Testarea qf -PCR în sarcina cu risc de anomalii [632073]

1
Universitatea București
Facultatea de Biologie

TEZӐ DE DIZERTAȚIE

Testarea qf -PCR în sarcina cu risc de anomalii
cromozomiale

Coordonator : Conf. Cimponeriu Dan

Masterand: [anonimizat]

2017

2
Cuprins:
Partea generală:
I. Diagnosticul prenatal…………………………………………………………..4
II. Screeningul bolilor genetice în sarcină ………………………………… ……13
-teste de screening trimestrul 1.………………………………………………15
-teste de screening trimestrul 2………………………………………………18
-tehnici de diagnostic prenatal……………… ..…… .…………………………21
III. Amnioc enteza în diagnosti cul prenatal………………………………… .…….25
-metoda tehnică de realizare a amniocentezei…………………………………25
-riscuri ……… ………………………………………………………………….27
-interpretarea rezultatelor…………………………………………………….. 28
IV. Testarea rapidă………………………………………………………………..37
-qf-PCR ……………………………………………………………………….37
-testarea non invazivă………………………………………………………… 40
-ghiduri europene pentru diagnosticul prenatal………………………………40

Partea experimentală :
V. Materiale necesare…………..…………………………..………………………42
-metoda de lucru……………………………………….………………………42
VI. Diagosticul prenatal al sindroamelor cromozomiale………………………… ..45
-pacienții…………………………………………………………………… …45
-recoltarea probelor………………………………………………………… …47
VII. R ezultate…………….. ……………………………………………………… ..51
VIII. Discuții …..……………………………………………………………………54
IX. Concluzii .. ……………………………… ………………………………… .….55

Bibliograf ie…………………………………………………………………………56

3
Introducere

Diagnosticul pre natal este un domeniu care s -a dezvoltat în cadrul Centrelor de Medicină Ma terno –
Fetală. Acestea integrează informațiile obținute î n cursul evaluarii riscului genetic din timpul sarcinii, și
ulterior, acolo unde riscul este crescut fie pentru o anomalie cromozomială fie pentru alte afecțiuni cum ar
fi bolile monogenice, oferă parinț ilor posibilitatea diagnosticului prenatal.
Ȋntrucât accesul la informații pentru pacienți este foarte facil, aceș tia caută și acceptă această testare,
conștienți fiind de consecințele bolilor genetice asupra fătului.
Totodată sunt disponibile metode performante de screenin g. În prezent analiza AND fetal liber din
plasma maternă pentru cele mai comune trisom ii 13,18,21 are o rata de detecț ie de peste 99% și rata de fals
pozitivitate de numai 0,1%. Pe de alt ă parte, ec ografia de screening a malformaț iilor fetale combinată cu
determinarile biochim ice din serul matern are o rată de de tecție de 95% în primul trimestru de sarcină pentru
trisomiile 13,18,21.
De asemenea pot fi testate adițional boli genetice rare (ex.: acondroplazia) pornind de la semne
ecografice sugestive.
Ȋn cazul familiilor cu boli genetice cunoscute , pacienții au opțiunea informată de testare și șansa de
a avea un copil sănătos. Diagnosti cul prenatal sau preimplantațio nal este posibil însă numai după
diagnosticul genetic al bolii genetice cu risc de transmitere familială.
Încadrare a în standardele europene de îngrijiri prenatale, de dezvoltare simultană a celor mai noi și
performante meto de de analiză trebuie să fie preocuparea principală a centrelor de medicină Materno –
Fetală.

4
Diagnosticul prenatal

Diagnosticul prenatal are rolul de a stabili dacă în cazul sarcinilor cu risc crescut de anomalii
cromozomiale fătul este sau nu afectat . Acesta implică screening -ul non invaziv în timpul sarcinii pentru
identi ficarea cazurilor cu risc de anomalii cromozomiale , sau î n cazul antecedentelor familiale de boli
genetice și risc de recurență crescut, diagnostic ul prenatal specific fiecarei afecțiun i în parte.
Procedurile diagnosticului prenatal sunt țint ite pentru a descoperi anomalii fetale (cromozomiale, boli
monogenice, defecte metabolice). Testele diagnos tice au nevoie de celule fetale și de aceea se
efectuează manevre invaz ive cu scopul de a preleva aceste celule și de a oferi un diagnostic cât mai clar
și complet asupra bolii fătului . Astfel, cuplul poate analiza toate opțiunile posibile și o poate alege pe
cea care i se potriveste cel mai bine. Acestea sunt : ȋntreruperea sarcinii, terapie fet ală (unde este posibil)
sau pregătire pentru nașterea unui copil bolnav (Puri and Trivedi,2010)1.
Cuplurile interesate de riscul pentru boli genetice ale copilului ar trebui să opteze pentru consiliere a
genetică precon cepțională. Aceasta reprezintă un proces de comunicare în ceea ce priveste apariția
bolilor ereditare și riscul de recurență a l unei anomalii genetice ȋntr -o familie. Scopul este de a-l face
pe pacient să ȋnțeleagă cât mai clar afecț iunea și consecinț ele acesteia, precum și toate posibili tățile de
diagnostic, tratament și opțiunile de diagnostic prenatal. Consilierea genetică ajută de asemenea
familiile în a avea o viziune clară asupra problemei și ȋn luarea informată a unei decizii.
Doctorul trebuie să empatizeze cu pacientul. Trebuie să știe cum și când să recomande un test, cum
să confirme diagnosticul, să cunoască acuratețea și limitele testului, să știe testele disponibile pentru a
detecta starea de purtător, heterogenicitatea bolii, importanța comorbiditaților, riscul de recurență,
modul de transmitere, calitatea vieții asociată cu supraviețuirea, prognosticul vital. Când este relevant,
trebuie știute metodele de tratament și eficacitatea lor.
Este necesar ca medicul să informeze pacientul asupra indicațiilor testarii invasive și să explice
tehnica pentru recoltarea probei (LA, vilozități coriale), limitele și riscurile asociate testării , riscul de
anomalii cromozomiale ale fătului, și când este cazul toate aspectele referitoare la avortul electiv al
unui făt anormal.
Consilierea genetică
Limbajul simplu și clar , alocarea unui timp adecvat, sensibilitatea pot fi elemente cheie ale unei
consilieri potrivite pentru pacient . Felul în care este descrisă o problemă, modul de a vorbi al medicului
îl poate influența pe pacient în luarea u nei decizii. Consilierea trebuie să treacă prin trei întrebari cheie:
“De ce ați venit?”, “Ce sperați să aflați?”, “Am răspuns tuturor intrebărilor și ȋngrijorărilor dvs?”. Felul
ȋn care sunt explicate riscurile este foarte important pentru înțelegerea pac ientului. Trebuie avute ȋ n

5
vedere atât educația cât și gradul de înțelegere al pacienților. Cu cât este mai simplu și bine explicat cu
atât cresc șansele ca pacientul să înțeleagă cu adevarat situația. Este foarte important feed -back -ul
primit de la pacien t pentru ca medicu l să fie sigur că pacientul a înțeles explicațiile acestuia. Totodată,
pe lângă calificarile și cunoștiințele medicale, medicul trebuie să aibă în vedere atitudinea, limbajul
corporal, căldura, manierele, vestimentația, tonul vocii și pe rsonalitatea întrucât acestea participă la
credibilitatea și acceptarea consilierii.
Criteriile esențiale ale unei consilieri empatice sunt (Milunsky and Milunsky ,2010 )2:
1. Întelegerea problemei și empat ia pentru pierderea suferită de pacient (ex: un copil, avorturi
recurente, un părinte afectat dec edat, o pacientă care a suferit o masectomie ș i a facut chimioterapie
pentru cancer de sân cu fiica cu risc de a face boala )
2. Înțelegerea durerii psihologice și stresul unui cuplu cu experințe dureroase (ex: avorturi repetate
urmate de procedura FIV cu obținerea unei sarcini cu făt anormal)
3. Aprecierea efortului unui cuplu de a trece prin momente dificile
4. Recunoașterea dificultății luării unei decizii atunci când se înfrunta cu un diagnostic prenatal al
unei af ecțiuni care se transmite de la unul din părinți (ex: sentimentele de vinovație ale unei mame
purtatoare de maladie cu transmitere X -linkată. Explicația faptului că toți suntem purtători de gene
afectate ajută.)
5. Înțelegerea nevoii pacientului pentru speran ță și suport

Importanța stabilirii unui diagnostic în cadrul consultului genetic
Medicii întalnesc des pacienți în căutarea unui sfat genetic din cauza unei boli genetice î n familie.
Un copil, un frate sau un părinte decedat ar fi putut avea boala î n cauză. Consilierea genetică nu poate
incepe, totuși, fără un diagnostic precis. Informațiile certe despre diagnosticul anterior sunt importante
nu numai pentru comunicarea riscului de recurență dar și pentru diagnosticul prenatal. Nu este suficient
să se știe că copilul a avut o boala lizozomală ; tipul exact, chiar subtipul trebuie determinat deoarece
fiecare poate avea diferite tipuri de deficiență enzimatică. Un istoric de distrofie musculară nu va facilita
diagnosticul prenatal deoarece sunt două tipur i clasice (Duchenne/Becker), precum nici un istoric de
epilepsie nu dă o indicație clară despre care dintre cele 45 de gene sunt implicate. Conștientizarea
heterogenității genetice precum și a variantelor fenotipice intra – și interfamiliare a le unei boli g enetice
(ex: scleroza tuberoasă) este necesară. În loc să accepte descrierea pacientului despre boală – distrofie
musculară sau mucopolizaharidoză – medicul trebuie să obțină date care să confirme acest lucru.
Fotografii ale persoanei afectate, fișe medicale , rezulatate al e găsirii stării de purtător, alte teste
efectuate în altă parte sau alte informații ar putea da informații cruciale ȋn confirmarea sau infirmarea
diagnosticului pus anterior.

6
Sfatul genetic trebuie să fie nondirectiv astfel încât să exprim e cât mai complet informația, dar să
ramană imparțial și obiectiv. Datoria medicului este de a comunica toată informația disponibilă și apoi
să ajute pacientul pentru a face posibilă dec izia corectă, totodată ținând cont și de priorități le, credințe le,
temerile și alte preocupari a pacientului. A rămâ ne imparțial este dificil și uneori este nevoie de mult
timp și efort. A interfera cu decizia pacientului prin exprimarea propriilor credințe constituie un afront
moral la intimitatea personală și la autonomia reproductivă.
Mai multe probleme ar trebui rid icate de că tre consilierul genetic. Comunicarea nu ar trebui să
depindă doar de întrebarile puse de pacient, care ar putea sa nu fie conștient de dimensiunile subiectului
sau de opțiunile sale. De exemplu, pen tru un cuplu cu un risc crescut de a avea un copil cu întarziere
severă în dezvoltare , medicul ar trebui să exploreze consecințele în relațiile din cuplu, efectul pe care
ȋl va avea asupra celorlați copii ai cuplului, posibilitatea de stigmatizare socială precum și implicațiile
economice și sociale. Mulți consideră că povara economică nu ar trebui menționată deloc în consilierea
genetică, iar în relația medic -pacient grija pentru individ ar trebui să primeze în fața nevoiilor societății.
Un cuplu poate op ta pentru amniocenteză atunci când îi este indicată, fară dorința de a întrerupe
sarcina dacă fătul este afectat. Unii ar putea nega acestor cupluri oportunitatea diagnosticului prenatal.
Toate cuplurile au dreptul de a avea informații despre copilul lor i ar diagnosticul prenatal este o tehnică
fundamenală pentru a realiza acest lucru . Mai mult de 95% din astfel de cupluri nu au nevoie să ia în
considerare avortul electiv. Dintre cei puțini care inițial sunt ambivalenți aproape invariabil se hotărăsc
să întrerupă sarcina după aflarea unui rezultat pozitiv pentru o anomalie cromozomială . Cu toate
acestea, avortul poate fi declinat după diagnosticul prenatal, în cazul unui rezultat pozitiv pentru
trisomia 21. Grija pentru individ include oferirea, pentru c uplurile ambivalente, a reasigurării că
alegerea pe care au facut -o este cea potrivită pentru ei.
Există situații când pacienții pot refuza amniocenteza chiar ȋn cazul unui risc crescut. Astfel medicul
trebuie să atașeze la dosarul pacientului o fișă semna tă cu refuzul acestuia, pentru asigurarea medicului
împotriva malpraxisului.
Confidențialitatea mai importantă ca sănătatea?
Încă de pe vremea lui Hipocrate, medicii adesea ascundeau adevărul pacienților, pentru a -i scuti de
un stres emoțional. Pe măsură c e s-a recunoscut schimbarea modernă despre moralitate s -a concluzionat
că spunerea adevarului este “moral obligatoriu”. În anumite situații în consilierea genetică este posibil
ca anumite fapte să fie deliberat distorsionate, diminuate sau chiar ascunse.
Medicul poate să nu stabilească un diagnostic exact, să nu fie sigur de statutul de purtător al unui
individ sau să nu spună cu acuratețe evoluția unei sarcinii atunci când rezultatele investigatiilor sunt
necon cludente sau sunt necesare testă ri supliment are. Indiferent cât de greu este, pacientul trebuie să
înțeleagă aceste limitări.

