Toxiinfectii Alimentare

TOXIINFECȚII ALIMENTARE

Cuprins

CAPITOLUL 1

GENERALITĂȚI

Definiții și clasificări

Clasificarea toxiinfecțiilor alimentare

BACILII GRAM NEGATIVI

ADJUVANȚII ALIMENTARI SAU ADITIVII ALIMENTARI

FACTORII DE RISC AI TOXIINFECȚIILOR ALIMENTARE

CAPITOLUL 2

TRATAMENTUL ÎN TOXIINFECȚIILE ALIMENTARE

2.1 Tratamentul

2.2 Regimul alimentar

2.3. Profilaxia în toxiinfecțiile alimentare

MOD DE LUCRU

Procedee calitative

Procedele ELISA

PARTEA EXPERIMENTALA

REZULTATE ȘI DISCUȚII

1. Evaluarea microbiologica a cerealelor

2. Evidențierea mucegaiurilor producătoare de aflatoxine

3. Evaluarea calitativa a aflatoxinelor

CONCLUZII

Bibliografie

CAPITOLUL 1

GENERALITĂȚI

Definiții și clasificări

Igiena alimentației este acea parte a igienei ce are ca scop cunoașterea și valorificarea efectelor pozitive ale alimentației asupra sănătății și să reducă ori să îndepărteze orice risc de a pune în pericol sănătatea consumatorului.

Pentru organismul uman alimentația este indispensabilă. Alimentația reprezintă posibilitatea de a trăi și de a rezista în variatele condiții ale mediului. Pentru a stabili gradul de toxicitate a alimentelor se face apel la o serie de examene: senzoriale, fizice, chimice, microbiologice, parazitologice, biologice.

Igiena alimentației are importanță pentru organismul uman și buna funcționara a acestuia, o importanță o are și pentru proprietatea de a muncii, pentru longevitatea populației (1).

Igiena alimentației îndeplinește mai multe funcții, dintre care:

Funcția socială, aceasta protejează consumatorii de bolile ce pot să apără ca urmare a ingerării unor alimente contaminate (boli transmisibile, intoxicații și toxiinfecții alimentare);

Funcția economică, stabilește felul în care se recuperează total sau parțial o partida de produse alimentare;

Funcția juridică, stabilește motivele care au condus la degradarea alimentelor, precum și vinovații.

Ceea ce încă nu se cunoaște destul de bine sunt procedeele de: preparare, conservare și depozitare a unor alimente, iar acestea pot duce la unele îmbolnăviri mai ușoare sau mai grave. Aceste îmbolnăviri se numesc toxiinfecții alimentare (2, 3).

Toxiinfecțiile alimentare pot fi definite ca constituind boli acute ce apar într-un mod sporadic sau epidemic ca urmare a ingerării unor alimente contaminate intens cu diferite bacterii și toxinele acestora. Există și factori etiologici, în mod deosebit rezidiurile metalelor grele, adjuvanții alimentari, unele pesticide.

Acestea pot duce la intoxicații alimentare cronice. Uneori evoluția bolii se desfășoară mai lent conducând la schimbarea totală a tabloului clinic acesta constituind diferit de cel care se are la persoana ce a ingerat de puțin timp alimentele cu microorganisme (4).

Clasificarea toxiinfecțiilor alimentare după diferite forme și clase astfel:

1 Toxiinfecții de origine microbiana, acestea pot fi potențate de germeni potențiali patogeni cum ar fi: Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Serovariantele enteropatogene, Echericha coli, Vibrio parahemoliticus, Klebsiella, Hafria, Aeromonas.

În aceasta categorie se încadrează și toxicozele, ce se împart în doua categorii:

a) Toxicoze bacteriene, în aceasta subgrupa pot fi enumerate toxinele produse de Clostridium botulinum, Staphyloccocus aureus;

b) Micotoxicoze, acestea sunt produse de diferite specii de ciuperci (Pencilinum, Aspergillus, Fusarium).

Toxiinfecțiile alimentare de etiologie mixta.

În aceasta clasă se încadrează diferite combinații ce se pot produce între agenții patogeni, de exemplu: Bacilul Cereus se poate combina cu toxinele eliminate de Staphyloccocus aureus, sau Proteus în combinație cu toxinele Staphyloccocus aureus.

2. Toxiinfecții alimentare de origine nemicrobiană

În aceasta categorie se pot încadra toxiinfecțiile potențate de plante otrăvitoare sau țesuturi de animale.

a) Toxiinfecțiile potențate de plante otrăvitoare: majoritatea acestor toxiinfecții se datorează ciupercilor. Toxiinfecția datorată neprelucrării culinare adecvate sau din cauza faptului ca au fost nerecunoscute sau confundate.

Toxiinfecții alimentare pot fi și cu fructele anumitor specii de plante (ricin, fag), cu cartofi ce sunt verzi sau încolțiți grație conținuturi mare de solanină.

b) Toxiinfecții alimentare pricinuite țesuturilor unor animale. În aceasta subcategorie pot fi structurate organele unor specii de pește, sau mierea de albina atunci când albinele culeg nectarul unor plante otrăvitoare.

3. Toxiinfecții cu rezidiurile de substanțe chimice

cu adjuvanți alimentari introduși în mod abuziv în preparatele alimentare;

cu pesticide;

cu substanțe ce migrează de pe uneltele de lucru când acestea nu sunt curățate și igienizate corespunzător (cântar, balanța, masa de lucru) (5).

BACILII GRAM NEGATIVI

Această clasă face parte din familia Enterobacteriaceae, ce cuprinde aproximativ în jur de 27 de genuri și 127 de specii, pe lângă acestea mai sunt și 8 grupuri enterice.

Această familie constituind una controversată este supusă tot timpul unor schimbări permanente.

Enterobacteriile constituind germeni ubicuitari pot fi izolați din: sol, plante, intestinul omului, intestinul animalelor și apa.

Majoritatea acestor enterobacterii (Klebsiella, Echerichia coli, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, etc.) făcând parte din flora normală a unui organism pot crea infecții oportuniste.

Habitatul unor specii cum ar fi Salmonella typhi este exclusiv în organismul uman.

Din punct de vedere patogen, germenii acestei familii se împart în:

germeni cu înaltă patogenitate (Yersinia, Salmonella, Shigella);

germenii ce sunt condiționat patogeni (Echerichia coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus);

germeni ce nu au o importanță în patologia umană.

Familia Enterobacteriaceae are o rezistență în mediul extern.

Germenii pot rezista între 5 și 6 luni când se află în ape poluate cu materii fecale, excepție făcând genul Shigella ce poate rezista între 2 și 6 săptămâni.

Se multiplica și supraviețuiesc la temperatura camerei, în alimente, în medii umede, sau în soluții perfuzabile.

Există mari posibilități de răspândire mai ales la spitale și în colectivități.

Germenii pot fi distruși de căldură (la 55-60C, sau distruși instantaneu la fierbere), antiseptice, dezinfectante.

Îngrijorător este faptul că speciile sunt tot mai rezistente la antibiotice.

Bacilii gram negativi pot fi mobili sau imobili. Aceștia sunt de dimensiuni medii, au capetele rotunjite și de regulă are o dispoziție necaracteristică. Pot prezenta o capsulă proeminentă (Klebsiella), fie îmbrăcate într-un material cabsular.

Cu ușurință se dezvoltă pe mediile uzuale (geloza-sânge, geloza, bulion) și pe medii selective unde se poate face o diferență între enterobacteriile lactozo-pozitive de enterobacteriile lactozo-negative. Pe mediile solide cresc luând forma unor colonii, iar mediu lichid îl tulbură uniform (6).

Figura 1. Medii de cultură în care s-a dezvoltat Salmonella

https://www.google.ro/search?q=genul+salmonela&biw=1333&bih=658&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=JEVKVfTvBOGpygO36oHYBQ&ved=0CAYQ_AUoAQ#imgrc=UDGhc029

Infecția cu Salmonella se numește Salmoneloza.

Aceasta se consideră printre cele mai comune infecții alimentare. Salmonelloza se transmite deseori grație igienei precare, pe cale fecal-orala (mâini nespălate, apa, sol, oua, carne de vită, fructe de mare, sosuri).

Din cauza acidului gastric ce distruge aproximativ majoritatea bacteriilor ingerate, pentru a se produce infecția cu Salmonella este nevoie de o cantitate mare de bacterie.

Salmonella typhi și Salmonella paratyphi determina febra tifoida.

Factorii ce cresc riscul infestării cu Salmonella sunt:

igiena precară;

alimentele și apa ce au avut contact cu materiile fecale;

persoanele în vârsta;

imunosupresatii;

copii;

contactul cu animalele domestice sau sălbatice.

Simptomatologia începe într-un interval de 12-48 de ore din momentul ingerării bacteriilor, apoi apar: crampele, greața, diareea, vărsăturile, febra.

În tratamentul Salmonelozei medicația antibiotică poate agrava simptomatologia de aceea se utilizează doar în cazuri speciale.

Antibioticele utilizate sunt: Ciprofloxacin, Ceftriaxona, Trimetroprim, Cloramfenicol.

În prevenirea deshidratării se administrează electroliți și fluide oral sau parenteral aceasta depinzând de starea clinică a pacientului.

Toxoplasma gondii, face parte din grupa sporoza, iar boala este denumită Toxoplasmoza.

