Umf Craiova 1.5 [308704]

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE DIN CRAIOVA

FACULTATEA DE MEDICINĂ DENTARĂ

PROGRAM DE STUDIU : MEDICINĂ DENTARĂ

STUDIUL HISTOLOGIC AL FIBRILOGENEZEI ÎN HIPERCREȘTEREA GINGIVALĂ FIBROTICĂ

Coordonator științific

Prof. Univ. Dr. Monica Baniță

Îndrumător științific

Sef Lucr. Dr.Anca Predescu

Absolvent: [anonimizat]

2018

CUPRINS

INTRODUCERE

Hipercreșterea gingivală reprezintă o patologie care se manifestă prin creșterea excesivă a [anonimizat] (hiperplazie).

[anonimizat] (inflamație locală prin prezența plăcii bacteriene, a unor tratamente endoorale inadecvate, a cariilor sau resturilor radiculare) [anonimizat] (ereditatea, dezechilbre hormonale apărute în timpul sarcinii sau în perioada pubertară), sau patologice (leucemia) O [anonimizat] (antihipertensive, antiepileptice, imunosupresoare).

Scopul lucrării este acela de a [anonimizat]. De asemenea, s-a realizat o comparație a două loturi de pacienți: un lot ce prezintă hipercreștere gingivală fibrotică și un alt lot ce prezintă hipercreștere gingivală de cauză inflamatorie.

[anonimizat], care în condiții extreme poate avea repercusiuni asupra sănătății generale a subiecților.

Este important recunoașterea tipului exact de hipercreștere care corespunde unui anumit aspect clinic hipertrofie sau hiperplazie și identificarea cât mai exactă a [anonimizat].

[anonimizat], [anonimizat], diferențiere și funcție sunt nemijlocit implicate în sănătatea parodonțiului.

Studiul histologic și imunohistochimic al acestor fenotipuri celulare și al modului în care ele interacționează este deosebit de important pentru cunoașterea modificărilor microscopice care determină alterările clinic în hipercreșterea gingivală.

CAPITOLUL 1

PARTICULARITĂȚILE HISTOLOGICE ALE ȚESUTURILOR PARODONTALE

Parodonțiul este format din totalitatea țesuturilor care asigură menținerea și susținerea dinților în oasele maxilare: cementul, ligamentele parodontale (periodonțiul), osul alveolar, o parte a mucoasei gingivale.

Parodonțiul prezintă două compartimente: parodonțiul de înveliș (superficial) format din fibromucoasa gingivală și din ligamentele supraalveolare; parodonțiul de susținere (profund) [anonimizat], periodonțiu sau desmodonțiu sau ligamentul parodontal.

[anonimizat]. [anonimizat], pentru care se folosește termenul de parodonțiu apical. Patologia care afectează aceste zone prezintă o etiopatogenie diferită: [anonimizat], [anonimizat]e se află la nivelul mucoasei gingivale și șanțului gingival [Dumitriu H.T., 2009].

1.1 Parodonțiul de inveliș

1.1.1 Fibromucoasa gingivală

Gingia este reprezentată de fibromucoasa gingivală care acoperă osul alveolar, înconjoară coletul dinților, formând șanțul gingival a cărui adâncime normal este de 0,5-3mm, iar interdentar, mucoasă gingivală formează papilele gingivale.

Gingia papilară, papilă interdentară, ocupă spațiul interproximal dintre cei doi dinți vecini,sub punctual de contact, are formă piramidală sau conică, pentru fiecare dinte există două papile interdentare,una vestibulară si alta orală, unite printr-o zonă îngusta, numită col. Poate fi modificată din punct de vedere a formei si volumului prin prezența unei incongruențe dentare cu plus sau cu minus sau in funcție de vârstă.

Gingia liberă, gingia marginală, este porțiunea de gingie care se situează deasupra inserției epiteliale corespunzător peretului gingival având înălțime de 0,5-3mm, inconjoară coletul fiecărui dinte; între ea și smalțul dintelui se găseste un șanț circular,șanțul gingivo-dentar.

Gingia fixă, se atașează la cement și la procesele alveolare; prezintă aspectul caracteristic “in coajă de portocală”, posedă un corion fibros, ce aderă de periostul alveolar. Este delimitat apical de gingia mobilă(pasiv mobilă) prin linia muco-gingivală prezentă pe fața vestibulară la maxilar și mandibular. Sub linia muco-gingivală, mucoasa devine mai lax și mobilă pe planul osos. Înălțimea ei fiind între 1-9mm.

1.1.2 Ligamente supraalveolare

Este format dintr-o rețea de colagen sub formă de fibre, având diferite direcții și funcții:

fibre circulare – mențin conturul și poziția marginii libere a gingiei;

fibre dento-gingivale – asigură susținerea gingivală;

fibre alveolo-gingivale – fixează gingia pe os;

fibre periosteo-gingivale – fixează gingia la periost;

fibre trans-septale – mențin legăturile dinților alăturați, protejează osul interproximal;

fibre trans-gingivale – asigură aliniamentul dinților în arcade;

fibre interpapilare – sprijină gingia interdentară;

fibre intercirculare – stabilizează dinții în arcade;

fibre intergingivale asigura suport și contur pentru gingia fixă.

1.2. Parodonțiu de susținere

1.2.1. Cementul

Este un țesut dur mineralizat, de origine mezenchimală ce acoperă dentina radiculară care începe de la nivelul coletului(joncțiunii smalț-cement) și se continuă până la apex. Acesta are o compoziție chimică și structură aseamanatoare cu țestutul osos prin prezența celulelor propria (cementoblaste și cementocite), localizate în lacune(cementoplaste) dar singura diferență este aceea că cementul este lipsit de canale Havers, invervație și vascularizație.

În timp ce cementul împărtășește proprietăți multiple comune cu osul alveolar și dentină, totuși fiind un țesut unic mineralizat, cementul acelular are un rol major în atașarea dintelui la nivelul ligamentului parodontal inconjurător [Foster B.L., 2012].

În timpul formării cementului celular situate apical, undele cementoblaste devin înglobate în matricea cementoidă și devin cementocite. Dacă în cazul osteocitului știm cu siguranță rolul său în cadrul scheletului, nu putem afirma acest fapt și despre rolul cementocitului în cementul radicular. Chiar și în momentul actual nu este elucidat pe deplin modul de diferențiere, funcția și potențiala cementocitelor [Zhao și colab., 2016].

Compoziția cementului: Cementul este format dintr-o componentă oraganică(35%), o componentă minerală(55%) și apă(10%), compoziție care-l face mai puțin dur decât osul. Cementul este format din fibre de colagen și dintr-o matrice interfibrilară calcificată.

Colagenul cementar conține cantități mari de hidroxiprolină, glicină, alanină și prolină. Există deosebiri între cementul acelular și cementul celular din punct de vedere a compoziției în aminoacizi [Baniță M., 2006].

Clasificarea definește cementul în funcție de:

Momentul formării(primar/secundar).

Prezența sau absența celulelor în matricea depusă (celular si acelular).

Originiea fibrelor de colagen ale matricei (intrinseci – proprii, rezultate prin sinteza cementoblastelor, extrinseci – provenite de la nivelul ligamentului parodontal).

Structura cementului

1.Cementul primar acelular – localizat deasupra dentinei radiculare, în 2/3 superioare ale rădăcinii. Prezintă o dublă origine: sinteza unor fibre de colagen de către cementoblaste; sinteza unui material amorf produs de celule de origine epitelială.

Cementobalstele are ca origine în ectomezenchimul folicului dentar care depozitează primele fibre colagene cât și proteinele necolagene din matrice.

Tipuri de fibre de colagen:

Intrinseci: fibre de colagen tip 1(depuse de cementoblaste).

Ectrinseci: reprezentat de fibre Sharpey care formează cea mai mare parte din structura cementului acelular care are ca rol principal cel de susținere a dintelui. Aceste straturi sunt dispuse neregulat sau paralele cu axul lung al dintelui.

Principala funcție a cementului primar este cea de ancorare, este asigurată de capturșirea fibrelor de colagen proprii de pe o parte a dentinei și de cealaltă parte a ligamentului parodontal.

2.Cementul secundar celular – debutează odată cu intrarea dintelui în ocluzie Acest cement conține atât fibre extrinseci Sharpey, cât și fibre colagene intrinseci, produse de cementoblaste.

Conține fibre colagene intrinseci, localizat în treimea medie, apicală și la nivelul furcației rădăcinilor. La nivelul dentinei nemineralizate sunt depuse pe suprafața externă a acestuia de către cementoblaste care rămân înglobate datorită parcusul mineralizării iar în timp se vor transforma în cementocite care sunt adăpostiți în cavități numite cementoplaste.

Funcțiile principale ale cementului secundar constau în:

Acomodarea dintelui in alveolă ca urmare a necesitații compensarii pierderii lungimii sale totale.

In cazul apariției unor patologii parodontale sau traumatisme la nivelul rădăciniilor să fie prezent materialul reparator.

Funcție de susținere a dintelui este secundară deoarece cementul secundar este absent la nivelul dințiilor monoradiculari [Borda A., 2008].

1.2.2.Ligamentul Parodontal

Desmodonțiul este format din totalitatea structurilor care ocupă spațiul dento-alveolar, spațiul dintre cemetul radicular și compacta internă a osului alveolar (spațiul desmodontal) având origine histologică mezenchimală, din foliculul dentar. Grosimea spațiului parodontal variază de la 0.15-0.40mm iar dimensiunile sunt în funcție de vârstă (larg la adolescenți și tineri iar la vârstnici mai îngust) și starea funcțională a dintelui (erupție și gradul de funcționalitate a dintelui).

Radiologic apare ca o linie de radiotransparență. Este compus dintr-un țesut conjuctiv complex din punct de vedere vascular și slab diferențiat celular, care înconjoară rădăcină dintelui și atașează dintele de osul alveolar.

Celulele predominante sunt reprezentate de fibroblaste, alături de macrofage, celule mezenchimale nediferențiate, osteoclaste, osteoblaste și cementoblaste care din punct de vedere structural intră și la nivelul osului alveolar.

Fibroblastele constituie 50-60% din totalitatea celulelor de la nivelul ligamentului parodontal. Activarea fibroblastelor duce la secretarea unor substanțe precum plasminogen și inhibitorul său, metaloproteazele matricei, citokinele(PGE-2) si interleukina-6 [Nan Jiang și colab.,2016].

Fibrele predominante în ligamentul parodontal sunt fibre colagene de tip I și III cu diametru relativ mic, 55nm și având o orientare reprezentativă grupate în fascicole.

În cantitate redusă se pot găsi fibre de oxitalan și elaunin care intră în grupul fibrelor de tip elastic.

Funcția principală a ligamentului parodontal este cea de susținere a dintelui în alveolă dar putem vorbii și de existența unui alt rol fiind de receptor reprezentați de anumiți stimuli care coordonează mișcările masticatorii.

El constă în principal fascicole contiunue de fibre de colagen, între dinte și osul aveolar. Aceste fibre sunt și denumite și fibre principale ale ligamentului parodontal.

Funcțiile principale al ligamentului parodontal sunt:

Atașamentul dinte la os alveolar.

Ameliorarea presiunilor ocluzale, rol de protejare.

Pozitia funcțională a dintelui si menținerea acestuia.

Prezintă receptori de tip mecanici pentru controlul reflex al ciclilor masticatori si de perceperea senzațiilor tactile.

Participă la formarea osului, a cementului si la resorbția osului.

Fibrele principale ale ligamenului parodontal sunt dispuse in 5 grupuri:

Grupul crestelor alveolare: localizat in regiunea cervicală a dintelui, imediat sub joncțiunea amelo-cementară.

Grupul orizontal: se întind de la cement la osul alveolar, având ca orientare dispusă perpendicular cu axul lung al dintelui.

Grupul oblic: localizat in 1/3 inferioară a rădăcinii, fiind cel mai bine reprezentat.

Grupul apical: sunt repartizate radiar, de la cement la os.

Grupul interradicular: se întalnesc la dinții pluriradiculari; se gasesc in zona de furcație a rădăcinilor având un traiect paralel cu axul dintelui [Onisei D., 2012].

1.2.3. Osul Alveolar

Osul alveolar este conectat la cementul radicular prin intermediul ligamentului periodontal care ancorează rădăcina dintelui la peretele alveolar. Pe de altă parte, osul alveolar este în continuitate cu osul mandibular sau maxilar asigurând o și mai mare soliditate acestei legături. Dezvoltarea osului alveolar începe în momentul în care edificarea coroanei dentare este terminată și începe formarea rădăcinii [Borda A., 2008].

Țesutul osos al structurii oro maxilo facial este alcătuit din țesut conjuctiv specializat ce conține celule și matrice extracelulară mineralizată. La nivelul matricei extracelulare se disting: matricea fibrilară și matricea amorfă (substanță fundamentală).

În matricea organică se evidențiază colagen de tip I și V, dar alte elemente non-colagene: osteocalcina, osteonectina,osteopontina,proteoglicani și sialoproteine osoase. Dintre sărurile minerale cele mai reprezentative sunt cele de calciu și fosfor organizate sub forma cristalelor de hidroxiapatită.

Osul alveolar prezintă 2 componente din punct de vedere histologic: os fascicular si os lamelar.

Osul fascicular: reprezintă porțiunea cea mai internă a peretului alveolei dentare. Acesta prezintă numeroase foramene cu rol în conducerea vasculară și nervoasă, fiind numit și lamina cribla; prezentând la examinarea radiologică o opacitate crescută este numit lamina dura. Prezența fibrelor Sharpey, formate din colagen tip I ce pătrund în osul alveolei dentare, fibrele de colagen se evidențiază prin faptul că sunt voluminoase și se întrepătrund într-o împletitură. Pe lângă fibrele de colagen de tip I se pot observa la periferia fibrelor Sharpey colagen de tip III.

Osul de suport, situat la exterior față de peretele alveolei, formează corpul procesului alveolar. Este alcătuit din: os trabecular sau spongios și corticala externă. La nivelul acestui os celulele și matricea extracelulară formează lamele, respectiv trabecule de țesut osos. Lamelele de țesut osos se pot regăsi sub 3 tipuri de forme:

1.Lamele cu dispoziție circumferențială.

2.Lamele concentrice formând sistemele Havers, structurile caracteristice osului compact.

3.Lamele osoase interstițiale, formând arcuri incomplete de cerc care umplu spațiul dintre sistemele Havers complete.

Celulele osoase reprezentate de 2 categorii majore de populații celulare: celule osteogenice (cu rol în formarea țesutului osos) și osteoclastele(cu rol în resorbția țesutului osos).

Celulele osteogenice sunt reprezentate de celulele osteoprogenitoare: preosteoblaste, osteoblaste, osteocite și celulele bordante.

Din punct de vedere morfologic, osteoblastele prezintă o formă poliedrică având nucleul cu dispunere central, rotund cu 1,2 nucleoli, citoplasmă este intens bazofilă și prezintă numeroase granule de PAS positive, iar la nivelul membranei celulare prezintă cantități importante de fosfataze alcaline.

Printre principalele funcții ale osteoblastelor:

Creșterea si remodelarea osoasă

Sinteza de proteine colagene și non-colagene

Prezintă capacitate mare de regenerare

Secretă o serie de factori de crestere și citokine: TGF beta, BMP,FGF,FDGF

Prin intermediul enzimelor hidrolice participă alaturi de celulele bordante la degradarea matricei.

