Teza Caveole Caveolele Și Caveolina 3 În Mușchiul Normal Și Patologic (1) Copie [311061]

INTRODUCERE

Sistemul muscular face parte din sistemele care asigură locomoția corpului și cuprinde aproximativ 600 [anonimizat], 125 de perechi de mușchi au un rol foarte important în menținerea poziției verticale a corpului și în realizarea mișcărilor de baza. [anonimizat]. [anonimizat] a mușchilor striați. Caveolele se găsesc în densități diferite pe suprafața diferitelor tipuri de celule. [anonimizat]. Una dintre cele mai importante proteine din complexul caveolar este reprezentată de caveolină. Aceasta este întâlnită sub 3 forme: caveolina-1 și caveolina-2 [anonimizat]-3 specifică musculaturii scheletice.

[anonimizat]3 și ale proteinei codificate de aceasta. De-a [anonimizat]. Bolile musculare cauzate de mutații ale genei CAV3 se numesc caveolinopatii. [anonimizat] : distrofia musculară forma centurilor de tip 1C (LGMD1C), [anonimizat] (RMD), mialgia.

Lucrarea de față își propune să urmărească modificările caveolinei-3 [anonimizat]-3 în fiziologia mușchilor scheletici. Prin urmare au fost studiate și analizate o serie de experimente din literatura de specialitate pentru a [anonimizat], caveolina-3 și caveolele asigură o bună funcționare a musculaturii scheletice.

CAPITOLUL 1. ȚESUTUL MUSCULAR SCHELETIC

1.1 Aspecte de morfologie și anatomie ale țesutului muscular

Țesutul muscular face parte din sistemele care asigură locomoția corpului. S-a [anonimizat]: mușchistriați, mușchi netezi și mușchiul striat de tip cardiac. [anonimizat]. [anonimizat]. Țesutul conjunctiv care intră în alcătuirea mușchilor scheletici se dispune sub forma unor teci conjunctive care au rolul de a [anonimizat]. Fascia musculară este învelișul de la exteriorul mușchiului pe care îl înconjoară în totalitate. Epimisium este o teacă conjunctivă elastică care se găsește imediat sub fascia musculară și care se continuă cu tendoanele (Figura 1). Perimisium este reprezentat de septuri de țesut conjunctiv lax care înconjoară fasciculele musculare și care este bogat în nervi și vase de sânge. Endomisiumul este reprezentat de lame fine conjunctive desprinse din perimisium care învelesc fiecare fibră musculară în parte (Marcu, 2005).

Mușchii conțin 75% apă și 25% substanțe organice și anorganice. Dintre substanțele organice cele mai importante sunt proteinele, localizate în sarcoplasmă și sarcolemă, și substanțele energetice: glucide, lipide, substanțe macroergice. În cazul glucidelor, acestea se găsesc sub formă de polimer al glicogenului și glucozei. Lipidele sunt reprezentate de incluziuni citoplasmatice de trigliceride, iar substanțele macroergice sunt reprezentate de ATP și creatinfostat-ului. Substanțele anorganice sunt reprezentate de săruri minerale și ioni (Niculescu și colab., 2007).

Tabelul 1. Compoziția chimică a mușchilor

Fibra musculară striată este un sincițiu deoarece provine în cursul dezvoltării embrionare din fuziunea mioblastelor care își au originea în miotomul somitelor. Prin fuziunea mioblastelor se formează miotomul în care se adună proteinele contractile pentru a forma microfilamente, iar în final se formează fibra musculară scheletică.

Fibra musculară striată este o celulă alungită, de mari dimensiuni, multinucleate. În secțiune longitudinală are o formă dreptunghiulară, în timp ce în secțiune transversală are formă poligonală. Fibrele pot atinge lungimi de ordinul centimetrilor, până la 20 de cm, iar grosime lor este de ordinul micronilor (40-100 μ). La periferia fibrei se găsește sarcolema care în interiorul celulei prezintă invaginări de formă tubulară, denumite tubuli tansverși sau tubulii T (Zărnescu, 2012).

La nivelul sarcolemei se găsesc numeroase agregate proteice ce cuprind mai multe tipuri de proteine precum: proteine contractile reprezentate de actină, miozină, tropomiozină, troponină și proteine reglatoare sau accesorii reprezentate de α-actină, titină, nebulină, desmină, tropomodulină, distrofină, miomesină, proteina C (Borda și colab., 2010).

Sarcoplasma celulei musculare prezintă numeroși nuclei care sunt poziționați periferic. În citoplasma fibrei musculare scheletice se găsesc mitocondrii (2%) , acestea sunt dispuse fie paralel cu miofibrilele, fie înconjoară miofibrilele. De asemenea, în citoplasmă se mai găsește glicogen (0,5- 1%) care reprezintă depozit de energie și este care este utilizat în timpul contracției musculare. Tot la nivelul sarcoplasmei se mai găsește și mioglobina care leagă oxigenul și are structură asemănătoare hemoglobinei. Pe lângă organitele comune, în citoplasma fibrei musculare se mai intalnesc și organitele specifice precum reticulul sarcoplasmatic, miofibrilele, dar și sistemul tubular transversal (Marieb, 2016).

Reticulul sarcoplasmatic este specific fibrei musculare striate și este format din zone dilatate, denumite cisterne terminale și din zone cu orientare longitudinală. Rolul reticulului sarcoplasmatic constă în reglarea intracelulară de calciu pe care îl acumulează și îl eliberează în timpul unei contracții musculare (Borda și colab., 2010).

Sistemul tubular transversal este reprezentat de invaginări digitiforme ale sarcolemei care formează tubulii T. Aceștia sunt dispuși la limita dintre discurile clare și cele întunecate, care înconjoară fiecare miofibrilă. Tubulii T vin în contact cu cisternele terminale ale reticului sarcoplasmatic. În mușchiul scheletic, un tubulul T vine în contact cu 2 cisterne terminale ale reticulului sarcoplasmatic pentru a forma triade. La nivelul triadelor, depolarizarea sarcolemei determinată de impuls nervos se transmite reticulului sarcoplasmatic, care la rândul său determină eliberarea calciului necesar contracției musculare (Marcu, 2005).

Miofibrilele reprezintă elemente contractile ale fibrei musculare și reprezintă 80% din volumul celulelor. Într-o fibră musculară scheletică există peste 1000 de miofibrile. În microscopia electronică și microscopia optică miofibrilele prezintă o alternantă de benzi clare și benzi întunecate (Borda și colab., 2010). Benzile clare se mai numesc și benzi I pentru că ele apar izotrope la microscopul cu lumină polarizată. La mijlocul benzilor clare există strioze formate din proteina α – actinină. Benzile clare sunt formate din miofilamente subțiri de actina (6 µm). Fiecare miofilament subțire de actină este format din doua lanțuri de actină filamentoasă. Fiecare lanț polipeptidic de actină filamentoasă este format din monomeri de actină globulară. Fiecare monomer de actină globulară prezintă un situs de recunoaștere pentru miozină. Miofilamentele de actină sunt asociate cu proteine accesorii, troponina și tropomiozina. Troponina reprezintă un complex format din trei subunități: troponina I sau inhibitoare care blochează legarea actinei de miozină, troponina T care interacționează cu tropomiozina și troponina C care leagă ionii de calciu în timpul contracției musculare. Tropomiozina este o proteină foarte lungă alcătuită din două lanțuri polipeptidice. Fiecare molecula de tropomiozină acoperă 7 monomeri de actină globulară (Zărnescu, 2012).

Benzile întunecate se numesc și benzi A pentru că sunt aizotrope la microscopul cu lumină polarizată. La mijlocul benzilor A există banda H (Hell). Această bandă H conține numai miofilamente groase de actină. La mijlocul benzilor H există banda M (Mitte). Benzile întunecate conțin la perifeire atât filamente groase de miozină cât și filamente subțiri de actină. Fiecare filament gros este înconjurat de 6 miofilamente subțiri astfel încât în fibra musculară scheletică raportul dintre miozină și actină este de 1 la 6. Miofilamentele groase de miozină se ancorează cu un capăt de o proteină foarte mare denumită titină. Celălalt capăt al titinei se ancorează la proteina striei Z. Filamentele groase sunt formate din miofilamente de miozină cu diametrul de 15 µm. Fiecare moleculă de miozină este formată din 2 lanțuri polipeptidice grele si 2 lanțuri ușoare. Cozile moleculelor de miozină formează fascicule în timp ce capetele de miozină sunt orientate către miofilamentele de actină (Zărnescu, 2012).

În formarea și susținerea structurii benzilor, un rol important il au și proteinele accesorii.

α -actinina este proteina cea mai importantă a striei Z. Prezintă o afinitate ridicată față de actină și este organizată sub formă de filamente subțiri. Ea este implicată în așezarea paralelă a miofilamentelor subțiri.

Titina este o proteină reglatoare care face parte din citoscheletul intrasarcomeric și este cea care ancorează miofilamentele groase de miozină de stria Z. De asemenea, titina oferă elasticitate miofibrilelor, menține aliniamentul filamentelor de miozină și împiedică întinderea excesivă a sarcomerului.

Nebulina face parte tot din categoria proteinelor reglatorii și este o componentă a citoscheletului intrasarcomeric. Aceasta nu prezintă elasticitate, dar însoțește și învelește miofilamentele subțiri de actină pe care le atașează strei Z. Se consideră că pe parcursul embriogenezei nebulina ar determina lungimea miofilamentului subțire.

Desmina este componenta cea mai importantă a citoscheletului extrasarcomeric. Ea participă în formarea filamentelor intermediare și leagă miofibrilele de membrana celulară.

Tropomodulina este o proteină de mici dimensiuni care face parte din componentele citoscheletului intrasarcomeric. Ea se atașează de capătul liber al miofilamentelor subțiri și are rolul de regla lungimea acestora. Proteina C și miomezina formează banda M și atașează miofilamentele groase de miozină. Distrofina este o proteină ce se leagă la un capăt de actina F iar la cealălalt capăt se leagă prin intermediul unui complex glicoproteic de laminina din membrana bazală a sarcolemei (Marieb, 2016).

Sarcomerul este unitatea contactilă a fibrelor musculare scheletice dar și a celor cardiace. Este situat între doua benzi Z și este format dintr-o bandă întunecată, flancată de câte o jumătate dintr-o bandă clară (Figura 2). Sarcomerul numit și miomer are 2,5 µm în repaus și 1 µm în contracție (Zărnescu, 2012).

Celulele satelit sunt localizate între sarcolemă și lamina bazală a fibrei musculare scheletice. În cursul dezvoltării embrionare, celulele satelit se atașează de miotubuli înaintea formării laminei bazale. Fiecare fibră musculară este asociat cu un anumit număr de celule. Celulele satelit sunt mononucleate și ele pot fi puse în evidență doar în microscopie electronică sau în microscopie optică după colorații specifice de anticorpi față de aceste celule. Celulele satelit au rol important în regenerarea mușchiului striat. Când mușchiul este lezat, celulele satelit sunt activate, încep să prolifereze și să formeze mioblaste, formează ulterior miotubuli și în final iau naștere noi fibre musculare (Borda și colab., 2010).

În funcție de diferențele din punct de vedere al structurii, rezistenței la oboseală și al vitezei de contracție s-au observat 3 tipuri de fibre musculare: fibre roșii (tip I), fibre albe (tip II) și fibre intermediare (tip II B). Aceste fibre prezintă diferite concentrații de mioglobină care este responsabilă de legare oxigenului în fibra musculară striată și prezintă o structură asemănătoare hemoglobinei. Mușchii scheletici prezintă în structura lor toate tipurile de fibre, însă acestea se găsesc în proporții diferite: 50% fibre roșii, 15% fibre albe și 35% fibre intermediare. De asemenea, proporția acestor fibre diferă și în funcție de zona în care se află mușchii. Spre exemplu mușchii trunchiului și a zonei gâtului prezintă în structura lor până la 90% fibre roșii, în timp ce mușchii membrelor inferioare conțin mai multe fibre albe și fibre intermediare (Marcu, 2005).

Dintre cele 3 tipuri de fibre, cele roșii sunt de cele mai mici dimensiuni și prezintă cantități mari de mioglobină care asigură cantitatea necesară de oxigen pentru contracția musculară. Fibrele de tip I prezintă numeroase mitocondrii și au o vascularizație capilară bogată. De asemenea, acestea sunt rezistente la oboseală și prezintă o contracție lungă și prelungită. Spre deosebire de fibrele roșii, cele albe sunt mai mari ca dimensiuni, cu o vascularizație mai slabă și cu un număr mai mic de mitocondrii. În schimb, acestea prezintă depozite de glicogen care poate fi metabolizat anaerob. Din acest punct de vedere, fibrele de tip II au contracții mai rapide și de scurtă durată, iar oboseala musculară se instalează mult mai repede din cauza acumulării de acid lactic. Fibrele intermediare au o culoare roz. Acestea au în structura lor un conținut bogat de mioglobină și sunt capabile sa metabolizeze aerob glucoza. Sunt rezistente la oboseală asemenea fibrelor roșii, însă au contracții mai rapide decât acestea (Marcu, 2005).

Inervația musculaturii scheletice este asigurată de o inervație somatică (senzitivă și motorie) și de o inervație vegetativă care este asigurată de fibre vegetative simpatice și mai rar de fibre vegetative parasimpatice. Inervația somatică este reprezentată de nervii spinali și de cei cranieni în cazul mușchilor de la nivelul feței. Fibrele somatice senzitive sunt reprezentate de dendritele neuronilor pseudounipolari care se găsesc în ganglionii spinali sau în ganglionii omologi nervilor cranieni. Aceste fibre ajung sub formă de terminații nervoase libere la nivelul mușchiului și intră în alcătuirea fusurilor neuromusculare și a corpusculilor tendinoși Golgi (Borda și colab., 2010).

Fusurile neuromusculare reprezintă receptori senzitivi încapsulați de formă alungită care sunt prezenți printre fibrele musculare scheletice (Figura 3). Acestea sunt sensibile la schimbările de lungime ale mușchiului și sunt responsabile de reflexul de întindere. Un fus neuromuscular are în alcătuirea sa 12-14 fibre musculare striate care au o lungime mai scurtă față de fibrele contractile înconjurătoare. Fibrele specializate din interiorul fusului au fost numite fibre intrafusale pentru a putea fi deosebite de fibrele extrafusale care sunt nespecializate. Cele două tipuri de fibre au o dispunere paralelă una față de cealaltă (Marcu, 2005).

Fibrele intrafusale sunt de doua tipuri: fibre cu sac nuclear și fibre cu nuclei în lanț. Fibrele cu sac nuclear sunt mai mari ca dimensiune și într-un număr mai mic comparativ cu fibrele cu nuclei în lanț. Tot fibrele cu sac nuclear prezintă o regiune centrală care este necontractilă, mai dilatată și care este bogată în nuclei. Fibrele cu nuclei în lanț au în regiunea centrală nuclei dispuși unul lângă altul sub forma unui lanț (Zărnescu, 2012).

Fusul neuromuscular are o dublă inervație: senzitivă și motorie. Inervația senzitivă este asigurată de terminațiile primare care sunt spiralate și se dispun în zona centrală a fibrelor intrafusale și de terminațiile secundare care au o dispunere “în buchet”. Inervația motorie este asigurată de motoneuronii gamma care sunt localizați în coarnele anterioare ale măduvei spinării. Axonii acestor neuroni motor se dispun la extremitățile contractile ale fibrelor intrasusale (Marcu, 2005).

Corpusulii tendinosi Golgi sunt situați la nivelul joncțiunii dintre mușchi și tendon. Aceștia sunt receptori senzitivi și au funcția de a informa sistemul nervos central aspura tensiunii musculare (Marcu, 2005).

Fibrele somatomotorii sunt reprezentate de axonii neuronilor alfa și gamma din coarnele anterioare ale măduvei spinării, iar în cazul mușchilor feței sunt reprezentate de fibre motorii ale nervilor cranieni. Fibrele somatomotorii alfa au diametru mare și sunt cele care stabilesc legătura cu fibrele musculare scheletice de la nivelul plăcii motorii. Fibrele motoneuronilor gamma au diametrul mic și inervează fibrele intrafusale. Activarea acestor neuroni permit ajustarea permanentă a sensibilității fibrelor neuromusculare (Marcu, 2005).