Toxoplasma este întâlnita sub trei forme, iar în organismul uman se manifestă doar primele două:

trofozit (tahizoit, endozoit), se are sub formă vegetativă, are o dimensiune de câțiva microcentimetri, are un nucleu central. Se înmulțește într-o celula gazdă și niciodată înmulțirea nu are loc extracelular, dar nici nu va supraviețui în medii de cultură ce nu are celule vi.

chistul tisular, este rezultatul a unui ciclu asexuat, acesta are proprietatea de a deține sute sau mii de aglomerări de trofoziti. Se poate evidenția în diferite organe, dar mai ales în formele lente de boala sau cronice. Chistul tisular deține o singură membrană.

oochistul, este rezultatul ciclului sexuat ce are loc în organismul felinelor. Întâlnit doar în fecalele pisicii, aceasta constituind unica gazdă definitivă a parazitului.

Toxoplasma are proprietatea de a invada orice țesut, mai ales pe cel nervos.

Chistul tisular prefera țesutul nervos și pe cel muscular. Afectați sunt mușchii scheletici, miocardul, ganglionii limfatici, retina, placenta, encefalul (7, 8).

La om infecția apare din cauza consumului de carne infestată cu chisturi, poate fi transmisă tranplacentar sau prin oochisturile fecalelor de pisică.

Consecința proliferării trofozoizilor este moartea celulei ce este invadată ducând la focare de necroza.

Toxoplasma acută potențează hepatita, encefalita, pneumonie, miocardita, datorica tihiozoizilor ce distrug celulele parazitate. La nivelul pielii Toxoplasma formează un rash maculopapular ce ajuta la multiplicarea acesteia.

Toxoplasma congenitală are ca rezultat infectarea placentei. Aceasta rămâne asimptomatică.

Toxoplasma oculară apare după un timp îndelungat și poate fi unica exteriorizare a acestei boli. Forma congenitală de regulă este bilaterală fără a implica și alte organe.

Toxoplasma cerebrala este întâlnita la persoanele imunodeprimate.

Clostridium dificile este un bacil gram pozitiv, anaerob sporulat. Acesta este responsabil de: producerea colitei pseudomembranoase, dar și a diarei post antibiotice.

Clostridium dificile are doua toxine. Toxina A este o enterotoxina responsabila de creșterea secreției fluidelor și a inflamației de la nivelul mucoasei intestinale. Toxina B in vitro are o acțiune citotoxica mult mai puternică decât toxina A.

Colita potențată de Clostridium dificile rezulta în urma unui dezechilibru prezent în flora bacteriana a colonului.

Tratamentul antibiotic potențează alterarea florei, iar principala ținta a infecției o are persoanele spitalizate.

Simptomatologia infecției cu Clostridium dificile este: greața, dureri abdominale, diaree, febra, anorexie, sângerări intestinale oculte (9).

Factorii de risc a acestei infecții sunt în primul rând antibioticele (cefalosporinele de generație II și III, clindamicina, amoxacilina, ampicilina, eritromicina, claritromicina, aminoglicozidele) și asocierea sau prelungirea consumului a antibioticelor.

Alți factori sunt: vârsta, locuirea în aceiași camera cu pacienți deja infestați, lunga durata de spitalizare (10).

2. Substanțe alogene prezente în alimente și adjuvanții alimentar.

Substanțele alogene:

Substanțele alogene mai sunt numite și substanțe heterogene sau xenobiotice, acestea sunt substanțele ce duc la insalubrizarea alimentului.

Acestea se împart în:

Substanțe chimice care ajung în aliment grație nerespectării sau neconformării cerințelor de igienă, fie întâmplător în diferitele etape de fabricație, depozitare și transportare a alimentului;

Pesticidele, sunt substanțe chimie care sunt utilizate pentru a combate dăunătorii.

Cla, locuirea în aceiași camera cu pacienți deja infestați, lunga durata de spitalizare (10).

2. Substanțe alogene prezente în alimente și adjuvanții alimentar.

Substanțele alogene:

Substanțele alogene mai sunt numite și substanțe heterogene sau xenobiotice, acestea sunt substanțele ce duc la insalubrizarea alimentului.

Acestea se împart în:

Substanțe chimice care ajung în aliment grație nerespectării sau neconformării cerințelor de igienă, fie întâmplător în diferitele etape de fabricație, depozitare și transportare a alimentului;

Pesticidele, sunt substanțe chimie care sunt utilizate pentru a combate dăunătorii.

Clasificarea acestora în funcție de mecanismul de acțiune:

fungicide

ierbicide

insecticide

rodenticide

grupe de pesticide mai însemnate din punct de vedere chimic sunt:

carbamați;

compuși organoclorurați (hexaclorciclohexan).

compușii organofosforici (Paration);

derivați nitrofenolici (Dinitro-o-crezol);

c) Substanțe permise introduse intenționat în aliment și utilizate în cantități care depășesc limita admisă;

d) Substanțe care nu sunt permise, dar introduse în aliment în mod intenționat;

e) Unele substanțe nocive care ajung în alimente în urma depozitarii;

Substanțe de origine biologica care apar în urma activităților vitale a unor microorganisme (micotoxinele) (11).

În aceste moduri substanțele alogene pot ajunge să contamineze și să pună în pericol sănătatea omului.

Persoana care este responsabilă de respectarea și îndeplinirea normelor de igienă, de calitatea și inofensivitatea produselor alimentare este producătorul.

Importanță au grupa metalelor grele (cadmiu, cupru, cromul, fierul, plumbul, mercurul, staniul, zincul) și arsenul.

Când se dorește evidențiarea de elemente toxice la examenul de laborator, o importanță se acordă depistării cadmiului, plumbului și mercurului, pentru că aceste metale are capacitatea de a se acumula în organismul uman cu o acțiune toxică pe termen lung.

Examene de laborator se efectuează la alimentele pentru copii, la cele dietetice, precum și la alimentele conservate în cutii metalice.

Cantitatea de mercur se analizează mai ales la pește și derivatele acestuia, la produsele lactate, la cereale.

Conținutul cadmiului se analizează la alimentele vegetale, carne, lactate. Conținutul de staniu se analizează la alimentele din cutiile metalice compuse (12).

Foarte abordată este problema nitriților, nitraților și a altor substanțe azotice, pentru că în ultima perioadă s-a intensificat agricultura iar impurificarea mediului ambiant cu deșeuri menajere, și industriale scad puterea de acumulare a azotului de nitrați în apele subterane, în sol, și produsele alimentare de origine vegetală.

Creșterea numărului de nitrați în produsele alimentare vegetale este datorată unei cantități relativ mari de îngrășământ mineral.

Cantitatea zilnică care este admisă pentru organismul uman de nitrați este de 312,5 miligrame.

Atenție este acordată legumelor care asigură într-un procentaj mai mare organismul cu nitrați (sfeclă, varză, cartofi etc.) (13).

ADJUVANȚII ALIMENTARI SAU ADITIVII ALIMENTARI

Adjuvanții alimentari sau aditivii alimentari pot fi substanțe chimice/ compuși naturali care sunt introduși intenționat în diverse etape ale fabricației, depozitării sau transportării produselor alimentare, pentru a ameliora procesul tehnologic, a crește rezistența alimentelor de a nu se altera și nu în ultimul rând pentru a ameliora proprietățile organoleptice.

Adjuvantul alimentar poate rămâne în aliment în totalitate sau poate fi schimbat parțial, iar în unele cazuri ca urmare a interacțiunii adjuvantului cu părțile care compun alimentul pot apărea substanțe noi (14).

Conform clasificării, adjuvanții alimentari se împart în categoriile:

Adjuvanți alimentari care potențează stabilitatea produselor alimentare, ceea care conduce la o creștere mai mare a termenului de valabilitate (substanțe antioxidante, substanțe antimicrobiene)

Adjuvanți alimentari care se introduc în aliment pentru a ameliora consistența și proprietăți ale produselor alimentare (aromatizați, coloranți, substanțe gustative).

Adjuvanți alimentari de îmbunătățire a procesului tehnologic (substanțe de afânare, fixatori).

Aminoacizii, vitaminele, microelementele nu sunt considerate adjuvanți alimentari.

Se efectuează un control permanent în fabrici, întreprinderi pentru utilizarea corectă a adjuvanților alimentari și a cantității acestora.

Pentru ca adjuvantul alimentar să se încadreze în cerințele igienice și să poată fi folosit în industria alimentară, el trebuie să corespundă regulilor în vigoare privind buna stare și sănătatea consumatorului.

Pe ambalajul produsului alimentar trebuie scrise atât componentele produsului cât și adjuvanții alimentari ai produsului, data fabricației, lotul, data expirării produsului alimentar. Pe ambalajul produsului poate fi scrisă și cifra alimentară a acestuia, precedată de litera E (Europa), de exemplu pentru nitritul de sodiu care se încadrează în categoria conservanților, indicația de pe ambalaj poate fi E250 (15).

