Translocatiile Cromozomiale – Biomarkeri CU Valoare Diagnostica Si Predictiva In Leucemiile Acute Si Cronice

TRANSLOCAȚIILE CROMOZOMIALE – BIOMARKERI CU VALOARE DIAGNOSTICĂ ȘI PREDICTIVĂ ÎN LEUCEMIILE ACUTE ȘI CRONICE

CUPRINS

INTRODUCERE

Descoperirile importante realizate de-a lungul vremii în domeniul biologiei celulare și moleculare au condus la formularea ideii că la nivel biologic și molecular, cancerul este un termen generic care definește o gamă extrem de largă de boli caracterizate prin alterarea proceselor de creștere și proliferare celulară.

În lumina progreselor actuale în studiul biologiei tumorale, cancerul poate fi privit ca o boală rezultată prin dereglarea sistemelor de control ale celulei care acționează la nivelul transducției, reglării proliferării și a diferențierii. Cancerul este și o boală a diferențierii celulare, celulele neoplazice, considerate imature funcțional, scăpă mecanismele de control ale organismului (Nagy, 2007).

Cancerul devine o boală poligenică, în care progresia tumorală este rezultatul unei combinații infinite și continue de alterări genetice și epigenetice în cadrul unui proces de selecție darwiniană, cu instalarea fenotipului malign.

În anumite circumstanțe, unele antigene asociate cancerului sunt substanțe prezente sau sintetizate de tumora însăși sau produsă de gazdă ca răspuns la existența tumorei, care pot fi măsurate în sânge sau secrețiii și utilizate pentru a diferenția o tumoră de țesutul normal sau pentru a determina prezența tumorii.

Un biomarker reprezintă o caracteristică care poate fi măsurată obiectiv și evaluată ca indicator a unui proces biologic normal, proces patologic sau ca răspuns farmacologic la o intervenție terapeutică (Lyman, 2009).

Termenul de marker tumoral descrie o varietate de molecule care ar putea diferi de normal, în celulele maligne, în țesuturi sau fluide, la pacienții cu neoplazii.

Un marker tumoral este util clinic dacă rezultatul său este util în a separa populațiile mari heterogene în grupuri mai mici, omogene cu rezultate mai precise și predictibile.

Deși se poate vorbi de o adevărată revoluție a markerilor tumorali în ultimile decade, în ciuda progreselor impresionante în biologia tumorală, utilitatea clinică a markerilor nu este încă elucidată la capacitățile maxime.

Una dintre particularitățile celulelor tumorale este că anumite regiuni ale ADN-ului tind să se replice de multe ori, în timp ce alte regiuni sunt deletate. Adesea, aceste schimbări genetice ajută celulele să devină mai maligne – făcându-le să crească și să se răspândească prin corp. Modificările cromozomiale contribuie la dezvoltarea hemopatiilor maligne precum și a fenotipului prin variate mecanisme. Hematopatiile maligne reprezintă grave afecțiuni proliferative ale cel puțin unei clone leucemice derivate dintr-o celulă stem hematopoietică. În linii mari, aceste afecțiuni sunt caracterizate printr-o acumulare, la nivelul măduvei osoase, a celulelor blastice care, ulterior, se pot localiza în diverse situsuri extramedulare. Primele cercetări în vederea asocierii anomaliilor cromozomiale ca și biomarkeri cu valoare diagnostică și predictivă asociate cancerului, au fost făcute în sfera hemopatiilor maligne și mai cu precizie în sfera leucemiilor.

Ca definiție, leucemiile sunt procese patologice maligne ale “pool-ului” leucopoietic global sau diferențiat mielopoietic și limfopoietic, determinate de amplificarea funcției de proliferare și de diminuarea funcției de citodiferențiere, cu sau fără modificări în citodiabază. Mai concis, leucemiile constau în înmulțirea în exces a celulelor tinere, prin descărcarea lor în exces în periferie și din infiltrația lor în diverse țesuturi ale organismului. Înmulțirea în exces se însoțește în leucemiile acute de un deficit total de maturație, astfel încât se înmulțesc celulele foarte tinere. În leucemiile cronice nu apare o inhibiție a maturației, astfel încât înmulțirea se produce la toate vârstele, predominând la vârsta medie, pentru leucemia mieloidă cronică, sau pe vârsta adultă în leucemia limfoidă cronică (Bădescu, 2001).

Scop și obiective

Fiecare persoană prezintă o structură genetică unică, constantă și ireparabilă, ce constituie genotipul. Genotipul reprezintă totalitatea informației genetice existente în nucleul unei celule somatice. Genotipul se formează odată cu zigotul, prima celulă a viitorului organism, în momentul fecundării, prin unirea informației genetice a ovulului cu cea a spermatozoidului.

În condițiile în care pe parcursul formării gameților și a fecundării, au loc procese de recombinare genetică, iar materialul genetic este supus permanent riscului apariției unor mutații, este evident faptul că fiecare zigot este unic și irepetabil, având un genotip particular.

Deși incidența sa este ingrijorătoare (1-6,5 la 100 000 de persoane), etiologia leucemiilor rămâne o necunoscută pentru majoritatea cazurilor. Conform teoriei multi-secvențiale a procesului de carcinogeneză, nu există o cauză unică generatoare a alterărilor ce duc, în final, la apariția leucemiei acute, ci, în procesul de leucemogeneză, intervin factori succesivi, în etape consecutive, care duc la acumularea unor anomalii genetice, pe parcursul unei perioade îndelungate.

Managementul pacientului cu cancer este un proces complex care implică numeroși profesioniști și o varietate de funcțiuni interconectate. Tratamentul trebuie să aibă totdeauna un impact pozitiv asupra pacientului, dar rezultatele tratamentului nu sunt totdeauna previzibile.

Ținând cont de paticularitățile procesului neoplazic, aceste hemopatii maligne pot fi încadrate în tipologia bolilor genetice, pentru că apariția lor necesită producția seriată a mai multor mutații în gene diferite implicate în controlul creșterii, diviziunii și morții celulare (Dăscălescu, 2009).

În literatura de specialitate, se acumulează date care vin, din ce în ce mai puternic, în sprijinul teoriei conform căreia identificarea markerilor biologici din domeniul translocațiilor cromozomiale sunt de un real ajutor în depistarea precoce, insituirea unei conduite terapeutice precum și a predictibilității evoluției pacienților diagnosticați cu leucemie.

Studiul de față își propune:

demonstrarea utilității identificării precoce a biomarkerilor de tipul translocațiilor cromozomiale cu aplicabilitate în cazul leucemiilor, și, ca urmare, importanța studierii acestora

stabilirea eficienței metodelor citogenetice (clasice și moleculare) în identificarea acestor rearanjamente cromozomiale.

Translocațiile cromozomiale sunt primele evenimente care apar în cursul dezvoltării leucemiilor și sunt folosite ca markeri și în alte hemopatii maligne. Testele bazate pe biomarkeri au fost utilizate de mai bine de jumătate de secol, dar interesul asupra aplicabilității lor în procesul de diagnosticare și descoperire de noi tratamente a crescut remarcabil la începutul secolului XXI (Gersen, 2005).

Raționamentul acestui studiu este de a genera date convingătoare care să ajute la înțelegerea modului prin care translocațiile cromozomiale reprezintă factori de predictibilitate în cazul hemopatiilor maligne. Evaluarea prognosticului pacientului reprezintă o practică curentă și studiul factorilor prognostici este integrat în cercetarea științifică. După stabilirea diagnosticului cert de malignitate și a extensiei bolii prin stadializare conform normelor stabilite, un alt moment important, înaintea deciziei terapeutice îl reprezintă identificarea factorilor prognostici. Stadiul bolii nu este însă suficient pentru a determina un prognostic complet.

Acest studiu va aduce un volum important de date în sprijinul fundamentului funcțional cu identificarea unor biomarkeri prognostici asociați cu leucemiile acute și cronică, precum și evaluarea lor în contextul abordului terapeutic, abordând problema atât din prisma geneticii cât și din cea clinică.

Odată stabilită relevanța datelor obținute pentru mecanismele patogene, acestea se pot constitui în repere de baza ale evaluării diagnostice și terapeutice în leucemia acută mieloblastică. Intenția este în mod principal de a deschide noi canale de cercetare, cât și de abordare clinică, din punct de vedere a diagnosticului, prognosticului și al tratamentului modulat în cazul pacienților diagnosticați cu hemopatie malignă.

Motivație și metode de cercetare

Analiza cromozomială a celulei leucemice oferă cele mai importante informații prognostice în leucemie, înainte de începerea tratamentului.

Observațiile privind numeroasele anomalii citogenetice recurente au dus la studii moleculare, care au pus în evidență câteva gene ce ar putea juca un rol cauzal în leucemo-geneză (Fauci, 2002).

Studiul cromozomilor umani joacă un rol important în diagnosticul, prognosticul și monitorizarea tratamentului care implică condiții vizate nu numai de geneticieni ci, de asemenea, de către medici pediatri, obstetricieni/ginecologi, neonatologi, hematologi, oncologi, endocrinologi, urologi, patologi. Însă, testele citogenetice reprezintă adesea o problemă pentru laboratorul spitalelor din lipsa de personal instruit în domeniu sau de aparatura necesară.

Analiza cariotipului urmărește evaluarea numărului, formei, structurii, prezența unor repere morfologice și evidențiază polimorfisme individuale.

Actualmente există diverse metode ce sunt utilizate în evaluarea cariotipului, depistarea anomaliilor cromozomice de număr sau de structură, evidențierea unor markeri cromozomiali în normă sau patologie. Mai mult decât atât, unele tehnici bazate pe tehnologiile ADN recombinat, permit identificarea unor modificări la nivel de secvență de ADN cromozomial.

În dependență de scopul propus, cromozomii pot fi analizați atât în interfază, cât și în timpul diviziunii. Aceasta permite identificarea atât a unor schimbări minore în structura moleculară a ADN (microdeleții, microduplicații), cât și modificări majore în structura și numărul cromozomilor (aberații cromozomiale, aneuploidii) (Lyman, 2009).

Pe baza metodelor de analiză moleculară a acizilor nucleici au fost elaborate o serie de tehnici noi de analiză a cromozomilor interfazici, ce se caracterizează printr-o specificitate și precizie înaltă – metode de hibridizare in situ (FISH, CGH, SKY). De aceea, pentru acest studiu au fost selectate două tehnici: bandare GTG și tehnica FISH.

I. CITOGENETICA HEMOPATIILOR MALIGNE – CONSIDERAȚII GENERALE

Dezvoltarea tehnicilor de investigare a bolilor genetice, de la tehnicile de citogenetică convențională, la cele de citogenetică moleculară, și culminând cu investigațiile moleculare la nivel de secvență genică și expresie genică în diferite țesuturi, au permis stabilirea diagnosticului multor afecțiuni genetice și identificarea mecanismelor cauzatoare. Precizarea etiologiei permite un diagnostic exact, precoce și un sfat genetic adecvat, ca mijloc de reducere a riscului de recurență a bolii în familie.

Pe măsură ce sindroame specifice sunt recunoscute și genele cauzatoare sunt precizate, este posibilă identificarea mutațiilor apărute în cadrul familiilor individuale. Corelația dintre poziția mutației în cadrul secvenței genice și aspectul clinic al bolii va permite identificarea modului de codare al unor segmente genice în diferite domenii funcționale ale proteinelor.

Familiile care au membri afectați trebuie luate în studiu. Analizele de linkaj genic reprezintă un aspect important al cercetării privind bolile rare și trebuie să includă toți membrii disponibili, dar analiza secvențierii genice va fi efectuată doar la indivizii afectați. Indivizii luați în observație pentru analiza linkajului genic vor fi contactați de medicul genetician.

Modelele de studiu pe animal au contribuit la explozia descoperirilor în domeniul geneticii moleculare. În ultimii ani, genetica moleculară a făcut posibilă descifrarea mecanismelor patogenice în multe boli și se așteaptă descoperiri mai avansate pe masură ce cercetările avansează. Cercetarea vizează remedii mai eficiente pentru aceste boli, majoritatea fără tratamente spamente specifice, incluzând posibile terapii genice.