Osteocitele, celulele mature ale osului, au formă ovalară, nucleu rotund cu un nucleol și citoplasmă bazofilă. Principalele funcții ale osteocitelor:

Rol de a transmite forțe aplicate pe os, mecanotransductori.

Responsabile de menținerea viabilității matricei osoase

Osteoclastele sunt celule multinucleate cu dimensiuni mari și se recunosc cu ușurință cu ajutorul colorațiilor histologice uzuale. Ele sunt cuprinse în lacunele HOWSHIP iar în microscopia electronică au ca și element individual “margine în perie”.

Funcțiile osteoclastelor sunt:

Resorb si remodelează țesutul osos prin eliberarea de protoni.

Resorbția si remodelarea de țesut osos are activitate maximă in perioadele de osteogeneză [Baniță M., 2006].

CAPITOLUL 2

HISTOLOGIA SI HISTOFIZIOLOGIA MUCOASEI GINGIVALE

Mucoasa gingivală reprezintă porțiunea de mucoasă orală care acoperă osul alveolar și dinții din regiunea cervicală. Impreună cu ligamentele gingivale formează parodonțiul de înveliș. Termenii “normal clinic” sau “clinic sănătos” sunt utilizați pentru a desemna țesutul gingival caracterizat prin următoarele aspecte:

Nuanța de roz pal sau coral variabile în raport cu rasa și pigmentația. Factorii care influențează culoarea sunt aportul vascular, grosimea epiteliului și gradul de keratinizare.

Aspect de lamă de cuțit, gingia se adaptează strâns în jurul dintelui.

Fermitatea și minima adâncime a șanțului gingival cu nici o sângerare atunci când este sondat.

Raportându-ne la aspecte legate de coloristica mucoasei gingivale, se poate evidenția o situație de gingie roz în cazul femeilor și o nuanță de roz mai închis sau roșiatică în cazul bărbaților [Lăzărescu F., 2013].

2.1. Epiteliul Gingival

Din punct de vedere microscopic gingia este format dintr-un țesut conjuctiv, constituent al corionului gingival, acoperit dintr-un epiteliu pavimentos pluristratificat.

Epiteliul gingival este alcătuit din:

1. Epiteliul oral sau extern;

2. Epiteliul șanțului gingival, epiteliul sulcular sau intern;

3. Epiteliul joncțional.

1. Epiteliul oral sau extern

Este zona de epiteliu situat în continuarea epiteliului sulcular spre cavitatea bucală și se întinde de la creasta mărginii gingivale libere și gingiei fixe pe care le acoperă, până la joncțiunea muco-gingivala. În epiteliul oral, majoritatea celulelor sunt keratinocite, cu funcția de formare a kertatinei. Această activitate începe din stratul bazal prin apariția în citoplasmă a celulelor a unor structuri filamentoase: tonofilamentele cunoscute ca și citokeratine, precursori ai keratinei.

Alături de keratontinocite în epiteliul oral mai sunt melanocite, celule cu prelungiri dendritice care produc un pigment protector față de radiația actinică, și celule LANGERHANS cu funcție de apărare față de agresiunea microbiană. Epiteliul oral este format din mai multe straturi:

Stratul bazal;

Stratul spinos;

Stratul granulos;

Stratul cornos.

Stratul bazal: este format din 1-2 rânduri de celule așezate “in palisadă” care au formă cuboidală sau ușor prismatică. Așezarea acestui strat este cel mai profund care se află deasupra membranei bazale. Celulele din stratul bazal evoluează până la suprafață, având transformări structurale corespunzătoare, într-un interval de timp numit turnover care durează două săptămâni pentru epiteliul oral și o săptămâna doar pentru epiteliul joncțional.

Celulele stratului bazal au un nucleu ovalar si prin prezenta numeroaselor organite, acesta are o activitate metabolică intensă.

Stratul spinos: se află deasupra stratului bazal care este format din 7-8 rânduri de celule poliedrice la care între aceste celule se află spații intracelulare vizibile prin care circulă lichidul hranitor venit din corion. Acesta are cea mai mare grosime si prezintă o activitate mare de prekeratinizare. Celulele din stratul spinos sunt legate între ele prin desmozomi. Forma nucleului este sferică situat central. Celulele stratului spinos impreună cu celulele din stratul bazal formează o zona germinativă.

Stratul granulos: sunt mai puțin prezente ca și grosime față de stratul spinos prin prezența de granule de keratohialină (precursor al keratinei) care participă la formarea filamentelor de keratină.

Stratul cornos: este alcătuit din celule aplatizate, turtite având forma romboidală, fără nuclee și organite citoplasmatice. Intreg spațiul celular este predominat de keratină. S-a obervat că celulele Langerhans nu posedă nici desmosomi, nici tonofibrili, iar forma sa dendritică sugerează că poate fi legată de un monocit. Prin numeroase studii s-a observat că aceste celulele poate conține granule asemănătoare melaninei sau pot reprezenta pierderea capacității de a sintetiza melanina si intră intr-o fază de dezvolatare diferită și terminală [Waterhouse J.P., Squier C.A., 1997].

Între celulele epiteliale se mai pot găsi si celule migratorii precum:

Melanocite: asigură secreția melaninei care conferă pigmentarea mucoasei.

Celulele sanguine: limfocite T si granulocite: cu rol in apărarea imunitară.

Celulele Langherhans: având rol in apărarea specifică și nespecifică a mucoasei.

Celule Merkel: rol in funcția senzorială de tip tactil, izolate sau intrând în alcătuirea corpusculilor Merkel.

2. Epiteliul șanțului gingival, epiteliul sulcular sau intern

Este un epiteliu stratificat fără keratinizare care acoperă peretele moale al șanțului gingival. Datorită keratinizarii scăzute, aceasta favorizează apariția microulcerațiilor și microeroziuni apoi poate să ducă la sângerarea acestuia. Șantul gingival este spațial situat între suprafața dintelui si epiteliul care captușește marginea gingivală pe fața ei internă de la creastă până la epiteliul joncțional.

Adâncimea normală a șantului gingival este între 0,5-3mm. Lichidul sulcular sau lichidul șantului gingival prezintă celule sanguine de apărare (PMN) si anticorpi (imunoglobuline) ,fosfataze,mucus,lizozimi si electroliți. Rolul principal al acestuia este cea de spălare cu activitate antimicrobiană și antimicotică participând la imunitatea specifică și chiar nespecifică. Lichidul sulcular este un exudat inflamator de apărare.

3.Epiteliul joncțional

Reprezintă principala structură a joncțiunii dento-gingivale. Aceasta se extinde în direcție apicală de la nivelul porțiunii celei mai declive a șanțului gingival și formează un manșon în jurul dintelui fiind localizat nu numai pe smalț dar și la nivelulul cementului.

Grosimea epiteliului joncțional în plan transversal la vârstă adultă este de 10-20 de straturi iar pe măsură ce se extinde către apical, epiteliul joncțional se reduce din grosime ajungând la 3-4 straturi. Înălțimea epiteliul joncțional în plan vertical ajunge între 0.25-1.35mm.[Dumitriu H.T., 2009].

Epiteliul joncțional, fiind nekeratinizat, este singura componentă a epiteliului gingival care prezintă două lamine bazale, câte un pe fiecare față:

Lamina bazală externă – se conectează cu țesutul conjuctiv subiacent.

Lamina bazala internă – se conectează direct cu suprafața dintelui.

Joncțiunea propriu-zisă dintre epiteliu și smalț/cement se realizează prin intermediul hemidesmozomilor care formează o placă de atașare continuă, în plus cuprinde o foiță internă mai ingroșată a membrane plasmatice si placile de ancoraj sunt constitutite dintr-un material fibrilar și granular citoplasmatic.

Aceasta particularitate este o adaptare la condiția de aderență față de suprafața dintelui. Tot în această regiune se găsesc fibre supracrestale și ligamentul circular (coronar) care conferă fermitatea țesutului [Șurlin P., 2011].

2.2. Membrana Bazală

Se află între epiteliul gingival și țesutul conjuctiv subiacent. Deci la interfața epiteliu-lamina propria. Acestă structură acelulară este formată din proteine fibrilare înglobate într-un substrat polizaharidic iar la microscopul electronic apare formată din două lamine:

Lamina lucida (rara internă) – situată sub membrana bazală a celulelor epiteliale iar conexiunea dintre lamina lucida și celulele epiteliale este asigurată de hemidesmozomilor și tonofilamentele.

Lamina densa – situată sub lamina lucida fiind atașată de epiteliu prin filament de ancoraj.

Lamina rara externă sau lamina fibroreticularis , deasupra laminei propria.

2.3. Corionul Gingival

La nivelul corionului gingival, țesut conjunctiv dens semiordonat, este alcătuit din elemente celulare și matricea intercelulară, cu fibre colagene, elemente vasculare și limfatice și nervi.

Din varietățile de populații celulare fixe, autohtone, și mobile, venite din sânge și ajunse prin diapedeză în țesutul conjunctiv, fibroblastele sunt cele mai numeroase, puntând fi prezente în stare liberă sau interfibrilar. Corionul este un țesut conjuctiv, numit și lamina propria, prezintă două zone: corion superficial, sau papilar, care este situat spre epiteliu și corion profund situat sub corionul superficial, spre straturile adicente. Deoarece acesta din urmă se inseră prin fibre de colagen (fibre Sharpey) în osul maxilar , mucoasa gingivală mai este denumită și mucoperiost. Datorită bogăției mari de fibre colagene este denumită și fibromucoasă gingivală, pentru a o deosebi de mucoasa de cătușire alveolară.

Corionul gingival conține:

Substanță fundamentală: conține o matrice organică în care sunt prezente componente macromoleculare cum ar fi proteoglicani și glicoproteine. Colagenul este foarte bine reprezentat și sub formă de colagen nefibrilar.

Fibrele conjunctive : de colagen, fibre de reticulină (colagen I) fibre elastice,fibre de oxitalan.

Celule: fibroblastele și elemente figurate ale sângelui atât linia eritrocitară cât și linia leucocitară: monocite,plasmocite,PMN, osteoblasti limfocite T și B.

Fibroblastul este cea mai răspândită celulă conjunctivă prin care produce fibre conjunctive și substanță fundamentală. În perioada embrionară fibroblastul are origine în celulă mezenchimală.

Funcțiile fibroblastelor:

Participă la sinteza mai multor tipuri de fibre de colagen și a fibrelor de reticulină și oxitalan.

Participă la producerea proteoglicanilor,glicoproteinelor și principalul său rol de a proteja și de a menține integritatea corionului gingival.

Rol activ in resorbția si remodelarea tramei fibrilare de colagen [Mogoantă L., 1998].

Aspecte fibroblastelor:

Sunt dispuse de-a lungul fibrelor de colagen.

Sunt celule alungite sau stelate.

Au rol important în reînoirea colagenului și sinteza elementelor de structură a substanței fundamentale [Crăițoiu Ș.,Crăițoiu M., 1995].

2.4. Funcțiile Mucoasei Orale

Funcția de protecție: Datorită depozitelor bogate de keratină din care este alcătuit epiteliul mucoasei gingivale, principalul rol pe care îl îndeplinește epiteliul este de protecție a structurilor subjacente.

Funcția de recepție senzorială: Prin receptorii pe care-i conține pentru sensibilitatea tactilă, termică și dureroasă, mucoasa gingivala contribuie pe de o parte la apărarea oraganismului împotrivă pătrunderii unor substanțe nocive informând sistemul nervos central asupra calităților fizice și chimice ale alimentelor introduse în gură și inițiază alături de celelalte structuri din cavitatea orală reflexe de înghițire, salivație, masticație.

Funcția de absorbție: În cantitate mică la nivelul gingival se elimină-excretă, atât prin canalele glandelor salivare cât și prin intermediul celulelor fagocitare unele substanțe nocive pătrunse în organism sau rezultate din procesele metabolice tisulare (uree,acid uric).

În gingie au fost identificate anumite enzime (fosfatază alcalină și fosfatază acidă, glucozo-6-fosfat-dehidrogenă, lactate-dehidrogenază) cu rol în procesele metabolice, în inflamație, în vindecare și cicatrizare [Surpățeanu M., 2013].

CAPITOLUL 3

HIPERCREȘTEREA GINGIVALĂ

3.1. Definirea conceptului de hipercreștere gingivală

Hipercreșterea gingivală se definește clinic drept îngroșarea sau creșterea în volum a țesuturilor moi care acoperă crestele alveolare cu mai mult de 1mm. Gradul de hipercreștere gingivală este variabil: poate fi într-un stadiu incipient când se remarcă limitarea sa la nivelul papilei interdentare sau poate avansa ducând la acoperirea întregii porțiuni coronare ale dintelui.

Extensia sau creșterea excesivă a gingiei este terminologia acceptată pentru marirea gingiei ca volum si acesta reprezintă cel mai important aspect pentru a diagnostica boala gingivală [Drăghici si colab., 2016].

Etiologia hipercreșterii gingivale

Etiologia hipercreșterii gingivale nu este cunoscută în totalitate, aceasta se poate corela atât cu factori de ordin local, precum procesele carioase, prezența plăcii bacteriene și a tartrului, cât și cu factori sistemici: susceptibilitatea organismului, diverse patologii sistemice. De asemenea, un alt factor de importanță majoră este reprezentat de modul de acțiune al unor medicamente și de produși metabolici [Cekmez și colab., 2009].

Clasificarea hipercreșterii gingivale

Hipercreșterea gingivală detectabilă clinic se clasifică în raport cu factorul etiologic și cu modificările patologice pe care le determină:

Hipercreștere gingivală reactivă –produsă de existența plăcii bacteriene, sau hiperplazie inflamatorie, denumită și epulidă. În general, epulidele sunt leziuni sesile sau pedunculate ale gingiei, termenul fiind clinico-topografic, fără o descriere histologică a leziunii, de aceea este preferat termenul de leziune reactivă a gingiei.

Hipercreșterea gingivală determinată de iritații cronice locale–resturi radiculare, carii, defecte de protezare.

Hipercreșterea gingivală indusă de tratamentul- cu unele medicamente cum ar fi: anticonvulsivante de tipul fenitoinei, imunosupresoare – ciclosporina A, antihipertensive blocante ale canalelor de calciu – nifedipina; mai este denumită și hiperplazie gingivală fibrotică.

Hipercreșterea gingivală determinată de afectiuni sistemice – diabet zaharat, leucemii.

Hipercreșterea gingivală congenital – epulisul sau tumora Neumann.

Hipercreșterea gingivală determinată de dezechilibrare hormonală – aparuta la pubertate, sarcină.

Fibromatoza gingivală – denumită fantiazis gingival,sau fibromatoză gingivală idiopatică, hiperplazie gingivală ereditară, leziune gingivală, non placă bacteriană, gigantism gingival, sau doar gingie hipertrofică [Barros și colab., 2001].

3.3.1. Hipercreșterea gingivală produsă de factori iritativi cronice locale

Reprezintă varietatea cea mai frecventă a hipercreșterii gingivale și poate îmbrăca numeroase forme: prezența plăcii bacteriene cronice și a tartrului, procese carioase, protezarea incorectă a structurilor dentare. Educarea pacientului în ceea ce privește igiena orală corespunzătoare este obligatorie pentru a elimina factorii ce produc iritația sau cel puțin pentru a stopa din evoluție procesul patologic. Pacientul trebuie informat despre metoda corectă de periaj dentar, în cazul gingivitelor fiind indicate metoda Clinicii de Parodontologie a UMF Carol Davila, București [Șurlin P., 2011].

