Universit atea de Medicină și Farmacie Craiova [628598]

Universit atea de Medicină și Farmacie Craiova
Facultatea de Medicină

LUCRARE DE LICENȚĂ
Injectarea de nanoparticu le magnetice sub ghidaj
ecoendoscopic – o nouă metodă de abordare a tumorilor
hepatice

Coordonator științific:
Prof. Univ. Dr. SĂFTOIU Adrian

Îndrumător științific:
Asist. Univ. Dr. UNGUREANU Bogdan Silviu

Absolvent: [anonimizat]
2 0 1 7

Cuprins

Introducere ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………… 1
Partea Generală ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……. 3
Cap. I. Carcinomul hepatocelular ………………………….. …………………………. 4
1. Etiologia CHC ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 4
1.1 Ciroza hepatică. ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 4
1.2 Hepatita virală. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …. 5
1.3 Hepatopatiile nonalcoolice. ………………………….. ………………………….. …………….. 6
1.4 Diabet zaharat. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ….. 7
1.5 Alți factori etiologici . ………………………….. ………………………….. …………………….. 8
2. Patogeneza CHC ………………………….. ………………………….. ………………………… 9
2.1 Modifică ri genetice ………………………….. ………………………….. ……………………… 10
2.2 Modificări epigenetice ………………………….. ………………………….. ………………….. 11
2.3 Căi de semnalizare celulară în hepatocarcinogeneză ………………………….. …….. 12
3. Diagnosticul CHC ………………………….. ………………………….. …………………….. 13
3.1 Aspecte clinice ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 13
3.2 Investigații paraclinice ………………………….. ………………………….. …………………. 15
Cap. II. Nanoparticulele magnetice (NPM) ………………………….. ………….. 19
1. Toxicitatea nanoparticulelor magnetice ………………………….. ……………………. 19
1.1. Mecanismele toxicității ………………………….. ………………………….. ……………….. 19
1.2. Modificări morfologice și efectele genotoxice ………………………….. ……………. 21
1.3. Testarea toxicității in vitro și in vivo ………………………….. ………………………….. 22
2. Biodistribuție și biodisponibilitate ………………………….. ………………………….. . 24
3. Posibilități diagnostice și terapeutice ………………………….. ……………………….. 25
3.1. Acumularea pasivă ………………………….. ………………………….. ……………………… 25
3.2. A cumularea activă ………………………….. ………………………….. ………………………. 26
3.3. Posibilități de diagnostic ………………………….. ………………………….. ……………… 26

3.4. Opțiuni terapeutice oferite de NPM ………………………….. ………………………….. . 28
Cap. III. NPM în diagnosticul și tratamentul CHC ………………………….. 32
1. NPM – IRM în tumorile hepatice ………………………….. ………………………….. .. 32
2. Hipertermia în cadrul CHC ………………………….. ………………………….. ………… 34
3. Terapia țintită a CHC ………………………….. ………………………….. ………………… 35
Partea Specială ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 37
1. Introducere ………………………….. ………………………….. ………………………….. ….. 38
2. Materiale ș i Metode ………………………….. ………………………….. ………………….. 38
3. Rezultate ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……… 40
4. Discuții ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……….. 46
5. Concluzii ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 47
Bibliografie ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………. 49

1
Introducere

Succesele vaste obținute în cadrul nanotehnologiei au făcut posibilă apariția unor
progrese imense în numeroase domenii, de la stocarea datelor până la medicină. Datorită
proprietăților atractive ale nanoparticulelor magnetice (NPM), acestea au atras un grad înalt de
atenție, facilitând o dezvoltare continuă a domeniului. P otențialul imens al NPM, combinat cu
excelenta lor biocompatibilitate, a condus la apariția a numeroase oportunități și în domeniul
medical.
Cele mai utilizate nanoparticule magnetice sunt cele din oxid de fier (iron oxide
nanoparticles, IONs), care prin proprietățile lor superparamagnetice au deschis calea către noi
posibilități diagnostice și terapeutice. Superparamagnetismul este proprietate a acestor particule
de a fi magnetizate numai sub influența unui câmp magnetic extern, pierzând această
magnetizare odată ce câmpul este dezactivat [1].
O mare parte din potențialul IONs a fost orientat către diagnosticul și tratamentul
oncologic. De ac eea, multe dintre succesele în acest domeniu pot fi atribuite și nanotehnologiei.
În principiu, nanoparticulele din oxid de fier pot fi utilizate în tratamentul oncologic prin metode
care implică hipertermia indusă magnetic și distribuția selectivă atât a substanțelor
chem oterap eutice, cât și a fragmentelor genice [2]. În ce privește diagnosticul, atât identificarea
tumorilor, cât și supravegherea acestora pot fi îmbunătățite pr in utilizarea IONs ca agenți de
contrast în imagistica prin rezonanță magnetică (IRM), crescând semnificativ sensibilitatea
metodei [3]. Mai mult, tehnica imagistică prin particule magnetice ( Magnetic Particle Imaging,
MPI) oferă rezoluție temporală crescută și rate de achiziție mult mai înalte, îmbunătățind și mai
mult sensibilitatea și specificitatea în comparație cu IRM [4]. Dezvoltarea și aplicarea tuturor
acestor posibilități depind de sintetizarea unor noi tipuri îmbunătățite de NPM, dar și de
stabilirea cu o claritate cât mai mare a proprietăților și efectelor generale ale acest ora.
Carcinomul hepatocelular (CHC) reprezint ă cea mai comună tumoră a ficatului, ocupând
locul al doilea în râ ndul deceselor determinate de cancer. Substratul care st ă la baza dezvoltă rii
CHC este asociat cu afecț iuni precum hep atitele cronice virale , B sau C , în 80% din cazuri [5 ], și
determină o rat ă de mortalitate de 54% [6] până la 70% [ 7] în cazul pacienț ilor cu ciroză
compensată . Având în vedere p rognosticul rezervat și posibilităț ile terapeutice limitate , CHC
reprezintă o importantă problemă de sănătate, în special în ță rile dezvoltate.

2
Necesitatea de optimizare a tehnicilor de diagnostic și tratament pentru CHC,
promovează utilizarea NPM în aceste scop uri, având î n vedere caracteristicile și potenț ialul
acestora . Așadar, nanotehnologia poate fi capabilă să îndrepte anumite deficiențe întâlnite î n
managementul pacienților cu CHC .
Lucrarea de față este stru cturată într -o parte generală și o parte speci ală. Partea generală
este, la râ ndul ei, împarțită î n capitole care cuprind noțiuni esenț iale pentru întelegerea pe deplin
a caracteristicilor CHC și ale NPM, subliniind, astfel , impactul pe care acest tip de particule î l
poate avea asupra dezvoltă rii unor noi tehnici de diagnostic și tratament î n tumorile hepatice.
Partea specială a lucrării urmăr ește descrierea studiului efectuat în cadrul Centrului de Cercetare
în Gastroenterologie ș i Hepatologie, din cadrul UMF Craiova.

3

Partea Generală

4

Cap. I . Carcinomul hepatocelular

1. Etiologia CHC
Hepatocarcinogeneza este un proces complex multifactorial. Una dintre principalele
caracteristici ale carcinomului hepatocelular (CHC) constă în posibilitatea de a identifica, în cele
mai multe cazuri, factorul etiologic care a deținut contribuția cea mai mare la inițierea și
promovarea tumorigenezei. Totuși, în mod obișnuit, nu există o cauză individuală care a
determinat apariția CHC, apărând efecte cumulative determinate de prezența mai multor factori
de risc la același individ. Contribuția fiecăruia din tre acești factori este dependentă de
caracteristicile populațiilor studiate, fiind în mare măsura influențată de susceptibilitatea
genetică, zona geografică, stilul de viață.
1.1 Ciroza hepatică. Factorul de risc cu contribuția cea mai mare la dezvolta rea
carcinomului hepatocelular este reprezentat de ciroză, aceasta fiind prezentă în 80 -90% dintre
cazurile de CHC [8]. Ratele de incidență anuală a acestui tip de cancer, în cadrul pacienților cu
ciroză, variază considerabil în funcție de afecțiunea hepat ică de bază [9]. În plus, și stadiul
cirozei influențează atât riscul de apariție al cancerului, cât și evoluția ulterioară a acestuia [10].
Ciroza cauzată de infecția cu virusul hepatitic C (VHC) prezintă cea mai mare incidență
cumulativă pe 5 ani (30% î n Japonia și 17% în țările vestice), urmată de hemocromatoza
ereditară (21%) [11]. În cadrul cirozei cauzate de infecția cu virus hepatitic B (VHB), riscul de
dezvoltare al CHC, la 5 ani, este de 15% în zonele endemice, scăzând până la 10% în țările
vestic e. În absența hepatitelor virale, ciroza provocată de alte cauze, determină incidențe mai
mici ale CHC: ciroza de cauză etanolică cu un risc cumulativ la 5 ani de aproximativ 8%, ciroza
biliară cu un risc cumulativ la 5 ani de 4% [11].
CH apare în urma un ei îndelungate perioade de afectare hepatică, fiind caracterizată de o
scădere a ratei de proliferare a hepatocitelor, determinând, deci, scăderea capacității regenerative
a ficatului [12]. Acest proces este asociat cu o creștere a țesutului fibros, însoți tă de distrucția
hepatocitelor, ambele promovând apariția celulelor canceroase [13]. Mecanismele posibile care
au implicații în aceste procese includ disfuncția telomerică și alterări în mediile micro și
macrocelular [14].

5
1.2 Hepatita virală. Hepatita virală posedă roluri esențiale în inițierea, promovarea, și
progresia CHC. Infecțiile cu virusurile hepatitice B și C fac parte din cei mai comuni factori de
risc ai carcinomului hepatocelular [15,16], infecția cu VHB fiind responsabilă de aproxim ativ
50% dintre cazurile de CHC [17]. Deci, odata cu creșterea nivelului endemic în anumite regiuni,
se vor înregistra creșteri concordante ale incidenței CHC. Nu sunt cunoscute cu exactitate
mecanismele prin care hepatita virală determină inițierea și pro gresia hepatocarcinogenezei,
existând o multitudine de factori intra și extracelulari care au implicații în acest proces. Totuși,
printre acești factori, un rol important revine procesului inflamator care stimulează angiogeneza,
determină alterarea ADN -ului, și produce o amplificare a ratei de creș tere a celulelor maligne
[18].
Deși VHB poate cauza cancer hepatic și în absența cirozei, majoritatea cazurilor (70 –
90%) dezvoltă carcinom hepatocelular pe un fond cirotic [19] . Infecția cu virusul hepatitic B
poate determina hepatocarcinogeneza atât prin mecanisme directe, cât și indirecte. În primul
rând, infecția determină alterarea integrității hepatocitelor și inflamație cronică, ulterior apărând
proliferare hepatocitară, fibroză și ciroză. Regenerarea contin uă din cadrul cirozei va conduce la
un turnover celular crescut, însoțit de acumularea de mutații în genomul celulelor gazdă, având
ca efecte rearanjamente cromozomiale, activarea de oncogene, și inactivarea genelor supresoare
de tumori [20]. Totuși, VHB p oate determina apariția CHC și prin mecanisme indirecte, în
absența cirozei [14], prin mecanisme care permit integrarea ADN -ului viral în celulele gazdă,
acționând ca agent mutagenic, crescând instabilitatea genomică [21].
Riscul de dezvoltare a CHC, în cazul infecției cu VHB, este influențat și de factori
demografici (sex masculin, vârsta înaintată, antecedente heredocolaterale de CHC), factori virali
(nivel înalt de replicare a VHB, genotipul viral, durata mare a infecției, coinfecția cu VHC, VHD
sau HIV ), factori de mediu (expunere la aflatoxină, consum excesiv de alcool, fumat).
Asocierea dintre infecția cu virusul hepatitic C și riscul crescut de dezvoltare a
carcinomului hepatocelular a fost bine stabilită până în prezent. Infecția cu VHC determină
inflamație cronică, moarte celulară, proliferare și, în final, ciroză [20]. Deci, spre deosebire de
infecția cu virusul hepatitic B, CHC asociat infecției cu VHC, apare aproape exclusiv la cazurile
în care ciroza hepatică s -a instalat [20]. Infecția cu VHC e ste asociată cu o creștere de
aproximativ 17% a riscului de apariție a carcinomului hepatocelular, cu variații dependente de
stadiul fibrozei hepatice la momentul infecției [22]. Rata de apariție a cirozei la 25 -30 de ani
după momentul infecției, variază î ntre 15% și 35% [23], durata medie de apariție a CHC fiind, în
aceste cazuri, de aproximativ 30 de ani [24].

6
Spre deosebire de VHB, VHC este un virus ARN, fiind incapabil de a se integra în
genomul gazdă. Deci, mecanismele care determină apariția CHC, acț ionează în mod indirect prin
promovarea alterărilor specifice cirozei. De asemenea, a fost observată o legatură între infecția
cu VHC și dezvoltarea insulinorezistenței (IR), care, la rândul ei, a fost asociată cu apariția
fibrozei hepatice și a diabetului zaharat tip II [25]. Mecanismele explicative pentru asocierea IR
cu VHC sunt incomplet elucidate, fiind, totuși, considerate parțial responsabile răspunsurile
imune orientate împotriva particulelor virale.
Factorii virali contribuie mai puțin la progresi a cirozei din cadrul hepatitei cronice cu
VHC, aceasta fiind corelată în măsură mai mare cu factori care țin de mediu și de stilul de viață,
incluzând: vârsta înaintată, sexul masculin, consum excesiv de alcool (>50g/zi), diabet zaharat,
obezitate, și coin fecție cu HIV sau VHB [26]. Consumul excesiv de alcool este un cofactor
important la pacienții infectați cu VHC, aceștia prezentând rate mai înalte de ciroză și CHC, spre
deosebire de cei care nu consumă alcool [27]. Mecanismele posibile prin care alcoolul poate
influența rata de apariție a CHC în prezența infecției cu VHC, includ: creșterea ratei de replicare
a virusului, creșterea agresivității virale prin modificarea regiunilor hipervariabile ale genomului
viral, ducând la o afectare hepatică mai severă și la o rezistență crescută la interferon; și inhibiția
expresiei hepatice a genei Bcl-2, crescând rata de apoptoză a hepatocitelor [27]. Totuși, cea mai
mare influență este atribuită sinergismului dintre alcool și VHC în amplificarea stress -ului
oxidativ.
1.3 Hepatopatiile nonalcoolice (nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD). NAFLD
acoperă un spectru larg de afecțiuni care au la bază obezitatea și insulinorezistența. Entitățile
care fac parte din NAFLD variază de la simpla acumulare de grăsimi la nivelul ficatului, până la
asocierea acestei simple steatoze cu anumite grade de inflamație, și, eventual, cu apariția cirozei.
Deci, NAFLD sunt divizate în două entități: simpla steatoză hepatică (nonalcoholic fatty liver,
NAFL), și steatohepatita nonalcoolică ( non-alcoholic steatohepatitis, NASH) în care sunt
prezente balonizarea hepatocitară și fibroza hepatică avansată. NAFLD a devenit cea mai
comună afectare hepatică cronică, cu o prevalență estimată în populația ge nerală de 10 până la
36% [28] . Aceste numer e prezintă o creștere continuă pe fondul măririi prevalențelor obezității,
ale diabetului zaharat, dislipidemiei, și a altor factori asociați cu sindromul metabolic, care este
strâns corelat cu apariția NAFL D [29] . Până la 70 -80% dintre pacienții cu diabet zaharat tip II
prezintă NAFLD în diverse stadii [30], fiind posibilă existența unei influențe genetice asupra
severității NAFLD în c adrul pacienților cu diabet [31].

7
Odată cu creșterea incidenței acestui grup de boli, a devenit evidentă legatura acestor a cu
dezvoltarea carcinomului hepatocelular. Totuși, mecanismele prin care NAFL/NASH
influențează apariția CHC, sunt doar parțial elucidate. Riscul de progresie spre ciroză al
pacienților cu hepatopatie nonalcoolică este de aproximativ 4 până la 20%, în fu ncție de gradul
necrozei și al fibrozei [29,32] . Deși riscul de a dezvolta CHC în urma cirozei cauzate de NAFLD
nu este în mod clar stabilit, rata cumulativă a incidenței CHC -NAFLD este de 2.4% până la
12.8% pe o perioadă medie de 3.2 până la 7.2 ani [33 -35]. Totuși, pe lângă evoluția ciroză –
CHC, există dovezi conform cărora NAFLD poate determina carcinom hepatoc elular și în
absența cirozei [29 ,33,36 -40]. De fapt, chiar până la 50% dintre cazurile de CHC -NAFLD ap ar
în lipsa cirozei hepatice [29 , 41] .
Mecanismele patogenice implicate în apariția carcinomului hepatocelular din cadrul
NAFLD, sunt legate de prezența obezității și a insulinorezistenței (IR). În prezent, rolul major al
obezității în hepatocarcinogeneză este atribuit răspunsului inflamator cr onic persistent cauzat de
nivelurile crescute de leptină asociate cu nivelurile relativ scăzute ale adiponectinei [42].
Insulinorezistența are un rol bine elucidat în NAFLD. Acesta este un proces complex care
implică atât secreția cât și acțiunea insulinei , fiind strâns legate de mecanismele patogenice
implicate în obezitate [43]. IR determină lipoliză periferică și creșterea nivelurilor circulante de
acizi grași, care sunt captați de ficat. Pe lângă acest proces, există și o lipogeneză de novo în
hepatocit e, însoțită de o reducere a secreției de VLDL, rezultând în acumularea excesivă de
trigliceride în ficat. Depozitarea crescută a lipidelor în ficat reprezintă o sursă de stress oxidativ,
care are implicații importante în dezvoltarea steatohepatitei și în p rogresia spre ciroză [44].
Modificări apărute în microbiomul intestinal, cât și anumite polimorfisme genetice, pot, de
asemenea, să influențeze progresia NAFLD și dezvoltarea CHC la pacienții cu obezitate [42].
Mecanismele hepatocarcinogenezei în steatoza hepatică par a fi diferite față de cele
clasice implicate în ciroză, acest aspect putând explica, cel puțin parțial, incidența crescută a
CHC în NAFLD non -cirotică. Pentru acest grup de pacienți, o altă posibilitate pentru dezvoltarea
CHC este reprezentat ă de transformarea maligna a adenoamelor hepatocelulare [45].
1.4 Diabet zaharat. Diabetul zaharat, în special tipul II, a fost propus ca factor de risc
pentru dezvoltarea CHC. Totuși, există anumite dificultăți întâmpinate în încercarea de observa
posibil e asocieri între acesta și CHC. În primul rand, diabetul zaharat este factor de risc pentru
NAFLD, inclusiv pentru NASH, care pot avea evoluție spre CHC independent de prezența altor
factori. În plus, afectarea hepatică cronică poate fi ea însăși cauză pen tru instalarea intoleranței la
glucoză sau a diabetului manifest [46]. Până la 96% dintre pacienții cu ciroză pot avea

8
intoleranță la glucoză, și până la 30% dintre aceștia pot avea DZ [47]. Mai mult, anumite
afecțiuni hepatice (VHC, hemocromatoză) sunt a sociate cu risc crescut de DZ [48].
Diversele corelații dintre diabetul zaharat și CHC au fost demonstrate în numeroase
studii, care atesta rolul DZ ca factor de risc independent pentru dezvoltarea carcinomului
hepatocelular. Dovezile rezultate din aceste studii includ mai multe tipuri de legături cauzale: i.
dovezi conform cărora IR și DZ măresc rata de progresie a afecțiunilor hepatice cronice care
preced dezvoltarea CHC [49,50]; ii. dovezi care atestă un risc de 2.5 ori mai mare de dezvoltare
a CHC la pa cienții cu DZ [48,51], risc corelat și cu durata mai îndelungată a DZ [52 -54]; iii.
dovezi care arată existența unui sinergism între DZ și alți factori de risc pentru CHC [53,55,56];
iv. dovezi asupra asociației semnificative dintre DZ și recurența CHC dup ă tratament [57,58]; v.
dovezi care demonstrează plauzibilitate biologică semnificativă pentru posibila asociere dintre
DZ și CHC [59]. Cu toate acestea, mecansimele fizipatologice pentru aceste asocieri nu sunt,
până în prezent, cunoscute cu exactitate.
Sunt necesare investigații continue atât pentru evaluarea mai exactă a mecanismelor prin
care DZ influențează apariția CHC, cât și pentru evaluarea modului prin care acest risc crescut
poate fi mediat și prin durata și tratamentul diabetului, istoricului f amilial, obezitații, fumatului,
consumului de alcool, și a altor factori de risc asociați.
1.5 Alți factori etiologici . Aflatoxinele sunt substanțe cu potențial carcinogen, care sunt
produse de unele specii de Aspergillus. Zonele în care ingestia de alimen te contaminate cu
aflatoxină este crescută, înregistrează o rată mare a incidenței CHC, fiind, cel mai probabil,
determinată de mutații caracteristice în gena supresoare de tumori p53, prevalența acestei mutații
fiind de 30 -60% în cazurile de CHC din acest e zone [60]. Mai mult, indivizii infectați cu VHB
au risc mai mare de carcinom hepatocelular dacă infecția se asociază cu expunere la aflatoxină,
sugerând o relație sinergică între acești doi factori [61].
Consumul excesiv de alcool (>50 -70 g/zi) pe perioa de îndelungate de timp, reprezintă
unul dintre factorii de risc pentru CHC. Majoritatea dovezilor referitoare la rolul alcoolul ca
factor de risc, arată lipsa unui efect carcinogenic direct al acestuia, acționând mai probabil prin
intermediul cirozei la ba za căreia se poate afla. Totuși, sunt demonstrate și efectele sinergice
dintre consumul excesiv de alcool și infecțiile cu VHC sau VHB, posibil și prin prom ovarea mai
intensă a cirozei [ 22, 27].
Alți factori de risc pentru dezvoltarea CHC includ: obstrucți a biliară, ciroza biliară
primitivă/secundară, hemocromatoza ereditară, boli genetice ale metabolismului (deficiența de α –

9
1 antitripsină, galactozemie, porfiria, boala Wilson), hepatitele autoimune, medicamente (alfa –
metildopa, amiodarona, izoniazida, meto trexat), agenți infecțiosi (bruceloză, sifilis), afecțiuni
vasculare (insuficiența cardiacă dreaptă, pericardită, telangiectazia hemoragică ereditară), boli
venoocluzive etc. [62] (Tabel I).
Tabel I. Cauze determinante de CHC
Cauze frecvente Cauze rare
Consum excesiv de
alcool (60 -70%) Hepatită autoimună
Obstrucție biliară (5 –
10%) Medicamente/toxine
Hepatită cronică B sau
C Boli metabolice
genetice
Hemocromatoză (5 –
10%) Infecții
NAFLD (10%) Malformații vasculare
Boală venoocluzivă
2. Patogeneza CHC
Patogeneza carcinomului hepatocelular nu a fost pe deplin elucidată până în prezent.
Totuși, este clară natura plurifactorială a procesului de hepatocarcinogeneză. În majoritatea
cazurilor, apariția carcinoamelor hepatocelulare este mediată de injurii hepatice care dezvoltă
inflamație și fibroză, ambele determinând alterarea arhitecturală a ficatului cu aspecte
caracteristice cirozei hepatice. Progresia cirozei hepatice spre CHC este un proces complex, care
se află în stransă legatură și cu afecțiunea h epatică de bază. Multiple studii au investigat
posibilele mecanisme implicate în dezvoltarea carcinomului hepatocelular la pacienții cu ciroză.
Totuși, inițierea și progresia carcinogenezei pot avea loc și în absența cirozei hepatice, cum este
cazul carcin omului asociat infecției cu virusul hepatitic B (VHB). Datele obținute până în
prezent, descriu hepatocarcinogeneza ca pe un proces malign complex și heterogen, care are la
bază o gamă largă de modificări genetice și epigenetice, cât și alterări specifice ale un or căi de
semnalizare celulară (Figura 1 ).