Joncțiunea neuromusculară, numită și placă motorie este un tip particular de sinapsă, care se realizează între terminațiile axonale ale neuronilor motori și fibrelor scheletice. Particularitatea acesteia este aceea că membrana postsinaptică, prezintă invaginări adânci (Marcu, 2005). Joncțiunea neuromusculară, asemenea unei sinapse chimice este alcătuită din componenta presinaptică, componenta postsinaptică și fanta sinaptică. Fanta sinaptică reprezintă spațiul dintre componenta presinaptică și cea postsinaptică. Componenta presinaptică este reprezentată de butonul terminal al fibrei nervoase. În perimisium, nervii motori mielinizați se ramifică și dau naștere la câteva ramuri terminale.. Aceste ramuri formează butonul terminal care este acoperit de celula Schwann. Butonul terminal prezintă mitocondrii și vezicule sinaptice ce conțin neurotransmițători. La nivelul membranei presinaptice, în zonele active, veziculele cu acetilcolină (ACh) se descarcă la nivelul fantei sinaptice. Componenta postsinaptică este formată din sarcolemă și sarcoplasma aferentă sinapsei. Acesta prezintă invaginări la nivelul cărora se găsesc receptori pentru acetilcolină (Zărnescu, 2012). În momentul în care o moleculă de acetilcolină se cuplează cu receptorul său, acesta se va deschide și va permite ionilor de Na+ să intre și ionilor de K+ să iasă într-o cantitate mai mică. Descărcarea veziculelor sinaptice nu este suficientă pentru a determina o contracție, de aceea este nevoie de un potențial de acțiune. În urma potențialului de acțiune are loc un influx de Ca2+ care determină eliberare a câtorva sute de cuante de Ach. Astfel se formează un curent terminal de placă care duce la apariția unui potențial de acțiune la nivelul sarcolemei care se propagă până la nivelul sistemului T din triade (Figura 4). În final, acetilcolina este metabolizată de acetilcolinesteraza și astfel se încheie transmiterea sinaptică (Ristoiu și colab., 2004).

Un singur neuron motor alfa este capabil să inerveze mai multe fibre musculare datorită numeroaselor ramuri terminale ale axonului său. Prin urmare, un motoneuron alfa împreună cu toate fibrele pe care le inervează formează unitatea motorie (Marcu, 2005).

1.2. Fiziologia fibrei musculare

Mușchii prezintă o serie de proprietăți: contractilitatea, excitabilitatea, extensibilitatea și elasticitate. Contractilitatea este o proprietate specifică mușchilor și reprezintă capacitatea de a dezvolta tensiune între capetele sale și de a se scurta. Extensibilitatea este proprietatea mușchilor de a se lungi pasiv sub acțiunea unei forte exterioare. Excitabilitatea este proprietatea mușchilor de a răspunde la un stimul prin generarea unui potențial de acțiune și apariția contracției musculare. Această proprietate se datorează permeabilității membranei. Între manifestările electrice de la nivelul sarcolemei și fenomenele mecanice de la nivelul scromerului se produce un fenomen numit cuplaj excitație-contracție. Elasticitatea este o proprietate specifică mușchilor și presupune deformarea sub acțiunea unei forțe și capacitatea de a reveni pasiv la forma de repaus atunci când forța a încetat să mai acționeze ( Niculescu și colab., 2007).

Cuplarea excitație cu contracția este seria de evenimente prin care transmiterea unui potențial de acțiune de-a lungul sarcolemei duce la alunecarea miofilamentelor. Potențialul de acțiune (PA) se propagă de-a lungul sarcolemei până la nivelul sistemului T. Se activează canalele de Ca2+ și încep să se elibereze ioni de calciu. Transmiterea potențialului de acțiune de-a lungul tubulilor T ai triadelor determină ca proteinele tubulare sensibile la tensiune să își schimbe forma. Această schimbare de formă duce la deschiderea canalelor și induce eliberarea de Ca2+ în cisternele terminale ale reticulului sarcoplasmic, permițând astfel fluxului Ca2+ în citosol. Concentrația intracelulară de calciu crește de la 0.01µmol/l la 1-10 µmol/l. Calciul se leagă de troponină și stopează funcția de blocare a tropomiozinei. În urma legării calciului la nivelul său, troponina își schimbă forma, expunând site-uri de legare pentru miozină care sunt situsuri active. Prin urmare această creștere de concentrație a calciului culminează cu producerea unei contracții musculare. Atunci când potențialul de acțiune de la nivelul muscular încetează, proteinele tubulare sensibile la tensiune revin la forma lor inițială, închizând canalele de eliberare Ca2+. Nivelurile de Ca2+ în sarcoplasmă scad pe măsură ce Ca2+ este continuu pompat înapoi în reticulul sarcoplasmic prin transport activ. Fără Ca2+ interacțiunea miozină – actină este inhibată și are loc relaxarea (Marieb, 2016).

În timpul contracției musculare au loc mai multe evenimente care se produc cu ajutorul calciului, magneziului, ATP-ului și ATP-azei. Ca2+ care este eliberat din reticulul sarcoplasmic se cuplează cu troponina C și determină activarea troponinei I. Troponina I la rândul ei duce la modificarea conformației tropomiozinei și eliberarea sinusurilor de legare a miozinei pe filamentului de actină. Un rol deosebit de important pentru alunecare filamentelor îl are ATP-ul (Figura 3). Este necesară câte o moleculă de ATP pentru fiecare dintre cele două jumătăți ale capătului miozinei. În acest complex miozină-ATP, capetele lor formează un unghi de 90ș. Atunci când calciul se găsește în concentrație intracelulară mare, de capetele miozinei se leagă actina care activează ATP-aza de la nivelul capului miozinei. În urma acestor evenimente ATP-ul este hidrolizat în ADP și o grupare fosfat (Pi) și sunt necesari 3 mmol/l de Mg2+. În final rezultă un complex actină-miozină-ADP-Pi.Atunci când Pi părăsește complexul, capetele miozinei se înclină de la 90ș la 50ș, fapt ce duce la alunecarea filamentelor de actină și miozină unul față de celălalt. Această alunecare este exercitată în direcții opuse la cele două capete ale filamentului de miozină (Atwood și colab., 2010). Prin urmare scurtarea sarcomerului are loc la ambele capete ale filamentului de miozină. În cazul în care se pierde ADP-ul, capetele miozinei se înclină și mai mult, ducând la formarea unui unghi de 45ș. În această configurație alunecarea încetează, iar complexul actină – miozină este stabil. În prezența ATP-ului , este reluată poziția inițială de 90ș. În funcție de frecvența potențialelor de acțiune și dacă concentrația de calciu este încă suficient de mare, ciclul este reluat de până la 50 de ori până când mușchiul este complet scurtat. Dacă concentrația de calciu scade sub 1 µmol/l atunci ciclul este oprit și are loc relaxarea mușchiului (Figura 5). Acest ciclu este valabil pentru o contracție musculară izotone unde tensiunea musculară rămâne constantă și lungimea se micșorează, spre deosebire de o contracție izomerice unde lungimea este constantă și tensiunea este variabilă (Flonta și colab., 2007).

În timpul activității musculare au loc mai multe tipuri de manifestări precum cele electrice, mecanice, biochimice, calorice și acustice. Manifestările electrice sunt datorate potențialului de acțiune al fibrei musculare scheletice. Sarcolema este polarizată cu sarcini negative la interior și sarcini pozitive la exterior, cu o diferență de potențial de 90 mV. Atunci când fibra musculară este excitată se produce apariția unui potențial de acțiune care se propagă cu o viteză de 30 m/s. Manifestările acustice se datorează vibrațiilor care se produc la nivelul fasciculelor musculare care se contractă asincron. Mușchii sunt principalii generatori de căldură din organism de aceea, nu toată energia eliberată în timpul contracției este transformată în lucru mecanic, ci o parte se pierde sub formă de căldură. Prin urmare manifestările termice se datorează fenomenelor biochimice din fibra musculară. Randamentul contracției musculare este de 30% , ceea ce înseamnă ca 70% din căldura generată se pierde sub formă de căldură calorică (Niculescu și colab. , 2007).

Miograful permite înregistrarea fenomenelor care au loc în contracția musculara în cazul manifestărilor mecanice. Activitatea musculară este gradată, în funcție de câte unității motorii au fost activate. În urma aplicării unui stimul unic, cu o valoare prag, are loc o contracție unică, rapidă, numită secusă (Figura 6). Dacă are loc o contracție susținută produsă prin aplicarea unei succesiuni de stimuli atunci se va produce un tetanos (Niculescu și colab., 2007).

Secusa prezintă mai multe componente: perioada de latență care durează în medie 0,01 secunde și reprezintă intervalul de timp din momentul aplicării stimulului până la începutul contracției; perioada de contracție care durează 0.04 secunde și perioada de relaxare care durează 0,05 secunde (Ristoiu și colab., 2004).

În funcție de frecvența stimulilor s-au observat două tipuri de tetanos: tetanos complet și tetanos incomplet. Tetanosul incomplet este rezultatul sumării incomplete a mai multor secuse, ca urmare a faptului că fiecare stimul din serie cade în perioada de relaxare a contracției precedente. Tetanosul complet se realizează prin aplicare unor stimulări repetate la interval de timp foarte scurte, iar în acest caz fiecare excitație cade în perioada de ascendentă a contracției precedente (Ristoiu și colab., 2004).

Manifestările biochimice se produc în urma utilizării ATP-ului ca energie pentru producerea contracției musculare. ATP –ul este descompus în ADP și Pi și energie pentru glisarea filamentelor. De asemenea, descompunerea ATP-ului se face și în lipsa oxigenului. Regenerarea ATP-ului se face prin trei căi și anume: descompunerea creatinfosfat – ului (CrP), glicoliză anaerobă și glicoliză aerobă (Flonta și colab., 2007).

Creatinfosfatul este prezent în mușchi și reprezintă o rezervă de energie. Gruparea fosfat rezultată din descompunerea creatinfosfat-ului este cedată ADP-ului fapt care permite refacerea ATP-ului în condiții de anaerobioză. Rezervele de CrP se refac prin intermediul energiei rezultate din urma glicolizei. Cu ajutorul celor 25 µmol CrP/g de țesut muscular sunt posibile 50 de contracții musculare înainte ca rezerva să se epuizeze (Flonta și colab., 2007).

În timpul glicolizei anaerobe rezervele de glicogen din mușchi sunt transformate în acid lactic, iar pentru fiecare mol de glucoză degradată se obțin 3 moli de ATP. În eforturile susținute, energia produsă anaerob este insuficientă, iar glicoliza aerobă începe în același timp. Glucoza din sânge este descompusă în acid lactic, iar energia obținută în acest caz este doar de 2 moli ATP/mol de glucoză pentru că un mol de ATP este utilizat pentru fosforilarea glucozei. În cazul în care glicoliza anaerobă se prelungește atunci acidul lactic acumulat va determina scăderea pH-ului la nivel muscular, care va duce la blocare contracției și instalarea oboselii musculare (Flonta și colab., 2007).

Glicoliza aerobă apare în situațiile în care trebuie susținut un efort muscular intens și de o durată mai lungă. Prin intermediul acestei căi, glucoza este degradată în ciclul Krebs rezultând în final 34 moli de ATP/ mol glucoză (Ristoiu și colab., 2004).

Controlul nervos al activității musculare este organizat pe trei nivele. Nivelul superior de control al activității musculare este reprezentat de ariile de asociație din neocortex și de nucleii bazali. Acest nivel superior este responsabil cu stabilirea scopului mișcării și strategia de realizare a mișcării respective care asigură cel mai bine realizarea scopului. Nivelul mijlociu de control al activității musculare este reprezentat de cortexul motor și cerebel și este responsabil cu tactica. Acest nivel presupune stabilirea secvențelor de contracții musculare, aranjate în timp și spațiu, necesare pentru o realizare singură și precisă a scopului. Nivelul inferior de control al activității musculare este reprezentat de trunchiul cerebral și măduva spinării. Acest nivel presupune activarea neuronilor motori și a neuronilor intercalari care generează mișcări orientate și corectarea posturii, prin urmare este responsabil cu execuția (Flonta și colab., 2007).

CAPITOLUL 2. CAVEOLELE ȘI CAVEOLINA -3

2.1. Caveolele

Caveolae sunt structuri celulare care au fost descrise pentru prima dată în 1953 în endoteliul inimii de George Emil Palade care le-a numit vezicule plasmalemale. Doi ani mai târziu, Eichi Yamada a descris structuri similare în epiteliul vezicii biliare, pe care le-a numit caveole intracelulare. Din momentul descoperirii lor, prezența acestor structuri a fost documentată prin intermediul microscopiei electronice în majoritatea tipurilor de celule, cu câteva excepții precum: celulele roșii din sânge, trombocitele, limfocitele, neuroblastomul și alte celule neuronale și anumite epitelii cum ar fi celulele CaCo-2. Pe baza compoziției lor lipidice și a caracteristicilor biofizice, caveolele sunt considerate subtipuri de plute lipidice care formează invaginării și sunt capabile de endocitoză. Caveolele se deosebesc de celelalte invaginării lipidice prin prezența caveolinei – 1 care este un marker (Echarri și Pozo, 2015).

2.1.1 Modul de formare și structura caveolelor

Caveolele au fost definite morfologic ca invaginării sferice sau în formă de balon ale membranei plasmatice, care au forme și dimensiunii regulate de aproximativ 70 nm în cazul diametrului exterior. Caveolele apar sub o forma ordonată, lineară pe întreaga suprafață celulară, ceea ce sugerează o legătură cu citoscheletul (după Echarri și Pozo, 2015). În multe tipuri celulare, caveolele apar singure, în lanțuri sau în clustere asemănătoare strugurilor. În endoteliu, caveolele sunt atașate pe orice supratafață a celulei, în timp ce în alte epitelii, caveolele sunt atașate în mod preferențial la suprafața anumitor zone ale membranei plasmatice.

În celulele musculare sau în adipocitele proaspăt izolate, caveolele apar mai degrabă ca entități unice invaginate, decât în clustere, deși pot fi găsite și sub formă de clustere. Caveolele pot adopta mai multe conformații. De exemplu, pot fuziona și forma canale transendoteliale ocazionale (TEC). Se crede, de asemenea, că formează clustere complexe, care sunt deschise pe ambele fețe ale celulelor endoteliale, așa-numitele organite vesiculo-vacuolare (VVO). VVO-urile sunt structuri specializate care apar fie în endoteliul normal al venulelor (în stare de echilibru, fie când sunt activate de anumite substanțe sau de citokine), fie în endoteliul tumorilor solide (Stan, 2005).

Caveolele se găsesc în densități diferite pe suprafața diferitelor tipuri de celule. Celulele endoteliale sunt printre cele mai bogate în caveole, unde aceste structuri au fost cel mai mult studiate prin microscopie electronică. Există o variație marcată a densității caveolare într-un anumit tip celular, care este cel mai bine exemplificat în cazul diferitelor tipuri de endoteliu. În endoteliu, cea mai mare populație de caveole apare în endoteliul capilarelor de tip continuu (de exemplu, 89 și 78 de deschideri veziculare pe µm2 de membrană plasmatică în inimă și respectiv în endoteliul mușchiului scheletic), în timp ce numărul acestora este mult mai mic în endoteliul fenestrat (de exemplu, 25 și 10 vezicule per µm2 în jejun și, respectiv, în pancreas), iar în endoteliul de tip discontinu caveolele apar ocazional. Aceste cifre au fost determinate din celulele endoteliale după fixarea cu aldehidă și au fost contestate de constatări ale numărului caveolar redus în exemplare congelate și nefixate, care sugerează că fixarea ar putea induce formarea invaginărilor. De asemenea, s-a descoperit că diametrul caveolele din țesuturile înghețate este puțin mai mare decât cele din țesuturile fixate. Adipocitele sunt, de asemenea, foarte bogate în caveole, alături de fibroblaste, mușchi și anumite celule epiteliale. În adipocite, aproximativ 20% din membrana plasmatică a fost estimată a fi membră caveolară (Pollard și colab., 2017).

O etapă importantă în descrierea și studierea caveolelor a fost demonstrarea prin imunocitochimie, caveolina fiind o componentă specifică care formează învelișul caveolar. Caveolina-1 împreună cu caveolina-2 și caveolina-3 fac parte dintr-o familie de gene bine conservată la amniote. Caveolina-1 și -2 au o distribuție similară la nivelul țesuturilor și sunt exprimate în majoritatea tipurilor de celule, în timp ce caveolina-3 apare în principal în celulele musculare. Fiecare caveolă are în jur de 140-150 molecule CAV1 (Ludwig și colab., 2013). Proteinele Cav1 și Cav3 au patru domenii primare: domenii terminale NH2 cu multiple situri de ubiquitinare/sumoilare pe ambele Cav, precum și un situs de fosforilare pe Cav1; domenii scaffold care formează α-helixul și se inserează în membrană; domenii membranare helix-turn-helix care ies din membrană la un loc de palmitoilare și domenii COOH-terminale cu alte două cisteine palmitoilate și două situsuri de sumoilare pe Cav3 (Busija și colab., 2017).

Mult timp s-a considerat că, caveolinele sunt singurele componente proteice ale caveolelor și au un rol important în biogeneza acestor structuri. Dovezi directe în acest sens sunt furnizate de experimentele care arată că expresia caveolinei în bacterii este suficientă pentru a genera invaginări membranare asemănătoare caveolelor. Deși caveolinele au fost considerate singurele proteine responsabile de formarea caveolelor, date recente au arătat existența unei familii de proteine, denumite cavine care sunt componente structurale și funcționale integrale ale caveolae. Lista componentelor caveolare a fost considerabil extinsă, cu identificarea proteinelor EHD2 și pacsin 2. Acest lucru sugerează faptul că biogeneza și funcția caveolelor implică un set complex de proteine (Ludwig și colab., 2013).