Aceasta presupune că periajul să se realizeze în mod separat al arcadei dentare maxilare și al cei mandibulare exercitând mișcări în plan vertical, iar periajul suprafețelor palatine și linguale se realizează într-o singură direcție: dinspre gingie spre dinte.

De asemenea, utilizarea mijloacelor chimice de îndepărtare a plăcii bacteriene și de prevenire a formării tartrului joacă un rol deosebit, cele mai cunoscute antiseptice fiind clorhexidină cu un spectru antimicrobian extrem de larg ce poate ajunge până la 12 săptămâni și eliminarea microorganismelor de tipul: candida albicans și E. fecalis.[Iliescu A., 2014].

Un alt antiseptic local eficient este reprezentat de listerina fiind o apa de gură fără efecte secundare și care îndepărtează 20-22% din placă bacteriană.

Apariția inflamațiilor la nivelul mucoasei gingivale poate fi provocată și de anomaliile dento-maxilare precum:

Incongruență dento-alveolară prin înghesuire ce îngreunează procesul de curățire, dar și de autocurățire, ducând totodată la retenția resturilor alimentare și la apariția cariilor. În acest caz se poate observa troficitate redusă a septurilor și papilelor interdentare.

Incongruență dento-alveolară prin spațiere duce la apatizarea papilelor interdentare.

Dinții supranumerari ca și aspect clinic se remarcă un parodonțiu subțire, cu troficitate scăzută, fiind predispus la atacurile microorganismelor.

Compresia de maxilar duce la apariția hipertrofiei gingivale din cauza suprasolicitării zonei laterale, iar în zonă frontala apare retracția gingivală.

Ocluzia adâncă acoperită lezarea în mod direct a parodonțiului marginal de la nivelul feței palatinale a dinților frontali superiori.

Distrofiile dentare din cauza rugozităților și a anfractoșităților se acumulează într-un timp scurt resturi alimentare și placă bacteriană.

Ocluzia deschisă produce atrofia parodonțiului în zonele nefuncționale [Șurlin P., 2011].

În ceea ce privește factorii iatrogeni ce duc la afecțiuni ale mucoasei gingivale se pot clasifica în:

1.Factori de cauză odontală: obturații coronare de colet și aproximale incorect executate; obturații înalte la nivelul suprafețelor ocluzale; manipularea incorectă a instrumentrului de realizarea a cavității coronare ce duce la leziuni directe ale mucoasei gingivale; traumatizarea parodonțiului prin utilizarea unor matrici sau pene interdentare de dimensiuni necorespunzătoare; introducerea de pansamente arsenicale în cavități aproximale sau de colet.

2.Factori de ordin protetic: lucrări protetice incorect realizate cu margini prea lungi; șlefuirea în mod intempestiv la nivel subgingival.

3.Factori de cauză ortodontică: aparate ortodontice ce produc lezarea directă a parodonțiului marginal sau prezența un forțe ortodontice prea mari.

4.Factori de cauză chirurgicală: lezarea dinților vecini în cadrul manoperelor de extracție dentară sau de îndepărtare a dinților incluși.

Nu trebuie neglijate nici obiceiurile vicioase precum fumatul care duce la inflamație parodontală prin depunerea de nicotină ce formează o peliculă pe care placă bacteriană aderă cu ușurință. Nicotină are efecte nocive și asupra vaselor de sânge de la nivelul cavității orale, dar și asupra procesului metabolic local. Un alt obicei vicios este reprezentat de respirația orală ce produce xerostomie, dar și compresie de maxilar [Șurlin P., 2011].

Aceasta trebuie corectată apelând la medici de specialitate ORL pentru a investiga presupuse cauze: deviația de sept nazal, obstrucția nazală produsă prin vegetații adenoide, corpi străini nazali, tumori benigne/maligne ale rinofaringelui [Dumitriu H.T., 2009].

Hipercreșterea gingivală poate fi indusă și de administrarea unor medicații

Medicații precum: ciclosporina A, care deterimină creșterea secrețitei de glicozaminoglicani de către fibroblaste, nifedipina si fenitoina cresc nivelul heparinei, beta-blocante de calciu, verapamil, tratament cu citostatice și mai nou și de contraceptivele administrare pe cale orală. Aceasta se caracterizează prin o acumulare de matrice extracelulară în țesutul conjunctiv gingival, în special componenta colagenă, cu grade diferite de inflamație cronică. Stabilirea cu exactitate a ratei de prevalență în ceea ce privește determinarea hipercreșterii gingivale produsă de medicamente este greu de precizat, iar indicii inflamației gingivale nu ne pot conferi date concrete [Masatoshi K., 2005].

Aceste modificari pot fi determinate de catre gradul de inflamație gingivală pentru ca datorită producției de citokine inflamatorii este stimulată proliferarea fibroblastelor gingivale. În cazul hiperplaziei gingivale induse de medicamente, aceasta se prezintă într-o primă fază ca fiind o hiperplazie minimă, apoi apare o hiperplazie a papilei interdentare ce se extinde spre marginile gingivale orale și vestibulare. Hiperplazia afectează în primul rând regiunile anterioare ale maxilarului și mandibulei, determinând tulburări fizionomice, dar poate interfera și cu vorbirea, erupția dentară sau masticația. În cazul prezent există două soluții radicale: fie întreruperea administrării medicației, fie înlocuirea acesteia cu acțiune similară și eficientă.

În ceea ce privește epulisul trebuie precizat că este o tumoră beningnă fiind prezența sub șase forme:

Granulomatos – alcătuit mai mult din țesut conjunctiv. Predomină celulele tinere. Clinic are culoare roșie, suprafața neregulată, consistență moale și sângerează la atingere.

Teleangiectatic – seamănă cu primul tip, dar predomină vasele de sânge în structură sa. Clinic are culoare violacee, consistență moale, tendință la sângerări spontane, dar și la atingere.

Fibros – are aceleași aspecte clinice ca și primul tip, prezintă celule de tip matur, fără tendință de sângerare.

Osteogen – prezintă lamele osoase în interior, seamănă cu tipul fibros, dar consistența este mai fermă și radiologic se văd semnele osoase distinctive.

Epulis cu celule gigante – este acoperit de un strat care poate prezenta leziuni de tip ulcerație, culoarea este roșie – violacee, și suprafața neregulată. Uneori prezintă mai mulți lobi, sângerează ușor și poate ajunge de dimensiuni mari.

Mixomatos – pe fondul unui țesut bogat în vase. Are culoare violacee, consistență gelatinoasă și tendința să invadeze osul. Extrem de rar se transformă malign [Florescu și colab., 2005].

3.3.3. Hipercreșterea gingivală determinată de dezechilibrare hormonală

Anumite persoane de sex feminin acuză periodic – lunar de un episod de gingivită cu una sau două zile înainte de începerea ciclului menstrual. În afară de inflamarea și sângerarea gingiilor, simptomele pot include și inflamarea glandelor salivare ,afte. Contraceptivele orale ce conțin progesteron pot avea un efect similar asupra gingiilor. Progesteronul în cantități crescute determină creșterea sensibilității la nivel gingival și predispune pacienta la sângerări în cantități reduse spre medii. Schimbările puternice prin care trece organismul în timpul sarcinii pot provoca probleme dentare oricând între luna a doua și a opta. Gingivita de sarcină cauzată de fluctuațiile hormonale poate fi prevenită doar printr-o curățare mai atentă a dinților și igienizare profesională efectuată în cabinetul dentar. La menopauză, simptomele orale ce apăr pe fondul fluctuațiilor hormonale pot include următoarele simptome: xerostomie, senzații dureroase, senzații de arsuri la nivelul mucoasei bucale alături de schimbări în senzația gustativă. Menopauza este asociată și cu scăderea densității osoase, iar atunci când maxilarul are o densitate scăzută, riscul pierderii dinților este mai mare.

3.3.4. Hipercreșterea gingivală provocată de boli sistemice

Precum diabetul zaharat, dar și leucemiile. În cazul leucemiilor, studiile din literatură de specialitate ne-au arătat că prin examinarea histopatologică a fragmentelor de mucoasă orală în colorația hematoxilină-eozină, se poate observa prezența în număr extrem de mare a leucocitelor polimorfonucleare bazofile și eozinofile, a leucocitelor imature, dar și acumularea unor infiltrate celulare nespecifice. La nivelul cavității orale, unul dintre semnele particulare și de o mare importanță în diagnosticarea leucemiei este reprezentat de purpură trombocitopenică ce se poate situa adesea pe palatul dur. Alte manifestări pot fi: gingivoragiile masive, hipercreșterile gingivale, necroze și ulcerații gingivale, eroziuni ale buzelor, candidoză orală. Aceste leziuni orale pot fi diminuate sau stopate prin respectarea protocolului de îngrijire a bolnavului cu leucemie în cabinetul dentar. Protocolul prevede: orice manevră stomatologică se efectuează numai cu acordul medicului hematolog, educația sanitară a pacientului în vederea menținerii igienei orale corespunzătoare, igienizarea zonei cu ajutorul soluțiilor antiseptie de tip clorehexidină 0,12%, utilizarea substanțelor hemostatice în caz de ulcerații gingivale și evitarea periajului gingival [De Angelo și colab., 2007].

Hipercreșterea gingivală determină de modificări genetice

Fibromatoza gingivală reprezintă o afecțiune din sfera oro-maxilo-facială cu o frecvență destul de redusă ce se caracterizează prin caracterul benign, supraaglomerare celulară la nivelul țesutului gingival, absența ulcerației. Fibromatoza gingivală poate îmbrăca două forme: izolată sau parte componentă a unui sindrom. În ceea ce privește aspectul clinic, această afecțiune se prezintă ca fiind o gingie fibroasă, de culoare roz care are tendința de a acoperi întreaga coroană a dintelui. Există și situații în care fibromatoza gingivală împiedică erupția și dezvoltarea normală pe arcadă a structurii dentare afectate. O incidență crescută a fibromatozei gingivale s-a observat în perioada de tranziție de la dentiția temporară la cea permanentă. Tratamentul ideal este reprezentat de gingivectomie ce se poate practica atât prin metodă classica chirurgicală, cât și prin metoda chirurgicală minim invazivă realizată cu ajutorul laserului stomatologic dioda. S-a observat prezența fibromatozei gingivale cu precădere la dinții definitivi, fiind mai rare cazurile în care a afectat dinții temporari. O dată cu instalarea stimulului care declanșează patologia are loc creșterea nivelului de TGF beta 1. Creșterea factorului TGF atrage după sine creșterea proliferării fibroblastelor. În consecință, se produce un dezechilibru între procesul de sinteză și cel de degradare al moleculelor matricei extracelulare [Pedro și colab., 2017]. Multe procese fibrotice sunt asociate cu un nivel crescut de factor de creștere transformator TGF beta 1, crește nivelul de proteine de la nivelul matricei si pot sporii secreția inhibitorilor de protează, rezultând acumularea de matrice [Chen si colab., 2018].

CAPITOLUL 4

MATERIAL SI METODE

4.1. MATERIALUL STUDIAT

În prezentul studiu au fost utilizate mucoase gingivale de la subiecți diagnosticați cu hipercreștere gingivală, obținute în urma gingivectomiei terapeutice în cadrul Clinicii OMF a Spitalului Clinic de Urgență Craiova.

Pacienții au avut vârsta cuprinsă între 10-29 ani, 5- bărbați și 3 femei. Diagnosticul de hipercreștere gingivală fibromatoasă gingivală a fost stabilit în urma anamnezei și a examenului clinic, conform următoarelor criterii de includere/excludere :

– lotul I – hipercreștere gingivală fibrotică – 5 cazuri:

– 2 subiecți care au prezentat istoric familial de hipercreștere gingivală, cu lipsa oricărui alt simptom clinic sistemic asociat care să permită includerea în lotul fibromatozei gingivale sindromice.

– 3 pacienți prezentând hipercreșterea gingivală fibrotică în urma administrării unor medicamente – fenitoină.

– lotul II – hipercreștere gingivală inflamatorie – 7 cazuri – pacienții au prezentat creșteri de volum ale mucoasei gingivale datorită unor cauze locale – igienă orală deficitară, carii netratate, resturi radiculare.

Examinarea clinică a gingiilor a relevat hipercreștere gingivală localizată, nodulară, formată din una sau mai multe leziuni sau generalizată simetrică pe ambele arcade. Culoarea gingiei a fost roz-pal, consistența fermă, nesângerândă, nedureroasă, cu grade variabile de acumulare a plăcii bacteriene, în cazul pacienților din lotul I.

Placa dentară a fost remarcată la 3 dintre cazuri, dar nu de intensitatea care să justifice hipercreșterea gingivală.

În cazul examenului lotului al II-lea s-a constatat o creștere a dimensiunii gingiei la nivelul unui/mai multor dinți, cu gingie nedureroasă, moale, sângerândă.

Radiografia panoramică a arătat grade variabile de periodontită cu pierderea substanței osoase în trei cazuri.

În toate cazurile a fost efectuat un examen clinic complet de rutină precum și examene paraclinice (hemoleucogramă completă, glicemie, examen de urină) care să excludă patologii asociate care pot interfera cu manifestările gingivale.

4.2. METODELE UTILIZATE

Prelucrarea histologică s-a făcut în cadrul laboratorului de Histologie al UMF Craiova.

Probele de țesut gingival au fost spălate cu ser fiziologic și introduse în fixator. S-au urmat timpii de includere în parafină conform tehnicii histologice clasice. Blocurile obținute au fost secționate la microtom, iar secțiunile seriate au fost utilizate după deparafinare fie pentru efectuarea colorațiilor histologice de rutină fie pentru efectuarea de reacții imunohistochimice.

A. Includerea în parafină

Includerea în parafină permite efectuarea unor secțiuni seriate de 3-5µ grosime, fiind cea mai utilizată tehnică în laboratoarele de histologie și histopatologie.

Tehnica histologică de includere la parafină a comportat următorii timpi:

Fixarea;

deshidratarea;

clarificarea;

parafinarea;

includerea propriu-zisă;

secționarea blocului;

lipirea secțiunilor pe lame și uscarea lor;

colorarea secțiunilor;

uscarea și depozitarea materialului histologic.

a. Fixarea

Toate piesele histologice recoltate au fost fixate imediat în soluție de formol 10%. Această fixare este indispensabilă pentru studiul morfologic și trebuie respectat raportul de 30:1 dintre volumul fixatorului și volumul piesei.Soluția de formol 10% a fost preparată din soluție apoasă de aldehidă formică 40% și apă distilată în raport de 1:9, folosindu-se pentru neutralizarea acidului formic care se formează bicarbonat de calciu.

După fixare piesele au fost spălate cu apă de la robinet timp de 12 ore.

b. Deshidratarea

Eliminarea apei din piesele fixate și apoi spălate sub jet de apă trebuie făcută cu foarte mare exigență, aproximativ 8-12 ore, deoarece apa nu este miscibilă cu mediul de includere, parafina. Reactivul cel mai utilizat pentru deshidratare care a fost folosit este alcoolul etilic. Pentru deshidratare au fost necesare mai multe băi de alcool de concentrații diferite, piesele fiind trecute prin alcool etilic de concentrații crescânde până la alcool absolut. Durata deshidratării este, în general, variabilă în funcție de mărimea piesei și de natura fixatorului.

