umanității de a conserva dieferite materii biologice exist ă încă din antichitate. Răcirea artificială face parte din preocupările speciei noastre… [607798]

Dorința

umanității de a conserva dieferite materii biologice exist
ă

încă din antichitate.

Răcirea artificială
face parte din preocupările speciei noastre pentru a crea condiții de viață mai bune.
[1]

Conservarea
diferitelor materii biologice, datează din timpuri străvec
hi, având în vedere că au fost găsite
corpuri de
animale (în special

de mamuți
)

perfect păstrate
,

în zonele arctice.
[2]

În China antică,
începând cu
secolul al XI
–
lea, înaintea erei noastre,
în perioada

rece a anului, localnicii adunau zăpadă
și gheață p
e
care o depozitau în pivni
țe. Aceasta era ulterior utilizată,
în

perioada caldă a anului pentru răcirea
spa
țiilor și alimentelor
[1]

. Procedee similare mai există eviden
țiate și în Egiptul antic ( aproximativ 2500
înaintea erei noastre),
în
India sau
în

perioada existen
ței Imperiului Roman.

Dincolo de aceste descoperiri timpurii
și rudimentare de utilizare a frigului artifcial
în scopul
folosir
ii

lui
în diferite ramuri ale confortului
, prin diferite procedee foarte simple, este oportun de men
ționat că
adevăratul avânt al răcirii artificiale a

fost
realizat
odată cu descoperirea amestecurilor frigorifice în
secolele XVI
–

XVII
[1]

și a
principiilor termodinamicii

în secolul al XIX
–
lea.

Din acest moment industria frigului a cunoscut o evolu
ție rapidă, ajung
ând până la nivelul cunoscut de
noi în momentul existen
ței noastre. Au fost o sumedenie de de
scoperiri din care merită să men
ționăm
unele ca descoperirea instala
țiilor frigorifice cu compresie mecanică de către Jacob Perkins în 1834
numită
“
Apparatus and means for producing ice, and in cooling fluids
”
[3]

sau
descoperirea frigiderului
casnic de către Fred W. Wolf în anul 1913
, numită “
Refrigerating aparatus
” cunoscut
vremii
ca
și
“
Domelre
”

[4]

Ma
joritatea procedeelor de răcire utilizate în toate industriile ( chimic, naval, alimentar, confort etc.)
sunt procedee de răcire care se
desfă
ș
oară

în regim izobar.

Într
–
un proces izobar considerăm că
presiunea la care se petrece transformarea este constan
tă. În termeni simpli, modificarea presiunii, în
cazul unui schimb de cădură
,

∆

=
0

. În acest caz sistemul se încălze
ște, acumulează energie, volumul
ecestuia expandând; iar în cazul în care sistemul cedează căldură, volumul acestuia se contractă.
Dacă
ne

referim prin prisma principiului I al termodinamicii, ecua
ția noastră devine:

=
∆

+

,

W
–

lucrul mecanic

U
–

energia internă

Q
–

căldura

Principala limitare al unui astfel de sistem este că în momentul în care temperatura scade sub 0 grade

Celsius, materialul biologic care este conservat cu ajutorul acestor echipamente înghea
ță. Prin înghețare
apar distrugeri celulare ireversibile care fac ca acest proces să fie unidirec
țional prin prisma p
osibilită
ții
refolosirii acest
eia

la proprietă
țile
ini
țiale.

[5]

Un proces care se desfă
șoară în regim izocoric sau sub altă denumire, la volum constant, este un

proces
în timpul căruia sistemul studiat este la un volum, teroretic, nedeformabil. În cazul unui astfel de proces,
cel mai simplu este să ne închipuim că avem un container închis ermetic, pe care îl răcim sau îl încălzim.
Este evident că va exista transf
er de căldură între mediul exterior si acest container, însă schimbările
fizice ale con
ținutului acestuia sunt limitate de volumul constant al acestuia.

=

∆

,

W
–

lucrul mecanic

P

–

presiunea

V
–

Volumul

După cum se poate observa din formula de mai sus, în cazul unui proces izocoric, lucrul mecanic al
sistemului
este
0, singura diferen
ță în cazul
tra
ns
ferului de căldură

poate fi dată doar de varia
ția de
presiune din interior. Dacă trasăm procesul într
–
o di
agramă de tipul presiune
–

volum, acesta ar arăta în
felul următor:

Din punct de vedere
al defini
ției cuvântului
“izocor” sau
în engleză
“isochor” acesta înseamnă “ o linie
care reprezint
ă varia
ția de presiune în funcție de temperatură când volumul subs
tan
ței stud
i
ate este
constant
”
[
6]

.

Acesta

provine din greacă
și este derivat din
ἴ
σος (
isos
) însemnând “egal”
ș
i
χώρα
(
kh
ṓ
ra
) care înseamnă
“sp
a
țiu
”.

Cuvântul mai este folosit cu alte în
țelesuri specifice în genetică
“isochore” unde însemană o zonă mare de
ADN

cu proprietă
ți specifice
[7]

sau în geologie
“iscochore
map”, unde
înseamnă

un contur reprezentând puncte, care specifică grosimea verticală a straturilor.
[8]

Procedee tehnice care au func
ționat pe baza de trans
f
er de căldură în regim izocoric au fost studiate
amânun
țit odată cu descoperirea principiilor termodinamicii.

Aceste cercetări au avut l
a bază, în special fenomele specifice care apar odată cu încălzirea fluidului care
e
ste

prezent într
–
un recipient cu volum constant.

Răcirea acestora a fost studiată în primă etapă mai pu
țin, cercetările timpurii concentrându
–
se, în special
pe studiul
prezervării diferitelor materii biologice în regim izobar cu adăugarea diferitelor tipuri de
crioprezervan
ți în etape distincte ale studiilor
[9]
, sau a răcirii rapide a lichidelor până la vitrificarea
acestora, pentru a evita înghe
țarea apei din interiorul materiilor biologice studiate.
[10]

Prima
lucrare
notabilă
în care a fost prezentat un studiu
al efectului presiunilor hidrostatice mari
și
diagrama de fază a apei
, a fost publicată în anul 1912.