FACTORII DE RISC AI TOXIINFECȚIILOR ALIMENTARE

Factorii care amenință contaminarea alimentului sunt:

a) Timpul insuficient alocat procesului de preparare,pentru că țesuturile și organele animalelor pot găzdui tipuri sau genuri diferite de microorganisme, mai ales la nivel intestinal. Poate rezulta contaminarea persoanei care manevrează și are contact direct cu carnea. În procesului de preparare, conservare pot există persoane purtătoare de un anumit tip de microorganism (Stafilococ), sau de asemenea persoanele bolnave care pot contamina produsul alimentar;

b) În cazul cultivării fructelor și legumelor, care pot fi foarte ușor de contaminat, în mod special dacă cultivatorul folosește diferite îngrășăminte chimice sau îngrășăminte naturale, pesticide, erbicide, acceleratori de creștere, sau în cazul în care cultivatorul irigă plantația dintr-o sursă de apă contaminată;

c) Un alt factor de risc a toxiinfecțiilor alimentare este mediul înconjurător, care este tot mai adesea contaminat cu diferite microorganisme patogene care se pot regăsi în apa, pământ, praf;

d) Alegerea spre consuma unor produse sau băuturi alimentare nepasteurizate (lapte nefiert, sau diferite produse concepute din acesta, cum ar fi brânza sau smântâna);

e) Timpul insuficient de preparare alocat cărnii (friptură în sânge, cârnat crud, carne de pui contaminată, pește, melci, scoici, moluște infestate și insuficient preparate);

f) Petrecerea concediilor sau călătorii făcute în unele țări care sunt în curs de dezvoltare (16).

Persoanele care are risc crescut de dezvoltare a toxiinfecțiilor alimentare sunt:

Persoane care își desfășoară activitatea în domeniul sanitar, pescării, abatoare;

Persoane care are un sistem imunitar deficitar;

Bolnavii care se confruntă cu boli cronice (diabeticul, persoane infestate cu virusul HIV sau Sida);

Femeile însărcinate;

Copii (sugarii și preșcolarii);

Vârstnicii (mai ales cei peste 65 de ani);

1.3 Simptomatologie

Simptomatologia unei toxiinfecții alimentare este influențată de tipul de microorganism care a creat infecția. Alte elemente ale simptomatologiei sunt vârsta și starea sănătății generale a persoanei contaminate.

De aceste criterii depinde timpul care declanșează apariția simptomelor și durata acestora, cât și severitatea lor. În cazul unei toxiinfecție alimentare, bolnavul are o pierdere masivă de electroliți (sodiu și potasiu). Simptomatologia toxiinfecției alimentare are o patologie glastro-intestinală, care debutează de regulă brusc cu următoarele simptome: inapetență, dureri abdominale, grețuri, vărsături, frisoane, lăcrimarea ochilor, salivă excesivă, creșterea temperaturii corporale, stări de slăbiciune.

Unele microorganisme stagnează în peretele intestinal, iar altele sunt producătoare de toxine, care vor fi eliberate în circulația sanguina, iar o altă parte invadează organele și țesuturile. Diareea și vărsăturile rezină mecanismul prin care organismul se apără, încercând să îndepărteze microorganismele în timp de câteva zile de la debutul simptomatologiei, iar în acest caz pacientul nu necesită tratament medicamentos.

Atunci când simptomele se agravează, bolnavul are: durere abdominală, diaree severă, vedere încețoșată, dureri ale mușchilor, leșin, cefalee acesta trebuie să se prezinte cât mai repede la un consult medical. Când bolnavul are durere abdominală asociată cu lipsa scaunelor și gazelor, acesta are nevoie de un consult chirurgical urgent pentru că există posibilitatea unei ocluzii intestinale (17).

După de microorganismul care a creat toxiinfecția, pot fi prezente următoarele simptomatologii:

Toxiinfecție alimentară generată de Clostridium botulinum, aceasta are simptome care apar aproximativ la 18-36 de ore de la ingerare și se manifestă prin paralizia progresivă care începe din regiunea nervilor cranieni, cuprinzând apoi întreg corpul;

Toxiinfecția alimentară potențată de Toxoplasmoză, de regulă este reprezentată de simptome minore precum cele din urma unei răceli. Toxoplasmoza are un grad mare de periculozitate pentru femeile însărcinate, pentru că poate afecta fătul;

Toxiinfecția alimentară provocată de Listerioză, poate crea următoarele simptome: dureri musculare, greață, vărsături, febră, cefalee, stări de confuzie.

Toxiinfecția alimentară precedată de contaminarea cu Echerichia coli. Aceasta se manifestă mai ales la copii sub 5 ani, dar și la persoanele vârstnice, având puterea de a provoca complicații renale. Se necesită spitalizare;

Toxiinfecția alimentară cu Salmonella este extrem de agresivă. Simptomele sunt de ordin glastro-intestinal;

Toxiinfecția alimentară generată de Giardia lamblia, este una severă, iar persoanele care are: diaree severă,durere abdominală intensă, vedere încețoșată, oligurie sau anurie, hipotensiune arterială, necesită de urgență consult medical.

De un consult medical este nevoie și atunci când vărsăturile durează mai mult de o zi,iar scaunele diareice mai mult de două zile la adulți,o zi la copii sub 5 ani,opt ore la copii între trei ți șase luni și nu mai mult de patru ore pentru copii sub trei luni.

Medicul are proprietatea de a formula diagnosticul de toxiinfecție alimentară,în baza simptomatologiei,a examenului de laborator și a istoricului medical (18).

CAPITOLUL 2

TRATAMENTUL ÎN TOXIINFECȚIILE ALIMENTARE

2.1 Tratamentul

Înainte de un tratament specific gradului de periculozitate la care este expus pacientul, trebuie ca medicul să stabilească un diagnostic pozitiv de toxiinfecție alimentară. Se poate stabili un diagnostic clinic, în care medicul stabilește pe baza simptomatologiei pacientului gravitatea toxiinfecției alimentare, sau se va recurge la diagnosticul de laborator, unde se va efectua:

1. Examenul de analiză a modificărilor hidroelectrice (hipopotasemie, hiponatriemie, hipocloremie, modificarea crescândă a ureei serice și a creatininei);

2. Examenul hematologic: se urmărește modificarea leucocitozei care aduce urmări de tipul neutrofiliei, uneori creșterea dimensiunilor hematocritului ca urmare a dezhitratării;

3. Examenul bacteriologic efectuat din produse patologice: sânge, lichid de vomă, materii fecale.

Pe baza acestora se vor efectua coproculturi, hematoculturi, culturi extrase din alimente și lichidul de vomă din probele biologice.

Pe baza acestor examene diagnosticul unei toxiinfecții alimentare va avea un grad de precizie mult mai mare constituind cât se poate de concludent și exact (19).

Pe baza acestora va fi stabilit tratamentul.

Tratamentul unei toxiinfecții alimentare ușoare poate fi reprezentat de antiemetice, antidiareice, la nevoie antispastice.

Medicația antiemetică este utilizată în tratamentul vomismentelor,pentru a reduce senzația de greață. Însă antiemeticul poate întârzia stabilirea de către medic a unui diagnostic. Antiemeticul acționează în unul sau mai multe stadii a senzației de vomă. De regulă medicația antiemetică produce somnolentă.

De aceea se preferă a fi utilizate grupa antihistaminicelor, de exemplu: triploidina, hidroxizina, meclozina, bromfeniramina, dimenhidrina.

Dintre medicamentele antiemetice se reamintește de:

Emetostop, care are clorhidrat de medozină, 30 de miligrame și lactoză monohidrat, amidonul de porumb, celuloză, talc, stearat de magneziu, galben de chinalină ca excipienți.

Face parte din grupa antihistaminicelor, derivații de piperazine de uz sistematic.

Emetiral de 5 miligrame, are maleat de proclorperazină, lacloză, amidon, stearat de magneziu, talc.

Metoclopramid 10 miligrame, are substanța denumită metoclopramidă, care acționează o parte a creierului care previne greața și vărsăturile. Este posibil ca aceasta să potențeze somnolență și este contraindicat consumul de alcool.

Medicația antidiareică are efect invers fată de medicamentele laxative, purgative. Medicamentele diareice se clasifică în modul următor:

1. Antidiareice simptomatice (absorbante și protectoare, astringente, antipropulsive, antipropulsive și antisecretoare);

2. Antidiareice de substituție (enzime digestive, soluții de electroliți, rehidratate, microorganisme antidiareice)

3. Antidiareice etiotrope, acestea are acțiune antiinfecțioasă și de antiparazitare intestinală (20).

Medicamente antidiareice utilizate frecvent:

Furazolidon, un comprimat are 100 de miligrame de Furazolidon. Este indicat în toxiinfecții alimentare, mai ales pentru salmoneloze, lambliază, disterii baciliare. Este un antiseptic care este activ pe tulpini numeroase.

Pe lângă medicația antiemetică, antidiareică, poate fi asociată și medicația antispastică care are proprietatea de a împiedica cu ajutorul substanțelor antispastice, spasmele musculaturii netede.

În cazul unei toxiinfecții alimentare mai severe, bolnavul are o pierdere masivă de electroliți astfel că acesta se deshidratează.

Deshidratarea include pierderi masive de lichid din organism.

În cazul unei toxiinfecții alimentare cauzele principale ale deshidratării sunt: scaunele diareice, vărsăturile, transpirația.

Simptomele cu care debutează deshidratarea sunt: setea, pierderea poftei de mâncare, pielea este fierbinte și uscată, urina este de culoare închisă, frisoane, vertij, uscăciunea gurii.

Dacă deshidratarea se accentuează apar următoarele simptomatologii: diminuarea transpirației, cantitatea de urină se micșorează, temperatura corpului crește, vărsăturile și scaunele diareice sunt tot mai frecvente, apare dificultatea în a respira, spasme musculare, pierderea conștiinței.

În cazul deshidratării severe bolnavul trebuie tratat în regim de urgență cu săruri și fluide intravenos.

