZII

Acest experiment a avut drept scop evaluarea , ​ in vitro, ​ a raspunsului imun anti-tumoral prin
activarea limfocitelor T CD8+ fa ț ă de TAF peri-tumorale ale unui pacient. În cadrul studiului se
direc ț ionează limfocitele T CD8+ asupra antigenului FAP-CD26, marker de suprafa ț ă al TAF
izolat din tumorile solide.
Izolarea limfocitelor T CD8+ active anti-FAP a fost posibilă datorită tehnicii streptamerilor.
Limfocitele active anti-FAP au fost incubate cu TAF peri-tumoral, urmărindu-se proliferarea
limfocitară prin metoda xCELLigence, exprimându-se numărul de celule ș i gradul de dispersie al
acestora.
S-a evaluat reac ț ia atât a monuclearelor din sângele periferic, în stare nativă, cât ș i a limfocitelor
T CD8+ activate func ț ional anti-FAP.
La nivelul TAF s-a observat expresia unor markeri ce definesc MSC, precum ș i identificarea
CD26 la nivel TAF (prin imunocitochimie).
A ș a cum s-a eviden ț iat mai sus TAF aflat in co-cultură cu limfoc itele CD8+ active anti-FAP sau
cu mononucleare în stare nativă, au suferit o scădere a aderen ț ei ș i a dispersiei. Ceea ce
demonstrează că limfocitele T au o poten ț ială influen ț ă ș i în lipsa unei prealabile activări.
Drept pentru care, se poate spune că există un efect citotoxic limfocitar împotriva TAF izolate
din tumori solide.

40

41