Tot în această lucrare a fost definit pentru prima
oară
“
punctul triplu al apei
”
, care se află la o temperatură de
–
22
grade Celsius
și la o presiune de 207.5
M
P
a
. Prin această demonstra
ție a fost deschisă oportunitatea studierii prezervării în condiții de presiune
mare, deoarece apa poate exista în stare lichidă
și solidă, în același timp, la o temperatură negativă
.

[11]
[12]
[13]

(Figxx)

Fig. XX
–

Diagrama de fază a apei
după Bridgman (1912)

După cum se poate vedea în diagramă, Bridgman a afirmat că apa poate exista in fază lichidă
și în 5
tipuri de ghea
ță ( ICE I, II, III, IV, V). Diferențele sesizate la tipurile de gheață, sunt date de diferențele de
condi
ții necesare fo
rmării acest
eia

(presiune, temperatură)
.

Studierea comportomantelui diverselor materii biologice în timpul unei răciri în aceste condi
ții au fost
studiate în amănunt
în special în ultimii
5
0 de ani.

Prin observarea comportamentului anom
a
lios
al schimbării
de fază a
apei la înghe
țarea în regim izocor,
în anul 1977

a fost publicat un studiu

de către
Charm, în care au studiat monstre de file de cod
și crab
ro
șu
, care au fost prezervate timp de 36 de zile în acest regim la
–
3 grade Celsius si 24 MPa. După
perioada de conservare, au observat că în cazul în care compară proba prezervată în regim izocor cu una
prezervată în regim izobar, prin prima metodă, reu
șesc să obțină un timp mai lung cu 24 de ore, în care
proba lor nu se alterează ( 7 zile respectiv 6 z
ile)
[14]

Unele din primele
eviden
țe

a tratării acestor aspecte din punct de vedere matematic
–

termodinamic
–
chimic
au fost publicate
începând cu anii

1981. Î
n
acest an a fost
public
ată prima lucrare în care s
–
a
studiat
transferul de căldură

la temperaturi negative (
–
40 grade Celsius). Rezultatele ob
ținute prin
calculele teoretice au fost însă doar estimative
și au fost realizate prin suprapunerea determinărilor
teoretice din interval
ul de temperatură 28
–
120 grade Celsius. Practic func
ția de temperatură presiune a
fost extrapolată, teoretic, pe intervalul de temperatură subzero

0
—
40 grade Celsius
.
[15]

Aspectul
interesant al acestei cercetări a fost faptul că s
–
a demonstrat că există diferen
țe între calculele teoretice
și măsurătorile practice, din
acest punct au pornit studiile, care mai târziu, au dus până la
–
180 grade
Celsius.

În anii
1982
–

198
4
, când J.W. Magee
și R. Kobayashi au studiat comportamentul în regim izocoric, la
temperaturi între 140
și 273.15 [K] pentru
diferite amestecuri de ga
ze.

În lucrările acestora au subliniat
importan
ța studierii comportamentului din punct de vedere P
–
ρ
–
T, pentru solu
ții pure cât și pentru
mixturi ale acestora.

Lucrările acestora pentru


−

[16]

sau
pentru
0
.
2005


+
07995

[17]

au adus îmbunătă
țiri pentru procedurile de transport și lichifere a gaze
lor.

Prin testele realizate
și bazele
de date întocmite de ace
știa
,

au putut fi realizate modele predictive din punct de vedere al
proprietă
ților termodinamice ale mixturilor.

Odată cu aplicarea studiilor în regim izocor pe diferite ramuri ale
științei, a început și studierea
comportametului materiilor biologice la diferetile schimbări cauzate de condi
țiile răcirii în acest regim.

În anul 1988 a fost definit un model matematic
de simulare a comportamentului celulelor în cazul unor
temperaturi foarte scăzute. Această analiză a avut la bază

o metodă termodinamică ireversibilă,
și
totodată a demonstrat că distrugerea celulelor în momentul în care lichidul în care sunt immersate
îng
hea
ță, este cauzată însăși de gheața care se formează în interiorul acestora.
[18]

Un alt studiu interesant a fost publicat în anul 1990, acesta a avut la baza un model fizico
–
chimic
bazat
pe teoria înghe
țării heterogene c
lasice. Metoda a
î
ncercat să estimeze frecven
ța înghețării și era bazată
pe determinări practice. Cu ajutorul acestor metode a putut fi determinat un model termodinamic, care
a func
ționat până la
–
3
5

grade Celsius.
[19]

În acela
și an, un studiu distinct din domeniul
Climatologiei a analizat echilibrul topirii ghe
ții în condiții de
presiune mare
[0
–
2100 BAR]. Pe baza unor date
culese din pr
a
ctică, au fost specificate o serie de ecua
ții
cu ajutorul cărora poate fi calculată
calculată cantitatea de ghea
ță care se topește la diferite seturi de
date. Acest studiu este unul foarte important în dezvoltarea ulterioară a termodinamicii specifice
fenomenelor produse în regim izocor.
[20]

A devenit evident că s
tudiul
comportamentului
lichidelor la presiuni mari
și în regim izocor a luat
amploare

în anul 1998 când
a fost publicată
o

sinteză a cercetărilor făcute în acest
domeniu

de către
Knorr D., Schluetler O.
și Heinz V.
[21]

.

Acestia au def
init pentru prima oară tipurile de prezervare:

–

Pressure
–

assisted freezing : schimbarea de fază are loc la volum constant

–

Pressure
–

shift freezing : schimbarea de fază are loc din cauza unei schimbări de presiune

–

Pressure
–

induced freezing : schimbarea

de fază este ini
țiată prin modificare de presiune și este
continuată la volum constant.

În figura
XX

de mai jos putem observa transpunerea teoriei lor pe diagrama de fază a apei.

Figura XX

–

(acdf)
–

schimbarea de fază are loc din cauza unei modificări de presiune; (abef)
–

schimbarea de fază are loc la volum constant; (fdca)
–

schimbarea de fază (topire) demarează prin

modificare de presiune
și continuă la volum constant.