7
În cursul studiului diagnosticului prenatal, pot fi necesare probe sangvine de la părinți pentru a
elucida o posibilă dificultate diagnostică. Ocazional, asemenea studii rele vă neașteptat nonpaternitatea.
A nu divulga această informație tatălui ar putea avea implicații legale. Managementul și re zolvarea unei
asemenea situații va avea în vedere cel mai adesea natura problemei . Descoperirile, precum și problema
nonpaternității, vor fi spuse ȋntâi mamei dar și documentate în registrul medical.
Extinderea indicațiilor pentru testare a prenatală și folosirea tehnicilor de genetică moleculară pentru
detectarea statusului de purtător vor duce la creșterea frecvenței de descoperire a no npaternității.
Avertismentul că rata infidelității este mai mare decât rata de erori ȋnnascute de metabolism nu ar trebui
rezervată doar pentru specialiș ti. Managementul este invariabil complicat atât medical, etic cât și legal.
Un principiu important este că un partener masculin nonpurtător nu ar trebui indus in eroare.
Acțiunile pe care trebuie să le facă medicul după diagnosticul de purtător de boală cu transmitere
X-linkată sunt mai multe decât simpla supreveghere prenatală ȋn u rmatoarele sarcini. Este o obligație
ȋmpărtășirea informației cu surorile unei asemenea paciente. Cu toate acestea, pacienta poate interzice
medicului să transmită informația chiar unei surori aflată la risc, ȋn ciuda consensului internațional că
indivizii sunt obligați moral să comunice informațiile genetice familiilor lor. O viziune întărită de
justiție spune că este o datorie să avertizezi rudele la risc indiferent de legea confidențialității. Acordul
anterior de a contacta rudele este o altă opțiune. At unci când, pentru rudele la risc, un rău poate fi
anticipat, când boala poate fi tratată sau prevenită, sau când riscul poate fi redus prin monitorizare,
divulgarea este permisă. Răul care poate rezulta din nondivulgare ar trebui să cântarească mai mult
decât răul care poate rezulta din divulgare. În practică, marea majoritate a geneticienilor care decid să
nu avertizeze rudele sunt preocupați de problemele legale și de confidențialitate.
Indicațiile consultului genetic
Consilierea înainte de concepție sau mariaj poate oferi oportunitatea detectarii stării de purtător,
diagnostic ului preconcepțional sau prezentarea altor optiuni cum ar fi adopția . De aceea, momentul
optim pentru consiliere nu este în timpul sarcinii.
Medici i au datoria de a oferi informaț ii despre toate opțiunile știute, riscuri, beneficii și consecințele
prevăzute cuplurilor cu risc crescut de a avea un copil cu defecte genetice. Această datorie poate fi
dificilă dacă nu chiar imposibilă dacă participă doar un membru al familiei. Probleme le sunt de obicei
complexe, și frecvent accentuate de sentimente de vinovăție sau ignoranță, prejudecăți familiare,
obstacole religioase, frică sau diferențe de opinie între parteneri. De aceea este important ca ambii
parteneri să participe la consiliere. Nu de puține ori se întâmplă ca cei doi parteneri să înțeleagă lucrurile
diferit. De asemenea se întamplă des ca un părinte anxios să participe singur și apoi să relateze
interpretarea incorectă a problemei partenerului. Nici mă car documente medicale scrise dup ă o

8
consiliere (o procedură recomandată) nu pot substitui discuția față în fa ță cu ambii parteneri, permiț ând
schimbul de întrebări.
Medicii trebuie să se reorienteze ȋn educarea femeilor de vârstă fertilă să înțeleagă că șansele de a
avea un copil să nătos trebuie să se afle printr -o consiliere prenatală înainte de a rămâne însărcinată.
Descoperirea sau realizarea nonpaternității ȋn momentul diagnosticului prenatal este confruntată cu
probleme medicale, sociale și legale. Avertizarea despre potențiala descoperire a nonpaternității ca
parte a acordului informat anterior testării poate determina o femeie însărcinată să decline o biopsie de
vilozități coriale (CVS) sau o amniocenteză. În efortul de a nu face rău, medicul trebuie să solicite o
ședință de co nsiliere doar cu mama. Decizia ei, luată în confidențialitate va fi primară oricarei acțiuni.
Dacă, cu toate acestea, testarea partenerului prost atribuit are implicații genetice, nondivulgarea devine
nerealizabilă.
În cazul unei maladii genetice care afectează mai mulți membri ai unei familii, pacientul sau
medicul au obligația morală de a anunța rudele.
La prima vizită preconcepțională se fac documentari despre istoricul medical, obstetrical și familial.
Această activitate include o revizuire a rapoartelor medicale, fotografii, rapoarte anatomopatologice,
radiografii, tomagrafii computerizate, rezultate ale testelor genetice. Afecțiuni nedetectate anterior pot
fi descoperite acum pentru prima dată la această vizită și să fie importante pentru planificarea sarcinii
și să necesite viitoare teste diagnostice. Este important ca partenerul să participe măcar la prima vizită
preconcepție pentru a putea fi consultat și a oferii amănunte despre antecedentele lui familiale.
Partenerul poate fi diagnosticat cu o afecțiune genetică de care acesta să nu știe că ar putea fi ereditară,
precum ar fi: osteogenesis imperfecta, scleroza tuberoasă, neurofibromatoză, etc.
Preocupările pentru dezvoltarea fetală normală după expunerea la m edicamente, droguri ilicite,
substante chimice, infecții, agenți fizici sau boli ale mamei sunt cele mai des întâlnite motive pentru
consilierea genetică în timpul sarcinii. Multe dintre aceste anxietați și frecvente riscuri reale pot fi
evitate prin grija preconcepțională. Ȋn planning -ul preconcepțional este necesar să se dea atenție
“toxinelor” fetale cum ar fi: alcoolul, fumatul, droguri ilicite, a numite medicamente, radiațiile X.
Consilierea preconcepțională indentifică riscuri le specific e fiecărui cup lu în parte și oferă op tiuni,
printre care se gasesc și următoarele (Milunsky and Milinsky ,2010 )2:
1. Hotărârea de a nu avea copii
2. Adopția
3. Fertilizarea in vitro (posibil inseminare cu donator)
4. Transfer ul de gameți (intrafalopian) – donatoare ovocit
5. Insemina rea artificială cu donator
6. Testarea stării de purtător pentru boli recesive legate de cromozomul X

9
7. Diagnostic ul prenatal (CVS, amniocenteză)
8. Avort ul selectiv în cazul unui rezultat pozitiv .

Viitorii p ărinți trebuie să înțeleagă indicațiile specifice pentru teste prenatale precum și limitările
acestora. Frecvent, unul sau ambii membrii ai cuplului nu reușesc să înțeleagă cât de țintit va fi testul
respectiv. Pacienții pot avea impresia că toate cauzele de retard mental sau defecte congenitale vor fi
detectate sau excluse. Este important pentru medic să convingă cuplul că este important să participe
amândoi la consilierea pretestare, CVS sau amniocenteză , pentru a avea ambii aceeași informație și
pentru a putea pune între bări lămuritoare . Marele avantaj este că medicul poate să afle concomite nt și
antecedentele medicale ale cuplului și poate detecta o boală genetică (neanunțată sau nediagnosticată).
Ȋnainte de a face investigaț ii prenatale , ambii parteneri trebuie să înțe leagă limitările atât ale
analizelor de laborator cât și ale ecografiei . Pentru detecția de afecțiuni cromozomiale, cuplul trebuie
să fie atenținat de potențiala contaminare cu celule materne sau mozaicism. Durata examinării
cariotipului fetal sau alți par ametri biochimici trebuie comunicate de la început. Este cunoscută
anxietatea din perioada așteptării rezultatului. De aceea, trebuie oferită posibilitatea efectuării testului
rapid, care reduce din anxietate. O a doua amniocenteză este rar necesară, dar î n rare circumstanțe
examinarea sângelui fetal ramâne o opțiune ce ar putea fi discutată, în ciuda eventualității în care nu se
poate obține un rezultat din cauza eșecului de cultură celulară sau contaminare a probei. Toate
informațiile disponibile trebuies c comunicate.
Pacienților ar trebui să li se spună că diagnosticul prenatal are anumite LIMITE și ca nu există test
care să poată detecta toate bolile genetice. U n consimțămant informat trebuie semnat . Astfel pacienții
vor fi informați asupra posibilității (Milunsky and Milunsky) 2:
1. Eșecului de a oferi un diagnostic prenatal
2. Eșecului de a oferi cu acuratețe informații legate de risc și recurență
3. Eșecului de a explica rezultate anormale cu consecințe severe
4. Esecului de a comunica recomandarea laboratorului pentru o a doua amniocenteză
5. Eșecului de a determina sexul fetal corect sau anomalii genetice din cauza contaminării cu
celule materne
6. Eșecului de a oferi la timp rezulatele și având ca și consecință nașterea unui făt cu anomalii
cromozomiale
7. Eșecului de a analiza cariotipului fetal
8. Imposibilitatea diagnosticării tuturor anomaliilor fetale la examenul ecografic
9. Eșecul laboratorului sau infecția culturii celulare, fără a fi timp de a repeta analiza putând duce
la nașterea unui făt cu anomalii congenitale.

10
Deși aceste posibilități sunt rare , ele trebuie întotdeauna spuse pacienților.
Comunicarea rezultatului testării și implicațiile acesteia
Ziua în care un cuplu află că diagnosticul prenatal nu este cel așteptat va ramane în memorie o
perioadă lungă. Medicul trebuie să se poarte cu foarte mare grijă, oferind cuplului toate informațiile de
care dispune și totodată trebuie să răspundă oricăror întrebări venite din partea cuplul ui. Cel mai bine
este ca această discuție să aibă loc cu ambii părinți implicați sau ca mama să aibă o persoană de sprijin,
într-un loc unde cuplul are parte de toată intimitatea de care are nevoie, întreruperile fiind minime. De
asemenea contactul vizual este un aspect important.
Recunoașterea unei anomalii fetale imagistic, molecular sa u citogenetic poate ar ăta pentru prima
dată o bo ală asimptomatică la unul din pă rinți: sdr. DiGeorge, beta talasemie minoră.
Nu rar, utrasonografia de al doilea trimestru arată anomalii fetale de etiologie necunoscută.
Prezența ambilor părinți la o consultație privind avortul electiv pentru un defect fetal este critică.
Pacienții își pun întrebări referitoare la o explicație fiindu -le greu să accepte situația: “ Oare s-a încurcat
proba? ”, “Câtă acuratețe are diagnosticul? ”, “Cât de competent este laboratorul? ”, “Au făcut erori în
trecut? ”, “Cum putem să fim siguri că nu s -a produs o eroare de comunicare? ”, “Există un alt cuplu cu
același nume? ”. Sunt întrebari și dubii nenumărate, fiecare dintre ele necesitând să fie lămu rite. Cel
mai important aspect și cel care va ocupa cel mai mult timp este explicarea naturii defectului și
informarea despre disfuncție, povara anticipată, prognosticele asociate, speranța de viață și posibi litatea
de a necesita tratament sau grijă pe toa tă durata vieții. Pe planul secund trec efectele asupra p ărinților
și al celorlalți copii având în prim plan efectele asupra copilului ce se va naște. Ȋntrebări cu privire la o
viitoare sarcină trebuiesc lămurite prin exprimarea riscului de recurență.
Ocaz ional, în cuplu apar atitudini diferite față de o întrerupere de sarcină. Rezolvarea acestui
conflict nu este de datoria medicului, la fel cum nu ar trebui să țină partea nici unui membru . Există
posibilitatea dea apărea diferențe religioase sau păreri contradictorii despre consecințe . Rolul
medicului, în acestă situație, este de a se asigura că toate faptele au fost spuse și înțelese și de a prezenta
scenarii pro și contra într -o manieră cât mai neutră.
Cea mai grea provocare pentru cosilierul genetic est e consultația în care trebuie să comunice
părinților că, la testul genetic, fătul este afectat. Calitățile necesare pentru aceasta situatie sunt:
maturitatea, e xperiența, caldura și empatia , sensibilitate a și cunostiințe despre psihologia relațiilor
umane, sarcină și pierdere. Medicul trebuie să le explice pacienților că nu au de ce să se simtă vinovați
sau stigmatizați indiferent ce decizie vor lua.
Invariabil, părinții care primesc vestea unui defect genetic fetal, simt nevoia de a -și testa și ceilalți
copii. Răspunsul afirmativ este pertine nt atunci când poate fi decoperită starea de purtător. Testele
pentru starea de purtător trebuie foarte bine cântărite și cel mai bine amânate până la majoratul copilului

11
când i se poate oferi consilierea genetică dato rită implicațiilor care uneori pot afecta calitatea vieții. De
asemenea, va fi decizia copilului dacă dorește tes tarea sau nu.
Părinții trebuiesc susținuți moral în perioada de recuperare după decizia de a întrerupe o sarcină cu
făt afectat. Ei pot înfrunta sentimente de vinovăție, depresie, furie, negare, probeme în cuplu cum ar fi
frigiditatea sau impotența. Pot lua decizii impulsive de a se steriliza. Aceste dorințe ar trebui refuzate,
în schimb se poate recomanda contracepție pentru o perioda mai lungă de timp (chiar și doi ani). De
asemenea ar trebui consiliați și informați despre consecintele de a face repede un copil „de înlocuit”.
Acest copil ar putea fi un motiv permanent de îndurerare pentru părinț i care ar putea deveni excesiv de
anxioși și protectivi. Totodată și copilului îi va fi greu să își stabilească o identitate proprie.
Scopul esențial al consilierii genetice este de a obține o înțelegere cât mai completă a informațiilor
de către pacienți pentru a putea lua cea mai bună decizie pentru ei. Decizia de a p ăstra un copil cu o
afecțiune genetică nu trebuie vazută ca un eșec al consilierii genetice.

Indicații pentru consiliere genetică preconcepțională :
1. Vârsta avansată a mame i: mamele peste 35 ani trebuie informate despre riscul de a avea un
copil cu defecte cromozomiale, despre recomandarea diagnosticul prenatal (CVS și
amniocenteza) precum și riscurile acestor manevre. De asemenea în prezen t pot opta și pentru
testarea non invazivă din sângele matern pentru aneuploidiile cromozomilor 13,18,21,X,Y.
2. Primul copil al cuplului are o boală genetică: dacă nu se reușește diagnosticul exact al maladiei
primului copil, părinții rămân fără opțiunea diagnosticului prenatal al afecțiunii în cauză la
următoarea sarcină . De cele mai multe ori, părinții vin la doctor când se află deja la a doua
sarcină iar nu de puține ori timpul este insuficient pentru diagnosticul primului copil.
3. Unul dintre parinți are o boală genetică cu risc de transmitere.
4. Istoric de infertilitate: dacă cauza nu este gasită, se recomandă analiza cariotipurilor ambil or
parteneri
5. Părinte purtător al unui rearanjament cromozomial sau al unei gene mutante: prima vizită
preconcepțională este cea care stabilește statutul de purtător al unei translocații reciproce sau
inversii cromozomiale sau a unei gene mutante. Se poate lua în con siderare grupul etnic din
care a face parte și defectele care apar mai des în acel grup. Printre multe aspecte care trebuiesc
luate în calcul, mai sunt și potențialele trăsături fizice care indică afectiuni cu transmitere legată
de cromozomul X ma nifestate la femei purtătoare.
6. Istoric familial de boală genetică: numele explicit a l unei afecțiuni genetice atunci când este
discutat istoricul familial facilitează evaluarea și testarea. Dificultățile apar atunci când familia
sau medicii anteriori nu au diagnosticat maladia genetică.

12
7. Consangvinitatea: cuplurile consang vine au un risc mai mare pentru copii cu maladii autozomal
recesive, cu cât este mai apropiată relația, cu atât riscul este mai mare.

13
Screeningul bolilor genetice în sarcină

Metodele screening sunt cele care pot indentifica feții cu risc crescut de a ave a malformații, defecte
genetice sau anomalii cromozomiale. Ca o metodă screening să fie eficientă trebuie să aibă o rată mare
de detecție și o rată acceptabilă de fals -pozitiv. Urmatoarele metode pot fi folosite pentru a detecta
cupluri cu risc crescut de anomalii cromozomiale (Puri and Trivedi ,2010 )1:
1. Istoric: -in timpul sarcinii actuale
-sarcinile anterioare
-trecutul medical sau chirurgical
-istoricul familial
2. Examenu l clinic
3. Investigații:
-screening din serul matern
-ultrasonografia
-alte teste specifice
Date privind evoluția sarcinii :
1. Istoricul din timpul sarcinii: anumite situații pot indica un risc crescut al sarcinii:
A. Expunere la teratogeni: medicamente citostatice, antiepileptice (valproat de sodiu),
anticoagulante (warfarina), iod radioactiv
B. Contact cu persoane cu boli infecțioase (rubeola)
C. Anemia la mamă –trebuie investigate hemoglobinopatiile
2. Ȋn cazul în care cuplul a avut anterior un cop il cu o boală genetică cu risc crescut de recurență, ar
trebui să apeleze la diagnosticul prenatal. Metoda pentru diagnosticul prenatal diferă în funcție de
fiecare afecțiune în parte. Ex: fibroza chistică, autozomal recesivă, risc de recurență 25%, se iau
probe și se testează după cunoaș terea mutațiilor cauzatoare la persoana afectată. În acest caz, ar fi
bine ca părinții să fie testați anterior.
3. Istoricul familial ar trebui atent făcut întrucât poate oferii detalii importante despre starea de
purtător sau riscul de apariție a unei maladii, mai ales că pacienții pot să “ascundă” anumite
informații care pentru ei nu sunt relevante. Consangvinitatea este de asemenea un aspect important.