O deshidratare incompletă va avea drept urmare o impregnare insuficientă cu parafină, care la rândul ei va cauza grave dificultăți la secționare. Dimpotrivă, prelungirea fixării peste durata necesară deshidratării va cauza o întărire exagerată a pieselor, secționarea lor devenind dificilă.

În practica laboratorului nostru se folosește o baterie de soluții de alcool etilic preparate proaspăt, după următoarea schemă:

– alcool etilic 800………………………………………………………….3 ore;

– alcool etilic 900………………………………………………………….3 ore;

– alcool etilic 960 I………………………………………………………..3 ore;

– alcool etilic 960 II……………………………………………………….4 ore;

– alcool etilic absolut I……………………………………………………3 ore;

– alcool etilic absolut II…………………………………………………..4 ore;

– alcool etilic absolut III………………………………………………….5 ore.

Pentru a preveni evaporarea și hidratarea alcoolului, deshidratarea se face în borcane de sticlă cu dop rodat.

Aceste borcane trebuie să aibă o capacitate suficient de mare pentru a permite ca volumul reactivului deshidratant să fie de 30-35 de ori mai mare decât volumul pieselor.

La trecerea dintr-o baterie în alta pieselor li se elimină excesul de lichid pe o hârtie de filtru, pentru a nu impurifica băile următoare.

Trecerea pieselor prin soluțiile de alcool cu concentrație crescândă a realizat înlocuirea cu alcool absolut a apei din țesuturi.

c. Clarificarea

Aceasta este operația prin care se elimină din structura piesei histologice alcoolul folosit la operația precedentă.Din cauză că hidrocarburile benzenice fac ca piesele din anumite țesuturi sau organe să devină translucide, toți reactivii folosiți în acest scop sunt cuprinși sub denumirea de clarificatori, iar timpul respectiv al includerii în parafină se numește clarificare.

Deshidratarea se face cu reactivi nemiscibili cu parafina – alcool etilic sau alcool metilic. Eliminarea completă a alcoolului din țesuturi se face prin intermediul unui reactiv miscibil cu parafina.

Dintre cele trei hidrocarburi aromatice utilizate în mod curent în laboratoarele de histologie și histopatologie pentru realizarea clarificării – benzenul (benzolul), xilenul (xilolul) și toluenul (toluolul) – xilenul este cel mai utilizat, deoarece întărește mai puțin țesuturile și, fiind mai volatil, se elimină rapid în timpul cât piesele se află în termostatul pentru parafină.

Clarificarea s-a realizat la temperatura laboratorului, în recipiente de sticlă înguste și înalte, prevăzute cu dop rodat sau capac etanș. Cantitatea de lichid clarificator dintr-o baie a fost de aproximativ 20 de ori mai mare decât volumul pieselor.

Durata clarificării cu xilen variază în funcție de natura și de grosimea pieselor. Pentru unele țesuturi durata este ușor de apreciat pentru că, pe măsură ce sunt impregnate cu xilen piesele devin transparente. Din acest moment este suficient încă o scurtă baie (de 15 minute) cu xilen proaspăt, după care piesele pot fi trecute în parafină.

Durata clarificării trebuie corect apreciată deoarece depășirea limitei optice duce întotdeauna la întărirea pieselor care devin dificil de secționat.

S-a utilizat următoarea schemă de clarificare:

xilen I ……………………………………………………75 min.

xilen II …………………………………………………..75 min.

xilen III ………………………………………………….30 min.

d. Parafinarea

● Impregnarea cu parafină

Parafina histologică este ușor de secționat și prelucrat și permite obținerea unor secțiuni histologice foarte subțiri și ușor de prelucrat în continuare.

Pătrunderea până în cele mai mici interstiții cu parafina topită și solidificarea în bloc, prin răcire, are menirea să confere pieselor consistență omogenă, fără de care obținerea unor secțiuni plane și subțiri nu este posibilă.

Parafinarea se efectuează la cald, la termostatul pentru parafină, la o temperatură de 560C. Pentru cele trei băi în care se face parafinarea se utilizează recipiente joase (2-3 cm), cu un diametru mare, din sticlă sau porțelan, fără capac.

Se folosesc trei băi de parafină după cum urmează:

– parafină I …………………………………………………12 ore

– parafină II ………………………………………………12 ore

– parafină III………………………………………….12 ore

Trecerea pieselor dintr-o baie într-alta se face rapid, pentru a împiedica solidificarea parafinei.

● Includerea propriu-zisă și formarea blocului

Piesele bine îmbibate cu parafină topită se înglobează într-un bloc de parafină ce solidifică, de consistență omogenă. Drept formă pentru turnarea blocurilor se pot folosi mici matrițe de plastic.

Piesa trebuie orientată cu fața care trebuie secționată în jos, spre fundul suportului. Se pune matrița de plastic și se umple cu parafină. După orientarea piesei se lasă un timp până parafina din formă se solidifică complet, după care se trece la fasonarea blocului. Se îndepărtează excesul de parafină.

e. Secționarea

Secționarea blocurilor s-a făcut la un microtom Leica, realizând secțiuni (cupe) de 3-5μm. Secțiunile s-au întins pe lame de sticlă care în prealabil au fost curățate și degresate.Pentru obținerea secțiunilor folosite pentru realizarea reacțiilor imunohistochimice, lamele au fost tratate anterior cu polilisină sau s-au folosit lame silanate.

Etalarea secțiunilor s-a făcut într-un cristalizor, în care se afla apă distilată încălzită la aproximativ 40-45˚C.

S-au detașat cu bisturiul secțiunile cele mai bune și au fost transferate, cu fața lucioasă în jos, în cristalizorul în care se afla apa distilată încălzită, având grijă ca orice cută de pe preparat să fie destinsă. Din cristalizor, secțiunile urmau a fi culese pe fața albuminată sau polilisinată a lamelor de sticlă realizându-se ceea ce se numește preparatul histologic necolorat.

Lipirea secțiunilor pe lame

Secțiunile au fost culese, una câte una, fie pe suprafața tratată cu polilisină a lamelor port-obiect. Fiecare lamă a fost introdusă în lichidul din cristalizator plasându-se oblic sub secțiune, după care a fost ridicată încet în timp ce secțiunea a fost menținută în mijlocul lamei cu ajutorul unui ac. S-a scos lama din apă, a fost scursă puțin pe o hârtie de filtru și așezată pe stativ lăsând să se scurgă complet apa. După ce lamele au fost lăsate scurt timp să se usuce, stativul a fost introdus la termostat și lăsat 12-24 de ore.

După scoaterea din termostatul de 37˚C, lamele erau perfect uscate și secțiunile întinse și aderente la lamă putând fi apoi colorate. Preparatele histologice obținute au fost folosite pentru realizarea de colorații histologice uzuale (hematoxilină-eozină) și colorații speciale pentru evidențierea fibrelor de colagen: tricromic și PAS- Hematoxilină.

B. Tehnici histologice utilizate

ș Tehnici histologice uzuale

Tehnica de colorare cu hematoxilină-eozină (HE)

Aceasta este cea mai folosită tehnică de colorare pentru vizualizarea arhitectoniei țesuturilor, colorând în mod diferit structurile în funcție de proprietățile tinctoriale ale acestora.

Tehnica comportă următorii timpi :

1. Deparafinarea (3 băi de xilen succesive):

xilen I ……………………………………………….8 min;

xilen II ……………………………………………….9 min;

xilen III……………………………………………..10 min;

2.Hidratarea (în băi de alcool etilic succesive):

alcool etilic absolut ……………………..……5 min;

alcool etilic 900 ………………………………5 min;

alcool etilic 800 ………………………………5 min;

alcool etilic 700 ………………………………5 min;

3. Spălare cu apă de robinet ………………………..……4-5 sec;

4. Colorarea nucleilor cu hematoxilină Mayer…………..15 min;

5. Spălare cu apă de robinet ………………………..……4-5 sec;

6. Diferențiere cu alcool clorhidric, după formula:

alcool etilic 960 ……………………………….100 ml;

acid dorhidric concentrat .…………………….5 picături;

timp de acționare ……………………….………………….2-3 sec;

7. Spălare cu apă de robinet ………………………….…..4-5 sec;

8. Virare în soluție saturată de carbonat de litiu …………..3-5 sec;

9. Spălare cu apă de robinet ………………………………..4-5 sec;

10.Colorarea citoplasmei cu eozină …….……………….30-45 sec;

11. Spălare cu apă de robinet …………………………..…..4-5 sec;

12. Spălare în alcool etilic 700 ………………………………3 min;

13. Deshidratare în alcool etilic 800 …………………………3 min;

14. Deshidratare în alcool etilic 900 …………………………3 min;

15. Deshidratare în alcool etilic 960 …………………………3 min;

16. Deshidratare în alcool etilic absolut I .…………………..3 min;

17. Deshidratare în alcool etilic absolut II………………..….3 min;

18. Deshidratare în alcool etilic absolut III…………………..3 min;

19. Clarificare în xilol-fenicat (3 băi succesive) ….……..….3 min;

20. Montare între lamă și lamelă, în balsam de Canada;

21. Termostatare la 370C………………………………………………..24 ore.

Rezultate

Tehnica de colorare cu HE oferă următoarele rezultate:

Citoplasmele…………………………..roz

Nucleii…………………………………albastru-violet

Fibrele de colagen……………………..roz palid

Fibrele elastice și de reticulină……….. nu se colorează.

Tehnica de colorare tricromic după metoda Masson (Masson modificat):

1. Deparafinarea (2băi de xilen succesive):

xilen I………………………………………………………….…………………………….…15 minute

xilen II………………………………………………………………………………………….15 minute

2. Hidratarea (în băi succesive de etanol de concentrații scăzânde):

alcool etilic absolut I…………………………………………….……………….. 10 minute

alcool etilic absolut II……………………………………………………………. 10 minute

alcool etilic 960 I…………………………………………………………………….5 minute

alcool etilic 960 II……………………………………………………………………5 minute

alcool etilic 750………………………………………………………………………5 minute

alcool etilic 500……………………………………………………………..……….5 minute

3. Spălarea în apă de robinet

4. Colorarea nucleilor cu hematoxilină Weigert…….10 minute

Soluție stoc A: 1 g hematoxilină și 100 ml etanol 95%;

Soluție stoc B: 4ml clorură ferică 29%, 95ml apă distilată, 1ml HCl conc.;

Soluție Weigert de lucru: se amestecă părți egale de A și B, stabilă 3 luni.

5. Spălare cu apă de robinet caldă…………………………………………………………..10 minute;

6. Spălare cu apă distilată.…………………………………………………………………….5 secunde;

7. Colorare cu soluție Biebrich scarlet – fucsină acidă:

Soluția se obține astfel: 90 ml soluție apoasă Scarlet Biebrich 1%,

10 ml soluție de fucsină acidă 1% și 1 ml acid acetic glacial.

Timp de acțiune…………………………………………………………………………………10-15 minute;

8. Spălare cu apă distilată…………………………….. ………………………………………5 secunde;

9. Diferențiere cu acid fosfomolibdenic-fosfolframic:

Soluția: 25 ml acid fosfomolibdenic 5%, 25ml acid fosfotungstic;

Timp de acțiune…………………………………………………………………………………10-15 minute;

10. Colorare cu albastru de anilină…………………………………………………………..5-10 minute;

11. Clătire apă distilată, diferențiere acid acetic 1%

Timp de acțiune……………………………………………………………………………………2-5 minute;

12. Spălare în apă distilată……………………………………………………………………….5 secunde;

13. Deshidratare în alcool etilic 800……………………………………………………………3 minute;

14. Deshidratare în alcool etilic 900…………………………………………………………….3 minute;

15. Deshidratare două băi alcool etilic 960……………………………………………………5 minute;

16. Deshidratare trei băi etanol absolut………………………………………………………..5 minute;

17.Clarificare în trei băi de xilol……………………………………………………………….15 minute;

18. Montare între lamă și lamelă, în balsam de Canada;

19. Termostatare la 370C …….…………..…………………………………………………….24 ore.

Rezultatele colorării:

Citoplasmele …………………………………….……roz

Nucleii…………………………………….…………..negru

Fibrele de colagen………………………….…………albastru

Fibrele musculare…………………………….………..roz.

Tehnica de colorare PAS –Hematoxilină

Colorația se face pentru identificarea grupărilor aldehidice libere ( Glicogen. Glicoproteine).

Deparafinarea în benzen:

benzen I …………………………………………………5 min.

benzen II ………………………………………………..5 min.

benzen III …………………………………………….. ……..5 min.

Hidratarea:

alcool absolut …………………………………………5 min.

alcool absolut 900 …………………………………… ……5 min.

alcool absolut 800 …………………………………….5 min.

apă distilată ………………………………………….. ……15 min.

Oxidarea cu acid periodic 1% ……………………5 min.

Spălarea în apă distilată ……………………………5 min.

Colorarea cu reactiv Schiff ……………………….15 min.

Spălarea în apă sulfurată 0,5%:

baia I …………………………………………………….2 min.

baia II ………………………………………………….. ……..2 min.

baia III …………………………………………………..2 min.

Spălare în apă de robinet ……………………………15-20 min.

Colorarea nucleilor cu hematoxilină ……………..3 min.

Spălarea în apă de robinet ……………………………5 min

Diferențierea în alcool acid ……………………….3-5 sec.

Spălarea în carbonat de litiu ………………………3-5 sec.

Spălare.

Deshidratare:

alcool 800

alcool 900

alcool 960

alcool absolut I

alcool absolut II

alcool absolut III

Rezultatele colorării. Se evidențiază:

– membranele bazale – roșu-roz

– fibrele de colagen roz-roși

– nucleii celulelor- mov

Tehnica de imunohistochimie

Secțiunile de 3-5µm grosime au fost lipite pe lame au fost ulterior prelucrate pentru studiul imunohistochimic.

Imunohistochimia reprezintă o tehnică de morfologie microscopică, folosită atât în cercetarea fundamentală cât și în diagnosticul histopatologic, care permite evidențierea existenței anumitor proteine în diverse celule și țesuturi prin intermediul unor reacții chimice vizibile la microscopul fotonic, folosind anticorpi monoclonali sau policlonali.

Imunohistochimia asigură, prin intermediul unei reacții antigen-anticorp amplificată, evidențierea localizării in situ a componentelor specifice anumitor celule și țesuturi ceea ce permite o mai precisă caracterizare biologică și, deci, terapeutică și prognostică.

Anticorpii sunt imunoglobuline (Ig) produse de plasmocite, ultimele elemente ale diferențierii limfocitelor B după recunoașterea unui antigen străin.

Cel mai frecvent utilizate în imunohistochimie sunt imunoglobulinele G (Ig G).Pentru a funcționa ca anticorp este suficient ca o moleculă să aibă o anumită dimensiune și o anumită rigiditate structurală care îi pot permite să mențină o configurație spațială tridimensională necesară pentru recunoașterea și legarea anticorpului specific.

Antigenul trebuie să dețină două proprietăți principale:

– imunogenitate (capacitatea de a induce formarea anticorpului) și

– reactivitate specifică cu anticorpul a cărei formare a indus-o el însuși.

