Teza Chiselita Natalia (2) [604830]

MINISTERUL EDUCA ȚIEI, CULTURII ȘI CERCETĂRII AL
REPUBLICII MOLDOVA
INSTITUTUL DE MICROBIOLOGIE ȘI BIOTEHNOLOGIE

Cu titlu de manuscris
C.Z.U: 663.12:579.6 (043.2)

CHISELIȚA NATALIA

TEHNOLOGIE DE OBȚINERE A β-GLUCANILOR
DIN LEVURI

167.01 – BIOTEHNOLOGIE, BIONANOTEHNOLOGIE

Teză de doctor în științe biologice

Conducător științific:

USATÎI Agafia , doctor habilitat
în științe biologice, profesor
cercet ător, specialitatea 167.01 –
Biotehnologie, bionanotehnologie

Autor : CHISELI ȚA Natalia

CHIȘINĂU, 201 8

2

© Chiselița Natalia, 201 8

3 CUPRINS
ADNOTĂRI……………………………………………………………… ……..…………… 6
LISTA ABREVIERILOR…………………………………………… …..…………………. 9
INTRODUCERE…………………………………………………………………… …..…… 10
1. LEVURILE – SURSE VALOROASE DE β-GLUCANI…………… …………… 17
1.1. Oportunitatea studierii β -glucanilor…………………… ……………………………….. 17
1.2. Structura, compoziția chimică și mecanismul de biosinteză a β-glucanilor…… ….… 20
1.3. Modelarea biosintezei β -glucanilor prin varierea factorilor de cultivare…… …… ….. 25
1.4. Concluzii la capitolul 1…………………………………………… ….………………. 42
2. BIOSINTEZ A β-GLUCANILOR LA TULPINA SACCHAROMYCES
CEREVISIAE CNMN -Y-20 ÎN FUNCȚIE DE NECESITĂȚILE NUTRITIVE
ȘI CONDIȚIILE DE CULTIV ARE…… ….………………………………………

44
2.1. Materiale și metode de cercetare…… ………………………………………………… 44
2.1.1. Obiect ul de studiu……………………………… ….……… .………………………… 44
2.1.2. Metode de investigație……………………………………… ….…………………….. 45
2.2. Eficientizarea metodei de extracție a β-glucanilor ……………… ………………………………. 47
2.3. Influența surselor de carbon, azot asupra biosintezei β-glucanilor și elaborarea
mediului de cultivare a tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20… ………… ……………
51
2.4. Influența temperaturii, aerației și duratei de cultivare asupra biosintezei β-
glucanilor la tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20……………………. ………………….
60
2.5. Procedeu de sporire a conținutului de β -glucani la tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-
20 cu aplicarea mediului nutri tiv și condițiilor de cultivare optimizate…… ….……
65
2.6. Concluzii la capitolul 2……………………………… .……………………………. .. 68
3. POTENȚIALUL BIOTEHNOLOGIC A LEVURII SACCHAROMYCES
CEREVISIAE CNMN -Y-20 SUB INFLUENȚA NANOPARTICULELOR
OXIZILOR METALICI ……………………… …………………………………..

69
3.1. Materiale și metode de cercetare…………………………………………………….. 70
3.2. Efectele nanoparticulelor dioxidului de titan asupra bi osintezei β -glucanilor și altor
constituiente celulare a levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20………………………….
72
3.3.

Efectele nanoparticulelor oxidului de zinc asupra bi osintezei β -glucanilor și altor
constituiente celulare a le levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20, în funcție de
dimensiuni…………………………………………………………………………………… ……………..

75

4 3.4. Efectele nanoparticulelor oxidului de zinc asupra biosintezei β -glucanilor și altor
constituiente celulare a levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20, în funcție de
concentrație…………………………………………………………………………………. ……………..

79
3.5. Efectele nanoparticulelor oxidului de zinc în combinație cu alcoolul etilic asupra
biosintezei β -glucanilor și altor constituiente celulare a levurii S. cerevisiae
CNMN -Y-20…… ………………………………………………………………………………………….

82
3.6. Procedeu de cultivare a levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20 cu utilizarea
nanoparticulelor oxidului de zinc ………. …………………………………………………………..
90
3.7. Concluzii la capitolul 3…………………………… …………………………………. 91
4. ELABORAREA TEHNOLOGI EI DE CULTIVARE A TULPINII
SACCHAROMYCES CEREVISIAE CNMN -Y-20 ȘI DE OBȚINERE A β-
GLUCANILOR …………………………………………………………………………………………….

92
4.1. Materiale și metode de cercetare…………………………………………………… 92
4.2. Acțiunea undelor milimetrice cu frecvență extra înaltă asupra procesului de
biosinteză a β-glucanilor ………………………………………………………… …
93
4.2.1. Efectele undelor milimetrice asupra biosintezei β-glucanilor și altor constituiente
celulare a levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20, în funcție de spectrul de
frecvență……………………………………………………………………. …………………………..

93
4.2.2. Efectele undelor milimetrice cu frecvența 53,33 GHz asupra biosintezei β-
glucanilor și altor constituiente celulare a levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20, în
funcție de durata de iradiere……………………………….. …………………………………………

102
4.2.3. Procede u de sporire a conținutului de β-glucani la tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-
20 cu utilizarea undelor milimetrice cu frecvență extra înaltă… ……………. ……………..
109
4.3. Tehnologia de cultivare a tulpinii Saccharomyces cerevisiae CNMN -Y-20 și de
obținere a β-glucanilor ……………………………………………………………………………. ……
110
4.3.1. Proces tehnologic de cultivare a levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20 și de obținere a
β-glucanilor …………………… …………………………………………….. ………..
111
4.3.2. Evaluarea eficienței tehnologiei elaborate ………………………………………………………. 117
4.3.3. Valorificarea bioprodusului Glucan -20, obținut din levura S. cerevisiae CNMN -Y-
20………………………. ………………………………………………………. ……………………………….
120
4.4. Concluzii la capitolul 4………………………………………………………………………………… 122
CONCLUZII GENERALE ȘI RECOMANDĂRI ………………………………………. 123

5 BIBLIOGRAFIE …………………………………………………………………………… 125
ANEXE ……………………………………………………………………………………… 142
Anexa 1. Brevete de invenție MD 4048, MD 4329, MD 717 ………………………………. 143
Anexa 2. Act de implementare a tulpinii de levuri S. cerevisiae CNMN -Y-20………. 146
Anexa 3. Acte de implementare bioprodusului Glucan -20………………………………….. 147
Anexa 4. Mențiuni la Saloane de Invenții și Expoziții Internaționale …………………… 150
DECLARAȚIA PRIVIND ASUMAREA RĂ SPUNDERII ………………………………………… 156
CV-ul AUTORULUI ……………………………………………………………………………………………….. 157

6 ADNOTARE
Chiseli ța Natalia „Tehnologie de obținere a β-glucanilor din levuri ”. Teză de doctor în
științe biologice , Chișinău, 201 8.
Teza conține introducere, patru capitole, concluzii și recomandări, bibliografie cu 281
titluri, 4 anexe, 124 pagini text de bază, 68 figuri, 11 tabele. Rezultatele obținute sunt publicate
în 36 lucrări științifice .
Cuvintele cheie: Tehnologie de cultivare, levuri, Saccharomyces cerevisiae, β-glucani,
carbohidrați, proteine, nanoparticule, unde milimetrice cu frecvență extra înaltă.
Domeniul de studiu: 167.01 – biotehnologie, bionanotehnologie.
Scopul lucrării constă î n elaborarea tehnologiei inovative eficiente de obținere a β-
glucanilor din levuri.
Obiectivele lucrării: Selectarea nutrienților și condițiilor optime de cultivare submersă a
tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20 în vederea ameliorării biosintezei β-glucanilor; Elucidarea
acțiunii nanoparticulelor oxizilor de metale asupra biosintezei β-glucanilor și altor constituiente
celulare a levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20; Evaluarea efectelor undelor milimetrice cu
frecven ță extra înaltă asupra biosintezei β-glucanilor și altor constituiente celulare a levurii S.
cerevisiae CNMN -Y-20; Elaborarea tehnologiei de obținere a β-glucanilor din biomasa
levuriană.
Noutatea și originalitatea științifică. În premieră se propune o tehnologie inovativă de
cultivare a levurii S. cerevisiae și de obținere a β-glucanilor, bazată pe procedee avantajoase de
sinteză orientată, care contribuie la ameliorarea calității și sinecostului produsului final. Au fost
selecta ți nutrienții preferențiali și elaborat e două medii de cult ură pentru tulpina S. cerevisiae
CNMN -Y-20, au fost stabili te condițiile speciale de cultivare pentru sporirea biosintezei β-
glucanilor. În premieră s -a demonstrat că nanoparticule TiO 2 și ZnO, utilizate la cultivarea
levurii, influențează procesul de biosinteză a β-glucanilor și altor constituiente celulare, efectul
exprimându -se în funcție de dimensiunile și concentrațiile nanoparticulelor. În premieră a fost
elucidat caracterul acțiun ii undelor milimetrice cu frecven ță extra înaltă asupra biosintezei β-
glucanilor și altor componente celulare în dependență de spectrul de frecvență și durata de
iradie re. Pentru prima dată au fost elaborate 2 procedee noi de sporire a conținutului de β-glucani
la tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20, dintre care unul a fost brevetat.
Problema științifică importantă soluționată în lucrare . Au fost determina ți parametrii
biotehnologici optimali de cultivare a levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20, ceea ce a contribuit la
eficienti zarea procedeelor de sintez ă orientată a β-glucanilor, fapt ce a permis elaborarea
tehnologiei de obținere a acestor compuși biologic activi valoro și.
Semnificația teoretică. Este fundamentată științific și demonstrată posibilitatea dirijării
proceselor biosintetice și sporirii potențialului de produce re a β-glucani lor la cultivarea levurii S.
cerevisiae CNMN -Y-20 prin tehnologia cu utilizarea nutrienților preferențiali, condițiilor
speciale de cultivare, a nanoparticulelor și undelor milimetrice cu frecven ță extra înaltă în
calitate de stimula tori.
Valoarea aplicativă . Se propun spre valorificare : tulpina de levuri S. cerevisiae CNMN –
Y-20, brevetată ca sursă de β-glucani; două variante de medii nutritive și două pr ocedee de
sinteză orientată cu aplicarea nanoparticulelor oxizilor de metale și undelor milimetrice cu
frecven ță extra înaltă ca factori reglat ori, care asigură sporirea semni ficativă a cantității de β-
glucani în biomasa levuriană; metoda de extragere a β-glucanilor, caracterul inovațional al căreia
permite de a reduce etapele suplimentare de distrugere a peretelui celular și extragere a β-
glucanilor; bioprodusul „Glucan -20” cu activitate fiziologică înaltă.
Implementarea rezultatelor științifice. Tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20 a fost
depozitată în CNMN a IMB și utilizată în cercetări știin țifice. Preparatul „Glucan -20” a fost
utilizat în furajul pentru puietul și larvele de pești (Acte de implementare: Nr. 1 din 17.07.2014,
Nr. 3 din 17.07.2015, Nr. 4 din 10.10.2016 , Nr. 85a din 04.09.2017 )

7 AННОТАЦИЯ
Киселица Наталья „Технология получения β -глюканов из дрожжей ”.
Диссерт ация кандидата биологических наук, Кишинѐв, 201 8.
Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и рекомендаций,
библиографии из 281 наименований , 4 приложений, 124 страниц основного текста, 68
рисунков , 11 таблиц . Результаты исследований опубликованы в 36 работах .
Ключевые слова: Технология к ультивирования, дрожжи, Saccharomyces cerevisiae ,
β-глюканы, углеводы, белки, наночастицы, миллиметровые волны .
Область исследования: 167.01 – Биотехнология , бионано технология .
Цель работы: разработка эффективной инновационной технологии получения β -глюканов из
дрожжей .
Задачи работы : отбор питательных веществ и оптимальных условий для глубинного
культивирования штамма S. cerevisiae CNMN -Y-20 с целью улучшения биосинтеза β –
глюканов ; выявление действия наночастиц оксидов металлов на биосинтез β -глюканов и
других клеточных компонентов штамма S. cerevisiae CNMN -Y-20; определение эффекта
высокочастотных миллиметровых волн на биосинтез β -глюканов и других клеточных
компонентов штамма S. cerevisiae CNMN -Y-20; разработк а технологии получения β -глюканов
из биомассы дрожжей .
Научная новизна и оригинальность. Впервые предла гается инновационная технология
культивирования дрожжей S. cerevisiae для получения β-глюканов , основ аннaя на способах
направленного синтеза, ведущих к улучшению качества конечного продукта и уменьшению его
себестоимости . Отобраны источники питания и оптимальные условия культивирования ,
оптимизирова ны две питате льные среды с целью увеличения биосинтеза β -глюкан ов штамм ом
S. cerevisiae CNMN -Y-20. Впервые показано , что наночастицы TiO 2 и ZnO, используемые в
культивировании дрожжей, влияют на процесс биосинтеза β -глюканов и других клеточных
компонентов, эффект которых зависит от их размера и концентрации . Впервые выя влен
характер действия высокочастотных миллиметровых волн на биосинтез β -глюканов и других
клеточных компонентов в зависимости от спектра и времени их действия . Впервые были
разработаны два новых способа культивирования способствующих увеличению содержания β –
глюканов в биомассе S. cerevisiae CNMN -Y-20, од ин из которых запатентован .
Научная задача, решенная в данной работе . Были определе ны оптимальны е
биотехнологически е параметр ы культивирования дрожжей S. cerevisiae CNMN -Y-20, что
способствовало оптимизированию способов направленного синтеза β -глюканов и позволило
разработать технологию получения этих веществ .
Теоретическое значение. Научно обоснована и доказ ана возможность управления
биосинтетическими процессами в дрожжах S. cerevisiae CNMN -Y-20, а также улучшения
потенциала синтеза β-глюканов путем использования отобранных источников питания ,
оптимальных условий для культивирования , наночастиц и высокочастотных миллиметровых
волн в качестве стимулято ров.
Практическое значение : Предлага ются: штамм дрожжей S. cerevisiae CNMN -Y-20,
запатентованный как источник β -глюканов ; две питательные среды и два способа направленного
синтеза с использованием наночастиц оксидов металлов и высокочастотных миллиметровых
волн как регулирующих факторов, ведущих к увеличени ю содержания β-глюканов в
биомассе дрожжей ; метод экстракции β-глюканов , котор ый позволяет сократ ить этапы
разрушения клеточной стенки и экстракции β -глюканов; биопрепарат „Глюкан -20” с
высокой физиологической активностью.
Внедрение результатов. Штамм S. cerevisiae CNMN -Y-20 был деп онирован в
НКНМ и использован в научных исследованиях. Препарат „Глюкан -20” был использова н
в кормах для малька и личинок рыб (Акты о внедрении : №1 от 17.07.14, №3 от 17.07.15,
№4 от 10.10.16, №85а от 04.09.17 )

8 ANNOTATION
Chiselita Natalia „Technology for obtaining of β -glucans from yeasts”. PhD thesis in biological
sciences, Chisinau, 201 8.
The thesis consists of an introduction, four chapters, conclusions and recommendations, bibliography
list with 281 references, 124 pages of the main content, 68 figures, 11 tables and 4 anexes. The obtained
results were published in 36 scientific papers.
Keyword s: Cultivation technology, yeasts , Saccharomyces cerevisiae , β-glucans,
carbohydrates, proteins, nanoparticles, extra -high frequency millimeter waves.
Field of study: 167.01 – biotechnology, bionanotechnology.
Research goal: to develop an efficient innovative technology for β -glucan obtaining from
yeasts .
Objectives: Selection of preferred nutrients and optimum conditions for submerged cultivation of S.
cerevisiae CNMN -Y-20 strain to improve the biosynthesis of β -glucans; Elucidation of the action of the
metal oxides nanoparticles on the biosynthesis of β -glucans and other cellular constituents of S. cerevisiae
CNMN -Y-20 yeast; Evaluation of the extra -high frequenc y millimeter wave effects on the biosynthesis of
β-glucans and other cellular constituents of S. cerevisiae CNMN -Y-20 yeast; Elaboration of technology of
obtaining β-glucans from the yeasts biomass.
Scientific novelty of reasearch. For the first time, an i nnovative technology is proposed
for S. cerevisiae yeast cultivation and β -glucan production, based on advantageous directed
synthesis procedures, which contribute to improving the quality and reducing the cost of the final
product. Preferential nutrients and two culture media for S. cerevisiae strain CNMN -Y-20 were
selected, and specific culture conditions for enhancing β-glucan biosynthesis were established.
For the first time, it has been demonstrated that TiO 2 and ZnO nanoparticles used in yeast
cultivation influence the biosynthesis process of β-glucans and other cellular constituents, the
effect being dependent upon nanoparticle size and concentration. For the first time, the character
of extra -high frequency millimeter wave action on the biosynthesis of β -glucans and other
cellular components, depending on the frequency spectrum and the duration of irradiation, has
been elucidated. For the first time, 2 new procedures for increasing β -glucan content in S.
cerevisiae CNMN -Y-20 strain were elaborated, one of which was patented.
Important scientific problem, solved in the scientific work . The optimal
biotechnological parameters of S. cerevisiae CNMN -Y-20 yeast cultivation were determined ,
which has contributed to the efficiency of the targeted synthesis of β-glucans, which enabled the
elaboration of the technology for their obtaining.
Theoretical value. It is scientifically justified and demonstrated the possibility to direct
the biosynth etic processes and to increase the β -glucan production potential diring S. cerevisiae
CNMN -Y-20 yeast cultivation by the use of preferential nutrients, special cultivation conditions,
nanoparticles and extra -high frequency milimeter waves as stimulators.
Practical value. There are proposed for valorisation: S. cerevisiae CNMN -Y-20 yeast
strain, patented as a source of β -glucans; two variants of nutrient media and two directed
synthesis processes with application of metal oxides nanoparticles and extra -high frequency
milimeter waves as regulating factors, which ensure a significant increase of the β -glucans
amount in the yeast biomass; the method of β -glucan extraction, the innovative character of
which allows to reduce additional steps of cell wall destructi on and β -glucans extraction; the
bioproduct „Glucan -20” with high physiological activity.
Implementation of scientific results. The S. cerevisiae CNMN -Y-20 strain was dep osited
in the CNMN of IMB and used in scientific research. The polysaccharide bioproduct "Glucan –
20" has been used in diets of fish larvae and juveniles. (Implementation Acts: Nr. 1 from
17.07.2014, Nr. 3 from 17.07.2015, Nr. 4 from 10.10.2016, Nr. 85a from 04.09.2017).

9 LISTA ABREVIERILOR
AP actinoplaști
BIG1 Bad In Glucose protein
B.U. biomasă uscată
CNMN Colecția Națională de Microorganisme Nepatogene
CNMN -Y Colecția Națională de Microorganisme Nepatogene – Yeasts
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
FKS1 FK506 Sensitivity – 1,3-β-glucan synthase component
FLI finger -like invagination
FT-IR Fourier Transform Infrared spectroscopy
FT-Raman Fourier Transform Raman spectroscopy
GPI Glycosylphosphatidylinositol
KNH1 Kre9(Nine) Homolog
KRE5 Killer toxin -Resistan ce protein 5
KRE6 Killer toxin -Resistan ce protein 6
KRE9 Killer toxin -Resistan ce protein 9
MAP kinase Mitogen -Activated Protein kinase
NP nanoparticule
PVP Poli(N -vinilpirolidonă)
RHO1 Ras HOmolog1
ROT1 Reversal Of Tor2 lethality
R-ZZ Rieder + zaharoză + zinc
SDS Sodium Dodecyl Sulfate
S.U. substanță uscată
SKN1 Suppressor of Kre Null β-glucan
UMM
unde milimetric e
YPD Yeast Extract Peptone Dextrose medium

10 INTRODUCERE
Actualitatea și importanța cercetărilor. Importanța β-glucanilor pentru medicină,
farmaceutică, industria alimentară și alte domenii ale economiei condiționează dezvoltarea
rapidă a industriei de producer e a acestor polizaharide complexe constitui te din unități de D –
glucopiranoză conjugate în poziții le β-(1-6) și β-(1-3) [234]. Levuril e genului Saccharomyces se
numără printre producători per formanți de β-glucani cu proprietăți imunologice deosebite [ 133].
Intere sul înalt față de 1,3 – și 1,6 -ß-glucani este condiționat și de activitatea antibacteriană,
antivirală, anticanc erigenă, antioxidantă, antimutagenă, hipocolesterolem ică, detoxifiantă , etc.
[146, 228, 273].
Pentru dezvoltarea biotehnologiilor moderne de obținere a β -glucanilor este evidentă
oportunitatea selectării tulpinilor cu calități performante utilizate în producerea industrială.
Producția de β-glucani depinde în mod semnificativ de conținutul lor în pe retele celular al
levurii. În general, schimbările în starea fiziologică a celulei și reacția sa la influența factorilor
externi sunt legate de structura peretelui celu lar. Arhitectura peretelui celular și mecanismele
responsabile de sinteza componentel or acestuia pot fi controlate prin compoziția mediului de
cultură și condițiile de cultivare [ 155]. O problemă științifică importantă ține de elaborarea unor
formule noi a le mediilor de fermentație și evidențierea condițiilor optime de cultivare în
profunzime a tulpinilor de levuri selectate. Conform unor autori, temperatura de cultivare, pH -ul,
aerația mediului și durata procesului de cultivare, determină activitatea fiziologică a culturilor și
acționează asupra proprietăților și compoziției biochimice a micr oorganismelor [ 228, 233].
De asemenea , actuale și importante sunt cercetările destinate studiului influenței asupra
levurilor a nanoparticulelor oxizilor de metale și undelor milimetrice cu frecvență extra înaltă.
Mecanisme le posibile de influență a nanoparticulelor la nivel celular au fost cercetate parțial de
către specialiști în domeniu [110, 178]. Importante sunt rezultatele investigațiilor acțiunii undelor
milimetrice asupra dezvoltării și proliferării celulelor, activității enzimelor și altor sisteme
biologice. În zona de interes intră și modelarea teoretică a mecanisme lor posibile de interacțiune
a undelor milimetrice cu obiectele biologice, inclusiv microorganismele [172].
Situația în domeniul de cercetare . Cererea de substanțe naturale biologic active de
origine polizaharidică cu efect sanogen a dat un impuls simțitor cercetărilor orientate spre
identificarea noilor surse, precum și a procedeelor și tehnologiilor de obținere a preparatelor
sigure pentru utilizare [ 106]. În ultimii ani în calitate de a stfel de surse su nt studiate
microorganismele, în speci al levuril e, capabile să sintetizeze un complex de substanțe bioactive ,
inclusiv β-glucan i, care au un rol impunător în activitatea vitală a organismelor vii [ 253] și
obținerea cărora din punct de vedere economic este avantajoasă. Luând în considerație că

11 biomasa de Saccharomyces cerevisiae este lipsită de efecte toxice asupra organismelor vii, fiind
utilizată în hrana omului peste 2000 mii ani și posibilitatea reglării productivității și activității
biosintetice a levurilor prin optimizarea condițiilor de cultivare , mediilor nutritive și utilizarea
diferitor factori chimici și fizici [ 74, 184], considerăm oportune cercetările orientate spre
elaborarea tehnologiilor de cultivare a acestui obiect biotehnologic și obținere a β-glucanilor .
Reieșind din cele expuse, o soluție inovativă pentru obținerea β-glucanilor din levuri poate
fi identificarea noilor procedee de reglare a biosintezei lor, rezultate care vor servi ca bază la
elaborarea tehnologiilor microbiene pentru producerea preparatelor cu utilizări polivalente.
Scopul lucrării constă în elaborarea tehnologiei inovative eficiente de obținere a β-
glucanilor din levuri.
Pentru realizarea scopului au fost trasate următoarele obiective:
Selectarea nutrienților și condițiilor optime de cultivare submersă a tulpinii S.
cerevisiae CNMN -Y-20 în ved erea ameliorării biosintezei β -glucanilor;
Elucidarea acțiunii nanoparticulelor oxizilor de metale asupra biosintezei β –
glucanilor și altor constituiente celulare a levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20;
Evaluarea efectelor un delor milimetrice cu frecvență extra înaltă asupra
biosintezei β -glucanilor și altor constituiente celulare a levurii S. cerevisiae CNMN -Y-
20;
Elaborar ea tehnologiei de obținere a β -glucanilor din biomasa levuriană.
Noutatea și originalitatea științifică. În premieră se propune o tehno logie inovativă de
cultivare a levurii S. cerevisiae și de obținere a β-glucanilor, bazată pe procedee avantajoase de
sinteză orientată, care contribuie la ameliorarea calității și sinecostului produsului final. Au fost
selecta ți nutrienții preferențiali și elaborat e două medii de cultură pentru tulpina S. cerevisiae
CNMN -Y-20, au fost stabili te condițiile speciale de cultivare pentru sporirea biosintezei β-
glucanilor. În premieră s -a demonstrat că nanoparticule TiO 2 și ZnO, utilizate la cultivarea
levurii, influențează procesul de biosinteză a β-glucanilor și altor constituiente celulare, efectul
exprimându -se în funcție de dimensiunile și concentrațiile nanoparticulelor. În premieră a fost
elucidat caracterul acțiun ii undelor milimetrice cu frecven ță extra înaltă asupra biosintezei β-
glucanilor și altor componente celulare în dependență de spectrul de frecvență și durata de
iradie re. Pentru prima dată au fost elaborate 2 procedee noi de sporire a conținutului de β-glucani
la tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20, dintre care unul a fost brevetat.
Problema științifică importantă soluționată în lucrare . Au fost determina ți parametrii
biotehnologici optimali de cultivare a levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20, ceea ce a contribuit la

12 eficienti zarea procedeelor de sintez ă orientată a β-glucanilor, fapt ce a permis elaborarea
tehnologiei de obținere a acestor compuși biologic activi valoroși .
Semnificația teoretică. Este fundamentată științific și demonstrată posibilitatea dirijării
proceselor biosintetice și sporirii potențialului de produce re a β-glucani lor la cultivarea levurii S.
cerevisiae CNMN -Y-20 prin tehnologia cu utilizarea nutrienților preferențiali, condițiilor
speciale de cultivare, a nanopart iculelor și undelor milimetrice în calitate de stimula tori.
Valoarea aplicativă . Se propun spre valorificare : tulpina de levuri S. cerevisiae CNMN –
Y-20, brevetată ca sursă de β-glucani; două variante de medii nutritive și două pr ocedee de
sinteză orientată cu aplicarea nanoparticulelor oxizilor de metale și undelor milimetrice cu
frecven ță extra înaltă ca factori reglat ori, care asigură sporirea semni ficativă a cantității de β-
glucani în biomasa levuriană; meto da de extragere a β-glucanilor, caracterul inovațional al căreia
permite de a reduce etapele suplimentare de distrugere a peretelui celular și extragere a β-
glucanilor; bioprodusul „Glucan -20” cu activitate fiziologică înaltă.
Aprobarea rezultatelor științ ifice. Materia lele expuse în teza de doctor au fost
comunicate și discutate la: Всероссийский симпозиум с международным участием
„Современные проблемы физиологии , экологии и биотехнологии микроорганизмов ”,
Москва , 2014; Conferința științifică național ă cu participare internațională „Integrare prin
cercetare și inovare” , Chișinău, 2014; Conferința Științifică Internațională a Doctoranzilor
„Tendințe contemporane ale dezvoltării științei: viziuni ale tinerilor cercetători”, Chișinău, 2015,
2016, 2017; Conferința Științifică Internațională “Științele vieții în dialogul
generațiilor: conexiuni dintre mediul acade mic, universitar și de afaceri" , Chișinău, 2016;
Международная научная конференция молодых ученых , аспирантов и студентов
„Научные достижения молодежи – решению проблем питания человечества в XXI веке”,
Киев , Украина , 2016; International Conference „NANO -2016 Ethical, Ecological and Social
Problems of Nanoscience and Nanotechnologies”, Chișinău, 2016; International Scientific
Conference on Microbial Biotechnology 2nd and 3rd edition s, Chișinău, 2014, 2016; 40th
international invention show , 11th inven tion and prototype show and student business plan
competition Karlovac, Croatia, 2015; Salonul internațional al cercetării, inovării și inventicii
„PROINVENT”, Cluj -Napoca, România, 2016; European Exhibition of Creativity and
Innovation „EUROINVENT”, Iasi, Romania, 2015, 2016, 2017.
Publica țiile la tema tezei . La tema tezei au fost publicate 36 lucrări științifice: 15 articole
în reviste recenzate (3 – în reviste interna ționale ; 2 – în monoautorat ), 12 teze la conferin țe
interna ționale și naționale (6 – în monoautorat ), 3 brevete de inven ție, 6 materiale la saloane de
invenții .

13 Volumul și structura tezei . Teza const ă din patru capitole , are un volum de bază de 124
pagini, conține 11 tabele și 68 figur i. Lista surselor bibliografice citate include 281 titluri.
Cuvintele cheie : Tehnologie de cultivare , levuri , Saccharomyces cerevisiae , β-glucani ,
carbohidra ți, proteine , nanoparticule , unde milimetrice cu frecven ță extra înaltă.
Sumarul compartimentelor tezei . Teza const ă din 4 capitole , primul dintre care prezint ă
analiza situa ției din domeniu , iar următoarele trei reflect ă contribu țiile metodice și rezultatele
propriilor cercet ări.

1. LEVURILE – SURSE VALOROASE DE β-GLUCANI prezintă o analiză amplă și
minu țioasă a publica țiilor științifice de ultim ă oră la tema de cercetare . În capitol este
argumentat ă oportunitatea studierii β-glucanilor levurieni , care se bazeaz ă pe activitatea
biologic ă valoroas ă a acestor polizaharide și poten țialul lor înalt de utilizare în medicin ă,
farmaceutic ă, cosmetologie , acvacultur ă, zootehnie și industria alimentar ă și pe inofensivitatea și
nontoxicitatea lor.
Capitolul include o caracteristică amplă a structuri i și componenței peretelui celular la S.
cerevisiae , inclusiv a componentei sale de bază – β-glucani . Este elucidat mecanismul de
biosintez ă a β-glucanilor și eviden țiate principalele enzime și gene responsabile de biogeneza
diferitor modific ări ale acestora .
O atenție deosebit ă se atrage posibilit ății model ării biosintezei β-glucanilor levurieni prin
varierea surselor nutritive și optimizarea condi țiilor de cultivare . Este analizată influ ența
nanoparticulelor de diferit ă natur ă și a undelor milimetrice cu frecven ță extra înaltă asupra
diferitor organisme vii și posibilitatea utiliz ării acestor factori în calitate de stimulatori ai sintezei
β-glucanilor la levuri .
Sunt reflectate diverse metode de extrac ție și purificare a β-glucanilor , care permit
obținerea din biomasa levurian ă a preparatelor β-glucanice de calitate și cu activitate înaltă.
Prin analiz ă ampl ă a literaturii de specialitate se ajunge la concluzia că levurile S.
cerevisiae sunt o sursă biotehnologic ă importantă pentru obținerea preparatelor β-glucanice
biologic active , atât datorit ă componen ței biomasei , cerin țelor nutritive minime , cât și
posibilit ății dirijă rii proceselor biosintetice prin varierea diferitor factori de cultivare . În final este
formulat ă problema de cercetare și direc țiile de rezolvare a acestee a, sunt definite scopul și
obiectivele cercet ării.

2. BIOSINTEZA β-GLUCANILOR LA TULPINA SACCHAROMYCES
CEREVISIAE CNMN -Y-20 Î N FUNC ȚIE DE NECESIT ĂȚILE NUTRITIVE ȘI

14 CONDI ȚIILE DE CULTIVARE este dedicat cercet ărilor ce țin de eficientizarea metodei de
extragere a β-glucanilor , evaluarea capacit ăților de acumulare a biomasei și biosintez ă a β-
glucanilor la tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20, î n funcție de necesit ățile nutritive și condi țiile
de cultivare .
Studiul comparativ a metodelor de dezagreg are a celulelor a demons trat, că cea mai
eficientă metodă este omogenizare a cu durata de tratare a biomasei 10 minute . Aplicarea acestui
procedeu de preparare a pereților celulari în combinație cu tratarea alcalin -acidă sporește cu
34,5% conținutul de β-glucani extrași din pereții celulari levurieni și reduce durata de extragere
cu 24 ore comparativ cu procedeul martor.
Au fost studiate sursele optimal e de carbon și azot, care asigură obținerea cantităților
maxime de β-glucani .
În baza rezultatelor obținute , utiliz ând metoda planific ării matematice a experien țelor, a fost
elabora t mediul nutritiv , numit conven țional R-ZZ [13], pentru cultivarea tulpinii S. cerevisiae
CNMN -Y-20, care permite de a obține cu 31,8% mai mulți β-glucani comparativ cu martor ul.
În cazul cultivării tulpinii pe mediul YPD modificat – YPD -4, suplimentat cu acetatul de
zinc, cantitatea de β-glucani este inferioară martorului cu 5,8 -11,4% . În consecintă, pentru
cercetările ulterioare a fost utilizat mediul YPD -4.
Cercet ările destinate evalu ării influen ței condi țiilor de cultivare asupra sintezei β-glucanilor
la tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20 au stabili t că temperatura de 25°C, concentra ția O2 în
mediul de cultur ă – 81,3…83,3 mgL-1 și durata de 120 ore sunt optime pentru cultivarea tulpinii
S. cerevisiae CNMN -Y-20 și producerea β-glucanilor pe mediul optimizat R-ZZ.
Astfel , au fost stabili ți metoda de extragere a β-glucanilor , nutrien ții preferen țiali și
condi țiile optime de cultivare a tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20 pentru obținerea biomasei cu
conținut sporit de β-glucani . În baza acestor rezultat e se propun e un procedeu de cultivare a
tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20 [22].

3. POTEN ȚIALUL BIOTEHNOLOGIC A LEVURII SACCHAROMYCES
CEREVISIAE CNMN -Y-20 SUB INFLUENȚA NANOPARTICULELOR OXIZILOR
METALICI prezintă rezulta tele cercet ărilor proprii ce țin de elucidarea influen ței
nanoparticulelor oxizilor de metale asupra propriet ăților morfo -culturale , viabilit ății, produc ției
de biomas ă, activit ății biosintetice și enzimatice a tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20.
Au fost testate nanoparticulele de TiO 2 și ZnO. Efecte de stimulare a sintezei β-glucanilor
au fost obținute pentru nanoparticulele de ZnO cu dimensiunea 30 nm în concentrație de 5 -10
mg/L.

15 Nanoparticulele de ZnO de asemenea s -au manifestat în calitate de remediu ce înlătură
efectele negative ale alcoolului . Datele obținute au confirmat că nanoparticulele ZnO nu pot
înlătura efectul negativ al concentrațiilor înalte de alcool etilic asupra multiplicării celulelor S.
cerevisiae CNMN -Y-20 și producției de biomasă , în același timp influențează pozitiv procesul
de biosinteză a β-glucanilor , carbohidraților și proteinelor . Nanoparticulele ZnO (30 nm) ,
aplicate în procesul de cultivare a levurii, pot fi precăutat e ca un factor eficient pentru a spori
producția de β-glucani sub aspect industrial. S-a constatat că ponderea conținutului de β-glucani
este maximală în cazul cultivării tulpinii în prezența a 5 mg/L nanoparticule ZnO și 2% alcool
etilic . Rezultatele obținute au stat la baza elaborării unui procedeu nou de stimulare a biosintezei
β-glucanilor, care permite de a obține cu 30,7% mai mulți β-glucani față de martor [11, 88 ].

4. ELABORAREA TEHNOLOGI EI DE CULTIVARE A TULPINII S. CEREVISIAE
CNMN -Y-20 ȘI DE OBTINERE A β-GLUCANILOR este dedicat elaborării unei tehnologii
integrate de obținere a β-glucanilor, care include utilizarea undelor milimetrice cu frecvența extra
înaltă .
Studiul ce reflectă acțiunea undelor milimetrice cu frecvența f=53,33 GHz în funcție de
durata de iradiere a demonstrat, că în intervalul de 15 -20 minute de iradiere tulpina acumulează
activ carbohidrați, inclusiv β-glucani și proteine. Între conținutul de biomasă, carbohidrați, β-
glucani, proteine și activitatea catalazei la tulpina de levuri iradiată s -a stabilit un grad înalt de
dependență (coeficienții de determinare va riază în limitele R²=0,633… 0,949), fapt ce
demonstrează că sinteza acestor componente celulare este influențată de același factor, undele
milimetrice cu frecvența f=53,33 GHz. În baza acestor rezultate a fost elaborat un procedeu de
stimulare a biosintezei β-glucanilor, bazat pe iradierea tulpinii cu unde milimetrice cu frecvența
f=53,33 GHz timp de 20 minute. Avantajul procedeului propus constă în majorarea conținutul ui
de β-glucani cu 25,7% față de martor. Procedeul este brevetat [7].
Cercetările ce țin de influenț a undelor milimetrice asupra tulpinii studiate au permis
elaborarea tehnologiei de producere a β-glucanilor, bazat pe utilizarea undelor milimetrice cu
frecvență extra înaltă în calitate de factor reglator.
Tehnologia elaborată asigură un spor al cantității de β-glucani de până la 25,2% față de
tehnologia martor .
În baza β-glucanilor obținuți conform tehnologiei a fost elaborat preparatul biologic activ
Glucan -20, care în componența rațiilor furajere, majorează cu 22,0 -26,7% supraviețuire a
larvelor , cu 16,9 -24,0% masa medie a unei l arve, cu 45,2 -56,3% ihtiomasa generală medie.

16 Rezultatele obținute la crescătoriile de pești au fost brevetate [8] și sunt documentate prin acte de
implementare.
Astfel, această lucrare dezvăluie mai multe aspecte, scopul final al cărora este selectarea
mediului și condițiilor optime de cultivare a producătorului, evaluarea stimulatorilor chimici și
fizici ai sintezei β-glucani lor, elucidarea metodelor eficiente de extracție a β-glucanilor, elaborarea
tehnologiei de obținere a acestora, testarea lor în practică și deci prezintă atât importanță teoretică,
cât și valoare aplicativă.

17 1. LEVURILE – SURSE VALOROASE DE β-GLUCANI

1.1. Oportunitatea studierii β-glucanilor la levuri
În ultimele decenii biotehnologiile microbiene au influențat tot mai mult întreaga activitate
umană, iar comunitatea științifică internațională acordă o atenție deosebită studiilor de estimare a
biodivers ității microorganismelor și utilizare a acestora în diverse procese biotehnologice. O
problemă actuală este căutarea noilor surse de materie primă pentru elaborarea preparatelor
medicamentoase și profilactice, suplimentelor furajere și alimentare biologic active. În ultimii
ani în calitate de astfel de surse sunt studiate microorganismele și în special drojdiile, capabile să
sintetizeze un complex de substanțe bioactive , inclusiv polizaharide , cu un rol imp ortant în
activitatea vitală a organismelor vii [253], obținerea cărora este mult mai avantajoasă din punct
de vedere economic în comparație cu cele de origine animală și vegetală.
Producerea microbiologică a polizaharidelor biologic active este una din ramurile
biotehnologiilor ce se dezvoltă rapid. În prezent indust ria microbiologică produce un spectru larg
de polizaharide valoroase: WGP (whole glucan particles ), Zymosan, Curdlan , dextran, xantan,
etc. [121]. Însă toate aceste preparate sunt importate în Republica Moldova, fapt ce evidențiază
necesitatea și actualitatea cercetărilor ce țin de elaborarea tehnologiilor autohtone de obținere a
polizaharidelor naturale.
Printre producători de polizaharide se regăsesc reprezentanți ai diferitor clase, familii,
genuri și specii de microorganisme . Însă cei mai mulți aparț in reg nului Fungi printre care pot fi
menționate macromicete le cei din genurile Lentinus, Ganoderma, Agaricus , [119] și
micromicete le din genurile Candida, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Neurospora,
Rhodotorula și Saccharomyces, care conțin până la 40 -55% polizaharide intracelulare [ 234]. În
acest context, un mare interes științifico -practic, la momentul actual, îl prezintă polizaharidele de
bază ale peretelui celular al levurilor , și anume glucanii .
Deși printre levurile produc ătoare de polizaharide, utilizate în alimenta ție, se regăsesc
reprezentan ți ai genuri lor Zygosaccharomyces, Kloeckera, Kluyveromyces, Debaryomyce s, totuși
Sacch aromyces cerevisiae rămâ ne o sursă majoră de β-glucan i [49, 78, 184].
β-glucan ii obținuți din levuri au fost aprobați de Autoritatea Europeană pentru Siguran ța
Alimentară ca ingr ediente alimentare noi [ 106] și recunoscute ca fiind sigur e GRAS (Generally
Recognized as Safe) de către Administra ția SUA pentru Alimente și Medicamente [ 120, 253,
275].
Saharomicete le sunt utilizate în produc erea alimente lor și băuturi lor fermentate timp de mii
de ani și sunt cele mai detaliat studiate microorganisme, a le căror condi ții de cultivare sunt foarte

18 bine cunoscute și pot fi optimizate pentru a maximiza randamentul de producere a β-glucanilor.
Din punct de vedere biotehnologic ele au avantaj ul de a produc e o cantitate mare de biomasă cu
cheltuieli minime. Biomasa de levuri în calitate de produs secundar al produc ției de bere, vin ar
putea fi de asemenea u tilizată ca materie primă pentru obținerea β-glucanilor [257].
β-glucanii sunt polizaharide ale monomerilor de D -glucoză legați prin legături β –
glicozidice. În calitate de fibre dietetice, β -glucani se găsesc într -o varietate largă de surse
naturale : drojdii, ciuperci, bacterii, alge, orz și ovăz [ 280]. Aceștea posedă mai multe proprietăți
benefice grație căror și -au găsit aplicație în diverse domenii. Pe lângă perspectiva utilizării lor în
medicină, β -glucanii prezintă interes major pentru industria alimentară, cosmetică, farmaceutică,
chimică, veterinărie și producerea furajelor [117, 281]. Obținuți din diferite surse naturale,
posedă activitate biologică înaltă , ceea ce îi face indispensabili pentru obținerea diferitor produse
medicamentoase, alimen tare și de uz veterinar.
Efectul antiviral și antibacterian [ 37, 55, 64 ], propriet ățile imunomodulatoare [ 70, 71, 235],
imunostimulatoare [ 80, 133, 252], și anticancerigene [ 51, 83, 84, 137 ] a β-glucanilor permit
utilizarea lor la elaborarea medicamentelor anticancerigene și eviden țiază semnifica ția
biomedical ă deosebit ă a acestora. Recent s -au confirmat propriet ățile hipocholesterolemice [ 149,
263], antimutagene [ 169], antiinflamatorii [ 105, 135] și antioxidante [ 165, 183 ] ale β-glucanilor,
lărgind și mai mult spectrul de utilizare a acestor compuși în medicină și farmaceutică.
Utilizarea β -glucanilor și altor polizaharide biologic active de origine naturală deschid noi
perspective privind tratamentul și prevenirea bolilor alergice. Mecanismele de acțiune a acestor
substanțe se bazează pe activarea răspunsului limfocitelor T H1, suprimarea paralelă a reacțiilor
alergice imune ale organismelor vii și restabilirea echilibrului limfocitar T H1/T H2/T H17.
Imunomodularea prezintă pe viitor o abordare eficientă în prevenirea și tratamentul astmului
bronșic și altor boli alergice [ 136, 240].
Rezultate promițătoare au fost obținute privind posibilitatea reglării nivelului de zahăr în
sînge cu ajutorul β -glucanilor. Astfel, efect benefic asupra indicelui glicemic a avut ingestia de
β-glucani, din S. cerevisiae și alte surse naturale, de către animale [ 95, 96, 161] și om [ 126].
1,3-β-glucan liniar din Saccharomyces cerevisiae stimulează proliferarea fibroblaștilor,
creșterea numărului de plasmocite, contribuind la cicatrizarea rănilor și vindecarea mai rapidă a
ulcerului venos la om. Rezultatele sugerează că β-glucanii sunt stimulatori a i procesului de
vindecare natural ă a rănilor. Însă pentru a elucida mecanismele de acțiune și a evalua beneficiile
terapeutice a acestor polizaharide sunt necesare studii detaliate suplimentare [ 220].

19 Tulpinile de levuri S. cerevisiae din diferite subspecii și variante pot fi incluse în grupul
microorganismelor prebiotice din car e face parte Saccharomyces cerevisiae var. boulardii.
Rezultatele unor studii recente a Jawhara et al. [ 135] confirmă ace st fapt, iar activitatea biologică
înaltă a acestor tulpini, se datorează prezenței ß -glucanilor în peretele celular [ 140, 154]. Aceste
tulpini prezintă o activitate biologică semnificativă, care constă în prevenirea adeziunii tulpinilor
de microorganisme patogene la epiteliul intestinal, inhibarea activității toxinelor bacteriilor
patogene, prevenirea d iareelor după tratament cu antibiot ice, imunostimulare și activitate anti –
inflamatorie.
Micotoxinele , produse de multe specii de Aspergillus (predominant Aspergillus flavus și
Aspergillus parasiticus ), reprezintă un pericol eminent pentru organismele vii, fiind unul din cei
mai persistenți contaminanți ai hranei. Aceste toxine au efecte adverse semnificative asupra
sănătății animalelor și a omului. Astfel de toxine cresc susceptibilitatea la infecții, compromit
sistemul imunitar. Expunerea permanentă la mic otoxine cauzează necroza hepatică acută , care
poate duce la ciroză sau carcinoma ficatului. Insuficiența hepatică acută se manifestă prin
hemoragie, edem, modificări ale digestiei, absorbției și metabolismului nutrienților. Studiile
recente sugerează posib ilitatea uitilizării β -glucanilor în calitate de detoxificanți pentru reducerea
și evitarea efectelor negative cauzate de agenții toxici din mediu [ 72, 163, 202, 259].
În prezent tot mai des se discută despre utilizarea biomasei de levuri S. cerevisiae și a
derivatelor acesteia de natură polizaharidică la remedierea siturilor poluate cu metale grele: Cd,
Cu, Hg, Pb, Cr, Cs, Ni, U, Sr, Zn, etc. Mecanismul de biosorbție este bazat pe interacțiunea
ionilor metalici cu peretele celular al levurilor [ 166, 218, 226, 231].
Actualmente, grație proprietăților antioxidante, de vindecare a plăgilor, protecție de
radiațiile ultraviolet e și reducere a ridurilor, efectului de hidratare a tenului și măririi
permiabilității pielii, este discutată pe larg posibilitatea utilizării β -glucanilor din diferite surse
naturale în cosmetologie [ 53, 104]
Investigațiile de ultimă oră reliefează perspectiva utilizării glucanilor în zootehnie și
acvacultură, domenii ale economiei ce pr ezintă interes deosebit pentru R epublica Moldova .
Dezvoltarea intensivă a acvaculturii și zootehniei este indispensabil însoțită de creșterea
numărului de boli cauzate de diverse microorganisme. Pentru a preveni și controla aceste boli se
utilizează diferite medicamente, produse chimice sintetice și vac cinuri. O abordare alternativă
este aplicarea unor compuși naturali pentru stimularea sistemul ui imunitar al peștilor și
animalelor. Acești compuși sunt cunoscuți ca imunostimulatori, rolul benef ic al căror în
managementul bol ilor deja e stabilit. Astfel, e demonstrat că atât biomasa S. cerevisiae cât și
derivatele acesteia, în special β -glucanii, suplimentate la nutrienții specifici îmbunătățesc

20 calitatea furajelor, stimulează răspunsul imun, creșterea și dezvoltarea organisme lor, majorează
supraviețuirea animalelor nounăscute și a puietului de pește [ 25, 34, 71, 148, 174, 177, 200, 262].
Potențialul înalt de utilizare a β-glucanilor și altor derivate a biomasei de levuri ca
hidrocoloizi în industria alimentară se bazează în principal pe proprietățile lor reologice, adică
capacitatea lor de gelif iere și capacitatea de a mări vi scozitatea soluțiilor apoase. Astfel, β-
glucani din diferite surse n aturale sunt utilizați ca age nți de îngroșare pentru a modifica textura,
aspectul și parametrii organoleptici ai produselor alimentare [49, 69, 119 ]. În plus, ei pot fi
utilizați ca stabilizatori în fabricarea produselor dietice cu conținut scăzut de grăsimi, cum ar fi
sosurile pentru salate, biscuiți, înghețată, iaurturi ș i brânză [ 153, 212, 251, 27 5, 281]. β-glucanii
și mano proteinele de levuri au fost de asemenea examinați în calitate de substituenți ai grăsimi lor
în maioneză și în alte produse alimentare [ 260, 265].
Astfel, activitatea biologică înaltă și diversitatea domeniilor de utilizare a β -glucanilor
fungici, în special a celor din levuri, evidențiază oportunitatea studierii acestor compuși, care
posedă potențial înalt în promovarea sănătății umane și elaborarea prepara telor biologic active cu
utilizări polivalente.

