Testarea unor potențiali factori de risc pentru formele [630120]

0
UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOLOGIE

UCRARE DE ICENȚ
Testarea unor potențiali factori de risc pentru formele
sporadice de neoplazii mamare

Coordonator tiințific:
Conf. Cimponeriu Gh. Dănuț

Absolvent: [anonimizat]

2017

1
CUPRINS

INTRODUCERE ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………… 3
1.NOȚIUNI GENERALE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………. 4
1.1. CANCERUL ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 4
1.2. INCIDENȚA CANCERULUI DE SÂN ………………………….. ………………………….. …. 6
1.3. ANATOMIA SÂNULUI ………………………….. ………………………….. ……………………….. 8
2.CLASIFICAREA CANCERULUI DE SÂN ………………………….. ………………………….. …….. 10
3.FACTORI DE RISC PENTRU TUMORILE MAMARE ………………………….. ……………….. 12
3.1. FACTORI DE RISC EXTRINSECI ………………………….. ………………………….. ………. 13
3.1.1. FUMATUL ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 13
3.1.2.CONSUMUL DE ALCOOL ………………………….. ………………………….. ……………….. 14
3.1.3.DIETA ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 15
3.1.4.ACTIVITATEA FIZICĂ ………………………….. ………………………….. ……………………. 15
3.2. FACTORI DE RISC INTRINSECI ………………………….. ………………………….. ……….. 15
3.2.1.VÂRSTA ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………… 16
3.2.2.ANTECEDENTE HE REDOCOLATERALE ………………………….. ……………………. 16
3.2.3.PARTICULARITĂȚI REPRODUCTIVE ………………………….. …………………………. 17
3.2.4.SEXUL SUBIECȚILOR ………………………….. ………………………….. …………………….. 17
4.COMPONENTA GENETICĂ ………………………….. ………………………….. ………………………… 17
5.PREVENȚIE,DIAGNOSTIC ȘI TRATAMENT ………………………….. ………………………….. . 25
5.1.DIAGNOSTIC ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 27
5.2.TRATAMENTUL CANCERULUI DE SÂN ………………………….. ………………………….. 30
6.MATERIALE ȘI METODE ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 32
6.1.DESIGNUL STUDIULUI …………………………………………………………………………………..32
6.2.EXTRACȚIA ADN ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 34
6.3.ELECTROFOREZĂ ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……. 36
6.3.1.ELECTROFOREZĂ ÎN GEL DE AGAROZĂ ………………………….. ………………….. 36
6.3.2.ELECTROFOREZĂ ÎN GEL D E POLIACRILAMIDĂ ………………………….. …….. 38
6.4. REACȚIA PCR ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………. 40
6.5.TESTUL ODD RATIO ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 45
7.REZULTATE ȘI DISCUȚII ………………………….. ………………………….. ………………………….. . 47

2
CONCLUZII …………………………………………………………………………………………………………..5 6
BIBLIOGRAFIE …………………………………………………………………………………………………….. 57

3
INTRODUCERE

De i a fost descris cu mai mult de 3500 de ani în urmă, cancerul de sân rămâne o
gravă problemă de sănătate publică , fiind una dintre cele mai întâlnite maladii în rândul
femeilor. Evoluția semnificativă în cunoa terea biologiei cancerului a condus la progrese
remarcabile în depistarea precoce, tratamentul i preve nirea cancerelor în ultimii ani.
Cancerul mamar este una dintre cele mai întâlnite maladii la femeile din țara noastră,
considerată ca fiind cea mai frecventă localizar e tumorală, cu o frecvență în continuă cre tere.
Scopul prezentei lucrări este de a testa diferiți factori de risc ce pot fi implicați în
apariția, favorizarea i dezvoltarea formelor sporadice de neoplazii mamare. Lucrarea își
propune să prezinte principa lele aspecte teoretice și practice în legătură cu dez voltarea
cancerului de sân. În acest sens este divizată în două capitole : o parte practică i o parte
teoretică. P arte teoretic ă abordează aspectele teoretice cu privire la distribuția maladiei,
clasificare, factori de risc, diagnostic i tratament. În partea a doua a lucrării , partea practică
sunt prezentate i descrise principalele metode folosite , precum i rezultatele obținute.
Obiectivele specifice c are stau la baza prezentei lucrări sunt acelea de a găsi asocieri
posibile între factori de risc i cancerul mamar.

4
PARTEA TEORETICĂ
1.NOȚIUNI GENERA E
1.1.CANCERUL
Cancerul este una dintre cele mai complexe i mai comune boli întâlnite în populația
umană , continuând sa fie o problemă de actualitate atât pentru medicină cât i pentru
cercetare.
Cancerul reprezintă o cauză majoră de morta litate i morbiditate, fiind pe locul doi
după afecț iunile cardiovasculare. Conform Organizației Mondiale a Săn ătății în anul 2015 ,
cancerul a fost responsabil de aproximativ 8,8 milioane de decese.
Originea cuvântului "cancer " îi este atribuită lui Hippocrate, considerat părintele
medicinei. Cancerul a fost înt âlnit dese ori de -a lungul istoriei, astfel există mai multe scrieri
în care este amintit, iar c ea mai veche descriere a cancerului (cuvântul cancer nu es te folosit) a
fost descoperită î n Egipt i datează încă din anii 3000 î.H.. Este numit Papirusul lui Edwin
Smith , fiind o copie a unui manual egiptean antic . În ac est manuscris sunt descri se opt cazuri
de tumori sau ulcere ale sânului care au fost îndepărtate prin cauterizare cu un instrument
numit forajul de foc. Este notat i faptul că în prezent nu există un tratament curativ pentru
toate tipurile de cancer (American Cancer Society , 2014) .
În ciuda avansării remarcabile în înțelegerea i managementul clinic i farmacologic al
cancerului de sân din ultimele decenii, aceasta rămâne o problemă majoră de săn ătate publică
la nivel mondial.
Înțelegerea i descriere a cancerului au evoluat în decursul timpului. În medicina antică
bolile maligne erau considerat e o manifestare a dezechilibru lui "umorilor naturale" (Aristotel ,
secolul al V -lea î.H. ) sau o acumulare a bilei negre (î n secolul al -II-lea d.H. "melancolia" în
sân). În prezent canceru l de sân este considerat o boală heterogenă c are are un grad ridicat de
diversitate intra i inter individual (Kiven E., 2017 ).
Noțiunea de cancer cuprinde o mare varietate de boli care sunt caracterizate prin
capacitatea de proliferare anormală a unor celule (J.D.Watson) . A adar, cancerul re prezintă o
cre tere necontrolată i anormală a unei celule, sau a unui grup de celule care se pot răspândi,
invadând țesuturile î nconjurătoare i pot metastaza. Se cu nosc numeroase tipuri de cancer ,
care se pot dezvolta din aproape toate tipurile de celule din organism .

5
Cele mai multe tipuri de celule canceroase formează inițial o masă de celule tumor ală,
care dobânde te un avantaj proliferativ i care este numită după partea corpului pe care o
afectează atunci când se declan ează.
Una dintre cele mai întâ lnite forme de cancer e ste cancerul de sân ; acesta este a doua
cauză de mortalitate î n rândul femeilor adulte . El apare atât la femei, cât i la bărbați, însă
incidența la bărbați este mult mai mică . Riscul ca o femeie să moară de canc er de sân este de
1 la 37, adică aproximativ 2,7% (cancer.org) .
Cancerul de sân reprezintă 10% dintre cancerele diagnosticate anual i 22% din tre
cazurile nou diagnosticate la femei în anul 2000 ; aceste date susțin impactul major al acestei
boli asupra femei lor (who.int) .
Cancerul de sân î i are originea î n celulele glandei mamare care încep să prolifereze
necontrolat i formează un grup de neoplazii. Cancerul p oate apărea î n orice țesut al sânului,
însă majoritatea vizează celul ele care căptu esc ductele i cele care participă la formarea
lobulilor (Fig. 1) .

Figura 1. Structura anatomică a sânului

6
1.2.INCIDENȚ A CANCERULUI DE SÂN
Cancerul de sân este boala neoplazică cea mai frecvent diagnosticată la femeile aflate
în jurul menopauzei i reprezintă o gravă problemă de sănătate publică, din cauza numărului
din ce în ce mai mare de persoane afectate.

DISTRIBUȚIA PE SEXE
Cancerul de sân este unul dintre cele mai comune tipuri de cancer identificate la
femeile din Europa i din Statele Unite ale Americii (reprez intă 29% dintre cancerele nou
descoperite ). Bărbații au un risc mai scăzut de a manifesta această boală (American Cancer
Society, 2016 ).
Se estimează că în anul 2017 vor fi raportate doar în Statele Unite aproximativ
252,710 cazuri noi de cancer de sân la femei i 2470 de cazuri de cancer de sân la bărbați la
fiecare 100,000 de indivizi (https://cancerstatisticscenter.cancer.org/#/cancer -site/Breast ).

DISTRIBUȚIA CANCERULUI DE SÂN PE GRUPE DE VÂRST

Figura 2. Distribuția cancerului de sân în lume -în funcție de vârstă

7
(Preluat după GLOBALCAN 2012 http://gco.iarc.fr/today/online -analysis -map)
Cancerul de sân este rar întâlnit la persoane le care au mai puțin de 20 ani. Riscul de a
dezvolta cancer de sân cre te odată cu vârsta. Aproximativ 1 -2% dintre pacien ți au mai puțin
de 30 de ani, însă p robabilitatea de a manifesta boala cre te după vârsta de 40 de ani. Pentru
femeile cu vârsta de 50 -54 de ani, incidența bolii este de 10 ori mai ridicată decât la femeile
care au 30-34 de ani ( Renee Sophie Cornelis , 1995 ).
Vârsta medie la momentul stabilirii diagnosticului de cancer de sân a fost de 61 de ani
în SUA (American Cancer Society, 2016) (Fig 2.) . De obicei cancerul de sân este detectat la o
vârstă mai înaintată ; aproximativ 60 din 10 0 de femei cu cancer de sân au o vârstă de peste 60
de ani atunci când sunt diagnostic ate cu această boală .

Grupa de
vârstă Numărul cazurilor care vor fi
diagnosticate în următor ul deceniu Numărul dece selor atribuite
cancerului de sân în următorul
deceniu
45 de ani 21 din 1000 3 din 1000
55 de ani 32 din 1000 5 din 1000
65 de ani 37 din 1000 9 din 1000
75 de ani 31 din 1000 12 din 1000

Tabel 1. Impactul cancerului de s ân la femei
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmedhealth/PMH0072606/ )

Incidența bolii cre te t reptat odată cu înaintarea î n vârstă ; astfel la vârsta de 30 ani
probabilitatea ca o persoană să fie diagnosticată cu cancer mamar este de 0,44%, la vârsta de
40 ani probabilitatea este de 1,47%, crescând pân ă la 3,56 % la vârst a de 50 ani ; valoarea
maximă se înregistrează la femeile care au mai mult de 70 de ani
(https://www.cancer. gov/types/breast/risk -fact-sheet ).

DISTRIBUȚIA BO II ÎN UNE E POPU AȚII SAU GRUPURI ETNICE
Incidența și rata deces elor atribuite cancerului de sân prezintă diferențe majore care
pot fi corelate cu etnia; aceste diferențe reflectă influența factorilor sociali, economici și
culturali. Incidența cancerului de sân a fost asociată i cu spațiul geografic ocupat de populația
studiată; a stfel valorile sunt cuprinse între 27 cazuri la 100.000 de persoane (în Asia de E st i

8
Orientul mijlociu ) până la 96 la 100.000 (în Europa de V est). Incidenț a bolii tinde să fie mai
mare î n țările dezvoltate comparativ cu cele în curs de dezvoltare sau cu cele subdezvoltate .
Ratele de incidență au tendința să crească în aproape toate ță rile. Rata de mortalitate
este mai sc ăzută în țările mai dezvoltate, cu venituri mari, comparativ cu țările mai puțin
dezvoltate, cu venituri mici. În general, o proporție semnificativ mai mare de femei cu cancer
de sâ n vor muri din cauza bolilor în regiunile mai puțin dezvoltate în care nu există programe
funcționale de screening (http://canceratlas.cancer.org/the -burden/breast -cancer/ ).
La persoanele cu vârsta cuprinsă î ntre 60 i 84 de ani , ratele de incidență a cancerului
de sân sunt mai crescute la femeile caucaziene comparativ cu cele negroide . Femeile negroide
au totu i o rată de incidență mai mare înainte de vârsta de 45 de ani i sunt mai predispuse la
deces cauzat de această boală în toate grupele de vârstă. Ratele de incidență i de deces în
cazul neoplaziei mamare sunt mai mici în râ ndul fem eilor din alte grupuri rasiale i etnice
decât în rândul femeilor caucaziene non-hispanice comparativ cu cele negroide (American
Cancer Society, 2016 ).
În Statele Unite , în anul 2012, ratele de deces au fost cu 42% mai mari la femei le
negroide spre deosebire de cele caucaziene . Pe parcursul anului 2003 pân ă în anul 20 12, rata
de deces în cazul cancer ului de sân a scăzut pentru femeile albe în toate cele 50 de state;
pentru femei le negroide declinul a avut loc la 27 din cele 30 de state care au avut suficient e
date pen tru a permite analiza tendințel or (De Santis CE. i colab., 2016).
Din 1989 până în 2006, mortali tatea provocată de cancerul mamar a scăzut cu peste
20% în 15 țări, dar a rămas stabilă sau chiar a crescut în Europa Centrală. Cifrele variază de la
o reducere de 45%, în Islanda , la o cre tere de 17% în România (E. A ltobelli i A. L attanzi,
2014 ).

1.3.ANATOMIA SÂNULUI
Regiunea mamară este localizată la nivelul toracelui, pe peretele antero -lateral al
acestuia, între coast ele III i V -VI. Sânii sunt a ezați simetric la acest nivel, ei fiind prezenți
atât la sexul feminin cât i la sexul masculin , dar cu o dezvoltare i atribuții complet diferite.
La bărbați glanda mamară este un organ rudimentar, de dimensiuni foarte reduse. La femei
forma i dimensiunea sânului variază în raport cu diferiți factori (ex. ciclul menstrua l, sarcină,
menopauz ă, vârstă, rasă, constituția fiziologică a femeii ). Glanda mamară cântăre te l a
femei le adult e 150-200 g, i poate ajunge la 500 g în timpul alăptării. La adolescente, sânii
sunt den i i predominant glandulari, însă pe ăasură ce înaintează în vârstă țesutul glandular

9
este u or u or înlocuit de țesutul adipos, a stfel că la menopauză țesutul gla ndular este înlocuit
de grăsime (Cîrstoiu Monica Mihaela , 2015 ).

Figura 3. Diferențe anatomice ale glandei mamare la bărbați și femei

Sânul este format din glanda mamară i părți le moi care o înconjoară. Pielea glandei
mamare prezintă central o arie circulară, pigmentată, denumită areola mamară (Fig. 3 ). În
centrul areolei mamare se găse te mamelonul (papila mamară) în care se deschid ductele
lactifere prin orificii mici denumite galactofori .
Glanda mamară este o glandă de tip tubulo -acinoasă, de culoare cenu ie -gălbuie,
compusă din 10 -20 de lobi, subdivizați la rândul lor prin conjunctive (sept conjunctiv) în
lobuli. Fiecare lob es te format dintr -o singură glandă tubulo -acinoasă care prezintă un sistem
canalicular foarte ramificat. Întregul sistem canalicular este asociat unui c anal colector, ductul
lactifer (Papilan Victor, 1993) .

10
Atât lobii cât i lobulii sunt interconectați prin ducte care conduc laptele spre
mamelon. La nivelul celulelor care căptu esc aceste ducte încep e, în cele mai multe cazuri,
procesul de malignizare .
Sistemul limfatic este parte a sistemului imunitar, fiind format dintr -o rețea de vase
limfatice i ganglioni limfatici dispu i în întreg organismul. Ganglionii limfatici au forma
unui bob de fasole i sunt localizați în diferite zone ale sistemul ui limfatic unde acționează
similar unor filtre care îndepărtează celule le modificate care s-au desprins din țesutul de
origine (http://www.nationalbreastcance r.org/breast -anatomy ).
Majoritatea ganglionilor limfatici ai sânului sunt localizați la nivelul axilei i sunt
numiți ganglioni axilari.
Atunci când la nivelul sânului are loc o proliferare a unui grup de celule anormale ,
acesta afectează echilibrul local i duce la alterarea țesuturilor înconjurătoare. Cre terea
excesivă a numărului de celule anormale poate duce la înlocuirea celulelor normale ale
sânului i la formarea unei tumori. Atunci c ând boala evoluează se pot forma metastaze
(http://www.nationalbreastcancer.org/growth -of-breast -cancer ).