Proliferarea necontrolata a celulelor anormale care se produce în hemopatiile maligne este rezultatul, ca si in cazul altor tipuri de cancere, a alterarii mecanismelor de control si reglare a cresterii si diferentierii celulare. Aceste mecanisme sunt reglate de gene (fragmente cromozomale constituite din ADN, detinatoare a informatiei pentru toate functiile celulare). Alterarea acestor gene duce la transformarea maligna a celulelor prin mecanisme pe care le cunoastem doar partial. In momentul actual exista o serie de tehnici specifice (de citogenetica clasica, hibridizare in situ, genetica moleculara), care permit studierea acestor gene. In acest fel se pot detecta modificarile care permit stabilirea diagnosticului si clasificarea tipului de leucemie iar tratamentul va fi orientat in functie de aceste modificari (http://www.leukemia-net.org) .

Leucemia mieloidă cronică este prima boală neoplazică umană în care s-a descris o anomalie cromozomală constantă și caracteristică: cromozomul Philadelphia (Ph). Este o boala mieloproliferativă cronică, clonală care apare prin transformare neoplazică la nivelul celulei stem multipotente. În faza cronică, pacienții au un număr mare de progenitori mieloizi, celule sangvine precursoare si mature atât în măduva osoasa cât și în sânge.

Multe din anomaliile cromozomiale caracteristice limfoamelor sau leucemiilor implica translocarea între gena ce codifică imunoglobulina sau receptorul celular T (TCR) si o altă genă. Printre genele active în urma juxtapoziției cu locusul Ig sau TCR sunt genele myc și bcl-2. Tot în hemopatiile maligne s-au descris și alte translocații care au ca rezultat apariția unor proteine himerice noi prin fuzionarea secvențelor genice de la un capăt al punctului de ruptură de pe un cromozom cu secvențele genice ale altui punct de ruptura de pe un alt cromozom așa cum se întâmplă în cromozomul Philadelphia.

Alte alele oncogene himerice care au fost identificate codifică factori de trancripție himerici cu structura și funcția alterată, de exemplu în leucemia acută pre-B se produce fuziunea între gena e-2-a de pe cromozomul 19q cu gena pbx-l de pe cromozomul 1q.

1.1. PROTO-ONCOGENE ȘI GENE SUPRESOARE TUMORALE

ROL ÎN DECLANȘAREA ȘI DEZVOLTAREA PROCESULUI MALIGN

În malignizare sunt implicate două mari categorii de gene: oncogenele și antioncogenele (gene supresor tumorale), a căror acțiune se manifestă în diferitele stadii ale apariției și evoluției cancerului. De altfel, una din principalele caracteristici ale acestui grup larg de maladii este multistadialitatea (Figura 1.1).

Oncogenele sunt gene care joacă un rol esențial în controlarea proliferării celulare și codificarea factorilor de creștere și factorii transcripționali. Acestea promovează creșterea autonomă a celulelor canceroase, iar corespondentul lor celular normal se numesc protooncogene. Oncogenele se formează când protooncogenele sunt modificate (mutate). Genele celulare normale sunt denumite protooncogene, iar variantele lor activate – oncogene celulare (c-onc). Activarea acestor gene este rezultatul unor mutații cu câștig de funcție. Aceste gene stimulează continuu, exagerat creșterea conducând la creșterea necontrolată și la transformarea malignă. Oncogenele au efect dominant la nivel celular ca atare o singură alelă mutantă (activată) este suficientă pentru modificarea fenotipului celular. În prezent, sunt cunoscute peste 100 de oncogene din care 70% aparțin familiei Ras.

Figura 1.1. Reprezentarea schematică ae tapelor procesului malig (după Weigant, 1990).

În funcție de nivelul celular la care acționează proteinele codificate de acestea, oncogenele pot fi clasificate în mai multe categorii:

oncogene care codifică factorii de creștere celulari (ex. pdgfrb);

oncogene care codifică receptorii factorilor de creștere (ex. egfr, ret);

oncogene care codifică componentele ale căilor de semnalizare intracelulară (ex. ras, abl);

oncogene care codifică proteine nucleare în special factorii de transcripție (ex. myc);

oncogene care codifică proteine implicate în controlul ciclului celular (ex. mdm2).

Fiind gene dominante, majoritatea mutațiilor responsabile de activitatea oncogenelor survin la nivelul celulelor somatice, mutațiile germinale fiind probabil incompatibile cu dezvoltarea embrionară.

Activarea oncogenelor în celulele somatice – mecanisme:

activarea oncogenelor prin mutații punctiforme (ex. genele familiei Ras; protooncogena ras codifică o proteină membranară G responsabilă pentru transducția semnalului celular, produsele genei ras rămân activate în absența unui semnal adecvat din partea factorului de creștere; mutațiile genei ras sunt implicate în 30% din cancere inclusiv melanoame, plămân și pancreas);

activarea oncogenelor prin translocații cromozomiale, cel mai adesea translocațiile (au fost descrise peste 40 de asemenea translocații cu potențial activator al unor oncogene, în special în limfoame și leucemii);

activare oncogenelor prin amplificare genică, amplificarea genică fiind fenomenul care are ca rezultat producerea mai multor copii ale unor oncogene normale structural (ex. oncogenele myc și erb).

activarea oncogenelor prin inserție virală (mutație inserțională) precum în cazul retrovirusurilor oncogene de exemplu HTLV1 (3,4).

Proto-oncogenele sunt gene funcționale, ce pot fi activate și transformate în oncogene prin mutație punctiformă, translocare sau amplificare genică (Tabel 1.1).

Tabel 1.1. Proto-oncogene și funcțiile lor (http://www.epathology.ro).

Mutațiile punctiforme constau în modificarea arhitecturii DNA prin înlocuirea unei baze azotate cu alta. Pot fi de 3 feluri :

sinonime (când aminoacidul codificat rămâne același);

mis-sens (când codifică alt aminoacid) și

non-sens (codon stop ce codifică un aminoacid terminator).

Translocațiile reprezintă schimbul de gene între 2 cromozomi omologi. Pot fi:

reciproce (fără pierdere de material genetic),

nereciproce (cu pierdere de material genetic) sau

de tip robertsonian (fuziunea centrică).

Consecințele translocațiilor pot fi:

– amplificarea genică (prin inserarea unui fragment ADN lângă un promotor) cu supraexpresie proteică;

– juxtapoziția genică (prin suprapunerea genelor) cu apariția unei proteine de fuziune.

Amplificarea genică reprezintă creșterea numărului de copii în genom prin alterări ale DNA-ului. Amplificarea poate fi intracromozomială (sub forma benzilor de colorare omogenă) sau extracromozomială sub forma corpusculilor double-minute (fragmente cromatidice mici, fără centromere dispuse în perechi).

Genele supresor tumorale (GST), gene ale căror funcții sunt pierdute în cursul carcinogenezei, determină inhibarea proliferării celulare (Tabel 1.2). Versiunile mutante GST din celulele canceroase au activitatea pierdută. Ambele copii alele trebuie să fie inactivate înainte ca funcția genei supresoare de tumori să fie pierdută, rezultând absența unei proteine normale.

GST sunt gene care blochează dezvoltarea neoplaziilor maligne prin reglarea creșterii și proliferării celulare. GST sunt deci gene normale a căror funcție este inactivată prin mutații care trebuie să se producă în ambele alele. Aceasta înseamnă că două evenimente sau mutații trebuie să se producă în prima și apoi în a doua alelă. Mutațiile cu pierderea funcției acestor gene conduc la proliferarea și creșterea celulară necontrolată și la apoptoza ineficientă. Genele supresoare a creșterii tumorale se manifestă ca gene recesive la nivel celular, pentru convertirea fenotipului fiind necesară pierderea sau mutația ambelor alele (inactivare alelică).

Tabel 1 .2. Anti-oncogene și tumorile implicate (http://www.epathology.ro).

Studiile citogenetice au permis identificarea mai multor mecanisme de inactivare a celei de-a doua copii a unei gene supresoare a creșterii tumorale în cancerele ereditare:

– deleții;

– recombinări somatice – prima dovadă a existenței acestui fenomen la nivelul celulelor somatice;

– pierderea unui cromozom asociată cu duplicarea cromozomului restant.

– pierderea unei copii funcționale a unei gene supresoare a creșterii tumorale a fost denumit pierderea heterozigozității (loss of heterozygosity, LOH). Pierderea heterozigozității este mecanismul cel mai frecvent de inactivare a celei de-a doua alelele produse prin moștenirea unei gene supresoare a creșterii tumorale mutante.

Genele supresoare a creșterii tumorale codifică proteine cu funcții extrem de diverse: receptorii membranari (ex. PTCH), proteine citoplasmatice (ex. APC, NF1), proteine nucleare ( p53, Rb1, VHL, WT1, TM, BRCA1).

Genele supresoare a creșterii tumorale au fost clasificate de Vogelstein și Kinzler (1996) în două categorii majore: gene gate-keeper („portar”) și gene caretaker („îngrijitor”).

Genele gate-keeper sunt gene care codifică proteine implicate direct în controlul creșterii celulare de exemplu, inhibând mitoza sau promovând apoptoza). Funcția acestor gene este critică pentru supresia tumorală. Exemple de gene gate-keeper sunt: APC, VHL, TP 53, NF1 sau PTEN. Mutațiile germinale ale tuturor acestor gene determină producerea unor boli genetice cu risc crescut de dezvoltare a a canceruui care prezintă o transmitere dominantă (ex. sindromul Li-Fraumeni).

Genele care-taker sunt gene care codifică proteine implicate în menținerea stabilității genomului. Alterările acestor gene au drept consecință creșterea frecvenței mutațiilor la scara întregului genom, inclusiv a protooncogenelor și a genelor supresoare tumorale și determină fenomenul de instabilitate genomică.

O atenție particulară este acordată genelor implicate în repararea leziunilor ADN. Genele de reparare ale ADN, ale căror funcții sunt inactivate în carcinogeneză conduc la instabilitate genomică. Genele de reparare ale ADN afectează proliferarea sau supraviețuirea indirect prin influențarea capacității organismului de a repara leziuni neletale la nivelul altor gene incluzând protooncogenele, genele supresoare tumoral și genele care reglează apoptoza.

Unele defecte în mecanismele de reparare a ADN pot predispune la mutații în genom și astfel, la transformarea neoplazică. Această predispoziție la mutații se numește fenotip mutator, iar genele implicate în mecanismele de reparare se numesc și gene mutator. Cu unele excepții, sunt necesare mutații în ambele alele ale genelor de reparare ale ADN pentru a induce ceea ce se numește instabilitate genomică – adică capacitatea de achiziții sau reparare a mutațiilor în absența unor factori cauzatori. În acest sens, genele mutator pot fi considerate gene supresoare. Incapacitatea mecanismelor de reparare a ADN poate predispune la mutații.

În celulele canceroase mutațiile au fost identificate în genele care reglează ciclul celular (protooncogene și genele supresoare de tumori) sau de reparare a leziunilor ADN (genele de reparare). Mutațiile funcționale ale genelor de reparare ale ADN accelerează acumularea mutațiile genelor supresoare și protooncogenelor (Marinca, 2007).

Tabelul 1.3 prezintă câteva anomalii citogenetice care afectează atât oncogenele, cât și antioncogenele și generează diferite tipuri de tumori maligne.

Tabel 1. 3. Tipuri de anomalii citogenetice (http://www.epathology.ro)

1.2. LEUCEMIILE ACUTE MIELOBLASTICE ȘI LIMFOBLASTICE

Leucemiile mieloide sunt un grup heterogen de boli caracterizate de infiltrarea sângelui, a măduvei osoase și a altor țesuturi de către celule neoplazice ale sistemul hematopoietic.

În 1996, numărul estimat de cazuri noi de leucemie mieloidă a fost, în Statele Unite, de 12.800. Aceste leucemii cuprind un spectru larg de boli maligne, de la cele care, netratate, pot fi fatale în scurt timp, la cele care evoluează lent. Pe baza evoluției leucemiilor mieloide netratate, acestea au fost împărțite în acute și cronice.