1.2. Structura , compoziția chimică și mecanismul de biosinteză a β-glucanilor
Peretele celular este vital pentru creșterea, supraviețuirea și morfogeneza fungilor. El este o
barieră de protecție împotriva unei game largi de condiții nefavorabile ale mediului, cum ar fi
temperaturile joase și înalte, des hidratarea și stresul osmotic, precum și împotriva altor
microor ganisme. Proteinele recept ori ai peretelui celular permit fungilor să evalueze și să
răspundă la schimbările mediului înconjurător. Polizaharidele mediază proprietățile adezive ale
celulei fungice și permite colonizarea medii lor noi. Peretele celular este, deasemenea, esențial
pentru participarea unei game largi de fungi la formarea biofilmului – nișă ecologică importantă
pentru multe microorganisme. Pentru fungii patogeni, peretele celular determină virulența și
patogenitatea lor, le ajută la invazia țesutului gazdă și le oferă protecție față de mecanismele de
apărare a le gazdei.
Sursele naturale majore de β -glucani sunt bacteriile, drojdiile, algele, ciupercile și plantele
[256]. Levurile sunt microorganisme bine cunoscute care se utilizează în biotehnologie din cele
mai vechi timpuri, și prezintă o sursă sigură și importantă de β -glucani [264].
Pereții celulari ai fungilor sunt compuși din glucani, chitină și chitosan, manoproteine
și/sau galactoman ani și glicoproteine. Componentele de bază a peretelui celular al S. cerevisiae
sunt manoproteinele, 1,3 -; 1,6-β-glucanii și chitina (F igura1.1). O var ietate largă de glucani : 1,3-
β; 1,4 -β; 1,6 -β; 1,3 -ά; 1,4 -ά) și diferite combinații a acestora s -au identificat în pereții celulelor

21 fungice. Acești polimeri sunt sintetizați pe membrană plasmatică cu ajutorul glucan sintazelor și
apoi exudați în spațiul pe retelui celular [ 234].

Fig. 1.1. Structura peretelui ce lular la S. cerevisiae [225].

Dintre cele 3 componente majore ale levurilor ( lipide, proteine și carbohidrați ), anume
carbohidrații și -au găsit cea mai largă aplicare în practică, în special β-glucanii.
Structura chimică nativă a β -glucanilor depinde de sursa din care sunt izolați. Fiecare tip de
β-glucan, derivat din diferite surse, are o structură unică în care unitățile de glucoză sunt legate
între ele în mod diferit [115, 239].
Polizaharidul β-D-glucan din levura este un biopolimer al D -glucozei. Acesta constituie un
element structural major al peretelui celular de levuri . Celălalt element structural principal al
peretelui celular sunt manoproteinele, costituite din polimeri ai m anozei și fracțiuni de protein e
[152]. În peretele celular al levurii , se regăsesc două tipuri principale de β-D-glucani: 1,3 -β-D-
glucan liniar, componenta principală (85%), reprezentând mai mult de 50 -55% din peretele
celular și 1,6-β-D-glucan ramificat – (15%) (F igura 1.2) [155, 175 ]. În general, peretele celular
reprezintă până la 30% din masa uscat ă a celulelor levuriene [48 ].

Fig. 1.2. Structura 1,3 -β-D-glucanului liniar ( A) și 1,6 -β-D-glucanul ui ramificat ( B) al levurilor
S. cerevisiae [115].
În literatura de specialitate în mod frecvent sunt descrise trei clase de β -glucan i a levurilor ,
bazate pe proprie tățile lor de solubilitate: 1,3 -β-glucan alcalin -insolubil -acid acetic insolubil,

22 care este responsabil de proprietă țile mecanice și structura le ale perete lui celular de levuri; 1,3 -β-
glucan solubil în alcalii ce conferă flexibilitate peretelui celular; 1,6-β-glucan solubil în alcalii ,
care stă la baza structurii macromoleculare a peretelui celular de levuri , asigurând
interconectarea dintre cat enele liniare de 1,3 -β-glucan, chitină și manoproteine [266]. Această
structură complexă asigură rigiditatea și insolubilitatea peretelui celular de levuri . [270] Încă un
polimer, 1,4-α-D-glucan, similar glicogenului, reprezentând 3 -7% din peretele celular, poate fi
asociat la β-glucani prin legături covalente, formând complec și α, β-glucanici [ 151].
În peretele celular al levurilor S. cerevisiae 1,3-β-glucanul se organizează într -o structură
complexă, compusă din lanțuri helix simple sau asociate în triplu helix, stabiliz ată prin legături
de hidrogen (F igura 1. 3) [153].

Fig. 1.3. Structura Triplu -Helix a 1 ,3-β-D-glucanilor din peretele cel ular al S. cerevisiae conform
[276].

Moleculele de glucan asociate prin legături de hidrogen laterale formează subunități
microfibrilare similare cu cele de celuloză sau de xilan. La rândul lor, microfibrilele de glucan se
asociază, organizând în interiorul matrixului parietal o rețea cu o ar hitectură și topografie
complicată. Experiențele cu protoplaștii de levuri au arătat că aceștia regenerează pe suprafața
lor o structură reticulară glucanică, dar care pare să difere de glucanii insolubili ai peretelui nativ,
ce rămân du pă extracția mano proteinelor [ 150]. Astfel, 1,3 -β-glucanul este foarte potrivit pentru
a servi ca bloc major de construcție a peretelui celular.
Sinteza peretelui celular la levuri are loc pe membrana plasmatică și este dependentă de
proteinchinazele secretorii și controla tă de un sistem enzimatic echilibrat, care conține hidrolaze,
glicozidaze, glicoziltransferaze și transglicozilaze. Acest sistem numit GH72, ce conține 72 de
enzime, este prezent în organismele fungice ș i posedă funcția importantă de sinte ză a unităților
de structură și alungi re a lanțuri lor de 1-3-; 1-6-β-glucan . Cu toate acestea, mecanismele
moleculare care controlează echilibrul între hidroliză și transglicozilare în aceste sisteme nu sunt
pe deplin elucidate [124, 132, 224].

23 1,3-β-glucanul este sintetizat de 1,3 -β-glucan sintază, o enzimă asociată cu membrana
plasmatică situată în multiple domenii transmembranare. Enzima utilizează UDP -glucoza
citoplasmatică ca substrat și adaugă monomeri de glucoză la capătul polimerului glucanic liniar.
S. cere visiae posedă trei gene răspunzătoare de producerea 1,3 -β-glucan sin tetazei, dar principală
este FKS1, care funcți onează ca sin tetază de bază a 1,3 -β-glucanilor în timpul creșterii și
dezvoltării levurii [ 143].
FKS1 se găsește în asociere cu proteină G RHO1, care funcționează ca subunitate de
reglementare pentru FKS1. Funcția RHO1 în sistemul de transducție a semnalelor este controlul
căilor de semnalizare a MAP (mitogen -activated protein) chinazei , care reglează creșterea
celulelor și integritatea per etelui celular. Asocierea FKS1 cu G RHO1 este necesară pentru a
activa sau inhiba sinteza 1,3 -β-glucanului în condiții normale sau de stres [ 143, 155, 242].
Mobilitatea FKS1 1,3 -β-glucan sin tetazei, necesară pentru sinteza și asamblarea uniformă a
peretelu i celular, este asigurată de o pr oteină structurală numită actină. Aceasta se află în AP
(actinoplaști) în anumite locații a membranei plasmatice fiind de tip FLI (finger -like
invagination), în care are loc sinteză și asamblarea lanțurilor de 1,3 -β-glucan în triplu -helix
(nanofibrile elementare) și în microfibrile [ 144, 191]. Datorită importanței sale în biogeneza
peretelui celular, 1,3-β-glucan sin tetaza este o țintă primordială pentru acțiunea agenților
antifungici [ 85].
β-glucanii reprezintă aproximativ 30 -60% din masa uscată a peretelui celular al S.
cerevisiae , manoproteinele și chitina constituie 20 -50% și respectiv 1 -2%. Moleculele de 1,3 -β-
glucan sunt formate din aproximativ 1 500 monomeri de glucoză, iar ponderea aces tui polimer în
conținutul total de g lucan atinge 65 -90%. 1,6 -β-glucanul este un polimer cu greutate moleculară
mică, cons tituit în medie din 130 -150 fragmente de glucoză [ 152, 155 ].
1,6-β-glucanul este o componentă specifică esențială a peretelui celular al S. cerevisiae
care interconectează toate celelalte componente structurale într-un grilaj. Eforturi considerabile
au fost îndreptate la identificarea și caracterizarea etapelor biosintez ei sale din punct de vedere
genetic și biochimic. Studiile arată că acest polimer joacă un rol central în structura peretelui, și
leaga lanțurile de glucan 1,3-β- cu chitina de mano proteine . Cercetările genetice au identificat
gene le ce codifică pentru enzimele responsabile de sinteza 1,6 -β-glucanului, defectarea cărora
duce la diverse modificări în structura 1,6 -β-glucanului, de multe ori cu consecințe letale.
Acestea includ genele responsabile de sinteze proteinel or specifice cu același nume KRE5 ,
BIG1 și ROT1, care au fost localizate în reticolul endoplasmatic și controlează împachetarea și
transportul moleculelor în aparatul Golgi. Proteinele KRE6 și SKN1 sunt de asemenea necesa re
pentru sinteza normală a 1,6 -β-glucanului. Secvența și struct ura lor sugerează că aceste proteine

24 sunt glicozilhidrolaze sau transglicozidaze și au me nirea de a forma rețeaua de 1,6 -β-glucanul în
peretele celular. Studiile a supra proteinelor KRE6 și SKN1 indică că acestea sunt localizate în
aparatul Golgi. KRE1 este o proteină glicosilphosphatid ilinositol GPI ancorată care deasemenea
este necesară pentru sinteza normală a peretelui celular și are fu ncția de a alungi lanțul de 1,6 -β-
glucan. KRE9 și KNH1 sunt o pereche dublă de proteine a peretelui care nu sunt legate de GPI și
au funcția de a dir ecționa corect încorporarea 1,6 -β-glucanul ui în peretele celular, depistarea 1,6 –
β-glucan sintazei în membrana plasmatică și legarea polimerilor c omponenți ai peretelui între ei
[155, 242]. Pierderea ambelor, KRE9 ș i KNH1 , este letală. Sinteză 1,6 -β-glucanului este
localizată pe membrana plasm atică, iar 1,6 -β-glucan sint etaza funcționează similar și 1,3 -β-
glucan sin tetaza [ 234].
Produsele activității acestor gene au fost localizate în întreaga cale secretorie și la suprafața
celulelor. Cu toate acestea, activitatea majorității gene lor identificate rămâne necunoscută, ceea
ce face neclar în ce măsură și mod acestea contribuie la modificarea compoziției β-glucanilor .
Date curente structurale și genetice au permis dezvoltarea unor modele pentru a prezice
procesele biosintetice. Pe baza cunoștințelor despre sinteza glucanilor și a chitinei, este probabil
că cea mai mare parte a lor se sintetizează la suprafața celulelor, dar necesită în prealabil
evenimente cheie intracelulare [164].
Conținutul de polizaharide și ma noproteine, gradul lor de polimerizare și structura chimică
sunt caracteristici individuale ale fiecărei tulpini, în funcție de condițiile de creștere și timpul de
cultivare [ 96]. Structura macromoleculară a polimerilor izolați din pereții celulari a difer itor
specii de levuri se caracterizează prin grad diferit de polimerizare și ramificare. A stfel de
parametri ca greutatea moleculară, gradul de ramificare și structura primară, determină
proprietățile fizice și chimice (de exemplu, solubilitatea) a β-glucanilor și manoproteinelor de
care depinde activitatea lor biologică [ 57, 207]. Greutatea moleculară a polizaharidelor este
corelată cu activitatea lor antitumorală. Polizaharidele, în special de tip glucan – 1,3-β- și 1,6-β-
cu greutate moleculară mar e, posedă activitate biologică înaltă, comparariv cu cele cu greutate
moleculară mică.
Insolubilitatea în apă a β-glucanilor d in levuri limitează în mod substanțial aplicarea lor în
practică. Pentru a facilita utilizarea practică, a majora și diversifica activitatea biologică a β-
glucanilor au fost elaborate diverse metode pentru obținerea deriva ților β-glucanilor naturali.
Aceste metode includ prepararea de derivați esterificați, sulfatați, fosforilați și carboximetilați ai
β-glucanilor levurieni [ 112, 277].

25 Așadar, utilizarea practică a elementelor structurale ale pereților celulari a i levurilor
depinde de specia și chiar de tulpina de fungi, precum și de metodele de cultivare a lor, metoda
de izolare și preparare a polizaharidelor [ 77].
Astfel, putem concluziona că structura β-glucanilor levurieni este foarte diversă și ține de
varietatea taxonomică a microorganismelor din care sunt obținuți, iar activitatea lor biologică în
mare măsură depinde atât de structura primară și terțiară, greutatea moleculară, gradul de
ramificare cât și de metoda de izolare și preparare.

1.3. Modelarea biosintezei β-glucanilor prin varierea factorilor de cultivare
Funcționalitatea polizaharidelor și randamentul de producere a acestora sunt extrem de
dependente de varietatea taxonomică a producătorului, compoziția mediului nutritiv, condițiile
de cultivare, cum ar fi temperatura, pH-ul, aerația și durata acesteia [ 56, 74, 147].
Din punct de vedere biotehnologic, eficiența procesului poate fi mărită prin stimularea
biosintezei acestor polizaharide și/sau obținerea unei productivități mai mari a biomasei de
levuri . Acest lucru poate fi realizat printr -o selecție adecvată a compoziției mediului de cultură și
a condițiilor de cultivare. Optimizarea acestor parametri în procesele de biosinteză a
metabolitului dorit este unul dintre cele mai importante aspecte ale biotehnologiei industriale.
Costurile întregului proce s biotehnologic sunt determinate în primul r ând de costul mediului
nutritiv [190].
Un p arametru important ce caracterizează mediul de cultură este raportul
carbon :azot: fosfor (C:N:P) și carbon:azot (C: N). Disponibilitatea și proporția corectă dintre
elemen tele menționate mai sus sunt importante din punct de vedere al cultivării și utilizării
biomasei microbiene, optimizării condițiilor pentru biosinteza anumitor produse ale
metabolismului microbian. În producerea biomasei levuriene, raportul cel mai favorab il de
carbon, azot și fosfor (C:N: P) este de aproximativ 6,25:1: 0,125 [ 210].
La S. cerevisiae , modificări ale compoziției carbohidraților peretelui celular apar atunci
când celulele cresc în diferite condiții. În general, schimbările în starea fiziologică a celulei și
reacția sa la condițiile externe ar putea fi atribuite structurii dinamice a peretelui celular, în timp
ce, arhitectura și mecanismele celulare responsabile pentru sinteza acestuia pot fi controlate prin
compoziția mediului de cultură [ 67]. As tfel, Aguilar -Uscanga și François au confirmat că
conținutul de ß -glucani și manoproteine în peretele celular al levurilor este strâns legat de
condițiile de creștere și biosintez ă a polizaharidelor levuriene , fiind influențat mult de tipul sursei
de carbon și azot, pH -ul mediului, temperatura de cultivare, gradul de oxigenare a mediului,
precum și faza de dezvoltare celulară [ 48].

26 Creștere semnificativă (10 -20%) a conținutului de polizaharide, exprimat în greutate
uscată, în p eretele celular al levurilor de bere S. cerevisiae R9 a fost observată la cultivare în
mediu cu glicerol în concentrație de 2 -5% și pH 4,0. Conținut maxim de carbohidrati (58%) la
tulpina probiotică S. cerevisiae var. boulardii a fost depistat la cultivare în mediu cu 3% de
glicer ol și pH 5, 0. Peretele celular al levurii probiotice era caracterizat printr -un conținut ridicat
de manoproteine, comparativ cu peretele celular al levurii lor de bere S. cerevisiae R9, compus în
special din ß -glucani. După cultivar e în mediu nutritiv cu 2 și 3% de glicerol , celula de levuri de
bere conținea cea m ai mare cantitate (36% S.U.) de 1,3 -/1,6-β-glucani. Glicerolul în concentrație
de 3 și 5% intensifica biosinteza manoproteinelor în peretele celular al S. cerevisiae R9,
cantitatea lor ajungâ nd la 29% S.U., comparabilă cu cea din levurile cu proprietăți prebiotice,
cultivate î ntr-un mediu cu pH -ul 5,0 cu 3% de glicerol [77].
Modificări în structura peretelui celular la tulpin a de levuri furajere Candida utilis ATCC
9950 au fost observate în funcție de mediul de cultură. Mediul nutritiv în bază de suc de cartofi
deproteinizat cu pH -ul 5,0 suplimentat cu 5 și 10% glicerol a i ntensificat semnificativ biosinteza
1,3/1,6 -β-glucanilor în peretele celular al levurii studiate. Celule pe acest mediu erau
caracterizate prin pereți celulari mai groși, cu conținut de β-glucani de aproximativ 44 -45% la
S.U., fiind semnificativ mai mare în comparație cu cel determinat după cultivare în mediul YPD
(aproximativ 31%) [ 75].
Mediile de cultură diferenția le trebuie să conțină substanțe care pot facilita dezvoltarea
levurilor fără a afecta viabilitatea lor. Cercetările științifice au arătat că mediile nutritive pentru
cultivarea S. cerevisiae includ sursă de carbon și azot, agenți de creștere, săruri minerale și
microelemente.
Astfel, Naruemon M. și colab oratorii au studiat efectul aditivilor SDS (Sodium Dodecyl
Sulfate), EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid), NaCl și a diferitor combinații dintre acestea
asupra producției de β -glucani la S. cerevisiae Angel®. Rezultatele au arătat că toate mediile
completate cu aditivii studiați majorează producția de β -glucani cu o eficiență de 7-40% față de
martor. Levura cultivată în mediul YPD suplimentat cu 100 mg/L SDS a produs cea mai mare
cantitate de β -glucan : cu 40% mai mult față de martor . În același timp, conținutul de proteine a
scăzut semnificativ, probabil din cauza proprietății SDS de a extrage proteinele din peretele
celular. În alte variante deasemenea s -a determinat o majorare a conținutului de β -glucani, însă
diferența față de martor nu era atât de semnificativă 15-27% [ 184]. Bazându -se pe studiile altor
cercetători [ 271] ei susțin că stimularea biosintezei β -glucanilor este un răspuns al celulelor la
stres, care, în condiții nefavorabile, în acest caz cauzate de SDS, prin diferite căi de semnalizare
își activează mecanismele enzimatice pentru a proteja celula de deteriorare. Sub acțiunea SDS

27 are loc activarea (FKS1) β -glucan sin tetazei și redistribuirea ei pe suprafață membranei
plasmatice pentru a repara deteriorările apărute în peretele celular [ 155].
Descoperirea multiplelor căi de semnalizare, implicate în reglarea organiz ării peretelui
celular de levuri ca răspuns la diferite semnale de mediu, a condus la recunoașterea biogenezei
peretelui celular ca un proces dinamic, complex și la o nouă înțelegere a naturii interdependente
a proceselor de remodelare a peretelui celular [156, 201].
Sursele de carbon utilizate pentru fermentarea levuri lor includ glucoza, zaharoza, lactoza,
fructoza, malt oza, și amidon ul, din care glucoza este sursa optimă a S. cerevisiae și este utilizată
pentru a spori randame ntul levurilor [86].
Glucoza este un compus indispensab il și strict necesar pentru bună sinteză a peretelui
celular și funcția sinergică a glucozidazelor și tuturor enzimelor implicate în acest proces . Ea este
responsabilă de activarea enzimelor membranei plasmatice , cu rol multipl u în organism : mediază
fluxul de ioni și pro toni în membrana celulară, reglâ nd pH -ul și protejează celula de cationii
toxici [63, 79].
Calea pentru catabolismul glucozei în S. cerevisiae este glicoliza, caracteristică și pentru
alți carbohidrați . Fructoza și glucoza sunt ușor fosforilate și intră în glicoliză în mod direct, în
timp ce galactoza și manoza sunt mai întâi convertite în glucoză -6-fosfat și fructoză -6-fosfat,
respectiv, înainte de a intra în glicoliză. Di -, tri- și oligozaharidele tre buie să fie hidrolizate în
monozaharide, care pot intra în calea glicolitică. Zaharoza, prin urmare, este hidrolizată în
glucoză și fructoză de către invertază, maltoza în glucoză de către maltaze ( α-D-glucozidază) și
melibioza în galactoză de către melibiaze ( α-D-galactozidaze). Poli – și trizaharidele constând din
unul sau mai multe tipuri de monomeri sunt hidrolizate în monozaharide printr -o combinație de
enzime. Rafinoza, de exemplu, este redusă în monozaharidele galactoza, glucoza și fructoza prin
eforturile combinate ale melibiazei și invertazei. Amidonul necesită glucoamilaze pentru a fi
hidrolizat până la glucoză [ 65].
Ca și în cazul surselor de carbon, S. cerevisiae a dezvoltat mecanisme care permit
utilizarea rapidă și optimă a mai multor surs e de azot și reprimarea utilizării surselor de azot mai
puțin favorabile. Acest fenomen și mecanismul său de bază au fost denumite „regulamentul de
azot”. Surse de azot, precum amoniacul, glutamatul și glutamina sunt descrise ca surse de azot
preferențiale, care asigură o rată de creștere mult mai ridicată decât sursele considerate sărace,
cum ar fi prolina, arginina sau ureea [ 113]. Sursele de azot organic pentru fermentarea S.
cerevisiae sunt peptona , cazeina și extractul de levuri , în acelaș i timp levurile sunt capabile să
utilizeze și surse de azot anorganic așa ca sulfatul de amoniu, azotatul de potasiu . În același timp
Zeng și colaboratorii au descoperit că microorganismele ar putea fi afectate în mod semnificativ

28 de utilizarea concomitent ă a două surse de azot diferite, ca de exemplu pepton a și extractul de
levuri [278]. Pentru a utiliza orice compus care conține azot, celule le levuri ene trebuie să -l
transforme în glutamină sau glutamat. Compușii azotați se sintetizează în celulele de levuri ,
folosind produsele asimilării sursei de carbon și gl utamatul sau glutamina ca dono r de azot [ 243].
Astfel, levur ile S. cerevisiae sunt capabile să utilizeze o gamă largă de surse de carbon și
azot, dar nu toate dintre acestea sunt utilizate cu o ef iciență egală.
Factorii fizici ai mediului de cultură au, de asemenea, o influență semnificativă asupra
creșterii și metabolismului microorganismelor. Temperatura de cultivare, pH -ul, aerația mediului
și durata procesului de cultivare determină activitatea fiziologică a culturilor și acționează asupra
proprietăților și compoziției biochimice a microorganismelor.
Cercetările privind influența temperaturii, pH -ului și aerației mediului de cultivare asupra
sintezei polizaharidelor de către Ganoderma lucidum au arătat, că temperatura de +25 -30șC este
optimală pentru aceste procese. Cultura posedă capacitate de a crește într -un spectru larg de
valori ale pH -ului de la 3,0 până la 7,5 și mai sus. Productivitatea maximală după biomasă s -a
determinat la un pH ini țial de 6,0 -7,0 și o aerație a mediului de 0,155-0,325 g O 2/l oră. Scăderea
pH-lui de la 6,0 la 4,0 și a aerației până la 0,155 g O 2/l oră a dus la intensificarea sintezei
polizaharidelor. Optimizarea condițiilor de cultivare nu a avut nici un efect asupra compoziției
calitative a polizaharidelor, glucanii constituind partea principală a lor [ 28].
Prin varierea pH -ului de la 3,5 la 6,5 și temperaturii de cultivare de la +20 la 40șC, pe un
mediu nutritiv m ineral în care glicerolul (50 g L-1) a servit ca unică sursă de carbon, Chagas B. și
colab oratorii au determinat intervalele optime de sinteză a polizaharidelor peretelui celular la
Komagataella (Pichia) pastoris DSM 70877. Varierea parametrilor în aceste limite nu a
influiențat semnificativ productivitatea d e biomasă, însă a modificat es ențial raportul dintre
polizaharidele peretelui celula r al tulpinii. Astfel, în inter valul de pH 4,5 -5,8 și temperatură +26-
38șC raportul dintre conținutul de chitină și glucani era de 14:86, în timp ce o reducere drastică a
chitinei până la 6% a fost observată în afara acestor intervale [ 81].
În baza unor cercetări vaste, cu utilizarea metodelor de planificare matematică a
experiențelor, a fost optimizată componența mediului de cultură pentru producerea mananilor de
tulpina S. cerevisiae 2.0016 -S. Astfel, stimulare esențială a sintezei mananilor s -a obținut la
utilizarea în calitate de surse de carbon și azot a zaharozei, peptonei de soia, glicer olului și
extractului de levuri în concentrație de 4,98; 4,39; 3,10 și 2,21 g la 10 0 ml de mediu respectiv.
Mediul de cultură optimizat a permis majorarea conținutului de manani de la 82,7 până la 162,5
mg la 100 ml de mediu nutritiv. Deasemenea a fost evaluată și influența pH -ului inițial,
volumului de inocul, temperaturii de cultivare și volumului mediului nutritiv. Condițiile optimale

29 s-au dovedit a fi următoarele: pH inițial – 5; volumul inocu lului – 5 ml; temperatura – 32șC; și
volumul mediului de cultură – 40 ml. Producția maximă de manan i a fost de 258,5 mg per 100 ml
mediu nutritiv la respectarea parametrilor optimi [ 129].
Conform datelor din literatura de specialitate, este cunoscut procedeul de cultivare
submersă a tulpinilor de levuri pe medii care conțin precursori ai biosintezei β-glucanilor
(monozaharide, extracte din șroturi, etc.) [ 100]. Un alt procedeu propus constă în cultivarea
tulpinii de levuri saharomicete ce include prepararea materialului semincer pe must de bere la
temperatura de 20 °C și durata de cultivare de 72 ore, inoc ularea germenilor în mediul de
fermentație steril YPD sau Rieder, cultivarea ulterioară în profunzime pe agitator (200 rot/min),
la temperatura de 20 °C timp de 120 ore. Cultivarea tulpinii utilizând mediile de fermentație și
condițiile indicate asigură acu mularea a 15,38 -19,66% β-glucani în biomasa uscată a levurii [4].
Concentrația inițială a inocumului de 2,5×106, pH-ul – 5,7; temperatura de 30 °C au fost
stabiliți drept factori importanți pentru producerea componentelor peretelui celular al tulpinii S.
cerevisiae T7. În condiții optime de cultivare, pe mediul YPD, după 24 de ore, protoplaștii S.
cerevisiae T7 produc 0, 91 mg/ml ß -glucani, cu o activitate de necroză tumorală de aproximativ
1,3 ori mai mare decât cea a preparatului 1,3/1,6 -β-glucan din celu le de levuri de brutărie
disponibil comercial [ 127].
Șocul termic duce la schimbări radicale în metabolismul celulei, provocând deteriorarea
membranelor, denaturarea și agregarea proteinelor celulare. Majorarea temperaturii induce
sinteza proteinelor și tr egalozei, care protejează celula de aceste deteriorări. Datele din literatură
ne indică faptul, că în timpul șocului termic la levurile S. cerevisiae crește esențial concentrația
formelor active a oxigenului ce conțin anioni superoxidanți (O 2-), peroxid de hidrogen (H 2O2) și
radicali hidroxili (OH-) toxici pentru celulă. Sinteza acestor compuși toxici duce la distrugerea
membranelor, denaturarea proteinelor și ADN – ului și moartea celulelor [ 156].
Temperaturi le optime de dezvoltare și biosinteză a substanțe lor biologic active variază de
la o grupă taxonomic ă de microorganisme la altă . Astfel, temperatura optimă de acumulare a
biomasei de către Agaricus blazei este de +28°C, iar de biosinteză a polizaharidelor – de +30°C.
Însă polizaharidele sintetizate la ac eastă temperatură se caracterizează printr -o activitate
biologică scăzută, în comparație cu cele sintetizate la temperatura de +24°C. Acest fapt se
datorează conținutului sporit de β-glucan în polizaharidele sintetizate la temperatura mai joasă
[87].
Procesele de acumulare a biomasei și polizaharidelor la cultivarea submersă a culturii
Bacillus subtilis practic coincid în timp și depind mult de temperatura de cultivare și de pH -ul
inițial al mediului nutritiv [ 40].

30 Deasemenea o mare importanță pentru sinteza substanțelor biologic active și acumularea
biomasei are faza de dezvoltare a microorganismului. Experiențele asupra ciupercii Aspergillus
niger au demonstrat, că cantitatea și calitatea glucanilor și chitinei dep inde de stadiul
ontogenezei și că acumularea complexului chitino -glucanic este strâns legată de stoparea
proceselor de multiplicare. Prin urmare, procesul de majorare a cantității de chitină și glucani în
celulă este o reacție de răspuns a acesteia la acți unea factorilor nefavorabili ai mediului, adică a
factorilor de stres [ 43].
Celule de levuri S. cerevisiae prezintă o durată de viață finită, care este în general
dependentă de numărul de diviziuni suportate. Drept consecință a îmbătrânirii, celulele de levuri
suferă modificări fiziologi ce, morfologi ce și de expresie a genelor. Aceste caracteristici
influențează absorbția de zahăr, producția de metaboliți, proprietățile de floculare, care depind de
structura peretelui celular. Proprietățile de fermentare, potențialul de floculare și hidrofobic al
celulelor de levuri cresc odată cu vârsta. Toți acești parametri în final determină eficacitatea
industrială a tulpinilor de levuri [90].
Studiul analitic al literaturii de specialitate evidențiază posibilitatea r eglării potențialului
biosintetic și productiv al microorganismelor prin utilizarea nanoparticulelor diferitor metale și al
oxizilor acestora.
Nanoparticulele, datorită dimensiunilor reduse (1 -100 nm) și proprietăților unice chimice și
fizice, pot induce modificări substanțiale în diferite sisteme biologice. Astfel, conform datelor
unor autori utilizarea nanoparticulelor în biotehnologia cultivării microorganismelor asigură
sporirea capacității de absorbție a nutrienților necesari și implicit se pot produc e modificări în
procesele metabolice [ 59, 93, 209].
Aplicarea nanoparticulelor la cultivarea microorganismelor reprezintă un domeniu inovativ
în cercetările de nanobiotehnologie [ 185, 206, 209, 272].
Func ționalitatea nanoparticulelor (NPs) este expusă în diferite publicații în care se
menționează eficiența utilizării acestora în industria alimentară, medicină, microbiologie, la
producerea vopselelor, pigmenților, aplicarea în cosmetologie. Există ipoteza că mai multe
nanocompozite posedă ac tivități toxice, dar și stimulatorii asupra microorganismelor, care se
manifestă în dependență de compoziția nanostructurilor și concentrația aplicată.
Proprietățile unice și utilitatea NPs permit de a le aplica în diferite domenii: biologie,
medicină, chimie, fizică etc. [ 18, 181 , 238].
Dezvoltarea științei și tehnologiei în ultimul deceniu se caracterizează prin studii intensive
asupra proprietăților obiectelor nanodimensionale și prin ela borarea diferitor tehnologii de
aplicare a acestora în practică. Analiza ș i generalizarea literaturii de specialitate [ 54, 171],

31 sugerează că progresul în această direcție va contribui la rezolvarea multor probleme cu care se
confruntă omenirea. Î n același timp, nu există dubii că aplicarea pe scară largă a
nanotehnologiilor, care înseamnă, de fapt trecerea la un nou nivel, mai înalt al progresului
științific și tehnologic, are și reversul său, cu noi pericole, legate de cercetarea insuficientă a
proprietăț ilor, caracteristicilor și acțiunilor necunoscute ale obiectelor nanometrice.
Unul dintre aceste pericole, recunoscut astăzi de majoritatea cercetătorilor, este insuficiența
informației privind influența nanomaterialelor asupra organismelor vii, inclusiv a omului. Astfel,
devine important să se determine condițiile utilizării unor nanotehnologii sigure pentru sistemele
vii, în special pentru om, problemă care este frecvent discutată în numeroase lucrări științifice
[180, 237 ]. Merită evidențiat faptul că pr oprietățile unice ale nanoparticulelor, cum ar fi
dimensiunile mici, suprafața specifică mare și reactivitatea ridicată oferă posibilități largi de
aplicare a acestora în practică, pentru binele omului, dar în același timp pot ascunde riscuri grave
pentru om. În așa mod, rezultă că pentru a estima pericolele și a reduce riscurile posibile, sunt
necesare studii biologice sistematice ale efectelor nanoparticulelor și nanomaterialelor asupra
organismelor vii.
Deși este studiată influența nanoparticulelor asupr a diferitor obiecte biologice, cele mai des
utilizate sunt microorganismele [ 107]. Astfel, a fost studiată influența diferitor nanoparticule
asupra creșterii, dezvoltării și activității enzimatice a micromicetelor [ 230], bacteriilor [ 99, 219]
și levuri lor [14, 194].
Despre efectele de stimulare a NPs se comunică în publicațiile autorului Kiran [142], care
menționează că utilizarea nanoparticulelor de fier în concentrație de 10 mg/l sporește cu 80%
producția glicolipidelor biosurfactante la cultura marină Nocardiopsis sp. MSA13A.
Activitatea biologică a nanoparticulelor depinde atât de caracteristicile principale ale
acestora: dimensiunea, forma, suprafața de contact, compoziția și structura stratului de
stabilizare, cât și de varietatea taxonomică a microo rganismului care servește în calitate de
cultură de referință [107]. Acest fapt ne sugerează că utilizarea nanoparticulelor în orice scop,
necesită studii detaliate și abordare specifică în fiecar e caz concret, privind evidenți erea
parametrilor optimi.
În prezent sunt descrise diferite tipuri de nanoparticule, cum ar fi nanoparticulele metalice,
nanoparticulele de oxizi metalici, nanoparticulele polimerice. Dintre toate acestea,
nanoparticulele oxizilor metalici sunt precăutate drept cele mai versatile m ateriale, datorită
proprietăților și funcționalității lor diverse. Dintre nanoparticule le de oxizi metalici, cele mai
utilizate sunt nanop articule oxidului de zinc (ZnO), datorită aplicațiilor lor diverse [ 258]. În
special, nanoparticulele oxidului de zinc sunt, frecvent, utilizate ca bioprodus antimicrobian. La

32 fel, nanopartuculele ZnO cu dimensiunile medii de ~50 ± 10 nm, testate pe ciuperci patogene în
concentrație de 100 mg/L, au demonstrat efect antimicotic evident [ 109]. Oxidul de zinc (ZnO),
datorită proprietăților sale antimicrobiene este încorporat într -o varietate de produse
farmaceutice cu aplicații dermatologice, în creme, loțiuni și unguente [ 173].
In prezent, ZnO este unul dintre cei cinci compuși de zinc, care figurează ca un material
sigur (G RAS) în general recunoscut de către US Food and Drug Administration
(21CFR182.8991 FDA, 2011) [ 199]
Compuși anorganici de nano -dimensiuni prezintă activitate antibacteriană înaltă în
concentrații mici, datorită raport ului mare suprafață:volum și proprietăților unicale chimice și
fizice [ 208]. Ei sunt, de asemenea, mult mai stabili în condiții extreme, cum ar fi temperatura și
presiunea înaltă [ 222], iar unii sunt considerați non -toxici și chiar conțin elemente minerale
esențial e pentru organismul uman [ 214].
Studiile recente oferă o nouă perspectivă cu privire la potențialul utilizării nanoparticulelor
ZnO ca un supliment pentru a spori producția industrială de β-glucosidază – enzimă importantă
în S. cerevisiae , cultivat atât în condiții normale , cât și în condițiile stresului alcoolic, precum și
producerea levurii de panificație în cantități mai mari [ 59].
Mudasir A. și colegii argumentează o posibilă utilizare în medicină a nanoparticulelor de
Ag sintetizate biologic, elucidând activitatea antimicrobiană înaltă asupra Staphylococcus
aureus , Escherichia coli, Salmonella typhi și Candida albicans [182].
Se consideră că nanoparticulele de Fe, Zn, Mg, în calitate de elemente esențiale cu
proprietăți noi, pot modifica căile matabolice la organismele vii [ 125]. Nanomateriale pe bază de
nanoparticule a le oxizilor metalici (CuO și F 3O4) se propun a fi utilizate în medicină ca remedii
cu efect citotoxic [ 9, 246].
Un număr mare de experiențe sunt destinate studiului influenței nanoparticulelor dioxidului
de titan cu scopul obținerii unor medicamente eficiente și inofensive pentru om și mediu. Se știe
că dioxidul de titan posedă activitate antibacteriană și antivirală . A fost testată influența
nanoparticulel or TiO 2 cu dimensiunea 4 -5 nm asupra virusului gripei H3N2. Ex periențile au
demonstrat, că deja peste 15 minute nanoparticulele TiO 2 aderă la suprafa ța virusului și provoacă
leziunile ei. Efectul dioxidului de titan depinde de timpul incubării , concentra ția virusului și
concentra ția de nanoparticule. Moartea virusului este cauzată de deteriorarea membranei sale.
[38]. Posibile mecanisme de influen ță a nanoparticulelor TiO 2 la nivel celular au fost cercetate de
către mai mulți specialiști în domeniu [110, 178], care au elucidat unele procese ce au loc în
cazul aplicării NP s.

33 Astfel, căutarea noilor căi pentru dezvoltarea biotehnologiilor microbiene inovative este de
o importanță majoră. La moment, posibilitatea stimulării proceselor metabolice la levuri prin
aplicarea nanoparticulelor este insuf icient studiată. Cercetările efectuate asupra mai multor specii
de levuri s -au soldat cu rezultate contradi ctorii. Luând în considerație inofensivitatea produselor
levuriene pentru organismul uman și perspectiva utilizării nanomaterialelor în diverse domenii,
prezintă interes studiul influenței oxizilor metalici nanostructurați asupra potențialului biosintetic
al levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20, în vederea elaborării unor procedee eficiente de obținere a
biomasei cu conținut biochimic pronosticat.
Cercetările destinate evidențierii unor noi căi de sporire a productivității
microorganismelor și obținere a biomasei cu un conținut înalt, prognozat de substanțe biologic
active rămân a fi actuale și capătă o răspândire tot mai largă. Cercetătorii preocupați de
investigarea p roceselor de sinteză a substanțelor biologic active de către microorganisme și
elaborarea tehnologiilor eficiente de obținere a acestora au marcat mai multe posibilități de a
spori eficiența proceselor biotehnologice menționate. În calitate de stimulatori se propun diferiți
compuși chimici, inclusiv coordinativi [ 23, 42, 215, 255 ].
Pe lîngă utilizarea factorilor chimici, o modalitate relevantă și actuală de a stimula
creșterea și dezvoltarea microorganismelor este utilizarea factorilor fizici, care influenț ează
activitatea fiziologică a microorganismelor. O atenție deosebită se acordă posibilității de utilizare
a radiației undelor milimetrice ca mijloc de stimulare a proceselor biologice. Acest tip de radiatie
poate avea un efect semnificativ asupra diferito r obiecte biologice, inclusiv microorganisme, care
în acest aspect sunt puțin studiate. Utilizarea undelor milimetrice cu frecvență extra înaltă în
aceste scopuri prezintă o direcție neexplorată, care poate oferi beneficii evidente industriei de
producere a substanțelor biol ogic active microbiene, în primul rând prin intensificarea proceselor
tehnologice.
Undele milimetrice cu frecvență extra înaltă sunt alineate la tipul de iradiere neionizante și
se referă la oscilațiile electromagnetice de frecvență ∫=30 -300 GHz care ocupă diapazonul
lungimii de undă λ=1-10 mm [ 245].
Undele milimetrice de intensitate joasă și frecvență extra înaltă sunt un factor de mediu
foarte răspândit. Ele sunt utilizate în sistemele de telecomunicații, practicile terapeutice și
prote cția produselor alimentare. În industria medicamentelor și alimentelor sunt utilizate , în
special , pentru efectele lor bactericide [ 249, 268].
UMM își găsesc o aplicare largă în diverse domenii, în special medicină și biotehnologie.
Un număr impresionant de cercetări științifice fundamentale, experimentale și aplicative privind
acțiunea câmpului electromagnetic milimetric asupra microorganismelor și animalelor de

34 laborator, efectului în tratamentul bolilor cu diferite etiologii, aplicarării în diverse biotehnologii,
s-au desfășurat cu succes și sunt în derulare în Federația Rusă, Ucraina, Italia, Cehia, Australia,
Spania, Croația, Finlanda, etc. [31, 91, 97, 172, 203]. Aceste studii demonstrează manifestarea
efectelor UMM asupra dezvoltării și proliferării celulelor, activității enzimelor, funcționării
membranelor celulare și altor sisteme biologice [ 250].
Multitudinea datelor experimentale, cu privire la eficacitatea undelor milimetrice, au pus
baza utilizării lor în medicină [ 29].
În practica terapeutică, se utilizează de regulă trei frecvențe: f = 42,25; 53,57; 61,2 GHz
(λ= 7,1 mm; 5 ,6 mm; 4,9 mm). Dacă primele două lungimi de undă au fost det erminate
experimental, în experiențele cu microorganisme și animale, apoi a treia λ= 4,9 mm corespunde
liniei de absorbție a oxigenului molecular al aerului [ 32].
Undele milimetrice se utilizează cu succes la tratarea unui spectru larg de afecțiuni
cardiovasculare, neurologice, urologice, ginecologice, dermatologice , gastro -intestinale, dentare,
oftalmologice, oncologice [ 52, 213, 247, 267].
De asemenea este bine cunoscut și studiat efectul imunostimulator, imunomodulator și
antiinflamator a l undelor milimetrice asupra organismului uman [ 35, 168].
Actualmente, acțiunea undelor milimetrice asupra organismelor vii este pe larg utilizat ă în
așa domenii ca medicina veterinară (tratarea diferitor boli la animale), fitotehnia (protecția
plantelor de diferite boli, stimularea germinării semințelor etc.) și biotehnologi a [27, 103].
Rezultate promițătoare , ce pun baza utilizării undelor milimetrice în piscicultură , au fost
obținute în experiențele asupra peștilor. Astfel, s -au demonstrat efecte pozitive a câmpurilor
electromagnetice asupra creșterii, dezvoltării, imunității nes pecifice și rezistenței la boli
păstrăvului Oncorhynchus mykiss [141].
Efectul acțiunii undelor milimetrice depinde de frecvență, timpul și puterea iradierii, dar și
de însăși obiectul biologic. Oscilațiile undelor milimetrice suprapuse cu vibrațiile proprii ale
celulei, pot iniția diverse răspunsuri, atît pozitive, cît și negative [ 41, 61, 118 ].
Actualmente există mai multe ipoteze privind mecanismel e primare de interacțiune dintre
undele milimetrice și obiectele biologice. Potrivit celei mai plauzibile, efectul interacțiunii
undelor milimetrice cu organismele vii se datorează absorbției de rezonanță a radiației
milimetrice la nivel celular, în rezult atul căreia se formează o reacție adecvată de răspuns a
organismului viu. Această ipoteză se bazează pe caracterul informațional al acțiunii undelor
milimetrice (iradierea extrernă imită semnalele proprii de control al funcțiilor vitale ale
organismelor vi i), iar influiența undelor milimetrice se datorează formării pe membranele
celulare a unor „substructuri” proteice, responsabile de restabilirea activității vitale [ 216, 261].

35 Efectele înregistrate nu întotdeauna se păstrează pe o durată lungă de timp, de aceea, pentru
intensificarea proceselor fiziologice, în cazul studiului acțiunii undelor milimetrice, este
important de a stabili durata optimă de acțiune a acestora asupra organismului. În cazul lipsei
iradierii exterioare aceste substructuri, sub acțiune a mișcării brouniene, treptat revin la starea
inițială [ 41, 122 ].
Un moment important în studierea mecanismelor de interacțiune a cîmpului
electromagnetic de diapazon milimetric cu obiectele biologice, prezintă evidențierea unității
structurale care reacți onează nemijlocit la acțiunea factorului extern [ 41, 118]. Este demonstrat
că efectul undelor milimetrice asupra organismelor vii se poate manifesta la diferite niveluri de
organizare a materiei vii: molecular, celular, de substructuri celulare și de organ ism [ 139, 279].
Puncte le de bază a le interacțiunii acestor unde cu celulele vii sunt apa, membrana celulară
și genomul. Schimbările în structura și proprietățile clusterului de apă duce la creșterea activității
chimice sau hidratarea proteinelor și a altor structuri celulare, modificarea act ivității enzimatice.
Aceste efecte pot fi specifice și pe termen lung. Mai mult, este modificată structura de suprafață,
transportul substanțelor și procesele energetice ale membranei celulare. Consecințele
interacțiunii undelor milimetrice cu microorganis mele se manifestă prin modific area sensibilității
lor față de diverse substanțe chimice [ 232].
Conform unor autori , rolul principal în formarea reacțiilor de răspuns la influ ența factorilor
fizici externi le revine membranelor celulare, capabile de reglare a proceselor energetice și
biochimice în celulă, prin mod ificarea nivelului de difuzie a ionilor și altor substraturi [ 36].
Vastul material științific, acumulat e xperimental, confirmă că mecanis mul interacțiunii undelor
milimetrice atăt cu organismele unic elulare, cît și cu cele pluricelulare, vizează aspectele
esențiale vitale ale animalelor, plantelor și microorganismelor.
Datorită unui șir de particularități ale interacțiuni i undelor milimetrice cu obiectele
biologice, utilizarea lor în biotehnologia microbilogică este de mare perspectivă. Deoarece
microorganismele sunt parte integrantă a proceselor de producere utilizate în industria
alimentară, agricultură și alte domenii al e economiei, stimularea creșterii, îmbunătățirea
parametrilor tehnologici și optimizarea proceselor de cultivare a acestora sunt sarcini actuale și
relevante, rezolvarea cărora are o mare importanță practică.
Reieșind din necesitățile optimizării indicilor tehnologici, este important de a evidenția
frecvențele optime ale undelor milimetrice la care reacționează obiectul biologic. Se știe, că
obiectele biologice sunt mai receptive la anumite frecvențe [31, 32].
Prin alegerea corectă a parametrilor de iradier e, utilizarea undelor milimetrice poate
îmbunătăți în mod semnificativ capacitatea de reglementare a proceselor metabolice din culturile

36 microbiene. Mai mult, utilizarea acestui tip de iradiere nu are efect negativ asupra mediului, nu
lasă reziduuri toxice , este sigur pentru viața umană [ 187, 188 ].
A fost acumulat un m aterial științific variat referitor la efectul undelor milimetrice asupra
microorganismelor din diferite grupe taxonomice. În prezent, în literatura de specialitate, sunt
disponibile date cu p rivire la efectul undelor electromagnetice milimetrice asupra organismelor
fotosinteti zante – cianobacterii, micro – și macro -alge, plante superioare [ 39, 205 , 241],
actinomicete [ 33, 73 ].
Sunt descrise timpul, frecvența, și regularitatea acțiunii radiației undelor milimetrice asupra
organismelor fotosintetice procariote și eucariote precum și efectele fiziologice care rezultă din
interacțiunea acestora. Este demonstrat efectul stimulator al iradierii asupra creșterii și
acumulării de biomasă, transportului de ioni și excreției din celulă a substanțelor biologic active
la organismele procariote și eucariote.
Cercetările savanților au demonstrat că undele milimetrice influențează asupra viabilității
microorganismelor și această acțiune are un caracter selectiv [50].
Undele mimilmetrice provoacă modificări în membrana plasmatică a microorganismelor
gram -pozitive și g ram-negative. Astfel, au loc diverse modificări fizico -chimice:
hiperpolarizarea membranelor, schimbarea potențialului de suprafață, majorarea activ ității
respiratorii etc. [ 192].
Deasemenea sunt studiate unele aspecte a le influenței undelor milimetrice asupra ciclului
vital, particularităților morfologice și a capacităților biosintetice a levurilor [ 91, 116, 118, 122,
145].
Este evident însă, că pentru a utiliza undele milimetrice în biotehnologia cultivării dirijate a
levurilor și obținerii produselor bioactive de diversă natură, sunt necesare cercetări suplimentare
detaliate privitor la sensibilitatea celulelor la acest tip de unde, influența lo r asupra ciclului vital,
activității fiziologice și biosintetice. Studiul în dinamică a derulării ciclului mitotic și biosintezei
principiilor bioactive su b influența undelor milimetrice , poartă un caracter teoretic și practic.
Pentru aplicațiile practice a undelor milimetrice în microbiologie și biotehnologie este esențială
cunoașterea procesului de creștere a culturii ca răspuns la acțiunea factorului extern. Obiectele
biologice posedă sensibilitate diferită la iradiere, deaceea în vederea caracterizării reacției de
răspuns a levurilor este important de a depista timpul când celula își sincronizează activitatea la
frecvența undelor milimetrice aplicate. Un indice important al ameliorării calităților tehnologice
ale tulpinilor de levuri este caracteristica bioproductivă – producția de biomasă, conținutul de
proteine, carbohidrați, polizaharide, alte principii bioactive.

