Ulcerul Peptic

PARTEA I.

Ulcerul peptic este cea mai răspândită boală a tubului digestiv. Aproximativ 5-10% din populația globului suferă, într-o anumită perioadă a vieții, de ulcer. După un an de la tratamentul ulcerului apar complicații grave la aproximativ 70% din bolnavii cu ulcer duodenal și la aproximativ 30% din bolnavii cu ulcer gastric.

De la descoperirea histaminei în 1907 de către Windaus și Vogt, până la descoperirea receptorilor H1-histaminici și a antihistaminicelor H1 în 1940 de către Ash și Schild, și până la descoperirea receptorilor H2–histaminici în 1972 de către J.V. Black, și a burimamidei ca primul antihistaminic H2 în 1977, numeroasele cercetări au revoluționat teoriile ulcerogenezei precum și terapia antiulceroasă.

Mulți ani dictonul “no acid-no ulcer” a stat la baza farmacoterapiei ulcerului peptic prin neutralizarea sau inhibarea secreției acide gastrice produsă de celula parietală. Așa s-au folosit pe larg blocanții receptorilor M1-muscarinici (pirenzepina), blocanții receptorilor H2-histaminici (cimetidina, ranitidina), inhibitorii H+K+ATP-azei (omeprazolul)). Evoluția permanentă a pieței antiulceroaselor ne arată declinul continuu al cimetidinei, care a avut un succes enorm în anii 70-80 fiind înlocuită de produsele nou aparute, mai performante și lipsite de efecte adverse. Un trend puternic ascendent îl are famotidina urmată de nizatidină, datorată eficacității lor, a lipsiei reacțiilor adverse și a accesibilității lor. Cel mai bine vândut antagonist al receptorilor H2-histaminici continuă să rămână ranitidina, care se situează mai bine în cota de piață, atât față de noile antihistaminice H2 cât și față de inhibitorii pompei de protoni, respectiv omeprazolul. Întrucât între factorii etiologici ai ulcerelor sunt incriminați, pe de o parte, scăderea rezistenței mucoasei gastrice, iar pe de altă parte hipersecreția acidă gastrică, și studiile actuale se bazează pe descoperirea unor noi agenți terapeutici, și a unor noi forme farmaceutice, mai stabile, mai eficiente.

Recente studii predictive computerizate, PASS (Prediction of Activity Spectro for Substance), pentru descoperirea unor noi substanțe antiulceroase arată că, dintr-un număr de aproximativ 135 substanțe nou configurate din punct de vedere al structurii chimice, 44 s-au dovedit a avea acțiune inhibitoare a receptorilor H2-histaminici, doar 32 au avut acțiune inhibitoare a receptorilor M1-muscarinici, respectiv 4 au fost inhibitori de H+K+ATP-ază. Aceste cercetări sunt încurajatoare în ce privește descoperirea unor noi agenți antiulceroși din grupul inhibitorilor de receptori H2 histaminergici care își păstrează în felul acesta actualitatea.

Așa cum se prefigurează prin cercetările recente de prospectare a unor noi antihistaminice H2, această clasă de antiulceroase este una foarte importantă de studiat atât sub aspectul descoperirii unor noi valențe terapeutice cât și sub aspectul studiilor de condiționare a unor noi forme farmaceutice sau a studiilor de stabilitate fizico-chimică a antihistaminicelorH2. Nu în ultimul rând costurile reduse de fabricație fac această clasă medicamentoasă să rămână în vizorul cercetătorilor din întreaga lume și să rămână medicația antiulceroasă cea mai accesibilă terapeutic.

Pe de altă parte, printre cerințele actuale pe care trebuie să le îndeplinească un medicament pentru a putea fi folosit în terapie, este ca acesta să fie stabil în timp. Prin urmare, este necesară urmărirea stabilității formelor dozate a medicamentelor, atât de către producător cât și de către distribuitor, pentru că altfel medicamentele pot să nu mai corespundă scopului pentru care au fost elaborate și nu mai prezinte siguranță pentru bolnavi. Din acest motiv și noi ne-am propus să punem în aplicare noi metode fizico-chimice de analiză a formelor farmaceutice cu antihistaminice H2 în scopul urmăririi stabilității lor în timp.

Cunoscând factorii care afectează stabilitatea medicamentelor devine posibilă adoptarea unor măsuri de prevenire a proceselor de degradare, ceea ce are ca efect stabilizarea lor. Astfel unul din obiectivele acestei teze este descoperirea unor noi formulări farmacetice sau a unor noi combinații chimice care să asigure stabilitatea mărită în timp a antihistaminicelor H2 .

De la sinteza cimetidinei în 1977 și până la sinteza ranitidinei în1978, a nizatidinei în 1983, și în continuare până la introducerea lor pe piața farmaceutică, inhibitorii H2 histaminici au fost și sunt intens studiați pentru optimizarea tehnicilor de fabricație, de conservare și condiționare în forme farmaceutice noi, care să le asigure eficiența maximă. În acest fel introducere recentă pe piață a primei forme farmaceutice de comprimate cu eliberare controlată a nizatidinei, relansează analiza noilor antihistaminice H2 în ce privește studiul biodisponibilității, metabolizării, degradării, stabilității și conservării.

Ne-am propus, de asemenea, ca prin noi modalități de abordare a unor metode de analiză fizico-chimică și enzimatică să realizăm o mai bună cunoaștere a mecanismelor de acțiune a medicației antiulceroase prin antihistaminice H2 .

PARTEA II.

STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII

II.1. MUCOASA GASTRICĂ ȘI SECREȚIA GASTRICĂ ACIDĂ

Cavitatea stomacului este acoperită de mucoasa glandulară care, prin glandele gastrice (cardiale, fundice, pilorice), produce secreția exocrină a stomacului. Glandele cardiale secretă mucus și o substanță amilolitică, glandele fundice secretă majoritatea componenților sucului gastric (acidul clorhidric, factorul intrinsec, pepsinogenii din grupa I, mucusul gastric) și glandele pilorice secretă pepsinogenii din grupa a II-a și mucusul gastric.

La nivelul acestor glande există mai multe tipuri de celule cu funcții diferite:[1]

celula mucoasă superficială, care secretă componentele mucusului (acidul sialic și sulfomucinele), asigură producția de HCO3- de către anhidraza carbonică;

celula zimogenă care secretă pepsinogenii;

celula parietală care este cea mai importantă din punct de vedere morfologic și funcțional.

II.1.1. Celula parietală și secreția acidă

II.1.1.1. Celula parietală are o caracteristică morfologică unică deoarece prin canalele secretorii din zona apicală, comunică cu lumenul glandular și datorită invaginațiilor prevăzute cu microvilozități au posibilitatea ca, în timpul stimulării, să-și mărească suprafața de aproximativ 10 ori decât era în starea bazală.[2]

II.1.1.2. Echipamentul enzimatic al celulei parietale este format din:

ATP-azele de membrană (pompele membranare)- intervin în ultima parte a procesului secretor gastric;

-ATP-aza H+/K+ dependentă, localizată la nivelul membranei apicale, reprezintă de fapt “pompa de ioni de protoni ”, schimbând ionii de H+ cu ionii de K+;

-ATP-aza Na+/K+ dependentă, localizată în membrana bazo–laterală a celulei parietale este implicată în transportul ionilor de Na+, K+ și Cl-.

anhidraza carbonică – este o metaloenzimă cu conținut de Zn care catalizează reversibil reacția de hidratare a bioxidului de carbon,asigurând producția de ioni de H+ pentru formarea acidului clorhidric, iar prin ionii de HCO3 – menține pH-ul intracelular la valori fiziologice (fig. 1.). [1,2,3]

Figura 1. Enzimele și receptorii celulei parietale. Mecanisme de acțiune; Ach-acetilcolina; G-gastrina; H-receptori H2histaminici, M-receptori muscarinici; AC-anhidraza carbonica,

P-receptori prostaglandinici

II.1.1.3. Receptorii celulei parietale și mecanismele producerii secreției gastrice

Mediatorii fiziologici ai secreției gastrice sunt histamina, acetilcolina, gastrina și prostaglandina, și își exercită efectul prin receptorii de membrană localizați la nivelul celulei parietale. Stimularea lor declanșează stimulare de secreție gastrică. Astfel:

stimularea receptorilor (H2) histaminici duce la activarea adenilatciclazei, cu rol, în formarea și acumularea intracelulară de 3,5-AMPc, și la activarea anhidrazei carbonice;

stimularea receptorilor colinergici (M) duce la activarea guanilat-ciclazei,

receptorul gastrinei (G) nu este cunoscut încă;

stimulare receptorilor prostaglandinici (P) determină inhibarea adenilatciclazei, rezultând efectul “citoprotector” al prostaglandinelor.(fig. 2) [2,3,4,5,6]

Se consideră, conform teoriei lui Code, că histamina este mediatorul chimic comun final al acestor secretagogi, sensibilizând celula parietală la efectul celorlalți mediatori (gastrina, acetilcolina). [7]

După o teorie mai nouă, a lui Grossman și Konturek, toți receptorii de la nivelul celulei parietale sunt stimulați specific de mediatorul lor, stimularea unui tip de receptor crescând sensibilitatea celorlalți receptori pentru mediatorul lor specific, prin interacțiuni de tip “amplificator” (fig. 1.). Subtipurile de receptori care mediază aceste interacțiuni nu sunt încă stabilite cu certitudine. [2,8,9]

Mecanismele implicate în producerea secreției gastrice acide la nivelul celulei parietale sunt sintetizate în figura. 1. și în figura 2.[1,10,11]

Figura 2. Efectele mediatorilor fiziologici ai secreției gastrice acide și principalii lor antagoniști

II.2. PROCESELE FIZIOLOGICE

DE PRODUCERE A SECREȚIEI ACIDE GASTRICE

Producerea acidității gastrice se face prin parcurgerea fazei bazale și fazei postalimentare, care la rândul ei cuprinde faza cefalică, faza gastrică și faza intestinală.

Secreția gastrică bazală este reprezentată de secreția stomacului nestimulat, în perioada interdigestivă, și este produsă de masa celulelor parietale, de tonusul vagal și de eliberarea intermitentă de gastrină. Valorile normale ale secreției bazale sunt de 0-5 mEq/oră.

Secreția postalimentară este declanșată încă înainte ca alimentele să fi ajuns în cavitatea gastrică și crește progresiv, pe măsura digestiei gastrice a alimentelor, urmând trei faze:

faza cefalică declanșează secreția acidă prin reflexe condiționate și necondiționate legate de miros, aspect, palpare, imaginație, etc., mediate pe de o parte, colinergic, de nervul vag, care eliberează acetilcolina, stimulatoare a secreției de HCl și pepsină, și pe de altă parte de gastrină, eliberată de celulele G din mucoasa gastrică, care stimulează la rândul ei secreția acidă;

faza gastrică a secreției acide este inițiată de contactul direct al alimentelor cu mucoasa gastrică, având o durată de 3-4 ore și reprezintă secreția acidă maximală. Stimularea secreției acide se datorează distensiei fundice și antrale cu activarea reflexelor colinergice, prin eliberarea de histamină din mucoasa gastrică și prin stimularea celulelor parietale. Creșterea acidității antrale suprimă eliberarea de gastrină în sânge, deci se produce o inhibare a secreției acide și implicit a pepsinei;

faza intestinală a secreției acide se datorează pe de o parte distensiei duodenale care declanșează reflex colinergic entero-oxintic, pe de altă parte aminoacizii absorbiți determină prin metabolizare, aminoacidemia iar proteinele digerate declanșează eliberarea de gastrină. Trecerea bolului alimentar acidifiat în duoden determină eliberarea de secretină care la rândul ei inhibă secreția gastrică și inhibă eliberarea de gastrină. [2,5,10,12]

În concluzie, secreția de acid clorhidric este stimulată de gastrină, acetilcolină, histamină, calciu și este inhibată de PGE2, PGI2 și somatostatină.

II.3. CARACTERIZAREA FARMACOLOGICĂ

A ANTIHISTAMINICELOR H2

Până la descoperirea antihistaminicelor H2, tratamentul ulcerului peptic se realiza prin administrarea de antiacide. Apoi au intrat în terapie medicația anticolinergică (atropina, pirenzepina), inhibitorii receptorilor H2-histaminici (cimetidina, ranitidina, famotidina, nizatidina, roxatidina), urmate de medicamentele inhibitoare ale pompei de protoni (omeprazol, lansoprazol, pantoprazol) precum și analogii de sinteză ai prostaglandinelor (misoprostol, enprostil). Medicamentele inhibitoare ale unor secretagogi cum ar fi gastrina (proglumidul), acetilcolina (pirenzepin), calciu (inhibitori ai canalelor de calciu), pot să determine o scădere a secreției acide, dar fără o eficacitate terapeutică prea mare.[12,13,14]

Substanțele care acționează la nivelul celulei parietale, cum sunt antihistaminicele H2 și inhibitorii pompei de protoni, care interferă în etapele finale ale producerii secreției acide gastrice, prezintă importanță terapeutică actuală și viitoare.

II.3.1. Histamina-caracterizare chimică și farmacologică

II.3.1.1. Caracterizarea chimică a histaminei

Până în prezent se cunoaște foarte puțin despre structura receptorilor histaminei la nivel molecular, dar se cunosc aspecte legate de structura și proprietățile ei chimice, esențiale pentru a înțelege activitatea farmacologică diferențiată a histaminei pe diferite tipuri de receptori.

Histamina, ([4(5)-imidazoliletilamina]), este compusă dintr-un inel imidazolic legat de un lanț scurt de gruparea amino, ambele fiind bazice,iar în soluție acidă devin protonate.[15]

Histamina în soluție apoasă este un amestec de forme ionice, tautomeri și conformeri, în permanentă interconversie rapidă, astfel că studiul activității biologice a fiecărei forme moleculare este extreme de dificilă (fig. 3.).Histamina protonată total este un dication (1A).

Treptele de ionizare ale histaminei în soluție apoasă sunt:

– prima treaptă la pKa=5,8 corespunde disocierii protonului de la azotul imidazolic,(1B ,1C);

– a doua treaptă la pKa=9,4 corespunde pierderii hidrogenului din catena laterală (NH3+), obținându-se astfel molecula neutrală de histamină (1D și 1E);

– a treia treaptă la pKa=14 corespunde ionizării grupării -NH- cu formarea anionului corespunzător (1F).[15]

Figura 3. Interconversia speciilor ionice și tautomere ale histaminei în soluție apoasă

Histamina are o mare capacitate de legare a protonilor, cationii de amoniu și imidazoliu funcționează ca donori de protoni, iar inelul neionizat acționează atât ca donor cât și ca acceptor de protoni. Molecula histaminei are capacitatea de a se complexa cu metale bivalente ca Zn, Cu, Ni, Co, Cd . Faptul că anhidraza carbonică este o metaloenzimă cu conținut de Zn ar putea explica mecanismul acțiunii histaminei de activator al cestei enzime cu consecințe asupra stimulării secreției acide gastrice, activare ce este antagonizată specific de cimetidină, ranitidină.[2,15]

II.3.1.2. Caracterizarea farmacologică a histaminei și a receptorilor histaminergici

Histamina este un mediator local și central care acționează pe receptorii specifici :

-receptorii H1 – stimularea lor determină bronhoconstricție și vasodilatație;

-receptorii H2 – stimularea lor determină hipersecreție gastrică și ușoară vasodiltație;

-receptorii H3 – stimularea lor determină efect inhbitor la nivelul unor terminații din S.N.C. funcționând ca autoreceptori presinaptici;e posibil să aibe acțiune în tratamentul bolii Parkinson,în boala Alzheimer,în tratamentul deficitului de atenție;

-receptoriiH4 – stimularea lor are rol în procese imunologice și antiinflamatorii. [16,17,18,19]

În funcție de preponderența acestor receptori, s-a constatat că:

la nivelul mucoasei gastrice există doar receptori H2;

la nivelul musculaturii netede există atât receptori H1 cât și receptori H2, histamina având totuși o afinitate mai mare pentru receptorii H1;

la nivelul vascularizației periferice sunt implicate atât receptorii H1 cât și receptorii H2, dar și aici există o afinitate mai mare a histaminei pentru receptorii H1;

la nivelul miocardului receptorii H1 mediază efectul dromotrop negativ, iar receptorii H2 mediază efectul inotrop pozitiv, corelat cu stimularea adenilat ciclazei de către histamină;

la nivelul S.N.C. se găsesc atât receptori H1 cât și H2 și H3. Receptorii H1 și H2 sunt localizați postsinaptic, iar receptorii H3 sunt localizați presinaptic;

la nivelul sistemului hematopoetic,în mastocite, limfocite-T, neutrofile și bazofile se află receptori H4. [18,19,20]

Urmare a localizărilor diferite a acestor receptori efectele histaminei sunt multiple:

-efecte asupra sistemulul nervos central: rol de neurotransmițător cerebral cu efecte în termoreglare, stimularea foamei și a setei, alternanța veghe-somn, modularea eliberării de hormoni ca prolactina și hormonul antidiuretic;

-efecte asupra sistemului nervos vegetativ: produce vasoconstricția vaselor mari, vasodilatația vaselor mici, a capilarelor, produce hipotermie,anorexie;

-efecte asupra sistemului cardiovascular: hipotensiune sistemică, hipertensiune pulmonară, venoconstricție, efect inotrop pozitiv și efect dromotrop negativ;

-efecte asupra musculaturii netede:contractă musculatura netedă digestivă;

-efecte asupra mastocitelor și bazofilelor circulante: rol în creșterea numărului lor și a agregării lor, determinând apariția reacțiilor alergice ;

-efecte asupra secrețiilor: creșterea secrețiilor gastrice, salivare, medulo-suprarenale. [21-25].

II.3.2. Structura chimică a antihistaminicelor H2

Plecând de la structura chimică a histaminei s-au făcut modificări atât la nivelul nucleului imidazolic cât și la nivelul catenei laterale, prin introducerea unor substituenți lipofili, nepolari, pentru facilitarea legării de receptori.

În figura 4 este prezentată structura generală a antihistaminicelor H2 din prima generație iar în tabelul 1 grupările funcționale specifice.

Figura 4. Structura generala a antagoniștilor H2 histaminici cu nucleu imidazolic

Tabelul 1. Grupările funcționale ale inhibitorilor H2 histaminici cu nucleu imidazolic/izocitozinic

O altă categorie de antihistaminice H2 au în structura lor chimică generală nucleul furan sau tiazol (fig.5). În tabelul 2 sunt prezentate grupările funcționale specifice acestor structuri precum și caracteristicile lor generale.[2, 5, 26-30].

Figura. 5. Structura chimică generală a antihistaminicelor H2 cu nucleu furan/tiazol

Tabelul 2. Antagoniști H2 cu nucleu furan/tiazol

Figura 6. Structura chimică generală a antihistaminicelor derivați de guanidinotiazol/pirazol

Tabelul 3. Antagoniști H2 derivați de guanidinotiazol/pirazol

Figura 7. Structura cimică generală a derivaților de fenoxipropilamina

Tabelul 4. Antagoniști H2 derivați de fenoxipropilamina

Alte antihistaminice H2 recent descoperite sunt următorarele: icotidina sulfotidina, ramixotidina, niperotidina, zaltidina, seganserina, tuvatidina, roxatidina, isolamtidina, donetidina, ebrotidina, zolantidina, lafutidina, dalcotidina, osutidina, aminopotentidina, lodoaminopotentidina .[12, 31-36]

Relația structură chimică-activitate în seria antihistaminicelor H2 arată că proprietatea de a bloca selectiv și competitiv receptorii H2 histaminergici, și prin aceasta secreția acidă gastrică, presupune ca structura chimică să conțină în molecula sa:

nucleu heterociclic substituit, extrem de diferit ca structură chimică (imidazolic, izocitozinic, tiazolic, furanic, guanidinotiazolic, pirazolic, fenoxipropilaminic);

catena laterală alchil (aril) aminică, grefată pe heterociclu, este formată dintr-un lanț de 4 atomi de carbon (alifatic sau înglobat într-un nucleu benzenic);

în pozitia β a catenei laterale, atomii de S pot înlocui atomului de C.

II.3.3. Mecanismul de acțiune al antihistaminicelor H2

Se cunosc mai multe mecanisme intracelulare de acțiune a histaminei, specific antagonizate de inhibitorii receptorilor H2 ai histaminei:

efectul asupra sistemului adenilat-ciclaza – 3’,5’AMPc;

efectul asupra anhidrazei carbonice;

efectul asupra ATP-azelor gastrice.

II.3.3.1.Sistemul adenilat-ciclaza- 3’,5’AMPc și receptorii H2 histaminergici

În 1965, Harris a fost primul cercetător care a presupus că 3’,5’AMPc este mediatorul intracelular al secreției acide gastrice, a cărui nivel intracelular crește datorită histaminei.

Figura 8. Efectul inhibitor al cimeidinei și ranitidinei asupra adenIlatciclazei din mucoasa fundică umană

Mecanismul acumulării intracelulare de 3’,5’AMPc este activarea adenilatciclazei prin histamină, fapt demonstrat experimental pe biopsii din mucoasă gastrică de cobai sau iepure, arătându-se că efectul histaminei este inhibat competitiv de burimamidă, cimetidină, ranitidină. [2,37,38]

Rezultate similare s-au obținut și folosindu-se biopsii gastrice din mucoasa fundică și antrală de la bolnavii de ulcer, demonstrându-se că histamina în concentrații între 10-7 și 10-2 M stimulează, dependent de doză, adenilatciclaza din mucoasa gastrică, efect antagonizat competitiv de cimetidină și ranitidină.