Incidența leucemiei mieloide acute (LMA) este de aproximativ 2,3 la 100.000 de locuitori pe an, iar incidența corectată în funcție de vârstă este mai mare la bărbați decât la femei (2,9 față de 1,9). În ultimii 20 de ani, incidența leucemiei mieloide acute nu a suferit modificări semnificative. Incidența leucemiei mieloide acute crește cu vârsta; sub 65de ani ea este de 1,3, iar peste 65 de ani incidența este de12,2 la 100000.

Ereditatea, radiațiile, expunerea la substanțe chimice și la alți factori profesionali, precum și medicamentele, au fost implicate în apariția leucemiei mieloide acute. Nu există date directe cu privire la o etiologie virală a acestei boli.

Anumite sindroame cu aneuploidie cromozomială a celulelor somatice, ca de exemplu, sindromul Down (trisomia cromozomului 21), Klinefelter (XXY și variante) și Patau (trisomia cromozomului 13), sunt asociate cu o incidență crescută a leucemiei mieloide acute. Boli moștenite cu fragilitate cromatiniană excesivă (anemia Fanconi, sindromul Bloom, ataxia-telangiectazia și sindromul Kostmann) sunt, și ele, asociate cu o incidență crescută a leucemiei mieloide acute.

Supraviețuitorii exploziilor atomice din Japonia în cel de-al II-lea Război Mondial au prezentat o incidență mai mare a leucemiilor mieloide, care a atins maximum la 5-7 ani de la expunere. Iradierea terapeutică singură pare să crească puțin riscul de leucemie mieloidă acută, dar riscul la persoanele expuse la agenții alchilanți, este mai mare.

Benzenul, folosit ca solvent în industria chimică, a materialelor plastice, cauciucului și în industria farmaceutică, a fost asociat cu o creștere a incidenței leucemiei mieloide acute. Fumatul și expunerea la produse petrolifere, vopsele, lichide de conservare, oxid de etilen, ierbicide, pesticide și la câmpuri electromagnetice au fost, de asemenea, asociate cu un risc crescut la leucemie mieloidă acută.

Medicamentele antineoplazice sunt principala cauză a leucemiei mieloide acute asociată cu administrarea medicamentelor (sau a LMA asociată cu terapia). Leucemiile asociate cu administrarea de agenți alchilanți apar, în medie, la 48-72 de luni de la expunere, putând fi evidențiate aberații la nivelul cromozomilor 5 și 7. Leucemiile asociate cu inhibitorii topoizomerazei II apar la 1-3 ani după expunere și prezintă, de obicei, aberații care afectează banda cromozomială 11q23. În mod similar, cloramfenicolul, fenilbutazona și, mai rar, metoxipsoralenul și clorochina, au fost citate drept cauze ale insuficienței măduvei osoase ce pot evolua spre LMA.

Împărțirea leucemiilor acute în grupuri biologic distincte se bazează pe tehnici morfologice, citochimice și de imunofenotipare, ca și citogenetice și moleculare (Fitzgerald, 1991).

1.2.1. Clasificare morfologică și citochimică

Diagnosticul de LMA se stabilește pe baza prezenței a cel puțin 30% mieloblaști în sânge și/sau în măduva osoasă. Mieloblaștii au cromatină nucleară de aspect fin, uniform, ca o dantelă, și 2-5 nucleolimari în fiecare celulă. Dacă nu sunt prezente granulații citoplasmatice specifice, corpi Auer sau plierea și incizarea nucleului, caracteristice celulelor monocitoide, caracteristicile morfologiceo observate la microscopul optic pot să nu fie suficiente pentru a clarifica diagnosticul.

LMA este clasificată pe baza criteriilor morfologice și citochimice, conform schemei FAB (French, American and British), care include opt subtipuri majore, M0-M7. În LMA varianta M1, o reacție pozitivă la mieloperoxidază (prezența mieloperoxidazei în 3% sau mai mult dincelulele blastice) poate fi singura trăsătură caracteristică care o diferențiază de leucemia limfoblastică acută (LLA) de tip L2. Tipurile M2 și M3 sunt cele mai intens peroxidazo-pozitive, în timp ce M4 prezintă o activitate mai redusă, iar la subtipurile M5 și M7 reacția peroxidazei este limitată sau nu apare deloc (Tabel 1.4).

Tabel 1. 4. Clasificarea FAB a LMA (după Fritz, 2005)

1.2.2. Clasificare imuno-fenotipică

Fenotipul celulelor din LMA umană poate fi studiat prin citometria în flux multi parametrică, după marcarea cu anticorpi monoclonali împotriva antigenelor de pe suprafața celulelor.

Rezultatele sunt utile atât pentru diagnostic, cât și pentru prognostic. De exemplu, M0, caracterizat prin morfologie imatură și lipsa reacțiilor citochimice specifice pentru linia celulară, se identifică prin punerea în evidență cu ajutorul citometriei în flux a antigenelor CD (cluster designation) 13 sau 33, mieloid-specifice. În mod similar, M7 poate fi adesea identificat doar prin exprimarea antigenului specific plachetar CD41 sau prin evidențierea mieloperoxidazei cu microscopul electronic. Un exemplu de utilizare a imunofenotipării pentru evaluarea prognosticului este evoluția negativă a pacienților pe ale căror celule leucemice sunt co-exprimate CD13, CD14 și CD34.

În plus, se studiază utilizarea citometriei de flux multiparametrice pentru evaluarea bolii reziduale după tratamentele efectuate în LMA.

1.2.3. Clasificarea cromozomială

Analiza cromozomială a celulei leucemice oferă cele mai importante informații prognostice în LMA, înainte de începerea tratamentului. Doar două anomalii citogenetice au fost asociate în mod invariabil cu un grup specific FAB: t(15;17)(q22;q11-12) cu M3 și inv(16)(p13q22) cu M4Eo. Cu toate acestea, multe anomalii cromozomiale au fost asociate primar cu un grup FAB, inclusiv t(8;21)(q22;q22) cu M2, și t(9;11)(q22;q23) și alte translocațiicare implică 11q23 cu M5. Multe din anomaliile cromozomiale recurente din LMA au fost asociate cu caractere clinice specifice. Asociate mai frecvent cu vârsta tânără a pacienților sunt t(8;21) și t(15;17), iar cu vârsta mai înaintată, del(5q) și del(7q).

Limfadenopatia este asociată cu inv(16); cloromul cu t(8;21); coagularea intravasculară diseminată (CDI) cu t(15;17); implicarea sistemului nervos central cu inv(16), și diabetul insipid,febra și infecția sunt asociate cu monosomia 7. Motivele pentru care diferite manifestări clinice specifice sunt asociate cu unele anomalii cromozomiale nu sunt cunoscute.

Pacienții cu leucemie mieloidă acută se prezintă cel mai adesea cu simptome nespecifice, care apar progresiv sau brusc și care sunt consecința anemiei, leucocitozei, leucopeniei sau disfuncțiilor leucocitare, sau trombocitopeniei. Aproape jumătate din pacienți au avut simptome cu 3 sau mai multe luni înainte ca leucemia să fie diagnosticată.

Jumătate dintre pacienți menționează oboseala ca prim simptom, dar majoritatea se plâng de oboseală sau slăbiciune în momentul diagnosticului. Alte acuze nespecifice, cum sunt anorexia și pierderea în greutate, sunt și ele obișnuite. În circa 10% din cazuri, febra este primul simptom, însoțită sau nu de o infecție identificabilă. De asemenea, la 5% dintre pacienți, primul semn este o anomalie a hemostazei (sângerare, echimoze). Uneori, simptomele de debut pot fi dureri osoase, limfadenopatie, tuse nespecifică, cefalee sau diaforeză.

Rareori, pacienții se prezintă cu simptome determinate de formațiuni localizate în țesuturile moi, sân, uter, ovare, dura mater craniană sau spinală, tactul gastrointestinal, plămân, mediastin, prostată, oase, sau în alte organe. Aceste formațiuni reprezintă tumori de celule leucemice și sunt denumite sarcom granulocitar sau clorom. La acești pacienți, LMA tipică poate să apară ulterior, sau să nu mai apară deloc. Astfel de situații, rare, sunt mai frecvente la pacienții cu translocații t(8;21).

Febra, hepatomegalia, splenomegalia, limfadenopatii, sensibilitate sternală și semne de infecție sau tendințe hemoragice sunt observate adesea când se pune diagnosticul. Sângerări semnificative în tractul gastrointestinal, hemoragii intrapulmonare sau intracraniene se observă mai frecvent în leucemia M3. Sângerările asociate cu coagulopatii pot să apară și în leucemia de tip M5, și însoțesc leucocitoza și trombocitopenia extremă în alte subtipuri din clasificarea FAB. Hemoragiile retiniene sunt observate la 15% dintre pacienți.

Infiltrarea cu celule leucemice blastice ale gingiilor, pielii, țesuturilor moi sau meningelor, observată în momentul diagnosticului, este caracteristică pentru subtipurile monocitare (M4 și M5).

În momentul diagnosticului, anemia este de obicei prezentă și poate fi severă. Gradul de anemie variază considerabil, independent de alte constatări de ordin hematologic, de splenomegalie sau de durata simptomelor. Anemia este de obicei normocromă și normocitară. Scăderea eritropoiezei are deseori drept rezultat o reducere a numărului de reticulocite, iar durata de viață a globulelor roșii este scăzută ca urmare a distrugerii accelerate. De asemenea, la anemie contribuie și pierderile active de sânge.

Numărul mediu de leucocite la prezentare este de aproximativ 15.000/μl. Între 25 și 40% dintre pacienți pot avea mai puțin de 5000 leucocite/μl, iar 20% au cifre mai mari de 100.000 leucocite/μL. Mai puțin de 5% dintre pacienți nu au celule leucemice detectabile în sângele periferic. Funcția neutrofilelor poate fi defectuoasă, așa cum se vede din deficiențele funcționale de fagocitoză și migrare, iar din punct de vedere morfologic, prin lobulația anormală și prin deficitul de granulație.

În momentul diagnosticului, numărul de plachete este mai mic de 100.000/μl la circa 75% dintre pacienți, în timp ce 25% pot prezenta valori mai mici de 25.000/μl. Se pot observa atât anomalii morfologice, cât și funcționale ale plachetelor, inclusiv plachete de dimensiuni mari și de forme bizare, cu granulații anormale, precum și incapacitatea plachetelor de a se agrega sau de a adera între ele în mod normal.

Odată ce se suspectează diagnosticul de LMA, trebuie efectuată o evaluare rapidă și trebuie inițiat tratamentul corespunzător. În Figura 1.2 se prezintă succint etapele care se parcurg în terapia specifică pentru LMA, în funcție de stadiul în care se inițiază aceasta.

Figura 1. 2. Etapele terapiei în LMA

În afară de clarificarea subtipului de leucemie, studiile inițiale trebuie să evalueze integritatea funcțională generală a sistemelor și organelor importante, ce includ aparatele cardiovascular, pulmonar, hepatic și renal. Înainte de a începe tratamentul, trebuie să se estimeze factorii care au semnificație prognostică, pentru obținerea unei remisiuni complete și pentru a anticipa durata remisiunii. Se vor preleva celule leucemice de la toți pacienții, acestea fiind crioconservate, pentru a fi utilizate în viitor, pe măsură ce teste noi devin disponibile. Toți pacienții vor fi evaluați în vederea stabilirii existenței unor infecții, aparente sau nu. Majoritatea pacienților sunt anemici și au trombocitopenie în momentul prezentării la medic. Imediat ce sunt cunoscute rezultatele studiilor inițiale, trebuie să înceapă înlocuirea promptă a componentelor sanguine, dacă acest lucru este necesar.

Deoarece disfuncțiile plachetare calitative sau prezența unei infecții pot crește probabilitatea sângerării, existența hemoragiilor justifică transfuzia imediată de plachete, chiar dacă numărul acestora este doar moderat scăzut.

Testele funcționale hepatice sunt anormale la aproximativ 20% din pacienți în momentul diagnosticului. Dat fiind că unii agenți chimioterapeutici sunt detoxifiați și excretați de ficat, poate fi necesară modificarea dozelor de medicamente la pacienții cu tulburări ale funcțiilor hepatice. De asemenea, unele medicamente, cum sunt analogii purinei și antraciclinele, pot să fie toxice pentru ficat, agravând bolile hepatice existente.