2.CLASIFICAREA CANCERULUI DE SÂN
Clasificarea i stadializarea tumorilor mamare reprezintă un aspect esențial pentru
caracterizarea bolii i orientarea tratamentului . Stabilirea stadiului bolii , care oferă informații
despre mărime i extensia tumorii este un factor important pentru prognostic. Stadializarea
definește extensia unei tumori, creșterea și progresia acesteia la un moment dat i este utilă i
pentru compararea rezultatelor obținute în urma administrării diverselor tratamente.
Sistemul de stadializare cel mai utilizat pe scară largă în rândul clinicienilor este
sistemul TNM. Acest sistem se bazează pe caracteristicile tumorii primare (T), diseminarea la
nivelul ganglionilor limfatici re gionali (N), i a metastazelor la distanță (M). În cazul
tumorilor multiple simultane într -un sân, clasificarea va lua în considerare tumora cea mai
mare (Edge SB. i colab. , 2010).
Clasificarea TNM a cancerului de sân :
T=Tumora primară
– Tx= tum ora primară nu poate fi evaluată
– To=tumora primară nu poate fi evidențiată
– Tis=carcinoamele in situ (carcinom intraductal -DCIS; carcinom lobular -LCIS
i boala Paget)
– T1=tumoră cu diametrul de maxim 2 cm

11
– T1mi=tumoră cu diametrul de maxim 0,1 mm
– T1a=tumoră cu diametrul mai mare de 0,1 cm, dar nu mai mult de 0,5
– T1b=tumoră cu diametrul mai mare de 0,5 cm, dar nu mai mult de 1 cm
– T1c=tumoră cu diametrul mai mare de 1 cm, dar nu mai mult de 2 cm
– T2=tumoră cu diametrul cuprin s între 2 -5 cm
– T3=diame trul tumorii mai mare de 5 cm
– T4=tumoră de orice mărime, dar cu extensie la peretele toracic sau piele
– T4a=extensie la peretele toracic
– T4b=edemul pielii (inclusive "piele de portocală") sau ulcerația pielii sânului
sau noduli de permeație la nivelul aceluia i sân (Diaconu Corneliu i colab. , 1994)
– T4c=ambele T4a i T4b
– T4d=carcinom inflamator
– N=ganglionii limfatici regionali
– Nx=ganglio nii limfatici nu pot fi evaluați
– No=fără metastaze limfoganglionare
– N1=metastaze la nivelul ganglionilor limfatici axilari ipsilaterali mobili
– N2=metastaze în limfoganglionii axilari ipsilaterali fixați, sau metastaze în
limfoganglionii mamari interni
– N2a=metastaze în ganglionii limfatici axilari ipsilaterali aderenți unul de
celălalt sau de alte structuri
– N2b=metastaze numai în limfoganglionii mamari interni în absența
metastazelor limfoganglionare axilare
– N3=metastaze în limfoganglionii subclaviculari cu sau fără afectarea
limfoganglionilor axilari sau mamari interni
– N3a=m etastaze în ganglionii limfatici infraclaviculari
– N3b=metastaze în ganglionii limfatici mamari interni i în cei axilari
– N3c=metastaze în ganglionii limfatici supraclaviculari
– M=Metastaze la distanță
– Mx=prezența metastazelor la distanță nu poate fi evaluată
– Mo=nu există metastaze la distanță
– M1=Metastaze la distanța prezente (E. Senkus S. Kyriakides i colab. , 2015) .

Descrierile TNM pot fi grupate în 4 stadi i mai simple:

12
 stadiul I – tumoră mamară de mici dimensiuni , aproximativ 2 cm, fără a afecta
ganglionii axilari i nu prezintă metastază .
 stadiul II – tumora mamară este mai mare, cu dimensiuni c are nu depă esc 5
cm, cu/fără afectarea ganglionilor i nu prezintă metastază .
 stadiul III – tumorile pot avea orice dimensiune, ganglionii axilari sunt
volumino i sau fixați între ei i/sau de structurile adiacente, nu există
răspândire în corp .
 stadiul IV – boala este răspândită în corp (World Health Organization Regional
Office for the Eastern Mediterranean, 2006).
Există diferențe semnificative între stadii: doar 5% până la 12% dintre pacienții din
stadiul I / II mor în primii 10 ani după diagnosticare, comparativ cu peste 60% dintre pacienții
din stadiul III i peste 90% dintre pacienții din stadiul IV. Brevetarea ca ncerului mamar
furnizează, de asemenea, informații valoroase despre opțiunile de tratament adecvate pentr u
fiecare stadiu al cancerului (Singletary S. Eva MD i colab. , 2006) .
Categoriile terapeutice recunoscute pentru cancerul mamar pe baza sistemului TNM
sunt:
A.Cancere neinvazive respectiv carcinomul ductal in situ i carcinomul lobular in situ ,
sau stadiul 0
B.Cancere invazive operabile întâlnite în stadiul I, II i unele III A
C.Cancere invazive inoperabile respectiv stadiul III B, unele III A
D.Cancere recidi vate sau metastazate stadiul IV (Peltecu Gh., 2003) .

3.FACTORI DE RISC PENTRU TUMORILE MAMARE
Cancerul de sân este o boală mul tifactorială, care poate implica o interacțiune între
mediu, stilul de viață, hormoni i factori genetici. Cancerul de sân prezintă o evoluție stadială,
caracteristică tuturor proceselor maligne.
Organizația Mondială a Sănătății (OMS) define te un factor de risc ca fiind „orice
atribut, caracteristică , sau expunere a unui individ , care cre te probabilitatea ca acesta să
dezvolte o boală sau un prejudiciu“. Cu toate acestea, prezența unuia sau mai multor factori de
risc nu duce neapărat la dezvoltarea bolii. Prin urmare, o mulțime de femei pot prezenta unul
sau mai mulți factori de risc , dar niciodată nu dez voltă cancerul de sân. Pe de altă parte,
pacienții fără factori de risc pot dezvo lta, de asemenea, cancer de sân (Stubert Johannes,
Toralf Reimer i colab. , 2014).

13
Anumiți factori de risc sau protectivi, precum i predispoziția genetică pot modifica
probab ilitatea de apariție a cancerului de mamar . Se consideră că fiecare persoană are un risc
particular de a dezvolta boala în funcție de num ărul mare de factori de risc i de perioada
îndelungată î n care acționează (Beca Lavinia Mariana i colab. , 2016) .
Toți factorii de risc care inițiază procesul pot fi împărțiți în două grupuri. Primul grup
ar include factori intrinsec i, cum sunt vârsta, sexul, particularitățile reproductive, factorii
genetici. Ei constituie parametri independenți i nu suferă modificări si mple în cursul vieții
unui individ, ace ti factori nu pot fi modificați. Al doilea grup ar include factori extrinseci
condiționați de stilul de viață , dieta, exercițiile fizice, consumul de alcool etc. . Ace tia pot fi
modificați i se pot chiar dezvolta me tode de prevenție u or de implementat (Kamińska
Marzena i colab. , 2015) .
Factorii de risc pentru cancerul de sân nu sunt cunoscuți în totalitate, iar la majoritatea
persoanelor diagnosticate factorii de risc nu pot fi detectați. Factorii de risc pot fi modificabili ,
cum ar fi: fumatul, dieta, consumul de alcool; sau nemodificabili ca de exemplu etnia, sexul
etc.

3.1.FACTORI DE RISC EXTRINSECI
Factorii de risc extrinseci sunt foarte importanți deoarece pot cre te incidența apariției
cancerului de sân (fu matul, consumul de alcool), dar totodata pot juca i rolul de factori de
prevenție împotriva dezvoltării lui (dieta, activitatea fizică) .
3.1.1. FUMATUL
Fumatul reprezintă unul dintre cele mai comune vicii înt âlnite în populație, fiind una
dintre cele mai importante probleme de sănătate publică. Efectele nocive ale fumatului sunt
determinate de substanțele existente în tutun i în fumul de țigară.
Numeroasele tipuri de molecule din fumul de țigară pun tot atâtea probleme de
rezolvat în procesul de transformare canceroasă.
Dintre cei 4800 de compu i identificați în fumul de țigară aproximativ 100 sunt
cancerigeni sau mutageni. În perioada 1988 – 2008 au fost analizate 20691 de femei din
Wisconsin, New Hampshire i Ma ssachusetts cu vârste cuprinse î ntre 20 – 79 ani. Pacientele
care au fumat activ cu cel puțin un an înainte de a fi diagnosticate au anse cu 25% mai mari
de a deceda din cauza acestei boli, comparativ cu femeile care nu au fumat nicioda tă. Riscul
de boală a fost semnificativ mai mare în cazul femeilor care au continuat să fumeze i dup ă ce

14
au fost d iagnosticate, î n schimb riscul de a muri datorită cancerului de sân a fost mai mic cu
33% la pacie ntele care au renunțat la fumat ( Passarelli Michael N. i colab. , 2016)
Comparativ cu persoanele nefumătoare, femeile fumătoare au un risc crescut de
mortalitate datorită cancerului de sân i nu numai (HR) (HR = 1,30 95% CI: 1.16 -1.45; I2 =
52,4%) i (HR = 1,59 , 95% CI: 1.41 -1.78; I2 = 87,1%). În timp ce fo tii fumători tind să aibă
o cre tere moderată a mortalităț ii de toate cauzele (HR = 1,10, 95% CI: 1.07 -1.12), nu a
existat nici o asociere semnificativă între fostul fum ător i mortalitate a specifică pentru cancer
mamar (HR = 0,95, 95% CI: 0.9 0-1.02; I2 = 0,0%) ( Duan W, Li S i colab. , 2017 ).

3.1.2. CONSUMUL DE ALCOOL
Băuturile alcoolice au o compoziție chimică complexă, i de i etanolul nu este
cancerigen, compu ii care rezultă din metaboliza rea compu ilor care se găsesc în băuturile
alcoolice au potențial cancerigen. O parte din ace ti compu i poate contribui la transformarea
celulară.
Studii epidemiologice i experimentale indică o corelație pozitivă între consumul de
alcool i riscul de cancer de sân. În timp ce expunerea la alcool poa te promova carcinogeneză
sau debutul de cancer de sân, aceasta poate spori la fel de bine progresia i agresivitatea
tumorilor mamare existente. Progresele recente în acea stă linie de cercetare sugerează că
expunerea la alcool este asociată cu cancer de sâ n invaziv i promovează cre terea i
metastazarea tumorilor mamare. E xistă mai multe mecanisme potenț iale implicate î n
progresia bolii stimulate de alcool i agre sivitatea cancerului de sâ n (Wang Y , Xu M i colab. ,
2017 ).
Studiile epidemiologice au constat at în mod constant că în cazul persoanelor care
consumă alcool cre te riscul de apariție a cancerului mamar . Printre femei le care consumă
alcool în mod regulat, o cre tere a consumului de alcool poate cre te riscul de cancer de sân
potenț ial. În plus, consumul de alcool peste cantitatea recomandată este asociată cu o cre tere
lineară a incidenței neoplaziei mamare . Riscul depinde de cantitatea de alcool consumată;
riscul relativ de cancer mamar a fost demonstrat printr -o cre tere cu 7,1% (95% CI: 5.5 -8.7%;
p <0,00001) pentru fiecare diferență suplimentar ă de 10 g pe zi aport de alcool (Manas
Kotepui, 2016) .

15
3.1.3. DIETA
Nutriția joacă un rol important în menținerea stării de sănătate i în prevenirea boli lor.
O nutriție sănătoasă scade riscul de boli pro gresive, cum ar fi bolile cronice, în special
cancerul de sân.
Studiile în curs de desf ă urare la Institutul de cercetare a cancerului de sân reflectă
impactul proteinelor de ceai verde i soia privind reducerea riscul de cancer mamar
(Shrubsole i colab. , 2009 ). În timp ce o dietă bogată în grăsimi i carne ro ie, alimente sărate,
alimente prelucrate i lipsită de fructe i legume proaspete sunt printre cele care cresc cel mai
mult riscul de boală.
În perioada 2014 -2015 au fost analizate date dintr -un stud iu caz -control la care au
participat 450 de femei. S-a observat că a existat o diferență semnificativă între cele două
grupuri , în ceea ce prive te consumul de lapte i produse lactate (OR = 0.6, 95% CI = 0,4 –
0,9), carne (OR = 0.49, 95% CI = 0,3 -0,7), pâin e i cereale (OR = 0.4, 95% IC = 0,2 -0,8),
legume (OR = 0.5, 95% C I = 0,3 -0,9) (Valoare P <0,05) ( Zahra Ahmadnia i colab. , 2016) .
Există de asemenea unele dovezi care relevă că o dietă bogată în fructe, legume i în
fibre dietetice po ate avea un efect slab asupra reducerii riscului de cancer de sân ( Dieterich
Max, Johannes Stubert i colab. , 2014). Fondul Mondial de Cercetar e a Cancerului (FMCC )
recomandă astfel consumul de 400 -600 g de legume i fructe pe zi pentru a ajuta la prevenirea
cancerului de sân ( World Cancer Research Fund , 2007) .

3.1.4.ACTIVITATEA FIZIC
Exercițiile fizice i lipsa de obezitate î n adolescență au fost asociate cu un debut
semnificativ întârziat al cancerului de sân (King MC., 2003) .
Activitatea fizică este unu l dintre factorii implicați în menținerea stării de săn ătate care
aduc multiple avantaje. Efectele pozitive ale activității fizice includ o reducere a țesutului
adipos din organism, îmbunătățirea sis temului imunitar , precum i modificări în generarea de
radicali liberi. Există dovezi convingătoare că activitatea fizică este protectoare împotriva
cancerului de sân în postmenopauză (Dieterich Max i colab. , 2014 ).

3.2.FACTORI DE RISC INTRINSECI
Factorii de risc intrinseci sunt factori ce nu pot fi modificați, prezintă particularităț ile
individuale ale organismului uman precum vârsta, sexul etc..

16
3.2.1. VÂRSTA
Vârsta este cel mai important factor de risc asociat cu riscul dezvoltării tumorilor.
Frecvența bolii cre te odată cu vârsta, iar cele mai multe cazuri sunt întâlnite la femei aflate în
preajma menopauzei.
Peste 77% dintre femeile diagnosticate cu cancer mamar în fiecare an au peste 50 ani,
i aproape 50% au mai mult de 65 an i (who.com).
Vârsta la care apar tumorile are relevanță pentru prognostic. Recent, interesul
cercetătorilor a fost atras de cance rul de sân care debutează înainte de menopauză, la femeile
tinere. Dovez ile actuale sugerează că la femeile cu vâ rsta de <45 de ani, cancerul de sân are
un prognostic mai puțin favorabil, fii nd o principală cauză de deces ( Anastasiadi Z i colab.,
2017). Această bolă este însă rar întâlnită în perioada de pubertare, majoritatea tumorilor fiind
de natură benignă. În cazul adolesc entelor incidența cancerului de sân este sub 0,1 la 100000
de femei cu vârsta sub 20 de ani (Cîrstoiu Monica M , 2015 ).

3.2.2. ANTECEDENTELE HEREDOCOLATERALE
Un istoric familial de cancer de sân este asociat cu un risc crescut de boala. Riscul de
boală cre te cu numărul de rude afectate, dar i cu vârsta la care a fost diagnosticată; cu cât
persoana a fost mai tân ără la momentul diagnosticului cu atât mai mare este riscul.
Riscul de a manifesta boala al unei femeie tinere , cu an tecedente de cancer de sân în
cazul unui membru al familiei este semnificativ mai mare decât în cazul unei femei tinere, c u
o istorie de familie negativă ( Ping Li i colab. , 2016 ).
Cancerul de sân ereditar se caracterizează printr -un număr neobi nuit de mare de
membri ai fa miliei afectate de boa lă, sau asociate, de obicei, la o vârstă mai tânără decât cea
observată în populația generală. În cazul în care au existat mai multe cazuri de cancer de sân
în familii decât ar fi de a teptat , cu siguranță genele transmise între generații sunt suficiente
pentru a provoca sau, mai probabil, să contribuie la dezvoltarea cancerului mamar .
Dezvoltarea acestor forme particulare de cancer mamar pare a fi con diționată de o mutație
existentă î ntr-o singură genă. Aproximativ 5% din toate cazurile de cancer de sân sunt în mare
măsură atribuite mutații mo tenite î n gene specifice , inclusiv BRCA1, BRCA2 i TP53
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25340237 ).