14
Examenul clinic :
Ca în orice situație medicală, examinarea pacientului este obligatorie și totodată importantă. Este
posibil ca mama să aibă trăsături care să o încadreze pentru o anumită afecțiune (ex: anomalii de
dentiție, polidactilie operată, prezența neurofibroamelor cutanate).
Investigatii :
Proceduri de screening:
1. Screenig biochimic din sângele matern:
A. Screening de primul trimestru (bitest/dublu test)
B. Triplul test
C. Cvadruplul test
D. Screeningul integrat
2. Imagistică fetală:
A. Ultrasonografia -2D/ 3D.
B. MRI (rezonanță magnetică nucleară).

Proced uri de testare noninvaziva
Analiza AND fetal din sângele matern pentru aneuploidiile cromozomilor 13, 18, 21, X, Y

Proceduri diagnostice invazive
1. Amniocenteza:
-Amniocenteza ȋn trimestrul al doilea de sarcină
2. Biopsia de vilozități coriale (CVS):
-CVS – ȋn primul trimestru de sarcină
3. Testarea sângelui fetal din sâ ngele cordonului ombilical –cordocenteza
După aceste proceduri invasive se pot face diferite teste: cariotiparea, testrea qf-PCR, array -CGH,
secvențiere în funcție de ce date oferă screen ingul.

Diagnosticul preimplantațional
Necesită proceduri de reproducere umană asistată (FIV) cu selecția ulterioară a embrionilor
indemni, după testarea genetică. Este o procedur ă rezervată cazurilor cu boli grave și risc mare de
recurență, fiind disponibilă numai în anumite c entre specializate.

Procedurile noninvazive sunt folosite pentru screening în timp ce manevrele invazive pentru
obținerea de celule fetale și diagnostic de c ertitudine.

15
Metode screening
Screeningul de trimetru I :
Presupune calcularea riscului de a avea o sarcină cu risc de anomalii cromozomiale în funcție de
vârsta maternă, rezultatul dublui test și evaluarea ecografică cu ajutorul unor softuri specializate cu ar
fi Prisca, Kryptor.
Dublul test :
Presupune testarea valorilor a doi hormoni: PAPP -A și β-HCG care dau informații despre funcția
placentei.

Markerii ecografici de trimestrul 1 sunt :
1. Lungimea cranio -caudală
2. Translucența nucală (TN)
3. Osul nazal (ON)
4. Unghiul facial frontomaxilar (FMF)
5. Examinarea Doppler a ductului venos

În ultimele decenii, ecografia a devenit de neȋnlocuit ȋn abordarea obstetricii. A existat un progres
constant al ȋnțelegerii fiziologiei normale și anorm ale fetale. Acest lucru a dus la capacitatea de a
diagnostica un număr crescând de afecțiuni fetale, și totodată a mutat momentul diagnostic mai devreme
ȋn sarcină.
Progresul abilitățiilor de screening ȋn primul trimestru a dus la o detectare ȋmbunătățită a
anomaliilor fetale, ȋn special a aneuploidiilor, dar și o scădere a ratei rezultatelor fals pozitiv e. Aceasta
din urmă are două beneficii majore: mai puține fem ei sunt puse ȋn fața unui stres asupra riscului de
anomalii cromozomiale și mai puține femei sunt supuse procedurilor de diagnostic invazive.
Odată cu optimizarea evaluării riscurilor, se poate e fectua screening pentru alte complicații ale
sarcinii decât cele date de genetică. Aceasta include utilizarea evaluarii ecografice a fluxului arterei
uterine materne, care poate fi combinat cu alți parametri clinici și biochimici pentru a estima cu
acurate țe riscul de a dezvolta preeclampsia și restricție de creștere intrauterină.
Evaluarea fetală din primul trimestru de sarcină (11-13 saptămâni +6 zile), a vascularizației pelvine
materne și serologia maternă, coroborate cu istoricul matern și examenul fiz ic pot fi utilizate pentru a
stabili riscul pentru aneuploidiile fetale și alte complicații care nu devin evidente clinic până mai târziu
în sarcină.

16
Examinarea cordului fetal ȋn primul trimestru poate aduce dovezi ale unui defect cardiac, cea mai
comună anomalie structurală ȋntâlnită la indivizii cu trisomie 21. Funcția cardiacă poate fi evaluată
examinând fluxul sanguin prin valva tricuspidă sau prin ductul venos.
Evaluarea sarcinilor ȋn primul trimestru are potențiale beneficii . Combinația dintre ecogra fie (TN)
și markerii serici materni (PAPP -A și βhCG liber) oferă cea mai bună metodă de screening pentru
aneuploidia fetală cu o rată de aproximativ 90% de detecție și o valoare predictivă pozitivă ȋnaltă.
Anatomia fetală poate fi examinată sistematic chia r și la această vârstă gestațională timpurie și cea mai
mare parte a anomaliilor structurale pot fi detectate ȋn acest stadiu (Chervenack și colab ,2012 )3. Un
avantaj al evaluarii ecografice ȋn primul trimestru constă ȋn determinarea precisă a vârstei sarcinii prin
măsurarea lungimii cranio -caudale, vârsta gestațională fiind foarte importantă ȋn gestionarea sarcinilor
(fie normale fie nu).
Beneficiile examinării ecografice de prim trimestru sunt maxime ȋntre 11 -13 săptămâni + 6 zile
gestaționale.
Eficac itatea măsurării translucenței nucale ca marker de aneuploidie este diminuată dincolo de 13
săptămâni și 6 zile de sarcină. Estimarea vârstei gestaționale prin măsurarea lungimii cranio -caudale
devine inexactă dincolo de această vârstă gestațională , din ca uza dificultății obținerii imaginilor datorită
poziției fetale și beneficiile potențiale ale diagnosticului precoce raportate la complicațiile ȋntreruperii
sarcinii sunt reduse.
Lungimea cranio -caudală
Măsurarea lungimii cranio -caudale (CRL) fetale pare a fi cea mai sigură metodă pentru
determinarea vârstei gestaționale. Pentru a măsura CRL, este obținută o imagine longitudinală pe linia
mediană a fătului care este măsurat de la partea de sus a capului p ână la partea caudală (Chervenack și
colab ,2012 )3.
Translucența nucală
Translucența nucală descrie un spațiu transonic situat sub pielea cefei. Această zonă anecogenă
poate fi vazută la toți feții (11 -13săptămâni +6zile). Pe măsură ce crește grosimea TN, există o creștere
a riscului ca fătul să fie afectat d e o anomalie cromozomială sau structurală, de un sindrom genetic sau
moarte intrauterină. În ciuda acestui fapt, o parte din feții cu TN crescută vor fi normali (TN este doar
un marker!!!).
Metoda standard de măsurare a grosimii translucenței nucale a fost descrisă de către Fundația de
Medicină Fetală (Cervenack și colab ,2012 )3:
-CRL: 45 -84mm
-imagine mediosagitală
-repere de profil: piele peste puntea nazală și vârful nasului

17
-structuri intracraniene: talamus, punte, măduva spinării
-mărimea imaginii: capul și partea superioară a toracelui ocupă cea mai mare parte a ecranului
-poziție fetală neutră (evită extensia sau flexia gâtului)
-linia tegumentului vizualizată separat de amnion
Atunci când este masurată corect, TN este cel mai puternic marker unic pentru anomaliile
cromozomiale.

Figura 1: Aspectul ecografic al translucenței nucale ( www.ultrasound -images.com )4

Osul nazal
Evaluarea prenatală a osului nazal ȋn screeningul pentru trisomia 21 se baze ază pe cara cteristica
trăsăturilor feței gă site la indivizii cu sindrom Down. Există studii care demonstrează o diferență
semnificativă atât ȋn ceea ce privește dimensiunea ON, cât și gradul de osificare ȋntre indivizii euploizi
și cei cu trisomie 21.
Pentru măsurarea corectă este necesar ca profilul fetal să includă o linie ecogenă reprezentând
tegumentul supraiacent piramidei nazale și o linie ecogenică ȋn fața ei, reprezentând tegumentul vârfului
nasului (Cervenack și colab ,2012 )3.
Unghiul facial frontomaxilar
Fața plată este recunoscută ca o car acteristică dismorfică comună a persoanelor cu sindrom Down.
Acest lucru poate fi evaluat subiectiv pe ecografia prenatală prin examinarea profilului fetal.
Pentru măsurarea unghiului FMF este necesar ca imaginea să fie similară cu cea pentru măsurarea
osului nazal. Spațiul dintre palatul superior și nas trebuie să fie lipsit de structuri ecogene; prima latură

18
e trasată de -a lungul marginii superioare a palatu lui dur, vârful unghiului este marginea anterioară a
maxilarului, a doua latură de la vârf sprijinindu -se pe linia ecogenă de sub tegument (Cervenack și
colab ,2012 )3.
Evaluarea Doppler a ductului venos
În imagine trebuie să se vadă toracele și abdomenul. D oppler -ul color este utilizat pentru a identifica
porțiunea hepatică a venei ombilicale și ductul venos, care apare ca o continuare a venei ombilicale.
Întrucât viteza fluxului ȋn ductul venos este semnificativ mai mare decât ȋn restul sistemului venos, cu
Doppler color se vizualizează distorsionat. Este nevoie de un filtru stabilit la o frecvență mică(50 -70Hz)
astfel ȋncât unda „a” nu este acoperită (Cervenack și colab ,2012 )3.

Screeningul de trimestru II (Puri și Trivedi ,2010 ):1
Este indicat pentru femeile ȋnsărcinate care se prezintă la medic pentru prima dată ȋn trimestrul al
doilea sau când screeningul de pr im trimestru nu a fost efectuat .
Se pot evidenția:
1. Markeri biochimici sanguini
2. Detecția ecografică a malformațiilor structurale majore
3. Detecți a ecografică a markerilor minori
Markeri biochimici sanguini
1. AFP- alfa-fetoproteina din serul matern
2. β-hCG
3. Estriol neconjugat
4. Inhibina A
Evaluarea serologică ȋn trimestrul doi
AFP are cea mai mare acuratețe ȋn săptămânile 16 -18 de sarcină. AFP scăzută es te asociată cu
sindromul Down. O treime până la o cincime din sarcinile cu sindrom Down prezintă valori scăzute.
AFP trebuie corectată ȋn funcție de rasă, greutate, diabet și număr de sarcini.
Triplul test
Componentele triplului test sunt alfa -fetoproteina din serul matern, estriolul liber și hCG. Nivelul
alfa-fetoprteinei și estriolului liber sunt cu 25% mai scăzute ȋn sarcinile cu sindrom Down. hCG -ul este
de două ori mai mare ȋn sindromul Down. Tripul test se face ȋntre săptămânile 16 -20 de sarcină. Cut –
off-ul standard este 1/250 care este egal cu riscul de trimestru doi pentru sindrom Down la femeile peste
35 ani. Triplul test identifică aproximativ 60% din sarcinile cu sindrom Down cu 5% cu screening
pozitiv.

19
Cvadruplul test
Nivelul inhibinei A este crescut cu 2,1 față de mediana de control pentru sindromul Down.
Cvadruplul test se face ȋntre săptămânile 15 -21. Reprezintă măsurarea și coroborarea alfa -fetoproteinei,
estriolului, β -hCG liber și inhibinei A cu vârsta maternă .

Imagistică fetală
Detecția ecografică a malformațiilor structurale majore
Se face ȋntre săptămânile 20 -24 de sarcină pentru a maximiza evaluarea anatomică fetală.
Malformațiile structurale majore asociate cu aneuploidii sunt:
1. Defecte cardiace: defect de sapt atrial, defect de sept ventricular, tetralogia Fallot, coarctație de
aortă, etc
2. Malformații gastrointestinale: atrezie duodenală, atrezie esofagiană, omfalocel, fistulă
traheoesofagiană, pancreas inelar, imperforație anală, hernie diafragmatică
3. Malformații ale sistemului nervos central: meningocel, holoprozencefalie, agenezie de corp calos,
ventriculomegalie, microcefalie
4. Malformații scheletice: polidactilie, picior strâmb
5. Malformații renale: rinichi ȋn potcoavă, rinichi polichistic, hidronefroză
6. Anomalii faciale: despicătura buz ei și a palatului, microftalmie, anoftalmie, macroglosie, ciclopie

Evaluare ecografică a markerilor minori
Aceștia sunt descoperiri specifice ecografice asociate cu risc crescut de aneuploidie.
1. Faldul nucal: măsoară aria dintre exteriorul osului occipital și exteriorul pielii ȋn planul axial care
trece prin fosa posterioară. Se măsoară ȋntre săptămânile 15 -21. Normal este mai mic de 5mm. Este
considerat a fi cel mai senzitiv și specific marker pe ntru aneuploidii ȋn ecografia de al doilea
trimestru.
2. Intestin ecogen: un intestin cu ecogenitate crescută ȋn abdomenul fetal este asociat cu creșterea
riscului de 6.7 ori pentru sindromul Down. Ecogenicitatea intestinului ar trebui comaparată cu cea
a sistemului osos fetal. Este de asemenea vizualizat ȋn boli ca: fibroză chistică, infecție cu
citomegalovirus sau alte aneuploidii. Amniocenteza ar putea fi făcută pen tru cariotiparea fetală,
detecția de mutații ale genelor pentru fibroza chistică și analiza ADN pentru infecția cu CMV.
3. Focus ecogen intracardiac: este cauzat de calcificarea mușchiului papilar ventricular. Cel mai des
apare la ventriculul stâng. Prezența focusului ecogen intracardiac cr ește riscul de sindrom Down.
Este de notat că apare la 30% din feții normali asiatici și de aceea nu este considerat un marker

20
sensibil sau specific pentru aneuploidie. De aceea, alte descoperiri ecografice sau testări pozit ive
din sânge ar trebui să fie prezente pentru a se justifica testarea invazivă.
4. Humerus sau femur scurt: prezența unui humerus scurt creșt e riscul unui sindrom Down de 0, 5 ori
iar prezența unui femur scurt de 1,5 ori. Sensibilitatea și specificitatea aces tui marker nu este mare
izolat și prezenta lui nu justifică un diagnostic invaziv.
5. Pilectazia: un pelvis renal măsurat ȋn diametrul antero -posterior mai mare de 4 mm este anormal
când este masurat ȋntre săptămânile 14 -20.
6. Osul nazal: osul nazal hipoplazic sau absent la ecografia de trimestru doi este asociată cu risc
crescut de sindrom Down.
7. Chist de plex coroid: prezența unui chist ȋn plexul coroid cu diametrul >10mm ȋntr -o vedere axială
prin porțiunea superioară a capului fătului a fost corelată cu risc c rescut de trisomie 18.

Nicolaides și co. a observat că detecția aneuploidiilor prin ecografie a fost corelată cu numărul de
defecte identificat. Au asociat puncte unor markeri specifici. Defectele structurale și îngroșarea faldului
nucal au primit câte do uă puncte iar femurul scurt, humerusul scurt, focusul ecogenic intracardiac,
intestinul hiperecogen și pilectaz ia au primit câte un punct. Unei femei cu risc crescut i se recomandă
un test invaziv la 1 sau mai multe puncte iar la o femeie cu risc scăzut la 2 sau mai multe puncte,
bazându -se pe acest scor (Nicholaides,2004)5.