Rezultate similare cu cele „in vitro” s-au obținut și „in vivo”, când la biopsii de la bolnavii tratați prealabil cu cimetidină,histamina nu mai stimulează adenilatciclaza (fig. 8).

Se presupune că adenilatciclaza nu este decât o parte a mecanismului efector al receptorului H2 histaminergic. [2]

II.3.3.2. Anhidraza carbonică și receptorii H2 histaminergici

Cercetările arată că histamina este un activator direct și reversibil al anhidrazei carbonice (AC), funcție de doză. Histamina stimulează celula parietală pe două căi:

-calea directă, în care activarea AC se face prin pătrunderea histaminei în celulă;

-calea indirectă prin cuplarea histaminei pe receptorii H2 ai histaminei.

Cimetidina și ranitidina antagonizează dependent de doză, efectul activator al histaminei asupra anhidrazei carbonice, la concentrații între 10-8 și 10-2 M. Activitatea bazală a anhidrazei carbonice eritrocitare și a celei din mucoasa gastrică umană este slab redusă de ranitidină și neinfluențată de cimetidină (fig.9.10.11.12). [2,39]

În urma acestor rezultate s-a tras concluzia că unul din mecanismele prin care actionează antagoniștii receptorilor H2-histaminici este inhibiția activării anhidrazei carbonice (AC) prin histamină (H).

II.3.3.3. ATP-azele de membrană și antagoniștii receptorilor H2 histaminergici

Celulele parietale dispun de mai multe tipuri de sisteme ATP-azice, atașate de membrana celulară. ATP-aza dependentă de Na+ și K+ ca și cea dependentă de K+ și H+, nu este activată de histamină dar este inhibată specific de benzimidazolii substituiți. [2,5,21]

II.3.4. Farmacocinetica antihistaminicelor H2

Administrarea dozelor multiple, repetate la intervale scurte, nu produc creșterea efectului terapeutic, existând fenomenul de autolimitare. [5,10]

Biodisponibilitatea la administrarea orală este de 90% la nizatidină în timp ce metabolismul la nivelul primului pasaj hepatic limitează biodisponibilitatea celorlalți antagonisti H2 la 45-60% (cimetidină, ranitidină, famotidină).

Se metabolizează în proporții reduse, de cel mult 40%, la nivelul ficatului ca S-oxizi (ranitidina, nizatidina), N-oxizi (cimetidina, ranitidina, nizatidina), prin hidroxilare (5-hidroximetil-cimetidina), prin demetilare (desmetil-ranitidina, monodesmetil-nizatidina), metaboliții fiind activi farmacologic. Din cauza timpului de înjumătățire mic și a clearace-lui rapid ei nu se acumulează în organismele cu funcția renală intactă.

Se elimină în cea mai mare parte nemetabolizati, pe cale renală iar restul se elimină prin fecale, lapte matern, placentă, dar nu traversează bariera hematoencefalică (cu excepția cimetidinei). [1,5,13,14,21,24,31].

Principalele caracteristici farmacologice sunt sintetizate în tabelul 5 și sunt valabile pentru doze orale ale cimetidinei de 800 mg., ranitidina 300 mg., famotidina 40mg., nizatidina 300 mg. [40-47].

Tabelul 5. Caracteristicile farmacologice ale principalilor inhibitori H2 histaminici

II.3.5. Acțiunea anthistaminicelor H2

asupra secreției acide gastrice

Aceasta clasă de medicamente inhibă atât secreția gastrică bazală diurnă și nocturnă, cât și pe cea stimulată de histamină, gastrină, cafeină, alimente, insulină, aminoacizi și de alți diverși agenți farmacologici, afectând toți parametrii secreției acide (debitul clorhidric, concentrația de H+, volumul secretor). [1,23,24].Dozele care inhibă secreția acidă gastrică sunt evidențiate în tabelul 6.[1,20,23,24,48,49]

Tabelul 6 Dozele eficace și echivalente în relație cu durata acțiunii antisecretorii

Durata acțiunii antisecretorii ale câtorva antihistaminice H2 precum și dozele eficace și echivalente terapeutic sunt prezentate în tabelul 7.[50-55]

Tabelul 7-Efectul antisecretor comparativ ai antagoniștilor H2

Figura 13 ilustrează evoluția pH-ului intragastric și a debitului clorhidric nocturn după dozele de 200, 300 și 400 mg. de cimetidină la bolnavii cu ulcer duodenal. [2]

Figura 13-Evoluția pH-ului intragastric și a debitului clorhidric nocturn după cimetidină

Nizatidina inhibă secreția gastrică acidă nocturnă pe o durată de 12 ore, de asemenea inhibă semnificativ secreția stimulată de alimente, cafeina, betazol și pentagastrină, gradul de inhibiție fiind evidențiat în tabelul 8. Efectele famotidinei asupra secreției acide este prezentat în tabelul 9. [2,5,10,49,54 – 57].

Tabelul 8. Inhibarea secreției acide gastrice de către nizatidină

Tabelul 9. Inhibarea secreției acide de catre famotidina

II.3.6. Alte efecte farmacologice ale antihistaminicelor H2

Antihistaminicele H2 reduc atât volumul secreției gastrice, cât și concentrația ionilor de H+ și nivelul secreției de pepsină, dar nici cimetidina nici ranitidina nu afectează secreția globală de mucus. De asemenea nu este influențată secreția bazală postprandială de lipază, tripsină și nici funcția pancreatică. Ei au și un efect protector față de producerea ulcerului gastric indus de stress, aspirină, agoniști H2.[10,23,44,58-62].

S-a constatat că o terapie îndelungată cu cimetidină, ranitidină, oxmetidină, poate induce hipergastrinemie și implicit hipertrofia celulelor parietale. Tratamentele de scurtă durată (4-6 săptămâni) nu modifică gastrinemia și nu s-a observat fenomenul ”rebound” a secreției de gastrină. [12,14,21]

Existența receptorilor H2 la nivelul S.N.C. explică acțiunea cimetidinei, ranitidinei dar nu și a famotidinei asupra glandei pituitare anterioare. [5,22]

La famotidină, nizatidină și roxatidină nu s-au observat creșteri ale concentrației serice de gonadotrofină, prolactină, hormoni de creștere, hormon antidiuretic, cortizol, triiodthironină, tiroxină, parathormon, testosteron, androstendionă sau estradiol. La aceștia nu s-a observat acțiunea antiandrogenică așa cum s-a constatat la cimetidină. [14,21,23,31,41]

Întrucât receptorii H1 și H2 sunt implicați în răspunsul microcirculației la administrarea de histamină, s-a constatat că antihistaminicele H2 (cimetidina, ranitidina, metiamida) reduc semnificativ (cu peste 30%) debitul la nivelul microcirculației, ceea ce poate explica eficiența mai redusă a acestor substanțe în vindecarea ulcerelor gastrice. [2,52].

II.3.7. Indicațiile terapeutice ale antihistaminicelor H2

Principalele indicații terapeutice ale antihistaminicelor H2 sunt: tratamentul ulcerului gastric, tratamentul ulcerului duodenal, profilaxia leziunilor produse prin administrarea de medicamente ulcerogene, profilaxia recidivelor ulcerului gastric și duodenal și a recidivelor postoperatorii (tratament de întreținere), tratamentul și profilaxia ulcerelor și hemoragiilor cauzate de stres, tratamentul sindromului Zollinger-Ellison, tratamentul esofagitei peptice de reflux, prevenirea sindromului aspirației acide la naștere (sindromul Mendelson). [6,1012,37,53,62,63]

În tratamentul ulcerului duodenal – răspunsul vindecării ulcerului duodenal în urma terapiei orale cu ranitidină, famotidină și nizatidină administrate unor loturi diferite de bolnavi, este sintetizat în cele patru tabele de mai jos. [10,12,20,37,43,64,65]

Tabelul 10- Rata vindecării ulcerului duodenal după cimetidină

Tabel 11-Rata vindecării ulcerului duodenal după ranitidină

Tabelu 12- Rata vindecării ulcerului duodenal după famotidină

Tabelul 13-Rata vindecării ulcerului duodenal după nizatidină

În ulcerul gastric, atât pentru tratamentul crizelor acute, cât și pentru cel de întreținere, se folosesc aceleași antihistaminice H2 ca și în ulcerul duodenal [37,40,41].

Prescrierea antihistaminicelor H2, în cazul esofagitei peptice de reflux, se bazează pe reducerea acidității secreției gastrice care refluxează. Dozele sunt cuprinse între 800 mg/zi și 1600mg/zi în cazul cimetidinei, 300mg/zi ranitidină, 300mg/zi nizatidină, 40mg/zi famotidină și 150mg/zi roxatidină. [40,43,66,67,68,].

Pentru prevenirea complicațiilor ce pot apărea în sindromul de aspirație acidă la naștere, datorate secreției gastrice acide în plămânii noului născut, se administrează fie 400 mg cimetidină, fie 150 mg ranitidină (sau nizatidină), fie 20 mg famotidină. [69,70,71]

În condiții de stres, există un risc mărit pentru apariția leziunilor acute gastro-duodenale, ducând la ulcerul de stres, existând riscul complicațiilor hemoragice sau perforative care necesită uneori intervenție chirurgicală de urgență, mortalitatea fiind în jur de 50%. Pentru profilaxia ulcerelor de stres, cimetidina se prescrie în doze zilnice de 400-800 mg, ranitidina 300 mg, iar famotidina 20 mg. [10,12,20,21,37]

Descoperirea antihistaminicelor H2 a constituit un progres considerabil în tratamentul sindromului Zollinger-Ellison, pentru care singura posibilitate anterioară de tratament era gastrectomia totală. Dozele uzuale zilnice sunt 1-2g/zi maximum 2.4g/zi cimetidină, 0.6-1.2g/zi, maximum 6g/zi ranitidină, sau 80mg/zi maximum 800mg/zi famotidină, fără a prezenta efecte nedorite la aceste doze. [41,49]

II.3.8.EFECTELE SECUNDARE și toxicitatea antihistaminiceloR H2

Reacțiile adverse ale antihistaminicelor H2 rezultă atât din acțiunea lor asupra receptorilor H2, larg răspândiți în organism, cât și din acțiunile lor farmacologice nemediate de receptorii H2. La folosirea antihistaminicelor H2 pot apărea o serie de reacții adverse la diferite nivele: SNC, endocrin, sanguin, gastro-intestinal, cardiovascular, căi respiratorii.

Efectele secundare de la nivelul SNC sunt cel mai bine descrise pentru cimetidină: somnolență, confuzie, delir, neliniște, anxietate, letargie, agitație, halucinații, spasme, dizartrie, amețeli, depresie, reacții psihotice, neuropatie motorie, tremor, comă, efecte extrapiramidale și efecte la nivelul cerebelului. [9,24,41].

Un risc în plus îl prezintă pacienții cu boli renale, hepatice sau cei în vârstă care au o permeabilitate mărită a barierei hematoencefalice, ceea ce duce la creșterea nivelului de cimetidină în sânge, respectiv în lichidul cefalorahidian. [22]

b) La nivel endocrin se constată efect antiandrogenic datorită proprietății cimetidinei de a deplasa dihidrotestosteronul de pe receptorii săi de la nivelul prostatei, ducând la apariția ginecomastiei, a micșorării libidoului și a tulburărilor de potență. [5,10,11]

c) La nivel sanguin poate să apară în cazuri rare leucopenie, trombopenie, pancitopenie, agranulocitoză, anemie aplastică.[13,14]

d) La nivel gastro-intestinal efectele care apar sunt mai complexe și au dus la creșterea riscului cancerigen în cazul folosirii îndelungate a unor doze mari de antihistaminice H2 cu potență mare și cu durată de acțiune prelungită, cum sunt lupitidina, lanitidina, laxtidina, observată prin studii toxicologice pe termen lung, la animale. [20,23,24,31,36,72,73,74]

e) La nivel cardiovascular, pot apare tulburări ca: bradicardie, tahicardie, hipertensiune arterială, bloc atrio-ventricular (mai rar), posibilitate de colaps. [1,37,41]

f) La nivelul căilor respiratorii poate să apară, mai rar, bronhospasmul. [16,25,72]

Se pot cita și efecte la nivel hepatic, urogenital, asupra sistemului imunitar și la nivelul pielii, determinate de fenomene de hipersensibilizare. [72,73,75]

II.4. CARACTERIZAREA ANALITICĂ

A ANTIHISTAMINICELOR H2

II.4.1. Proprietățile fizico-chimice ale antihistaminicelor H2

În tabelul 14 sunt prezentate câteva caracteristici fizico-chimice ale antihistaminicelor H2 introduse în terapie: [12,14,23,29,31,47,56]

Tabelul 14-Proprietățile fizico-chimice ale inhibitorilor H2 histaminici

II.4.2. METODE ANALITICE

APLICATE ÎN STUDIUL ANTIHISTAMINICELOR H2

Metodele analitice folosite în studiul antihistaminicelor H2 ne oferă date importante pentru controlul purității, identității substanțelor și în controlul cantitativ al diferitelor forme farmaceutice precum și în studiile de stabilitate ale acestor forme farmaceutice. [76-79]

II.4.2.1. Metoda titrimetrică este o metodă de analiză volumetrică în mediu apos.

Are o mare aplicabilitate în cazul analizei cantitative a nizatidinei din diferite forme farmaceutice în special din capsule, și se bazează pe reacția de oxidare în mediu apos a nizatidinei de către N-bromosuccinimidă. [80,81]

II.4.2.2. Metode cromatografice

Sunt cele mai folosite metode pentru caracterizarea analitică, atât calitativă cât și cantitativă, aplicate atât substanței pure, a sărurilor și a formelor farmaceutice sub care sunt condiționate.[76,82]

În USP XXIII sunt oficializate cimetidina substanță, cimetidina tablete, famotidina, famotidina tablete, ranitidina hidroclorică, ranitidina tablete, ranitidina în soluție orală, ranitidina în soluție apoasă injectabilă, ranitidina în soluție injectabilă de clorură de sodiu, nizatidina și nizatidina capsule. [83].În toate monografiile enumerate mai sus sunt precizate metode comatografice pentru studiul identității, purității și determinării canitative, ceea ce denotă gradul de precizie și siguranță a metodelor cromatografice în analiza chimică a antihistaminicelor H2.

II.4.2.2.1. Cromatografia pe strat subțire – CSS

Această metodă este folosită în scopul separării, identificării și dozării substanțelor medicamentoase ca atare sau din diferite medii biologice (ser, plasmă, urină, preparate biopsice) sau din diferite forme farmaceutice.

Principiul metodei constă în existența a două faze, mobilă și fixă, cu ajutorul cărora se realizează, prin capilaritate, migrări ale analiților în scopul separării și apoi a identificării lor.[76,79]

CSS este oficializată în toate monografiile ranitidinei din USP XXXIII ca metodă de identificare și în scopul determinării impurităților, fiind precizate și limitele acestora. Ca impurități în diferitele forme famaceutice de ranitidină se studiază compusul 5-[[(2-aminoetil)tio)]-metil]-N, N-dimetil-2-furanmetanamina (tablete, soluție apoasă injectabilă, soluție injectabilă de clorură de sodiu), precum și compusul N-[2-[2-[[[5-[(dimetilamino)metil]-2-furan]metil]sulfinil]etil]-N’-metil-2-nitro-1, 1-etilendiamina [83].

Se folosec plăci de silicagel, faza mobilă este formată dintr-un amestec de acetat de etil, alcool izopropilic, hidroxid de amoniu și apă în proporție de 25:15:5:1. Vizualizarea spoturilor se face prin expunere la vapori de iod. [83]

Prin această metodă este identificată și nizatidina, fiind folosită și la separarea și identificarea unor produși de degradare ai nizatidinei în studiul stabilității substanței. Cromatografia pe strat subțire de înaltă performanță este o variantă modernă a cromatografiei pe strat subțire care permite detectarea unor impurități în cantități foarte mici, de ordinul μg, sau pentru analiza cantitativă, folosind eșantioane foarte mici de probe de analiză.

II.4.2.2.2. Cromatografia în fază gazoasă – GC

Cromatografia gazoasă se aplică la separarea substanțelor volatile și/ sau a substanțelor ușor volatilizabile la temperaturi mai mici de 400°C, după ce se introduc într-un injector preîncălzit. Moleculele în faza gazoasă sunt antrenate de un gaz purtător (N2, Ar, He etc.) în coloana cromatografică separatoare, pe care analiții separați o părăsesc succesiv, fiind conduși la un detector unde înregistratorul trasează gaz-cromatograma care conține picurile substanțelor separate. În USP XXXIII în monografia famotidinei se cercetează prin această metodă impuritățile de substanțe organice volatile, care nu trebuie să existe. [76,83]

II.4.2.2.3. Cromatografia de lichide de înaltă performanță – HPLC

Este cea mai frecvent aplicată metodă modernă de analiză cromatografică bazată pe repartiția lichid-lichid, pe absorbția lichid-solid, pe schimbători de ioni și pe procesele de excludere–difuzie. [84-95].

Se folosește atât în studiul identității sau a purității substanțelor cât și în studiul cantitativ a substanțelor ca materii prime sau din forme farmaceutice și medii biologice.

În USP XXXIII se realizează prin această metodă controlul cantitativ al următoarelor antihistaminice H2 : [83]

Cimetidina:faza mobilă =240ml. methanol, 0,3ml acid fosforic 85% și apă 780ml;

Soluție 1 = standard de cimetidină RS = 0,8μg / ml dizolvat în faza mobilă

Soluția 2 = substanța de testat = cimetidină 0,1mg/ml, în faza mobilă

Coloana de dimensiuni 3,9mm X 30cm cu packing L1

Debit: 2ml/min., volum de injectare: 50 μl, detecție: 220nm.

Calculul concentrației de cimetidină în proba testată se face după formula:

10C(Ru/Rs) unde C = concentrația soluției standard

Rs = răspunsul soluției standard

Ru = răspunsul soluției de testat

Ranitidină: faza mobilă=metanol în soluție apoasă de acetat de amoniu 0.1M în raport 70:30

Soluție 1 = standard de ranitidină RS = 0,112μg/ml dizolvat în faza mobilă

Soluția 2 = substanța de testat = ranitidină 0,112μg/ml

Soluția 3 = substanța de testat = ranitidina 0,01mg/ml, în faza mobilă

Coloana de dimensiuni 4,6mm X 30cm cu packing L1

Debit: 2ml/min., volum de injectare: 40 μl, detecție: 322nm.

Calculul concentrației de ranitidină în proba testată se face după formula:10C(Ru/Rs)

Famotidina: faza mobilă = metanol în soluție tampon fosfat monobasic de potasiu la pH 5;

Soluție 1 = standard de famotidină RS = 80μg/ml dizolvat în faza mobilă

Soluția 2 = substanța de testat = famotidină 80μg/ml

Coloana de dimensiuni 4,6 mm X 25 cm cu packing L3

Debit: 1ml/min., volum de injectare: 40 μl, detecție: 254 nm.

Calculul concentrației de famotidină în proba testată se face după formula:

10C(Ru/Rs)

Nizatidina: faza mobilă = metanol în soluție tampon acetat de amoniu (0,1M ph 5 și 0,1% etilendiamină) în proporție 76:24;

Soluție 1 = standard de nizatidină RS = 502μg/ml dizolvat în faza mobilă

Soluția 2 = substanța de testat = nizatidină 50μg/ml în faza mobilă

Soluția3 = substanța de testat = nizatidină 25μg/ml în faza mobilă

Soluția 4 = substanța de testat = nizatidină 15μg/ml în faza mobilă

Coloana de dimensiuni 4,6mm X 250cm cu packing L1

Debit: 1ml/min., volum de injectare: 40 μl , detecție: 254nm.

Calculul concentrației de nizatidină în proba testată se face după formula:

10C(Ru/Rs)

II.4.2.3. Metode spectrale

Metodele spectrale în U.V., I.R. și R.M.N. sunt extrem de folosite în analiza calitativă și cantitativă a acestei clase medicamentoase. [96-102]

II.4.2.3.1. Metoda spectrală în U.V.

Caracteristicile spectrale în U.V. ale antihistaminicelor H2 sunt următoarele [103,104]:

Spectru UV pentru cimetidină – absorbție semnificativă între 230-360 nm;

Spectru UV pentru ranitidină – absorbție maximă la 313 nm;

Spectru UV pentru nizatidină – absorbție maximă la 254 nm;

Spectru în UV a nizatidinei, atât în metanol cât și în apă, conține două absorbții maxime care sunt abolite de adăugarea unui acid și se restabilesc la adăugarea unei baze . Absorbanța maximă a cromoforului diaminonitroalchena apare la 325 nm(metanol) și 314nm(apă) (tabel 15). [56,80,81,104]

Tabel 15-Absorbanțele în U.V. și absorbanțele moleculare

II.4.2.3.2. Metode spectrale în I.R

Aceste metode sunt aplicate în controlul purității substanțelor medicamentoase când impuritățile de peste cinci procente determină apariția unor benzi suplimentare. Metoda poate fi folosită și în determinări cantitative și în analiza structurală a substanțelor medicamentoase.