Cavinele 1, 2, 3 și 4 se localizează în caveole și sunt importante pentru formarea și dinamica caveolelor. Trebuie menționat că nomenclatura cavinelor nu este aceeași cu numele genice standard pentru această familie prin urmare genele codificatoare sunt: PTRF pentru cavina 1, SDPR pentru cavina 2, PRKCDBP pentru cavina 2 și respectiv MURC pentru cavina 4; cavina 3 este, de asemenea, denumit frecvent SRBC (Ludwig și colab., 2013).

În urma unor experimente de microscopie electronică s-a observat că la nivelul caveolelor există o compoziție mai bogată în colesterol. Studiile ulterioare au demonstrat că, caveolina-1 leagă strâns colesterolul liber, dar leagă și lipozomii artificiali fosfolipidici dar numai după încorporarea colesterolului. Mai mult decât atât, colesterolul este necesar pentru a stabiliza oligomerii de caveolină, atât sterolul cât și proteinele sunt necesare pentru a genera și menține structura caveolară. Sensibilitatea arhitecturii caveolare la depolarizarea și oxidarea colesterolului a determinat faptul că, caveolele sunt microdomenii membranare bogăte în colesterol (Kovtun și colab., 2015).

Caveolele sunt de asemenea, bogate în sfingolipide cum ar fi sfingomielina, ceramida și gangliozidele care apar cu precădere în pliul exoplasmatic al bistratului membranar. Caveolina-1 leagă, de asemenea, glicosfingolipidele cum ar fi gangliozida GM1 și acizii grași. Compoziția lipidică a caveolelor adică, colesterolul, sfingomielina, glicosfingolipidele și acizii grași saturați, este similară cu cea a „plutei lipidice”, microdomeniu de membrană care se întalnește la toate tipurile de celule (Kovtun și colab., 2015).

Predispoziția caveolinelor pentru a forma oligomeri, precum și prezența colesterolului, sunt un factor esențial care contribuie la formarea domeniilor caveolare. Într-adevăr, sinteza caveolelor este un proces complex de asamblare în trepte, care necesită mai multe molecule distincte . Caveolinele sunt sintetizate în reticulul endoplasmic și suferă rapid prima etapă a oligomerizării din care rezultă oligomeri formați din 7 până la 14 monomeri de caveolină (8S-cav). După exportul acestor oligomeri din reticulul endoplasmic în aparatul Golgi, colesterolul s-a cristalizat și ajută la formarea oligomerilor de caveolină- 70S care se combină cu structuri 8S-cav. Într-adevar, colesterolul joacă un rol esențial în biogeneza, integritatea și funcția caveolelor; de fapt, epuizarea acesteia duce la întreruperea structurii caveolare mature și împiedică geneza acestora. Înainte de formarea structurii caveolare mature în membrana plasmatică, se efectuează atât palmitoilare, cât și procese de inserție a cavinelor. Monomerii Cav1 și Cav2 se inserează cotranslațional în membrana reticulului endoplasmatic și se oligomerizează rapid în oligomeri 8S-Cav conținând 7-14 Cav (Figura 9). Acești oligomeri sunt transportați către site-urile de ieșire ale reticulului endoplasmatic în decurs de 5 minute de la sinteză, fiind utilizți pentru transportul dependent de COPII la aparatul Golgi. În apartul Golgi, colesterolul cristalizează în membrană și ajută la formarea complexelor 70S-Cav compuse din 18–25 subunități 8S-Cav, după care 70S-Cav este transportat la membrana plasmatică de către patru proteine ​​adaptoare (FAPP-1, -2) dependente de vezicule secretoare. La nivelul membranei plasmatice ​​cavinele care se trimerizează în citosol se agregă treptat pe membrana 70S-Cav pe parcursul a peste 25 de minute și ajută la curbura membranei. Caveolele mature prezintă trei straturi: o membrană bogată în lipide și colesterol și anionic, înglobată de un strat de palmitoylat 70S-Cav, care este înconjurat de un strat oligomerizat cu cavine 60S (Busija și colab., 2017).

Dezorganizarea caveolelor începe de la membrana plasmatică. În figura 10 este prezentată fosforilarea Cav1 dependentă de Src. Fosforilarea Cav1 inițiază formarea de vezicule dependente de dinamină care modifica structura caveolelor, dislocând trimerele de cavine și ducând la ubiquitinarea caveolinelor (UbCav). Stresul mecanic deplasează cavinele din membrană, care duce la ubiquitinarea și endocitoza ulterioară a Cav1 în endosomul timpuriu. Complexul ubiquitină- caveolină din endosom și colesterolul asociat cu proteine care conține valosină (VCP) formează corpuri multivesiculare prin sortarea complexelor endosomale necesare pentru transportul complexelor proteice și degradarea endosomului / lizozomului târziu. Unele poliUbCav sunt degradate de proteazom (Busija și colab., 2017).

2.1.2 Funcțiile caveolelor de la nivelul fibrei musculare

O proprietate esențială a membranei plasmatice este plasticitatea sa, care este necesară pentru detectarea și transmiterea semnalelor și pentru acomodarea schimbărilor de tensiune impuse de mediul său sau de biomecanica proprie. Plasticitatea membranei plasmatice se realizează parțial prin existența unor diferite domenii specializate. Un astfel de domeniu este caveola, o invaginare a membranei plasmatice cu un diametru de 60–80 nm și o formă caracteristică asemănătoare literei grecești omega (Ω). Caveolele sunt nanodomine membranare invaginate unice, care joacă un rol major în organizarea semnalizării, homeostazei lipidice și adaptării la tensiunea membranei. Caveolae sunt frecvent asociate cu fibrele de stres, un regulator major al tensiunii membranare și a formei celulare. Tensiunea din membrana plasmatică determină curbura caveolelor deoarece acestea se aplatizează la tensiune ridicată și se invagină la tensiune scăzută, oferind astfel un sistem de control al tensiunii. De asemenea, caveolele reglează mai multe căi celulare, inclusiv contractilitatea actomiozinei indusă de RhoA și alte căi mecano-sensibile. Prin urmare, caveolele răspund la modificările tensiunii, controlate de actină, prin asocierea lor cu fibrele de stres. Caveolele sunt au în structura lor o cantitate remarcabilă de molecule de semnalizare, incluzând proteine adaptoare, receptori de membrană sau GTPaze mici. Asocierea caveolelor cu filamentele de actină și capacitatea lor de a răspunde la tensiune, fie prin întindere mecanică, umflare osmotică sau întinderea produsă de actină, asigură caveolelor o poziție optimă pentru reglarea căilor de mecanotransducție. (Echarri și Pozo, 2015).

Interacțiunile dintre caveoline, cavine, lipide și alte proteine creează un mediu celular proteic, lipid și lipoproteic. Într-adevăr, caveolele sunt o modalitate atractivă de a segrega sau integra anumite căi în microdominii membranei plasmatice. Mai mult, caveolele sunt implicate în mai multe procese fiziologice ce au legătură cu traficul de membrană și compartimentarea. De exemplu, în ciuda faptului că au fost inițial identificate ca structuri aproape statice, caveolele participă la evenimentele de transport celular, cum ar fi endocitoza, transcitoza și pinocitoza. Mai mult decât atât, structurile caveolare joacă un rol critic nu numai ca transductor al stimulilor mecanici în cei chimici, dar participă și la procesele de migrare a celulelor. Această modulare a citoscheletului este o consecință a asocierii între caveole și mai multe componente ale aparatului citoscheletic, cum ar fi filamentele de actină, microtubuli și filamente intermediare. De asemenea, este de menționat faptul că acestea au un rol important în homeostazia colesterolului din celulă. În principal, importanța caveolelor a fost caracterizată detaliat în procesele de transducție, de semnalizare, fapt cunoscut și sub denumirea de „ipoteza de semnalizare caveolară”(după Busija și colab., 2017).

Endocitoza caveolară a fost descrisă pentru prima dată ca fiind dependentă de citoscheletul de actină. Ulterior, studiile folosind virusul SV40, care intră prin caveole cel puțin atunci când caveole sunt prezente în celulă, au arătat, de asemenea, că a fost necesară polimerizarea actinei. Similar cu endocitoza mediată de clathrin, endocitoza caveolară este, de asemenea, reglată de dinamina 2 (Dyn2) și Dyn2 s-a dovedit că reglează direct polimerizarea actinei. Endocitoza caveolară depinde foarte mult de adeziunea celulei la matricea extracelulară, deoarece pierderea acestei adeziuni are ca rezultat o relocare a Cav1 din membrana plasmatică în zona perinucleară. Această mișcare este dependentă de Dyn2, filamente de actină și proteine reglatoare de actină. Mai mult, filamina A, care reticulează fibrele de stres, este necesară pentru relocarea Cav1 în regiunea perinucleară. Proteina kinazei Cα (PKCα), care fosforilează filamina A, reglează, de asemenea, această cale. În mod similar, silențierea reglatorilor fibrelor de stres, Abl kinaza sau mDia1, previne endocitoza caveolară (Echarri și Pozo, 2015).

În Figura 9 sunt prezentate principalele molecule care formează caveolele , amintite și în subcapitoulul anterior, caveolina, cavina și pacsin 2, dar sunt prezentate și proteinele care reglează dinamica caveolelor precum Dyn2, EHD2 și filamina A. Sunt, de asemenea, indicate moleculele caveolare care au o asociere funcțională sau fizică cu citoscheletul de actină și, prin urmare, pot media interacțiunea fizică și funcțională între caveole și fibrele de actină. Filamina A este descrisă ca fiind proteina principală care mediază o legătură cu fibrele de stres, dar ar putea exista și alți linkeri încă neidentificați. Reglatorii fibrelor de stres, Abl kinazele și mDia1, care au rol în organizarea caveolelor și în transpot sunt prezentate lângă RhoA, care este principalul regulator al fibrelor de stres și este reglat de Cav1 (Echarri și Pozo, 2015).

Există trei familii de proteine care au fot identificate ca fiind componente ale caveolelor: dinamine, pacsine și EHD (domeniul de omologie C-terminal Eps15). Proteinele EHD și pacsinele sunt, de asemenea, prezente la nivelul gâtului caveolar (Figura 13). Proteinele EHD sunt ATPaze care, la fel ca dinamina, utilizează energia rezultată în urma hidrolizei nucleotidelor pentru a modifica curbura membranei de care sunt legate. În celulele lipsite de proteine EHD, caveole nu mai tind să formeze clustere. De asemenea, deși celulele lipsite de EHD-uri au în continuare caveole, numărul acestora scade semnificativ atunci când celulele sunt întinse. Aceste observații sugerează că EHD-urile ajută la menținerea ordonată a caveolelor și permit ca acestea să își păstreze forma atunci cânt membrana plasmatică este supusă unor întinderii repetate (Yeow și colab., 2017).

S-a dovedit faptul că, caveola este importantă pentru reglarea multor cascade de semnalizare, inclusiv a mai multor căi de mecanotransducție. De asemenea, caveolele joacă un rol esențial în homeostazia lipidelor, iar absența componentelor caveolare duce la lipodistrofie în cazul modelele de șoarece, dar și la oameni. Mai mult, caveolele au un rol în tamponarea stresului mecanic la nivelul membranei plasmatice, ceea ce ar putea explica apariția distrofiilor musculare, miopatiilor și cardiopatiilor la șoareci și la oameni care poartă mutații în componente caveolare, deoarece celulele musculare se confruntă constant cu stres mecanic la nivelul membranei plasmatice. Celulele trebuie să se adapteze sub acțiunea factorilor mecanici prin remodelarea membranei plasmatice și a citoscheletului de actină Au fot aduse dovezi care demonstrează rolul esențial al caveolinelor în structura caveolelor. Expresia caveolinei-1 în celulele în care atât expresia caveolelor cât și expresia caveolinelor este absentă induce formarea caveolelor și reconstituie stratul caveolar. (Kovtun și colab., 2015).

În urma mai multor studii s-a observat faptul că, caveolele intervin în mai multe procese moleculare precum: transcitoza macromoleculelor, semnalizare celulară, angiogeneză. Transcitoza macromoleculelor a fost prima funcție propusă pentru caveole. S-a sugerat că, caveolele medieze transportul pentru molecule precum albumina, trasferina, insulina, lipoproteinele cu densitate mică și chemokinele. Transcitoza ar putea fi esențială pentru trasportul specific și orientat al moleculelor la anumite organe. De exemplu, această cale poate fi crucială pentru celulele endoteliale capilare care formează bariera hematoencefalică. Transportul albuminei a fost cel mai studiat caz de transcitoză; este semnificativ, deoarece albumina poate transporta diferite molecule mici, cum ar fi acizii grași și hormonii steroizi. Transportul albuminei a fost sugerat să fie mediat de receptorul gp60 localizat în caveole și, mai recent, s-a dovedit că, caveola este implicată în transcitoza endotelială a albuminei (Sowa, 2012).

Numeroase molecule implicate în translocarea ionilor de calciu au fost localizate în caveole și ar putea juca un rol foarte important în semnalizarea celulară, inclusiv activarea eNOS. Mai mult decât atât, caveolele reglează influxul de ioni de calciu, prin legarea domeniul  scaffold la TRPC1 în celulele endoteliale (Sowa, 2012).

Angiogeneza este procesul de formare unui nou vas sanguin care are loc în trei faze clar distincte: inițierea, proliferarea celulelor vasculare și morfogeneza. Câteva proteine importante de semnalizare implicate în angiogeneză au fost localizate în caveole precum receptorul VEGF (VEGFR), receptorul urokinazei (uPAR), eNOS și receptorii TGF-β (Figura 14). Se pare că în urma mai multor studii realizate pe modele de șoareci s-a demonstrat cum caveolele au un rol în angiogeneză (Sowa, 2012).

2.2. Caveolina- 3

2.2.1. Structura proteinei caveolină 3

Caveolinele sunt principalele componente structurale ale caveolei, un tip de plută lipidică formată din invaginațiile veziculare ale membranei plasmatice. În plus, caveolinele sunt implicate într-o serie de procese de semnalizare celulară printr-o asociere cu o multitudine de proteine pentru a forma complexe multiproteice macromoleculare.

Secvența primară a caveolinei-3 este compusă din 151 de aminoacizi împărțiți în patru domenii: domeniul N-terminal (amino acizii 1–54) care conține un motiv specific caveolinelor (amino acizii 41-48, FEDVIAEP), domeniul scaffold (amino acizii 55 până la 73), domeniul transmembranar (amino-acizii 74 – 106) care poate să formeze o structură hairpin, plasând astfel și domeniul C-terminal (amino acizii 105-151) în citoplasmă. și domeniul terminal C (amino acizii 107-151);

Domeniul scaffold N-terminal reglează o varietate de molecule de semnalizare incluzând eNOS, proteină G, receptori adrenergici, monomeri ai proteinkinazei C și proteinkinaze din familia Src și are efecte substanțiale asupra numeroaselor aspecte ale fiziologiei musculare, inclusiv a distrofinei musculare, transportului colesterolului, semnalizării intracelulară, suprimării tumorii și sintezei miocitelor, însă funcția sa fiziologică în mușchiul scheletului nu este încă pe deplin înțeleasă (Shang și colab., 2017).

S-a observat că se păstrează porțiuni mari ale secvenței primare între caveoline cu 61% asemănare a secvenței între izoformele cav-1 și cav-3. Cu toate acestea, există diferențe distincte în secvență, cum ar fi capătul N-terminal extins al cav-1 comparativ cu cav-3. Există, de asemenea, o conservare substanțial mai mică între secvențele cav-3 și cav-1 cu cav-2, 33% și, respectiv, 30% (Kim și colab., 2014). De asemenea, există o diferență în ceea ce privește funcțiile izoformelor; de exemplu, cav-2, spre deosebire de cav-1 și cav-3, pare să nu fie necesară pentru formarea caveolelor și nici nu pare să fie implicat în transportul vezicular. Diferențele funcționale între izoformele caveolinelor sunt probabil influențate de țesuturile în care sunt exprimate; cav-1 și cav-2 sunt exprimate în majoritatea tipurilor celulare, în timp ce cav-3 este specific pentru mușchii scheletici, netezi și cardiaci (Whiteley și colab., 2012).

Domeniul scaffold, se află lângă domeniul N-terminal, si este esențial atăt pentru formarea oligomerilor caveolinei căt și pentru asocierea cu alte proteine.

Domeniu C-terminal al caveolinei-3 are palmitoylated pe trei reziduri de cisteina. Aceste lanțuri palmitate ajută la ancorarea domeniului C-terminal la membrană și s-a sugerat că ar putea crește stabilitatea structurii caveolare. De asemenea un alt posibil rol al lanturilor palmitate este acela de a ajuta la reglarea si transportul colesterolului o altă componentă cheie în structurile caveolare. Această structură modulară proteinei permite caveolinei-3 să se poată asocia cu canale ionice și alte molecule de semnalizare.

Interesant este faptul că s-au observat șoareci care nu prezintă cav-3, dar dezvolta un sistem de tubulii T dezorganizat în schelet mușchi. Tubulii T sunt invaginații ale membranei sarcolemale găsite în celulele excitabile care facilitează transmiterea potențialului de acțiune de la exterior la interiorul celulei. Pe scurt, depolarizarea membranei plasmatice duce la deschiderea canalelor de calciu dependente de voltaj de tip L, localizate în tubulii T care controlează cuplarea excitație-contracție în cooperare cu receptorul de rianodină (RyR), care se află în reticulul sarcoplasmic. În anul 2010, Vassilopoulos și colab., au arătat că cav-3 este imunoprecipitată din microzomi de șobolan formând complex cu triadă și cu izoforma receptorului de rianodină RyR1. În plus, grupul a raportat, de asemenea, că cav-3 ar putea fi co-imunoprecipitată din celulele COS-7 transfectate cu GFP-RyR corespunzător domeniului C-terminal, ceea ce presupune că interacțiunea era independentă de triadă și că regiunea transmembranară a receptorului a fost implicată (Vassilopoulos și colab, 2010).