Ecografia morfologică fetală
Este o ecografie pentru detecția malformațiilor fetale. Se face ȋntre săptămânile 20 -24 de gestație
și se acordă o atenție specială biometriei fetale anorm ale, anomalii fetale structurale și markerilor
minori pentru aneuploidii.
În sindromul Down ar trebui pot aparea următoarele semne ecografice: anomalii scheletale precum
spatiul interdigital 1 marit, 11 perechi de coaste, degete scurte; anomalii faciale precum față și occiput
aplatizate, fantă palpebrală oblică, punte nazală scurtă, urechi implantate jos, hipoplazie nazală,
macroglosie, fantă epicantică. Anomalii ale SNC cel mai des ȋntâlnite sunt: vetriculomegalia,
microcefalia, brahicefalia. Defectele cardiace pot include canal atrio -ventricular, DSA (defect septal
atrial), DSV (defect septal ventricular), focus ec ogenic intracardiac, infiltrat pericardic. Sunt frecvente
anomaliile gastrointestinale și renale ca: atrezie duodenală, fistulă traheoesofagiană, omfalocel,
pancreas inelar, anus imperforat.
În trisomia 18 creșterea fetal ă este restricționată. Anomalii a le SNC asociate sindromului Edwards
sunt: chist de plex coroid, cisterna magna anormală, absența corpului calos, hipoplazia cerebelului,
ventriculomegalie, defecte de tub neural. Printre anomaliile scheletice se regasesc : reduceri de membre,

21
picioare strâm be, polidactilie. Anomalii faciale asociate sunt: cheilognatoschizis, micrognația, urechi
jos implantate și microftalmie. Defectele gastrointestinale și renale sunt: omfalocel, hernie
diafragmatică, hidronefroză sau rinichi ȋn potcoavă.
Trisomia 13 este și ea asociată cu restricția de creștere intrauterină. Malformați i ale sistemului
nervos central asociate sindromului Patau sunt: holoprozencefalie, anomalii ale fosei posterioare,
agenezie de corp calos, ventriculomegalie și defecte de tub neural. Malforma ții scheletice: polidactilie
și malformații faciale ca ciclopie, anoftalmie, nas hipoplazic sunt asociate cu sindromul Patau.
Anomalii cardiovasculare: defecte septale, tetralogia Fallot, ventricul stâng hipoplazic, coarctație de
aortă, focus ecogenic intr acardiac. Malformațiile gastrointestinale și renale sunt: omfalocel, rinichi
polichistic, rinichi ȋn potcoavă și translucența nucală crescută.

Tehnici de diagnostic prenatal
Sunt tehnici prin care se obțin probe de țesuturi de origine fetală care pot fi folosite pentru
diagnostic ul de certitudine al fătului.
În prezența indicațiilor, pacienții trebuie con siliați pentru un test invaziv precum biposia de
vilozități coriale sau amniocenteza. Pacientului trebuie să ȋi fie oferite toate detaliile legate de teh nică,
rata complicațiilor, și durata primirii rezultatelor. Decizia de a face analiza este voluntară și trebuie
semnat un consimțămant informat (Puri și Trivedi, 2010)1.

Amniocenteza
Este o procedură invazivă prin care se introduce un ac ȋn cavitatea amniotică sub ghidaj ecografic
și este aspirat lichid amniotic pentru analiză. Indicațiile pentru amniocenteză sunt:
1. Sarcina cu ri sc crescut de aneuploidie fetală :
A. Vârsta maternă peste 35 de ani;
B. Risc crescut la testele de screening din pr imul sa u al doilea trimestru de sarcină ,
C. Identificarea ecografică a unor sem ne asociate malformațiilor fetale,
D. Unul dintre părinți este purtător ul unei translocații cromozomiale echilibrate
2. Făt cu risc crescut de boală metabolică:
Un diagnostic final a f ost stabilit la un alt membru din familie (frate/sora mai mare)
3. Făt cu risc de boală monogenică :
Boală cu transmitere autozomal reces ivă, autozomal dominantă sau legată de cromozomul X , după
diagnosticul unui caz similar în familie.

22
Amniocenteza se ef ectuează ȋntre săptămânile 16 -24 de sarcină. Se face ȋn condiții de asepsie
folosind un ac de 22G. O ecografie anterioară este necesară ȋnainte pentru a stabili numarul de feți,
viabilitatea, vârsta gestați onală, localizarea placentei și volumul lichidului . Se alege ca și loc de inserție
un loc unde este suficien t lichid și nu se află palcenta. Inițial primii 2 -3 ml se aruncă pentru a evita
contaminarea cu celule materne iar apoi sunt aspirați 20 ml.

Figura 2: tehnica amniocentezei6

www.mayoclinic.org
Lichidul amniotic se analizează de rutină pentru nivelul de alfa -fetoproteină. Celulele fetale
obținute prin amniocenteză sunt cultivate pentru realizarea cariotipari i și analiza AD N-ului fetal. Este
recomandat diagnosticul rapid pentru cele ma i comune ane uploidii ca trisomiile 13,18,21 și sexul fetal .
Tehnicile pentru diagnosticul rapid sunt hibr idizarea fluorescentă in situ (FISH) și PCR fluorescent
cantitativ (QF -PCR). Avantaj ul testului rapid este aflarea î n 48 de ore rezultatului.
Limitările testului r apid sunt imposibilitatea detectării aberațiilor structurale cromozo miale cum ar
fi translocații, inversii și a mozaicism . De asemenea testul este țintit numai pentru cele cinci perechi de
cromozomi.

Biopsia de vilozitati coriale
Acestă procedură se face ȋntre săptămânile 11 -13 +6 zile de sarcină. Se face prin abord
transabdominal. Indicatiile pentru CVS sunt aceleași ca și pentru amniocenteză exceptând situațiile
când este necesar lichid ul amniotic pentru analiză . Avantajul biopsiei de vilozități coriale este rezulatul
mai timpuriu și astfel oferă timp mai mult pentru ȋntreruperea de sarcină, dacă este nevoie.
Complicațiile celor două proceduri sunt similare.

23
Prima tehnică este cea cu două ace recomandată de Smidt Jensen și Hahnemann și folosește acul
exterior ca trocar pentru a străpunge pielea maternă, miometrul uterin și placenta. Un ac mai subțire
este introdus prin trocar direct î n placentă. Acestă tehnică permite reinserția ȋn cazul ȋn care pr oba de
țesut este inadecvată dar, permite și contaminare a maternă.
Tehnica cu un singur ac propusă de Brambati este c ea preferată pentru CVS. Un ac de 20G este
introdus percutan în placentă sub ghidaj ecografic. Stiletul este retras și conținutul este aspirat ȋntr -o
seringă de 20 ml cu 5 ml mediu. Acul este mi șcat ȋnainte și ȋnapoi ȋn placentă de câteva ori pentru a
obține cantitatea adecvată de țesut.
Analiza citogenetică este similară cu amniocenteza. În structura vilozităților coriale sunt trei tipuri
de țesuturi: sincițiotrofobasat, citotrofoblast, mezenchim. Celulele mezenchimale au nevoie de culturi
celulare și analiza durează 10 -15 zile. Câteodată există discrepanțe ȋntre placentă și țesutul fetal care ar
putea fi din cauza contaminării cu celule materne sau din cauza mozaicismului placentar. În
mozaicismul placentar, celule euploide se găsesc alături de linia celulară anormală din placentă, cu
toate acestea, fătul ar putea avea cariotipul normal. În această situație se recomandă amniocenteza
pentru cariotiparea fătului. Mozaicismul este indentific at ȋn 1% din CVS iar linia de celule anormale
este confirmată la 10 -40% din feți. Complicațiile acestei proceduri sunt: sângerări vaginale, riscul de
avort spontan este de 1%.

Cordocenteza
Acesată procedură se face sub ghidaj ecografic. Prima tehnică folosește un ac spinal de 20 -22 G și
15 cm lungime pentru a pătrunde ȋn vena ombilicală ȋntr -un segment relativ fixal cordonului lângă
inserția sa ȋn placentă. Cu acestă metodă acul este liber și se poate mișca ȋn toate direcțiile și de aceea
șansele de in jurie a cordonului sau altor structuri este mai mare. Altă tehnică presupune un ac fix ghid
care este atașat la transductorul ecografic prin care se introduce un ac de 22 -25G. Calea acului va fi
prevăzută de transductor și se poate alege un loc pentru punc ție. Mișcări laterale ale acului nu sunt
posibile. Cea mai accesibilă buclă este aleasă pentru puncție. În ambele metode vena ombilicală este
puncționată și sângele obținut este testat pentru originea sa fetală (Puri și Trivedi, 2010)1.

Fetoscopia
Se fac e cu un endoscop care permite inspecția fătului pentru depistarea anomaliilor structurale și
permite biopsierea de țesuturi.
Este o tehnic ă de vizualizare directă folosind un endoscop cu fibră optică. Trocarul endoscopului
măsoară 2,2 mm ȋn diametru iar en doscopul are diametrul de 1,7 mm. Limitarea fetoscopiei este câmpul
ȋngust de vizualizare și vederea limitată a părților mici ale fătului din cauza distanței focale scurte.

24

Diagnosticul preimplantațional
Este o tehnică de a diagnostica anomaliile geneti ce ȋnainte de sarcină. Se folosește pentru cuplurile
care au risc de aneuploidii datorită vârstei, sau celor care sunt purtători de translocații echilibrate. Este
folosită si pentru diagnosticul maladiilor X -linkate sau bolilor monogenice.
Diagnosticul pre implantațional se face ȋn timpul procedurilor de fertilizare in vitro, atunci când
celulele de la embrion sunt biposiate pentru analiza genetică.
Cea mai bună metodă de diagnostic preimplantațional este biposia unei singure celule din
embrionul cu opt cel ule sau blastocist. Blastocistul are celule independente și o singură celulă poate fi
recoltată fără a deranja celulele vecine pentru că, ȋn acest stadiu celulele nu dezvoltă joncțiuni gap și
sunt mai puțin aderente. Limitarea acestei tehnici este că celul ele sunt mari, și de aceea greu de recoltat.
Timpul scurt pentru analiza rezultatelor este o problemă pentru că o implantare de succes depinde de
transferul rapid al embrionului.
Biopsia blastomerului se face la cinci zile după fertilizare ȋn stadiul de 12 0 de celule. Conține
majoritar celule trofoblastice dar masa interioară de celule care forrmează embrionul este clar
demarcată ȋn acest stadiu. Celulele sunt biopsiate după ruperea mecanică a zonei. Avantajele sunt:
numărul mai mare de celule pentru analiz ă și faptul că sunt bine diferențiate. Dezavantajele sunt că
există un risc crescut de a leza masa interioară de celule din cauza aderenței mari dintre celule și timpul
scurt pentru incubație (Ward,2003)7.

25
Amniocenteza

Amniocenteza a fost folosită pentru prima dată în Germania la începutul anilor 1800 pentru a trata
hidroamniosul. Ȋn 1930 Menees a folosit amniocenteza pentru a injecta substanță de contrast în sacul
amniotic, pentru a evalua fătul și a localiza placenta. Procedura de a folosi amniocenteza pentru a
introduce soluție salină hipertonă în sacul amniotic pentru terminarea sarcinii a fost folosită în 1937.
Folosirea amniocentezei a crescut în anii 1950 când analiza spectofotometrică a bilirubinei s -a
dovedit valoroasă în monitorizarea feților cu izoimunizare Rh.
Amniocenteza pentru testare genetică a evoluat la mijlocul anilor 1950. Unele inve stigații au
demonstrat că sexul fetal putea fi determinat prin analiza cromatinei X in celulele lichidului amniotic.
Ȋn 1966, Steele și Breg, au raportat fezabilitatea analizei cromozomiale a celulelor lichidului amniotic,
introducând diagnosticul genetic prenatal. Ȋn a nul următor, Jacobson și Barter, au raportat primul
diagnostic prenatal a unei anomalii cromizomiale. Ȋn 1968, Valenti și Nadler au raportat detecția
sindromului Down in utero, cu confirmare după avort electiv. Ȋn același an, Nadler a diagnosticat prima
detecție a unei disfuncții mendeliene: galactozemia în celulele lichidului amniotic. Ȋn următorii ani au
fost raportat succese în diagnosticul prenatal a unei varietăți de boli cromozomiale sau metabolice.
Ȋn 1970 Nadler și Gerbie au sumarizat experiența lo r în diagnosticul prenatal prin amniocenteză la
142 de pacienți. Demonstrând atât acuratețea diagnostică cât și riscul relativ scăzut au reușit să pună
bazele diagnosticului genetic prenatal prin amniocenteză în tratamentul modern obstetrical.
În 1972 Milu nsky și Littlefield au cerectat diagnosticul erorilor ȋnăscute de metabolism. În același
an, Brock și Sutcliffe au descoperit că, cantități mari de alfa -fetoproteină se află ȋn lichidul amniotic al
sarcinilor cu defect de tub neural.
Ghidajul ecografic a ȋ nceput să ȋnsoțească amniocenteza ȋn 1972, la Copenhaga (www.ob –
ultrasound.net)8.

Metoda tehnică de realizare a amniocentezei
Amniocenteza se face între săptămânile 16 -20(24) de sarcină. Raportul dintre celulele viabile și
nonviabile este mai mare decât dacă procedura este efectuată mai târziu. Ȋn plus, uterul este accesibil
pentru abordarea abdominală și conține suficient lichid amniotic ca să permită aspirarea în siguranță a
20 ml. Amniocenteza transva ginală nu mai este recomandată din cauza dificultății tehnice și asocierii
cu infecții și avorturi spontane (Scrimegeour)9.