Toate aceste stu
dii, au culminat cu lucrarea
“
The termodinamic principles of isochoric preservation” ,
publicat în anul 2005
.
[22]

Acea
stă lucrare a propus în literatura de specialitate principiile

termodinamice ale cryoprezervării în regim izocor. Prin modelul matematic
explicita

prin aceasta, putem
calcula cantitatea de ghea
ță care se formează într
–
un sistem cu volum constant,
și pentru apă și pentru
diferite amestecuri

de ap
ă cu alte solu
ții
. Datele teoretice sunt sus
ținute de o serie de determinări
practice pentru demonstrarea
veridicită
ții metodelor prezentate.

În această lucrare sunt definite
și o serie de principii

fundamentale ale procesului de crioprezervare
:

–

Se petrece într
–
un sistem termodinamic în două faze, în care apa
și gheața coexistă și sunt în
echilibru termodinam
ic

–

Într
–
un sistem termodinamic în două faze, aflat în echilibru, temperatura
și presiunea sunt
interdependente

–

Într
–
un sistem izocor volumul este constant

–

Într
–
un sistem izocor în două faze, aflat la o anumită presiune
și temperatură, singura variabilă
care se poate ajusta, pentru a fi sistemul în echilibru, este
“
calitatea
”

sistemului, procentul
relativ de ghea
ță și apă din sistem

–

T
emperatura

sau presiunea
și calitatea la fiecare temperatură
sau
presiune specifică

complet

procesul de crioprezervare izocoră.

Pe lângă acestea, mai putem adăuga unele
concluzii recente:

–

Putem avea o cantitate predictibilă de lichid
și gheață în sistemul izocoric,
în func
ție de lichidul
(prezervantul) pe care îl folosim
. Cu cât scădem temperatura, teoretic, cantitatea de cristale vor
cre
ște și este important de studiat la fiecare tip de lichid de prezervare, care este temperatura
optimă la care va trebui să o răcim
astfel încît să avem presiune cât mai mică
și cristale de
ghea
ță cât mai puține.

[23]

–

Putem ajunge în situa
ția de a avea lichid suprarăcit, fără a avea cristale de gheață în compoziție.
Unele solu
ții sun
t foarte stabile din punct de vedere al perturbărilor microscopice

și nucleația
efectiv nu are loc în timpul răcirii, în acest caz s
e pot dezvolta protocoale de transport, fără

a
apărea

cristalizare
a
, foarte stabile
și sigure.
[24]

–

În cazul unor
amestecuri de lichide (apă+prezervan
ți), putem ajunge la vitrificare, fără a se
forma cristale de ghea
ță în timpul
transformării. Putem, totodată să scădem foarte mult
presiunea la care are loc această transformare, prin amestecarea optimă a solu
țiilor
componente.
[25]

După definirea principiilor, au fost publicate o

serie de lucrări care analizau mult mai detaliat diferite
faze ale acestui fenomen. În lucrarea
“Analyzis o
f

isochoric subcooling”, din anul 2006, a fost prezentată
oportunitatea folosirii cioprezervării izocorice pentru
o posibilă prezervare a
diferite
lo
r

organe.
[26]

Într
–
o altă cercetare, distinctă fa
ță de
cea
anterioara,
în acela
și an, numită “
PRESSURE
–
ASSISTED
FREEZING AND THAWING: PRINCIPLES AND POTENTIAL APPLICATIONS
”, a fo
st stabilită a concluzie
asemănăto
a
re,
și anume viabilitatea folosirii unei astfel de metode pentru prezervarea embrionilor,
organelor sau a celulelor.
[27]

Pen
tru a continua această discu
ție, vom menționa mecanismele de distrugere a țesuturilor

la prezervare
în condi
ții izobare
.
Sângele nu poate să con
țină nici un fel de soluții

prezervante

deorece în momentul în
care acesta înghea
ță, respinge orice fel de criop
rezervan
ți care se concentrează în jurul celulelor, acest

aspect

duc
â
nd la :

1.

Deshidratarea celulelor

2.

Precipitarea solu
ției

3.

Schimbări ale PH
–
ului

4.

Distrugeri chimice.

Limitările date de utilizarea crioprezervan
ților în condiții izobare sunt și ele de natură
negativă, făcând
din prezervarea izocoră o metodă viabilă:

1.

Organele de dimensiuni mari, nu se pot prezerva deoarece transferul de căldură de la lichid
la organ durează foarte mult timp

2.

Crioprezervan
ții pot fi, în sine, periculoși pentru organele ce se dore
ș
te a fi conservate.

Aceste aspecte pot fi evitate în cazul în care se utilizează prezervarea în regim izocoric.
[28]

Ulterior au apărut o serie de studii, care au analizat comportamentul
mai multor materii bioligice în
regim izocor:

–
LE
–
AM LUAT ALEATORIU

–

le pun in orine dupa ce le scriu pe toate.

2016
–

organism multicelular (
Caenorhabditis elegans)
; concluzia : au fost publicate primele eviden
țe
care au sugerat că un organism viu, poate

supravie
țui unei conservări în regim izocor fără a
se adăuga
crioprotectan
ți.
[29]

(Fig XX.)

Fig XX se scrie pe urma
[29]

20
17

–

mu
șchi de pește
,

Tilapia (Oreochromis aureus)
; concluzia: p
rin compara
ția unei prezervări
izobare cu una izocoră, a fost arătat că în urma
conservării

izocore nu au existat deshidratări celulare iar
morfologia
țesuturilor a rămas intactă, spre deosebire de prezervarea izobară
[5]

2017
–

cartofi
;
concluzia:
A fost arătat că cartofii prezerva
ți la
–
5 grade Celsius, în condi
ții izocore nu au
avut pierderi în greutate
substan
țiale și culoarea acestora

nu a suferit schimbări de culoare notabile.
(din punct de vedere al enzimatic). Spre deosebire, cartofii prezerva
ți în condiții izobare

la
–
5 grade
Celsius
, au avut pierderi majore de greutate, iar culoarea acestor
a s
–
a
transforamat în maroniu. Din
analiza mic
r
orscopică a reie
șit că integritatea structurală a cartofilor
nu a fost modificată în timpul
cons
e
rvării izocore, fapt ce nu poate fi afirmat în cazul prezervării izobare.
[30]

(Fig xx)