Hidratând intravenos bolnavul, se oferă corpului acestuia șansa ca substanțele nutritive esențiale să se asimileze mult mai ușor și mai repede, iar riscul ca viața acestuia să fie în pericol scade (21).

Medicamentele perfuzabile se are sub forma unor soluții sau emulsii apoase, sterile, izotonice și apirogene. Acestea se administrează intravenos cu dispozitivul de perfuzare. După scopul acestora, preparatele perfuzabile se împart în:

perfuzii cu electroliți (soluția Ringer, ser fiziologic 0,9%, KCl, CaCl2);

perfuzii pentru a restabili echilibrul acido-bazic;

perfuzii care conțin înlocuitori de plasmă;

perfuzii reconstituante.

În cazul unei toxiinfecții alimentare severe pacientul va primi ca prim tratament perfuzia cu electroliți. Aceasta ca toate celelalte preparate administrate intravenos trebuie să fie sterilă. Ea are clorură de potasiu, clorură de sodiu și apă.

Soluția perfuzabilă care are clorură de sodiu, este sterilă și apirogenă.

Aspectul sau este limpede, fără miros, incoloră, cu gust slab sărat.

Soluția perfuzabilă cu clorură de potasiu și glucoză este izoosmotică cu serul sanguin. După sterilizare este însemnat a se controla colorația și pH-ul acesteia, pentru că glucoza apoasă poate suferii transformări (22).

2.2 Regimul alimentar

Regimul alimentar este rezultatul selecției a diferitelor tipuri de alimente care sunt capabile să alcătuiască un meniu care va oferi organismului necesarul de energie.

Regimul alimentar se realizează ținând cont de o serie de factori:

starea de sănătate a organismului;

disponibilitatea alimentelor;

posibilitățile economice;

calitatea produselor alimentare disponibile.

Alimentele alcătuiesc următorii factori nutritivi: proteine, lipide, glucide, vitamine și săruri minerale. Aceștia îndeplinesc rolul energetic, plastic și catalitic.

Cantitatea de factori nutritivi diferă în funcție de originea acestora (animală care sunt bogate în lipide și proteine, de origine vegetală cu conținut ridicat de săruri minerale, dar mai ales glucide).

Organismul uman consumă energie pentru a realiza: homeostazia termică, activitatea fizică, pentru a întreține funcțiile vitale (circulația, respirația, excreția), pentru a realiza sintezele biochimice, pentru procesele catabolice (23).

Astfel pentru a întreține funcțiile vitale, energia necesară se împarte în felul următor:

55%-65%, se ia din glucide;

20%-35% din lipide;

10%-18% se ia din proteine.

Acestea se pot compara doar din punct de vedere energetic cu ajutorul relației de ionizare.

Chiar dacă organismul se află în stare de repaus, acesta consumă factori nutritivi pentru a menține metabolismul bazal.

În stare de repaus sau absolut organismul consumă energie pentru: activitățile de care au nevoie funcțiile vitale, pentru a sintetiza compușii proprii, pentru transportul ionic de la nivelul de membre, pentru a menține temperatura corpului, iar procentual consumul de energie se împarte astfel: 27 % din energie este consumată de ficat, 19 % de creier, 18 % de mușchii scheletici, 10 % de inimă, 7 % de rinichi (24).

Principiile nutritive denumite nutrienți sau trofine reprezintă substanțele prezente în aliment și care au rolul de a asigura funcționarea corespunzătoare a organismului.

Concentrațiile acestora în aliment depinde de rolul fiziologic și biochimic clasificându-se astfel:

macronutrienți (glucide, lipide, proteine);

micronutrienți (vitamine, substanțe minerale, substanțe biominerale);

alți nutrienți (fibrele alimentare, apa, substanțe biologic active).

Pentru a alcătui un regim alimentar echilibrat, doza de care este nevoie în fiecare zi de nutrienți trebuie asigurată.

De aceea în cazul unei toxiinfecții alimentare, după un regim alimentar hidric se recomandă începerea unui regim alimentar pentru a ajută reglarea tranzitului intestinal și a spori timpul de recuperare.

În acest sens sunt recomandate alimente ușoare, cu potențial scăzut de deținere a uni microorganism patogen. Dintre acestea se enumeră: orezul, morcovii, bananele, biscuiți, paste făinoase, brânza dulce de vaci, carne de pui sau vita fiartă sau la grătar.

Orezul este o sursă bună de energie în cazul unei toxiinfecții alimentare.

Acesta nu are colesterol, are proprietatea de a menține presiunea sângelui în valori stabile (25).

Morcovul sau Dacus carota are cantității ridicate de fibre dietetice

Bananele conțin o multitudine de vitamine precum: B6, B9, B1, B2, B3, A, K, E, C.

Acestea sunt un pachet de nutrienți esențiali pentru armonioasa dezvoltare a organismului.

În cazul unei toxiinfecții alimentare ușoare sau severe, tratamentul este însemnat, dar nici regimul alimentar nu este de neglijat. Acesta este însemnat atât pentru reenergizarea organismului cât și ca adjuvant în tratamentul medicamentos.

Se recomandă ca în regimul alimentar, alimentația să fie cât se poate de individualizată.

2.3. Profilaxia în toxiinfecțiile alimentare.

Pentru a prevenii toxiinfecțiile alimentare este foarte însemnat să se respecte regulile igienice personale, sanitare și cel mai însemnat igiena alimentului.

Măsurile luate în vederea profilaxiei toxiinfecțiilor alimentare sunt:

alegerea corectă a alimentelor;

alimentele vor fi puse cu promptitudine la rece, la temperaturi corespunzătoare;

angajații care contactează direct alimentul vor fi supuși unui control medical specific periodic, aceștia vor purta îmbrăcăminte adecvată postului pe care îl ocupă (mască, mănuși, halat);

articolele alimentare trebuie păstrate separat;

consumarea imediată a alimentelor după gătire;

decongelarea alimentelor se face în interiorul frigiderului și nu în apa caldă;

este necesară evitarea contactului între alimentele preparate și cele nepreparate;

la prepararea alimentului se va folosi exclusiv apa potabilă;

păstrarea și depozitarea adecvată;

personalul care este angajat în domeniul serviciilor publice pot fi surse de infecție cu stafilococ, la această categorie se vor urmării infecții ale mâinilor, unghiilor, igiena personală deficitară. în aceste domenii responsabilitatea posibilelor epidemii revine angajatorului;

prelucrarea (gătirea) completă a alimentelor;

produsele alimentare gătite nu trebuie ținute mai mult de doua ore la temperatura camerei;

produsele din carne crudă sau pește vor fi depozitate și așezate pe raftul cel mai jos a frigiderului sau congelatorului, pentru că există riscul ca acestea să fie contaminate, iar prin picurare pot infesta și alte alimente;

protejarea alimentului fată de insecte, rozătoare, animale de companie, sau alți factori care pot altera alimentul;

repetata spălare a mâinilor din timpul preparării;

spălarea fructelor și legumelor;

spălarea mâinilor cu apa caldă și săpun;

ustensilele de gătit se vor spăla frecvent și se vor steriliza regulat.

arealul de pregătire a alimentelor va fi dezinfectată periodic și într-un mod riguros;

Pentru a reduce riscul infestării produselor alimentare cu diferite microorganisme, sau pentru a micșora riscul producerii unei toxiinfecții alimentare este de dorit ca aceste măsuri să fie respectate pentru a ne proteja pe noi și pe oamenii din jurul nostru (26).

MOD DE LUCRU

De la descoperirea micotoxinelor, au fost dezvoltate multe metodologii de cuantificăre a acestora.

Procedeele utilizate în mod curent pentru evidențierea și cuantificarea cantitativă a micotoxinelor se bazează pe principiu tehnicii cromatografice, mai însemnate constituind cromatografia în strat subțire (CSS), cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC) cuplată cu diferite tipuri de detectoare (UV, DAD, MF) sau spectrometrie de masă (MS), gaz-cromatografia (GC), cuplată cu detectoare cu captura de electroni (ECD), cu ionizare în flacără (FID) sau detectoare tip MS.

În ultimii ani, cromatografia lichidă cuplată cu spectrometria de masă (LC-MS) a dobândit un statut de dominanță grație avantajelor pe care le are, în primul rând posibilitatea determinării simultane a mai multor categorii de micotoxine (27).

Conceptul și evaluarea unui plan de eșantionare

Factorii următori sunt esențiali în stabilirea unui plan de eșantionare:

concentrația maximă în toxine permisă în lot;

concentrația maximă permisă în eșantion (concentrația critică);

dimensiunea eșantionului;

procedeul analitică;

procedeul de obținere a eșantionului;

numărul eșantioanelor;

numărul subeșantioanelor;

tipul de probă.

Trebuie să se știe că există două tipuri de riscuri legate de planul de eșantionare: riscul producătorului (Producer Risk, PR), care este acela de a respinge un lot sigur, și cel al consumatorului (Consumer Risk, CR), care este acela de a accepta un lot contaminat. După cuantificarea părții relative a fiecăruia dintre cele două riscuri se poate construi o curba unică denumită curba caracteristică de operare (Operating Characteristic curve, OC curve) care pe abscisa are reprezentată probabilitatea [P(M)] ca planul de eșantionare sa accepte un lot în funcție de concentrația în aflatoxina M în lot. Forma acestei curbe va fi influențata de parametri:

concentrația critică permisă în eșantion;

mărimea eșantionului;

mărimea subeșantionului și gradul de fragmentare;

procedeul analitica (tipul și numărul analizelor).