10

Figura 1. Principalele mecanisme etiopatogenice implicate în dezvoltarea carcinomului
hepatocelular. DZ, diabet zaharat NAFLD, non -alcoholic fatty liver disease; VHB, virus
hepatitic B; VHC, virus hepatitic C;
2.1 Modificări genetice
2.1.1. Disfuncția telomerică . Telomerii sunt regiuni aflate la capetele cromozomilor cu
rolul de a împiedica fuziunea acestora sau distrucția mediată prin nucleaze și/sau ligaze.
Telomeraza joaca un rol important în menținerea lungimii telomerilor, prin sintetizarea unor
secvențe speci fice de ADN la capetele cromozomiale [63]. Expresia telomerazei, în mod normal,
este scazută în celulele mature, deci capetele terminale ale cromozomilor vor deveni în mod
progresiv mai scurte în urma diviziunilor repetate. În cadrul afecțiunilor hepatice cronice, unde
există un turnover celular amplificat, scurtarea telomerilor va fi accentuată [64]. Scurtarea
acestora, sub anumite lungimi prag, conduce la instabilitate genomică, cu deteriorarea ADN -ului,
determinând apoptoza sau senescența celulară, rezul tând inabilitatea ficatului de a regenera
arhitectura normală, ajungandu -se la fibroză și, eventual, la ciroză. Deoarece ciroza reprezintă un
precursor al CHC, ipoteza telomerică susține inițierea procesului carcinogenic prin dezvoltarea
instabilității cr omozomiale. Acest efect de scurtare a telomerilor întâlnit în afecțiunile hepatice
cronice, poate avea un efect sinergic cu anumite variante genetice moștenite ale genelor TERT și
TERC , care determină scaderea activității complexului telomerazic, accelerân d pro cesele de
fibroză și ciroză [65] . Mutațiile la nivelul promoterului genei TERT reprezintă unele dintre cele
mai comune mutații din cadrul carcinoamelor hepatocelulare, fiind întâlni te în 30 -60% dintre
CHC -uri [66] . Aceste mutații determină apariția a noi site -uri de legare a factorului de
transcripție ETS, determinând o creștere a expresiei transcriptului genei TERT . Caracterul

11
carcinogenic inițiator al mutațiilor în cadrul TERT , este susținut și de prezența acestora în până la
25% dintre leziunile pre neoplazice [66]. În schimb, prevalența mutațiilor la nivelului
promoterului acestei gene este mult mai mică în cazul carcinoamelor hepatocelulare determinate
de infecția cu VHB. Acest aspect poate fi explicat prin faptul că virusul hepatitic B determină
integrarea unor porțiuni din ADN -ul viral în locusul genei TERT , având astfel rol de mecanism
complemen tar în activarea telomerazei [67] .
2.1.2. Mutații ale genei p53 . În mod obișnuit, gena p53 promovează oprirea ciclului
celular și apoptoza. Mutațiile care implică această genă, măresc susceptibilitatea celulelor
hepatice la anumiți factori carcinogeni, și poate promova dezvoltarea de carcinom hepatocelular
cu fenotipuri mai agresive [68]. Frecvența cu care mutațiile genei p53 sunt întalnite în CHC,
variază între 18% și 50%, în funcț ie de etiologiile subiacente [67,69] . În mod particular,
expunerea la aflatoxină (AFB1) determină o mutație specifică a genei p53 (codonul 249).
Această mutație este considerată a fi inițiatoare a procesului de carcinogeneză dat fiind faptul că
a fost observată și în ficatul normal al pa cienților expuși la aflatoxine [70]. În cadrul inducției
CHC, există un sinergism între expunerea la aflatoxină și infecția cronică cu VHB. Expresia
proteinei HBx este asociată cu un risc de doua ori mai mare de dezvoltare a mutației G/C – T/A
în gena p53, în urma expunerii la AFB1 [71].
2.1.3. Mutații somatice asociate infecției cu VHB . VHB promovează carcinogeneza nu
doar prin intermediul cirozei, ci și prin mecanisme dependente de integrarea genomului viral în
cel al celulelor gazdă [72]. Genele hepatocitelor care reprezintă ținta cea m ai frecventă pentru
integrarea genomului viral includ TERT, MLL4, RARβ, CCNE1, Cyclin A2, FN1, ROCK1,
SENP5, ANGPT1 , receptorul factorului de creștere derivat din plachete (PDGF, platelet -derived
growth factor), genele proteinelor ribozomale, și receptorul factorului de creștere epidermic
(EGFR, epiderm al growth factor receptor) [72] . Aceste integrări genomice pot acționa atât în
mod indirect, cât și în mod direct în dezvoltarea CHC. De exemplu, gena MLL4 codifică o
proteină cu roluri importante în modifica rea epi genetică a expresiei genice . Mai mult, integrarea
virală poate să determine deleții și translocații în genomul gazdă, crescând instabilitatea
crmozomială, care, la randul ei, are r ol in inițierea tumorală [73] .
2.2 Modifică ri epigenetice
Mecanismel e epigenetice presupun alterări în cadrul proceselor de metilare,
hidroximetilare, sau acetilare a anumitor regiuni din ADN sau a histonelor, fără alterarea
secvenței genomice. Aceste procese contribuie la carcinogeneză prin mecanisme care includ

12
transcrip ția genică, stabilitatea cromozomială și diferențierea celulară. Hipometilarea globală, în
cadrul CHC, promovează instabilitatea cromozomială și genică, în timp ce hipermetilarea
regională este, de cele mai multe ori, asociată cu afectarea genelor supresoa re de tumori [74].
Infecțiile cronice cu VHB sau VHC pot cauza dereglarea procesului de metilare în cadrul
procesul ui de hepatocarcinogeneză [75] . De asemenea, anumite modificări la nivelul histonelor
au fost corelate cu carcinomul hepatocelular. Astfel, n ivelurile crescute de H3K4me27 au fost
asociate cu agresivitate crescută a tumorii, caracterizată prin invazie vasculară, dimensiuni
tumorale mari, diferențiere slabă, și prognostic nefavorabil [76]. Mai mult, remodelarea
cromatiniană pare, de asemenea, să aibă un rol în dezvoltarea carcinomului hepatocelular [77].
2.3 Căi de semnalizare celulară în hepatocarcinogeneză
În cadrul proceselor de carcinogeneză sunt frecvent implicate multiple alterări ale unor
căi de semnalizare celulară. Și în cazul carcinomului hepatocelular au fost observate dereglari ale
unora dintre aceste căi. Modificările hepatice induse de către infecțiile virale sau de către
expunerea la factori hepatotoxici, determină supraexprimarea anumitor componente ale acestor
căi de sem nalizare. Wnt/β -catenina este una dintre caile de semnalizare cu implicații majore în
dezvoltarea CHC. În alterările acestei căi implicate apariția de mutații în gena β -cateninei
(CTNNB1 ), cu o prevalență de 18% până la 40% dintre cazurile de CHC, cât și mutații în genele
AXIN1 și AXIN2 [69]. De asemenea, o altă cale cu importanță majoră este cea a receptorilor
tirozin -kinazici [78].
2.3.1. Calea de semnalizare Wnt/β -catenină . Semnalizarea Wnt joacă roluri cruciale în
diverse procese, care includ prolifera rea celulară, supraviețuirea, migrarea și polarizarea
celulelor, dezvoltarea embrionică, și auto -reinnoirea celulelor stem [79]. Aproximativ 95% dintre
carcinoamele hepatocelulare au prezentat dereglari la nivelul cascadei de semnalizare Wnt [80].
Calea d e semnalizare inițiata de Wnt poate fi activată atât în prezența beta 1 cateninei
(CTNNB1 -dependentă), căt și în lipsa acesteia (CTNNB1 -independentă). Dereglarea căi Wnt
dependenta de catenină pare a juca un rol esențial în inițierea hepatocarcinogenezei [81]. Calea
independentă are roluri mai puțin elucidate în dezvoltarea CHC. Unele studii au demonstrat o
implicare a acesteia în dezvoltarea CHC [80, 82] . Totuși, a fost observat ă și existența unui
anatgonism între liganzii căii independente și calea CTNNB1 -dependentă, inhibând proliferarea
și migrarea celulelor hepatice carcinomatoase [83].
2.3.2. Căi de semnalizare ale receptorilor tirozin -kinazici. În aproximativ 50% dintre
carcinoamele hepatocelulare există o activare intensă a căilor de semnalizare MAPK /ERK (Ras –

13
mitogen -activated protein kinase) și PI3K (fosfatidilinozitol 3 -kinaza) -Akt kinaza [78].
Activarea că ii Ras/Raf/MEK/ERK (MAPK), determină, la rândul ei , activarea protooncogenei
cFos și a factorul ui de transcripție AP -1/c-Jun, crescând expresia unor proteine care stimulează
proliferarea celulară [84]. Activarea căii PI3K -Akt prin receptorii insulinici sau cei ai IGF
(insulin growth factor) determină întreruperea căii mTOR (mammalian target of rapamyc in),
promovând astfel carcinogeneza; fenomen care apare în aproximativ 40 -50% dintre cazurile de
CHC [85]. Sorafenibul, care este în prezent singura terapie aprobată pentru tratamentul CHC în
stadiul avansat, acționează prin blocarea căii Ras/MEK/ERK [86].
Există numeroase alte căi de semnalizare celulară care prezintă implicații în inițierea și
progresia carcinomului hepatocelular, la fel cum există și un număr mult mai mare de modificări
genetice și epigenetice asociate cu CHC. Totuși, indiferent de compl exitatea acestor modificări și
de asocierea lor cu diverșii factori etiologici, apare evidentă o cale comună a patogenezei CHC,
în care o afectare hepatocitară repetată determină un cerc vicios de moarte și regenerare celulară
care determină în final insta bilitate genomică și inițierea procesului de hepatocarcinogeneză.
3. Diagnosticul CHC
3.1 Aspecte clinice
Cele mai multe cazuri de CHC sunt asimptomatice, cu caracter insidios, din acest motiv
este dificil de diagnosticat înainte de a atinge un stadiu ava nsat. Pacienții care dezvoltă CHC nu
prezintă de obicei semne sau simptome cu excepția celor corelate cu boala hepatică cronică de
care aceaștia suferă. Poate fi identificat o dată cu apariția unor complicații ale cirozei hepatice
precum ascita, encefalopa tie, hemoragie digestivă superioară, icter. Aceste complicații sunt
adesea asociate cu extensia tumorală în venele hepatice și în vena portă sau cu șuntarea
arteriovenoasă indusă de tumoră [87].
CHC poate fi însoțit într -un stadiu incipient de prezența se mnelor generale, sau
modificări nespecifice de boală, sau poate fi diagnosticat în evoluția bolii hepatice atunci când se
suprapune semnelor și simptomelor bolii de fond. Pot sa apară anorexie, durere abdominală,
senzație de plentitudine, scădere ponderală , tumoră abdominală, ascită, febră, icter, greață,
vărsături, edeme, hematemeză și melenă [88]. Unii pacienți pot prezenta durere ușoară spre
moderată la nivelul etajului abdominal superior, cu precădere in hipocodrul drept, scădere
ponderală sau sațietate precoce. Stadiile avansate pun în evidență, ficatul de dimensiuni
considerabile, cu suprafață netedă, neregulată sau chiar nodulară, cu durere pe aria de proiecție a
acestuia și chiar posibila apariția a unor sufluri la nivelul tumorii [89].

14
Modalitatea d e debut a bolii este diversificată, putându -se prezenta sub diferite forme
date fie de apariția complicațiilor cirozei sau a complicațiilor tumorale în sine. Ascita poate
reprezenta semnul de deplasare la medic și de cele mai multe ori este rezultatul evol uției cirozei
și hipertensiunii portale. Cu toate acestea poate să apară și în evoluția CHC prin invazia
peritoneului de tumora primară, metastazare, obstrucția venelor hepatice.
Febra în CHC poate fi asociată nu numai cu infecție și endotoxemie legate de ciroză, dar
și de mai multe afecțiuni asociate prezenței tumorii cum ar fi ruptura în cavitatea peritoneală,
obstrucția căii biliare urmată de infecție dar și febra de etiologie tumrală [88].
Ruptura tumorală în cavitatea peritoneală se produce adesea sp ontan și este caracterizată
de șoc și anemie progresivă, iar pacienții acuză durere abdominală severă și o senzație de
plentitudine abdominală. Ruptura tumorală se observă cel mai des la pacienții cu CHC avansat,
însă poate fi observată uneori și la cazuri le cu tumoră de dimensiuni mai mici. Unii noduli de
CHC au tendința la creștere extrahepatică [90], iar acest aspect combinat cu faptul că majoritatea
nodulilor de CHC sunt hipervascularizați [91], poate fi consecința rupturii acestora la nivelul
cavității peritoneale, chiar și în stadiile incipiente.
Icterul poate apărea în stadiile avansate de CHC. Se datorează fie insuficenței hepatice
și/sau obstrucției tumorale a tractului biliar [92]. Invazia vasculară poate duce la apariția
sindromului Budd -Chiari, sau chiar la afecțiuni trombotice cel mai frecvent cu invazia tumorală
a atriului drept [93].
CHC este considerat ca având o incidență relativ redusă de metastazare la distanță [94].
Cu toate acestea, cazurile private de semne și simptome ale bolii hepa tice pot prezenta inițial
manifestări caracteristice determinărilor secundare – osoase (grilaj costal, mandibula, coloană
vertebrală) cu durere severă, fracturi patologice și paralizie, întreruperea transversă a măduvei
spinale și sindromul Brown -Sequard în cazul unor metastaze spinal, pulmonare cu apariția
semnelor respirat orii, hepatice, cerebrale etc. La nivel de ganglioni limfatici și peritoneu,
metastazele pot apărea la un numar foarte mic de pacienți suferind de CHC [88].
Manifestările paraneoplazice asociate sunt diverse, dar cele mai frecvente sunt
reprezentate de hipoglicemie și policitemie (eritrocitoză). Mai putem întâlni sindromul carcinoid,
hipercalcemie, hipertensiune, osteoartropatie hipertrofică, neuropatie, osteo poroză, polimiozită,
porfirie, tulburări sexuale, tireotoxicoză, tromboflebită migratorie, sindrom diareic.

15
3.2 Investigații paraclinice
3.2.1 Investigații de laborator
În cazul acestor investigații este de așteptat ca testele să fie mult mai alterate atunci când
CHC este însoțit de ciroză hepatică sau de alte patologii. Excepțiile fiind gama –
glutamiltranspeptidaza și fosfataza alcalină a căror nivel crescut sugerează efectul cancerului de
―ocupare al spațiului‖ [95].
Alfa-fetoproteina (AFP) este un ma rker cu un cost scăzut și reprezintă o opțiune atractivă
pentru screening fiind utilizat pentru diagnosticul precoce, monitorizarea și recuranța CHC. Din
nefericire are o sensitivitate de doar 40 -64% deoarece multe tumori nu produc AFP deloc sau
doar în st adiile avansate. Prin urmare nivelul de AFP poate fi subiect de intrepretare eronată.
Când are valoare ridicată, AFP are o specificitate de 75 -91%, iar la valori mai mari de 400
ng/mL este considerată ca fiind o bun indicator a diagnosticului de CHC în con textul clinic
potrivit, mai ales daca este cuplat cu rezultate radiologice potrivite [ [96]. Valori normale ale
AFP nu exclud CHC. Markeri biologici mai eficienți, inclusiv variante ale AFP reprezintă
obiectul cercetărilor curente în diagnosticul b iologic al CHC [97].
Pe lângă AFP poate fi utilizată o gamă largă de biomarkeri, dar utilitatea acestora depinde
și de contextul clinic. Tabelul următor conține unii dintre markerii utili în cadrul diagnosticării
CHC și utilitatea clinică a acestora (Tabe lul II). Valoarea diagnostică pentru CHC a acestor
markeri serici variază de la caz la caz, dar asocieri ale acestora determină o creștere
semnificativă a acurateții diagnostice (Tabelul III) [98-100].
Pe parcursul bolii pot să apară și alte modificări ale constantelor biochimice de cele mai
multe ori fiind cele ce apar în boala hepatică cronică, în evoluția cirozei hepatice date de
decompensarea bolii cu modificările caracteristice ale hemoleucogramei, ale glicemiei, ale
funcției renale, modificări ale metabolismului lipidic, alterarea fluxului biliar, prezența
sindrumului de citoliză.

16
Tabelul II. Reprezentarea biomarkerilor utilizați în diagnosticul CHC și utilitatea acestora
Marker pentru CHC Utilitate clinică
AFP reactivă la aglutinine (AFP -L3%) Diagnostic precoce, prognostic, invazie vasculară
Des-gama -carboxi -protrombina (DCP) Diagnostic precoce, prognostic, invazia venei porte
și metastazare
Gama -glutamil -transferaza Diagnostic precoce, complementaritate cu alți
markeri
Glipican -3 Diagnostic precoce
Fosfoproteina Golgi 2 Agresivitate tumorală
Carbonil reductaza umană 2 Prognostic
Alfa-1-fucozidaza Diagnostic precoce
Factorul transformator de creștere beta Invazivitate tumorală
Factorul transformator de creștere b (TGF –
b) Prognostic al invaziei tumorale
Factorul specific de creștere tumorală Complementaritate diagnostică cu alți markeri
Factorul de creștere hepatocitar (HGF) Prognostic și recurența bolii/metastazare și
supraviețuire redusă
Familia receptorilor factorilor de creștere
epidermală Recurență precoce
Micro ARN -uri Răspândire turmorală și supraviețuire

Tabelul III. Reprezentarea sensibilității și sensibilității a valorii diagnostice în CHC a
biomarkerilor
Biomarker Sensibilitate (%) Specificitate (%)
AFP 67.7 71.0
AFP -L3 61.6 92.0
DCP 72.7 90.0
AFP -L3 + AFP 73.7 86.6
AFP -L3 + DCP 84.8 97.8
DCP + AFP 84.8 90.2
AFP -L3 + DCP + AFP 85.9 59.0

17

3.2.2. Investigații imagistice
Diagnosticul histologic al CHC este necesar destul de rar astăzi deoarece există
numeroase alternative imagistice non -invazive. Computer tomografia (CT), Imagistica prin
rezonanță magnetică nucleară (IRM) și ultrasonografia cu substanță de contrast (CEUS) sunt
larg disponibile la nivel global și au înlocuit în mare biopsia și angiografia convențională în
diagnosticarea CHC [101] .
Ultrasonografia (US)
Deși US este utilizată în general pentru screening, nu oferă suficiente detalii anatomice
pentru a planifica o rezecție chirurgicală sau o ablație, mai ales pentru că leziunile mici nu pot fi
detectate prin această metodă. Cercetările realizate în trecut au sugerat că sensitivitatea US este
doar de 60% [102] .