37 Astfel, o soluție inova țională pentru obținerea β-glucanilor este identificarea noilor
procedee de reglare a biosintezei lor, bazate pe optimizarea mediilor nutritive, condițiilor de
cultivare și utilizarea materialelor nanodimensionale și a undelor milimetrice în calitate de
stimulatori ai biosinte zei.
Metode de extracție, purificare și tehnologii de obținere a β -glucanilor
Apariția biotehnologiei moderne a transformat fundamental modul în care oamenii de
știință precaută microoorganismele și substanțele pe care acestea le produc. Microorganismele
pot sintetiza o cantitate mare de substanțe, inclusiv polizaharide, în condiții de producție optime,
simple, dar în unele cazuri costisitoare. Un număr mare de polizaharide produ se de
microorganisme fie sunt deja adoptate ca produse comerciale, fie au un potențial înalt de
comercializare. Principalul dezavantaj care limitează dezvoltarea tehnologiilor de obținere a
polizaharidelor este lipsa unor procedee eficiente pentru extra gerea completă și purificarea lor.
Metodele existente în present nu oferă posibilitatea de a extrage toate polizaharidele microbiene.
Cu toate acestea, biotehnologiile noi din agronomie, industria alimentară, medicină, farmaceutică
cosmetologie etc. ar putea da un imbold puternic pentru dezvoltarea lor [ 121].
Peretele celular al levurilor este ținta principală a metodelor de extracție a β-glucanilor.
Deși metode le de lezare a peretelui celular și extracție a componentelor diferă semnificativ între
ele, toate afectează cu grad diferit de gravitate randamentul final, puritatea, greutatea moleculară,
solubilitatea, activitatea biologică, și alte proprietăți biologice și funcționale ale β-glucanului
extras. Metodele de dezagregare a celulelor microbiene pot fi clasificate, în principal, în cele
mecanice și non -mecanice [ 159]. Toate metodele mecanice existente (ultrasunet, omogenizare la
presiuni înalte, măcinarea cu bile) se bazează pe forța de rupere, cele non -mecanice se divizeaz ă
în fizice (te rmoliza, șoc osmotic, congelare -decongelare), chimice (alcalii, acizi) și enzimatice
(enzime litice, glucanaze, autoliza) de perturbare a integrității peretelui celular. La următoarea
etapă are loc purificarea fracțiunilor de pereți celulari prin eliminarea manoproteinelor, lipidelor,
proteinelor, obținându -se diferite fracțiuni de β-glucani cu grad divers de puritate [ 256].
Majoritatea metodelor de purificare utilizează diferențierea componentelor celulare, pe baza
solubilității lor diferite în soluții alcaline și/sau acizi anorganici, unde conținutul de carbohidrați
din peretele celular este de regulă determinat prin utilizarea soluției fenol -acid sulfuric [ 114] sau
a reactivului antron [ 111].
Privitor la eficiența metodelor de distrugere a pereților celulari ai levurilor, printre
specialiștii în domeniu nu există unanimitate. Unii susțin că mai eficiente sunt metodele care
prevăd utilizarea unui singur procedeu de distrugere a peretelui celular: enzimatic [ 134], autoliza
[274], ultrasunetul [227] și extragerea și purificarea cu alcalii și acizi, alții optează pentru

38 metodele ce prevăd diferite combinații dintre metodele fizice și chimice [ 108, 189, 223]. Cert
este că selectarea corectă a metodei influențează semnificativ randamentul extracție i, puritatea,
solubilitatea, viscozitatea și activitatea biologică a β-glucanilor, de care depinde utilizarea
ulterioară a produsului finit.
Randamentul final de extracție a β -glucanilor prin utilizarea diferitor metode este foarte
variat. La utilizarea ce lor chimice și enzimatice variază de la 17,9 la 86,3%, ultimele fiind mai
eficiente [ 170].
Pentru evaluarea eficienței lizei pereților celulari sunt aplicate diverse metode. Metodele
microscopice directe permit evaluarea numărului de celule l ezate sau dezi ntegrate, în timp ce
metodele indirecte măsoară eliberarea componentelor intracelulare specifice rezultate din
solubilizarea biomasei. Pentru a observa modificările celulelor de levuri ca urmare a procese lor
de dezintegrare , se utilizează microscopia electronică de transm isie sau de scanare . Astfel,
utilizând aceste metode , s-a stabilit că pereții celulari a i diferitor levuri își păstrează forma de
bază, aspectul de suprafață și integritatea în timpul autolizei. Aceasta se datorează probabil
faptului c ă 1,3 -β-glucanii nu au degradat. Conform autorilor menționați, pierderea de
manoproteine din peretele celular nu afectează integritatea peretelui, ci modifică porozitatea lui,
fapt care facilitează eliberarea macromolecule lor intracelulare. Liu X. și colab oratorii [160] au
observat prin aceleași metode că, după autoliză, a avut loc separarea pere telui celular de
citoplasmă, păstrându -se integritatea peretelui celular levurian . Astfel, autoliza nu a afectat
pereții celulari, dar a contribuit la eliminarea su bstanțelor intracelulare nedorite în timpul
pregătirii lor.
În rezultatul unor cercetări vaste ce țin de evaluarea eficienței diferitor metode de liză a
peretelui celular și obținere a β-glucanilor (autoclavarea , autoliza, omogenizarea într -o moară cu
bile, ultrasonare a și diferite combinații a lor), Anna Bzducha -Wrobel și colaboratorii [76] au
stabilit că o cantitate maximă de preparate de pereți celulari de levuri S. cerevisiae cu cel mai
înalt grad de puritate au fost produse la omogenizare a cu bile de sticlă de zirconiu (0,5 mm în
diametru), timp de 30 de minute . Acest lucru a fost confirmat de cea mai mare cantitate de
material biologic solubilizat (aproximativ 64 -67%) în soluție tampon . Preparatele produse astfel
au avut un conținut total d e monozaharide de cca 60%, 1,3/1,6 -β-glucani 13 -14% și aproximativ
35% de proteine. Variantele experimentale au fost executate în apă cu pH -ul 5,0 și 7,0 și soluție
tampon Tris -HCl cu pH 8,0. Rezultate similare s -au obținut după autoliză cuplată cu măcinarea
cu bile sau cu ultrasunet, doar că timpul necesar pentru aceste procese a fost mai mare. Astfel,
prin aceste 2 metode combinate s -a obținut 52,6 -62,9% material solubil, cu conținut total de
monozaharide de 60,5 -61,2%, 1,3/1,6 -β-glucani 14,5 -15,5% și prote ine 36,5-36,7%. Însă,

39 utilizarea morilor cu bile are și neajunsurile sale, exprimate prin obținerea particulelor de
dimensiuni foarte mici, care cauzează probleme majore la următoarele etape de purificare, și duc
la majorarea costurilor de producere [ 58].
Li Zhang și colaboratorii au reușit să optimizeze parametrii de dezintegrare a pereților
celulari ai levurilor prin ultrasunet, pentru a obține cantități maxime de produs solubil cu puritate
înaltă. Eficiența acestei metode, exprimată prin cantitatea de ma terial solubil obținut și raportul
dintre cantitatea de proteină și β-glucani, este în mare măsură dependentă de durata procesului,
temperatura și puterea ionică a soluției. Cel mai semnificativ efect asupra eficienței metodei a
avut tempe ratura. Ultrasonarea efectuată la temperaturi ridicate favorizează eliber area
polizaharidelor. Este stipu lat că mecanismul de bază constă în denaturarea termică și coagularea
proteinelor care conduc la scăderea eliberării acestora în preparatul obținut [ 157]. Dar și această
metodă are unele neajunsuri ce țin de formarea în mediu a bulelor de aer, creșterea exagerată a
temperaturii și presiunii pe gradient, care în ansamblu duc la formarea radicalilor liberi OH-,
HO 2-.și O 2- [98].
Una din cele mai eficiente metode de obținere a β-glucanilor este considerată cea bazată pe
utilizarea enzimelor. Prin aplicarea lor e posibilă obținerea preparatelor β-glucanice cu o puritate
de cca 90% [ 160, 167]. Astfel, Chema Borchani și colaboratorii au obținut un randament de
extracție a β-glucanilor de 18,0% la substanță absolut uscată cu o puritate de cca 79,0%, printr –
un tratament inițial cu apă caldă, urmat de hidroliza enzimatică cu savinaze și lipaze. La prima
etapă s-a realizat îndepărt area manoproteinel or, evitând degradarea lanțului β-glucanic, iar prin
aplicarea enzimelor purificarea de proteinele remanente și lipide. În opinia autorilor, această
metodă are un potențial înalt de utilizare practică, pentru obținerea preparatelor glucanice de
calitate din S. cerevisiae la sca ră industria lă [68].
Prin utilizarea metodei combinate de dezintegrare a peretelui celular, care constă din 2
etape: hidroliza enzimatică și ultrasonarea ulterioară a biomasei de S. cerevisiae , Tran M. T. și
colaboratorii au obținut preparate de pereți celulari levurieni cu un conținut de β-glucani de
72,06% și proteină de 15,38% la B.A.U. Modificarea consecutivității etapelor sau utilizarea
numai a unei a dintre ele, rezulta în micșorarea es ențială a conținutului de β-glucani și majorarea
substanțială a celui de proteine în preparate [ 251].
Rezultate remarcabile au fost obținute de către Huang Gangliang și Li Jing, care prin
extracție alcalin -acidă și deproteinizare alcalină, fără a utiliza alte metode de dezintegrare a
peretelui celular, au obținut din pereții celulari a levurilor S. cerevis iae un preparat cu un
conținut de 84,4% β-glucani și 5,3% protein e. În rezultatul purificării (deproteinizării) acești
parametri au atins valori de 95,6 și respectiv 0,7% [ 131].

40 Condițiile de extragere din diferite obiecte biologice a glucanilor pot afecta structura și
compoziția acestora. Denaturarea structurii β-glucanilor are loc la temperaturi și pH ridicate –
factori fizici specifici procesului de extragere. Pachetul de macromolecule a β-glucanilor depinde
de conformația lor, care determină prezența de structuri ordonate sau dezordonate . Se consideră
că preparatele biologic active trebuie să conțină β-glucani î n conformația triplu -helix [ 15].
Cunoașterea proprietăților fizico -chimice, morfologice și mecanice a β-glucanilor, de
exemplu, forma suprafe ței, porozitatea, viscozitatea, permite aprecierea adecvată a materialului
vizat, precum și posibilitatea elucidării căilor de utilizare. Pentru caracterizarea polizaharidelor
pot fi utilizate metode fizice mode rne, spectroscopie (FT -IR și FT -Raman), microscop ie
electronică de baleaj (SEM) [ 228], microscopie de forță atomică (AFM) [ 45, 102].
În literatura de specialitate este stipulat că diverse modificări chimice și fizice simple pot
modifica esențial activitatea biologică a β-glucanilor levurieni. Astfel, mod ificarea chimică
elementară (fosforilarea sau carboxilarea) fragmentelor de glucoză la pozițiile O -2 sau O -6
conduce la solubilizarea 1,3 -β-glucanului și majo rarea activității sale biologice. Metodele fizice
aplicate pentru obținerea, purificarea și păstra rea preparatelor β -glucanice deasemenea modifică
activitatea lor biologică. Ca exemplu pot servi cercetările savanților din C ehia care au determinat
că uscarea preparatelor β-glucanice levuriene este o metodă fizică simplă de a majora activitatea
lor imunostimulatoare [130]. În același timp uscarea nu modifică structura și conținutul de β-
glucani în preparate, iar majorarea activității biologice se datorează creșterii purității lor, fapt ce
a fost confirmat prin FT -IR spectroscopie [ 158]. Însă, atât us carea cât și liofilizarea, au și unele
neajunsuri exprimate prin agregarea particulelor de β-glucani și formarea aglomeratelor. Pentru a
minimiza aceste efecte se utilizează uscarea prin pulverizare în combinație cu ultrasonarea
preparatelor [ 274].
Actualm ente, în baza diferitor metode și proc edee de dezintegrare a pereților celulari,
fracționare și purificare a polizaharidelor levuriene sunt elaborate diverse tehnologii de obținere
a preparatelor β-glucanice biologic active. Unul din primele preparate de a cest gen, obținut din
biomasa levurilor S. cerevisiae prin fierbere și tratare cu tripsină , este extract ul insolubil
Zymosan, compus din polizaharide, proteine, lipide și microelemente, substanța activă a cărui o
constituie β-glucanii [ 211]. Aceste constatări inițiale au dat un imbold puternic cercetărilor
privind evaluarea activității biologice a β-glucanilor.
Utilizarea practică a particulelor de β-glucani WGP (Whole glucan particle) era
restricționată din cauza insolubilității acestora î n apă. În consecință au fost elaborate o serie de
metode pentru solubilizarea 1,3 -β-glucanilor. Glucanii solubili în apă sunt denumi ți glucani PGG
(Poli -(1-6)-β-D-glucopiranozil -(1-3)-β-D-glucop iranoză). Astfel, Jamas și colaboratorii de la

41 Alpha -Beta Tech nology Inc., apoi și de la Biopolymer Engineering, Inc. au elaborat o serie de
metode pentru solubilizarea particulelor β-glucanice.
Tehnologia obținerii Betafectin PGG (Alpha -Beta Technology Inc.) este bazată pe
tratamentul consecutiv al WGP cu acizi și alcalii urmate de o serie de etape de filtrare și
ultracentrifugare pentru a ob ține un preparat netoxic, solubil în apă la pH neutru [ 197].
Betafectin PGG are structură triplu -helix, greutate moleculară de 150 kDa, stimulează sistemul
imun și hematopoeza, este eficient la tratarea bolilor infecțioase și cancerului [ 138].
Tot acești cercetători au descris și alte metode pentru prepararea β -glucanilor solubili.
Astfel, au fost obținuți β -glucanii neutri – NSG ( neutral soluble glucan) [198], cu structură helix
singular, greutate moleculară mai mică ca 20 kDa, ce declanșează un răspuns specific al celulelor
imune [ 138].
Yestimun® este un produs al companiei Leiber GmbH (Germania) în baza levurilor de
bere S. cerevisiae , aprobat pentru utilizare în industria alim entară ca supliment, ce inițiază și
stimulează răspunsurile imune înnăscute și adaptive. Biomasa este obținută la cultivar e pe mediu
nutritiv must de bere și apă de izvor. După autoliza ușoară a biomasei, precipitatul insolubil
(pereți i celulari) se separă de supernatant și se supune purificării cu utilizarea soluțiilor alcaline
slabe. Procesul de hidroliză cu acizi este omis , ceea ce permite obținerea β -glucanilor cu
structura intactă. Tehnologia permite obținerea a 22% de β-glucani la S.U. cu o puritate de cca
85% [ 235].
MacroGard® (Biorigin, Brazilia) , cel mai bine cercetat produs β -glucanic utilizat ca aditiv
furaj er în acvacultură, hrana anima lelor de fermă și de companie, p osedă un dosar științific vast
care prezintă efectele lui be nefice. Atât studiile in vitro , cât și cercetarea in vivo cu mai multe
specii de animale au demonstrat efectele benefice asupra parametrilor imuni și sănătății
animalelor. Acest produs este u n preparat insolubil de 1,3/1,6 -β-glucani, obținut prin autoliză și
purificare enzimatică din biomasa unei tulpini selecte S. cerevisiae și conține minim 60% β –
glucani, lipide 13 -18%, proteine 5 -7% [ 176]. O alternativă a acestui preparat sunt produsele
MacroGard®Pet, MacroGard®AquaSol, MacroGard® Immersion Grade, MacroGard®
Adjuvant și MacroGard® Fl Suspension, cu un grad diferit de puritate, în care conținutul de
lipide și proteine scade, iar cel de β-glucani ajungând la 95 -99% [ 196].
Imunoglucan – 1,3-β-glucopiranoză (HEBRON Farmacêuti ca, Recife, Brazilia) este un
polizaharid solubil, obținut din S. cerevisae extras și purificat timp de 18 zile, cu utilizarea
enzimelor și soluțiilor alcaline, care este utilizat subcutanat la copiii astmatici pentru a modula
stările alergice [ 221]. Administrat pe cale orală, Imunoglucanul modulează activitatea
imunomielopoietică și sporește rezistența animalelor bolnave de cancer [ 248].

42 β-glucanii industriali din levuri , cum ar fi BetaRight® și WGP® (Biotheras, Inc.) sunt
utilizați ca ingrediente în copturi, băuturi, iaurturi, sucuri de fructe, ciocolată și ca agenți de
îngroșare în sosuri pentru salate, inghețată, maioneză, sosuri și cașcavaluri. Majoritatea acestor
tehnologii au fost brevetate [ 244, 275].
Astfel, luând în considerație diversitatea metodelor de extracție și purificare a β-glucanilor,
activitatea lor biologică impunătoare, potențialul înalt de utilizare în diverse domenii ale
economiei și faptul că necesitățile consumatorilor locali sunt acop erite prin import, devine
evidentă necesitatea dezvoltării unor strategii de izolare ș i purificare cât mai eficiente î n vederea
elaborării tehnologiilor autohtone de producere a biopreparatelor β-glucanice cu efecte sanogene.

1.4. Concluzii la capitolul 1
1. Activitatea biologică înaltă și diversitatea domeniilor de utilizare a β -glucanilor fungici,
în special a celor din levuri, evidențiază oportunitatea studierii acestor compuși, care posedă
potențial înalt în promovarea sănătății umane și elaborarea preparatelor biologic active cu
utilizări polivalente.
2. Structura β-glucanilor levurieni este foarte diversă și ține de varietatea taxonomică a
microorganismelor din care sunt obținuți, iar activitatea lor biologică în mare măsură depinde
atât de structu ra, greutatea moleculară, gradul de ramificare cât și de metoda de izolare și
preparare.
3. O soluție inova țională pentru obținerea β-glucanilor este identificarea noilor procedee de
reglare a biosintezei lor, bazate pe optimizarea mediilor nutritive, condițiilor de cultivare și
utilizarea materialelor nanodimensionale și a undelor milimetrice în calitate de stimulatori ai
biosintezei.
4. Diversitatea metodelor de extracție și purificare a β -glucanilor, activitatea lor biologică
impunătoare, potențialul înalt de utilizare în diverse domenii ale economiei și faptul că
necesitățile consumatorilor locali sunt acoperite prin import, evidențiază necesitatea dezvoltării
unor strategii de izolare ș i purificare cât mai eficiente î n vederea elaborării tehnologiil or
autohtone de producere a β-glucanilor cu efecte sanogene.
Analiza surselor bibliografice relevante la tema tezei a permis de a formula problema de
cercetare a acestei lucrări care constă în determinarea parametrilor biotehnologici optimali de
cultivare a levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20, ceea ce a contribuit la eficienti zarea procedeelor
de sinteză orientată a β-glucanilor, fapt ce a permis elaborarea tehnologiei de obținere a acestor
compuși biologic activi valoroși .

43 Direcțiile de rezolvare a problemei de cercetare au constat în selectarea surselor de
carbon, azot, sărurilor minerale și condițiilor optime de cultivare submersă, care asigură
stimularea biosintezei β-glucanilor la tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20; eficientizarea metodei
de extragere a β -glucanilor în vederea simplificării procesului de obținere a produsului finit;
elaborarea procedeelor specifice pentru obținerea β-glucanilor, utilizând în calitate de reglatori ai
biosintezei nanoparticulele oxizilor de metale și undele milimetrice cu frecvența extra înaltă ;
elaborarea tehnologiei de obținere a β -glucanilor din biomasa levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20.
Scopul lucrării a const at în elaborarea tehnologiei inovative eficiente de obținere a β-
glucanilor din levuri.
Obiectivele lucrării au fost următoarele : 1) Selectarea nutrienților și condițiilor optime de
cultivare submersă a tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20 în vederea ameliorării biosintezei β-
glucanilor; 2) Elucidarea acțiunii nanoparticulelor oxizilor de metale asupra biosintezei β-
glucanilor și altor constituiente celulare a levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20; 3) Evaluarea
efectelor undelor milimetrice cu frecven ță extra înaltă asupra biosintezei β-glucanilor și altor
constituiente celulare a levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20; 4) Elaborarea tehnologiei de obținere
a β-glucanilor din biomasa levuriană.

44 2. BIOSINTEZ A β-GLUCANILOR LA TULPINA SACCHAROMYCES CEREVISIAE
CNMN -Y-20 ÎN FUNCȚIE DE NECESITĂȚILE NUTRITIVE ȘI CONDIȚIILE
DE CULTIVARE
Producția de β -glucani depinde în mod semnificativ de conținutul lor în peretele celular al
levurii. În general, schimbările în starea fiziologică a celulei și reacția sa la influența factorilor
externi sunt determinate inclusiv de structura și de modificările peretelui celular. Arhitect ura
peretelui unei celule și mecanismele responsabile de sinteza componentelor acestuia pot fi
controlate de compoziția mediului de cultură [155].
Mediile de cultură trebui e să conțină substanțe inductoare care pot facilita dezvoltarea
levurilor și care nu afectează viabilitatea lor. Cercetările au arătat că pentru S. cerevisiae , este
necesar ca în mediul de cultură să fie incluse surse de carbon, azot, alți factori de creștere [ 48]. În
calitate de sursă de carbon utilizată pentru fermentare și spori rea randamentul ui producerii de β –
glucani de către S. cerevisiae pot fi nominalizate glucoza, zaharoza, lactoza, fructoza, maltoza,
manoza, amidonul. Glucoza este cotată ca cea mai importantă sursă pentru biosinteza β –
glucanilor [63].
În calitate de sursă de azot organic pentru fermentare se aplică peptona și extractul de
drojdii, combinate cu surse de azot anorganic cum sunt sulfatul de amoniu, azotatul de potasiu,
cazeina [ 17, 195].
Reieșind din faptul că compoziția biomasei de levuri poate fi modificată în mod
semnificativ prin intermediul mediului de cultură, pentru producția înaltă de β -glucani este
important de a optimiza factorii specifici producătorilor identificați.
Astfel, scopul cercetărilor în acest capitol constă în eficientizarea metodei de extracție a
β-glucanilor , selectarea nutrienților preferențiali și condițiilor optime de cultivare submersă a
tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20 în vederea stimulării biosintezei β -glucanilor.

2.1. Materiale și metode de cercetare
Rezultatele investigațiilor prezentate în această lucrare au fost obținute în perioada anilor
2012 -2016 în laboratorul Biotehnologia levurilor.

2.1.1. Obiect de studiu
În calitate de obiect de studiu a servit tulpina Saccharomyces cerevisiae CNMN -Y-20,
brevetată ca producător de β-glucani, depozitată în colecția laboratorului Biotehnologia Levurilor
și în Colecția Națională de Microorganisme Nepatogene a Institutului de Microbiologie și
Biotehnologie al Academiei de Științe a Moldovei [ 4].

45 Pentru cultivarea levurii au fost utilizate următoarele medii de cultură:
YPD: 1% extract de drojdie, 2% peptonă, 2% glucoză, apă potabilă 1 L, pH-5,5 [48].
Rieder: 30,0 g/L glucoză; 3,0 g/L (NH 4)2SO 4; 0,7 g/L MgSO 4•7H 2O; 0,5 g/L NaCl; 0,4 g/L
Ca(NO 3)2; 1,0 g/L KH 2PO 4; 10 ml autolizat de drojdii; apă potabilă 1L ; pH-5,0-6,0 [1].
Cultivarea submersă s -a efectuat în baloane Er lenmeyer cu capacitate de 0,25 ; 0,5; 0,75;
1,0 L, pe agitator cu viteza de rotație 2 00 rot/min , la temperatura de 25°C, gradul de aerare
81,3…83,3 mg/L, durata de cultivare submersă 120 ore. Mediul lichid de fermentare s -a
însămâ nțat în volum de 5% cu inocul 2 x106 celule/ml. Conținutul de oxigen s -a măsurat cu
Oximetrul portabil – Oxi-315i/SET 2B10 -0011. Valorile pH -ului mediului de cultivare s -au
determinat cu pH -316i MeBketten WTW, Germania.
Metoda de preparare a inoculului (material semincer) . O colonie levuriană perfect izolată
se suspen dă în 50 ml bulion (must de bere ). Suspensia de celule se cultivă pe agitator (200
r.p.m.) timp de 24-48 ore, la temperatura de 25 °C, iluminare permanentă. Concentrația finală a
inoculatului se determină spectrofotometric la lungimea de undă λ=600 nm [217]. De regulă,
preparatul nativ de inocul se examinează microscopic între lamă ș i lamelă. Pe preparatele native
sunt evidențiate existența celulelor levuriene, forma și mobilitatea celulelor, puritatea inoculului .
Multiplica rea, productivit atea și activit atea biosintetic ă a tulpinii au fost modificate prin:
1) utilizarea reglatori lor și stimulatori lor:
– surse de carbon: glucoza, zaharoza, fructoza, manoza, melasa, etanolul în concentrații de
(w/v): 1%, 2%, 3%, 4%, 5%.
– surse de azot: sulfatul de amoniu (NH 4)2SO 4 și hidrogenofosfat de amoniu (NH 4)2 HPO 4, în
concentrații de (w/v): 0,1%; 0,2%; 0,3%; 0,4%; 0,5%.
– acetați : acetatul de zinc (CH 3COO) 2 Zn în concentrații de (w/v): 5, 10, 20, 30 mg/L .
2) varierea condițiilor de cultivare:
– durata de cultivare în profunzime: 48, 72, 96, 120, 144, 168 ore.
– influența temperaturilor de: 15, 20, 25, 30°C.
– influența conținutului de oxigen ( prin varierea volumului baloanelor ): cultivare în profunzime
la 200 rot /min și staționar .

2.1.2. Metode de investigație
Numărul de celule dezvoltate pe mediul lichid s -a determinat spectrofotometric conform
metodelor cunoscute. Pentru determinarea acestora din probele mart or și cele experimentale s -au
preluat monstre la începutul cultivării, după 6, 24, 48 ore de cultivare [179].

46 Viabilitatea celulelor s-a stabilit prin cuantificarea numărului de colo nii formate pe plăcile
cu YPD agarizat prin î nsămanțarea suspensiei de celule , exprimată în UFC/ml (Unități de colonii
formate la 1 ml suspensie ) [217]. Pentru aflarea numărului de germeni viabili existenți în
materialul examinat se utilizează formula de calcul:
UFC/ml = numărul de colonii x factorul diluției x 10 (2.1)
Examinarea formei și dimensiunii celulelor . Forma și dimensiunile celulelor s -au examinat
în culturi pe mediul nutritiv YPD, recomandat pentru levuri. După însămânțare, tulpinile s -au
incubat la 25 -28°C. Din cultură, după 6, 24 , 48 ore de cultivare, s -au făcut preparate de levuri
(celule fixate). Frotiurile cu celule fixate s -au colorat utilizând tehnica de colorare cu soluț ie de
violet de ge nțiană. Cu ajutorul microscopului XSZ -500, obiectiv 100x/1,25 OIL, 160/0,17 și
camera video – MEM1300, utilizând programul special Future WinJoe, s -a notat forma celulelor,
modul de înmugurire, s -au stabilit dimensiunile celulelor.
Biomasa levurii a fost determinată prin separarea de la lichidul cultural, prin centrifugare la
3000 rot/min timp de 15 min ute, resuspendarea depozitului cu apă distilată sterilă, centrifugare
repetată. Această procedură s -a repetat până s -a obținut un supernatant străveziu [129].
Metoda de determinare a substanței uscate prin cântărire . Metoda se bazează pe
eliminarea apei din biomasa levuriană prin incălzire la temperatura de 100 -110°C. Proba de
biomasă se introduce într -o capsulă de porțelan sau de platină și se incă lzește în etuvă. După
răcire capsula cu produs se cântărește. Operaț ia se repetă până se ajunge la o masă constantă.
Conț inutul de substanță uscată se calculează utilizând relaț ia:
% substanța uscată = m2 – m0 / m1 –m0 x 100 (2.2)
în care:
m1 = reprezintă masa fiolei ș i a produsului analizat (g);
m2 = masa fiolei și a reziduului după uscare (g);
m0 = masa fiolei (g) [129].
Prepararea pereților celulari de levuri s-a efectuat conform metodei propuse de Hong -Zhi
L., et al. [ 129].
Carbohidrații totali în biomasa de levuri au fost determinați la spectrofotometru PG T160
VIS Spectrophotometer, la lungimea de undă 620 nm cu utilizarea reactivului antron și D –
glucozei în calitate de standard [101]. Metoda este bazată pe deshidratarea he xozelor în prezența
acidului sulfuric concentrat, urmat de condensarea acestora cu Antron, care rezultă o dată cu
obținerea unei colorații albastre -verzui și măsurarea intensității acesteia la lungimea de undă 620
nm.

47 Pregătirea reactivul ui antronic (soluț ie antron de 0,05% în acid sulfuric 66%). În eprubete
se toarnă fie 0,5 m l (sau 5 mg) de probă analizată și cîte 0,5 ml soluție de 50, 100 și 200 mg
glucoză (pentru construirea curbei de calibrare); în eprubeta – martor se toarnă 0,5 m l apă. La
conținutul eprubetelor se ad augă cîte 5 ml reactiv antron. Se agită ușor și se pune timp de 10 – 15
minute la baia de apă la temperatura camerei. Se transferă la baia de apă fierbâ nd timp de 15
minute. Eprubetele se răcesc sub getul de apă la robinet și se lasă la întuneric timp de 30 min ute.
Cantitatea de carbohidrați din probele respective se determină după curba de calibrare.
Rezultatele finale ale conținutului de zahăr sunt considerate mediile aritm etice ale datelor
repetărilor, calculate după formula:
c(%) =X/m∙100%, unde: (2.3)
X – conținutul glucozei după curba de calibrare;
m – masa probei absolut uscate (mcg)
c% – cantitatea de carbohidrați în % la BAU.
Determinarea conținutului de β-glucani s-a realizat gravimetric [ 244], adaptată de Usatîi
A., Chiselița N. [19] și este descrisă în subcapitolul 2.2 .
Optimizarea componenței mediului de nutriție s-a efectuat conform metodelor de
planificare matematică a experiențelor [17].
Prelucrarea statistică a rezultatelor a fost efectuată cu ajutorul setului de programe
Statistica 7, veridicitatea în comparație cu martorul – p≤ 0,05.

2.2. Eficientizarea metodei de extracție a β-glucanilor
Extrage rea eficientă a β-glucanilor din pereții celulari levurie ni, ce posedă o structură
complex ă, este posibilă numai prin alegerea metodelor efic iente de distrugere a acestora. Î n
majoritatea cazurilor, pentru dez agregarea pereților celulari , se aplică procedee cu aplicarea
ultrasunetului, congelării -decongelării, autolizei, măcin ării în mori cu bile , precum și a
enzimelor. Parametrii variabili la extragerea β-glucanilor din biomasa levuriană sunt: solvenții și
concentrația acestora, temperatura, durata de extracție, etc. [115, 128, 167 ].
Metoda de extragere a β-glucanilor include două faze:
a) Dezagregarea celulelor ;
b) Extracția de β-glucani din pereții celulari prin intermediul tratării cu baze
și acid în diferite proporții.
Inițial, pentru extragerea β-glucanilor din biomasa levuriană de S. cerevisiae CNMN -Y-20,
s-a efectuat studiul comparativ al metodelor de dezagregarea celular ă. Pentru ruperea pereților
celulari s -au studiat comparativ cinci metode de fragmentare:

48 -Autoliza – la 50 °C timp de 24 ore, martor [ 244];
– Autoliza la 55 °C timp de 8 ore ;
– Ultrasonare efectuată la frecvența de 22 Hz timp de 3 minute ;
– Omogenizare la 15000 rot/min 10 minute ;
– Congelare -decongelare (3 cicluri +20 °C/-20°C).
Eficiența metodelor de fragmentare s -a apreciat prin următoarele analize: studierea
sedimentelor prin microscopie optică; determinarea viabilității celulelor de drojdie din sediment;
determinarea conți nutului de carbohidrați totali î n sediment.
Analiza sed imentelor prin microscopie optică a demonstrat că practic în toate variantele
testate se observă celule de diverse dimensiuni, ceea ce demonstrează că citoplasma este
eliminată parțial (Figura 2.1). Informația dată necesită studii suplimentare în vederea constatării
gradului de dezintegrare a peretelui celular. În acest sens s -a studiat viabilitatea celulelor.

a) b) c)

d) e)
Fig. 2.1. Celule de S. cerevisiae CNMN -Y-20 supuse diferitor procedee de dezintegrare a
peretelui celular, ( puterea de mărire 640 ).
Legenda: a – autoliză la 50 °C timp de 24 ore (martor) , b – autoliză la 55 °C timp de 8 ore, c –
ultrasonare 3 minute , d – omogenizare 10 minute , e – congelare/decongelare.

Viabilitat ea celulelor s -a stabilit prin î nsăm ânțarea pe mediu YPD agarizat a 0,1 ml
suspensie (20 mg sediment + 2 ml apă distilată sterilă) din sedimentele obținute după procedura
de centrifugare.

49 Rezultatele obținute după aplicarea diferitor metode de dezinteg rare sunt reflectate în
Figura 2.2, din care concluzionăm că gradul de rupere a pereților celulari este cel mai înalt la
aplicarea autolizei la 55 °C timp de 8 ore (celule viabile lipsesc), urmat de procedeul
omogenizare 10 minute , ultrasonare 3 minute , cu un grad de distrugere a celulelor de 90 -95%
(viabilitatea constituie 4,6 -11,0% comparativ cu varianta martor). Procedeul congelare –
decongelare este mai puțin eficient, gradul de distrugere a celulelor este de 80,7% (viabilitatea
constituie 19,3% compar ativ cu varianta martor).

Fig. 2.2. Viabilitatea celulelor levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20 supuse dezintegrării cu
aplic area diferit or procedee.
Legenda: 1 – autoliză la 50°C timp de 24 ore (martor) , 2 – autoliză la 55 °C timp de 8 ore, 3 –
ultrasonare 3 minute , 4 – omogenizare 10 minute , 5 – congelare/decongelare.

În continuare, în vederea obținerii β-glucanilor din pereții celulari, s -au aplicat variante de
lucru , ce îmbină metodele testate de dezagregare celulară cu modific area volumul ui de extragenți
și durat ei de extragere:
I. Proba martor: Metoda constă în autoliza suspensiei de drojdie (15% w/w conținut uscat
cu pH -5), la 50 °C timp de 24 ore, agitare moderată. Autolizatul se supune incălzirii la 80 °C timp
de 15 minute, răcirii până la temperatura camerei și centrifugării la 3565 rot/min timp de 10
minute, sedimentul se colectează. Procedura de extracție a β-glucanilor constă în tratarea
pereților celulari cu 1N NaOH ( raport 1:5) la temperatura de 80 ±5°C timp de 2 ore, separarea,
urmată de extracția cu acid acetic de 0,5N ( raport 1:5) la temperatur a de 75±5 °C timp de 1 oră.
Extractul se centrifughe ază la 3565 rot/min timp de 10 minute la temperatura camerei,
sedimentul se spală de 3 ori cu apă distilată și se usucă la 50±5 °C. Pasta obținută de β-glucani
este de culoare cafeniu -deschis [ 244].
020406080100
12345% la martorCelule viabile, %

50 Variante experimentale:
II. Autoliză cu durata de 8 ore. Amestecul din 10 g drojdie (30% S.U .) și 10 ml apă
sterilă se supune autolizei la 55 °C timp de 8 ore și se centrifughează la 3500 rot/min 10 minute.
Sedimentul (pereții celulari) se tratează cu 50 ml 1N NaOH timp de 1 oră la temperatura de
90±5 °C, se separă și se tratează cu 0,5N acid acetic în raport de 1:5, la 75±5 °C timp de 1 oră (în
scopul eliminării glicogenului), apoi se spală de 2 ori cu apă distil ată, se centrifughează la 3500
rot/min timp de 10 minute la temperatura camerei, se usucă la 50±5 °C. Produsul obținut sunt β-
glucanii.
III. Ultrason are cu durata de 3 minute. Amestecul din 10 g drojdie (30% S.U .) și 20 ml
apă sterilă se supune timp de 3 minute acțiunii ultrasunetului la frecvența de 22 KHz. Amestecul
se centrifughează la 3500 r ot/min 10 minute. Procedeul de extragere a β-glucanilor din pereții
celulari se desfășoară conform procedeului descris în varianta II.
IV. Omogenizare cu durata de 10 minute. Amestecul din 10 g drojdie (30% S.U.) și 20
ml apă sterilă se omogenizează 10 min ute la viteza de rotație 15000 rot/min (6F volum 30 ml),
umiditatea relativă 85%. Amestecul se centrifughează la 3500 rot/min 10 minute. Procedeul de
extragere a β-glucanilor din pereții celulari se desfășoară conform procedeului descris în varianta
II. Omogenizarea biomasei levuriene s -a efectuat la aparatul Silent Crusher M, Heidolph (2010) .
V. Congelare -decongelare : 10 g drojdie (30% S.U .) se supun congelării/decongelării la
-20°C/+20°C (3 cicluri), se centrifughează 10 minute la 3500 rot/min. Procedeul de
extragere a β-glucanilor din pereții celulari se desfășoară conform procedeului descris în varianta
II.
La analiza conținutului de carbohidrați totali se observă unele fluctuații, care nu indică
legități , ce ar permite evaluarea randamentului procedeelor de dezintegrare a pereților celulari.
Conținutul mai mic de carbohidrați în variantele experimentale comparativ cu probele martor se
explică prin dizolvarea monozaharidelor solubile în ap ă adăugată la probele de biomasă celulară
supusă procedeelor de autoliză, omogenizare, ultrasonare sau congelare/decongelare. Menționăm
faptul că conținut spo rit de carbohidrați 32,36 % la S.U. s -a observat în varianta IV de distrugere
a peretelui celular (omogenizare cu durata de 10 minute), ceea ce constituie 7,8% comparativ cu
proba martor (Figura 2.3).
Eficiența metodelor de extragere s -a apreciat prin determinarea conținutului de β-glucani.
În urma analizei rezultatelor obținute s -a stabilit, că condițiile optime de extragere a β-glucanilor
sunt c reate la aplicarea variantei IV (omogenizarea biomasei celulare timp de 10 minute) și
variantei V (procedura de congelare/decongelare a bi omasei celulare în 3 cicluri). La utilizarea
acestor metode se extrag circa 25,5% respectiv 25, 28% β-glucani l a S.U . (cu 35,6 și respectiv

51 34,5% mai mult față de proba martor), în varianta martor (autoliza 24 ore) conținutul de β-
glucani ext rași constituie 18,8% (Figura 2.3). Rezultatul tehnic pozitiv specific variantei cu
aplicarea omogenizării biomasei celulare se exprimă prin faptul că concomitent cu cantitatea mai
mare de β-glucani ext rași se reduce cu 24 ore comparativ cu procedeul martor și durata
procesului de extragere a β-glucanilor .

Fig. 2.3. Eficiența metodelor de extragere a β-glucanilor din pereții celulari ai S. cerevisiae
CNMN -Y-20.
Legenda: 1 – autoliză la 50 °C timp de 24 ore (martor) , 2 – autoliză la 55 °C timp de 8 ore, 3
– ultrasonare timp de 3 minute, 4 – omogenizare timp de 10 min ute, 5 – congelare/decongelare .

Astfel, în rezultatul cercetărilor se propune un procedeu simplificat pentru extragerea β-
glucanilor din biomasa levuriană, care constă din următoarele etape:
a) omogenizarea biomasei celulare la 15000 rot/min timp de 10 minute ;
b) separarea pereților celulari prin centrifugare la 3500 rot/min 10 minute ;
c) tratarea pereților celulari cu 1N NaOH în raport 1:5, incălzirea la 90 °C timp de 1 oră ;
d) tratarea cu acid acetic de 0,5N ( raport 1:5) la temperatura de 75±5 °C timp de 1 oră ;
e) centrifugarea la 3500 rot/min timp de 10 minute la temperatura camerei ;
f) spălarea sedimentului de β-glucani de 2 ori cu apă distilată ;
g) uscarea β-glucanilor la 50±5 °C.

2.3. Influența sur selor de carbon, azot asupra biosintezei β-glucanilor și elaborarea
mediului de cultivare a tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20
Carbohidrații au importanță deosebită în procesele de biosinteză a principiilor bioactive.
Glucoza (dextroz a) sau zahărul de struguri (C 5H11O5CHO) este componenta de bază din care
sunt construite mai multe polizaharide – β-glucanii, glicogenul, amidonul, celuloza. Glucoza intră 0 50 100 15012345β-glucani, % la martor Carbohidrați, % la martor

52 în componența zaharozei, maltozei, lactozei, ușor se absoarbe în s ânge. O altă monozaharidă –
manoza (HOCH 2(CHOH) 4CHO ), este componenta mai multor polizaharide, în special a
mananilor.
În scopul selectării surselor adecvate de carbon pentru sinteza β-glucanilor au fost
efectuate cercetări de evaluare a efectelor diferitor compuși ai carbon ului adăugat în mediile de
fermentație YPD și Rieder în diferite concentraț ii.
Drept criterii de evaluare au servit co nținutul de biomasă celulară (g L-1 mediu de cultură),
conținutul de carbohidrați totali (% la B.U.), conținutul de β-glucani ( % la B.U. și gL-1 mediu de
cultură).
Studiul efectelor glucozei, zaharozei, fructozei, manozei, melasei, etanolului în concentrații
de (w/v) 2% incluse în mediul de fermentație YPD și 3% – în mediul Rieder a demonstrat că pe
mediul de cultură YPD cantitățile de biomasă sun t semnificativ superioare celor obținute pe
mediul Rieder ( Figura 2.4a). De menționat că conținutul de carbohidrați totali pentru toate
sursele de carbon testate este mai înalt pe mediul Rieder comparativ cu mediul YPD. Maximul
de carbohidrați 71,64% – 65,92% la B.U. s-a obținut la suplimentarea mediului cu melasă sau
manoză (Figura 2.4b).

a) b)
Fig. 2.4. Efectul surselor de carbon asupra conținutului de biomasă (a) și carbohidrați (b) la
tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20.

Cantitatea de β-glucani în toate variantele mediului YPD are valori de 15,27…18,91% din
B.U., maximul fiind specific glucozei. În cazul cultivării levurii pe mediul Rieder conținutul de
β-glucani se află în limitele 14,16…19,85% la B.U., conținutul maxim s -a obținut în variantele de
mediu suplimentate cu glucoză, zaharoză și manoză ( Figura 2.5a).
Comparând randamentele de producere a β-glucanilor de către tulpina S. cerevisiae CNMN –
Y-20, putem afirma că etanolul, manoza și zaharoza incluse în mediul YPD au cel mai
semnificativ rezultat – 0,937…1,129 gL-1 mediu de cultivare ( Figura 2.5b). 012345678
Glucoza Zaharoza Fructoza Manoza Melasa Etanol Productivitatea,g/L B.U.
sursa de carbonYPD+ 2%carbohidrati RIEDER+3%carbohidrati
01020304050607080
Glucoza Zaharoza Fructoza Manoza Melasa Etanol carbohidrati, % S.U.
sursa de carbonYPD+ 2%carbohidrati RIEDER+3%carbohidrati

53 a) b)
Fig. 2.5. Efectul surselor de carbon asupra conținutului de β-glucani la tulpina
S. cerevisiae CNMN -Y-20.