În tabelul 16 sunt prezentate caracteristicile spectrale IR ale antihistaminicelor H2 .[80,83].

Tabelul 16-Caracteristicile spectrale IR ale inhibitorilor H2

II.4.2.3.3. Rezonanța magnetică nucleară – R.M.N.

Rezonanța magnetică nucleară se bazează pe capacitatea nucleelor de tipul 1H, 13C, 19F, 31P de a avea un moment magnetic nuclear permanent. Dacă aceste nuclee sunt plasate într-un câmp magnetic exterior suferă o orientare în funcție de câmp. [34,56,105]

Structura stabilită pentru nizatidină prin rezonanța magnetică nucleară este listată în tabelul 17 și figurată alăturat.[34]

Tabel 17.-Datele spectrale R.M.N.ale nizatidinei la 3°C

Tot prin RMN s-a putut stabili fără nici o ambiguitate toți 1H, 13C și 15N din structura roxatidinei acetat în doi solvenți, dimetilsulfoxid (DMSO-d6) și apă [14]. În spectrul 1H RMN a roxatidinei (tabelul 18) spectrul ciclului piperidinic indică foarte clar conformația “scaun” (figura 14). [34]

Figura 14. Conformația scaun a roxatidinei

Tabelul 18. Datele spectrale 1H RMN ale roxatidinei acetate în DMSO-d6 și apă

II.4.2.3.4. Spectrometria de masă

Spectrometria de masă este cea mai sigură și rapidă metodă de identificare a unei substanțe și se bazează pe fragmentarea moleculelor de substanțe organice sub acțiunea unor energii mari, iar din numărul, sarcina și masa fragmentelor rezultate se obțin informații asupra structurii și identității substanțelor cercetate.

Impactul electronic în spectrometria de masă a nizatidinei a permis determinarea elementelor componente ale fiecărui fragment. Structura mai multor fragmente sunt illustrate în figura15 și tabelul 19.[100,106,107]

Figura 15. Structura chimică a nizatidinei prin spectrometrie de masă

Tabelul 19 Masa stabilită de spectrul impactului de electroni ai nizatidinei

II.4.2.4. Cristalografia cu raze X

Datele difracției cu raze X a pulberii de nizatidină sunt cuprinse în tabelul 20, unde d este spațiul interplanar, I/Io este intensitatea relativă a razelor X. Nizatidina a fost cristalizată din soluție de acetat de etil, alcool butilic, clorură de metilen și etanol.[56]

Tabelul 20-Datele difracției cu raze X pentru nizatidină

Studiile de difracție cu raze X arată prezența unei singure forme cristaline în toate cazurile, iar spectrul cuprinde 21 de peak-uri. [56]

II.4.3 STUDIUL STABILITĂȚII UNOR ANTIHISTAMINICE H2

Stabilitatea unui medicament include:

Stabilitatea chimică, caracterizată prin menținerea în limite fixe a integrității și reactivității chimice a fiecărui component;

Stabilitatea fizică, atestată prin păstrarea proprietăților fizice inițiale, aspect, culoare, gust, uniformitate, formă cristalină, solubilitate, tendință de dispersie;

Stabilitatea microbiologică, manifestată prin menținerea sterilității sau rezistenței la dezvoltarea microorganismelor, în condiții determinate, ca și eficacitatea substanțelor conservante, eventual adăugate;

Stabilitatea terapeutică care exclude orice modificare a eficacității terapeutice;

Stabilitatea toxicologică care nu admite nici o mărire semnificativă a toxicității, evaluată prin DL50. [76,96,98,108-112]

Există reglementări precise prevăzute în farmacopeele care oficializează preparatele cu antihistaminice H2 (USPXXII, USPXXIII) stabilindu-se termene de valabilitate, respectiv de expirare, a formelor farmaceutice medicamentoase.

În cazul ranitidinei USPXXIII stabilește limite de impurități pentru 5-[[(2-aminoetil)tio]metil]-N, N’-dimetil-2-furanmetanamina hemifumarat) din tablete, soluții injectabile, determinate prin CSS. [83]

Studiul stabilității nizatidinei arată că nizatidina ca substanță activă s-a dovedit a fi stabilă atunci când este expusă la stres termic de 100°C timp de șapte zile. Substanța a mai fost supusă și unor condiții agresive ale acizilor, bazelor, peroxizilor și fotodegradării.

În toate aceste studii nizatidina a fost evaluată prin metode HPLC.[ 46]

a) atunci când este supusă sub un reflux de 24 ore într-o soluție de HCl 0,1N, în condiții grele de temperatură, nizatidina s-a dovedit a fi mai puțin stabilă. În aceste condiții se formează trei produși de degradare.[46]

4-[[(2-aminoetil)tio]metil]~N,N-dimetil-2-tiazolmetanamina (I);

2-[(dimetilamino)metil-4 -tiazol-metanol (II);

5,6-dihidro-3-(metilamino)-2H-l,4-tiazid-2-on- oxima (III)

b) expunerea la o soluție 0,1N de hidroxid de sodiu, timp de 72 ore, duce la obținerea a trei produși de degradare, unul dintre produșii de degradare fiind comuni atât hidrolizei acide cât și hidrolizei bazice :

4-[[(2-aminoetil)tio]metil]~N,N-dimetil-2-tiazol-metanamina (I);

N-metil-2-nitroacetamida (IV);

N-(tiazolamin)-2-nitroacetamida (V).

c) expunerea nizatidinei la o soluție de peroxid 0,3% duce la degradarea ei în nizatidin sulfoxid cu structură N-[2-[[[2-[(dimetilamino)metil]-4-tiazolil]metil]tio]etil]-N'-metil-2-nitro-l, l-etenediamina (VI)

d) Când se produce iradiere cu lampă de mercur timp de șapte ore într-o soluție apoasă, nizatidina se degradează la: N-[2-[[[2-[(dimetilamino)metil] -4 tiazolil]metil] tio]ethil]-N'-metil-uree (VII). [46,56]

Studiile de stabilitate a nizatidinei condiționată sub forma de capsule (150mg si 300mg) arată că ele sunt stabile timp de 24 luni la temperatura camerei și 12 luni dacă sunt păstrate la 40°C. [46,83] Soluțiile parenterale de nizatidină se dovedesc a fi stabile timp de 24 luni dacă sunt păstrate la temperatura camerei. Primii produși de degradare ai nizatidinei în soluție sunt nizatidin amida și nizatidin sulfoxid. [56,83]

În concluzie, cunoscând factorii care afectează stabilitatea medicamentelor devine posibilă adoptarea unor măsuri de prevenire a proceselor de degradare, ceea ce are ca efect stabilizarea lor. În general, cu condiția păstrării tuturor parametrilor de fabricație, de puritate a materiei prime, de păstrare, de conservare, antihistaminicele H2 prezintă o mare stabilitate. Cu toate aceste se efectuează controlul stabilității și valabilității în conformitate cu normele stabilite.

Parametrii fizico-chimici precum și metodele de analiză a antihistaminicelor H2 aplicați formelor farmaceutice se pot aplica cu succes și în cazul analizei fizico-chimice a acestora din medii biologice, (ser, hematii, urină, probe biopsice), pentru studiul lor farmacologic și faramacocinetic.

PARTEA A III-A.

CONTRIBUȚII PROPRII LA STUDIUL FIZICO-CHIMIC AL UNOR ANTIHISTAMINICE H2

III.1. METODE FIZICO-CHIMICE

UTILIZATE PENTRU DETERMINAREA

ACTIVITĂȚII ANTIHISTAMINICELOR H2

Conform concepției actuale a membranei celulare (teoria mozaicului fluid), membrana celulară este o structură lipidică fluidă bistratificată, în care receptorii sunt suspendați (flotați), proteina receptoare și sistemul efector putându-se cupla în funcție de stimulare sau inhibiție. Partea proteică a receptorului se situează pe fața externă a membranei, deoarece histamina se leagă de acesta, legarea fiind împiedicată de antagoniștii histaminei. [2]

Receptorul histaminergic H2 de la nivelul celulei parietale gastrice este un receptor membranar,cuplat cu proteina G format dintr-o proteină receptoare,proteină de cuplare și sistem efector.

Dacă adenilatciclaza, enzimă localizată la nivelul membranei bazo-laterale a celulei parietale, este considerată ca partea catalitică a receptorilor H2 histaminici pentru că este stimulată dependent de doza, de histamină și inhibată de antagoniștii receptorilor de tip H2, catalizând transformarea AMP în 3,5-AMP ciclic (mediatorul intracelular al producției de acid), dacă ATP-azele de membrană intervin în ultima parte a procesului secretor al acidului clorhidric și dacă anhidraza carbonică, prin reacția de hidratare a CO2,asigură producția de ioni de H+ pentru formarea acidului clorhidric, înseamnă că toate aceste enzime sunt strâns implicate în ulcerogeneză. [2,3,7,20,23,40,52,113]

Sistemul efector este reprezentat de adenilatciclază care determină formarea de AMPc, mesagerul secundar implicat în producția de acid. El este activat de histamină și blocat de antihistaminicele H2.

Pe lângă receptorii H2, pompele ionice (ATPazele membranare) și anhidraza carbonică contribuie la formarea secreției gastrice și sunt puncte cheie în ulcerogeneză și terapia antiulceroasă.

În toate aceste mecanisme secretagoge, histamina este mediatorul chimic final care sensibilizează celula parietală la efectul celorlalți mediatori, conform teoriei lui Code .[2,113]

Din aceste considerații, în această lucrare ne-am propus să studiem prin metode chimico-enzimatice capacitatea inhibitoare a antihistaminicelor H2 în relație cu activitatea anhidrazei carbonice.

III.1.1. METODE UTILIZATE PENTRU DETERMINAREA ACTIVITĂȚII ANHIDRAZEI CARBONICE, IMPLICATĂ ÎN MECANISMUL DE ACȚIUNE

AL ANTIHISTAMINICELOR H2

Au fost dezvoltate numeroase tehnici de măsurare a vitezei de reacție catalizată de AC, dar marea majoritate a metodelor se bazează pe măsurarea producției sau consumului de CO2 sau H+.

Metodele aplicate pentru estimarea activității enzimatice a AC se pot clasifica astfel:

a) Metode care implică reacții chimice

Metode bazate pe modificări de pH – acestea măsoară producția sau consumul de H+ și pot fi realizate:

cu indicatori de pH – când producția de H+ este vizualizată prin modificarea culorii unui indicator de pH.

cu electrozi de pH – când producția sau consumul de H+ sunt măsurate cu ajutorul unor electrozi de pH.

Metode bazate pe modificări ale concentrației de CO2 sau pCO2 care măsoară consumul sau producția de CO2 a reacției reversibile :

CO2 +H2↔H2CO3 ↔ H+ + HCO3¯

prin:

tehnica gaz manometrică

cu electrozi de pCO2

Metode bazate pe modificarea temperaturii de reacție – care constau în măsurarea creșterii inițiale rapide a temperaturii produsă prin asocierea (H+ + HCO3¯ ) pentru a forma H2CO3, măsurători efectuate cu aparate prevăzute cu termocuple.

b) Metode care nu implică reacții chimice nete

Din această categorie de metode fac parte:

Metode cu izotopi marcați 18O

Metode de rezonanță magnetică nucleară (RMN) cu 13C

Metode de relaxare – în care soluția la echilibru HCO3¯ / CO2 își modifică brusc proprietățile fizice ca de exemplu, câmpul electric, presiunea sau temperatura, cu modificări consecutive ale stării de echilibru chimic.[29,52,114]

III.1.1.1. Măsurarea recției enzimatice

Tehnicile utilizate pentru măsurarea vitezei enzimatice sunt de două tipuri: continue și discontinue.

Principiul care stă la baza metodelor continue este următorul: enzima și substratul sunt amestecați și este urmărită continuu sau periodic o funcție dependentă de concentrația produsului sau substratului, ca de exemplu absorbanța sau presiunea unui gaz.

În cazul metodelor discontinue se iau probe din amestecul de reacție, la diferite intervale de timp, se stopează reacția enzimatică și se dozează cantitativ componentul consumat sau eliberat în cursul reacției.

Aparatele cele mai perfecționate pentru măsurarea reacțiilor enzimatice sunt aparate cu amestecare rapidă (continous-flow sau stop-flow).

În tehnicile „continous-flow", reactanții sunt introduși într-o cameră de amestecare, sunt amestecați într-o perioadă de 1 milisecundă și trecuți apoi într-un dispozitiv de observație unde se urmărește pH-ul, pCO2, densitatea optică sau temperatura, pe toată durata trecerii fluxului de reactanți din camera de amestecare în celula de observare.[113,114]

Dezavantajul acestor metode este acela că necesită un volum mare de reactivi
(60 -180 ml) pentru o singură determinare, iar prelucrarea curbelor de reacție necesită mult timp.

În aparatele cu amestecare rapidă de tip stop-flow, se folosesc cantități foarte mici de reactanți (câțiva ml), care sunt introduși în camera de amestecare conectată la un sistem de vizualizare a reacției, după care sunt rapid evacuate printr-o a treia cale.

Avansarea reacției este monitorizată spectrofometric sau prin alt instrument cu răspuns rapid (electrozi de pH, senzori de temperatură, osciloscop etc). Apare astfel posibilitatea de a urmări continuu reacția, din primele milisecunde până la finalul ei.

III.1.1.1.1 Metoda stoped-flow

III.1.1.1.1.1. Determinarea activității anhidrazei carbonice in vitro și in vivo

Cercetările noastre anterioare au arătat că histamină activează direct anhidraza carbonică, iar studiile cinetice au dovedit un mecanism de activare de tip non-competitiv. [39,115,116,117].

Pornind de la rolul anhidrazei carbonice în secreția gastrică, cercetările noastre au dovedit că antagoniștii receptorilor H2-histaminergici de tipul cimetidinei scad efectul activator produs de histamină asupra anhidrazei carbonice.Pe baza acestor rezultate am continuat cercetările, extinzând aria preocupărilor noastre asupra unor noi antihistaminice H2, respectiv famotidina și nizatidina.

În acest studiu am urmărit in vitro și in vivo efectul famotidinei și a nizatidinei asupra anhidrazei carbonice purificate, efectul acestor antagoniști ai receptorilor H2 histaminergici asupra activării produsă de histamină asupra anhidrazei carbonice purificate, asupra unor izoenzime ale anhidrazei carbonice, precum și a anhidrazei carbonice din mucoasa gastrică și din hematii.

Material și metodă

Pentru experimentele efectuate in vitro am folosit:

substanțe active de famotidină obținută de la firma S.C Helcor S.R.L.,Baia Mare,România și nizatidină obținută de la firma S.C Sicomed S.A, București, România

anhidraza carbonică I, anhidraza carbonică II purificate de la Sigma (Deisenhofen, Germania).

histamina de la firma Serva Feinhbiochemica (Heidelberg,Germania)

Tampon Hepes, Tris-imidazol, p-nitrofenol, p- nitrofenil acetat, Na2SO4, de la Serva Feinbiochemia (Heidelberg, Germania).

Chitul de reactivi enzimatici pentru determinarea concentrației de CO2 de la Gilford System (U.S.A).

Pentru experimentele in vivo s-au ales două loturi de bolnavi voluntari diagnosticați cu ulcer gastric și ulcer duodenal,internați la secția de gastroenterologie de pe lângă Centrul de Cercetări și Asistență Medicală Șimleu Silvaniei.Pacienții sunt de sex masculin, între 20-58 de ani, cu greutate între 60 – 79 kg, din mediu urban și rural,care au fost tratați o perioadă de 21 de zile astfel:

lotul 1- unui grup de 62 de pacienți voluntari diagnosticați cu ulcer duodenal li s-a administrat de două ori pe zi, dimineața și seara, câte 20 mg famotidină timp de 21 zile;

lotul 2- unui grup de 47 de pacienți voluntari diagnosticați cu ulcer gastric li s-a administrat de două ori pe zi câte 150mg nizatidină, timp de 21 zile.

Tehnica de determinare a activității anhidrazei carbonice este tehnica stopped-flow, care este o metodă colorimetrica ce se bazează pe metoda pH-ului schimbător ca urmare a reacției de hidratare a CO2, reacție catalizată de enzimă. Este măsurat timpul în care pH-ul amestecului de reactanți scade de la valoarea inițială la valoarea finală. Urmărirea reacției este făcută spectrofotometric utilizând indicatori de culoare care virează în domeniul de pH ales.[52,113]

Aparatura

Determinările sunt efectuate cu un spectrofometru HI-TECH SF-51 MX (Hi-TECH, Anglia).

Acesta este prevăzut cu unitatea de amestecare SHU care este compusă dintr-un sistem de patru seringi pentru alimentarea reactivilor. Semnalul transmis prin fotomultiplicator de la camera de amestecare este preluat de un calculator RCD-IMB compatibil, prevăzut cu interfața OMEGA DAS-50 (Anglia) și cu facilități de prelucrare matematică a datelor, prin programul RKBIN IS-1 (HI-TECH, Anglia).

Alimentarea reactivilor în cuva de reacție se face pe două căi separate:

►o seringă realizează introducerea amestecului de reacție compus din enzimă și soluția tampon.

► cea de-a doua seringă realizează introducerea substratului.

Fluxul de reactivi se amestecă la intrarea în cuvă, moment în care se declanșează reacția propriu-zisă și începe monitorizarea ei.

Reactivi

Indicator de culoare – este folosit p-nitrofenol (pKa 7,1) în concentrație de 0,2 mM, care prezintă un peak maxim de absorbție la 400 nm. Ca urmare toate măsurătorile vor fi efectuate la 400 nm, urmărind descreșterea în absorbanță a maximului de absorbție, corespunzător cu modificarea culorii indicatorului de la galben (pH=7,5) la incolor (pH = 6,5). Reacția este urmărită astfel pe intervalul unei unități de pH.

Tampon- s-a folosit acidul 4-(2-hidroxietil)-1 – piperazin-etan-sulfonic (tampon Hepes) având pKa=7.83. Concentrația la care s-a lucrat este de 20 mM, iar pH-ul inițial al soluție este ajustat la 7,5.

Soluția stoc de anhidrază carbonică – s-au preparat soluții de anhidrază carbonică I, respectiv anhidraza carbonică II în concentrații de 3,44 x 10-5M. Concentrațiile anhidrazei carbonice sunt verificate prin măsurare spectrofotometrică la 280 nm, cunoscând coeficientul de extincție E1% = 19.

4. Soluția de CO2 – se obține prin barbotarea până la saturare a CO2 în apă bidistilată. Soluția astfel obținută este păstrată într-un vas închis, sub presiune, iar concentrația de lucru este de 15 mM. Această concentrație se determină spectrofotometric la 340 nm printr-o metodă enzimatică care folosește un chit de reactivi conținând fosfoenol piruvat carboxilază-maleat dehidrogenază.

Măsurătorile se efectuează pe un analizor automat IMPACT 100 (Gilford, USA).

5. Na2SO4 – în concentrație de 0,1 M folosit pentru menținerea constantă a tăriei ionice.

6. Soluții stoc de activatori sau inhibitori – sunt preparate în concentrații de 2×10-2 M, prin solubilizarea substanțelor respective în apă bidistilată sau în dimetil-sulfoxid (DMSO) și se ajustează pH-ul la 7,5.

Toți reactivii luați în lucru au pH-ul de 7,5 măsurat cu pH – metrul Corning (Ciba Corning – Anglia).

Metoda experimentală

a) Măsurarea reacției necatalizate (martor)

Se determină timpul în care decurge reacția de hidratare a CO2 în absența enzimei. În cuva de reacție se introduc:

►1 ml amestec format din: – 0,8 ml tampon – indicator.

– 0,2 ml apă (H2O)

►1 ml soluție CO2 de concentrație 15 mM.

Timpul reacției necatalizate este notat To.

b) Măsurarea reacției catalizate (bazal)

Se determină timpul în care are loc reacția de hidratare în prezența enzimei. În acest caz în cuva de reacție se vor introduce:

►1 ml amestec format din – 0,8 ml tampon-indicator

– 0,1 ml soluție AC (3,44×10-6M)

– 0,1 ml H20

►1 ml soluție CO2 de concentrație 15 mM.

Timpul astfel determinat se notează cu T. Activitatea volumetrică a AC este determinată după formula:

Activitatea volumetrică = To – T (U.E/ml)

T

unde To= timpul reacției necatalizate,

T = timpul reacției catalizate

U.E. reprezintă cantitatea de enzimă care dublează viteza reacției de hidratare sau deshidratare.

Activitatea anhidrazei carbonice poate fi exprimată ca activitatea specifică prin raportarea la concentrația de proteină:

Activitatea specifică = To – T x 1__ (U.E./mg. prot.)

T mg. proba

c) Măsurarea reacției catalizate în prezența activatorilor sau inhibitorilor

Deoarece viteza de reacție a unei enzime poate fi crescută sau scăzută prin asocierea ei cu activatori sau inhibitori, efectul acestora asupra activității enzimatice sunt urmărite prin adăugarea lor în mediul de reacție. De obicei aceste determinări se efectuează după relația doză-răspuns la concentrații între 10-8- 10ˉ2 M. În cazul acestei reacții, în cuvă se vor introduce:

►1ml amestec format din – 0,8 ml tampon – indicator

– 0.1 ml soluție AC (3.44×10ˉ 6M)

– 0,1 ml soluție activator sau inhibitor de concentrație între 10-8- 10ˉ2 M.