Figura 2. Algoritm de diagnosti c al evidențierii unei formațiuni hepatice la
ultrasonografie (US)

18
În general CHC apare ca o masă rotundă sau ovalară cu margini ascuțite și netede.
Leziunile variază în ecogenitate de la hipoecogenice la hiperecogenice în funcție de parenchimul
înconjurător și gradul de steatoză. Limita dintre CHC și parenchimul hepatic neafectat poate fi
imposibil de distins în cazul CHC nodular. Folosirea metodei Doppler pentru a caracteriza
leziunea poate fi utilă deoarece este destul de probabil ca CHC să aib ă o vascularizație arterială
și o neovascularizație bogată față de nodulii regenerativi din ciroza hepatică (Figura 2) .

19
Cap. II. Nanoparticulele magnetice (NPM)

1. Toxicitate a nanoparticulelor magnetice
Nanoparticulele magnetice au anumite proprietăți de bază care le fac potrivite pentru
realizări inovative în medicină. Totuși, aceleași proprietăți pot de asemenea să fie responsabile
de efecte citotoxice, având potențialul de a afecta componente celulare cu importanță majoră,
acestea incluzând mito condriile, nucleul și ADN -ul. Deci, creșterea continuă a interesului față de
NPM și obținerea progreselor majore în nanomedicină sunt factori care aduc si necesitatea unor
investigații cât mai precise atât asupra efectelor toxicologice ale acestor nanoparticule, cât și a
urmărilor pe termen lung asupra sănătății umane. Din această cauză, în ultimele decenii, multiple
studii au avut ca obiectiv caracterizarea cât mai meticuloasă a principalelor inconveniente care
sunt inerente utilizării nano particulelor din oxid de fier.
1.1. Mecanismele toxicității
În general, IONs sunt considerate biocompatibile, neavând efecte toxice severe in vivo .
Totuși, toxicitatea pe care o prezintă este considerată dependentă de doză. Principalul mecanism
prin care N P din oxid de fier pot determina alterări celulare implică producția de specii reactive
de oxigen (reactive oxygen species, ROS). Acești produși includ anioni, radicali hidroxil, și
peroxizi de hidrogen, toți reprezentând produși intermediari rezultați în cadrul metabolismului
oxidativ care are loc la nivel mitocondrial. Celulele răspund la nivelurile crescute de ROS prin
reacții dependente de activitatea unor enzime care au rolul de a reduce nivelul stress -ului
oxidativ (ex. superoxid dismutaza, glutation oxidaza). Nu este clar stabilită natura mecanismelor
prin care IONs induc creșterea producției de ROS; totuși, acestea par a fi în legătură directă cu
activitatea de tip peroxidază -like a acestor particule, promovată în mediul acid din interiorul
lizozomil or [103] . De asemenea, atât interacțiunile dintre ionii de fier și mitocondrii, cât și
activarea anumitor căi de semnalizare celulară fac parte din mecanismele propuse a fi
determinante în creșterea producției de ROS [103] . Supraproducția acestor specii re active de
oxigen a fost corelată cauzal cu peroxidarea lipidică [104] , afectarea structurală a ADN -ului
[105] , alterări în cadrul proceselor de transcripție [106] , și generarea de radicali proteici [107]
(Figura 3). Stress -ul oxidativ excesiv afectează sis temul imun și a fost, de asemenea, corelat cu
diverse afecțiuni incluzând boli cardiovasculare [108] , cancer [109] , boli inflamatorii [110] ,
diabet [111] , boala Parkinson [112] , și poliartrită reumatoidă [113] .

20

Figura 3 . Mecanisme generale ale toxicității IONs. ROS, specii reactive de oxigen

Administrarea sistemică a IONs permite acestora o acumulare nespecifică în sistemul
mononuclear fagocitar (mononuclear phagocyte system, MPS), în special la nivelul ficatului și
splinei [114] . Nanoparticul ele ajung prin endocitoza în interiorul celulelor Kupffer și al
macrofagelor splenice, unde sunt degradate, eliberând fier și alterând astfel homeostazia celulară.
Fierul eliberat este stocat sub formă proteică (feritină și hemosiderină). Totuși, când este depășită
capacitatea de stocare a acestor proteine, acesta rămâne liber și determină creșterea producției de
ROS .
Toxicitatea IONs depinde de anumiți parametri fizico -chimici ai acestora, incluzând aici
dimensiunea, forma, dispersia, și caracteristicile chimice ale suprafeței. Dimensiunea mai mică a
particulelor implică o arie de suprafață mai mare, iar aceste difere nțe în ariile de suprafață au fost
corelate cu o cr eștere a citotoxicității [115] . Totuși, există și studii care nu au găsit diferențe
semnificative în toxicitatea dependentă de suprafață. Unul dintre acestea, efectuat pe linia
celulară A549, a evaluat efe ctele toxice ale nanoparticulelor de Fe 3O4 (20–30 nm, arie de
suprafață: 42 m2/g) și Fe 3O4 (5 μm, arie de suprafață: 6.8 m2/g). Ambele tipuri au determinat in

21
vitro moarte celulară, afectare mitocondrială, și afectare structurală a ADN -ului. Totuși, nu au
existat diferențe semnificative între toxicitatea cauzată de Fe 3O4 (20–30 nm) și cea a Fe 3O4 (5
μm) [116] . De asemenea, forma nanoparticulelor determină variații în ceea ce privește tipul și
intensitatea citotoxicității. În comparație cu nanoparticulele c u formă sferică, cele cu formă de
bastonaș determină apariția unui grad mai înalt de necroză celulară [117] . Cele din urmă se
acumulează, în mare parte, sub forma liberă în citoplasmă, în timp ce NP sferice sunt agregate în
structuri vacuolare. Particulari tățile celor sub formă de bastonaș, și care pot explica diferențele
mari în toxicitate, includ raportul crescut suprafață/volum, endocitoza nespecifică, și afectarea
membranei celulare [117] .
Tipul materialului de înveliș și produșii de degradare ai ace stuia au rol important în
profilul toxicologic. Moleculele de IONs fără înveliș prezintă tendință la precipitare, apărând
astfel aglomerarea particulelor. Adăugarea unui înveliș nu determină numai stabilizarea
nanoparticulelor, ci previne și eliberarea ion ilor toxici. Există numeroase diferențe între
suprafețele nanoparticulelor neacoperite și cele acoperite cu diverse învelișuri, iar aceste
diferențe au fost luate în considerare în cadrul studiilor care au evaluat diferitele profiluri de
toxicitate ale mu ltiplelor tipuri de IONs [118] . Diversitatea foarte mare a învelișurilor face foarte
dificilă caracterizarea exactă a unui profil de toxicitate sau stabilirea unui algoritm ideal pentru
alegerea tipului potrivit de IONs. Totuși, până în prezent, adăugarea unui înveliș la NPM pare a
minimiza nivelul de toxicitate prin reducerea alterării homeostaziei fierului și prin reducerea
stress -ului oxidativ [119] . Aceste aspecte pot fi explicate, cel puțin parțial, printr -o scădere a
eliberării de ioni de fier și scăd erea degradării lizozomale, ambele dat orate prezenței învelișului .
1.2. Modificări morfologice și efecte le genotoxice
Expunerea celulelor la IONs poate determina alterări în morfologia celulară, în
citoschelet, și în motilitate [120] . Interacțiunea in vitro dintre IONs și celule endoteliale
determină alungirea acestora după un timp de incubare de 12 h [121] . Aceste modificări apar, cel
mai probabil, atât în urma adsorbției particulelor pe membrana celulară, cât și prin interacțiunea
dintre acestea și pr oteine cheie din j oncțiunile intercelulare .
Nanoparticulele din oxid de fier pot determina efecte genotoxice atât în urma
interacțiunii directe dintre ionii de Fe și materialul genetic, cât și prin mecanisme indirecte care
implică apariția s peciilor reac tive de oxigen . Indiferent de mecanismele prin care acționează,
nanoparticulele pot afecta nu doar structura ADN -ului (rupturi, oxidarea nucleotidică,
crosslinking), ci și procesele de transcripție și replicare. În plus, pe lângă afectarea propriu -zisă a

22
ADN-ului, NPM pot crește expresia unor gene asociate cu menținerea integrității endoteliale
[122] , funcția lizozomală [123] , activarea caspazelor [124] și a citokinelor [125] , și a unor gene
ale căror produși sunt implicați în metabolismul fierului [126] . Profilul citogenetic al unui
anumit tip de IONs variază considerabil în funcție de proprietățile fizico -chimice ale acestora.
Până în prezent, diferențe majore în genotoxicitate au fost d eterminate de dimensiune , proprietăț i
chimice ale suprafeței, compozi ția chimică , și dispersie.
1.3. Testarea toxicității in vitro și in vivo
Forma, dimensiunea, aria de suprafață, învelișul, tendința la agregare sunt caracteristici
cu impact semnificativ asupra rezultatelor toxicologice obținute în urma testării in vitro . Astfel,
este reflectată meticulozitatea necesară în caracterizarea fizico -chimică a NPM pentru urmărirea
cât mai clară a efectelor toxice pe culturi de celule. În principal, modificările urmărite în
evaluarea in vitro a interacțiunii dintre celule și IONs sunt integritatea membranară, activitatea
metabolică și modificările materialului genetic.
Dintre numeroasele caracteristici fizico -chimice cu rol în modificarea profilului
toxicologic, învelișul pare a avea importanță superioară. De aceea, numeroase s tudii au investigat
rolul acestuia în apariția citotoxicității. În această privință, majoritatea rezultatelor arată o
scădere considerabilă a toxicității in vitro în urma conjugării nanoparticulelor cu diverși
compuși, în comparație cu nanoparticulele fără înveliș. O creștere a toxicității a fost observată în
urma utilizării IONs acoperiți cu polietilenimina pe culturi de celule KB, cu dispariția acestei
citotoxicități în urma acetilării și conjugării cu polietilenglicol (PEG) [127] . Deși nanoparticulele
cu înveliș par a avea o toxicitate redusă, acest răspuns este asociat și cu dimensiunea particulelor.
În liniile celulare PAEC, IONs fără înveliș cu dimensiuni de 30 nm (0.5 mg/ml) induc o
producție mai mare de ROS în comparație cu cele fără înveliș dar cu d imensiuni de 5 nm (0.5
mg/ml); în timp ce IONs conjugate cu dextran și cu PEG nu au dovedit modificări ale producției
de ROS la concentrații similare [128] . Mai mult, același studiu a raportat o alungire celulară și o
perturbare a structurii citoscheletale în urma interacțiunii cu IONs (30 nm, 0.5 mg/ml). De
asemenea, scăderea efectelor toxice a fost demonstrată și în cazul conjugării nanoparticulelor din
oxid de fier cu chitosan (CSO -IONs) [129] . În plus, incubarea IONs fără înveliș cu trei linii
celulare (A549, HeLa și Hek293) a demonstrat o toxicitate dependentă de doză și de timp, dar cu
o scădere considerabilă a acestei toxicități în urma incubării celulelor cu CSO -IONs [129] .
Mecanismele complexe de menținere a homeostaziei in vivo nu pot fi mimate de către
sistemele in vitro . Din această cauză, până în prezent nu s -au putut efectua corelații suficient de

23
satisfăcătoare între efectele toxicologice ale NPM pe culturi de celule și cele observate in vivo ,
existând factori diferiț i de c are depind fiecare [130]. Căile de administrare a nanoparticulelor de
fier influențează interacțiunile primare ale acestora și internalizarea celulară. Organele care
captează cea mai mare parte a IONs sunt cele care conțin un număr mare de celule ale siste mului
mononuclear fagocitar (ficat, splină, plămâni). În mod implicit, principalele efecte toxice vor fi
în legătură cu organele în care acumularea este predominantă. Administrarea intravenoasă sau
prin inhalații determină acumularea nanoparticulelor în fi cat, splină, rinichi, creier, testicule, și
plămâni [131, 132] . Trecerea barierei cerebrale are loc și în urma administrării prin injecție
intraperitoneală, dar fără tulburări funcționale sau toxicitate aparentă la nivelul țesutului cerebral
[133] . Trecere a nanoparticulelor prin bariera cerebrală are loc, probabil, prin intermediul
organelor circumventriculare [133] .
In vivo , profilele de toxicitate prezintă variații și în funcție de modelul de animal
experimental. Astfel, în urma administrării intravenoa se la șoricei, au fost înregistrate creșteri ale
aspartat transaminazei (AST) și alanin transminazei (ALT), indicâ nd alterarea funcției hepatice
[131] . Deși nu au existat modificări în alți parametri analizați (uree serică, albumină, proteine
totale fofata za alcalină etc.), transaminazele s -au menținut la un nivel ridicat timp de 30 de zile.
Administrarea la șobolani a aceluiași tip de nanoparticule a determinat de asemenea o creșterea a
valorilor AST și ALT, dar acestea au revenit la normal după 3 zile [134]. Discrepanțele pot fi
explicate fie prin diferitele caracteristici ale fiecărui model experimental, fie prin metodele
specifice de preparare a nanoparticulelor. În plus față de aceste modificări, studiile hematologice
efectuate pe șoricei, după administ rarea IONs, au arătat o ușoară creștere a numărului de
neutrofile la o zi după administrare, cu revenirea la normal a acestora după o lună [131] . În final,
este demonstrată siguranța utilizării nanoparticulelor din oxid de fier la concentrații sub 100
mg/ml, efectele toxice majore fiind asociate cu concentrații ce depășesc această valoare [135] .
Există un număr limitat de studii efectuate pe pacienți, care au putut oferi informații
valoroase asupra potențialului toxic al nanoparticulelor din oxid de fier . Unul dintre aceste studii
a avut ca scop evaluarea eficienței și siguranței compusului ferumoxtran 10, folosit ca substanță
de contrast în diagnosticarea prin IRM a metastazelor nodulilor limfatici [136] . În urma
administrării acestui compus, 28% dintre pacienți (43 din 152) au avut unul sau mai multe efecte
adverse. Cele mai frecvente efecte adverse au fost cefaleea, durere lombară, vasodilatație
periferică, urticarie, fiecare apărând în 6% dintre pacienți. Majoritatea acestor efecte au debutat
la o oră după administrare, au fost ușoare sau moderate, iar după 24 h au dispărut. În plus, nu au
existat modificări ale testelor de laborator [136] .

24
2. Biodistribuție și biodisponibilitate
Nanoparticulele din oxid de fier prezintă numeroase posibilități de aplic abilitate în
medicină. De aceea, datorită corelațiilor observate între biodistribuție și modul de administrare,
există și un număr crescut de căi de administrare care pot determina mărirea eficienței acestora în
diagnostic sau tratament. Deci, diversitatea mare a posibilelor aplicații a făcut necesară evaluarea
rutelor care pot influența în mod pozitiv acumularea acestora în organele de interes, cu
minimizarea efectelor toxice.
În funcție de diametrul hidrodinamic, IONs se împart în trei categorii: oral I ONs 300 nm
– 3.5 mm, standard IONs (S -IONs) 50 – 150 nm, și ultrasmall IONs (U -IONs) <50 nm. Un
diametru între 10 și 100 nm este optim pentru administrarea intravenoasă, în timp ce particulele
>200 nm sau <10 nm sunt captate de către splină sau sunt elimin ate de către rinichi [137] .
Totuși, în cea mai mare parte, atât biodistribuția generală, cât și internalizarea celulară,
metabolismul și toxicitatea, sunt determinate de calea de administrare și de proprietăț ile
suprafeței particulelor .
Abordul intraven os pentru administrarea nanoparticulelor din oxid de fier a fost cea mai
meticulos investigată. După administrarea intravenoasă, IONs se distribuie în mai multe organe
și țesuturi, incluzând ficat, splină, colon, plămâni, măduv a osoasă , organe limfatice [138,139].
Sistemul mononuclear fagocitar influențează în mare parte biodistribuția nanoparticulelor în
urma injectării intravenoase. Astfel, în mod tipic, distribuția finală a S -IONs este 80% -90% în
ficat, 5% -8% în splină și 1% -2% în măduva osoasă [140] . Această biodistribuție poate fi totuși
modificată, în diverse măsuri, și în funcție de caracteristicile fizico -chimice ale particulelor. În
urma internalizarii celulare, IONs se depozitează în endozomi/lizozomi unde se descompun în
fier liber, care ajunge tr eptat în citoplasmă, putând eventual să conducă la toxicitate prin
mecanismele menționate. Distribuția nanoparticulelor este urmată rapid de un clearance din
circulația sistemică prin intervenția macrofagelor din ficat și splină, având un timp de
înjumătăț ire mic [141] . În mod normal, opsonizarea particulelor si clearance -ul acestora depind
de diametru si de caracteristicile suprafeței [142,143] . Spre deosebire de S -IONs, particulele cu
diametrul mai mic de 50 nm au timpul de înjumătățire mai lung [144] . În plus, diametrele de 20
de nm sau mai puțin, favorizează mai mult captarea de către țesutul tumoral, scăzând -o pe cea de
la nivel hepatic [145] . Totuși, diametrele prea mici (sub 5 nm) favorizează trecerea
nanoparticulelor prin glomerul, fiind eliminate renal [146] . La 100 de zile după administrarea
intravenoasă, IONs sunt eliminate complet din organele majore, nefiind observ ată toxicitate
persis tentă [147] .

25
După administrarea prin injecție locală (ex. în tumoră), nanoparticulele sunt transportate
pasiv în spațiile interstițiale, concentrația fiind maximă în jurul zonei de injecție, făcând din
aceasta o metodă valoroasă pentru tehnicile locale de tratament. Administrarea prin inhalații
permite traversarea nanoparticulelor atât prin membrana alveolo -capilară, cât și prin bariera
cerebrală și endoteliul de la nivel testicular [148]. În urma administrării intraperitoneale,
nanoparticulele sunt redi stribuite rapid în organele majore, excepție făcând țesutul pulmonar
unde distribuția acestora este neglijabilă [149] . Concentrațiile cele mai mari sunt prezente în ficat
și splină, urmate de testicule, rinichi și inimă [149] .
Alte abordări pot include administrarea nanoparticulelor direct în sistemul vascular
aferent unui organ, putând determina, cel puțin teoretic, o concentrație mai mare la nivelul
organului țintă, cu o minimă captare a acestora la nivelul altor organe. Dezavantajele acestor
posibile abordări rezidă din dificultatea întâmpinată în obținerea accesului vascular la anumite
organe. Totuși, tehnici precum ecoendoscopia pot facilita abordarea unor vase de sânge aflate în
apropierea tractului gastrointestinal [150] , oferind suport adițional p entru stabilirea unor noi
metode de distribuire a nanoparticulelor magnetice în ficat sau pancreas.
3. Posibilități diagnostice și terapeutice
Este evident faptul că pentru îndeplinirea atât a scopurilor diagnostice, cât și a celor
terapeutice, obiectivul principal constă în acumularea nanoparticulelor cu preponderență în
tumoră sau, în unele cazuri, în întreg organul de interes. Există două tipuri de mecanisme prin
care IONs se pot acumula preferențial într -o tumoră sau într -un organ, acestea constând în
acumulare pasivă și acumulare activă, cea din urmă depinzând de utilizarea unui câmp magnetic
sau a anumitor liganzi care vor determina transportul preferențial al NPM spre o anumită zonă.
3.1. Acumularea pasivă
Acumularea pasivă se bazează pe proprietăți le fizico -chimice ale nanoparticulelor care
pot dirija distribuția acestora. Acest tip de distribuție prezintă importanță majoră în special în
cadrul diagnosticului tumoral prin IRM. Pe lângă acumularea pasivă tipică, bazată pe captarea
IONs preferențial î n ficat și splină, există și un alt tip de acumulare, bazată tot pe mecanisme
pasive, care determină acumularea particulelor în interiorul tumorilor solide. La baza acestora
stau anumite caracteristici ale tumorilor solide determinate de angiogeneza tumora l-indusă și de
drenajul limfatic insuficient. Această angiogeneză tumorală produce vase de sânge anormale, cu
numeroase fisuri, permițând extravazarea sângelui în spațiul interstițial. Prezența acestor fisuri
împreună cu drenajul limfatic insuficient, cond uc la apariția efectului de permeabilitate și