Fi
g.
xx
[30]

2018
–

Escherichia coli
; concluzia:

După 12 ore de prezervare izocoră la
–
15 grade Celsius
și
–
20 grade
Celsius, popula
ția de E.Coli studiată a fost redusă de
cu 99.9%
. Prin compara
ție,

în cazul în care a fost
utilizată înghe
țarea izobară, populația a fos
t redusă la 90%. Acest studiu a arătat că
o
combina
ți
e

de
presiune mare
și temperatură scăzută
, în regim izocor, în apropiere de punctul triplu a apei poate fi mai
dezavantajoasă pentru materialul biologic fa
ță de combinația de concentrație mare,
temperatură
scăzută
și cristalizare
–

elemente specifice răcirii izobare
–
[31]

2018
–

inimi de
șobolan; concluzia:

după prezervarea în solu
ție UW, la
–
4 grade Celsius, în regim izocor,
inimile au avut proprietă
ți similiare
(
Fig XX A)
cu cele prezervate în regim izobar. Compara
ția a fost
realizată prin examen histopatologic folosind solu
ție perfuzabilă Langerdorff . Tot
odată, la inimile
prezervate în regim izocor a fost arătat că edemele intersti
țiale au
ocupat o suprafa
ță mult mai mică
fa
ță
de cele prezervate în regim izobar. Aceea
și cercetare a fost realizată și la temperaturi mai scăzute (
–
6
grade Celsius,
–

8 grade C
elsius). Ca urmare a acestor

valori
au fost raportate deteriorări masive ale
inimilor, a
șadar concluzia finală a fost că acest tip de prezervare poate fi viabil până la o temperatură de
–
4 grade Celsius.
[23
]

Fig XX completezi pe urmă

2018
–

celule mamifere (MDCK); concluzia:
Celulele

au fost

prezervate în solu
ție salină tamponată cu
fosfat
, în regim izocor,
și au fost studiate la
–
10 grade Celsius,
–
15 grade Celsius
și
–
20 grade Celsius, pe
intervale de

60
și 120 minute. Prin comparație, a fost stabilit numărul de celule vii/moarte utilizând
testul vitalită
ții celulare și citometria de flux.

Testele au arătat că cca. 60% din celule au supravie
țuit la o
temperatură de
–
10 grade Ceslsius
și 60 de minute; t
otodată la aceea
și temperatură și un timp de 120
minute, au supravie
țuit doar 18% din acestea.
[23]

2019
–

cire
șe
; concluzia: cire
șele prezervate la
–
4 grade Celsius, în regim izocor au avut calitatea
ș
i
proprietă
țile nutriționale similare cu cele proaspete . Prin prezervarea izocoră a fost păstrată textura
cire
șelor iar pierderea în greutate a fost minimală. Totodată, culoarea acestora era asemănătoare cu
culoarea cire
șelor proaspete și datorită faptulu
i că prezervarea a fost realizată fără cristalizare, a fost
păstrat în interiorul acestora acidul ascorbic, compozi
ția fenolică
ș
i activitatea antioxidantă . Acestea se
datoarează în special faptului că structura cellulară a cire
șelor nu a fost ditrusă din

cauza cristalizării.

Calitatea fructelor prezervate astfel, este net superioară fa
ță de calitatea fructelor prezervate în regim
izobar.
[32]

201
9
–

celule pancreatice; concluzia:

rata
de recuperare
și viabilitatea celulelor prezervate cu ajutorul
acestei metode

(nu au fost utiliza
ți agenți osmoti
ci de crioprezervare)

este net superioară fa
ță de cea
izobară. În figura de maj jos se poate observa acest

a
s
pect
[33]

:

FigXX:

Compara
ția rezultatelor studiului
, cu
investiga
ții anterioare, cu
acela
și interval de timp raportat la
la viabilitatea celulelor demonstrată cu ajutorul luminii fluore
șcente.

2019
–

spanac

(
Spinacia oleracea
); concluzia: Au fost comparate proprietă
țile spanacului prezervat

cu
cel proaspăt
după trei metode diferite :

1.

Dezghe
țare după prezervare izocoră la
–
4 grade Celsius

2.

Dezghe
țare după prezervare izobară la
–
4 grade Celsius

3.

Dezghe
țare a spanacului congelat ce se găsește în comerț.

Spanacul
conservat

în condi
ții izobare a pierdut din greutate și textură după ce a fost

dezghe
țat. Valorile
nutri
ționale ale acestuia, au fost și ele diminuate din cauza metodei de prezrvare.

Spanacul p
ăstrat

în condi
ții izocore și
–
a păstrat integritatea celulară
și turgeș
ț
en
ța. După dezghețare,
proprietă
țile acestuia au rămas similare cu c
ele ale spanacului proaspăt.

Prin
conservarea

izocoră, au
fost păstrate mult mai bine va
l
orile nutri
ționale ale acestuia în raport cu
conservarea
izobară
, acest
aspect poate fi văzut
și în tabelul de mai jos (tab xx)

[34]

Tab XX, se completează pe urmă

2020
–

cartofi minimal procesa
ți (
S.

Tuberosum
)

–

concluzia:
Au fost comparate calită
țile
(microstructura, textura
și culoarea); valorile nutriționale (acidul ascorbic, conținutul fenolic și
capacitatea antioxidantă)
și activitatea oxidului de poliphenol. Probele prezevate în regim izocoric (
–
3
grade Celsius / 30 Mp
a) au fost comparate cu probele păstrate în regim izobar (
–

3 grade Celsius/0.1
MPa)
și răcire rapidă la
–
20 grade Celsius urmată de păstrare timp de 4 săptămâni. Probele păstrate în
regim izocor au avut o pierdere de umiditate
și o scădere în volum mai m
ică, textura
și microstructura au
fost păstrate mai bine în raport cu probele păstrate cu celelalte tipuri de prezervare din studiu. Toate
probele prezervate au
prezentat cre
șteri în conținutul fenolic total și capacitatea antioxidantă și scădere
în con
țin
utul de acid ascorbic.

Toate metodele au cauzat colorarea în maroniu al probelor, în cazul
prezervării izocore, observîndu
–
se, totu
și, o întîrziere mai mare de o săptămână.