►1 ml soluție CO2 de concentrație 15 mM.

Calculul activității anhidrazei carbonice se face la fel ca și în cazul reacției catalizate, luându-se în calcul timpul obținut în prezența activatorilor sau inhibitorilor.

Pentru fiecare determinare se fac 8 – 10 probe paralele și se ia în calcul valoarea medie a timpului pentru aceste determinări.

d) Determinarea activității anhidrazei carbonice din eritrocite

Pentru efectuarea determinărilor enzimatice din hematii, sângele este recoltat în seringi sterile a căror pereți au fost în prealabil spălați cu heparină pentru a preveni coagularea.

Se ia 1 ml de sânge proaspăt care este spălat cu 9 ml soluție 0,15 M NaCI și centrifugat zece minute la 3000 rot./min. După centrifugare se îndepărtează supernatantul iar operația de spălare se repetă de trei ori. Se realizează apoi hemoliza eritrocitelor prin suspendarea acestora în 9 ml apă bidistilată. Soluția astfel obținută constituie stocul pentru efectuarea determinărilor de activitate enzimatică. Această soluție poate fi păstrată la 4oC timp de 2 – 3 zile fără să se modifice proprietățile enzimatice.[118,119,120]

Pentru determinările activității anhidrazei carbonice din hematii se face o diluție de 1/10 din stocul hemolizat și se introduc în cuva de reacție astfel:

►1ml. amestec format din – 0.8 ml tampon – indicator

-0.1 ml soluție hemolizat 1/10

-0.1 ml H2O

►1ml. soluție CO2 de concentrație 15mM

Calculul activității volumetrice se face similar cu cel pentru enzima purificată.

Exprimarea activității eritrocitare poate fi făcută și prin raportarea activității volumetrice la hemoglobină. (Hb).

Conținutul de hemoglobină este măsurat spectrofotometric fie ca oxihemoglobină la 540 nm sau ca cianmethemoglobină (CNMet-Hb) la 540 nm.Rezultatele se exprimă ca U.E./100g Hb.

e) Determinarea activității AC din mucoasa gastrică

Pentru estimarea activității AC din mucoasa gastrică se recoltează fragmente biopsice din zona fundică a stomacului sub urmărire video-endoscopică. Fragmentele sunt colectate în soluție NaCl 0.15 M și heparină 1% pentru spălarea și îndepărtarea hematiilor și mucusului. După spălare fragmentele biopsice sunt perfect uscate pe hârtie de filtru până când, după trei cântăriri consecutive uscării, greutatea rămâne constantă. În continuare se recurge la izolarea celulelor parietale, supunând probele biopsice acțiunii colagenazei și pronazei (cea mai eficientă enzimă proteolitică de depolimerizare).

După izolarea celulelor parietale acestea sunt omogenizate și suspendate în apă bidistilată, realizând o soluție stoc de 1mg/ml,care este folosită pentru determinarea activității enzimatice.

Activitatea anhidrazei carbonice, în acest caz, va fi calculată fie ca activitate volumetrică raportată la ml de proba luată în lucru, fie este calculată activitatea specifică:

Activitatea specifică = (U.E./mg)

Studii cinetice

Reacția enzimatică este pusă în evidență prin consumarea substratului sau prin apariția unui nou produs de reacție. Viteza reacției enzimatice crește proporțional cu concentrația de substrat numai în cursul primelor minute de reacție după care scade, rămâne constantă sau crește neproporțional. Aceste abateri pot fi datorate scăderii gradului de saturație a enzimei în substrat, deplasării echilibrului de reacție, instabilității enzimei, inhibiției prin produsul final, etc. Pentru aceste motive este recomandată determinarea vitezei inițiale de reacție, care se realizează indirect prin calcularea acestui parametru dintr-o curbă care redă variațiile vitezei de reacție în timp.

Pentru obținerea unor rezultate concludente, toate soluțiile amestecului de reacție trebuie să fie termostatate la aceeași temperatură, iar reactivii să fie preparați în soluții tampon care să preîntâmpine modificările de pH.[113]

Reacția de hidratare a CO2

Viteza inițială a reacției de hidratare a CO2 este măsurată prin metoda pH-ului schimbător cu spectrofotometrul stopped-flow HI-TECH SF-51 MX, la 400 nm,folosind sistemul Hepes (20mM p-nitrofenol). Temperatura de lucru este menținută la 25oC, iar pH-ul inițial este 7.5.

Concentrația anhidrazei carbonice în cuva de reacție este de 1.72×10-8M iar tăria ionica este menținută constantă cu o soluție Na 2SO4 0.1 M.

S-a urmărit determinarea vitezei maxime de reacție (Vmax) și a constantei Michaelis (Km) atât pentru anhidraza carbonică purificată cât și pentru asociere enzimei cu activatori, respectiv histamina, sau cu antihistaminice H2.

Pentru efectuarea măsurătorilor de viteză inițială s-au luat în lucru diferite concentrații de substrat între 5 mM și 30 mM CO2.Concentrațiile de CO2 luate în lucru au fost determinate spectrofotometric la 340 nm pe analizorul automat IMPACT 400 folosind chitul de reactivi enzimatici pentru determinarea concentrației de CO2.

Datele obținute au fost prelucrate prin liniarizarea de tip Eadie – Hoffstee a ecuației Michaelis – Menten, utilizând programul GraFit (Erithacus Software Ltd.,Anglia).

Pentru calculul mediei și abaterii standard s-a utilizat testul Student, toate valorile parametrilor cinetici reprezentând media a cinci determinări efectuate pentru fiecare probă.

În studiile noastre cinetice s-a folosit ca substrat p-nitrofenil-acetatul urmărindu-se spectrofotometric creșterea absorbanței ionului p-nitrofenil. Măsurătorile s-au efectuat la 25oC cu spectrofotometrul Gilford Response TM (Gilford,U.S.A), prevăzut cu facilități cinetice. Concentrația de enzimă folosită este de 2,29×10-6 M, preparată în tampon Tris-imidazo (pH = 7.4), înainte de fiecare folosire. Concentrațiile de substrat au fost variate între 1 mM și 10 mM p-nitrofenil acetat, iar citirea spectrofotometrică s-a făcut la 348 nm.

Prelucrarea datelor cinetice s-a realizat cu programul GraFit iar prelucrarea statistică a datelor s-a făcut prin testul Student.

Avantajul folosirii acestei variante a metodei stopped-flow constă în consumul minim de reactivi, timpul redus de măsurare și de prelucrare a datelor, posibilitatea de a lucra în condiții de pH și de temperatură cât mai apropiate de condițiile fiziologice. Sensibilitatea metodei este crescută iar determinările efectuate sunt reproductibile.

Metoda de lucru

În continuare vom prezenta datele cercetărilor pe care le-am efectuat in vitro și in vivo studiind efectul famotidinei și a nizatidinei asupra anhidrazei carbonice purificate, efectul acestor antagoniști ai receptorilor H2–histaminici asupra activării produsă de histamină asupra anhidrazei carbonice purificate, precum și a celei din mucoasa gastrică și din hematii.

Experimentele s-au efectuat în cadrul Centrului de Cercetări și Asistență Medicală Șimleu Silvaniei

In vitro

Am urmărit efectul separat al famotidinei și al nizatidinei asupra unor izoenzime ale anhidrazei carbonice,respectiv anhidraza carbonică I și anhidraza carbonică II (purificate), a anhidrazei carbonice din hematii și din celulele parietale izolate din mucoasa gastrică umană.

Am urmărit de asemenea, efectul direct produs de histamină ,famotidină și nizatidină, iar apoi efectul produs de asocierea famotidinei cu histamină și a nizatidinei cu histamină, asupra anhidrazei carbonice I și a anhidrazei carbonice II purificate, ca și asupra anhidrazei carbonice din hematii și din celulele parietale izolate din mucoasa gastrică umană. Determinările s-au efectuat la concentrații între 10-8 – 10-3 M , după relația doză-răspuns.

In vivo

Se determină inițial viteza reacției necatalizate (martor, făra anhidrază carbonică),apoi se determină viteza recției catalizate (în prezența enzimei) pentru a calcula valoarea activității anhidrazei carbonice purificate I și II în condițiile de lucru descrise mai sus.

S-a determinat activitatea anhidrazei carbonice din hematii și din mucoasa gastrică și apoi s-a urmărit, comparativ cu activitatea anhidrazei carbonice purificate I și II ,efectul activator al histaminei (10 ˉ8 – 10ˉ3 M) înainte și după tratament. Aceste determinări au fost efectuate cu scopul de a urmări dacă se produc modificări ale acțiunii histaminei asupra anhidrazei carbonice în urma tratamentului cu famotidină și nizatidină.

La ambele loturi s-a determinat activitatea anhidrazei carbonice din hematii și din mucoasa gastrică înainte de tratament, și după 21 de zile de tratament. Mucoasa gastrică din zona fundică a fost prelevată sub forma de fragmente biopsice sub control video-endoscopic. Celulele parietale au fost izolate urmând tehnica Lewin iar separarea anhidrazei carbonice s-a făcut urmând tehnica Maren. Pentru efectuarea determinărilor asupra anhidrazei carbonice din hematii, sângele a fost hemolizat după tehnica Pockery.[41,44,56]

Rezultate și discuții

În urma determinărilor efectuate rezultatele arată că:

In vitro:

Histamina, în concentrații 10-8–10-3 M, activează atât AC I și II purificată, (tabelul 21, 22,figura 16,17), cât și AC din hematii și din mucoasa gastrică (tabelul 23,24,25,figura 18,19,20), după relația doză-răspuns. Efectul activator maxim se realizează la concentrația 10-3 M.

Tabelul 21-Efectul activator al histaminei al histaminei asupra AC I și a AC II purificate

Indiferent de concentrația de histamină luată în lucru, efectul activator al histaminei asupra AC II purificate este semnificativ mai mare decât a AC I (p<0,001).

Figura 16-Efectul activator al histaminei asupra AC I și a AC II purificate

Histamina nu activează AC I la concentrații 10-8 – 10-4 M (concentrații terapeutice), iar la concentrația 10-3 M activarea este de doar 7%. Histamina activează anhidraza carbonică II, începând de la concentrație de 10-8 M (22%), ajungând la 10-3 M la activare de 98%. (tabelul 21, 22,figura 16,17).

Tabelul 22-Efectul activator al histaminei asupra AC I și a AC II exprimat procentual față de activitatea bazală

Figura 17-Efectul activator al histaminei asupra AC I și a AC II exprimat procentual față de activitatea bazală Anhidraza carbonică din hematii și din mucoasa gastrică a fost recoltată de la bolnavii din cele două loturi înainte ca bolnavii să fie supuși tratamentului cu famotidină (lotul1), respectiv cu nizatidină (lotul 2) și apoi a fost supusă reacțiilor de stimulare in vitro cu histamină în diferite concentrații. Rezultatele evidențiate în tabelele 23, 24, și 25 au fost comparate ulterior cu cele obținute la finalul tratamentului.

Tabel 23. Efectul activator al histaminei asupra AC din hematii și din mucoasa gastrică

înainte de tratament (Lot 1)

Figura 18. Efectul activator al histaminei asupra AC din hematii și din mucoasa gastrică înainte de tratament (Lot 1)

Efectul activator al histaminei asupra AC din hematii și mucoasa gastrică crește cu atât mai mult cu cât concentrația de histamină este mai mare, mai accentuat în mucoasa gastrică decât în hematii,at’t la lotul 1 (y=1,754x+0,185 – mucoasa gastrică, y=1,689x+0,171 – hematii) cât și lalotul 2 (y=1,683x+0,178 – mucoasa gastrică, y=1,614x+0,163 – hematii),așa cum se observă în tabelele 23,24,25 și figurile 18,19,20.

Tabel 24. Efectul activator al histaminei asupra AC din hematii și din mucoasa gastrică înainte de tratament (Lot 2-nizatidină)

Figura 19. Efectul activator al histaminei asupra AC din hematii și din mucoasa gastrică înainte de tratament (Lot 2-nizatidină)

Tabelul 25-Efectul activator al histaminei asupra AC din hematii și din mucoasa gastrică la bolnavi înainte de tratament, exprimat procentual față de activitatea bazală

Chiar dacă efectul activator al histaminei este mai pregnant în mucoasa gastrică față de hematii, diferențele constatate în cazul celor două tipuri de probe biologice nu sunt semnificative, indiferent de concentrația histaminei (p>0,05),așa cum se vede în tabelul 25 și figura 20.

Figura 20-Efectul activator al histaminei asupra AC din hematii și din mucoasa gastrică la bolnavi înainte de tratament exprimat procentual față de activitatea bazală

Datele cinetice s-au prelucrat după ecuația Michaelis – Menten, utilizând liniarizarea de tip Lineaweaver-Burk. Ele ne arată că viteza maximă de reacție (Vmax) crește în cazul asocierii histaminei la anhidraza carbonică II iar Km rămâne constantă (tabelul 26).

Tabelul 26. Date cinetice privind interacțiunea dintre AC II și histamină

la pH = 7,5; T = 25oC; Concentrația AC II = 1.72x 10-8M

Famotidina și nizatidina nu modifică activitatea bazală a AC I și a AC II purificate și nici pe cea din hematiile și mucoasa gastrică prelevată de la bolnavii din cele două loturi (tabelul 27, 28,figura 21,22,23,24).

Tabelul 27. Efectul famotidinei asupra anhidrazei carbonice purificate I și II, a anhidrazei carbonice din hematii și din mucoasa gastrică

Figura 21. Efectul famotidinei asupra anhidrazei carbonice purificate I și II

Nu există diferențe statistice în ceea ce privește efectul famotidinei în activarea AC I și AC II purificate și nici asupra AC din hematii sau mucoasa gastrică, indiferent de concentrația luată în lucru (p>0,05).

Figura 22. Efectul famotidinei asupra anhidrazei carbonice din hematii și din mucoasa gastrică

Tabelul 28. Efectul nizatidinei asupra anhidrazei carbonice purificate I și II,a anhidrazei carbonice din hematii și din mucoasa gastrică

Figura 23. Efectul nizatidinei asupra anhidrazei carbonice purificate I și II

Figura 24. Efectul nizatidinei asupra anhidrazei carbonice din hematii și din mucoasa gastrică

În cazul asocierii famotidinei la histamină, efectul activator al histaminei asupra AC II,de la 1,448±0,112 la 2,869±0,088 (tabelul 22) scade dependent de doză, iar la 10ˉ3 M efectul activator al histaminei este antagonizat cu 62%, de la valori de 2,869±0,088 (tabelul 21) la valori de 1,985±0,119 (tabelul 29,figura 25).

În cazul asocierii nizatidinei la histamină, efectul activator al histaminei asupra AC II scade dependent de doză, iar la 10-3 M efectul activator al histaminei este antagonizat cu 82% de la 2,869±0,088 UE la valori de 1,733±0,098 UE( tabelul 29).

Tabelul 29. Asocierea famotidinei și nizatidinei la histamină scade efectul activator al histaminei asupra AC II

Figura 25. Efectul activator al histaminei asupra AC II și efectul asocierii histaminei cu famotidină, respectiv cu nizatidină

In vivo:

La lotul 1- săptămânal se recolteză probe de sânge și probe biopsice sub control endoscopic de la bolnavii tratați cu famotidină iar probele sunt supuse determinării activității enzimatice, stimulate sau nu cu histamină, in vitro (ex vivo).Se constată că tratamentul cu famotidină scade progresiv, în timp, activitatea AC din hematii și din mucoasa gastrică, astfel încât la sfârșitul tratamentului, după 21 de zile, activitatea AC din hematii scade cu 33% iar activitatea AC din mucoasa gastrică scade cu 28% (tabelul 30).

Tabelul 30..Activitatea AC din hematii și din mucoasa gastrică pe parcursul tratamentului la lotul 1 (tratament cu famotidină)

Pe parcursul celor 3 săptămâni activitatea AC scade semnificativ de la o săptămână la alta (p<0,05), atât în hematii cât și în mucoasa gastrică.

Cu toate că inhibiția activității AC este mai puternică în hematii decât în mucoasa gastrică, diferențele sunt nesemnificative (p>0,05),(tabelul 30,figura 26).

Figura 26 . Inhibiția AC din hematii și din mucoasa gastrică după tratamentul cu famotidină (Lot 1)

La lotul 2 – s-a aplicat aceeași procedură ca și cea de la lotul 1 cu deosebirea că tratamentul s-a făcut cu nizatidină. Se constată că nizatidina scade progresiv în timp, activitatea AC din hematii și din mucoasa gastrică, astfel încât la sfârșitul tratamentului, după 21 de zile, activitatea AC din hematii scade cu 37% iar activitatea AC din mucoasa gastrică scade cu 31% (tabelul 31, figura 27).

Tabelul 31.Activitatea AC din hematii și din mucoasa gastrică pe parcursul tratamentului la lotul 2.(tratament cu nizatidină)

Figura 27. Inhibiția AC din hematii și din mucoasa gastrică după tratamentul cu nizatidina (Lot 2)

Efectul activator al histaminei asupra AC din hematii și din mucoasa gastrică scade progresiv pe toată durata tratamentului cu famotidină și nizatidină.

La inceputul tratamentului AC din hematii este activată de histamină cu 59% (tabelul 23,25,32,figura18,20,28), la sfârșitul tratamentului cu famotidină efectul activator al histaminei este de doar 7% (tabelul 32,figura 28,30), de la valori de 1,725± 0,101 la valori de 1,845± 0,098 . La sfârșitul tratamentului cu nizatidină, efectul activator al histaminei este antagonizat complet (tabelul 23,24,25,32,33,figura 29 ).

La începutul tratamentului AC din mucoasa gastrică este activată de histamină cu 61% (tabelul 32) iar la sfârșitul tratamentului cu famotidină efectul activator al histaminei este de doar 7%, de la valori de 1,725± 0,101 U.E. la valori de 1,845± 0,098 (tabelul 32,figura 31). După tratamentul cu nizatidină efectul activator al histaminei este antagonizat complet (tabelul 33, figura 32

Tabel 32. AC din hematiile bolnavilor din Lotul 1tratați cu famotidină și Lotul 2 tratați cu nizatidină activată in vitro(ex vivo) cu histamină ,înainte și după tratament

Figura 28. AC din hematiile bolnavilor din Lotul 1 tratați cu famotidină activată in vitro(ex vivo) cu histamină, înainte și după tratament

AC din hematiile bolnavilor din Lotul 2 tratați cu nizatidină activată in vitro(ex vivo) cu histamină, înainte și după tratament

Figura 30. Sensibilitatea la schimbare a AC din hematiile bolnavilor din Lotul 1 și 2 tratați cu famotidină versus nizatidină, activate in vitro(ex vivo) cu histamină

Sensibilitatea la schimbare exprimată prin mărimea efectului (Effect size – ES) arată atât în cazul lotului 1 (famotidină), cât și în cazul lotului 2 (nizatidină) un efect maxim la contrații ale histaminei cuprinse între 10-7 – 10-5M.

Chiar dacă mărimea efectului este mai mare la lotul 2(nizatidină) față de lotul 1 (famotdină), indiferent de concentrația histaminei, diferențe semnificative înregistrăm la concetrațiile 10-8 M- 10-3M (p<0,05).

Tabel 33. AC din mucoasa gastrică a bolnavilor din Lotul 1(famotidina) și Lotul 2 (nizatidină) activată in vitro(ex vivo) cu histamină, înainte și după tratament

Figura 31. AC din mucoasa gastrică a bolnavilor din Lotul 1 activată in vitro(ex vivo) cu histamină ,înainte și după tratament

Figura 32. AC din mucoasa gastrică a bolnavilor din Lotul 2 activată in vitro(ex vivo) cu histamină, înainte și după tratament

Figura 33. Sensibilitatea la schimbare a AC din mucoasa gastrică bolnavilor din Lotul 1 și 2 tratați cu famotidină versus nizatidină, activate in vitro(ex vivo) cu histamină

Sensibilitatea la schimbare exprimată prin mărimea efectului (Effect size – ES) arată în lotul 1 (famotidină) un efect maxim la concentrații ale histaminei cuprinse între 10-7–10-4 M, iar în lotul 2 (nizatidină) efectul maxim la concentrații ale histaminei cuprinse între 10-6–10-3M. Chiar dacă mărimea efectului este mai mare la lotul 2 (nizatidină) față de lotul 1 (famotdină), indiferent de concentrația histaminei, diferențe semnificative înregistrăm doar la concetrația 10-6 M (p<0,05).

Concluzii

În urma studiului nostru rezultă că famotidina și nizatidina chiar dacă nu modifică activitatea bazală a AC I și a AC II purificate, ele antagonizează totuși efectul activator al histaminei asupra AC II. In vitro, efectul activator al histaminei asupra AC II purificate este mai puternic antagonizat de către nizatidină decât de famotidina.

In vivo, în urma tratamentului cu famotidină și nizatidină, activitatea bazală a AC din hematii și din mucoasa gastrică este diminuată datorită efectului de antagonizare a histaminei endogene. Această antagonizare a efectului activator al histaminei se realizează atât la nivelul receptorilor H2-histaminici din celula parietală cât și la nivelul AC având ca urmare scăderea activității bazale a AC fiind mai evidentă în cazul tratamentului cu nizatidină.