17
3.2.3.PARTICU ARIT ȚI REPRODUCTIVE
Vârsta fragedă la care apare menarh a, nuliparitatea, vârsta t ârzie a primei sarcini dusă
la termen i faptul că niciodată nu au ală ptat, reprezintă factori de risc pentru cancerul de sân
în cazul femeilor (Huiyan Ma i colab. , 2017) .
Femeile care au o vârstă mică la prima na tere , au avut un risc mai mic de 7% de a
dezvolta cancer de sâ n dec ât cele care au o vârsta înaintată la prima na tere (Ping Li i colab. ,
2016 ).
Este bine stabilit în literatură faptul că:
 femeile care alăptează natural au un risc scă zut comparativ cu cele care nu o
fac, iar cu cât alăptarea este mai îndelungată riscul de boală este mai redus ;
 paritatea scăzută este un alt factor de risc, cu cât numărul de sarcini duse la
termen este mai mare, cu atât riscul apariției cancerului este mai mic;
 nuliparele au un risc mai mare de boală comparativ cu multiparele ; ansele de
apariție a c ancerului de sân cresc atunci câ nd menarha este precoce
(Balekouzou Augustin, Ping Yin i colab. 2017).

3.2.4.SEXU SUBIECȚI OR
Analizând rata de apariție a cancerului de sân în raport cu sexul, putem afirma cu
fermitate că neoplasmul este diagnosticat predominant la femei i doar sporadic la bărbați, în
care aceasta reprezintă mai puțin de 1% din toate cazurile de cancer de sâ n ( Gnerlich JL i
colab. , 2011). În ciuda apariției accidentale a acestui tip de neoplasm la bărbați, a naliza
datelor epidemiologice a arătat o cre tere evidentă în apariția cancerului de sân la bărbați de -a
lungul ultimelor trei decenii. Acest fenomen este greu de explicat , ceea ce este probabil un
rezultat al progresului civilizației (Kamińska Marzena i colab. , 2015) .
Este evident faptul că majoritatea datelor disponibile în literatura de specialitate fac
referire la formele de cancer mamar care apar la femei acest lucru fiind explicat de distribuția
diferită a bolii la cele două sexe. Riscul de boală în caz ul bărbaților este de 100 de ori mai
redus comparativ cu cel estima t în cazul femeilor (Giordano SH. , 2005 ).

4.COMPONENTA GENETIC
Cancerul este un proces multistadial care implică mai multe mutații. Există două tipuri
de cancer:
→ sporadic – bazat pe mutații somatice achiziționate în timpul vieții;
→ ereditar – bazat pe mutații mo tenite pe lini a germinală (de la ascendenți).

18
Cancerul de sân este o boală multifactorială. Apariția i dezvoltarea formelor comune
de cancer de sân sunt caractere determinate complex, care depind atât de factorii de risc
genetici, non genetici i cei protectivi dar i de interacțiunile dintre ace tia.
Cancerul de sân apărut la femei cu istoric familial al bolii , este cunoscut sub numele
de "cancer de sân familial". Uneori, termenul de cancer de sân "ereditar" este folosit pentru a
descrie cance rul mamar în familii cu o mo tenire aparent dominantă, sugerând că o gena cu
risc de penetrare a neoplaziei mamare segregă în acea familie. Cu toate acestea, nu toate astfel
de grupuri familiale pot fi explicate prin gene cunoscute care pot modifica semnif icativ riscul
apariției cancerului de sân. Un istoric familial al cancerului de sân este asociat cu un risc
crescut de îmbolnăvire, riscul crescând cu numărul de rude afectate i cu vârsta la care este
facută diagnostica rea – cu cât vârsta la momentul diagnosticului este mai mică, cu atât riscul
este mai mare (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11705483 ).
Cancerul de sân apărut la o femeie fără antecedente familiale este adesea denumit
"sporadic", dar acesta nu trebuie interpretat ca non -genetic , deoarece tot cancerul de sân are o
componentă poligenică a etiologiei sale. Mai mult, unele cazuri de cancer de sân sporadic
apar la femeile care poartă o mutație genetică a genei de susceptibilitate la cancer de sân, dar
nu au un istoric familial de cancer de mam ar (Petrucelli Nancie i colab. , 2016) .
Relația dintre apariția cancerului i existența modificărilor genetice este bine stabilită.
În cazul cancerului de sân, ca în majoritatea cazurilor de cancer, aceste modificări sunt în cea
mai mare parte somatice. În 4-10% din cazur ile de cancer mamar, o mutație î n linia germinală
va predispune la cancer de sân. Această mutație pare să ajute la apariția modificărilor genetice
somatice specifice, ceea ce va duce la fenotipul cancerului. Modificările genetice observate în
cursul transformării maligne sunt variate: deleții cromozomiale, translocații, amplificări i
rearanjări, duplicări sau pierderi cromozomiale întregi (a neuploidie) i mutații punctiforme .
Unele dintre aceste modificări duc la modificarea expresiei i / sau a structurii produsului
genei implicate în aceste modificări. Aceasta va avea ca rezultat:
– activarea protooncogenelor ;
– inactivarea genelor supresoare de cre tere tumorală a căror pierdere de funcț ie
favorizează tumorigeneză ;
– activarea sau inactivarea genelor ale căror produse interferează cu stabilitatea
genomului: genele care reglează procesele de mitoză i enzime de reparare a ADN.
Modificarea acestor gene va ajuta la apariția modificărilor genelor implicate mai direct (adică
oncogene i gene supresoare tumorale);

19
– modificările expresiei gene lor menționate mai sus pot fi cauzate de modificarea
secvenței acestor loci sau de alterarea genelor care pot "model a" cromatin a. Modelarea
cromatinei este cauzată de mecanisme epigenetice (F. Lerebours i R. Lidereau , 2002) .
Au fost identificate în diferite tipuri de afecțiuni maligne amplificări ale unor regiuni
cromozomale. Celulele tumorale sunt caracterizate prin instabilitate genomică, care
promovează apariția unor mutații, ca de exemplu m utații punctiforme, translocații.
Cele mai comune amplificări cromozomiale identificate în cazul cancerului de sân
sunt localizate 1p, 1p41 -44, 3q, 3p14, 4q, 6p, 6q, 8p11.2 -p12, 10p, 13q31, 14q, 15q, 16p,
17q22 -24, 19q i 20q13. Dintre toate aceste regiuni frecvența cea mai mare a amplificărilor
este la nivelul 1q i 8 q (Berca Lavinia M. i colab. , 2016).
Protooncogenele sunt gene celulare implicate în controlul ciclului celular, fiind înalt
conservate în seria vertebratelor. Protooncogenele pot suferi mutații (ex. inserții, translocații,
amplificare genică etc.), care determină exprimarea lor abera ntă i duc la transformarea lor în
oncogene. Exprimarea o ncogenel or promovează diviziunea celulară.
În urma studiilor făcute pe oareci au apărut primele dovezi ale activării oncogenelor
în țesuturile m amare, fiind identificate până î n prezent patru oncogene : H-ras, Neu, Myc i
wnt1 (Yu Q i colab. , 2011).
Pe baza datelor din literatur a de specialitate, cel mai frecvent la pacientele cu cancer
de sân au fost întâlnite amplificări la nivelul regiunilor cromozomale în care sunt localizate
genele: MYC (8q24), ERBB2 (17Q11.2), factorul de cre tere epidermal (EGFR) i nm23
(Berca Lavinia M. i colab. , 2016).
Datele recente suge rează numeroase oncogene descri se, însă numai c âteva au rol în
tumorigeneza sânului. Dintre acestea , cea mai studiată oncogenă în cancerul de sân r ămâne
ERBB2 ( v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2, 17q11.2 ),
cunoscută i ca HER2. În urmă cu 15 ani a fost observată una dintre primele alterări genetice
semnificative i anume amplificarea genei ERBB2 în ț esuturile tumorale ale sânului (Peltecu
Gh., 2003). Această genă codifică un membru al familiei receptorilor tirozin kinazici ai
factorului de cre tere epidermal (HER2) . Mecanismul primar prin care ERBB2 induce
carcinogeneza este supraexprimarea tipului sălbatic al receptorului HER2. Amplificarea i /
sau supraexprimarea acestei gene a fost raportată în numeroase tipuri de cancer, inclusiv în
tumorile mamare i ovariene, (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/2064 ) apărând la
aproximativ 30% dintre leziunile neoplazice sporadice ale sânului i fiind invers corelate cu
supraviețuirea pacientelor. Gena ERBB2 are o mare importanță clinică, fiind un indicator al
răspunsului la diverse tratamente cu agenți chimioterapeutici (Peltecu Gh., 2003) .

20
Conform OMIM, p rotooncogena MYC (v-myc avian myelocytoma tosis viral oncogene
hoomolog, 8q24.21 ) codifică un factor de legare a ADN care poate activa i reprima
transcripția. Prin acest mecanism, MYC reglează exprimarea a numeroase gene țintă care
controlează funcțiile celulare cheie, incluzând cre terea celulelor i progresia ciclului celular.
De asemenea, MYC are un rol critic în replicarea ADN. În cancerul mamar sunt în tâlnite
frecvent procese de amplificare i/sau supraexprimare , mod prin care este activată gena.
În cazul neoplaziilor mamare , amplific area MYC este observată în mod constant în
forme agresive de boală i se corelează cu prognosticul slab i metastazele îndepărtate .
Amplificarea MYC a fost raportat ă atât la cancerul mamar , cât i la multe alte tipuri de
cancer. În ciuda numeroaselor studi i, proporția cazurilor de cancer de sân raportată a fi
însoțită de amplificarea MYC variază foarte mult (de la 1 la 94% ) (Singhi Aatur D. i colab. ,
2012) .
EGFR ( v-erb-b avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog oncogene
ERBB, 7p11.2 ) i liganzii săi sunt molecule de semnalizare celulară implicate în diferite
funcții celulare, incluzând proliferarea celulară, diferențierea, supraviețuirea i dezvoltarea
țesuturilor (Xin Wang i colab., 2004) . Supraexpresia EGFR în cancerul de sân este asociată
cu tumori de mari dimensiuni , diferențierea slabă i rezultate clinice nefavorabile. Cu toate că
supraexpresia EGFR este observată la toate subtipurile cancerului mamar, EGFR este mai
frecvent supraexprimat în cancerul de sân triplu -negativ i cancerul mamar inflamator (Hiroko
i colab. , 2012) .
Genele supresor tumorale codifică pentru proteine implicate în diviziune, diferențiere
celulară, apoptoză, repararea A DN. Proliferarea celulară întâlnită în cele mai multe tipuri de
cancer este cauzată de pierderea funcției mai multor proteine care au rol de supresor de
cre tere tumorală.
Principalele gene candidat implicate în apariția cancerului de sân sunt genele BRCA1,
BRCA2, TP53.
Susceptibilitatea familială la cancerul de sân este responsab ilă de 25% din totalitatea
cazurilor de cancer mamar. BRCA1 și BRCA2 sunt gene cu penetranță mare care predispu n la
cancer de sân, identificate prin analiza markerilor ADN (analiza linkajului genetic ) și prin
clonare pozițională. Mutațiile BRCA1/2 explică aproximativ 20% din tre cazurile familiale de
cancer mamar. Atunci când oricare dintre aceste gene este mutantă sau modificată, astfel încât
produsul său proteic, fie nu este făcut sau nu funcționează corect, ADN deteriorat nu pot fi
reparat în mod corespun zător. Ca urmare, celulele sunt mai sus ceptibile de a dezvolta

21
modifică ri genetice suplimentare, care pot predispune la cancer
(https://www.cancer.gov/about -cancer/causes -prevention/genetics/brca -fact-sheet#q1 ).
Gena BRCA1 (Breast Cancer 1 gene, 17q12 -q21) codifică o fosfoproteină nucleară
care joacă un rol important în menținerea stabilității genomice i, de asemenea, acți onează ca
un supresor tumoral. Conform OMIM , genele BRCA1 i BRCA2 joacă un rol i mportant în
repararea ADN i în controlul punct elor de control al e ciclului celular . Cele mai multe
variante BRCA1 asociate cu patologia sunt de tip frameshifts i determină sinteza unei
protein e ne-funcționale sau chiar la blocarea sintez ei. În cazurile de cancer, la indivizii cu o
variantă patogenă BRCA1 î n linia germinală, alela normală este deletată sau inactivată, având
ca rezultat pierderea funcției somatice a BRCA1. În consecință se consideră că BRCA1 este o
genă supresoare de cre tere tumorală; pierderea funcției acestei gene este asociată cu
instabilitate genomica i cu un risc crescut de transformare malignă
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1247/ ).
Genele BRCA1 i BRCA2 permit transformarea malignă a celulelor în care nu există
proteine care să funcți oneze normal (Berca Lavinia M. i colab. , 2016 ).
Prima localizare a genei BRCA 1 a fost obținută de Hall (1990) prin analize de
linkage , cu un marker pentru locusul D17S74 la nivelul cromozomului 17q21. Studiile de
linkage au fost efectuate pe familii care aveau mai mulți indivizi afectați de boli maligne.
Confirmarea linkageului a fost dovedită de Narod (1991) care a g ăsit o asociere cu cancerul
ovarian. În 1993 Easton estimează că penetranța genei BRCA1 este de 59% la femeile în
vârstă de 50 d e ani i ajunge până la 83% la persoanele care au mai mult de 70 ani
(https://www.omim.org/entry/113705?search=BRCA1&highlight=brca1 ).
După localizarea genei de risc BRCA1 au început căutările altor gene asemănătoare.
În 1994, s-a descoperit o nouă regiune de susceptibilitate localizată la intervalul 13q12 -13,
care a fost denumită BRCA2. La fel ca BRCA1 i gena BRCA2 conferă un risc crescut de
apariție a cancerului mamar la o vârstă frage dă la femei (Renee Cornelis , 1995 ).
Genele BRCA1 i BRCA2 prezintă o serie de asemănări atât la nivel structural, cât i
funcțional, însă au i numeroase deosebiri în ceea ce prive te asocierea cu patologia. Ambele
gene au dimensiuni mari i codifică pentru proteine care sunt implicate în reparar ea leziunilor
ADN i în controlul progresiei ciclului celular.
Mutațiile la nivelul celor două gene nu sunt foarte întâlnite în cazul formelor sporadice
de boală, fiind prezente la maxim 5 % dintre pacienți. În consecință , recom andarea este ca
testarea mutațiilor din genele BRCA1 i BRCA2 să fie efectu ată doar la persoanele din

22
grupele c are a u risc crescut de boală; în prezent nu se recomandă efectuarea acestor teste la
pacientele care prezintă forme sporadice de cancer de sân (Berca Lavinia M. i colab. , 2016 ).
Frecvența populațional ă estimată a mutațiilor genelor BRCA1/2 este de 1/800 –
1/1000 pentru fiecare genă. În total, aceasta explică 15 -20% din riscul familial crescut de
apariție a cancerului de s ân. Prevalența mutațiilor BRCA1 sau BRCA2 din celulele liniei
germinale variază considerabil de la un grup etnic la altul și în regiuni geografice diferite .
În medi e, o femeie din Statele Unite prezintă un risc de a dezvolta ca ncer mamar în
timpul vieții de 12% ; femeile care au o mutație în genele BRCA1 sau BRCA2 (sau ambele)
pot avea un risc crescut de până la 80% de a dezvolta cancer de sân în timpul vieții (Tabel 2) .
Cancerul mamar asociat cu o genă anormală BRCA1 sau BRCA2 tinde să se dezvolte la femei
mai tinere i să apară mai des în ambii sâ ni decât în cazurile de cancer la femei care nu
prezintă aceste gene anormale. Femeile cu muta ții în BRCA1 sau BRCA2 au, de asemenea,
un risc crescut de a dezvolta cancere ovariene, de colon i pancreatice, precum i de melanom.
Bărbații care au o genă anormală BRCA2 au un risc mai mare d e cancer de sân
comparativ cu bă rbații care nu prezintă gena – aproximativ 8% î n momentu l în care au
împlinit 80 de ani, fiind de aproximativ 80 de ori mai mare decât media
(http://www.breastcancer .org/risk/factors/gene tics ).

Tipul de cancer Riscul la nivelul
populației Riscul de malignizare
BRCA1 BRCA2
Cancer de sân la femei 12% 46%-87% 38%-84%
Cancer de sân la
bărbați 0,1% 1,2% până la 8,9%
Al doilea cancer primar 2% în decurs de 5 ani După 70 ani
83% 62%

Tabel 2. Riscul de malignitate la persoanele cu o variantă BRCA1 sau BRCA2 -patogenă
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1247/ )

Comparat iv cu cancerul de sân sporadic, prognosticul maladiei cu BRCA pozit iv a fost
raportat ca fiind mult mai rău (Huzarski T . i colab. , 2013 ).
Cancerul mamar i ovarian sunt componente ale mai multor sindroame dominant
autoz omale de cancer. Sindroamele cel mai puternic asociate cu ambele tipuri de cancer sunt
sindroamele asociate cu variantele patogene BRCA1 sau BRCA2. Cancerul de sân este, de

23
asemenea, o caracteristică comună a sindromului Li -Fraumeni datorită variantelor pa togene
TP53 i a sindromului Cowden dator ită variantelor patogenice PTEN ( Lindor NM i colab. ,
2008 ).