Probabilitatea ca un lot sa fie acceptat se poate exprima astfel: P(M)=p(X<Xc/M)

Unde X este concentrația în toxina a eșantionului:

Xc este concentrația critica a eșantionului;

M este concentrația în aflatoxina a lotului.

Pentru evaluarea micotoxinelor, se vor prelua cate 4 eșantioane identice cantitativ:

primul pentru evaluarea propriu-zisa;

doua pentru eventualele analize complementare;

ultima este păstrata ca referința.

După principiul Gafta Rules, dacă cantitatea de micotoxina găsită în prima proba este mai mare de 50% față de limita permisă, cea de-a doua evaluarea va fi efectuată pe cel de-al doilea eșantion.

Dacă rezultatele furnizate de aceasta data sunt inferioare limitelor, atunci, lotul va fi acceptat. Dacă ce-a de a doua evaluarea are valori mai mari decât normele tolerate dar inferioare primei probe, se va realiza o noua evaluarea pe cel de al treilea eșantion. Daca rezultatele celei de a treia evaluarea sunt conforme cu normele în vigoare, lotul este acceptat, daca nu este respins.

Procedeele care permit evidențierea micotoxinelor în produsele alimentare sunt scindate în doua categorii calitative și cantitative menționând în egala măsura și „procedele kit' care permit evaluarea pe teren și furnizează date referitoare la prezenta sau absenta contaminanților, dar trebuie să fie confirmata de o evaluarea complementara de laborator.

Cele din urma, reprezintă un protocol recunoscut și normalizat de AOAC (Association of Official Analytical Chemist).

Totuși, înainte de a fi normalizat, un protocol de evaluarea propus de un laborator trebuie sa fie validat prin teste iter laboratoriale, organizate după normele ISO 43.

Diferitele procedee de referința se pot grupa după principiul lor fundamental de funcționare în tehnici fizico-chimice sau imunochimice; totuși noi le vom împarți în funcție de performanța lor, în tehnici calitative: minicoloanele, coloanele de imunoafinitate, testul ELISA (poate fi considerat și test cantitativ); și tehnici calitative: cromatografie în strat subțire (TLC), cromatografie gazoasa (CG) și cromatografie lichida de înalta rezoluție (HPLC) (19).

Procedee calitative

În aceasta secțiune sunt prezentate procedeele care în general sunt utilizate ca procedee rapide de detecție a micotoxinelor.

Aceste procedee sunt utilizate ca etape prealabile de purificare a micotoxinelor.

Procedeele calitative folosesc fluorometria cu lumina UV pentru a cuantifică concentrația molara a soluției (28).Pentru interpretarea corecta a măsurilor realizate, ne vom folosi de două legi care descriu absorbția luminii de materie:

Legea lui Lambert: A = logI0/I

Legea lui Beer: A=εCd

Unde: A = absorbanta sau densitatea optica a solutiei;

I = intensitatea luminii emise;

I0 = intensitatea luminii transmise;

C = concentrația substanței absorbante;

ε = coeficientul de extincție al substanței absorbante.

Tabel 1.

Parametri spectrofotometrici pentru diferite micotoxine

În practica, în cazul unui spectrofotometru UV cu un fascicol, scala absorbantei este adusa la zero cu un solvent folosit ca martor. Celula care are soluția de evaluat este apoi plasată în spectrofotometru și citirea poate începe. Fiecare micotoxină are o valoare a absorbantei bine specificată (29).

Procedeele ELISA

Două formate ale procedeelor ELISA sunt dezvoltate: procedeele competitive și procedeele non-competitive.

În testul ELISA tipic, legătura unui complex micotoxina-enzima cu anticorpi imobilizați este inhibata prin prezenta micotoxinei în soluția test.

Enzimele legate, catalizează transformarea substratului într-un complex colorat.

Intensitatea culorii este invers proporționala cu concentrația de aflatoxine.

Peroxidaza care catalizează oxidarea substratului tetrametilbenzidina într-un complex bleu este enzima de marcaj cel mai des întâlnita.

Procedeul ELISA este frecvent întâlnita în cazul laboratoarelor centrale unde sunt frecvent realizate numeroase teste.

Pentru o viziune rapida și tot odată detaliata a variantelor procedeului, este prezentat tabelul 2.

Principiul procedeului ELISA

Testul se bazează pe reacția antigen – anticorp.

Godeurile de microtitrare sunt acoperite cu anticorpi captura, direcționați împotriva anticorpilor anti – micotoxina.

În fiecare godeu, pentru standard, și pentru proba, se adaugă conjugatul enzimatic și anticorpii anti – micotoxina.

Micotoxina liberă și conjugatul enzimatic participă la competiția pentru siturile de legare ale anticorpilor de acoperire ai godeurilor (procedeul imunoenzimatica competitiva).

Conjugatul enzimatic nelegat este îndepărtat în faza de spălare.

Se adaugă substrat/cromogen, observându-se virarea culorii de la roșu la albastru.

Tabel 2.

Aplicații ale procedeului ELISA în cuantificarea micotoxinelor în alimentație.

Adăugarea reactivului de stopare al reacției determina modificarea culorii albastre în galben. Citirea probelor se realizează la 450 nm. Absorbanta este invers proporțională cu concentrația micotoxinei din proba de evaluat (30).

PARTEA EXPERIMENTALA

REZULTATE ȘI DISCUȚII

1. Evaluarea microbiologica a cerealelor

Evaluarea microbiologică este necesară pentru a asigura produsului o calitate și o conservabilitate mai bune, și pentru a garanta calitatea igienică și siguranța consumatorilor.

Pentru tehnicile de evaluarea microbiologică, cantitative și calitative s-au cumpărat din Piața cereale: porumb, orz și secara destinate consumului uman și animal. Probele de evaluat au fost cuantificate calitativ pentru a studia gradul de contaminare cu mucegaiuri.

1.1 Evaluarea calitativă aprecierea aspectului coloniilor dezvoltate prin cultivarea boabelor de cereale pe medii selective (MMA), în condiții de aerobioza la temperatura de 25˚C (30).

Materiale necesare:

S-au folosit probe de evaluat: porumb (15), grâu (14), orz (13) și secară (10), medii de cultură specifice (must de malț cu agar), placi Petri.

Mod de lucru:

Mediul de cultura de MMA este fluidificat, împărțit în placi Petri. După solidificarea mediului se adaugă în plăci cu o penseta boabe de porumb, grâu, orz și secara. Plăcile sterile sunt termostatate la 25°C timp de 5 zile.

Coloniile de mucegai crescute în plăcile Petri sunt izolate (procedeul în strii) și evaluate microscopic și macroscopic. După termostatare s-a identificat că gradul de contaminare a cerealelor cu mucegai este mare (tabel 3.). Astfel din probele de porumb evaluate, 80% au fost contaminate cu mucegai, la probele de grâu 71 % au fost contaminate cu mucegai, din probele de orz 85 % au fost contaminate și din probele de secară 70% au fost contaminate cu mucegai (31).

Tabel 3.

Gradul de contaminare a cerealelor cu mucegai

Evidențierea microscopica s-a realizat cu ajutorul preparatelor umede.

Obținerea preparatelor umede

Principalele etape pentru executarea unui preparat umed:

pregătirea lamei și lamelei–lama degresată se sterilizează trecând ambele fețe prin flacăra becului de gaz. Lamela se șterge cu hârtie de filtru;

realizarea suspensiei de celule pe lama–se pune o picătura de apă pe lama de sticla sterilizată (arealul centrală). Pentru recoltarea celulelor aflate în medii lichide se folosește ansa sau pipeta (sterila), pentru recoltarea microorganismelor aflate pe medii dense (solide sau solidificate) se folosește firul metalic.

realizarea preparatului între lamă și lamela–după obținerea suspensiei de celule, lamela se sprijină și se deplasează pe lamă la un unghi de 45°, până când devine tangentă la picătura, apoi se lăsă să cadă peste aceasta. Lichidul în exces se absoarbe pe marginile lamelei cu hârtie de filtru.

Un preparat de calitate nu are bule de aer, care ar cuantifică aglomerări de celule și deranjează studiul preparatului microscopic. După evaluarea microscopică și macroscopică a coloniile de mucegai dezvoltate pe mediul de cultură după termostatare s-a constatat prezența specii de mucegai Aspergillus sp., Penicillium, Fusarium, Mucor și Rhizopus (Fig. 2, 3, 4, 5).

Din graficele obținute s-a evidențiat ca în probele de porumb a predominat într-un procent de 60% Aspergillus sp. Comparativ (10) cu alte specii care au fost într-un procent mai mic Penicillium 20%, Fusarium 13% și Rhizopus 7%. Comparativ cu probele de grâu procentul de Aspergillus a fost mai mic de numai 36% dar a predominat Penicillium într-un procentaj de 43% și procentul cel mai mic de 21% Fusarium.

În probele de orz au fost identificate mai multe speciile de micotoxine (5), procentul mai mare avându-l tot Aspergillus la fel ca și în porumb celelalte având un procent de Penicillium 23%, Fusarium 15%, Rhizopus 15% și Mucor 8%. În secara s-au constatat 3 specii de micotoxine (Fusarium a reprezentat 50%, Aspergillus 30% și Penicillium 20%).