Aproximativ 50% dintre pacienți prezintă o creștere ușoară sau moderată a acidului uric la primul examen. Doar 10% dintre pacienți au o creștere marcată, dar precipitarea în rinichi a acidului uric și nefropatia care poate rezulta astfel reprezintă complicații potențiale serioase. Începerea chimioterapiei poate agrava hiperuricemia, pacienții primind, de obicei, imediat după stabilirea diagnosticului alopurinol și bicarbonat. În fine, lizozimul, un marker al diferențierii monocitare, poate determina disfuncții tubulare renale dacă se găsește în concentrații ridicate, accentuând alte probleme renale care apar deseori în fazele inițiale ale tratamentului.

Factorul cel mai important asociat cu supraviețuirea este instalarea remisiunii complete. Remisiunea completă este definită atât pe baza examenului sângelui periferic, cât și al măduvei osoase și trebuie să aibă o durată de cel puțin 4 săptămâni. Pentru ca să se poată spune despre un pacient că se găsește în remisiune completă trebuie ca numărul neutrofilelor din sânge să fie egal sau mai mare de 1500/μl, iar numărul plachetelor să fie egal sau mai mare de 100.000/μl. Nici hemoglobina și nici hematocritul nu se iau în considerare pentru definirea remisiunii complete. Celulele blastice trebuie să fie absente din circulație. Deși în perioada de regenerare a măduvei osoase, pot fi detectate în sângele periferic, rare celule blastice, acestea trebuie să dispară la examenele ulterioare. Celularitatea măduvei osoase trebuie să fie cel puțin 20%, cu maturare pe toate cele trei linii celulare.

Măduva osoasă trebuie să conțină mai puțin de 5% celule blastice, iar corpii Auer trebuie să fie absenți. De asemenea, nu trebuie să fie prezente focare leucemice extramedulare.

În cazul pacienților în remisiune completă, se folosește în mod curent reacția de polimerizare în lanț a transcriptazei inverse (reverse transcriptase polymerase chain reaction RT-PCR) pentru detectarea anomaliilor moleculare asociate cu LMA și hibridizarea fluorescentă in situ (fluorescence in situ hybridization – FISH) pentru detectarea aberațiilor citogenetice în vederea depistării bolii reziduale. Deși sunt necesare studii ulterioare, aceste tehnici de detectare a bolii reziduale minime au devenit un factor fiabil de discriminare între pacienții în remisiune completă care au sau nu nevoie de tratamente suplimentare sau alternative.

Au fost identificați numeroși factori care influențează probabilitatea remisiunii complete. Recent, au fost identificați factori legați în mod specific de durata remisiunii complete și de posibilitatea vindecării bolii. Este important să amintim că factorii de prognostic depind în foarte mare măsură de tratamentul folosit. Unul dintre riscurile cele mai importante înainte de începerea tratamentului îl reprezintă vârsta pacientului în momentul diagnosticului, vârsta înaintată (peste 60 de ani) fiind asociată cu un prognostic mai puțin bun, în primul rând din cauza influenței pe care vârsta o exercită asupra capacității pacientului de a supraviețui tratamentului de inducție și, deci, de a atinge remisiunea completă.

Bolile cronice și intercurente diminuează toleranța la tratamentul aplicat cu rigurozitate, iar problemele medicale acute în momentul diagnosticului influențează negativ probabilitatea supraviețuirii. Status-ul de performanță, indiferent de vârstă, influențează, de asemenea, capacitatea de a supraviețui la tratamentul inițial și, deci, de a răspunde la tratament. Vârsta mai poate influența rezultatele și prin faptul că LMA la pacienții vârstnici poate să fie diferită din punct de vedere biologic. Astfel, celulele leucemice ale pacienților vârstnici exprimă mai frecvent CD34 și pompa de eflux mdr1, care induce rezistență față de agenții terapeutici derivați din produse naturale de tipul antraciclinelor.

Alterările cromozomiale detectate la momentul diagnosticului sunt un alt factor independent important de prognostic. Astfel, pacienții cu t(8;21) și cu inv(16) au un prognostic foarte bun, în timp ce pacienții fără anomalii citogenetice sau cei care prezintă t(15;17) au un prognostic moderat favorabil sub tratament cu doze mari de citarabină. Pacienții cu del(5q), -7 și cu anomalii care implică 12p au un prognostic foarte prost. Pacienții cu anumite anomalii, cum este inv(3), nu ajung în remisiune completă cu chimioterapia standard de inducție.

Un interval simptomatic prelungit care precede stabilirea diagnosticului constituie o altă trăsătură clinică strâns asociată cu reducerea posibilităților de a atinge remisiunea completă și cu o durată de viață mai scurtă. Durata manifestării simptomelor înainte de stabilirea diagnosticului și existența confirmată a unei tulburări hematologice anterioare leucemiei sunt factori înrudiți. Astfel, remisiunea completă a fost mai rară la pacienții care au avut anemie, leucopenie și/sau trombocitopenie timp de mai mult de o lună înainte de a se stabili diagnosticul de LMA, spre deosebire de cei care nu au avut astfel de manifestări.

De fapt, răspunsul la chimioterapie pare să scadă constant pe măsură ce durata tulburărilor anterioare crește. În afară de aceasta, LMA care apare după tratamente cu agenți citotoxici și/sau iradiere, efectuate pentru cancer, s-a dovedit a fi extrem de dificil de tratat cu succes.

Au fost raportați o serie de factori de prognostic la unii bolnavi, factori care nu se întâlnesc la alții. Astfel, se citează o relație inversă între durata remisiunii complete și numărul de leucocite existente în momentul diagnosticului sau numărul absolut de mieloblaști circulanți. Printre pacienții cu hiperleucocitoză (peste 100.000/μl), cei care sunt mai vârstnici sau care au leucostază pulmonară, hepatomegalie, hiperbilirubinemie sau hipofibrinogenemie au un risc crescut de deces precoce în cursul tratamentului de inducție. Deși clasificarea FAB nu reprezintă, de obicei, un factor independent de prognostic, alte caracteristici ale celulei leucemice, observate în unele studii, au semnificație prognostică (Rodenhuis,1985).

1.3. LEUCEMIA MIELOIDĂ CRONICĂ

1.3.1. Epidemiologie și aspecte clinice

Incidența leucemiei mieloide cronice este de aproximativ 1,3/100.000 de locuitori pe an, iar incidența corectată pentru vârstă este mai mare la bărbați decât la femei (1,7 față de 1,0). A existat o ușoară diminuare a incidenței LMC între 1973 și 1991 (1,5/1,3). Incidența LMC crește lent cu vârsta până la mijlocul celei de-a patra decade, după care crește rapid.

Diagnosticul de LMC se stabilește identificând prin metode citogenetice sau moleculare expansiunea clonală a unei celule-sușă hematopoietice care posedă o translocație reciprocă între cromozomii 9 și 22. Această translocație are ca rezultat o fuziune cap-coadă a genei breakpoint cluster region – BCR de pe cromozomul 22 la banda q11, cu gena ABL (de la abelson murine leukemia) localizată pe cromozomul 9, la banda q34. Boala este caracterizată de o tranziție inevitabilă de la o fază cronică la o fază accelerată și la criză blastică.

Nu există o corelație clară cu expunerea la medicamente citotoxice, cum sunt agenții alkilanți, și nici nu există date directe care să sugereze o etiologie virală.

Fumatul accelerează evoluția spre criza blastică și are deci o influență negativă asupra supraviețuirii pacienților cu LMC. Studiile asupra supraviețuitorilor exploziilor atomice au demonstrat efectul radiațiilor, estimându-se că dezvoltarea unei mase de celule LMC de 10.000/μl necesită o perioadă de 6,3 ani. Accidentul de la uzina nucleară de și introducerea unor tehnici mai sensibile pentru detectarea celulelor produse de t(9;22) ne vor putea spune mai multe despre factorii de inițiere în patogenia LMC.

Instalarea clinică a fazei cronice este, în general, insidioasă. Din acest motiv, la unii pacienți, diagnosticul se stabilește în perioada în care aceștia sunt asimptomatici, în cursul unor examene curente de evaluare a stării de sănătate. Alți pacienți se prezintă la consultație cu stare generală alterată, oboseală și pierdere în greutate, sau prezintă simptome determinate de creșterea volumului splinei, cum ar fi senzație de sațietate precoce și prezența durerii sau a unor formațiuni tumorale în hipocondrul stâng. Simptomele determinate de disfuncțiile granulocitare sau plachetare sunt mai rare și includ infecții, tromboze sau sângerări.

Uneori, pacienții se prezintă cu manifestări leucostatice, provocate de leucocitoza sau trombocitoza severă, inclusiv boală vasculară ocluzivă, accidente cerebro-vasculare, infarct de miocard, tromboze venoase, priapism, tulburări de vedere și insuficiență pulmonară. Evoluția progresivă a LMC se însoțește de înrăutățirea simptomelor. Apare febră inexplicabilă, pierdere semnificativă în greutate, nevoia administrării unor doze tot mai mari de medicamente pentru a controla boala, dureri articulare și osoase, sângerare, tromboze și infecții, toate sugerând trecerea în faza accelerată sau în stadiul blastic al bolii. Prezentarea la consultație în faza accelerată a bolii sau în faza blastică a LMC reprezintă 10-15% din cazurile nou diagnosticate.

La majoritatea pacienților, examenul fizic în momentul diagnosticului arată o splenomegalie minimă sau moderată; uneori, se asociază o hepatomegalie ușoară. Persistența splenomegaliei în ciuda tratamentului este un semn de evoluție accelerată a bolii. Limfadenopatia și determinările leucemice extramedulare (clorom) sunt rare înainte de faza tardivă a bolii, iar atunci când sunt prezente prognosticul este prost.

În momentul diagnosticului se constată prezența unui număr crescut de leucocite, cu grade variate de imaturitate a elementelor granulocitare. De obicei, numărul de celule blastice circulante este mai mic de 5%, și mai puțin de 10% celule blastice și promielocite. Atunci când se urmăresc pacienții care nu primesc tratament, se poate observa o evoluție ciclică a valorilor leucocitare. În momentul diagnosticului, numărul de plachete este aproape totdeauna crescut, și se constată și un grad ușor de anemie normocromă, normocitară. Fosfataza alcalină din celulele LMC este caracteristic scăzută. Nivelul seric al vitaminei B12 și al proteinelor care leagă vitamina B12 este în general crescut. În momentul diagnosticului funcțiile fagocitare sunt de obicei normale, și rămân normale în perioada cronică a bolii. În stadiile tardive, apare o creștere a producției de histamină, secundară bazofiliei. Aceasta poate provoca diaree și eritem.

La stabilirea diagnosticului se constată la aproape toți pacienții cu LMC o creștere a celularității medulare, interesând mai ales liniile mieloidă și megacariocitară, și un raport mieloid/ eritroid profund alterat. Procentul de blaști medulari este în general normal sau ușor crescut. Se poate observa bazofilie, eozinofilie și monocitoză în măduva osoasă sau în sângele periferic. În timp ce fibroza colagenică a măduvei este neobișnuită la prezentare, la aproximativ jumătate dintre pacienți se constată un grad semnificativ de fibroză reticulară, confirmată prin colorații specifice.

1.3.2. Patogeneza

Se crede că produsul genei de fuziune care rezultă din t(9;22) joacă un rol central în dezvoltarea inițială a LMC. Această genă-himeră este transcrisă într-un ARNm hibrid BCR-ABL, în care exonul 1 al ABL este înlocuit de un număr variabil de exoni 5’BCR. Sunt produse proteinele de fuziune Bcr-Abl, p210BCR-ABL, care conțin domeniile terminale -NH2 ale Bcr și domeniile terminale -COOH ale Abl.

Potențialul oncogen al proteinelor de fuziune Bcr-Abl a fost confirmat de capacitatea acestora de a transforma celule-sușe hematopoietice in vitro. Există și un model în care refacerea șoarecilor iradiați letal cu celule medulare infectate cu retroviruși purtători ai genei care codifică p210BCR-ABL, duce la dezvoltarea unui sindrom mieloproliferativ similar LMC la 50% din animalele de experiență.