Mutațiile aminoacizilor și modificările nivelurilor de expresie ale caveolinelor au fost, de asemenea, legate de patogeneza mai multor stări de boală, inclusiv cancere, tulburări cardiovasculare, diabet și o gamă largă de distrofii musculare degenerative (Whiteley și colab., 2012).

2.2.2 Funcțiile proteinei caveolină- 3 de la nivelul fibrei scheletice

Caveolina-3 nu numai că este asociată cu membrana plasmatică, dar aceasta se dispune și de-a lungul fibrelor de stres. În mod notabil, expresia caveolin-3 a determinat, de asemenea, ca α-actină să formeze o rețea de actină bine definită. În schimb, absența caveolinei-3 a fost asociată cu un citoschelet de actină mai puțin organizat.

În plus, s-a comparat localizarea intracelulară a α-actinei și a proteinei musculare 22α și s-a observat ca ambele proteine s-au găsit co-localizate în structuri bine definite numai atunci când caveolina-3 a fost supraexprimată (Gutierrez-Pajares și colab., 2015)

Caveolinele sunt o clasă de proteine ​​membranare care se asociază în mod direct cu colesterol și constituie elemente structurale ale caveolelor. Domeniul scaffold al caveolinei participă în interacțiunile proteină-proteină și în reglarea evenimentelor de transmitere a semnalului. Țesutul muscular striat exprimă în principal izoforma caveolină-3. Nivelurile de expresie ale caveolinei-3 în mușchiul scheletic modulează Ca2+ prin canalele de calciu dependente de voltaj. În plus, studiile recente au raportat interacțiunea directă a caveolin-3 cu receptorul pentru rianodină RyR1 și au sugerat inhibarea canalelor cationice mecano-sensibile de către caveolin-3. Localizarea precisă a caveolin-3 în fibrele musculare scheletice rămâne controversată. Studiile anterioare au raportat că, caveolina-3 este prezentă în sarcolemă asociată cu complexul de distrofină și că, în timpul diferențierii celulare, caveolina-3 este asociată cu dezvoltarea tubulior T, dar este absentă în tubulii T maturi. Un studiu ulterior asupra mușchiului soleus de la șoarecii adulți a raportat că, în timp ce caveolina-3 are o densitate mare la nivelul membranei plasmatice, acesta este prezentă și în tubulii T maturi (Barrientos și colab.,2015).

Colesterolul și caveolina sunt componente integrale ale membranei care modulează funcția sau localizarea multor proteine celulare. Fibrele musculare scheletice, care au un nivel neobișnuit de ridicat de colesterol în tubulii transversali, exprimă izoforma caveolină-3. Eliminarea colesterolului afectează excitația-contracția în fibrele musculare scheletice. În urma unui studiu s-a arătat faptul că tratarea fibrelor musculare de la șoarecii adulți cu agentul de îndepărtare a colesterolului metil-β-ciclodextrină a scăzut colesterolul din fibre cu 26%, a modificat localizarea caveolinei-3 și a canalului de calciu dependent de voltaj și a redus semnificativ ionii de calciu, fără a afecta integritatea membranei sau fără să provoace epuizarea calciului din reticulul sarcoplasmic. Fracțiile triadei de la șoarecii în vârstă aveau un nivel similar de colesterol și proteine RyR1 în comparație cu triadele de la șoarecii tineri, dar aveau caveolină-3 și gliceraldehidă 3-fosfat dehidrogenază mai scăzute și niveluri crescute de Na + / K + -ATPaze. Eliminarea parțială a colesterolului afectează cuplarea excitație-contracție și modifică localizarea caveolinei-3, în timp ce îmbătrânirea reduce conținutul de caveolină-3 și modifică expresia altor proteine ce aparțin tiradei (Barrientos și colab.,2015).

Cercetările anterioare au arătat că proteina Cav3 devin din ce în ce mai abundentă în timpul dezvoltării celulelor musculare și că este implicată în formarea miotuburilor și diferențierea celulelor, promovarea sensibilității receptorului de insulină (IR) și activarea căii de semnalizare PI3K/Akt. Lipsa de Cav3 a provocat imaturitatea celulară, atrofie musculară și creșterea glicemiei.

Cav3 este necesară pentru creșterea și maturarea celulelor musculare și s-a stabilit că mutațiile CAV3-P104L duc la deteriorarea metabolismului glucozei. Într-un studiu recent, s-a observat efectul precis al proteinei Cav3 crescută asupra morfologiei celulare, creșterii, proliferării și metabolismului glucozei și a fost explorată funcția fiziologică a Cav3. În prezența unui nivelul ridicat de glucoză, după ce expresia proteinelor Cav3 a crescut, a crescut și rata de proliferare celulară. Proteina Cav3 a determinat, de asemenea, creșterea suprafeței și diametrul celulei, proces observat prin microscopie confocală. Rezultatele unui studiu realizat pe celule C2C12 transfectate cu gena CAV3 au arătat cum diametrul celulei a crescut după transfecție. Prin urmare, aceste date susțin în mod direct că Cav3 nu numai că promovează creșterea celulelor musculare, ci și accelerează diviziunea și proliferarea acestora (Shang și colab., 2017)

La mamifere, mușchii scheletici reprezintă 40% din greutatea corporală totală și mai mult de 50% din consumul total de energie. În condiții normale, mușchii scheletici pot utiliza glucoza din circulație și glicogenul din depozite pentru a menține metabolismul și funcția normală. Mușchii folosesc aproximativ 95% din glucoza în condiții de stimulare ridicată a glucozei și a insulinei. Atunci când celulele C2C12 au fost stimulate cu un nivel ridicat de insulină, reglarea expresiei proteinei Cav3 în celulele C2C12 transfectate cu o genă mutantă a dus la o absorbție redusă de glucoză și formarea unui depozit de glicogen în cantități reduse (Deng și colab., 2017).

Un alt studiu a arătat că șoarecii cu deficiență în proteina Cav3 au dezvoltat rezistență la insulină și a afectat căile de semnalizare a insulinei în mușchiul scheletului, fără niciun efect asupra semnalizării insulinei hepatice, ceea ce duce la scăderea absorbției de glucoză în mușchiul scheletului și creșterea nivelului glicemiei. Rezultatele au arătat că în urma creșterii cantității de Cav3, absorbția de glucoză s-a dublat și conținutul total de glicogen a crescut treptat în celule, dar conținutul de glicogen nu a crescut semnificativ după eliminarea factorului de proliferare celulară, ceea ce sugerează că proteina Cav3 favorizează doar absorbția de glucoză în celulele musculare și nu afectează glicogenul total al celulelor. Dincolo de o creștere a proteinei Cav3, alți factori, cum ar fi stimularea insulinei sau stimularea contracției, pot fi necesari pentru a susține sinteza celulară a glicogenului. S-a raportat că GSK3β a inhibat proliferarea celulelor în alte tipuri de celule. Pentru linia de celule C2C12 cu un nivel de Cav3 crescut, creșterea și proliferarea celulelor mai rapidă necesită un consum mai mare de energie și materiale din glucoza intracelulară, astfel încât este posibil să nu existe o cantitate suficientă de glucoză pentru a crește sinteza glicogenului (Shang și colab., 2017).

Calea de semnalizare a receptorului pentru insulină (IR) este cunoscută pentru mediarea metabolismului celular al glucozei, lipidelor și proteinelor, inclusiv promovarea transportului glucozei, utilizarea glicogenului și promovarea sintezei glicogenului, inhibarea gluconeogenezei și glicogenolizei, promovarea sintezei proteinelor și inhibarea descompunerii proteice. În cazul șoarecilor knockout CAV3, IR din mușchiul scheletic scade rapid după 15 minute de la stimulare cu insulină, ceea ce duce la apariția rezistenței la insulină, scăderea absorbției de glucoză și scăderea sintezei glicogenului. Injectarea musculară a proteinei Cav3 pot determina refacerea semnalului IR în țesutul muscular. Supraexpresia Cav3 a îmbunătățit fosforilarea tirozinei a substratului IR 1 (IRS-1), care poate activa calea de semnalizare PI3K / Akt.

Akt este un factor cheie care participă la mai multe căi de semnalizare implicate în supraviețuirea celulelor, creștere și metabolism și are de asemenea, legătură cu structurile downstream GLUT4, GSK3β și p70s6K. În urma unor studii s-a observat că fără stimularea insulinei și cu o expresie crescută a CAV3, fosforilarea Akt crește cu aproximativ 47,74%, iar localizarea membranară a GLUT4 a crescut, dar GSK3β, care este legat de sinteza glicogenului nu a fost afectat. În plus, a fost afectată și molecula de semnalizare p70s6K, care este legată de sinteza proteinelor. Se pare că o expresie crescută a Cav3 ar putea activa Akt, care la rândul său activează p70s6K, crescând astfel sinteza proteinelor și creșterea celulelor (Shang și colab., 2017).

2.2.3 Gena codificatoare CAV3

Gena care codifică pentru caveolina-3 – CAV3- este localizată pe brațul lung al cromozomul 3 în poziția 3p25.3 acopera 12kb ADN genomic si este formata din 2 exoni. Exonul 1 are o lungime de 181 pb in timp ce exonul 2 este format de 1236 pb (Minetti si colab 1998, McNally si colab. 1998).

Această genă codifică un membru al familiei caveoline, care funcționează ca o componentă a membranelor plasmatice caveolare găsite în majoritatea tipurilor de celule. Mutațiile identificate în această genă conduc la perturbarea oligomerizării proteice sau afectează anumite căi de semnalizare intracelulară, perturbând formarea caveolelor și ducând la apariția unor afecțiuni precum: distrofia musculară forma centurilor de tip 1C (LGMD-1C), boala spasmelor musculare (RMD), mialgia. Bolile musculare cauzate de mutații ale genei CAV3 se numesc caveolinopatii. Până în prezent, au fost descrise peste 40 de mutații CAV3 patogene care sunt localizate în diferite domenii ale proteinei și duc la apariția mai multor fenotipurii. Nu există o corelație clară între genotip și fenotip. Cu toate acestea, mutațiile dominante sunt asociate, de cele mai multe ori, cu nivelurile scăzute ale Cav-3 în sarcolemă. Acestea sunt legate de disocierea hetero-oligomerilor de sarcolemă, degradarea pe calea ubiquitin-proteaozomală și acumularea anormală a Cav 3 de tip mutat și sălbatic în aparatul Golgi (Coraspe și colab., 2018).

S-a raportat că deleția genei CAV3 produce afecțiuni musculare, inclusiv hipertrofia și dilatația cardiacă severe, degenerarea miocitelor, fibroza (Whiteley și colab., 2012).

CAPITOLUL 3. MODIFICĂRILE BIOCHIMICE ȘI PATOLOGICE ÎN MUȘCHIUL SCHELETIC DATORATE MUTAȚIILOR ÎN GENA CAV 3

3.1. Modificări genetice ale genei CAV3 care intervin în patologia LGMD1C

Gena CAV3 codifică proteina caveolină-3, care este forma specifică mușchilor scheletici și face parte din familia proteinelor caveoline. Caveolinele sunt componentele principale ale caveolelor, care sunt subcompartimente ale membranei plasmatice. Caveolina-3 joacă un rol esențial în dezvoltarea și fiziologia mușchilor. Fenotipul caveolinopatiei este extrem de heterogen și include boli musculare, LGMD, sindrom QT lung, miopatie distală, intoleranță la exercițiu și nivel ridicat al creatinkinazei. Patologiile se manifestă de la miotonie sau slăbiciune musculară progresivă până la moartea. Vârsta de debut este, de asemenea, extrem de variată cu debut de la copilărie până la mijlocul anilor 60, atât pentru LGMD determinat de Cav3 cât și pentru o miotonie determinată tot de Cav3. Conform bazei de date privind mutațiile genelor umane, au fost raportate 41 de mutații în CAV3 până în prezent (Lee și colab., 2019).

Distrofia musculară forma centurilor (LGMD) face parte dintr-un grup de distrofii musculare care au trăsături clinice extrem de heterogene și fond genetic variat. Gena CAV3 este una dintre genele implicate în acest tip de patologie. Pacienții cu LGMD prezintă frecvent un nivel crescut de creatinkinază (CK) și slăbiciune progresivă a mușchilor proximali, care începe de obicei după vârsta de 2 ani. Cu toate acestea, varietatea genetică asociată cu această boală sugerează că manifestările clinice pot varia foarte mult între pacienți. În funcție de genele care cauzează această patologie și a modului de moștenire, LGMD este acum clasificat în opt subgrupuri autozomale dominante (LGMD1A-1H) și 26 subgrupuri autozomale recesive (LGMD2A-2W). Cu toate acestea, poate fi dificil să se diferențieze subtipurile din mai multe motive: numărul mare de subgrupuri care prezintă un spectru larg de manifestare clinice, moștenirea genelor atât în ​​manieră autozomal dominantă , cât și în mod recesiv și evidențierea fenotipului LGMD față de alte câteva distrofii musculare care nu sunt încă clasificate în LGMD (Lee și colab., 2019).

Un studiu realizat în 2019 a urmărit caveolinopatia familială autozomal dominantă cauzată de o mutație a genei CAV3. Pe baza confirmării mutației in gena CAV3 folosind NGS, băiatul și mama sa au fost diagnosticați cu caveolinopatie, fiecare prezentând LGMD1C și, respectiv, un nivel ridicat al creatinkinazei. Cei doi pacienți nu au prezentat nici o slăbiciune musculară până la ultimul control medical, când pacientul avea 16 ani și mama lui avea în avea în jur de 40 de ani și aveau doar niveluri crescute de CK. Cu toate acestea, din moment ce copilul a prezentat pseudohipertrofie, contractură ușoară a gleznei, iar în urma biopsiei musculare s-au observat caracteristici patologice ale distrofiei musculare, pacientul a putut fi diagnosticat cu LGMD1C. În plus, marcarea prin tehnici de imunohistochimie a caveolinei-3 a confirmat că mutația genei CAV3 a contribuit la patogeneză. S-a observat ca una dintre mutațiile identificate până în prezent este aceeași cu cea găsită la pacientul coreean, iar această mutație a fost, de asemenea, raportată la un alt pacient coreean cu boala spasmelor musculare. Această constatare sugerează specificul etnic al acestei mutații CAV3 (p.Val103- Val104del). Având în vedere manifestările clinice variabile, se poate presupune că există și alții pacienții asimptomatici sau purtători ai acestei mutații în populația coreeană. Până în prezent, corelația fenotip-genotip rămâne neclară. Pacienții cu diferite mutații în aceeași poziție din genom prezintă manifestări clinice diferite. Deleția care nu modifica cadrul de citire (mutatie in-frame) de la pacienții coreeni studiați poate fi asociată cu un fenotipul ușor, cum ar fi un nivelul foarte ridicat al creatinkinazei. În orice caz, o altă deleție in-frame a fost raportată într-o familie numeroasă, cu variabilitate interfamilială, inclusiv LGMD cu debut precoce la adulți. Această constatare sugerează că polimorfisele uninucleotidice (SNPs) rare sau alte determinări epigenetice pot regla căile asociate CAV3 și pot modifica caracteristicile clinice. Sunt necesare cercetări suplimentare pentru a confirma corelația genotip-fenotip în caveolinopatie. LGMD este o afecțiune foarte heterogenă cauzată de o varietate de gene, iar dezvolatrea geneticii și a secvențierii de nouă generație (NGS) a crescut ratele de diagnosticare ale LGMD. Cu toate acestea, în multe cazuri variantele genomice sunt adesea greu de interpretat, iar segregarea sau validările funcționale sunt esențiale pentru a face diagnosticul molecular final. Patologia musculară este una dintre cele mai simple modalități de a dovedi patogenitatea.

Pierderea completă a caveolinei-3 a putut fi arătată folosind marcarea imunohistochimică. În cele din urmă pacientul a fost diagnosticat folosind NGS după 15 ani de monitorizare. Acest tip de diagnostic genetic permite predicția prognosticului bolii și oferă un ghid adecvat pacienților care include, de exemplu, recomandări pentru o consultație cardiologică. În ultimii ani utilizarea NGS în diagnosticare a arătat numeroasele avantaje pe care acesta tehnică le are , în special pentru bolile neuromusculare, însă abordările tradiționale pentru stabilirea unui diagnostic, cum ar fi biopsia musculară, ar trebui luate în considerare, deoarece acestea pot furniza, de asemenea, indicii importante pentru diagnosticul corect (Lee și colab., 2019).