Pentru optimizarea mediului de cultură sunt necesare experiențe de selectare a
concentrațiilor optime a sursei de carbon. În experiențele cu tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20,
au fost evaluate efectele diferitor concentrații, (w/v): 1%, 2%, 3%, 4%, 5% de glucoză adăugate
la mediul YPD și de zaharoză – la mediul Rieder.
Concentrațiile surselor de carbon au fost selectate din diferite informații bibliografice, care
indică că valorile mai mari de 6% pot reprima multiplicarea levurilor [17].
În cazul utilizări i diferitor concentrații de glucoză observăm o curbă în creștere atât a
biomasei, cât și a carbohidraților totali, sincronizată cu creșterea concentrațiilor sursei de carbon
de la 1% la 4% ( Figura 2.6a).
Același efect de stimulare s -a constat at în experiențele de evaluare a influenței diferitor
concentrații de glucoză asupra cantităților de β-glucani în biomasa tulpinii S. cerevisiae CNMN –
Y-20 (Figura 2.6b). Conținutul maximal de β-glucani (19,23 -19,8% la B.U.) s -a înregistrat în
variantele de mediu YPD cu 3-4% glucoză. Randamentul maxim de producere a β-glucanilor
exprimat la 1L de mediu s-a obținut la utilizarea glucozei în concentrație de 4%.
a) b)
Fig. 2.6. Efectul diferitor concentrații de glucoză asupra acumulării biomasei, carbohidraților
totali (a) și conținutului de β-glucani (b) la cultivare tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20 pe
mediul YPD. 0510152025
Glucoza Zaharoza Fructoza Manoza Melasa Etanol B-glucani, % S.U.
Sursa de carbonYPD+ 2%carbohidrati RIEDER+3%carbohidrati
00,20,40,60,811,21,4
Glucoza Zaharoza Fructoza Manoza Melasa Etanol B-glucani, g/l
Sursa de carbonYPD+ 2%carbohidrati RIEDER+3%carbohidrati
020406080100120140
1% 2%
martor 3% 4% 5%% la martor
Concentrația glucozeiBiomasa, g/L Carbohidrați, % la B.U

54 În continuare, în mod similar a fost studiat efectul diferitor concentrații de zaharoză , care
au substituit glucoza din mediul Rieder. În calitate de martor a servit mediul Rieder clasic cu 3%
de glucoză. Rezultatele sunt reflectate în Figura 2.7a, din care observăm o creștere a cantităților
de carbohidrați p ână la 60,14…63,0% la B.U. în variantele de mediu suplimentat cu 3, 4 sau 5%
zaharoză. Cantitatea de biomasă acumulată va riază în limitele 3,69…4,77 g L-1 mediu de cultură.
Aprecierea conținutului de β-glucani în biomasa us cată a evidențiat modificări nesemnificative în
dependență de concentrațiile zaharozei incluse în mediul de cultivare Rieder. Maximul
procentual 21,16% la B.U., cu 6,6% mai mult față de martor, s -a observat în varianta de mediu
cu 3% zah aroză, minimul proc entual 15,28 % la B.U. – în varianta cu 5% zaharoză. În probele
martor conținutul de β-glucani constituie 19,85 % la B.U. ( Figura 2.7b). Recalculul conțin utului
de β-glucani la 1 L mediu de cultură evidențiază superioritatea variantei experimentale în care
zaharoza s -a introdus în concentrația de 3%.
a) b)
Fig. 2.7. Efectul diferitor concentrații de zaharoză asupra acumulării biomasei, carbohidraților
totali (a) și conținutului de β-glucani (b) la cultivarea tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20 pe
mediul Rieder.

Din analiza comparativă a rezultatelor privitor la conținutul de β-glucani obținut pe mediile
YPD și Rieder se poa te afirma că pentru cercetările în vederea sporirii producerii de β-glucani
este oportună utilizarea mediului YPD cu conținutul de glucoz ă în concentrație de 4%, codificat
– YPD -4 sau a mediului Rieder cu aplicarea a 3% zaharoză, codificat Rieder -M.
Studiul ce urmează este consacrat evaluării acțiunii diferitor surse de azot . Azotul este un
element esențial pentru toate speciile de microorganisme și joacă un rol relevant într -o serie de
procese biologice implicate î n creșterea și dezvoltarea organismului. Sursa preferată de azot este
sulfatul de amoniu, utilizat practic de toate microorganismele [195].
În vederea identificării efecte lor azotului asupra acumulării biomasei, carbohidraților totali
și β-glucanilor la tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20 a u fost testate – sulfatul de amoniu 050100150200250
martor 1% 2% 3% 4% 5%% la martor
Concentrația zaharozeiBiomasa, g/L Carbohidrați, % la B.U
050100150200250
martor 1% 2% 3% 4% 5%% la martor
Concentrația zaharozeiβ-glucani, % S.U. β-glucani, g/L

55 (NH 4)2SO 4 și hidrogenofosfatul de diamoniu (NH 4)2HPO 4, în concentrație de (w/v): 0,1%; 0,2%;
0,3%; 0,4%; 0,5% la cultivarea levurii pe mediul YPD.
Analiza datelor obținute la determinarea conținutului de biomasă celulară a demonstrat
prezența unor cantități importante în variantele de mediu YPD suplimentat cu hidrogenofosfatul
de amoniu. Pentru concentrațiil e cercetate a sursei de azot s -au înregistrat valori de 5,75…6,61
gL-1 biomasă uscată, cu 20,8…38,9% mai mult față de martor. În varianta martor conținutul de
biomasă constituie 4,76 gL-1 (Figura 2.8a).

a) b)
Fig. 2.8. Efectul diferitor concentrații de azot asupra acumulării biomasei (a ) și sintezei
carbohidraților tota li (b) la cultivarea tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20 pe mediul YPD.

Pentru ambii compuși de azot implicați în cercetare au fost obținute rezultate
asemănătoare ce indică diminuarea conținutului de carbohidrați totali comparativ cu mediul
martor. Rezultatele obținute în cazul utilizării sulfatului de amoniu și cel al hidrogenofosfatului
de amoni u sunt reflectate în Figura 2.8b. Pentru toate concentrațiile utilizate ale com pușilor
azotați au fost obținute cantități de 33,12… 45,19% la B.U. carbohidrați totali, valori care sunt
inferioare martorului – 53,56% la B .U.
Privitor la conținutul de β-glucani în biomasa levurii, menționăm o deosebire
semnificativă pentru variantele de mediu YPD cu sulfat de amoniu comparativ cu cel obținut în
variantele cu hidrogenofosfat de amoniu.
Cantitatea de β-glucani în toate variantele de mediu suplimentate cu sulfat de amoni u
ating valori de 15,19…19,58 % la B.U ., față de 8,22…13,73 % la B. U. obținute în experimentele
cu hidrogenof osfatul de amoniu și au tendință de diminuare odată cu creșterea concentr ației
sursei de azot (Figura 2.9a). Deoarece conținutul procentual al β-glucanilor în biomasa uscată
este mai mic în vari antele experimentale comparativ cu martorul, concluzionăm că odată cu
activizarea procesului de multiplicare a levurii, biosinteza princ ipiilor bioactive, în special a 02468
0,10% 0,20% 0,30% 0,40% 0,50% Martor
YPD
clasicBiomasa, % S.U.Sulfat de amoniu Fosfatul de diamoniu
0102030405060
0,10% 0,20% 0,30% 0,40% 0,50% Martor
YPD
clasicCarbohidra ți, % S.U.Sulfat de amoniu Fosfatul de diamoniu

56 carbohidraților totali și a β-glucanilor, se diminuează, astfel se obțin cantități mari de biomasă cu
conțin ut mic de β-glucani.
Cercetările, rezultatele căro ra sunt reflectate în Figura 2.9b, confirmă concluzia că
utilizarea surselor de azot, implicit a sulfatului de amoniu sau hidrogenofosfatului de amoniu,
duce la diminuarea e ficienței mediului de cultură la produce rea β-glucani lor.

a) b)
Fig. 2.9. Efectul diferitor concentrații de azot amoniacal asupra conținutului de β-glucani la
cultivarea tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20 pe mediul YPD.

În baza cercetărilor efectuate putem afirma că din sursele de azot testate, numai
hidrogenofosfatul de amoniu asigură rentabilitate mediului de cultivare YPD pentru tulpina S.
cerevisiae CNMN -Y-20, datorită creșterii esențiale, cu 20,8…38,9% față de mediu l martor, a
producerii de biomasă celulară. Sulfatul de amoniu și hidrogenofosfatul de amon iu în
concentrații de 0,1…0,5 %, diminuează semnificativ conținutul de carbohidrați totali și β-glucani
la tulpina de levuri comparativ cu mediul martor.
Este cunoscut că sărurile minerale joacă un rol deosebit în procesele de biosinteză și se
evidențiază prin aceea că acești compuși pot reprezenta surse de elemente co nstitutive,
intermediari ai reacțiilor de oxido -reducere, reglatori ai permeabilității mem branelor celulare,
cofactori ai sistemelor enzimatice – metaloe nzime. Sărurile furnizoare de microelemente sunt de
obicei sulfații, fosfații, nitrații, acetații [17]. Un element important în metabolismul
microorganismelor este zincul, semnificativ pentru activitatea enzimelor zinccomponente.
În experiențele noastre s -a urmărit influența acetatului de zinc asupra producerii β-
glucanilor la tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20. Compusul s -a adăugat în c oncentrații de 5, 10,
20, 30 mg L-1 medii nutritive : YPD -4 – YPD modific at (glucoza 4 %) și Rieder -M – Rieder
modificat (glucoza substituită cu 3% zaharoză). În calitate de martor au servit mediile enunțate
fără completarea cu acetat de zinc. 051015202530
0,10% 0,20% 0,30% 0,40% 0,50% Martor
YPD
clasicB-glucani, % S.U.Sulfat de amoniu Fosfatul de diamoniu
00,20,40,60,811,21,4
0,10% 0,20% 0,30% 0,40% 0,50% Martor
YPD
clasicB-glucani, g/lSulfat de amoniu Fosfatul de diamoniu

57 Analiza rezultatelor a arătat, că efectul acetatului de zinc este variabil și depinde de
concentrați e și mediul de cultivare. Spre exemplu, acetatul de zinc în c oncentrații de 5, 10, 20, 30
mgL-1 mediu de cultură YPD -4 și Rieder -M micșorează nesemnificativ conținutul de biomasă și
carbohidrați, co mparativ cu martorul (Figura 2.10). Valorile conținutului de biomasă uscată în
variantele experimentale cu mediul YPD -4 constituie 5,36.. .5,62 g L-1 (Figura 2.10a). Majorarea
concentrațiilor de acetat de zinc adăugat la mediul YPD -4 a determinat diminuarea conținutului
de carbohidrați tota li de la 46,93 (varianta cu 10 mg L-1 acetat de zinc) la 43,97 % la B.U.
(varianta cu 30 mg L-1 acetat de zinc) .
În cazul culti vării tulpinii pe mediul Rieder -M, la care s -au adăugat diferite concentrații de
acetat de zinc, biomasa celulară constituie 1,24…1,81 gL-1, în variant a martor – 2,0 gL-1.
Carbohidrații totali mențin aceiași tendință de micșorare a conținutului lor legată de sporirea
concentrațiilo r de acetat de zinc (Figura 2.10b).

a) b)
Fig. 2.10. Influența acetatului de zinc asupra acumulării biomasei și carbohidraților la tulpina S.
cerevisiae CNMN -Y-20 la cultivare pe mediul YPD -4 (a) și Rieder -M (b).
Legenda: martor I – mediul Rieder, martor II – mediul M -4086 .

Efect simila r al acetatului de zinc a fost î nregistrat în studiul conținutului de β-glucani la
cultivarea tulpinii pe mediul YPD -4. Cantitatea de β-glucani în variantele de mediu completat cu
compusul studi at este inferioară martorului cu 5,8 -11,4% (Figura 2.11a). Deaceea în continuare
pentru cercetări a fost folosit mediu l YPD -4.
Un aspect total diferit prezintă datele obținute ca rezultat al studiului de evaluare a
influenței acetatului de zinc asupra conținutului de β-glucani la cultivarea tulpinii pe mediul
Rieder -M. La cultivarea tulpinii pe mediul nominalizat se constată că acetatul de zinc stimulează
biosinteza β-glucanilor. Valorile maximale ale conținutul ui acestora constituie 23,38…27,46 % la
B.U., ceea ce este cu 23,4…44,1% mai mult față de martor ( Figura 2.11 b). De rând cu efectul 4142434445464748
01234567
Martor 10 mg/l 20 mg/l 30 mg/l
Carbohidra ți, % S.U .Biomasa , g/l
Concentra ția acetatului de zincBiomasa, g/l Carbohidra ți, % B.U.
0102030405060
00,511,522,533,544,5
Martor I Martor II 5 mg/l 10 mg/l 20 mg/l 30 mg/l
Carbohidra ți, % S.U.Biomasa, g/l S.U.
Сoncentra ția acetatului de zincBiomasa, g/l Carbohidra ți, % B.U.

58 stimulator exercitat asupra conținutului de β-glucani în biom asa levurii, dozele 10 și 20 mg L-1
acetat de zinc intensifică randamentul mediului de cultură, obținându -se până la 0,440 gL-1 β-
glucani.

a) b)
Fig. 2.11. Influența acetatului de zinc asupra conținutului de β-glucani la tulpina
S. cerevisiae CNMN -Y-20 la cultivare pe medi ile modificate YPD -4 (a) și Rieder -M (b).

Reieșind din aceste considerente, r ezultatele experiențelor monofactoriale pentru toți
compușii mediului de nutriție au fost supuse analizei statistice și regresionale. După prelucrarea
rezultatelor, pentru mediul Rieder, au fost evidențiați 2 factori esențiali: zaharoza și acetatul de
zinc (CH 3COO) 2Zn), care pot influența semnificativ biosi nteza β-glucanilor.
Rezultatele acestor investigații au stat la baza optimizării matematice a mediului de cultură
pentru levura S. cerevisiae CNMN -Y-20 în vederea obținerii conținutului maximal de β-glucani.
Optimizarea mediului de nutriție în scopul obținerii unei cantități maximale de β-glucani a
fost efectuată în câteva etape consecutive: experiența conform planului „Experiența factorială
fracționată (EFF 22 )”, în timpul căreia se determină direcția varier ii concentrației factorilor (spre
mărirea sau micșorarea concentrației) și experiența conform planului „Mișcarea pe gradient”, în
timpul căreia se alege cea mai reușită combinație a factorilor esențiali și neesențiali.
Evidențierea factorilor cu efecte ese nțiale în procesul de acumulare a β-glucanilor a fost
efectuată în câteva trepte, utilizând metoda balanței aleatoare. La fiecare treaptă s -au selectat
efectele cu valoare esențială.
Inițial a fost elaborat planul experienței factoriale fracționate EFF 22 (Tabelul 2.1).
După rezultatele experienței EFF 22 au fost calculați coeficienții de regresie după
algoritmul Iets [17] (Tabelul 2.2). Pe baza coeficienților de regresie calculați a fost alcătuită
ecuația de regresie, care are expresia: Y= 24,10 – 0,482 X 1 + 1,647 X 2 – 2,117 X 1X2.
În corespundere cu ecuația dată a fost montată experiența „Mișcarea pe gradient”, conform
planului din Tabelul 2.3. 020406080100120
martor 10 mg/l 20 mg/l 30 mg/l% la martor
Concentrația acetatului de zincβ-glucani, % S.U. β-glucani, g/L
020406080100120140160
martor 5 mg/l 10 mg/l 20 mg/l 30 mg/l% la martor
Concentra ția acetatului de zincβ-glucani, % S.U. β-glucani, g/L

59 Tabelul 2.1. Informația inițială despre factori
Componenta
mediului Codific a
rea Concentrația componentelor Pasul de
variație,
λ(i) Minimă
– 1 Baza
0 Maximă
+ 1
Zaharoza, g L-1 X1
30 35 40 5
Acetat de zinc,
mgL-1 X2 10 15 20 5
Tabelul 2.2. Calcularea coeficienților de regresie după schema Iets
Planul
experienței
Rezultate
experimentale
(Y)
β-glucani, %
la S.U. Calculul efectelor Coeficientul
liniar de
regresie,
b(i)
Pasul 1 Pasul 2
X1 X2
– – 20,82 Y1+Y 2 = 44,91 Y1+Y 2 + Y 3+Y 4 = 96,41 24,10
+ – 24,09 Y3+Y 4 = 51,5 -Y1+Y 2 – Y3+Y 4 = – 1,93 – 0,482
– + 28,35 Y2-Y1 = 3,27 -Y1-Y2 + Y 3+Y 4 = 6,59 1,647
+ + 23,15 Y4-Y3 = – 5,27 Y1-Y2 – Y3+Y 4 = – 8,47 – 2,117
Tabelul 2.3. Planul experiențelor „Mișcarea pe gradient”
Valorile Factorii Biomasa
uscată, g
L-1. β-glucani, %
la B.U. Zaharoza,
X1 Acetat de zinc,
X2
Coeficient liniar de
regresie, b(i) – 0,482 1, 647
Unități de variație
λ(i) 5 5
b(i) ∙ λ(i) – 2,41 8,235
Coeficient de
proporționalitate, K i
1 b(i) · λ(i)x 2/ b(i) ·
λ(i)x 1
– 3,42
Pasul pantei
maximale, H(i) 2 -3,42 ·2=-6,84
Baza experimentului 35 15
Concentrația gL-1 mgL-1
1 35,0 15,0 1,72±0,13 23,59±0,46
2 37,0 8,16 1,73±0,01 29,47±0,52
3 39,0 1,4 1,73±0,08 29,25±0,08
4 41,0 0 1,91±0,01 29,16±0,61
5 43,0 0 1,97±0,01 25,86±0,73

Notă * b(i) – coeficientul de regresie; λ(i) – unități de variație; H(i) – pasul ascendenței.

60 Conform datelor din Tabelul 2.3 nivelul maximal de sinteză a β-glucanilor (29,47±0,52%
la B.U.) pentru tulpina S. cer evisiae CNMN -Y-20 este determinat de următoarea componență
cantitativă a mediului nutritiv, g L-1: zaharoză – 37,0; (NH 4)2SO 4 – 3,0; MgSO 4•7H 2O – 0,7; NaCl
– 0,5; Ca(NO 3)2 – 0,4; KH 2PO 4 – 1,0; acetat de zinc – 0,00816; autolizat de levuri – 10 ml; apă
potabilă – 1L; pH- 5,0-6,0. Mediul optimizat a fost numit convențional R -ZZ [13].
Cantitatea netă de β-glucani pe mediul optimizat R -ZZ este de 0,510±0,01 gL-1.
Mediul martor Rieder asigură obținerea a 22,36±0,57 % β-glucani, iar mediul M -4086 –
12,61±0,45 % β-glucani. Cantitatea netă de β-glucani pe mediul Rieder este de 0,467±0,02 gL-1,
iar pe mediul M -4086 este de 0,501±0,02 gL-1 [5]. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 2.4.

Tabelul 2.4. Conținutul de β-glucani, carbohidrați și biomasă la cultivarea tulpinii S. cerevisiae
CNMN -Y-20 pe difer ite medii nutritive
Componente
evaluate Mediul optimizat
R-ZZ Mediul Rieder
(martor I) Mediul
M-4086
(martor II)
β-glucani, % în
peretele celular 29,47±0,52 22,36±0,57 12,61±0,45
β-glucani, g L-1 mediu
de cultură 0,510±0,01 0,467±0,02 0,501±0,02
Carbohidrați totali, %
la B.U. 41,97±0,4 35,38±0,34 36,99±0,05
Biomasa uscată, g L-1
mediu de cultură 1,73±0,011 2,09±0,03 3,97±0,04

Astfel, prin analiza regresională au fost determinate concentrațiile optime a sursei de
carbon (zaharozei) și acetatului de zinc în componența mediului nutritiv pentru spori rea cantității
de β-glucani la tulpina de levuri S. cer evisiae CNMN -Y-20.
Cercetările efectuate au finalizat cu elaborarea unui nou mediu de nutriție – R-ZZ pentru
cultivarea levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20 care permite obținerea până la 29,47±0,52% β-
glucani în bio masa usca tă, față de 22,36±0,57 % în mediul mart or Rieder.

2.4. Influența temperaturii, aerației și duratei de cultivare asupra biosintezei β-glucanilor
la tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20
O influență semnificativă asupra creșterii și metabolismului microo rganismelor o au
condițiile de cultivare. Temperatura, pH -ul, aerația, durata procesului de cultivare determină

61 activitatea fiziologică a microorganismelor și acționează asupra compoziției biochimice a
acestora [66, 82, 228, 233 ].
Se știe că procesul de cr eștere al levurilor este deosebit de sensibil la temperatură. Sub
acțiunea temperaturii se modifică durata etapelor de dezvoltare a microorganismului – lag-fazei,
fazei exponențiale, fazei staționare și a termen ilor de manifestare a activității biochimice –
biosintezei enzimelor, proteinelor și altor substanțe biologic active [60]. La temperatur i extreme,
mecanismele de reglare ale celulei sunt afectate, astfel că randamentul producerii principiilor
bioactive se modifică. De exemplu, la aceeași tulpină pentru creșterea masei celulare este
necesară o anumită temperatură optimă, iar pentru producerea principiilor bioactive sunt
necesare alte valori de temperatură [16]. Diferite valori de temperatură pot influența procesele de
biosinteză a carbohid raților, în special a β-glucanilor, astfel prin cultivarea dirijată a tulpinii de
levuri se pot obține β-glucani cu structură programată.
Pentru selectarea valorilor de temperatură adecvate biosintezei β-glucanilor la tulpina S.
cerevisiae CNMN -Y-20 s-a studiat influența a 4 regimuri termice – 15, 20, 25 , 30°C. Cultivarea
s-a realizat submers în baloane Erlenmeyer cu volumul de 100 ml pe agitator rotativ (200
rot/min ). Probele au fost prelevate la 120 ore de cultivare. Celule se recuperează prin
centrifugare la 3000 rot/min , timp de 15 minute. Ulterior s -a determinat cantitatea de biomasă, de
carbohidrați totali și β-glucani. În rezultatul cercetărilor s -a stabilit, c ă temperatura optimă pentru
multiplicarea celulelor este de 15…25 °C la care tulpina timp de 120 ore acumulează o cantitate
maximă de biomasă. Majorarea temperaturi i de cultivare până la 30șC induce o încetinire a
procesului de multipl icare a levurii (Fig ura 2.12a). Faptul poate fi explicat prin creșterea
esențială în celulele de levuri , la cultivare a la temperaturi elevate, a concentrației compușilor
toxici reprezentați de formel e active a le oxigenului (anionul superoxid (O 2-), peroxidul de
hidrogen (H 2O2) și radicalii hidroxili (OH-). Formarea acestor compuși duce la distrugerea
membranelor, denaturarea proteinelor și ADN -ului și moartea celulelor [94, 236].
a) b)
Fig. 2.12. Efectul temperaturii de cultivare asupra acumulării biomasei, carbohidraților totali (a)
și β-glucanilor (b) la tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20. 01020304050
00,511,522,533,5
15 20 25 30
Carbohidrați, % la B.U.Biomasa uscată, g/L mediu
temperatura, Cbiomasa uscată, g/L carbohidrați, % la B.U.
00,20,40,60,81
05101520253035
15 20 25 30
β-glucani, g/L mediuβ-glucani, % la B.U.
temperatura, Cglucani, % la B.U. glucani, g/L mediu

62 Cu toate că tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20 a manifestat activitate maximală la cultivare
în regimul de 30°C (Figu ra 2.12), calculul pentru cantitatea netă de β-glucani la 1 L mediu de
cultură arată, că productivitate sporită a tulpinii (0,792 g/L) poate fi obținută la cultivarea în
regimul de 25 °C (Figura 2.12b).
Unul din factorii decisivi ai procesului de dezvoltare a microorganismelor aerobe este
alimentarea cu oxigen. Neces arul de ox igen pune problema dizolvării acestuia în mediu cu o
viteză care să corespundă cerințelor față de oxigen ale microorganismului aflat la o viteză
maximă de creștere. Viteza de dizolvare a oxigenului depinde de temperatură, de concentrația
unor componente ale mediul ui, în special al zaharurilor. Numeroase investigații efectuate de
cercetători au evidențiat faptul, că la concentrații mari de zahăr, inhibiția creșterii se datorează
stresulu i osmotic ce influențează procesele legate de difuzie și deshidratare. Pe de altă parte,
pornind de la aceeași cantitate de glucoză, dar în condițiile unei oxigenări puternice, se produce o
cantitate mul t mai mare de cel ule decât în condiții de oxigenare r edusă [16]. Prezența unei
concentrații mari de glucoză, în condițiile unei oxigenări puternice, duce la inhibarea sintezei
citocromilor a, b, c și, ca urmare, la represia respirației celulare. Aceasta afectează metabolismul
celulelor, deoarece NADH acumula t inhibă sistemul piruvat dehidrogenazic, ceea ce determină
încetarea activității ciclului Krebs, represia fosforilării oxidative, inhibarea producerii de ATP și
afectarea transportului transmembranar al glucozei [16]. Acest efect prezintă o importanță
deosebită în performanța proceselor biotehnologice.
Pornind de la aceste premi ze, cercetările experimentale ulterioare s -au axat pe elucidarea
efectelor influenței gradului de aerare a mediului de cultivare asupra biosintezei β-glucanilor la
tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20. Tulpina a fost cultivată pe mediul nutritiv R -ZZ optimizat.
Influența oxigenului dizolvat asupra procesului de biosinteză s -a urmărit în condiții de cultivare
pe agitator (200 rot/min) și staționar la temperatura de 25 °C, durata de cultivare – 120 ore.
Gradul de aerare, în condițiile cultivării submerse în baloane Erlenmeyer, a fost modificat
prin varierea volumului baloanelor: 1) baloane cu capacitatea 0,25 L ce conțin 0,15 L mediu
nutritiv, 2) baloane cu capacitatea 0,50 L ce conțin 0,15 L mediu nutritiv, 3) baloane cu
capacitatea 0,75 L ce conțin 0,15 L mediu nutritiv, 4) baloane cu capacitatea 1,0 L ce conțin 0,15
L mediu nutritiv. Ca martor a servit aceleași variante cultivate staționar. Rezultatele variaților
conținutul ui de oxigen molecular determinat la 120 ore de cultivar e sunt reflectate în Figura
2.13.
Cercetările au demonstrat că la cultivarea tulpinii în co ndiții de agitare conținutul de
biomasă, carbohidrați și β-glucani este semnificativ mai mare comparativ cu cel obținut în

63 condiții de staționare, în care conținutul de oxigen este redus și constituie 3,4…9,8 mg/L (Figura
2.14) .

Fig. 2.13. Conținutul de oxigen molecular în variantele experimentale și martor la
cultivarea tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20.
Legenda : Variante: 1 – baloane cu capacitatea 0,25 L; 2 – baloane cu capacitatea 0,5 L; 3
– baloane cu capacitatea 0,75 L; 4 – baloane cu capacitatea 1,0 L.

Pentru multiplicare și biosinteza carbohidraților, inclusiv a β-glucanilor este optimă
cultivarea tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20 în baloane cu capacitatea de 0,75 -1,0 L, gradul de
aerare fiind mai mare (81,3…83,3 mg O2/L), grație faptului că se mărește suprafața de contact al
fazei lichide cu aerul. În aceste condiții conținutul de β-glucani constituie 0,674 g/L mediu de
cultură, față de 0,424 g/L calculat în varianta cultivării staționare (Figura 2.14).
a) b)
c) d)
Fig. 2.14. Efectul gradului de aerare asupra acumulării biomasei (a), carbohidraților (b) și
β-glucanilor (c, d) la tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20.
Legenda : variante – 1) baloane cu capacitatea 0,25 L ; 2) baloane cu capacitatea 0,50 L ;
3) baloane cu capacitatea 0,75 L ; 4) baloane cu capacitatea 1,0 L. 020406080100
1 2 3 40xigen , mg/L
varianteaerație staționar
0123
1 2 3 4biomasa uscată, g/L
varianteaeratie stationar
01020304050
1 2 3 4carbohidrați, % la B.U.
varianteaerație staționar
010203040
1 2 3 4β-glucani, % la B.U.
varianteaeratie stationar
00,20,40,60,8
1 2 3 4β-glucani, g/L mediu de
cultură
varianteaerație staționar

64 În continuare s -a studiat influența duratei de cultivare a tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20
asupra biosintezei β-glucanilor. În baza studiului bibliografic s -a constatat că sinteza unui anumit
produs la levuri este asociată cu fazele de dezvoltare. Din aceste considerente este important de a
stabili pentru tulpina selectată relațiile dintre procesul de multiplicare și biosinteză a β-glucanilor
în dinamică.
Cercetările au fost efectuate la cultivarea tulpinii pe mediu l nutritiv optimizat R -ZZ la
temperatura de 25 °C, pe agitator rotativ (200 rot/min ) și concentrația O2 de la 80,3… 85,0 mg/L,
durata cultivării – 7 zile. La fiecare 24 ore de cultivare au fost prelevate probe pentru a stabili
acumularea biomasei celulare, conținutul de carbohidrați totali și de β-glucani.
Datele ce reflectă dinamica acumulării biomasei, carbohidraților totali și β-glucanilor de
către tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20 sunt prezentate în Figura 2.15.
a) b)
Fig. 2.15. Dinamica acumulării biomasei, carbohidraților totali (a) și β-glucanilor (b) la
tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20.

S-a constatat că acumularea biomasei este intensă în primele 48 ore de cultivare, după care
acest proces se stabilizează și după 72 ore de la începutul procesului de dezvoltare se intensifică
acumularea de glucide în celule (Figura 2.15a). Majorarea conțin utului de carbohidrați în
biomasă în faza respectivă de dezvoltare a levurilor poate fi explicată prin diminuarea
conținutului de azot în mediu, fapt ce duce la stoparea proceselor de multiplic are și biosinteza
activă a componentelor celulare și poate fi c onsiderată o adaptare la conținutul mediului nutritiv.
Aceste date corelează cu datele altor autori [ 150].
O acumulare semnificativă a β-glucanilor în peretele celular la tulpina S. cerevisiae
CNMN -Y-20 se produce peste 96 ore de cultivare submersă, valori care practic nu se modifică
pe parcursul următoarel or ore de cultivare (Figura 2.15b). Conținutul maximal al β-glucanilor
0,559 g/L se observă la 120 ore de cultivare a levurii. 01020304050
00,511,522,53
48 72 96 120 144 168
carbohidrați, % la B.U.biomasa uscată, g/L
durata de cultivare, orebiomasa uscată, g/L carbohidrați, % la B.U.
00,10,20,30,40,50,60,7
05101520253035
48 72 96 120 144 168
β-glucani, g/L mediuβ-glucani, % la B.U.
durata de cultivare, oreglucani, % la B.U. glucani, g/L mediu

65 Influența pH -ului asupra proceselor de creștere și biosinteză la microo rganism e este
complexă. Într -un ciclu de cultivare, pH -ul optim în faza de creștere a masei celulare are o
valoare, iar în faza de sinteză a produsului o altă valoare. Deci, în cele două etape tehnologice,
trebuie asigurate valori optime diferite pentru pH . Din aceste considerente, în timpul procesului
de creștere este necesar ca pH -ul mediului de cultură să fie permanent monitorizat.
Modificarea pH -ului mediului de cultivare inițial 5,5 observat pe durata creșterii tulpinii S.
cerevisiae CNMN -Y-20 este ref lectată în Figura 2.16.

Fig. 2.16. Modificarea pH-ului mediului de cultivare pe durata ciclului vital a tulpinii
S. cerevisiae CNMN -Y-20 pe mediul R -ZZ.

S-a constatat că tulpina posedă un puternic mecanism de reglare a pH -ului mediului de
cultură. Stabilizarea valorilor pH -ului se produce după 48 ore de cultivare. Conținutul maximal
de biomasă determinat în primele 48 ore de cultivare (Figura 2.16) poate fi caracterizat ca unul
pozitiv deoarece la etapele ulterioare de dezvoltare, când pH mediului d e cultivare scade, se
înlătură posibilitatea de contaminare bacteriană.
Astfel, ca rezultat al studiului efectuat asupra influenței diferitor parametri de cultivare a
levurii, s -a stabilit că temperatura favorabilă pentru producerea β-glucanilor este de 25 °C,
valoarea optimă a concentrației oxigenului dizolvat în mediul de cultură – 81,3…83,3 mg/L,
durata optimă de cultivare a tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20 este 120 ore.

2.5. Procedeu de sporire a conținutului de β-glucani la tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20 cu
aplicarea mediului nutritiv și condițiilor de cultivare optimizate
Cercetările de optimizare a compoziției mediului nutritiv și a condițiilor de cultivare au
permis de a elabora un procedeu de sporire a conținutului de β-glucani având ca obiec t
biotehnologic tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20, care poate fi realizat în mai multe variante. 01234567
inițial 24 48 72 96 120 144 168pH
durata de cultivare, orepH

66 a) Procedeu de cultivare a tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20 pe mediu R -ZZ.
Procedeul se realizează în următorul mod:
Se prepară mediul nutritiv R -ZZ cu următoarea componență (gL-1): zaharoză – 37,0;
(NH 4)2SO 4 – 3,0; MgSO 4•7H 2O – 0,7; NaCl – 0,5; Ca(NO 3)2 – 0,4; KH 2PO 4 – 1,0; acetat de zinc –
0,00816; autolizat de levuri – 10 ml; apă potabilă – 1 L; pH – 5,0-6,0. Mediul se inoculează cu
celule de levuri cultivate pe must de bere cu vârsta de 48 ore . Materialul semincer cu densitatea
2×106 celule/ml se introduce în volum de 5% din volumul mediului nutritiv și se cultivă pe
agitator (200 rot/min ), la temperatura de 25 °C, valoarea optimă a concentrației O2 – 81,3.. .83,3
mgL-1, pe parcursul a 120 ore .
Biomasa se colectează prin centrifugare, se supune autolizei urmată de efectuarea
analizelor biochimice de rigoare și standardizarea bioprodusului după conținutul de β-glucani.
Proce deul asigură obținerea a 2,18± 0,38 g L-1 biom asă uscată, care conține 28,74± 0,96% la
B.U. β-glucani. Cantitatea netă de β-glucani care se obține la aplicarea ace stui procedeu este de
0,620± 0,086 gL-1 mediu de cultură (Tabelul 2.5).

Tabelul 2.5. Indicii bioproductivi ai tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20 la
cultivare cu utilizarea me diului R -ZZ
Indici bioproductivi Procedeu nou
Procedeu cunoscut
Avantajul
procedeului
nou, %
Biomasa uscată, g/L 2,18±0,38 2,09±0,03
4,3
Carbohidrați totali, %
la B.U. 37,65± 2,88 35,38±0,34 6,4

β-glucani, % la B.U. 28,74±0,96 22,36±0,57 28,5

β-glucani, g/L mediu
de cultură 0,620±0,086 0,467±0,02 32,8

Procedeul standard cu utilizarea mediului clasic R ieder permite obținerea a 2,09± 0,03 gL-1
biomasă uscată, 22,36± 0,57% la B.U. β-glucani. Cantitatea netă de β-glucani care se obține la
aplicarea acestui procedeu este de 0,467± 0,02 gL-1 mediu de cultură.
Avantajul procedeului elabor at constă în producerea cu 32,8 % mai mult β-glucani la 1 L
mediu de cultură [22].

67 b) Procedeu de cultivare a tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20 pe mediu YPD -4.
Procedeul se realizează în următorul mod:
Se prepară mediul nutritiv YPD -4 cu următoarea componență (gL-1): 1% extract de levuri ,
2% peptonă, 4% glucoză, apă potabilă – 1 L, pH – 5,0-6,0. Mediul se inocul ează cu celule de
levuri cu vârsta de 48 ore cultivate pe must de bere. Materialul semincer cu densitatea 2×106
celule/ml se introduce în volum de 5% din volumul mediului nutritiv și se cultivă pe agit ator
(200 rot/min ), la temperatura de 25 °C, valoarea optimă a concentrației O2 – 81,3.. .83,3 mgL-1,
pe parcursul a 120 ore.
Biomasa se colectează prin centrifugare și se supune autolizei urmată de separarea β-
glucanilor din pereții celulari.
Procedeul asigură obținerea a 5,8±0,17 g L-1 B.U., care conține 45,35±0,51 % din B.U .
carbohidrați totali și 19,8±1,64 % la B.U. β-glucani. Cantitatea netă de β-glucani care se obține la
aplicarea acestui procedeu este de 1,14±0,07 gL-1 mediu de cultură.
Procedeul standard cu utilizarea mediului clasic Y PD permite obținerea a 3,91±1,06 gL-1
biomasă uscată, 19,06±0,09 % la B.U. β-glucani. Cantitatea netă de β-glucani care se obține la
aplica rea acestui procedeu este de 0, 748±0,207 g L-1 mediu de cultură (Tabelul 2.6).

Tabelul 2.6. Indicii bioproductivi ai tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20 la
cultivare cu utilizarea me diului YPD -4
Indici bioproductivi Procedeu nou
Procedeu cunoscut
Avantajul
procedeului
nou, %
Biomasa uscată, g/L 5,8±0,17 3,91±1,06 48,7
Carbohidrați totali, %
la B.U. 45,35±0,51 40,93±0,92 10,8

β-glucani, % la B.U. 19,8±1,64 19,06±0,09 3,9

β-glucani, g/L mediu
de cultură 1,14±0,07 0,748±0,207 52,4

Avantajele procedeului elabor at constau în producerea cu 48,7 % biomasă uscată și cu
52,4% mai mult β-glucani la 1 L mediu de cultură.
Astfel, analiza comparativă a rezultatelor obținute cu datele din literatura de specialitate
[47, 48, 128] ne permite să afirmăm că procedeul elaborat de sporire a biosintezei β-glucanilor în

68 biomasa de S. cerevisiae CNMN -Y-20 asigură obține rea unor cantități considerabile de acest
compus cu valoare fiziologică înaltă. Datorită simplității etapelor de realizare, procedeul de
sinteză orientată a β-glucanilor de către tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20 poate fi încadrat cu
succes în fluxurile tehnologice de producere industrială.

2.6. Concluzii la capitolul 2
1. Procedeul de dezintegrare a celulelor cu aplicarea omogenizării biomasei celulare timp de
10 minute asigură un grad de distrugere a pereților celulari de 95 %. Aplicarea procedeului
dat în îmbinare cu tratarea alcalin -acidă sporește cu 34,5 % conținutul de β-glucani extrași
din pereții celulari levurieni și reduce durata de extragere cu 24 ore comparativ cu
procedeul martor [19].
2. Din sursele de carbon investigate capacitate maximă de a spori acumularea β-glucanilor în
biomasa tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20 posedă glucoza și zaharoza. Biosinteză sporită
de β-glucani s -a înregistrat la cultivar ea tulpinii pe mediu l YPD completat cu 3 -4%
glucoză și mediul Rieder completat cu 3% zaharoză [21].
3. Sulfatul de amoniu și hidrogenofosfatul de amoniu în concentrații de 0,1…0,5% ,
suplimentat la mediul YPD, diminuează semnificativ conținutul de β-glucani la tulpina de
levuri S. cerevisiae CNMN -Y-20. Eficiența hidrogenofosfatului de amoniu a fost
demonstrată numai pentru acumularea biomasei celulare, care a sporit cu 38,9% față de
martor [21].
4. Acetatul de zinc în concentrații de 5 -30 mg/ L, adăugat la mediul de cultură Rieder -M,
asigură sporirea cu 23…44,1% față de martor a conținutului de β-glucani în biomasa S.
cerevisiae CNMN -Y-20 [21].
5. Aplicarea metodelor matematice de planificare a experiențelor a permis de a elabora un
mediu nutritiv , cu aplicarea concentrațiilor optime ale acetatului de zinc și zaharozei ,
codificat R -ZZ. Mediul nutritiv elaborat asigură o sinteză sporită a β-glucani lor cu 31,8%
față de martor [13].
6. Condițiile optime pentru biosinteza β-glucanilor la tulpina S. cerevi siae CNMN -Y-20,
cultivată pe mediile elabor ate sunt: temperatura de 25 °C, gradul de aerare 81,3…83,3
mg/L, durata d e cultivare submersă 120 ore [22].
7. Procedeul elaborat, bazat pe utilizarea mediilor nutritive R -ZZ și YPD -4, condițiil or de
cultivare optimizate, permit e obținerea a 0,620 și respectiv 1,14 gL-1 β-glucani, ce este cu
32,8 respectiv 52,4% mai mult com parativ cu procedeele cunoscute [22].

69 3. POTENȚIALUL BIOTEHNOLOGIC A LEVURII SACCHAROMYCES CEREVISIAE
CNMN -Y-20 SUB INFLUENȚA NANOPARTICULELOR OXIZILOR METALICI
Dezvoltarea științei și tehnologiei în ultimul deceniu se caracterizează prin studii intensive
asupra proprietăților obiectelor nanodimensionale și prin elaborarea diferitor tehnologii de
aplicare a acestora în practică. Analiza amplă și generalizarea literaturii de specialitate efectuată
în capitolul 1, evidențiază perspectiva utilizării nanoparticulelor în calitate de reglatori ai
creșterii și stimulatori a indicilor productivi și biosintetici a i microorganismelor, în sp ecial a i
levurilor.
Perspective biotehnologice privind apl icarea nanoparticulelor ZnO în diferite domenii sunt
menționate în publicațiile [199, 258] în care este descris rolul acestora în produsele cosmetice, în
procesul de preven ire a toxi infecțiilor alimentare datorat activității antimicrobiene a diferitor
nanoparticule, etc. Este de menționat faptul că nanoparticulele ZnO în concentrații mai mari de
50 mg/L sunt toxice pentru S. cerevisiae [92].
Zincul este un microelement strict necesar pentru structura, multiplicarea, creșterea și
dezvoltarea levurilor, ce întră în compoziția a cca 300 enzime, ce mediază procesele metabolice,
sinteza AND, ARN -ului și proteine lor [229]. În lucrările mai multor autori sunt expuse
rezultatele influenței diferitor nanoparticule (oxizi ai Au, Ag, Ti, Si, Zn) asupra celulei
microbiene din care concluzionăm că acestea, în dependență de structură și concentrație, pot
stimula sau inhiba creșterea și activitatea biosintetică a microorganismelor [59, 109].
Un alt tip de nanopa rticule cu efect reglator sunt cele ale dioxidului de titan. Comparativ cu
alti agenți antimicrobieni, TiO 2 merită atenț ie datorită stabilitații înalte, toxicității joase pentru
mediul ambiant, costului relativ mic, activități i biologice , etc. Posibile mecanisme de influență a
nanoparticulelor TiO 2 la nivel celular au fost cercetate de către mai mulți specialiști în domeniu
care au elucidat unele proces e ce au loc în cazul aplicării nanoparticulelor [110, 178] . Conform
rezultatelor din literatu ra de specialitate, concentrația minim inhibitorie (MIC – minimum
inhibitory concentration) a nanoparticulelor variaz ă în dependență de microorganismul cercetat.
Spre exemplu, pentru Escherichia coli și Candida albicans MIC a nanoparticulelor TiO 2
constituie 9,7 µg ml-1, iar pentru Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus
subtilis MIC este de 19,0 -19,5 µg ml-1 [204] .
În general, schimbările în starea fiziologică a celulei și reacția la influența factorilor externi
sunt legate de stru ctura și dinamica peretelui celular. Conform cercetărilor Ya-Nan Chang [269 ],
mecanismul de influență a nanoparticulelor CuO și ZnO asupra celulei microbiene este complex
și atrage asupra sa modificări atât în membrana celulară cât și în citoplasmă.

70 Așadar, a plicarea nanoparticulelor anorganice la cultivarea microorganism elor prez intă un
domeniu relativ nou, puțin explorat în cercetările de nanobiotehnologie.
Cele expus e mai sus determină importanța evaluării efectelor nanoparticulelor oxizilor de
metale asupra tulpinii de levuri S. cerevisiae CNMN -Y-20 și aprecierea perspectivelor de
aplicare ale acestora în biotehnologia cultivării levurilor în vederea sporirii potențialului
biosintetic .
Luând în considerație cele expuse scopul capitolului constă în e lucidarea acțiunii
nanoparticulelor ZnO și TiO 2 asupra biosintezei β -glucanilor și altor constituiente celulare a
levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20.

3.1. Materiale și metode de cercetare
În vederea realizării scopului acestui capitol, în cercetări au fost utilizate trei tipuri de
nanoparticule (NPs): ZnO cu dimensiunile 10 și 30 nm , stabilizate în poli(N -vinilpirolidon)
(Poly(N -vinylpyrrolide)) (PVP) [123] și TiO 2 cu dimensiunea 30 nm, obținute prin metoda zol-
gel asistată cu ultrasunet [44], puse la dispoziția de către cercetătorii Institutului de Ingineri e
Electronică și Nanotehnologii . Concentrațiile nanoparticulelor utilizate la cultivarea levurilor au
constituit 0,5; 1; 5; 10 ; 15; 20 mg/L. Nanoparticulele s -au adăugat sub formă de em ulsie la etapa
inoculării tulpinii.
Tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20 a fos t cultivată pe mediul nutritiv YPD cu următoarea
componență: 1% extract de drojdie, 2% peptonă, 2% glucoză, apă potabilă 1 L , pH-5,5 [48].
Cultivarea submersă s -a efectuat în baloane Erlenmeyer cu capacitate de 1,0 L, pe agitator
cu viteza de rotație 2 00 rot/min , la temperatura de 25°C, gradul de aerare – 81,3…83,3 mg/L,
durata de cultivare subme rsă – 120 ore. Mediul lichid de fermentare s -a însămâ nțat în volum de
5% cu inocul 2 x106 celule/ml.
Preparare a inoculului , determinare a numărul ui de celule dezvoltate pe mediul lichid ,
viabilitatea celulelor , examinarea formei și dimensiunilor celulelor , determinare a biomas ei
levurii , substanț ei uscat e a biomasei, conținutul ui de carbohidrați totali , conținutul ui de β-glucani
s-au efectuat în conformitate cu metodele descrise în capitolul 2 .
Determinarea proteinei a fost efectuată spectrofotometric după metoda Lowry [ 162].
Metoda este bazată pe determinarea intensității colorației soluției de protein e prin
combinarea a două reacții: Biuret (de identificare a legăturilor peptidice) și Folin (oxidarea
resturilor proteice aromatice aminoacizilor tirozina și cisteina ) din componența moleculei de
proteină. Ultima reacție constă în reducerea amestec ului de acizi fosfovolframic și

71 fosfomolibdenic cu formarea unui compus complex colorat în albastru. Intensitatea colorației
este proporțională cu cantitatea de protein e în materialul cercetat.
Protocolul experimental începe cu extracția proteinelor : la 0,1 ml probă biomasă de levuri
(7,0 mg/m l) se ad augă 0,9 ml NaOH 0,1N și se lasă 30 min ute. După care la 0,1 ml din soluția
dată se adaugă 0,4 m l apă distilată și 2,0 m l reactiv Biuret , se agită și se lasă 10 min ute la
temperatura camerei. Se adăugă 0,2 m l reactiv Folin și se agită energic. Proba se lasă timp de 30
minute pentru dezvoltarea colorației și se măsoară absorbanța soluției la spectrofotometru la
lungimea de undă 750 nm în cuve cu grosimea stratului de 1,0 cm.
Calcularea cantității de protein e se efectuează după curba de calibrare construită în baza
unor diluții succesive ale soluției standart de albumină .
Cantitatea de protein e se determină după formula:
c(%)=E 750∙d∙K∙100%/m , unde: (3.1)
E750 – absorbanța probei la lungimea de undă 750 nm;
K – coeficientul de recalculare a cantității de peptide în mg/m l;
d – diluția probei;
m – masa probei absolut uscate (mg);
c – conținutul de protein e în % din BAU.
Activitatea catalazei a fost stabilită conform metodei descrise de Aebi [ 46], adaptată pentru
levuri de Efremova [ 6].
Biomasa tulpinii de levuri S. cerevisiae se supune autolizei la temperatura de 30…35oC
timp de 20…24 ore, cu agitare periodică. Apoi se determină conținutul de protein e în autolizatul
obținut. Următoarea etapă este pregătirea soluțiilor pentru determinarea activității catalaze i:
0,05M de tampon fosfat cu pH -7,0 și soluție de peroxid de hi drogen de 0,06%. Pregătirea soluției
de peroxid de hidrogen se efectuează în felul următor: la 50 ml de 0,05 M de tampon fosfat cu
pH-7,0 ce conține 5 mM de EDTA se adaugă 0,1 ml de H 2O2 de 33%, soluția obținută se
incubează la temperatura de 25oC. Se pregă tește amestecul de reacție pentru determinarea
activității catalazei. În flacoane de sticlă cu volumul de 3 ml se adaugă 2,9 ml de soluție de
peroxid de hidrogen de 0,06% și 0,1 ml de material biologic (autolizat de levuri S. cerevisiae ).
Proba experimenta lă se diluează de 30 ori cu apă distilată. În proba de control se adaugă aceiași
reagenți în consecutivitatea descrisă mai sus, dar în loc de material biologic se a daugă 0,1 ml de
soluție de 0,05M de tampon fosfat cu pH -7,0. Amestecul de reacție se agită și se toarnă în cuvele
spectrofotometrice cu volumul de 3 ml. Următoarea etapă este determinarea indicilor
spectrofotometrici care vor fi utilizați pentru a calcula viteza de scădere a densității optice într -un
interval d e timp, la lungimea de undă de 240 nm (∆E/t). Scăderea densității optice se datorează

72 descompunerii peroxidului de hidrogen în prezența catalazei. Măsurarea densității optice a
produsului reacției în raport cu soluția tampon fosfat se efectuează spectrofot ometric la lungimea
de undă de 240 nm peste 15 s. Activitatea catalaze i se exprimă în U/mg de proteine . O unitate
enzimatică descompune 1 µmol de H 2O2/min, la temperatura de 25 °C și pH -7,0. Se calculează
activitatea CAT conform formulei:
Activitatea CAT (U/mg de pr oteine ) = (∆Eproba/t -∆Econtrol/t)∙d∙V probei de
reacție/0,0436∙Cproteine , unde: (3.2)
∆Eproba − variația densității optice a probei experimentale la lungimea de undă de 240
nm.

