TESTAREA IN VITRO A DOUĂ PRODUSE ÎMPOTRIVA INFECȚIILOR URINARE RECURENTE CU E. COLI [309606]

UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRONOMICE ȘI MEDICINĂ VETERINARĂ

FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII

MASTER BIOTEHNOLOGII IN INDUSTRIA FARMACEUTICĂ

LUCRARE DE DISERTAȚIE

Coordonator științific:

Conf. dr. Vamanu Emanuel

Absolvent: [anonimizat] 2020

UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRONOMICE ȘI MEDICINĂ VETERINARĂ

FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII

MASTER BIOTEHNOLOGII IN INDUSTRIA FARMACEUTICĂ

LUCRARE DE DISERTAȚIE

TESTAREA IN VITRO A DOUĂ PRODUSE ÎMPOTRIVA INFECȚIILOR URINARE RECURENTE CU E. COLI

Coordonator științific:

Conf. dr. Vamanu Emanuel

Absolvent: [anonimizat] 2020

[anonimizat] (infecții la animale sau ca adjuvante în hrana animalelor), industria alimentară (pentru conservare) sau cosmetică (săpun, loțiuni etc) au dus la creșterea fară precedent a rezistenței si multirezistenței antimicrobiene a bacteriilor, cu mare impact clinic și epidemiologic.

[anonimizat], a infecțiilor tractului urinar recurente cu E.coli, soldate cu eșec terapeutic se explică prin: nivelul de rezistență tot mai ridicat al agenților patogeni ([anonimizat]) [anonimizat] a acestora, [anonimizat], sexul și activitatea sexuală ([anonimizat]), [anonimizat] , [anonimizat]/manevre medicale.Mai mult Organizația Mondială a Sănătății a numit rezistența la antibiotice drept una dintre cele mai importante amenințări la adresa sănătății publice din secolul XXI .

[anonimizat], precum și în numeroase industrii. Fenomenul de rezistență bacteriană constituie o [anonimizat]. [anonimizat] s-[anonimizat] , ratele de rezistență a [anonimizat].

Lucrarea de față s-a realizat în cadrul laboratorului de Biotehnologii extractive al Facultății de Biotehnologii și a avut ca scop testarea in vitro a două produse împotriva infecțiilor urinare recurente cu E. coli.

CAPITOLUL I

INFECȚILE TRACTULUI URINAR

I.1. [anonimizat], reprezentând una dintre principalele căi prin care corpul uman excretă deșeurile lichide. Astfel, [anonimizat], rinichii filtrează continuu sângele pentru a produce 1 [anonimizat] 1500 ml pe zi.

Sistemul tractul urinar este împărțit în două secțiuni: tractul superior și tractul inferior.

[anonimizat], al deșeurilor lichide din organism în urină și alte produse.

[anonimizat] a fi expulzată din organism prin uretră. Secțiunea cea mai exterioară a uretrei și a țesutului care înconjoară deschiderea uretrală sunt cunoscute sub numele de meatul uretral.

În tractul urinar normal, spălarea regulată a uretrei pe măsură ce vezica se golește ajută la împiedicarea infecției ascendente a tractului, de către bacteriile care colonizează în mod normal pielea periuretrală. Bacteriile care reușesc să migreze în vezică sunt, de asemenea, spălate în timpul micțiunii. În plus, vezica este căptușită de celule uroteliale acoperite cu o mucină glicozaminoglicană, care oferă o suprafață rezistentă la aderența bacteriilor. În cazul în care o bacterie ocolește această primă linie de apărare, sistemul imunitar ar trebui să poată elimina bacteriile atât timp cât pacientul este sănătos.

Dacă sistemul imunitar eșuează, poate apărea o infecție a tractului urinar (UTI) și poate duce la boli grave. Când apar probleme la nivelul tractului urinar inferior, cum ar fi leziunile nervoase sau atrofia musculară care duc la incontinență, sau prin mărirea prostatei sau a structurii uretrale, care duce la retenție urinară, utilizarea unui cateter urinar devine o necesitate .