[35]
(Fig XX)

Fig. XX
[35]

2020
–
file de pe
ște Tilapia (

Oreochromis aureus)

–

concluzia :
Prezervarea izocoră a fost compar
ată cu
răcirea
, super
–
răcirea
și înghețarea
. Prezervarea izocoră a arătat degradări colorimetrice similare cu
răcirea
și
î
nghe
țarea. Conservarea prin toate metodele a condus la obținerea unui file mai moale,
eviden
țiându
–
se, totu
și, prezervarea izocoră pri
n care s
–
a ob
ținut o textură mult mai apropiată cu cea
proaspătp. TBARS
–
ul pentru probele conservate în izocor au fost similare cu cele din pe
ștele proaspăt. La
probele conservate prin răcire, super răcire
și înghețare a fost semnalată o creștere a TBARS
–
u
lui cu 53%,
55% respectiv 34%.

Con
ținutul de Azot volatil (TVB
–
N) a fost de 1.4 ori mai mare în cazul pentru probele
prezervate în izocor spre deosebire de celelalte metode de prezervare
, prin care acesta a fost mai mare
cu 3.0, 1.9 respectiv 1.3 . La stu
diul microstructural, prin prezervarea izocoră nu au fost raportate
distrugeri celulare.
[36]

Fig. Xxx
[36]

2020
–

Onocitogene de
Listeria
ș
i

Salmonella Typhimurium
; Concluzia : a fost comparată rata de
supravie
țuire a bacteriilor după conservare izocoră și izobară. Au fost examinate și din punc
t de vedere
structural după conservare, cu ajutorul unor microscoape. Studiul a arătat că prezervarea izocoră la
–

15
grade Celsius

și un timp de 24 de ore au redus populația de bacterii până la un nivel care le
–
a făcut
irecuperabile. Studiul a arătat că r
ăcirea în regim izocoric poate contribui cu succes la reducerea
agen
ților patogeni.
[37]

Fix XX

[37]

Toate aceste cercetări
și descoperiri au dus în anul 2020, la recunoașterea conservării izocorice ca o
metodă ce poate fi viabilă în domeniul alimenta
ției
, printre alte metode
de pionerat în domeniu.
Modelul este deja recunoscut, a
șadar vor urma cercetări care să dezvolte și eficientizeze mecanismele
componente ale acestora astfel încât să poată fi utilizată pe o scară mult mai largă.
[38]

Concluzia generală este că prezervarea în regim izocor, fără posibilitatea prezen
ței gheți
i în interiorul
celulelor studiate este în continuare foarte promi
țătoare din perspectiva prelungirii termenului de
valabilitate a diferitelor materii biologice în raport cu metodele tradi
ționale de prezervare.

Ref 9 din art 14 gaby

https://www.tandfonlin
e.com/doi/abs/10.1081/FRI
–
100102319?mobileUi=0&journalCode=lfri20

Crioprezervantii !

DE AICI DE CONTINUAT!!

:How cryoproectants work? Articol de bagat. E la rubinsky :

Crioprezervan
ții au revoluționat modul în care privim prezervarea. Faptul că putem
conserva o
multitudine de organisme procariotice
și eucariotice și le putem utiliza ulterior, după ce le
–
am răcit la o
temperatură de
–
196 grade Celsius a fost un pas uria
ș pentru multe ramuri ale științei. Putem enumera
aici: biologia
,

chimia

sau medicina
.

Acest lucru
nu ar fi însă posibil, fără prezen
ța unor crioprez
e
rvan
ți.
Acestea sunt solu
ții apoase, care în amestec cu apa, pot influența temperatura la care aceasta
cristalizează.

Cea mai bună defini
ție a crioprotectanților a fost publicată în anul 1974
, de către Armand Karow : „Orice
aditiv ce poate fi adăugat celulelor înainte de a fi prezervate prin înghe
țare în acest fel mărindu
–
se rata
de supravie
țuire a acestora după dezghețare față de situația în care nu am adăuga nimic”
[39]
[40]
, poate
fi numit crioprotectant.

Crioprezervan
ții sunt folosiți pentru a proteja integritatea membranelor celulelor și interior
ul acestora.
Totodată acestea reduc riscul de distugere ale lipidelor din membrane, proteinelor
și acidului
nucleic.
[41]

Modul cum func
ționează crioprezervanții este foarte variat, acestea putând
func
ționa ca soluții
intracelulare sau extracelulare. Toate au însă proprietatea de a fi foarte hidrofilice
și pot forma legături
foarte strânse cu hidrog
enul din apă. Aceasta le permite să întârzie foarte mult formarea ghe
ții, chiar
dacă sunt îndeplinite
condi
țiile de temperatură și presiunile necesare (
pentru solven
ți
i studia
ți (care pot
fi simpli sau compu
și)
) în condi
ții
atmosferice normale
.

Amestecurile sunt formate din 2 sau mai multe substan
țe de bază și acestea se obțin în urma unor
fenomene fizice.

Fazele se dispersează între ele însă legăturile chimice nu se rup. Proprietă
țile chimice a
a componentelor rămân neschimbate, însă proprietă
țile fizice ale amestecului, diferă, în general față de
proprietă
țile fizice ale componentelor individuale.
[42]

Avem un articol cerut de la Gaby, pe care tot
o citeaza Preciado. Si pe urma Preciado.

DESCCIERE CRIOPREZERVANTI DIN WORLD

Primele concepte
de crioprezervare au apărut la sf
â
r
șitul secolului al XIX
–
lea

când
Hans Molisch

a studiat
înghe
țarea plantelor cu un criomicroscop având o tehnologie incipientă
.
Acesta a ajuns la concluzia că

compozi
ția și concentrația de substanțe din citoplazma plantelor au un rol definitor în rata de
supravie
țuire a acestora după înghețare.
[43]

În discu
țiile avute
de H. Molisch cu contemporanul său,
Hermann
Muller
–
Thurgau
, au concluzionat că
expunerea plantelor la temperaturi negative
, duce la o acumulare de zahăruri în acestea, dar nu au făcut
o legătură înte acest aspect
și faptul că zahărul ar putea funcționa ca un inhibitor al cristalizării.
[44]

Importan
ța și recunoașterea zahărurilor ca și crioprotectanți a fost făcută prima oar
ă în anul 1912, de
către Maximov.
[45]
[46]

În următoarea perioadă au fost realizate mai multe studii prin car
e diverse plante
și insecte au fost
prezervate cu sau fără succes, dar nu au fost identificate rezultate care să dea un imbold domeniului.