3.2. Efectele nanoparticulelor dioxidului de titan asupra biosintezei β -glucanilor și altor
constituiente celulare a levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20
Func ționalitatea nanoparticulelor (NPs) de TiO 2 este expusă în diferite publicații în care se
menționează eficiența utilizării acestora în industria alimentară, medicină, microbiologie,
cosmetologie, la pro ducerea vopselelor, pigmenților [178].
Un studiu de evaluare a influenței nanoparticulelor TiO 2, ZrO 2 și Fe 2O3 asupra consumului
de O 2 și integrității membranei celulare la drojdia S. cerevisiae a efectuat Lila Otero -Gonzales,
care a stabilit că concentrațiile până la 1000 mg/L nu sunt toxice pen tru drojdie [193].
În legătură cu faptul că în ultimul timp, t ot mai des se menționează efectele pozitive ale
nanoparticulelor TiO 2 cercetările noastre au fost axate pe elucidarea posibilității de aplicare a
nanoparticulelor TiO 2 în bio tehnologia cultivării levurilor, în vederea sporirii producției de β –
glucani. Pentru a demonstra eficiența utilizării nanoparticulelor TiO 2 (30 nm) în tehnicile de
cultivare a levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20, a fost inițiat un studiu de apreciere a modificărilor
următorilor indicatori bioproductivi: multiplicarea , producția de biomasă, conținut ul de proteine,
de carbohidrați și β-glucani. Totodată s -a cercetat activitatea enzimei an tioxidante – catalaza.
Studierea și evidențierea particularităților de acțiune a nanoparticulelor TiO 2 asupra
multiplicării celulelor s -a monitorizat timp de 48 ore de cultivare .
Rezultatele experimentale ale influenței NPs TiO 2 asupra reproduc erii celulelor sunt
prezenta te în F igura 3.1 din care este evident că densitatea optică (OD), determinată la lungimea
de undă λ =670 nm, în probele experimentale ale tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20 nu difer ă
substanțial de proba martor. Procesele care au loc în fiecare din etapele vitale ale levurii decurg
în conformitate cu schemele clasice.

73
Fig. 3.1. Multiplicarea celulelor S. cerevisiae CNMN -Y-20 la cultivarea în prezența NPs TiO 2 în
funcție de concentrație și durata de contact .

Deoarece în condițiile fizico -chimice de cultivare modificate, cultu ra își poate schimba
indicii de productivitate ca o reacție de răspuns, în continuare a fost studiat potenția lul de
producere de către levură a biomasei celulare. Astfel, cantitatea de biomasă uscată obținută după
120 ore de cultivare în profunzime în prezența nanoparticulelor dioxidului de titan în concentrații
de 0,5 -20 mg/L s-a micșorat nesemn ificativ (cu 3 -6%) comparativ cu martorul (Figura 3.2).

Fig. 3.2. Efectul diferitor concentrații a nanoparticulelor TiO 2 asupra conținutului de biomasă la
tulpina de levuri S. cerevisiae CNMN -Y-20.

Din punct de vedere biotehnologic este de a stabili gradul de modificare a capacităților
biosintetice a culturii de levuri la acțiunea nanoparticulelor aplicate în procesul de cultivare.
Astfel, în continuare a fost cercetată influența nanoparticulelor TiO 2 asupra sintezei proteinelor la
tulpina în studiu. Analiza comparativ ă a rezultatelor prezentate în F igura 3.3 a pus în evidență o
cantitate redusă de proteine (în raport cu martorul) în biomasa levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20, 00,20,40,60,811,21,41,6
6 ore 24 ore 48 oreOD, λ=670 nm
Durata de cultivareMultiplicarea celulelor
Martor
0,5 mg/l
1 mg/l
5 mg/l
10 mg/l
15 mg/l
889092949698100
0,5 1 5 10 15 20% la martor
Concentrația NPs, mg/ LBiomasa celular ă, g/L

74 la cultivare în variantele experimen tale cu aplicarea NPs TiO 2. Semnificative (cu 14,5 -19,5%
mai jos față de proba de referință) sunt probele experimentale în care au fost aplicate
concentrațiile 0,5 -1,0 mg/L de NPs TiO 2.

Fig. 3.3. Efectul nanoparticulelor TiO 2 asupra conținutului d e protein e în biomasa levuriană, în
funcție de concentrație.

În cadrul exper iențelor ulterioare a fost monitorizat conținutul de carbohidrați totali și β-
glucani la levura S. cerevisiae CNMN -Y-20. Studierea și evidențierea particularităților de
acțiune a nanoparticulelor dioxidului de titan asupra c antității de carbohidrați în biomasă a pus în
evidență valori diferite în funcție de concentrația utilizată de nanoparticule. În variantele
experimentale de cultivare a tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20 în prezen ța nanoparticulelor
TiO 2 în diapazonul de concentrații 0,5; 1,0; 5,0; 10,0 și 15,0 mg/L s -a înregistrat o majorare cu
1-7,5% a conținutului de carbohidrați în funcție de concentrație (F igura 3.4). Astfel, s-a
demonstrat că nanopart iculele TiO 2 se manifestă ca reglatori și pot asigura o acumulare ușoară a
carbohidraților la S. cerevisiae CNMN -20.

Fig. 3.4. Efectele nanoparticulelor TiO 2 asupra acumulării carbohidraților la tulpina de levuri S.
cerevisiae CNMN -Y-20 în funcție de concentrație . 707580859095
0,5 1 5 10 15% la martor
Concentrația NPs, mg/ LProtein e, % S.U .
98100102104106108110
0,5 1 5 10 15% la martor
Concentrația NPs, mg/ LCarbohidrați, % S.U.

75 Determinarea conținutului de β-glucani, a indicat că în biomasa levurii S. cerevisiae
CNMN -20, la cultivare în prezența nanoparticulelor TiO 2, au loc variații nesemnificative a
acestui parametru comparativ c u proba martor. Astfel, sporire a conținutului de β-glucani cu 7,2 –
19,8% ma i mult comparativ cu martorul s-a observat la apli carea concentrațiilor de 10,0 -20,0
mg/L și a const ituit 18,8 -21,0% la S.U. (Figura 3.5). La concentrații mai mici a nanoparticulelor
TiO 2 (0,5-5,0 mg/L ), efectul de stimulare lipsește.

Fig. 3.5. Conținutul de β-glucani în biomasa S. cerevisiae CNMN -Y-20 la
cultivare în prezența diferitor concentrații nanoparticulelor TiO 2.

Așadar, î n premieră au fost efectuate cercetări pentru stabilirea posibilității de utilizare a
nanoparticulelor TiO 2 în biotehnologia cultivării levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20 și obținerii β-
glucani lor. Rezultatele au demonstrat eficiența utilizării nanoparticulelor TiO 2 la cultivarea
tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20 pentru majorarea randamentului de acumulare a β-glucanilor.
În rezultatul cercetărilor efectuate, putem afirma că gradul de acțiune a nanoparticulelor TiO 2
este determinat de concentrațiile utilizate. Proprietățile depistate ale nanoparticulelor TiO 2
prezintă oportunitate de aplicare în biotehnologia cultivării levurilor și obținerii un or
componente polizaharidice [254].

3.3. Efectele nanoparticulelor oxidului de zinc asupra biosintezei β -glucanilor și altor
constituiente celulare a le levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20 în funcție de dimensiuni
Pentru caracteristica comparativă a efectelor nanoparticulelor ZnO în funcție de dimensiuni
au fost selectați următorii indicatori bioproductivi ai tulpinii de levuri S. cerevisiae CNMN -Y-
20: gradul multiplicării levurii, acumularea biomasei celulare, conținutul de proteine,
carbohidrați totali, β-glucani, precum și activitatea enzimelor antioxidante. 020406080100120140
0,5 1 5 10 15 20% la martor
Concentrația NPs, mg/ Lβ-glucani, % S.U.

76 Pentru a aprecia ritmu l de creștere a levurii, n anoparticulele ZnO cu dimensiuni le 10 și 30
nm au fost adăugate în mediu de cultură YPD, în concentrații de 0,5; 1,0 mg/L. Procesul de
reproducere a celulelor s -a monitorizat timp de 48 ore de cultivare în profunzime, perioada care
cuprinde toate fazele procesului de multiplicare a celulei levuriene: lag, log, staționară , declin și
moarte celulară . Multiplicare a culturii s -a determinat după 6, 24 și 48 ore de cultivare în
profunzime. Rezultatele redate în Figura 3.6a, b demonstrează că, atât sub influența
nanoparticulelor ZnO cu dimensiunile de 10 nm, în concentrații de 0,5; 1 mg/L, cât și sub
influența celor cu dimensiunile de 30 nm, nu se produc devieri semnificative a multiplicării
celule lor comparativ cu proba martor.

a) b)
Fig. 3.6. Multiplicare a S. cerevisiae CNMN -Y-20 la cultivare în prezența nanoparticulelor ZnO
cu diferit e dimensiuni în funcție de durata de contact : a) 5 mg/L ; b) 10 mg/L .

Biomasa este unul din parametrii bioproductivi importanți ai culturii de levuri S. cerevisiae
CNMN -Y-20. Aceasta a fost colectată la finele ciclului vital, după 120 ore de cultivare, prin
centrifugare, și supusă analizel or biochimice. Figura 3.7 redă grafic c onținutul de biomasă
acumulat de S. cerevisiae CNMN -Y-20 la cultivare în prezența nanoparticulelor ZnO cu diferite
dimensiuni. Astfel, conținutul de biomasă acumulat prezintă o stabilitate relativă pentru levura
cultivată în prezența nanoparticulelor ZnO cu dimensiuni de 10 nm. În cazul cultivării levurii
studiate în prezența nanoparticulelor ZnO cu dimensiuni de 30 nm se observă o inhibiție ușoară
cu 3,2% comparativ cu proba martor.
De r ând cu polizaharidele, lipidele și acizii nucleici, printre constitu enții bioactivi
importanți ai biomasei levuriene, se numără și proteinele, care în calitate de enzime catalizează
diferite reacții biochimice sau pot juca un rol important în menținerea integrității celulare
(proteinele din peretele celular). Sub ac țiunea diferitor factori chimici (acizi, baze, solvenți
organici) , factori fizici (ultrasunet , radiații de diversă natură, temperatură) sau mecanici (agitare),
are loc modificare a structurii proteinelor, care poate fi reversibil ă sau ireversibil ă.
98100102104
6 ore24 ore48 ore% la martorMultiplicarea , concentra ția NPs
0,5 mg/L
10 nm
30 nm
95100105
6 ore 24 ore 48 ore% la martorMultiplicarea, concentrația NPs
1 mg/L
10 nm
30 nm

77
Fig. 3.7. Cantitatea de biomasă a S. cerevisiae CNMN -Y-20 la cultivare în prezența
nanoparticulelor ZnO cu diferite dimensiuni.

Din aceste considerente, ne -am propus să identificăm efectul nanoparticulelor ZnO asupra
conținutului de proteine în biomasa levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20. Rezultatele obținute
demonstrează că conținutul de proteine în b iomasă se modifică în funcție de dimensiunile
nanoparticulelor utilizate. Pentru nan oparticulele cu dimensiunile mici (10 nm) este specifică o
micșorare rela tivă (cu 4,7 -15,1%) a cantității de proteine. Nanoparticulele ZnO cu dimensiunile
mai mari , (30 nm), aplicate în concentrație de 1 mg/L , prezintă un efect pozitiv mai clar conturat,
astfel încât cantitatea de proteine în ace astă variantă experimentală atinge valori cu 10% mai
mari, decât cantitatea de p roteine determina tă în martor (F igura 3.8.).

Fig. 3.8. Conținutul de proteine în biomasa S. cerevisiae CNMN -Y-20 la cultivare în prezența
nanoparticulelor ZnO cu diferite dimensiuni.

În continuare a fost cercetat și stabilit conținutul de carbohidrați totali și cel al fracției de β –
glucani în biomasa levurii la cultivarea ei în prezența nanoparticulelor ZnO cu diferite
dimensiuni. În variantele de cultivare a levurii în prezența nanopa rticulelor ZnO cu dimensiunile
de 10 nm, valorile conținutului de carbohidrați totali au fost apropiate de cele din proba martor 859095100105110
0,5 1% la martor
Concentrația NPs, mg/LBiomasa celulară, g/L
10 nm
30 nm
020406080100120140
0,5 1% la martor
concentrația NPs, mg/LProtein e, % S.U.
10 nm
30 nm

78 (Figura 3.9a). Analiza statistică a rezultatelor obținute la cultivarea în prezența nanoparticulelor
ZnO cu dimensiunile de 30 nm ne demonstrează o inhibiție ușoară a conținutului de carbohidrați
totali cu 7% față de proba martor (Figura 3.9a).

a) b)
Fig. 3.9. Conținutul de carbohiodrați (a) și β-glucani (b) în biomasa S. cerevisiae CNMN -Y-20 la
cultivare în prezența nanoparticulelor ZnO cu diferite dimensiuni.

Studiul c onținutul ui de β -glucani în biomasa celulară din variantele cu utilizarea
nanoparticulelor ZnO cu dimensiunile de 30 nm a înregistrat un spor mai mare cu 5% comparativ
cu cel din variantele cu aplicarea nanoparticulelor cu dimensiunile de 10 nm. Conținutul de β –
gluca ni în variantele cu aplicarea nanoparticulelor cu dimensiunile de 10 nm a fost comparabil
cu proba martor (Figura 3.9b).
Nanoparticulele ZnO au provocat o intensificare a activității catalazei, valorile maximale
fiind atinse în cazul utilizării nanoparticulelor ZnO cu dimensiunile de 30 nm, care în
concentrație de 1 mg/L intensifică cu 6% activitatea catalazei față de cea apr eciată în martor.
Pentru nanoparticulele cu dimensiunile de 10 nm, activitatea catalazei înregistrată în variantele
experimentale este mai joasă cu până la 27,1% față de cea a martorului (Figura 3.10). Fluctuațiile
activității catalazei explică devieri de la starea normal ă a celulei, concretizate în producția de
peroxizi și radicali liberi, care pot afecta componentele celulare.

Fig. 3.10. Activitatea catalazei a S. cerevisiae CNMN -Y-20 la cultivare în prezența
nanoparticulelor ZnO cu diferite dimensiuni. 020406080100120
0,5 1% la martor
Concentrația NPs, mg/LCarbohidrați totali, % S.U.
10 nm
30 nm
859095100105110115
0,5 1% la martor
Concentrația NPs, mg/Lβ-glucani, % S.U.
10 nm
30 nm
050100150
0,5 1% la martor
Concentrația NPs, mg/LCatalaza , U/mg proteine
10 nm
30 nm

79 Generalizând rezultatele obținute în acest studiu putem deduce, că parametrii bioproductivi
ai tulpinii de levuri S. cerevisiae CNMN -Y-20, la cultivare în prezența nanoparticulelor ZnO, se
modifică în funcție de dimensiunile utilizate. Rezultatele obținute la stabilirea caracterului
acțiunii nanoparticulelor ZnO asupra proceselor biosintetice la S. cerevisiae CNMN -Y-20 pot
servi ca suport pentru cercetările ulterioare efectuate în scopul modelării proceselor de biosinteză
a principiilor bioactive de către levură în funcție de concentrațiile nanoparticulelor . Rezultatele
modeste obținute ne -au sugerat necesitatea continuării cercetărilor în dire cția majorării
concentrați ilor [14, 254 ].

3.4. Efectele nanoparticulelor oxidului de zinc asupra biosintezei β -glucanilor și altor
constituiente celulare a levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20, în funcție de concentrație
Pentru studiul efectelor în funcție de concentrație în continuare au fost selectate
nanoparticule ZnO cu dimensiunile 10 și 30 nm și concentrații le nanoparticulelor 5, 10 și 15
mg/L adăugate în mediu de cultură YPD . În mod identic subcapitolului 3.3 s-au studiat indic ii
bioproductivi: procesul de multiplica re, acumularea biomasei celulare, conținutul de proteine,
carbohidrați totali, β -glucani, precum și activitatea catalazei .
Multiplicare a culturii s -a determinat după 6, 24 și 48 ore de cultivare în prof unzime.
Rezultatele demonstrează că sub influența nanoparticulelor ZnO cu dimensiunile de 10 nm, în
concentrații de 5, 10 și 15 mg/L, nu se produc modifică ri semnificative în procesul de
multiplicare a celulelor comparativ cu proba martor. În variantele experiment ale cu utilizarea
nanoparticulelor ZnO cu dimensiunile 30 nm, gradul de multiplicare al culturii de levuri prezintă
devieri în raport cu martorul, îndeosebi după 6 ore de cultivare în prezența concentrației de 5
mg/L care amplifică procesul de multiplicare cu 7%. Rezultatel e experimentale ale influenței
nanoparticulelor ZnO asupra reproducerii ce lulelor sunt prezentate în Figura 3.11 a, b, c.
Studiul privind conținutul de biomasă uscată obținută după 120 ore de cultivare în
profunzi me a relevat că nanoparticule ZnO cu dimensiunea 10 nm sunt tolerate de către tulpina
S. cerevisiae CNMN -Y-20 și prezintă o stabilitate relativă comparativ cu proba martor.
Variații ale conținutului de biomasă s -au observat la ad ministrarea a 5, 10 și 15 mg/L a
nanoparticulelor ZnO cu dimensiunile de 30 nm. În acest e probe cantitatea de biomasă a
diminuat cu 3,5 -5,8% față de martor (Figura 3.12) .
Un indicator important, c e caracterizează desfășurarea proc eselor metabolice a culturii de
levuri supusă acțiunii dife ritor factori de cultivare, sunt proteinele. Analiza comparativă a
cantității de protein e acumulat e de levura S. cerevisiae CNMN -Y-20 în experiențe a rată că
nanoparticule ZnO cu dimensiunile 10 nm în concentrații 5 -15 mg/L micșorează conținutul

80 acestora în biomasă cu 10,7 -15,4% în comparație cu proba martor (Figura 3.13 ). Datele cu
privi re la cantitatea de protein e în biomasa levurii din variantele experimentale cu aplicarea
nanoparticulelor ZnO cu dimensiuni de 30 nm demonstrează un efect opus – pozitiv, astfel încât
conținutul de proteine î n varianta cu concentrația 5 mg/L atinge valori cu 18% mai înalte , decât
cantitatea de proteine determinată în martor .

a) b)
c)
Fig. 3.11. Multiplicarea S. cerevisiae CNMN -Y-20 la cultivare în prezența nanoparticulelor ZnO
în funcție de concentrație și durata de contact : a) 5 mg/ L; b) 10 mg/ L; c) 15 mg/ L.

Fig. 3.12. Conținutul de biomasă a S. cerevisiae CNMN -Y-20 la cultivare în prezența
nanoparticulelor ZnO în funcție de concentrație .
859095100105110115
10 nm 30 nm% la martor
Dimensiunea NPsMultiplicarea, concentrația NPs 5mg/ L
6 ore
24 ore
48 ore
406080100120
10 nm 30 nm% la martor
Dimensiunea NPsMultiplicarea, concentrația NPs 10
mg/L
6 ore
24 ore
48 ore
859095100105110
10 nm 30 nm% la martor
Dimensiunea NPsMultiplicarea, concentrația NPs 15 mg/ L
6 ore
24 ore
48 ore
80859095100105110
10 nm 30 nm% la martor
Dimensiunea NPsBiomasa celular ă, g/L
5 mg/l
10 mg/l
15 mg/l

81
Fig. 3.13. Conținutul de protein e în biomasa S. cerevisiae CNMN -Y-20 la cultivare în prezența
nanoparticu lelor ZnO în funcție de concentrație .

În continuare, un studiu similar a fost realizat p entru determinarea conținutului de
carbohidrați și β -glucani în biomasa levurii la utilizarea nanoparticulelor ZnO. Analiza
rezultatelor conținutului de carbohidrați a pus în evidență tendința de creștere a acestui indice în
probele experimentale cu aplicarea n anoparticulelor ZnO de 30 nm în concentrațiile de 5, 10 și
15 mg/L. În acest caz, conținutul de carbohid rați totali s -a majorat cu 16 -22,3% comparativ cu
martorul. În variantele de cultivare a levurii în prezența nanoparticulelor ZnO cu dimensiunile
de 10 nm, valorile conținutului de carbohidrați totali au fost comparabile cu martorul (Figura
3.14a).

a) b)
Fig. 3.14. Conținutul de carbohidrați (a) și β-glucani (b) în biomasa S. cerevisiae CNMN -Y-20 la
cultivare în prezența nanoparticu lelor ZnO în funcție de concentrație .
Rezultate similare s -au înregistrat și în cazul β -glucanilor. Conținutul de β-glucani în
biomasa celulară din variantele cu utilizarea nanoparticulelor ZnO cu dimensiunile de 30 nm a
înregistrat un spor mai mare comparativ cu cel din variantele cu aplicarea nanoparticulelor cu
dimensiunile de 10 nm. C reștere a conținutului de β-glucani este specifică tuturor concentraț iilor 405060708090100110120130
10 nm 30 nm% la martor
Dimensiunea NPsProtein e, % S.U.
5 mg/l
10 mg/l
15 mg/l
405060708090100110120130140
10 nm 30 nm% la martor
Dimensiunea NPsCarbohidrați, % S.U.
5 mg/l
10 mg/l
15 mg/l
405060708090100110120130
10 nm 30 nm% la martor
Dimensiunea NPsβ-glucani, % S.U.
5 mg/l
10 mg/l
15 mg/l

82 nanoparticulelor ZnO, valorile experimentale fiind cu 9-19% mai înalte față de martor ( Figura
3.14b). Însă creșterea cantității de β-glucani în biomasă este mai puțin evidentă odată cu
majorarea concentrației nanoparticulelor .
Nanoparticule le ZnO în dependență de concentrație aplicată au provocat o majora re
evidentă a activității catalazei, valorile maximale fiind atinse în cazul utilizării nanoparticulelor
ZnO cu dimensiunile de 30 nm, care în concentrație de 5 mg/L asigură intensificarea cu 13% a
activității catalazei față de cea apreciată în martor. Pentru nanoparticulele cu dimensiunile de 10
nm, activitat ea catalazei înregistrată în variantele experimentale este mai joasă cu până la 38,6%
față de cea a martorului (Figura 3.15).

Fig. 3.15. Activitatea catalazei a S. cerevisiae CNMN -Y-20 la cultivare în prezența
nanoparticulelor ZnO în funcție de concentrație .

Generalizând rezultatele acest ui studiu putem concluziona că gradul de acțiune a
nanoparticulelor asupra dezvoltării tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20 este determinat de
dimensiunile, concentrațiile și durata de contact. Nanoparticulele ZnO cu dimensiunile de 30 nm,
în concentrație de 5 și 10 mg/L, asigură sporirea moderată a cantității de carb ohidrați, β -glucani,
proteine în biomasa levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20, dar inițiază o micșorare relativă a
conținutului de biomasă celulară. Pentru sporirea randamentului procedeelor de cultivare dirijată
a tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20 și obținerea β-glucanilor se recomandă nanoparticulele ZnO
cu dimensiunile de 30 nm în concentraț ie de 5 -10 mg/L [14].

3.5. Efectele nanoparticulelor oxidului de zinc în combinație cu alcoolul etilic asupra
biosintezei β -glucanilor și altor constituiente celulare a levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20
Deoarece levurile își pot modifica indic ii de productivitate și caracterele morfo -culturale ca
răspuns la schimb area condițiilor fizico -chimice de cultivare, iar pe durata dezvoltării 406080100120140
10 nm 30 nm% la martor
Dimensiunea NPsCatalaza, U/mg proteine
5 mg/l
10 mg/l
15 mg/l

83 saharomicetelor în mediul nutritiv se acumulează anumite cantități de alcool etilic, scopul
cercetărilor expuse mai jos a constat în aprecierea gradului de influență a nanoparticulelor
oxidului de zinc (30 nm) asupra morfologiei celulelor, reproduc erii, productivității și indicilor
biosintetici ai S. cerevisiae CNMN -Y-20 în prezența alcoolului etilic în mediu l nutritiv în
concentrație de 2, 5 și 10% .
Inițial a fost cercetată morfologia celulelor levuriene cultivate pe mediul YPD suplinit cu
alcool etilic. Observațiile microscopice denotă prezența unor modificări nesemnificative ale
morfologiei celulelor levurii la cultivare în prezența alcoolului. De r egulă, celule le sunt ovale sau
rotunde, cu înmugurire polară, ce form ează asce din celula diploidă cu ascospori neeliberați,
rotunzi sau ovali. Dimensiunile celulelor în proba mart or și în cea experimentală cu 2 % alcool
variază în diapazonul 5 -10 µm ( Figura 3.16 a, b). În variantele experimentale, sub influența
alcoolului în volum de 5% majoritatea celulelor au dimensiuni mai mici ( Figura 3.16 c). În cazul
cultivării levurii pe mediu YPD cu 10% alcool, se întâlnesc atât celule cu dimensiuni mai mici
față de martor, cât și celule cu di mensiuni mai mari de 10 µm (Figura 3.16 d).

a) b)
c) d)
Fig. 3.16. Aspectul celulelor levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20 la cultivare pe mediul YPD în
prezența diferitor concentrații de alcool (puterea de mărire 1600).
Legenda: a – martor, b – 2% alcool, c – 5% alcool, d – 10% alcool.

Ulterior, s -a cercetat acțiune a diferitor concentrații de alcool asupra multiplicării celulelor.
Monitorizarea reproducerii celulelor în variantele martor și experimentale a demonstrat pericolul
evident al alcoolului inclus în mediul de cultură YPD în concentrație de 10%. Multiplicarea
celulelor s -a redus de 2 ori comparativ cu proba martor ( Figura 3.17).

84
Fig. 3.17. Multiplicarea celulelor levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20 la cultivare pe mediul YPD
în prezența alcoo lului eti lic.

Efectul inhibitor al alcoolului , utilizat în concentra ție de 10% în mediul de cultivare a
levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20, s-a observat și în cazul acumul ării biomasei celulare , după
120 ore de cultivare în profunzime . Din datele Figurii 3.18 concluzion ăm că sub influen ța
alcoolului are loc o micșorare evident ă (cu 71% ) comparativ cu proba martor a conținutului de
biomas ă obținută la 1L mediu de cultur ă. Totodată, concentrația de 2% de alcool, induce
activizarea procesului de multiplicare a celulelor (Figura 3.17) și a cantității de biomasă (Figura
3.18). Rezultatele cercetărilor influenței alcoolului în concentrații de 2, 5 , 10% asupra
componentelor celulare a levurii au demonstrat efecte diferite.
Alcoolul administrat în concentra țiile testate manifest ă efecte pozitive asupra biosintezei β-
glucanilor , conținutul cărora este superior martorului cu 10-13% ( Figura 3.18), însă conținutul de
proteine la cultura de levuri, la concentrațiile de 2, 5 și 10% al cool, se micșorează cu 10 -15%.
Efectul negativ al prezenței alcoolului este confirmat și de activitatea catalazei. În condițiile când
conținutul de alcool în mediul de cultură atinge valori de 10%, are loc o activizare a catalazei,
ceea ce indică asupra toxicității alcoolul ui pentru tulpina studiată (F igura 3.18 ).

Fig. 3.18. Modificarea productivității și conținutului de principii bioactive la S. cerevisiae
CNMN -Y-20 sub influența alcoolului, % la martor . 020406080100120
6 ore 24 ore 48 ore% la martorMultiplicarea celulelor
2% alcool
5% alcool
10% alcool
020406080100120140
Biomasa, g/L Carbohidra ți, %
la s.u.β-glucani, % la
s.u.Proteine, % la
s.u.Catalaza, U/mg% la martor Martor 2% alcool 5 % alcool 10 % alcool

85 Prin urmare , datele obținute confirm ă faptul că alcoolul etilic influențează asupra celulelor
levuriene, induce schimb ări în procesele vitale , iar în concentrații înalte provoacă apariția
stresului alcoolic , care duce la degrad area membranelor celulare și moarte a celulelor . În acest
context prezint ă interes cercet ările ce țin de posibilit atea diminuării efectului negativ al
alcoolului prin utilizarea nanoparticulelor oxidului de zinc.
Conform unor lucrări științifice publicate în revistele de specialitate , nanoparticulele ,
datorit ă dimensiuni lor mici (1-100 nm) și propriet ăților fizice și chimice unicale, ar putea
provoca modific ări substan țiale în diferite sisteme biologice . Astfel, s-a stabilit că
nanoparticulele ZnO pot stimula activitatea enzimatică a levurii S. cerevisiae [59]. Autorii
menționeaz ă că nanoparticulele ZnO cu toate că au inhibat creșterea celular ă, totuși au
neutralizat efectul negativ al alcoolului asupra activit ății β-glucozidazei , sporind cantitatea de
enzime produs ă de către levuri . Aceste rezultate oferă perspectiv e noi privind aplicarea
nanoparticulelor ZnO pentru a spori produc erea β-glucozidaz ei, care este o enzim ă industrial ă
important ă.
În scopul obținerii unei informa ții mai ample despre influența nanoparticulelor oxidului de
zinc asupra tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20, în condi ții de stres alcoolic , s-au monitorizat
modific ările care se produc în morfologia celulelor , precum și în procesul de multiplicare și
produc ția de biomas ă celular ă. Datele obținute în investiga țiile realizate au demonstrat
modific ări ale dimensiunilor celulelor în variantele experimentale , sub influen ța diferitor
concentra ții de nanoparticule incluse atât în mediul YPD cu 2% alcool , cât și în cel suplimentat
cu 5% alcool (Figura 3.19 și 3.20). Observa țiile microscopice sugereaz ă că în celul ă au loc
modific ări esențiale ale proceselor metabolice , iar schimbarea morfologiei celulelor ovale în
forme rotunde și transparente se datoreaz ă probabil fenomenului de apoptoz ă indus ă [11].
În continuare , s-au efectuat cercet ări de eviden țiere a particularit ăților de acțiune a
nanoparticulelor ZnO (30 nm) în combina ție cu diferite concentra ții de alcool etilic asupra
multiplicării celulelor . Rezultatele experimentale ale influen ței nanoparticulelor ZnO utilizate în
concentra ții de la 5 mg/L până la 15 mg/L în combina ție cu alcoolul în concentra ție de 2% ș i 5%
asupra reproducerii celulelor sunt prezentate în Figura 3.21.
Analiza datelor obținute prin prisma efectului de acțiune a nanoparticulelor oxidului de
zinc în combina ție cu diferite concentra ții de alcool etilic asupra reproducerii celulelor levurii , a
demonstrat faptul că pe durata a 48 ore de cultivare se semnaleaz ă o reducere a capacit ăților de
multiplicare a celulelor , efect mai pronun țat observ ându-se după 6 ore. Rata de multiplicare a
celulelor în perioada menționat ă scade cu 20-40% la sută și este specific ă atât pentru combina ția

86 2% alcool și nanoparticule în concentra țiile de 5, 10 ș i 15 mg/L, atât și pentru combina ția 5%
alcool și nanoparticule în conce ntrațiile de 5, 10 ș i 15 mg/L (Figura 3.21a, b).

a) b)
c) d)
Fig. 3.19. Efectele nanoparticulelor ZnO (30 nm) asupra morfologiei celulelor levurii S.
cerevisiae CNMN -Y-20 la cultivare pe mediul YPD cu 2% alcool (puterea de mărire 1600).
Legenda : a – martor , b – 2% alcool +5 mg/L NPs ZnO, c – 2% alcool +10 mg/L NPs ZnO, d – 2%
alcool +15 mg/L NPs ZnO.
a) b) c)
Fig. 3.20. Efectele nanoparticulelor ZnO (30 nm) asupra morfologiei celulelor levurii S.
cerevisiae CNMN -Y-20 la cultivare pe mediul YPD cu 5% alcool (puterea de mărire 640 ).
Legenda : a – martor , b – 5% alcool +5 mg/L NPs ZnO, c – 5% alcool +10 mg/L NPs ZnO.
a) b)
Fig. 3.21. Efectele nanoparticulelor ZnO (30 nm) asupra ratei de multiplic are a celulelor levurii
S. cerevisiae CNMN -Y-20 la cultivare pe mediul YPD suplinit cu alcool etilic: a – 2%, b – 5%.
020406080100120
6 ore 24 ore 48 ore% la martorMultiplicarea celulelor
2% alcool+5
mg/l NPs
2% alcool+10
mg/l NPs
2% alcool+15
mg/l NPs
020406080100
6 ore 24 ore 48 ore% la martorMultiplicarea celulelor
5% alcool+5
mg/l NPs
5% alcool+10
mg/l NPs
5% alcool+15
mg/l NPs

87 Efect similar se observ ă și în cazul produc ției de biomas ă celular ă. Din datele obținute în
experiențe , la cultivare a în profunzime timp de 120 ore , se observă că administrarea a 2% alcool
și nanoparticule lor ZnO în concentraț ie de 5, 10 și 15 mg/L, spre deosebire de martor a
condi ționat schimbări în cantit atea de biomasă acumulată, cu precădere, în variantele care
conțineau 5% alcool și 10, 15 mg/L nanoparticule ZnO , în care biomasa uscată s -a redus cu 13-
18% (Figura 3.22).

Fig. 3.22. Efectele nanoparticulelor ZnO (30 nm) asupra produc ției de biomas ă S. cerevisiae
CNMN -Y-20 la cultivare pe mediul YPD în condi ții de stres alcoolic .

Determinarea cantitativă a proteinelor în biomasa levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20 scoate
în evidență faptul că n anoparticulele ZnO, aplicate în combinație cu 2% alcool etilic, nu
modifică semnificativ conținutul acestora. Nivelul de proteine în variantele experimentale este cu
4-7% sub nivelurile d epistate în variantele martor (Fig ura 3.23). Totodată, rezultatele influenței
nanoparticulelor ZnO administrate în prezența concentrației mai mare de alcool din medi ul
nutritiv (5% ) indică un trend de acțiune diferit celui de scris pentru varianta cu 2% alcool și
nanoparticule ZnO în concentrații 5, 10, 15 mg/L. Nivelul de proteine în vari antele
experime ntale 5% alcool și nanoparticule ZnO crește nesemnific ativ, cu 4 -5% față de conținutul
de proteine depistat în variantele martor (Fig ura 3.23). Astfel, analiza comparativă a rezultatelor
experimentale privind conținutul de proteine în bi omasa levuriană la cultivare numai în prezența
alcoolului și la cultivare pe mediu suplinit cu alcool și nanoparticule ZnO (30 nm) în diferite
concentrații , putem concluziona că nanoparticulele ZnO, într -o măsură ori alta înlătură efectele
negative ale alc oolului asupra proceselor de biosinteză a protein elor. Acțiunea nanoparticulelor
în cazul dat, poate fi explicată, probabil , prin includerea ionilor de zinc în procesele biosintetice
și de regenerare a peretelui celular, prin int ermediul enzimelor care med iază aceste procese. 020406080100120140
2% alc.+5
mg/l NPs2% alc.+10
mg/l NPs2% alc.+15
mg/l NPs5% alc.+5
mg/l NPs5% alc.+10
mg/l NPs5% alc.+15
mg/l NPs% la martorBiomasa uscat ă, g/L

88
Fig. 3.23. Efectele nanoparticulelor ZnO (30 nm) în combinație cu alcoolu l etilic asupra
conținutului de proteine la S. cerevisiae CNMN -Y-20.

În ceea ce privește cantitățile de carbohidrați și β-glucani în biomasa levurii, observăm că
combinația alcool și nanoparticulele ZnO provoacă activizarea procesului de biosinteză.
Rezultatele obținute indică efectul cumulativ pozitiv al acestor doi factori de cultivare.
Conținutul carbohidraților și β-glucanilor crește în funcț ie de concentraț ii cu 10,7 -16,6% și 12,1 –
19,9% respectiv , comparativ cu variantele martor (Figura 3.24 a, b). Un efect stimulator maximal
pentru conținutul de β-glucani se observă la u tilizarea combinației 2% alcool și 5 mg/L
nanoparticule ZnO (30 nm) .

a) b)
Fig. 3.24. Efectele nanoparticulelor ZnO (30 nm) în combinație cu alcool asupra conținutului de
carbohidrați (a) și β-glucani (b) la S. cerevisiae CNMN -Y-20.

În așa mod, datele obținute au confirmat că nanoparticulele ZnO nu pot înlătura efectul
negativ al concentrațiilor înalte de alcool etilic asupra multiplicării celulelor S. cerevisiae
CNMN -Y-20 și producției de biomasă , în același timp influențează pozitiv procesul de
biosinteză a proteinelor . Aplicarea nanoparticulelor ZnO (30 nm) în procesul de cultivare a 859095100105110
5 10 15Proteine, % la martor
Concentrația NPs ZnO , mg/L2% alcool 5% alcool
020406080100120140
5 10 15Carbohidrați, % la martor
Concentrația NPs ZnO, mg/L2% alcool 5% alcool
020406080100120140
5 10 15β-glucani, % la martor
Concentrația NPs ZnO , mg/L2% alcool 5% alcool

89 levurii, poate fi precăutată ca un factor eficient de spori re a producți ei de β-glucani sub aspect
industrial.
În termeni de toxicitate, o importanță mare o au valorile activității enzimelor an tioxidante.
Rezultatele activ ității catalazei în variantele cu aplicarea diferitor concentrații de nanoparticule
ZnO în combinație cu alcoolul sunt similare cu rezultatele obținute de noi la determinarea
efectelor nanoparticulelor asupra componentelor biochimice determinate în biomasa levurii.
Activitatea catalazei variază nesemnificativ în funcție de concentrațiile de nanoparticule utilizate
la cultivare a tulpinii de levuri . Dacă o să operăm cu cifre absolute, atunci, la concentrația cea mai
mare 15 mg/L a nanoparticulelor, semnalăm o sporire a activității catalazei cu 10 -16%
comparativ cu martorul, ceea ce ne indică că celula levuriană neutralizează efectu l compusului în
măsura necesară (Figura 3.25).

Fig. 3.25. Activitatea catal azei în biomasa S. cerevisiae CNMN -Y-20, la cultivare în prezența
nanoparticule lor ZnO (30mn) în combinație cu alcool .

Ținând cont de faptul că administrarea nanoparticulelor ZnO în mediul nutritiv suplinit cu
alcool etilic stimulează conținutul de β-glucani la S. cerevisiae CNMN -Y-20, s-a recurs la
analiza comparativă a ratelor de creștere specifice biomasei celulare și c onținutului de β-glucani.
Rezultatele au arătat că rata specifică de creștere a levurii este cea mai mare (de 6,02 -6,16 g/L
biomasă uscată), la cultivarea în prezența nanoparticulelor oxidului de zinc, comparativ cu alte
variante experimentale, iar cea mai mică rată de creștere (1,55 g/L biomasă uscată) s -a observat
la cultivarea levuri i pe mediul YPD cu 10% alcool (T abelul 3.1). În cazul acumulării β-
glucanilor, cele ma i înalte valori (21,25 -22,55% la S.U.) s-au observat în mediul nutritiv
suplimentat cu alcool în concentrație de 2% și nanoparticule ZnO. 020406080100120140
5 10 15Catalaza, % la martor
Concentrația NPs ZnO, mg/L2% alcool 5% alcool

90 Tabelul 3.1. Cantitatea de biomasă și conținutul de β-glucani la S. cerevisiae CNMN -Y-20 la
cultivare pe mediul YPD în prezența nanoparticulelor ZnO (30 nm) și alcoolului etilic
Concentrația
de etanol
(%, v/v) Concentrația
NPs ZnO
(mg/L) Cantitatea de
biomasă uscată Conținutul de β -glucani
g/L % la
martor % la S.U. % la
martor g/L % la
martor
0 0 5,37±0,45 100 18,8±1,4 100 1,01 100
2 0 6,06±1,3 113 20,01±3,4 106,4 1,21 119,8
5 0 5,52±0,9 103 20,86±5,5 110,9 1,15 113,8
10 0 1,55±0,3 29 21,0±1,6 111,7 0,32 31,7
0 5 6,02±0,08 112 20,52±1,0 109,1 1,23 121,7
0 10 6,16±0,28 115 19,14±0,17 101,8 1,18 116,8
0 15 6,02±0,18 112 18,78±109 99,9 1,13 111,0
2 5 5,88±1,2 109 22,55±1,9 119,9 1,32 130,7
2 10 5, 81±1,5 108 21,28±1,9 113,1 1,24 122,7
2 15 5,74±1,3 107 21,25±2,4 113 1,21 119,8
5 5 5,08±2,4 95 19,5±1,9 103,7 0,99 98,0
5 10 4,4±2,1 82 21,08±2,5 112,1 0,92 91,1
5 15 4,65±2,3 86 19,32±2,3 102,7 0,89 88,1

Valorile indicate de către martor în experiențele efectuate fiind de 18,8% la S.U. β-glucani.
Nivelul producției de β-glucani în variantele experimentale a variat de la 0,32 g/L până la 1,32
g/L, maximele find specifice prezenței în mediul nutritiv a 2% alcool și 5 mg/ L nanoparticule
ZnO [88].

3.6. Procedeu de cultivare a levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20 cu utilizarea nanoparticulelor
oxidului de zinc
Analizând rezultatele experiențelor efectuate putem recomanda un procedeu nou de sinteză
orientată a β-glucanilor, care constă în adăugarea la mediul de nutriție YPD a 5 mg/L
nanoparticulelor ZnO în combinație cu alcoolul etilic în volum de 2%. Aplicarea procedeului
permite de a obține 1,32 g/L β-glucani, ceea ce constituie c u 30,7% mai mult față de martor .
Proced eul elaborat constă în prepararea mediului nutritiv YPD cu următoarea componență,
g/L: peptonă – 20,0; glucoză – 20,0; extract de levuri -10,0. pH -ul mediului se ajustează la valori

91 între 5,5 -6,6. La acest mediu se adaugă suplimentar o cantitate de 5 mg/L nanoparticule ZnO,
stabilizate în poli(N -vinilpirolido n), cu dimensiuni de 30 nm și 2 % alcool (v/v). În mediul
preparat se introduce inoculul (cultură de levuri cu vârst a de 24 ore) în volum de 5%, (2 x106
celule/ ml), necesare pentru a asigura etapele de dezvoltare a culturii. Cultivarea se efectuează la
temperatura de 25±1 °C, aerare continuă (81,3 …83,3 mg/L oxigen solvit), durata de cultivare
submersă 120 ore. Din biomasa col ectată prin centrifugare la 30 00 rot/min timp de 15 minute, se
extra g β-glucanii [88].

3.7. Concluzii la capitolul 3
1. Nanoparticulele TiO 2 cu dimensiuni de 30 nm nu modifică semnificativ proces ul de
reproducere a celulelor, producția de biomasă , conținutul de carbohidrați la levura S.
cerevisiae CNMN -Y-20. În concentrații de 10,0 -15,0 mg/L stimulează biosinteza β-
glucanilor cu 7,2-19,8% comparativ cu proba martor [254].
2. Parametrii bioproductivi ai tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20 la cultivare în prezența
nanoparticulelor ZnO se modifică în funcție de dimensiuni și concentrație. Cantitatea de β-
glucani în biomasa celulară din variantele cu utilizarea nanoparticulelor cu dimensiuni de
30 nm înregistrează un spor mai mare comparativ cu cel din variantele cu dimensiuni a
nanoparticulelor de 10 nm. Pentru concentrațiile mai mari de nanoparticule ZnO se atestă
cantități mai mici de β-glucani. Pentru sporirea randamentului de producere a β -glucanilor
se recomandă utilizarea nanoparticulelor ZnO cu dimensiuni de 30 nm în concentrație de
5-10 mg/L [14, 254 ].
3. Nanoparticule le ZnO (30 nm) nu pot înlătura efectul negativ al concentrațiilor înalte (10%)
de alcool etilic asupra multiplicării celulelor S. cerevisiae CNMN -Y-20 și producției de
biomasă, dar sunt eficiente pentru procesul de biosinteză a β-glucanilor, care se amplific ă
în cazul prezenței în mediul nutritiv a 2% a lcool și 5 mg/L nanoparticule ZnO. Nivelul
produ cției de β -glucani crește cu 30, 7% [11, 88].

92 4. ELABORAREA TEHNOLOGIEI DE CULTIVARE A TULPINII S. CEREVISIAE
CNMN -Y-20 ȘI DE OBȚINERE A β-GLUCANILOR
Levurile genului Saccharomyces au o istorie lungă de utilizare în diferite ramuri ale
economiei. Datorită eficacității în producerea diferitor prod use, S. cerevisiae fără dubii este cel
mai solicitat microorganism biotehnologic . Folosit la producerea pâinii, berii și vinurilor, cel mai
vechi utilizat de om microorganism, a stat și la baza primelor procese biotehnologice din lume.
În același timp levurile reprezintă un obiect biotehnologic de mare perspectivă, care g rație
compozi ției sale biochimice complexe, sunt considerate ca sursă valoroasă atât de nutrienți cu
valoare energetică și nutrițională ridicată, cât și de substan țe biologic active cu spectru larg de
aplicare. În acest context i nteres sporit prezintă levurile ca producen ți de polizaharide, în
particular β-glucani.
Astfel, c u dezvoltarea metodelor noi ale microbiologiei contemporane S. cerevisiae din
nou se află în prim planul perfecționărilor în biotehnologie.