O altă observație care vine în sprijinul rolului Bcr-Abl în creșterea celulelor leucemice t(9;22)-pozitive presupune utilizarea oligomerilor anti-sens specifici la nivelul joncțiunilor BCR-ABL. După expunerea anti-sens, se observă suprimarea formării de colonii leucemice, în timp ce formarea de colonii macrofagice din celule medulare normale nu a fost afectată. Luate la un loc, acestea oferă date coerente privind participarea genei BCR-ABL la procesul de leucemogeneză.

Mecanismele prin care p210BCR-ABL promovează tranziția de la starea benignă la cea complet malignă sunt deocamdată neclare. Cu toate acestea, fixarea secvențelor BCR are drept rezultat trei modificări funcționale: (1) proteina Abl devine activă constitutiv ca o enzimă tirozin-kinază, (2) activitatea ADN de legare a proteinei a Abl este atenuată, și (3) legarea Abl de filamentele citoscheletice de actină este amplificată.

1.3.3. Citogenetica

În general, se crede că apariția unor anomalii genetice și/sau moleculare este esențială pentru transformarea fenotipică. Instabilitatea cromozomială a clonei maligne, rezultând, spre exemplu, în achiziția unei translocații t(9;22) suplimentare, a unei trisomii 8 sau 17p-, este una din caracteristicile fundamentale ale LMC. Mai multe grupuri de cercetători au comunicat că locul de ruptură din gena BCR poate prezice momentul în care se va declanșa criza blastică, dar aceste observații au fost respinse de alți cercetători.

Alterările structurale heterogene ale genei p53, ca și alterările structurale și lipsa producției de proteină a genei retinoblastomului, au fost ambele asociate cu evoluția progresivă a bolii într-un subgrup de pacienți cu LMC. În mod similar, o serie de comunicări au arătat existența unor cazuri rare de alterare a genei RAS.

Există, de asemenea, câteva comunicări în care se indică prezența unei gene MYC alterate (denumită astfel după virusul myelocytomatozei) sau apariția p190BCR-ABL, proteina care se găsește de obicei în leucemia limfoidă acută (LLA) a adultului, și uneori în LMA, în cursul evoluției clinice a unui mic număr de pacienți cu LMC.

S-a arătat și că metilarea progresivă de novo la locus BCR-ABL anunță transformarea blastică. În fine, IL-1 beta poate fi și ea implicată în evoluția progresivă a LMC spre stadiul blastic. Pe scurt, există căi multiple de transformare a bolii, cu toate că relevanța și momentul exact al acestora rămâne neclar.

Accelerarea bolii este definită prin evoluția progresivă a anemiei, care nu poate fi explicată prin sângerări sau chimioterapie, prin evoluția citogenetică clonală și prin prezența celulelor blastice în măduvă sau în sângele periferic în număr egal sau mai mare de 15%, dar mai mic de 30%, a celulelor blastice și promielocite în măduvă sau în sângele periferic în număr egal sau mai mare de 30%, a bazofilelor peste 20% și a plachetelor sub 100.000/μl. Criza blastică este definită ca leucemie acută, cu valori ale celulelor blastice medulare

Pot apare neutrofile hiposegmentate (anomalie Pelger-Huët). Celulele blastice sunt din seria mieloidă, eritroidă sau limfoidă, sau pot fi nediferențiate, evaluarea fiind făcută pe baza caracteristicilor morfologice, citochimice sau imunologice. În aproximativ jumătate din cazuri, este vorba de leucemie acută mieloidă, o treime sunt cazuri de leucemie acută limfoidă, 10% sunt cazuri de eritroleucemie, restul fiind nediferențiate.

Caracteristica citogenetică a LMC, observată în 90-95% din cazuri, este t(9;22)(q34;q11). La început, această caracteristică era identificată prin prezența unui cromozom scurt 22(22q-), desemnat cromozom Philadelphia, și care ia naștere prin translocația reciprocă 9:22. Unii pacienți pot avea translocații complexe (cunoscute sub numele de translocații variante), și care pot implica trei, patru sau cinci cromozomi (incluzând, de obicei, cromozomii 9 și 22).

Cu toate acestea, consecințele moleculare ale acestor modificări cromozomiale par să fie similare celor care sunt asociate prezenței t(9;22).

Evoluția clinică a pacienților cu LMC este variabilă. La 10% dintre pacienți este de așteptat un sfârșit letal în maximum 2 ani, și ceva mai puțin de 20% din ceilalți pacienți se pierd în fiecare din anii următori. Durata medie de supraviețuire este de aproximativ 4 ani. Din acest motiv au fost elaborate câteva modele de prognostic, care identifică diferitele grupuri de risc în LMC.

Sistemul de stadializare cel mai des folosit este bazat pe analiza multivariantă a factorilor de prognostic. Indicele Sokal ia în considerare procentul de celule blastice circulante, dimensiunile splinei, numărul de plachete, evoluția citogenetică clonală și vârsta, ca fiind indicatorii de prognostic cei mai importanți. Două modele, cel al lui Tura și modelul combinat al lui Kantarjian, împart pacienții în funcție de numărul de factori de pronostic negativi în ordinea următoare: vârsta egală sau mai mare de 60 de ani, splina la sau mai mult sub rebordul costal, celule blastice 3% sau peste în sânge și 5% sau peste în măduvă, bazofile 7% sau peste în sânge, și 3% sau peste în măduvă, plachete 700.000/ml sau peste, sau oricare din caracteristicile fazei accelerate, sunt asociate cu un prognostic foarte prost pe termen scurt, și o rată de risc de trei ori mai mare, sau risc de deces pe unitate de timp, în primul an (Druker, 1999).

1.4. TRATAMENTUL LEUCEMIILOR ACUTE ȘI CRONICE, PRINCIPII GENERALE, MONITORIZAREA TERAPIEI

Tratamentul pacientului la care s-a stabilit diagnosticul de LMA se împarte, de obicei, în două faze, de inducție și postremisiune. Scopul tratamentului inițial este de a eradica rapid leucemia și de a induce remisiunea completă. Odată ce s-a obținut remisiunea completă trebuie aplicate alte strategii care să prelungească supraviețuirea și să ducă la vindecare.

Chimioterapia de inducție Regimul terapeutic de inducere a remisiunii complete aplicat în mod obișnuit (pentru toate subtipurile FAB, cu excepția subtipului M3) constă într-o combinație de chimioterapie cu citarabină (citozin-arabinozidă) și o antraciclină. Citarabina este un antimetabolit specific pentru faza S a ciclului celular, care este forsforilat în forma activă de trifosfat și care interferează sinteza ADN. Antraciclinele sunt substanțe care se intercalează în ADN. Modul lor primar de acțiune este interacțiunea cu topoizomeraza II, ceea ce duce la ruperea ADN. Citarabina se administrează prin perfuzie intravenoasă continuă, în cantitate de 100-200 mg/mp de suprafață corporală/zi, timp de 7 zile (Miron, 2008).

Tratamentul cu antracicline constă, de obicei, în administrarea de daunorubicină, în cantitate de 45 mg/mp de suprafață corporală pe zi, în zilele 1, 2 și 3 de tratament cu citarabină (administrată ca mai sus) (regimul de tratament 7 și 3). Tratamentul cu idarubicină, o nouă antraciclină, 12-13 mg/mp/zi timp de 3 zile, în combinație cu citarabina în perfuzie continuă timp de 7 zile, este cel puțin la fel de eficace și poate fi superior celui cu daunorubicină, așa cum arată câteva studii randomizate.

După chimioterapia de inducție, se examinează măduva osoasă în momentul în care numărul de celule din sângele periferic atinge valorile normale sau un platou, pentru a se determina leucemia reziduală sau remisiunea completă.

Remisiunea completă este realizată, de obicei, într-un interval de 4 săptămâni de la inițierea chimioterapiei de inducție. Dacă în ziua a 14-a de la inițierea chimioterapiei sau în zilele următoare se confirmă leucemie persistentă sau reziduală în măduva osoasă a pacientului, acesta va fi tratat cu citarabină și antraciclină în doze similare cu cele administrate inițial, dar timp de 5, respectiv 2 zile. Totuși, în acest context, se recomandă schimbarea tratamentului, preferându-se administrarea de citarabină în doze mari.

Măsurile suportive necesare pentru a susține pacienții cu LMA în cursul celor câteva săptămâni de granulocitopenie și trombocitopenie sunt esențiale pentru succesul tratamentului LMA. Pacienții cu LMA trebuie să fie tratați în unități cu experiență în aplicarea măsurilor suportive.

În trialurile clinice pentru LMA au fost introduși și factorii hematopoietici de creștere. Aceste trialuri au fost proiectate fie pentru scăderea ratei infecțiilor după chimioterapie, pentru sensibilizarea (amorsarea) celulelor blastice leucemice la chimioterapie, fie pentru realizarea ambelor obiective. Atât G-CSF, cât și factorul de stimulare a coloniilor granulomonocitare (GM-CSF) au redus durata medie necesară pentru revenirea la valorile normale ale neutrofilelor la 5-7 zile. Această refacere accelerată a numărului de neutrofile nu s-a însoțit totdeauna de o reducere semnificativă a infecțiilor.

Un studiu randomizat efectuat în 22 de centre din Europa a arătat o rată mai mare a remisiunii complete după folosirea G-CSF, la terminarea chimioterapiei de inducție, în comparație cu administrarea de placebo, mai ales la pacienții cu elemente citogenetice nefavorabile.

Obiectivul tratamentului LMC este de a realiza o hematopoieză prelungită și durabilă, fără neoplazie și non-clonală, ceea ce presupune eradicarea tuturor celulelor reziduale care conțin transcripția BCR-ABL. Deci, obiectivul este remisiunea moleculară completă și vindecarea.

Transplantul allogenic de măduvă osoasă este singurul tratament curativ pentru LMC, și, atunci când se poate efectua, este tratamentul de elecție. Cu toate acestea, transplantul allogenic de măduvă osoasă este complicat de o mortalitate precoce ridicată, din cauza procedurilor de transplantare.

Atunci când s-a comparat evoluția tuturor pacienților la care s-a efectuat transplant allogenic de măduvă osoasă, raportați Marrow Transplant Registry (Registrul Internațional de Transplant de Măduvă Osoasă), cu evoluția tuturor pacienților tratați cu hidroxiuree și interferon-alfa (IFN alfa) de către German CML Study Group (Grupul German de Studiu al LMC), supraviețuirea pacienților din primul lot era mai bună din punct de vedere statistic, dar numai pornind de la 5 ani după transplant. Atunci când s-au evaluat doar pacienții cu risc mic, conform criteriilor lui Sokal, beneficiul transplantului medular allogenic pentru supraviețuirea pacienților cu LMC se manifestă numai după 6 ani.

Rezultatele transplantului allogenic de măduvă osoasă depind de numeroși factori, ce țin de (1) pacient (vârstă și stadiul bolii); (2) tipul de donator [singenic (gemeni monozigoți) sau allogenic HLA-compatibil, înrudit sau neînrudit]; (3) regimul de pregătire în vederea transplantării; (4) boala grefă-contragazdă și (5) tratamentul post-transplant.

Regimurile de pregătire au fost studiate de mai multe grupuri de cercetători. Un studiu randomizat al grupului din Seattle a comparat utilizarea ciclofosfamidei și a iradierii corporeale totale cu administrarea de busulfan și ciclofosfamidă. Autorii studiului nu au constatat deosebiri semnificative cu privire la probabilitatea supraviețuirii la trei ani, a recăderii, absenței semnelor de boală, rapiditatea grefării sau incidenței bolii veno-ocluzive a ficatului. Un număr semnificativ mai mare de pacienți din grupul celor supuși iradierii totale au prezentat creșteri importante ale creatininei, boală grefă-contra-gazdă acută, perioade mai îndelungate de febră, hemoculturi pozitive, internări în spital și spitalizări mai îndelungate. Aceste date sugerează că regimul de preferat este combinația busulfanciclofosfamidă.