26
retenție ridicate (enhanced permeability and retention effect, EPR), întâlnit în cadrul anumitor
tumori solide [151] . În consecință, datorită efectului EPR, nanoparticulele cu dimensiuni între 10
și 100 nm se p ot acumula preferenția l în interiorul tumorii .
3.2. Acumularea activă
Acumularea activă reprezintă o strategie promițătoare pentru captarea nanoparticulelor
magnetice în interiorul unei tumori fie prin dirijarea acestora cu ajutorul unui câmp magnetic
extern, fie prin utilizarea unor liganzi cu o afinitate înaltă față de celulele tumorale.
Polietilenimina și acidul hialuronic fac parte din grupul celor mai folosiți liganzi cu afinitate
pentru anumite structuri moleculare de pe suprafaț a celulelor tumorale . Pe lângă aceștia, alți
liganzi care au fost studiați includ anticorpi, peptide, lectine, fragmente proteice [146,152,153] .
De asemenea, o altă modalitate de acumulare activă se bazează pe aplicarea la suprafața
tumorilor a unui câmp magnetic care determi nă atragerea către zona de interes a nanoparticulelor
complexate cu diverse molecule active [154] .
3.3. Posibilități de diagnostic
În ultimele decenii, imagistica oncologică a înregistrat o creștere considerabilă în
numărul metodelor de diagnostic ce pot oferi atât informații anatomice, cât și fiziologice. Până în
prezent, imagistica prin rezonanță magnetică (IRM) a evoluat într -o teh nică cu multiple aplicații,
și a devenit unul dintre cele mai potente instrumente în diagnosticul imagistic neinvaziv. Orice
îmbunătățire a metodei, adăugată avantajelor deja existente, aduce beneficii imense în creșterea
eficienței diagnosticului imagisti c. Integrarea nanotehnologiei în cadrul tehnicilor de imagistică a
produs progrese considerabile, promovând cercetarea continuă, și a determinat îmbunătățirea
unor parametri ca sensibilitate, specificitate, rezoluție spațială și temporală, și anumite capac ități
cantitative.
IRM este o tehnică tomografică, neinvazivă care se bazează pe manipularea momentelor
magnetice inerente nucleilor atomici endogeni. Imaginile sunt obținute prin expunerea nucleilor
la un câmp magnetic static, oferindu -le o magnetizare de echilibru, care este perturbată prin
pulsuri repetitive de radiofrecvență [155] . În urma acestor modificări sunt înregistrați timpii de
relaxare T1 (spin -lattice relaxation) și T2 (spin -spin relaxation) [155] . Valorile acestor doi
parametri diferă pentru fiecare țesut în funcție de densitatea protonilor, apărând astfel un contrast
endogen dependent de caracteristicile fizi ce și chimice ale țesutului . Deși calitatea imaginilor
este relativ mare, există situații în care contrastul endogen nu este sufi cient în diagnosticarea

27
anumitor patologii. În aceste circumstanțe, sensibilitatea poate fi mărită prin utilizarea uno r
agenți de contrast exogen .
Rolul principal al agenților de contrast în IRM este de a scurta în mod selectiv timpii de
relaxare ai prot onilor în regiunea anatomică examinată, oferind astfel un contrast mai bun.
Această selectivitate a agentului exogen pentru o anumită regiune apare fie datorită unei afinități
crescute, fie datorită diferențelor de vascularizație care pot crește transportu l acestuia în regiunea
de examinat. Tumorile, prin diferențele structurale și funcționale față de țesutul normal din care
provin, oferă posibilitatea obținerii unor acumulări anormale de substanță de contrast, care sunt
evidențiate în imaginile obținute. Î n cadrul IRM, nanoparticulele din oxid de fier scad
intensitatea semnalului în regiunile în care se acumulează. Astfel, se produc semnale hipointense
în imaginile ponderate T2/T2*, regiunile cu IONs apărând mai întunecate față de țesutul
înconjurător, amp lificând astfel contrastul [156] .
Nanoparticulele din oxid de fier au fost folosite de peste 25 de ani ca agenți de contrast
negativ (T2) în examinarea prin rezonanță magnetică. Acestea oferă anumite avantaje în
comparație cu alți agenți convenționali. Unul dintre aceste avantaje rezidă din proprietățile
superparamagnetice ale acestora, care ajută la obținerea unui răspuns biologic favorabil [1]. Un
alt avantaj este apare prin posibilitatea pro iectării unei suprafețe care permite reglarea timpului
de eli minare din sânge sau țintirea selectivă a unei regiuni anatomice. Toxicitatea scăzută și
momentele magnetice suficient de mari sunt alte avantaje pe care le au asupra altor agenți de
contrast [157] .
În principiu, IONs pot evidenția prezența unei formațiu ni tumorale prin creșterea
diferenței de semnal dintre tumoră și țesutul înconjurător. Acest mecanism are loc fie prin
acumularea cu predominanță în țesutul normal din jurul tumorii, fie printr -o acumulare cu
preponderență în interiorul tumorii. Prima situ ație este cea caracteristică organelor în care IONs
se acumulează în mod tipic datorită captării lor de către celulele sistemului mononuclear
fagocitar (ficat, splină, noduli limfatici). În cea de -a doua situație, acumularea mai mare a
nanoparticulelor în interiorul tumorii se bazează fie pe efectul EPR, fie pe țintirea tumorii prin
mecanisme active.
Astfel, în cadrul IRM, captarea S -IONs ( 50 -150 nm) de către celulele Kupffer determină
o acumulare globală a acestora în ficat [56], cu scăderea ulterioară a semnalului în imaginile
ponderate T2. Tumorile hepatice maligne, primare sau metastatice, prezintă fie o scădere a
numărul de celule Kupffer, fie absența totală a acestora [158] . Acești factori duc la apariția unor

28
diferențe în captarea nanoparticulelor , determinând apariția unui contrast înalt între țesutul
hepatic normal (care va apărea hipointens) și tumoră [159-161]. Deci, utilizarea unor
nanoparticule cu diametrul între 50 și 150 nm (S -IONs) favorizează o captarea mai mare a
acestora de către țesutu l hepatic normal, în detrimentul captării tumorale, crescând sensibilitatea
tehnicii prin amplificarea contrastului.
IONs cu diametre sub 50 nm (U -IONs) prezintă un timp de înjumătățire sanguin mai
îndelungat [144] , crescând astfel probabilitatea de a fi captate de alte organe sau de către tumoră
prin efectul EPR [151] . Totuși, EPR este limitat numai la anumite tumori, iar implementarea cu
succes a metodelor diagnostice bazate pe acest efect depinde de o multitudine de factori care,
până în prezent, nu a u adus această metodă la o eficiență acceptabilă. Însă, suprafața NPM poate
fi modificată cu anumiți liganzi pentru a permi te țintirea celulară activă . Acidul folic a fost intens
studiat ca ligand pentru creșterea afinității tumorale datorită faptului că r eceptorii acestuia sunt
supraexprimați la suprafața multor tipuri de celule tumorale. Avantajele utilizării acidului folic
ca ligand în imagistica oncologică includ: 1) afinitate crescută pentru receptori, 2) costuri mici,
3) proces de conjugare facil, 4) compatibilitate atât în solvenți organici, cât și în solvenți apoși,
5) lipsa imunogenității [162] . De asemenea, markerii de angiogeneză (ex. integrinele αvβ3)
reprezintă ținte care pot fi utilizate pentru atragerea IONs prin conjugarea acestora cu liganzi
specifici [163] . Sintetizarea sistemelor alcătuite din IONs și anticorpi a dovedit că acestea
păstrează atât proprietățile anticorpilor, cât și pe cele ale nanoparticulelor, făcându -le potrivite
pentru distribuția selectivă a part iculelor din oxid de fier [164] . În plus, conjugarea cu peptide a
NPM determină internalizarea complexelor prin endocitoza mediată de receptor, amplificând
acumularea acestora intracelular, oferind un contrast IRM persistent și îmbunătățit [165] .
Există anumiți compuși pe bază de nanoparticule din oxid de fier care au aprobați de
către EMA și FDA ca agenți de contrast pentru IRM. Totuși, majoritatea compușilor aprobați
pentru administarea intravenoasă au fost înlăturați de pe piață, în sp ecial din motive financiare .
3.4. Opțiuni terapeutice oferite de NPM
3.4.1. Hipertermie
Termoterapia poate fi utilizată în tratamentul oncologic prin multiple abordări care includ
radiofrec vență, microunde sau laser . Totuși, aceste metode pot prezenta efecte adverse prin
lezarea țesuturilor normale în urma creșterii neselective a temperaturii. Astfel, hipertermia indusă
magnetic reprezintă o alternativă ce poate minimiza aceste efecte adverse. Principiul acesteia se
bazează pe proprietățile superparamagnetice ale nanoparticulelor din oxid de fier, prin care pot

29
genera căldură la nivel local, în urma aplicării externe a unui câmp magnetic alternant. În aceste
procese, temperaturile atinse depășesc 37 °C determinând apoptoză/moarte celulară. Acest tip de
abordare este bazat pe sensibilitate term ică crescută a celulelor tumorale în comparație cu cele
normale. În plus, prin utilizarea NPM, cantitatea de căldură generată poate fi stabilită atât prin
reglarea proprietăților fizico -chimice ale nanoparticulelor, cât și prin modificarea câ mpului
magnet ic aplicat [166] . Similar abordării prin radiofrecvență, hipertermia magnetică obține cu
ușurință o temperatură peste 42 °C, determinând inițierea procesului apoptotic tumoral, cu efect
minim asupra țesutului sănătos [167] . Totuși, eficiența nanoparticulel or magnetice în cadrul
hipertermiei nu depinde numai de superparamagnetism, ci și de dimensiune [168] , înveliș, și
concentrația particulelor în tumoră [169] .
NPM se pot acumula în interiorul tumorii prin vasele de sânge ale acesteia prin efectul
de perme abilitate și retenție crescute. Totuși, efectul EPR nu poate obține o acumulare
acceptabilă de nanoparticule în tumoră, iar concentrația insuficientă a acestora este unul dintre
factorii limitanți ai procesului de hipertermie magnetică. De aceea, pentru ac est tip de aplicație,
eficiența crește fie prin injectarea locală a nanoparticulelor direct în tumoră, fie prin utilizarea
mecansimelor active de acumulare tumorală. O altă alternativă este creșterea amplitudinii și/sau
frecvenței câmpului magnetic, dar ac easta poate mări nespecific temperatura în zonele sănătoase,
și de asemenea, poate promova toxicitatea [170] .
Hipertermia magnetică poate fi asociată și cu utilizarea liganzilor pentru a obține o
acumulare selectivă a nanoparticulelor [170, 171]. Ca exempl u, s-a demonstrat acumularea
tumorală selectivă a complexelor anti -HER2 -IONs în cazul tumorilor de sân, care, în urma
aplicării câmpului magnetic, au determinat creșter ea temperaturii locale cu 8 °C [170] . În mod
similar, IONs cu afinitate pentru receptori i EGF determină acumularea selectivă a acestora în
carcinomul pulmonar non -small -cell, iar hipertermia aplicată ulterior determină inhibiție
semnificativă a creșterii tumorale [171] .
Pe lângă inducerea procesului de apoptoză, hipertermia magnetică stimul ează răspunsul
imun înnăscut. În acest mecanism este implicată eliberarea unor resturi proteice în urma
leziunilor celulare, care determină activarea monocitelor din micromediul tumoral [172] . Acest
proces este urmat de inducția citokinelor proinflamatorii și recrutarea celulelor prezentatoare de
antigen. Activarea sistemului imun ca răspuns la hipertermie, diminuează invazia tumorală
ulterioară [173] .

30
Fezabilitatea și toleranța bună a hipertermiei, ca formă de tratament oncologic, au fost
demonstrate și în studii clinice la pacienți cu tumori de prostată [174, 175] și glioblastoame
multiforme [176] . În aceste studii, nu au existat efecte adverse sau complicații serioase. Totuși,
printre factorii limitanți au fost enumerați disconfortul pacientului la aplic area câmpului
magnetic și distribuția neregulată a căldurii la nivel intratumoral.
3.4.2. Terapia medicamentoasă țintită
Una dintre limitările majore ale chimioterapiei provine din farmacocinetica nefavorabilă
și din biodistribuția nespecifică, determinân d numeroase efecte adverse pe organe și țesuturi
sănătoase. Nanotehnologia este una dintre metodele care pot influența în mod favorabil aceste
dezavantaje, prin îmbunătățirea profilelor farmacocinetice și farmacodinamice ale
chimioterapicelor. Transportul țintit al unui medicament poate conduce la scăderea dozelor
necesare, reducerea efectelor adverse și creșterea eficienței t ratamentului [177] .
Există mai multe strategii prin care agenții citotoxici pot fi încorporați în nanoparticulele
din oxid de fie r. Aceștia pot fi legați direct de materialul de înveliș, depozitați în stratul de la
suprafață, sau prinși în interiorul nanoparticulelor [178] . Eliberarea agenților în tumoră poate fi
efectuată prin difuzie, distrugerea vectorilor, dizolvare sau prin end ocitoză [179,180] . În plus,
cunoașterea concentrațiilor agenților citotoxici din fiecare particulă, împreună cu semnalele
oferite de IONs în timpul examinării prin IRM, pot fi folosite la estimarea nivelului tisular de
medicament. Mai mult, un alt avantaj constă în posibilitatea de a controla rata și momentul în
care agenții vor fi eliberați, prin modularea anumitor caracteristici ale NPM în cadrul procesului
de sinteză.
Până în prezent, există mai mulți agenți chimioterapici care au fost combinați cu NPM ,
printre care sunt paclitaxel, doxorubicina (DOX), și metotrexat (MTX) [181, 182] . Pe lângă
efectul terapeutic, metotrexatul posedă și afinitate pentru receptorii acidului folic. Conjugarea
IONs cu MTX determină o captare amplificată a medicamentului de către celulele care
supraexprima receptorii pentru folați [182] . În acest studiu au fost evidențiate anumite avantaje
ale complexelor IONs -MTX: 1) posibilitatea legării unui număr mare de molecule de MTX de
fiecare nanoparticulă, 2) internalizarea selectiv ă a complexelor în celulele tumorale, 3) eliberarea
MTX doar intracelular în interiorul lizozomilor, la pH acid, 4) urmărirea în timp real prin IRM a
distribuției agentului citotoxic [182] .
Un interes major prezintă și magnetolipozomii (ML) datorită abilității acestora de
schimbare a structurii și permeabilității în urma aplicării unor câmpuri magnetice cu frecvență

31
joasă, permițând eliberarea controlată a medicamentelor [183] . Un studiu re cent a evaluat, in
vitro , posibilitatea eliberării controlate a DOX din dML (polyethylene glycol -stabilized bilayer –
decorated magnetoliposomes) pe linia celulară Huh – 7 [184] . Rezultatele arată o scădere a
viabilității celulare cu până la 40% după 8 h, și moarte celulară completă după 24 h. Aceste
efecte se datorează citotoxicității prin DOX eliberată din dML doar în urma apli cării câmpului
magnetic [185] , și nu leziunilor induse prin hipertermie [184] .
3.4.3. Terapia genică
Terapia genică reprezintă o alternativă viabilă la tratamentul chimioterapic al tumorilor.
Acest tip de terapie vizează țintirea unor gene implicate în procesul de carcinogeneză, și
înlocuirea funcțională a acestora, având ca scop exprimarea genelor terape utice. Totuși, in vivo ,
materialul genetic prezintă instabilitate crescută în mediile fiziologice, ceea ce pune dificultăți în
implementarea unor metode convenabile pentru transportul intracelular al acestora. Astfel,
lanțurile de ADN sau siARN integrate î n complexe alcătuite din NPM pot depăși inconvenientele
date de degradarea enzimatică și internalizar ea celulară deficitară [186] .
Pentru obținerea unor complexe eficiente, legătura dintre nanoparticule și acizii nucleici
poate fi efectuată prin interme diul polietileniminei (PEI) sau sulfatului de protamină [187,188] .
PEI este polimerul folosit cel mai frecvent pentru distribuția lanțurilor de acizi nucleici, având
avantajul de a evita degradarea lizozomală [189] . Toxicitatea asociată utilizării PEI poat e fi
redusă prin conjugare suplimentară cu polietilenglicol [187] . Pentru menținerea stabilității, acizii
nucleici trebuie să rămână încapsulați în interiorul vectorilor până la eliberarea declanșată a
acestora în mediul intracelular [190] . Pe lângă stabil itate, NPM oferă și posibilitatea unui
transport țintit al genelor, prin atragerea complexelor la țesut utilizând un câmp magnetic extern
(eng. magnetofection) [191,192] . Totuși, este necesară o anumită accesibilitate a tumorii pentru
aplicarea câmpului ma gnetic [192] . Deși aceste metode au fost aplicate cu succes în studii in
vitro și in vivo [193-195], evoluția lor este încă într -o fază timpurie, fiind necesară apariția a
numeroase alte progrese înaintea implementării lor cu succes în cadrul terapiei oncologice.

32

Cap. III. Utilizarea NPM î n diagnosticul
și tratamentul CHC

1. NPM – IRM în tumorile hepatice
Proprietăț ile farmacocinetice ale particulelo r SPION le permi te acumularea, într -un mod
nespecific, î n sistemul fagocitar mononuclear, lucru care a permis folosirea lor în imagistica prin
rezonanță magnetică a organelor, cum sunt ficatul și splina [196], noduli i limfatici [197] ,
maduva osoasă [198]. De atunci, m ultiple studii de cercetare au încercat să evidențieze sinergia
dintre SPION ș i RMN, pentru o mai bună caracterizare a leziunilor hepatice.
Cu un diametru hidrodinamic mediu între 100 și 150 nm, particulele SPION sunt preluate
nespecific de către celulele Kupf fer din țesutul hepatic normal. Acest lucru determină, în timpul
unei examinări IRM, scăderea semnalului țesutului hepatic în imaginile ponderate T2(*).
Existența unei alterări a țesutului hepatic, cum apare în cazul malignitatilor hepatice (carcinom
hepat ocelular (CHC), carcinom colangiocelular (CCC) sau determinări secundare (metastaze) )
unde nu se mai găsesc celule Kupffer, sau acestea sunt în număr redus, va determina absența
semnalului datorită lipsei de SPION în aceste zone [199]. Ca o consecință, se va obține un
contrast leziune -ficat mult crescut, crescând astfel sensibilitatea detectării tumorale [200]. De
asemenea, se poate diferenția foarte bine între CHC și nodulii displazici/hepatocelulari benigni
[201].
Există doi compuși SPIO disponibili pent ru utilizarea clinică în imagistica hepatică:
ferumoxide (Endorem®, Guerbet) [202] și ferucarbotran (Resovist®, Bayer Healthcare
Pharmaceuticals) [203]. Ambii compuși au fost aprobați doar pentru imagistica IRM a ficatului,
deși au caracteristici diferite. Pe de o parte, Resovist® poate fi folosit atât pentru imagistica
dinamică cât și întârziată datorită posibilității administrarii rapide în bolus, în timp ce Endorem®
este folosit doar pentru imagistica întârziată, din cauza administrării lente în bolus. D e asemenea,
Resovist® are un diametru hidrodinamic mai mic (45 -60 nm), care va determina scurtarea atât a
timpul de relaxare T2 cât și a timpul T1. Producția ambilor produși a fost întreruptă atât din
cauza vânzărilor mici cât și din cauza introducerii age ntului de contrast hepatobiliar pe baza de
Gadoliniu (Gd), Gd -EOB (Primovist®, Bayer Healthcare Pharmaceuticals), cu o mai mai
eficiență în detectarea leziunile hepatice [204].

33
A fost demonstrată o mai bună acuratețe în detectarea leziunilor hepatice focal e prin
SPIO -IRM față de tehnica IRM neintensificată, și de asemenea s -a evidențiat și o mai fină
acuratețe prin combinarea ambelor tehnici, în comparație cu analiza doar a imaginilor obținute
prin SPIO -IRM [205]. Un studiu multicentric a observat o creșter e a sensibilității cu 27% pentru
detectarea leziunilor hepatice în imagini ponderate T2, folosind ferumoxid ca agent de contrast,
comparandu -le pe acestea cu imaginile neintensificate, și s -a observat, de asemenea, o creștere
cu 40% a sensibilității în com parație cu CT non -spirală [206].
Diferențierea dintre CHC și alte leziuni hepatice este imperativă pentru instituirea
precoce și precisă a tratamentului. Cateva studii s -au concentrat asupra observării diferitelor
modele de contrast apărute între aceste le ziuni, folosind -se de potențialul particulelor SPIO în
combinație cu imagistica prin IRM. Acest potențial apare din faptul că particulele SPION sunt
preluate de celulele Kupffer care se găsesc în proporții diferite în leziunile hepatice față de
țesutul hep atic normal, care, de fapt, reprezintă ideea de bază pentru studii viitoare privind
diagnosticul cu SPIO -IRM. Un studiu a concluzionat faptul că IRM în combinație cu SPION ca
agenți de contrast poate fi folositoare în diferențierea CHC de nodulii hiperplaz ici, dar cu
dificultăți în unele cazuri, indicând că sunt și alți factori de care depinde acumularea NPM în
ficat [206,199] .
Un alt studiu a identificat un caz în care un CHC bine diferențiat apare hipointens în
imaginile ponderate T2 obținute prin folosirea SPIO ca agenți de contrast, indicând astfel
acumularea particulelor în tumoră [207] . Acest lucru a fost, de asemenea, conf irmat într -un
studiu ulterior, care a observat ca numărul celulelor Kupffer scade proportional cu scăderea
gradului de diferențiere a CHC, ceea ce dovedește că CHC bine diferențiate au un număr de
celule Kupffer similar cu parenchimul hepatic normal, expli când semnalul hipointens și lipsa
contrastului în unele CHC [208] . Aceleași rezultate au fost ulterior susținute de alte studii,
indicând faptul că rația intensității oferite de SPIO este bine corelată cu numărul celulelor
Kupffer din CHC și din nodulii di splazici. Ulterior, s -a investigat relația dintre intensitatea
oferită de SPIO și gradarea histologică a CHC și s -observat o corelare invers proportională, cu
creșterea intensității o dată cu scăderea gradului de diferențiere [209] . Toate aceste rezultate au
condus la concluzia că potențialul acestora de a diferenția între CHC și alte leziuni hepatice este
limitat în cazurile în care tumora este bine diferențiată.
O meta -analiza recentă care a investigat date extrase din 15 studii, a observat beneficul
clar al folosirii SPIO -IRM pentru diferențierea CHC de alte leziuni hepatice focale, și
pontențialul acestora de a diferenția nodulii displazici de CHC avansat, în ficatul cirotic [210] .