Sindrom Abreviere Gena Contribuția
estimativă la
cancerul de sân Contribuția estimativă
la cancerul de sân
ereditar
Cancer de sân i
ovarian ereditar HBOC BRCA1
BRCA2 5-10% 35-40%
Li-Fraumeni LFS TP53 <1% <1%
Boala Cowden CS PTEN <1% <1%

Tabel 3. Sindroame de cancer ereditar care includ cancerul de sân ( Preluat după Petecu
Gh., 2003)

TP53 (Tumor Protein p53, 17p13.1 ) codifică pentru proteina p53, care are cel mai
important rol în menținerea integrității genomului. Atunci câ nd AD N este alterat , TP53
blochează ciclul celular î n G1 până la repararea leziunilor. Dacă acest proces nu funcționează
corect, proteina contribuie la inițierea programului care induce apoptoza.
Analiz a celule lor hibride om -rozătoare, de către McBride i colab. (1985, 1986) au
permis cartografi erea genei TP53 în cromozomul 17, iar în 1986 Isobe i colab. au mapat gena
TP53 în 17p13 (omim.org ).
Gena supresor tum oral TP53 , codifică un fac tor de transcripție implicat în mai multe
niveluri în cadrul ciclul celul ar, în procesul de reparare, având un rol important în stabilitatea
genomului i apoptoză. Această genă este frecvent întâlnită în cancerele umane , manifestând
cel mai larg spectru de alterări mutaționale . Mutațiile din linia germinală sunt responsabile
pentru sindromul de susceptibilitate ne oplazică Li-Fraumeni , care este asociat cu cancerul de
sân (1% din toate cazurile de cancer mamar).
Mutațiile TP53 se găsesc în 15 -35% din ca zurile de cancer mamar sporadic, cu o
frecvență mai mare în cancerele medulare, în tumori agresive sau avansate . Mutațiile TP53 în
cazurile de cancer mamar sunt "spontane", adică nu sunt induse de un agent carcinogen
identifi cat. Regiunea genei din 17p13 este eliminată în aproximativ 50% din tumori. Dar
corelația dintre LOH i prezența unei mutații nu este sistematică, sugerând fie inactivarea unei

24
alte gene pe aceea i porțiune a cromozomului, fie un efect negativ dominant . LOH l a 17p13 ar
putea preceda apariția mutației (F. Lerebours i R. Lidereau , 2002) .
În cazul persoanelor purtătoare de mutații ale genelor BRCA1 i BRCA2 în celulele
liniei germinale, cre te i ansa apariției de mutații ale genei P53 . Un aspect important al
mutații lor genei P53 este faptul că pot fi depistate în sângele periferic în cazul unor pacienți
cu tumori primare, ajutând la di agnosticarea moleculară precoce (Peltecu Gh., 2003) .
În cazul cancerului de sân întâlnit la bărbați sindromul Kilnefelter reprezintă cel mai
important factor de risc pentru cancerul mamar. Aceasta este o afecțiune genetică rară care
determină atrofie testiculară, ginecomastie i dezechilibre hormonale. Bărbații care prezintă
sindrom Kilnefelter au o predispoziție de a manifes ta boala de 20 -60 de ori mai frecv ent decât
cei cu genotip normal (Peltecu Gh., 2003) .
Transcripția genetică poate fi activată sau inhibată printr -o modificare reversibilă a
genei. Această modificare este denumită modificare epigenetică. Acest studiu al ep igeneticii
în cancer examinează mecanismele i consecințele modificărilor epigenetice în celulele
canceroase i se încheie cu implicațiile acestor modificări pentru diagnosticul, prognos ticul i
tratamentul cancerului (Esteller M ., 2008 ).
Atât modificările genetice cât i cele epigenetice contribuie la carcinogeneza sânului i
tumorile invazive acumulează totodată aberații genetice dar i epigenetice pe măsură ce boala
progresează ( Hanahan D i Weinberg RA , 2011 ).
Cele mai recente cercetăr i privind etiologia cancerului au identificat un rol -cheie jucat
de epigenetică . Factorii epigenetici explică în principal apariția cazurilor sporadice de cancer
de sân. În mod specific, au fost demonstrate modificări ADN aberante (alterarea modelului de
metilare al ADN) i modificări ale histonei care au eliminat gene supresoare tumorale sau au
promovat oncogene contribui nd astfel la fazele inițiale ale transformării maligne . Mai mult de
100 de gene au fost raportate ca fiind hipe rmetilate în tumorile mamare primare sau în liniile
celulare de cancer mamar . Multe dintre aceste gene metilate aberant joacă roluri importante în
supresia tumorală, regla rea ciclului celular, apoptoză i meta stazare ( Esteller M. , 2008 ).
Modificările epig enetice, cum ar fi modificările în metilarea ADN, sunt evenimentele timpurii
bine stabilite în cancerul de sân care servesc la perturbarea expresiei genei normale i la
cre terea instabilității cromozomiale (van Hoesel AQ i colab. 2013 ).
Inactivarea epigenetică a genelor supresoare tumorale, cu m ar fi BRCA1, au fost
considerate ca evenimente importante în canc erul de sân sporadic. Rapoartele anterioare au
arătat că unul dintre mecanismele cheie ale pierderi i expresiei BRCA1 a fost silențierea
epigenetică.

25
În plus față de modificările genetice, astfel de mutații în oncogene i gene supresoare
tumorale, alternările epigenetice, cum ar fi metilarea promotorului i modificarea histonei, ar
putea conduce, de asemenea, la inițierea, promovarea i met astazare a cancerului de sân
(Yanyuan Wu i colab., 2016 ).
Hipermetilarea promotorului insulelor CpG a fost asociată cu pro gresia cancerului de
sân. Studiile recent e au evaluat nivelele de metilare ale genelor supresoare tumorale, RARβ2
i RASSF1A (Ras association domain family member1) , MINT17 i MINT13 în timpul
etapelor -cheie ale de zvoltării cancerului de sân. S-a identificat o cre tere semnificativă a
nivelurilor de exprimare a le acestor gene în timpu l dezvoltării cancerului mamar (van Hoesel
AQ i colab. , 2013 ). Insula CpG este localizată in regiunea 5' a genei BRCA1 i este metilată
regional în toate țesuturile analizate, cu excepția gameților unde aceasta se găse te în formă
nemetilată. În general nivelul de metilare al insulei CpG este asociat mecanismelor pr in care
se asigură reglarea ex presiei genei BRCA (Berca Lavinia M. i colab. , 2016) .
Epigenetica poate juca î n continuare un rol important în terapia cancerului, pentru
cercetare i pentru îmbunătățirea rezultatelor tratamentului cancerului mamar (Yanyuan,
2016) . Modificarea gradului de metilare al ADN poate fi considerat un potențial biomarker
pentru detectarea precoce a persoanelor predispuse la cancer, îndeosebi la identificarea
formelor sporadice de cancer de sân (Naiara G Bediaga i colab. , 2010 ).

5.PREVENȚIE,DIAGNOSTIC ȘI TRATAMENT

OMS promovează controlul cancerului de sân în contextul unor programe naționale ,
cuprinzătoare de control al cancerului. Controlul cuprinzător al cancerului implică prevenirea,
depistarea precoce, diagnosticarea i tratam entul.
Pentru a preveni apariția unor cancere noi, oamenii de tiință examinează factorii de
risc i factorii de protecție. Evitarea factorilor de risc i cre terea factorilor de protecție pot
reduce riscul de a manifesta boala , dar nu îns eamnă ca este im posibil ca aceasta să apară.
Pentru a încerca să prevenim maladia, trebuie să avem în vedere controlul factorilor de risc
modificabili specifici cancerului de sân, precum: consumul de alcool, fumatul, sedentarismul,
o greutate corporală mare etc. Aproximat iv 20% din cazurile de cancer mamar la nivel
mondial se datorează factorilor de risc modificabili ( GLOBAL BURDEN OF CANCER IN
WOMEN American Cancer Society) .

26
Foarte importanți pentru apariția i evoluția cancerului mamar sunt factorii protectivi,
i aici a mintim:
 Activitate fizică moderată ( poate reduce până la 25% riscul de a prezenta
cancer de sân la femeile in pre/postmenopauza comparativ cu femeile inactive
(Lynch BM i colab., 2011)
 dietă echilibrată ("Dacă am putea oferi fiecărui individ cantitatea potrivită de
hrană i exercițiu, nu prea puțin i nu prea mult, am fi găsit cea mai sigură cale
spre sănătate", spunea Hippocrates )
 Controlul greutății
 Vârsta tânără la momentul primei sarcini (Femeile care au o sarcină înainte de
vârsta de 20 de ani au u n risc mai scăzut de cancer mamar decât femeile care
nu au avut copii sau care vor na te primu l copil după vârsta de 35 de ani).

27
5.1. DIAGNOSTIC

Opțiunile terapeutice pentru pacienții cu cancer mamar au crescut semnificativ în
secolul 21, cu eforturi crescute spre dezvoltarea de screening, diagnoză i opțiuni de tratament
mai eficiente.
Diagnosticul cancerului de sân se bazează pe examinarea clinică în combinație cu
imagistica i confirmat prin evaluarea patologică. Examenul clinic incl ude palparea bimanuală
a sânilor i a ganglionilor limfatici locoregionali i evaluarea metastazelor îndepărtate (oase,
ficat etc.). Imagistica include mamografie i ultrasunete bilaterale ale ganglionilo r limfatici de
sân i regionali (E. Senkus i colab. , 2015 ).
Stabilirea diagnosticului se bazează pe:
 examinarea clinică a sânului și ariilor ganglionare, istoric personal și familial,
examen clinic general;
 investigații imagistice (mamografie, ecografie, eventual RMN mamară);
 confirmare anatomopatologică (puncție -biopsie sau biopsie excizională).
Depistarea pr ecoce a cancerului de sân i obț inerea unui plan de tratament, sunt cele
mai importante strategii pentru a preveni decesele datorate cancerului mamar. Scopul testelor
de screening pentru c ancerul de sân este de a le identifica înainte de a produce simptome.
Cancerul mamar găsit în timpul examenelor de screening este mai probabil să fie
incipient i încă limitat la sân. Mărimea unui cancer de sân i cât de departe s -a răspândit, sunt
câțiva dintre cei mai importanți factori în prezicerea prognosticul ui unei femei cu această
boală ( http://www.who.int/cancer/detection/breastcancer/en/index3.html ).
Astfel , se observă o cre tere a incidenței în majoritatea țărilor occidentale, dar i o
scădere a ratei de mortalitate datorate cancerului de sân , datorită progreselor ter apeutice i
depistării precoce (Autier P i colab., 2010 ).
În ultima perioadă se acordă o atenție din ce in ce mai mare programelor de screening
populațional, național prin mamografie. Un număr de 18 țări europene au inițiat astfel de
programe, în vederea cre terii anselor de supraviețuire prin depista rea precoce a cancerului
de sân ( Giordano L i colab. , 2012 ).
De exemplu, datele din Baza de date privind cancerul național (BDCN) arată că
procentul pacienților americani care au prezentat inițial Stadiul 0 sau I a crescut de la 42,5%
în 1985 la 56,2% în 1995, în timp ce procentul pacienților prezentați în Stadiul III sau Stadiul
IV a scăzut de la 18,3% la 11,6% în aceea i perioadă de timp. Această imagine în schimbare
sugerează că utilizarea sporită a mamografiei de screening în aceea i perioadă de timp a fost

28
eficientă în detectarea cancerului într -o etapă mai precoce când poate fi tratată mai bine
(Singletary S. Eva MD i colab. , 2006) .
S-au descoperit numeroase metode minimal invazive de diagnostic precoce al
cancerului mamar:
 Biopsia cu ac a formațiunilor mamare palpabile:puncția aspirativă cu ac fin i
puncția biopsie cu ac gros
 Biopsia percutanată a sânului ghidată imagistic
 Localizarea preoperatorie cu ac ghidată imagistic i biopsia leziunilor
nepalpabile ale sânului
 Excizia anomaliilor mamare nepalpabile .
Se fac eforturi mari pentru a dezvolta metode noninvazive de diferențiere a tumorilor
maligne de cele benigne, însă excizia chirurg icală si examenul histopatologic rămân cele mai
sigure strateg ii în depistarea diagnosticului (Peltecu Gh., 2003 ). Există mai multe abordări ale
screeningului cancerului mamar, însă cea mai simplă modalitate este auto -examinarea sânului
(Figura 4.). Această metodă a fost aprobată i promovată pe scară largă de către organizațiile
de cancer i autoritățile din întreaga lume. Eficacitatea sa, totu i, depinde de educație i
informare în rândul femeilor i de auto -examinarea con tiincioasă i regulată. Au to-
examinarea sânului ar trebui să fie utilizată în asociere cu mamografia i examinarea clinică a
i nu ca înlocuitor al oricărei metode (WHO, 2006 ).

Figura 4. Mișcări recomandate pentru a uto-exminarea sânului

29
Mamografia
Mamografia este cea mai sensibilă tehnică disponibilă pentru detectarea leziunilor
neoplazice ale sânului i, prin urmare, mamografia de screening a asigurat un loc de rutină în
întreținerea sănătății femeilor din Statele Unite. De i nu este perfectă, mamografia de
screening poat e reduce mortalitatea în cazul persoanelor care prezintă cancer de sân când este
combinată cu intervenții adecvate.( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK222350/ )
Mamografia este o metodă imagistică bazată pe raze X (Fig. 5 ) pentru detectarea
cancerului mamar. Analiza mamografică, la fiecare 2 ani, a prezentat cel mai mare beneficiu
de reducere a mortalității la femei aflate în grupa de vârstă de 50 -69 ani i este recomandată
de Uniunea Europeană i numeroase țări individuale. Dovezile privind eficacitate a
screeningului mamografic la femeile în vârstă de 40 -49 de ani sunt limitate. Nu există un
consens cu privire la efectul exact al mamografiei asupra reducerii mortalității cauzat de
cancerul mamar, deoarece estimările raportate variază. Într -o revizuire d in Marea Britanie a
studiilor din programe de mamografie randomizate, s -a constatat o reducere a mortalității de
aproximativ 20% la femeile cu vârsta cuprinsă între 50 i 70 de ani ( E. Senkus i colab. ,
2015 ). Societatea Americană de Cancer recomandă ca femeile cu vârsta de peste 40 de ani ar
trebui să efectueze o examinare mamografică în fiecare an, de asemenea femeile cu risc
crescut de a face cancer mamar trebuie să urmeze aceea i recomandare, sau un RMN mamar
(Fig. 6).

Figura 5. Mamografie – cancer de sân

30

Figura 6. RMN – Cancer de sân (Scanarea RMN dezvălui e 2 zone cu anomalii
discrete )

5.2.TRATAMENTUL CANCERULUI DE SÂN

Deciziile de tratament sunt lua te în comun de către pacient i m edic, luând în
considerare stadiului i caracteristicile biologice ale cancerului , vârsta pacientului i
preferințele acestuia , precum i riscurile i benefici ile asociate cu fiecare opțiune (American
Cancer Society, 2016) .
Tratamentul cancerului mamar constă în tratament locoregional (intervenț ie
chirurgicală și/sau radioterapie) și tratament sistemic (chimioterapie, hormonoterapie și
terapie biologică).
Tratamentul local poate fi reprezentat fie de o masectomie radicală (operația H alsted),
masectomie radicală modificată (masectomia tip Patey, tehnica Chiricuța) , fie de chirurgie
conservatoare (masectomie parțială) i radioterapie, rezultatele fiind similare. Radioterapia
este obligatorie în cazul tratamentului conservator (Peltecu Gh., 2003) .

31
Operația Halsted, cunoscut ă i ca masectomie radicală, constă în îndepărtarea în bloc a
sânului, a mu chilor pectorali i a țesutului limfoganglionar regional. Avantajele constau în
evidarea ganglionară axilară i asigură cel mai bine ridicarea complexului fascial i a țesutului
limfoganglionar interpectoral. Dezavantajul este că poate da sechele severe, mai ales dacă se
practică după radioterapie. În prezent are indicații restrânse, numai pentru cazurile cu extensie
la mu chii pectorali (Popescu I., 2008).
Masectomia tip Patey sau masectomia radicală modificată constă în ridicarea sânului
bolnav împreună cu fascia anterioară a mu chiului mare pectoral i țesutul limfoganglionar
axilar, suprimând mu chiul pectoral mic, dar păstrând mu chiul pectoral mare. Dez avantajul
este că nu permite o evidare la fel de largă ca în cazul operației Halsted a țesutului
limfoganglionar interpectoral.
Masectomia parțială constă în excizia formațiunii tumorale împreună cu țesutul mamar
din jur , până se obțin margini libere microscopic. În general, se consideră că o margine de 1
cm este suficientă, însă cei mai mulți chirurgi se mulțumesc i cu o margine de 2 mm.
Tratamentul conservator chirurgical al cancerului mamar este o alternativă a masectomiei
pentru stadiile ma i puțin avansate ale cancerului mamar i î i propune să evite mutilarea
(Burcos T, 2003).