Figura 2. Speciile principalele de mucegai prezente pe porumb

Figura 3. Speciile principalele de mucegai prezente pe grâu

Figura 4. Speciile principalele de mucegai prezente pe orz

Figura 5. Speciile principalele de mucegai prezente pe secara

2. Evidențierea mucegaiurilor producătoare de aflatoxine

Procedeul se bazează pe cultivarea mucegaiurilor izolate sub forma de culturi pure din alimente mucegăite, pe mediu optim pentru elaborarea aflatoxinelor și cuantificarea calitativă / semicantitativă a micotoxinelor prin cromatografie și studiu în lumina UV cu 365 nm ca lungimea de undă (32).

Modul de lucru: Din culturile (pure) ale mucegaiurilor din genul Aspergillus de pe cereale, cu ajutorul firului se recoltează cantități mici de spori și se fac inoculări în arealul centrală a plăcilor Petri în care se afla în prealabil repartizat mediul Hara cu agar (tabel 3). Plăcile se incubează la 28°C timp de 5-7 zile, condiții optime pentru elaborarea aflatoxinelor. După acest interval, plăcile se expun la radiații ultraviolete cu λ= 365 nm.

Tabel 4.

Compoziția mediului HARA

Pentru că culturile evaluate au prezentat o pată fluorescentă în jurul coloniei (fig. 6), se consideră ca mucegaiul are caracter toxicogen (33).

Figura 6. Coloniile speciei Aspergillus cultivate pe Mediu HARA incubate la 25°C timp de 7 zile constatate cu și fără lumina UV

3. Evaluarea calitativa a aflatoxinelor

Pentru evaluarea calitativă au fost evaluate patru medii de cultură, un mediu lichid sintetic (tabel 5) și trei medii solide pe baza de cereale (tabel 6).

Mediul pe baza de cereale a fost obținut prin fierberea amestecului de cereale cu apa, timp de 30 minute, filtrat și s-a adus la 1 litru cu apa distilată din fiecare mediu câte 100 ml au fost repartizate în pahare Erlenmeyer și timp de 20 min. La 121°C sterilizate.

Tabel 5.

Compoziția mediului lichid sintetic

Tabel 6.

Compoziția mediului pe baza de cereale

3.1 Pregătire inocul

Mucegaiul a fost dezvoltat 7 zile pe MMA la 25°C, a sporulat. Sporii au fost suspendați în apă distilată cu 0,005 % agent Tween 80. Cu camera Thoma s-au numărat sporii și pentru a obține o suspensie cu 10-7 spori pentru inoculare s-au realizat diluții decimale (34).

Numărare cu Camera Thoma

Pentru numărare se plasează o picătură din suspensia de ositiv de evaluat pe platforma centrală, în dreptul suprafeței delimitate.

Peste suspensie se plasează o lamelă care se sprijină pe cele două platforme laterale și astfel între lamela și citometru se creează o peliculă de lichid cu înălțime egală cu denivelarea platformei centrale (0,1 mm). Volumul de lichid plasat pe fiecare pătrățel este ¼ 106 cm3.

Preparatul obținut se cercetează la microscop cu obiectiv cu grosisment x40, când în câmpul microscopic poate fi vizualizat un grup de 16 pătratele elementare, din care se număra celulele a căror suprafața se afla mai multe câmpuri microscopice (n= 100) și se calculează numărul mediu de celule pe un pătrate elementar:

n = n /10 16

Numărul de celule prezente într-un cm3 de suspensie de evaluat se cuantifică cu formula:

N= n·4·106·k

în care:

n este numărul mediu de celule pe un pătrățel elementar;

k- coeficientul de diluție (35).

3.1 Inoculare și incubare

În mediu preparat proaspăt s-a inoculate o suspensie cu 107 spori. Mediile au fost agitate 10 min (repartizarea sporilor în tot mediul). Mediile inoculate au fost termostatate la 28°C, timp de 14 zile, staționar (figura 6).

Figura 7. Mediile de cultura după perioada de termostatare

3.2. Extracție

După terminarea perioadei de termostatare, s-a adăugat la fiecare probă 100 ml cloroform apoi timp de 24 h, 200 rot./min la 25°C s-a agitat.

Separarea de cloroform s-a făcut cu pâlnii de separare. Extracția cu cloroform se va repeta și cele două extracte se vor amesteca și vor fi evaluate prin cromatografie în strat subțire. Extractele obținute au fost evaluate la lampa U.V pentru a vedea fluorescența care indică prezența aflatoxinelor (36).

Figura 8. Extractele obținute constatate cu și fără lumina U.V

Aparatura necesară pentru cromatografia în strat subțire

camera de vizualizare în ultraviolete cu filtre de 254 nm și 366 nm;

cilindri gradați de 50 ml, 100 ml, 250 ml;

placi pentru cromatografie în strat subțire (strat de silicagel 60 G de 0.3 mm grosime) sau placi sticla preparate (pregătite în laborator cu 200×200 mm / 100×200 mm);

rotovapor;

seringa Hamilton 10 μl;

Shaker

șablon pentru aplicarea spoturilor pe placă;

tanc pentru cromatografie sau camera cromatografică (vas paralelipipedic din sticlă);

Reactivi

aflatoxine: B1;

amestec alcool metilic-apa 85:15 (V/V);

amestec de acetona–apa 85:15 (V/V);

amestec eter etilic eter de petrol (20:30)

cloroform;

clorura de metilen acetona (98: 2)

silicagel G 60

sistem de solvenți de developare: toluen acetat de etil acid formic în proporție de 6:3:1 (V/V/V);

sulfat de sodiu anhidru;

Prepararea sistemului de cromatografie în strat subțire. Plăcile din sticlă s-au spălat cu detergent, s-a clătit cu apă curentă, apă distilată și s-a uscat.

Înainte de întinderea absorbantului s-a șters cu tampon de tifon cu alcool / acetona, apoi cu tifon curat și uscat. Pe plăcile pregătite s-a aplicat amestecul absorbant (cu dispozitivul de aplicat absorbantului pe placă).

Pentru a obține placi cu strat absorbant fixat bine s-a substituit 20 ml amidon 10 % (grosimea stratului adsorbant aplicat pe placă este de 0.3 mm).

Plăcile s-a lăsat sa se usuce la temperatură camerei (poziție orizontală) timp de 1…2 h. Apoi sunt activate prin introducere în etuvă, la 110°C, timp de 1 h, după care s-a scos imediat / s-a putut păstra într-un exsicator cu clorura de calciu (dacă s-a ținut mult înainte de întrebuințare trebuie activate din nou) (37).

Aplicarea spoturilor pe placa cromatografică

Placa cromatografică pregătita, s-a așezat pe o suprafață plană (linia de start la 2 cm de la marginea plăcii și linia până la care trebuie să migreze au fost marcate) ositiv solventului care se situează la 15 cm față de linia de start.

Reziduul rămas la evaporare conform punctului 1, s-a reluat cu solvent de spotulare din care s-a luat 10 μl cu o micropipeta și s-a aplicat pe placa cromatografică sub forma de spoturi rotunde cu diametrul de 5 mm.

Pe o placa cromatografică cu dimensiunile de 200×200 mm s-a aplicat maximum opt spoturi la o distanta de minim 1 cm față de marginile laterale.

Din soluțiile etalon de micotoxine care au concentrația de 1 mg/ml și din proba de evaluarea s-a aplicat cu o microseringa spoturi de 10 μl soluție pe placa cromatografică în cele poziții posibile astfel:

în poziția 1 se aplică 10 μl soluție de aflatoxina B1 (soluția etalon cu o valoare a concentrație de aflatoxine de 4050 ppt fig. 9);

în poziția 2 se aplică 10 μl soluție din prima probă de evaluarea;

în poziția 3 se aplică 10μl soluție din a doua probă de evaluarea;

în poziția 4 se aplică 10 μl soluție din a treia probă de evaluarea;

în poziția 5 se aplică 10 μl soluție din a patra probă de evaluarea;

Figura 9. Solutia etalon de aflatoxina

Developarea. În tancul de developare s-a introdus amestecul de solvenți de developare până la o înălțime de max 5 mm.

Partea interioară a tancului s-a căptușit cu hârtie de filtru care să îmbibe cu solvenții de developare pentru a asigura o atmosferă saturată cu vaporii developantului și pentru a evita evaporarea acestuia de pe placă în timpul developării.

După executarea acestor operații tancul s-a închis, s-a rasat 20…30 minute pentru saturarea atmosferei cu vapori.

După care s-a introdus placa cromatografică cu capătul pe care s-au aplicat spoturile în sistemul de solvenți de developare din tanc. S-a închis etanș cu capacul și s-a lăsat la developat până când frontul solventului a atins linia marcată (15 cm de linia de start).

S-a scos placa, și s-a uscat timp de câteva minute la temperatura camerei.