I. 1. Microbiota sistemului urogenital

Microbiota normală a diferitelor zone ale corpului oferă o apărare nespecifică, importantă împotriva bolilor infecțioase, iar tractul urogenital nu face excepție. Cu toate acestea, atât la bărbați, cât și la femei, rinichii sunt sterili. Deși urina conține unele componente antibacteriene, bacteriile vor crește în urina lăsat la temperatura camerei. Prin urmare, “acțiune de spălare” / eliminare este cea care ține ureterele și vezica urinară liberă de microbi.

Sub vezica urinară, microbiota normală a sistemului urogenital masculin se găsește în principal în uretra distală și include specii bacteriene care sunt frecvent asociate cu microbiota pielii. La femei, microbiota normală se găsește în interiorul unei treimi distale a uretrei și a vaginului.

Cadrul microflorei normale a vaginului devine înființată la scurt timp după naștere reprezentând o populație complexă și dinamică de bacterii care fluctuează ca răspuns la schimbările de mediu. Membri ai microbiotei vaginale juca un rol important în nespecifice de apărare împotriva infecțiilor vaginale și infecții cu transmitere sexuală prin ocuparea celulare site-uri de legare și competiție pentru nutrienți. În plus, producția de acid lactic de către membrii microbiota oferă un mediu acid în vagin, care, de asemenea, servește ca o apărare împotriva infecțiilor.

Membrii microbiotei vaginale joacă un rol important în apărarea nespecifică împotriva infecțiilor vaginale și a infecțiilor cu transmitere sexuală, prin ocuparea site-urilor de legare celulară și concurența pentru nutrienți. În plus, producția de acid lactic de către membrii microbiotei oferă un mediu acid în interiorul vaginului, care servește și ca apărare împotriva infecțiilor.

Pentru majoritatea femeilor, bacteriile producătoare de acid lactic din vagin sunt dominate de o varietate de specii de  Lactobacillus. Pentru femeile care nu au suficient lactobacili în vagin, producția de acid lactic provine în principal din alte specii de bacterii, cum ar fi  Leptotrichia spp., Megasphaera spp., și  Atopobium vaginae.

I. 2. Infecțiile tractului urinar – descriere, diagnostic și clasificare

Infecțiile tractului urinar (UTI) sunt printre infecțiile bacteriene frecvente la nivel mondial. Deși femeile, în special cele cu vârste cuprinse între 16 și 64 de ani, sunt mult mai susceptibile să experimenteze UTI decât bărbații, infecțiile urinare apar în mod repetat la ambele genuri, cât și la toate grupele de vârstă, populații explicite, cum ar fi femeile însărcinate, vârstnicii sau pacienții cu leziuni ale măduvei spinării, catetere sau diabetul care are, de asemenea, un risc crescut.

Cele mai multe infecții ale tractului urinar rezultă din ascensiunea bacteriilor din uretră la vezică și eventual rinichi. Creșterea bacteriană este considerată esențială pentru evaziunea răspunsului imun al gazdei și pentru stabilirea cu succes a infecției. Mai mult, creșterea bacteriilor este esențială pentru majoritatea antibioticelor în uz clinic pentru a-și exercita efectul .

UTI constituie un model extrem de relevant de adaptare microbiană, în care rolurile contrastante ale agenților patogeni și ale comensalelor sunt clar afișate. Agenții patogeni perturbă bariera mucoasă la nivelul rinichilor, cauzând boală severă, potențial periculoasă pentru viață, urosepsis și mortalitate. Pielonefrita recurentă este, de exemplu, o cauză a bolii renale în stadiu final, cu morbiditatea și necesitatea de dializă și transplant, pe lângă sarcinile personale și economice asociate cu boli cornice .