Caveolina-3 este o proteină specifică mușchiului care joacă un rol important în menținerea sănătății musculare și a homeostazei glucozei in vivo. O nouă formă dominant- autosomală a LGMD-1C la om se datorează unei mutații P104L în secvenței genei CAV3 umane. Atunci când mutația P104L a fost transfectată tranzitoriu în celulele C2C12, a scăzut absorbția de glucoză și sinteza de glicogen după stimularea insulinei. Analiza prin imunoblotare a arătat că mutația P104L a dus la scăderea expresiei Cav3, Cav1 și pAkt. Imunomicroscopia confocală a indicat că mutația P104L a redus Cav3 și GLUT4 în membrana celulară, care s-a acumulat mai ales în apropierea nucleului. Acest lucru este primul indiciu observat care duce la asocierea dintre slăbiciunea musculară datorată LGMD-1C și metabolismul energetic. Mutația P104L a condus la o scăderea absorbției glucozei musculară în celulele C2C12 și poate fi implicată în patogeneza LGMD1C (Deng și colab., 2017). În mod semnificativ, mutațiile dominante în CAV3 sunt asociate cu o cantitate redusă de proteină Cav3 care ar putea avea implicații importante pentru numeroase procese de la nivelul sarcolemei dependente de Cav3 și, prin urmare, cu severitatea bolii. O mutație missense a unui aminoacid unic, de la o prolină la o leucină în poziția 104 (Cav3P104L) este frecvent asociată cu LGMD1C. În condiții normale, homooligomeri de Cav3 de tip sălbatic ar fi dirijați către sarcolemă sau tubulii T prin calea reticul endoplasmatic – aparat Golgi, dar aceast trasport este afectat în cazul mutației Cav3P104L. Formarea oligomerilor între CAV3 WT și mutantul CAV3 afectează, de asemenea, transportul de Cav3 la suprafața celulei, care împreună cu celula care expune la suprafața membranei Cav3 mutant, devin ținte pentru degradarea pe calea ubiquitin-proteazom. În conformitate cu aceastea, analizele de mușchi de la pacienții cu LGMD1C dezvăluie o scădere substanțială (~ 95%) a abundenței Cav3, pierderi de caveole de pe suprafață celulară și o dezorganizare accentuată a sistemului de tubuli T. Aceste modificări miopatice contribuie la atrofierea și slăbiciunea mușchilor observate la acești pacienți și pot fi fenocopiate la șoarecii care sunt supraexpresori transgenici pentru mutantul Cav3P104L. Deși se știe puțin despre modul în care mutația Cav3P104L ar putea duce la apariția atrofiei musculare, s-a raportat că Cav3 inhibă semnalizarea miostatinei prin activarea receptorului de suprafață celulară de tip I. Miostatina este un binecunoscut regulator negativ al masei musculare, iar această represie inhibă activitatea unei căi care altfel ar stimula atrofia musculară. Această represie este probabil atenuată în mușchiul care exprimă mutantul Cav3P104L din cauza reducerii substanțiale a Cav3 care ar duce la o creștere concomitentă a semnalizării miostatinei. Recent s-a observat că expresia Cav3P104L în miotubulii C2C12 determină o activare redusă a Akt (un intermediar cheie de semnalizare a insulinei) și o diminuare a absorbției de glucoză și a sintezei glicogenului. Aceste observații indică posibilitatea ca tulburările în metabolism să contribuie, de asemenea, ca factori patologici ai LGMD1C. În timp ce expresia proteinelor Cav a fost asociată în mod tradițional cu caveole de pe suprafață celulară, acum există dovezi considerabile care susțin localizarea lor în diferite compartimente subcelulare. Cav1, de exemplu, a fost identifictă în aparatul Golgi, endosomi, picături lipidice citosolice, vezicule secretoare și în apropiere de mitocondriile în celulele epiteliale ale căilor respiratorii. Cav1 este, de asemenea, o componentă a membranelor mitocondriale asociate la nivelul ficatului de șoarece unde a fost implicată în reglarea metabolismului steroidic și a lipoproteinelor intracelulare. Mai recent, Volonte și colab. a demonstrat că Cav1 se găsește în mitocondrii în timpul stresului oxidativ, unde se asociază cu o protează mitocondrială, AFG3L2, o interacțiune care se consideră că face parte dintr-un mecanism de răspuns la stres, care poate ajuta la menținerea controlului calității mitocondriale. Știind că, caveolinele au și localizare mitocondrială și că pot oferi protecție împotriva stresului celular și a leziunilor este, de asemenea, susținută de studii pe cardiomiocite în care supraexpresia și localizarea crescută a Cav3 în mitocondrii sunt asociate cu toleranța crescută a calciului, funcția respiratorie îmbunătățită și suprimarea generării de specii reactive de oxigen. Dacă Cav3 se asociază în mod similar cu mitocondriile din mușchiul scheletului și dacă pierderea Cav3 afectează funcția mitocondrială nu este cunoscută în prezent. Cu toate acestea, având în vedere că disfuncția mitocondrială a fost legată de atrofia musculară în timpul inactivității musculare și de tulburări în biologia mitocondrială pot fi, de asemenea, o caracteristică care contribuie la dezvoltarea și progresia afecțiunilor musculare. În sprijinul acestei propuneri, există dovezi tot mai mari care leagă disfuncția mitocondrială cu o serie de distrofii musculare, incluzând distrofia Duchenne, atrofia musculară spinală și calpainopatia care induce distrofia musculară a centurilor de tip 2A (LGMD2A). Nu a fost încă documentat, dar studiile efectuate pe culturi de mioblaști și șoareci care exprimă mutația Cav3 P104L au raportat dereglări ale metabolismului glicemiei și a expresiei alterate a unui număr de proteine mitocondriale care reglează diverse aspecte ale structurii și funcției mitocondriale. Tocmai modul în care aceste modificări sunt legate de disfuncția Cav3 rămân neclare, dar se presupune că, Cav3 este strâns asociat cu mitocondriile din celulele musculare scheletice și că disfuncția sau pierderea sa, indusă de mutația Cav3 P104L, afectează forma și funcția mitocondrială cu consecințe importante pentru procesele cheie dependente de energie (de exemplu, sinteza proteinelor) care pot fi semnificative în patologia LGMD1C (Shah și colab., 2020)

Șoarecii transgenici care prezintă Cav3 P104L, suferă pierderi ale Cav3 în srcarolemă și dezvoltă o atrofie musculară severă, în timp ce șoarecii care supraexprimează o formă Cav3 de tip sălbatic (wtCav3) suferă un fenotip muscular de tip Duchenne, ceea ce sugerează că nivelurile adecvate de Cav3 sunt cruciale pentru menținerea homeostazei musculare. Ținând cont de aceste observații, am fost supraexprimate atât formă mutată cât și forma sălbatică wtCav3 în mioblastele C2C12 pentru a analiza efectele asupra procesului de diferențiere. Expresia transgenică a produs o creștere semnificativă a ambelor versiuni de CAV3. Cu toate acestea, în timp ce transfecția formei sălbatice a produs acumularea de proteine Cav3, Cav3P104L a declanșat o pierdere substanțială de Cav3 . Acest lucru este în concordanță cu alte observațiile descoperite, care indică faptul că proteinele Cav3 mutate au timpul de înjumătățire redus și agregândă cu formele sălbatice din aparatul Golgi, provocând în cele din urmă pierderea Cav3 din membrana plasmatică. Analiza microscopiei confocale a arătat că un anticorp pentru Cav3 a marcat regiunile perinucleare în mioblastele Cav3 P104L, care au fost colorate pozitiv cu anticorpi pentru GM130, un marker tipic pentru aparatul Golgi. Pe de altă parte, marcarea Cav3 a fost localizată predominant la nivelul membranei plasmatice în celulele care supraexprimă wtCav3. Ambele condiții au afectat diferențierea mioblastelor C2C12, dar în afară de acestea, prezența Cav3P104L a indus un fenotip mai sever. În special, formarea miotubulilor a fost aproape suprimată complet în prezența formei Cav3P104L, ceea ce sugerează că nivelul scăzut de Cav3, inhibă fuziunea mioblastului. Aceste date arată faptul că pierderea Cav3 la nivelul membranei plasmatice, este indusă de expresia Cav3 P104L, întârzie sever fuziunea mioblastului (Stoppani și colab., 2011).

3.2. Modificări genetice ale CAV3 care modifică creatinkinaza serică

La scurt timp după identificarea mutațiilor CAV3 care determină apariția LGMD-1C, a fost descoperită o nouă mutație sporadică CAV3 p.R26Q la doi copii de 4 și 6 ani. Spre deosebire de pacienții cu LGMD-1C, acești copii au avut doar o creștere a CK serice cu aproximativ 4 până la 8 mai mare decât normal. Analiza histologică a mușchilor a evidențiat doar o variabilitate ușoară a mărimii fibrelor la unul dintre copii. Nu au fost evidente alte caracteristici miopatice. Mutația CAV3 p.P28L a fost identificată la o mamă și fiul care aveau nivelul de CK serică de 4 până la 17 ori mai mare decât normal. Analiza histologică a mușchilor a arătat o variabilitate mare a fibrelor musculare, fibre hipertrofice, câțiva nuclei interni și o fibră necrotică. Ulterior a fost descris un caz de creștere a CK serice în cadrul unei familii spaniole datorate unei deficiențe de Cav-3 (Gazzerro și colab., 2010).

În anul 2016 a fost raportat un caz sporadic al unui pacient de sex feminin de e vârstă mijlocie cu miopatie distală în care mutația genei CAV3 a fost identică cu o altă mutație raportată anterior în cazurile de boală a spasmelor musculare. În RMN-ul T1 la nivelul membrelor inferioare a apărut un semnal anormal în mușchii distali și proximali. O biopsie musculară a evidențiat modificări distrofice moderate, iar colorarea imunohistochimică a arătat o expresie redusă a Cav3 plasmalemă. Analiza genetică a permis descoperirea unei mutații CAV3 c.136G> A (p.Ala46Thr) care părea a fi de novo, deoarece lipsea de la părinții pacientului. Acest studiu a sugerat că mutația CAV3 c.136G> A (p.Ala46Thr) poate provoca miopatie distală, precum și diferite fenotipuri la diferiți indivizi, sugerând că loci necunoscuți suplimentari trebuie să afecteze fenotipurile bolii (Zeng și colab., 2016). Pentru pacienții cu miopatie, slăbiciune musculară și atrofie, transfecția genelor CAV3 poate ajuta la îmbunătățirea metabolismului muscular și la creșterea numărului de celule musculare, restabilind astfel morfologia și funcția fibrelor musculare. Cav3 muscular poate activa căile de insulină și non-insulină în mod independent, ceea ce duce la o varietate de efecte fiziologice (Shang și colab., 2017).

3.3. Modificări genetice ale CAV3 care intervin în miopatia distală

Au post identificate cazuri de miopatie distală datorate unor mutații a genei CAV3. Interesant este că ambele cazuri analizate au fost asociate cu aceeași mutație a genei CAV3 și anume p.R26Q. O femeie japoneză în vârstă de 25 de ani a fost găsită cu atrofie musculară la mâini și picioare ce prezenta o scădere a funcției musculaturii distale, însă avea o forță musculară normală. Concentrația sa serică de creatinkinază a fost crescută de 25 de ori. Analiza histologică a bicepșilor brahiali a arătat o variație ușoară a mărimii fibrelor, un număr crescut de nuclee dispuse central și o predominanță a fibrelor de tip 1. Cav-3 a fost redusă semnificativ. Al doilea caz descris se refera la o familie spaniolă ai cărei membri au dezvoltat o miopatie distală autozomal-dominantă la nivelul musculaturii mâinii. Interesant este că cei mai tineri membri au prezentat semne de hiperexcitabilitate musculară și o creștere a creatinkinazei serice. Biopsiile musculare nu au evidențiat modificări distrofice, ci doar o ușoară variație a mărimii fibrelor și un număr crescut de nuclee. Expresia Cav-3 a fost mult redusă (Gazzerro și colab., 2010)

Recent o nouă mutație a genei CAV3 și anume CAV3 p.Val44Met (c.130G> A) a fost identificată la doi frați care prezintă o creștere persistentă a creatinkinazei serice, mialgiei și hipercolesterolemiei. Studiul de imunofluorescență cu anticorpi anticaveolină-3 pe biopsia musculară a probandului a confirmat o imunoreactivitate redusă a caveolinei-3 pe sarcolemă (Bruno și colab., 2020). În urma unui studiu au fost analizate biopsii musculare și a fost realizată o analiză genetică a genei CAV3 ce aparțineau a trei pacienți cu miopatie distală. Rezultatele au arătat o contracție rapidă a musculaturii și spasme musculare induse mecanic. Primul pacient a avut slăbiciune și atrofie a mușchilor mâinii. Al doilea pacient a manifestat inițial hiperexcitabilitate musculară, iar ulterior a dezvoltat slăbiciune și atrofie la nivelul musculaturii distale a membrelor inferioare. Al treilea pacient a prezentat forță și tonus muscular normale. Totuși toți au prezentat mialgie sau sensibilitate musculară. Biopsia musculară a evidențiat modificări genetice la doi pacienți și un model distrofic la alt pacient. Colorarea imunohistochimică a caveolinei-3 a evidențiat o deficiență uniformă în cazul primului pacient și o deficiență în mozaic în cazul celorlalți doi pacienți. Analiza geneală a evidențiat o mutație missense ,c.80G> A, p.R27Q, în gena CAV3 din cazul primului pacient. Nu au fost identificate mutații în cazurile 2 și 3 (Shan si colab., 2018).

Varianta 233C> T care introduce substituția de aminoacizi T78M (figura 16) a fost identificată la pacienții cu RMD, miopatie proximală, LQTS și sindromul morții subite la nou născuți. Un pacient homozigot pentru substituția T78M a prezentat atât cardiomiopatie dilatată, nivel crescut de creatinkinază și miotonia proximală. Analiza in vitro a demonstrat că expresia T78M provoacă modificări ale proprietăților canalului de sodiu Nav1.5, generând un impuls de sodiu întârziat și o reducere mare a densității curentului generat de canalul de potasiu Kir2.1. Chiar dacă aceste descoperiri indică un rol al T78M în generarea fenotipurilor patologice, analize recente au raportat totuși că această variantă se găsește și la populația generală (sănătoasă) cu o frecvență comparabilă cu cea găsită la pacienții cu LQTS. Prin urmare, nu este clar dacă și cum această variantă unică poate genera fenotipuri atât de diferite (Campostrini și colab., 2017)

Figura 16. Marcarea prin imunohistochimie a caveolinei-3 în cazul unor probe control și a probandului cu mutație T78M. La proband se observă reducerea semnificativă a caveolinei-3 la nivelul sarcolemei (după Ricci și colab., 2012).

3.4. Modificări genetice ale genei CAV3 implicate în diferite aspecte patologice ale mușchiului scheletic

În urma unui studiu au fost analizate probele de la 3 pacienți diferiți care prezentau diferite simptome de slăbiciune musculară. Primul pacient studiat a fost un băiat de origine caucaziană în vârstă de 13 ani care a prezentat o pierdere lentă, progresivă a forței musculare, dar nu a avut mialgii sau crampe musculare. Examenul clinic a evidențiat o slăbiciune generalizată a mușchilor, pronunțată la nivelul mușchilor centurilor. Au fost păstrate reflexe de tendon muscular; prezența pes cavus bilateral, o pseudohipertrofie ușoară a gambei și semnul lui Gower. Nu au existat fasciculații, atrofie musculară, anomalii senzoriale sau semne clinice ale RMD. Pacientul putea merge pe vârfuri, dar nu pe călcâie. Electromiografia mușchiului cvadriceps și vastus medialis au prezentat un model amiopatic. Nivelul creatinkinazei a fost crescut la 624 U/L. Analiza histopatologică a unei biopsii musculare a vastus lateralis a evidențiat o miopatie cronică marcată cu un spectru extins al calibrelor fibrelor musculare, inclusiv fibre musculare atrofice, rotunjite și hipertrofice. Au existat numeroase fibre musculare care nu aveau nucleul poziționat sub sarcolemă și puține fibre musculare necrotice. Microscopia electronică a evidențiat un număr redus de caveole; unele dintre structurile caveolare rămase au fost lărgite. Secvențializarea genei CAV3 a permis identificarea variantei heterozigote c.163G> A (G56S) în ADN-ul pacientului. Această variantă alelică a fost găsită și la mama pacientului și la o soră. Însă, examenele clinice ale acestor indivizi nu au evidențiat anomalii (Brauers și colab., 2017).