Histamina activează receptorii H2 histaminergici prezenți în membrana celulei parietale, formând complexul histamină-receptor, având ca urmare creșterea secreției gastrice. Cercetările noastre dovedesc că în procesul secretor, histamina acționează nu numai la nivelul receptorilor H2-histaminici dar și la nivelul izoenzimelor anhidrazei carbonice. În felul acesta se creează un cuplaj funcțional între AC și complexul histamină-receptor. Aceste constatări contribuie la explicarea mecanismelor complexe implicate în procesele de producere a secreției gastrice acide, în care un rol important îl au receptorii H2 histaminici, probabil situați în mare măsură și la nivelul anhidrazei carbonice.

Dacă datele obținute din analiza activității anhidrazei carbonice din hematiile și din probele biopsice prelevate de la bolnavii tratați cu antihistaminice H2, sunt extrapolate asupra datelor obținute in vitro cu aceeași inhibitori H2 asupra activității anhidrazei carbonice purificate, metoda se pretează să fie folosită în analiza calitativă a eficienței terapeutice cu această clasă de substanțe medicamentoase.

III.1.1.1.1.2. Determinarea activității izoenzimei IV a anhidrazei carbonice

Studii in vivo și in vitro

În continuarea studiilor noastre am dorit să urmărim gradul de inhibare a activității altor izoenzime ale anhidrazei carbonice , respectiv a anhidrazei carbonice IV, știind că aceasta e situată la nivelul membranei celulei parietale, spre deosebire de anhidraza carbonică II, prezentă în citoplasma celulelor parietale și a celulelor epiteliale superficiale dar nu și în celelalte tipuri celulare ale mucoasei. Anhidraza carbonică IV se deosebește ca localizare și față de anhidraza carbonică I ce se află cu preponderența (85%) în hematii.[2,121]

Material și metodă

Pentru experimentul in vitro s-au folosit substanțe pure, respectiv:

famotidină procurată de la firma S.C. Helcor S.R.L. Baia Mare și nizatidină, procurată de la firma S.C.Sicomed S.A. București..

histamina de la firma Serva Feinhbiochemica (Heidelberg,Germania)

Tampon Hepes, Tris-imidazol, p-nitrofenol, p- nitrofenil acetat, Na2SO4, de la Serva Feinbiochemia (Heidelberg, Germania).

Chitul de reactivi enzimatici pentru determinarea concentrației de CO2 de la Gilford System (U.S.A).

Efectul famotidinei și nizatidinei a fost cercetat pe anhidraza carbonică IV din mucoasa gastrică. Izolarea celulelor parietale din mucoasă gastrică umană s-a efectuat prin metoda cu colagenază descrisă anterior iar separarea AC IV din celulele principale și parietale gastrice umane s-a efectuat după tehnica Lewin .[118,119,120].

Pentru experimentele in vivo au fost selectați 158 de voluntari, cu ulcere gastrice și duodenale, internați la secția de gastroenterologie de pe lângă Centrul de Cercetări și Asistență Medicală Șimleu Silvaniei .Pacienții sunt de sex masculin, cu vârste cuprinse între 28 și 59 ani, cu o greutate cuprinsă între 65 și 86 kg care au fost împărțiți în 2 grupe și tratați timp de 21 zile astfel:

Lotul 1(80 pacienți) – famotidină, în doză de 20 mg de două ori pe zi, dimineața și seara;

Lotul 2(78 pacienți) – nizatidină, în doză de 150 mg de două ori pe zi, dimineața și seara.

Am urmărit efectul separat al famotidinei și nizatidinei asupra AC IV izolată din membrana celulelor parietale gastrice, din probe biopsice. S-a asociat apoi la concentrații echimolare de famotidină cu histamină și nizatidină cu histamină și s-a studiat efectul acestei asocieri asupra și izoenzimei IV a AC gastrice.Determinările s-au efectuat după relația doză-răspuns,la concentrații cuprinse între 10-8 și 10-4M. [123]

Determinarea activității AC IV s-a efectuat după metoda stopped-flow, urmărindu-se reacția enzimatică de hidratare a CO2 prin tehnica colorimetrică de schimbare a pH-ului, cu un spectrofotometru de cinetică rapidă model HI-TECH SF-51MX (Anglia).

Reactivii utilizați au fost aduși toți la pH = 7,5 și la temperatura camerei (25°C).

Pentru măsurarea activității anhidrazei carbonice s-au folosit:

p-nitrofenol – ca indicator de culoare, în concentrație de 0,2 mM;

tampon Hepes în concentrație de 20 mM,

soluție stoc de anhidrază carbonică purificată în concentrație de 3,44 x 10-6 M

soluție CO2 (15 mM) obținută prin barbotarea CO2 în apă bidistilată;

Na2SO4 0.1 M pentru menținerea tăriei ionice.

Formula de calcul a activității anhidrazei carbonice a fost:

A = To-T/T UE/ml

Unde T0 = timpul reacției necatalizate

T= timpul reacției catalizate (în prezența anhidrazei

carbonice din mucoasa gastrică).

Rezultate și discuții

Înainte de administrarea terapiilor, precum și la sfârșitul tratamentului, tuturor voluntarilor li s-a efectuat examen endoscopic și li s-au recoltat fragmente biopsice de mucoasă gastrică, din zona celulelor parietale, sub control video-endoscopic pentru determinarea activității AC IV.

Izolarea celulelor parietale din mucoasă gastrică umană s-a efectuat prin metoda cu colagenază descrisă anterior iar separarea AC IV din celulele principale și parietale gastrice umane s-a efectuat după tehnica Lewin .[118,119,120].

In vitro:

Într-o primă fază s-a urmărit efectele pe care le produc atât famotidina cât și nizatidina asupra AC IV din mucoasa gastrică.(tabelul 34)

Înr-o altă etapă a analizei antihistaminicelor H2 asupra AC IV din mucoasa gastrică am urmărit atât efectul activator direct al histaminei ,în diferite concentrații molare, asupra AC IV , cât și efectul interacțiunii hiistaminei cu famotidina ,respectiv a histaminei cu nizatidina, (în concentrații echimolare) ,asupra activității AC IV din mucoasa gastrică (tabelul 35 și 36).

Tabelul 34. Efectele famotidinei și nizatidinei asupra AC IV gastrice

Rezultatele obținute in vitro sunt evidențiate în tabelul 34 și figura 34. Ele arată că famotidina și nizatidina nu modifică semnificativ activitatea bazală a anhidrazei carbonice IV din mucoasa gastrică neexistând diferențe semnificative în funcție de concentrație (p>0,05).

Figura 34. Efectele famotidinei și nizatidinei asupra AC IV gastrice

Tabelul 35. Efectul famotidinei și nizatidinei asupra AC IV gastrice, precum și efectul asocierii echimolare a histaminei la famotidină, respectiv la nizatidină

Figura 35. Efectul famotidinei și nizatidinei asupra AC IV gastrice, precum și efectul asocierii echimolare a histaminei la famotidină, respectiv la nizatidină

Tabelul 36. Efectul famotidinei, nizatidinei și histaminei asupra AC IV gastrice, precum și efectul asocierii echimolare a histaminei la famotidină, respectiv la nizatidină, exprimate procentual

Famotidina și nizatidina antagonizează efectul activator al histaminei în proporție de 20-75% în cazul famotidinei și 22-85% în cazul nizatidinei, în funcție de concentrație. Efectul antagonizant este de 1,5-2 ori mai mare în cazu nizatidinei față de famotidină (p<0,02).

Figura 36. Efectul famotidinei, nizatidinei și histaminei asupra AC IV gastrice, precum și efectul asocierii echimolare a histaminei la famotidină, respectiv, la nizatidină exprimate procentual

In vivo:

Datele obținute sunt prezentate în tabelul 37. Ele arată că tratamentul cronic cu famotidină și nizatidină scade activitatea anhidrazei carbonice IV din mucoasa gastrică, astfel: famotidina scade activitatea anhidrazei carbonice IV cu 62% față de valorile inițiale(de la 1,408 la 0,520) UE/ml), iar nizatidina produce o scădere a activității anhidrazei carbonice IV cu 71% față de valorile inițiale (de la 1,556 la 0,451 UE/ml).

Mărimea efectului este de 1,2 ori mai mare în cazul nizatidinei comparativ cu famotidina (ES=9,13 versus ES=7,66).

Tabel 37. Inhibiția izoenzimei AC IV din mucoasa gastrică produsă de famotidină și nizatidină

Figura 37. Inhibiția izoenzimei AC IV din mucoasa gastrică produsă de famotidină și nizatidină

Concluzii

Concluziile care rezultă din aceste studii pornesc de la faptul că rezultatele obținute in vitro dovedesc că agenții terapeutici studiați, aparținând clasei de antihistaminice H2, nu inhibă semnificativ activitatea anhidrazei carbonice IV din mucoasa gastrică, dar antagonizează puternic efectul activator produs de histamină asupra acestei izoenzime. Antagonizarea efectului activator este mai puternică în cazul nizatidinei.

In vivo, tratamentul cronic cu famotidină și nizatidină scade activitatea bazală a anhidrazei carbonice VI din mucoasa gastrică. Această inhibiție se produce probabil prin antagonizarea efectului histaminei endogene. Cercetări anterioare au arătat că histamina, activator puternic și direct al anhidrazei carbonice, menține enzima într-o stare activată și constantă la o anumită valoare bazală, cu atât mai mare cu cât aciditatea secreției gastrice și extinderea ulcerului este mai mare.

Datele obținute sugerează că antagonizarea efectului histaminei de către famotidină și nizatidină se produce nu numai la nivelul receptorilor H2 din celula parietală, ci și la nivelul anhidrazei carbonice IV, enzimă cuplată funcțional cu acești receptori de histamină.

În acest fel activarea anhidrazei carbonice IV prin histamină, urmată de scăderea pH-ului intra- și extracelular, ar putea influența formarea complexului histamină-receptor, cuplarea proteinei Gs urmată de activarea adenilatciclazei și creșterea cAMP-ului care are drept consecință creșterea secreției acide. Prin antagonizarea efectului activator al histaminei de către famotidină și nizatidină, este împiedicată formarea complexului histamină-receptor și ca urmare este întrerupt lanțul prin care se ajunge la stimularea secreției acide, obținându-se astfel un efect de inhibiție al acesteia. Aceste cercetări sugerează că prin izoenzimele ei, atât II cât și IV, anhidraza carbonică poate modula activitatea celorlalte enzime ale celulei parietale implicate în procesul secretor gastric.

III.1.1.1.2. Micrometoda Maren de determinare a activității anhidrazei carbonice

III.1.1.1.2.1. Determinarea activității anhidrazei carbonice purificate studii

in vitro

Urmare a cercetărilor noastre anterioare am continuat să determinăm activitatea anhidrazei carbonice în corelație cu famotidina și cu nizatidina și prin alte metode pe care le aplicasem anterior în cazul cimetidinei și ranitidinei.[63,115]

În cazul cercetărilor pe care le-am efectuat pe anhidraza carbonică purificată am constatat că famotidina și nizatidina nu diminuează semnificativ activitatea anhidrazei carbonice purificate dar diminuează semnificativ activarea enzimei de către histamină.

Material și metodă

Investigațiile s-au efectuat in vitro, și s-au folosit substanțe active de:

famotidină procurată de la firma S.C. Helcor S.R.L. Baia Mare

nizatidină, procurată de la firma S.C.Sicomed S.A. București.

histamina de la firma Serva Feinhbiochemica (Heidelberg,Germania

anhidraza carbonică pură,de origine bovină ,de la firma Boeringer Manheim GmbH

Determinările activității anhidrazei carbonice s-au făcut cu micrometoda Maren, în cadrul Centrului de Cercetări și Asistență Medicală Șimleu Silvaniei, după un procedeu pe care îl descriem în continuare.[119]

Reacțiile au loc într-un recipient special confecționat din sticlă termorezistentă, cu o capacitate de 3 ml în care se deschide un vas capilar, prin care se barbotează continuu un flux de CO2, dintr-un rezervor legat printr-un tub de vasul în care se fac determinările. Constanța fluxului, de 150ml/min, este monitorizată de un rotametruBrooks (Brooks Instrumenta Corp., Statesboro, GA, USA). Toate determinările s-au efectuat la o temperatură constantă, sub control termostatic, de +4oC. [119]

Folosind tehnica enzima-inhibitor, reactanții au fost introduși în vas în ordinea următoare:

substratul: CO2 se barbotează așa cum s-a descris mai sus;

indicator: 0.4 ml dintr-o soluție ce conține 12,5 mg roșu fenol dizolvat în 1l de soluție de 0.0026 mol/l NaHCO3;

enzima: 0.1 ml dintr-o soluție ce conține 10 mg anhidrază carbonică purificată din hematii de bovină dizolvată în 1 l de apă bidistilată;

activator și/sau inhibitor: ca activator s-a folosit histamina într-un interval de concentrații 10-7M-10-2 M; ca inhibitori s-a folosit famotidina și nizatidina într-un interval de concentrații de 10-7- M-10-2M . Volumul a fost imediat ajustat la 0.7 ml cu apă bidistilată

soluție tampon: 0.15 ml dintr-o soluție formată din 30 ml Na2CO3 1 mol/l adăugat la 20.6 ml NaHCO3 1 mol/l și apă bidistilată completat până la 100 ml. Soluția tampon s-a adăugat rapid în cuvă peste ceilalți reactanți, cu ajutorul unei pipete gradate, iar din acest moment timpul se cronometrează până când indicatorul își schimbă culoarea de la roșu la galben.

Determinările activității anhidrazei carbonice (obținut de la firma Boeringer Manheim GmbH) s-a făcut atât în condiții bazale (fără activatori și/sau inhibitori), cât și după adăugarea unui agonist sau a unui antagonist, în concentrațiile arătate mai sus, pentru fiecare substanță luată în lucru (histamină, famotidină, nizatidină).

De asemenea s-a determinat și efectul combinat asupra anhidrazei carbonice a agonistului cu antagoniștii luați în lucru, respectiv, în experimentele noastre, histamina cu famotidina și histamina cu nizatidina.

Activitatea enzimei purificate s-a calculat după formula:

Unde: To = timpul reacției necatalizate,

T = timpul reacției catalizate

S-au efectuat cinci determinări paralele pentru fiecare probă, fiind luată în calcul media acestor determinări. Evaluarea statistică a datelor s-a făcut cu testul Student.

Am urmărit efectul separat al famotidinei și nizatidinei asupra anhidrazei carbonice purificate din hematii.

S-a asociat apoi concentrațiile de 10ˉ6 M, 10-4M și 10ˉ2M ale famotidinei la concentrații molare diferite ale histaminei (10ˉ7M, 10ˉ6M, 10ˉ5M, 10ˉ4M, 10ˉ3M și 10ˉ2M), respectiv concentrațiile de 10ˉ7M, 10ˉ6M și 10ˉ2M ale nizatidinei cu histamina și s-a studiat efectul acestei asocieri asupra anhidrazei carbonice purificate.Determinările s-au efectuat după relația doză-răspuns, la concentrații cuprinse între 10ˉ7M și 10ˉ2M.

Rezultate și discuții

Rezultatele cuprinse în tabelul 38 arată că nici famotidina și nici nizatidina nu au un efect semnificativ asupra anhidrazei carbonice purificate, indiferent de concentrația luată în lucru, diferențele fiind nesemnficative din punct de vedere statistic (p>0,05).

Tabelul 38. Efectul famotidinei și a nizatidinei asupra AC purificată

Figura 38. Efectul famotidinei și a nizatidinei asupra AC purificată

Asociate cu histamina, se constată că, la o concentrație de 10ˉ6 M, famotidina diminuează activarea produsă de histamină asupra anhidrazei carbonice purificate cu aproximativ 20%, iar la o concentrație de 10ˉ2 M activarea enzimei de către histamină este aproape complet inhibată (tabelul 39). Aceeași situație se observă și în cazul nizatidinei dar efectele comparabile se constată la concentrații de 10ˉ7M, respective la 10ˉ2 M.(tabelul 40).

Tabel 39. Efectul famotidinei asupra activării AC purificate de către histamină

Figura 39. Efectul famotidinei asupra activării AC purificate de către histamină

Tabelul 40. Efectul nizatidinei asupra activării AC purificate de către histamină

Figura 40. Efectul nizatidinei asupra activării AC purificate de către histamina

Rezultă că o concentrație maximă de famotidină și nizatidină reduce efectul maxim al histaminei (10ˉ2M) asupra anhidrazei carbonice purificate de la 412283 U.I. la o valoare apropiată celei bazale de 214594 U.I., respectiv 215874 U.I. (p<0,001).

Concluzii

Concluzia care se desprinde din aceste analize este că famotidina și nizatidina antagonizează efectul activator al histaminei asupra anhidrazei carbonice, ceea ce denotă că acesta este însăși mecanismul lor de acțiune, implicând atât receptorii H2 histaminergici cât și anhidraza carbonica.

Prin extrapolarea datelor obținute in vitro putem stabili gradul de eficacitate a tratamentelor cu famotidină și nizatidină în urma stabilirii nivelului activității anhidrazei carbonice din probele biologice (hematii sau probe biopsice prelevate endoscopic din mucoasa gastrică) de la bolnavii aflați sub tratament, așa cum am descris și în alte studii. De asemenea studiind in vitro efectul inhibitorilor H2-histaminici ca substanțe pure asupra anhidrazei carbonice purificate putem corobora aceste date cu cele obținute in vivo, metoda pretându-se ca metodă de analiză a acestor inhibitori atât ca substanță pură cât și din diferite forme farmaceutice.

III.2. METODA DE DETERMINARE HPLC A FAMOTIDINEI DIN

PREPARATE FARMACEUTICE

Cromatografia de lichide pe coloană este una din cele mai sensibile și exacte metode de analiză în domeniul controlului analitic al medicamentelor.Această metodă prezintă avantajul și pentru faptul că, spre deosebire de alte metode, poate fi aplicată pe o mare varietate de probe.

Analizele pin metode HPLC sunt rapide, eficiente și extrem de sensibile, putând detecta cantități de ordinul 100µg. Denumirea de “înaltă performanță” se referă la viteza analizei, a capacității de separare și a sensibilității acesteia. [76,101,122]

HPLC este o metodă cromatografică în care faza mobilă este un amestec de solvenți iar faza imobilă este dată de o coloană constituită dintr-un material solid, inert, impregnat cu un lichid, sau le-au fost grefate grupări organice, sau solidul este de o granulație extrem de fină (5-50µm).

Mecanismele care stau la baza cromatografiei de înaltă performanță sunt :

cromatografia de absorbție – metodă clasică, directă, faza staționară este polară și este formată din silicagel sau aluminiu, iar faza mobilă va fi puțin polară, formată dintr-un amestec de solvenți: izooctan, heptan, hexan, cloroform, clorura de metil, acetat de etil, alcool izopropilic.

cromatografia de repartiție – cu faze inverse, folosită pentru determinarea compușilor mai puțin polari, este cea mai utilizată în analiza subtanțelor medicamentoase și a formelor farmaceutice. În acest caz faza staționară este nepolară, formată din silicagel grefat cu grupări alchil. Faza mobilă va fi polară, formată din apă/metanol, apă/acetonitril sau apă/etanol, la care se pot adăuga sisteme tampon.

cromatografia prin schimb ionic – în care faza staționară este o rașină schimbatoare de ioni; rășinile sintetice folosite sunt materiale polimerice cu masă moleculară mare, conținând multe grupări funcționale ionice per moleculă.

cromatografia de excluziune moleculară – faza staționară este reprezentată de macromolecule.

În cazul HPLC compoziția fazei mobile prevazută la începutul analizei poate să rămână neschmbată pe toată durata determinării (eluție izocratică) sau poate fi modificată după un anumit program (gradient de eluție).

Temperatura coloanei cromatografice se menține constant pe tot parcursul analizei și în majoritatea cazurilor temperatura de lucru este temperatura camerei.

Detectorii, în analiza HPLC, trebuie să indeplinească urmatoarele caracteristici: limita de detecție, limita de cuantificare, de sensibilitate, robustețe, să fie selectivi pentru un anumt grup de substațe sau să fie neselectivi pentru altele, să nu distrugă moleculele substanțelor de analizat și să fie ușor de utilizat.

Cei mai utilizați detectori sunt următorii : [76,89,122]

detectori UV-VIS-cu limita de detecție de ordinul µg;

refractometrul diferențial-măsoară diferența între indicele de refracție a fazei libere și a fazei mobile ce conține componentul de separat;

detectorul de fluorescență – cu o limită de detecție de ordinul 100µg;

detectori electrochimici (amperometrici sau colorimetrici) – cu limita de detecție de ordinul100µg;

spectrofotometrul de masă – are avantajul unei identificări precise a componentului de separat.

În metodele HPLC au loc trei faze principale: injectarea probei, separarea și eluția, apoi detecția. În timpul injectării componentele sunt reținute de faza stationară. Migrarea componentelor prin faza stationară se realizează sub acțiunea a două forțe (mișcarea condusă de faza mobilă și reținerea pe structura fazei staționare). Separarea este rezultatul unei distribuții dinamice între cele doua faze, în care fiecare component din amestec interactionează diferit cu mediul, fată de celălalt component. Are loc în acest caz migrarea diferențiată a constituenților amestecului de-a lungul fazei staționare sub acțiunea fazei mobile.