Figura 10. Operația de developare

Evidențierea micotoxinelor. Pe placă s-a examinat la lampa UV (fig. 11) și s-a încercuit zonele cu fluorescența asemănătoare cu a etaloanelor și s-a pulverizat cu soluție de derivatizare. După pulverizare, timp de 2..3 minute, placa s-a introdus în etuva la 60°C. Se examinează din nou placa la lumina ultravioleta și dacă fluorescența a suferit modificări similare celor din etaloane s-a confirmat prezența micotoxinei în proba studiată. Tipurile de micotoxine, raportul zonelor de fluorescența asemănătoare etaloanelor și culoarea fluorescenței în ultraviolete sunt în tabelul 7. Raportul zonelor de fluorescență asemănătoare cu ale etaloanelor (Rt) se calculează cu formula:

Rt = d1/d2

În care: d1- distanța dintre linia de start și centrul ariei fluorescențe a micotoxinei, mm; d2- distanta dintre linia de start și linia de migrat frontal solventul, în mm;

Figura 11. Lampa UV

Derivatizarea și confirmarea micotoxinelor. Pentru confirmarea unei micotoxine, se stabilește pe placa cromatografica arealul asemănătoare cu cea a etalonului micotoxinei respective și se pulverizează cu soluție de derivatizare.

Tabel 7

Caracteristici de evidențiare a micotoxinelor prin cromatografie în strat subțire

După pulverizare arealul și etalonul devin de culoare caracteristica micotoxinei.

După realizarea analizelor se întocmesc buletine de evaluarea în care trebuie sa se menționeze următoarele: datele necesare pentru evidențiarea lotului; rezultatele obținute; SR 9597/19:1993.

CONCLUZII

Micotoxinele, factori de risc majori pentru sănătatea omului și a animalelor sunt peste tot și oriunde.

Ele au fost puse în evidență în boabele de cereale (grâu, orez, orz, ovăz, porumb, secară) sorg, și de leguminoase (arahide, fasole, mazăre, soia), în toate produsele și subprodusele acestora (aluat, franzeluțe de mălai, pâine, prăjituri), în semințele de oleaginoase (bostan, floarea-soarelui, miez de nucă), în legume și fructe, proaspete / conservate (ardei, caise, citrice, gutui, mere, morcov, pere, pătrunjel, piersici, smochine, tomate, kiwi), în preparate (compot, dulceață, gem, peltea) și sucuri naturale, în bere, must, vin, cidru, în condimente (boia de ardei, curry, cimbru, oregano, piper verde, negru sau alb, parika), în plante medicinale (frunze de pătlagină, sunătoare).

Amploarea fenomenului de contaminare micotoxinică a vegetalelor la nivelul biosferei este atât de frecventă încât se poate afirma că micotoxinele sunt un poluant major, de vreme ce ele au fost evidențiate pe toate meridianele lumii, din ținuturile reci și umede ale Rusiei (Siberia) și până în arhipelagul Japoniei, în Australia sau Noua Zeelandă; din Regatul Unit al Marii Britanii până în zonele aride ale Africii de Sud.

Aceste informații sunt susținute de studii științifice, care din nefericire, nu are forța de a evidenția decât puțin, pentru că numai în câteva țări se aplică un program strategic preventiv de control micotoxicologic.

Bibliografie

Harper, Douglas. "myco". Online Etymology Dictionary.

Brown, D., S. P. McCormick, N. A. Alexander, R. H. Proctor, and A. E. Desjardins. 2001. A genetic and biochemical approach to study trichothecene diversity in Fusarium sporotrichioides and Fusarium graminearum. Fung. Genet. Biol. 32:121-133.

Richard JL (2007). "Some major mycotoxins and their mycotoxicoses—an overview". Int. J. Food Microbiol. 119 (1–2): 3–10.

De Vries, J. W., M. W. Trucksess, and L. S. Jackson (ed.). 2002. Mycotoxins and food safety. Kluwer Academic/Plenum Publications, New York, N.Y.

Robbins CA, Swenson LJ, Nealley ML, Gots RE, Kelman BJ (2000). "Health effects of mycotoxins in indoor air: a critical review". Appl Occup Environ Hyg 15 (10): 773–84.

Calderone, R. A., and R. L. Cihlar (ed.). 2002. Fungal pathogenesis: principles and clinical applications. Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.

Engelhart, S., A. Loock, D. Skutlarek, H. Sagunski, A. Lommel, H. Farber, and M. Exner. 2002. Occurrence of toxigenic Aspergillus versicolor isolates and sterigmatocystin in carpet dust from damp indoor environments. Appl. Environ. Microbiol. 68:3886-3890.

Keller NP, Turner G, Bennett JW (2005). "Fungal secondary metabolism – from biochemistry to genomics". Nat. Rev. Microbiol. 3 (12): 937–47.

Melina, Remy. "Sex-Change Chicken: Gertie the Hen Becomes Bertie the Cockerel". Live Science. Retrieved 12 July 2014.

Desjardins, A. E., and R. D. Plattner. 2000. Fumonisin B (1)-nonproducing strains of Fusarium verticillioides cause maize (Zea mays) ear infection and ear rot. J. Agric. Food Chem. 48:5773-5780.

Berger KJ, Guss DA (2005). "Mycotoxins revisited: Part I". J Emerg Med 28 (1): 53–62.

Berger KJ, Guss DA (2005). "Mycotoxins revisited: Part II". J Emerg Med 28 (2): 175–83.

Hagler, W. M., Jr., N. R. Towers, C. J. Mirocha, R. M. Eppley, and W. L. Bryden. 2001. Zearalenone: mycotoxin or mycoestrogen?, p. 321-331. In B. A. Summerell, J. F. Leslie, D. Backhouse, W. L. Bryden, and L. W. Burgess (ed.), Fusarium. Paul E. Nelson Memorial Symposium. APS Press, St. Paul, Minn.

Shephard GS (2008). "Determination of mycotoxins in human foods". Chem Soc Rev 37 (11): 2468–77.

Kendra DF, Dyer RB (2007). "Opportunities for biotechnology and policy regarding mycotoxin issues in international trade". Int. J. Food Microbiol. 119 (1–2): 147–51.

Henry, S. H., F. X. Bosch, and J. C. Bowers. 2002. Aflatoxin, hepatitis and worldwide liver cancer risks, p. 229-320. In J. W. DeVries, M. W. Trucksess, and L. S. Jackson (ed.), Mycotoxins and food safety. Kluwer Academic/Plenum Publications., New York, N.Y.

Martins ML, Martins HM, Bernardo F (2001). "Aflatoxins in spices marketed in Portugal". Food Addit Contam 18 (4): 315–9.

Yin YN, Yan LY, Jiang JH, Ma ZH (2008). "Biological control of aflatoxin contamination of crops". J Zhejiang Univ Sci B 9 (10): 787–92.

Hinkley, S. F., and B. B. Jarvis. 2001. Chromatographic method for Stachybotrys toxins, p. 173-194. In M. W. Trucksess, and A. E. Pohland (ed.), Mycotoxin protocols. Humana Press, Totowa, N.J.

Mateo R, Medina A, Mateo EM, Mateo F, Jiménez M (2007). "An overview of ochratoxin A in beer and wine". Int. J. Food Microbiol. 119 (1–2): 79–83.

Bennett, JW; Klich, M (Jul 2003). "Mycotoxins.". Clinical Microbiology Reviews 16 (3): 497–516. Retrieved 31 May 2013.

Newberne, P. M., and W. H. Butler. 1969. Acute and chronic effect of aflatoxin B1 on the liver of domestic and laboratory animals: a review. Cancer Res. 29:236-250.

Trucksess MW, Scott PM (2008). "Mycotoxins in botanicals and dried fruits: A review". Food Addit Contam. 25 (2): 181–92.

Jarvis, B. B. 2002. Chemistry and toxicology of molds isolated from water damaged buildings, p. 43-52. In J. W. deVries, M. W. Trucksess, and L. S. Jackson (ed.), Mycotoxins and food safety. Kluwer Academic/Plenum Publications, New York, N.Y.

Schaafsma AW, Hooker DC (2007). "Climatic models to predict occurrence of Fusarium toxins in wheat and maize". Int. J. Food Microbiol. 119 (1–2): 116–25.

Desjardins AE, Proctor RH (2007). "Molecular biology of Fusarium mycotoxins". Int. J. Food Microbiol. 119 (1–2): 47–50.

Jonsyn-Ellis, F. E. 2000. Seasonal variation in exposure frequency and concentration levels of aflatoxins and ochratoxins in urine samples of boys and girls. Mycopathologia 152:35-40.

Fog Nielsen, K (2003). "Mycotoxin production by indoor molds". Fungal genetics and biology: FG & B 39 (2): 103–17.

Pestka JJ, Yike I, Dearborn DG, Ward MD, Harkema JR (2008). "Stachybotrys chartarum, trichothecene mycotoxins, and damp building-related illness: new insights into a public health enigma". Toxicol. Sci. 104 (1): 4–26.

Klich, M. A., E. J. Mullaney, C. B. Daly, and J. W. Cary. 2000. Molecular and physiological aspects of aflatoxin and sterigmatocystin biosynthesis by A. tamarii and A. ochraceoroseus. Appl. Microbiol. Biotechnol. 53:605-609.

Li, F.-Q., T. Yoshizawa, S. Kawamura, S.-Y. Luo, and Y.-W. Li. 2001. Aflatoxins and fumonisins in corn from the high-incidence area for human hepatocellular carcinoma in Guangxi, China. J. Agric. Food Chem. 49:4122-4126.

Peltola, J., M. A. Andersson, T. Haahtela, M. Mussalo-Rauhamaa, F. A. Rainey, R. M. Kroppenstedt, R. A. Samson, and M. S. Salkinoja-Salonen. 2001. Toxic-metabolite-producing bacteria and fungus in an indoor environment. Appl. Environ. Microbiol. 67:3269-3274.