Cel de-al doilea pacient studiat a fost o femeie, în vârstă de 38 de ani, de origine africană, care a observat pentru prima dată slăbiciunea musculaturii proximale a centurilor la vârsta de 26 de ani. Simptomele au fost lent progresive cu unele recidive. Mama ei și bunicul matern au fost raportați să fi prezentat simptome similare, dar au murit cu ani înainte de inițierea acestui studiu; nu a fost disponibil ADN sau țesut pentru analiză. Fiica de 3 ani a pacientei în vârstă de 38 de ani, nu a prezentat niciun simptom sau semn de boală neuromusculară. Slăbiciunea simetrică a mușchilor proximali a fost constatată prin examen clinic. Reflexele tendonului profund au fost normale. RMN-ul musculaturii la nivelul centurilor a prezentat o atrofie ușoară. Nu s-au descoperit anomalii în sistemele senzoriale sau extrapiramidale. Electromiografia a evidențiat modificări miopatice. Creatinkinaza serică a fost ușor crescută până la 315 U/L. Biopsia mușchiului rectus femoris a evidențiat semne ale unei miopatii cronice moderate, cu o variabilitate crescută a calibrelor fibrelor musculare și un număr crescut de fibre musculare care nu aveau nucleul poziționat sub sarcolemă. Fibrele musculare parțial atrofice erau atât rotunjite cât și unghiulare. Microscopia electronică a evidențiat structuri tubulare vacuolare și tubulare legate de membrană, de mărime variabilă, mai ales în compartimentul subarcolemal și regiunea perinucleară, dar și între miofibrilele. În mare parte, aceste structuri corespund unor caveole și / sau componente extinse ale sistemului ER /aparat Golgi. Au fost asociate în mod repetat cu semne de autofagie modificată, cum ar fi corpuri citoplasmatici și / sau proliferații focale extinse ale membranelor. Secvențializarea genei CAV3 a permis identificarea variantei heterozigote c.163G> A (G56S) în ADN-ul pacientului; ambele alele CAV3 ale fiicei erau normale (Brauers și colab., 2017).

Ultimul pacient ale cărui probe au fost analizate a fost un bărbat în vârstă de 40 de ani, de origine portugheză. El a suferit de o slăbiciune generală ușoară, progresivă, începând cu vârsta de 38 de ani, combinată cu un nivel ridicat al creatinkinazei de până la 800 U/L. Examenul electromiografic nu a evidențiat un model caracteristic. Nu a existat istoric familial de boală neuromusculară; nu au fost disponibile rude pentru examen neurologic sau genetic. Analiza histopatologică a unei biopsii musculare de cvadriceps a evidențiat o miopatie cronică moderată, cu puține fibre musculare atrofice și cu mai multe fibre musculare hipertrofice și un număr relativ crescut de fibre musculare care nu aveau nucleul poziționat sub sarcolemă. Nu a existat o grupare tip a fibrelor. Ca și în cazurile descrise mai sus, microscopia electronică a evidențiat structuri vacuolare tubulare și perinucleare de până la 0,5 m. Secvențializarea genei CAV3 a permis identificarea variantei heterozigote c.163G> A (G56S) în ADN-ul pacientului (Brauers și colab., 2017).

Caveolina-3 este necesară pentru repararea mușchilor și dezvoltarea musculaturii scheletice. Rezultatele unui studiu au oferit informați cu privire la expresia caveolinei-3 în mușchii pacienților cu miastenia gravis. Caveolina-3 a fost exprimată anormal în membrana musculară de la pacienții cu miastenia gravis. 5/15 pacienți au prezentat o subexprimare a Cav3, în timp ce 10/15 pacienți au avut o supraexpresie a Cav3. Nivelul mARN-ul al caveolinei-3 și a altor proteine a fost mai mare în miastenia gravis decât în probele de control, ceea ce sugerează că deficiența parțială de caveolină-3 este detectată ocazional în mușchiul din miastenia gravis și că poate fi necesară supraexpresia caveolinei-3 după ce mușchii sunt afectați în miastenia gravis (Iwasa și colab., 2016).

3.5 Modificări ale caveolinei-3 care intervin în diferite căi de semnalizare

Mai multe studii au arătat că diverse molecule de suprafață a celulelor musculare sunt asociate cu caveolina-3. Stoppani și colab. au descoperit că șoarecii knock-aut pentru caveolina-3 au fenotipuri mai severe și se caracterizează prin atenuarea simultană a proteinei Akt și a căii de semnalizare p38, ducând astfel la apariția celulelor imature (Stoppani și colab., 2011). În plus, scăderea caveolinei-3 este legată de căile Smad2 și Erk1 / 2 induse de TGF-β, ceea ce confirmă că, caveolina-3 controlează calea de semnalizare a TGF-β în membrana plasmatică. Inhibitorii receptorului TGF-β de tip 1 (TβRI) kinzici permit, de asemenea, caveolinei-3 să devină un medicament împotriva atrofiei musculare într-o varietate de tratamente clinice (Yin și colab., 2016).

Majoritatea mutațiilor CAV3 provoacă o pierdere severă a proteinei Cav-3, așa cum a fost arătat atât prin tehnici de imunohistochimie, cât și prin analiza imunoblotului asupra biopsiilor musculare. Au existat două cazuri raportate de nivel crescut de CK serică datorate unor mutații a genei CAV3, p.G55S și p.T77M, cu expresie normală a Cav3 la biopsia musculară. Este posibil ca aceste mutații să determine apariția unei proteine stabilă, dar nefuncțională. Așa cum am mai menționat în capitolele anterioare, caveolele sunt esențiale în dezvoltarea și menținerea arhitecturii membranei musculaturii scheletice. Prin analiză de microscopiei electronică a probelor de mușchi de la pacienți cu LGMD1C s-a observat faptul că pierderea caveolelor a fost asociată cu formarea de vacuole mari poziționate sub sarcolemă și formarea unor structuri membranoase sub formă de „fagure” văzute în timpul proliferării anormale a sistemului de tubuli T. Mai mult decât atât, caracterizarea funcțională a unor mutații CAV3, p.P104L, p.ΔTFT 63–65 p.R26Q și p.T77K, determină formarea unor agregate cu masă moleculară mare care sunt reținute în aparatul Golgi și nu sunt direcționate corect către membrana plasmatică. În cazul în care aceste mutații sunt moștenite autozomal-dominant, pot provoca reținerea Cav3 de tip sălbatic în aparatul Golgi, astfel inducând proteoliza Cav3 de tip sălbatic prin ubiquitinarea și degradarea proteasomală. Mutantul p.ΔTFT 63-65 Cav-3 în miotuburile postmitotice reduce foarte mult legarea moleculelor de semnalizare Src la Cav3, diminuează direcționarea Src către plutele lipidice și determină acumularea perinucleară anormală de Src. Alături de aceste modificări ale localizării și direcționării Src, activarea Src este crescută în miotuburile care exprimă această mutație și se observă o incidență crescută a apoptozei în aceste celule în comparație cu miotuburile normale. În cele din urmă, este important de subliniat că pacienții cu LGMD-1C și modele experimentale ale mutațiilor p.P104L și p.ΔTFT 63-65 CAV3 manifestă, de asemenea, o localizare greșită a disferinei, o proteină de membrană musculară care este scăzută în miopatia Miyoshi și LGMD-2B. În condiții fiziologice, disferina interacționează cu Cav-3 la nivelul sarcolemei, în timp ce în cazul deficienței de Cav-3 disfrina se acumulează în citoplasmă sau prezintă o distribuție neregulată pe membrană. Într-adevăr, Cav-3 modulează nivelurile de disferinei la nivelul sarcolemei prin inhibarea endocitozei printr-o cale independentă de clatrină. Analiza biopsiilor musculare de la pacienții afectați de miopatia Myoshi indică faptul că deficiența de disferină duce la întreruperi severe ale structurii sarcolemei sugerând faptul că disferină are un rol important în structura celulelor musculare. Prin urmare, este posibil ca modificările localizării celulare a disferinei să contribuie la patogeneza tulburărilor asociate cu Cav-3 (Gazzerro și colab., 2010).

Este cunoscut faptul că proteina Cav-3 intervine în căile de semnalizare pentru insulină, iar acest lucru a dus la realizare unor studii pe șoareci CAV3 knockout. Rezultatele obținute au arătat că acești șoareci au dezvoltat rezistență la insulină iar căile de semnalizare a insulinei în mușchiul scheletului au fost afectate. Prin urmare, se produce o scădere a absorbției glucozei în mușchiul scheletic. În urma creșterii cantității de Cav3, absorbția de glucoză s-a dublat și conținutul total de glicogen a crescut treptat în celule, ceea ce sugerează că proteina Cav3 favorizează doar absorbția de glucoză în celulele musculare și nu afectează glicogenul total al celulelor.Tot în cazul șoarecilor knockout Cav3, a fost înregistrată o scădere a numărului de receptori pentru insulină din mușchiul scheletic pe parcursul a 15 minute de la stimularea cu insulină, fenomen ce duce la apariția rezistenței la insulină, scăderea absorbției de glucoză și scăderea sintezei glicogenului. Dacă caveolina-3 este injectată intramuscular se poate reface numărul de receptori pentru insulină în țesutul muscular. Supraexpresia Cav3 poate activa calea de semnalizare PI3K / Akt. Akt este un factor cheie care participă la mai multe căi de semnalizare implicate în supraviețuirea celulelor, creștere și metabolism și are de asemenea, legătură cu structurile downstream GLUT4, GSK3β și p70s6K. În urma unor studii s-a observat că în absența stimulării cu insulină ci doar în prezența crescută a Cav3, fosforilarea Akt crește cu aproximativ 47,74%, concentrația GLUT4 a crescut, dar GSK3β, care este implicat în sinteza glicogenului nu a fost afectat. În plus, a fost afectată și molecula de semnalizare p70s6K, care are rol în sinteza proteică. Se pare că expresia crescută a CAV3 activează Akt, care la rândul său activează p70s6K, crescând astfel sinteza proteinelor și creșterea celulelor (Shang și colab., 2017).

Au fost identificate două mutații diferite ale cadrului de citire al genei PTRF la cinci pacienți cu deficiență de Cav-3, dar fără mutații ale genei CAV3. Pacienții au prezentat o ușoară slăbiciune musculară, hipertrofie a mușchilor și PIMMS. Pierderea generalizată a țesutului adipos subcutanat / lipodistrofiei a fost observată în copilăriei. Nivelurile CK serice au crescut moderat la toți pacienții, însă niciunul dintre ei nu a prezentat o creștere marcată a nivelului de glucoză în condiții de repaus alimentar. Biopsiile musculare au arătat toate caracteristicile histologice specifice distrofiei musculare, iar imunoreactivitatea PTRF și Cav-3 a fost mult redusă în sarcolemă. Atunci când au fost transfectate într-un sistem heterolog, mutanții PTRF au pierdut capacitatea de a se asocia cu Cav-3 și au indus întreruperea structurilor caveolare, activând apoi efectori în aval, cum ar fi calea de semnalizare a miostatinei. Acest efect este similar cu cel observat în celulele musculare ale pacienților cu deficit primar de Cav-3 (Gazzerro și colab., 2011).

3.6. Modificări ale caveolinei-3 care afectează alte proteine specifice mușchiului scheletic

În populația japoneză au fost identificate două mutații ale genei PTRF. Au fost raportați 5 pacienții cu aceste mutații din care patru au avut aceeași mutație homozigotă c.696_697insC (p.K233fs) în exonul 2, iar al cincilea a prezentat o mutație heterozigotă c. 696_697insC și c.525delG (p.E176fs) din exonul 2. Mutația c.525delG înlocuiește ultimii 275 de aminoacizi cu o secvență de 98-aminoacizi, în timp ce mutația c.696_697insC înlocuiește ultimii 158 aminoacizi cu o secvență de 191-aminoacizi. Se pare ca aceste mutații ale genei PTRF au fost identificate la pacienții care prezentau deficiență de proteină Cav-3. Caveolina-3 a fost observat în mod clar la nivelul sarcolemei, în timp ce caveolina-1 și -2 erau prezente doar în vasele de sânge. În schimb, mușchii pacienților au prezentat imunoreactivitate scăzută la ambii anticorpi PTRF. Imunoreactivitatea caveolinei-3 a fost mult redusă în sarcolemă. Acest model de colorare al caveolinei-3 a fost similar cu cel observat la pacienții cu distrofie musculară cauzată de mutațiile CAV3. În mod similar, disferina a fost scăzută în sarcolemă și localizată în ale zone citoplasmatice decât cele normale. Același model este observat și în mușchii indivizilor cu mutații CAV3. Alți anticorpi legați de distrofia musculară, incluzând distrofina, sarcoglicani, distroglicani, emerina, merozina și colagenul au prezentat modele normale în urma colorării. S-a raportat anterior că caveolina-3 are un rol important în inhibarea semnalizării miostatinei prin inhibarea receptorului de tip I al miostatinei. La șoarecii transgenici Cav3 mutanți, pierderea caveolinei-3 provoacă atrofie musculară cu p-Smad2 crescut, iar această atrofie musculară poate fi redusă prin inhibarea miostatinei. În concordanță cu reducerea secundară a caveolinei-3, mușchii scheletici ai pacienților au arătat cantități crescute de p-Smad2 / 3. Totuși, în mod neașteptat, s-a observat hipertrofie musculară la acești pacienți. Calea Akt, atunci când este activată, determină sinteză proteică, și stimulează hipertrofia musculară. Această cale este de asemenea cunoscută pentru că are rol în reglarea transportului de glucoză și sinteza glicogenului în celulele musculare scheletice. Akt este activat de insulină, diverși factori de creștere, nutrienți și exerciții fizice, în timp ce este reglat negativ de miostatină și citokine. Creșterea fosforilării Akt în mușchiul pacienților poate explica, cel puțin parțial, hipertrofia musculară observată. Activarea căii Akt ar putea fi asociată cu complicațiile metabolice observate la cei cinci pacienți de origine japoneză (Hayashi și colab., 2009).

Analiza țesutului mușchiului scheletic de la șoareci transgenici care supraexprimă caveolina-3 a surprins o creștere dramatică a caveolelor de la nivelul sarcolemei, fibrele musculare scheletice hipertrofice, necrotice și regeneratoare cu nuclei centrali și inhibarea expresiei de ​​distrofină și β-distroglican. Supraexpresia caveolinei-3 perturbă procesarea normală sau stoechiometria complexului de distrofină, ceea ce duce la degradarea acestuia. În plus, acești șoareci prezintă niveluri crescute de creatinkinază serică, în concordanță cu mionecroza observată morfologic. Caveolina-3 este funcțională la acești șoareci transgenici, deoarece induce formarea de caveole. Important de menționat este faptul că în urma experimentelor realizate pe șoareci care supraexprimă caveolina-1, aceștia nu au prezentat fenotip de distrofie musculară. La șoarecele mdx, o mutație în cadrul genei distrofinei duce la exprimarea unei proteine incomplete care nu se leagă de sarcolemă. Rezultatul este o deficiență de distrofină asociată cu o deficiență secundară de proteine ​​asociate distrofinei (49). Cu toate acestea, șoarecii afectați nu prezintă necroză semnificativă în majoritatea mușchilor, deși noile fibre regeneratoare rețin nucleii central după ce au ajuns la maturitate (49). În special, șoarecii mdx nu prezintă proliferarea țesutului conjunctiv care este markerul tipic al mușchiului distrofic în DMD și în alte miopatii primitive care sunt cauzate de o deficiență a altor componente ale complexului distrofină-proteine. La șoarecii transgenici pentru caveolina-3, distrofina este foarte scăzută, în timp ce merosina este exprimată în mod normal. S-a observat o proliferare semnificativă a țesutului conjunctiv asociat cu degenerarea și regenerarea fibrelor musculare. Aceste observații duc la concluzia că șoarecii transgenici pentru caveolina-3 se comportă mai mult ca o distrofie asemănătoare cu cea Duchenne. Astfel, fenotipul de tip Duchenne al șoarecilor transgenici pentru caveolina-3 oferă o direcție importantă pentru înțelegerea patogenezei DMD la om (Galbiati și colab., 2000).

CAPITOL 4. TRATAMENT ȘI ABORDĂRI TERAPEUTICE

Studiile de patogeneză necesită modele animale deoarece sistemele in vitro nu pot stimula un răspuns complex precum răspunsul imun înnăscut și cel adaptativ . Studiile de patogeneză realizate pe modele animale sunt, de asemenea, de o importanță deosebită pentru știința aplicată, deoarece constituie un fundament esențial pentru dezvoltarea, evaluarea și producerea de medicamente și vaccinuri pentru tratarea și prevenirea bolilor. Asemănările anatomice și fiziologice remarcabile dintre oameni și animale, în special mamifere, au determinat cercetătorii să investigheze o gamă largă de mecanisme și să evalueze terapii noi pe modelele animale înainte de a aplica descoperirile lor la oameni. Oamenii și mamiferele sunt organisme foarte complexe în care organele îndeplinesc funcții fiziologice distincte (Barré-Sinoussi și Montagutelli, 2015).