Majoritatea proteinelor, polipeptidelor, lipoproteinelor și carbohidraților prezintă aceste caracteristici și, în configurația lor, există unul sau mai multe situsuri care se pot lega cu anticorpii specifici.

Situsurile antigenice sunt regiuni topografice cu înaltă specificitate, compuse dintr-un număr mic de aminoacizi sau unități monozaharidice și sunt denumite determinanți antigenici sau epitopi. O moleculă de proteină, carbohidrat sau lipid conține mai multe situsuri de legare a anticorpilor. Numărul de antigene care poate fi detectat pe secțiunile histologice prin metoda imunohistochimică este imens și în continuă creștere. Teoretic, orice substanță antigenică a cărei antigenitate este parțial reținută de țesuturi poate fi evidențiată.

Reacția dintre un antigen (sau un epitop al său) și anticorp nu este numai specifică dar și foarte stabilă, formarea acestor complexe imune stând la baza identificării componentelor antigenice celulare.

Reacțiile imunohistochimice se bazează pe legătura antigen tisular-anticorp și permit localizarea antigenelor datorită vizualizării complexului prin marcarea sa fie cu un colorant fluorescent, fie cu o enzimă, sau cu un element radioactiv sau cu aur coloidal (folosit pentru tehnica imunohistochimică pentru ultramicroscopie). Evoluția metodelor imunohistochimice de la cele directe, în imunofluorescență, la cele indirecte, tristadiale, a dus la creșterea performanței metodei și preciziei și stabilității reacțiilor. În prezent se folosesc mai multe tipuri de metode imunohistochimice pentru a localiza antigenele.

Selectarea metodei potrivite se bazează pe parametri cum ar fi specimenul de investigat și gradul de sensibilitate necesar.

Indiferent de metoda folosită se parcurge o secvență imunohistochimică, care presupune următoarelor etape realizate cu reactivi specifici:

Demascarea situsurilor antigenice. Detectarea prezenței unor antigene poate fi semnificativ îmbunătățită de pretratarea secțiunilor histologice cu un agent de demascare care rupe legăturile încrucișate dintre proteine formate în timpul fixării cu formalină și descoperă, ”demască” situsurile antigenice. Cele mai folosite tehnici denumite ”Heat Induced Epitope Retrieval (HIER)” implică aplicarea căldurii un timp variat într-o soluție apoasă (soluție de demascare). Ca soluții pentru demascare pot fi folosite fie soluția tampon citrat pH 6 fie tampoanele Tris-EDTA pH 9 și EDTA pH 8.

Alte metode denumite ”Proteolytic Induced Epitope Retrieval” (PIER), se bazează pe digestia enzimatică a legăturilor încrucișate folosind diferite proteaze.

Metodele ce folosesc enzimele (precum proteinaza K, tripsina, pepsina, pronaza) restabilesc imunoreactivitatea antigenelor din țesuturi, dezavantajul este însă că pot distruge unii epitopi iar morfologia țesutului nu este totdeauna perfect conservată, fiind necesară testarea concentrației optime de enzimă. Cuplarea celor două tipuri de metode este utilă atunci când se marchează mai mulți anticorpi simultan. Pentru a îmbunătăți penetrarea anticorpilor se pot aplica cicluri repetate de congelare-dezghețare dacă se folosesc țesuturi congelate sau aplicarea de detergenți de tipul triton X100.

Blocarea reactivității nespecifice. Reacția de culoare de fond (engl- background) în cazul unei reacții imunohistochimice poate fi specifică sau nespecifică. Un exemplu este fixarea necorespunzătoare care poate da rezultate fals pozitive datorită captării pasive a proteinelor serice și difuziei antigenului. Cauza principală a unei marcări nespecifice este legarea non-imună a serului imun prin forțe electrostatice și interacții hidrofobe la unele situsuri din secțiunea analizată. Această formă de marcare de fond este, de obicei, uniformă și poate fi redusă prin blocarea acestor situsuri cu un ser normal, cu albumină serică bovină sau cu lapte degresat. Anticorpii, mai ales cei policlonali, sunt adesea contaminați cu alți anticorpi datorită antigenului impur utilizat pentru imunizarea animalului gazdă.

Activitatea peroxidazei endogene este specifică multor țesuturi și poate fi detectată nespecific în reacția secțiunii de țesut fixat cu diaminobenzidina. Soluția pentru a elimina activitatea peroxidazei endogene este pretratamentul țesutului cu peroxid de hidrogen înainte de incubarea cu anticorpul primar.

Multe țesuturi conțin și activitate a fosfatazei alcaline endogene care poate fi blocată prin pretratamentul secțiunii cu levamisol. Unele țesuturi, cum sunt ficatul și rinichiul, conțin biotină endogenă. Pentru a evita legarea nedorită a avidinei la biotina endogenă dacă se folosește sistemul biotină-avidină ca sistem de detecție; este necesar tratamentul țesutului cu avidină neconjugată care apoi se saturează cu biotină.

Controlul reacțiilor enzimatice. Controale speciale trebuie efectuate pentru a testa protocolul și specificitatea anticorpului ce urmează a fi analizat. Controlul pozitiv se face pentru testarea protocolul pentru a știi sigur că funcționează. Este ideal a se folosi un țesut cunoscut a fi pozitiv ca și control. Dacă țesutul control pozitiv prezintă reacție negativă, protocolul trebuie să fie verificat până se obține un marcare bună a controlului pozitiv.

Controlul negativ se face pentru a testa specificitatea anticorpului. Mai întâi, nu trebuie să se observe nici o colorare dacă anticorpul primar lipsește sau este înlocuit cu un ser normal al aceleiași specii care a produs anticorpul. Acesta este cel mai folosit mijloc de a realiza un control negativ.

Altă modalitate este aceea de a inhiba prin adsorbție anticorpul primar la antigenul pur înainte de a-l folosi. Acest tip de control negativ este ideal și necesar la caracterizarea și evaluarea noilor anticorpi, însă este mai puțin folosit.

Metodele imunohistochimice pot fi directe sau indirecte.

Metoda directă. Metoda directă se efectuează într-o singură etapă și implică un anticorp marcat (de exemplu antiser conjugat FITC) care reacționează direct cu antigenul din secțiunile de țesut. Această tehnică utilizează un singur anticorp, este rapidă și de scurtă durată. Cu toate acestea, nu este foarte sensibilă datorită amplificării mici a semnalului și este tot mai rar folosită de la introducerea în practică a metodei indirecte.

Metoda indirectă. Metoda indirectă implică utilizarea a doi anticorpi: un anticorp primar nemarcat, care reprezintă primul strat și care reacționează cu antigenul tisular, și un anticorp secundar, care va reacționa cu anticorpul primar, reprezentând al doilea strat. Este obligatoriu ca anticorpul secundar să fie anti IgG a speciei de animal care a produs anticorpul primar. Această metodă este mai sensibilă datorită amplificării semnalului prin reacțiile pe care anticorpul secundar le are cu diferite situsuri antigenice ale anticorpului primar. În plus, este o metodă mai economică, deoarece anticorpul secundar marcat poate fi folosit pentru mai mulți anticorpi primari ce reacționează cu antigene diferite. Anticorpul secundar poate fi marcat cu un colorant fluorescent, cum ar fi FITC, rodamină sau roșu Texas, numindu-se metodă indirectă prin imunofluorescență, sau cu ajutorul unei enzime (de ex. peroxidază, fosfatază alcalină sau glucozoxidază), în acest caz fiind vorba de o reacție indirectă imuno-enzimatică.

Metoda PAP (metoda peroxidază anti-peroxidază). Metoda PAP este o variantă evoluată a tehnicii indirecte și implică un al treilea strat reprezentat de un anticorp de tip iepure anti-peroxidază care se cuplează cu peroxidaza pentru a forma un complex stabil peroxidază-anti-peroxidază. Acest complex, alcătuit din imunoglobuline de tip iepure și peroxidază, acționează ca un antigen din al treilea strat și se leagă de imunoglobulina neconjugată de tip capră anti-iepure din cel de-al doilea strat. Sensibilitatea este de 100 până la 1000 de ori mai mare datorită faptului că molecula de peroxidază se leagă prin metode imunologice și nu chimice de anticorpii anti-IgG, din acest motiv activitatea enzimei rămânând nemodificată. Metoda are și avantajul că permite utilizarea unor diluții mult mai mari ale anticorpului primar, în acest fel fiind evitate reacțiile fals pozitive și reducându-se colorația nespecifică de fond.

Metoda complexului avidină-biotină. Metoda ABC este o metodă imunohistochimică standard și una dintre cele mai frecvent utilizate. Avidina poate fi marcată cu peroxidază sau fluoresceină și prezintă o afinitate mare pentru biotină. Avidina este o glicoproteină bazică obținută din albușul de ou, are o greutate moleculară de 68 kDa și o structură terțiară cu patru situsuri de legare, cu mare afinitate pentu biotină (vitamina H) ce are o greutate de 244 daltoni. Biotina, o vitamină cu greutate moleculară mică, se poate conjuga cu mulți anticorpi.

Metoda se bazează pe marea afinitate a avidinei pentru biotină iar tehnica presupune utilizarea a trei straturi succesive: primul strat este reprezentat de anticorpul primar nemarcat, cel de-al doilea strat de către anticorpul secundar biotinilat, iar cel de-al treilea strat este complexul avidină-biotină-peroxidază. Peroxidaza este ulterior developată într-o reacție de culoare cu diaminobenzidină sau alt substrat pentru a forma produși finali colorați diferit.

Între ele se realizează o legătură chimică (tipul legăturii sterice de corespondență prin afinitate de formă) puternică și înalt specifică, cu o constantă de disociere de 10-15. În acest complex preformat, în care avidina este liberă și biotina este conjugată cu peroxidaza, concentrația moleculelor este calculată în așa fel încât rezultă molecule de avidină incomplet saturate de moleculele de biotină peroxidată (10 μg/ml de avidină pentru 2,5 μg/ml de biotină conjugată cu peroxidază). Astfel, sensibilitatea metodei ABC este de 100 de ori mai înaltă decât cea a metodei imunoperoxidazei indirecte și de circa 10 ori mai mare ca a metodei peroxidază-anti-peroxidază (PAP).

Reziduurile oligoglucidice din avidină îi determină afinitatea pentru unele componente tisulare și, deci, legăturile nespecifice. Riscul colorației nespecifice este mult redus, deși în unele țesuturi se pot forma legături electrostatice ale avidinei, libere sau marcate, cu diverse componente celulare sau cu biotina endogenă (de exemplu în ficat, țesut adipos, glandă mamară sau în rinichi).

Avantajele metodei ABC sunt următoarele:

sensibilitatea înaltă – metoda ABC este foarte sensibilă, putând fi utilizată ori de câte ori se dorește evidențierea unui antigen care nu a fost individualizat cu alte metode;

pozitivitate mică de fond (background) redus;

eficiență – metoda permite obținerea unei pozitivități intense în numai 30 de minute de incubare cu anticorpul primar;

preparare simplă și rapidă – complexul preformat se obține amestecând soluții în raport de 1:1, soluția rămânând stabilă pentru aproximativ 72 de ore.

Metoda streptavidină marcată – biotină. O moleculă similară avidinei este streptavidina (greutate moleculară de 60 kDa) extrasă din bacteria Streptomyces avidini. Această moleculă prezintă avantaje datorită lipsei reziduurilor oligoglucidice (în felul acesta nu se mai leagă de lectinele tisulare și nu prezintă colorație de fond) și datorită faptului că prezintă punct izoelectric neutru. Totuși, în practică, diferențele dintre cele două tipuri de avidină sunt limitate în ceea ce privește sensibilitatea și fondul. Biotina se conjugă ușor cu anticorpii și marcatorii enzimatici.

Cu ajutorul moleculei mari de avidină se pot atașa la o moleculă de anticorpi până la 150 molecule de biotină. Datorită numărului mare de molecule de biotină legate de un singur anticorp, numeroase molecule de avidină sau streptavidină pot fi legate de acesta, rezultatul fiind o sensibilitate crescută față de tehnicile cu enzime obișnuite și permițând o diluție mai mare a anticorpului primar. Peroxidaza (respectiv fosfataza alcalină) se poate lega direct de avidină sau streptavidină, iar enzimele sunt biostimulate și 75% din situsurile avidinei sunt ocupate de trasorul biotinilat formând complexul avidină-biotină.

Link – Streptavidin- Biotin (LSAB) este o tehnică similară metodei standard ABC. Primul strat este reprezentat de anticorpul primar nemarcat, al doilea strat de anticorpul secundar biotinilat, iar cel de-al treilea strat este reprezentat de conjugatul enzimă-streptavidină (peroxidază-streptavidină sau fosfatază alcalină-streptavidină), care înlocuiesc complexul avidină-biotină-peroxidază. Enzima este ulterior vizualizată prin utilizarea unor soluții de substraturi cromogene pentru obținerea unor produși finali colorați diferit. Enzima utilizată în cel de-al treilea strat poate fi înlocuită de o colorație fluorescentă de tipul FITC dacă se dorește o marcare prin fluorescență. Studii recente sugerează faptul că metoda LSAB este de 5 până la 10 ori mai sensibilă decât metoda standard ABC.

Metodele polimerice sunt foarte intens folosite în prezent.

Sistemul EnVision se bazează pe o tehnologie polimer-dextran, care permite legarea unui număr mare de enzime de un anticorp secundar prin intermediul unui schelet dextranic. Beneficiile sunt numeroase și includ sensibilitate crescută, colorație non-specifică de fond redusă și reducerea numărului total de teste comparativ cu tehnicile convenționale. Protocolul este simplu și constă în: i) aplicarea anticorpului primar; ii) aplicarea polimerului marcat enzymatic; iii) aplicarea unui substrat cromogen. Ulterior s-a dezvoltat sistemul EnVision + care are o sensibilitate mai mare.

Metodele imunohistochimice utilizate în lucrarea de față au fost metodele indirecte ABC, LSAB și metoda polimerică EnVision, datorită avantajelor oferite de specificitate și sensibilitate.

Folosind ca sistem de developare peroxidaza, am preferat utilizarea cromogenului 3,3’-diaminobenzidină (DAB), substrat a cărui oxidare cu peroxid de hidrogen produce un precipitat brun-negru, insolubil, la nivelul legăturii antigen-anticorp primar. Am ales DAB ca și cromogen, deoarece utilizarea aminoetilcarbazolului (AEC), care dă un precipitat roșu, are dezavantajul solubilitații în alcool și cel al unei slabe rezoluții optice.

De asemenea, am avut în vedere necesitatea inhibării peroxidazei endogene datorită utilizării peroxidazei ca enzimă de developare, precum și o bună prezervare morfologică a țesuturilor.

Tehnica de lucru imunohistochimică am aplicat-o pe țesutul gingival inclus la parafină și secționat la 3-5 μm grosime. Secțiunile au fost etalate pe lame histologice tratate cu polilisină, după care au fost supuse următorilor timpi ai protocolului general de lucru:

Deparafinare în două băi de xilen a câte 10 minute fiecare;

Rehidratare cu alcool etilic în concentrații descrescătoare astfel:

– alcool absolut ……………………………………………………….5-10 min.;

– alcool absolut ……………………………………………………….5-10 min.;

– alcool 960 ……………………………………………………………5-10 min.;

– alcool 900……………………………………………………………..5-10 min.;

– alcool 700 …………………………………………………………….5-10 min.