Metodele HPLC își găsesc aplicații multiple în controlul medicamentelor, atât în cercetările chimice și biochimice, dar și în controlul calității produselor famaceutice. Prin aceste metode se realizează separări de mare precizie și cu rezoluție mare a amestecurilor complexe și oferă posibilități de detecție de o mare exactitate și sensibilitate.[76,122]

Consultând literatura de specialitate,[76,122-126] ne-am propus să validăm o metodă proprie de analiză a famotidinei din forme farmaceutice condiționate în țară, și am recurs la analiza tabletelor de famotidină de la firma S.C.Helcor S.R.L.Baia Mare.

Material și metodă

Pentru elaborarea metodei de analiză s-au folosit următorii rectivi:

famotidină substanță pură procurată de la firma S.C.Helcor S.R.L. Baia Mare

famotidină din preparatul tipizat de firma Helcor sub formă de comprimate filmate de concentrație 40mg

metanol HPLC Grade, procurată de la firma Merck

acid clorhidric p.a. de la firma Merck,

apă bidistilată preparată în laborator

Metoda pe care o implementăm pentru determinarea famotidinei din preparate farmaceutice, se dorește a fi o metodă rapidă,specifică și exactă.

Studiile au fost efectuate în cadrul S.C.Chimprod S.A.Oradea.

Sistemul cromatografic

Analizele HPLC au fost efectuate cu un sistem cromatografic HPLC Able & Jasco (Japonia ) format din:

modul pompe PU – 1580

modul gradient ternar LG – 980 – 02S

modul degazor DG – 980 – 50

modul detector UV – 1575

injector manual RHEODINE

progarm de procesare a datelor BOR WIN 1.50

coloană cromatografică NUCLEOSIL 100 CI8 5 fim 100 x 4,6 mm

faza mobilă a fost compusă din amestecul metanol și soluție 1 % acid acetic cu un debit de 0,4 ml/min ; faza mobilă a fost filtrată.

Toate experimentele au fost conduse la temperatura camerei, de aproximativ 25°C.

Prepararea soluțiilor standard

Soluțiile standard au fost preparate prin diluarea soluției standard stoc de concentrație 1 mg/ml famotidină, obținută prin dizolvarea unei cantități de 0.01 g famotidină substanță pură, exact cântărită în 0.2 ml soluție acid clorhidric 20 %, 2 ml metanol și apă bidistilată în balon cotat de 10 ml. Această soluție s-a păstrat la 4°C fără a se observa modificări în conținut într-o periodă de o lună.

Soluțiile standard de lucru, de concentrații 0,1 mg/ml – 0,0001 mg/ml au fost preparate prin diluarea unui volum corespunzător din soluțiile stoc cu apă bidistilată.

Preparea soluției de analizat din preparatele farmaceutice

Pentru verificarea metodei de analiză s-a determinat principiul activ, famotidina, din preparate farmaceutice:

S-au cântărit exact 10 comprimate conținând 20mg famotidină după care s-au pulverizat fin. Din pulberea rezultată s-au cântărit exact o cantitate corespunzătoare masei unui comprimat, care s-a introdus cantitativ într-un balon cotat de 100 ml. Se adaugă 5 ml metanol, 1 ml soluție HC1 20 % și 50 ml apă bidistilată. Suspensia se agită în baia de ultrasunete timp de oră și se aduce la semn cu apă bidistilată. Suspensia obținută se filtrează.

Mod de lucru

S-au preparat cinci soluții de etalon de lucru, pentru construirea curbei de calibrare, prin diluții repetate ale soluției stoc, conform modului de lucru prezentat, având concentrații de 0,1mg/ml – 0,0001mg/ml. Fiecare soluție a fost cromatografiată în condițiile stabilite, detecția fiind efectuată la lungimea de undă ۸ = 267 nm. Cromatogramele au fost evaluate prin calcularea ariei picului corespunzător picului de famotidină.

Validarea metodei

Liniaritatea

Curba de calibrare s-a construit prin analizarea soluțiilor de concentrații diferite observăndu-se liniaritatea dreptei pentru concentrații de 0,1-0,0001 mg/ml famotidină.

În tabelul 41 sunt prezentate datele experimentale obținute pentru construirea curbei de calibrare a soluției standard, obținându-se un coeficient de corelație 0,99998, ecuația dreptei fiind y = 1145 x+0,19

Tabelul 41. Datele curbei de etalonare a soluției standard

Precizia

Precizia a fost determinată prin cromatografierea de trei ori consecutiv, în aceeași zi și în zile diferite a fiecărei soluții etalon de lucru. A fost calculată deviația standard relativă, RSD, pentru rezultatele obținute.

Acuratețea

Acuratețea a fost determinată prin analiza și determinarea concentrației de famotidină din soluție de concentrații 0,003, 0,008 respectiv 0,015 mg/ml, preparate prin cântărirea exactă a cantității corespunzătoare de famotidină și dizolvare în soluții metanolice slab acide, pentru a obține concentrațiile prescrise.

Rezultate și discuții

Au fost efectuate mai multe experimente pentru a elabora o metodă rapidă, ușoară și precisă pentru determinarea cantitativă a famotidinei în preparate farmaceutice

Au fost investigate mai multe variabile a metodelor HPLC, studiindu-se efectul acestora asupra procesului de separare a famotidinei în coloana cromatografică. S-au determinat capacitatea separării la diferite :

compoziții ale fazei mobile

debite ale fazei mobile

Prin incercări succesive s-a determinat că cele mai bune rezultate s-au obținut în cazul detecției la lungimea de undă ۸ = 267 nm.

Compoziția fazei mobile

Cantitățile diferite de fază organică în fază mobilă va influența analitul care este menținut predominant prin adsorbție în faza staționară. Pentru separarea famotidinei s-a folosit amestecul ce conține:

A = metanol HPLC grade

B = Soluție 1 % acid acetic în apă bidistilată

S-a studiat variația capacității de separare, funcție de conținutul de component organic (A=metanol)

În tabelul 41 și figura 41 sunt prezentate rezultatele variației capacității de separare în funcție de compoziția fazei mobile.

Tabelul 41.Variația capacitații de separare funcție de compoziția fazei mobile

Din datele prezentate rezultă că o separare eficientă și un timp de analiză optim se obține în cazul utilizării unei compoziții a fazei mobile a amestecului A:B =30:70.

Figura 41- Variația capacității de separare în funcție de compoziția fazei mobile

b. Debitul

A fost testată influența debitului de eluent asupra separării. S-au utilizat debite de eluent în intervalul 0,3-0,7 ml/min, determinându-se capacitatea de separare în fiecare caz.

În tabelul 42 și figura 42 sunt prezentate variațiile capacității de separare în funcție de debitul fazei mobile.

Tabelul 42. Variația capacității de separare în funcție de debitul fazei mobile

Figura 42.Variația capacității de separare în funcție de debitul fazei mobile

Având în vedere că la un debit de 0,4 ml/min se obține o separare bună și un timp de retenție optim , Tr=4,16 min., se consideră că acest debit este optim.

Prin urmare, cele mai bune rezultate se obțin utilizând ca fază mobilă un amestec de :

metanol: soluție 1 % acid acetic = 30:70 și

un debit de 0,4 ml/min.

În figura 43 este prezentată comatograma obținută la analiza famotidinei în condițiile de operare stabilite.

Figura 43. Cromatograma obținută la analiza famotidinei

Validarea metodei

Răspunsul liniar al detectorului pentru aria picului corespunzător famotidinei a fost observată la concentrații variind între 0,1 mg/ml și 0,0001 mg/ml, (figura44) obținându-se un coeficient de corelație 0,99998. Ecuația dreptei obținute a fost y=1145 x +0,19.

Utilizând condițiile experimentale stabilite s-a determinat:

limita de detecție – 0,003 µg/ml

limita de cuantificare – 0,015 µg/ml.

Rezultatele studiului de validare a metodei de determinare a famotidinei din preparate farmaceutice sunt prezentate în tabelul 43.

Figura 44- Dreapta de calibrare a famotidinei

Tabelul 43-Rezultatele studiului de validare a metodei de determinare a famotidinei din preparate farmaceutice

Pentru determinările repetate efectuate în aceeași zi și în zile diferite s-a calculat deviația standard relativă ( RSD ). Valorile obținute sunt cuprinse între 0,17 %-0,49 % pentru analizele efectuate în aceeași zi și respectiv 0,38 % și 1,14 % pentru analizele efectuate în zile diferite. Valorile obținute sunt mai mici de 2 %, valoare impusă pentru analiza produselor farmaceutice (tabelul 43).

Determinarea preciziei metodei s-a bazat pe analiza a trei soluții de famotidină preparate după modul indicat, calculându-se eroarea relativă de determinare. Rezultatele obținute sunt prezentate în tabelul 44.

Tabelul 44. Eroarea relativă de determinare a preciziei metodei de lucru

Eroarea relativă la toate determinările efectuate sunt mai mici de 8 %, ceea ce dovedește că metoda este precisă.

Analiza conținutului de famotidină din preparate farmaceutice

Verificarea exactității metodei de analiză elaborată s-a efectuat prin determinarea conținutului de famotidină din preparate farmaceutice. Soluțiile de analizat s-au preparat conform modului de lucru descris.

Fiecare soluție obținută s-a analizat prin cromatografieri repetate, determinându-se pentru flecare preparat eroarea relativă. Rezultatele obținute sunt trecute în tabelul 45.

Tabelul 45. Eroarea relativă a determinărilor pentru famotidină

Din rezultatele obținute se poate observa că metoda propusă permite o determinare exactă ( cu eroare relativă mai mică de 2 %) a conținutului de famotidină din preparatele farmaceutice.

Concluzii

S-a elaborat o metodă HPLC – UV de determinare a famotidinei din preparatele farmaceutice. Analiza este rapidă și exactă, timpul de analiză fiind de aproximativ 10 minute.

Datele obținute la validarea metodei de analiză demonstrează o bună precizie și exactitate.

Metoda propusă poate fi implementată pentru determinarea famotidinei din preparatele farmaceutice.

III.3. COMPLEXAREA FAMOTIDINEI ȘI NIZATIDINEI

CU β-CICLODEXTRINĂ

UN STUDIU RMN H¹ ÎN SOLUȚIE APOASĂ

Ciclodextrinele sunt substanțe heterogene obținute din degradarea enzimatică a amidonului.Ele sunt de trei tipuri:

Alfa- ciclodextrina cu șase unități glucopirazolonice

Beta-ciclodextrina cu șapte unități glucopirazolonice

Gama-ciclodextrina cu opt uniăți glucopirazolonice

Ciclodextrinele pot fi considerate ca și niște capsule cu dimensiuni moleculare. Când cavitatea este plină cu moleculele altei substanțe se consideră că s-a format complexul de incluziune.

Complecșii de incluziune sunt intitulați cei care cuprind două sau mai multe molecule în care una din ele, numită ”oaspete” este inclusă în cealaltă numită “gazdă”, total sau parțial, doar prin forțe fizice și fără legături covalente.Ciclodextrinele sunt gazde tipice pentru complecșii de incluziune. Ele pot forma complecși cu tot felul de molecule având dimensiuni diferite dar compatibile cu dimensiunile cavității. [105,127,128,129] ۸ = 267 nm.

Astfel, în această parte a lucrării prezentăm modul în care am efectuat un studiu RMN H¹ asupra complecșilor de incluziune ai famotidinei și nizatidinei cu β-ciclodextrină, pentru a defini stoechiometria asocierii și tăria legăturilor. S-au efectuat măsurători ale deplasărilor chimice ale protonilor asupra famotidinei, nizatidinei și β-ciclodextrinei, la diferite raporturi molare, permițând determinarea stoechiometrică 1:1 în cazul ambelor substanțe. Constantele de asociere, calculate din graficele de titrare în raport molar au fost de 179.6 Mˉ¹ pentru complecșii famotidină : β-ciclodextrină și de 74.9 Mˉ¹ pentru complecșii nizatidină : β-ciclodextrină. Pe baza acestor rezultate s-a discutat pe scurt geometria acestor complecși de incluziune.

Famotidina și nizatidina, fiind doi inhibitori competitivi ai receptorilor H2 -histaminici, se caracterizează, prin urmare, prin acțiunea lor farmacologică importantă din punct de vedere clinic, de a inhiba secreția gastrică acidă.. Din nefericire, famotidina este foarte puțin solubilă în apă și are un gust amar, iar nizatidina are un gust amar și un slab miros de sulf, ceea ce le face extrem de neplăcute la administrarea pe cale orala. S-au testat mai multe modalități pentru prevenirea sau reducerea efectelor secundare adverse ale medicamentelor, incluzând aici formarea prodrogurilor, microincapsularea sau adăugarea de excipienți neutralizanți.

Ciclodextrinele sunt recunoscute ca fiind un grup de excipienți farmaceutici extrem de mult folosiți [129]. Sunt oligozaharide ciclice compuse din șase ( α- ), șapte ( β- ), sau opt ( γ- ) unități D-glucopiranozice legate prin legaturi α ( 1,4 ), cu o suprafață exterioară hidrofilă și o cavitate centrală hidrofobă. [129,130,131]

Structura lor moleculară le conferă câteva proprietăți unice. Exteriorul hidrofil al moleculelor de ciclodextrină le face solubile în apă dar cavitatea hidrofobă furnizează un micromediu pentru moleculele nepolare de mărime asemănătoare. În soluții apoase ciclodextrinele sunt capabile să formeze complecși de incluziune de tip gazdă-oaspete cu multe medicamente, prin includerea în cavitate a unei molecule întregi de medicament sau a unei părți nepolare a moleculei.

Acest aspect este important de a fi subliniat pentru că, de vreme ce nu se formează legături covalente în timpul formării complecșilor, complecșii sunt în echilibru dinamic cu medicamentul liber, nelegat și cu moleculele de ciclodextrină din soluție.

Complecșii de tip gazdă-oaspete ai ciclodextrinei au multe aplicații. Complecșii ciclodextrinei [130] pot intensifica stabilitatea compușilor volatili și instabili, pot elimina sau reduce gusturile sau mirosurile neplăcute și pot crește solubilitatea apoasă a medicamentelor puțin solubile în apă.[131, 132,133].

Scopul acestui studiu este reducerea efectelor secundare nedorite ale famotidinei și nizatidinei prin complexare cu β-ciclodextrină.Asocierea moleculară între aceste două substanțe și β-ciclodextrină precum și stoechiometria complecșilor de incluziune au fost examinate prin RMN H¹. Metoda RMN se bazează pe analiza variației deplasărilor chimice ale protonilor direct implicați în interacțiune, ca o funcție a concentrației β-ciclodextrinei.

Materiale si metode

β-ciclodextrina (1) conține în medie opt molecule de apă ( substanța a fost achiziționată de la Sigma Chemie GmbH ,Germania). β-ciclodextrina a fost folosită fără purificare ulterioară iar în calculul concentrațiilor soluțiilor s-a ținut cont de conținutul în apă. D2O (conținut în deuteriu 97 %) a fost achiziționat de la Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Tehnologii Criogenice și Izotopice (Râmnicu Vâlcea, Romania). Famotidina a fost achiziționată de la firma S.C.Helcor S..R.L. Baia Mare și nizatidina a fost achiziționtă de la S.C. Sicomed S.A Bucuresti, Romania.

Cercetările s-au efectuat la Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Tehnologii Izotopice și Moleculare Cluj-Napoca.

Structurile și numerotarea protonilor acestor molecule sunt prezentate în figura 45.

(1)

Figura 45. Structura chimică și numerotarea poziției protonilor ciclodextrinei(1),

famotidinei(2) și nizatidinei(3)

Spectrul RMN a fost realizat la 300 MHz folosind un spectrometru Varian- Gemini NMR. Spectrele ¹H-NMR au fost înregistrate în soluție D2O la 295 ± 0.5 °K .

Spectrele au fost colectate prin co-adiția a 32 sau 64 scanări.

Pentru a putea studia procesul de complexare dintre famotidină, nizatidină și β-ciclodextrină în soluție, s-au realizat trei soluții stoc 10 mM în D2O. Din cauza solubilității extrem de scăzute a famotidinei în apă, am folosit ca solvent o soluție de acid acetic deuterizat în D2O 20 % ( v/v) . Pe baza acestor soluții echimolare s-au preparat două serii de nouă eșantioane (i = 1-9 ) conținând atât famotidină sau nizatidină cât și β-ciclodextrină .

Acest lucru s-a realizat prin amestecarea a două soluții la volum constant (2 ml ) în proporții variate, astfel încât s-a eșantionat o gamă completă (0 ≤ r ≤ 1) a raportului r = [X] / ( [H] + [G]) ,unde X = G sau H, iar [H] și [G] reprezintă concentrațiile totale ale gazdei (β-ciclodextrina) și respectiv ale oaspetelui (famotidina sau nizatidina). Același set de eșantioane a fost folosit atât pentru determinarea stoechiometriei cât și a constantei de asociere Ka.

Determinarea stoechiometriei

Mai multe tehnici precum IR sau UV-VIS pot stabili dacă moleculele oaspete formează un complex de incluziune cu β-ciclodextrina în soluție, dar nu pot furniza informații despre configurația geometrică a complexului.

Prin contrast, RMN reprezintă o metodă care furnizează cele mai multe dovezi ale includerii oaspetelui în cavitatea hidrofobă a ciclodextrinei. Includerea unei molecule oaspete în β-ciclodextrină este dovedită de modificările în deplasarea chimică a unor protoni ai moleculei gazdă sau oaspete în comparație cu deplasarea chimică a acelorași protoni în compușii liberi.

Figura 46. Variația deplasării chimice RMN H¹ ai unor protoni ai β-CD după adăugarea nizatidinei

[(Δδ = δfree – δobs) ,G = nizatidina, H = β-CD.]

Astfel, în figura 46 este prezentată variația deplasării chimice RMN H¹ a unor protoni reprezentativi ai β- ciclodextrinei după adăugarea unei cantități semnificative de nizatidină. Același comportament a fost observat când s-a înlocuit nizatidina cu famotidina.

În figura 47 sunt prezentate deplasările de complexare ale protonilor Hd si Hd’ ai famotidinei,respectiv ai nizatidinei la care s-au adăugat cantități semnificative de β-ciclodextrină.

Figura 47. Deplasările de complexare ale protonilor Hd ai famotidinei si Hd’ ai nizatidinei cărora li s-a adăugat β-ciclodextrină.

Absența unor noi picuri RMN care ar putea fi atribuite complexului, sugerează că această complexare este un proces dinamic, substanța inclusă aflându-se într-o rapidă interconversiune între specia liberă și cea legată.

Determinarea stoechiometriei pentru ambii complecși prin metodele variației continue [131] , s-a bazat pe spectrele RMN H¹ ale amestecurilor de famotidină și nizatidină cu β-ciclodextrină, în care concentrațiile inițiale ale celor două specii au fost menținute constante iar raportul a variat intre 1 si 0 ( vezi secțiunea Materiale si Metode ). Graficele variației continue ale Δδ [β-CD] față de r1 = m/(m+n) , unde m si n reprezintă proporțiile β-cicldextrinei și G ( G = famotidina sau nizatidina ) în complexul Xn : (β-CD)m, sunt prezentate în figura 48. Un comportament asemănator s-a obținut pentru famotidină.

În mod asemănător, reprezentările Job Δδ [G] ca o funcție a r2 = n/(n+m), sunt prezentate în figura 49. Deplasarea provocată este definită ca diferența dintre deplasările chimice în prezența sau absența celuilalt reactant la un raport dat “r”. Din considerente de concizie, au fost selectați doar câțiva protoni (cei mai vizibil afectați ) din moleculele gazdă și oaspete.

Figura 48. Deplasări ale protonlor H3, H5 și H6 ai+++-+

β-ciclodextrinei complexate cu nizatidină

Protonii H3 și H5 ai β- CD situați în interiorul cavității sunt considerabil deplasați, confirmând faptul că famotidina și nizatidina interacționează cu interiorul cavității, având astfel loc includerea.

Reprezentările Plot prezintă un maximum la r1 = 0.5 indicând că complecșii au o stoechiometrie de 1 : 1.

Figura 49. Deplasări ale protonlor Hd famotidinei și Hd’ai nizatidinei complexatecu β-ciclodextrina

Evaluarea constantelor de asociere

Pentru a putea aprecia gradul legăturilor intermoleculare între două substanțe și β-ciclodextrină trebuie să fie evaluate constantele de asociere. Constanta de asociere Ka pentru un complex 1: 1 poate fi determinată folosind următoarea ecuație [133]:

Δδ(ij) = ( Δδc(j)/2[X]){[M] + (1/Ka) – [([M] + (1/Ka))2 – 4[H](i)[G](i)]1/2} (1)

unde i și j reprezintă numărul eșantionului, respectiv protonii studiați

Dacă protonul supus studiului aparține moleculei gazdă sau oaspete, atunci X = G sau respectiv H. Δδc(j) reprezintă diferența de deplasare chimică ( pentru un proton dat ) între componentul liber și complexul pur de incluziune. Ecuația ( 1) nu implică aproximări și corelează concentrațiile totale ale moleculelor gazdă și oaspete cu diferențele observate în deplasarea chimică Δδ(ij).

Am folosit un program bazat pe repetarea procedeului urmărind algoritmi specifici pentru a putea introduce valorile experimentale ale Δδ(ij) în ecuația corespunzătoare [130, 131].