32
PARTEA PRACTIC
În partea a -2 a a lucrării am descris i prezentat principalele materiale și metode
folosite, rezultatele studiului dar i concluziile la care am aju ns în urma prelucrării statistice a
datelor .

6.MATERIA E ȘI METODE
6.1.DESIGNUL STUDIULUI

Studiul pe care l -am realizat este retrospectiv, de tip caz -control.
Studiile observați onale reprezintă o categorie importantă de modele de studiu. Studiile
de cohortă i studii de caz -control sunt două dintre cele mai comune tipuri de studii utilizate
pentru a evalua asoci erile dintre boli i diferiți factori de risc. Studiile de observație se
încadrează în categoria modelelor studiului analitic i sunt subclasificate ca modele de studiu
observați onal sau experimental . Scopul studiilor analitice este de a identifica i evalua cauzele
sau factorii de risc ai bolilor sau evenimentel or legate de săn ătate.
Diferența dintre modelele studiilor observaționale i cele experimentale este că în
acestea din urmă, prezența sau absența unei intervenții define te grupurile. Prin contrast, într –
un studiu observațional, investigatorul nu intervine i mai degrabă "observă" i evaluează
puterea relației dintre o va riabilă a expunerii i a bolii.
 Studiu de tip cohortă – Definiția epidemiologică modernă înseamnă acum un "grup
de persoane cu caracteristici definit e'', care sunt urmăriți pentru a determina incidența
sau morbiditatea sau mortalitatea cauza tă de anumit e boli (Morabia A., 2004). Un
studiu de cohortă bine conceput poate oferi rezultate puternice din punct de vedere
statistic . Într -un studiu de cohortă, o populație d e studiu (care au sau nu au boala) este
este urmărită în timp , până când apare fenotipul de interes sau b oala. Deoarece
expunerea este identificată înainte de rezultat, studiile de cohortă au un cadru temporal
pentru a evalua cauzalitatea i au astfel , potențialul de a furniza cele mai puterni ce
dovezi tiințifice. Studiile de tip cohort ă pot f i prospective sau retrospective. Studiile
prospective se desfă oară din prezent în viitor. Deoarece studiile prospective sunt
concepute cu metode specifice de colectare a datelor, acestea au avantajul de a fi
adaptate pentru a colecta date specifice de expunere i pot fi mai complete.
Dezavantajul unui studiu de cohortă prospectiv poate fi perioada lungă de urmărire în

33
timp pentru a permite apariția bolii . Astfel, acest aspect al studiului îl face inefici ent
pentru investigarea bolilor c are au perioade lungi de latență i este influențat de rata
cu care subiecții renunță la participarea la studiu . În schimb, studiile retrospective de
cohortă sunt mai u or de realizat având în vedere că necesită costuri ma i reduse de
organizare. O caracteristică critică a selecției subiectului este aceea de a fi selectate
atât grupurile expuse cât i cele neexpus e din aceea i populație ( Song Jae W. , i
Chung Kevin C. 2010 ).
 Studiile de tip caz -control identifică subiecții după statutul acestora la începutul
investigației. Rezultatele pot fi de interes dacă subiectul a fost supus unui tip specific
de intervenție chirurgicală, a prezentat o complicație sau a fost dia gnosticat cu o boală .
Odată ce statutul pacientului este identificat i subiecții sunt clasificați ca i cazuri, se
trece la select area controalel or (subiecții fără rezultat, dar din aceea i populație sursă).
Datele privind expunerea la un factor de risc sau la mai mulți factori de risc sunt apoi
colectate retrospe ctiv, în mod obi nuit prin interviu sau prin sondaj. Studiile de tip
caz-control sunt potrivite pentru investigarea bolilor care au o frecvență mare sau
medie în populație; de asemenea aceste studii sunt utile pentru investigarea bolilor
care au o perioadă lungă de latență deoarece subiecții sunt selectați de la început după
statutul lor de rezultat. Astfel, în comparație cu studiile de cohorta, studiile de tip caz-
control sunt mai u or de organizat, mai rapide, necesită resurse finan ciare mai reduse ,
i necesită mai puțin i subiecți pentru a constitui loturile de studiu. Un alt avantaj al
acestor studii se referă la posibilitatea de a testa efectul subiecților care au fost expu i
la mai mulți factori de risc ( Song Jae W., i Chung Kevin C. 2010 ).
 Studiile transversale (Cross -sectional ) sunt efectuate la un momen t dat i includerea
durează o perioadă mai scurtă de timp. Acestea sunt de obicei efectuate pentru a
estima prevalența rezultatului de interes pentru o anumită populație, de obicei în
scopul planific ării sănătății publice. Datele pot fi colectate, de asemenea, cu privire la
caracteristicile individuale, inclusiv expunerea la factori de risc, alături de informații
despre rezultat. În acest fel, studiile transversale oferă un "instantaneu" al rezultatul ui
i al caracteristicilor asociate cu acesta, la un moment dat. Studiile transversale sunt
uneori efectuate pentru a investiga asociațiile între factorii de risc i rezultatul
interesului. Ele sunt limitate, totu i, prin faptul că acestea sunt efectuate l a un moment
dat i nu dau nici o indicație a secvenței evenimentelor – indiferent dacă expunerea a
avut loc înainte, după sau în timpul declan ării rezultatului bolii. Astfel, este im posibil
să deducem cauzalitatea ( Levin Kate Ann , 2006).

34
Lotul de studiu
În acest studiu au fost analizate date de la 40 de paciente de sex feminin , care au fost
diagnosticate cu cancer de sân , cu vârste cuprinse între 50 i 60 ani. De asemenea au fost
selectate i 40 de persoane control (femei considerate sănătoase din punct d e vedere clinic i
paraclinic) cu vârste cuprinse între 43 i 61 ani . Acest studiu este organizat pe principiul caz-
control i analizează date legate de posibili factori implicați în neoplaziile mamare.
De la fiecare subiect inclus în studiu s -au recoltat 1 ml de sânge periferic ( pe
anticoagulant EDTA ).

Toate probele au fost prelev ate de la subiecți voluntari i toți sunt caucazieni .
Diagnosticarea pacienților, includerea în studiu i pr elevarea probelor s -a realizat la INDNBM
N Paulescu din Bucure ti i Spitalul Colțea.

6.2.EXTRACȚIA ADN
Pentru extracția ADN din sângele recoltat am utilizat Wizard genomic DNA purification
kit (Promega), conform instrucțiunilor producătorului.

Materiale utilizate pentru extracția ADN:
 Tuburi sterile Eppendorf (1,5 ml)
 Vârfuri pentru pipete automate
 Pipete automate
 Centrifugă
 Vortex
 Soluție de liză celulară
 Soluție de liză nucleară
 Soluție de precipitare a proteinelor
 Izopropanol la temperatura camerei
 Etanol 70% la temperatura camerei
 Baie de apă la 65șC

Protocol de lu cru:
 Într-un tub steril Eppendorf de 1,5 ml, se pipetează 900 µl soluție de liză celulară;

35
 Se agită u or tubul cu sânge pentru a se amesteca i apoi se transferă 300 µl în tubul cu
soluție de liză celulară.Se inversează tubul de 5 -6 ori pentru amestecare;
 Se lasă mixtura timp de 10 minute la temperatura camerei (timp în care mai agităm de
câteva ori tubul) pentru a se produce liza hematiilor;
 Se centrifughează 1 minut la 14.000g ;
 Se îndepărteaza pe cât posibil supernatantul fară a leza sedimentul alb depus la baza
tubului (Pot r ămâne 10 -20 µl de lichid rezidual deasupra sedimentului);
 Se vortexează puternic timp de 10 -15 secunde, pân ă ce leucocitele sunt resuspendate;
 Peste celulele resuspendate se adaug ă 300 µl soluție de liză nucleară. Se pipeteza d e 5-
6 ori soluția pentru a produce liza leucocitelor. Soluția devine foarte vâscoasă. Dacă
sunt vizibile agregate celulare dup ă amestecare, se incubează tubul la 37șC pân ă dispar
agregatele;
 Se adaugă 100 µl de soluție de precipitare i se vortexează vigu ros timp de 10 -20
secunde;
 Se centrifughează la 14.000 rpm 2 minute;
 Se transferă supernatantul într -un tub Eppendorf de 1,5 ml ce conține 300 µl de
isopropanol la temperatura camerei;
 Se amestecă u or soluția prin inversie pân ă ce devin vizibile filamente albe de ADN i
până ce acestea formează o masă compactă, ca o meduză;
 Se centrifughează la 14.000 rpm timp de 1 minut (ADN trebuie sa fie vizibil ca un mic
sediment alb);
 Se îndepărtează supernatantul i se adaugă un volum de 300 µl de etanol 70% la
temperatură camerei. Se inversează u or tubul de câteva ori pentru a spăla sedimentul
de ADN i pereții tubului.
 Se centrifughează din nou la 14.000 rpm timp de un minut;
 Se aspiră u or i cât mai complet etanolul. În această etapă sedimentul de ADN este
foarte fragil i trebuie aspirat cu multă atenție pentru a se evita aspirarea sedimentului.
Se inversează tubul pe o hârtie de filtru absorbantă i se lasă 10 -15 minute pentru a se
usca sedimentul;
 Se adaugă 100 µl de soluție de rehidratare în tub i se re hidratează AD N prin incubare
la 65șC timp de 1 ora. (Se amestecă periodic soluția);
 Se sochează ADN la 2-8șC.

36
6.3.E ECTROFOREZ

Elecroforeza este o metodă ce pe rmite analiza macromoleculelor ce pot fi acizi
nucleici sau proteine, în funcție de mărime și de sarcina electrică, prin migrarea acestora sub
influența unui câmp electric, într -un gel de agaroză/poliacriamidă.
6.3.1.E ECTROFOREZ ÎN GE DE AGAROZ

Electroforeza în gel de agaroză reprezintă o metodă standard de separare, modificare i
identificare a moleculelor de ADN, inclusiv din amestecuri de unde acestea nu pot fi separate
prin alte tehnici. Deplasarea moleculelor se face sub prezența unui curent electric i migrează
spre anod (la pH alcalin sau neutru ADN este încărcat negativ dato rită prezenței grupărilor
fosfat i migrează spre electrodul încărcat pozitiv).
Rata migrației moleculelor de ADN prin gelul de agaroză este influențată de câțiva factori:
 dimensiunea moleculară a ADN ;
 concentrația agarozei (un anumit fragment de ADN liniar de o anumită dimensiune
migrează cu o rata diferită în f uncție de concentrația agarozei );
 conformația moleculei de ADN (monocatenar, dublu catenar) ;
 prezența bromu rii de etidiu în gel sau buffer. Acest agent intercalant determină o
migrare mai lentă a ADN, rata de migrare scade cu până la 15% (EtBr are sarcină
pozitivă i determină o descre tere a sarcinii negative a ADN) ;
 voltajul aplicat ;
 tamponul utilizat .
Există trei clase de agaroză: standard/gel de agaroză cu temperatură crescută, g el de
agaroză cu temperatură sc ăzută, electro -osmoza.
Agaroza standard este compusă din două tipuri de alge Gelidium i Gracilaria. Este
utilizată pentru analiza fragmentelor ADN de la 1kb până la 25kb.
Sunt disponibile 3 tipuri de tampoane utilizate în electroforeză: TAE (Tris -Acetat -EDTA,
ph=8), TBE (Tris -Acid boric -EDTA) i TPE (Tris -fosfat -EDTA). Bufferul este de obicei o
soluție concentrată, păstrată la temperatura camerei.
Buffer -ul de încărcare (Loading Buffer) este mixat cu probele înainte ca ace stea să fie
încărcate în godeu. El este util deoarece cre te densitatea probelor păstr ându-le la fundul
godeului i de asemenea oferă culoare probelor ajutând la vizualizarea lor în timp ul migrării.
Bromfenolul migrează în gel de aproximativ 2,2 ori mai ra pid decât xile n cianolul.

37
Bromfenolul migre ază prin gelul de agaroză de 1X TBE cu o rată asemănătoare cu a unui
ADN dublu catenar de 300pb, spre deosebire de xile n cianol care are o rată de migrare
asemănătoare unui fragm ent de ADN dublu catenar liniar de 4kb (Sambrook i Russell 2001 ).

Materiale necesare pentru electroforeză :
 Linie de elecroforeză
 Pipete automate
 Vârfuri pentru pipete automate
 Erlenmeyer
 Soluție de agaroză
 Buffer de elecroforeză -TBE (1X)
 Bromură de etidiu 1X
 Buffer de încărcare 6X
 Probe ADN
 Apa distilată
 Transiluminator cu cameră

Protocol de lucru:
Pentru testele realizate au fost preparate geluri de aga roză cu o concentrație de 0,8%.
Reactivi folosiți Volume
Agaroză 0,32 g
TBE 10X 4 ml
Apă distilată 36 ml

Tabel 4. Reactivi utilizați pentru prepararea gelurilor de agaroză

S-a cântărit la balanța analiti că 0,32 grame de agaroză care a fost transferată într-un
vas Erlenmayer de 100 ml ce conțin ea 40 ml tampon TBE 1 X. Pentru a ajunge la concentrația
de TBE 1X s-a diluat cu apă distilată conform T abelului 4 .
Vasul Erlenmayer a fost acoperit cu folie de staniol i amestecul a fost încălzit la becul
de gaz până c ând agaroza s-a topit.
S-a realizat electroforeză în tr-un sistem submers orizontal. Aceasta este formată dintr –
un tanc de electroforeză și o t ăviță în care se toarnă gelul de agaroză. Prima dată s -au izolat

38
marginile t ăviței aparatului de electroforeză cu banda adeziv ă pentru a împiedica curgerea
gelului. S-a montat pieptenul astfel încât dinții acestuia să nu atingă t ăvița (să nu p ătrundă în
toată grosimea gelului), apoi s -a turnat gelul cald, în grosime de 3 -5 mm în tavă. S -a a teptat
aproximativ 25 -30 de minute pentru ră cirea și solidificarea gelului.
După ce gelul s -a solidificat s -a îndepărtat cu grijă banda adezivă și pieptenul. Tăvița
cu gelul solidificat a fost a ezat î n tancul de electroforeză. În prealabil în tanc a fost pus
tampon TBE 0,5% pân ă când pelicula de lichid care acoperă gelul are apoximativ 1 -2 mm.
S-au încărcat probele reprezentate din 5 µl soluție ADN peste care s-a adăugat 1 µL
soluție de tampon de încărcare . Amestecul a fost încărcat în godeurile rezult ate prin scoaterea
pieptenului. S-a a ezat capacul electroforezei i s -a conectat la sursă de tensiune (85V/cm)
având grijă să corespundă culorile bornelor ; probele au fost migrate aproximativ 30-50 de
minute. Voltajul se calculează î n funcție de mărimea tancului de electroforeză (5V/cm).
După terminarea migrării s -a oprit electroforeza. S -a scos gelul din tanc i a fos t
introdus într -o tăviță de colorare care conține soluție de bromură de etidiu . Durata colorării a
fost de aproximativ 15 minute.
Bromura de etidiu a fost utilizat ă pentru vizualizarea moleculelor ADN. Acest
fluorocrom este un agent intercalant care se inseră între planurile formate de bazele azotate la
nivelul macromoleculei de ADN. Prin excitarea bromurii de etidiu în lumina UV (λ = 250 –
310 nm) se obține o emisie în domeniul vizibil, la 520 nm (culoare roz -portocalie).
Ulterior gelul a fost scos i analizat la lumină UV la transiluminat or (EtBr absoarbe
lumina în UV).