26
Amniocenetza pentru diagnosticul prenatal se face în ambulator. Ca și pregatiri înaintea procedurii
este necesar ca pacienta să își golească vezica urinară ca să nu fie aspirată din greșeală urină. Pacienta
poate manca sau bea înainte. O ecografie anterioară este făcută și se alege un loc de inserție a acului.
Acul este inserat preferabil în linia de mijloc a fundului uterului sub ghid aj ecografic; dar nu întotdeauna
acest loc corespunde locației optime pentru extragerea lichidului amniotic. De multe ori este nevoie de
un segment uterin mai jos sau lateral. Placenta trebuie evitată atunci când este posibil. Daca nu, este de
dorit să se aleagă cea mai subțire parte a placentei pentru a fi perforată. De obicei, acest loc este la
periferia placentei. Cordonul ombilical și inserția sa trebuie indentificate și evitate. Riscul pentru
complicații fetale nu s -a dovedit mai mare atunci când este făcută amniocenteza transplacentară de
operatori experimentați decât amniocenteza nontransplacentară (Bombard, Powers și colab,1995)10.
Se poate folosi un anestezic local (2 -3 ml xilină/lidocaină) , lidocaină -prilocaină cremă aplicată pe
piele sau ȋnghețar ea acului ; cu toate acestea, nu par să diminueze durerea. Este necesară explicar ea
procedurii înainte pacientei asigurându -o că anxietatea și durerea vor fi mai mici decât se așteaptă.
După dezinfectarea pielii materne cu soluție iodată sau alcoolică, se f ace un câmp steril în jurul
locului ales pentru puncționare pentru a păstra condițiile de asepsie. Un ac de 22 G cu stilet este cel mai
des folosit și recomandat. Pe parcursul întregii proceduri se practică monitorizare ecografică pentru
vizualizarea aculu i. Gelul ecografic se aplică adiacent de locul puncției și un transductor în timp real
este ținut astfel încât raza ultrasunetelor este direcționată la un unghi de 15 -20 de grade de paralela
unde va intra acul. La inserție, toată lungimea acului trebuie vi zualizată pe ecran, cu vârful identificat
ca o „flacără”. Percepția tactilă a operatorului când acul trece prin diferite țesuturi este importantă
pentru poziționarea corectă a acului. La pacientele nulipare în mod deosebit, operatorul simte trecerea
acului prin fascia dreptului abdominal. Pacinta poate răspunde la trecerea prin peritoneu cu o senzație
de durere puternică. Operatorul apreciază apoi trecerea prin uter și apoi prin sacul amniotic (Milunsky
și Milunsky,2010)2.
După ce se asigură că acul este î n poziția bună, stiletul se scoate și o seringă de 10 -20 cc este atașată.
Dacă la aspirație nu apare lichid amniotic, acul trebuie repozitionat împreună cu stiletul. Nu se caută
lichidul amniotic trăgând din seringă în timp ce se mișcă ac ul. După ce s -a repoziținat corect stiletul
este retras definitiv. Primii mililitrii de lichid conțin teoretic, cel mai probabil celule materne din vasele
de sânge, perete abdominal sau miometru. De aceea proba inițială (primii ml) este de obicei aruncată
sau pusă deoparte pentru testarea alfa -fetoproteinei din lichidul amniotic. 20 ml sunt aspirați într -o
seringă sterilă, de unică folosință. Contaminarea cu celule materne apare mai des la medicii care fac
mai puțin de 50 de amniocenteze anual. Este de preferat folosirea ser ingilor de 10 -20 ml din cauză că
o tragere a capatului seringii uș oară este de preferat . După ce lichidul este obținut, fie este lăsat în

27
seringă etichetată fie este transferat în eprubete etichetate, care sunt transportate la temperatura
ambientală direct la laborator.
Abilitatea de a obține lichidul amniotic este corelată cu experiența operatorului, folosirea
ecografului și vârsta gestaținală la care se practică procedura. Dacă se practică la 16 săptămâni de către
un medic experimentat în diagnosticul pre natal, eșecul de a obține lichidul amniotic este mai mic de
1%. După o amniocenteză eșuată, o nouă procedură poate fi încercată în aceeași zi. Dar dacă și aceasta
eșuează o nouă încercare trebuie amânată cu 3 -7 zile.
După amniocenteză, trebuie documentate ecografic mișc ările cardiace fetale. Pacienta trebuie
consultat ă sumar după procedură și instruit ă să raporteze orice scurgere sau sângerare vaginală, crampe
uterine severe (crampele medii nu sunt neobișnuite) sau febră. Activități fizice normale pot fi reluate
după procedură, dar nu sunt recomandate activități fizice puternice (jogging, aerobic) și ni ci raporturile
sexuale în ziua respectivă.

Riscuri asociate amniocentezei
Riscuri materne
Riscuri amenințătoare de viață sunt extrem de rare. Amniotita apare la 1 din 1000 de femei care fac
amniocenteză. Aceasta poate duce la pierderea sarcinii, și doar în cazuri extraordinare pot fi
amenințătoare de viață pentru mamă.
Probleme minore materne, nu sunt rare. Ȋntre anii 1972 -1975 National Institude of Chid Health and
Development (NICHD)11 a concluzionat că 2 -3% din femei au spotting sau scurgeri vaginale d upă
amniocenteză. Deși aproape întotdeauna limitată cantitativ și în durată, scurgerea de lichid amniotic
poate persista și duce la pierderea sarcinii. Cu toate acestea există femei care nu doar că au pierdut
cantități relativ mari de lichid după amniocent eză dar au continuat să piardă lichid pe tot parcursul
sarcinii. Surprinzător, toate au născut la termen copii sănătoși. Recomandarea actuală este de
management expectativ după scurgere persistentă de lichid amniotic, atât timp cât cuplurile sunt
informate despre riscurile materne și fetale. Supravegherea trebuie să se concentreze asupra semnelor
clinice de infecție (creșterea leucocitelor), monitoriza re ecografică și clinică a creșterii fetale și
aprecierea ecografică a cantității de lichid amniotic.
Contracțiile uterine imediat după amnicenteză nu sunt rare. Din nou, managementul expectativ și
reasigurarea sunt de obicei tot ce este necesar.
Injuria directă a fătului
Riscurile potențiele fetale includ: avort spontan, injurii cauzate de ac, separarea placentei, corio –
amnionitita, travaliu prematur și injurii cauzate de retragerea lichidului amniotic. Rare, dar raportate ,
injuriile directe cu acul incl ud: fistulă ileocutanată, fistulă peritoneoparietală, gangrena unui braț,

28
traumă oculară, disrupție patelară, atrezie ileală, injurii ale creierului, nervilor periferici, cordului
(hematom). Foarte multe dintre acestea au fost raportate înaintea folosirii ecografiei concomitent.
Transmiterea materno -fetală a HIV în timpul amniocentezei
Amniocenteza a fost asociată cu o creștere a ratei de transmitere verticală a virusului
imunodeficienței umane de tip 1 (De Decker,2002)12. Cu toate acestea, cu ajutorul chi mioprofilaxiei
retrovirale , riscul transmiterii ca urmare a amniocentezei a fost redus marcat.
Pierderea sarcinii
Cele mai multe avorturi spontane au loc ȋn trimestrul unu, dar pot apărea și în trimestrul doi. Mai
mult, femeile ȋn vârstă sunt mai predis puse de a avea avorturi spontane față de cele tinere. Vârsta ar
putea fi un factor și pentru nașterile premature.
Eventualitatea ȋn care se pierde sarcina depinde de:
1. Experiența obstetricianului care face procedura
2. Caracteristicile lichidului amniotic stu diat (ex: prezența sau absența creșterii alfa -fetoproteinei in
lichidul amniotic)
3. Folosirea ecografului cu ȋnalta rezoluție
4. Indicațiile pentru testare
O altă contribuție la controversă este faptul că patogeneza avortului rămâne ȋncă obscură. Sunt ȋn
ipotez ă mai multe mecanisme: infecție, travaliu prematur, ruperea placentei, alte injurii ale placentei,
injuria cordonului ombilical, pu ncție directă a fătului sau rup tura de membrane. Cele mai informative
cazuri de avort spontan ar trebui să fie cele care au l oc ȋn prima săptămână după procedură. Chiar și
centrele mari ȋntâlnesc puține asemenea cazuri, și rareori o cauză a putut fi identificată. S-a ajuns la
concluzia că riscul de 1% risc de avort spontan nu mai este de actualitate la un medic experimentat.
Pacienții sunt informați că:
1. Riscul atribuit amniocentezei de avort spontan este de 0,5% dar un risc mai scăzut de 0,2 -0,3% sau
chiar mai mic este mai corect ȋn centre cu experiență
2. Riscul de injurie fetală majoră cu continuarea sarcinii este foarte mic
3. Cicatricile date de ac sunt rare
4. Riscul matern este minim
Interpretare
La mijlocul anilor 1950 Serr, Fuchs și Riis au descoperit că sexul fetal poate fi determinat prenatal
examinând corpul cromatinei X in celulele lichidului amniotic uman. O dacadă mai târziu, Steele și
Breg au reușit cultivarea și carotiparea celulelor lichidului amniotic (LA). Această descoperire a dus
la folosirea la scară largă a diagnosticului prenatal pentru femeile cu risc crescut de a avea copii cu
anomalii cromozomiale. Descoper irea ȋn anii 1980 a biopsiei de vilozitați coriale (CVS) pentru

29
diagnosticul de trimestru unu a repre zentat un avans important din diagnosticul prenatal (Van Dyke,
Robertson și colab,2002)13. Astăzi, evaluarea riscului fiecărei femei de a avea un copil cu anomalii
cromozomiale este o componentă standard ȋn obstetrica contemporană, iar femeilor care sunt
considerate cu risc mare le este oferită amniocenteza sau CVS. Tendința actulă este de a amâna sau
continua sarcina la vârste ȋnaintate, ȋmpreună cu folosi rea la scară largă a biochimiei serului matern și
screening -ul ecografic ajută la identificarea sarcinilor cu risc crescut.

Figura 3 . Cariotip din cazuistica clinicii spitalului Filantropia14

Interpretarea rezultatelor testelor de diagnostic
În general pacienții care aleg un diagnostic prenatal sunt îngrijorați de anumite afecțiuni
cromozomiale (cel mai adesea de sindromul Down). Categoriile majore de anomalii cromozomiale
neaștep tate sunt: o trisomie autozomală alta decât trisomia 21, aneupl oidie a cromozomilor de sex, o
rearanjare structural ă, un cromozom marker suplimentar, poliploidia și mozaicismul.
În diagnosticarea mozaicismului , definit ca prezența concomitentă a două sau mai multe linii
celulare diferite la același individ, este uneo ri dificil de diferențiat între un mozaicism adevărat prezent
la făt, un mozaicism limitat la placentă și un pseudomozaicism.
De cele mai multe ori se dovedește a fi o falsă alarmă, iar mozaicismul în țesutul vilozitar sau
amniocite nu reflecta un mozaicis m constitutional adevarat la făt. Linia cromozomială anormală poate

30
exista doar la nivelul țesuturilor extraembrionare (corion, amnion), iar embrionul sa fie normal (46,N).
În acest caz vorbim despre mozaicismul limitat la placentă (confined placental m osaicism, CPM),
situatie î ntalnită mai frecven t în cazul biopsiei de vilozități coriale.
Dacă anomalia apare î n timpul cultivării in vitro iar atât embrionul cât și țesuturile
extraembrionare sunt normale, situația se denumește pseudomozaicism. Acesta are o frecvență mai
mare decât mazaicismul adevărat, fiind întâlnit la 0,1 -0,3% din cazuri.
Diagnosticarea unui mozaicism adevărat (frecventa aprox. 0,1% în cazul amniocentezei și de
1% corespunzător biopsiei de vilozități coriale) trebuie făcută numai când ex istă două populații
celulare, cu cariotip diferit care sunt prezente în cel puțin două vase de cultură independente. Două
colonii aneuploide prezente î n aceeași cultură nu stabilesc diagnosticul de mozaicism datorită
posibilității migrării celulare.
Fenotipu l asociat mozaicismului poate fi foarte variabil, reflectând proporția celulelor
normale/anormale. Ȋn general însă se pot întâlni aceleași modificări ca în cazul trisomiei omogene.
Oricum in cazul mozaicismelor trebuiesc considerate ș i următoarele situați i particulare:
• CPM (mozaicismul limitat la placenta) poate cauza insuficiență placentară și poate
determina restricție de creștere intrauterină sau moarte fetală; prezenț a unei linii celulare anormale la
nivelul placentei poate determina dezvoltarea unui făt anormal;
• DUP (disomia uniparentala) poate cauza anomalii specifice in cazul cromozomilor ce au
gene amprentate (cromozomii 6,7, 11,14,15, 20 ). Ȋn aceste situaț ii se recomandă teste ADN; DUP
poate permite expresia unei afecțiuni recesive când două al ele recesive identice sunt prezente
(isodisomie);
• pot fi prezente trăsă turi clinice care apar numai în prezența mai multor linii celulare, de
exemplu cre șterea asimetrică și anomaliile de pigmentatie (hipomelanoza Ito).
Avand în vedere faptul că numai un numar limitat de celule poate fi cariotipa t, statisticile
uneori “conspiră” împotriva citogeneticianului ș i doar celulele normale sunt analizate. Acest fapt
trebuie acceptat: testul nu este perfect.
Trisomiile autozomale omogene
În cazul trisom iilor 13,18 ,21 produșii de concepț ie pot fi viabili, dar rata de supraviețuire este
variabilă (în cazul sindromului Down speranța de viată poate ajunge în prezent până la 60 de ani), fiind
însă semnificativ redusă în cazul trisomiilor 13 ș i 18. Ȋn toate situații le însă sunt prezente modificari
somatice și retard intelectual.
Alte trisomii autozomale sunt foarte rare și sunt incompatibile cu supraviețuirea postnatală.

31
Triploidia
Aproape î n toate cazur ile avortul spontan se produce înainte de naș tere. Dacă fătul afectat
supraviețuieste până la naștere, decesul apare precoce.
Rearanjamentele structurale cromozomiale
Ȋn cazul în care se dovedesc a fi identice cu ale unui părinte purtator, cu mare probabilitate copilul
va fi normal. Ȋn caz contrar fenotipul este greu de anticipat .
Aneuploidiile cromozomilor de sex
Ȋn astfel de situatii decizia de continuare sau întrerupere a sarc inii are mari dileme etice. Cu excepția
sindromului Turner (45,X) ș i Klinefelter (47 ,XXY), câ nd cu certitudine adulț ii sunt infertili iar
problemele psihosomatice sunt greu predict ibile, pentru cazurile 47, XXX ș i 47,XYY dilemele sunt
legate de dezvoltarea psihomotorie și a limbajului, respectiv de tulburarile de comportament și de
adaptare socială.
Ȋn cazul polisomiilor 48, XXXX; 48,XXXY; 49, XXXXX; 49,XXXYY; 49,XYYYY este
caracteristică afectarea intelectuală .
Translocație reciprocă
Translocația reciprocă este rezultatul ruperii cromozom iale ȋn doi cromozomi autozomali și
schimbul subsecvent al segmentelor cromozomiale. Ideal, pacienții cu transocații balansate ar trebui
consiliați folosind tabele de risc pentru anomalii neechilibrate care sunt specifice pentru breakpointul
translocației individuale (Milunsky și Milunsky,2010)2.
Translocația robertsoniană
Translocația robertsoniană se refer ă la o translocație tip fuziune centromerică. Este o fuziune a î ntreg
brațului lung a doi cromozomi acrocentrici (13, 14, 15 din grupul D și 21 și 22 din gupul G). La oameni,
un individ cu o translocație robesrtsoniană are doar 45 cromozomi, cu cromozomul translocat conținând
cele două brațe lungi complete de la cei doi acrocentrici implicați. Brațele scurte de la cei doi cromozomi
sunt pierdute. Riscul este mai mare ȋn cazul ȋn care purtătorul translocației este mama.
Translocațiile robertsoniene balansa te pot fi asociate cu disomia uniparentala (DUP) iar atunci cand
sunt implica ți cromozomii 14 și 15 este semnificativă clinic. Pe lângă estimarea riscului pentru o
translocație nebalansată consilierea pre -amniocenteză pentru părinții purtători trebuie să i ncludă
informații despre riscul de disomie uniparentală și opțiunile valabile de testare (Milunsky și
Milunsky,2010)2.
Inversia cromozomială
Inversia cromozomială apare atunci când a avut loc o dublă rupere la un singur cromozom,
inversarea segmentului, ș i apoi fuziunea secvenței inversate. Dacă inversia include centromerul, este o
inversie pericentrică. Dacă este localizată doar la un braț al cromozomului este paracentrică. Când o

32
celulă germinală cu o inversie pericentrică trece prin meioză, cromozomul i nversat trebuie să formeze o
buclă pentru a alinia segmentele omoloage pentru ȋmperechere potrivită. O incrucișare ȋn interiorul
buclei de inversie poate să ducă la un gamet cu o inversie nebalansată. Aceasta se numește aneusomie
prin recombinare. Pentru p urtătorii cu o inversie paracentrică, riscul de a avea un copil anormal este
scăzut (Milunsky și Milunsky,2010)2.
Mozaicism și pseudomozaicism
Celulele din lichidului amniotic care se dezvoltă în cultură își au originea în diferite țesuturi ca
pielea feta lă, tractul urinar sau respirator, placentă și membrane. Prezența a una sau mai multe celule
cu cariotip anormal ȋntr -un preparat normal de lichid amniotic poate reflecta mozaicism adevărat, care
este definit ca prezența de multiple linii celulare fetale. Alternativ, prezența de celule anormale doar în
cultura (”in vitro”) fără ca fătul să fie afectat, indica un pseudomozaicism.
Mozaicismul care implică trisomii poate apărea prin unul din două mecanisme.
Primul, trisomia poate avea origini meiotice, cu p ierdere subsecventă de o copie ȋn celula
postzigotică. Acest mecanism poate uneori rezulta din situațiile ȋn care linia celulară euploidă este
reprezentată de două copii ale unui cromozom care provin de la același părinte (disomie uniparentală).
Al doilea mecanism implică o celulă euploidă postzigotică experimentând o nondisjuncție rezultând
ȋntr-o copie extra a unui cromozom ȋntr -o celulă fiică și o monosomie ȋn cealaltă.
Momentul apariției nondisjuncției este important. Evenimentele ce au loc după separa rea celulelor
fetale și extrafetale pot rezulta ȋn o dicotomie ȋntre consti tuția cromozomilor din placentă și făt
(mozaicism placentar sau mozaicism fetal).
Aspecte unice ale mozaicismului trebuie considerate:
1. Mozaicismul placentar poate cauza insuficienț ă placentară și poate fi asociat cu restricția de creștere
intrauterină sau moarte fetală intrauterină .
2. Prezența sau existența unei linii celulare normale ȋn placentă este importantă ȋn d eterminarea
normală si supravieț uirea in utero .
3. Disomia uniparentală poate cauza anomalii specifice când sunt implicați cromozomii care p oartă
gene amprentate (6,7,11,14,15,20).
4. DUP poate permite expresia unei maladii recesive când două alele identice recesive sunt prezente.
5. Proliferearea celulară a celulelor trisomice po ate fi asociată cu dezvoltarea anomaliilor specifice de
țesut.
6. Pot fi factori clinici adiționali care sunt aparenți doar când linii celulare multiple sunt prezente.
Diagnosticul mozaicismului adevarat ar trebui facut când două populații celulare cu cariotip
diferit sunt găsite ȋn mai multe (ce l puțin două) culturi diferite (Milunsky și Milunsky,2010)2.