Fiecare repetare stabilește un program pătratic pentru a determina direcția cercetării și funcțiile de eroare:

E = Σi Σj ( Δδ(ij) – Δδcalc(ij))2 (2)

Până când rezultatele se apropie. Procedeul de introducere se termină când diferența dintre două valori E consecutive este mai mică de 10-6 .

Prelucrarea intregului set de protoni studiați determină o singură valoare Ka și un set de valori Δδ(ij)calculate. Programul este destul de sensibil de vreme ce permite determinarea variației deplasării chimice a moleculelor gazdă, oaspete sau chiar a ambelor molecule ca funcție a concentrației variabile a moleculei gazdă sau oaspete.

Pentru famotidină: complexul de incluziune β- CD în toate spectrele RMN, semnalele pentru H3 și H5 situat în interiorul cavității moleculei și H6 localizat la extremitatea părții înguste a β- CD ,au prezentat deplasări de câmpuri destul de înalte, în comparație cu β- CD pură, în timp ce protonii H1, H2 si H4 emit semnale practic nemodificate. În prezența β- CD s-a observat o deplasare în jos a câmpului pentru protonii Hd ai famotidinei. Cu toate acestea, semnalul Hc se suprapune cu semnalul β-CD H5 și nu permite determinarea cantitativă a deplasării induse peste întreaga gamă a “r”. Din această cauză, pentru a putea evalua constanta de asociere, am aplicat ecuația (1) unui set de protoni alcătuit din H3, H5 și H6 ai β-CD și Hd ai famotidinei.

Ka totală folosind acest procedeu a fost 179.6 M-1 la temperatura de 295 K.

În cazul nizatidinei, cea mai evidentă variație s-a observat la protonii H3, H5 și H6 apaținând moleculei gazdă, și la protonii Hd’ ai nizatidinei. Aplicănd același procedeu matematic complexului nizatidină – β-CD, s-a obținut o constantă de asociere de 74.9 M-1

Constantele de asociere fiind calculate, se poate determina fracțiunea famotidinei sau nizatidinei complexate, urmărind presupunerea [135] că, valoarea concentrației complexului este dată de formula:

[HG] = {D – (D2 – 4Ka2[G]t[H]t)2}(2Ka)-1 (3)

unde D = Ka([G]t +[H]t) + 1

Substituind [G]t =[H]t = 5 mM, punctul de mijloc în reprezentarea Job, procentajul substanței complexate poate fi obținut ca

q(%) = 100 ([HG]/[G]t)

Constantele de asociere obținute, diferențele relevante Δδc ale deplasării chimice, funcția de eroare, precum și procentajul substanțelor incluse, sunt rezumate în tabelul 46.

Tabel 46. Constantele de asociere Ka (M-1) pentru complecșii puri (ppm) și factorii q(%) pentru complecșii de famotidină și nizatidină cu β-CD

Structura soluției complecșilor

Ciclodextrinele au o formă de trunchi de con, cu o cavitate interioară care este predominant hidrofobă. Cavitatea interioară este deschisă la cele două capete, care au diametre diferite și care, prin urmare, sunt menționate ca și extremitățile largă și îngustă.

Protonii H3 si H5 din fiecare unitate de zahăr sunt orientați spre cavitatea interioară și sunt situați lângă extremitatea largă, respectiv cea îngustă. Ei pot fi utilizați pentru examinarea cavității interioare a ciclodextrinei pentru a depista prezența unei molecule oaspete și pentru a înțelege natura interacțiunilor intermoleculare.

Indicații preliminare în ceea ce privește structura soluției complecșilor de incluziune pot fi obținute prin analizarea datelor variației deplasării chimice ale protonilor.

Spre exemplu, în cazul famotidinei, modificările cele mai mari ale deplasării chimice asupra complexării cu β- CD au fost în cazul β- CD, protonul H5, urmat de protonii H3 si H6. În prezența β- CD, rezonanța protonică a famotidinei era neecranată, cea mai mare deplasare în jos a câmpului fiind observată la Hd. Se poate presupune faptul că famotidina penetreză preferențial torul dinspre partea mai largă, mai accesibilă a cavității, fiind adânc inclusă în cavitatea ciclodextrinei.

Același argument este valabil și pentru complexul nizatidină – β-CD. O structură mai detaliată a complecșilor se poate obține cu ajutorul cadrului rotativ nuclear bidimensional. Efectul spectroscopic ( tehnica ROESY ) și rezultatele detaliate ale modelării moleculare ale acestor experimente constituie continuarea acestui studiu.

Concluzii

În urma acestor experimente se pot rezuma următoarele aspecte:

– formarea complecșilor între famotidină-β-CD și nizatidină-β-CD, precum și stoechiometria și puterea de asociere au fost evaluate prin studierea RMN.

– în cazul ambelor complexe, folosind considerații de tipul modificării deplasării chimice, s-a descoperit o stoechiometrie 1 : 1.

– constantele de asociere calculate sunt în concordanță cu caracterul mai hidrofob al famotidinei în comparație cu al nizatidinei.

Incluziunea gazdă-oaspete ar trebui să fie considerată un proces dinamic în cazul medicamentelor, în care aceeași grupă funcțională (-CH2-S-CH2-CH2-) este inclusă în cavitatea β-CD, în timp ce unitatea tiazolică este localizată deasupra extremității mai largi a β-CD.

Formarea unor astfel de complecși poate fi valorificată în practică prin posibilitatea elaborării unor noi forme farmaceutice în care astfel de combinații îmbunătățesc caracterele orgaoleptice ale substanțelor cu gust sau miros neplăcut, pentru a putea fi mai ușor de administrat bolnavilor.De asemenea ele pot constitui suportul unor noi formulări farmaceutice prin microcapsularea acestor complecși, pentru a sta chiar la baza unor forme orale retard sau cu cedare controlată, știut fiind că astfel de formulări în cazul antihistaminicelor H2 se află într-o fază incipientă chiar pe plan internațional și constituie o prioritate pentru industria farmaceutică.

III.4. CONCLUZII

În parte monografică a lucrării s-a facut o prezentare generală a teoriilor actuale în ceea ce privește mecanismele complexe implicate în producerea secreției gastrice acide ,mecanisme încă incomplet elucidate, dar legate de prezența receptorilor H2 histaminici, M-colinergici, P-prostaglandinici, G-gastrinici, etc., histamina fiind mediatorul chimic comun final al acestor secretagogi.

Diversitatea structurală a acestei clase de medicamente determină o multitudine de reprezentanți ,relația structură-activitate a antihistaminicelor H2 presupune existența unui nucleu heterociclic substituit foarte diferit ca structură chimică, existența unei catene laterale cu 4 atomi de carbon care poate fi înlocuit și de atomi de sulf în poziția a catenei laterale.

S-au trecut în revistă principalele caracteristici fizico-chimice,proprietățile farmacologice, farmacocinetice, chimice și fizico-chimice ale acestora, precum și cele mai importante metode analitice și instrumntale ce se aplică în controlul calității și a stabilității acestor molecule,conform cerințelor autorităților din domeniul medicamentului, (metode titrimetrice, spectrale în UV , IR, cromatografice CSS și GS ,HPLC, RMN, cristalografie cu raze X, spectrometrie de masă).

În partea experimentală, coroborat cu studiile efectuate timp de mai mulți ani pe mai multe antihistaminice H2 (cimetidină,ranitidină,mifentidină, și recent pe famotidină și nizatidină) , prin metode chimico-enzimatice,am contribuit la expllicarea mecanismelor, încă incomplet elucidate, în ce privește producerea secretiei gastrice acide și procesele vindecării prin inhibitorii de H2-histamină.

Cercetările noastre dovedesc că în procesul secretor histamina acționează nu numai la nivelul receptorilor H2 histaminergici dar și la nivelul izoenzimelor anhidrazei carbonice.În felul acesta se crează un cuplaj functional între anhidraza carbonică și complexul histamină-receptor.Aceste constatări contribuie la explicarea mecanismelor complexe implicate în procesele de producere a secreției gastrice acide, în care un rol important îl au receptorii H2 histaminergici, probabil situați în mare masură și la nivelul anhidrazei carbonice.

În urma studiilor noastre rezultă că famotidina și nizatidina chiar dacă nu modifică activitatea bazală a AC I și a AC II purificate, ele antagonizează efectul activator al histaminei asupra izoenzimelor AC, în special a AC II. In vitro, efectul activator al histaminei asupra AC II purificate este mai puternic antagonizat de către nizatidină decât de famotidină.

Atunci cand asociem famotidina și nizatdina cu histamina, se constată că, la o concentrație de 10ˉ6 M, famotidina diminuează activarea produsă de histamină asupra anhidrazei carbonice purificate cu aproximativ 20% iar la o concentrație de 10ˉ2 M activarea enzimei de către histamină este aproape complet inhibată . Aceeași situație se observă și în cazul nizatidinei dar efectele comparabile se constată la concentrații de 10ˉ7 M, respective la 10ˉ2 M.

Studiile au fost efectuate pe anhidrază carbonică purificată din hematii bovine, metoda putându-se preta in vitro și la analiza calitativă a coținutului în substanță activă a antihistaminicelor H2 din forme farmaceutice. În urma tratamentului cu famotidină și nizatidină, activitatea bazală a AC din hematii și din mucoasa gastrică este diminuată datorită efectului de antagonizare a histaminei endogene. Această antagonizare a efectului activator al histaminei se realizează atât la nivelul receptorilor H2 histaminergici din celula parietală cât și la nivelul AC având ca urmare scăderea activității bazale a AC, fiind mai evidentă în cazul tratamentului cu nizatidină.

Antihistaminicele H2, famotidina și nizatidina, au fost studiate în ceea ce privește efectul inhibitor asupra anhidrazei carbonice din hematii și din probe biopsice, in vitro și in vivo asupra izoenzimelor I, II și IV. Famotidina și nizatidina antagonizează efectul activator al histaminei asupra anhidrazei carbonice IV în proporție de 20-75% în cazul famotidinei și 22-85% în cazul nizatidinei, în funcție de concentrație. Efectul antagonizant este de 1,5-2 ori mai mare în cazul nizatidinei față de famotidină.

Activarea anhidrazei carbonice IV prin histamină, urmată de scăderea pH-ului intra- și extracelular, ne demonstrează că ea ar putea influența formarea complexului histamină-receptor, cuplarea proteinei Gs, urmată de activarea adenilatciclazei și creșterea cAMP-ului, care are drept consecință producția secreției acide.

Prin antagonizarea efectului activator al histaminei de către famotidină și nizatidină este împiedicată formarea complexului histamină-receptor și ca urmare este întrerupt lanțul prin care se ajunge la stimularea secreției acide, obținându-se astfel un efect de inhibiție al acesteia.

Experimentele făcute ne conduce la teoria novatoare care încearcă să explice producerea secreției gastrice acide și inhibarea ei prin antihistaminice H2. Aceste cercetări sugerează că prin izoenzimele ei, atât II cât și IV, anhidraza carbonică poate modula activitatea celorlalte enzime ale celulei parietale implicate în procesul secretor gastric, asa cum am arătat detaliat în conținutul tezei.

Prin extrapolarea datelor obținute in vitro putem stabili gradul de eficacitate a tratamentelor cu famotidină și nizatidină în urma stabilirii nivelului activității anhidrazei carbonice din probele biologice (hematii sau probe biopsice prelevate endoscopic din mucoasa gastrică) de la bolnavii aflați sub tratament. De asemenea studiind in vitro efectul antihistaminicelor H2 ca substanțe pure asupra anhidrazei carbonice purificate putem corobora aceste date cu cele obtinute in vivo, metoda pretându-se ca metodă de analiză cantitativă și calitativă a acestor inhibitori atât ca substanță pură cât și din diferite forme farmaceutice.

Au fost efectuate mai multe experimente pentru a elabora o metodă rapidă, ușoară și precisă pentru determinarea cantitativă a famotidinei din preparate farmaceutice. Au fost investigate mai multe variabile ale metodelor HPLC, studiindu-se efectul acestora asupra procesului de separare a famotidinei în coloana cromatografică. S-au determinat capacitatea de separare la diferite compoziții ale fazei mobile și la diferite debite ale fazei mobile.Prin incercări succesive s-a determinat că cele mai bune rezultate s-au obținut în cazul detecției la lungimea de undă λ=261 nm,la o compoziție a fazei mobile de 30:70 metanol : acid acetic1%, și la un debit de 0,4 ml/min.

Analiza validată pentru determinarea cantitativă a famotidinei din preparate farmaceutice este rapidă și exactă, timpul de analiză fiind de aproximativ 10 minute. Datele obținute la validarea metodei de analiză demonstrează o bună precizie și exactitate. Metoda propusă poate fi implementată pentru determinarea famotidinei din preparatele farmaceutice.

S-au testat mai multe modalități pentru prevenirea sau reducerea efectelor secundare ale famotidinei și nizatidinei. În scopul mascării gustului neplăcut al acestor substanțe perceput la administrarea pe cale orală, famotidina și nizatidina au fost complexate cu β-ciclodextrină. Asocierea moleculară între aceste două substanțe și β-ciclodextrină precum și stoechiometria complecșilor de incluziune au fost examinate prin RMN H¹. Metoda RMN se bazează pe analiza variației deplasărilor chimice ale protonilor direct implicați în interacțiune ca o funcție a concentrației β-ciclodextrinei.

Formarea complecșilor între famotidină – β-ciclodextrină și nizatidină – β- ciclodextrină precum și stoechiometria și puterea de asociere au fost evaluate prin studierea RMN. În cazul ambelor complexe, folosind considerații de tipul modificării deplasării chimice, s-a descoperit o stoechiometrie 1:1, ceea ce permite utilizarea acestor complecși în scopul obținerii unor noi forme farmaceutice orale. Constantele de asociere calculate sunt în concordanță cu caracterul mai hidrofob al famotidinei în comparație cu al nizatidinei.

Formarea unor astfel de complecși poate fi valorificată în practică prin posibilitatea elaborării unor noi forme farmaceutice în care astfel de combinații îmbunătățesc caracterele organoleptice ale substanțelor cu gust sau miros neplăcut, pentru a putea fi mai ușor de administrat bolnavilor. De asemenea ele pot constitui suportul unor noi formulări farmaceutice prin microcapsularea acestor complecși, pentru a sta chiar la baza unor forme orale retard sau cu cedare controlată, știut fiind că astfel de formulări în cazul antihistaminicelor H2 se află într-o fază incipientă chiar pe plan internațional și constituie o prioritate pentru industria farmaceutică.

Lucrarea este ilustrată cu 49 figuri,din care 34 în partea experimentală ,și cu 46 tabele din care 26 de asemenea în partea experimentală.

O parte din rezultatele experimentale obținute au fost comunicate(118,119) sau publicate (40,63,117 și cele anexate acestei teze) iar altele urmează să fie publicate (cele care fac obiectul capitolului III.2. și III.3.).

BIBLIOGRFIE

Mycek J.M., Harvey R.A.,Champ P.C.,-Farmacologie Ilustrată Lippincot,ed.2.,Ed .Medicală Callisto, 2000, 235-247.

Pușcaș I.,Buzas G.,-Progrese în fiziopatologia și tratamentul ulcerului gastric și duodenal,Ed.Academiei,Bucuresti,1990, 65-69, 114-119, 305-326.

De Villier P., Arranh J.M., Barbara M., Pollard H., Schwartz J.C.,-Le troisieme recepteur de l'histamine pharmacologie et perspectives therapeutiques, Med. Sci.,2005(2) :321-329

Robert A. ,-Cytoprotection by prostaglandins., Gastroenterology, 1979, 77:761-778.

Goodman & Gilman’s,-The Parmacological Basis of Terapeutics, 5th Edition, McGraw-Hill, Inc.1990, 897-920.

Silecchia G, Spaziani E, Guarino E, Neri T, Grasso E, Mariani P, Materia A, Genco A, Basso N,- Effect of nizatidine versus ranitidine on gastric intraluminal prostaglandin release in duodenal ulcer patients, Scand. J. Gastroenterol. Suppl., 1994, 206:8-13.

Code C.F. -Histamine and gastric secretion-in Wolstholm GEW, O’Connor(eds), London, 1956, 189-219.

Grossman M.I., Konturek S.J.-Inhibition of acid secretion in dog by metiamide, a histamine antagonist acting on H2 receptors, Gastroenterology, 1974, 66:517-521.

In Fauci, Braunwald, Isselbacher, Wilson Martin Kasper,- Extragastric vagal nerves and gastric secretion, Hauser Longo editors: Harrison's Principles of Internal Medicine, 14th, 2002,2:81

Martindale-The Extra Pharmacopoeia, 31-th ed., Royal Pharmaceutical Society, London, 1996, 1218-1220.

Black J.W., Duncan W.A.M., Durant G.J.-Definition and antagonism of histamine H2-receptors ,Nature, 1972, 236: 385-390.

***Comprehensive Parmacy Review 3rd Edition, 1997, Williams&Wilkins Mass Publishing Co., Giza, Egypt, 2001,850-866.

Vecina,S.T., -Farmacología de los antiulcerosos, Emergencias, Barcelona, 2002, 14:S2-S13.

***Physicians’ Desk Reference 52 Edition, , Medical Economics Company, Inc., Montvale, USA, 1998, 1127-1323, 1439-1716, 2864.

Wolff M.E., -Risk of therapeutic aclorhydria Burger’s Medicinal Chemestry, Fourth Edition, John Wiley&Sons. Wormsley K.G., Scand. J. Gastroenterology, 1998,64 (4): 924.

Mahdz,Amr.M., Webster, R.N., – Histamine and antihistamines ,Anaesthesia & Intensive Care Medicine, 2008, 9, (7):324-328.

Chazot,P.L., Shenton,F.C,- H3 Histamine receptors: the gene knockout data so far Current Anaesthesia & Critical Care, 2004 ,15, (1),:23-28

Grandi, D., Morini ,G., -Histamine H3 receptors and the gastric mucosa: A link between protection and epithelial proliferationCurrent Anaesthesia & Critical Care ,2006, 17, (1):37-42

Khanferyan,R.A., LesikD.V., DuBuske,L.M., – Histamine and an H3/H4 receptor antagonist may modulate IgE and nitric oxide production,The Journal of Allergy and Clinical Immunology 2005, 115,(2): 10

Brittain R.T., Jack D., Price B.J., -Recent developments in histamine H2-antagonists,  Trends in Pharmacological Sciences, 1981,2 (C),:310-313.

Ezeamuzie, C.I., Philips, E.,- Histamine H2 receptors mediate the inhibitory effect of histamine on humane eosinophil degranulation, British Journ. of Pharmacology, 2000, 131: 482-488.

Berlin, R.G., Effects of H2-receptor antagonists on the central nervous system, Drug Develop. Res., 1989,227-229

***AHFS-Drug Information-American Hospital Formulatory Service,American Society of Health-System Pharmacists, 1996, 2091-2139;

***Drug Information for the Health Care Profesional-USP DI-19th Edition,1999,1633-1644;

Jackson P.J., Manning P.J., O’Byrne P.M.- A new role histamine H2 receptors in asthmatic airwais, Am. Rev. Resp. Dis., 1998,1:344-351

Brymblecomble R.W., Ganellin C.R.,- Cimetidine and others histamine H2-receptors antagonists.,J. Int. Med. Res.,1975,3: 86

Dassenoy N. -Les antihistaminiques H2, Toulouse Coresp., 1983.,209

Myers, D. -H2 Receptor Antagonists, Journal of Exotic Pet Medicine, 2006, 15, 2: 150-152.

Delgado N.J., Remers W., -Textbook of organic medicinal and pharmaceutical chemistry.,10th ed.Lippincott,Williams &Wilkins, New York, 1989, 335-349.

Jantratid Ekarat, Prakongpan Sompol, Amidon Gordon, Dressman Jennifer-Fesability of Biowaiver Extension to Bioclassification System Class III Drug Products-Clin. Pharmacokinet., 2006; 45(4): 385-399.

***Physicians GenRx-The Complete Drug Reference, Mosby-Year Book, Inc. 1996, 460, 849, 1553, 1833.

Hiroshi Sato, Kousaku Kawashima, Mika Yuki, Hideaki Kazumori, Mohammad Azharul Karim Rumi, Cesar Francisco Ortega-Cava, Shunji Ishihara, Yoshikazu Kinoshita ,-Lafutidine, a novel histamine H2-receptor antagonist, increases serum calcitonin gene-related peptide in rats after water immersion-restraint stress,The Journal of Laboratory and Clinical Medicine, 2003 141, (2): 102-105

Hajime Isomoto, Kenichiro Inoue, Hisashi Furusu, Hitoshi Nishiyama, Saburo Shikuwa, Katsuhisa Omagari, Yohei Mizuta, Kunihiko Murase, Ikuo Murata, Shigeru Kohno ,-Lafutidine, a Novel Histamine H2-Receptor Antagonist, vs. Lansoprazole in Combination with Amoxicillin and Clarithromycin for Eradication of Helicobacter pylori ,Journal of Gastroenterology and Hepatology,2003, 8, (2): 111-119

Errol V.Mathias, Uma P. Halkar, Evans C.Continho -Structure of roxatidine acetate by 1H, 13C AND 15N NMR spectroscopy-Arkivac 2003, XV :102-106.