Blocarea peroxidazei endogene se poate face cu una din următoarele metode în funcție de antigenul cercetat:

apă oxigenată 3% în apă distilată, timp de 5 minute;

apă oxigenată 2% în metanol, timp de 30 minute;

Clătire în tampon fosfat salin (TFS) pH 7,4;

Demascarea situsurilor antigenice prin una din metodele menționate anterior: digestie enzimatică, pretratament la cuptorul cu microunde în tampon citrat pH 6 sau EDTA pH 8 la intensitatea de 750W, trei reprize a câte trei minute fiecare, urmată de răcire;

Spălare în apă de robinet;

Clătire în TFS pH 7,4;

Blocarea situsurilor nespecifice prin incubare cu ser neimun al animalului ce a produs anticorpul secundar (puntea) diluat 1:75, cu BSA 1% sau cu lapte praf degresat 1%, pentru a lega situsurile antigenice nespecifice de tip Fc, timp de 20 de minute la temperatura camerei;

Incubare cu anticorpul primar în diluția optimă (vezi tabel 3.1), peste noapte la 4oC;

10. Spălare în TFS timp 3×15 minute;

11. Incubare cu anticorp secundar biotinilat (punte) cu specific de specie pentru fiecare tip de anticorp primar timp de 30 de minute la temperatura camerei;

12. Spălare în TFS;

13. Amplificarea reacției (cu sistemele avidină-biotină, streptavidină-biotină, Envision) un timp variat în funcție de metoda selectată (30-60 minute);

14. Spălare în TFS pH 7,4;

15. Developare cu clorhidrat de 3,3’- diaminobenzidină (Sigma Aldrich Co.) și peroxid de hidrogen (10 mg DAB în 88 ml Tris pH 7,6 și 0,025% peroxid de hidrogen) timp de 5 minute la întuneric. DAB ca substrat pentru peroxidaza liberă a complexului ABC dezvoltă un precipitat de culoare brună, foarte fin, localizând clar antigenul cercetat;

16. Clătire în apă de robinet;

17. Contrastarea nucleilor cu hematoxilina Mayer timp de 2 minute;

18. Clătire în apă de robinet;

19. Virare în carbonat de litiu;

20. Clătire în apă de robinet;

21. Deshidratare în alcool cu concentrație crescătoare astfel:

alcool 960 timp de 5 min.;

alcool timp de 5-10 min.;

alcool absolut timp de 5 min.;

alcool absolut timp de 5 min.

22.Clarificare în trei băi de xilen câte cinci minute fiecare;

23.Montare în balsam de Canada, vizualizare la microscop.

În tabelul 4.1. sunt prezentați anticorpii folosiți pentru detectarea antigenelor evaluate în studiile imunohistochimice din această lucrare.

Tabel 4 .1. Anticorpii folosiți pentru studiile de imunohistochimie

CAPITOLUL 5

REZULTATE

Hipercreșterea gingivală se referă la o mărire de volum a gingiei însoțită de modificarea aspectului și culorii normale ale acesteia, modificare ce poate fi mai mult sau mai puțin accentuată. Termenul „hipercreștere gingivală” este cel preferat pentru a defini toate leziunile gingivale denumite anterior „hiperplazie gingivală” sau „hipertrofie gingivală”, acesta prespunând simultan fenomene de hiperplazie (proliferare a epiteliului gingival) cât și de hipertrofie (îngroșare) gingivală.

În prezentul capitol vom face o expunere a rezultatelor pe care le-am obținut în urma studiului celor două loturi de pacienți, lotul I prezentând hipercreștere gingivală fibrotică și lotul al II-lea hipercreștere inflamatorie. Aceste diagnostoce clinice ale hipercreșterii gingivale au fost stabilite în urma examenului clinic endo-oral.

S-a recoltat mucoasă gingivală care a fost supusă tehnicilor histologice de includere în parafină, urmate se secționare și colorarea secțiunilor pentru examinarea histologică de rutină (H-E ) dar și tehnici speciale pentru evidențierea fibrelor de colagen (Colorații tricromice sau reacție PAS- Hematoxilină. Secțiuni seriate au fost de asemenea prelucrate pentru tehnica imunohistochimică și incubate cu anticorpi primari anti-vimentină, anti α-sma și anti CTGF.

Am inițiat studiul nostru prin evaluarea modificărilor histologice ale fibromucoasei gingivale în gingivite și parodontite, în raport cu țesutul gingival provenit de la lotul 1, lipsit de modificări inflamatorii.

Evaluarea microscopică în colorații uzuale, hematoxilină -eozină a arătat au arătat fibromucoasa gingivală cu volum mărit, atât în leziunile fibromatoase cât și în cele inflamatorii. Creșterea înălțimii mucoasei gingivale se face, așa după cum au arătat rezultatele noastre, prin creșterea de dimensiune atât a epiteliului cât și a laminei propria.

Epiteliul prezinta zone de grosime normală, care alternează cu zone de acanzoză și hiperkeratoză (Fig.5.1, Fig.5.2, Fig.5.3, Fig.5.4 ).

Fig. 5.1. Aspect de ansamblu al unei mucoase gingivale provenind de la un pacient cu leziune inflamatorie locală, tip epulidă , Col H-E ob. x 4

Fig. 5.2. Imagine de detaliu care surprinde epiteliul și lamina propria aparținând unui caz cu hipercreștere gingivală inflamatorie. Se constată acumularea atât a țesutului de granulație cât și a fibrelor de colagen subepitelial . Col H-E obx 20

Fig. 5.3. Hipercreștere fibrotică, tratament cu fenitoină. Hiperkeratoză epitelială, acumulare de benzi de fibroză PAS pozitive. La interfața epiteliu-lamina propria se markează membrana bazală continuă, PAS pozitivă. Col PAS-Hematoxilină ob. x 10

Fig. 5.4. Imagine de detaliu, hipercreștere fibrotică, Se remarcă acumularea de colagen și numărul extrem de redus de celule în lamina propria. Col H_E ob. x 20

Epiteliul gingival apare de dimensiuni diferite, în general hiperplazic, prezentând numeroase arii de akantoză (Fig.5.1, Fig.5.3)și hiperkeratoză (Fig.5.1), Pe unele preparate am remarcat de asemenea și parakeratoză. Straturile superficiale ale epiteliului au arătat în unele cazuri aspecte de edematoase (Fig.5.5) dar aspectul apare, alături de infiltrarea inflamatorie a epiteliului, mai ales în cazurile în care secțiunea a fost surprinsă la nivelul epiteliului sulcular (Fig.5.6).

Fig. 5.5. Aspect al epiteliului oral provenind de la o mucoasă cu hipercreștere gingivală. Se remarcă aspectul edemațiat al epiteliului, cu numeroase celule balonizate, iar în stratul bazal numeroase celule cu figuri mitotice. Col. tricr.ob. x 10

Frecvent, în ariile de acantoză, a fost observată și acantoliza, aspectul epiteliului în aceste arii devenind spongios. În zonele de acantoză – creșterea grosimii epiteliului prin înmulțirea celulelor din stratul spinos (acanthos – spin) am remarcat frecvent spații mari între keratinocite prin aparariția acantolizei. În aceste arii stratificarea epitelială normală dispare, iar celulele apar balonizate, sferice, pierzând aspectul normal al celulelor epiteliale și apar ca spații clare în interiorul epiteliului. Nucleul acestor celule apare lenticular, împins la un pol al celulei.

Fig. 5.6. Hipercreștere gingivală inflamatorie, epiteliu sulcular, col. tricr. ob. x 20

Alte imagini de detaliu ale epiteliului oral de tip masticator arată distribuția keratinocitelor pe cele cinci straturi cunoscute (Fig.5.3), menținerea aspectului normal al fiecărui strat epitelial, iar suprafața o bandă bine delimitată, eozinofilă, cu nuclei tahicromi, bine individualizați. Aspectul caracterizează parakeratoza epitelială

Interfața dintre epiteliu și lamina propria apare la nivelul epiteliului mucoasei gingivale extrem de anfractuoasă, creste epiteliale adânci și puternic ramificate pătrunzând profund în chorion. Aspectul este caracteristic mucoasei masticatorii (Fig.5.4., Fig.5.7).

La nivelul epiteliului sulcular papilele chorionului sunt mai puțin înalte iar crestele epiteliale mai puțin ascuțite și ramificate (Fig.5.6).

Un alt aspect este cel al infiltrării limfocitare, care apare nu doar în epiteliul sulcular ci și în epiteliul keratinizat al mucoasei masticatorii (Fig.5.7, Fig.5.8, Fig.5.9 ).

Fig. 5.7. Mucoasă orală, aspect de ansamblu, hipercreștere fibrotică. Se remarcă hiperkeratoza epitelială și aspectul papilomatos al laminei propria. Col tricr. ob.x 10

Fig. 5.8. Epiteliu oral aparținând unei fibromucoase gingivale cu hipercreștere fibroasă. Numeroase celule proinflamatorii cu halou clar infiltrează straturile profunde epiteliale. Col. tricr. ob. x 20

Fig. 5.9. Epiteliu gingival aparținând unei hipercreșteri gingivale din lotul inflamator. Celule inflamatorii ascensionează în număr mare dinspre stratul profund spre straturile superficiale ale epiteliului, lipsit de keratinizare . Col H-E ob. x 20

Fig. 5.10. Imagine de detaliu al epiteliului gingival aparținând unui caz de hipercreștere gingivală. Se remarcă diferența morfologică între keratinocite și celulele proinflamatorii care apar înconjurate de un halou clar. Col. tricr. ob. x40.

În figurile (5.7, 5.8 ,5.11) se remarcă diferența de distribuție și de acumulare a țesutului conjunctiv în lamina propria între cele două tipuri de hipercreșteri gingivale studiate: în cea fibrotică benzile colagene ascensionează dinspre corionul profund spre cel superficial și șterg diferențele între cele două tipuri de țesut conjunctiv: lax în corionul superficial, papilar și dens semiordonat în cel profund.

Fig. 5.11. Fibromucoasă gingivală de tip inflamator, cu celule proinflamatorii acumulate sub forma țesutul lui de granulație în chorionul superficial, numeroase vase dilatate, extravazat sanghin. Col tricr. ob.x 20

Procesul de proliferare papiliferă se caracterizează prin apariția a numeroase papile ale chorionului ce prezintă înălțimi variabile și aspect ramificat, structura papilelor putând fi diferită din punct de vedere histologic. Colorația tricromică evidențiază fibrele de colagen, colorate selectiv, ce formează axul conjunctiv al acestor papile. Uneori țesutul conjunctiv la al papilelor ,mai ales în fibromucoasele cu hipercreștere fibrotică, este înlocuit cu țesut conjunctiv dens, fibrilar.

Fig .5.12. Fibromucoasă gingivală cu leziuni fibrotice,aparținând lotului al II-lea. Se remarcă numeroase benzi groase de colagen care ocupă toată lamina propria. Col. PAS-hematoxilină ob.x10

Lamina propria a fibromucoasei gingivale a fost reprezentată de un țesut conjunctiv – chorion, alcătuit în mod caracteristic din benzi groase de colagen, vizibile în colorațiile tricromice, alcătuite dintr-o aglomerare strânsă de fibre colagene. Aceste benzi prezintă orientare neregulată, ocupând întreaga grosime a chorionului.

Foarte rar se mai menține aspectul stratificat caracteristic al chorionului, în care stratul superficial de țesut conjunctiv, denumit și chorion papilar, este constituit dintr-un țesut conjunctiv mai lax, bine vascularizat iar cel profund din țesut conjunctiv dens, neordonat.

Fibrele colagene par a ocupa întreaga grosime a laminei propria.

Imaginile de detaliu arată că fasciculele colagene sunt sărace în celule și în vase sanghine (Fig.5.13, Fig.5.15) în timp ce la intersecția acestor fascicule colagene se remarcă arii de condensări de țesut de granulație, mult mai extinse în cazul hipertrofiilor inflamatorii(Fig.5.14).

Fig. 5.13. Imagine de detaliu a laminei propria dintr-o hipercreștere gingivală fibrotică. Col. PAS-hematoxilină ob.x10

Fig. 5.14. Hipercreștere gingivală inflamatorie. Arii extinse de țesut de granulație situate la intersecția fascicolelor de colagen. Col.H-E ob.x 20

Celulele pe care le-am remarcat printre fibrele colagene sunt reprezentate fie de elemente fibroblastice, cele mai multe având aspect histologic de celule active, cu prelungiri neregulate și numeroase vezicule intracitoplasmatice; nucleul este central, cu cromatina granulară și constant nucleolat fie de fibrocite cu aspect de celulă inactivă, cu nuclei tahicromși citoplasma condensată, lipsită de vacuole și cu forma caracteristică fuziformă (Fig.5.13, Fig.5.15).

Fig. 5.15. Imagine de detaliu al benzilor de colagen din fibromucoasă aparțin în dunei hipercreșteri fibrotice . Col.Tricr.Ob x 20.

Atât în leziunile fibrotice cât și în cele inflamatorii am remarcat printre celulele proinflamatorii ale țesutului de granulație plasmocite și mastocite. Pe cele din urmă le-am reunoscut după colorația metacromatică a granulațiilor în reacția PAS (Fig.5.16).

Fig. 5.16. Țesut de granulație cu prezența mastocitelor în leziuni inflamatorii ale mucoasei gingivale. Col. Pas-hematoxilină ob.x 40

Studiul histologic în colorații uzuale și speciale a fost urmat de un studiu imunohistochimic în care am urmărit marcarea celulelor fibrosecretante cu anticorpii Vimentină, marker pentru celule de origine mezenchimală, deci și pentru fibroblaste și α-sma, marker pentru miofibroblaste, categorie de celule înalt secretante implicate în procesul de fibroză.

Marcarea cu vimentină a arătat un număr relative scăzut de celule prezente în fibromucoasele cu leziuni de hipercreștere fibrotice (Fig.5.17).

În aceste leziuni numărul de celule marcate pozitiv pentru α-sma a fost sensibil mai mare, aceste celule fiind prezente printre fascicule de colagen din benzile de fibroză alături de fibroblastele marcate cu vimenină.

În leziunile inflamatorii dar și în unele leziuni fibrotice celulele marcate cu α-sma au fost absente, ceea ce presupune că un alt tip de fibroblaste este responsabil de secreția de colagen.

Fig. 5.17. Marcaj cu vimentină pentru celulele mezenchimale ale laminei propria din fibromucoasa gingivală, hipercreștere gingivală din lotul II. Imunoreacție ob.x 40

Fig. 5.18. Imunoreacție pozitivă pentru α-sma pentru celule de tip miofibroblastic, chorion profund, hipercreștere gingivală fibrotică. Imnoreacție ob.x 40

Fig. 5.19. Reacție pentru vimentină, hipercreștere inflamatorie , imunoreacție ob.x 20

Fig. 5.20. Imunoreacție pentru α-sma, hipercreștere inflamatorie. Pozitivitate exclusive pentru pericitele din pereții vaselor de sânge. Imunoreacție ob.x 10

In hipercreșterile inflamatorii reacția pentru CTGF a prezentat răspuns extrem de diferit la nivelul epiteliului: uneori absent pe arii întinse, alternând cu keratinocite pozitive izolat, uneori prezentând pozitivitate parcelară, pentru ca în alte situații un grup de keratinocite situat profund, spre membrana bazală, să fie intens pozitive (Fig.5.21, Fig.5.22). În țesutul conjunctiv am surprins atât fibroblaste cât și celule endoteliale pozitive.