34
Aceeași analiza a gasit o sensibilitate de 98% în detectarea CHC de grad avansat, folosind
nivelul de hiperintensitate ca și criteriu în imaginile ponderate T2.
Validarea NPM pentru diagnostic cancerului hepatic, implica și o comparatie cu alte
tehnici imagistice disponibile. În această privință, un real beneficiu a fost demonstrat prin
compararea IRM intensificat cu SPIO față de CT spiral cu fază duală, obținând o sensibilitate
semnificativ mai mică pentru cea din urmă (70.6% vs. 58.1%, p<0.05) [211] . Un alt studiu a
demonstrat faptul că prin combinarea rezultatelor din imaginile obținute prin IRM neintensificat
și cele obținute prin IRM intensificat cu SPIO se ob ține o sensibilitate mult crescută și de
asemenea, o mai mare acuratețe în diferențierea leziunilor benigne de cele maligne, în
comparație cu fiecare metodă în parte, dar și cu imaginile obținute prin CT spiral [205] . Trei
modalități de imagistică au fost comparate în 72 de CHC, obținându -se rate de detecție de 69%
pentru CT dinamic cu faza triplă, 89% pentru IRM dinamic cu faza triplă, și 86% pentru IRM
intensificat cu SPIO [201] . Apare o diferență mică între ratele de detecție ale IRM dinamic și
cele ale SPIO -IRM, dar diferența este semnificativ mai mare între fiecare dintre ele și CT
dinamic.
Există câteva studii care au demonstrat superioritatea imaginilor obținute cu substanța de
contrast pe baza de gadoliniu (Gd -IRM), fața de SPIO -IRM, sugerând faptul că agenții de
contrast pe baza de gadoliniu sunt preferați în comparatie cu ferumoxid, lucru datorat acurateții
mărite în detectarea CHC de dimensiuni mici [204, 212] . Alți autori au concluzionat ca IRM cu
dublu contrast (acuratete medie = 0.86), folosind atât SPION cât și agenți de contrast pe baza de
gadoliniu, îmbunătățesc semnificativ diagnosticul pentru CHC în comparatie cu SPIO -IRM
(acuratețe medie = 0.76) [213] .
2. Hipertermia î n cadrul CHC
Până î n prezent, datele preclinice disponibile în literatură demonstrează fezabilitatea
hipertermiei în cadrul tratamentul ui CH C. El iberarea NPM la nivelul tumorii permite acestora să
ajung ă în interioru l celulelor maligne într -un mod pasiv, î n conformitate cu caracteristicile
acestora. Mai mult, expunerea l or la u n camp magnetic determină creș terea temper aturii locale
prin metoda relaxării Neel, producâ nd astfel apoptoza celulelor maligne .
Recent au fost evaluate efectele hipertermiei magnetice pe linii celulare SMMC -7721 de
cancer hepatic, folosind diverse concent rații de nanoparticule de Fe2O3 [214] . Nanoparticulele
folosi te au avut un diametru cuprins între 10 și 20 nm și au fost împărțite î n grupuri cu
concentraț ii de fier dife rite. După ce fiecare probă , de celule si NPM, a fost expusă la iradi ție
timp de o oră, și apoi incubată, s -a observat că o cantitate mare de NPM a fost captat ă de către

35
celulele tumoale, iar în urma expunerii la un câmp magnetic cu frecvență mare s -a evid ențiat nu
numai o rată mare a apoptozei, dar și o inhibiț ie a ratei de profilerare celulară . Prin urmare,
autorii au observat faptul că după expunerea celulelor SMMC -7721 la un curent de 300 A,
temperatura înregistrează o creștere până la 39 -54 C, nivel la care s -a men ținut cons tantă mai
mult de 40 de minute, sugerâ nd posibilitatea ca ac eastă metodă să fie o alternativă de succes î n
cadrul tehnicilor de hipertermie cu temperatură constantă . Examenul imunohistochimic a arătat
influența concentraț iei de nanoparticule asupra expresiei proteinelor Bax si Bcl -2.
Mai mult, foarte multă atenț ie a fost atrasă de că tre posibilitatea existenței unei sinergii
între hipertermie ș i alte metode de te rapie la nivelul tumorilor. Atașarea altor substanț e cu efecte
chemoterapeutice, pot îmbunătății ră spunsul tumoral la trat ament. Folosirea As2O3/Fe2O3 în
combinaț ie cu hipertermia , asupra xen ogrefelor de cancer hepatic la ș oareci, a indica t apariția
unui efect terapeutic mai mare în cazul asocierii față de efectul exclusiv al Fe2O3 [215] . Ulterior,
un alt studiu , care a folosit complexul As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4 pe o linie celulară HepG2, a
sugerat potenț ialul rol complementar , cu intensificarea efectele citotoxice ale agentului
chemoterapeutic prin creș terea temperaturii [216] . Leg area doxorubicinei de un înveliș
termosensibil pentru NPM, a fost invest igată ca modalitate duală de terapie pentru CH C [217] .
Acest complex poate determina moa rtea celulelor tumorale datorită efectelor duble ale câ mpului
magnetic și cele ale doxorubicinei.
3. Terapia țintită a CH C
Una dintre metodele comune de abordare a terapiilor onc ologice este chimioterapia. În
cazul CHC, din cauza stadiului avansat în care se prezintă de obicei pacienț ii, tratamentul
chirurgical sau terapia ablativă se pot lua î n considerare doar în cazuri rare [218] . Pentru acești
pacienț i, chemot erapia siste mică este singura cale de a le prelungi supravieț uirea. Totuși,
necesitatea administrării unor doze mari și acț iunea neselectivă a agenți lor chem oterap eutici ,
determină apariția a numeroase efecte adverse. Metodele de distribuire țintită a chemoterapiei
permit atât obținerea unei concentraț ii optime a agentul terapeutic în țesutul țintă, cât ș i
minimizarea efectelor asupra țesuturilor sănă toase.
Un inters major il reprezintă magnetolipozomii (ML) datorită capacităț ii acestora de a -și
schimba structura și permeab ilitatea sub acț iunea câmpurilor magnetice de frecvență mică ,
facându -i potriviț i pentru utilizarea ca agenți cu eliberare controlată [219,220] . Un studiu recent
a evaluat posib ilitatea eliberării intracelulare, declanșată prin radiofrecvență, a doxorubici nei
(DOX) legată de dML (polyethylene glycol -stabilized bilayer -decorated magnetoli posomes)
folosind linia celulară Huh -7 de HCC [221] . Motivaț ia ce a stat la baza studiului a ap ărut ca

36
urmare a unor studii anterioare în care s -a observat că dML îș i pot re ține încă rcătura, inclusiv
DOX, până î n momentul declanșării eliberă rii [222-224]. Autorii au presupus că această abilitate
cuplată cu faptul ca dML sunt comp uși din IONs și din lipide biocompatibile, î i face pe aceștia
potriviți pentru chemoterapia în CH C. Rezultate le au arătat o scădere în viabilitatea celulară cu
până la 40% dup ă 8 h, și moarte celulară completă după 24 h. Mecanismul terapeutic a fost
eliberarea intracelulară de DOX declanșată prin radiofrecvență, ș i nu prin hipertermie.
De o mare releva nță este ș i un alt studiu [225] care s -a bazat pe folosirea sorafenibului,
un medicament care inhib ă atât calea RAF/MEK/ERK, cât ș i receptorul pentr u tirozin kinază
[226] . Datorit ă efectelor secundare severe, o strategie a fost de a dezvolta nanovectori magnetici
legați cu so rafenib pentru a obține transportul țintit al medicamentului. Rezultatele au aratat
faptul ca este posibil să se obț ină complexe stabile SLN -Sor-Mag capabile să inhibe poliferarea
celulelor canceroase prin efect ul citotoxic al sorafenibului, ș i să se localizeze acest efect în zona
țintă prin acumulare locală dirijată magnetic.
Mai mult, câ teva studii efectuate pe diverse tipuri de cancer au arătat că terapiile du ale
simulta ne sunt de asemenea plauzibile ș i atractive [227] . Un studiu iniț ial a indicat posibilitatea
livrării intraarteriale a complexului NPM -PNIPA(poli -N-isopropilacrilamida) -doxor ubicin și
localizarea acestuia în urma aplicării unui câ mp magneti c alternativ, la nivelul unui CHC, în
șobolani. Un studiu ulterior a demonstrat fezabilita tea conceptului de terapie duală cu MDT ș i
hipertermie magnetică pentru CH C, folosind nanoparticule de oxid de fier [228] . Rezultatele
studiului au ară tat că odată ce com plexul NPM -PNIPA -doxorubicin se localizeaz ă în interiorul
tumorii, aplicarea câmpului mag netic alternativ poate determina atât apari ția hipertermiei cât și
eliberarea doxorubicinei în tumora ț intă.
O nouă abordare terapeutic ă în tratamentul CHC este terapi a genică. Aceasta presupune
înlocuirea func țională a unei gene defecte ș i expresia consecutivă a genei terapeutic e. Genele pot
fi integrate în IONs, oferind protecție acidului nucleic față de degradarea enzimatică ș i
facilitează, de asemenea, și internalizarea c elulară. O abordare integrativă a fost dezvoltat ă în
cadrul unui studiu în care s -a efectuat î n mod simultan observare tumorală în timp real, terapie
genică ș i radioterapie [229] . Pentru aceasta s -a folosit un ti p de SPION (SilenceMag) com binați
cu fragmente siRNA și Iod 131 radiomarcat împotriva factorului de creș tere vascular ă endotelial
uman ( hVEGF), la ș oareci. Rezultatele studiului au arătat că î ntreg complexul 131I-hVEGF
siRNA/SilenceMag ghidat electromagnetic, a pr ezentat efect antit umoral, concluzionâ nd că
poate reprezenta o opț iune promițătoare pentru tratamentul CHC.

37

Partea Specială

38

Injectarea de nanoparticu le magnetice sub ghidaj
ecoendoscopic – o nouă metodă de abordare a tumorilor
hepatice

1. Introducere
Prognosti cul rezervat al tumorilor hepatice face necesară obținerea unor noi progrese î n
cadrul modali tăților de diagnostic ș i tratament al acestora. Nanoparticulele magnetice pot
reprezenta unul dintre mijloacele capabile de a îmbunătăți aceste modalităț i. Obiectivul stu diului
este de a evalua siguranța și fezabilitatea injectă rii de nanoparticule sub ghidaj ecoendoscopic
prin diverse metode, pentru dezvoltarea a noi modalităț i de diagnostic și tratament î n cazul
tumorilor hepatice.

2. Materiale și Metode
Procedurile au fost efectuate conform Legislatiei Europene pentru drepturile animalelor,
și cu aprobarea scrisă din parte Comisiei de Etică din cadrul Unversității de Medicină și
Farmacie din Craiova (UMFCV).
Nanoparticulele de oxid de fier au fost sintetizate în Institutul de Chimie
Macromoleculară ―Petru Poni‖ Iași, prin metoda coprecipitării cu soluție de acid citric. Metoda a
presupus precipitarea unui produs magnetic sub formă de nanoparticule ferice dintr -o soluție de
amestec de săruri Fe3+ si Fe2+ în mediu alcalin. Contraionii ionilor feric și feros au fost de tipul
Cl-, NO3-, SO3-, în unele cazuri modificându -se metoda de coprecipitare în funcție de contraionul
ales. De asemenea, s -au avut în vedere și alți parametri care permit controlul dime nsional, dar și
structura cristalină a nanoparticulelor, precum raportul Fe2+/Fe3+, tăria ionică, concentrația
ionilor ferici si feroși, precum și pH -ul mediului de reacție.
Într-o manieră generală, ecuația caracteristică de reacție poate fi scrisă sub for ma:
Fe2+ + 2Fe3+ + 8HO−→ Fe 3O4 + 4H 2O
Caracterul bazic al mediului de reacție a fost asigurat de baze anorganice de tipul
hidroxizilor alcalini sau soluții amoniacale, ultimele fiind cele mai utilizate atunci când sinteza
are loc în mediu apos.

39
Într-un sistem de coprecipitare, soluția alcalină a fost adăugată prin picurare în amestecul
de săruri pe bază de fier, permițând creșterea graduală a pH -lui. La pH = 9, ionii ferici precipită
sub forma unor cristale de oxid feric hidratat (Fe 2O3 0.5 H 2O), care re acționează cu ionii feroși
din soluție, rezultând particulele de magnetită. Transferul de electroni între cei doi ioni joacă un
rol esențial în formarea structurii cristaline caracteristice sub forma de spinel.
Au fost sintetizate nanoparticule pornind de la cloruri hidratate ale ionilor ferici și feroși
(FeCl 3 6H2O), utilizând un raport de combinare de 0.5 (mol/mol), ce asigură un diametru scăzut
de până la 20 nm a nanoparticulelor. Cele două săruri au fost dizolvate în apă, iar soluția a fost
menținută în curent de azot 10 min. și agitată sub atmosferă de azot timp de 30 min. cu 1000 rpm
(agitare mecanică) la temperatura camerei. Treptat, temperatura a fost ridicată la 70 oC,
menținându -se agitarea și atmosfera inertă. Mediul bazic a fost asigurat de solu ția amoniacală cu
o concentrație de 27 – 30% M NH 4OH care a fost picurată prin pâlnia de picurare într -un interval
de 15 min, moment în care soluția trece printr -un viraj de culoare de la cărămiziu la negru mat.
Reacția a continuat sub temperatură timp de 30 de minute, asigurându -se atmosfera inertă.
Etapa finală a constat în adăugarea supernatantului în apă, proces care a fost repetat de
câteva ori. Înainte de injectare, soluția de nanoparticule a fost sonicată timp de câteva minute
pentru o bună dispersie .
Întreg st udiul a fost efectuat folosind 6 porci, sus scrofa domesticus , care au fost ținuti în
condiții speciale. Aceștia au fost supuși restricției de alimente ș i lichide timp de 24h, respectiv 6
h înaintea intervenției. Premedicația, administrată intr amuscular, a constat din Ketamina mg/kgc
(MSD Animal Health, Germany), Xilazina 2mg/kgc (Bioveta A.S., Czech Republic) și Atropina
0.015 mg/kgc (Biofarm, Romania). Abordul periferic a fost realizat cu ajutorul unui cateter
(WellcathPlusTM, Wellmed, Noida, India) poziționat la nivelul venei marginale a urechii. Porcii
au fost intubați, iar anestezia generală a fost menținută cu Propofol 0,5 mg/kgc (Fresenius Kabi
Austria GMBH – Austria) în perfuzie continuă, Fentanil 3 μg/kgc (Actavis Nordis A/S –
Denmark) ș i Pavulone 0,1 mg/kgc (Pancuronium Bromide, Schering -Plough), în timp ce
funcțiile vitale au fost monitorizate.
Toate procedurile au fost efectuate folosind echipament standard specific pentru animale.
Porcii au fost împărțiti în trei grupuri: doi porci au fost injectați într -o venă perferică, doi au fost
injectați în vena portă, iar ceilalți doi au fost supuși unei injectări locale de IONs la nivelul
ficatului. Injectarea de MNP prin ghidaj ecoendoscopic a fost efectuată cu ajutorul unui
ecoendoscop liniar (GFUCT140 -AL5, Olympus, Tokio, Japan), cu canal intervențional larg,
cuplat cu un sistem Evis Exera (Olympus, Tokio, Japan) și un sistem de ultrasunete
AlokaProSound 5500 (Hitachi -Aloka, Tokio, Japan). Pentru injectarea locală și în vena portă, a

40
fost pre ferată efectuarea procedura printr -un ac de 19 G. Ecoendoscopul a fost intrdus printr -un
overtube plasat în esofag, avansat în stomac și duoden până în momentul obținerii unei imagini
bune a organelor țintă.
Un ac ecoendoscopic de 19 G (Boston Scientific, Cook M edical) a fost inserat, iar după
retragerea stiletului, 2 ml de soluție au fost injectați direct în vena portă sau direct în ficat. În
cazul ficatului, soluția a fost injectată în lobul stang . Injectarea în vena portă a constat în puncția
peretelui v ascular și injectarea soluției în torentul sangvin. În ceea ce privește abordul periferic,
cateterul plasat pe lobul urechii a fost punctul de distribuție.
Nu au fost întâmpinate complicații imediate. Porcii au fost urmăriți pentru următoarele 7
zile, cu monitorizare atentă în ceea ce privește schimbările posibile în comportament, alimentație
și temperatură. Animalele au fost eutanasiate cu o supradoză de pentobarbital și apoi a fost
efectuată necropsia cu recoltarea ficatului, și a altor organe. Rinichii si splina au fost, de
asemenea, recoltate în vederea comparării cantității de nanoparticule obținute prin injectare
vasculară și cea obtinută prin injectare locala. După efectuarea examinării macroscopice,
organele au fost depuse în formol și apoi trimise în vederea scanării prin IRM 3T (Philips
Ingenia 3T, Netherlands), aparat dotat cu o bobină specifică. După scanare, analiza histologică s –
a efectuat folosind colorația cu albastru de Prusia.

3. Rezultate
Toți cei 6 porci, cu o greutate între 25 -35 kg, au fost supuși procedurilor de injectare fără
a prezenta schimbări în comportament și fără semne de complicații. Nu au fost întâmpinate
dificultăți în identificarea prin EUS a structurilor vasculare sau a organelor țin tă. Procedurile de
injectare au fost efectuate într -un timp mediu de 5 minute și 21 secunde și au constat in
injectarea de 2 ml de soluție ferofluidă printr -un ac de 19G. În timpul injectării locale, a fost
observată o masă hiperecogenă la locul injectării , cu un diametru mediu de 1,5 cm la nivelul
lobulului stâng al ficatului (Figura 4 ). În urma cateterizării venei porte, soluția de nanoparticule
a fost dispersată în torentul sangvin fără semne imediate de tromboză (Figura 5). Nu au existat
perforații ale peretelui gastric sau a altor organe și nici risc de hemoragie în timpul pocedurii.

41

Figura 4. Injectare ecoendoscopică a NPM la nivelul lobului stâng hepatic

Figura 5. Injectare ecoendoscopică a NPM în vena portă

42
Necropsia a fost efectuată după 7 zile, fiind colectate ficatul, rinichii și splina, urmate de
depozitarea acestora în formol. Modificările macroscopice au fost observate doar în urma
injectării locale direct la nivelul organului țintă. Examinarea IRM a fi catului a demonstrat
prezența unor depozite considerabile apărute în urma injectării locale și a celei portale (Figura
6). Injectarea în vena portă nu a determinat apariția trombozei, deși au fost vizualizate depozite
mari de nanoparticule până la nivelul distal al ramurilor hepatice
Evaluarea patologică a fost efectuată prin colorație cu albastru de Prusia care a evidențiat
depozite de fier în interiorul organelor selectate. Injecția locală în ficat a arătat un volum crescut
de nanoparticule preponderent în zona țintă și doar câteva depozite în cantități mici la distanță de
locul injectării. Pe de altă parte, injectarea ecoen doscopică în vena portă a evidențiat un volum
mare de IONs cu o distribuție difuză în lobulii hepatici și de asemenea, între lobuli și în spațiul
periportal.

Figura 6. Imagine IRM post injectare NPM prin vena portă

43
În ambele cazuri, depozitele au fost încapsulate în macrofage, în celulele Ito, în
hepatocite și în interiorul capilarelor sinusoide ( Figura 7 , 8). În urma injectării periferice, s -au
evidențiat depozite și în alte țesuturi cu caractere macrofag -like. Astfel, m ici depozite au fost
descoperite în spațiul interstițial medular și în tubii colectori la nivelul rinichiului ( Figura 9), în
pulpa albă și în pulpa roșie a splinei ( Figura 10), și chiar și la nivelul țesutului miocardic
(Figura 11). Totuși, injectarea sistemică a arăta t cantități mai mici de nanopaticule depozitate în
ficat, în comparație cu cele determinate de injectarea locală sau prin vena portă, cu depozite
considerabil mai mari în celelalte organe recoltate.