De asemenea, Danemarca, cu o populație de 5,5 milioane de locuitori, tratează anual între 200.000 și 300.000 de cazuri de infecții ale tractului urinar, iar în alte țări se observă un număr comparabil. Unul dintre motivele pentru cazurile numeroase de infecții urinare este frecvența lor mare de recurență. Un total de 20% până la 40% dintre femeile tratate pentru UTI prezintă cel puțin o recidivă în 6 luni de la infecția inițială. Mai mult, UTI-urile recurente sunt adesea cauzate de aceeași clonă, ceea ce sugerează că uropatogenii au mecanisme care le permit să sustragă răspunsul gazdă și tratamentul cu antibiotice.

Prin urmare, tratamentul cu antibiotice empirice este adoptat frecvent. Cu toate acestea, din cauza diferențelor notabile locale în incidența agenților urinari, a apariției de noi agenți patogeni și a modificărilor rezistenței antimicrobiene, se sugerează evaluarea periodică a epidemiologiei agenților patogeni, pentru a revizui sfaturile de tratament. Deoarece factorii esențiali de gazdă pot implica etiologie urinară și sensibilitate la antibiotice, anumite grupuri de pacienți trebuie să fie cercetate mai detaliat.

Infecția tractului urinar (UTI) poate fi simptomatică sau asimptomatică. Diagnosticul UTI simptomatice este de obicei simplu, bazat pe simptome, semne și sprijin din datele de laborator. Cu toate acestea, diagnosticul de UTI poate fi destul de dificil de făcut la pacienții care nu sunt capabili să recunoască simptomele, de exemplu: pacienții cu deficiențe senzoriale, cum ar fi leziuni ale măduvei spinării sau care sunt cateterizate sau la pacienții cu tulburări cognitive.

Infecțiile tractului urinar simptomatice sunt de obicei caracterizate printr-un sindrom clinic, împreună cu dovezi de piurie și / sau bacteriurie.

Piuria reprezintă leucocitele sau globulele albe din sânge (Wbc) într-o probă de urină, cu un prag de > 10 WBC / câmp de mare putere cu microscopie de urină. Valoarea predictivă a diferite praguri de piurie pentru UTI fiind neclară.

Bacteriuria denotă prezența (la microscopie sau cultură) a bacteriilor în urină. Astfel la un pacient fără semne sau simptome ale unei UTI, aceasta este denumită bacteriurie asimptomatică (ASB). Bacteriuria asimptomatică este prezența bacteriilor în urina normal sterilă a vezicii urinare sau a rinichilor, împreună cu absența semnelor clinice sau a simptomelor atribuibile infecției tractului urinar. Bacteriuria asimptomatică mai este denumită infecție a tractului urinar asimptomatic și, ocazional, colonizare a vezicii urinare.

Cele două sindroame clinice majore observate sunt UTI inferioare (cistită sau infecții ale vezicii urinare) și UTI superioare (pielonefrite sau infecții renale). Rareori, pacienții pot dezvolta UTI bacteriotice asimptomatice, unde culturile de urină și sânge cresc același agent patogen în absența simptomelor clinice.

Astfel, cistita necomplicată se manifestă de obicei prin disurie, frecvență și / sau urgență fără febră, iar pielonefrita se manifestă de obicei prin febră și dureri de spate / sensibilitate a unghiului costovertebral. Cu toate acestea, piuria este de obicei prezentă cu UTI, indiferent de locație, iar absența sa sugerează că o altă condiție poate fi cauza simptomelor pacientului.

Tratamentul cistitei este de obicei simplu cu unul dintre mai multe regimuri antimicrobiene eficiente cu curs scurt, deși rezistența la antimicrobiene continuă să crească și poate complica opțiunile de tratament în anumite zone.

I.3. Infecțiile tractului urinar asociate cateterului

Infecția tractului urinar asociat cu cateterul (CAUTI) este cea mai frecventă infecție legată de asistență medicală folosită în mod obișnuit în obstrucția urinară și incontinență la pacienții bolnavi critici cu cateterizare îndelungată (mai mult de 30 de zile), care este aproape invariabilă la toți pacienții în termen de 14 zile de la cateterizare, ceea ce crește morbiditatea, mortalitatea și cheltuielile de tratament.