Folosirea
cu succes a crioprezervan
ților a început din anul 1949 când a fost demonstrat pentru prima
oară benefiiul f
olosirii
glycerolului ca
și crioprotectant. În studiul realizat de Polge, Smith și Parkes pe
materie biologică vie (celule ro
șii) a fost constatate proprietățile benefice ale acestuia.
Munca acestora a
fost continuată
și din cercetările lui Lovelock, în 195
4 au fost publicate
și rezutate pentru DMSO, alături
de alte solu
ții apoase cu masă moleculară mică cum ar fi methanolul sau acetamida.
[47]

Prima sinteză
a protectan
ților studiați în criobiologie, pentru conservarea țesuturilor a fost publicată în
anul 1969 de către
Armand M. Karow, JR. . Este cunoscută ca
și
“lista de 56 a lui Karow”.
În conformitate

cu denumirea acest
eia, lista con
ținea 56 de soluții cu proprietăți care au fost studiate ca și
crioprezervan
ți,
cf tab XX

Compozi
ție

Celule sau
țesut studiat

Referin
țe s
tudii

Acetamide

Erythrocytes, human

Renal cells, human, cultured

Sperm, bovine

Trypanosomes

Heart tissue, chick, embryo

Lovelock (1954)

Vos & Kaalen (1965)

Polge & Soltys (1960)

Polge & Soltys (1960)

Keane (1953)

L
–
Alanine

Bone marrow, mouse

Phan The
Tran & Bender
(1960)

Albumin

Erythrocytes, human

Schreiner & others (1962)

Ammonium acetate

Erythrocytes, human

Meryman (1968)

Chloroform

Heart, dog

Connaughton & Lewis (1961)

Choline

Bone marrow, mouse

Bender & others (1960)

Dextran

Erythrocytes, human

Bricka & Bessis (1955)

deVerdier & others (1965)

Bone marrow, mouse

Bender & others (1960)

Diethylene glycol

Erythrocytes, human

Lovelock (1954)

Renal cells, human, cultured

Vos & Kaalen (1965)

Dimethylacetamide

Erythrocytes

Nash (1962)

Renal cells, human, cultured

Vos &‘Kaaien (1965)

Dimethylformamide

Erythrocytes, human

Nash (1962)

Renal cells, human, cultured

Vos & Kaalen (1965)

Dimethylsulphone

*
Renal cells, human, cultured

Vos & Kaalen (1965)

Dimethylsulphoxide

Blood, bovine

Rapatz & Luyet (1965)

Erythrocytes, human

Huggins (1963)

Lovelock & Bishop (1959)

Leukocytes, human

Bouroncle (1967)

Mitochondria, tomato

Dickinson & others (1967)

Renal cells, human, cultured

Vos &
Kaalen (1965)

Sperm, bovine

Lovelock & Bishop (1959)

Cornea, canine and human

O’Neill & others (1967)

Uterus, guinea
–
pig

Farrant (1965)

Heart, rat

Karow & others (1965)

Erythritol

Erythrocytes, human

Lovelock (1954)

Bone marrow,
mouse

Bender & others (1960)

Ethanol

Erythrocytes, human

Lovelock (1954)

*Renal cells, human, cultured

Vos & Kaalen (1965)

Ethylene glycol

Erythrocytes, human

Lovelock (1954)

Renal cells, human, cultured

Vos & Kaalen (1965)

Bone marrow,

mouse

Bender & others (1960)

Skin, mouse, rat

Taylor & Gernstner (1955)

Formamide

Renal cells, human, cultured

Vos & Kaalen (1965)

*
Erythrocytes, human

Lovelock (1954)

Nash (1962)

*
Heart tissue, chick, embryo

Keane (1953)

Glucose

Blood, bovine

Rapatz & Luyet (1965)

Erythrocytes, human

Lovelock (1954)

Strumia & others (1960)

*Bone marrow, mouse

Bender & others (1960)

Heart tissue, chick embryo

Luyet & Keane (1952)

Renal cells, human, cultured

Vos & Kaalen (1965)

Sperm, bovine

Polge & Soltys (1960)

Trypanosomes

Polge & Soltys (1960)

Glycerol

Blood, bovine

Rapatz & Luyet (1965)

Erythrocytes, human

Lovelock (1954)

Jones & others (1957)

Lovelock & Bishop (1959)

Pert & others (1965)

Sperm, bovine

Polge &

Soltys (1960)

Tryanosomes

Polge & Soltys (1960)

HeLa and L cells

Scherer & Hoogasian (1954)

Renal cells, human, cultured

Vos & Kaalen (1965)

Bone marrow, mouse

Bender & others (1960)

Bone marrow, rabbit

Richards & Persidsky (1961)

Bone marrow, human

Lochte & others (1959)

Skin, mouse, rat

Taylor & Gerstner (1955)

Cornea, rabbit

Capella & others (1965)

Heart, hamster

Smith (1957)

Heart, mouse, embryonic

Conway & others (1957)

Kidney, dog

Halasz & others (1967)

Mitochondria, rat, liver

Greiff & others (1961)

Glycine

Bone marrow, mouse

Phan The Tran & Bender
(1960b)

Hydroxyethyl starch

Erythrocytes, human

Doebbler & Rinfret (1965)

Inositol

Bone marrow, mouse

Bender & others (1960)

Renal cells,
human, cultured

Vos & Kaalen (1965)

Lactose

Blood, human

Rinfret & Doebbler (1960)

Erythrocytes, human

Strumia & others (1960)

Rinfret (1963)

Bone marrow, mouse

Bender & others (1960)

Magnesium chloride

Blood

Rapatz, personal
communication

Heart, rat

Karow & others (1967)

Barner (1968)

Magnesium sulphate

Heart; rat, guinea
–
pig, rabbit,
dog

Karow & others (1967)