33
Concluzii și recomandări pentru pseudomozaicism:
1. Cele mai multe anomalii structurale cromozomiale care sunt clasificate ca pseudomozaicism vor fi
nesemnificative clinic.
2. Unele trisomii autozomale pot reflecta linii celulare prezente ȋn țesuturile extrafetale.
3. Cu excepția cel or care implică cromozomul 16, este puțin probabil ca trisomiile autozomale
asociate pseudomozaicismului să fie semnificative clinic.
4. Nu există nicio dovadă directă că pseudomozaicismul unei singure celule sau pseudomozaicismul
a multiple celule implicând câștig sau pierdere a unui cromozom sexual este asociată cu risc crescut
de anomalii fetale.

Mozaicismul care implica câștig sau pierdere de autozomi:
1. Riscurile pentru rezultat anormal par a fi foarte mari (>60%) pentru trisomii ale cromozomilor
2,4,9,16 și 22; mari (40 -59%) pentru trisomiile 5,13,14,15,18 și 21; moderat mari (20 -39%) pentru
trisomiile 6,7,12 și 17.
2. Comparați a fenotipurilor cazurilor anormale diagnosticate prenatal și cazurilor diagnosticate
postnatal cu același diagnostic arată concordanța considerabilă.
3. Datorită multiplelor anomalii descoperite ecografic, o examinare a fătului ecografică ar trebui
făcută in toate cazurile diagnosticate prenatal.
4. Pentru confirmare citogenetică, ambele fibroblaste (din piele, alte țesuturi fetale și/sau inimă) și
țesutul din placentă ar trebui studiat e. Când ambele țesuturi fetale ș i extrafetale sunt analizate, o
confirmare cit ogenetică poate fi obținută.
5. Mozaicismele implicând monosomiile 20, 21 sau 22 și aneuploidii implicând unul sau mai mulți
cromozomi sunt foarte rare dar pot avea semnificație clinică.

Mozaicismul care implică cromozomii sexuali:
1. Aceste aneuploidii sunt comune, și, asa cum era de așteptat, majoritatea cazurilor prezintă un
fenotip normal la naștere.
2. Evaluarea cazurilor 45,X/46,XY cu mozaicism ar trebui să includă evaluare ecografică a sexului
fetal și evaluare complet ă la naștere, care po ate confirma sau exclude prezenț a unei gonade
intraabdominale.
3. Semnificația clinică pe termen lung a celor mai multe aneuploidii a cromozomilor sexuali
diagnosticate prenatal rămâne incertă.

34
4. Riscul asociat cu mozaicismul care implică un X anormal structural este probabil mai mare atunci
când nicio linie celulară normală nu este prezentă. Din cauza f uncționalității disomiei, există o grijă
specială când un cromozom X inelar mic sau un alt cromozom X -derivat mic este prezent.
5. Cele mai multe anomalii sexuale identificate ȋn celulele lichidului amniotic sunt confirmate ȋn
studiile următoare.

Aranjamentele cromozomiale:
1. Rearanjamentele cromozomiale familiare balansate nu sunt ȋn general asociate cu un risc crescut
pentru anomalii, deși unele excepții notabile au fost documen tate. Riscul asociat unei translocații
X/autozomale familiare balansate este nesigur.
2. Riscul asociat cu o mutație de novo nebalansată va depinde de dezechilibrul specific, și tehnica
citogeneticii moleculare ar trebui să ajute la caracterizarea cariotipul ui.
3. Translocațiile reciproce balansate de novo și inversiile pot avea un risc de până la 7% pentru un
copil anormal fenotipic. Riscul asociat unei translocații X/autozomale de novo este neclar și va
depinde de punctul de rupere al lui X.
4. Markerii cromozomi ali supranumerari de novo pot fi caracterizați folosind citogenetica moleculară
și tehnici adiționale d e bandare a cromozomilor.
5. Studiul DUP ar trebui oferit atunci când este identificat un cromozom supranumerar mic (15;15)
(Milunsky și Milunsky,2010)2.

Polimorfism și alte variații:
1. Polimorfisme comune apar cu frecvență diferită la diferite populații și sunt folositoare pentru
identificarea liniilor celulare individuale.
2. Polimorfismele rare pot fi ȋn general deosebite de anomaliile structurale cromozomiale folosind
tehnici de colorare, FISH și dacă este necesar analiza cromzomială a părinților.
3. Există inversii specifice, Y/acrocentrice pe brațul scurt, braț scurt acrocentric/teleomer și
t(11.22)(q23.3q11.2) translocații care sunt ȋntâlnite des ȋn populație (Milunsky și Milunsky,2010)2).

Contaminarea cu celule materne :
1. Frecvența contaminării cu celule materne poate fi redusă folosing un ac de amnicenteză mai mic
(21G), având stiletul inițial la locul său, și separând primul sau primii doi mililitrii din lichidul
amniotic.
2. Analiza citogenetică trebuie să includă celule din cel puțin două culturi independente cu analiza a
cel puțin 20 de metafaze .

35
3. Când apare o mixtură de celule XY și XX, o comparație a bandării Q a cromozomului polimorfism
al 46,XX a celule lor materne din lichid poate fi informativă.
4. O examinare ecografică pentru a confirma prezența de organe genit ale masculine ar trebui făcută
în cazuri le ȋn care este suspectată o contaminare cu celule materne (Milunsky și Milunsky,2010)2.

Factori care pot afecta rata de succes și acuratețea diagnosticului
Sarcina gemelară este identificată aproape ȋntodeauna folosind o ecografie de rutină, ȋnainte de
amniocenteză. Cu ajutorul ecografiei, se poate aspira separat lichidul amniotic din fiecare din cei doi
saci amniotici.
În cazurile sarcinilor gemelare diamniotice in trecut se utiliza adăugarea carmin indigo ȋn timpul
amniocentezei pentru a stabili care sac a fost aspirat -această metoda NU se mai folosește.
O problemă de management apare atunci când unul di n gemeni este normal și celălalt nu. Multe
cazuri de avort selectiv al fătului anormal au fost raportate.
Contaminarea culturilor cu mycoplasma este o problemă relativ frecventă. Seriozitatea
contaminării cu mycoplasma este reprezentată de efectul de deter iorare a culturii celulare. Celulele
contaminate pot să nu prezinte nici un semn la ȋnceput referitor la cresterea celulară sau morfologie,
dar prezintă o creștere semnficativă ȋn gap -urilor cromozomiale, ruperi, rearanjamente și alte tipuri de
aneuploidii .
Toxicitatea seringilor sau tuburilor poate fi semnificativă ȋn aparitia eșecului de cultură celulară.
Alte cauze pot fi reprezentate de sarcinile cu anomalii cromozomiale. Eșecul culturii celulare nu
este neobișnuit in cazul m ortii fetale, când specimen ul este contaminat cu sânge sau când volumul
probei este insuficient. Ratele eșecului sunt mai mari pentru vârsta gestatională prea mică(<14
săptămâni) sau prea mare (>24 săptămâni).

Elementele de bază pentru un laborator de citogenetică includ (Milunsky și Milunsky,2010)2:
1. Laboratorul trebuie să dovedească competența ȋn toate aspectele de testare ȋnainte de a oferi servicii
de diagnostic.
2. Training -ul, calificarea și experiența personalului trebuie să fie testate.
3. Cel puțin doua culturi independente ar t rebui să fie folosite.
4. Culturile trebuie crescute și menținute ȋn incubatoare diferite.
5. Statusul fiecărei culturi celulare trebuie determinat ȋn 10 zile pentru a evaluat necesitatea unei a
două amniocenteze.
6. Diagnosticul citogenetic final trebuie sa derive din analiza celulelor din cel puțin două cul turi
independente

36
7. Un minim de două metafaze bandate ar trebui cariotipate.
8. Cariotipurile trebuie să prezinte cel puțin o pereche din fiecare cromozom fără overlaping și trebuie
clar identificat după patern -ul lui de bandare.
9. Rezulatele trebui comunicate ȋn 14 -21zile.
10. Laboratorul trebuie sa poate oferi și alte tipuri de testare: QF -PCR ,etc.

Din cauza ratei de eroare pentru diagnosticul citogenetic prenatal prin amniocenteză diferă ȋntre
laboratoare, iar laborat oarele au tendința de a nu-și raporta greșelile, rata exactă a erorilor nu este
cunoscută. Se consideră, totuși că rata de eroare ar fi ȋntre 0,01 -0,02% ȋn anii 1990.
Majoritatea gravidelor care recurg la diagnosticul citogenetic prenatal prin amniocentaz ă vor primi
ȋnapoi un rezultat normal. Aceste femei pot fi reasigurate că feții lor vor fi neafectați de sindromul
Down sau alte aneuploidii grave. Femeile care au o sarcină anormală pot alege ȋntreruperea sarcinii.
Alternativ, pot primi indicații prenatel e pentru grija față de copilul lor, planuri despre naștere care includ
ȋngrijiri neonatale speciale și pot fi pregătite cu ajutorul familiei și altor organizatii de sprijin. Rezulatele
amniocentezei și testului rapid sunt primite ȋn cadrului unei ședințe d e consiliere care respectă valorile
etice individ uale și respectă decizia pacienț ilor.
Schimbări importante s -au făcut prin redefinirea populației de femei care ar beneficia cel mai mult
după amnicenteză. Screning -ul sângelui matern și ecografia au ajutat substanțial la identificarea
femeilor cu risc crescut pentru aneuplodii fetale reducând simultan nevoia altora.
Testarea moleculară citogenetică a completat cariotiparea tradițională și a mărit rata de anomalii
cromozomiale care pot fi diagnosticate pre natal.

37
Testarea rapidă

QF-PCR
Pentru femeile cu risc crescut, se recomandă efectuarea testului rapid (qf -PCR) pentru a obține
rezulatele în cel mult 48 de ore, în loc de apro ximativ 3 săptămâni cât durează în mod normal
cariotiparea. Astfel se evită stresul datorat anxietății asteptării rezultatului. Riscul de anomalii
cromozomiale este calculat pe ntru trisomiile 13,18 ,21 care sunt compatibi le cu supraviețuirea la
termen.
Dacă o trisomie este prez entă, markerii pentru acei cromo zomi a rată fie 3 vârfuri fie 2 vârfuri
in raport de 2:1, depinzând de alelă . Dacă există suspiciunea de co ntaminare maternă , atunci se face
comparația probei cu ADN -ul matern (Saadi, Kushtagi și colab ,2010)15.
Metodele rapide moleculare de detectare a an omaliilor citogenetice includ QF-PCR
(quantitative fluorescence polymerase chain reaction). Aceste metode sunt făcute să caute anomalii
doar pentru anumiți cromozomi (13,18,21,X,Y) și, in special, anumite locusuri de pe acei cromozomi.

Figu ra 4: Test QF -PCR care evidențiază prezența a trei semnale pentru cromozomul 21
(trisomia 21) www.genteq.de16

38
Spre deosebire de cariotipare, a carei interpretare s -a discutat în capitolul anterior, testarea
rapidă prin qf -PCR verifică cele mai comune aneuploidii: trisomia 13, 18 și 21.
Qf-PCR se folosește ca și metodă de diagnostic prenatal, în care markerii polimorfici
(microsa teliți) de pe autozomii 13, 18 ș i 21 sau de pe cromozomii sexuali sunt folosiți pentru a
determina prezența a trei alele diferite. Această metodă se bazează pe markerii informativi și
prezența ADN -ului prenatal. Există câteva caracteristici și avantaje ale diagnosticului prin această
metodă (Chitty , Nicholaides,2006)17:
1. Diagnosticul rapid a l anueploidiilor
2. Este o tehnică de bi ologie moleculară fiabilă, care folostește di, tri, tetra -nucleotide STR (small
tandem repeats) polimorfice ca și markeri pentru detecția aneuploidiilor cromozomiale, în
diagnosticul prenatal și postnatal implicand crom ozomii 13,18,21, X, Y.
3. Originea parentală a aneuploidi ei precum și determinarea originii non -disjuncției in meioza I
sau II poate fi evaluată
4. În cazul aneupoidiilor, poate aparea fie un vârf trialelic, fie un vârf dialelic cu diferențe
cantitative
5. Testare a probelor prenatale poate fi complicată de cantitatea și calitatea probei, mozaicism sau
contaminare maternă.