Mai sunt testate și alte regimuri de pregătire, al căror obiectiv principal este de a reduce rata recăderilor. În cazurile în care transplantul medular allogenic nu este posibil, tratamentul de preferat este IFN-alfa. Interferonii sunt un grup complex de proteine naturale, produse de celulele eucariote ca reacție la prezența virusurilor, antigenelor și a substanțelor mitogene. Au fost identificate trei grupuri distincte de interferoni: IFN-alfa, IFN -beta, și – IFN – gama.

Deși o varietate de interferoni sunt disponibili pentru investigații clinice, cele mai multe date au rezultat din folosirea preparatelor IFN-alfa. Interferonii au efecte biologice pleiotrope puternice, acoperind un spectru de proprietăți antivirale, microbicide, imunomodulatoare și antiproliferative. Cu toate că s-a arătat că interferonii diminuă exprimarea câtorva substanțe oncogene și a unor citokine, ei pot, de asemenea, să stimuleze exprimarea factorului de reglare a interferonului-1 (un activator transcripțional cu activitate anti-oncogenă), a moleculelor de adeziune, și a genelor de histocompatibilitate.

S-a mai arătat și că interferonii inhibă angiogeneza și induc răspunsul celular imun. Deși cercetările de laborator au pus în evidență o diversitate de posibilități pentru interferoni, nu există încă o cunoaștere clară a modului sau modurilor lor de acțiune.

Pacienții dezvoltă atât efecte secundare acute, cât și efecte secundare cronice la tratamentul cu IFN-alfa. Efectele secundare acute (simptome de tip gripal) apar precoce în cursul tratamentului. Majoritatea fenomenelor de tip gripal ăspund la administrarea de acetaminofen și, într-un interval de 1-2 săptămâni, se instalează fenomenul de tahifilaxie. Reacțiile secundare cronice, cum sunt oboseala, letargia, pierderea în greutate, mialgiile și artralgiile, survin la aproximativ jumătate dintre bolnavi și pot necesita reducerea dozelor. Pacienții mai acuză și tuse, rinoree și uscăciunea tegumentelor. Rareori, apar trombocitopenie și anemie, mediate imun. În plus, tratamentul de lungă durată a fost asociat cu efecte secundare autoimune tardive, cum sunt hipotiroidismul, și uneori fenomene autoimune generalizate

Tratamentul inițial cu agenți chimioterapeutici este rezervat, de obicei, pentru scăderea rapidă a numărului de leucocite din sânge, pentru reducerea simptomelor și a splenomegaliei simptomatice. Controlul rapid al bolii se poate realiza cu hidroxiuree, un inhibitor al ribonucleotid-reductazei. Doza inițială este de 1-4 g/zi, doza fiind redusă cu jumătate la fiecare scădere cu 50% a numărului de leucocite. Din păcate, remisiunile citogenetice cu hidroxiuree sunt rare. Busulfan, un agent alchilant care acționează asupra celulelor precursoare tinere, are un efect mai prelungit.

Totuși, acest agent nu este recomandat, din cauza efectelor secundare severe, printre care mielosupresie neașteptată, și uneori fatală, la 5-10% dintre pacienți, fibroză pulmonară, endocardică și medulară, și un sindrom cașectic (wasting syndrome) de tip Addison. Chimioterapia combinată intensivă s-a mai folosit și în faza cronică a LMC, între 30 și 50% din pacienți realizând răspunsuri citogenetice complete. Cu toate acestea, astfel de remisiuni citogenetice au fost de scurtă durată și în consecință, azi se folosește chimioterapia combinată intensivă numai pentru mobilizarea celulelor tinere normale în sânge, în scopul de a colecta celule-stem circulante pentru transplant medular autolog. Un alt rol al chimioterapiei (efectuată cu homoharingtonină sau cu citarabină în doze mici) este cel de asociere cu IFN-alfa.

Un trial realizat de M.D. Anderson Cancer Center a arătat o supraviețuire mai bună a pacienților cu LMC la mai mult de un an de la diagnostic și care erau tratati cu citarabina ȋn doze mici, ȋn comparatie cu o populație de control tratată anterior exclusiv cu IFN-alfa (Fitzgerald, 1991).

II. MATERIALE ȘI METODE

2. 1. PACIENȚI

Lucrarea de față s-a realizat în cadrul Laboratorului de Genetică al Institutului ”Victor Babeș” București. Studiul s-a realizat pe un lot format din 3 pacienți femei cu diferite vârste, respectiv: 28, 40 si 50 de ani, cu diagnosticul de leucemie acută limfoblastică (LAL), leucemie mieloida limfoblastică (LMC) și respectiv leucemie acută mieloblastică (LAM).

CAZ 1 – Leucemie acută limfoblastică (LAL)

Pacientă în varsta de 28 de ani

Hemoleucograma evidentiaza leucopenie cu prezenta de limfoblasti – 5% si anemie.

Diagnostic hematologic – leucemie acuta limfoblastica de linie B (maduva osoasa cu 30% blasti si markeri de suprafata specifici de linie B).

CAZ 2 – Leucemie mieloida cronică (LMC)

Pacienta in varsta de 40 de ani

Hemoleucograma evidentiaza leucocitoză cu formulă leucocitară deviată la stânga și trombocitoză. Maduvă osoasă hiperplazică.

Diagnostic hematologic – leucemie mieloida cronica in observatie.

CAZ 3 – Leucemie acuta mieloblastică (LAM)

Pacienta în vârstă de 50 de ani

Hemoleucograma evidentiaza leucocitoza cu 31% blasti, anemie, trombocitopenie.

Diagnostic hematologic – leucemie acuta mieloblastica M2 (maduva osoasa cu 50% blasti).

2.2. METODE

2.2.1. METODE CITOGENETICE CLASICE

A. CULTURĂ DE MĂDUVĂ OSOASĂ/SINCRONIZARE CICLU CELULAR

Inițierea culturii de măduvă osoasă

Identificarea, înregistrarea și marcarea probei (pe fiecare tub de cultură se notează codul pacientului, tipul probei biologice, timpul de cultivare, data inițierii culturii).

Prepararea soluțiilor necesare: Mediu de cultură complet (RPMI complet: la 400 ml RPMI 1640 cu L-Glutamină se adaugă 100 ml ser fetal bovin, 5 ml soluție antibiotic (10.000 unități penicilină + 20 mg steptomicină/ml soluție).

Se agită ușor măduva, în seringă sau flaconul în care a fost recoltat. Se efectuează număratoarea celulelor nucleate din măduva osoasă.

Se distribuie 9 ml din mediul menționat anterior în tubul de cultură steril, se adaugă o cantitate de măduvă ce conține 20 x 106, celule pentru fiecare tub de cultură.

Se agită ușor tuburile de cultură pentru omogenizare.

Se incubează pentru 24, 48 sau 72 h la 37˚C, în poziție înclinată. În acest interval de timp, tuburile de cultură se verifică macroscopic zilnic pentru evaluarea calității proliferative (aspectul roz-gălbui al mediului) și se omogenizează prin agitare ușoară.

Cu două ore înaintea sacrificării, se adaugă 150 µl soluție Colcemid (10μg/ml)/ tub de cultură. Se agită și se incubează 2 ore.

Echipamente necesare:

hota cu aer steril în flux laminar; balanță analitică electronică; incubator reglat la 37ºC; frigider de laborator; tuburi de cultură sterile; seringi de unică folosință de 1 ml gradate; ace de seringă, de unică folosință; pipete automate cu volum reglabil; vârfuri de pipete.

Materiale necesare:

mediu de cultură (RPMI 1640 sau alte medii bazale); ser fetal bovin; soluție antibiotic (10.000 unități penicilină + 20 mg steptomicină/ml soluție); soluție Colcemid (10μg/ml).

Prelucrarea culturii celulare

Prepararea soluțiilor necesare:

Soluția hipotonă (KCl 0,075M) se introduce la termostat la cu cel puțin 30 minute înaintea începerii etapelor experimentale.

Soluția fixatoare se prepară extemporaneu prin amestecarea a trei părți alcool metilic absolut și o parte acid acetic glacial.

Se centrifughează cultura la 200g, timp de 10 minute.

Se îndepartează supernatantul. Se lasă o cantitate mică de supernatant (~0,5 ml) deasupra sedimentului celular.

Se resuspendă sedimentul celular prin scuturare ușoară a tuburilor și se adaugă 10 ml de soluție hipotonă pre-încălzită la .

Se incubeaza la 37˚C pentru 50 minute. În acest interval de timp tuburile se agită ușor de două-trei ori.

Cu 5-10 minute de încheierea timpului de hipotonie se adaugă 0.5 ml soluție fixatoare, se omogenizează prin inversare și se continuă incubarea.

Se centrifughează la 200g, timp de 10 minute.

Se îndepărtează supernatantul prin aspirare cu pipeta de plastic, lăsând o cantitate mică de supernatant (~0,5 ml) deasupra sedimentului celular.

Se adaugă 5-6 ml de soluție fixatoare de la frigider (4-). Primii 2 ml de soluție fixatoare se adaug picatură cu picatură.

Tuburile se incubează pentru 2 ore la 4-.

Se centrifughează la 200g, timp de 10 minute.

Se îndepărtează supernatantul prin aspirare cu pipeta, se resuspendă sedimentul celular cu o pipetă Pasteur și se adaugă fixator nou (5-6 ml). Se repetă etapele de centrifugare-fixare de cel puțin 5 ori.

După ultima centrifugare, se adaugă un volum mic de fixator (variabil în funcție de cantitatea de sediment celular), astfel încât, suspensia celulară să aibă un aspect opalescent.

Se efectuează preparatul citogenetic prin distribuirea echidistantă a 3 picături de sediment celular pe o lamă de microscop umedă, utilizând o pipetă Pasteur. Se usucă la aer.

Densitatea celulară și calitatea plăcilor metafazice se verifică la microscopul optic prin colorare clasică în soluție 5% Giemsa (conform POS.04.LGM).

Dacă densitatea celulară este mai mare de 100 celule nucleate/câmp microscopic (10X) se mai adaugă soluție fixatoare. Dacă densitatea celulară este mai mică de 10 celule nucleate/câmp microscopic (10X), se recentrifughează și se resuspendă sedimentul celular într-un volum mai mic de soluție fixatoare.

Gradul de etalare al cromozomilor în placa metafazică poate fi mărit prin expunerea preparatului citogenetic la abur, după distribuirea sedimentului celular pe lamă, timp de 5-20 secunde urmată de uscarea preparatului pe plita încălzită la .

Numărul de preparate depinde de densitatea de celule în diviziune, dar în mod obișnuit se efectuează 8-10 preparate. Pe fiecare preparat se notează codul pacientului și numărul lamei. Pentru probele de măduvă unde se practică mai multe variante de prelucrare, se trece și timpul de cultivare.

În continuare preparatele citogenetice sunt supuse colorației convenționale Giemsa pentru verificarea calității acestora.

15. Păstrarea sedimentului celular fixat se realizeaza la 4- (frigider) până la rezolvarea definitivă a cazului. Depozitarea surplusului de sediment celular se face în microtuburi de 1,5 ml, etichetate cu codul pacientului, la temperaturi sub (congelator) pentru o perioda nelimitată.

Echipamente necesare:

nișă chimică; centrifugă de masă cu viteză de rotație reglabilă; incubator reglat la ; pipete Pasteur si pere de cauciuc de 3-5ml; pipete de plastic cu volum 3-5ml; lame de microscop bine degresate, cu un capăt jivrat; plită electrică; bec de gaz; ceas de laborator; frigider; microscoape optice.

Materiale necesare:

clorură de potasiu; acid acetic; alcool metilic absolut.

B. BANDARE GTG

Prepararea soluțiilor necesare:

soluție de tripsină 0,25% (pH=7,4-7,5): 2,5g tripsină + 100ml solutie GKN 10X + apă distilată până la un volum final de 1000ml.

soluție GKN 10X: 80g NaCl + 4g KCl + 10g D-glucoză + 0,2g roșu fenol + 3,5g NaHCO3 + apă distilată până la un volum final de 1000ml.

soluție Versen-EDTA: 8g NaCl + 0,2g KH2PO4 + 1,55g Na2HPO4 • 2H2O + 0,2g KCl + 0,2g EDTA + apă distilată până la un volum final de 1000ml.

tampon Sorensen: Na2HPO4 1/15M + KH2PO4 1/15M (pH=6,8).

apă tamponată: 10ml tampon Sorensen + 90ml apă distilată

soluție Giemsa 5%: 4 ml colorant Giemsa + 90ml apă tamponată.