6.3.2.E ECTROFOREZ ÎN GE D E PO IACRI AMID
Spre deosebire de gelul de agaroză, gelul de poliacrilamidă prezintă trei avantaje
majore:
 se pot separ a fragmente ADN care diferă între ele prin mai puțin de 10 nucleotide
(0,1%) ;
 se poate încărca o cantitate de ADN care poate ajunge la 10µg ;
 ADN poate fi recuperat, fiind foarte pur, poate fi utiliz at pentru majoritatea scopurilor
propuse .
Există două tipuri de geluri de poliacrilamidă: gel de poliacrilamidă denaturat i gel de
poliacrilamidă nedenaturat.
Gelul de poliacrilamidă denaturat se folose te pentru separarea i purificarea
fragmentelor de ADN monocatenare. Gelurile sunt polimerizate în prezența unui agent

39
denaturant (ex. uree, formaldehidă) care împiedică împerecherea bazelor azotate. ADN
denaturat migrează în gel cu o rată care este aproape complet independentă de compoziția
bazelor azotate. Este utilizat pentru: izolarea secvențelor ADN marcate radioactiv, analiza
produ ilor de digestie ai nucleazei S ₁, analiza produ ilor de secvențiere ADN.
Gelul de poliacrilamidă nedenaturant este utilizat pentru separarea i purificarea
fragmentelor ADN dublu catenare. ADN migrează prin gel cu o rată invers proporțională a
logaritmului zecimal al dimensiunii. Mobilitatea electroforetică este afectată de com poziția
bazelor azotate i de secvență. Moleculele de ADN care au aceea i dimensiune pot avea o
mobilitate diferită de până la 10%. Gelurile de poliacrilamidă nedenaturat e sunt utilizate
pentru purificate fragmentelor de ADN sau pentru detec tarea complexel or ADN -proteine
(Sambrook i Russell 2001 ).
Materiale utilizate :
 Linie de electroforeză
 Plăci de sticlă
 Piepteni
 Spațiatori
 acrilamidă:bisacrilamidă (29:1)
 Persulfat de amoniu (10% w/v)
 Etanol
 LB 6X
 TBE 5X (1X)
 Apă distilată
 TEMED (N,N,N',N' -Tetramethylethyieneediamine)
 Molecule de ADN
Reactivi folosiți Volume
Mix 40% 2 ml
TBE 1X 2 ml
APS 200µl
TEMED 25µl
Apă distilată 12 ml
Volum final 20 ml

Tabel 5. Reactivi utilizați pentru prepararea gelurilor de poliacrilamidă (12%)

40

În acest studiu au fost preparate geluri de poliacrilamidă 12%
(acrilamidă:bisacrilamidă 29:1), reactivii utilizați fiind prezentați în Tabelul 5.

Protocol de lucru:
 Se degresează plăcile de sticlă cu KOH/ Metanol i se a teaptă să se usuce. Se
asamblează plăcile de sticlă cu spațiatorii i cu clamele.
 Se prepară amestecul de acrilamidă -bisacrilamidă i apoi este turnat cu grijă între cele
două plăci de sticlă.
 Se inseră pieptenul cât mai bine în gel, având grijă să nu se formeze bule. Se
incubează în termos tat (10 minute la 37°C), până câ nd începe să polimerizeze;
 Se îndepărtează pieptenul i se fixează sistemul în tancul cu electroforeză, care a fost
umplu t în prealabil cu soluție TBE 1X .
 Se încarcă probele în godeuri.
 Se montează electrozii i se conectează la sursa de curent electric, la un voltaj de
aproximativ 85 V (5V/cm) .
 Se a teaptă migrarea probelor, până c ând acestea pot fi observate sub forma a două
benzi distincte .
 După terminarea programului, se opre te curentul electric i se transferă gelul în baia
de colorare care conține bromură de etidiu.
 Se analizează gelul de poliacrilamidă la transiluminator.

6.4. REACȚIA PCR
Reacția PCR ( Polymerase Chain Reaction = Reacție de Polimerizare în Lanț) este o
metodă de amplificare enzimatică in vitro a unei anumite secvențe de ADN. În prezent a fost
dezvoltată o adev ărată tehnologie PCR care este folosită într -o varietate foarte mare de
domenii: biologie moleculară, șt iințele mediului, criminalistică, științe medicale,
biotehnologie, microbiologie, industria alimentară, epidemiologie etc.
Metoda a fost propusă pentru prima dată la începutul anilor 1970 de către H. Ghobin
Khorana însă la acea vreme nu a părut practicabi lă (genele nu erau secvențiate, ADN
polimeraza termostabilă nu fusese descrisă). 15 ani mai târziu tehnica a fost independent
concepută i a primit numele de PCR, fiind pusă în practică de Kary Mullis i colab. . Prima

41
descriere a PCR -ului – precis, imperso nal- a fost publicată de Kleppe i colab. în 1971, iar a
doua sa descriere a fost publicată de Kary Mullins în 1990.
Principalele componente ale reacției sunt : ADN matriță, o ADN polimerază
termostabilă, primeri oligonucleotidici, deoxinucleotidtrifosfati (dNTP), tamponul de reacție,
ioni de Mg++.
Componentele esențiale ale reacției de polimerizare :
1. ADN polimeraza termostablilă care catalizează sinteza de ADN dependentă de
matriță. Există mai multe enzime ce pot fi folosite în funcție de fidelitate, de capacitatea de a
sintetiza fragmente mari de ADN, însă cea mai utilizată rămâne Taq polimeraza . Activitatea
Taq polimerazei este de aproximativ 80.000 unități/mg/proteină. PCR -ul standard conține
2×1012 – 10×1012 molecule de enzimă. Eficiența elongării primerilor cu Taq polimeraza este
de aproximativ 0,7 i activitatea enzimei devine limitată atunc i când 1,4×1012 -7×1012
molecule de produs amplificat s -au acumulat în reacție.
2. Primeri – designul primerilor este unul esențial deoarece acesta este necesar pentru
obținerea produsului dorit , care să supreseze amplificarea unor secvențe nedorite i să
favorizeze manipularea ulterioară a produsului amplificat. Există i o altă tehnica –
MULTIPLEX PCR în care se utilizează mai multe perechi de primeri pentru a amplifica mai
multe secvențe ADN. În general într -o reacție de PCR clasic se utilizează în tre 0,1 -0,5µM.
Pentru un segment de 8 kbaze această cantitate este suficientă pentru 30 de cicluri de
amplificare. O concentrație mai mare de primer favorizează amplificările nespecifice.
Totodată, pentru a se evita dimerizarea primerilor, este necesar ca primeri i să nu fie
complementari unul cu celă lalt.
3. Deoxinucleotidtrifosfat (dNTP). Deoxinucleotidtrifosfații introduși în reacție sunt
folosiți de către ADN polimerază în reacția de polimerizare. Î n amestecul de reacție se
introduc cantități echimolare din cel e 4 tipuri de molecule; în caz contrar scade fidelitatea
ADN polimerazei, concentrația recomandată este de 200 -250 µM din fiecare dNTP care
conține 1,5mM de MgCl2. O concentrație mai mare de dNTP poate inhiba desfă urarea
reacției PCR. Se stochează la -20șC.
4. Cationi bivalenți – cel mai util izat este Mg ++ fiind utilizat în concentrație de 1,5mM.
Concentrația ionilor de Mg++ este un factor crucial ce afectează performanța oricărei ADN
polimeraze.
5. Buffer care menține ph -ul. Se utilizează TrisCl într -o concentrație de 10mM.
6. Cationi monovalenți KCl în concentrație de 50 mM, ace tia fiind utilizați pentru
amplificarea fragmentelor ADN mai mari de 500 p baze. O concentrație mai mare de 70 –

42
100mM este utilizată pentru amplificarea fragmentelor mai mici. Excesul ionilor de Mg++
într-o reacție PCR poate crește atașările nespecifice ale primerilor.
7. Matrița ADN poate fi mono – sau bicatenară. ADN circular covalent î nchis este
amplificat cu mai puțină eficienț ă față de cel liniar ( Sambrook i Russell 2001 ).

Etapele reacției PCR
PCR este formată din n cicluri (între 25 și 40), în fiecare ciclu fiind parcurse 3 etape
principale: denaturarea termică a matriței (deci, desfacerea dublului helix ADN), atașarea
primerilor și polimerizarea propriu -zisă.
 Denaturare – Dacă concentrația de Guanină -Citozină este mare, denaturarea se
face mai greu i avem nevoie de o temperat ură mai ridicată. Cu câ t cantitatea de
ADN este mai mare, cu at ât este mai lung timpul de denaturare. Daca
temperatura de denaturare este mai mică sau timpul prea scurt, se vor denatura
doar regiunile bogate în Adenină -Timina. Denaturarea se face la 94 -95șC, fiind
o temperatură optimă pentru ca enzima să poată cataliza 30 de cicluri de
amplificare în 45 de secunde.
 Alinierea primerilor – se realizează la 72șC, însă de multe ori temperatura
trebuie determinată i optimizată empiric. Alegerea acestei temperaturi
reprezintă unul din tre factorii cei mai critici pentru asigurarea unei înalte
specificități a reacției PCR. Dacă temperatura de atașare este mult prea înaltă,
nu are loc atașarea primerilor, iar dacă temperatura este prea scăzută, atunci
crește probabilitatea atașărilor nespecifice.
 Extensia primerilor – se realizează l a 72-78șC. La această temperatură rata de
polimerizare a Taq polimerazei este de aproximativ 1000 de nucleotide/minut.
Numărul de cicluri de amplificare – sunt necesare cel puț in 25 de cicluri pentru a
obține un nivel de amplificare acceptabil. De obicei se realizează 30 de cicluri de amplificare.

Materiale utilizate :
 tuburi pentru PCR sterile
 micropipete și vârfuri corespunzătoare
 apă distilată
 ADN -polimerază termostabilă și buffer aferent
 soluție dNTP

43
 primeri oligonucleotidici
 ADN matri ță
Buffer PCR 7,5 μl
dNTP 0,2 μl
primer F 0,04 μl
primer R1 0,04 μl
primer R2 0,04 μl
Taq polimerază 0,1 μl
apă distilată 6,08 μl
ADN matriță 1 μl
Volum total: 15 μl

Tabel 6. Compoziția amestecului pentru PCR utilizat pentru amplificarea exonului 2 al
genei BRCA1

Protocol de lucru :
Se realizează un amestec care conține: apă distilată, dNTP, primeri i ADN –
polimerază într-un tub steril pentru PCR, compoziția amestecului fiind prezentată în Tabelul
6.
Amestecul din tub este distrib uit în tuburi sterile, apoi se adăugă probele de ADN de
amplificat în tuburile corespunzătoare. ADN matriță rămâne ca i control al amplificării , i
nu se va adăuga în tubul în care s -a făcut amestecul. Dacă unul din reactivi este cont aminat cu
ADN, sau în timpul manipulării ADN ajunge în acest tub, în gelul de agaroză se va observa o
bandă de migrare la nivelul controlului i rezultatele PCR sunt neconcludente.
Tuburile se închid bine i se plasează în termo -cycler. Se închide capacu l i se
configurează astfel:
1. denaturarea iniția lă – 95ș C ti mp de 1 minut;
2. denaturare – 95ș C, 45 secunde;
3. ata area primerilor – 60ș C, 30 secunde;
4. elongare – 72ș C, 50 secunde (se repetă pa ii 2 -4 de 35 ori); (e)
5. elongare finală – 72ș C, 2 minute;
Probele pot fi lăsată în termo -cycler și ținute la temperatura camerei , sau la 4° C până
la o prelucrare ulterioară.

44
Se verifică rezultatul amplificării prin analiza a 5 -15 μl de probă într -un gel de
agaroză .

Figura 7. Gel de agaroză în care au fost migrați 10 ampliconi . Gelul a fost colorat cu
bromură de etidiu și vizualizat la trans iluminator pentru a verifica dacă reacția PCR a fost
productivă și dacă există amplificări nespecifice (doar probele în care nu există amplificări
nespecifice pot fi util izate pentru analiza postamplificare a ampliconilor ).
Pentru amplificarea exonului 2 în care se găse te mutația 185delAG s -au folosit trei
tipuri de primeri, i anume : un primer reverse scurt care conține secvența normală a exonului
2 din gena BRCA1, un primer reverse lung care conține secvența cu deleția celor două baze
azotate i un primer forward comun.
În alele la nivelul cărora se găse te mutația 185delAG în timpul reacției PCR se v or
ata a primerii reverse de tip 2, având o dimensiune mai mare decât primerii reverse de tip 1
care vor recunoa te i se vor ata a la nivelul secvenței ADN a alele lor normale. În acest fel, la
migrarea electroforetică a probelor într -un gel de poliacrilam idă, ampliconul care conține
mutația i care a încorporat primerul lung va migra mai greu, iar ampliconul care conține
secvența normală a exonului i care a încorporat primerul mai scurt va migra mai rapid.
După reacția PCR ampliconii au fost supu i unei e lectroforeze în gel de polia crilamidă
folosind tehnica SSCP ( Single -Strand Conformation Polymorphism ).
Principiul metodei SSCP este relativ simplu. În condițiile de migrare electroforetică
într-un gel non -denaturant, monocatenele de ADN au o conformație pl iată care este
determinată de interacțiunile intramoleculare și, prin urmare, de secvența de bază.

45
Când migrează într -un gel de poliacrilamidă non -denaturant, monocatenele ADN au o
mobilitate specifică în funcție de secvența de nucleotide. Orice diferență în această secvență
de bază a unui eșantion din cauza unei mutatii sau polimorfism, va fi detectată ca o schimbare
de mobilitate i va produce un alt model de bandă în gel, diferit în comparație cu cel normal
de „tip sălbatic” ( Lo Y.M i colab., 2006).
După migrarea probelor, gelurile de poliacrilamidă au fost evidențiate folosind
colorația argentică. Această tehnică de colorare oferă avantaj prin faptul că gelul poate fi
vizualizat după colorare la lumină naturală . S-a realizat i analiza heteroduplexur ilor.

Figura 8. Gel de poliacrilamidă (8%, colorat cu EtBr) în care se observă
homoduplexurile rezultate în urma analizei HA pe ntru ampliconii BRCA 1 exonul 2. P attern –
ul de benzi obținut arată că nu exi stă mutații în probele testate.

6.5.TESTUL ODD RATIO
Comparațiile datelor cantitative între grupuri s-a efectuat cu testul Mann -Whitney U .
OR (Odd ratio) i intervalele de încredere corespunzătoare de 95% au fost calculate
pentru estimarea asocierii dintre boală i factorilor de risc calitativi testaț i.
Valorile p<0,05 au fost considerate semnificative din punct de vedere statistic.

46
OR reprezintă probabilitatea ca un rezultat să aibă loc , în funcție de o anumită expunere,
comparativ cu cotele rezultatului care apare în absența expunerii respective. În studiile c linice,
în special în studiile caz -control sau, mai rar, în studiile de cohortă, se folosește testul , ca
raportul între cota de îmbolnăvire la cei expuși și cota de îmbolnăvire la cei neexpuși
(Magdalena Szumilas, 2010 ).
Testul Odd Ratio este u tilizat pentru a compara cotele relative ale apariției rezultatului
de interes (de exemplu, boală sau tulburare), dat fiind expunerea la variabila de interes (de
exemplu, caracteristica de sănătate, aspectul istoricului medical). Rata probabilității poate fi,
de asemenea, utilizată pentru a determina dacă o anumită expunere este un factor de risc
pentru un anumit rezultat i pentru a compara mărimea diferiților factori de risc pentru
rezultatul respectiv.
Ca și interpretare, valori apropiate de 1, arată cote asemănătoare, ce ea ce înseamnă că
expunerea nu influenț ează prezența bolii. Valori mult peste 1, arată o tendință de corelație
(cauzală) între prezența expunerii și a bolii la pacie nți. Valori mult sub 1 arată tot o corelație,
dar în acest caz, expune rea este considerată un factor de protecție .

47
7. REZU TATE ȘI DISCUȚII
În cadrul studiului am testat diferiți factori de risc ce pot fi implicați în apariția,
favorizarea i dezvoltarea formelor sporadice de neoplazii mamare . Principalele rezultate
obținute în urma aplicării testelor statistice sunt prezentate în cele ce urmează .