Maltose

Blood, human

Rinfret & Doebbler (1960)

Mannitol

Bone marrow, mouse

Bender & others (1960)

Renal cells,
human, cultured

Vos & Kaalen (1965)

Mannose

Renal cells, human, cultured

Vos & Kaalen (1965)

Methanol

Erythrocytes, human

Lovelock (1954)

*Bone marrow, mouse

Bender & others (1960)

*Sperm, bovine

Polge & Soltys (1960)

*Trypanosomes

Polge & Soltys (1960)

Renal cells, human, cultured

Vos & Kaalen .(1965I)

Methylacetamide

Erythrocytes

Nash (1962)

Methylformamide

Erythrocytes, human

Nash (1962)

Methylurea

*Heart tissue, chick, embryo

Keane (1953)

Monoacetin

Erythrocytes, human

Lovelock (1954)

Renal cells, human, cultured

Vos & Kaalen (1965)

Phenol

*Renal cells, human, cultured

Vos & Kaalen (1965)

Polyethylene glycol

*Erythrocytes, human

Lovelock (1954)

Polyoxyethylene

Erythrocytes, human

Doebbler &
Rinfret (1965)

Polyviny lpyrrolidone

Erythrocytes, human

Bricka & Bessis (1955)

Rinfret (1963)

Doebbler & Rinfret (1965)

Bone marrow, human

Persidsky & others (1962,
1965)

Cartilage, human

Braid & others (1966)

L
–
Proline

Bone marrow, mouse

Phan
The Tran & Bender
(1960b)

Propionamide

*Heart tissue, chick, embryo

Keane (1953)

Propylene glycol

Erythrocytes, human

Lovelock (1954)

Renal cells, human, cultured

Vos & Kaalen (1965)

Pyridine N
–
oxide

Erythrocytes, human

Nash (1961)

Renal

cells, human, cultured

Vos & Kaalen (1965)

Resorcinol

*Renal cells, human, cultured

Vos & Kaalen (1965)

Ribitol

Bone marrow, mouse

Bender & others (1960)

Ribose

Renal cells, human, cultured

Vos & Kaalen (1965) ’

L
–
Serine

*Bone marrow,
mouse

Phan The Tran & Bender
(1960b)

Sodium bromide

Bone marrow, mouse

Phan The Tran & Bender
(1960a)

Sodium chloride

Erythrocytes, human

Doebbler & Rinfret (1965)

*Renal cells, human, cultured

Vos & Kaalen (1965)

Heart tissue, chick,
embryo

Luyet & Keane (1952)

Sodium iodide

Bone marrow, mouse

Phan The Tran & Bender
(1960a)

Sodium nitrate

Bone marrow, mouse

Phan The Tran & Bender
(1960a)

Sodium nitrite

*Bone marrow, mouse

Phan The Tran & Bender
(1960a)

Sodium sulphate

Bone
marrow, mouse

Phan The Tran & Bender
(1960a)

Sorbitol

Bone marrow, mouse

Bender & others (1960)

Renal cells, human, cultured

Vos & Kaalen (1965)

Sucrose

Blood, bovine

Rapatz & Luyet (1965)

Blood, human

Rinfret & Doebbler (1960)

*Erythrocytes,
human

Lovelock (1954)

Bone marrow, mouse

Bender & others (1960)

Skin, rat

Berggren & others (1966)

Sperm, bovine

Polge & Soltys (1960)

Sperm, bovine

Polge & Soltys (1960)

Trypanosomes

Polge & Soltys (1960)

Urea

*Erythrocytes, human

Nash (1962)

Doebbler & Rinfret (1965)

*Renal cells, human, cultured

Vos & Kaalen (1965)

Heart tissue, chick, embryo

Keane (1953)

L
–
Valine

*Bone marrow, mouse

Phan The Tran & Bender
(1960b)

Xylose

Erythrocytes, human

Lovelock (1954)

Sperm,
bovine

Polge & Soltys (1960)

Trypanosomes

Polge & Soltys (1960)

Triethylene glycol

Erythrocytes, human

Lovelock (1954)

*

Cu precizarea că rata de supravie
țuire este de sub 40%

Tab xx . Protectan
ți pentru uz potențial în crioprezervare în anul
1969
[48]

Un aspect interesant îl reprezintă faptul că din cele 127 de studii raportate cu cele 56 de solu
ții cu
poten
țial crioprezervant

s
–
au eviden
țiat încă din faze incipiente ale studiilor

: Glicerolul (15 studii);
Dimetilsulfoxidul
–

DMSO
–

(9 studii); Glucoza (7 studii); Zaharoza (8 studii); Metanolul (5 studii);

În anul 1986 a fost publicată lucrare
a
“Mechanism of cryoprotectant action” de c
ătre Ashwood
–
Smith
MJ.

În aceasta
lucrare
, pe baza studiilor dintre anii 1969
și 1986, au rămas 20 și ceva de soluții
crioprezervante
eficace.
[49]

“Lista celor 56” al lui Karow a r
ămas, însă, încă viabilă în alte ramuri ale
științ
ei, cum ar fi acvacultura.

În lucrarea publicată în anul 1996
“
Cryopreservation

of

finfish

and

shellfish sperms
”

de către
Nai Hsien
–
Chao, se regăsesc
52

de solu
ții crioprezervante, încă studiate în acvacultură.
[50]

Din solu
țiile
crioprezervante prezentate în anul 1969, multe se regăsesc încă în studiu. Tab
XX

Acetamide

Ethylene glycol

Mannose

Serine

L. Alanine

Formamide

Methanol

Sodium bromide

Albumin

Glucose

Methyl
acetamide

Sodium chloride

Ammonium acetate

Glycerol

Methyl
formamide

Sodium iodide

Chloroform

Glycerol
monoacetate

Methyl ureas

Sodium nitrate

Choline

Glycine

Phenol

Sodium

sulphate

Dextrans

Hydroxyethyl
starch

Pluronic polyols

Sorbitol

Diethylene glycol

Inositol

Polyethylene
glycol

Sucrose

Dimethyl acetamide

Lactose

Polyvinyl
pyrrolidone

Triethylene glycol

Dimethyl

formamide

Magnesium
chloride

Praline

Trimethylamine acetate

Dimethyl sulphoxide (DMSO)

Magnesium

sulphate

Propylene
giycol

Urea

Erythritol

Maltose

Pyridine
–
N
–
Oxide

Valine

Ethanol

Mannitol

Ribose

Xylose

Tab XX
–

Solu
ții crioprezervante 1996
–

acvacultură

și alte domenii

[50]

Dintre solu
țiile prezentate, au dovedit eficacitate mare

(raportat la solu
țiile din tabel)
:

Dextransul,
Ethylen glycolul ( raportat la spermatozizi de pe
ște), amidonul de hidroxyetil, metanolul, polyetilen
glycolul, polyvinil pyrrolidona
și sucrosa.