S-a considerat că testarea qf -PCR poate înlocui cariotiparea clasică. Au fost efectuate studii
care au dezbătut acest lucru (Badenas , Rodríguez -Revenga și colab,2010) 18:
Cultura și analiza celulelor fetale durează aproximativ 2 -3 săptămăni iar un biolog poate face
în jur de 250 de probe pe an. În schimb un biolog poate examina pana la 5000 de probe testate prin
qf-PCR. Deși multe defecte care nu pot fi detectate sunt de mică sau fără semnificație clinică, o
trecere a diagnosticului prenatal de la cariotiparea completă la qf -PCR va fi asociată cu e șecul de
diagnostic al unor anomalii semnificative. Se poate argumenta, că pentru a oferi un diagnostic
complet, rezultatele testarii genetice prenatale ar trebui să fie dispo nibile în mai puțin de trei zile,
urmate de cariotiparea completă.
În Marea Britanie, unde a fost efectuat studiul, se prezintă trei argumente împotriva dublei
testăr i:
1. Screeningul și consilierea pacienților se face doar pentru trisomia 21 și nu pentru toate anomaliile
cromozomiale
2. Diagnosticul inițial al rearanjarilor cromozomiale necesită investigații suplimentare, unele fiind
invazive, pentru a face distincția între cele cu semnificație clinică și cele fără
3. Dubla testare crește substanțial costurile

39

Același studiu din 2006 susține o serie de avantaje și dezavantaje (Chitty , Nicholaides,2006)17:
Avantaje : de o asemenea politică ar beneficia multe familii a căror anxi etate ar fi redusă prin
aflarea rapidă a rezultatelor. Astfel, și decizia în privința unei sarcini cu fetus cu anomalii poate fi
luată mai devreme, dar și timpul de decizi e va fi mai lung. De asemenea, investigațiile adiționale
necesare în cazul detecției unei rearanjări cromozomiale cu mică sau fără semnificație clinică pot
fi evitate, la fel ca și anxietatea care pornește de la ele. Există cazuri în care anxietatea părinților
este atât de mare, încât nu mai așteaptă rezultatul final, care ar putea fi norm al, și decid întreruprerea
sarcinii. Prin înlocuirea cariotiparii clasice cu qf -PCR aceste cazuri pot fi evitate. Un alt avantaj îl
constituie costul redus al acestei investigații.
Dezavantaje: există 3 dezavantaje ale înlocuirii cariotipării complete cu q f-PCR:
1. Anumite cazuri cu risc crescut de alte anomalii cromozomiale vor fi nediagnosticate, iar unora
dintre părinți nu li se va acorda opțiunea de a întrerupe sarcina.
2. În anumite cazuri cu făt cu cariotip normal și mozaicism placentar, prin testarea qf -PCR s -ar ajunge
la un diagnostic greșit. Această problemă poate fi redusă prin împărțirea probei în 2 și efectuarea
cariotipării în paralel . Trebuie avută în vedere de fiecare dată când apare un rezultat pozitiv dar
nicio anomalie ecografi că.
3. Cazurile în care parinții sunt purtători ale unor rearanjări cromozomiale balansate, dar pot avea
copii cu rearanjări nebalansate vor trece nedetectate. Potrivit studiilor, în absența unui istoric
familial clar, majoritatea purtătorilor au un risc scăz ut de a avea urmași cu rearanjări nebalansate.

Un alt studiu din 2010 vine în completarea celui din 2006. În acest studiu concordanța între qf -PCR
și cariotiparea clasică este de 98,75% (Badenas , Rodríguez -Revenga și colab,2010) 18. Majoritatea
centrelor de diagnostic prenatal oferă cariotipare sau testare rapidă cu criotipare completă. Qf-PCR a
fost introdus ca test unic în cel puțin două țări: din ianuarie 2005 în Stockholm pacientele pot alege
între testarea doar prin qf -PCR sau cariotipare completă când indicațiile pentru test area prenatală sunt
vârsta maternă avansată, sau anxietate. 70% aleg doar testarea prin qf -PCR (Badenas , Rodríguez –
Revenga și colab,2010) 18. De asemenea, din mai 2007 o strategie qf -PCR a fost introdusă în Londra.
Cariotiparea se efectuează doar în cazurile în care : sunt detectate prin examinarea ecografică anomalii
structurale, sunt prezenți doi sau mai mulți markeri minori pentru trisomia 21, o translucență nucală >3
mm la mai puțin de 14 săptămâni de g estație sau >6mm la mai mult de 14 săptămâni, sau un istoric
familiar de rearanjamente cromozomiale.

40
Testarea non invazivă a ADN -ului liber fetal din sângele matern
Testarea non invazivă prenatală (NIPT) este cea mai nouă metodă de detecție a trisomiilo r
13,18 și 21 utilizând ADN -ul fetal liber circulant în sangele matern. NIPT are o specificitate de peste
99% pentru trisomia 21.
Sângele unei femei insărcinate conține fragmente de ADN atât de origine maternă cât și de
origine fetală. Cel din urmă trece prin bariera placentară în circulația maternă. ADN -ul liber fetal apare
în timpul apoptozei celulelor citotrofoblastului. Fracția f etală este de până 10 -20% din ADN liber
plasmatic, crescând o dată cu vârsta sarcinii. După naștere, dispare din circulația maternă la câteva ore.
Testarea se paote face din a 9a sau a 10a săptămână de sarcină. Fragmentele de ADN liber fetal
reprezintă uniform tot genomul fetal și astfel se pot analiza cromozomii (Pantiukh, Chekanov și
colab,2016)19.
Pentru ca un rezultat sa fie validat, trebuie ca fracția de ADN să depașească 8%. Dacă aceasta
este mai mică de 4%, o nouă puncție venoasă este necesară.
Secvențierea ADN -ului liber fetal d in sângele matern s -a dovedit o tehnică sigură, cu acuratețe
mare și cu potențial de extindere. De la intro ducerea ei în practica clinică î n 2011, s -a răspândit rapid
și este disponibilă în multe țări (Pantiukh, Chekanov și colab,2016)19, inclusiv în Român ia.
O dată cu introducerea acestui tip de testare, numarul de proceduri invazive a scăzut datorită
refuzului pacientelor pentru o confirmare prin testare invazivă (Guijie, Jianping și colab, 2016)20.
Totodată trebuie avută în vedere introducerea testării î n clinică întrucât această testare este mai scumpă
decât screeningul convențional.
De asemenea, ecografia va rămâne de bază pentru screening, ea putând măsura translucența nucală
și alți markeri. Cu toate acestea, într -un model de screening care incorporea ză NIPT, care nu are rată
de avort, ar tre bui revizuită valoarea cut -off pentru risc (Guijie, Jianping și colab, 2016)20.

Ghiduri europene pentru diagnosticul prenatal:
Deși noile tehnologii pot schimba modul în care probele pentru diagnosticul prenatal sunt
obținute și testate, cel mai important principiu rămane cel al consimțământului informat. Aceste ghiduri
includ necesitatea unei consilieri pre și post testare, pentr u ca pacienta să poată avea acces la toate
informațiile necesare care să o ajute în luarea unei decizii autonome, și să folosescă rezultatele testării
cum dorește în limita contextelor legale și etice locale. Trebuie luate în considerare toate aspectele et ice,
legale, sociale și psihologice atunc i când sunt ofer ite testele prenatale . Informația trebuie oferită atât
verbal cât și scris.

41
Aceste ghiduri au fost bazate pe discuții între experți din diferite domenii implicate î n testarea
prenatală. Ținând cont de nevoia unei abordări individualizate care să ia în considerare valorile și
credințele individuale, precum și normele culturale și etnice au fost dezvoltate aceste ghiduri generale
care pot fi adaptate pentru fiecare caz în parte. Tinând cont de rapidita tea schimbărilor în practica clinică
genetică, aceste ghiduri ar trebui revizuite o dată la 3 ani. Ar trebui dezvoltate de organizații relevante
care să lucreze împreună pentru ca pacienților c ărora li se oferă o testare prenatală să li se ofere
informații adecvate și să poată lua deciziile care sa li se potrivească și să fie ajutați de -a lungul
procesului (Skirton , Goldsmith și colab, 2016)21.

42
Partea experimentală
Materiale și metode

Echipament necesar:
1. Hotă sterilă
2. Tuburi
3. Pipete automate
4. Centrifugă
5. Kit de extracție ADN
6. Kit de cuantificare ADN
7. Fluorometru
8. Kit pentru qf -pcr
9. Polimerază
10. Aparat PCR
11. Secvențiator
12. Soft pentru interpretarea datelor

Tehnica de lucru a reactie i qf-PCR
Pentru a putea realiza un test q f-PCR este necesară obținerea de ADN, care de regulă
este extras dintr -o cantitate d e 3 ml lichid amniotic, obținut prin amiocenteză.
I. Etapele extracției de ADN folosind kitul Ivitrogen :
1. Peste probă am adaugat 180μl PureLink Genomic Digestion Buffer și 20 μ l proteinază K
2. Am incubat la 55°C cu vortex timp de 15 -20 de minute.
3. Am adăugat 20μl RNAza A, am vortexat și am lasat la incubat la temeperatura camerei 2
minute.
4. Am adăugat 200μl Pure Lin k Genomic Lysis și am vortexat
5. Am adăugat 200μl 96-100% etanol și am vortexat
6. Am mutat amestecul pe coloniță și am centrifugat la 10.000 RPM, 1 minut
7. Colonița am mutat -o pe un tub nou și am adăugat 500μl Wash Buffer 1 și am centrifugat la
10.000RPM 1 minut
8. Colonița se mută pe un tub nou și se adaugă 500μl Wash Buffer 2 și se centrifughează la viteză
maximă 3 minute

43
9. Am mutat colonița intr-un tub steril de 1,5 ml și am adăugat 25-200μl Pure Link Genomic
Elution Buffer
10. Am incubat 1 minut la temeperatura camerei și am centrifugat la viteză maximă 1 minut

II. Etapele cuantificarii ADN folosind Qubit :
Figura 5:

www.thermofisher.com

1. Sunt necesare 2 tuburi pentru standarde și câte un tub pentru fiecare probă
2. S-a preparat Qubit Working Solution diluând reactivul Qubit 1:200 in bufferul Qubit. S -au preparat
200μL Working Solution pentru fiecare standard și probă
3. S-au preparat tuburile ca în imagine:
Tuburi standard Tuburi probă
Volum Working Solution 190 μl 180-199 μl
Volum standard (kit) 10 μl –
Volum probă – 1-20 μl (s -a folosit 1 μl)
Volum total 200 μl 200 μl

4. S-a vortexat fiecare tub 2 -3 secunde
5. S-au incubat tuburile 2 minute la temperatura camerei
6. S-au introdus tuburile în Qubit și s-au citit

III. Prepararea reacției PCR și eletroforezei capilare

44

Am folosit kitul Chromoquant 311.003, care conține două tuburi, cel cu capac alb este folosit pentru
cromozomii 13/18, iar cel cu capac albastru este folosit pentru analiza cromozomului 21. Pentru analiza
cromozomilor sexuali se folosesc ambele tuburi.
Pentru prepararea master mixului este nevoie de poli merază. Master mixul s -a realizat conform
instrucțiunilor.

Apoi am vortexat și am alicotat în tuburi un volum de 15μL, apoi am i ntrodus tuburile în congelator.
Pentru fiecare tub s -au adaugat 10 μL probă rezultând un volum final de 25 μL. Am centrifugat și
am introdus probele în PCR.
Protocol PCR

Step No. Of cycles Temp. Time
1.GoTaq 1 94°C 3 min
2. 26 94°C 30 sec
3. 26 57°C 1 min
4. 26 71°C 2 min
5. 1 71°C 5 min
6. 1 60°C 30-60 min
7. HOLD 4°C ∞

Pentru electroforeza capilară s -a folosit ABI310 cu următorul protocol.
ABI310
Injection voltage 1.5kV
Injection time 30 sec
Run voltage 15 kV
Filter set D filter
Run time 60 min
Polymer POP4

Pentru analizarea datelor s -a folosit GeneMapper 5.
Soluție Culoare capac Taq polimerază (μ L) 5U/μL
311.322 -52 Alb 22.0
311.323 -52 Albastru 22.0

45
Diagnosticul prenatal al sin droamelor cromozomiale

Pacientele
Pacientele incluse în cadrul studiului au fost recrutate de la Departamentul de
Medicină Materno -Fetală din cadrul Spitalului Cl inic de Obstetrică și Ginecologie Filantro pia,
București, pe parcursul a 4 luni .
Persoanele incluse în studiu au avut una dintre indicațiile majore de diagnostic prenatal:
1. vârsta avansată a mamei (peste 35 ani)
2. risc crescut la testele biochimice de screening
3. vizualizarea ecografică a unor anomalii fetale ( semne “de apel”)
4. istoric familial pentru boli monogenice și pentru afecțiuni cu transmitere legată de cromozomul
X.

Probele analizate au fost reprezentate d e lich id amniotic, vilozități coriale. Acestea au
fost atât cultivate in vit ro pentru realizarea cariotipării , cât și preparate pentr u testarea qf -PCR.
Fiecare pacientă a beneficiat de consiliere genetică înainte de testare și după obținerea
rezultatelor . Este important ca ambii părinți să fie prezenți la consiliere pentru a evita
neînțelegerile ulterioare .
Scopul acestei consultații genetice este ca pacientele să înțeleagă motivul testării
prenatale, în ce constă puncția propriu -zisă, riscul asociat proc edurii și limitele testelor
efectuate.
Este important ca pacientele să înțeleagă că „nici un test nu e perfect”, posibilele
eșecuri de cultură celulară, precum și existența mozaicismelor, a sindroamelor de microdeleții
și microduplicații care nu sunt diag nosticate prin analiza c ariotipului standard sau testarea
rapidă . Au fost explicate și beneficiile și limitările testului rapid, aflarea unui rezultat mai
devreme de trei sptămâni cu mai mult timp pentru luarea unei decizii. De asemenea efectuarea
suplimen tară a unor teste de genetică moleculară este justificată în cazurile cu istoric familial
de boli monogenice (beta talasemie, hemofilie, distrofie musculară Duchenne) sau când
modificările ecografice ridică suspiciunea unui astfel de sindrom. Au fost prezentate de
asemen ea consecințele și opțiunile, inclusiv cea de întrerupere a cursului sarcinii, în cazul unui
făt afectat.
De asemenea au fost întocmite fișe de diagnostic prenatal pentru fiecare caz în parte. Acestea
cuprind:
1. date de identitate, grupul sangvin și Rh -ul,

46
2. paritatea sarcinii
3. antecedentele personale și heredocolaterale,
4. indicația de diagnostic prenatal,
5. vârsta sarcinii.

Toate aceste date sunt utile pentru a stabili în fiecare caz în parte o posibilă corelație a
factorilor materni cu ide ntificarea unor anomalii fetale cât și oportunitatea efectuării unor teste
genetice suplimentare .
După consultația genetică pacientele au semnat un consimțământ informat despre
beneficiile și riscurile procedurilor de diagnostic prenatal.
În prezentul studiu a u fost încadrate un număr de 40 de pacie nte, cu vârsta cuprinsă
între 16 -42 de ani.

Figura 6 : Graficul distribuției pacientelor după vârstă

Majoritatea pacientelor au vârsta cuprinsă între 30 -40 de ani, cu extremele de 16,
respectiv 45 ani.
Vârsta maternă se corelează cu incidența crescută a sindromului Down în special după
35 de ani, când riscul statistic este de aproximativ 1/250. Astfel 6 paciente cu vârsta peste 35
de ani au avut riscul calculat pentru trisomia 21 mai mare de 1/50, în tim p ce doar 2 paciente
cu vârsta sub 35 de ani au avut acela și risc.
Majoritatea pacientelor pre zentate în lotul analizat ( 23 vs 17 ) au avut vârsta sub 35 de
ani. Acest fapt este explicabil prin importanța tot mai mare pe care o au testele de screening fie
biochimic fie ecografic , care datorită faptului că sunt lipsite de riscuri sunt u șor acceptate de
către gravide. Totuși rămâne o problemă, aceea legată de costurile acestor teste. 37
3137
343639
293938
2236
2939
3036
333740
3142
32
2539
3031
28
2042
30
162224343439
323245
41
30
1520253035404550Varsta pacientelor

47
Astfel în majoritatea cazurilor studiate indicațiile de diagnostic prenatal au fost
reprezentate de risc crescut după testarea serologică, fie bitest pentru primul trimestru sau
triplu test în trimestrul al II -lea de sarcină.
Este cunoscut faptul că aproximativ 70% dintre copii cu sindrom Down se nasc din
mame cu vârsta sub 35 de ani. De aceea este justificată efectuarea investigațiilor de screening,
neinvazive tuturor gravidelor, indiferent de vârstă.