Caracteristică Variante ot pacienți Lot control
Sex 40 femei 40 femei
Vârstă 60±3,3(50-65) 51,3±4 (43-61)
Obez nu/da 40/0 40/0
Alcool nu/da/în
trecut/ocazional 31/9/0/0 29/9/1/1
Fumători nu/da/în
trecut/ocazional 23/17/0/0 25/8/7/0
DZ1 nu/da 40/0 40/0
DZ2 nu/da 36/4 40/0
SM nu/da 40/0 40/0
HTA nu/da 26/14 40/0
cancer de sân nu/da 0/40 40/0
Însărcinate nu/da 40/0 40/0
mediul în care trăiesc urban/rural/navetă 22/7/11 20/8/12
efort fizic sedentar/ocazional/reg
ulat 21/15 /4 15/15/10
imobilizare la pat >2
săptămâni nu/da 39/1 38/2
Înălțime 1,71±0,02 (1,67 –
1,79) 1,7±0,02 (1,66 –
1,75)
Greutate 68,7±5,9 (60-82) 72,4±5,6 (61-82)
valoare IMC 23,4±1,8 (19,1 –
27,4) 24,9±1,7 (21,3-
27,4)
Glicemie 105,2±9,4 (88-
130) 102,3 ±6,4 (89-
115)
avorturi spontane Nu/da 35/5 36/4
hepatită virală Nu/da 30/10 36/4
sarcini duse la termen 1±0,7 (0 -3) 0,9±0,8 (0 -3)
TTV -uri prezente Nu/da 8/32 21/19

Tabel 7. Principalele c aracteristici ale subiecților incluși în loturil e studiate
(sunt prezent ate valorile absolute sau valorile medii ± abaterea standard i intervalele în care
se găsesc valorile înregistrate)

48
Datele din literatură arată că vârsta este unul dintre cei mai importanți factori de risc în
cazul cancerului de sân ; datele din acest studiu arată că vârsta pacientelor selectate pentru
studiu este de 60±3,3 ani (Tabel 7 .). De i vârsta pacientelor este mai înaintată comp arativ cu a
subiecților din lotul control ( 60±3,3 vs 51,3 ±4) diferențele constatate nu pot influen ța
celelalte date obținute în urma prelucrării statistice .
În lot urile selectate nu au fost incluse persoane obeze, hipertensive , cu DZ1 sau femei
însărcinate , pentru a reduce impactul factorilor de confuzie asupra rezul tatelor acestui studiu.
Având în vedere vârsta pacientelor cu cancer de sân au fost păstrate în studiu patru persoane
care aveau diabet zaharat de tipul 2 (DZ2) . În lotul control acest car acter nu a fost prezent
deoarece prezența oricărei condiți i patologice reprezenta un criteriu de excludere din studiu.
Putem observa că în cazul lotului pacienți există mai multe persoane fumătoare (17),
comparativ cu lotul control în cazul căruia există numai 8 fumătoare . De i difer ențele
observ ate nu sunt semnifica tive din punct de vedere statistic , (p=0.10) rolul compu ilor din
fumul de țigară în procesul de malignizare nu trebuie minimizat. În literatura de specialitate,
datele sunt contradictorii în privința relației dintre fumat i riscul de malignizare. U nele studii
demonstrează implicarea fumatului ca factor de risc pentru cancerul de sân ( Michael N.
Passarelli i colab., 2016 ). De i dovezile epidemiologice privind rolul fumatului activ al
țigărilor în canc erul de sân au fost inconsecvente, literatura recentă susține o asociere modestă
între fumat i cancerul de sân. Această asociere se observă în special la femeile care fumează
pe o perioadă lungă de timp sau care fumează mult tim p înainte de prima lor sarc ină
(Catsburg C i colab., 2015).
Valoarea IMC -ului este mai sc ăzută în cazul pacientelor (p=0.061), însă diferențele nu
sunt semnificative din punct de vedere statistic . Glicemia în schimb (p= 0.25 ), este mai mare
în cazul lotului control, cea mai mare val oarea înregistrată fiind de 130, dar nici în acest caz
diferențele nu ating pragul minim de semnificație statistică.
Studiul de față evidențiază diferențe semnificative ce se pot observa între cele d ouă
loturi în cazul prezenței virusurilor Torque teno (TTV). TTV este un virus nou , în dezvoltare,
al cărui potențial de a induce boala n u a fost stabilit. Cu toate acestea, genomul TTV a fost
detectat la pacienții cu diferite tipuri de cancer, inclusiv cancerul de sân . Există numeroase
studii care sugerează o relație dintre prezența TTV i dezvoltarea bolilor maligne (Margaret
E. i colab., 2008). Un astfel de studiu caz -control a fost făcut i în România, studiu ce
urmărea asocierea dintre TTV i forme le sporadice de cancer de sân, rezultatele fiind
asemănătoare , TTV fiind mult mai frecvent e la pacienții care prezentau boala ( Cimponeriu

49
Dnuț i colab., 2013). Datele obținute în acest studiu sunt concordante cu cele menționate în
studiul anterior.
Nr. crt Factorul testat Pacienți vs control Rezultate
1. Imobilizare la pat
>2 săptămâni 1/39 vs 2/38 OR= 0.6069
IC:95% 0.042 >0.487> 5.599
p= 0.55
2. Avorturi spontane 5/35 vs 4/36 OR= 0.9149
IC:95% 0.319 >1.286> 5.186
p= 0.72
3. Glicemia 105,2±9,4 (88-130) vs
102,3±6,4 (89 -115) p= 0.25
4. IMC 23,4±1,8 (19,1 -27,4) vs
24,9±1,7 (21,3 -27,4) p=0.061
5. Vârsta 60±3,3(50 -65) vs.
51,3±4 (43 -61) p< 0.00001
6. TTV 32/8 vs 19/21 OR=2.2391
IC:95% 1.638 >4.421> 11.93
p=0.002
7 Consumul de alcool 9/31 vs 9/29 OR= 0.5029
IC:95% 0.326 >0.935> 2.683
p=1
8 Fumatul 17/23 vs 8/25 0R= 1.1942
IC:95% 0.838 >2.31> 6.363
p=0.10
9 Înălțime 1,71±0,02
vs
1,7±0,02 p=0.8493
10 Greutate 68,7±5,9 (60 -82)
vs
72,4±5,6 (61 -82) p=0.006
11. DZ2 4/36 vs 0/40 p=0.012
12. HTA 14/26 vs 0/40 p=1.0E -6
13. Hepatita virală 10/30 vs 4/36 OR= 1.9235
IC:95% 0.095 – 1.171 , p=0.07
14. Mediul în care
trăiesc
22/18 vs 20/20 OR= 0.548
IC:95% 0.508 – 2.943 , p=0.65
7/33 vs 8/32 OR= 0.487
IC:95% -0.196 – 0.146 , p=0.77
11/29 vs 12/28 OR= 0.4376
IC:95% 0.336 -2.332 , p= 0.80
15. Efort fizic 21/19 vs 15/25 OR= 0.8379
IC:95% 0.755 – 4.493 , p= 0.17
15/25 vs 15/25 OR= 0.4619
IC: 95% 0.404 – 2.473 , p=1
4/36 vs 10/30 OR= 0.2137
IC:95% 0.095 – 1.171 , p= 0.07
Tabel 8 . Calcularea r elațiilor de asociere dintre parametrii testați și fenotipul patologic

50
Din datele obținute se observă o prezența mai mare a hepatitei virale (Figura 9 .) în
cazul pacienților, față de controli ( p=0.07), iar în literatură există studii care au evaluat relați a
dintre infecția cu HCV (virus hepatic C) sau HBV (virus hepatic B) i dezvoltarea tumorii
mamare, dar i cu alta maladii. A fost observată o prevalență mai mare a HBV la pacienții
vârstnici cu tumori de colon / rect, prostată, sân. Cu toate acestea , hepatita virală nu a fost
semnificativ asociată cu cancerul de sân, de i riscul a fost mai mare pentru subiecții cu H CV
decât pentru cei cu HBV sau ambele (Larrey D i colab., 2010). Un alt studiu de tip caz –
control sugerează faptul că infecția cronică cu HCV este asociată cu cancer de sân la începutul
tratament ului i că infecția cronică cu HBV nu este asociată cu cancerul de sân (Fu -Hsiung Su
i colab., 2011).
De asemenea, în lotul pacienților se întâlne te un număr mai mare de persoane
sedentare, efortul fizic fiind considerat benefic pentru organism, chiar un factor protector
pentru cancerul de sân. Rezultatele nu au fost semnificative în cazul în care s -a testat efortului
fizic zilnic pe care îl fac participantele la studiu. Efortul fizic a fost autoapreciat. Nu au fost
detectate diferențe smnificative ale numărului de persoane care s -au declarat sedentare ( p=
0.17) i între cele care fac sport regulat ( p= 0.07) în cele doua loturi de subiecț i.
Există studii care atestă r educere m edie a riscului în rândul femeilor active din punct
de vedere fizic în comparați e cu cele mai puțin active . Este probabil ca activitatea fizică să fie
asociată cu un risc redus de cancer mamar prin multiple că i biologice interdependente care pot
implica adipozitatea, hormoni sexuali, rezistența la insulină (Lynch BM i colab., 2011).
Multe studii arată că femeile active din pun ct de vedere fizic au un risc mai scăzut de cance r
mamar decât femeile inactive. Într-o meta -analiză din 2013 a 31 de studii prospective,
reducerea medie a riscului de cancer mamar asociată activității fizice a fost de 12% .
Activitatea fizică a fost asociată cu un risc redus de cancer la sân atât la femeile afl ate în
premenopauză, cât i la femeile aflate în postmenopauză. Cu toate acestea, dovezile pentru o
asociere a activității fizice i cancerul de sân sunt mai puternice pentru femeile aflate în
postmenopauză (Wu Y i colab., 2013). În cadrul studiului, dife rențele nu ating gradul minim
de semnificație statistică (p>0.05).
Prelucrarea statistică a datelor obținute relevă faptul că unii factori sunt asociați cu
cre terea riscului de boală (ex.vârsta, fumat ul, prezența TTV etc.) (Figura 10.), în timp ce alți
factori par să confere o protecție pentru maladie (ex.efortul fizic).
În cazul acestui studiu, asocierile referitoare la consumul de alcool nu sunt
semnificative (p=1 ; OR= 0.5029 ), spre deosebire de alte studii caz -control asemănătoare în

51
care consumul de alcool este asociat cu cre terea riscului cancerului de sân ( Bagnardi V .,
2013).

Figura 9. Reprezentar ea grafică a distribuției TTV+ și a hepatitei virale în lotul studiat

În cadrul studiului , în urma calculării riscului de bolă, rezultatele arată o asociere
semnificativă a prezenței virusurilor Torque teno (p=0.002 ; OR=2.2391 ), în cadrul lotului
pacienți, fiind prezente la 80% dintre femeile din lotul pacienți .

Figura 10. Factori în cazul cărora am obținut valori semnificative 05101520253035
TTV+ Hepatită viralăPacienți
Controli

52

TTV se caracterizează printr -o prevalență ridicată în populația generală. Posibila
implicare a acestor virusuri în patologiile umane a fost dezbătută încă de la descoperirea lor.
Concluziile studiului asemănător făcut în România a fost acela că virusul Torque ten o are
valoare semnificativ mai mare la pacienții cu cancer de sân, i a evidențiat distribuția
preferențială a infecțiilor cu TTV la pacienții cu cancer de sân sporadic (Cimponeriu Gh.,
2012).
Greutatea pare să fie asociată cu riscul pentru boală ( p=0.006 ), în acest caz rezultatele
arată diferențe semnificative din punct de vedere statistic. Datele din literatură ne arată faptul
că femeile supraponderale sau obeze prezintă un risc crescut de cancer mamar invaziv față de
femeile cu greutate normală ( Neuhouser ML i colab., 2015). S e pare că aproximativ 50%
dintre pacienți iau în greutate în perioada post -operatorie, însă cre terea medie în greutate î n
randul supraviețuitorilor de cancer de sâ n pe termen lung este mic (Dimitrios Vagenas , 2015).
Nu am observat asocieri semnificative între înălțimea subiecților i cancerul de sân
(p > 0.05 ).

Tabelul 9 . Rezultatele comparării datelor înregistrate pentru subiecții incluși în acest
studiu
Nr.
crt. Factor testat Pacienți vs control Rezultat
1. Consumul de alcool+fumători
vs restul 7/33 vs 2/38 OR= 3.3707
IC:95% 0.782 >4.03> 20.761
p= 0.076869
2. Consumul de alcool+sedentari
vs restul 5/35 vs 3/37 0R= 1.3521
IC:95% 0.392 >1.762> 7.929
p= 0.456057
3. Consumul de alcool+ exerciții
fizice ocazionale vs restul 3/37 vs 5/35
0R= 0.4356
IC:95% 0.126 >0.568> 2.554
p= p=0.456057
4. Consumul de alcool+ mediul
urban vs restul 6/34 vs 3/37 0R= 1.6235
IC:95% 0.504 >2.176> 9.391
p= 0.288467

53
5. Consumul de alcool+ naveta
vs restul 2/38 vs 2/38 0R= 1.026
IC:95% 0.134 >1> 7.47
p=1
6. Consum de alcool + mediu
rural vs. restul 1/39 vs 4/36 0R= 0.2635
IC:95% 0.025 >0.231> 2.163
p= 0.165857
7. Fumători + sedentari vs. restul 11/29 vs 2/38 OR= 5.818
IC:95% 1.481 >7.207>
35.068
p=0.00638
8. Fumători + efort fizic
ocazional vs. restul
5/35 vs 5/35
OR= 0.6761
IC:95% 0.266 >1> 3.763
p=1
9. Fumători + mediu urban vs.
restul

9/31 vs 5/35 OR= 1.2394
IC:95% 0.615 >2.032> 6.716
p= 0.239204
10. Fumători + mediu rural
vs. restul 3/37 vs 0/40 OR=0
IC:95% 1.65 >2.081> 2.625
p= 0.031659
11. Fumători + navetă vs. restul 5/35 vs 3/37 OR= 1.3521
IC:95% 0.392 >1.762> 7.929
p= 0.456057
12. Sedentari + mediu urban vs.
restul 11/29 vs 8/32 OR= 0.8052
IC:95% 0.536 >1.517> 4.293
p= 0.430592
13. Sedentari + mediu rural vs.
restul 6/34 vs 4/36 OR= 1.0933
IC:95% 0.412 >1.588> 6.122
p= 0.498962
15. Sedentari + navetă vs. restul 4/36 vs 3/37 OR= 1.0947
IC:95% 0.286 >1.37> 6.559
p= 0.692348
16. Efort fizic ocazional + mediu
urban vs. restul 15/25 vs 8/32 OR= 1.2306
IC:95% 0.879 >2.4> 6.556

54
p= 0.083776
17. Efort fizic ocazional + mediu
rural vs. restul 1/40 vs 1/40 OR= 1.4322
IC:95% 0.06 >1> 16.562
p=1
18. Efort fizic ocazional + navetă
vs. restul 6/40 vs 0/40 OR=0
IC:95% 1.666 >2.111> 2.676
p= 0.002567
Tabelul 9 . Rezultatele comparării datelor înregistrate pentru subiecții incluși în acest
studiu (continuare)
Analiza statistică a datelor a relevat o asociere între fumat i stilul de viață sedentar.
Diferențele sunt semnificative între cele două loturi în ceea prive te fumătorii care sunt
sedentari (p=0.00638 ).
În mod surprinzător nu s -au găsit asocieri semnificative între cancerul de sân i
consumul de alcool sau locul de domiciliu al persoanelor participante la studiu
(urban/rural/naveti ti). În schimb, diferențele sunt semnificative din punc t de vedere statistic
în cazul persoanelor care depun efort fizic ocazional i sunt naveti ti ( p= 0.002567 ).
În ceea ce prive te restul rezultatelor obținute în cazul analizei multivariate,
diferențele nu ating pragul mi nim al semnificației statistice (Tabel 9.).
În cadrul studiului efectuat,în ceea ce prive te factorul genetic studiat ( mutații în
exonul 2 al genei BRCA1 ), în urma analizei electroforetice a produ ilor de amplificare
rezultați din reacția PCR a genei BRCA1 provenind atât de la pacientele cu cancer cât i de la
cele control (sănătoase din punc t de vedere clinic ), nu s -a găsit mutația.
Absența mutațiilor în exonul 2 al genei BRCA1 a fost confirmată și prin analiz a
heteroduplex urilor. După cum s -a observat i în gelul de poliacrilamidă, s -a putut constata
faptul că toate prob ele au un profil similar de benz i (Figua 8.). 185delAG este o mutație
specifică , localizată în exonul 2 al genei BRCA1, foarte des întâlnită î n rândul populației
Ashkenazi. Mai mulți factori contribu ie la această frecvență ridicată, inclusiv căsătoriile
consangvine i fenomenul cunoscut ca efectul fondatorului în popul ațiile de evrei Ashkenazi.
Această mutație nu este prezentă exclusiv la indivi zii acestei populații (Dillenburg Crisle
Vignol i colab., 2012) . Un studiu a arătat că mutația 185delAG apare, de asemenea, în rândul
indivizilor evrei de origine marocană, yemenită și iraniană la rate comparabile cu cele ale
evreilor A shkenazi (Bar -Sade R.B i colab., 1998). Cu toate acestea, frecvența mutației în
populațiile non -evreie ti este redusă (mutația provenind într-o populație mică an cestrală de

55
evrei Ashkenazi în care consangvinizarea era frecventă), astfel în Regatul Unit frecvența
alelelor mu tante BRCA1 este cuprinsă între 0,0013 i 0,0017 (comparativ cu 0,1-0,2 la evreii
Ashkenazi) ( Khourny M i colab., 200 4), aceste cifre indicând faptul că mutația 185delAG
este destul de rară în populația generală.