4.1. Materiale și metode de cercetare
În vederea realizării scopului acestui capitol, tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20 a fost
cultivată pe mediile nutritive:
YPD: 1% extract de drojdie, 2% peptonă, 2% glucoză, apă potabilă 1 L, pH-5,5 [48].
Must de bere : 6 Bl, agar – 2% [2].
Cultivarea submersă s -a efectuat în baloane Erlenmeyer cu capacitate de 1,0 L, pe agitator
cu viteza de rotație 2 00 rot/min , la temperatura de 25°C, gradul de aerare – 81,3…83,3 mg/ L,
durata de cultivare submersă – 120 ore. Mediul lichid de fermentare s -a însămâ nțat în volum de
5% cu inocul 2 x106 celule/ml.
Metode de p reparare a inoculului , determinare numărul ui de celule dezvoltate pe mediul
lichid , viabilitatea celulelor , examinarea formei și dimensiunii celulelor , determinare a biomas ei
levurii , substanț ei uscat e a biomasei, conținutul ui de carbohidrați totali , conținutul ui de β-
glucani , proteine, activit ății catalazei s-au efectuat în conformitate cu metodele descrise în
capitolul 2 și 3 .
Undele milimetrice cu frecvență extra înaltă. Ca generator de unde milimetrice a fost
utilizat dispozitivul KB Ч-НД, RS -232, cu lungimile de undă λ=4,9; 5,6; 7,1mm, ceea ce
corespunde frecvențelor f=60,12 GHz; 53,33 GHz; 42,19 GHz; (maxim 10mW/cm2), oferit cu
amabilitate de către colaboratorii Institutului de Inginerie Electronică și Nanotehnologii ,,D.
Ghițu”. Aparatu l este certificat și permis spre utilizare în practica medicală. Durata tratării

93 culturii de levuri a constituit: pentru iradierea o rdinară – 5, 10, 15, 20, 25 minute , pentru iradierea
dublă – 10, 10+10, 20, 20+20 minute.
Numărul de generații și rata de cr eștere a levurii s -a determinat conform ecuației
n= log 10 X – log 10 X0 /0,301 [16] (4.1)
Examinarea coloniilor . Caracterele morfologice coloniale au fost stabilite conform
principiilor și tehnicilor de microbiologie generală [ 26]. Aprecierile macromorfologice s -au
efectuat prin însămânțarea culturilor de levuri pe mediul solid must de bere utilizând metoda prin
epuiza re. Incubarea s -a efectuat la 28 °C timp de 5 zile. Apreci erea morfologică a coloniilor s -a
realizat prin notarea formei coloniilor, mărimea, profilul, luciul, transparența, culoarea, marginea
coloniei, consistența.
Gradul de corelare între unele caractere morfologice și conținutul de principii bioactive de
interes biotehnologic s -a stabilit folosind instrumente Excel, aplicând coeficientul de determinare
r2 = r2 xy. Coeficientul de corelare a fost calculat conform programului Microsoft Office Excel.

4.2. Acțiunea undelor milimetrice cu frecvență extra înaltă asupra procesului de biosinteză
a β-glucanilor
Un i nteres științific particular prezintă cercetările ce țin de influența diferitor tipuri de
unde, în special a celor cu frecvența extra înaltă, asupra creșterii și dezvoltării
microorganismelor. Analiza amplă și generalizarea literaturii de specialitate evidențiază
perspectiva utilizăr ii undelor milimetrice cu frecvența extra înaltă în calitate de reglatori ai
creșterii și stimulatori a i indicilor productivi și biosintetici a i microorganismelor, în particular ai
levurilor.
Undele milimetrice influențează dezvolt area și prolifer area celulelor, activit atea enzimelor,
funcțion area membranelor celulare, a diferitor sisteme biologice [ 250], iar efectul acțiunii lor
depinde de frecve nță, timpul, puterea iradierii, varietatea obiectului biologic . Interes sporit
prezintă cercetările ce țin de ev aluarea influenței UMM asupra creșterii, dezvoltării și activității
biosintetice a levurilor.
Cele expuse mai sus determină importanța evaluării efectelor undelor milimetrice cu
frecvența extra înaltă asupra tulpinii de levuri S. cerevisiae CNMN -Y-20 și aprecierea
perspectivelor de aplicare ale acestora în biot ehnologia cultivării levurilor.

4.2.1. Efectele undelor milimetrice asupra biosintezei β-glucanilor și altor constituiente
celulare a levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20, în funcție de spectrul de frecvență

94 Reieșind din faptul confirmat de literatura de specialitate, că undele milimetrice cu
frecvență extra înaltă au o influență semnificativă asupra ciclului vital, productivității și
activității biosintetice a microorganismelor, în special a levurilor, scopul acestui subcapitol
constă în evaluarea efectelor un delor milimetrice cu frecvență extra înaltă asupra biosi ntezei β –
glucanilor și altor constituiente celulare a levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20.
Pentru studiul efectelor cauzate de undele milimetrice cu frecvență extra înaltă asupra
levurii, a fost utilizat materialul semincer , obținut prin cultivarea tulpinii levuriene pe must de
bere, timp d e 24 ore, pe agitator 200 rot/min , la temperatura de 25 °C. Inoculul în volum de 5 ml,
a fost expus acțiunii undelor milimetrice cu frecvențele f=60,12 GHz; 53,33 GHz; 42,19 GHz
(respectiv lungimile de undă λ=4,9; 5,6; 7,1 mm), emise în regim continuu , timp de 10, 20 sau 30
minute.
După expunerea la undele milimetrice cu frecvență extra înaltă, celulele de levuri în volum
de 5%, 2×106 celule/ml, au fost inoculate pe mediul lichid YPD și crescute în condiții identice cu
marto rul. Cultivarea s-a realizat în baloane Erlenmeyer, durata de cultivare 120 ore, la
temperatura de 25 °C.
Inițial ne -am propus ca scop de a determina indicii multiplicării și viabilității celulelor de
levuri. Estimarea particularităților multiplicării celulelor cuprinde diverse aspecte ale reacției
populației de levuri față de factorii endo – sau exogeni. În studiile de monitoring al efectelor
produse de diverși factori, procesele proliferative asigură posibilitatea utilizării diferitor
parametri în cad rul elaborării strategiei pentru stabilitatea populației. Indicele multiplicării și al
viabilității constituie un criteriu important în aprecierea efectelor negative sau pozitive a
factorilor exogeni.
Cercetările au demonstrat că undele milimetrice, aplica te timp de 10 minute, stimulează
viabilitatea celulelor în primele 24 ore de cultivare indiferent de frecven ța lor , iar după 48 ore
efectul stimulativ asupra viabilității celulelor (cu 52%) se observă numai la iradierea cu unde de
frecvența 42,19 GHz (Figu ra 4.1a). Rezultate de stimulare semnificativă a viabilității culturii S.
cerevisiae CNMN -Y-20 (cu 55,8…96,7%) s -au observat și la iradierea cu unde milimet rice cu
frecvența 60,12 GHz ( λ=4,9 mm) timp de 20 minute (Figura 4.1b ). Prelungirea duratei de
iradiere a tulpinii cu unde milimetrice până la 30 minute, stimulează dezvoltarea populației în
primele 6 ore de cultivare, însă după 48 ore se constată o micșorare (cu 16…34,5% față de
martor) a num ărului de celule vii (Figura 4.1c ). Din rezultatele obț inute reiese că pentru
stimularea viabilității tulpinii de levuri se recomandă a fi utilizată iradierea cu unde de frecvența
42,19 GHz timp de 10 minute sau 60,12 GHz timp de 20 minute.

95 a)
b)
c)
Fig. 4. 1. Efectul undelor milimetrice cu frec vență ext ra înaltă (f=60,12 GHz; 53,33 GHz;
42,19 GHz ) asupra viabilității celulelor S. cerevisiae CNMN -Y-20.
Legenda: Durata expoziției la unde milimetrice: a) 10 minute; b) 20 minute; c) 30 minute.

Celulele levuri ene, sub influen ța undelor milimetri ce, își pot modifica capacitatea de
utilizare a surselor nutritive, astfel dinamica procesului de creștere a populației evoluează diferit.
Diferen țele pot fi estimate comparând curbele de cre ștere a popula ției levuriene supusă iradierii
cu unde milimetrice și curbelo r de creștere a popula ției neiradiate. 050100150200250300
6 ore 24 ore 48 oreCelule viabile, % la martor
Durata de cultivare60,12 GHz 53,33 GHz 42,19 GHz
050100150200250
6 ore 24 ore 48 oreCelule viabile, % la martor
Durata de cultivare60,12 GHz 53,33 GHz 42,19 GHz
020406080100120140160180
6 ore 24 ore 48 oreCelule viabile, % la martor
Durata de cultivare60,12 GHz 53,33 GHz 42,19 GHz

96 Conform datelor din literatură sensibilitatea celulelor la acțiunea undelor milimetrice este
individuală, dar efectul mai evident se observă în faza G1 a ciclului celular de dezvoltare [ 122].
Studiul efectelor undelor milimetrice asupra celulelor a demonstrat capacitatea tulpinii de a
reacționa la undele milimetrice cu frecvență extra înaltă ceea ce confirmă posibilitatea de
modificare a stării fiziologice a levurii. Aceste rezultate au o mare importanță pentru tehnolo gia
cultivării levurii.
Cercetările noastre au demonstrat că efectul diferitor frecven țe a undelor milimetrice
asupra populației S. cerevisiae CNMN -Y-20 este neunivoc și se exprimă prin stimulare, inhibare
sau lipsă de efect asupra poten țialului de mult iplicare a celulelor (Figura 4.2 a, b, c ).

a)
b)
c)
Fig. 4. 2. Efectul undelor milimetrice cu frecvență extra înaltă (f=60,12 GHz ; 53,33 GHz; 42,19
GHz ) asupra dinamicii procesului de multiplicare a S. cerevisiae CNMN -Y-20.
Legenda: Durata expoziției la unde milimetrice: a) 10 minute; b) 20 minute; c) 30 minute .
0510
6 ore12 ore24 ore48 oreCelule, mln/mlMartor 60,12 GHz 53,33 GHz 42,19 GHz
0510
6 ore12 ore24 ore48 oreCelule, mln/mlMartor 60,12 GHz 53,33 GHz 42,19 GHz
051015
6 ore12 ore24 ore48 oreCelule, mln/mlMartor 60,12 GHz 53,33 GHz 42,19 GHz

97 Astfel, în primele 24 de ore de la momentul iradierii timp de 10 și 20 minute , undele
milimetrice nu modifi că curba de cre ștere a levurii indiferent de frecvența lor . Devieri de la
martor se ob servă după 48 ore di n momentul iradierii (Figura 4.2a, b).
Relevante sunt variantele experimentale care au fost iradiate cu unde cu frecvențele 60,12
GHz timp de 10 minute (rata de multiplicare a culturii crește cu 14,1%) și frecvența 42,19 GHz
(rata de multiplicare crește cu 17,6%). Prelungirea duratei de expoziție a culturii la iradiere cu
undele milimetrice până la 30 minute duce la încetinirea vitezei de multiplic are a celulelor, astfel
că în toate fazele de dezvoltare numărul de celule este mai mic comparativ cu martorul (Figura
4.2c).
Obiectivul ulterior a constat în examinarea caracterelor morfologice și culturale a celulelor
tulpinii expus e la iradiere cu unde milimetrice cu frecvență extra înaltă. Din caracterele
morfologice ale celulelor putem menționa, atât pentru martor, cât și pentru tulpina iradiată,
celule ovale sau rotunde, cu înmugurire polară, cu dimensiuni de la 3 -6 μm (Figura 4. 3). Din
caracteristicele culturale menționăm stabilitatea tipului de respirație aerobă, formarea ascelor
persistente direct din celula diploidă, 4 ascospori neeliberați, rotunzi .

a) b)

c) d)
Fig. 4. 3. Morfologia celulelor S. cerevisiae CNMN -Y-20 expusă ac țiunii undelor
milimetrice cu frecvențe extra înalte timp de 10 minute (descri ere după 48 ore de la incubare): a)
martor; b) f=60,12 GHz; c) f=53,3 3 GHz; d) f=42,19 GHz (puterea de mărire 640 ).

98 În vederea evaluării caracterelor morfologice ale coloniilor S. cerevisiae CNMN -Y-20,
expusă acțiunii undelor milimetrice cu frecvențe extra înalte (f=60,12 GHz; 53,33 GHz; 42,19
GHz), cultura de levuri din variantele martor și cele iradiate cu unde milimetrice a fost
însămânțată pe mediul solid YPD. Cercetările după 6, 24 și 48 ore de la momentul iradierii, au
demonstrat că undele milimetrice cu frecvențele examinate, aplicate pe durata a 10, 20 sau 30
minute, nu produc efecte semnifi cative asupra caracterelor morfologice ale coloniilor tulpinii de
levuri. Comun pentru toate var iantele experimentale, cultivate după 6, 24 și 48 ore de la
momentul iradierii , sunt: formarea coloniilor alb -roz, cu suprafața lucioasă, netedă, bombată,
diametrul coloniilor variază de la 4 la 6 mm ( Figura 4.4).

a) b)
c) d)
Fig. 4. 4. Morfologia coloniilor S. cerevisiae CNMN -Y-20 expusă acțiunii undelor milimetrice cu
frecvențe extra înalte timp de 10 minute, (descriere după 24 ore de la iradiere). Legenda: a)
martor; b) f= 60,12 GHz; c) f= 53,33 GHz; d) f= 42,19 GHz .

Prin urmare, putem menționa că reacția de răspuns a tulpinii de levuri la acțiunea undelor
milimetrice este diferită și se manifestă în dependență de frecvențele aplicate. Rezultatele
pozitive obținute, exprimate prin stimularea moderată a viabilității și lipsa modificărilor esențiale
a caracterelor morfo -culturale, servesc ca bază pentru derularea noilor cercet ări teoretice și
practice privitor la utilizarea undelor milimetrice cu frecven ță extra înaltă în biotehnologia
cultiv ării tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20 [10].
Se consideră, că fluctuațiile valorice ale indicelui multiplicării celulelor reflectă direct
intensitatea reacțiilor fiziologo -biochimice, dependente la rândul său de viteza reacțiilor

99 fermentative. Reducere a sau sporirea multiplicării sub acțiunea diferitor factori, denotă
caracterul acestora , generat de inhib area sau stimularea multiplicării celulare. În acest context, în
vederea ameliorării calităților de biosinteză, sunt importante cercetările ce țin de particularitățile
biosintetice ale levurii supuse iradierii cu unde milimetrice cu frecvență extra înaltă.
Evaluarea caracterului de acțiune al undelor milimetrice cu frecven ță extra înaltă s-a
efectuat examinând conținutul de biomas ă, carbohidra ți totali , β-glucani , proteine , activit atea
catalazei la S. cerevisiae CNMN -Y-20.
Analizând producția de biomasă menționăm că undele cu frecvențele examinate, emise
timp de 10, 20, 30 minute nu modifică esențial indicii cantitativi. Unele rezultate , obținute în
variantele iradiate cu unde cu frecvența f=60,12 GHz (lungimea de undă λ=4,9; expoziție 10
minute) sau cu frecvența 42,19 GHz (lungimea de undă λ=7,1; expoziție 30 minute) indică o
micșorare nesemnificat ivă a conținutului de biomasă (F igura 4.5).

Fig. 4.5. Efectul undelor milimetrice cu frecvență extra înaltă ( f=60,12 GHz ; 53,33 GHz ; 42,19
GHz) asupra acumulării biomasei la S. cerevisiae CNMN -Y-20.

Analiza rezultatelor denotă că, după 120 ore de cultivare în profunzime pe mediul YPD,
pentru unele componente biochimice cercetate, s -au observat deosebiri veridice între martor și
variantele expuse iradierii cu unde milimetrice. Efect de stimulare a conț inutului de carbohidrați
(cu 16,7% și 43,5%) s -a constatat în biomasa levurii iradiate cu unde cu frecvența f=60,12 GHz
și respectiv f=53,33 GHz , durata de iradiere 20 minute. Rezultatele obținute sunt prezentate în
Figura 4.6 ce caracterizează diferențel e între indicii mostrelor experimentale, exprimate în
procente față de martor.
Cauza modific ărilor în conținutul de carbohidra ți, determinat în biomasa levurian ă, ar fi că
aceștea împreun ă cu moleculele proteice din membrana celular ă, prezint ă un factor reglator al 020406080100120
10 min 20 min 30 minBiomasa uscată, % la martor
Durata iradierii60,12 GHz 53,33 GHz 42,19 GHz

100 proceselor fiziologo -biochimice . Presupunem , că sub influen ța undelor milimetrice cu frecven ță
extra înaltă, prin intermediul receptorilor proteici se modific ă capacitățile biosintetice ale
celulelor .

Fig. 4.6. Impactul undelor milimetrice cu frecven ță extra înaltă asupra conținutului de
carbohidra ți la S. cerevisiae CNMN -Y-20.

Ulterior s -a studiat efectul undelor milimetrice asupra biosintezei altei componente
importante a celulei levuriene – β-glucanii.
Datele studiului au demonstrat că utilizarea undelor milimetrice în procesul de cultivare a
levurii a contribuit la sporirea conținutului cantitativ al β-glucanilor. Menționăm deosebiri
veridice la utilizarea undelor milimetrice cu frecvențele f=60,12 GHz și f=53,33 GHz ( λ= 4,9 și
λ=5,6), durata expunerii 10 și 20 minute. Devierea procentuală de la indicii martor constituie
17,4% și 25,7% în direcția stimul ării conținutului de β-glucani (Figura 4. 7).

Fig. 4.7. Efectul undelor milimetrice cu frecvență extra înaltă ( f=60,12 GHz; 53,33 GHz; 42,19
GHz) asupra conținutului de β-glucani la S. cerevisiae CNMN -Y-20. 020406080100120140160180
10 min 20 min 30 minCarbohidrați, % la martor
Durata iradierii60,12 GHz 53,33 GHz 42,19 GHz
020406080100120140
10 min 20 min 30 minβ-glucani, % la martor
Durata iradierii60,12 GHz 53,33 GHz 42,19 GHz

101 S-a constatat că lipsește tendința sigură atât de sporire cât și de micșorare a conținutului de
β-glucani în variantele expuse undelor milimetrice timp de 30 minute, caracteristică pentru toate
frecvențel e utilizate. În viziunea noastră, efectul biologic al undelor milimetrice are un prag
temporar, 20 minute, după care expunerea obiectului biologic la iradiere nu conduce la mărirea
efectului biologic. Fenomenul dat este confirmat și de alți cercetători, care evidențiază că efectul
biologic al undelor milimetrice are un prag de a cțiune, după care apare efectul platou [ 31]
Din cele expuse este evident faptul că creșterea semnificativă a conținutului de carbohidrați
și β-glucani se produce la iradierea tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20 cu unde milimetrice cu
frecvențele 60,12 GHz și 53,33 GHz timp de 10 -20 minute.
În cadrul cercetărilor complexe ale influenței undelor milimetrice asupra capacităților
biosintetice ale levurii au fost efectuate investigaț ii vizând conținutul de proteine și activitatea
catalazei. S -a observat că iradierea culturii de levuri pe durata 10 și 20 minute a stimulat sinteza
proteinei. În variantele expuse frecvenței f=42,19 GHz, conținutul de proteine a sporit cu
41,2…49,9 % față de martor (Figura 4. 8). Valori înalte a conținutului de proteine au fost
înregistrate la iradierea tulpinii și cu unde milimetrice cu frecvența 60,12 GHz timp de 10 -20
minute. Valorile conținutului de protein e cresc cu 35,6…41,0% comparativ cu martorul.

Fig. 4.8. Efectul undelor milimetrice cu frecvență extra înaltă ( f=60,12 GHz; 53,33 GHz; 42,19
GHz) asupra conținutului de protein e la tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20.

Paralel, a fost efectuat studiul activității catalazei (realizat cu aportul Doamnei dr. în biol.
N. Efremova), care este unul din cei mai eficienți catalizatori cunoscuți a reacțiilor esențiale
pentru viață. Catalaza reduce nivelu l peroxidului de hidrogen pentru a oxida toxine, fenoli sau
alcooli. Studiul efectuat a permis identific area răspunsul ui catalazei care este mult mai promt
(cu 34,5…39,4 % mai mult față de martor) la stresul cauzat de undele cu frecvența f=42,19 GHz , 050100150200
10 min 20 min 30 minProteine, % la martor
Durata iradierii60,12 GHz 53,33 GHz 42,19 GHz

102 durata de iradiere p ână la 30 minute (Figura 4. 9). Activitatea înaltă a catalazei înregistrată în
toate variantele experimentale , de regulă este caracteristică procese lor ce produc cantități mari de
peroxid de hidrogen.

Fig. 4.9. Efectul undelor milimetrice cu frecvență extra înaltă ( f=60,12 GHz; 53,33 GHz; 42,19
GHz) asupra activității catalazei la tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20.

Astfel, rezultatele investigațiilor au evidențiat dependența act ivității funcționale a tulpinii
S. cerevisiae CNMN -Y-20 față de spectrul de frecvență a undelor milimetrice, utiliza te în
procesul de cultivare a levurii. Undele cu f recvența f=53,33 GHz au un efect pronunțat de
stimulare a biosintezei carbohidraților totali, inclusiv a β-glucan ilor. Rezultatele ne permit să
menționăm că undele milimetrice cu frecvența extra înaltă sunt un factor important de modificare
a metabolismului celular , iar undele milimetrice cu frecvențele nominalizate pot fi propuse în
biotehnologia cultiv ării levurii în scopul sporirii performan ței biosintetice [89].

4.2.2. Efectele undelor milimetrice cu frecvența 53,33 GHz asupra biosintezei β-glucanilor
și altor constituiente celulare a levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20, în funcție de durata de
iradiere
La inițierea studiului a fost înaintată cerința de a evidenția durata de iradiere optimă în
vederea obținerii valorilor maxime de acumulare a β-glucanilor .
Din rezultatele cercetărilor prezentate în Figura 4. 10 putem conchide că o cantitate
maximală de β-glucani, carbohidra ți și biomasă uscată (B.U.) este acumulată l a iradierea culturii
timp de 20 min ute: conținutul de β-glucani – de 18,84 -20,0% la B.U., cu 18,5 -25,7% mai mult
față de martor , conținutul carbohidra ților – de 35,94 -36,33% din B.U., cu 19,6-20,8% mai mult
comparativ cu martorul neiradiat ; conținutul de biomasă – de 4,85 -4,98 g/L, ceea ce depă șește
martorul cu 14,1 -17,2% . 050100150
10 min 20 min 30 minActivitatea catalazei,
% la martor
Durata de iradiere60,12 GHz 53,33 GHz 42,19 GHz

103
Fig. 4. 10. Efectul undelor milimetrice cu frecvența f=53,33 GHz asupra con ținutului de β-
glucani, carbohidr ați și cantității de biomasă la tulpina S. cerevisiae CNMNY -20 în func ție de
durata iradierii.

Prin aplicarea analizei statistice, au fost determinate ecuațiile liniilor de regresie, precum și
coeficienții de determinare R2, ce descriu relația dintre două valori variabile, în cazul nostru
relația dintre valorile cantitative ale biomasei și cele ale componentelor peretelui celular la
iradierea culturii cu unde milimetrice emise timp de 5 , 10, 15, 20, 25 minute (Figura 4. 11, 4.12,
4.13).
Calculul coeficientului de determinare pentru două variabile – biomasă și β-glucani,
caracteristice levurilor supuse iradierii cu unde milimetrice, a relevat o asociere puternică,
pozitivă. Coeficientul de determinare R² =0,718 sau 71,8 % din va riația valorilor acumulării
biomasei este însoțită de variația valorilor celeilalte variabile – a β-glucanilor (Figura 4. 11).

Fig. 4.11. Interdependența acumulării biomasei și β-glucanilor la tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-
20, iradiată cu unde milimetrice cu frecven ța f=53,33 GHz. 406080100120140
5 10 15 20 25% la martor
Durata iradierii, minuteβ-glucani, % S.U. Carbohidrați, % S.U. Productivitatea, g/L
y = 2,5754x + 6,452
R² = 0,7183
16,51717,51818,51919,52020,5
3 3,5 4 4,5 5 5,5 6β-glucani, % B.U.
Biomasa uscată, g/ L

104 Calculul coeficientului R²= 0,949, înterpretat procentual, pentru variabilele – biomasă și
carbohidrați, ar însemna că 94,9% din varianta biomasei este înso țită de varian ța acumulării
carboh idraților (Figura 4. 12).

Fig. 4. 12. Interdependența acumulării biomasei și carbohidraților la tulpina S. cerevisiae CNMN –
Y-20, iradiată cu unde milimetrice cu frecven ța f=53,33 GHz.

Analiza dependenței parametrilor conținutului de β-glucani și carbohidr ați a stabilit o
tendință ascendentă a unei valori care implică, la rândul său, o tendință ascendentă a celeilate
variabile. Legătura între ele identificată ca R²=0,633 sau 63,3%, argumentează ipoteza existenței
unei legături reale în baza c ăreia se poate pronostica valorile uneia în raport cu valorile celeilalte
pe baza ecuației de regresie. O posibilă explicație ar fi că ambele variabile, carbohidrații și β-
glucanii, sunt influenț ate de același fenomen – de undele milimetrice cu frecven ța f=53,33 GHz
(Figura 4. 13).

Fig. 4. 13. Interdependența acumulării β-glucanilor și carbohidra ților la tulpina S. cerevisiae
CNMN -Y-20, iradiată cu unde milimetrice cu frecven ța f=53,33 GHz. y = 5,5301x + 8,7902
R² = 0,9498
31323334353637
3 3,5 4 4,5 5 5,5Carbohidrați, % B.U.
Biomasa uscată, g/ L
y = 1,4857x + 6,8856
R² = 0,633
31323334353637
16 17 18 19 20 21Carbohidrați, % B.U.
β-glucani, % B.U.

105 Studiul conținutului de protein e și activită ții catalazei la tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20
a demonstrat un maximum de acumulare a proteinei (41,00%) și de activitate a catalazei (2642
U/mg protein e), ceea ce este cu 33,00 -38,00% mai mult față de proba neiradiată, care se
manifestă la durata d e iradiere de 15 minute (Figura 4. 14).

Fig. 4.14. Efectul undelor milimetrice cu frecvența f=53,33 GHz asupra cantită ții de protein e și
activit ății catalazei la tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20 în func ție de durata iradierii.

Examinarea relației dintre conținutul de protein e și activitatea catalazei la tulpina S.
cerevisiae CNMN -Y-20, iradiată cu unde milimetrice cu frecve nța f=53,33 GHz, a demonstrat
un grad de depende nță înalt, coeficientul de determinar e a constituit 0,864 (Figura 4. 15).

Fig. 4. 15. Rel ația dintre co nținutul de protein e și activitatea catalazei la tulpina S. cerevisiae
CNMN -Y-20 iradiată cu unde milimetrice cu frecven ța f=53,33 GHz.

Astfel, pentru tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20, regimul optimal de acumulare a
componentel or structurale, cant ității maximale de biomasă, carbohidra ți, β-glucani și proteine se
constată la iradierea cu unde milimetrice cu frecven ța 53,33 GHz timp de 15 -20 min ute [62].

106 De regulă, p rocedeele de utilizare a undelor milimetrice în scopul ob ținerii rezultatului
scontat, prevăd aplicarea acestora pe parcursul a 5 -10 runde, fapt ce duce la amplificarea
semnalului interior al organismului. Din aceste considerente, este important de a stabili reac ția
celulei levuriene la aplicarea repetată a undel or milimetrice cu frecven ță extra înaltă.
Investiga țiile ulterioare au avut drept scop evaluarea efectului iradierii duble cu unde milimet rice
de intensitate joasă a tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20 în vederea relevării regimului optim de
stimulare a proceselor biosintetice. În experien țele noastre, cultura de levuri, a fost iradiată inițial
în faza de latență (până la inoculare) și repetat în faza creșterii accelerate (după 24 ore de
cultivare în profunzime).
În calitate de indicatori sensibili a stării funcționale a levurii au fost cercetate multiplicarea
și viabilitatea tulpinii de levuri în dinamică, pe durata a 48 ore de dezvoltare.
Din rezultatele expuse în Figura 4.16 se observă că iradierea dublă a culturii, în intervalul
de 10 -20 minute, nu induce diminuarea sau stimularea substanțială a numărului de generații, deci
nu provoacă dereglări majore în ciclul mitotic al levurii comparativ cu varianta martor neiradiată.
Cauza lipsei efectului iradierii duble cu unde milimetrice cu frecvența f=53,33 GHz urmează a fi
determinată ulterior. Însă, în literatura de specialitate deja este cunoscut fenomenul de anihilare
al influenței undelor milimetrice asupra organismelor vii, în condiții nefavorabile de dezvoltare
[30].

Fig. 4.16. Efectul iradierii duble cu unde milimetrice cu frecven ța f=53,33 GHz asupra
numărului de genera ții ale popula ției S. cerevisiae CNMN -Y-20.

Nu s-au observat modific ări majore ale efectelor dublei iradieri cu unde milime trice nici în
cazul experien țelor de determinare a viabilit ății celulelor , acest parametru variind neesen țial față 00,511,522,533,5
Martor 10 10+10 20 20+20Numărul de generații
Durata iradierii, minute0-6 ore 6-12 ore 12-24 ore 24-48 ore

107 de nivelul martor ului radiat o singur ă dată (Figura 4.17). Acest fenomen poate fi explicat , din
punctul nostru de vedere , prin încetinirea mecanismelor de autostimulare și reîntoarcerea la
normalitate a stării funcționale a membranei celulare a levurii iradiate repetat la diferite intervale
de timp [12].

Fig. 4.17. Efectul iradierii duble cu unde milimetrice cu frecvența f=53,33 GHz asupra
viabilității celulelor S. cerevisiae CNMN -Y-20.

În continuare s -a determinat conținutul de biomasă, carbohidrați, β-glucani, proteine și
activitatea catalazei. Cercetăril e au demonstrat că iradierea dublă a culturii, inițial în faza de
latență (până la inoculare) și repetat în faza creșterii accelerate (după 24 ore de cultivare în
profunzime la temperatura de 30 °C) nu induce schimbări esențiale ale con ținutului de β-glucani,
carbohidra ți și produc ției de biom asă, comparativ cu variantele culturii ira diate o singură dată
(Figura 4.18 ).

Fig. 4. 18. Efectul iradierii duble cu unde milimetrice cu frecven ța f=53,33 GHz asupra
conținutului de β-glucani , carbohidra ți și produc ției de biomas ă la tulpina S. cerevisiae CNMN –
Y-20. 050100150200
10 10+10 20 20+20Celule viabile, % la
martor
Durata iradierii, minute6 ore 12 ore 24 ore 48 ore
020406080100120140160
10 10+10 20 20+20% la martor
Durata iradierii, minuteβ-glucani Carbohidrați Productivitatea

108 Rezultate relevante s -au obținut în experiențele de elucidare a poten țialului de biosinteză a
proteinei și activită ții catalazei la tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20 iradiată repetat.
La analiza rezultatelor s -a constatat că iradierea dublă, cu durata de 10 min ute, are efect
stimulator asupra co nținutului de proteine și activit ății catalazei. Conținutul maximal de protein e
prevalează martorul cu 20,0 și respectiv 36,0% (Figura 4. 19). Iradierea dublă cu durata de 20
minute nu influențează semnificativ conținutul de proteine comparativ cu iradierea culturii o
singură dată, în faza de laten ță.
Cercetările au eviden țiat că iradierea dublă, cu durata de 20 min ute, provoacă o micșorare a
activit ății catalazei (Figura 4. 19). Acest efect poate fi explicat prin faptul că iradierea dublă
provoacă stres oxidativ puternic, ceea ce contribuie la formarea radicalilor liberi, precum și
peroxidului de hidrogen. Numărul mare de radicali liberi inhibă activitatea enzimelor
antioxidante, inclusiv și a catalazei. Rezultatele obținute în experien țele noastre sunt similare cu
datele din literatura de specialitate, care demonstrează că activitatea enzimelor antioxidante și
conținutul de protein e sunt legate de stresul oxidativ [186].

Fig. 4.19. Efectul iradierii duble cu unde milimetrice cu frecven ța f=53,33 GHz asupra
conținutului de protein e și activit ății catalazei la S. cerevisiae CNMN -Y-20.

Astfel, în acest compartiment sunt expuse rezultatele cercetărilor efectuate în premieră
pentru stabilirea efectelor undelor milimetrice cu frecvență extra înaltă , în funcție de frecvență și
durata de iradiere , asupra capacității de biosinteză a β-glucani lor și altor constituiente celulare a
levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20. Rezultatele obținute au de monstrat eficiența tratării levurii cu
undele milimetrice cu frecvență 53,33 GHz timp de 20 minute.
În rezultatul cercetărilor efectuate a fost propus un procedeu nou de sporire a conținutului
de β-glucani la tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20 cu utilizarea undelor milimetrice, care poate fi

109 utilizat în industria microbiologică, alimentară, farmaceutică, etc. În baza acestor rezultate a fost
elaborat și obținut brevet de invenție [ 7, 20].

4.2.3. Procedeu de sporire a conținutului de β-glucani la tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20
cu utilizarea undelor milimetrice cu frecvență extra înaltă
În conformitate cu rezultatele obținute se propune un procedeu nou de sinteză orientată a β-
glucanilor prin utilizarea undelor milimetrice cu frecvență extra înaltă.
Schema realizării procedeului este prezentată în Figura 4. 20 și include următoarele etape:
Etapa I . Obținerea inoculului .
Materialul semincer se obține prin cultivarea levurii în profunzime, pe must de bere sau
YPD, timp de 24 ore, p e agitatorul rotativ (200 rot/min ), la temperatura de 25 °C.

Etapa II. Iradierea culturii cu unde milimetrice cu frecvență extra înaltă .
Inoculul se iradiază cu unde milimetrice cu frecven ța f=53,33 GHz, timp de 20 min ute.
Inoculul iradiat, în volum de 5% în bază volumetrică, 2×106 celule/ml, se inoculează în mediile
de fermentație.

Etapa III. Cultivarea levurii în profunzime pe mediu de biosinteză .
Cultivarea submersă a levurii se realizează în baloan e Erlenmeyer cu capacitate de 1L ce
conține 0, 2 L mediu nutritiv YPD: extract de levuri 1%, peptonă 2 %, glucoză 2%, apă potabilă
1L, pH-5,5 [1 29], pe agitatorul rotativ (2 00 rot/min ), la temperatura de 25°C, timp de 120 ore.
Biomasa lev uriană se separă de lichidul cultural prin cent rifugare 3500 rot/min timp de 20
minute.

Etapa IV. Extragerea β-glucanilor.
Extragerea β-glucanilor se efectuează conform procedeului: biomasa celulară (ajustată la
15% g /g conținut de substan ță solidă și pH-5) se supune autolizei la 50 °C timp de 24 ore, ulterior
autolizatul se încălzește la 80±5 °C timp de 15 min ute, se răcește, se centrifughează la 3500
rot/min timp de 10 min ute. Sedimentul se colectează. La sediment se adaugă 5 volume de 1N
NaOH, amestecu l se supune tratării termice la 80±5 °C, timp de 2 ore. Ulterior, se adaugă 5
volume de acid acetic 0,5N și se încălzește la 75±5 °C timp de 1 oră. Amestecul se
centrifughează timp de 10 minute la 3500 rot/min la temperatura camerei. Sedimentul (β-
glucanii) se spală de trei ori cu apă distilată, se usucă.

110
Fig. 4. 20. Schema realizării procedeului de sporire a co nținutului de β-glucani la S. cerevisiae
CNMN -Y-20 cu utilizarea undelor milimetrice cu frecvență extra înaltă.

Așadar, cercetările au permis demonstra rea eficienței undelor milimetrice cu frecvență
extra înaltă în amplificarea semnificativă a efectului biotehnologic obținut la cultivarea tulpinii S.
cerevisiae CNMN -Y-20. Variantele experimentale selectate de noi în calitate de suport pentru
elaborarea proce deului asigură un nivel înalt al cantității de β-glucani în biomasă. Cu toate că, în
obiectivele noastre de lucru a fost prevăzută doar obținerea cantităților sporite de β-glucani ,
cercetările au evidențiat și modelarea cantității de alte componente celulare în biomasa levuriană.

4.3. Tehnologia de cultivare a tulpinii Saccharomyces cerevisiae CNMN -Y-20 și de obținere
a β-glucanilor
În baza rezultatel or prezentate anterior în capitolul 2 și subcapitolul 4. 2 cu referință la
metoda optimizată de extracție a β-glucani lor, selectarea nutrienți lor preferențiali și condiții lor Mediul YPD, cultivare în profunzime,
120 ore la t 25°C
Recuperarea biomasei prin
centrifugare la 3000 rot/min,
timp de 15 minute
Biomasa obținută
Extragerea și purificarea β -glucanilor Obținerea inoculului
prin cultivare timp de
24 ore la t 25°C Tulpina Saccharomyces
cerevisiae CNMN -Y-20 Iradiere cu unde
milimetrice f =53,33
GHz, 20 minute

111 optime de cultivare submersă , acțiunea undelor milimetrice cu frecvență extra înaltă a fost
necesar de a combina procedeele elaborate într -un flux tehnologic avantajos, care permite
obținerea din biomasa levuriană a β-glucani lor cu proprietăți biologice valoroase. În cadrul
acestui subcapitol sunt descrise cercetările care au permis să fie definitivate fazele principale ale
tehnologiei , precum și valorificarea biopreparatului obținut conform acestei tehnologii.
În cadrul fluxului tehnologic importanță majoră au procedeele de cultivare dirijată a
levurii, care permit obținerea cantității maximale de biomasă cu un conținut înalt de β-glucani .
După cum a fost demonstrat pe parcursul întregii lucrări realizarea acestui obiectiv a fost posibilă
datorită eficientizării procedeul ui de extragere și purificare a β-glucani lor din biomasa levuriană,
optimizării mediilor nutritive, condițiilor de cultivare, utilizării undelor milimetrice, procedee ce
au contribuit la intensificarea procesului de biosinteză a β-glucani lor.
În continuare prezentăm descrierea fazelor tehnologiei propuse.

4.3.1. Proces tehnologic de cultivare a levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20 și de obținere a β-
glucanilor .
Procesul tehnologic de cultivare a levurii în scopul obținerii de biomasă cu conț inut sporit
de β-glucani este bazat pe următoarele principii:
Utilizarea în calitate de producător a tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20;
Prepara rea materialului semincer cu aplicarea undelor milimetrice cu frecvența 53,33 GHz
timp de 20 minute;
Utilizarea mediilor nutritive optimizate YPD -4 și R -ZZ;
Cultivarea în profunzime conform parametrilor optimi de temperatură, pH, durată și
aerație ;
Procesarea biomasei levuriene conform metodei optimizate pentru extragerea β-glucanilor .
Tehnologia este structurată în patru co mpartimente (Tabelul 4.1).
Prima și a doua parte a tehnologiei integrate reprezintă obținerea materiei prime, care
prevede obținerea materialului semincer și cultivarea tulpinii d e levuri în condițiile optime cu
utilizarea indicatorilor care asigură efect ul maximal de acumulare a β-glucanilor.
Partea a treia a tehnologiei implică procedeele de procesare a biomasei și extragere a
produsului polizaharidic.
Partea a patra a tehnologiei prevede studiul calităților produsului finit.

112 Tabelul 4.1. Fazele procesului tehnologic de cultivare dirijată a producătorului și obținere a β –
glucanilor .
Nr
d/o Denumirea operațiunii Controlul interfazic
1. Obținerea materialului semincer .
1.1. Caracteristica producătorului, tulpina S.
cerevisiae CNMN -Y-20. Verificarea caracterelor morfo –
culturale.
1.2. Cultivarea culturii stoc în tuburi cu gel
înclinat. Verificarea condițiilor de cultivare
și purității culturii.
1.3. Cultivarea materialului semincer în
baloane Erlenmeyer. Verificarea condițiilor de cultivare
și purității culturii.
1.4. Iradierea materialulu i semincer cu unde
milimetrice frecvența 53,33 GHz, regim
continuu, timp de 20 min ute. Supravegherea parametrilor de
iradiere .
2. Procesul de cultivare submersă a tulpinii .
2.1. Prepararea mediului nutritiv steril YPD -4
sau R -ZZ. Verificarea preciziei balanței.
2.2. Inocularea culturii de levuri pe mediul
nutritiv, inocul iradiat (2×106 celule/ ml),
în concentrație de 5 % în bază volumetrică . Verifi carea cantității și calității
inocul ului.
2.3. Cultivarea submersă dirijată a levurii, t –
25°C, aerare 81,0…83,0 mg L-1 O2, durata
cultivării 120 ore. Supravegherea parametrilor de
cultivare, monitorizarea purității
culturii.
3. Procesarea biomasei levuriene .
3.1. Separarea biomasei levuriene de lichidul
cultural prin centrifugare la 3000 rot/min timp
de 15 minute . Verificarea gradului de separare .
3.2. Procesul de extragere a β-glucanilor din
biomasa levuriană . Verificarea gradului de extrag ere.
4. Caracterizarea produsului.
4.1. Caracteristica fizico -chimică . Analize de conformitate .
4.2. Dozaj, ambalare, etichetare . Verificarea ambalajului,
inscripțiilor pe etichete.

113 Descrierea fazelor procesului tehnologic de cultivare dirijată a producătorului și de
obținere a β-glucanilor
 Caracteristica producătorului
Caracteristica producătorului S. cerevisiae CNMN -Y-20 este indicată în brevetul de
invenție MD 4048 [4].
Conform criteriului sistematic tulpina de levuri S. cerevisiae CNMN -Y-20 corespunde
următoarei clasificări: încrengătura Eumicota, subîncrengătura Ascomycotina, clasa
Hemiascomycetes, ordinul Endomycetales, familia Saccharomycetaceae, genul Saccharomyces.
Originea tulpinii. Tulpina de levuri S. cerevisiae CNMN -Y-20 a fost izolată în cultură
pură din sedimentele levurilor provenite de la fermentarea vinului roșu Cabernet -5 prin metoda
selecției în mai multe etape pe medii lichide și agarizate must de bere și mediul Rieder, în cadrul
laboratorului Biotehnologia levurilor , Institutului de Microbiologie și Biotehnologie al AȘM
(sedimente oferite de Institutul de Vinificație a Republicii Moldova).
Caracterele morfologice și culturale ale tulpinii. Tulpina de levuri S. cerevisiae CNMN –
Y-20 se prezintă sub forma unor celule ovale sau rotunde, înmu gurire polară, uneori formează
pseudohife. Tipul respirației – aerob, formează asce persistente direct din celula diploidă,
ascospori neeliberați, rotunzi sau ovali netezi. Pe me diu solid formează colonii alb -roz, suprafața
lucioasă, net edă, plată, diametrul 4…6 mm.
Caracterele fiziologo -biochimice. Nu formează peliculă. Fermentația +: nitrat -; ureaza -;
testul diazonium blue B (DBB). Asimilarea glucidelor: D -glucoza, zaharoza, fructoza, D –
maltoza, D -galactoza, D -manoza, D -tregaloza, D -xiloza. Tulpina de levuri S. cerevisiae CNMN –
Y-20 suportă bine aciditatea, pH-ul inițial fiind de 5,5; se dezvoltă bine la temperatura de
+20…25°C. Tulpina cre ște bine pe mediul must de bere (6 %) și medii nutritive:
1. Mediul YPD, care conține, g/L: peptonă – 20,0; gluco ză – 20,0; extract de drojdie – 10
ml; apă potabilă – 1000 ml.
La cultivare în profunzime pe mediul dat timp de 120 ore, tulpi na sintetiz ează până la
15,3% β-glucani în biomasa uscată.
2. Mediul Rieder, care conține, g/ L: glucoză – 30,0; (NH 4)2SO 4 – 3,0; MgSO 4 •7H 2O –
0,7; KH 2PO 4 – 1,0; NaCl – 0,5; Ca(NO 3)2 – 0,4; autolizat de drojdie – 10 ml; apă potabilă –
până 1000 ml.
La cultivare în profunzime pe mediul dat timp de 120 ore, tu lpina sintetizează până la
22,5% β-glucani în biomasa uscată.
 Descrierea procesului tehnologic de obține re a biopreparatului
Procesul constă din patru etape:

114 I – Obținerea materialului semincer
II – Procesul de cultivare submersă a tulpinii
III – Procesarea biomasei levuriene
IY – Caracterizarea produsului
Schema tehnologică de cultivare a levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20 și obținere a ß-
glucanilor este redată în Figura 4.21 .

Fig. 4. 21. Schema tehnologică de obținere a ß-glucanilor din levura S. cerevisiae CNMN -Y-20.
I. Obținerea m aterialului semincer (inocul ) Obținerea materialului semincer
Tulpina
Saccharomyces
cerevisiae
CNMN -Y-20.
Cultivarea
materialului
semincer în
tuburi cu gel
înclinat. Cultivarea
materialului
semincer în
baloane .
Iradierea materialului
semincer cu unde
milimetrice, frecvența
53,33 GHz, regim
continuu, timp de 20
minute.
Cultivarea submersă a tulpinii
Prepararea
mediului nutritiv
steril YPD -4 sau
R-ZZ. Inocularea culturii de levuri pe
mediul nutritiv, inocul iradiat
(2×106 celule/ml), în concent rație
de 5% în bază volumetrică.
Cultivarea di rijată
submersă a levurii, t –
25°C, aerare
81,3…83,3 mg/L O2 ,
durata de cultivare 120
ore.
Procesarea biomasei levuriene
Separarea
biomasei levuriene
de lichidul cultural
prin centrifugare
la 3000 rot/min
timp de 15 minute . Distrugerea peretelui
celular prin
omogenizare .
Extragerea β-glucanilor
din biomasa levuriană .
Caracterizarea produsului
Caracteristica fizico –
chimică, dozaj . Ambalare, etichet are.