Fig. 5.21. Imunoreacție pentru CTGF , hipercreștere gingivală inflamatorie de cauză locală. Pozitivitate parcelară în epiteliul gingival. Imunoreacțieob. x 10

În fibroza gingivală răspunsul mucoasei la reacția pentru CTGF a fost extrem de intens, epiteliul prezentând reacție puternică și uniformă pe toată suprafața, iar în chorion elementele marcate au fost atât celule mezenchimale cât și celule proinflamatorii (Fig.5.23,5.24).

Fig. 5.22. Hipercreștere gingivală inflamatorie. CTGF prezintă reacție pozitivă în unele keratinocite și în celule din chorion. Imunoreacție ob. x 20

Fig. 5.23. Hipercreștere fibroasă, imunoreacție intense pentru CTGF în epiteliul gingival. ob. x 10

Fig. 5.24. Aspect de detaliu, imunoreacțiepentru CTGF. Semnal pozitiv în celulele keratinocitare și slab în celulele endoteliale. Imunoreacție ob.x 40

CAPITOLUL 6

DISCUȚII

În lucrarea de față ne-am propus studiul histologic și imunohistochimic al modificărilor fibromucoasei gingivalei din hipercreșterea gingivală fibrotică. Pentru acest scop am împărțit cazurile clinice în două loturi : lotul I cuprinzând pacienți cu diagnosticul clinic de hipercreștere fibrotică, lotul al II-lea, cuprinzând pacienți diagnosticați clinic cu hipercreștere gingivală inflamatorie, determinată de cauze locale sau de administrarea blocantelor de calciu. Rezultatele obținute pentru cele două loturi au fost prezentate prin comparație.

Toate cazurile studiate s-au caracterizat prin creșterea constantă de grosime a epiteliului gingival, care apare datorită multiplicării rândurilor de celulele din stratul spinos. Acantoza a fost uneori însoțiță de akantoliză, cu aspectul spongios al epiteliului, apărut prin pierderea coeziunii dintre celulele epiteliale.

Modificările epiteliale descrise nu par a fi specifice pentru un anumit factor de risc, întrucât ele sunt descrise atât în hipercreșterea gingivală determinată de medicamente [Belazi și colab., 1993], cât și în cea ereditară sau idiopatică [Douzgou S. și Dallapicolla B., 2011]. Hiperkeratoza și parakeratoza pe care le-am constat în majoritatea cazurilor par de asemenea a fi o modificare obișnuită epitelială. Nu există explicații pentru aceste modificări decât doar cele care s-ar putea pune pe seama creșterii indicelui mitotic al keratinocitelor, observație care a fost de asemenea raportată de mai mulți autori [Araujo și colab., 2003, Kantarci și colab., 2007] și care la rândul său este determinată de prezența unor citokine proinflamatorii sau de factori de creștere [Bulut și colab., 2006, Araujo și colab., 2003]. Tot prin creșterea capacității de multiplicare a keratinocitelor este explicată și prezența constantă a papilelor epiteliale denumite și creste epiteliale, adânci, ascuțite și uneori ramificate [Araujo și colab., 2003, Black și colab., 2007].

Rezultatele obținute indică de asemenea o creștere a numărului și adâncimii acestor creste epiteliale, ce apar uneori chiar ramificate și unite între ele prin punți epiteliale. Rolul acestor creste epiteliale adânci cu numeroase celule epiteliale aflate în diviziune ar putea fi acela de a furniza celule cu capacitate de sinteză colagenă prin fenomenul de tranziție epitelio-mezenchimală [Sume și colab., 2010, Kantarci și colab., 2011]. Raportul intim între epiteliul gingival și țesutul conjunctiv subjacent care se realizează pe o suprafață crescută prin apariția acestor creste epiteliale adânci i-a determinat pe unii cercetător să afirme că celulele epiteliale dețin rol important în patogeneza hipercreșterii gingivale fibrotice inducând pe de o parte capacitatea de sinteză a matricei extracelulare de către fibroblaste și la acumularea sa prin stimularea sintezei de TIMP-1, inhibitor al metalo-proteinazelor matriciale.

Printre celulele epiteliale din stratul bazal am evidențiat elemente celulare cu aspect microscopic diferit de al keratinocitelor. O parte dintre aceste celule sunt descrise în literatură ca ”celule clare” deoarece datorită lipsei de joncțiuni desmozomale comune keratinocitelor, citoplasma lor se retractă în urma tehnicii histologice apărând un halou clar perinuclear [Nanci A., 2003, Baniță M. și Deva V., 2007]. Celulele clare sunt reprezentate de celule dendritice Langerhans, limfocite, celule pigmentare și celule Merkel. Numărul limfocitelor care au infiltrat epiteliul profund a fost mai mare la pacienții cu hipercreștere inflamatorie unde și lamina propria a găzduit mai multe celule proinflamatorii. Epiteliul crevicular aprezentat în mod costant edem subepitelial cu un infiltrat inflamator mai important dar și aspecte lezionale de degenerescență sau leziuni ulcerative, precum și parakeratoză.

Acest fapt indică un alt rol al epiteliul în modificările patogenice ce determină hipercreșterea gingivală, și anume acela de a asigura condiții pentru răspunsul imun local.

Lamina propria, țesutul conjunctiv al mucoasei gingivale, apare de grosime crescută, cu acumulare importantă de colagen sub forma unor benzi groase care la rândul lor pot avea diferite direcții. De cele mai multe ori fibrele colagene ascensionează dinspre chorionul profund spre cel papilar, astfel încât înlocuiește țesutul conjunctiv lax al papilelor cu țesut dens. În ambele loturi dar și în celelalte loturi am remarcat prezența unor arii de acumulare de țesut inflamator. Țesutul de granulatie, a fost localizat fie imediat sub chorionul papilar, la vârful crestelor epiteliale și printre acestea, fie sub forma unor mici noduli de țesut proinflamator localizat în unghiurile dintre fasciculele colagene.

Studiul biochimic al chorionului gingival a arătat o compoziție diferită față de derm a țesutului conjunctiv, alcătuit în special din colagen, proteoglicani, tenascină, fibronectină, osteonectină și elastină. Distribuția acestor molecule diferă în raport cu profunzimea față de membrana bazală: astfel imediat subjacent membranei bazale se află o zonă bogată în colagen tip I și tip III, dar și în mici molecule de proteoglicani bogați în leucină (decorin și biclican). Colegenul tip IV este mai bine reprezentat în jurul vaselor de sânge și al nervilor, la interfața între epiteliu și țesutul conjunctiv-în membrana bazală epitelială și în papilele chorionului. Colagenul tip VI este distribuit în vecinătatea membranei bazale într-un pattern microfibrilar. Elastina se găsește în cantitate mică în gingia atașată dar este mai bune reprezentată în mucoasa alveolară [Bartold P.M. și Narayanan A.S., 2006]. Elastina din gingie ar fi reprezentată de fibre eleastice obișnuite dar și de fibre groase imature de oxitalan [Doufexi și colab., 2005]. Fibrele de colagen în țesutul conjunctiv al fibromucoasei gingivale în fibromatoza gingivală prezintă o distribuție anormală, fiind formate din fibrile cu traiect neregulat, uneori formând bucle, care se intersectează cu fibre cu traiect normal. Un alt aspect descris în depunerea fibrotică gingivală este creșterea cantității de molecule matriciale filamentoase care se dispun într-o rețea rețea ramificată [Barros și colab., 2001].Rezultatele noastre ilustrate prin colorații speciale pentru fibrele de colagen dar și pentru mucopolizaharidele acide sau neutre (PAS- hematoxilină) indică acumularea mai importantă de mucopolizaharide acide în zonele de infiltrat inflamator din chorion. Benzile groase colagene prezintă PAS pozitivitate relativă.

Un studiu microscopic efectuat pe țesuturi recoltate de la subiecți cu fibromatoză ereditară, una dintre cele mai rare condiții ale hipercreșterii fibrotice gingivale, arată în colorațiile tricromice benzi colagene largi cu puține fibroblaste situate în profunzimea țesutului conjunctiv. Determinările semicantitative arată la aceste cazuri inflamație redusă, mai slab reprezentată decât la lotul martor în timp ce nivelul de fibroză a fost mult mai crescut față de martor (3.33 pe o scară până la 4). Autorii concluzionează că în fibromatoza gingivală ereditară nivelul de sinteză al matricei extracelulare este independent de factorii locali cum ar fi inflamația. Așa cum am menționat anterior rezultatele noastre indică un grad variabil de inflamație pe toate secțiunie examinate [Cassavechia și colab., 2004]. Este dificil de cuantificat prin metode histologice uzuale nivelul inflamație, deoarece țesutul proinflamator nu este situat în zone stabilite anume ce pot fi evaluate histomorfometric, țesutul de granulație fiind răspândit în diferite zone. Există în literatura de specialitate descrise cazuri de asociere a fibromatozei gingivale cu periodontite severe [Cassavechia și colab., 2004, Rizwan S., 2009]. Aceste observații ne îndreptățesc să afirmăm că leziunile fibromatoase nu pot fi considerate izolat de microambientul inflamator în care se găsește țesutul gingival.

Celulele care intră în alcătuirea laminei propria sunt reprezentate de celule locale, autohtone, reprezentate în special din fibroblaste cu variantele lor fibrocitele, celulele vaselor de sânge și celule migrate din sânge, elemente proinflamatorii. Fibroblastele gingivale sunt relativ frecvente așa după cum demonstrează preparatele noastre. Exisă numeroase controverse în ceea ce privește numărul și capacitatea de multiplicare a fibroblastelor din gingia fibrotică. Există autori care consemnează un număr important de fibroblaste în gingia fibrotică [Trackman P.C. și Kantarci A., 2004, Khan și colab., 2012, Aghili și colab., 2013] în timp ce alții susțin că numărul celulelor și al vaselor sanghine este mai redus față de țesutul conjunctiv din fibromucoasa normală [Doufexiși colab., 2005].Controversele privind numărul fibroblastelor se mențin și în ceea ce privește capacitatea lor de multiplicare, existând în acest sens trei curente de opinie: o rată mai mare de multiplicare decât în mucoasa gingivală normală [Coletta și colab., 1998, Kantarci și colab., 2007] alți autori susțin o scădere a ratei de proliferare [Martelli -Junior și colab., 2005, Meng și colab., 2007] sau că fibroblastele prezintă o rată normală de proliferare [Coletta și colab., 1998]. Studii recente arată însă că în țesuturile fibrotice originea fibroblastelor în procesul de fibroză este doar în mică măsură dacă nu chiar absentă în fibroblastele locale, cât în maduva spinării (fibrocitele) sau în celulele endoteliale sau endoteliale [Guarino și colab., 2009, Sume și colab., 2010, Kantarci și colab., 2011].

Am menționat anterior prezența constantă a țesutului inflamator în lamina propria, indiferent de lotul studiat. Infiltratul inflamator a fost alcătuit în special din limfocite și plasmocite, alcătuind așa numitul țesut de granulație, situat mai ales perivascular. Examinarea de detaliu a arătat și existența macrofagelor activate și a mastocitelor, uneori în curs de degranulare. Mastocitele sunt prezente și în mucoasa gingivală normală, fiind localizate în apropierea vaselor de sânge, anervilor și a membranei bazale epiteliale ceea ce le asigură îndeplinirea rolului în mecanismele homeostaziei dar și participarea în răspunsul imun primar al organismului [Batista și colab., 2005]. Prezența plasmocitelor a fost reportată în număr relativ important în hipercreșterea gingivală indusă de medicamente [Subramani și colab., 2013]. În inflamațiile gingivale cronice mastocitele participă prin mediatorii chimici eliberați atât la degradarea țesuturilor cât și la menținerea unei bariere de apărare pentru structurile respective. În inflamația gingivală heparina, histamina și TNFα eliberate de mastocite influențează proliferarea fibroblastelor, sinteza și degradarea matricei extracelulare dar stimulează și sinteza de MMP-9 care mediază liza membranei bazale epiteliale [Di Girolamo și Wakefield, 2000] ceea ce facilitează pătrunderea limfocitelor în straturile epiteliale. Această cale patogenică implică direct mastocitele în creșterea cantității de matrice extracelulară în hipercreșterea gingivală fibrotică. Printre numeroșii mediatori chimici conținuți în granulațiile mastocitelor se numără și endotelina-1 (Et-1) care acționează de manieră autocrină inițiind degranulareamastocitară. În același timp Et-1induce și exprimarea unui mare număr de MMP dar și a numeroase proteine matriciale în celulele în cultură, cum ar fi colagenul, laminina, fibronectina [Ohuchi și colab., 2002, Fraccarollo și colab., 2002].

Există două mari mecanisme biologice care conduc în final la creșterea acumulării de țesut gingival: sinteza în exces sau scăderea degradării matricei extracelulare [Trackman P.C și Kantarci A., 2004, Bartold P.M. și Narayanan A.S., 2006, Black și colab., 2007, Kantarci și colab., 2011, Douzgou S. și Dallapiccola B., 2011, Aghili H. și Moghadam M., 2013].

Prin studiul imunohistochimic am urmărit marcarea specifică a principalelor celule impicate în sinteza colagenului ( vimentina pentru toate celule de origine mezenchimală, deci incluzând și fibroblastele și α-sma, anticorpspecific pentru miofibroblaste, fenotipul înalt secretant al fibroblastelor. Celulele cunoscute clasic sub denumirea de fibroblaste reprezintă de fapt o populație extrem de heterogenă ca origine, diferențiere și funcție de la un organ la altul, dar și cadrul aceluiași țesut , cum ar fi gingia, aceste celule pot prezenta variații semnificative în raport cu situația fiziologică sau patologică în care se găsește.

Consecutiv acestei heterogenități de origine, există și diferiți markeri care se folosesc în prezent pentru evidențierea fibroblastelor, nu toți fiind însă la fel de fiabili. Vimentina, un marker ce s-a impus de-a lungul timpului pentru evidențierea celulelor de origine mezenchimală, prin marcarea filamentelor intermediare din citoplasma acestora, pare a nu fi potrivit pentru evidențierea fibroblastelor din toate țesuturile in vitro [Okada și colab. 2000]. Doar unele subpopulații de fibroblaste exprimă colagenul de tip I [Kalluri R. și Neilson E.G., 2003]; similar, doar anumite subpopulații exprimă α-sma, marker pentru miofibroblaste, denumite și fibroblaste activate [Serini G. și Gabbiani G., 1999, Tang și colab., 1997], fiind chiar avansată ipoteza că actina mușchiului neted ar putea marca de fapt celule desprinse din pereții vaselor sanghine în injuriile determinate de patologia locală [Okada și colab., 2000, Eyden și colab., 2010].