Figura 7. Ficat – Depozite pulverulente predominant la nivelul capilarelor sinusoide ale
lobulului hepatic, posibil și depozite intracelulare în celulele Ito ș i hepatocite. Col Pearls, 100x

44

Figura 8. Ficat – Depozite de fier predominant interstițial în spațiul port. Posibil și depozite
intracelulare în macrofagele spațiului port, respectiv depozite și în interstițial lobular p eriportal
hepatic. Col Pearls, 10x

Figura 9. Rinichi – Depozite de fier atât în interstițiul din medulara renală , cât și în lumenul
tubilor colectori. Posibil și depozite intracelulare în macrofagele interstițiului medular renal și a
celulelor epiteliale ce tapeteaz a tubii colectori. Col. Pearls 20x

45

Figura 10. Splină – Depozite de fier predominant în pulpa roșie, depozite pulverulente ș i în
pulpa albă – cel mai probabil î n elementele de tip macrofagic de la acest nivel. Col Pearls, 20x

Figura 11. Miocard – Depozite de fier în interstiț iul miocardului. Col Pearls, 10x

46
4. Discuții
Opțiunile terapeutice pentru pacienții cu tumori hepatice sunt relativ limitate dacă boala a
fost diagnosticată într -un stadiu avansat. Recent, nanoparticulele magnetice au fost folosite ca
instrumente de diagnostic prin IRM cu contras t [3] și ca metode terapeutice în hipertermie,
vectori pentru medicamente sau pentru terapia gen ică în modele experimentale [2]. Reacțiile
tisulare la nanoparticule sunt influențate de către proprietățile generale ale acestora, de înveliș,
biocompatibilitat e, toxicitate și metodele de distribuție [230] . În funcție de scop, acestea pot fi
injectate local în regiunea de interes, oral după gavaj sau intravenos. Totuși, aceste tehnici sunt
dificil de controlat din moment ce răspunsul biologic al țesutului țintă necesită o concentrație
mare de nanoparticule pentru a obține efectul terapeutic dorit [231] . În general, injectarea
vasculară și distribuția nanoparticulelor presupune trecerea prin trei faze: cleareance -ul sangvin,
extravazarea și depozitarea în spațiul interstițial de unde vor ataca celulele tumorale. Până în
prezent, există puține studii care exploatează potențialul injectării în structurile vasculare
adiacente organelor de interes, în principal din cauza accesului dificil la acestea. Ecoendoscopia
poate depăși aceste obstacole, prin imensul potențial imagistic și variatelor opțiuni terapeutice.
Studiul prezent a avut ca obiectiv evaluarea distribuției nanoparticulelor magnetice prin
diverse metode de injectare, încercând evidențierea acestora în ficat. Injectarea econedoscopică
poate fi luată în considerare ca o opțiune paliativă fie prin injectare locală fie prin utilizarea
accesului accesului vascular. Potențialul acesteia în dezvoltarea metodelor diagnostice și
terapeutice bazate pe imagistica în tim p real, poate depăși dezavantajele radiologiei
intervenționale. Nu există îndoieli cu privire la faptul că ghidajul ecoendoscopic oferă opțiuni
mai atractive pentru terapiile vasculare, din moment ce atât vasele mari cât și cele mici adiacente
tractului ga strointestinal pot fi cu ușurință vizualizate și abordate.
Injectarea ecoendoscopică posedă abilitatea de a ținti ficatul prin utilizarea unei abordări
transgastrice. Până în prezent, această metodă a fost testată în cazul injectării intratumorale cu
etanol [232,233] și a chemoterapeuticelor [234].
Transportul în ficat al nanoparticulelor magnetice a fost evaluat prin diferite moduri de
administrare. Injectarea locală prin ecoendoscopie a evidențiat o concentrație mare de NPM în
zona țintită, și cantități reduse de NPM în țesutul hepatic înconjurător. Deși există p rotocoale
precise pentru pacienții cu fomațiuni tumorale hepatice, injectarea ecoendoscopică a fost
evaluată până în prezent la animale, existând de asemenea și c âteva studii de caz [235, 236] . Pe
de altă parte, abordul prin vena portă și distribuirea de N PM a arătat o difuziune mai mare a
nanoparticulelor în întreg ficatul, până la nivelul ramurile distale. Această abordare pare a fi mai

47
potrivită decât injectarea periferică, fiind constat at un volum mai mare de NPM în țesutul
hepatic.
Injectarea locală și injectarea prin vena portă pot fi folosite pentru diferite tipuri de
tumori. În timp ce injectarea locală se poate adresa unei tumori hepatice solitare (precum
carcinomul hepatocelular sau metastaze solitare cu scopul obținerii unei concentrații maxime î n
zona de interes), potențialul injectării prin vena portă se poate adresa metastazelor hepatice,
acoperind întreg țesutul hepatic. De asemenea, NPM acoperite cu diferite chemoterapeutice
injectate prin vena portă ar putea diminua efectele toxice la nivel sistemic apărute în urma
injectării periferice. Această abordare a fost studiată de către Faigel și colaboratorii [237] care au
comparat concentrațiile a trei chemoterapeutice după injectarea acestora în vena portă și după
injectarea perferică pe modele ex perimentale porcine. După compararea rezultatelor, a observat
faptul că au existat concentrații mai mari în țesutul hepatic ale irinotecanului, doxorubicinei și
paclitaxelului, în urma injectării prin vena portă, în comparație cu injectarea sistemică, în t imp ce
nivelul toxic a fost redus la aproape jumătate în special în țesutul cardiac.
În comparația dintre injectarea locală și cea prin vena portă, imaginile prin IRM au fost în
concordanță cu rezultatele examinării patologice. Acest studiu prezintă anumi te limtări care
constau în numărul mic de animale și în faptul că distribuția NPM a fost evaluată doar prin
scanarea cu rezonanță magnetică și prin examinarea histopatologică. Prin încercarea de a valida
tehnica ecoendoscopică, nu ne -am orientat spre deter minarea concentrațiilor de fier din țesuturi
și nici pe eliminarea urinară. Totuși, concentrația NPM poate fi estimată cu ușurință prin
imagistică, conducând la o mai bună cuantificare în interiorul regiunii de interes.

5. Concluzii
Prezentul studiu s -a axat pe demonstrarea fezabilității distribuției nanoparticulelor
magnetice prin utilizarea injectarii ecoendoscopice în ficat prin acces local sau vascular, și pe
distribuția acestora în organe. Ghidajul prin EUS oferă un acces unic la acest organ și la
structurile vasculare adiacente, fapt care facilitează tehnicile terapeutice care au reprezentat un
interes major în cadrul radiologiei intervenționale. În conformitate cu obiectivele studiulu i, am
demonstrat fezabilitatea și siguranța administrăr ii nanoparticulelor atât prin injectare directă în
ficat, câ t și prin abordare ecoendoscopic ă a venei porte. Aș a cum era de a șteptat , ambele abordari
sunt mult superioare inject ării periferice, în termeni de distribuție strict hepatică și de minimizare
a acumulării nespecifice a nanoparticulelor în alte organe. Diferenț ele obse rvate între rezultatele
injectării locale ș i cele i prin abord portal pot fi cu ușurință extrapolate î n anumite circumstanțe
clinice, în conformitate cu an umite caracteristici tumoral e, în special în ceea ce priveș te num ărul

48
sau extensia local ă a acestora, determinâ ndu-se astfel necesitate a unei distribuț ii hepatice difuze,
sau, dimpotrivă, utilitatea obținerii unei acumulă ri locale și limitate. Nanoparticulele magnetice
au fost pe la rg studiate pentru formațiuni hepatice în diferite scenarii terapeutice precum
hipertermia sau ca vector pentru diverse medicamente cu potențial chemoterapeutic. Astfel,
rezultatele acestui studiu reprezint ă o adi ție important ă arsenalului de cuno ștințe acumulate p ână
în prezent . În concluzie, i njectarea acestora prin ghidaj ecoendoscopic poate determina
dezvoltarea unor noi strategii de diagnostic sau de tratament în cazul tumorilor de ficat, cu
posibilitatea de a amelior a prognosticul nefavorabil al aces tor afecțiuni .

49
Bibliografie

1. Bean CP, Livingston JD. Superparamagnetism. J Appl Phys 1959; 30: 120 –129. doi:
10.1063/1.2185850
2. Yu Y, Sun D. Super paramagnetic iron oxide nanoparticle ―theranostics‖ for multimodality
tumor imaging, gene delivery, targeted drug and prodrug delivery. Expert RevClin Pharmacol
2010; 3:117 –13
3. Li Li , Wen Jiang : Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles as MRI contrast agents for
Non-invasive Stem Cell Labeling and Tracking. Theranostics. 2013; 3(8): 595 –615 PMCID:
PMC3741608
4. Weizenecker J, Gleich B, Rahmer J, Dahnke H, Borgert J. Threedimensional real -time in vivo
magnetic particle imaging. Phys Med Biol. 2009; 54(5):L1 –L10.
5. Llovet JM , Burroughs A, Bruix J. Hepatocellular carcinoma. Lancet 2003; 362: 1907 -1917.
doi:10.1016/S0140 -6736(03)14964 -1
6. Sangiovanni A , Del Ninno E, Fasani P, et al. Increased survival of cirrhotic patients with a
hepatocellular carcinoma detected during surveillance. Gastroenterology 2004; 126: 1005 -1014.
7. Benvegnù L , Gios M, Boccato S, Alberti A. Natural history of compensated viral cirrhosis: a
prospective study on the incidence and hierarchy of major complications. Gut 2004; 53: 744 –
749.
8. Tiribelli C, Melato M, Crocè LS, Giarelli L, Okuda K, Ohnishi K .Prevalence o f hepatocellular
carcinoma and relation to cirrhosis: comparison of two different cities of the world –Trieste,
Italy, and Chiba, Japan. Hepatology. 1989 Dec; 10(6):998 -1002.
9. Fattovich G, Giustina G, Degos F, Tremolada F, Realdi G, et al. Morbidity and mor tality in
compensated cirrhosis type C: a retrospective follow -up study of 384 patients.
Gastroenterology. 1997 Feb; 112(2):463 -72.
10. Bolondi L, Sofia S, Siringo S, et al. Surveillance programme of cirrhotic patients for early
diagnosis and treatment of hepa tocellular carcinoma: a cost effectiveness analysis. Gut.
2001; 48(2):251 –9
11. Fattovich G, Stroffolini T, Zagni I, et al. Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and
risk factors. Gastroenterology. 2004; 127(5 Suppl 1):S35 –50.
12. Delhaye M, Louis H, Degraef C, et al . Relationship between hepatocyte proliferative activity
and liver functional reserve in human cirrhosis. Hepatology 1996;23:1003 -1011.

50
13. Caillot F, Derambure C, Bioulac -Sage P, et al . Transient and etiology -related transcription
regulation i n cirrhosis prior to hepatocellular carcinoma occurrence. World J Gastroenterol
2009;15:300 -309.
14. El-Serag HB, Rudolph KL . Hepatocellular carcinoma: Epidemiology and molecular
carcinogenesis. Gastroenterology 2007;132:2557 -2576.
15. Kew MC. Interaction between hepatitis B and C viruses in hepatocellular carcinogenesis. J
Viral Hepat. 2006; 13:145–149.
16. Kremsdorf D, Soussan P, Paterlini -Brechot P, Brechot C. Hepatitis B virus -related
hepatocellular carcinoma: paradigms for viral -related human carcinogenesis. Oncogene.
2006; 25:3823 –3833
17. Parkin DM. The global health burden of infection -associated cancers in the year 2002. Int J
Cancer. 2006; 118(12):3030 –44.
18. Berasain C, Castillo J, Perugorria MJ, Latasa MU, Prieto J, Avila MA. Inflammation and liver
cancer: new m olecular links. Ann N Y Acad Sci. 2009; 1155 :206–221.
19. Yang JD, Kim WR, Coelho R, et al. Cirrhosis is present in most patients with hepatitis B and
hepatocellular carcinoma. Clin Gastroenterol Hepatol. 2011 Jan; 9(1):64 –70.
20. But DYK, Lai CL, Yuen MF . Natural h istory of hepatitis -related hepatocellular carcinoma.
World J Gastroenterol 2008;14:1652 -1656.
21. Szabó E, Páska C, Kaposi Novák P, et al . Similarities and differences in hepatitis B and C virus
induced hepatocarcinogenesis. Pathol Oncol Res 2004;10:5 -11.
22. Donato F, Tagger A, Gelatti U, et al . Alcohol and hepatocellular carcinoma: The effect of
lifetime intake and hepatitis virus infections in men and women. Am J Epidemiol
2002;155:323 -331.
23. Freeman AJ, Dore GJ, Law MG, et al. Estimating progression to cirrho sis in chronic hepatitis C
virus infection. Hepatology. 2001; 34(4 Pt 1):809 –16
24. Tong MJ, el -Farra NS, Reikes AR, et al. Clinical outcomes after transfusion -associated hepatitis
C. N Engl J Med. 1995; 332(22):1463 –66.
25. Lonardo A, Adinolfi LE, Petta S, et al . Hepatitis C and diabetes: The inevitable coincidence?
Expert Rev Anti Infect Ther 2009;7:293 -308.
26. Cramp ME. Hbv + Hcv = Hcc? Gut. 1999; 45(2):168 –9.
27. Singal AK, Anand BS . Mechanisms of synergy between alcohol and hepatitis C virus. J Clin
Gastroenterol 2007;4 1:761 -772.
28. Noureddin M, Mato JM and Lu SC. Nonalcoholic fatty liver disease: Update on pathogenesis,
diagnosis, treatment and the role of S -adenosylmethionine. Exp Biol Med. 2015; 240:809 -820

51
29. Rinella ME. Nonalcoholic fatty liver disease: a systematic revie w. JAMA. 2015; 313:2263 –
2273.
30. Henao -Mejia J, Elinav E, Jin C, Hao L, Mehal WZ, Strowig T, Thaiss CA, Kau AL, Eisenbarth
SC, Jurczak MJ, Camporez JP, Shulman GI, Gordon JI, Hoffman HM and Flavell RA.
Inflammasome -mediated dysbiosis regulates progression of N AFLD and obesity. Nature. 2012;
482:179 -185.
31. Loomba R, Abraham M, Unalp A, Wilson L, Lavine J, Doo E, Bass NM and Nonalcoholic
Steatohepatitis Clinical Research N. Association between diabetes, family history of diabetes,
and risk of nonalcoholic steatohep atitis and fibrosis. Hepatology. 2012; 56:943 -951.
32. Matteoni CA, Younossi ZM, Gramlich T, Boparai N, Liu YC, McCullough AJ. Nonalcoholic
fatty liver disease: a spectrum of clinical and pathological severity. Gastroenterology.
1999; 116:1413 –1419.
33. White DL, K anwal F, El -Serag HB. Association between nonalcoholic fatty liver disease and
risk for hepatocellular cancer, based on systematic review. Clin Gastroenterol Hepatol.
2012; 10:1342 –1359.e2.
34. Ascha MS, Hanouneh IA, Lopez R, Tamimi TA, Feldstein AF, Zein NN. The incidence and
risk factors of hepatocellular carcinoma in patients with nonalcoholic steatohepatitis.
Hepatology. 2010; 51:1972 –1978.
35. Bhala N, Angulo P, van der Poorten D, Lee E, Hui JM, Saracco G, Adams LA,
Charatcharoenwitthaya P, Topping JH, Bugianesi E, et al. The natural history of nonalcoholic
fatty liver disease with advanced fibrosis or cirrhosis: an international collaborative study.
Hepatology. 2011; 54:1208 –1216.
36. Alexander J, Tor benson M, Wu TT, Yeh MM. Non -alcoholic fatty liver disease contributes to
hepatocarcinogenesis in non -cirrhotic liver: a clinical and pathological study. J Gastroenterol
Hepatol. 2013; 28:848–854.
37. Guzman G, Brunt EM, Petrovic LM, Chejfec G, Layden TJ, Cotle r SJ. Does nonalcoholic fatty
liver disease predispose patients to hepatocellular carcinoma in the absence of cirrhosis? Arch
Pathol Lab Med. 2008; 132:1761 –1766.
38. Mittal S, El -Serag HB, Sada YH, Kanwal F, Duan Z, Temple S, May SB, Kramer JR,
Richardson PA, Davila JA. Hepatocellular Carcinoma in the Absence of Cirrhosis in United
States Veterans is Associated With Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Clin Gastroenterol
Hepatol. 2016; 14:124–131.e1.

52
39. Perumpail RB, Wong RJ, Ahmed A, Harrison SA. Hepatocellular Carci noma in the Setting of
Non-cirrhotic Nonalcoholic Fatty Liver Disease and the Metabolic Syndrome: US Experience.
Dig Dis Sci. 2015; 60:3142 –3148.
40. Sasdelli AS, Brodosi L, Marchesini G. NAFLD -Associated Hepatocellular Carcinoma: a Threat
to Patients with Metabolic Disorders. Curr Hepatology Rep. 2016; 15:103–112
41. Piscaglia F, Svegliati -Baroni G, Barchetti A, Pecorelli A, Marinelli S, Tiribelli C, Bellen tani S.
Clinical patterns of hepatocellular carcinoma in nonalcoholic fatty liver disease: A multicenter
prospective study. Hepatology. 2016; 63:827–838.
42. Margini C, Dufour JF. The story of HCC in NAFLD: from epidemiology, across pathogenesis,
to prevention and treatment. Liver Int. 2016; 36:317–324.
43. Adams LA, Angulo P, Lindor KD . Nonalcoholic fatty liver disease. CMAJ 2005;172:899 -905.
44. Sanyal AJ, Campbell -Sargent C, Mirshahi F, et al . Nonalcoholic steatohepatitis: Association of
insulin resistance and mitochondrial abnormalities. Gastroenterology 2001;120:1183 -1192.
45. Farges O, Ferreira N, Dokmak S, Belghiti J, Bedossa P, Paradis V. Changing trends in
malignant transformation of hepatocellular adenoma. Gut. 2011; 60:85–89.
46. Petrides  AS,  Vogt  C,  Schulze -Berge  D,  Matthews  D,  Strohmeyer  G.  Pathogenesis  of 
glucose  intolerance  and  diabetes mellitus in cirrhosis. Hepatology 1994;19:616 -627
47.  Garcia -Compean  D,  Jaquez -Quintana  JO,  GonzalezGonzalez  JA,  Maldonado -Garza  H. 
Liver  cirrhosis  and  d iabetes: risk factors, pathophysiology, clinical implications 
and management. World J Gastroenterol 2009;15:280 -288. 
48. Davila JA, Morgan RO, Shaib Y, McGlynn KA, El –
Serag HB. Diabetes increases the risk of hepatocellular carcinoma in 
the United States: a  population based case control study.  Gut 2005;54:533 -539. 
49. El-Serag HB, Hampel H, Javadi F. The association between diabetes and hepatocellular
carcinoma: a systemic review of epidemiology evidence. Clin Gastroenterol Hepatol.
2006; 4:369–380.
50. Bell DS, Al lbright E. The multifaceted associations of hepatobiliary disease and diabetes.
Endocr Pract. 2007; 13:300–312..
51. Veldt BJ, Chen W, Heathcote EJ, Wedemeyer H, Reichen J, Hofmann WP, Knegt RJ, Zeuzem
S, Manns MP, Hansen BE, Schalm SW, Janssen HL. Increased ri sk of hepatocellular carcinoma
among patients with hepatitis C cirrhosis and diabetes mellitus. Hepatology. 2008; 47:1856 –
1862.
52. Hassan MM, Curley SA, Li D, Kaseb A, Davila M, Abdalla EK, Javle M, Moghazy DM,
Lozano RD, Abbruzzese JL, Vauthey JN. Associatio n of diabetes duration and diabetes

53
treatment with the risk of hepatocellular carcinoma. Cancer. 2010; 116:1938 –1946. doi:
10.1002/cncr.24982.
53. Yuan JM, Govindarajan S, Arakawa K, Yu MC. Synergism of alcohol, diabetes and viral
hepatitis on the risk of hepatocellular carcinoma in blacks and whites in the U.S. Cancer.
2004; 101:1009 –1017. doi: 10.1002/cncr.20427.
54. El-Serag HB, Tran T, Everhart JE. Di abetes increases the risk of chronic liver disease and
hepatocellular carcinoma. Gastroenterology. 2004; 126:460–468. doi:
10.1053/j.gastro.2003.10.065
55. Chen CL, Yang HI, Yang WS, Liu CJ, Chen PJ, You SL, Wang LY, Sun CA, Lu SN, Chen DS,
Chen CJ. Metabolic f actors and risk of hepatocellular carcinoma by chronic hepatitis B/C
infection: a follow -up study in Taiwan. Gastroenterology. 2008; 135:111–121. doi:
10.1053/j.gastro.2008.03.073.
56. Hassan MM, Hwang LY, Hatten CJ, Swaim M, Li D, Abbruzzese JL, Beasley P, Pat t YZ. Risk
factors for hepatocellular carcinoma: synergism of alcohol with viral hepatitis and diabetes
mellitus. Hepatology. 2002; 361:1206 –1213.
57. Komura T, Mizukoshi E, Kita Y, Sakurai M, Takata Y, Arai K, Yamashita T, Ohta T, Shimizu
K, Nakamoto Y, Honda M, Takamura T, Kaneko S. Impact of diabetes on recurrence of
hepatocellular carcinoma after surgical treatment in patients with viral hepatitis. Am J
Gastroenterol. 2007; 102:1939 –1946. doi: 10.1111/j.1572 -0241.2007.01354.x.
58. Ikeda Y, Shimada M, Hasegawa H, Gion T, Kajiyama K, Shirabe K, Yanaga K, Takenaka K,
Sugimachi K. Prognosis of hepatocellular carcinoma with diabetes mellitus after hepatic
resection. Hepatology. 1998; 27:1567 –1571. doi: 10.1002/hep.510270615
59. Dellon ES, Shaheen NJ. Diabetes and hepatocell ular carcinoma: associations, biological
plausibility and clinical implications. Gastroenterology. 2005; 129:1132 –1134. doi:
10.1053/j.gastro.2005.06.079.
60. Zhang YJ, Chen Y, Ahsan H, et al. Silencing of glutathione S -transferase P1 by promoter
hypermethylati on and its relationship to environmental chemical carcinogens in hepatocellular
carcinoma. Cancer Lett. 2005; 221(2):135 –43.
61. Qian GS, Ross RK, Yu MC, et al. A follow -up study of urinary markers of aflatoxin exposure
and liver cancer risk in Shanghai, People ’s Republic of China. Cancer Epidemiol Biomarkers
Prev. 1994; 3(1):3 –10.
62. Heidelbaugh JJ, Bruderly M . Cirrhosis and chronic liver failure: Part I. Diagnosis and
evaluation. Am Fam Physician 2006;74:756 -762.