115 Materialul semincer se obține în următoarele etape :
1) cultivarea în tuburi pe medii agarizate;
2) cultivarea în baloane cu medii nutritive ;
3) iradierea materialului semincer cu unde milimetrice .
1) Cultivarea culturii stoc în tuburi cu gel înclinat
Tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20 se însămâ nțează în tuburi cu malț agarizat. Mediul
pregătit se toarnă a câte 6-7 ml în tuburi de sticlă cu volumul de 13 ml, se sterilizează în autoclav
la temperatura de 112 -115°C timp de 30 minute. După autoclavare mediul agarizat din tuburi se
înclină.
Însăm ânțarea se efectuează transferând celulele pe suprafața mediului solid cu ajutorul
ansei. Tuburile se incubează la temperatura de 25…27 °C (24 -48 ore), după ce cultura poate fi
transferată pe mediu lichid în baloane Erlenmeyer . Cultura stoc se păstrează în frigider la
temperatura de 4… 5°C pe parcursul a 1 -2 luni. Fiecare lot de material semincer trebuie să fie
pașaportizat.
2) Cultivarea materialului semincer pe mediul lichid
Pentru obținerea inocul ului, tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20, cultivată anterior pe
mediul agarizat înclinat , este cultivată în profunzime timp de 24 ore în baloane Erlenmayer cu
volumul 500 ml, a cîte 100 ml mediu lichid YPD ster il, durata cultivării este de 24 ore la
temperatur a de 25±1 °C.
3) Iradierea materialului semincer cu unde milimetrice
Din precultură (inocul) c u densitatea de 2×106 celule/ml se pregătesc mostrele pentru
iradierea cu unde milimetrice. Pentru iradiere se utilizează celule în faza creșterii exponențiale. O
astfel de populație conține celule în toate etapele mitotice a ciclului celular.
Inoculul se tratează cu unde milimetrice cu frecvența 53,3 3 GHz, regim continuu, durata de
iradiere 20 minute. Ca gen erator de unde milimetrice este utilizat dispozitivul model KB Ч-НД,
RS-232. Aparatul este certificat și permis spre utilizare în practica medicală.
II. Procesul de cultivare submersă a tulpinii
Procesul tehnologic constă din următoarele etape:
1) Pregătirea mediului nutritiv steril;
2) Inocularea culturii de levuri pe mediul de fermentație;
3) Cultivarea submers ă dirijată a levurii.
1) Prepararea mediului nutritiv steril
Pentru cultivarea în profunzime a tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20 se utilizează mediul
optimizat YPD -4 cu următoarea componență, g/L: extract de drojdie – 10,0; peptonă – 20,0;

116 glucoză – 40,0 sau mediul optimizat R -ZZ cu următoarea co mpoziți e, g/L: zaharoză – 37,0;
(NH 4)2SO 4 – 3,0; MgSO 4•7H 2O – 0,7; NaCl – 0,5; Ca(NO 3)2 – 0,4; KH 2PO 4 – 1,0; acetat de zinc –
0,00816; autolizat de drojdii – 10 ml; apă potabilă – 1L; pH – 5,0-6,0.
2) Inocularea cultu rii de levuri pe mediul nutritiv de fermentație
Materialul semincer tratat cu unde milimetrice (2×106 celule/ml) se introduce în volum de
5% din volumul mediului nutritiv .
3) Cultivarea submers ă dirijată a levurii
Procesul de cultivare decurge conform următorilor parametri:
– Cultivarea submersă se va efectua în baloane Erlenmeyer cu capacitate de 1 L
– Temperatura mediului în timpul procesului de cultivare se menține 25 °C
– Gradul de aerare 81…83 mg/L
– Durata procesului de cultivare 120 ore, agitare permanentă
– Nu se permite poluarea cu microfloră străină.
III. Procesarea biomasei levuriene include:
1) Separarea biomasei levuriene de lichidul cultural;
2) Procesul de extragere a β-glucanilor din biomasa levuriană.
1) Separarea biomasei levuriene de lichidul cultural
La finalul procesului de fermentare se efectuează separarea biomasei levuriene de lichidul
cultural prin centrifugare la 3000 r ot/min timp de 15 minute.
2) Procesul de extragere a β-glucanilor din biomasa levuriană
Dezintegrarea peret elui celular se efectuează aplic ând procedeul omogenizării biomasei
celulare: 10 g drojdie (30% S.U .) + 20 ml apă sterilă, amestecul se omogenizează timp de 10
minute la viteza de rotație 15000 rot/min (6F volum 30 ml ), în contact cu apa, umiditatea relativă
85%. Amestecu l se centrifughează. Sedimentul (pereții celulari) se tratează cu 50 ml 1N NaOH
timp de 1 oră la temperatura de 90 °C. Sedimentul se colectează și se tratează cu 0,5 N acid acetic
în raport de 1:5, la 75 ±5 °C timp de 1 oră (în scopul eliminării glicogenului) . Sedimentul se spală
de 2 ori cu apă distilată, se centrifughează, se usucă la 50±5 °C. Produsul obținut este β-glucanul.
IV. Caracterizarea și marcarea produsului include:
1) Caracteristica fizico -chimică ;
2) Dozaj, ambalare, etichetare .
1) Caracteristica fizico -chimică a produsului
Bioprodusul, obținut din pereții celulari a tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20, reprezintă
cristale de culoare bej -gălbuie, insolubile în solvenți organici (alcool, eter, acetonă, benzoat, eter

117 petroleic) și greu s olubile în apă. Puritatea produsului se examinează p rin spectroscopie în
infraroșu [276] .
2) Dozaj, ambalare, etichetare
Bioprodusul se trece cantitativ cîte 1 -5 g în flacoane de sticlă mată. Fiecare flacon se
etichetează indicându -se denumirea produsului, data, numărul lotului, termenul de valabilitate.
Bioprodusul se păstrează la temperatura de +4 °C (Figura 4.22 ).

Fig. 4.22. Produsul ,,Glucan -20” pulbere obț inut din levura S. cerevisiae CNMN -Y-20.

4.3.2. E valuare a eficienței tehnologiei elaborate
Pentru a compara eficien ța tehnologiei elaborate , au fost montate experien țe care au avut la
bază procese tehnologice cu parametrii tehnici standard . În aceste cercet ări s-a utilizat mediul de
fermenta ție YPD , materialul semincer nu a fost tratat cu unde milimetrice , s-a aplicat metoda de
extragere a ß-glucanilor propusă de Thammakiti [244], temperatura de cultivare , gradul de aerare
și durata de cultiv are (ore) a tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20 au fost identice cu cele din
variantele experimentale .
Pe parcursul derulării investigațiilor au fost monitorizați indicii: cantitatea de β-glucani,
carbohidrați totali, biomasă uscată, protein e.
Analiza rezultatelor obținute în cadrul experiențelor cu utilizarea mediului YPD -4 a scos în
evidență eficiența aplicării tehnologiei noi, care constă în obținerea a 1,26±0,29 g/L β-glucani,
ceea ce depășește martorul cu 68,2 %. Cantitatea netă de biomas ă obținută la aplicarea
tehnologi ei cu parametrii tehnici elabora ți este de 6,18±0,65 g/L față de 4,6±1,04 g/L pentru
tehnologia martor (Tabelul 4.2). În conformitate cu calculele efectuate, cantitatea de carbohidrați
totali în biomasa tulpinii la cultivare conform fluxului tehnologic elaborat este de 52,86±1,4 % la
S.U. comparativ cu 46,36±2,75 % la S. U. specific tehnologiei martor. Conținutul de β -glucani în

118 peretele celular const ituie 20,29% comparativ cu 16,2 % determinate în varintele de control, ceea
ce este cu 25,2 la sută mai mult comparativ cu indicii obținuți la utilizarea tehnologiei martor.
Pornind de la faptul că modificare a condițiilor de cultivare poate duce la declanșarea unor
procese fiziologice cu efecte asupra biosintezei componentelor celulare, am aplicat un studiu ce
include aprecierea nivelului de protein e. Conform rezultatelor obținute, cele mai mari valori ale
conținutului de protein e la tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20 au fost stabilite la aplicarea
tehnologiei elaborate, indicii cărora constituie 42,45±1,80 % prot eine ceea ce este cu 40 la sută
mai mult comparativ cu indicii obținuți la utilizare a tehnologiei martor (Tabelul 4.2 ).

Tabelul 4.2. Nivelul indicatorilor biologici a tulpinii de levuri S. cerevisiae CNMN -Y-20 la
cultivare conform proceselor tehnologice standard și experimentale, mediul de fermentație YPD -4.
Nr.
d/o Indicii monitorizați Tehnologia
martor Tehnologia nouă (mediul
YPD -4)
Nivelul
indicatorului % la
martor
1. β-glucani, g/L mediu de cultură 0,752±0,22 1,265±0,29 168,2
2. β-glucani, % la S.U . 16,2±1,14 20,29±2,76 125,2
3. Carbohidrați totali, % la S.U . 46,36±2,75 52,86±1,4 114,0
4. Biomasă uscată, g/L mediu de cultură 4,6±1,04 6,18±0,65 134,3
5. Protein e, % la S.U. 30,12±1,30 42,45±1,80 140

Analiza rezultatelor obținute în cadrul experien țelor cu utilizarea tehnologiei elaborate în
care s-a utilizat mediul optimizat R-ZZ, a scos în eviden ță acelea și legități ale activit ății
biosintetice a tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20. Aplicarea noilor procedee de cultivare permite
obținerea a 0,813±0,13 g/L β-glucani ceea ce depășește martorul cu 91,7% ( Tabelul 4.3).

Tabelul 4.3. Nivelul indicatorilor biologici a tulpinii de levuri S. cerevisiae CNMN -Y-20 la
cultivare conform proceselor tehnologice standard și experiment ale, mediul de fermentație R -ZZ.
Nr.
d/o Indicii monitorizați Tehnologia
martor Tehnologia nouă
(mediul R -ZZ)
Nivelul
indicatorului % la martor
1. β-glucani, g/L mediu de cultură 0,424±0,03 0,813±0,13 191,7
2. β-glucani, % la S.U . 21,19±0,8 27,10±0,46 128
3. Carbohidrați totali, % la S.U . 42,07±6,74 44,55±4,64 106
4. Biomasă uscată, g/L mediu de cultură 2,0±0,12 3,0±0,1 150
5. Protein e, % la S.U. 26,27±1,0 31,56±1,4 120
Astfel , putem afirma cu siguranță că tehnologia propusă permite sporirea atât a
conținutului de β-glucani, obținut la 1 L de mediu de cultivare, cât și a nivelului valorilor altor

119 indicatori biologici a tulpinii de levuri S. cerevisiae CNMN -Y-20, ceea ce confirmă că
procedeele și condițiile integrate într -un singur flux tehnologic asigură o eficiență înaltă a
tehnologiei elaborate. În rezultatul aplicării acestei tehnologii de culti vare, obținem cu
68,2… 91,7% mai mult bioprodus față de procedeu l de referință .
Următoarea etapă a studiului constă în caracterizarea fizico -chimică a β-glucanilor izolați
din pereții celulari ai levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20.
Struc tura β -glucanilor este un factor important al calității. Actualmente este confirmat că
structura β-glucanilor depinde de procedeele de izolare și uscare. Relevanța acestei ipoteze este
confirmată de cercetările efectuat e la utilizarea a două proceduri diferite de izolare din dr ojdia de
bere a β-glucanilor ins olubili în apă: izolare alcalin -acidă (AA) și izolare alcalin -acidă cu
indepărtarea manoproteinelor (AAM) . β-glucani i izolați din biomasa levuriană se analizează prin
spectroscopia în infraroșu (FTIR) [276]. Autorii au constatat că β-glucanii, uscați prin diferite
procedee: cu aer, liofilizare și uscare prin pulverizare, au avut structuri diferite. Preparatele de β-
glucani obținute prin procedeele de izolare (AA) și (AAM) au avut valori similare ale masei
uscate, a conținutului de polizaharide totale, proteinei și elementelor organice. In mod
semnificativ au fost afectate, fracțiile de β-glucani din totalul de polizaharide. Liofiliz area și, în
special, uscarea cu aer au cauzat un grad mai mare de aglomerare și modificări a microstructurii
β-glucanilor (Figura 4.23).
a) b)
Fig. 4.23. Structura microscopică a β-glucanului uscat cu aer (a) și liofilizat (b), izolat
prin procedura alcalin -acidă [276].
Toate aceste informații pot fi valorificate la analiza β-glucanilor obținuti din alte tulpini de
levuri.
Referitor la caracterele fizico -chimice determinate ale β-glucanilor obținuți din pereții
celulari ai levurilor S. cerevisiae CNMN -Y-20, aplicând procedeul de extragere simplificat,
putem menționa cristale inodore, de culoare bej -gălbuie, greu solubile în solvenți organic
(alcool, acetonă, eter petroleic) și în apă. Compoziția produsului „Glucan -20” este redată în
Tabelul 4.4 . Puritatea s -a identific at prin determinarea prezenței proteinei, glicogenului.

120 Tabelul 4.4. Compoziția chimică a produsului „Glucan -20” (raportată la substanța uscată) .
Produsul β-
glucan,
g % Glicogen,
g % Carbohidrați
totali,
g % Proteine,
g %
Alte
impurități,
%
Glucan -20
pulbere 90…93,0 2,4 3,2 1,0 3,0…0,3

Caracteristicile fizico -chimice a β-glucanilor prezintă criterii importante în aprecierea
adecvată a materialului vizat pentru utilizare în diferite domenii. Ulterior, bioprodusul Glucan -20
obținut a fost propus în calitate de supliment alimentar și furajer pentru sporirea statutului imun
al puietului de pești fitofagi .

4.3.3. Valorificarea bioprodusului Glucan -20 obținut din levura S. cerevisiae CNMN -Y-20
Preparatul de β-glucani a fost utilizat la furajarea puietului de pește, în particular pentru
fortificarea viabilității și indicilor de creștere a puietului de cosaș ( Ctenopharyngodon idella ).
Cercetările au fost efectuate în colaborare cu cercetătorii Institutului de Zoologie ,
laboratorul Ihtiologie și Acvacultură.
Materialul biologic a fost reprezentat de puiet din specia de cosaș ( Ctenopharyngodon
idella ) cu greutatea inițială medie de 1,185±0,318 g. Pentru a urmări evoluția parametrilor fizico –
chimici a apei din incubatoare, pe parcursul desfășurării experiențelor, s -au exercitat măsurări de
determinare a temperatur ii, oxigenului dizolvat , pH-ului.
Experiențele au fost efectuate pe un număr de 160 exem plare în 3 loturi: lotul martor – 53
larve; lotul II – 54 larve; lotul III – 53 larve. Perioada experimentală a durat 20 zile.
Metoda de furajare utilizată a fost cea manuală, numărul de tainuri a fost adaptat în funcție
de vârsta puietului și a constituit 75 -50% furaj la o unitate de masă a larvei.
Observațiile asupra dezvoltării larvelor s -au efectuat după 10 și 20 zile de la inițierea
experimentelor. La fiecare citire s -a determinat mortalitatea și indicii de creștere a puietului de
cosaș.
În experiențele efectuate au fost cercetate următoarele va riante de rețete furajere:
Varianta I (unit. masă,%): făină de pește – 35; drojdie de vin uscată – 40; făină de
tescovină de struguri –15; lapte praf – 7,9; bioprodusul Glucan -20 – 0,1; metionină – 1,0; premix
vitamino -mineral – 1,0.

121 Varianta II (unit. masă,%) : făină de pește – 30; drojdie uscată de vin – 30; făină de
tescovină de struguri – 30; lapte praf –7,5; bioprodusul Glucan -20 – 0,5; metionină – 1,0; premix
vitamino -mineral – 1,0.
Varianta III (martor) (unit. masă,% ): autolizat de drojdii – 48…50; făină de pește – 34…
35; făină de grâu – 7…6; lapte praf – 7…8; metionină – 0,5…1,0; premix vitamino -mineral –
0,5…1,0 [ 3].
Rezultatele au demonstrat că sporul maximal de supraviețuire a larvelor de cosaș este de
26,7% și este specific pentru rețeta II de furaj. Valorile medii a indicilor liniari a larvelor de
cosaș la cele două loturi luate în studiu , prezintă o creștere cu 6,3… 9,8% comparativ cu in divizii
din lotul martor. Analiza masei corporale la puietul de cosaș după 20 zile a constatat diferențe
semnificative (p<0,01) în favoarea ambelor rețete furajere comparativ cu lotul martor. Sporul
masei corporale constituie 17 -24%. Rezultate pozitive s -au stabilit și în cazul estimării greutății
medii corporale. Cele mai mari valori ale ratei de creștere, g greutate medie corporală, se
constată în cazul lotului experimental în care puietul de cosaș a fost hrănit cu rețeta II de furaj,
unde valorile greută ții medii corporale au constituit 56,128±7,628 g sau cu 56,3% mai mult față
de martor (Figura 4.24). Pentru receta II de furaj s-a obținut brevet de invenție [ 8].

Fig. 4.24. Indicii productivi ai puietul ui de cosaș Ctenopharyngodon idella .

Prin urmare, pe baza rezultatelor cercetărilor efectuate putem face unele recomandări
privind utilizarea β-glucanilor obținuți din levuri la îmbunătățirea performanțelor productive ale
puietului de pești. Cercetările pot servi la efectuarea altor tipuri de experimente sau tehnologii
noi de creștere a puietului de specii fitofage.
Receta nouă de furaj a fost utilizată în condiții de producere industrială. Testarea a fost
efectuată la întreprinderea individuală ,,Marin Alexandru”. Rezultatele confirmă eficiența înaltă
a furajului elaborat, care contribuie la sporirea procentului de viabilitate și ihtiomasei puietului 30507090110130150170190
supraviețuirea
larvelormasa corporală a
unei larveihtiomasa generală% la martorRețeta I Rețeta II Rețeta martor

122 de pești fitofagi cu 20 -30% (Act de implementare din 17.07.2014, Act de implementare din
17.07.20 15 și Act de implementare din 10.10.2016)

4.4. Concluzii la capitolul 4
1. Reacția de răspuns a tulpinii S. cerevisiae CNMN -Y-20 la acțiunea undelor milimetrice cu
frecvenț ele 60,12 GHz; 53,33 GHz; 42,19 GHz se manifestă în dependență de frecvență și
durata de iradiere. Efectul biologic al undelor milimetrice are un prag temporar, 20 minute,
după care expunerea levurii la iradiere nu conduce la mărirea efectului biologic [62, 89 ].
2. Procedeul elaborat de cultivare a S. cerevisiae CNMN -Y-20, care includ e etapa d e iradiere
a inoculului cu undele milimetrice 53,33 GHz timp de 20 minute asigură rentabilitate,
datorită creșterii cantității de β-glucani în biomasa levuriană cu 25,7% față de martor [7,
62].
3. Tehnologia complexă de producere a β-glucanilor, elaborată în baza elementelor noi –
tulpinii de levuri cu capacități biotehnologice performante, mediilor nutritive eficiente,
condițiilor optimizate de cultivare în profunzime, tratarea materialului semincer cu unde
milimetrice cu frecvență e xtra înaltă, aplicarea procedeului modificat de extracție a β-
glucanilor, permite obținerea cu 68,2…91,7% mai mult produ s comparativ cu tehnologia
martor [20, 24 ].
4. Furajul combinat pentru creșterea puietului de pești fitofagi , ce con ține în componența sa
bioprodusul Glucan -20 în cantitate de 0,1 -0,5 unit. masă, %, duce la sporirea cu 22,0 –
26,7% a ratei de supraviețuire , cu 16,9 -24,0% a masei medii a unei larve și cu 45,2 -56,3%
a ihtiomasei generale medii [8, 25].

123 CONCLUZII GENERALE ȘI RECOMANDĂRI

Reali zarea cercetărilor și analiza rezultatelor obținute în cadrul tezei de doctor „Tehnologie
de obținere a β-glucanilor din levuri ” au condus la formularea următoarelor concluzii:
1. Parametrii biotehnologici determinați de cultivare dirijată a levurii S. cerevisiae CNMN –
Y-20, contribuie la eficientizarea tehnologiei de producere a β-glucani lor cu utilizări
polivalente, în vederea aplicării lor în diferite domenii.
2. Mediile de cultură optimizate R -ZZ și YPD -4 și condițiile de cultivare, valoril e de
temperatură – 25°C, aerație – 81,3…83,3 mg O 2/L, durata de cultivare – 120 ore,
specifice tulpinii producătoare, sporesc producerea de β-glucani la levura S. cerevisiae
CNMN -Y-20 cu 32,8% și respectiv 52,4% [13, 21, 22 ].
3. Efectele nanoparticulelor TiO 2 și ZnO asupra biosintezei β-glucanil or și altor componente
celulare sunt determinat e de dimensiun ea acestora , concentrați a și durata de contact cu
tulpina S. cerevisiae CNMN -Y-20. Nanoparticulele ZnO cu dimensiuni de 30 nm, în
concentrație de 5 -10 mg/L se manifestă ca factor de stimulare a biosintezei β-glucanilor
la levuri [14, 25 4].
4. Nanoparticulele ZnO, în prezența concentrațiilor de 2% și 5% alcool etilic, intensific ă
procesele de biosinteză a β-glucanilor, conținutul cărora în biomasa S. cerevisiae CNMN –
Y-20 crește cu 19,9% mai mult față de probele martor , dar nu asigură intensificarea
biosintezei prote inelor [88].
5. Caracterul acțiunii undelor milimetrice cu frecvențele 60,12 GHz; 53,33 GHz; 42,19 GHz
asupra levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20 este determinat de frecvența și durata de
iradiere. Aplicarea undelor cu frecvența f=53,33 GHz ti mp de 20 minute la etapa
prepară rii materialului semincer, permite majorarea conținutului de β-glucani în biomasa
celulară cu 25,7% mai mult față de martor, astfel se propune o cale nouă de reglare a
biosintezei β-glucanilor la levuri [ 7, 12, 20, 62, 89].
6. Tehnologia complexă de producere a β-glucanilor, elaborată în baza elementelor noi –
tulpina de levuri cu capacități biot ehnologice performante, medii nutritive eficiente,
condiții optimizate de cultivare în profunzime, tratarea materialului semincer cu un de
milimetrice cu frecvență extra înaltă, aplicarea procedeului modificat de extracție a β-
glucanilor, permite obținerea a 0,81…1,26 g/L bioprodus , comparativ cu 0,42…0,75 g/L
β-glucani ai tehnologi ei martor [24].
7. Preparatul elaborat în baza β-glucanilor , extrași din levuri , manifest ă activitate biologic ă,
exprimat ă prin sporirea cu 22,0 -26,7% a ratei de supraviețuire, cu 16,9 -24,0% a masei

124 medii a unei larve și cu 45,2 -56,3% a ihtiomasei generale medii a pești lor fitofagi , ceea
ce indică asupra perspectiv ei utilizării lui în domeniul pisciculturii [8, 25 ].
Problema științifică importantă soluționată în lucrare. Au fost determina ți parametrii
biotehnologici optimali de cultivare a levurii S. cerevisiae CNMN -Y-20, ceea ce a contribuit la
eficienti zarea procedeelor de sinteză orientată a β-glucanilor, fapt ce a permis elaborarea
tehnologiei de obținere a acestor compuși biologic activi valoroși .
Aportul personal. În materialele care reflectă conținutul brevetelor de invenție autoarei îi
revine cota parte în corespundere cu lista autorilor. Toate celelalte rezultate obținute, analiza lor,
generalizările și concluziile aparțin autoarei.
Recomandări practice
Se recomandă :
1. Tulpina de levuri S. cerevisiae CNMN -Y-20 în calitate de sursă de ß -glucani cu ut ilizări
polivalente.
2. Două variante de medii nutritive, care asigură sporirea semni ficativă a cantității de β-
glucani în biomasa levuriană;
3. Două procedee de sinteză orientată a ß-glucanilor cu aplicarea nanoparticulelor oxizilor
de metale și undelor milimetrice cu frecvență extra înaltă ca factori reglatori;
4. Tehnologia de obținere a ß -glucanilor din S. cerevisiae CNMN -Y-20 pentru producerea
industrială a bioproduselor naturale glucanice;
5. Bioprodusul Glucan -20 pentru utilizare în piscicultură și alte domenii .
Sugestii privind cercetări de perspectivă
1. Sunt de perspectivă cercetările în vederea procesării lichidului cultural, rez ultat din
producerea biomasei de levuri , datorită conținutului său sporit de componente valoroase:
exopolizaharide, vitamine, aminoacizi .
2. Se propun cercetări de det erminare a pro prietăților imunomodulatoare și anticancerigene
ale β-glucanilor obținuți din biomasa levuriană.
3. Sunt de perspectivă cercetările pentru dezvoltarea industrială și experimentală la nivel
pilot pentru stabilirea parametrilor tehnologici optimi.

125 BIBLIOGRAFIE:
În limba român ă
1. Anghel I. ș.a. Biologia și tehnologia drojdiilor. București: Ed. Tehnică, 1993, vol. 3. 308 p.
2. Anghel I. ș.a. Biologia și tehnologia drojdiilor. Bucur ești: Ed. Tehnică. 1991, vol. 2. 385 p.
3. Brevet de invenție. 3792 MD. Furaj pentru larve și puiet de pește / Agafia Usatîi, Oleg
Chiselița , Oleg Crepis, Natalia Chiselița ș. a. (MD) BOPI nr. 1/2009.
4. Brevet de invenție. 4048 C1, MD, C12N 1/16 C12P 39/00. Tulpină de drojdie
Saccharomyces cerevisiae – sursă de β-glucani/ Chiselița O. ș. a. (MD). Cerere depusă
12.02.2010, BOPI nr. 6/2010.
5. Brevet de invenție . 4086 MD , C12N 1/16, C 12 F 7/64. Mediu nutritiv pentru cultivarea
tulpinii de drojdie Saccharomyces cerevisiae CNMN -Y-20 / Oleg Chiselița , Agafia Usatîi,
Natalia Chiselița, Aurelian Gulea . (MD). Cererea depusă 2010.09.08, BOPI nr. 12/2010.
6. Brevet de invenție. 4205 MD. Metodă de determinare a activității catalazei. /Nadejda
Efremova, Agafia Usatîi, Elena Molodoi (MD). BOPI nr. 2/2013 .
7. Brevet de invenție. MD 4329. Procedeu de cultivare a tulpinii de levuri S. cerevisiae
CNMN -Y-20 / Agafia Usatîi, Natalia Chiselița ș. a. (MD). BOPI nr. 2/2015 .
8. Brevet de invenție. MD 717. Furaj pentru puiet de pești fitofagi / Agafia Usatîi, Ana
Dadu, Natalia Chiselița , Marin Usat îi. (MD). BOPI nr. 1/2014 .
9. Buteică S. A. Nanoparticule de oxid de fier cu înveliș polar: proprietăți și perspective
biomed icale. Rezumat Teză de doctorat, Universitatea de Medicină și Farmacie din
Craiova, Craiova, 2014 . 11p.
10. Chiselița N. Efectele undelor milimetrice asupra procesului de dezvoltare a populației
levurii Saccharomyces cerevisiae CNMN -Y-20 în funcție de durata iradierii. În: Studia
Universitatis Moldaviae, seria „Științe reale și ale naturii”. 2014, vol. 1(71), p. 67 -72.
11. Chiselița N. Influența nanoparticulelor ZnO asupra tulpinii Saccharomyces cerevisiae
CNMN -Y-20 în condiții de stres alcoolic. În: Buletinul Academiei de Științe a Moldovei.
Științele vieții. 2017, Nr. 1(331), p. 124 -132.
12. Chiselița N., ș.a. Efectele undelor milimetrice asupra viabilității și caracterelor morfo –
culturale ale tulpinii Saccharomyces cerevisiae CNMN -Y-20. În: Buletinul Academiei de
Științe a Moldovei. Științele vieții. 2014, Nr. 1(322), p. 112 -119.
13. Chiselița N., ș.a. Optimizarea matematică a mediului de cultură pentru producerea ß-
glucanilor la tulpina Saccharomyces cerevisiae CNMN -Y-20. În: Studia Universitatis,
seria „Științe ale naturii”. 2013, vol. 6(66), p. 49 -53.
14. Chiselița N., Usatîi A. Efectul nanoparticulelor ZnO asupra parametrilor bioproductivi ai
tulpinii biotehnologice de levuri Saccharomyces cerevisiae CNMN -Y-20. În: Buletinul
Academiei de Științe a Moldovei. Științele vieții. 2016, Nr. 2(329), p. 134 -141.
15. Marinescu Constantin G . Cercetări privind valorificarea biomasei de drojdie reziduală din
industria berii. Rezumat teză de doctorat. Galați, 2011. 40 p.
16. Moldoveanu D.; Militaru C.; Moldoveanu I. Microbiologie și inginerie genetică.
București: Fiat Lux, 2001. 352 p.
17. Oniscu C., Cașcaval D . Inginerie biochimică și biotehnologie. 1. Ingineria proceselor
biotehnologice. Iași : Inter Global, 2002. 451 p.

126 18. Simion A. Radoi, ș. a. Materiale nanostructurate: aplicatii practice în nanomedicină și bio –
senzoristică. In: Workshop -ul „Nano Sisteme Dinamice: de la Concepte la Aplicații
Senzoristice” Centrul Internațional de Biodinamică, București , 22 -23 sept. 2010, p. 26.
19. Usatîi A., Chiselița N. Metode de extragere din levuri a glucanilor și proprietățile lor
fizico -chimice. În: Buletinul AȘM. Științele vieții. 2015, Nr. 1(325), p. 153 -160.
20. Usatîi A., Chiselița N. Soluții inovative de cultivare a levurilor producătoare de β-
glucani. În: Intellectus. 2016, Nr. 4, p. 77 -80.
21. Usatîi A., Chiselița N., ș.a. Substraturi nutritive pentru dezvoltarea și biosinteza
maximală a β-glucanilor la tulpina Saccharomyces cerevisiae CNMN -Y-20. În: Buletinul
AȘM. Științele vieții. 2013, Nr. 3(321), p. 123 -131.
22. Usatîi A., Chiselița N., ș.a. Rolul condițiilor de cultivare în biosinteza β-glucanilor la
Saccharomyces cerevisiae CNMN -Y-20. În: Buletinul Academiei de Științe a Moldovei.
Științele vieții. 2013, Nr. 2(320), p. 116 -125.
23. Usatîi A., ș.a. Saccharomyces carlsbergensis CNMN -Y-15 la cultivare în prezența
compușilor coordinativi ai Mn(II), Cr(II) și Zn(II). În: Buletinul Academiei de Științe a
Moldovei. Științele vieții. Chișinău, 2009, vol. 1(307), p. 142 -147.
24. Usatîi A., Molodoi E. , Chiselița N., ș.a. Biotehnologii de obținere din levuri a β-
glucanilor și manoproteinelor. În: Akademos. 2015, Nr. 1(36), p. 87 -91.
25. Usatîi M., Dadu A., Usatîi A., Chiselița N. Fortificarea viabilității și indicilor de creștere
a puietului de cosaș ( Ctenopharyngodon idella) prin utilizarea tescovinei de struguri și
bioproduselor levuriene. În: Știința Agricolă. 2013, Nr. 2, p. 101 -105.
26. Zarnea G., Mihăescu Gh., Velahorschi T. Principii și tehnici de microbiologie generală.
București, 1992. vol. 1. 141 p.
În limba rusă
27. Андреев А . В. Применение электромагнитного излучения крайне высокой частоты
мм-диапазона и препарата «Этасульфон» при бронхопневмонии телят . Автореф .
Дисс . канд ветерин . наук . По специальности 06.02.01 – «Диагностика болезней и
терапия животных, патология, онкология и морфология животных» . п.
Персиановский , 2012 . 22 c.
28. Бабицкая В. Г., и др. Факторы, влияющие на образование полисахаридов G. lucidum .
В: Прикл. Биохим. и Микробиол. , 2005, т. 41(2), с. 194 -199.
29. Бескаравайная Е., Митрошин И., Харыбина Т. Тематическая коллекция «Влияние
миллиметровых волн КВЧ -диапазона на биологические объекты». В:
Информационные ресурсы россии , 2009, №1, c. 14-16.
30. Бецкий О., Девятков Н. Электромагнитные миллиметровые волны и живые
организмы . B: Радиотехника, 1996, № 9 -10, с. 4 -10.
31. Бецкий О. В., Котровская Т. И., Лебедева Н. Н. Миллиметровые волны в биологии
и медицине. 3 Всерос. Конф. Радиолокация и радиосвязь, 2009, ИРЭ РАН, 26 -30
октября 2009 , с. 146 -150.
32. Бецкий О. В., Лебедева Н . Н. Биологические эффекты миллиметровых волн низкой
интенсивности. //12th Int.Crimean Conference “Microwave & Telecommunication
Technology”(CriMiCo’2002). 2002, 9 -13september, Sevastopol, Crimea, Ukraine.

127 ©2002:CriMiCo’2002 Organizing Committee; Weber Co. ISBN: 966 -7968 -12-X. IEEE
Catalog Number : 02EX570.
33. Бурцева С. А., Маслоброд С. Н., Бырса М. Н. Оценка влияния миллиметрового
излучения на биологическую активность экзометаболитов стрептомицетов. В:
Материалы XXIII Международного Симпозиума «Охрана био -ноосферы.
Нетрадиционное растениеводство. Эниология. Экология и здоровье», 2014,
Алушта, 7 -14 сент ., c. 733-739.
34. Буряков Н. П., Бурякова М. А., Миронов М. М. Показатели обмена веществ и
продуктивности цыплят -бройлеров при использовании в кормлении пребиотика
«Сель Ист» . В: РВЖ СХЖ 2015 , № 1, c. 13 -15.
35. Гапеев А. Б., Чемерис Н. К. Механизмы биологического действия
электромагнитного излучения крайне высоких частот на уровне организма. В:
Биомедицинская радиоэлектроника, 2007, №8 -9, c. 30 -46.
36. Гапеев А. Б., Чемерис Н. К. Механизмы биологического действия
электромагнитного излучения крайне высоких частот на клеточном уровне. В:
Биомед. технологии и радиоэлектроника , 2007 , N 2(4), c. 44-61.
37. Калюжин О. В., и др . Bлияние композ иции клеточных стенок Bifidobacterium
bifidum и Saccharomyces cerevisiae на выживаемость мышей в условиях
экспериментального сепсиса . В: Курский научно -практический вестник "Человек и
его здоровье", 2012, № 3 , c. 10 -14.
38. Мазуркова Н. А. и др. «Взаимодействие наночастиц диоксида титана с вирусом
гриппа». Российские нанотехнологии, 2010, № 5-6.
39. Маслоброд С. Н., и др. Влияние миллиметрового излучения на жизнеспособность
растений. Изменение метаболизма семян при опосредованном воздействии
фактора. В: Электронная обработка метериалов , 2011, том 47, №1, c. 81-86.
40. Осадчая А. И., и др. Способность бактерий рода Bacillus гидролизовать ксилан. В:
Мiкробiол. i Бiотехнол., 2009, т. 7, с. 63 -69.
41. Савельев С. В., Бецкий О. В., Морозова Л. А. Основные положения теории
действия миллиметровых волн на водосодержащие и живые биологические
объекты . В: Журнал Радиоэлектроники, 2012, № 11, c. 1-12.
42. Сырбу Т. Ф., и др. Влияние салицилатных и фуроатных комплексных соединений
железа на образование каталазы грибами рода Penicillium . В: Весцi Hацыянальнай
Акадэмii Навук Беларусi, 2011, nr. 3, c. 57 -61.
43. Феофилова Е. П. и др. Состав и содержание хитин -глюканового комплекса в
онтогенезе гриба A. niger . В: Прикл. Биохим. и Микробиол. , 2006, т. 42(6), с. 624 -628.
În limba engleză
44. Abramova A., et al. An ultrasound -assisted sol -gel method for the synthesis of nano
titanium dioxide. In: Moldavian J ournal of the Physical Sciences, 2016, vol. 15(1 -2), p.
49-53.
45. Abu-Lail N. I., Camesano T. A. Polysaccharide properties probed with atomic force
microscopy. In: Journal of Microscopy, 2003, vol. 212, p. 217 -238.
46. Aebi H. Catalase in Vitro. In: Methods in Enzymology, 1984, no. 105, p. 121 -126.

128 47. Aguilar -Uscanga B., et al. Effect of Agave tequilana juice on cell wall polysaccharides of
three Saccharomyces cerevisiae strains from different origins. In: Antonie van
Leeuwenhoek. 2007, V. 91, nr. 2, p. 151 -157.
48. Aguilar -Uscanga B ., François J . M. A study of the yeast cell wall composition and
structure in response to growth conditions and mode of cultivation. In: Lett. Appl .
Micro biol., 2003, vol. 37( 3), p. 268 -274.
49. Ahmad A. , et al. Perspective of β-Glucan as Functional Ingredient for Food Industry. In:
J. Nutr. Food Sci., 2012, vol. 2(2), p.1 -6.
50. Ahmed Istiaque , Istivan T., Pirogova E. Irradiation of E. coli by extremely -low frequency
(ELF) pulsed electromagnetic fields (PEMF): evaluation of bacterial survival. In:
JEMWA , 2015, vol. 29( 1), p. 26 -37.
51. Albeituni S. H., Yan Jun . The. Effects of β -Glucans on Dendritic Cells and Implications
for Cancer Therapy. In: Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry (Formerly Current
Medicinal Chemistry – Anti-Cancer Agents), 2013, vol. 13( 5), p. 689 -698.
52. Anton E., et al. Links betwee n extremely high frequency electromagnetic waves and their
biological manifestations. In: Archives of Biological Sciences, 2015 , vol. 67 (3), p. 895 -897.
53. Ariane Fernanda da Silva, et al. Anticlastogenic effect of β-glucan, extracted from
Saccharomyces cerevisiae , on cultured cells exposed to ultraviolet radiation. In:
Cytotechnology, 2013, vol. 65, p. 41 -48.
54. Arora S ., Radjwade J . M., Paknikar K . M. Nanotoxicology and in vitro studies -the need
of the hour. In: Toxicol Appl Pharmacol., 2012, vol. 258, p. 151 -165.
55. Auinger A., et al. Yeast (1,3) -(1,6) -beta-glucan helps to maintain the body’s defence
against pathogens: a double -blind, randomized, placebo -controlled, multicentric study in
healthy subjects. In: European Journal of Nutrition, 2013, vol. 52( 8), p. 1913 -1918.
56. Backhaus K., et al. Milk and sugar: regulation of cell wall synthesis in the milk yeast
Kluyveromyces lactis . In: Eur. J. Cell Biol. , 2011, vol. 90, p. 745 -750.
57. Badia R ., et al. Effect of Saccharomyces cerevisiae var. Boulardii and β-galactomannan
oligosaccharide on porcine intestinal ep ithelial and dendritic cells challenged in vitro
with Escherichia coli F4 (K88). In: Vet. Res., 2012 , vol. 43(4), p. 1 -11.
58. Balasundaram B., Harrison S., Bracewell D. G. Advances in product release strategies
and imp act on bioprocess design. In: Trends Biotechnol. , 2009, vol. 27, p. 477 -485.
59. Ban D. K., Subhankar P. Zinc Oxide Nanoparticles Modulates the Production of β-
Glucosidase and Protects its Functional State Under Alcoholic Condition in Saccharomyces
cerevisiae . In: Appl. Biochem . Biotechnol. , 2014, vol. 173, p. 155 -166.
60. Barberis M., et. al. Cell size at S phase initiation: an emergent prope rty of the G1/S
network PLoS. In: Comput. Biol. 2007, V ol. 13, N. 3(4), p. 64.
61. Bayr E., et al. The effects of different intensities, frequencies and exposure times of
extremely low -frequency electromagnetic fields on the growth of S. aureus and E. coli
O157:H7. In: Electromagnetic Biol. and Medicin e, 2015 , vol. 34(1), p. 14-18.
62. Bejenaru L., Usatîi A., Tofan E., Chiselița N., Efremova N. Modification of Biomass
Production and Biochemical Composition of Saccharomyces cerevisiae CNMN -Y-18
and Saccharomyces Cerevisiae CNMN -Y-20 Yeasts under the Action of Extremely High
Frequency Electromagnetic Radiation. În: Surface Engineering and Applied
Electrochemistry. Elektronnaya Obrabotka Materialov. 2017, Vol. 53, Nr. 1, p. 71 -76.

129 63. Belinchón M. M., Gancedo J. M. Glucose controls multiple processes in S. cerevisiae.
through diverse combinations of signaling pathways. In: FEMS Y. Res. , 2007, vol. 7(6 ), p.
808-818.
64. Berit A., et al. Effects of orally administered yeast -derived beta -glucans: A review. In:
Mol. Nutr. Food Res. , 2014, vol. 58, p. 183 -193.
65. Berthels N. J., et al. Discrepancy in glucose and fructose utilisation during fermentation by
S. cerevisiae wine yeast strains. In: FEMS Y. Res. , 2004, vol. 4(7), p. 683 -689.
66. Beuse M ., et al. O 2, pH value, and carbon source induced changes of the mode of
oscillation in synchronous continuous culture of S. cer evisiae . In: Biotechnol. Bioeng.
1999, vol. 20, nr 63(4), p. 410-417.
67. Blazejak St. , et al. Impact of magnesium and mannose in the cultivation media on the
magnesium biosorption, the biomass yield and on the cell wall structure of Candida utilis
yeast. In: Eur. Food Res. Technol. , 2008, vol. 227, p. 695-700.
68. Borchani Ch. , et al. Enzymatic process for the fractionation of baker’s yeast cell wall
(Saccharomyces cerevisiae ). In: Food Chemistry, 2014, vol. 163, p. 108 -113.
69. Borchani Ch. , et al. Structural Characterization, Technological Functionality and
Physiological Aspects of Fungal β-D-Glucans: A Review. In: Critical Reviews in Food
Science and Nutrition, 2016, vol. 56(10), p. 1746 -1752.
70. Brian K. McFarlin, et al. Baker’s Yeast Beta Glucan Supplementation Increases Salivary
IgA and Decreases Cold/Flu Symptomatic Days After Intense Exercise. In: Journal of
Dietary Supplements, 2013 , vol. 10(3) , p. 171-183.
71. Broadway P. R., Carroll J. A., Burdick Sanchez N. C. Live Yeast and Yeast Cell Wall
Supplements Enhance Immune Function and Performance in Food -Producing Livestock:
A Review. In: Microorganisms , 2015 , vol. 3, p. 417 -427.
72. Bruna Leonel Goncalves, et al. The in vitro ability of different Saccharomyces cerevisiae
– Based products to bind aflatoxin B1. In: Food Control , 2015, vol. 47, p. 298 -300.
73. Burtseva S. A., et al . Effect of Millimeter Electromagnetic Radiation on the Protein
Content and Amino Acid Composition of Streptomyces Biomass. In: Surface Engineering
and Applied Electrochemistry , 2012, vol. 48(4), p. 359 -364.
74. Bzducha -Wróbel A., Błażejak St., Tkacz K. Cell wall structure of selected yeast species
as a factor of magnesium binding ability. In: Eur. Food Res. Technol. , 2012, vol. 235( 2),
p. 355-366.
75. Bzducha -Wrobel A., et al. Biosynthesis of β (1,3)/(1,6) -glucans of cell wall of the yeast
C. utilis ATCC 9950 strains in the culture media supplemented with deproteinated potato
juice water and glycerol. In: Eur. Food Res . Technol ., 2015 , vol. 240(5), p. 1023 -1034 .
76. Bzducha -Wrobel A., et al. Evaluation of the Efficiency of Different Disruption Methods
on Yeast Cell Wall Preparation for β-Glucan Isolation. In: Molecules , 2014 , vol. 19, p.
20941 -20961.
77. Bzducha -Wróbel A., Kieliszek M., Błażejak St. Chemical composition of the cell wall of
probiotic and brewer’s yeast in response to cultivation medium with glycerol as a carbon
source . In: Eur. Food Res. Technol. , 2013, vol. 237( 4), p. 489-499.
78. Cabib E., Blanco N., Arroyo J. Presence of a large beta(1 -3)glucan linked to chitin at the
Saccharomyces cerevisiae motherbudneck suggests involvement in localized growth
control. In: Eukaryotic cell, 2012 , vol. 11 (4), p. 388-400.

130 79. Campetelli A. N., et al. Activation of the plasma membrane H+-ATPase of S. cerevisiae. by
glucose is mediated by dissociation of the H+-ATPase acetylated tubulin complex . In:
FEBS J., 2005, vol. 272(22), p. 5742 -5752.
80. Carpenter K. C., et al. Baker’s yeast b -glucan supplementation increases monocytes and
cytokines post -exercise: implications for infection risk? In: British Journal of Nutrition,
2013, vol. 109, p. 478-486.
81. Chagas B., et al. Chitin -glucan complex production by Komagataella (Pichia) pastoris :
impact of cultivation pH and temperature on polymer content and composition. In: New
Biotechnology, 2014, vol. 31(5), p. 468 -474.
82. Charoenchai C., Fleet G., Henschke P. Effects of temperature, ph and sugar concentration
on the growth rate s and cells biomass of wi ne yeasts. In: Am. J. of Enol. a nd Viticul., 1998,
vol. 49, p. 283 -288.
83. Chen Jiezhong, Zhang Xu Dong, Jiang Zhengyi. The Application of Fungal Beta -glucans
for the Treatment of Colon Cancer. In: Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemi stry,
2013, vol. 13( 5), p. 725 -730.
84. Chen Jiezhong. Recent Advance in the Studies of Beta-glucans for Cancer Therapy . In:
Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemi stry, 2013, vol. 13( 5), p. 679 -680.
85. Chen S. C.-A., Slavin M. A., Sorrell T. C. Echinocandin a ntifungal drugs in fungal
infections. In: Drugs, 2011, vol. 71, p. 11 -41.
86. Chi Z. M., Zhao S. Z. Optimization of medium and cultivation conditions for pullulan
production by a new pullulan -producing yeast strain. In: Enzym. Microb. Technol. , 2003,
vol. 33, p. 206 -211.
87. Chin -Hang S., Ko -Jung L., Bor -Jiun W. Effects of culture temperature on the production of
bioactive polysaccharides by A. blazei in batch cultures. In: J. of Chem. Technol. &
Biotechnol., 2007, vol. 82(9 ), p. 831 -836.
88. Chiselița N., Usatîi A., Efremova N. The effects of ZnO nanoparticles in combination
with alcohol on biosynthetic potential of Saccharomyces cerevisiae . În: Acta
Universitatis Cibiniensis Series E: Food Technology, 2017, v. XXI (2), p. 19-24.
89. Chiselița N., et.al. Biosynthetic potential of Saccharomyces yeasts at the treatment with
extremely high frequency millimeter waves. În: Analele Universității din Oradea –
Fascicula Biologie . 2016, v. XXIII (1), p. 12 -16.
90. Chris D. P., David E. Q., Smart K. A. The impact of brewing yeast cell age on
fermentation performance, attenuation and flocculat ion. In: FEMS Y. Res., 2003, vol.
3(2), p. 149 -157.
91. Cifra M., et al. Ultra Low Frequency Yeast Cells Electric Activity. In: Microwave
Technigues, 2008, COMITE 2008, 14 th Conferecce on Microwave Techniques , Prague,
Czech Republic , 23-24 april 2008, p. 1 -4.
92. Citlali Garcia Saucedo . Developing a Yeast Cell Assay for Measuring the Toxicity of
Inorganic Oxide Nanoparticles. Chemical & Environmental Engineering Departament
University of Arizona. May 6th 2 010. http://www.erc.arizona.edu/seminar/Current –
2010/CitlaliGarcia_UA_5 -6-10.pdf
93. Coulon J., et al. Glycosylated Quantum Dots for the Selective Labelling of K. bulgaricus
and S. cerevisiae Yeast Strains. In: J. Fluoresc ., 2010, vol. 20, p. 591 -597.

131 94. Davidson J. F., et al . Oxidative stress is involved in heat -induced cell deatherior S.
cerevisiae . In: Proc. Natl. Acad. Sci. 1996, V. 93, N.10, p. 5116 -5121.
95. De Araujo T. V., et al. Effects of beta -glucans ingestion ( S. cerevisiae ) on metabolism of rats
receiving high -fat diet. In : J. Anim. Physiol. Anim. Nutr., 2017, vol. 101(2), p. 349 -358.
96. De Oliveira Silva V., et al. β-Glucans ( S. cereviseae ) Reduce Glucose Levels and
Attenuate Alveolar Bone Loss in Diabetic Rats with Periodontal Disease. In: PLoS One ,
2015, vol. 10(8): e0134742.
97. De Vita A., et al. Nonlinear interaction of electromagnetic radiation the cell membrane
level: response to stochastic fields. In: Progress In Electromagnetics Research B, 2011,
vol. 33, p. 45 -67.
98. Demirdoven A., Baysal T. The use of ultrasound and combined technologies in food
preserv ation. In: Food Rev. Int., 2009, vol. 25, p. 1 -11.
99. Deryabin D. G., et al. Comparative sensitivity of the luminescent Photobacterium
phosphoreum , Escherichia coli , and Bacillus subtilis strains to toxic effects of carbon –
based nanomater ials and metal nanoparticles. In: Microbiology, 2016, 85(2), p. 198 -206.
100. Desai Kiran M., et al. Use of an artificial neural network in modeling yeast biomass and
yield of β-glucan. In: Process Biochemistry. 2005, vol. 40 p. 1617 -1626.
101. Dey P., Harborn J. Methods in Plant Biochemistry. Carbohyd r. Academic Press, 1993,
vol. 2. 529 p.
102. Ding S. Y., Himmel M. E. The maize primary cell wall microfi bril: A new model
derived from direct visualization. In: J. Agric. Food Chem., 2006, vol. 54, p. 597 -606.
103. Dong -Ho S eo, et al. Effects of millimeter wave treatment on the germination rate and
antioxidant potentials and gamma -aminobutyric acid of the germinated brown rice. In:
Food Science and Biotechnology, 2016 , vol. 25(1), p. 111-114.
104. Du B ., Bian Z ., Xu B. Skin health promotion effects of natural beta -glucan derived from
cereals and microorganisms: a review. In: Phytother Res. , 2014, vol. 28(2), p. 159-166.
105. Du Bin, et al. An insight into anti-inflammatory effects of fungal beta -glucans. In: Trends
in Food Science & Technology , 2015, vol. 41( 1), p. 49 -59.
106. EFSA Panel on Dietetic Products, Nutrition and Allergies (NDA). Scientific opinion on
the safety of “yeast beta -glucans” as a novel food ingredient. In: EFSA J. , 2011, 9(5), p.
2137.
107. Egorova E., Kubatiev A. , Schvets V. Biological Ef fects of Metal Nanoparticles. Springer
International Publishing, 2016 . 292 p .
108. Elba M. Alcazar V., et al. Extraccion y cuantificacion de los polisacaridos de la pared
celular de las levaduras. In: e-Gnosis [online], 2016, v ol. 14 (2), art. 2, p. 1 -7.
109. El-Diasty E. M., et al. Antifungal activity of Zn O Nanoparticles against der matophytic
lesions of cattle. In: Romanian J. Biophys., 2013,vol. 23( 3), p. 191 -202.
110. El-Said Karim Samy, et al. Molecular mechanism of DNA damage induced by titanium
dioxide nanoparticles in toll -like receptor 3 or 4 expressing human hepatocarcinoma cell
lines. In: Journal of Nanobiotechnology, 2014, vol. 12(1), p. 48 -57.
111. Farkas V. Structure and biosynthesis of fungal cell walls: methodological approaches. In:
Folia Microbiology, 2003, vol. 48(4), p. 469 -478.