În prezent 70%-80% din infecțiile tractului urinar sunt infecții ale tractului urinar asociate cateterului (CAUTI). Aproximativ 12% -16% dintre pacienții spitalizați vor avea plasat, la un moment dat în timpul spitalizării lor, un cateter urinar intern (UIC) și, prin urmare, sunt expuși riscului pentru infecția tractului urinar asociat cateterului. Astfel cu trecerea fiecarei zi în care cateterul rămâne plasat, un pacient are un risc crescut de 3% -7% de a dobândi infecția (CAUTI).

Cateterele urinare sunt niște dispozitive medicale tubulare, fabricate din silicon sau latex, inserate prin uretră până la vezica urinară, putând fi un sistem de tip deschis sau închis. In cele de tip deschis, urina este drenată într-un centru de colectare deschis, spre deosebire de cele cu sistem închis, unde urina este colectată într-o pungă de plastic. Primul tip de cateter urinar prezintă șanse de contaminare mai mari față de cel de-al doilea, putând duce cu ușurință în câteva zile la infecții ale tractului urinar (UTI). Cele mai frecvente infecții de acest tip sunt generate de asocieri în biofilme ale unor bacterii precum Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Preoteus mirabilis, Klebsiella pneunomiae și alte bacterii Gram negative. Dintre pacienții ce necesită instalarea unui cateter urinar pe termen scurt (până la 7 zile), doar între 10 și 20% vor dezvolta infecții ale tractului urinar, în timp ce majoritatea pacienților supuși unei cateterizări pe termen lung vor dobândi UTI. Ionii bivalenți (calciu și magneziu) conduc la creșterea pH-ului și tăriei ionice ale urinei, ceea ce duce la sporirea atașării bacteriilor. Unele dintre microorganismele implicate în generarea de UTI au capacitatea de a sintetiza urează, care hidrolizează urea. Creșterea pH-ului are ca rezultat precipitarea mineralelor. Biofilmele conțin minerale, care formează depozite ce pot bloca complet lumenul cateterului .

În legătură cu infecțiile tractului urinar se află și prostata, o glandă ce poate fi infectată cu bacterii ce migrează dinspre uretră sau din cauza unui reflux al urinei infectate în ductul prostatic (Domingue și Hellstrom, 1998). Odată ajunse la acest nivel, bacteriile se multiplică rapid și pot forma microcolonii și biofilme. Drept rezultat, pacienții vor suferi de prostatită cronică bacteriană, microorgansmele răspunzătoare de această afecțiune sunt: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, specii ale genului Klebsiella, Proteus, Serratia, Bacteroides, etc (Donlan și Costerton, 2002).

I.4. Infecțiile recurente ale tractului urinar (rUTI) – studii de caz

Infecțiile tractului urinar recurente (rUTI – definite ca trei sau mai multe UTI-uri într-o perioadă de 12 luni) contribuie în mare măsură la incidența și la ratele de morbiditate ale UTI, deoarece peste 30% dintre femei vor experimenta o infecție ulterioară în termen de 12 luni de la rezolvarea simptomelor inițiale în ciuda terapiei adecvate cu antibiotice. Astfel, UTI-urile devin din ce în ce mai dificile de tratat din cauza răspândirii rapide a rezistenței la medicamente printre organismele Gram-negative, inclusiv UPEC .

De aceea rUTI este o afecțiune obișnuită și greoaie, care reprezintă până la 3% din programările medicale pe an. Aceasta afectează mai mult de jumătate din femei în timpul vieții lor, afectând în mod disproporționat femeile aflate în post-menopauză. Cele mai multe prezentări ale UTI recidivante vor fi la medicii specialiști, astfel încât ei să recunoască și să gestioneze UTI recurente, și când trebuie să se refere la îngrijiri secundare.