Rezultatele noastre indică un număr mare de elemente mezenchimale pozitive pentru vimentină în lotul II, conținând fibromucoasele provenind de la pacienții cu inflamație gingivală, pacienții cu fibroză au prezentat un număr redus de celule vimentin pozitive. Invers, fibroblastele pozitive pentru α-sma au prezentat cea mai mare incidență în lotul I, la cazurile cu fibroză produsă de fenitoină sau în fibroza idiopatică. Această similitudine între cele două situații, una fiind indusă iar cealaltă fiind genetică este dificil de explicat, dar trebuie avut în vedere că ambele situații se caracterizează printr-o cantitate mare de matrice extracelulară fibroasă și prin prezența a numeroase fibroblaste active. Prezența miofibroblastelor în chorionul gingiei normale este controversată. Una dintre posibilele explicații ale rezultatelor noastre ar fi aceea că în ambele loturi am întâlnit pe lângă fibroza extinsă și țesut de granulație, chiar dacă nu cu o frecvență sau în cantități importante. Există autori care arată că în mod progresiv, în țesutul de granulație fibroblastele devin populație majoritară și capătă fenotip de miofibroblaste, inclusiv exprimarea actinei α [Desmouliere și colab., 2005, Tomasek și colab., 2002]. Aceste miofibroblaste astfel diferențiate pot rămâne multă vreme silențioase sau pot dispărea prin apoptoză după cicatrizarea leziunii. Există raportări în literatură care fac referire la evidențierea miofibroblastelor în fibromatoza gingivală ereditară și în hiperplazia gingivală indusă de medicamente [Damasceno și colab., 2012].

Rezultatele noastre indică o pozitivitate constantă și intensă pentru CTGF în toate cazurile studiate, cu cea mai slabă reacție în cazurile din lotul II și cea mai intensă în gingiile fibrotice.

În mod constant reacția pozitivă a fost în epiteliu, și ocazional în lamina propria, mai ales în pereții vaselor sanghine. Rezultate similare cu ale noastre au fost raportate de către [Kantarci și colab., 2006] care au studiat exprimarea CTGF pe loturi de țesuturi comparativ provenind de la pacienți tratați cu fenitoină și de la cazuri de fibromatoză gingivală ereditară. Din multe puncte de vedere cele două hipercreșteri gingivale sunt comparabile [Kantarci și colab., 2007, Sume și colab.,2010]. Deoarece prezența CTGF în epiteliu, indicată prin imunohistochimie, deci în celule care nu produc factorul de creștere [Leask și colab., 2003] a fost intrigantă pentru autori, au efectuat dozarea ARNm care a confirmat prezența în cantitate mare a CTGF în stratul bazal epitelial. Dacă în țesutul conjunctiv CTGF promovează fibroza locală, prezența sa în epiteliu are cu totul altă semnificație, astfel în țesutul uterin stimulează proliferarea celulară [Kantarci și colab., 2006]. Autorii sugerează că și în țesutul gingival ar putea rolul de a stimula proliferarea keratinocitelor din stratul bazal, unde am remarcat și noi un număr crescut de celule aflate în diviziune.

CONCLUZII

Hipercreșterea gingivală fibrotică se caracterizează histologic prin mărirea de volum a mucoasei gingivale la care participă în egală măsură epiteliul gingival și lamina propria.

Indiferent de factorii etiologici implicați, epiteliul gingival prezintă hiperkeratoză, akantoză și creste epiteliale profunde în chorionul subjacent. Celulele proinflamatorii prezintă incidență diferită în stratul profund epitelial, în raport cu gradul infiltrației inflamatorii din țesutul conjunctiv: mai important în hipercreșterea inflamatorie de cauză locală și mai redusî în hipercreșterea fibrotică.

În lamina propria distribuția țesutului proinflamator este diferită, putând fi concentrat în anumite zone sau fragmentat în mici nodului inflamatori printre fasciculele colagene.

Colorațiile speciale sunt importante în studiul modificărilor morfologice deoarece indică modificări cantitative – depunerile de matrice organică care cresc consistența fibromucoasei gingivale la examinarea clinică dar care nu se regăsesc sub forma aspectului fibrilar la examinarea histologică în colorații uzuale.

Numărul celulelor de origine mezenchimală și a raportului fibroblaste/miofibroblaste este de asemenea diferit în funcție de factorul etiologic al hipercreșterii gingivale, celulele marcate cu α-sma fiind în mod constant slab reprezentate.

CTGF este bine reprezentat în epiteliul gingival și slab în structurile celulare ale țesutului conjunctiv, indicând o permanentă interrelație epitelio-mezenchimală în hipercreșterea gingivală.

BIBLIOGRAFIE

Aghili H., Goldani Moghadam M., Hereditary gingival fibromatosis: a review and a report of a rare case. Case Rep Dent. 2013; 2013:930972. doi: 10.1155/2013/930972. Feb 21, Epub 2013.

Araujo C.S., Graner E., Almeida O.P., SaukJ.J., Coletta R.D., Histomorphometric characteristics and expression of epidermal growth factor and its receptor by epithelial cells of normal gingiva and hereditary gingival fibromatosis,J.Periodontal Res.,2003.

Baniță M., Deva V.(2006) Organul Dentar, Editura Alma,Craiova:68-78,96-102.

Barros S.P.,Merzel J., de Araújo V.C., de Almeida O.P., Bozzo L., Ultrastructural aspects of connective tissue in hereditary gingival fibromatosis oral surg,Oral Med,oral Pathol,Oral Radiol,Endod,92:78-82 2001.

Bartold P.M ,Narayanan A.S., Molecular and cell biology of healthy and diseased periodontal tissues, Periodontol 2000 vol.40, 29-49, 2006.

Batista A.C., Rodini C.O., Lara V.S., Quantification of mast cells in different stages of human periodontal disease. Oral Dis. Jul;11(4):249-54. 2005.

Borda A. (2008) Curs de Histologie Vol.2, Targu Mureș, 46-47, 52-53.

Belazi M., Thomopoulos G.N., Markopoulos A.K., Papanayotou P., Cyclosporin-induced gingival hyperplasia: an ultrastructural study of the oral epithelial prickle cells., J Submicrosc CytolPathol. Oct;25(4):591-601., 1993.

Black S.A. Jr, Trackman P.C., Transforming growth factor-beta1 (TGFbeta1) stimulates connective tissue growth factor (CCN2/CTGF) expression in human gingival fibroblasts through a RhoA-independent, Rac1/Cdc42-dependent mechanism: statins with forskolin block TGFbeta1-induced CCN2/CTGF expression J Biol Chem. Apr 18;283(16):10835-47. doi: 10.1074/jbc.M710363200. 2008.

Casavecchia P., Uzel M.I. ,Kantarci A. ,Hasturk H. ,Dibart S., Hart T.C., Trackman P.C., E Van Dyke T., Hereditary gingival fibromatosis associated with generalized aggressive periodontitis:a case report,J.Periodontal, 2004.

Cekmez F.,Pirgon O.,TanjuI.A.,Idiopathic gingival hyperplasia, Int.J. Biomed Sci.,5(2):198-200,2009.

Chen J.T., Wang C.Y., Chen M.H., Curcumin inhibits TGF-BETA1- induced connective tissue growth factor expression through the interruption of Smad2 signaling in human gingival fibroblast, J Formos Med Assoc. Jan 13, 2018.

Coletta R.D.., Almeida O.P., Graner E., Page R.C., Bozzo L., Differential proliferation of fibroblasts cultured from hereditary gingival fibromatosis and normal gingival, J Periodontal Res. Nov;33(8):469-75,1998.

Coletta R.D., Almeida O.P., GranerE., Page R.C., Bozzo L.,Differential proliferation of fibroblasts cultured from hereditary gingival fibromatosis and normal gingiva,J. Periodontal Res.33:469-75,2009.

Crăițoiu Ș., Crăițoiu M.(1995) Histologia Cavitații Bucale, Editura Sitech, Craiova,179-181, 143-144.

Damasceno L.S.,Gonçalves F.daS.,Costa e Silva, E.Zenóbio E.G.,Souza PE, Horta M.C., Stromal myofibroblasts in focal reactive overgrowths of the gingival, Braz.Oral Res.26(4):373-7. Epub,2012.

De Angelo S., Murphy J., Claman L., Kalmar J., Leblebicioglu B., Hereditary gingival fibromatosis: a review.Compendium,28(3):138-144.,2007.

Desmoulière A., Chaponnier C., Gabbiani G., Tissue repair, contraction, and the myofibroblast. Review. Wound Repair Regen. Jan-Feb;13(1):7-12, 2005.

Di Girolamo N., Wakefield D., In vitro and in vivo expression of interstitial collagenase/MMP-1 by human mast cells., Dev Immunol.;7(2-4):131-42, 2000.

Doufexi A., Mina M., Ioannidou E., Gingival overgrowth in children: epidemiology, pathogenesis, and complications. A literature review. J Periodontol. Jan;76(1):3-10, 2005.

Drăghici Emma, Ștefania Crăițoiu, Veronica Mercuț, Monica Scrieciu, Sanda Mihaela Popescu, Oana Andreea Diaconu, Bogdan Oprea, Roxana Maria Pascu, Monica Mihaeala Crăițoiu (2016), “Local cause of gingival overgrowth. Clinical and histological study “,Rom J Morphol Embryol 2016, 57(2):427–435.

Dumitriu H.T.(2009) Parodontologie. Editura Viata Medicală Românească București, 39-58.

Douzgou S., Dallapicolla B., The gingival Fibromatoses, www. intechopen.com, 2011.

Eyden B., Curry A., Wang G., Stromal cells in the human gut show ultrastructural features of fibroblasts and smooth muscle cells but not myofibroblasts. J Cell Mol Med. 2011 Jul;15(7):1483-91. doi: 10.1111/j.1582-4934.2010.01132.x.Epub Jul 21, 2010.

Florescu M., Simionescu C., Mărgăritescu Cl., Anatomie patologică general și sistemică, Ed. Medicală Universitară, Craiova, 2005.

Foster B.L. (2012) Methods for Studying Tooth Root Cementum by Light Microscopy, Int J Oral Sci,Sep;4(3):119-28.

Fraccarollo D., Galuppo P., Bauersachs J., Ertl G Collagen accumulation after myocardial infarction: effects of ETA receptor blockade and implications for early remodeling., Cardiovasc Res. Jun;54(3):559-67. 2002.

Guarino M., Tosoni A., Nebuloni M., Direct contribution of epithelium to organ fibrosis: epithelial-mesenchymal transition. Hum Pathol. 2009 Oct;40(10):1365-76. doi: 10.1016/j.humpath.2009.02.020. Aug 19. Epub, 2009.

Kalluri R., Neilson E.G., Epithelial-mesenchymal transition and its implications for fibrosis, J.Clin.Invest.112(12):1776–1784, 2003.

Kantarci A., Augustin P., Firatli E., Sheff M.C., Hasturk H., Graves D.T., Trackman P.C., Apoptosis in gingival overgrowth tissues., Dent Res. Sep;86(9):888-92., 2007.

Kantarci A., Nseir Z., Kim Y.S., Sume S.S., Trackman P.C., Loss of basement membrane integrity in human gingival overgrowth. J Dent Res. 2011 Jul;90(7):887-93. doi: 10.1177/0022034511404703. Apr 11.Epub, 2011.

Khan U., Mustafa S., Saleem Z., Azam A., Hereditary Gingival Fibromatosis , Diagnosis and treatment, Pakistan Oral & Dental journal, Vol 32, nr.2, Aug., 2012.

Iliescu A. (2014) Tratat de Endodonție vol.2,Editura Medicală, București, 522-523.

Lăzărescu F. (2013) Incursiune in Estetica Dentară București , pag:62-63.

Leask A., Abraham D.J., The role of connective tissue growth factor, a multifunctional matricellular protein, in fibroblast biology, Biochem Cell Biol, 81(6):355-363, 2003.

Martelli-Junior H., Lemos D.P., Silva C.O., Graner E., Coletta R.D., Hereditary gingival fibromatosis: report of a five-generation family using cellular proliferation analysis., Periodontol. Dec;76(12):2299-305,2005.

Meng L., Huang M., Ye X., Fan M., Bian Z., Increased expression of collagen prolyl 4-hydroxylases in Chinese patients with hereditary gingival fibromatosis., Arch Oral Biol. 2007 Dec;52(12):1209-14. Epub Sep 6, 2007.

Masatoshi Kakota, Jun-ichi Kido, Yasuo Shinohara, Toshihiko Nagata (2015) Drug-Induced Gingival Overgrowth – a Review, Biol. Pharm. Bull28(10) 1817-1821.

Mogoantă Laurențiu., Bold Adriana., Mateescu Olivia (1998) Histologie Volumul 1. Editura Info, Craiova, 41-42.

Nan Jiang, Weihua Guo, Mo Chen, Ying Zheng, Jian Zhou, Sahng Gyoon Kim, Mildred C. Embree, Karen Songhee Song, Heloisa F. Marao and Jeremy J. Mao (2016) Periodontal Ligament and Alveolar Bone in Health and Adaptaion: Tooth Movement,Front Oral Biol. 2016; 18: 1–8.

Nanci A.,Ten cate’s oral Histology,Development,structure and function, Sixth,Mosby, 2003.

Ohuchi N., Koike K., Sano M., Kusama T., Kizawa Y., Hayashi K., Taniguchi Y., Ohsawa M., Iwamoto K., Murakami H., Proliferative effects of angiotensin II and endothelin-1 on guinea pig gingival fibroblast cells in culture., Comp BiochemPhysiol C Toxicol Pharmacol. ., Aug;132(4):451-60, 2002.

Onisei D. (2012) Parodontologie, Timișoara,pag 17-18.

Pedro J. Almiñana-Pastor, Pedro J. Buitrago-Vera, Francisco M. Alpiste-Illueca, Montserrat Catalá-Pizarro (2017) Hereditary gingival fibromatosis: Characteristics and treatment approach, J Clin Exp Dent. 2017 Apr; 9(4): e599–e602.

Rizwan S., Gingival Fibromatosis with Chronic Periodontitis – A rare Case report, IeSME, 3 (2), :24-27, 2009.

Serini G, Gabbiani G., Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation, Exp Cell Res. Aug 1;250(2):273-83., 1999.

Subramani T., Rathnavelu V., Yeap S.K., Alitheen N.B., Influence of mast cells in drug-induced gingival overgrowth., Mediators Inflamm. 2013;2013:275172. doi: 10.1155/2013/275172. Epub Jan 28, 2013.

Sume S.S., Kantarci A., Lee A., Hasturk H., Trackman P.C., Epithelial to mesenchymal transition in gingival overgrowth, Am J Pathol, 177(1):208-218, 2010.

Șurlin P. (2011) Parodontologie vol. 1, Editura Aius, Craiova,25-26, 44-45, 96-99.

Surpățeanu M. (2013), Teza de Doctorat “Studiu clinic și morfologic al hipercreșterii gingivale fibrotice”.

Tang W.W., Van G.Y., Qi M., Myofibroblast and alpha 1 (III) collagen expression in experimental tubulointerstitial nephritis. Kidney Int. Mar;51(3):926-31, 1997.

Tomasek J.J., Gabbiani G., Hinz B., Chaponnier C., Brown R.A.Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nat Rev Mol Cell Biol. May;3(5):349-63, 2002.

Zhao N., Foster B.L., Bonewald L.F. (2016) The Cementocyte – An Osteocyte Relative, J Dent Res Jul;95(7):734-41.

Waterhouse J.P, Squier C.A. (1997) The Langerhans cell in human gingival epithelium, Pages 341-346, IN5-IN6, 347-348,IN7.