Boonen J, Malysheva S, Taevernier L, Diana Di Mavungu J, De saeger S, De Spiegeleer B (2012). Human skin penetration of selected model mycotoxins" Toxicology 301(1-3) 21-32.

Lewis L, Onsongo M, Njapau H et al. (2005). "Aflatoxin contamination of commercial maize products during an outbreak of acute aflatoxicosis in eastern and central Kenya". Environ. Health Perspect. 113 (12): 1763–7.

Manabe, M. 2001. Fermented foods and mycotoxins. Mycotoxins 51:25-28.

Marasas, W. F. O., J. D. Miller, R. T. Riley, and A. Visconti. 2001. Fumonisins—occurrence, toxicology, metabolism and risk assessment, p, 332-359. In B. A. Summerell, J. F. Leslie, D. Backhouse, W. L. Bryden, and L. W. Burgess (ed.), Fusarium. Paul E. Nelson Memorial Symposium. APS Press, St. Paul, Minn.

Miller, J. D., J. W. ApSimon, B. A. Blackwell, R. Greenhalgh, and A. Taylor. 2001. Deoxynivalenol: a 25 year perspective on a trichothecene of agricultural importance, p. 310-319. In B. A. Summerell, J. F. Leslie, D. Backhouse, W. L. Bryden, and L. W. Burgess (ed.), Fusarium, Paul E. Nelson Memorial Symposium. APS Press, St. Paul, Minn.

Bibliografie

Harper, Douglas. "myco". Online Etymology Dictionary.

Brown, D., S. P. McCormick, N. A. Alexander, R. H. Proctor, and A. E. Desjardins. 2001. A genetic and biochemical approach to study trichothecene diversity in Fusarium sporotrichioides and Fusarium graminearum. Fung. Genet. Biol. 32:121-133.

Richard JL (2007). "Some major mycotoxins and their mycotoxicoses—an overview". Int. J. Food Microbiol. 119 (1–2): 3–10.

De Vries, J. W., M. W. Trucksess, and L. S. Jackson (ed.). 2002. Mycotoxins and food safety. Kluwer Academic/Plenum Publications, New York, N.Y.

Robbins CA, Swenson LJ, Nealley ML, Gots RE, Kelman BJ (2000). "Health effects of mycotoxins in indoor air: a critical review". Appl Occup Environ Hyg 15 (10): 773–84.

Calderone, R. A., and R. L. Cihlar (ed.). 2002. Fungal pathogenesis: principles and clinical applications. Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.

Engelhart, S., A. Loock, D. Skutlarek, H. Sagunski, A. Lommel, H. Farber, and M. Exner. 2002. Occurrence of toxigenic Aspergillus versicolor isolates and sterigmatocystin in carpet dust from damp indoor environments. Appl. Environ. Microbiol. 68:3886-3890.

Keller NP, Turner G, Bennett JW (2005). "Fungal secondary metabolism – from biochemistry to genomics". Nat. Rev. Microbiol. 3 (12): 937–47.

Melina, Remy. "Sex-Change Chicken: Gertie the Hen Becomes Bertie the Cockerel". Live Science. Retrieved 12 July 2014.

Desjardins, A. E., and R. D. Plattner. 2000. Fumonisin B (1)-nonproducing strains of Fusarium verticillioides cause maize (Zea mays) ear infection and ear rot. J. Agric. Food Chem. 48:5773-5780.

Berger KJ, Guss DA (2005). "Mycotoxins revisited: Part I". J Emerg Med 28 (1): 53–62.

Berger KJ, Guss DA (2005). "Mycotoxins revisited: Part II". J Emerg Med 28 (2): 175–83.

Hagler, W. M., Jr., N. R. Towers, C. J. Mirocha, R. M. Eppley, and W. L. Bryden. 2001. Zearalenone: mycotoxin or mycoestrogen?, p. 321-331. In B. A. Summerell, J. F. Leslie, D. Backhouse, W. L. Bryden, and L. W. Burgess (ed.), Fusarium. Paul E. Nelson Memorial Symposium. APS Press, St. Paul, Minn.

Shephard GS (2008). "Determination of mycotoxins in human foods". Chem Soc Rev 37 (11): 2468–77.

Kendra DF, Dyer RB (2007). "Opportunities for biotechnology and policy regarding mycotoxin issues in international trade". Int. J. Food Microbiol. 119 (1–2): 147–51.

Henry, S. H., F. X. Bosch, and J. C. Bowers. 2002. Aflatoxin, hepatitis and worldwide liver cancer risks, p. 229-320. In J. W. DeVries, M. W. Trucksess, and L. S. Jackson (ed.), Mycotoxins and food safety. Kluwer Academic/Plenum Publications., New York, N.Y.

Martins ML, Martins HM, Bernardo F (2001). "Aflatoxins in spices marketed in Portugal". Food Addit Contam 18 (4): 315–9.

Yin YN, Yan LY, Jiang JH, Ma ZH (2008). "Biological control of aflatoxin contamination of crops". J Zhejiang Univ Sci B 9 (10): 787–92.

Hinkley, S. F., and B. B. Jarvis. 2001. Chromatographic method for Stachybotrys toxins, p. 173-194. In M. W. Trucksess, and A. E. Pohland (ed.), Mycotoxin protocols. Humana Press, Totowa, N.J.

Mateo R, Medina A, Mateo EM, Mateo F, Jiménez M (2007). "An overview of ochratoxin A in beer and wine". Int. J. Food Microbiol. 119 (1–2): 79–83.

Bennett, JW; Klich, M (Jul 2003). "Mycotoxins.". Clinical Microbiology Reviews 16 (3): 497–516. Retrieved 31 May 2013.

Newberne, P. M., and W. H. Butler. 1969. Acute and chronic effect of aflatoxin B1 on the liver of domestic and laboratory animals: a review. Cancer Res. 29:236-250.

Trucksess MW, Scott PM (2008). "Mycotoxins in botanicals and dried fruits: A review". Food Addit Contam. 25 (2): 181–92.

Jarvis, B. B. 2002. Chemistry and toxicology of molds isolated from water damaged buildings, p. 43-52. In J. W. deVries, M. W. Trucksess, and L. S. Jackson (ed.), Mycotoxins and food safety. Kluwer Academic/Plenum Publications, New York, N.Y.

Schaafsma AW, Hooker DC (2007). "Climatic models to predict occurrence of Fusarium toxins in wheat and maize". Int. J. Food Microbiol. 119 (1–2): 116–25.

Desjardins AE, Proctor RH (2007). "Molecular biology of Fusarium mycotoxins". Int. J. Food Microbiol. 119 (1–2): 47–50.

Jonsyn-Ellis, F. E. 2000. Seasonal variation in exposure frequency and concentration levels of aflatoxins and ochratoxins in urine samples of boys and girls. Mycopathologia 152:35-40.

Fog Nielsen, K (2003). "Mycotoxin production by indoor molds". Fungal genetics and biology: FG & B 39 (2): 103–17.

Pestka JJ, Yike I, Dearborn DG, Ward MD, Harkema JR (2008). "Stachybotrys chartarum, trichothecene mycotoxins, and damp building-related illness: new insights into a public health enigma". Toxicol. Sci. 104 (1): 4–26.

Klich, M. A., E. J. Mullaney, C. B. Daly, and J. W. Cary. 2000. Molecular and physiological aspects of aflatoxin and sterigmatocystin biosynthesis by A. tamarii and A. ochraceoroseus. Appl. Microbiol. Biotechnol. 53:605-609.

Li, F.-Q., T. Yoshizawa, S. Kawamura, S.-Y. Luo, and Y.-W. Li. 2001. Aflatoxins and fumonisins in corn from the high-incidence area for human hepatocellular carcinoma in Guangxi, China. J. Agric. Food Chem. 49:4122-4126.

Peltola, J., M. A. Andersson, T. Haahtela, M. Mussalo-Rauhamaa, F. A. Rainey, R. M. Kroppenstedt, R. A. Samson, and M. S. Salkinoja-Salonen. 2001. Toxic-metabolite-producing bacteria and fungus in an indoor environment. Appl. Environ. Microbiol. 67:3269-3274.

Boonen J, Malysheva S, Taevernier L, Diana Di Mavungu J, De saeger S, De Spiegeleer B (2012). Human skin penetration of selected model mycotoxins" Toxicology 301(1-3) 21-32.

Lewis L, Onsongo M, Njapau H et al. (2005). "Aflatoxin contamination of commercial maize products during an outbreak of acute aflatoxicosis in eastern and central Kenya". Environ. Health Perspect. 113 (12): 1763–7.

Manabe, M. 2001. Fermented foods and mycotoxins. Mycotoxins 51:25-28.

Marasas, W. F. O., J. D. Miller, R. T. Riley, and A. Visconti. 2001. Fumonisins—occurrence, toxicology, metabolism and risk assessment, p, 332-359. In B. A. Summerell, J. F. Leslie, D. Backhouse, W. L. Bryden, and L. W. Burgess (ed.), Fusarium. Paul E. Nelson Memorial Symposium. APS Press, St. Paul, Minn.

Miller, J. D., J. W. ApSimon, B. A. Blackwell, R. Greenhalgh, and A. Taylor. 2001. Deoxynivalenol: a 25 year perspective on a trichothecene of agricultural importance, p. 310-319. In B. A. Summerell, J. F. Leslie, D. Backhouse, W. L. Bryden, and L. W. Burgess (ed.), Fusarium, Paul E. Nelson Memorial Symposium. APS Press, St. Paul, Minn.