132 112. Feng Shi , Jikui Shi , Yongfu Li. Mechanochemical phosphorylation and solubilisation of
β-D-Glucan from Yeast S. cerevisiae and its biological activities. In: PLoS One , 2014 ,
vol. 9(7), e103494.
113. Forsberg H., Ljungdahl , P. O. Genetic and bioch. analysis of the yeast plasma membrane
Sy1p -Ptr3p -Sy5p sensor of extracellular amino acids . In: Mol. Cell Biol. , 2001, vol. 21, p.
814-826.
114. Francois J. M. A simple method for quantitative determination of polysaccharides in
fungal cell walls. In: Nature Protocols , 2006, vol 1(6), p. 2995 -3000.
115. Freimund S., et al. A new non -degrading isolation process for 1,3 -β-D-glucan of high purity
from baker's yeast S. cerevisiae . In: Carbohydrate Polymers . 2003, vol.54, p. 159 -171.
116. Gamaiurova V., Krinitskaya A., Astrahantseva M. The influence of EHF EMR non –
thermal intensity on the growth of the yeasts Saccharomyces cerevisiae . In: Biomed.
Technologies and Radioelectronics, 2004, vol. 1-2, p. 117 -120.
117. Garello F., et al. Successful Entrapping of Liposomes in Glucan Particles: An Innovative
Micron -Sized Carrier to Deliver Water -Soluble Molecules . In: Mol. Pharma ceutics, 2014,
11 (10), p. 3760 -3765 .
118. Garkusha O. M., et al. Infl uence of Low -Intensity Electromagnetic Millimeter Radiation
on the Vital Activity of S. cerevisiae Cells. In: Biophysics, 2008, vol. 53( 5), p. 402 -405.
119. Giavasis I . Bioactive fungal polysaccharides as potential functional ingredients in food
and nutraceuticals. In: Current Opinion in Biotechnology , 2014, vol. 26, p. 162 -173.
120. Giavasis I. Production of microbial polysaccharides for use in food. In Microbial
Production of Food Ingredients, Enzymes and Nutraceuticals. Edited by McNeil B,
Archer D, Giavasis I, Harvey L. Woodhead Publishing; 2013. 656 p.
121. Gopal Rao M., Bharathi P., Akila R.M. A comprehensive review on biopolymers. In: Sci.
Revs. Chem. Commun ., 2014, vol. 4(2), p. 61 -68.
122. Gromozova E. N., Voychuk S.I. Influence of radiofrequency EMF on the yeast S.
cerevisiae as model eukaryotic system . Inst. of Microbiol . and Virology , NAS Ukraine ,
2005, p.167-175.
123. Guțul T., et. al. Preparation of poly(N -vinylpyrrolidone) -stabiliz ed ZnO colloid
nanoparticles. In: Beilstein J. Nanotechnol., 2014, vol. 5, p. 402 -406.
124. Hashimoto K. Comprehensive analysis of glycosyltransferases in eukaryotic genomes for
structural and functional character of glycans. In : Carbohydr. Res., 2009, vol. 344(7), p. 881 -887.
125. Hassan A. A., Howayda M. E., Mahmoud H. H. Effect of Zinc Oxide Nanoparticles on
the G rowth of Mycotoxigenic Mould. In: SCPT. , 2013, vol. 1(4), p. 66-74.
126. He L., et al . The difference between oats and beta-glucan extract intake in t he
management of HbA1c, fasting glucose and insulin sensitivity: A meta -analysis of
randomized controlled trials. In: Food Funct. , 2016 , vol. 7(3), p. 1413 -1428.
127. Hideki Aoyagi, Mikiko Ishizaka, Hideo Tanaka . Secretory production of cell wall
components by S. cerevisiae protoplasts in static liquid culture. In: Biotechnology
Letters , 2012, vol. 34( 4), p. 695-700.
128. Hong-Zhi L iu, et al . Effects of spaceflight on polysaccaharides of Saccharomyces
cerevisiae cell wall. I n: Appl. Microbiol. Biotechnol. 2008, nr 81, p. 543-550.

133 129. Hong -Zhi Liu, et al . Statistical Optimization of Culture Media and Conditions for
Production of Mannan by Saccharomyces cerevisiae . In: Biotechnology and Bioprocess
Engineering , 2009, vol. 14(5), p. 577-583.
130. Hromadkova Z., et al. Influence of the drying method on the physical properties and
immunomodulatory activity of the particulate (1 –3) β -glucan from Saccharomyces
cerevisiae . In: Carbohydr. Polym. , 2003, vol. 51, p. 9 -15.
131. Huang Gang liang, Li Jing. Efficient preparation of alkali -insoluble (1,3) -β-D-glucan . In:
Int. J. Food Sci . Nutr., 2012, vol. 63(2) , p. 184 -186.
132. Hurtado -Guerrero Ramon, et al. Molecular Mechanisms of Yeast Cell Wall Glucan
Remodeling. In: J. of Biol. Chem., 2009, vol. 284(13), p. 8461 -8469.
133. Javmen A., et al. β-Glucan from Saccharomyces cerevisiae Induces IFN -γ Production In
Vivo in BALB/c Mice. In: In Vivo, 2015, vol. 29, p. 359 -364.
134. Javmen A., Grigiškis S., Gliebute R. β-glucan extraction from S. cerevisiae yeast using A.
rutgersensis 88 yeast lysing enzymatic complex. In: Biologija, 2012, vol. 58 (2), p. 51-59.
135. Jawhara S, et al. Modulation of Intestinal Inflammation by Yeasts and Cell Wall Extracts:
Strain Dependence and Unexpected Anti -Inflammatory Role of Glucan Fractions . In:
PLoS One, 2012, vol. 7(7), e40648 .
136. Jesenak M. , et al. β-Glucans in the treatment and prevention of allergic diseases. In:
Allergologia et Immunopathologia , 2014, vol. 42( 2), p. 149 -156.
137. Jie Tian, et al. β-Glucan enhances antitumor immune responses by regulating
differentiation and function of monocytic myeloid -derived suppressor cells. In: Eur. J.
Immunol. , 2013, vol. 43, p.1220 -1230.
138. Jun Yan, Daniel J . Allendorf, Brian Brandley. Yeast whole glucan particl e (WGP) β –
glucan in conjunction with antitumor monoclonal antibodies to treat cancer. In: Expert
Opin. Biol. Ther. , 2005, vol. 5(5), p. 691 -702.
139. Kalantaryan V., et al. Influence of low intensity coherent electromagnetic millimeter
radiation (EMR) on aqua s olution of DNA. In: PIER Letters., 2010, vol. 13, p. 1 -9.
140. Ka-Lung Lam, Peter Chi -Keung Cheung. Non -digestible long chain beta -glucans as
novel prebiotics . In: Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre, 2013, vol.2(1), p. 45 -64.
141. Katayoon Nofouzi, et al. Influence of extremely low frequency electromagnetic fields on
growth performance, innate immune response, biochemical parameters and disease
resistance in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. In: Fish Physiology and Biochemistry,
2015, vol. 41( 3), p. 721 -731.
142. Kiran G. S., et al . Effect of Fe nanoparticle on growth and glycolipid biosurfactant
production under solid state culture by marine Nocardiopsis sp . MSA13A. In: BMC
Biotechnology, 2014, vol. 14, p. 48-57.
143. Klis F. M., Boorsma A., de Groot P. W. J. Cell wall construction in Saccharomyces
cerevisiae. In: Yeast, 2006, vol. 23, p. 185 -202.
144. Kopecka M., Yamaguchi M, Kawamoto S . Effects of the F -actin inhibitor latrunculin A
on the budding yeast S. cerevisiae . In: Microbiology , 2015, vol. 161, p. 1348 -1355.
145. Krinitskaya A., Suhanov P., Sedelinikov Iu. The influence of the effects of EHF -radiation on
the activity of baker's yeasts. In: Millimeter waves in biol. and medicine, 2004, vol . 4, p. 17 -27.

134 146. Krizková L ., et al. Antioxidant and antimutagenic activity of mannan neoglycoconjugates:
mannan -human serum albumin and mannan -penicillin G acylase. In : Mutat. Res. , 2006,
vol. 606(1, 2), p. 72 -79.
147. Kuan -Chen Cheng, Ali Demirci, Jeffrey M. Catc hmar k. Pullulan: biosynthesis, production,
and applications. In: Applied Micr obiology and Biotechnology, 2011, v ol. 92(1), p. 29 -44.
148. Kuhlwein H., et al. Effects of dietary β-(1,3)(1,6) -D-glucan supplementation on growth
performance, intestinal morphology and haemato -immunological profile of mirror carp
(Cyprinus carpio L .). In: J. of Animal Physiol. and Animal Nutr., 2014, vol. 98(2), p. 279 -289.
149. Kusmiati T., Rizky Dhewantara F.X. Cholesterol -Lowering Effect of Beta Glucan
Extracted from S. cerevisiae in Rats. In: Sci. Pharm., 2016 , vol. 84(1), p. 153-165.
150. Kwang S.K., Hyun S.Y. Production of soluble β-glucan from the cell wall of S. cerevisiae.
In: Enz. and Microb. Technol., 2006, vol. 39(3 ), p. 496-500.
151. Kwiatkowski S., et al. A study of Saccharomyces cerevisiae cell wall glucans. In: J. Inst.
Brew. , 2009, vol. 115(2), p. 151-158.
152. Kwiatkowski S., Kwiatkofski S.E. Yeast ( S. cerevisiae ) Glucan Polysaccharides –
Occurrence, Separation and Application in Food and Health In dustries. The Complex
World of P olysaccharides. (Ed. D.N. Karunaratne), In Tech, Croatia , 2012. 648 p.
153. Laroche C., Michaud P. New developments and prospective applications for β-(1,3) –
glucans. In: Recent Patents on Biotechnology , 2007 , vol. 1(1), p. 59-73.
154. Laugier Olga B., et al. The effects of repetitive alkaline ⁄acid extractions of
Saccharomyces cerevisiae cell wall on antioxidative and bifidogenic efficacy. In: Int. J.
Food Sci . Technol ., 2012 , vol. 47( 2), p. 369 -375.
155. Lesage G., Bussey H. Cell Wall Assembly in Saccharomyces cerevisiae . In: Microbiol.
Mol. Biol. Rev. , 2006, vol. 70(2), p. 317 -343.
156. Levin David E. Regulation of Cell Wall Biogenesis in Saccharomyces cerevisiae : The
Cell Wall Integrity Signaling Pathway. In: Genetics . 2011 , vol. 189 (4), p. 1145 -1175.
157. Li Zhang, et al. Releasing polysaccharide and protein from yeast cells by ultrasound:
Selecti vity and effects of processing parameters. In: Ultrasonics Sonochemistry , 2014,
vol. 21, p. 576 -581.
158. Liepins J. , et al. Drying enhances immunoactivity of spent brewer’s yeast cell wall β -D-
glucans. In: Journal of Biotechnology, 2015, vol. 206, p. 12 -16.
159. Liu D., et al. Disruption and proteins release by ultrasonication of yeast cells. In: Innov.
Food Sci. Emerg ., 2013 , vol. 18, p. 132 -137.
160. Liu X.Y., et al. A new isolation method of β-D-glucans from spent yeast Saccharomyces
cerevisiae . In: Food Hydrocoll. , 2008 , vol. 22, p. 239 -247.
161. Lobato R.V., et al. Metabolic effects of β -glucans ( S. cerevisae ) per os administration in
rats with streptozotocin -induced diabetes. In: Nutr. Hosp. , 2015, vol. 32(1), p. 256 -264.
162. Lowry O., et. al. Protein measurment with the folin phenol reagent. In: J. Biol. Chem.,
1951, vol. 193, p. 265 -275.
163. Luo Y, et al. Effect of Yeast Cell Morphology, Cell Wall Physical Structure and
Chemical Composition on Patulin Adsorption. In: PLoS One , 2015, vol. 10(8):
e0136045.
164. Machi K., et al. Rot 1p of S. cerevisiae is a putative membrane protein required for normal
levels of the cell wall 1,6 -ß-glucan. In: Microbiol., 2004, vol. 150, p. 3163 -3173.

135 165. Machova E , Bystricky S. Antioxidant capacities of mannans and glucans are related to their
susceptibility of free radical degradation. In: Int. J. Biol. Macromol ., 2013 , vol. 61, p. 308-311.
166. Maedeh Galedar and Habibollah Younesi . Biosorption of ternary cadmium, nickel and
cobalt ions from aqueous solution onto S. cerevisiae cells: batch and column studies. In:
American Journal of Biochemistry and Biotechnology, 2013, vol. 9(1), p. 47 -60.
167. Magnani M., et al. Optimized methodology for extraction of (1,3)(1,6) -β-D-glucan from S.
cerevisiae and in vitro evaluation of the cytotoxic ity and genotoxicity of the corresponding
carboxymethyl derivative. In: Carbohydrate Polymers, 2009, vol. 78, p. 658 -665.
168. Makar V. R., et al. Effect of cyclophosphamide and 61.22 GHz millimeter waves on T -cell,
B-cell, and macrophage functions. In: Bioelectromagnetics, 2006, vol. 27(6), p. 458 -466.
169. Mantovani M. S., et al. β-Glucans in promoting health: Prevention against mutation and
cancer. In: Mut. Res ., 2008, vol. 658(3), p. 154 -161.
170. Many Josephine Nirmala and Kayal vizhi. Analysis of Different Extraction Methods on the
Yield and Recovery of β-Glucan from Baker’s Yeast (S. cerevisiae ). In: IJISET – Intern. J. of
Innovative Sci ence, Engineering & Technology, 2014, v ol. 1(6), p. 268 -271.
171. Marambio -Jones C., Hoek E .M.V. A review of the antibacterial effects of silver
nanomaterials and potential implications for huma n health and the environment. In: J
Nanopart . Res., 2010, vol. 12(5), p. 1531 -1551 .
172. Markkanen Ari. Effects of Electromagnetic Fields on Cellular Responses to Agents
Causing Oxidative Stress and DNA Damage. Doctoral dissertation . Kuopio University
Publications C. Natural and Environmental Sciences 253, 2009. 59 p.
173. Martinez F. E., Negrete J., Torres V. G. Structure and properties of Zn -Al-Cu alloy
reinf orced with alumina particles. In: Mater. Des., 2003, vol. 24, p. 281 -286.
174. Mastan S. A. Use of Immunostimulants in aquaculture disease management . In:
International Journal of Fisheries and Aquatic Studies , 2015, vol. 2(4), p. 277-280.
175. Michels C.A. In Genetic Techniques for Biological Research: A Case Study Approach.
(Ed. John Wiley and Sons Eds), John Wiley & Sons Ltd, Chichester UK , 2002. 254 p.
176. Miest J. J., et al. Dietary β-glucan (MacroGard®) enhances survival of first feeding
turbot ( Scophthalmus maximus ) larvae by altering immunity, metabolism and microbiota.
In: Fish and Shellfish Immunol. , 2016, vol. 48, p. 94 -104.
177. Miguel Pulido Rodriguez, et al. Influence of Live Cells or Cells Extract of S. cerevisiae
on in Vitro Gas Production of a Total Mixed Ration. In: Ital. J. Anim. Sci. , 2015, vol.
14(4), p. 590 -595.
178. Minju Jeong, et al. Cytotoxicity of Ultra -pure TiO 2 and ZnO Nanoparticles Generated by
Laser Ablation. In: Bull. Korean Chem. Soc. , 2013, v ol. 34(11), p. 3301 -3306 .
179. Mitchell D. N., Godwin H.A. , Claudio E. Nanoparticle Toxicity in S. cerevisiae : A
Comparative Study Using Au Colloid, Ag Colloid, and HAuCl 4•3H2O in Solution. In:
Nanoscape, Spring , 2004, vol. 1, p. 59-69.
180. Mossman B. T., et al. Mechanisms of action of inhaled fibers, particles and nanoparticles
in lun g and cardiovascular deseases. In: Part. Fibre Toxicol., 2007, vol. 4, p. 4.
181. Mrinmoy De, Partha S. Ghosh, and Vincent M. Rotello . Applications of Nanoparticles in
Biology. In: Adv. Mater. , 2008, vol. 20, p. 4225 -4241 .

136 182. Mudasir A. D., Avinash I., Mahendra R . Enhanced antimicrobial activity of silver
nanoparticles synthesized by Cryphonectria sp. evaluated singly and in combination with
antibiotics. In: Nanomedicine: Nanotechnol., Biol. and Medicine, 2013, vol. 9(1), p. 105 -110.
183. Na Lei, et al. Effects of Low Molecular Weight Yeast β-Glucan on Antioxidant and
Immunological Activities in Mice. In: Int. J. Mol. Sci. , 2015, vol. 16(9), p. 21575 -21590.
184. Naruemon M., et al. Influence of additives on Saccharomyces cerevisiae β-glucan
production. In: International Food Research Journal. , 2013, vol. 20(4), p. 1953 -1959.
185. Nasr N. F. Applications of Nanote chnology in Food Microbiology. In: Int.J. Curr.
Microbiol. App. Sci., 2015, vol. 4(4), p. 846 -853.
186. Nedjoud, G., et.al. Effect of zinc on growth, metabolism and activity of antioxidant
enzymes in the yeast S. cerevisiae . In: Glob. J. Biodivers. Sci. Manag. , 2013, nr 3(2), p.
243-248.
187. Nicolaz C . N., et al. Study of narrow band millimeter -wave potential interactions with
endoplasmic reticulum stress sens or genes. In: Bioelectromagnetics. 2009 , vol. 30(5), p.
365-373.
188. Nicolaz C . N., et al. Absence of direct effect of low -power millimeter -wave radiation at
60.4 GHz on endoplasmic r eticu lum stress. In: Cell Biol. Toxicol. 2009, vol. 25(5), p.
471-478.
189. Noppa wat Pengkumsri , et al. Extraction of β-glucan from S. cerevisiae : Comparison of
different extraction methods and in vivo assessment of immunomodulatory effect in
mice. In: Food Sci. Technol ., Campinas, 2017, vol. 37 (1), p. 124 -130.
190. Nowak J., Lasik M. High temperature bioremediation of potato industry wastewaters by
bacteria mixed culture. In: Nauka Przyroda Technologie, 2009, vol. 3(4), p . 1-10 (In Polish) .
191. Okada H., et al. Multiple functional domains of the yeast l,3 -β-glucan synthase subunit
Fks1p revealed by quantitative phenotypic analysis of temperature sensitive mutants. In:
Genetics, 2010, vol. 184, p. 1013 -1024.
192. Oncul S., et al. Effect of extremely low frequency elect romagnetic fields on bacterial
membrane. In: Internation al Journal of Radiation Biology, 2016, vol. 92(1), p. 42 -49.
193. Otero -Gonzalez Lila, et al. Toxicity of TiO 2, ZrO 2, Fe0, Fe 2O3, and Mn 2O3 nanoparticles
to the yeast, Saccharomyces cerevisiae . In: Chemosphere, 2013, vol. 93, p. 1201 -1206 .
194. Padrova K., et al. Enhancing the lipid productivity of yeasts with trace concentr ations of
iron nanoparticles. In: Folia Microbiol . (Praha), 2016, vol. 61(4), p. 329-335.
195. Parrou J., et.al. Dynamic response of reserve carbohydrate metabolism under carbon and
nitrogen limitation in S. cerevisiae. In: Yeast. 1999, vol. 15, p. 191 -203.
196. Patent EP2091352 A2. Animal feeds and veterinary compositions. Elvebo Odd. Biotec
Pharmacon ASA, Application da te: 13.10.2007 , Publication date: 26.08.2009.
197. Patent US 5322841A, Int. Cl.5 A61K 31/715. Method for producing neutral glucans for
pharmaceutical applications. Jamas S. E., Davidson Easson D. , Ostroff G.R. , Alpha -Beta
Technology, Inc. , Application date: 02.11.1992 , Publication date: 21.06. 1994.
198. Patent US 5622939A, Int. Cl.5 A61K 31/715. Glucan preparation. Jamas S. E., Davidson
Easson D. , Ostroff G. R., Alpha -Beta Technology, Inc. , Application date: 21.08.1992 ,
Publication date: 22.04. 1997.
199. Perez Espitia P. J., et al. Zinc Oxide Nanoparticles: Synthesis, Antimicrobial Activity and
Food Packaging Applications. In: Food Bioprocess Technol., 2012, vo l. 5, p. 1447 -1464 .

137 200. Petit J., Wiegertjes G. F. Long -lived effects of administering β -glucans: Indications for
trained immunity in fish. In: Dev. Comp. Immunol. , 2016, vol. 64, p. 93 -102.
201. Pillet F., et al. Uncovering by atomic force microscopy of an original circular structure at
the yeast cell surface in response to heat shock. In: BMC Biology, 2014, vol. 12(1), p. 2 -24.
202. Piotrowska Małgorzata, Masek Anna. Saccharomyces c erevisiae Cell Wall Components
as Tools for Ochratoxin A Decontamination. In: Toxins , 2015, vol. 7(4), p. 1151 -1162.
203. Pirogova E., Vojisavljevic V., Cosic I. Biological effec ts of electromagnetic radiation,
Biomedical Engineering, Carlos Alexandre Barros de Mello (Ed.), Vukovar: In Tech,
2009. 658 p.
204. Pișkin S. , Palantöken A., and Yılmaz M.S. Antimicrobial Activity of Synthesized TiO 2
Nanoparticles. In: International Conference on Emerging Trends in Engineering and
Technology (ICETET'2013) , Patong Beach, Phuket (Thailand ), Dec. 7 -8, 2013 , p. 91 -94.
205. Pooley David T. Bacterial Bioluminescence, Bioelectromagnetics and Function. In:
Photoch emistry and Pho tobiology, 2011, vol. 87(2 ), p. 324 -328.
206. Quiñones -Jurado Zoe Vineth, et al. Silver Nanoparticles Supported on TiO 2 and Their
Antibacterial Properties: Effect of Surface Confinement and Nonex istence of Plasmon
Resonance. In: Materials Sciences and Applications, 2014, vol. 5, p. 895 -903.
207. Rahar S., et al. Preparation, characterization, and biological properties of β-glucans. In: J.
Adv. Pharm. Technol. Res. , 2011 , vol. 2, p. 94 -103.
208. Rai M., Yadav A., Gade A. Silver nanoparticles as a new generation of antimicrobials.
In: Biotechnology Advances , 2009, vol. 27(1), p. 76-83.
209. Rai M. N., Duran ( eds.), Metal Nanoparticles in Microbiology. Springer -Verlag Berlin
Heidelberg , 2011. 303 p.
210. Raimondi S., et al. Getting lipids from glycerol: new perspectives on biotechnological
exploitation of Candida freyschussii . In: Microb . Cell Fact. , 2014, vol. 13(83), p. 1 -11.
211. Riggi S. J.; Di Luzio N. R. Identification of a reticuloendothelial stimulating agent in
zymosan. In: The American journal of physiology , 1961 , vol. 200, p. 297 -300.
212. Rinaldi L., et al. In vitro bioaccessibility of peptides and amino acids from yogurt made
with starch, pectin, or β-glucan. In: International Dairy Journal, 2015, vol. 46, p. 39 -45.
213. Romanenko S., et al. Effects of millimeter wave irradiation and equivalent thermal
heating on the activity of individual neurons in the leech ganglion. In: Journal of
Neurophysiology. 2014 , vol. 112(10), p. 2423 -2431.
214. Roselli M., et al. Zinc oxide protects cultured enterocytes from the damage induced by
Escherichia coli . In: Journal of Nutrition , 2003. vol. 133(12), p. 4077 -4082.
215. Rudic V., et al. Coordination compounds of copper (II) as regulators of productivity and
biosynthesis of cia nobacterium Spirulina platensis . 2nd French -Romanian Co lloquium on
Medicinal Chemistry , Iasi, Romania, 3 -5 october, 2012 , p. 57.
216. Ruiz -Gomez M. J., et al. Static and 50 Hz magnetic fi elds of 0.35 and 2.45 mT have no
effect on the growth of S. cerevisiae. In: Bioelectrochemistry , 2004, vol. 64, p. 151 -155.
217. Sahayaraj K. , Rajesh S. Bionanoparticles: synthesis and antimicrobial applications . In:
Science against microbial pathogens: communicating current research and technological
advances , A. M éndez -Vilas (Ed.), Formatex 2011 , p. 228 -244.
218. Salah N. Farhan, Anees A. Khadom. Biosorption of heavy metals from aqueous solutions
by S. cerevisiae. In: Int. J. of Industrial Chemistry , 2015, vol. 6(2), p. 119-130.

138 219. Santimano M.C., Kowshik M. Altered growth and enzyme expression profile of ZnO
nanoparticles exposed non -target environ mentally beneficial bacteria. In: Environ Monit
Assess, 2013, vol. 185, p. 7205 -7214 .
220. Sarah Dantas Viana Medeiros, et al. Effects of Purified S. cerevisiae (1→3) -β-Glucan on
Venous Ulcer Healing. In: Int. J. Mol. Sci., 2012 , vol. 13(7), p. 8142 -8158.
221. Sarinho E., et al. Production of interleukin -10 in asthmatic children after beta -1-3-glucan.
In: Allergol. Immunopathol. , 2009, vol. 37, p. 188 -92.
222. Sawai J. Quantitative evaluation of antibacterial activities of metallic oxide powders
(ZnO, MgO and CaO) by conductimetric assay. In: J. Microbiol. Methods , 2003, vol.
54(2), p. 177-182.
223. Schiavone M. , et al . A combined chemical and enz ymatic method to determin e
quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. In: FEMS Yeast
Res., 2014 , vol. 14, p. 933 -947.
224. Scrimale T., et al. The Unfolded Protein Response Is Induced by the Cell Wall Integrity
Mitogen -activated Protein Kinase Signaling Cascade and Is Required for Cell Wall
Integrity in S. cerevisiae . In: Mol. Biol. Cell, 2009, vol. 20(1), p. 164 -175.
225. Selitrennikoff P. C. Antifung al proteins. In: Applied and Environmental Microbiology ,
2001 , vol. 67 (7), p. 2883 -2894 .
226. Shahram Amirnia, Madhumita B. Ray, Argyrios Margaritis. Heavy metals removal from
aqueous solutions using Saccharomyces cerevisiae nin a novel continuous bioreactor –
biosorption system. In: Chemical Engineering Journal , 2015, vol. 264, p. 863-872.
227. Shokri H., Asadi F., Khosravi A.R.. Isolation of β-glucan from the cell wall of
Saccharomyces cerevisiae . In: Nat. Prod. Res. , 2008, vol. 22(5), p. 414 -421.
228. Silke C. J., et al. Antioxidative activity of (1 -3), (1 -6)-β-D-glucan from S. cerevisiae
grown on different media. In: LWT -Food Sci. and Technol. , 2008, vol. 41(5), p. 868 -887.
229. Šillerová S., et al. Preparation of zinc enriched yeast ( Saccharomyces cerevisiae ) by
cultivation with differe nt zinc salts. In: JMBFS., 2012 , vol. 1 (Special issue), p. 689 -695.
230. Sirbu T., et al. Influence of Dispersed Solutions of Copper, Silver, Bismuth and Zinc
Oxide Nanoparticles on Growth and Catalase Activ ity of P. funiculosum. In: IFMBE
Proceedings , 3rd International Conf. on Nanotechnologies and Biomedical Engineering.
September 23 -26, 2015, Chisinau, Republic of Moldova , vol. 55 of the series 2015, p. 271-274.
231. Soares E.V. & Soares Helena M. V. M. Bioremediation of industrial effluents containing
heavy metals using brewing cells of Saccharomyces cerevisiae as a green technology: a
review. In: Environ Sci . Pollut Res . Int., 2012, vol. 19(4), p. 1066 -1083 .
232. Soghomonyan D., Trchounian K., Trchounian A. Millimeter waves or extremely high
frequency electromagnetic fields in the environment: what are their effects on bacteria?
In: Applied Microbiology and Biotechnology, 2016, v ol. 100(11), p. 4761 -4771 .
233. Soltanian S., et al . The protective effect against V. campbellii in A. nauplii by pure β-
glucan and isogenic yeast cells differing in β-glucan and chitin content operated wit h a
source dependent time lag. In: Fish Shellfi sh Immunol. 2007, V. 23, nr. 5, p. 1003 -1014.
234. Stephen J. Free. Fungal Cell Wall Organization and Biosynthesis, In Th eodore
Friedmann, Jay C. Dunlap and Stephen F. Goodwin, editors: Advances in Genetics, v ol.
81, Burlington : Academic Press, 2013, p. 33 -82.

139 235. Stier H., Ebbeskotte V., Gruenwald J . Immune -modulatory effects of dietary Yeast Beta –
1,3/1,6 -D-glucan. In: Nutrition Journal , 2014, vol. 13, p. 38 -46.
236. Storz G., Imlay J. Oxidative stress. In: Curr. Opin. Microbiol. 1999, vol. 2(2), p.188-194.
237. Stratmeyer M.E., et al. What we know and don’t know about the bioeffects of
nanoparticles: developing experimental approa ches for safety measurements. In: Biomed .
Microdevices, 2 010, vol. 12(4), p. 569 -573.
238. Syed A. Jamal . Application of Nanoparticles of Ceramics, Peptides, Silicon, Carbon, and
Diamonds in Tissue Engineering. In: Chemical Sciences Jo urnal, 2013, vol. CSJ -91, p. 1 -10.
239. Synytsya A., Novak M . Structural analysis of glucans. In: Annals of Translational
Medicine, 2014, vol. 2(2), p. 17 -30.
240. Talbott S. M., et al. β‐Glucan supplementation, allergy symptom, and quality of life in
self‐described ragweed allergy sufferers. In: Food Sci Nutr ., 2013, vol. 1(1), p. 90 -101.
241. Tambiev A. Kh., Skalny A. V. Electromagnetic Radiation and Life: Bioelementological
Point of View, Biophysics, Dr. Prof. Dr. A.N. Misra (Ed.), InTech ., 2012. 220 p .
242. Teparic R., Mrsa V . Proteins involved in building, maintaining and remodeling of yeast
cell walls. In: Current Genetics, 2013, vol. 59( 4), p. 171-185.
243. Ter Schure E. G., Van Riel N. A., Verrips , C. T. The role of ammonia metabolism in nitrogen
catabolite repression in S. cerevisiae. In: FEMS Microbiol. Rev., 2000, vol. 24, p. 67-83.
244. Thammakiti S., et al. Preparation of spent brewer's yeast β-glucans for potential applications
in the food industry. Int. J. of Food Science&Technol., 2004, vol. 39(1), p. 21 -29.
245. Ting Wu, T. S. Rappaport, C. M. Collins. The Human Body and Millimeter -Wave Wireless
Communication Systems: Interactions and Implications. In: Communications (ICC), IEEE
International Conf. on Communications, London 8 -12 june, 2015, p. 2423 -2429 .
246. Tingting Sun., et al. Copper Oxide Nanoparticles Induce Autophagic Cell D eath in A549
Cells. In: PLoS One , 2012, vol.7( 8), e43442 .
247. Topfer F., Oberhammer J. Millimeter -Wave Tissue Diagnosis: The Most Promising Fields
for Medical Applications . In: IEEE Microwave Magazine , 2015, vol. 16(4 ), p. 97-113.
248. Torello C. O., Souza -Queiroz J. and Queiroz M. L. S. β-1,3-Glucan given orally
modulat es immunomyelopoietic activity and enhances the resistance of tumour -bearing
mice. In: Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology , 2012 , vol. 39, p. 209 –
217.
249. Torgomyan H., Trchrounian A . Bactericidal effects of low -intensity extremely high
frequ ency electromagnetic field: an overview with phenomenon, mechanisms, targets and
consequences. In: Critical Reviews in Microbiology, 2013, vol. 39(1), p. 102 -111.
250. Toshi M., et al. Effect of Low Power Microwave Radiation on Microorganisms and other
Life Forms. In: Advances in Micr owave and Wireless Technol., 2013, vol. 1(1), p. 4 -11.
251. Tran Minh Tam, et al. Optimization of βeta-glucan extraction from waste brewer’s yeast
S. cerevisiae using autolysis, enzyme, ultrasonic and combined enzyme – ultrasonic
treatment. In: American J. of Research Communication, 2013, vol. 1(11), p. 149 -158.
252. Tukmechi B. A., Bandboni M. Effects of S. cerevisiae supplementation on immune response,
hematological parameters, body composition and disease resistance in rainbow trout,
Oncorhynchus mykiss (Walbaum, 1792). In: J. Appl. Ichthyol., 2014 , vol. 30, p. 55 -61.
253. Ulbricht C., Windsor R. C. An Evidence -Based Systematic Review of Beta -Glucan by the
Natural Standard Research Collaboration. In: J. Diet. Suppl., 2014, vol. 11(4), p. 361 -475.

140 254. Usatîi A., Chiselița N., Efremova N. The evaluation of nanoparticles ZnO and TiO 2
effects on Saccharomyces cerevisiae CNMN -Y-20 yeast strain. În: Acta Universitatis
Cibiniensis Series E : Food Technology. 2016, v. XX (1), p. 85 -92.
255. Usatîi A., et al. The effects of some compounds of Mn(II) and Zn(II) on the
multiplication of wine yeast and biosynthesis of carbohydrates in the biomass. In:
Analele Universității din Oradea – Fascicula Biologie, 2010, vol. XYII(2), p. 208 -212.
256. Varelas V., et al. An evaluat ion study of different methods for the production of β-D-
glucan from yeast biomass. In: Drug Test. Analysis , 2015, vol. 8, p. 46 -55.
257. Varelas V. , et al. Valorization of Winery Spent Yeast Waste Biomass as a New Source
for the Production of β-Glucan. In: Waste Biomass Valor ., 2016, vol. 7( 4), p. 807-817.
258. Vase em M., Umar A., Hahu Y.B. ZnO nanoparticles: Growth, properties, and
application. Metal oxide nanostructures and their applications. Metal Oxide
Nanostructures and Their Applications. Edited by Ahmad Umar and Yoon -Bong Hahn.
2010, vol. 5 , p.1-36.
259. Vetvicka V. Effects of β-glucan on some environmental toxins: An overview. In:
Biomed. Pap . Med. Fac. Univ . Palacky Olomouc Czech Repub., 2014, vol. 158(1), p. 1 -4.
260. Vilma Barbosa da Silva Araujo, et al. Followed extraction of β-glucan and mannoprotein
from spent brewer's yeast ( S. uvarum ) and application of the obtaine d mannoprotein as a
stabilizer in mayonnaise. In: Innov . Food Sci . Emerg . Technol ., 2014, vol. 23, p. 164 -170.
261. Vrhovac I., Hrascan R., Franekic J. Effect of 905 MHz microwave radiation on colony
growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae strains FF18733, FF1481 and D7. In:
Radiol. Oncol. , 2010, vol. 44(2), p. 131-134.
262. Wanna Sirimanapong, et al. The effects of feeding immunostimulant β-glucan on the
immune response of Pangasianodon hypophthalmus. In: Fish & Shellfish Immunology,
2015, vol. 45( 2), p. 357–366.
263. Waszkiewicz -Robak B . Spent Brewer's Yeast and Beta -Glucans Isolated from Them as
Diet Comp onents Modifying Blood Lipid Metabolism Disturbed by an Atherogenic Diet.
In: Lipid Metabolism , Edition: 1, Chapter: 12 , Publisher: Janeza Trdine 9, 51000 Rijeka,
Croatia, Editors: Rodrigo Valenzuela Baez, 2013, p.261 -290.
264. Waszkiewicz -Robak B., Bartnikowska E. Effects of spent brewer’s yeast and biological
β-glucans on selected parameters of lipid metabolism in blood and liver in rats. In:
Journal of Animal and Feed Sciences , 2009, vol. 18, p. 699 -708.
265. Worrasinchai S ., et al. β-Glucan prepared from spent brewer s yeast as a fat replacer in
mayonnaise. In: Food Hydrocoll. , 2006, vol. 20, p. 68 -78.
266. X. Y. Liu, et al. A new isolation method of β-D-glucans from spent yeast Saccharomyces
cerevisiae . In: Food Hydrocoll ., 2008, vol. 22, p. 239 -247.
267. Xihai Li, et al. Millimeter wave radiation induces apoptosis via affecting the ratio of
Bax/Bcl -2 in SW1353 human chondrosarcoma cells . In: Oncology Reports, 2012, vol.
27(3), p. 664-672.
268. Yadollahpour A. , Jalilif ar M., Rashidi S . Antimicrobial Effects of Electromagnetic
Fields: A Review of Current Techniques and Mechanisms of Action. In: Journal o f pure
and applied microbiology, 2014. v ol. 8(5), p. 4031 -4043.
269. Ya-Nan Chang, et al. The Toxic Effects and Mechanisms of CuO and ZnO
Nano particles. In: Materials , 2012 , vol. 5, p. 2850 -2871.

141 270. Yannikouris A., et al. Alkali extraction of β-D-glucans from Saccharomyces cerevisiae
cell wall and study of their absorptive properties toward Zeralenone. In: J. Agric. Food
Chem., 2004, vol. 52, p. 3666 -3673.
271. Yeast Stress Response. First edition, Editors: Professor Dr. St. Hohmann, Dr. Willem H.
Mager. Topics in Current Genetics , Springer -Verlag Berlin Heideberg, Germany, 2003. 389 p.
272. Yinxia Li., et al. Molecular Control of TiO 2-NPs Toxicity Formation at Predicted
Environmental Relevant Concentrations by Mn -SODs Proteins. In: PLoS One , 2012, vol.
7(9), e44688 .
273. Yoon T. J., et al . Anti-tumor metastatic activity of β-glucan purified from mutated S.
cerevisiae . In: International Immunopharmacolog. , 2008, vol. 8( 1), p. 36 -42.
274. Zechner -Krpan V., et al. Application of different drying methods on β-glucan isolated from
spent brewer’s yeast using alkaline procedure. In: Agric. Conspec. Sci. , 2010, vol.75(1), p.
45-50.
275. Zechner -Krpan Vesna. Potential Application of Yeast β-Glucans in Food Industry. In:
Agriculturae Conspectus Scientificus , 2009, v ol. 74(4), p. 277 -282.
276. Zechner -Krpan V. , et al. Characterization of β -Glucans Isolated from Brewer’s Yeast and
Dried by Different Methods . In: Food Technol. Biotechnol., 2010, vol. 48 (2), p. 189 -197.
277. Zekovic Djordje B., et al. Natural and Modified (1 →3)-β-D Glucans in Health Promotion
and Disease Alleviation. In: Critical Reviews in Biotechnol. , 2005, vol. 25, p. 205 -230.
278. Zeng X. B., et al. Medium optimization of carbon and nitrogen sources for the production
of eucalyptene A and xyloketal A from Xylaria sp. 2508 using response surface
methodology. In: Process Biochemistry, 2006, vol. 41(2), p. 293 -298.
279. Zhadobov M., et al. Complex Permittivity of Representative Biological Solutions in the
2-67 GHz Range. In: Bioelectromagnetics , 2012 , vol. 33, p. 346 -355.
280. Zhu F. M., et al. Beta-glucans from edible and medicinal mushrooms: characteristics,
physicochemical and biological activ ities. In: J. Food Compost. Anal ., 2015, vol. 41, p.
165-173.
281. Zhu Fengmei, Du Bin, Xu Baojun. A critical review on production and industrial
applications of beta -glucans. In: Food Hydrocolloids . 2016 , vol. 52, p. 275 -288.

142

ANEXE

143 Anexa 1
Brevete de invenție
Brevet de invenție. MD 4048 . Tulpină de drojdie Saccharomyces cerevisiae -sursă de β-glucani .
BOPI nr. 6/2010

144 Brevet de invenție . MD 717 . Furaj pentru puiet de pești fitofagi. BOPI 1/2014 .

145 Brevet de invenție . MD 4329 . Procedeu de cultivare a tulpinii de levuri Saccharomyces
cerevisiae CNMN -Y-20. BOPI 2/2015.

146 Anexa 2.
Act nr. 85 a din 04.09.2017 de implementare a tulpinii de levuri S. cerevisiae CNMN -Y-20

147 Anexa 3.
Acte de implementare bioprodusului Glucan -20
Act de implementare a rezultatelor Nr.1 eliberat de ÎI „Marin -Alexandru” la 17.07.2014

148 Act de implementare a rezultatelor Nr.3 eliberat de ÎI „Marin -Alexandru” la 17.07.2015

149 Act de implementare a rezultatelor Nr.4 eliber at de SRL „Acces -Activ ” la 10.10.2016

150 Anexa 4.
Mențiuni la Saloane de Invenții și Expoziții Internaționale
Diploma European Exhibition of Creativity and Innovation „EUROINVENT ”, Iași 2015, (Silver
medal) „ Feed for phytophagous fish fry ”.

151 Diploma European Exhibition of Creativity and Innovation „EUROINVENT” , Iași 2015 , (Silver
medal) „ New proceeding for obtaining β -glucans from yeasts with
application of millimetric waves ”.

152 Diploma „40th International Invention Show 11th Invention and Prototype Show and Student
Business Plan Competition” Karlovac, 2015 , (Silver medal) „Fish spawn incubation and larvae
storage device and feeding them with specialized feed ”

153 Diploma European Exhibition of Creativity and Innovation „EUROINVENT” , Iași 2016, (Silver
medal) „ Technology of β -glucans products obtaining from Saccharomyces yeast ”.

154 Diploma Salonul internațional al cercetării, inovării și inventicii „PROINVENT”, Cluj -Napoca
2016, (Medalia de aur cu mențiune specială) „Technology of β-glucans products
obtaining from Saccharomyces yeast ”

155 Diploma de participare European Exhibition of Creativity and Innovation „EUROINVENT” , Iași
2017, „New proceeding for obtaining β-glucans from yeasts using ZnO nanoparticles ”.

156

DECLARAȚIA PRIVIND ASUMAREA RĂSPUNDERII

Subsemnata , declar pe răspundere personală că materialele prezentate în teza de doctorat
sunt rezultatul propriilo r cercetări și realizări științ ifice. Conștientizez că, în caz contrar, urmează
să suport consecințele în conformitate cu legislația în vigoare.

CHISELIȚA Natalia

Data :

157
CURRICULUM VITAE
Nume le, prenume: CHISE LIȚA NATALIA

Cetățenia Republica Moldova

Studii

1991-1996
Universitatea de Stat din Moldova, Facultatea de Chimie , specialitatea
Chimie
2012 -2014 Universitatea de Stat din Tiraspol, Facultatea de Biologie și Chimie,
specialitatea Biologie aplicată
2014-2017 Institutul de Microbiologie și Biotehnologie , doctorandă , specialitatea
„167.01 – Biotehnologie , bionanotehnologie ”

Domeniile de Microbiol ogia și biotehnologia levurilor;
interes științific Biochimie, specializare în domeniul biochimiei levurilor ;
Elaborarea procedeelor de cultivare dirijată a levurilor.

Participări în 06.411. 015 F. (2006 -2010) „Fundamentarea științifică a sintezei orientate
proiecte științifice a substanțelor bioactive de către microorganisme” ;
naționale și 07.411.11 IND A. (2007 -2008) „Evaluarea principiilor bioactive a levurilor
internaționale de la vinificație ca sursă pentru obținerea biopreparatelor ”;
09.819.08. 03. IND F. (2009 -2010) „Procesarea drojdiilor rezultate în urma
vinificării în scopul obținerii carbohidraților pentru utilizare în diverse
domenii”;
11.817.08.19A (2011 -2014) „Tehnologii inovaționale microbiene pentru
producerea polizaharidelor și enzimelor hidrolitice cu utilizări polivalente” ;
14.05.076A (2015 -2018) „Utilizarea nanomaterialelor în biotehnologia
cultivării fungilor miceliali și levurilor ca strategie de sporire a
performan țelor biotehnologice ”.

Participări la Всероссийский симпозиум с международным участием „Современные
foruri științifice проблемы физиологии , экологии и биотехнологии микроорганизмов ”,
Москва , 2014;
Conferința științifică național ă cu participare internațională „Integrare
prin cercetare și inovare”, Chișinău, 2014;
Conferința Științifică Internațională a Doctoranzilor „Tendințe
contemporane ale dezvoltării științei : viziuni ale tinerilor cercetători”,
Chișinău, 2015, 2016, 2017;
Conferința Științifică Internațională “Științele vieții în dialogul generațiilor:
conexiuni dintre mediul academic, universitar și de afaceri" , Chișinău, 2016 ;
Международная научная конференция молодых ученых , аспирантов
и студентов „Научные достижения молодежи – решению проблем
питания человечества в XXI веке”, Киев , Украина , 2016;
International Conference „NANO -2016 Ethical , Ecological and Social
Problems of Nanoscience and Nanotechnologies ”, Chișinău, 2016;
International Scientific Conference on Microbial Biotechnology 2nd and
3rd editions, Chișinău, 2014, 2016 .

158
Lucrări științifice 36 publicații științifice: 15 articole în reviste recenzate , 12 teze la
publicate conferin țe interna ționale și naționale , 3 brevete de inven ție, 6 materiale
la saloane de invenții .

Premii și Bursa de Excelență a Guvernului (2016);
mențiuni Bursa unică de performanță „Mircea Ciuhrii ”.
40th international invention show 11th invention and prototype show and
student business plan competition Karlovac , Croatia , 2015 (Medalie de
argint);
European Exhibition of Creativity and Innovation E U R O I N V E N T ,
Iasi, Romania, 2015 ( Medalie de argint) ;
European Exhibition of Creativity and Innovation E U R O I N V E N T ,
Iasi, Romania, 2015 ( Medalie de argint) ;
European Exhibition of Creativity and Innovation E U R O I N V E N T ,
Iasi, Romania, 201 6 (Medalie de argint) ;
Salonul internațional al cercetării, inovării și inventicii PROINVENT,
Cluj-Napoca, România, 2016, (Diplomă de excelență, Medalia de aur) ;
European Exhibition of Creativity and Innovation E U R O I N V E N T ,
Iasi, Romania, 201 7 (Diplomă de participare ).

Apartenența
la societăți : Membru al Federației Societăților Europene de Microbiologie (FEMS).
Cunoașterea
limbilor: română , rusă, engleză, portugheză.

Date de contact
de serviciu : Laboratorul Biotehnologia levurilor
Institutul de Microbiologie și Biotehnologie
MD 2028, str. Academiei 1, bir. 202
Tel.: +373 (22) 7 3 80 13,
e-mail: chiselita.natalia @gmail.com