[50]

A
șadar din listă putem să extragem 8 soluții viabile.

În lucrarea
“Cryoprotectants: A review of the actions and applications of

cryoprotective solutes that
modulate cell recovery from ultra
–
low

temperatures”

de
Gloria D.
,
Shangping Wang
,
Barry

J. Fuller

din
anul 2017

au fost sintetizate studii din domeniu.
Au fost raportate urmatoarele ca fiind viabile
[51]
. TAB
X
XX

Alcooluri
și
derivate

Zahăruri
și
Zahăruri
alcoolizate

Polimeri

Sulfoxide
și amide

Amine

Methanol

–

2

Glucose

–

2

Polyethylene glycol (PEG)

–

3

Dimethyl sulfoxide

–

5

Proline

–

3

Ethanol

–

1

Galactose

–

2

Polyvinyl pyrrolidone (PVP)

–

2

Acetamide

–

2

Glutamine

–

2

Glycerol

–

4

Lactose

–

1

Dextrans

–

3

Formamide

–

2

Betaine

–

2

Propylene glycol

–

3

Sucrose

–

1,3

Ficoll

–

3

Dimethyl acetamide

–

1

Propylene glycol
–
3

Trehalose

–

3

Hydroxeythyl starch

–

3

Raf
fi
nose

–

3

Serum proteins (complex mix)

–

3

Mannitol

–

1,2

Milk proteins (complex mix)

–

1,2

Sorbitol

–

1

Peptones

–

1

1
–

Ef
icient pe celule procariotice

2
–

Ef
icient

pe scară redusă
la celul eucariotice

3
–

Pu
țin eficient pe celule eucariotice. De multe ori amestecat.

4
–

Foarte
eficient pe un număr clar definit de celule

5
–

Foarte eficient pe toate tipurile de celul
e

Fig XX
–

Crioprezervan
ți studiați și considerați viabili în anul 2017
[51]

Mai e ultima lista 2021 smecheră.

–

ASTA O LASAM ULTIMA
–

ACUM VEDEM CARACTERISTICELE

DE scris despre toxicitate etc.

Pe urma lista din 2000

Ashwood
–
Smith
si ceva unde sunt scăzute din ele.

(aia de unde ma
i putem
descrie si unele din ele)

Pe urma lista din 2016 (ne inspiram din articolul Cryoprotectants A review of the actions and
applications of pagina 78 unde este un pic de cronologie)

Din rezultatele experimentale ob
ținute în următorii 50 de
ani

–

asta cam pică
, a

fost concluzionat că unii
agen
ți crioprezervanți
au rezultate foarte bune, cum ar fi : Me2SO

(
dimethylsulfoxid
)

, methanol,
ethylene glycol, propilene glycol
, serul sangvin
și serul albumin
. Al
ți agenți crioprezervanți, cum ar fi :
glycerolul, polietilen glicolul, polivinilpirolidona (PVP
–
ul) au rezultate mai

pu
țin scontate. Dacă vorbim
despre eficien
ță, atunci zahărurile, dextranul, hidroxietil amidonul, sorbitolul și laptele sunt cele mai
ineficiente.
[52]

După
permeabilitate, crioprotectan
ții pot fi categorizați în 2 grupe :

Nonpermeabile

–

protectan
ți cu molecule m
ari
[53]
–

(nu pătrund în interiorul celulelor, sunt
extracelulare): zahărulile ( trehalose
ș
i sucroza); amidonul (hydroxyethyl); PVP
–
ul sau polyethulene
oxidul.

Acestea sunt folosite, în principal, în cazul în care procesul de crioprezervare se desfă
șoară foarte rapid.
Aceste solu
ții transformă lichidul în sticlă pe parcursul răcirii. Fluxul de

apă dintre interiorul
și exterior
celulelor va fi întrerupt din această cauză.
[41]

Permeabile

–

protectan
ți cu molecule mici
, în general polimeri
[53]
–

(pătrund în interiorul celulelor, sunt
intracelulare):
DMSO (Dymethilsulfoxid), glycerol, ethylene glycol
, sau propylene glycol.

Acestea sunt folosite, în principal, în cazul în care procesul de crioprezervare se desfă
ș
oară lent. Datorită
acestui aspect este suficient timp ca apa din celule să se evacueze datorită
presiunii osmotice care
conclude cu o

scădere

în volum a celulelor
.
[41]

Descriere a celor mai i
m
portante solu
ții crioprezervante:

Descrierea din articololul cu ele:

Aici mai gasim
aspecte interesante in teza de doctorat al gagicii Preciado de la
pagina 6

Mai sunt cateva articole la prezervan
ți, la mine în folder. Le putem utiliza

Mai sunt si lnkuri in worldul acela

E IMPORTANT ALA LUNG DE LA NBC..

Mai bagam si din articolul de pe researchgate ca e bunisor.

Si după acea categorizare vom baga catego
rizarea de mai jos.

https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry
–
genetics
–
and
–
molecular
–
biology/cryoprotectant

–

din cartea asta băgăm cate
goriile de criopretectan
ți.

Sunt 2

In final bagam articolul din 2021 cu
:

The need for novel cryoprotectants and
cryopreservation protocols

FINAL

Discutie de ce este importan
t sa mergem pe acest drum cu prezervarea, tot

Transplanturi

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0011224015001133?via%3Dihub

Food

Articolul smecher Lui Rubinsky

Daca nu, stergem