4.1 Modele celulare

Datorită studiilor efectuate pe șoareci transgenici, pești zebră sau celule care supraexprimă Cav3 s-a observat că mutațiile P28L și R26Q ale genei CAV3 duc la dereglări ale unor căile de semnalizare distincte, defecte în repararea membranei și mecanoprotecția țesutului muscular. Miotuburile Cav3 P28L și Cav3 R26Q nu au un număr suficient de caveole funcționale la nivelul membranei plasmatice, ceea ce duce la o pierdere a tamponării tensiunii membranare și a integrității membranei sub tensiune mecanică. Lipsa de caveole funcționale în miotuburile mutante dereglează semnalizarea IL6 / STAT3 în stres mecanic, ceea ce duce la hiperactivizarea constitutivă a căii de semnalizare IL6 / STAT3 și reglarea mai multor gene musculare. În cele din urmă, expresia wt Cav3 în miotuburile mutante este suficientă pentru a restabili baza funcțională a caveolelor și pentru a regla cuplarea mecaosemnalizării caveolelor cu semnalizarea IL6 / STAT3. Aceste rezultate arată faptul că, caveolele sunt ca niște dispozitive de conectare care adaptează semnalizarea intracelulară la indicii mecanici din celulele musculare. Pierderea acestei funcții în mutațiile asociate cu Cav3 poate fi responsabilă pentru unele dintre simptomele clinice descrise la pacienții cu distrofii. Pentru a aborda impactul mutațiilor CAV3 în afecțiunile mușchilor umani, au fost analizate miotuburi de tip sălbatic, Cav3 P28L și Cav3 R26Q derivate din mioblaști imortalizați, care au fost izolași de la pacienții sănătoși sau cu mutații pentru Cav3. În miotuburile de tip sălbatic, au fost observat numeroase structuri invaginate corespunzătoare unor caveole, sub formă de cupă de 60–100 nm care erau legate de membrana plasmatică. În schimb, la membrana plasmatică a miotuburilor mutante au putut fi depistate mult mai puține caveole care erau grupate în aceiași zonă. De asemenea, la nivelul celulelor mutante s-au observat zone foarte mari lipsite de caveole sau prezența unor caveole foarte mari în comparație cu dimensiunile normale. Această scădere drastică a numărului de caveole este ascociată cu prezența Cav3, care este necesară pentru legarea caveolelor de membrana plasmatică. Prin tehnici de imunoblotare s-a observat o expresie redusă a Cav3 mutant ,(P28L: −50%; R26Q: −51%) comparativ cu tipul sălbatic. Caveolina-3 de tip sălbatic a fost asociată în principal cu membrana plasmatică a miotuburilor și parțial localizată în complexul Golgi. În schimb, Cav3 s-a acumulat puternic în complexul Golgi, în miotuburile Cav3 P28L și R26Q. Acest lucru indică faptul că reducerea puternică a numărului de caveole prezente la nivelul membranei plasmatice a miotuburilor mutante Cav3 este o consecință a localizării anormale a Cav3 mutant în complexul Golgi. Deoarece mioblastele exprimă Cav1, dar nu Cav3, miotuburile independent de Cav3. Prin urmare, a fost analizată expresia Cav1 în miotuburi și s-a constatat că Cav1 a fost într-adevăr exprimat la același nivel în toate cele trei linii celulare. Cav1 s-a colocalizat perfect cu Cav3 la nivelul membranei plasmatice și într-o măsură mai mică în aparatul Golgi din miotuburile de tip sălbatic, în timp ce a în miotuburile Cav3 P28L și R26Q fost prezent cu precădere în aparatul Golgi. Analiza biochimică GPMVs a confirmat că Cav3 nu a fost prezent la nivelul membranei plasmatice a miotuburilor Cav3 P28L și R26Q. În timp ce Cav1 a fost prezent și la membrana plasmatică a miotuburilor de tip sălbatic, a fost mult mai puțin abundent în miotuburile mutante. Prin urmare, aceste date indică faptul că Cav1 este probabil să formeze heterooligomeri cu Cav3 și că mutanții Cav3 P28L și R26Q au un caracter dominant asupra localizării Cav1. Având în vedere rolul cheie al caveolelor și caveolinei în semnalizarea intracelulară, a fost detreminat dacă pierderea caveolelor funcționale ar putea afecta unele dintre căile cheie de semnalizare în mușchi. Una dintre aceste căi este reprezentată de calea de semnalizare IL6 / STAT3. Glicoproteină gp130 împreună cu subunitatea receptorului IL6, formează receptorul IL6, a fost localizat în caveole dintr-o linie celulară a mielomului, sugerând o potențială reglare a căii de semnalizare IL6 de către caveolae. Legarea IL6 la receptorul IL6 este urmată în mod clasic de activarea receptorilor kinazici JAK1 și JAK2, care la rândul lor fosforilează transductorul de semnal și activator al transcripției 3 (STAT3), care este apoi translocat ca dimer către nucleu unde activează transcrierea genelor IL6. Prin urmare, s-a monitorizat nivelul de activare a STAT3, adică fosforilarea tirozinei (Tyr705) (pSTAT3) în miotuburile stimulate cu concentrații fiziologice de IL6. În stare de echilibru, în absența stimulării IL6, s-a putut detecta o mică fosforilare a tirozinei a STAT3, în miotuburile de tip sălbatic (Podar și colab., 2003). În schimb, s-a observat un nivel substanțial mai mare de pSTAT3 în miotuburile mutante Cav3 P28L și R26Q, chiar și în absența stimulării IL6. În timp ce stimularea IL6 a dus la creșterea nivelului de pSTAT3 în miotuburile de tip sălbatic, s-a observat încă niveluri mult mai mari de pSTAT3 în miotuburi mutante Cav3 P28L și R26Q. Expresia mult mai mare a STAT3 în miotuburile mutante Cav3 P28L nu este responsabilă pentru hiperactivarea STAT3, deoarece miotuburile mutante Cav3 R26Q, care exprimă niveluri identice de STAT3, asemenea miotuburilor normale, au arătat aceeași hiperactivare a STAT3. Spre deosebire de miotuburile Cav3 P28L și R26Q, STAT3 nu a fost activat în absența stimulării IL6. Acest lucru s-ar putea datora compensării pierderii Cav3 de către Cav1 la nivelul membranei plasmatice, deoarece este puțin probabil ca Cav1 să fie păstrat în aparatul Golgi în miotuburile. Aceste rezultate indică faptul că Cav3 este un regulator negativ al căii IL6 / STAT3 în miotuburi normale și că absența Cav3 în miotuburile de tip sălbatic, reproduce într-o oarecare măsură fenotipul observat la mutanții Cav3. Se sugerează că absența Cav3 și / sau caveolelor din membrana plasmatică a miotuburilor mutante este responsabilă pentru hiperactivarea constitutivă a căii de semnalizare IL6 / STAT3 (Dewulf și colab., 2019). STAT3 este un factor cheie de transcripție care controlează transcripția multor gene ale căror produse mediază efectele pleiotropice ale STAT3 în contexte fiziologice și patologice. Mecanosemnalizarea IL6 / STAT3 este afectată în miotuburile Cav3 mutante. Când miotuburile au fost supuse șocului hipoosmotic înainte de stimularea IL6, a fost observată o scădere dramatică a activării STAT3 (aproximativ 80%) în miotuburile de tip sălbatic, în timp ce în miotuburile mutante Cav3 P28L și R26Q. nu a fost observată nicio schimbare semnificativă. A fost aplicat un șoc hipoosmotic pe miotuburile lipsite de Cav3 și, în timp ce nu s-a observat niciun efect asupra stării de echilibru, s-a constatat că activarea STAT3 de către IL6 a fost ușor diminuată de stresul mecanic cu aproximativ 20% (Levy și Lee, 2002). Scăderea activării STAT3 a fost mai accentuată atunci când analiza a fost limitată la translocarea STAT3 în nucleele miotuburilor complet diferențiate. Mai important, nu s-au observat modificări în miotuburile lipsite de Cav3. Cu toate acestea, rezultate confirmă faptul că, calea de semnalizare IL6 / STAT3 este reglată negativ de stresul mecanic indus la nivelul miotuburilor și că această reglare este absentă în lipsa caveolelor funcționale, așa cum se observat în miotuburile mutante Cav3 P28L și R26Q și în miotuburile de tip sălbanic lipsite de Cav3 (Dewulf și colab., 2019).

În urma mai multor studii s-a stabilit că, caveolele au rol în mecanosemnalizare și mecanoprotecție. Atunci când celulele se confruntă cu stres mecanic puternic, cum ar fi umflarea celulelor sau întinderea celulelor, caveolele se aplatizează în membrana plasmatică pentru a oferi o suprafață suplimentară a membranei și previne creșterea tensiunii membranare și ruperea membranei (Lim și colab., 2017). Este absolut necesar prezența unor caveole funcționale pentru protecția miotuburilor împotriva stresului mecanic. Prin urmare, miotuburile mutante Cav3 P28L și R26Q au prezentat un defect major în mecanoprotecție, cu o lipsă a tamponării tensiunii membranare și sensibilitate crescută la ruperea membranei. În timp ce miotuburile mutante au arătat o scădere dramatică a numărului de caveole prezente la nivelul membranei plasmatice, expresia Cav3 de tip sălbatic a permis refacerea unui număr suficient de caveole pentru a restabili mecanoprotecția. Absența Cav3 în miotuburile normale a dus la apariția fenotipurile observate în miotuburile Cav3 P28L și R26Q, indicând că acumularea de Cav3 în aparatul Golgi este responsabilă pentru absența unui număr suficient de caveole funcționale. Știind faptul că în miotuburile Cav3 P28L și R26Q este exprimat un număr mic de caveole ce prezintă o morfologie anormală , s-a constatat că acest număr este prea mic pentru a asigura o mecanoprotecție normală (Dewulf și colab., 2019).

Studiile in vivo pe șoareci s-a urmărit trasplantul de mioblaști umani WIP GFP, P28L GFP sau P28L Cav3 GFP în mușchii anteriori ai tibiei deteriorați prin criogenare. În cazul celor trei tipuri de celule transplantate s-au observat fibre musculare mature care conțin un număr identic de celule umane cu nuclee pozitive pentru laminina A / C și care exprimă spectrină umană. Nici localizarea nucleelor în fibre nu a fost afectată. Aceste rezultate indică faptul că mioblastele mutate Cav3 P28L își păstrează potențialul de a se diferenția in vivo după transplant în mușchii șoarecilor. Rezultate similare au fost raportate pentru mai multe distrofii musculare, inclusiv Duchenne și distrofii musculare facoscapulohumerale care prezintă tulburări clinice mai severe decât distrofiile musculare legate de Cav3 (Mamchaoui și colab., 2011).

Experimentele in vivo au dus la investigarea reglării semnalizării celulelor musculare, deoarece mai multe defecte de semnalizare au fost descrise în distrofiile musculare, iar caveole au fost asociate de multe ori cu reglarea semnalizării intracelulare. Într-adevăr, Cav3 este implicat în reglarea căilor de semnalizare distincte, importante pentru funcția musculară, cum ar fi homeostazia calciului, calea insulinei / GLUT4 / Akt sau semnalizarea TrkA și EGFR26. Testele realizate s-au concentrat pe calea de semnalizare IL6 / STAT3, care s-a dovedit a juca un rol esențial în homeostazia țesutului muscular (Muñoz-Cánoves și colab.,2013). În plus, calea IL6 este strâns asociată la stresul mecanic din celulele musculare, deoarece IL6 este secretat mai ales în timpul exercițiului fizic. Datele recente arată o dereglare majoră a căii de semnalizare IL6 / STAT3 în miotuburile mutante Cav3 cu o hiperactivate a STAT3 constantă. În comparație cu miotuburile de tip sălbatic, nu a fost găsită nicio diferență semnificativă în expresia totală de IL6Rα și gp130, cele două subunități ale receptorului IL6.Interesant este faptul că un studiu a raportat că cavina-1 a fost necesară pentru localizarea corespunzătoare a SOCS3 în celulele endoteliale în repaus și că activarea STAT3 a fost crescută atunci când cavina-1 a fost absentă (Williams și colab., 2018). Însă în miotuburile mutante Cav3 P28L și Cav3 R26Q, sunt exprimate niveluri similare de cavină-1 și niveluri ridicate de SOCS3. Dereglarea căii de semnalizare IL6 / STAT3 a dus în translocarea nucleară a STAT3 și expresia crescută a MYH8, SOCS3, ACTC1 și ACTN2, gene care sunt cunoscute ca fiind reglate de STAT3 și care au fost asociate cu dezvoltarea și regenerarea mușchilor. În ceea ce privește defectele mecanoprotecției, dereglarea căii de semnalizare IL6 / STAT3 ar putea fi produsă prin epuizarea miotuburilor sănătoase, ceea ce indică faptul că absența caveolinei-3 și / sau a caveolelor au fost responsabile pentru hiperactivarea STAT3. Mai important, semnalizarea IL6 / STAT3 a fost reglată prin stres mecanic într-o manieră dependentă de Cav3 în miotuburile umane. Reglarea mecanosemnalizării IL6 / STAT3 prin caveole a fost pierdută în miotuburile mutante Cav3 sau când miotuburile sănătoase au fost lipsite de Cav3 (Dewulf și colab., 2019).

Prima mutație a CAV3 asociată cu tulburări musculare a fost descrisă acum 20 de ani și astăzi a fost extinsă la cinci tulburări genetice distincte: boala spasmelor musculare (RMD), miopatii distale (DM), nivel crescut de creatinkinază serică (HCK), distrofia musculară a centrilor de tip 1C ( LGMD-1C) și cardiomiopatie hipertrofică familială (HCM). Deși multe studii au abordat rolul acestor mutații în leziunile musculare, mecanismele de bază rămân slab caracterizate. Cav3 a fost implicată în mai multe aspecte ale fiziologiei musculare, inclusiv fuziunea mioblastului și organizarea tubulilor T. Mai mult decât atât, Cav3 interacționează cu complexul de distrofină și reglează traficul de disfernă, două proteine musculare importante a căror exprimare și localizare sunt deregulate în miopatii severe. Prin urmare, este probabil ca mecanismele prin care mutațiile Cav3 să fie responsabile pentru distrofiile musculare să fie multiple. Mai multe interacțiuni caveolină-proteine, incluzând molecule de semnalizare, cum ar fi eNOS sau PTEN, se pare că au loc la nivelul domeniului scaffold al caveolinei (CSD), o regiune de 20 de aminoacizi din Cav1 și Cav3. Cavtratina, o peptidă care imită domeniul scaffold al caveolinei a fost capabilă să reducă semnificativ hiperactivarea căii IL6 / STAT3 în miotuburile mutante Cav3 P28L. Reglarea mecanosemnalizării IL6 necesită interacțiunea cu Cav3-CSD în afara caveolelor. Aceste rezultate pot presupune că alte interacțiuni ale semnalizărilor celulare mediate de CSD ar putea fi mediate de mecanica caveolelor în celulele musculare. În acest context, este interesant faptul că miotuburile mutante Cav3 R26Q au avut o creștere semnificativă a producției de NO. În cele din urmă, studiile de proteomică efectuate pe șoarecii transgenici CAV3 p.P104L, unde Cav3 este de asemenea reținută în aparatul Golgi, au relevat schimbări semnificative în expresia proteinei, inclusiv în molecule de semnalizare (Coraspe și colab., 2018). Studiile efectuate au concluzionat că sub tensiune mecanică, caveolele reglează calea de semnalizare IL6 / STAT3. Datele confirmă că reținerea Cav3 P28L și R26Q în aparatul Golgi este responsabilă de absența caveolelor funcționale și normale din punct de vedere morfologic la nivelul membranei plasmatice, ceea ce la rândul său are ca rezultat o mecanoprotecție deficitară. Calea IL6 / STAT3 este strâns asociată cu reglarea masei musculare (Dewulf și colab., 2019).

Un studiu interesant a fost realizat pentru a stabilii dacă caveolina-3 inhibă activitatea trascripțională indusă de miostatină. A fost efectuată o analiză tarscripțională folosind o genă repoter pentru luciferează care raspunde la activitatea Smad. Modelul de studiu a fost reprezentat de celulele renale embrionare umane HEK293, care nu exprimă caveolina-3 endogenă, au fost cotransfectate cu reporterul luciferazei, cu un vector gol, vector cu caveolină-3 de tip sălbatic sau vector cu caveolină-3 mutantă. Stimularea cu miostatină recombinantă în celulele HEK293 transfectate cu vectorul gol a determinat o creștere semnificativă a activității luciferazei peste nivelul normal. În transformantul de tip caveolină-3, activitatea transcripțională indusă de miostatină a scăzut cu aproximativ 90%. În schimb, transformantul mutant de caveolină-3 a arătat o creștere de 1,5 ori a activității transcripționale induse de miostatină. Prin urmare, s-a demonstrat că, caveolina-3 inhibă activitatea transcripțională indusă de miostatină (Ohsawa și colab.,2006).