Se pregătesc băile de bandare în patru pahare Borell:

Baia 1: Soluție de lucru tripsină (6 ml tripsină 0,25%+30 ml Versen-EDTA+24 ml GKN)

Baia 2: Soluție tamponată GKN

Baia 3: Soluție de colorare Giemsa 5% preparată în tampon fosfat

Baia 4: Apă tamponată pentru clătirea lamelor după colorare.

Se imersionează preparatul în paharul cu soluție de tripsină timp de 30 secunde până la 3 minute (se tatonează timpul de tratament în baia de tripsină). Dacă preparatul este proaspăt de câteva ore, tratamentul este de ordinul secundelor, iar dacă preparatul este mai vechi de 2-3 zile, tratamentul este de 2-3 minute. Se scoate lama din prima baie și se scurge pe o hârtie de filtru în poziție ușor înclinată.

Se imersionează pentru 1-2 secunde în baia tampon GKN.

Se introduce preparatul în baia de colorare Giemsa, se menține pentru 5-10 minute. Se clătește și se usucă la aer.

Se verifică la microscop calitatea bandării și a colorării cu obiectiv 40X.

Dacă bandarea și colorarea sunt satisfăcătoare, proba va fi spălată în toluen timp de 1-2 minute în vederea montării și realizării unui preparat permanent.

Pe o lamelă se plaseaza echidistant 3 picături de Entellan.

Se scoate preparatul citogenetic din toluen și se asează cu fața în jos pe lamela cu Entellan și se îndepărtează eventualele bule de aer prin apăsare ușoară. Preparatul citogenetic este astfel gata pentru analiza citogenetică.

Examinarea microscopică a preparatului se efectuează cu obiectiv de 10X, 20X sau 40X, iar analiza microscopică a metafazelor se face cu obiectiv de 63X sau 100X cu imersie.

Se analizează 20 de metafaze, se selectează metafazele cu cromozomi lungi și foarte bine etalați și se efectuează cariotipurile.

Echipamente necesare:

pahare Borell și Coplin; hârtie de filtru; ceas de laborator; baie termostatată; microscop optic; lamele 24/60 mm

Materiale necesare:

KH2 PO4; Na2HPO4 x 2H2O; NaCl; KCl; EDTA; NaHCO3; roșu fenol; D-glucoză; tripsină; Giemsa; Entellan; toluen; ulei de imersie.

2.2.2. METODE DE CITOGENETICĂ MOLECULARĂ – FISH

A. SONDE FISH UTILIZATE:

Caz 1- MLL/MLLT1 t(11;19) Fusion KI-10307, Kreatech (Poseidon)

Caz 2- BCR/ABL Translocation, Dual Fusion LPH 038, (Cytocell)

Caz 3 – AML1/ETO Translocation, Dual Fusion LPH 026, (Cytocell)

B. FLUORESCENCE IN SITU HIBRIDIZATION (FISH)

La realizarea tehnicii FISH se folosesc preparate citogenetice mai vechi de 24 ore, p-păstrate la frigider sau congelator.

Înaintea începerii etapelor experimentale se selectează pentru hibridizare, o arie de aproximativ 22×22 mm de pe preparatul citogenetic, arie care prezintă caracteristicile optime pentru reușita tehnicii FISH. Selectarea ariei de lucru se realizează prin marcarea lamei de sticlă, cu creionul cu diamant.

Dacă preparatele sunt proaspete (sub 24h de la realizare) se supun unui tratament de maturare astfel :

Se pun preparatele pe plita încălzită la și se mențin 30-45 minute.

Se introduc preparatele în soluție 2XSSC, încălzită la , și se mențin 1 ora.

Se lasă preparatele să se usuce la temperatura camerei.

PRE – TRATAMENTUL PREPARATELOR CITOGENETICE

Se introduce preparatul în soluție 2XSSC/0,5% IGEPAL, timp de 30 de min., la temperatura de ; se înlătură excesul de soluție de pe lamă;

Se introduce preparatul în soluție 2XSSC timp de 2 minute, la temperatura camerei;

Se deshidratează preparatul în soluții de etanol 50%, 75%, 100% timp de 5 minute în fiecare baie, la temperatura camerei.

Se lasă preparatul să se usuce la aer și se menține la temperatura camerei până în momentul utilizării. Preparatele neutilizate în ziua respectivă se pot păstra la frigider maxim 2 săptămâni. În cazul în care preparatul nu a fost utilizat în intervalul de 2 săptămâni, este necesară repetarea etapei de pretratament, înaintea efectuării tehnicii FISH.

PREGATIRE SONDĂ

Se scoate sonda din frigider și se lasă 5-10 minute la temperatura camerei.

Se vortexează și se centrifughează scurt.

Sondele sunt deja preparate; se folosesc 10 µl sondă/preparat.

DENATURARE PREPARAT

Se denaturează preparatul în soluție 70% Formamidă/2XSSC, pH=7, încălzită la (±), timp de 2 minute.

După denaturare, preparatul se plasează în soluție de etanol 50% (-20oC) pentru 2 minute.

Se introduce succesiv lama în următoarele 2 băi: etanol 75% și etanol 100% (-20oC), pentru 2 minute/baie.

DENATURARE SONDA

Se denaturează cantitatea necesară de sondă, la (±), pentru 10 minute.

HIBRIDIZARE

Se depune sonda pe preparat, în aria preselectată și se acoperă zona cu o lamelă ( x );

Se sigilează cu Rubber-Cement;

Se incubează în camera umedă peste noapte (16 ore) la .

SPĂLĂRI POST-HIBRIDIZARE

Se îndepărtează lamela.

Se introduce preparatul în soluție 0,4XSSC/0,3%IGÉPAL, pentru 3 minute la temperatura camerei

Se spală preparatul cu soluție 0,4XSSC/0,3%IGÉPAL, pentru 3 minute, la (±),

Se introduce preparatul în soluție 2XSSC/0,1%IGÉPAL, pentru 1 minut, la temperatura camerei.

Se îndepărtează excesul de lichid prin scurgere, lama nu se lasă la uscat.

CONTRA-COLORAREA

Se depune pe lama 10-15 µl de solutie DAPI 0,4 µg/ml.

Se plaseaza lamela de 24 mmx60 mm.

Se sigilează cu Rubber-Cement.

Se plasează la întuneric, la frigider, timp de 10 minute.

Preparatele au fost analizate la microscop Axio Imager Z1 (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany) echipat cu soft Metafer and Ikaros (MetaSystems GmbH, Altlussheim, Germany). Pentru cariotipare s-au folosit recomandările International System for Human Cytogenetic Nomenclature.

III. REZULTATE ȘI DISCUȚII

Leucemia este o afecțiune neoplazică care este generată de transformarea malignă a celulelor hematopoietice. Celulele maligne apar prin proliferarea unei singure celule, celula stem limfoidă sau celula stem mieloidă – din acest motiv sunt denumite boli clonale. Celulele leucemice au capacitatea de a produce factori de creștere proprii și au avantaje față de celulele normale, datorită factorilor hematopoietici pe care îi sintetizează.

Pacienții luați în calcul au fost diagnosticați în urma examenului hematologic cu diferitele tipuri de leucemii.

Cazul 1

Pacientei diagnosticată hematologic cu leucemie acuta limfolastică de linie B (LAL), i-a fost indicată confirnarea prin teste genetice (cariotipare prin bandare GTG și FISH).

În urma realizarii cariotipului s-a determinat că pacienta este purtătoare a translocației t(11;19)(q23:p13). (Figura 3.1)

Figura 3.1. Cariotip caz 1: 46, XX, t(11;19)(q23:p13)/46, XX

Identificarea t(11;19)(q23:p13) prin tehnicile de citogenetică clasică a fost urmată de investigațiile de citogenetică moleculară–FISH. Sonda utilizată pentru identificarea/ confirmarea tipului de aberație cromozomială determinantă pentru aspectele anormale detectate prin hemoleucogramă a fost: MLL/MLLT1 t(11;19) Fusion – KI-10307, (Kreatech Poseidon) (Figura 3.2).

Figura 3.2. Sonda MLL/MLLT1 (www.kreatech.com)

Sonda utilizată – MLL/MLLT1- este o sondă dublă ce evidențiază pe de o parte regiunea genei MLL – 11q23, de pe cromozomul 11 (fluorocrom roșu) și pe de altă parte regiunea genei MLLT1 – 19p13, de pe cromozomul 19 (fluorocrom verde).

Tipuri de semnale asteptate și interpretarea acestora:

2 semnale roșii și 2 semnale verzi – cromozomi normali fără translocații, fără rupturi/break-uri în nici una dintre regiunile analizate.

2 semnale galbene 1 semnal roșu și 1 semnal verde – translocații implicând atât gena MLL, cât și gena MLLT1.

3 semnale roșii și 2 semnale verzi – translocații implicând rupturi la nivelul genei MLL fără a implica gena MLLT1.

Figura 3.3. Evidențierea prin tehnica FISH a t(11;19)(q23:p13) în cazul 1.

În urma analizelor realizate prin tehnica FISH s-au identificat în cazul acestei paciente metafaze prezentând 2 semnale galbene 1 semnal rosu și 1 semnal verde, ceea ce confirmă diagnosticul genetic inițial bazat pe cariotipare și anume, prezența translocației t(11;19)(q23:p13), s-au întâlnit de asemenea și celule normale ceea ce indică un caz de mozaicism (Figura 3.3.).

Conform datelor din literatura de specialitate (Huret, 1993) în identificarea tipului de translocație prin cariotipare, în funcție de regiunea din cromozomul 19 implicată (p13.1, respectiv p13.3) diferă tipul de bandare cromozomală utilizabilă pentru cariotipare. În cazul în care translocația implică regiunea 19p13.1 aceasta poate fi identificată numai prin intermediul bandarii R, în timp ce translocația ce vizează 19p13.3 poate fi detectată și prin bandare G.

Cariotiparea realizată în cazul pacientei numărul prezentului studiu, este bazată pe analizarea cromozomilor bandați G. Acest aspect corelat cu faptul că acest tip de bandare a permis decelarea translocației t(11;19), ne determină să definim zona translocată mai exact și anume: t(11;19)(q23:p13.3).

CRITERIILE DE DIAGNOSTIC:

Modificarea cromozomială identificată inițial prin cariotipare și confirmată ulterior prin FISH a încadrat pacienta în categoria LAL cu remaniere 11q23 (conform clasificării OMS a neoplasmelor mieloide și limfoide din 2008). Semnificație: prognostic nefavorabil.

Pacienta a fost propusă pentru transplant medular alogenic în prima remisiune hematologică.

Cazul 2

Este reprezentat de o pacienta diagnasticata cu leucemie mieloida cronica in observatie, avand indicatie pentru diagnostic genetic (examenul de cariotip si tehnica FISH).

Ȋn urma examenului de cariotipare s-a identificat prezenta translocatiei t(9;22) – cromozom Philadelphia (Figura 3.4).

Figura 3.4. Cariotip caz 2: 46,XX, t(9;22)(q34;q11.2)

Identificarea t(9,22) prin FISH s-a realizat utilizând ca sondă: BCR/ABL Translocation, Dual Fusion LPH 038, (Cytocell). Este o sonda duală ce evidențiază regiunea genei BCR de pe cromozomul 22 (fluorocrom verde), respectiv regiunea genei ABL de pe cromozomul 9 (fluorocrom roșu) (Figura 3.5).

Semnalele fluorescente generate au următoarea interpretare:

2 semnale roșii pentru cromozomul 9 și două semnale verzi pentru cromozom 22 – celulă normală

2 semnale galbene sau semnale roșu/verde foarte aproiate și 1 semnal rosu și 1 semnal verde – prezența t(9;22)(q34;q11.2)

Figura 3.5. Reprezentarea schematica a sondei BCR/ABL (www.cytocell.com)

Figura 3.6. Evidențierea prin tehnica FISH a t(9;22)(q34;q11.2) la pacienta nr. 2

În urma analizelor metafazelor marcate fluorescent prin FISH a fost deasemenea detectată prezența t(9;22), respectiv a cromozomului Ph (Figura 3.6.).