56

CONCLUZII

În urma rezultatelor obținute în cadrul acestei lucrări se pot formula următoarele concluzii:
1. Studiul efectuat a vizat testarea unor potențiali factori de risc în cazul formelor
sporadice de cancer de sân în cadrul unui studiu de tip caz -control care a i nclus 80
de subiecți (40 pacien ți i 40 controli).
2. Prelucrarea statistică a datelor obținute de la pacienți i controli a evidențiat că unii
factori de risc pot contribui la riscul de boală; riscul de boală a fost asociat mai
ales cu vârsta, cu prezența virusurilor Torque teno ( p=0.002 ) i cre terea greutății
corporale (p=0.006 ).
3. În loturile studiate cancerul de sân nu a fost asociat cu mediul în care se găse te
domiciliul, imobilizare la pat, înățim ea, numărul de sarcini, numărul de avorturi
declarate etc..
4. În cadrul loturilor studiate nu am identificat nicio mutație la nivelul exonului 2 al
genei BRCA1 .

57
BIBLIOGRAFIE

1. Aatur D. Singhi, Ashley Cimino -Mathews, Robert B. i colab. ,2012 . MYC Gene
Amplification is Often Acquired in Lethal Distant Breast Cancer Metastases of
Unamplified Primary Tumors. Mod Pathol, 25(3): 378 –387.
2. Anastasiadi Z, Lianos GD2, Ignatiadou E., Harissis HV, Mitsis M. , 2017 . Breast
cancer in young women: an overvie w. Updates Surg . doi: 10.1007/s13304 -017-0424 –
1)
3. Autier P, Boniol M, La Vecchia C et al. , 2010 . Disparities in breast cancer mortality
trends between 30 European countries: retrospective trendanalysis of WHO mortality
database . BMJ ; 341: c3620 .
4. Bagnardi V, Rota M, Botteri E, et al. , 2013 . Light alcohol drinking and cancer: a
meta -analysis. Ann Oncol . 24:301–308.
5. Balekouzou Augustin, Ping Yin i colab. , 2017 . Reproductive risk factors associated
with breast cancer in women in Bangui: a case –control study; BMC Womens Health
17: 14 .
6. Bar-Sade, R.B.; Kruglikova, A.; Modan, B.; Gak, E.; Hirsh -Yechezkel, G.; Theodor,
L.; Novikov, I.; Gershoni -Baruch, R.; Risel, S.; Papa, M.Z.; Ben -Baruch, G.;
Friedman, E. (1998): The 185delAG BRCA1 mutation originated before the
dispersion of Jews in the Diaspora and is not limited to Ashkenazim. Human
Molecular Genetics, 7(5): 801–805.
7. Bediaga Naiara G, Amelia Acha -Sagredo, Isabel Guerra, Amparo Viguri, Carmen
Albaina i colab. , 2010 . DNA methylation epigenotypes in breast cancer molecular
subtypes. Breast Cancer Res. 12(5): R77 .
8. Catsburg C1, Miller AB, Rohan TE , 2015. Active cigarette smoking and risk of breast
cancer. Int J Cancer . ;136(9):2204 -9
9. Cimponeriu Danut, Daniela Adriana, T oma Mihai i colab. , 2013. Potential
implication of genetic polymorphisms and Torque teno virus in sporadic breast
cancer .Romanian Biotechnological Letters Vol. 18, No.1.
10. DeSantis CE., Fedewa SA., Goding Sauer A., Kramer JL4., Smith RA5., Jemal A.,
2016. B reast cancer statistics: Convergence of incidence rates between black and
white women. CA Cancer J Clin 66(1), 31 -42.

58
11. Dieterich Max, Johannes Stubert, Toralf Reimer, Nicole Erickson, and Anika
Berlingb , 2014. Influence of Lifestyle Factors on Breast Cancer Risk. Breast Care
(Basel). 9(6): 407–414.
12. Dillenburg Crisle Vignol, Isabel Cristina Bandeira, Taiana Valente Tubino, Luciana
Grazziotin Rossato, Eleonora Souza Dias, Ana Cristina Bittelbrunn, and Sandra
Leistner -Segal 2012. Prevalence of 185delAG and 5382insC mutations in BRCA1,
and 6174delT in BRCA2 in women of Ashkenazi Jewish origin in southern Brazil .
Genet Mol Biol . 35(3): 599 –602.
13. Duan W, Li S, Meng X, Sun Y, Jia C. , 2017 . Smoking and survival of breast cancer
patients: A m eta-analysis of cohort studies . Breast 31;33:117 -124.
14. E. Altobelli i A. Lattanzi. , 2014 . Breast cancer in European Union: An update of
screening programmes as of March. Int J Oncol. 45(5), 1785 –1792 .
15. E. Senkus , S. Kyriakides , S. Ohno , F. Penault -Llorca , P. Poortman s, E. Rut ger,
Zackrisson F., 2015 . Primary breast cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines for
diagnosis, treatment and follow -up. Ann Oncol 26, 8 -30.
16. Edge S.B. & Compton, C.C. , 2010 . The American Joint Committee on Cancer: the
7th Edition of the AJCC Cancer Staging Manual and the Future of TNM. Ann Surg
Oncol 17(6),1471 -4.
17. Esteller M. 2008 Epigenetics in cancer. N Engl J Med .;358:1148 –1159
18. F. Lerebours, R. Lidereau ,2002 . Molecular alterations in sporadic breast cancer
Oncology/Hematology 44:121 -141,
19. Fu- Hsiung Su , Shih-Ni Chang, Pei -Chun Chen, Fung -Chang Sung, Chien -Tien Su
and Chih -Ching Yeh, 2011. Association between chronic viral hepatitis infection and
breast cancer r isk: a nationwide population -based case -control study. BMC Cancer
11:495.
20. Giordano L, von Karsa L, Tomatis M et al. , 2012 . Mammographic screening
programmes in Europe: organization, coverage and participation. J Med Screen ;
19(Suppl 1): 72 –82.
21. Giordano SH. , 2005 . A review of the diagnosis and management of male breast
cancer. Oncologist. 10(7):471 -9.
22. Gnerlich JL, Deshpande AD, Jeffe DB, et al. , 2011 . Poorer survival outcomes for male
breast cancer compared with female breast cancer may be attributable to in -stage
migration. Ann Surg Oncol. 18:1837–1844 .

59
23. Hanahan D, Weinberg RA. , 2011. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell;
144:646 -74.
24. Hiroko Masuda, Dongwei Zhang i colab. , 2012 . Role of Epidermal Growth Factor
Receptor in Breast Cancer Breast Cancer Res Treat 136(2): 10.1007/s10549 -012-
2289 -9.
25. Huiyan Ma, Giske Ursin, Xinxin Xu, Eunjung Lee, Kayo Togawa, Lei Duan i colb. ,
2017. Reproductive factors and the risk of triple -negative breast cancer in white
women and African -American women: a pooled analy sis. Breast Cancer Res 19: 6.
26. Huzarski T, Byrski T, Gronwald J, Gorski B, Domagala P, Cybulski C, et al. , 2013 .
Ten year survival in patients with BRCA1 -negative and BRCA1 -positive breast
cancer. J Clin Oncol . 31:3191 –6.
27. Jae W. Song, i Kevin C. Chung , 2010. Observational Studies: Cohort and Case –
Control Studies. Plast Reconstr Surg 126(6): 2234 –2242.
28. Johannes Stubert, Toralf Reimer, Nicole Erickson, and Anika Berlingb. , 2014.
Influence of Lifestyle Factors on Breast Cancer Risk Max Dieterich Breast Car e Dec;
9(6): 407–414
29. Kamińska Marzena, Tomasz Ciszewski, Karolina Łopacka -Szatan, Paweł Mi otła, and
Elżbieta Starosławska, 2015 . Breast cancer risk factors. Prz Menopauzalny. 14(3):
196–202.
30. King MC, Marks JH, Mandell JB , 2003. New York Breast Cancer Study Group.
Breast and ovarian cancer risks due to inherited mutations in BRCA1 and BRCA2.
Science 302(5645):643 -6.
31. Kiven Erique Lukong 2017. Understanding breast cancer – The long and winding road
32. Larrey D, Bozonnat MC, Kain I, Pageaux GP, 2010 . Assenat E: Is chronic hepatitis C
virus infection a risk factor for breast cancer?. World J Gastroenterol. , 16 (29): 3687 –
3691
33. Levin Kate Ann , 2006. Study design III: Cross -sectional studies Evidence -Based
Dentistry 7, 24–25.
34. Lindor NM, McMaster ML, Lindor CJ, et al. , 2008. Concise handbook of familial
cancer susceptibility syndromes – second edition . J Natl Cancer Inst Monogr (38): 1 –
93.
35. Lynch BM, N eilson HK, Friedenreich CM, 2011. Physical activity and breast cancer
prevention. Recent Results Cancer Res , 186:13–42.

60
36. Manas Kotepui, 2016. Diet and risk of breast cancer Contemp Oncol (Pozn). 20(1):
13–19.
37. Margaret E. McLaughlin -Drubin and Karl Munger, 2008.Viruses Associated with
Human Cancer. Biochim Biophys Acta 1782(3): 127 –150.
38. Morabia A. , 2004. A History of Epidemio logic Methods and Concepts. American
Journal of Epidemiology . Vol. 161, No. 6 .
39. Neuhouser ML, Aragaki AK, Prentice RL, Manson JE, Chlebowski R, Carty CL,
Ochs -Balcom HM, Thomson CA, Caan BJ, Tinker LF, Urrutia RP, Knudtson J,
Anderson GL, 2015. Overweight, Obesity, and Postmenopausal Invasive Breast
Cancer Risk: A Secondary Analysis of the Women's Health Initiative Randomized
Clinical Trials. JAMA Oncol . 1(5):611 -21.
40. Passarelli Michael N., Polly A et al, 2016. Cigarette Smoking Before and After Breast
Cancer Diagnosis: Mortality From Breast Cancer and Smoking -Related Diseases J
Clin Oncol. 34(12): 1315 –1322 .
41. Petrucell Nancie i, MS, Mary B Daly, MD, PhD, and Tuya Pal, 2016. BRCA1 – and
BRCA2 -Associated Hereditary Breast and Ovarian Cancer. GeneReviews
42. Ping Li, RN, Jialing Huang, Huina Wu, Cuixia Fu, Yun Li, Jiajia Qiu , 2016. Impact
of lifestyle and psychological stress on the development of early onset breast cancer.
Medicine (Baltimore) 95(50): e5529.
43. Shrubsole MJ1, Lu W, Chen Z, Shu XO, Zheng Y, Dai Q, Cai Q, Gu K, Ruan ZX,
Gao YT, Zheng W. , 2009. Drinking green tea modestly reduces breast cancer risk. J
Nutr. 139(2):310 -6.
44. Singletary S. Eva MD†, FACS, Dr. James L. Connolly MD , 2006 . Breast Cancer
Staging: Working With the Sixth Edition of the AJCC Cancer Stag ing Manual. CA:A
cancer Journal for Clinicians .56, 37 -47.
45. Szumilas Magdalena, 2010 . Explaining Odds Ratios. J Can Acad Child Adolesc
Psychiatry . 19(3): 227 –229.
46. Vagenas Dimitrios, Tracey DiSipio,corresponding, Diana Battistutta, Wendy Demark –
Wahnefried, Sh eree Rye, John Bashford, Chris Pyke, Christobel Saunders, and Sandra
C Hayes , 2015. Weight and weight change following breast cancer: evidence from a
prospective, population -based, breast cancer cohort study. BMC Cancer 15: 28.
47. van Hoesel AQ, Sato Y, Elash off DA, Turner RR, Giuliano AE, Shamonki JM,
Kuppen PJ, van de Velde CJ, Hoon DS. , 2013. Assessment of DNA methylation status
in early stages of breast cancer development. Br J Cancer 108(10): 2033 –2038.

61
48. Wang Y, Xu M, Ke ZJ, Luo J., 2017 .Cellular and mole cular mechanisms underlying
alcohol -induced aggressiveness of breast cancer. Pharmacol Res ;115:299 -308.
49. World Cancer Research Fund/American Institute for Cancer Research (AICR) 2007.
Food, nutrition, physical activity, and the prevention of cancer: a globa l perspective.
Washington, DC: AICR;
50. World Health Organization Regional Office for the Eastern Mediterranean, 2006 .
Guidelines for the early detection and scr eening of breast cancer, Cairo.
51. Wu Y, Zhang D, Kang S. , 2013 . Physical activity and risk of breas t cancer: a meta –
analysis of prospective studies. Breast Cancer Research and Treatment ; 137(3):869 –
882.
52. Xin Wang, Shu -Mei Huong i colab. 2004 Epidermal growth factor receptor is a
cellular receptor for human cytomegalovirus Nature 424 (6947), 456 -461.
53. Yanyuan Wu, Marianna Sar kissyan, and Jaydutt V. Vadgama, 2016 . Epigenetics in
Breast and Prostate Cancer. Methods Mol Biol 1238: 425 –466.
54. Yu Q, GengY, Sicinski P. , 2001 . Specific protection against breast cancer by ciclin D1
ablation. Nature ; 411:1017 -1021.
55. Zahra Ahmadnia i colab ., 2016 . Dietary Patterns and Risk of Breast Cancer in
Women in Guilan Province,. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention ,
17(10):4623 -4629.
Cărți:
56. Beca Lavinia Mariana, Nica Remus Iulian, Adascălului Marian, Radu Irina,
Cimponeriu Gheorghe Dănuț , 2016. Factori de risc implicați în apariția cancerului de
sân, Editura Universitară .
57. Burco T, Popa E, Zodieru I, Bordea A, Voiculescu S, Anghelescu N, 2003. Locul
chirurgiei conservatoare în cadrul tratamentului complex al cancerulu i de sân,
Chirurgia vol 98 .
58. Cîrstoiu Monica Mihaela , 2015. Tratat de patologie mamară în copilărie i
adolescență. Ed. Universitară Carol Davila .
59. Diaconu Corneliu , Lucian Miron , Eugen Carasevici, 1994. Cancerul mamar –
Diagnostic, principii de tratament, factori prognostici. Ed. Cariatide .
60. Khourny, M., Little, J., & Burke, W. (2004): Human Genome Epidemiology. Oxford
University Press

62
61. Lo, Y.M .; Chiu, R.W.; Chan, K.C. 2006 : Clinical Applications of PCR. Second
Edition. Humana Press Inc.
62. Miscalencu Dumitru, 2005 . Cancerizarea chimică, Ed. Universitatea Bucure ti .
63. Papilan Victor, 1993. Anatomia omului vol.2 Editura All.
64. Peltecu Gh., 2003. Tratamentul conservator al cancerului ma mar incipient, Ed
Universitară Carol Davila .
65. Popescu I, 2008 . Tratat de chirurgie, vol III Chirurgie generală, Editura Academiei
Române, Bucure ti.
66. Renee Sophie Cornelis , 1995. Breast Cancer Genetics pag 3
67. Sambrook i Russell , 2001. Molecular Cloning a lab oratory manual Cold Spring
Harbor Laboratory Press, New York.

Site-uri:
1. http://www.who.int/cancer/detection/breastcancer/en/index3.html 21.04 .2017
2. https://cancerstatisticscenter.cancer.org/#/cancer -site/Breast 31.03 .2017
3. https://www.cancer.gov/about -cancer/causes -prevention/ge netics/brca -fact-
sheet#q1 14.04.2017
4. https://www.cancer.org/cancer/breast -cancer/about/how -common -is-breast –
cancer.html 02.03 .2017
5. American Cancer Society 2014. The history of cancer
https:/ /www.cancer.org/cancer/cancer -basics/history -of-cancer.html 06.03.2017
6. American Cancer Society, 2016. Breast Cancer Facts & Figures 2015 -2016.
Atlanta Inc https://www.cancer.org/research/cancer -facts -statistics/breast -cancer -facts
figures.html 15.03 .2017
7. http://canceratlas.cancer.org/the -burden/breast -cancer/ 30.03.2017
8. https://www.omim.org/entry/113705?search=BRCA1&highlight=brca1
24.04 .2017
9. https://www.omim.org/entry/164870?search=ERBB2&highlight=erbb2
24.04 .2017
10. https://www.cancer.gov/ty pes/breast/risk -fact-sheet/ 31.03
11. http://www.nationalbreastcancer.org/breast -anatomy 03.04.2017
12. http://www.nationalbreastcancer.org/growth -of-breast -cancer 03.04 .2017
13. http://www.breastcancer.org/risk/factors/genetics 14.04.2017

63
14. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/2064 20.04 .2017
15. https://www.omim.org/entry/190080?search=MYC&highlight=myc
25.04 .2017
16. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK222350/ 2.05 .2017
17. https://www.ncbi.nlm .nih.gov/pubmed/25340237 06.05.2017
18. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11705483 19.05. 2017