Fukushima, Y., Otsuka, H., Ishikawa, M., Asano, T., Anai, M., Katsube, T., Ogawa, K., Saitoh, T. -Potent and long-lasting action of lafutidine on the human histamine H2 receptor,Digestion, 2001, 64 (3): 155-160.

Gerald G. Briggs , Histamine2 Blockers and Proton Pump Inhibitors, Family Practice New ,2001,31,( 4) :33

Black J.W.-Reflection on the analytical pharmacology of histamine-H2 receptor antagonists, Gastroenterology, 1993, 105, 963-968.

Tornawski A., Mecanismos Celulares y Moleculares de la Mucosa Gástrica: La Injuria a la Mucosa y la acción protectora de los antiácidos. Revista de Gastroenterología del Perú ,1995 15, (1):109.112.

Buzaș G., Pușcaș I., Moldovan A.-Effect of structurally different H2-histamine receptor antagonists (cimetidine, ranitidine and mifentidine) on human gastric mucosa cabonic anhydrase-Gastroenterology, 1986, 90, (5)2: 1362.

Grant SM, Langtry MD, Brogden RN. Ranitidine: an updated review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties and therapeutic use in peptic ulcer disease and other allied diseases. Drugs 1989; 37:801-817.

Herfindal T.E.,Helms,A.R.,QUAN D.J.,Gourley D.R.,-Clinical Pharmacy and Terapeutics, 5th ed. Lippincott Williams & Wilkins Baltimore, USA, 2006,1227-1326

Labaune J.P., Barre J., Flouvat B., Herman P., Honin G., Trouvin J.H.-Proprietes pharmacocinetiques des medicaments, Ed.Masson, Paris, 1991,186-192

Langtry MD, Grant SM, Gua KL. -Famotidine: an updated review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties, and therapeutic use in peptic ulcer disease and other allied diseases. Drugs 1989, 38:551-90.

Lassman H.E., Ho I., Surendra K.P., Saeo R., Scheffler M. -Farmacodinamică și farmacocinetică la doze multiple de roxatidin acetat, un nou antagonist H2 la oamenii sănătoși, Drugs 1998,35, ( 3): 198-204.

Mallat, A.; Roudot-Thoraval, F.; Bergmann, J.F.; Trout, H.; Simonneau, G.; Dutreuil, C.; Blanc, L.E.; Dhumeaux, D.; & Delchier, J.C.- Inhibition of gastric alcohol dehydrogenase activity by histamine H2-receptor antagonists has no influence on the pharmacokinetics of ethanol after a moderate dose, British Journal of Clinical Pharmacology, 1994, 37(2):208-211.

BlumR.A., Braverman J.A., Patricia Rice Franklin K.- Farmacokinetics and Pharmadynamics of a Novel Nizatidine Controlled- Release Formulation in Healthy Subjects,Journal of Clinical Pharmacology, 2003, 43:74-83.

Winek, Ch.L., Wahba,W.W., Balzer,T.W., Drug and chemical blood-level data 2001 ,Forensic Science International 2001,122,( 2), 107-123

Kumar N, Vij JC, Karol A, Anand BS. -Controlled therapeutic trial to determine the optimum dose of antacids to duodenal ulcer. Gut (BMJ Group), 1984; 25:1199-202.

Merki M.S., Wilder-Smith C., Halter F., Treatment with H2 – receptors antagonists when is the best time to dose. Scand. J. Gastroenterologie, 1988.,84,5,(2):1263-1269

Dammann HG, Dreyer M, Gottlieb WR, Wolf N, Müller P, Simon B. Inhibition of 24-hour acidity by nizatidine, Fortschr Med. 1989, 107(14):321-324.

Tanioka H, Kaga K. Comparison of roxatidine and famotidine on nocturnal gastric juice secretion. J. Int. Med. Res., 1996, 24: 88–91.

Durant G.J., Parson M.E. -Some recent development in histamine H2-receptor antagonists as gastric acid secretion inhibitors- in Progress in the Pathophysiology and Treatment of Gastric and Duodenal Ulcers, edited by Pușcaș I. and Buzaș Gh, Ed. Acad. Rom., 1990, 278-290

Kumar N, Vij JC, Karol A, Anand BS.- Controlled therapeutic trial to determine the optimum dose of antacids to duodenal ulcer. Gut (BMJ Group), 1984; 25:1199-202.

Merki M.S., Wilder-Smith C., Halter F., -Treatment with H2 – receptors antagonists when is the best time to dose. Scand. J. Gastroenterologie, 1988,84,5,(2)1263-1269

Fullarton GM, Macdonald AM, McColl KE. -Rebound hypersecretion after H2-antagonist withdrawal-a comparative study with nizatidine, ranitidine and famotidine ,Aliment Pharmacol Ther. 1991, 5(4):391-8.

Timothy J.Wozniak -Nizatidine description-Analytical Profiles of Drog Substances, Academic Press, ed. Klaus Florey, London, 1990, 19, 399-423.

Evans A.M., Nation R.L., Sansom L.N.- Lack of effect of cimetidine on the pharmacokinetics of R(-)- and S(+)-ibuprofen., Br. J. Clin. Pharmacol.,London UK ,1989, 28(2): 143–149.

Fraser, A.G.; Hudson, M.; Sawyerr, A.M.; Smith, M.; Rosalki, S.B.; & Pounder, R.E. -Ranitidine, cimetidine, famotidine have no effect on post-prandial absorption of ethanol 0.8 g/kg taken after an evening meal. Alimentary Pharmacology and Therapeutics 1992,6(6):693-700.

Kendall, M.J.; Spannuth, F.; Walt, R.P; Gibson, G.J.; Hale, K.A.; Braithwaite, R.; & Langman, M.J.S.- Lack of effect of H2-receptor antagonists on the pharmacokinetics of alcohol consumed after food at lunchtime. British Journal of Clinical Pharmacology 2005,378:1856-1863.

Caballeria, J.; Baraona, E.; Deulofeu, R.; Hernandez-Munoz, R.; Rodes, J.; & Lieber, C.S. -Effects of H2-receptor antagonists on gastric alcohol dehydrogenase activity. Digestive Diseases and Sciences,1991, 36(12): 1673-1679.

DiPadova, C.; Roine, R.; Frezza, M.; Gentry, R.T.; Baraona, E.; & Lieber, C.S. -Effects of ranitidine on blood alcohol levels after ethanol ingestion: Comparison with other H2-receptor antagonists, Journal of the American Medical Association, 1992, 267(1):83-86,

Moldovan A., Bungău S., Szabo I., Unita L., Stanca S., Filip L.-Famotidina și nizatidina protejează mucoasa gastrică de leziunile induse de aspirină paralel cu inhibiția anhidrazei carbonice la acest nivel. Perpective în practica farmaceutică, Ed. Universității Oradea, 2005, 249-252.

Kounenis G,Koutsoviti-Papadopoulou M,Elezoglou V; Effect of nizatidine and ranitidine on the D-tubocurarine neuromuscular blockade in the toad rectus abdominis muscle;Pharmacol. Res., 1994, 155-161.

Lerebours E , Michel P, Hochain P, Berkelmans I. -Nizatidine as maintenance treatment of duodenal ulcer Clinical results; Scand. J .Gastroenterol. Suppl. 1994,206:52-55,371-374,

Hiroshi Mimaki, Shigeru Kagawa, Shoji Kawauchi, Shigeru Ueki, Koji Takeuchi -Bicarbonate stimulatory action of nizatidine, a histamine H2-receptor antagonist, in rat duodenums: Comparison with both ranitidine and famotidine, Gastroenterology, 2001, 120,( 5):156

Friedman LS, Peterson WL.- Peptic ulcer and related disorders., Gastroenterology, 1986,90,5(2): 1362

Sontag SJ-. Prostaglandins in peptic ulcer disease: an overview of current status and future directions. Drugs, 1986. 32:445-7.

Francis KL Chan, Leung, W.K.,-Peptic-ulcer disease ,The Lancet,London,2003,60, (9337): 933-941

Kenji Furuta, Kyoichi Adachi, Yoshinori Komazawa, Takafumi Mihara, Masaharu-Tolerance to H2 receptor antagonist correlates well with the decline in efficacy against gastroesophageal reflux in patients with gastroesophageal reflux disease,Journal of Gastroenterology and Hepatology,2006, 21,  10: 1581-158

Miki Takane Azumi, Tomoo Fujisawa, Comparative study of the speed of acid-suppressing effects of oral administration of cimetidine and famotidine.
Journal of gastroenterology and hepatology, 2005;20(7):1012-1015.

Zoler, M.L., Finn ,R.,-Gastroesophageal Reflux Disease, Family Practice News, 2002, 32, (9): 25

Fonkalsurd E.W., Ashcraft K.W., Coran A.G., Ellis D.G., Grosfeld J.L., Tunell W.P., Weber T.R.,- Surgical Treatment of Gastroesophageal Reflux in Children: A Combined Hospital Study of 7467 Patients; Pediatrics March 1998, 101(3):419-422.

Tomoari Kamada, Jiro Hata, Hiroaki Kusunoki, Yoshinori Fujimura, Tatsuro Tanimoto, Soichiro Kido, Hiroshige Hamada, Ken Haruma , -Effect of Famotidine After Endoscopic Treatment on Bleeding Peptic Ulcers, Gastrointestinal Endoscopy 2005, 61,( 5):169

McGuigan JE. A consideration of the adverse effects of cimetidine. Gastroenterology 1981;80:181-92.

Doug Brunk, -Histamine Blockers May Reduce Colorectal Adenoma Recurrence ,Internal Medicine News, 2001, 34, (23): 21

Mechcatie, E., -Warning On Tizanidine Issued ,Family Practice News
2007,37, (1): 8

Bojiță M., Săndulescu R., Roman L., Oprean R.-Analiza și controlul medicamentelor, Ed.Intercredo, Deva, 2003, 2:17-63,65-96.

Al-Majed,A.A.,Belal,F.,Al-Obaid,A.M.,Dawoud,A.H.,- The Voltammetric Behavior of Nizatidine and its Determination in Biological Fluids. Journal of Pharmaceutical and biomedical analysis,1999,21:319-326

Luksa J, Josić D. -Determination of cimetidine in human plasma by free capillary zone electrophoresis J.Chromatogr . Biomed .Appl.,2004,667(2):321-327.

Bungău S., Merca V., Copolovici l.-Analiza instrumentală și metode de separare-Editura Universității Oradea, 2004,102-123

El Yazhi F.A., Gazy A.A., Mahgaub H., El-Sayed M.A., Youssef R.M.-Spectrofotometric and titrimetric determination of nizatidine –Journal of Pharmaceutical and Biochemical Analysis, 2003, 31, 5: 1027-1034.

Basavaiah K, Nagegowda P. -Determination of ranitidine hydrochloride in pharmaceutical preparations by titrimetry and visible spectrophotometry using bromate and acid dyes. Farmaco., 2004, 59(2):147-53.

Ziemniak, J.A., Chiarmonte, D.A., Schentag,J.J.,- Liquid-chromatographic determination of cimetidine, its known metabolites, and creatinine in serum and urine, Clinical Chemistry, 1981,27: 272-275,

***USPharmacopeia 23- National Formulary 18, 1995, 373, 651, 1094, 1361.

Farthing D, Brouwer KL, Fakhry I, Sica D.- Solid-phase extraction and determination of ranitidine in human plasma by a high-performance liquid chromatographic method utilizing midbore chromatography. Chromatog. B Biomed. Sci. Appl. 1997, 688(2):350-3.

Hare LG, Millership JS, Collier PS, McElnay JC, Carson DJ, Shields MS. -The use of polymeric solid phase extraction and HPLC analysis for the determination of ranitidine in routine plasma samples obtained from paediatric patients, Pharm Pharmacol,2001, 53(9):1265-72.

Hassan EM, Belal F.,- Kinetic spectrophotometric determination of nizatidine and ranitidine in pharmaceutical preparations, J .Pharm. Biomed. Anal. 2002, 27(1-2):31-8.

Ho C, Huang HM, Hsu SY, Shaw CY, Chang BL. -Simultaneous high-performance liquid chromatographic analysis for famotidine, ranitidine HCl, cimetidine, and nizatidine in commercial products, Drug Dev.Ind.Pharm.,1999,25(3):379-385

Kalligas G., Kaniou I., Zachariadis G., Tsoukali H., Epivatianos P.-Thin Layer and High Pressure Liquid Chromatographic Determination of Histamine in Fish Tissues-,Journal of Liquid Cromatography, 1994, 17(11): 2343- 2357.

Kokoletsi MX, Kafkala S, Tsiaganis M.- A novel gradient HPLC method for simultaneous determination of ranitidine, methylparaben and propylparaben in oral liquid pharmaceutical formulation. J .Pharm. Biomed. Anal. ,2005,l 15,38(4):763-7.

Lau-Cam C.A., Rahman M., Roos W.R.-Rapid Reversed Phase High Performance Liquid Cromatographic Assay Method for Ranitidine Hidrochloride in Dosage Form-Journal of Liquid Cromatography, 1994, 17(5):1089-1104.

López-Calull C, García-Capdevila L, Arroyo C, Bonal J.- Simple and robust high-performance liquid chromatographic method for the determination of ranitidine in microvolumes of human serum, Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl., 1997,693(1):228-32.

Tracqui A, Kintz P, Mangin P. Determination of nizatidine and two of its main metabolites in human serum using high-performance liquid chromatography Chromatogr., 1990,529(2):369-76.

Won C. Yang, Hye S, Lee-On – Line Trace Enrichment of Mifentidine in Plasma Using Column-Swetching High Performance Liquid Chromatography-Journal of Liquid Cromatography, 1994, 17(6): 1375-1384.

Zeldelovska D., Stafilov T.-High-performance liquid chromatographic determination of famotidine in human plasma using solid-phase column extraction,J. Serb. Chem. Soc., 2003, 68(11),:883-892.

Zendelovska D, Stafilov T.,- Development of an HPLC method for the determination of ranitidine and cimetidine in human plasma, J. Pharm. Biomed. Anal., 2003,33(2):165-73.

Curea E., Băloescu C. -Controlul medicamentului, Ed. Didactică și Pedagogică, București, 1983.,76-92

Darwish IA, Hussein SA, Mahmoud AM, Hassan AI.- Spectrophotometric determination of H(2)-receptor antagonists via their oxidation with cerium(IV). Spectrochim Acta Mol Biomol Spectrosc., 2008,69(1):33-40.

Grecu I., Curea Elena -Stabilitatea medicamentelor, Ed. Medicală, București, 1987,101.

Koricanac Z., Jovanovic T., Petkovic J., Minic D-Spectrofotometric investigation of famotidine-Pd(II) complex and its analytical application in drug analysis,J.Serb.Chem. Soc., 2004, 69(6): 485-491.

Pavian L.D., Lampman M.G., Kriz S.G.-Introduction to spectroscopy,1997,146-171

Bojiță M., Săndulescu R., Roman L.,Oprean R.,-Analiza și Controlul Medicamentelor,ed. Intercredo,Deva,2002,vol I,37-88,289-307

Walash M, Sharaf-El Din M, Metwalli ME, RedaShabana M., -Spectrophotometric determination of nizatidine and ranitidine through charge transfer complex formation. Arch. Pharm. Res., 2004, 27(7):720-6.

Clarke E.G.C.-Clarke's isolation and Identification of drug, London, The Pharmacy Press, 1986,84-92

Apostu M, Dorneanu V, Bibire N., -Sudiul ranitidinei prin spectrofotometria în vizibil. Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat. Iași, 2003, 107(1):214-217.

Irie T., Uekama K.,- Proton NMR spectroscopy studies,J. Pharm. Sci.,1997, 86: 147.

Abu Zuhri A.Z.,Zatar, N.A.,Shubietah R.M.,Arafat,H.H.- Voltammetric and spectrophotometric determination of nizatidine in pharmaceutical formulations Mikrochimica acta  , 2000, 134, 34: 153-160 

Dumanovic ,D.,Juranic I., DzeletovicD., Vasic V.M.,JovanovicJ.,-Protolytic constants of nizatidine, ranitidine and N,N'-dimethyl-2-nitro-1,1-ethenediamine; spectrophotometric and theoretical investigation, Journal of pharmaceutical and biomedical analysis,  1997,  11: 1667-1678 

Carstensen T.J.-Stabilitatea medicamentelor,Ed. Medison, Wisconsin,2005,424-432

Carstensen T.J., -Drug Stability:Principles and Practices,3rd ed. Ed. Carstensen & Rhodes, New York,2000, 107,329-415

Crowther RS, Bellanger R, Szauter KE.- In vitro stability of ranitidine hydrochloride in enteral nutrient formulas, Ann. Pharmacother. 1995, (9):859-62.

Dentinger PJ, Swenson CF, Anaizi NH.- Stability of famotidine in an extemporaneously compounded oral liquid. Am. J. Health Syst .Pharm. 2000,15,57(14):1340-2.

Otsuka M., Kata F., Matsuda Y.,P- Physiochemical Stability of Cimetidine Amorphous Form Estimated by Isothermal Microcalorimetry- Pharm. Sci.Tech., 2002, 3, (4) 30:1-9.

Halifah R.G.-The carbon dioxid hidration activity of carbonic anhydrase: stop-flow kinetic studies on the native human isozymes B and C.J. Biol. Chem. ,1971, 246:2561-2573.

Puscas I.- Carbonic anhydrase is a modulator of vasculary and secretory processes in the organism.The pH theory.Digestion,1998,59 (3): 671-714

Pușcaș I., Buzaș G., Moldovan A., Cadar l., Costelas I.-Powerful activatory effect of triple interaction of cathecolamines, beta-adrenergic agonists and histamine on human gastric mucosa carbonic anhydrase-Gastroenterology, 1986, 90, (5)2: 1593.

Moldovan A., Timbus A., Chiș A., Filip L., Nasta M.-Relația dintre receptorii H2-histaminici și anhidraza carbonică din mucoasa gastrică, studii in vitro și in vivo,Perpective în practica farmaceutică, Ed. Universității Oradea, 2005, 259-262.

Moldovan A., Bungău Szabo I., Drăgan F.-Acțiunea inhibitorilor H2-histaminici asupra anhidrazei carbonice din mucoasa gastrică, studii in vitro si in vivo. The proceedings of the VI-th National Congress of Pharmacology, Therapeutics and Clinical Toxicology, Ed. Medica Universitară ”Iuliu Hațieganu”, Cluj-Napoca, 2005, 213-217

Lewin M.J.M.-Cell separation-in Methods and Selected Application (Pretlow T.G. , Pretlow T.P,eds.), Academic Press, New York, 1982, 223-245.

Maren T.H.- A simplified micromethod for the determination of carbonic anhydrase and its inhlbitors, J. Pharm. Exptl. Therap., 1960, 130, 26.

Pockery Y., Stone J.T.-The catalytic versatility of eritrocyte carbonic anhydrase. The enzyme-catalyzed hydrolysis of p-nitrophenyl acetate. J.Am. Chem. Soc. 1965,87:5497-5498.

Maren T.H., Wynns G.C., Wistrand P.J.-Chemical properties of cabonic anhydrase IV, the membrane-bound enzyme. Molecular Pharmacology, 1993, 44:901-905.

Roman,L.,Săndulescu,R.,Bojiță,M.,Muntean,D.L.Validarea metodelor analitice, Ed. Medicală, București,2007,201-335

***Validation of Analytical Procedures:Text and Methodology EMEA/CPMP/ICH,1997,381,10-14

***Guideline on Stability Testing:Stability Testing of Existing Active Substances and Related Finished Products European Medicines Agency London, EMEA/CPMP/QWP/ 2003,122: 4-18

***Process Validation-Non-Standard Processes CPMP /QWP/2003, 2054 & EMEA/CVMP,2003, 395,2-16

***Note for Guidance on Pharmaceutical Development ,EMEA/ CHMP/2004, 167068, 3-8

Lupuleasa D.,Pana M., Neagu A.,Sever S.,- Studiu privind prepararea si evaluarea unui complex de incluziune indometacin -b ciclodextrina, Farmacia,1998, XLVI, 1: 12-96

Bogdan M., M.R. Caira, S.I. Farcaș, Inclusion of the niflumic acid anion in beta-cyclodextrin:a solution NMR and Xray structural investigatin,Supramolec. Chem., 2002, 14 (5), 427-436

Bogdan M., S.I. Farcaș, M.R. Caira, Proton NMRspectroscopy studies of the inclusion complex of the niflumic acid with beta-ciclodextrin,Studia Univ. Babeș-Bolyai, Physica Spec. 2001,2, 319-325

Hirose K.,J. Cyclodextrins and the drugs,,Incl. Phenom. Macrocyc. Chem., 2001, 39, 193.

Fromming K.H., J. Szejtli -Cyclodextrins in pharmacy, Dordrecht, Kluwer Acad. Publ. ,1994,447-458

Loftsson T., D.S. Petersen, Cyclodextrin solubilization of water-insoluble drugs: calcipotriol and EB-1089", Pharmazie, 1997, 52:783-785.

Djedaini F., Lin S.Z.,. Perly D.,- Wouessidjewe, High field NMR techniques for the investigation of a beta-cyclodextrin-indomethacin inclusion complex.J. Pharm.Sci. 1990,79, 643.

Venturini C.G., Nicolini J.Machado C.,Machado V.G.,- Properties and recent applications of cyclodextrins, Quim.Nova,2008,31,2:28-33