Prezența cromozomului Ph are o importanță deosebiță atât în diagnosticul cât și în prognosticul bolilor hematologice. Acesta este specific pentru leucemia mieloidă cronică, fiind identificat în aproximativ 90% din cazuri, în timp ce în leucemia acuta limfoblastică, frecvența este mult mai mică și anume: 30% în cazurile LAL adulte și 10% în LAL la copii. Acest tip de cromozom remaniat poate fi prezent și în cazuri de leucemie mieloidă acută (LAM), dar foarte rar. (Rodenhuis, 1985)

Având în vedere posibilitatea întâlnirii cromozomului Ph, în mai multe tipuri de leucemii, este foarte importantă corelarea datelor clinice (hematologice) cu cele genetice pentru a genera o imagine de ansamblu completă și a permite elaborarea unui diagnostic pertinent.

Ca urmare a translocației t(9;22)(q34;q11), protoconcogena ABL1 și gena BCR fuzionează generând o genă hibrid BCR/ABL1. Însă, translocația între cromozomii 9 și 22 poate fi acompaniată și de pierderea secvenței proximale ASS1/ABL1 și a celei distale 22q, aspect întâlnit frecvent în cazurile de leucemie acută limfoblastică și rareori în leucemia acută mieloidă. Deleția regiunii 9q cuprinzând gena ASS1 este asociată cu prognostic nefavorabil, ajungându-se mult mai rapid la recădere în urma tratamentului cu imatinib. Din acest motiv stabilirea prin diagnostic molecular a patern-urilor atipice de translocație BCR/ABL1 are o importanță clinică deosebită cu implicații directe în prognostic (Druker, 1999; Fitzgerald, 1991).

CRITERIILE DE DIAGNOSTIC:

Maduva osoasă este hiperplazică.

Ȋn urma examenului de cariotip și a analizei semnalelor evidențiate prin tehnica FISH, s-a susținut astfel diagnosticul inițial de leucemie mieloidă cronică (LMC).

Se inițiază terapie cu inhibitori de tirozin kinază de primă generație (imatinib).

Cazul 3

A fost reprezentat de o pacientă diagnosticată hematologic cu leucemie acută mieloblastică M2, având de asemenea indicație de diagnostic genetic.

În urma examinării cariotipurilor realizate, la acestă pacientă s-a identificat prezența unei translocatie t(8;21)(q22 :q22) (Figura 3.7).

Figura 3.7. Formula cariotipului: 46,XX,t(8;21)(q22;q22) pentru cazul 3

Analizele de hibridizare fluorescentă in situ au utilizat ca sondă: AML1/ETO Translocation, Dual Fusion LPH 026 (Cytocell). Sonda duală include regiunea genei AML1 de pe cromozomul 21, marcată fluorescent cu fluorocrom roșu, si respectiv regiunea genei ETO, de pe cromozomul 8, marcată fluorescent cu fluorocrom verde (Figura 3.8).

Semnalele fluorescente pot fi interpretate după cum urmează:

– 2 semnale roșii pentru cromozomul 21 și două semnale verzi pentru cromozom 8 (în celula normală); 2 semnale galbene sau semnale roșu/verde foarte aproiate și 1 semnal roșu și 1 semnal verde (prezența t(8;21)(q22;q22)).

Figura 3.8. Reprezentarea schematică a sondei AML1/ETO (www.cytocell.com)

În urma analizelor realizate prin tehnica FISH s-au identificat, în cazul acestei paciente, metafaze prezentând 2 semnale de fuziune și 1 semnal roșu și respectiv 1 semnal verde ceea ce confirmă diagnosticul genetic inițial bazat pe cariotipare GTG și anume prezența translocației t(8;21)(q22;q22) (Figura 3.9).

Figura 3.9. Evidențierea prin tehnica FISH a t(8;21)(q22;q22) la pacienta nr. 3.

Conform datelor din literatură, fuziunea genică AML1/ETO, aparută ca urmare a translocației t(8;21)(q21;q22), este întalnită în aproximativ 40% din cazurile de leucemie mieloidă acută de tip M2 și rar la grupurile M1 și M4, ceea ce se corelează cu diagnosticul hematologice pus pacientei numărul 3 (Cline, 1994).

CRITERIILE DE DIAGNOSTIC:

Modificarea cromozomială identificată, a incadrat pacienta în categoria LMA cu translocație t(8;21) (conform clasificării OMS a neoplasmelor mieloide și limfoide din 2008).

Semnificație: prognostic favorabil.

Pacienta a efectuat chimioterapie de inducție cu obținerea remisiunii hematologice și citogenetice.

CONCLUZII

În această lucrare au fost analizate, prin tehnici citogenetice clasice și moleculare, trei tipuri de leucemii, aflate în stadii diferite de evoluție. Studiul s-a focalizat pe investigarea calității de markeri biologici a translocațiilor, primele rearanjamente cromozomiale observate în procesul de apariție și evolutie al leucemiilor.

Rezultatele obținute au condus la următoarele concluzii:

Tehnicile citogenetice (bandare GTG și FISH) au confirmat diagnosticul hematologic inițial în toate cele trei cazuri și a existat o concordanță perfectă între rezultatele obținute prin tehnicile clasice și, respectiv, prin tehnici moleculare. De asemenea, datele obținute au fost conforme cu cele din literatură.

Tehnica FISH prezintă avantajul unei diagnosticări mai rapide comparativ cu tehnicile de bandare, dar aceasta din urmă au avantajul că sunt mai ieftine și cel puțin la fel de precise în identificarea rearanjamentelor cromozomiale, de dimensiuni microscopice.

În toate cele 3 cazuri, translocațiile au fost responsabile de procesul de cancerizare, iar tipul acestora s-a corelat foarte bine cu prognosticul privind evoluția pacienților. S-a reconfirmat faptul că, acest tip de aberație cromozomială este frecvent agentul declanșator al transformărilor maligne.

Deciziile privind tratamentul leucemiilor se bazează pe cunoașterea tipului, stadiului clinic al bolii, vârstei pacientului etc. Datorită asocierii dintre un anumit tip de translocație si o anumita forma de leucemie, identificarea translocațiilor prin tehnici citogenetice permite adoptarea unei conduite terapeutice adecvate pentru fiecare caz în parte.

În concluzie, identificarea translocațiilor este deosebit de utilă în depistarea precoce, tratamentul și predicția evoluției pacienților diagnosticați cu leucemie.

BIBLIOGRAFIE

Bădescu M., 2001, Compendiu de fiziopatologie generală. Editura Vasiliană, Iași, p.83-104.

Cline M.J., 1994, The molecular basis of leukemia. New Engl. J. Med., 330: 328-335.

Dăscălescu A., Zlei M., Grigore G., Dănăilă C., Jitaru D., Carasevici E., 2009, Identificarea semnificației prognostice a fenotipului asociat leucemiei ȋn corelatie cu alți markeri biologici la pacienții cu leucemie acută mieloblastică. Revista Medico-Chirurgicală, Iași, 1:23-34.

Druker B., 1999, Status of BCR-ABL Tyrosine Kinase Inhibitors in CML, in Hematology. (Schechter, G., ed.), American Society of Hematology, , p. 160–191.

Fauci A.S., Braunwald E., Isselbacher K.J., Wilson J.D., Martin J.B., Kasper D.L., Hauser S.L., Longo D.L. 2000, Harrison; principes de médecine interne. 14e éd. : McGraw-Hill, 2 vols.

Fitzgerald P., Morris C., 1991, Complex chromosomal translocations in the chromosome leukemias. Cancer Genet. Cytogenet, p.143–151.

Fritz A., Percy C., Jack A., Shanmugaratnam R., Sobin L., Parkin D.M., Whelan S., 2005. OMS-International Classification of Diseases for Omology ICD-0-3.

Gersen S.L., Keagle M.B., 2005. The Principles of Clinical Cytogenetics. second Edition. Humana Press Inc. .

http://www.cytocell.com

http://www.epathology.ro

http://www.kreatech.com

http://www.leukemia-net.org

Huret JL, Brizard A, Slater R, Charrin C, Bertheas MF, Guilhot F, Hählen K, Kroes W, van Leeuwen E, Schoot EV, 1993. Cytogenetic heterogeneity in t(11;19) acute leukemia: clinical, hematological and cytogenetic analyses of 48 patients–updated published cases and 16 new observations. Leukemia. 7(2):152-60.

Lyman G., Cassidy J., Bisset D., Spence A.J.R., Payne M. (eds.) 2009, American Handbook of Oncology. Oxford University, New York, p.112-123.

Marica M., 2007, Oncologie generală, Editura UMF Iași, p. 90-123.

Miron L., 2008, Terapia oncologică. Opțiuni bazate pe dovezi. Editura Institutul European Iași, p. 92-117, 176-192.

Navy V., 2007, Principii de cancerologie generală. Curs pentru studenți, Editura Medicală Universitară Iulia Hațeganu, p.45-67.

Rodenhuis S., Smets L., Slater R., Behrendt H., Veerman A.,1985, Distinguishing the Philadelphia chromosome of acute lymphoblastic leukemia from its counterpart in chronic myelogenous leukemia. N. Engl. J. Med., 313:51–52.

BIBLIOGRAFIE

Bădescu M., 2001, Compendiu de fiziopatologie generală. Editura Vasiliană, Iași, p.83-104.

Cline M.J., 1994, The molecular basis of leukemia. New Engl. J. Med., 330: 328-335.

Dăscălescu A., Zlei M., Grigore G., Dănăilă C., Jitaru D., Carasevici E., 2009, Identificarea semnificației prognostice a fenotipului asociat leucemiei ȋn corelatie cu alți markeri biologici la pacienții cu leucemie acută mieloblastică. Revista Medico-Chirurgicală, Iași, 1:23-34.

Druker B., 1999, Status of BCR-ABL Tyrosine Kinase Inhibitors in CML, in Hematology. (Schechter, G., ed.), American Society of Hematology, , p. 160–191.

Fauci A.S., Braunwald E., Isselbacher K.J., Wilson J.D., Martin J.B., Kasper D.L., Hauser S.L., Longo D.L. 2000, Harrison; principes de médecine interne. 14e éd. : McGraw-Hill, 2 vols.

Fitzgerald P., Morris C., 1991, Complex chromosomal translocations in the chromosome leukemias. Cancer Genet. Cytogenet, p.143–151.

Fritz A., Percy C., Jack A., Shanmugaratnam R., Sobin L., Parkin D.M., Whelan S., 2005. OMS-International Classification of Diseases for Omology ICD-0-3.

Gersen S.L., Keagle M.B., 2005. The Principles of Clinical Cytogenetics. second Edition. Humana Press Inc. .

http://www.cytocell.com

http://www.epathology.ro

http://www.kreatech.com

http://www.leukemia-net.org

Huret JL, Brizard A, Slater R, Charrin C, Bertheas MF, Guilhot F, Hählen K, Kroes W, van Leeuwen E, Schoot EV, 1993. Cytogenetic heterogeneity in t(11;19) acute leukemia: clinical, hematological and cytogenetic analyses of 48 patients–updated published cases and 16 new observations. Leukemia. 7(2):152-60.

Lyman G., Cassidy J., Bisset D., Spence A.J.R., Payne M. (eds.) 2009, American Handbook of Oncology. Oxford University, New York, p.112-123.

Marica M., 2007, Oncologie generală, Editura UMF Iași, p. 90-123.

Miron L., 2008, Terapia oncologică. Opțiuni bazate pe dovezi. Editura Institutul European Iași, p. 92-117, 176-192.

Navy V., 2007, Principii de cancerologie generală. Curs pentru studenți, Editura Medicală Universitară Iulia Hațeganu, p.45-67.

Rodenhuis S., Smets L., Slater R., Behrendt H., Veerman A.,1985, Distinguishing the Philadelphia chromosome of acute lymphoblastic leukemia from its counterpart in chronic myelogenous leukemia. N. Engl. J. Med., 313:51–52.