54
63. Wege H, Brümmendorf TH . Telomerase activation in liver regeneration and
hepatocarcinogenesis: Dr. Jekyll or Mr. Hyde? Curr Stem Cell Res Ther 2007;2:31 -38.
64. Wiemann SU, Satyanarayana A, Tsahuridu M, et al . Hepatocyte telomere shortening and
senescence are general markers of human liver cirrhosis. FASEB J 2002;16:935 -942.
65. Calado RT, Brudno J, Mehta P, et al. Constitutional telomerase mutations are genetic risk
factors for cirrhosis. Hepatology. 2011; 53(5):1600 –1607.
66. Nault JC, Mallet M, Pilati C, et al. High frequency of telomerase reverse -transcriptase promoter
somatic mutations in hepatocellular carcinoma and preneoplastic lesions. Nat Commun. 2013; 4:
2218.
67. Totoki Y, Tatsuno K, Covington KR, et al. : Trans -ancestry mutational landscape of
hepatocellular carcinoma genomes. Nat Genet. 2014; 46(12):1267 –1273. 10.1038/ng.3126
68. Hussain SP, Schwank J, Staib F, et al. : TP53 mutations and hepatocellular carcinoma: insights
into the etiology and pathogenesis of liver cancer. Oncogene. 2007; 26(15):2166 –2176.
10.1038/sj.onc.1210279
69. Cleary SP, Jeck WR, Zhao X, et al . : Identification of driver genes in hepatocellular carcinoma
by exome sequencing. Hepatology. 2013; 58(5):1693 –1702.
70. Ozturk M.: p53 mutation in hepatocellular carcinoma after aflatoxin exposure. Lancet.
1991; 338(8779 ):1356 –1359. 10.1016/0140 -6736(91)92236 -U
71. Madden CR, Finegold MJ, Slagle BL.: Altered DNA mutation spectrum in aflatoxin b1 -treated
transgenic mice that express the hepatitis B virus x protein. J Virol. 2002; 76(22):11770 –11774.
10.1128/JVI.76.22.11770 -11774.2002
72. Jiang Z, Jhunjhunwala S, Liu J, et al. : The effects of hepatitis B virus integration into the
genomes of hepatocellular carcinoma patients. Genome Res. 2012; 22(4):593 –601.
73. Wang Y, Lau SH, Sham JS, et al. : Characterization of HBV integrants in 14 hepatocellular
carcinomas: association of truncated X gene and hepatocellular carcinogenesis. Oncogene.
2004; 23(1):142 –148.
74. Tischoff I, Tannapfe A.: DNA methylation in hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol.
2008; 14(11):1741 –1748. 10.3748/wjg.14.1741
75. Park IY, S ohn BH, Yu E, et al. : Aberrant epigenetic modifications in hepatocarcinogenesis
induced by hepatitis B virus X protein. Gastroenterology. 2007; 132(4):1476 –1494.
76. Cai MY, Hou JH, Rao HL, et al. : High expression of H3K27me3 in human hepatocellular
carcinomas correlates closely with vascular invasion and predicts worse prognosis in patients.
Mol Med. 2011; 17(1–2):12–20. 10.2119/molmed.2010.00103

55
77. Li M, Zhao H, Zhang X, et al. : Inactivating mutations of the chromatin remodeling gene
ARID2 in hepatocel lular carcinoma. Nat Genet. 2011; 43(9):828 –829. 10.1038/ng.903
78. Villanueva A, Newell P, Chiang DY, et al. : Genomics and signaling pathways in hepatocellular
carcinoma. Semin Liver Dis. 2007; 27(1):55–76. 10.1055/s -2006 -960171
79. Anastas JN, Moon RT. WNT signal ling pathways as therapeutic targets in cancer. Nat Rev
Cancer. 2013; 13:11–26
80. Bengochea A, de Souza MM, Lefrançois L, Le Roux E, Galy O, Chemin I, Kim M, Wands JR,
Trepo C, Hainaut P, et al. Common dysregulation of Wnt/Frizzled receptor elements in human
hepatocellular carcinoma. Br J Cancer. 2008; 99:143–150
81. Whittaker S, Marais R, Zhu AX. The role of signaling pathways in the development and
treatment of hepatocellular carcinoma. Oncogene. 2010; 29:4989 –5005.
82. Cetin GO, Toylu A, Atabey N, Sercan Z, Sakizli M. Downregulation of VANGL1 inhibits
cellular invasion rather than cell motility in hepatocellular carcinoma cells without stimulation.
Genet Test Mol Biomarkers. 2015; 19:283–287.
83. Toyama T, Lee HC, Koga H, Wan ds JR, Kim M. Noncanonical Wnt11 inhibits hepatocellular
carcinoma cell proliferation and migration. Mol Cancer Res. 2010; 8:254–265.
84. Roberts LR, Gores GJ.: Hepatocellular carcinoma: molecular pathways and new therapeutic
targets. Semin Liver Dis. 2005; 25(2):212 –225. 10.1055/s -2005 -871200
85. Bhat M, Sonenberg N, Gores GJ.: The mTOR pathway in hepatic malignancies. Hepatology.
2013; 58(2):810 –818. 10.1002/hep.26323
86. Liu L, Cao Y, Chen C, et al. : Sorafenib blocks the RAF/MEK/ERK pathway, inhibits tumor
angiogenesi s, and induces tumor cell apoptosis in hepatocellular carcinoma model PLC/PRF/5.
Cancer Res. 2006; 66(24):11851 –11858. 10.1158/0008 -5472.CAN -06-1377
87. Sugano, S., et al., Intrahepatic arteriovenous shunting due to hepatocellular carcinoma and
cirrhosis, and its change by transcatheter arterial embolization. Am J Gastroenterol, 1994.
89(2): p. 184 -8.
88. Inagaki, Y., M. Unoura, and K. Kobayashi, Clinical features and diagnosis of primary
liver cancer, in Primary Liver Cancer in Japan, T. Tobe, et al., Editors. 19 92, Springer Japan:
Tokyo. p. 93 -102.
89. Kew, M.C., H.A. Dos Santos, and S. Sherlock, Diagnosis of primary cancer of the liver.
Br Med J, 1971. 4(5784): p. 408 -11.
90. Horie, Y., et al., Pedunculated hepatocellular carcinoma. Report of three cases and
review of literature. Cancer, 1983. 51(4): p. 746 -51.

56
91. Takashima, T. and O. Matsui, Infusion hepatic angiography in the detection of small
hepatocellular carcinomas. Radiology, 1980. 136(2): p. 321 -325.
92. Nakashima, T., et al., Pathology of hepatocellular carcinoma in Japan. 232 Consecutive
cases autopsied in ten years. Cancer, 1983. 51(5): p. 863 -77.
93. Kato, Y., et al., Growth of hepatocellular carcinoma into the right atrium. Report of five cases.
Ann Intern Med, 1983. 99(4): p. 472 -4.
94. Edmondson, H.A. and P.E. Stei ner, Primary carcinoma of the liver: a study of 100 cases
among 48,900 necropsies. Cancer, 1954. 7(3): p. 462 -503.
95. Trevisani, F., et al., Etiologic factors and clinical presentation of hepatocellular carcinoma.
Differences between cirrhotic and noncirrhoti c Italian patients. Cancer, 1995. 75(9): p. 2220 -32.
96. Thyagarajan, M.S. and K. Sharif, Space Occupying Lesions in the Liver. Indian J Pediatr,
2016.
97. Kemmer, N., et al., An analysis of the UNOS liver transplant registry: high serum alpha –
fetoprotein does n ot justify an increase in MELD points for suspected hepatocellular carcinoma.
Liver Transpl, 2006. 12(10): p. 1519 -22.
98. Carr, B.I., et al., Clinical evaluation of lens culinaris agglutinin -reactive alpha -fetoprotein and
des-gamma -carboxy prothrombin in his tologically proven hepatocellular carcinoma in the
United States. Dig Dis Sci, 2007. 52(3): p. 776 -82.
99. Sterling, R.K., et al., Clinical utility of AFP -L3% measurement in North American
patients with HCV -related cirrhosis. Am J Gastroenterol, 2007. 102(10) : p. 2196 -205.
100. Sterling, R.K., et al., Utility of Lens culinaris agglutinin -reactive fraction of alpha –
fetoprotein and des -gamma -carboxy prothrombin, alone or in combination, as biomarkers for
hepatocellular carcinoma. Clin Gastroenterol Hepatol, 2009. 7(1 ): p. 104 -13.
101. Hennedige, T. and S. Kundapur Venkatesh, Imaging of hepatocellular carcinoma:
diagnosis, staging and treatment monitoring. Cancer Imaging, 2012. 12(3): p. 530 -547.
102. Colli, A., et al., Accuracy of ultrasonography, spiral CT, magnetic resonance, and alpha –
fetoprotein in diagnosing hepatocellular carcinoma: a systematic review. Am J Gastroenterol,
2006. 101(3): p. 513 -23.
103. Wu H., Yin J.J., Wamer W.G., Zeng M., Lo Y.M. Reactive oxygen species -related
activities of nano -iron metal and nano -iron oxides. J. Food Drug Anal. 2014; 22:86–94. doi:
10.1016/j.jfda.2014.01.007.
104. A., Muoz M.F., Arguelles S. Lipid peroxidation: Production, metabolism, and signaling
mechanisms of malondialdehyde and 4 -hydroxy -2-nonenal. Oxidative Med. Cell. Longev.
2014; 2014 :31. doi: 10.1155/2014/360438.

57
105. Srinivasan A., Lehmler H.J., Robertson L.W., Ludewig G. Production of DNA strand
breaks in vitro and reac tive oxygen species in vitro and in HL -60 cells by PCB metabolites.
Toxicol. Sci. 2001; 60:92–102. doi: 10.1093/toxsci/60.1.92.
106. Ziech D., Franco R., Pappa A., Panayiotidis M.I. Reactive oxygen species (ROS) —
Induced genetic and epigenetic alterations in huma n carcinogenesis. Mutat. Res. 2011; 711:167–
173. doi: 10.1016/j.mrfmmm.2011.02.015.
107. Sharma P., Jha A.B., Dubey R.S., Pessarakli M. Reactive oxygen species, oxidative
damage, and antioxidative defense mechanism in plants under stressful conditions. J. Bot.
2012;2012 :26. doi: 10.1155/2012/217037.
108. Sugamura K., Keaney J.F., Jr. Reactive oxygen species in cardiovascular disease. Free
Radic. Biol. Med. 2011; 51:978–992. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2011.05.004.
109. Liou G.Y., Storz P. Reactive oxygen species in cancer. Free Radic. Res. 2010; 44:479–
496. doi: 10.3109/10715761003667554.
110. Mittal M., Siddiqui M.R., Tran K., Reddy S.P., Malik A.B. Reactive oxygen species in
inflammation and tissue injury. Antioxid. Redox Signal. 2014; 20:1126 –1167. doi:
10.1089/ars.2012.5149
111. Giacco F., Brownlee M. Oxidative stress and diabetic complications. Circ. Res.
2010; 107:1058 –1070. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.110.223545
112. Zuo L., Motherwell M.S. The impact of reactive oxygen species and genetic
mitochondrial mutations in Parkinson’s disease. Gene. 2013; 532:18–23. doi:
10.1016/j.gene.2013.07.085.
113. Gelderman K.A., Hultqvist M., Olsson L.M., Bauer K., Pizzolla A., Olofsson P.,
Holmdahl R. Rheumatoid arthritis: The role of reactive oxygen species in disease development
and therapeutic strategies. Antioxid. Redox Signal. 2007; 9:1541 –1567. doi:
10.1089/ars.2007.1569.
114. Hemmingsson A, Carlsten J, Ericsson A, Klaveness J, Sperber GO, Thuomas KA.
Relaxation enhancement of the dog liver and spleen by biodegradable superparamagnetic
particles in proton magn etic resonance imaging. Acta Radiol 1987; 28: 703 –705.
115. Ying E., Hwang H. -M. In vitro evaluation of the cytotoxicity of iron oxide nanoparticles
with different coatings and different sizes in A3 human T lymphocytes. Sci. Total Environ.
2010; 408:4475 –4481. d oi: 10.1016/j.scitotenv.2010.07.025.
116. Karlsson H.L., Gustafsson J., Cronholm P., Möller L. Size -dependent toxicity of metal
oxide particles —A comparison between nano – and micrometer size. Toxicol. Lett.
2009; 188:112–118. doi: 10.1016/j.toxlet.2009.03.014.

58
117. Lee J.H., Ju J.E., Kim B.I., Pak P.J., Choi E.K., Lee H.S., Chung N. Rod -shaped iron
oxide nanoparticles are more toxic than sphere -shaped nanoparticles to murine macrophage
cells. Environ. Toxicol. Chem. 2014; 33:2759 –2766. doi: 10.1002/etc.2735.
118. Voinov M.A ., Pagán J.O.S., Morrison E., Smirnova T.I., Smirnov A.I. Surface -mediated
production of hydroxyl radicals as a mechanism of iron oxide nanoparticle biotoxicity. J. Am.
Chem. Soc. 2011; 133:35–41. doi: 10.1021/ja104683w.
119. Malvindi M.A., de Matteis V., Galeon e A., Brunetti V., Anyfantis G.C., Athanassiou A.,
Cingolani R., Pompa P.P. Toxicity assessment of silica coated iron oxide nanoparticles and
biocompatibility improvement by surface engineering. PLoS ONE. 2014; 9:e85835.
120. Cromer Berman S.M., Kshitiz, Wang C. J., Orukari I., Levchenko A., Bulte J.W.M.,
Walczak P. Cell motility of neural stem cells is reduced after SPIO -labeling, which is mitigated
after exocytosis. Magn. Reson. Med. 2013; 69:255–262.
121. Buyukhatipoglu K., Clyne A.M. Superparamagnetic iron oxide nan oparticles change
endothelial cell morphology and mechanics via reactive oxygen species formation. J. Biomed.
Mater. Res. Part A. 2011; 96:186–195.
122. Kalive M., Zhang W., Chen Y., Capco D. Human intestinal epithelial cells exhibit a
cellular response indicati ng a potential toxicity upon exposure to hematite nanoparticles. Cell
Biol. Toxicol. 2012; 28:343–368.
123. Kedziorek D.A., Muja N., Walczak P., Ruiz -Cabello J., Gilad A.A., Jie C.C., Bulte J.W.
Gene expression profiling reveals early cellular responses to intra cellular magnetic labeling
with superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Magn. Reson. Med. 2010; 63:1031 –1043
124. Alarifi S., Ali D., Alkahtani S., Alhader M.S. Iron oxide nanoparticles induce oxidative
stress, DNA damage, and caspase activation in the human breast cancer cell line. Biol. Trace
Elem. Res. 2014; 159:416–424
125. Couto D., Freitas M., Porto G., Lopez -Quintela M.A., Rivas J., Freitas P., Carvalho F.,
Fernandes E. Polyacrylic acid -coated and non -coated iron oxide nanoparticles induce cytokine
activation in human blood cells through TAK1, p38 MAPK and JNK pro -inflammatory
pathways. Arch. Toxicol. 2015; 89:1759 –1769. doi: 10.1007/s00204 -014-1325 -4.
126. Liu Y., Wang J. Effects of DMSA -coated Fe 3O4 nanoparticles on the transcription of
genes related to iron and osmosis homeostasis. Toxicol. Sci. 2013; 131:521–536. doi:
10.1093/toxsci/kfs300.
127. Cai H., An X., Cui J., Li J., W en S., Li K., Shen M., Zheng L., Zhang G., Shi X. Facile
hydrothermal synthesis and surface functionalization of polyethyleneimine -coated iron oxide

59
nanoparticles for biomedical applications. ACS Appl. Mater. Interfaces. 2013; 5:1722 –1731.
doi: 10.1021/am30 2883m.
128. Yu M., Huang S., Yu K.J., Clyne A.M. Dextran and polymer polyethylene glycol (PEG)
coating reduce both 5 and 30 nm iron oxide nanoparticle cytotoxicity in 2D and 3D cell culture.
Int. J. Mol. Sci. 2012; 13:5554 –5570. doi: 10.3390/ijms13055554.
129. Shukla S., Jadaun A., Arora V., Sinha R.K., Biyani N., Jain V.K. In vitro toxicity
assessment of chitosan oligosaccharide coated iron oxide nanoparticles. Toxicol. Rep.
2015; 2:27–39. doi: 10.1016/j.toxrep.2014.11.002.
130. NDong C., Tate J.A., Kett W.C., Batra J., De midenko E., Lewis L.D., Hoopes P.J.,
Gerngross T.U., Griswold K.E. Tumor cell targeting by iron oxide nanoparticles is dominated
by different factors in vitro versus in vivo . PLoS ONE. 2015; 10:e0115636. doi:
10.1371/journal.pone.0115636.
131. Gu L., Fang R.H., Sailor M.J., Park J. -H. In vivo clearance and toxicity of monodisperse
iron oxide nanocrystals. ACS Nano. 2012; 6:4947 –4954. doi: 10.1021/nn300456z
132. Bellusci M., La Barbera A., Padella F., Mancuso M., Pasquo A., Grollino M.G., Leter G.,
Nardi E., Cremisini C ., Giardullo P., et al. Biodistribution and acute toxicity of a nanofluid
containing manganese iron oxide nanoparticles produced by a mechanochemical process. Int. J.
Nanomed. 2014; 9:1919 –1929.
133. Kim J.S., Yoon T.J., Yu K.N., Kim B.G., Park S.J., Kim H.W., L ee K.H., Park S.B., Lee
J.K., Cho M.H. Toxicity and tissue distribution of magnetic nanoparticles in mice. Toxicol. Sci.
2006; 89:338–347.
134. Jain TK, Reddy MK, Morales MA, Leslie -Pelecky DL, Labhasetwar V. Biodistribution,
Clearance, and Biocompatibility of Iron Oxide Magnetic Nanoparticles in Rats. Molecular
Pharmaceutics. 2008; 5:316–327.
135. Bourrinet P , Bengele HH , Bonnemain B , et al. Preclinical safety and pharmacokinetic
profile of ferumoxtran -10, an ultrasmall superparamagnetic iron oxide magnetic resonance
contrast agent . Invest Radiol 2006; 41: 3 13–324
136. Anzai Y, Piccoli CW, Outwater EK, et al. Evaluation of neck and body metastases to
nodes with ferumoxtran 10 -enhanced MR imaging: phase III safety and efficacy study.
Radiology 2003; 228: 777 -88. doi : 10.1148/radiol.2283020872
137. Elias A, Tsourkas A. Imaging circulating cells and lymphoid tissues with iron oxide
nanoparticles. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2009:720 –6.

60
138. Fabian, E., Landsiedel, R., Ma -Hock, L. et al. Tissue distribution and toxicity of
intravenously administered titanium dioxide nanoparticles in rats . Arch Toxicol (2008) 82: 151.
doi:10.1007/s00204 -007-0253 -y
139. Huang, XL., Zhang, B., Ren, L. et al. In vivo toxic studies and biodistribution of near
infrared sensitive Au –Au2S nanoparticles as potential drug delivery carriers J Mater Sci: Mater
Med (2008) 19: 2581. doi:10.1007/s10856 -007-3210 -7
140. Laurent S, Bridot JL, Elst LV et al. Magnetic iron oxide nanoparticles for biomedical
applications. Future Med Chem 2010; 2: 427 –449
141. Moghimi SM, Hunter AC , Murray JC . Long -circulating and target -specific nanoparticles:
theory to practice. Pharmacol Rev. 2001 Jun;53(2):283 -318.
142. Curtis, J., Greenberg, M., Kester, J. et al. Nanotechnology and Nanotoxicology. Toxicol
Rev (2006) 25: 245. doi:10.2165/00139709 -200625040 -00005
143. Moghimi SM,Hunter AC and Murray JC. Nanomedicine: current status and future
prospects. 2005 Faseb Journal 19 -311
144. Laurent S, Bridot JL, Elst LV et al. Magnetic iron oxide nanoparticles for biomedical
applications. Future Med Chem 2010; 2: 427 –44
145. Raynal I, et al. Macrophage Endocytosis of Superparamagnetic Iron Oxide
Nanoparticles: Mechanisms and Comparison of Ferumoxides and Ferumoxtran -10.
Investigative Radiology. 2004; 39(1):56 –63
146. Gupta AK, Gupta M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for
biomedical applications. Biomaterials 2005; 26: 3995 –4021
147. Longmire M, et al. Clearance properties of nano -sized particles and molecules as imaging
agents: considerations and caveats. Nanomedicine. 2008; 3(5):703 –717.
148. Kwon J T, Hwang S K, Jin H, Kim D S, Minai -Tehrani A, et al. Body Distribution of
Inhaled Fluoresc ent Magnetic Nanoparticles in the Mice. Journal of Occupational Health Vol.
50 (2008) No. 1 P 1-6
149. Kim J.S., Yoon T.J., Yu K.N., Kim B.G., Park S.J., Kim H.W., Lee K.H., Park S.B., Lee
J.K., Cho M.H. Toxicity and tissue distribution of magnetic nanoparticles in mice. Toxicol. Sci.
2006; 89:338–347.
150. Săftoiu A. State -of-the-art ima ging techniques in endoscopic ultrasound. World J
Gastroenterol. 2011 Feb 14; 17(6):691 -6.
151. Maeda H, Wu J, Sawa T, et al. Tumor vascular permeability and the EPR effect in
macromolecular therapeutics: a review. J Control Release. 2000;65:271 –284.