Recoltarea probelor
Lichidul amniotic și vilozitățile coriale au fost prelevate de echipa de medici
obstetricieni ai Departamentului de Medicină Materno -Fetală, folosind ace de puncție sterile,
de unică folosință și un ecograf Voluson GE .
În fiecare caz a fost folosit abordul de puncție transabdominal, atât pentru efectuarea
amniocentezelor cât și în cazul biopsiei de vilozități coriale.
Pentru amniocenteză vârsta la care a fost efect uată a fost cuprinsă între 16 -24
săptămâni de sarcină. Se consideră că după vârsta de 16 săptămâni există o cantitate suficientă
de lichid amniotic (200 -250ml) pentru a permite aspirarea în siguranță a 20m l de lichid
amniotic. De asemenea la vârsta de 16 -18 săptămâni proporția de celule viabile/nonviabile este
maximă.
În majoritatea cazurilor înainte de puncție s -a făcut anestezie loca lă. Cu toate acestea,
se pare că aceasta nu influențează nivelul durerii .
Înainte de puncționare abdomenul matern este dezinfectat cu o soluție iodată/alcoolică,
ulterior se asigură un câmp steril. Cel mai frecvent se folosește un ac de 22G cu stilet. Pe t ot
parcursul procedurii se asigură monitorizare ecografică. De obicei primii mililitrii aspirați în
cazul lichidului amniotic care sunt cel mai probabil contaminați cu celule materne ale vaselor
sangvine, peretelui abdominal sau miometru sunt îndepărtați. Pentru aspirare se folosesc seringi
de 10 sau 20ml.
De menționat că pacientelor li s-a administrat tratament profilactic cu antibiotic și
antispastic.
Pentru cazurile de amniocenteză au fost prelevați în medie 20 ml de lichid amniotic .
Complicațiile mater ne ale amniocentezei, deși apar rar, pot fi: amniotită, embolie cu
lichid amniotic, hemoragii, spotting tranzitoriu sau pierdere de lichid amniotic,
oligohidramnios sau contracții uterine.

48
Complicațiile fetale ale amniocentezei pot fi: avort spontan, injurii cu acul de puncție,
corio -amniotită, naștere prematură, benzi amniotice secundare pierderii de lichid amniotic,
deformări ortopedice, risc crescut de transmitere verticală a infecției HI V de la mamă la făt.
Se pare că pierderea unui copil după o amniocenteză nu crește riscul de a se repeta la o
sarcină viitoare .
Biopsia de vilozități coriale a fost efectuată la vârste de sarcină cuprinse între 11 –
13 săptămâni 6zile. Înainte de puncționa re abdomenul matern a fost dezinfectat cu o soluție
iodată/alcoolică. În toate cazurile abordul de puncție a fost transabdominal . Cel mai frecven t
se folosește un ac de 19 -20G. Și în acest caz sunt controverse asupra folosirii sau nu a anesteziei
locale, c are se pare că nu amelioreză sursa de durere localizată în peritoneu și peretele uterin.
Pacienta trebui e informată asupara complicațiilor minore care pot apărea ca
sângerări ușoare, „spotting”, crampe abdominale, hematoame. În cazul unor complicații majo re
ca febra și sângerările importante necesită ca pacienta să revină pentru un consult de
specialitate.
După puncție se recomandă urmărirea periodică ultrasonografică pentru a verifica
starea fătului și a exclude hematoamele coriale.
Contraindicații ale biopsiei de vilozități coriale sunt sângerările vaginale, tulburări
de coagulare ale mamei în special hemofilia, infecții virale cu risc de transmitere verticală la
făt.
Probele obținute după procedura de biopsie de vilozități coriale conțin o mixtură de
celule deciduale materne, sânge și vili. Vil ii pot fi identificați ca structuri de culoare albicioasă,
ușor ramificate ce plutesc libere în mediu. Probele recoltate au avut medie 30mg de țesut corial.
Pentru cazurile de mame Rh negative și feți Rh pozitivi după puncție s -a administrat
intramuscular imunoglobulină anti -D mamei (200 -300mcg), pentru a reduce riscul de apariție
a bolii hemolitice a nou născutului, atât pentru sarcina în curs cât și la o viitoare sarcină.
Ajunsă în laborato r, fiecare probă este s eparată î n două tuburi, pentru cultură,
respectiv test rapid . Pentru testul rapid este nevoie de 3 ml.

Distribuția pacientelor după indicațiile diagnosticului prenatal
Distribuția pacientelor în funcție de indicațiile pentru diagnosticul prenatal a fost
următoarea: 19 paciente au avut risc biochimic după screeningul de trimestrul 1, 5 au avut risc
biochimic după screeningul de trimestrul 2 ; acestea reprezintă mai mult de jumatate (24 de
paaciente); 9 au avut modificari ecografice , iar 7 la „cerere” (fie au avut riscul scăzut și au

49
dorit o siguranță, fie au antecedente boli monogenice în familie și au dorit testarea moleculară –
pentru acestea s -a efectuat doar testul rapid).

Figura 8: Graficul indicațiilor de diagnostic

Între indicațiile pentru diagnostic prenatal există adesea situații de „overlap”, adică de
paciente care au rezultate cu risc crescut după metode diferite de testare neinvazivă.

Figura 7 : Graficul distribuției pacientelor după trimetrul în care s -a facut screeningul .

Este preferat screeningul de trimetrul 1 întrucât acesta ține cont nu doar de valorile
hormonale și vârsta maternă cât și de rezulatatele ecografiei.
Cu toate acestea, o parte din pacientele care au efectuat screeningul de trimestru 1, au
preferat să aștepte și să facă amniocenteza în locul biopsiei de vilozități coriale.

Indicatii de diagnostic
Dubu test Triplu test Ecografie Cerere
012Screening Trimestru

50
Figura 9 : Grafi cul distribuției pacie ntelor după v ârsta sarcinii în momentul efectării testării

Deși amniocenteza se realizează în mod normal între 16 -22 saptămâni, au fost cazuri
în care aceasta s -a efectuat chiar și la 23 sau 24 de săptamâni.
Un rezultat pozitiv în acest caz îi poate ajuta pe pă rinți doar pentru pregatirea pentru
nașterea unui copil bolnav, nu și pentru luarea unei decizii de întrerupere a sarcinii.

Analizarea probelor

Figura 10 : Distribuți a probelor în funcție de metoda de analiza folosită

Majoritatea probelor a fost reprezentată de lichid amniotic (LA) .
Pentru fiecare caz s -a facut testul rapid . Datele au fost analizate cu GeneMapper 5. 22
1422
1320
1320
1220
171721
17
131316171722
16161617
161718
131823
18
171824
1620
19
1719
17
1113151719212325Varsta Gestatie
LA
82%
CVS
18%Probe

51
Rezultate

În 10% din ca zuri au fost rezultate pozitive, restul de 90 % fiind normale.

Figura 11: Graficul rezultatelor

Rezultatele p ozitive au inclus: trisomia 21 ( 2 cazuri), sindrom Turner ( 1 caz), și triploidie (1
caz).

Figura 12: triploidie

136
2 1
0510152025303540
45,X N T21 triploidieRezultate

52

Figura 13: rezultat normal

53
Discuții

Cazul 1 – Pacientă în vârstă de 24 de ani, cu screening de trimestrul 1, βHCG 0.2 Mom,
PAPP -A 0,2 Mom, TN -1,6 mm, riscul calculat ¼ trisomia 18. Rezultatul este 69,XXY. Deși
pacienta nu prezintă risc mare datorită vârstei, valorile biochimice atrag atenția. Sarcina s -a
oprit din evoluție.

Cazul 2 – Pacintă î n vârstă de 42 de ani, cu valori biochimice normale, dar cu modificări
ecografice – nu se vizualizează osul nazal și cu riscul final calculat de 1/18 pentru trisomia 21
decide testarea prin CVS. Rezultatul a fost normal.

Cazu l 3- Pacientă în vârstă de 34 de ani, cu modificări eco grafice – agenezie de corp
calos și ventriculomegalie decide efectuarea amniocentezei. Rezultatul a fost normal atât la
testul rapid cât și cariotiparea. Aici ar trebui indicată testarea prin alte metode (ex: array CGH)
întrucât modificările vizualizate ec ografic necesită testare mai amanunțită .

Cazul 4 -????????????????????? ???????????????????????????????

54
Concluzii

1. Dintre probele analizate, în 90% din cazuri rezultatele au fo st normale. Acest lucru confirmă
pentru pacientele cu risc crescut avantajul testării diagnostice prenatale.
2. Din rezultatele anormale, cele mai multe (2) au fost reprezentate de trisomia 21 (sindromul
Down), ceea ce confirmă și atrage atenția asupra frecvenței acestei boli.
3. Din totalul c azurilor analizate, numai 17 dintre gravidele care au beneficiat de diagnostic
prenatal au avut vârsta peste 35 ani. Deși testarea a confirmat apariția sindromului Down la
peste 35 de ani, este important de reținut că acesta poate aparea la orice vârstă.
4. Deși s-a facut și analiza cariotipului și nu au existat neconcordanțe, trebuie avută in vedere
posibilitatea apariției altor afecțiuni care nu sunt vizibile la testarea prin qf -PCR.
5. Este foarte important ca testarea, indiferent de metoda aleasă sau testul necesar să se efectueze
cât mai rapid în cursul sarcinii pentru a permite pacientei și familiei acesteia un timp cât mai
lung pentru luarea deciziei potrivite pentru aceasta.

Obser vații:
1. Screeningul mai precoce (12 săptămâni) permite diagnosticul prenatal încă din primul
trimestru, aceasta fiind tendința în centrele de medicină fetală. Introducerea metodelor
screening noninvazive a ADN -ului fetal liber din plasma maternă ca metoda c u acurateațea cea
mai mare pentru trisomia 21 (99,9%) va influența si mai mult rata de manevre invazive
(scazând) /rezultate anormale (crescând). Costul este o problema importantă în prezent.
Ramâne opțiunea informată a pacientelor în legatură cu afecțiuni le testate numai pentru cele
mai comune aneuploidii (13, 18, 21).
2. Este foarte important ca pacientele sa beneficieze de consiliere genetică cât mai devreme în
decursul sarcinii, pentru a avea timpul necesar de a efectua testarile genetice, care în anumite
czuri pot dura până la 40 de zile.

55
Bibliografie
1. Puri M, Trivedi SS – Management of high risk pregnancy. A practical approach, ed Jaypee
Brothers Medical Publishers, 2010; 8 -11.
2. Nicholaides KH. Nuchal translucency and other first trimester sonographic markers of
chromozomal abnormalities. Am J Obstet Gynecol 2004, 191:45 -67.
3. Puri M, Trivedi SS – Management of high risk pregnancy. A practical approach, ed Jaypee
Brothers Medical Publishers, 2010; 14 -16.
4. Puri M, Trivedi SS – Management of high risk pregna ncy. A practical approach, ed Jaypee
Brothers Medical Publishers, 2010;21.
5. Ward K – Genetics and prenatal diagnosis. Scott JR, Gibbs RS, Karlan BY, Haney AF –
Danforth’s obstetrics and gynaecology. 9th ed: Lippincott Williams and Wilkins, 2003; 105 -28.
6. http://www.ob -ultrasound.net/amniocentesis.html
7. Scrimegeour JB – Amniocentesis: technique and complications. Ed: Baltimore: Williams and
Wilkins, 1973; 11.
8. Bombard AT, Powers JF, Carter SM, et al – Procedure related fetal losses in transplacental
versus nontransplacental genetic amniocentesis. Ed: Am J Obstet Gynecol 1995; 172:868.
9. Milunsky JM, Milunsky A – Genetic Disorders and the Fetus. 6th ed. Wiley -Blackwell,
2010;65.
10. NICHD National Register y for Amniocentesis Study Group – Midtrimester amniocentesis for
prenatal disgnosis: safety and accuracy. JAMA 1976; 236:1471.
11. De Decker HP – Mother -to-fetus HIV transmission during amniocentesis – ethical concerns.
South African Medical Journal 2002; 92: 124.
12. Van Dyke DL, Roberson JR, Wiktor A – prenatal cytogenetic diagnosis. In: McClatchey KD,
Ed: Clinical laboratory medicine, 2nd ed:Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins, 2002;
636.
13. De Coppi P, Bartsch G jr, Siddiqui MM, et al – Isolation of amni otic stem cells lines with
potential for therepy. Ed: Nature Biotechnol 2007; 25:100.
14. Milunsky JM, Milunsky A – Genetic Disorders and the Fetus. 6th ed. Wiley -Blackwell,
2010;194
15. www.mayoclinic.org/ tests-procedures/amniocentesis/multimedia/amniocentesis/i mg-
20008561
16. Puri M, Trivedi SS – Management of high risk pregnancy. A practical approach, ed Jaypee
Brothers Medical Publishers, 2010; 21 .
17.

56
18. http://pendiente demigracion.ucm.es/info/genetica/AVG/practicas/cariotipo/carioP.htm
17-23. Milunsky JM, Milunsky A – Genetic Disorders and the Fetus. 6th ed. Wiley -Blackwell,
2010;208 -250
24. spitalul clinic Filantropia
25-34. Milunsky JM, Milunsky A – Genetic Disorders and the Fetus. 6th ed. Wiley -Blackwell,
2010;208 -250
35.Strachan T., Read A., – Human Molecular Genetics, editia a 4a, ed. Garland Science,
2010 de adaugat !!!!!!!!!!!!!!!!
36. Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction (QF -PCR) for Prenatal Diagnosis of
Chromosomal Aneuploidies , Abdul Vahab Saadi, Pralhad Kushtagi, PM Gopinath and
Kapaettu Satyamoorthy, Internationa l Journal of Human Genetics , 10(1 -3): 121 -129 (2010 )
37-39. Fetal nuchal translucency scan and early prenatal diagnosis of chromosomal
abnormalities by rapid aneuploidy screening: observational study, Lyn S Chitty, Karl O Kagan,
Francisca S Molina, Jonathan J Waters, Kypros H Nicolaides, British Medical Jo urnal , 2006
Feb 25; 332(7539): 452 –455
38-39. Assessment of QF -PCR as the First Approach in Prenatal Diagnosis, Celia Badenas,
Laia Rodríguez -Revenga, Carme Morales, Carmen Mediano, Alberto Plaja, Ma Mar Pérez –
Iribarne, Anna Soler, Núria Clusellas, Antoni Borrell, Ma Ángeles Sánchez, Elisabeth Miró,
Aurora Sánchez,Montserrat Milà, and Wladimiro Jiménez, Journal of Molecular Diagnostics ,
2010
41-42. Report on noninvasive prenatal testing: classical and alternative approaches, Kateryna
S. Pantiukh,Nikolay N. Chekanov,Igor V. Zaigrin, Alexei M. Zotov, A lexander M. Mazur, and
Egor B. Prokhortchouk, F1000Research , 2016
43-44. Offering prenatal diagnostic tests: European guidelines for clinical practice, Heather
Skirton, Lesley Goldsmith, Leigh Jackson, Celine Lewis, and Lyn Chitty, European Journal
of Huma n Genetics, 2016