4.2 Modele animale

Caveolina-3 este specifică mușchiului scheletic și este exprimată în majoritatea tipurilor de țesuturi musculare (diafragmă, inimă, mușchi scheletici și netezi), iar expresia sa crește semnificativ în timpul diferențierii mioblastelor scheletice în cultură. Lipsa expresiei proteinei caveolină-3 are ca rezultat pierderea caveolelor în fibrele musculare scheletice, fără tulburări în expresiile caveolinei-1 și -2 sau formarea de caveole în țesuturile non-musculare. Constatarea faptului că densitatea caveolară în sarcolemă depinde de cantitatea de caveolină-3 este în continuare susținută de faptul că supraexpresia transgenică a caveolinei-3 provoacă o creștere a numărului de caveole. Acest lucru sugerează că, caveolina-3 este necesară pentru formarea caveolelor în celulele musculare scheletice in vivo. În general, nu au existat diferențe de creștere între șoarecii de tip sălbatic și mutant. Cu toate acestea, au putut fi observate unele leziuni patologice care au avut loc în principal în mușchiul soleus și diafragmă și care au fost caracterizate prin degenerare musculară. Aceste modificări miopatice ușoare sunt similare cu cele descrise la pacienții care suferă de distrofie musculară a centurilor de tip 1C (LGMD-1C) cauzată de o mutație în exonul 2 al genei CAV3 umane (3p25). Această proteină mutantă acționează ca un inhibitor dominant negativ, oligomerizarea cu tipul sălbatic de caveolină-3 și dirijarea acestor complexe la degradarea proteosomală. În consecință, mutațiile care cauzează LGMD-1C duc la o reducere a expresiei caveolinei-3 cu aproximativ 90-95%. Expresia caveolinei-3 este crescută în distrofia musculară Duchenne și în șoarecele mdx care are o deficiență de distrofină. Aceste observații sugerează că este necesară o exprimare corectă a caveolinei-3 pentru o funcție musculară normală. Similar cu caveolina-1, se crede că caveolina-3 funcționează ca o proteină scaffold care concentrează multe molecule de semnalizare, în special componente ale complexului de distrofină-glicoproteină (DGC). În ciuda expresiei normale sau localizării distrofinei, α-sarcoglicanului și β-distroglicanului în fibrele musculare scheletice de la șoareci cav-3 -/-, complexul de distrofină-glicoproteină nu mai este asociat cu DRM-urile în absența caveolinei-3. Studiile morfologice au sugerat că sistemul tubulilor T este format din lanțurile musculare caracteristice ale caveolelor. Mai târziu, caveolina-3 s-a dovedit a fi asociată tranzitoriu cu tubulii T în timpul diferențierii celulelor primare din cultură și la dezvoltarea fibrelor musculare scheletice de șoarece. Studiile asupra sistemului de tubuli T al fibrelelor musculare scheletice de la șoareci Cav3 -/- au arătat că două proteine marker ale tubulului T (receptor dihidropiridină-1α și receptorul de rianodină) sunt localizate difuz sau localizate greșit la șoarecii cu deficit de caveolină-3, rezultand un sistem de tubuli T imatur, dezorganizat, cu tubulii T dilatați și orientați longitudinal. Pentru a crea șoareci cu adevărat lipsiți de caveole, de plasmalema, precum și de sarcolema, au fost împerecheați șoareci cu deficit de caveolină-1 cu șoareci cu deficit de caveolină-3 pentru a genera șoareci dublu-knockout Cav-1 / Cav-3 (Cav-1 -/- / Cav-3 -/-).Așa cum era de așteptat, acești șoareci nu au reușit să formeze caveole în toate celulele. Similar cu animalele knockout, animalele dublu-knockout sunt viabile și fertile. Șoarecii Cav-1 -/- / Cav-3 -/- au prezentat defecte pulmonare și scheletice cu severitate comparabilă cu șoarecii knockout. Cu toate acestea, acești șoareci Cav-1 -/- / Cav-3 -/- dezvoltă cardiomiopatie mai severă (Le Lay și Kurzchalia, 2005).

Miostatina este un membru al superfamiliei TGF-β și joacă un rol esențial în reglarea negativă a volumului mușchiului scheletic. Supraexpresia miostatinei determină atrofie musculară severă, în timp ce întreruperea menținută a miostatinei crește semnificativ masa musculară la șoareci. Studiile au fost realizate pe, șoareci transgenici care supraexprimă prodomeniul miostatinei în mușchiul scheletic (MstnPro), un inhibitor al activării miostatinei. Asemenea altor membri ai superfamiliei TGF-β, miostatina este sintetizată ca o proteină precursoare și este supusă prelucrării proteolitice pentru a genera un prodomeniu N terminal și un dimer disulfid C terminal. În stare inactivă, prodomeniul se leagă de dimerul C terminal al miostatinei și inhibă puternic activitatea sa. Forma activă circulantă a miostatinei se leagă direct și activează receptorul activin IIB (ActRIIB), un receptor serin / treonin kinazic de tip II, ALK4 sau ALK5. Aceasta, la rândul său, activează receptorul serin / treonin kinazic de tip I la nivelul membranei plasmatice. Activarea unui complex heteromeric induce fosforilarea efectorilor intracelulari Mad 2 (Smad2) și Smad3. Smad2 și Smad3 fosforilați sunt translocați din citoplasmă în nucleu, unde reglează transcrierea genelor țintă specifice. Recent, s-a raportat că, caveolina-1 inhibă activarea receptorului de tip I pentru TGF-β1, care stopează creșterea în celulele non-musculare. Luând în considerare analogia moleculară și distribuția la nivelul țesuturilor, se pare că caveolina-3 inhibă semnalizarea miostatinei în celulele musculare într-o manieră similară caveolinei-1. În consecință, o creștere a activității miostatinei care rezultă din pierderea caveolinei-3 în mușchi poate participa la patogeneza atrofiei musculare scheletice la pacienții cu LGMD1C. Pentru a investiga modificările semnalizării miostatinei la pacienții cu LGMD1C s-au folosit modele de șoareci cu deficiență de caveolină-3. De asemenea, au fost utilizți șoareci transgenici CAV-3P104L / MSTNPro obținuți prin împerecherea șoarecilor transgenici CAV-3P104L cu șoareci transgenici MSTNPro care supraexprimă prodomeniul miostatinei pentru fi investigat efectul inhibării miostatinei in vivo asupra atrofiei musculare cu deficit de caveolină-3. Mai mult decât atât, a fost injectată o formă solubilă a receptorului de miostatină de tip II, care este un alt inhibitor al miostatinei, la șoarecii transgenici Cav3 pentru a investiga potențialul terapeutic al inhibării miostatinei pentru tratamentul viitor al pacienților cu LGMD1C (Ohsawa și colab.,2006).

Caveolina-3 se poate asocia cu receptorul de miostatină de tip I. Acest lucru a fost observat în urma colorării cu anticorpi specifici și coprecipitării caveolinei-3 cu receptorul de miostatină de tip I. Aceste rezultate indică faptul că, caveolina-3 se asociază cu receptorii de miostatină de tip I. Caveolina-3 reglează negativ activarea receptorului de miostatină de tip I. Asocierea caveolinei-3 de tip sălbatic cu receptorul de miostatină scade considerabil fosforilare ALK4 sau ALK5, în timp ce asocierea cu Cav-3 P104L a dus la creșterea fosforilării. Aceste rezultate indică faptul că, caveolina-3 inhibă activarea receptorului de miostatină de tip I, în timp ce mutantul Cav-3 P104L duce la activarea receptorului de miostatină de tip I in vitro. De asemenea, s-a urmărit dacă, caveolina-3 inhibă fosforilarea Smad2 indusă de miostatină. Rezultatele obținute în urma unor serii de experimente au indicat faptul că nivelul proteinei Smad2 a fost redus sub acțiunea caveolinie-3 de tip sălbatic, în timp ce sub acțiunea formei mutante Cav-3 P104L nivelul proteinei Smad2 a crescut. Astfel, fosforilarea Smad2 indusă de miostatină a fost inhibată de caveolina-3 de tip sălbatic și, în schimb, stimulată de forma mutantă, indicând că, caveolina-3 reglează semnalizarea miostatinei intracelulare la nivelul efectorului. Caveolin-3 joacă roluri importante în transducția semnalului celulelor musculare, acționând ca o proteină scaffold. Caveolina-3 colocalizează și coimunoprecipită cu receptorul de miostatină ALK4 sau ALK5 de tip I în celulele COS-7 transfectate și inhibă activarea ALK4 și ALK5 in vitro. Caveolinele se leagă și reglează mai multe molecule de semnalizare prin intermediul domeniului scaffold. Proteinele care leagă caveolina au în mod obișnuit domenii specifice de legare a caveolinei. Secvențele de aminoacizi ai ALK4 și ALK5 au domenii putative de legare a caveolinei-3 în regiunile citoplasmice. Astfel, inhibarea receptorului de miostatină de tip I de către caveolină-3 se poate datora unei interacțiuni directe între domeniul scaffold al caveolinei-3 și domeniile de legare la caveolină-3 în domeniul receptorilor de miostatină de tip I. Alternativ, caveolina-3 poate facilita degradarea prin endocitoză mediată de caveole a receptorilor de miostatină legați de ligand, deoarece degradarea receptorilor TGF-β1 legați de ligand este mediată de veziculele de endocitoză acoperite cu caveolina-1 și este accelerată de caveolina-1 (Di Guglielmo și colab., 2003). Mușchii scheletici de la șoarecii transgenici cu miostatină mutantă au arătat o scădere a proteinei p-Smad2 și inhibarea p21, un inhibitor al CDK dependent de miostatină. Miostatina induce fosforilarea Smad2 și crește transcripția p21, iar supraexpresia miostatinei crește expresia p21 în mușchiul scheletic de șoarece. Șoarecii dublu transgenici au arătat niveluri trascripționale ale p-Smad2 și p21 în mușchiul scheletic comparabil cu cele ale șoarecilor de tip sălbatic. Injecția intraperitoneală a receptorului de miostatină solubil de tip II ActRIIB-Fc în șoarecii transgenici cu Cav-3 mutant a ameliorat atrofia musculară în asociere cu scăderea p-Smad2 și P21. Aceste rezultate in vivo sugerează că supraactivarea semnalizării intracelulare a miostatinei rezultată din pierderea caveoline-3 care joacă un rol semnificativ în atrofia musculară scheletică la șoarecii model LGMD1C (Razani și colab., 2001).

Hiperfosforilarea Smad2 și p21 reglată în mușchiul scheletic cu deficiență de caveolină-3 rezultă și din activarea peste limitele normale ale semnalizării miostatinei, întrucât prodomeniul de miostatină sau receptorul de miostatină de tip II solubil pot suprima nu numai miostatina, dar și alți liganzi TGF-β, inclusiv factorul de creștere și diferențiere 11 (GDF11). De fapt, injectarea receptorului solubil de miostatină de tip II a crescut și mai mult masa musculară scheletică a șoarecilor knockout pentru miostatină. Astfel, liganzii TGF-β ar putea fi, de asemenea, implicați în patogeneza atrofiei musculare prin calea mediată de Smad2-p21 (Lee și colab., 2005).

Pentru a determina dacă caveolina-3 reglează semnalizarea miostatinei în mușchiul scheletic in vivo și dacă inhibarea miostatinei afectează atrofia musculară la șoarecii cu deficiența de caveolină-3, au fost generați șoareci dublu transgenici care prezintă atât deficiență de caveolină-3, cât și miostatină inhibată. Împerecherea heterozigotă a șoarecilor transgenici cu caveolină-3 mutantă cu șoareci transgenici cu miostatină mutantă a dat naștere la șoareci cu 4 genotipuri distincte: tip sălbatic, transgenici cu Cav3 mutant (CAV-3P104L), transgenici cu miostatină mutantă (MSTNPro) și dublu transgenici (CAV-3P104L / MSTNPro). Au fost examinate modificările progresive ale greutății corporale între 3 și 16 săptămâni de la naștere. Greutățile corporale pentru tipul sălbatic, șoarecii transgenici cu Cav-3 mutant și șoarecii transgenici cu miostatină mutantă au fost semnificativ diferite începând cu 6 săptămâni și până la vârsta de 16 săptămâni. Șoarecii transgenici cu Cav-3 mutant au fost semnificativ mai mici decât șoarecii de tip sălbatic, în timp ce șoarecii dublu transgenici au fost semnificativ mai mari decât șoarecii transgenici cu Cav-3 mutant și au dimensiuni similare cu șoarecii de tip sălbatic. Această tendință a fost găsită la ambele sexe. Examinarea mușchiului membrului posterioar a arătat că atrofia musculară la șoarecii transgenici cu Cav-3 mutant a fost inversată la șoarecii dublu transgenici. Aceste rezultate sugerează că inhibarea semnalizării miostatinei cu prodomeniul său inversează atrofia mușchilor scheletici la șoarecii transgenici cu Cav-3 mutant. Caveolina-3 de tip sălbatic inhibă evenimentele intracelulare în aval în semnalizarea miostatinei, și anume fosforilarea unui efector, Smad2 și transcrierea unei gene raportoare responsabile de Smad in vitro. Rezultatele indică faptul că caveolina-3 reglează negativ fosforilarea Smad2 și transcrierea ulterioară prin inhibarea activării receptorilor de miostatină de tip I. Interesant este că, spre deosebire de caveolina-3 de tip sălbatic, mutantul Cav-3 P104L stimulează autofosforilarea receptorului de tip I, fosforilarea ulterioară a Smad2 și activitatea transcripțională în aval. Atât hipoplazia cât și hipotrofia contribuie la atrofia mușchiului scheletic la șoarecii transgenici cu Cav-3 mutant. Studii anterioare la șoareci mdx, au demonstrat că numărul de miofibere din mușchii atrofici nu a fost scăzut în comparație cu mușchii scheletici de la șoarecii de control. Astfel, atât hipoplazia musculară, cât și hipotrofia sunt caracteristice deficienței de caveolină-3. În schimb, șoarecii trasgenici cu miostatină mutantă au arătat un efect opus asupra miofibrelor, adică atât hiperplazie, cât și hipertrofie. Aceste efecte opuse ale deficienței de caveolină-3 și inhibarea miostatinei în miofibre au sugerat că, caveolina-3 interacționează cu căile de semnalizare a miostatinei în celulele musculare in vivo (Ohsawa și colab.,2006).

Celulele epiteliale mamare derivate de la șoareci fără caveolină-1 au prezentat semnalizare TGF-β constitutivă activă, incluzând tranziția epitelială mezenchimală și hiperfosforilarea Smad2. Acest lucru indică faptul că caveolinele pot suprima semnalizarea superfamilie TGF-β mediată de factori de creștere. Spre exemplu, caveolina-1 suprimă semnalizarea mediată de TGF-β1 în celulele non-musculare în timp ce caveolina-3 suprimă activitatea miostatinei în celulele musculare. Datele actuale in vitro și in vivo sugerează un nou mecanism de reglare intracelulară a miostatinei de către caveolina-3 care împiedică atrofia musculară indusă de miostatină. Terapia prin inhibarea miostatinei poate fi considerată un tratament al distrofiei musculare. Administrarea intraperitoneală a unui anticorp monoclonal anti miostatină sau prodomeniului miostatinei îmbunătățește fenotipul șoarecilor mdx; cu toate acestea, mecanismul molecular precis prin care inhibarea miostatinei îmbunătățește fenotipul mușchiului scheletic care are deficiențe de distrofină nu este pe deplin înțeles. Mai mult decât atât, terapia prin inhibarea miostatinei nu îmbunătățește fenotipul, ci mai degrabă crește letalitatea postnatală a șoarecilor dy, un model de șoarece cu distrofiemusculară ce prezintă deficit de laminină α2 (Bogdanovich și colab.,2005). Prin urmare, terapia prin inhibarea miostatinei nu pare a fi eficientă pentru toate tipurile de distrofie musculară. Este necesar să se stabilească ce tipuri de terapii prin inhibarea miostatinei în distrofiile musculare ar putea fi aplicate. Inhibarea miostatinei în cazul distrofiilor musculare cauzate de caveolina-3 ar putea fi o terapie cu rezultate promițătoare. Într-adevăr, inhibarea miostatinei are cel mai probabil mai mult succes la pacienții cu LGMD1C decât la cei cu alte tipuri de distrofie musculară (Ohsawa și colab.,2006).

CONCLUZII

Caveolele au fost definite morfologic ca invaginării sferice sau în formă de balon ale membranei plasmatice, care au forme și dimensiunii regulate de aproximativ 70 nm.

În structura caveolelor se găsește caveolina cu cele 3 frome ale sale: caveolina-1, caveolina-2 în țesuturile non-scheletice și caveolina-3 specifică musculaturii scheletice.

Caveolinele alături de cavine sunt componente structurale și funcționale integrale ale caveolelor și sunt proteine responsabile de formarea caveolelor.

Conform studiilor din literatura de specialitate numeroase mutații ale caveolinei-3 sunt responsabile de apariția unor fenotipuri patologice care corespund unor bolii precum LGMD1C, miopatie distală, dar și de apariția unor anomalii morfologice identificate la nivelul țesutului muscular striat, a creșterii nivelului seric de creatin kinază.

Pe baza experimentelor realizate până în prezent de către diferite grupuri de cercetare s-a constatat că proteina caveolina-3 intervine în stabilitatea sarcolemei fibrelor musculare și modulează activitatea diferitelor căi de semnalizare.

În funcție de rol pe care îl are în aceste căi supraexprimarea sau absența ei ar putea duce la identificarea unui tratament. Spre exemplu, supraexpresia miostatinei determină atrofie musculară severă, în timp ce inhibarea miostatinei crește semnificativ masa musculară la șoareci. Caveolina-3 inhibă semnalizarea miostatinei în celulele musculare. În consecință, o creștere a activității miostatinei care rezultă din pierderea caveolinei-3 în mușchi poate participa la patogeneza atrofiei musculare scheletice la pacienții cu LGMD1C. Utilizarea unui inhibitor al miostatinei la șoarecii transgenici Cav3 pentru a investiga potențialul terapeutic al inhibării miostatinei poate reprezenta un tratament viitor al pacienților cu LGMD1C.

Studiile pe modelel experimentale in vivo și in vitro au arătat importanța caveolinei 3 pentru dezvoltarea și buna funcionare a mușchiul scheletic