61
152. Fay F, Scott CJ. Antibody -targeted nanoparticles for cancer therapy. Immunotherapy.
2011; 3:381–94. doi:10.2217/imt.11.5.
153. Arosio D, Casagrande C, Manzoni L. Integrin -mediated drug delivery in cancer and
cardiovascular diseases with peptide -functionalized na noparticles. Current medicinal chemistry.
2012; 19:3128 –51.
154. Tietze R, Lyer S, Durr S, Alexiou C. Nanoparticles for cancer therapy using magnetic
forces. Nanomedicine (Lond) 2012; 7:447–57
155. Hendee WR, M.C. Magnetic resonance imaging. Part1 -physical principles. West J. Med.
1984, 141, 491 –500.
156. Park JY, Choi ES, Baek MJ, et al. Water -soluble ultra small paramagnetic or
superparamagnetic metal oxide nanoparticles for molecular MR Imaging. Eur J Inorg Chem.
2009;9:2477 –2481.
157. Filippousi M, Angelakeris M, Sikini M, e t al. Surfactant effects on the structural and
magnetic properties of iron oxide nanoparticles. J Phys Chem C. 2014;118:16209 –16217.
158. Tanaka M, Nakashima O, Wada Y, Kage M, Kojiro M. Pathomorphological study of
Kupffer cells in hepatocellular carcinoma and hyperplastic nodular lesions in the liver.
HEPATOLOGY 1996; 24:807 -812.
159. Kawamori Y, Matsui O, Kadoya M, Yoshikawa J, Demachi H, Takashima T.
Differentiation of hepatocellular carcinomas from hyperplastic nodules induced in rat liver with
ferrite enhanced M R imaging. Radiology 1992; 183: 65 –72. doi :
10.1148/radiology.183.1.1549696
160. Tanimoto A, Kuribayashi , S. Application of superparamagnetic iron oxide to imaging of
hepatocellular carcinoma. Eur J Radiol. 2006 May;58(2):200 -16.
doi:10.1016/j.ejrad.2005.11.040
161. Vogl TJ, Hammersti ngl R, Keck H, Felix R. Differential diagnosis of focal liver lesions
with MRI using the superparamagnetic contrast medium endorem. Radiologe 1995; 35: S258 –
S266.
162. Low PS, Henne WA, Doorneweerd DD. Discovery and development of folic -Acid -based
receptor targ eting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases. Acc Chem
Res. 2008; 41:120–9
163. Zhang C, Jugold M, Woenne EC, et al. Specific targeting of tumor angiogenesis by
RGD -conjugated ultrasmall superparamagnetic iron oxide particles using a clinical 1.5 -T
magnetic resonance scanner. Cancer Res. 2007; 67:1555 –62.

62
164. Toma A, Otsuji E, Kuriu Y, et al. Monoclonal antibody A7 -superparamagnetic iron oxide
as contrast agent of MR imaging of rectal carcinoma. Br J Cancer. 2005; 93:131–6
165. Soroceanu L, Gillespie Y, Khazaeli MB, et al. Use of chlorotoxin for targeting of primary
brain tumors. Cancer Res. 1998 ;58:4871 –9.
166. Colombo M, Carregal -Romero S, Casula MF, et al. Biological applications of magnetic
nanoparticles. Chem. Soc. Rev. 2012; 41(11):4306 –4334.
167. Andra W, Nowak H. Magnetism in Medicine: A Handbook . firsted. Germany: Wiley –
VCH; 1998.
168. Gonzales -Weimuller M, Zeisberger M, Krishnan KM. Size -dependant heating rates of
iron oxide nanoparticles for magnetic fluid hyperthermia. J. Magn. Magn. Mater.
2009; 321(13):1947 –1950.
169. Bañobre -López M , Teijeiro A , Rivas J . Magnetic nanoparticle -based hyperthermia for
cancer treatment . Rep Pract Oncol Radiother. 2013 Nov 1;18(6):397 -400.
170. Kikumori T, Kobayashi T, Sawaki M, Imai T. Anti -cancer effect of hyperthe rmia on
breast cancer by magnetite nanoparticle -loaded anti -HER2 immunoliposomes. Br. Cancer Res.
Treat. 2009; 113(3):435 –441.
171. Kikumori T, Kobayashi T, Sawaki M, Imai T. Anti -cancer effect of hyperthermia on
breast cancer by magnetite nanoparticle -loaded anti -HER2 immunoliposomes. Br. Cancer Res.
Treat. 2009; 113(3):435 –441.
172. Kubes J, Svoboda J, Rosina J, Starec M, Fiserova A. Immun ological response in the
mouse melanoma model after local hyperthermia. Physiol. Res. 2008; 57(3):459 –465
173. Multhoff G. Hyperthermia classic commentary: activation of natural killer (NK) cells by
heat shock protein 70, Gabriele Multhoff, International Journal of Hyperthermia, 18, 576 –585.
Int. J. Hypertherm. 2009; 25(3):176 –179. (2002)
174. Johannsen M, Gneveckow U, Eckelt L, et al. Clinical hyperthermia of prostate cancer
using magnetic nanoparticles: presentation of a new interstitial technique. Int. J. Hypertherm .
2005; 21(7):637 –647
175. Johannsen M, Thiesen B, Wust P, Jordan A. Magnetic nanoparticle hyperthermia for
prostate cancer. Int. J. Hypertherm. 2010; 26(8):790 –795
176. Maier -Hauff K, Ulrich F, Nestler D, et al. Efficacy and safety of intratumoral
thermotherapy using magnetic iron -oxide nanoparticles combined with external beam
radiotherapy on patients with recurrent glioblastoma multiforme. J. Neurooncol.
2011; 103(2):317 –324.

63
177. Gang J, Park SB, Hyung W, et al. Magnetic poly epsilon -caprolactone nanoparticles
containing Fe3O4 and gemcitabine enhance anti -tumor effect in pancreatic cancer xenograft
mouse model. J Drug Target. 2007; 15:445–53.
178. Chen H, Gu Y, Hub Y, et al. Characterization of pH – and temperature -sensitive hydrogel
nanoparticles for controlled drug release. PDA J Pharm Sci Technol. 2007; 61:303–13.
179. Lanza GM, Winter P, Caruthers S, et al. Novel paramagnetic contrast agents for
molecular imaging and targeted drug delivery. Curr Pharm Biotechnol. 2004; 5:495–507.
180. Atri M. New technologies and directed agents for appl ications of cancer imaging. J Clin
Oncol. 2006; 24:3299 –308.
181. Jain TK, Richey J, Strand M, Leslie -Pelecky DL, Flask CA, Labhasetwar V. Magnetic
nanoparticles with dual functional properties: Drug delivery and magnetic resonance imaging.
Biomaterials. 2008; 29:4012 –4021.
182. Kohler N, Sun C, Fichtenholtz A, Gunn J, Fang C, Zhang MQ. Methotrexate –
immobilized poly(ethylene glycol) magnetic nanoparticles for MR imaging and drug delivery.
Small. 2006; 2:785–792.
183. Nappini S, Bonini M, Ridi F, Baglioni P. Structure and per meability of
magnetoliposomes loaded with hydrophobic magnetic nanoparticles in the presence of a low
frequency magnetic field. Soft Matter. 2011; 7:4801 –4811. 15. doi: 10.1039/C0SM01264E
184. Chen Y, Chen Y, Xiao D, Bose A, Deng R, Bothun GD. Low -Dose Chemotherapy of
Hepatocellular Carcinoma through Triggered -Release from Bilayer -Decorated
Magnetoliposomes. Colloids Surf B Biointerfaces. 2014 April 1; 116: 452 –458.
doi: 10.1016/j.colsurfb.2014.01.022
185. Chen Y, Bose A, Bothun GD. Controlled Release from Bi layer -Decorated
Magnetoliposomes via Electromagnetic Heating. ACS Nano. 2010; 4:3215 –3221.
186. McBain SC, Griesenbach U, Xenariou S, Keramane A, Batich CD, Alton E, Dobson J.
Magnetic nanoparticles as gene delivery agents: enhanced transfection in the presence of
oscillating magnet arrays. Nanotechnology. 2008; 19
187. Kievit FM, Veiseh O, Bhattarai N, et al. PEI -PEG -chitosan copolymer coated iron oxide
nanoparticles for safe gene delivery: synthesis, complexation, and transfection. Adv. Funct.
Mater. 2009; 19(14):2244 –2251.
188. Morishita N, Nakagami H, Morishita R, et al. Magnetic nanoparticles with surface
modification enhanced gene delivery of HVJ -E vector. Biochem. Biophy. Res. Comm.
2005; 334(4):1121 –1126.

64
189. Patnaik S, Gupta KC. Novel polyethylenimine -derived nanoparticles for in vivo gene
delivery. Expert Opin. Drug Deliv. 2013; 10(2):215 –228.
190. Reddy LH, Arias JL, Nicolas J, Couvreur P. Magnetic nanoparticles: design and
characterization, toxicity and biocompatibility, pharmaceutical and biomedical applications.
Chem. Rev. 2012; 112(11):5818 –5878.
191. Schwerdt JI, Goya GF, Calatayud MP, Herenu CB, Reggiani PC, Goya R G. Magnetic
field-assisted gene delivery: achievements and therapeutic potential. Current gene therapy.
2012; 12:116–26. doi:10.2174/156652312800099616
192. Li C, Li L, Keates AC. Targeting cancer gene therapy with magnetic nanoparticles.
Oncotarget. 2012; 3:365–70.
193. Wang C, Ding C, Kong M, et al. Tumor -targeting magnetic lipoplex delivery of short
hairpin RNA suppresses IGF -1R overexpression of lung adenocarcinoma A549 cells in vitro
and in vivo . Biochem. Biophy. Res. Comm. 2011; 410(3):537 –542.
194. Jiang S, Eltoukhy A A, Love KT, Langer R, Anderson DG. Lipidoid -coated iron oxide
nanoparticles for efficient DNA and siRNA delivery. Nano Lett. 2013; 13(3):1059 –1064.
195. Wen M, Li B, Ouyang Y, Luo Y, Li S. Preparation and quality test of superparamagnetic
iron oxide labeled anti sense oligodeoxynucleotide probe: a preliminary study. Ann. Biomed.
Eng. 2009; 37(6):1240 –1250.
196. Hemmingsson A, Carlsten J, Ericsson A, Klaveness J, Sperber GO, Thuomas KA.
Relaxation enhancement of the dog liver and spleen by biodegradable superparamagnetic
particles in proton magnetic resonance imaging. Acta Radiol 1987; 28: 703 –705.
doi: 10.3109/02841858709177427
197. Weissleder R, Elizondo G, Wittenberg J, Lee AS, Josephson L, Brady TJ. Ultrasmall
superparamagnetic iron oxide: an intravenous contrast agent for assessing lymph nodes with
MR imaging. Radiology 1990; 175: 494 –498. doi : 10.1148/radiology.175.2.2326475
198. Seneterre E, Weissleder R, Jaramillo D, et al. Bone marrow: ultrasmall
superparamag netic iron oxide for MR imaging. Radiology 1991; 179: 529 –533. doi:
10.1148/radiology.179.2.2014305
199. Kawamori Y, Matsui O, Kadoya M, Yoshikawa J, Demachi H, Takashima T.
Differentiation of he patocellular carcinomas from hyperplastic nodules induced in rat liver with
ferrite enhanced MR imaging. Radiology 1992; 183: 65 –72. doi :
10.1148/radiology.183.1.1549696
200. Ferrucci JT, Stark D D. Iron oxide -enhanced MR imaging of the liver and spleen: review
of the first 5 years. Am J Roentgenol 1990; 155: 943 – 950. DOI: 10.2214/ajr.155.5.2120963

65
201. Tanimoto A, Kuribayashi , S. Application of superparamagnetic iron oxide to imaging of
hepatocellular carcinoma. Eur J Radiol. 2006 May;58(2):200 -16.
doi:10.1016/j.ejrad.2005.11.040
202. Vogl TJ, Hammerstingl R, Keck H, Felix R. Differential diagnosis of focal liver lesions
with MRI using the superparamagnetic contrast medium endorem. Radiologe 1995; 35: S258 –
S266.
203. Vogl TJ, Hammerstingl R,Schwarz W, et al. Magnetic resonance imaging of focal l iver
lesions. Comparison of the superparamagnetic iron oxide resovist versus gadolinium -DTPA in
the same patient. Invest Radiol 1996; 31: 696 –708.
204. Tang Y, Yamashita Y, Arakawa A, et al. Detection of hepatocellular carcinoma arising in
cirrhotic livers: com parison of gadolinium – and ferumoxides -enhanced MR imaging. AJR Am J
Roentgenol 1999; 172: 1547 -54.
205. Reimer P, Jähnke N, Fiebich M, et al. Hepatic lesion detection and characterization:
value of nonenhanced MR imaging, superparamagnetic iron oxide -enhanced MR imaging, and
spiral CT -ROC analysis. Radiology 2000;217:152 -8. doi : 10.1148/radiology.217.1.r00oc31152
206. Ros PR, Freeny PC, Harms SE, et al. Hepatic MR imaging with ferumoxides: a
multic enter clinical trial of the safety and efficacy in the detection of focal hepatic lesions.
Radiology 1995;196:481 -8. doi: 10.1148/radiology.196.2.7617864
207. Yamamoto H, Yamashita Y, Yoshimatsu S, et al. Hepatocellular carcinoma in cirrhotic
livers: detection with enhanced and iron oxide -enhanced MR imaging. Radiology
1995;195:106 -112. doi: 10.1148/radiology.195.1.7892448
208. Tanaka M, Nakashima O, Wada Y, Kage M, Kojiro M. Pathomorphological study of
Kupffer cells in hepatocellular carcinoma and hyperplastic nodular lesions in the liver.
HEPATOLOGY 1996; 24:807 -812. doi : 10.1002/hep.510240409
209. Imai Y , Murakami T , Yoshida S , Nishikawa M . Su perparamagnetic Iron Oxide –
Enhanced Magnetic Resonance Images of Hepatocellular Carcinoma: Correlation With
Histological Gradin. Hepatology. 2000 Aug;32(2):205 -12.
210. Li YW, Chen ZG, Wang JC, Zhang ZM. Superparamagnetic iron oxide -enhanced
magnetic resonance imaging for focal hepatic lesions: Systematic review and meta -analysis.
World J Gastroenterol. 2015 Apr 14; 21(14): 4334 –4344. doi: 10.3748/wjg.v21.i14. 4334
211. Lee JM, Kim IH, Kwak HS, Youk JH, Han YM, Kim CS. Detection of small
hypervascular hepatocellular carcinomas in cirrhotic patients: comparison of superparamagnetic
iron oxide -enhanced MR imaging with dual -phase spiral CT. Korean J Radiol 2003; 4: 1 -8.
doi: 10.3348/kjr.2003.4.1.1

66
212. Pauleit D, Textor J, Bachmann R, et al. Hepatocellular carcinoma: detection with
gadolinium – and ferumoxides -enhanced MR imaging of the liver. Radiology 2002; 222: 73 -80.
doi: 10.1148/radiol.22210 01599
213. Ward J, Guthrie JA, Scott DJ, et al. Hepatocellular carcinoma in the cirrhotic liver:
double -contrast MR imaging for diagnosis. Radiology 2000;216:154 -62. doi:
10.1148/radiology.216 .1.r00jl24154
214. Yan S , Zhang D , Gu N , et al. Therapeutic effect of Fe2O3 nanoparticles combined with
magnetic fluid hyperthermia on cultured liver cancer cells and xenograft liver cancers. J
Nanosci Nanotechnol. 2005 Aug; 5(8): 1185 -92. doi: 10.1166/jnn.2005.219
215. Wang ZY, Song JY, Zhang DS. Nanosized As2O3/Fe2O3 complexes combi ned with
magnetic fluid hyperthermia selectively target liver cancer cells World J Gastroenterol 2009
June 28; 15(24): 2995 -3002. doi: 10.3748/wjg.15.2995
216. Zhang J, Zhang D . Preparation of a nanosized as (2)o(3) /mn (0.5) zn (0.5) fe(2)o (4)
complex and its anti-tumor effect on hepatocellularcarcinoma cells. Sensors
(Basel). 2009;9(9):7058 -68. doi:10.3 390/s90907058
217. Chang PEJ, Purushotham S, Rumpel H, et al. Novel Dual Magnetic Drug Targeting and
Hyperthermia Therapy in Hepatocellular Carcinoma with Thermosensitive Polymer -Coated
Nanoparticles. J Gastroint Dig Syst 2014, 4:4.
218. Okada S. Chemotherapy in he patocellular carcinoma. Hepatogastroenterology. 1998
Aug;45 Suppl 3:1259 -63.
219. Nappini S, Bonini M, Ridi F, Baglioni P. Structure and permeability of
magnetoliposomes loaded with hydrophobic magnetic nanoparticles in the presence of a low
frequency magnetic field. Soft Matter. 2011; 7:4801 –4811. 15. doi: 10.1039/C0S M01264E
220. Nappini S, Al Kayal T, Berti D, Norden B, Baglioni P. Magnetically Triggered Release
From Giant Unilamellar Vesicles: Visualization By Means Of Confocal Microscopy. J Phys
Chem Lett. 2011; 2:713 –718. doi: 10.1021/jz2000936
221. Chen Y, Chen Y, Xiao D, B ose A, Deng R, Bothun GD. Low -Dose Chemotherapy of
Hepatocellular Carcinoma through Triggered -Release from Bilayer -Decorated
Magnetoliposomes. Colloids Surf B Biointerfaces. 2014 April 1; 116: 452 –458.
doi: 10.1016/j.colsurfb.2014.01.022
222. Chen Y, Bose A, Bothun GD. Controlled Release from Bilayer -Decorated
Magnetoliposomes via Electromagnetic Heating. ACS Nano. 2010; 4:3215 –3221.
doi: 10.1016/j.colsurfb.2014.01.022

67
223. Amstad E, Kohlbrecher J, Muller E, Schweizer T, Textor M, Reimhult E. Triggered
Release from Liposomes through Magnetic Actuation of Iron Oxide Nanoparticle Containing
Membranes. Nano Letters. 2011; 11:1664 –1670. doi: 10.1021/nl2001499
224. Bothun GD, Lelis A, Chen Y, Scully K, Anderson LE, Stoner MA. Multicomponent
folate -targeted magnetoliposomes: design, characterization, and cellular uptake. Nanomed –
Nanotechnol. 2011; 7:797 –805 doi: 10.1016/j.nano.2011.02.007
225. Grillone A , Riva ER , Mondini A , et al. Active Targeting of Sorafenib: Preparation,
Characterization, and In Vitro Testing of Drug -Loaded Magnetic Solid Lipid Nanoparticles.
Adv Healthc Mater. 2015 Aug;4(11):1681 -90. doi: 10.1002/adhm.201570068.
226. Wilhelm SM, Carter C, Tang L, et al. BAY 43 -9006 exhibits broad spectrum oral
antitumor activity and targets the RAF/MEK/ERK pathway and rec eptor tyrosine kinases
involved in tumor progession and angiogenesis. Cancer Res. 2004;64:7099 –7109.
227. Ito A, Fujioka M, Yoshida T, et al. 4 -S-Cysteaminylphenol -loaded magnetite cationic
liposomes for combination therapy of hyperthermia with chemotherapy aga inst malignant
melanoma. Cancer Sci. 2007 Mar;98(3):424 -30. doi: 10.2217/17435889.2.5.649
228. Purushotham S, Chang PE, Rumpel H, et al. Thermoresponsive core -shell magnetic
nanoparticles for combined modalities of cancer therapy. Nanotechnology. 2009 Jul
29;20(30):305101. doi: 10.1088/0957 -4484/20/30/305101
229. Chen J, Zhu S, Tong L, et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles mediated 131I –
hVEGF siRNA in hibits hepatocellular carcinoma tumor growth in nude mice. BMC Cancer.
2014; 14: 114. doi: 10.1186/1471 -2407 -14-114.
230. Trincu NF, Balseanu TA, Ungureanu BS, et al. Blood Clearance of Citric of Citric Acid –
Coated Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles in Rats – a Pilot Study. Current Health
Sciences Journal – in press
231. Antonelli A , Magnani M . Red blood cells as carriers of iron oxide -based contrast agents
for diagnostic applications. J Biomed Nanotechnol. 2014 Sep;10(9):1732 -50.
232. Zhang WY, Li ZS, Jin ZD. Endoscopic ultrasound -guided ethanol ablation therapy for
tumors. World J Gastroenterol . 2013 Jun 14; 19(22):3397 -403
233. Park do H, Choi JH, Oh D, et al. Endoscopic ultrasonography -guided ethanol ablation for
small pancreatic neuroendocrine tumors: results of a pilot study. Clin Endosc . 2015 Mar;
48(2):158 -64.
234. Sharma V, Rana SS, Bhasin DK. Endoscopic ultrasound guided interventional
procedures. World J Gastrointest Endosc . 2015 Jun 10; 7(6):628 -42

68
235. Klapman JB, Chang KJ. Endoscopic ultrasound -guided fine -needle injection. Gastrointest
Endosc Clin N Am . 2005 Jan; 15(1):169 -77
236. Verna EC, Dhar V. Endoscopic ultrasound -guided fine needle injection for cancer
therapy: the evolving role of therapeutic endoscopic ultrasound. Therap Adv Gastroenterol .
2008 Sep; 1(2):103 -9
237. Faigel DO, Lake DF, Land reth TL, Kelman CC, Marler RJ. Endoscopic ultrasonography –
guided portal injection chemotherapy for hepatic metastases Gastrointest Endosc . 2015 Sep 7