În ultimii ani, cercetătorii au realizat diferite studii în care au urmărit incidența infecțiile recurente / recidivante ale tractului urinar, în raport cu diferiți factorii. Printre acestea se regăsesc următoarele:

Infecțiile tractului urinar posttransplant (UTI) – reprezinta o sursă continuă de morbiditate și insuficiență a grefei. Infecția tractului urinar fiind cel mai obișnuit tip de infecție bacteriană contractată de către beneficiarii grefelor renale în perioada posttransplant. Cu toate acestea UTI recidivantă este frecventă în rândul beneficiarilor de rinichi și asociată cu rezistența la mai multe medicamente, iar factorii de virulență a speciilor de Klebsiella par să fie cei mai responsabili pentru dezvoltarea infecțiilor urinare superioare la beneficiarii de transplant de rinichi. Mai mult decât atât, într-o unitate în care incidența recurentă a UTI după transplantul de rinichi a fost de 72%, iar specia Klebsiella a fost uropatogenul predominant, infecția nosocomială și bacteriile rezistente la mai multe medicamente păreau a fi factori predictivi independenți. Într-un studiu efectuat pe 161 de pacienți transplantați la un singur centru, între 2003 și 2005, 41 de pacienți (25%) au dezvoltat cel puțin o infecție urinară, iar într-un alt studiu care a inclus 177 de pacienți transplantați între, 2000 și 2005, 75% dintre pacienți au dezvoltat această infecție. S-a demonstrat în diferite studii faptul că, frecvența UTI variază de la 30% la 79%, cu aproximativ 60% din bacteremia originară acestui site. De asemenea, atât Sqalli, cât și asociații, precum și Hussain și asociații au raportat incidențe similare ale UTI printre pacienții lor (42% și 46%). Cercetarea s-a bazat pe obiectivul primar în transplantul de organe, reprezentat de realizarea unei bune funcții de grefă simultan cu prevenirea și tratamentul eficient al infecțiilor

Infecțiilor tractului urinar recurente la copii – Pentru pediatrie rUTI continuă să reprezinte o provocare semnificativă pentru furnizorii de servicii medicale și sistemul de asistență medicală. Diagnosticul precis este vital pentru prevenirea utilizării necorespunzătoare a antibioticelor. Diagnosticul unei astfel de infecții poate fi dificil, în special la copii febrili, deoarece ratele de rezistență la antibiotice continuă să crească, ceea ce limitează opțiunile de tratament oral. Antibioticele profilactice care sunt utilizate în mod obișnuit pentru a gestiona infecțiile urinare recurente (rUTI), au dus în timp la creșterea riscul de apariție a rUTI, cu tulpini rezistente la antibiotice, fără a reduce semnificativ cicatrizarea renală. Terapii alternative pentru rUTI includ probiotice și antocianidine (de exemplu, extract de afine) pentru a reduce colonizarea intestinului de uropatogeni și pentru a preveni aderența bacteriană la uroepitelii, dar datele privind eficacitatea acestor tratamente sunt rare.

Implicația infecției recurente a tractului urinar în necroza vezicii urinare și perforația în stadiul terminal al bolii renale – infecția tractului urinar este frecventă la pacienții cu boală renală în stadiu final (BESRD) care au producție reziduală de urină, de aceea infecțiile la pacienții cu BESRD care fac și dializă sunt asociate cu rate crescute de complicații și mortalitate datorată imunosupresiei. Un astfel de caz este descris de către Olanipekun T și asociații săi, unde o pacientă în vârstă de 57 de ani cu antecedente medicale de cistită recurentă, diabet zaharat (de tip 2) și BERS pe hemodializă, admisă pentru șoc septic și presupusă colită ischemică, a prezentat în a doua zi de internare rezultate notabile pentru testele de Escherichia coli, precum și o stare deteriorată semnificativ. În urma efectuări mai multor analize medicale s-a dovedit faptul că, pacienta are necroză vezicală și rupture, în timpul efectuării laparotomiei pentru peritonita suspectată. De aceea, este important ca personalul medical să recunoască ruptura vezicii urinare ca o potențială complicație a cistitei bacteriene recurente la pacienții cu RDS pe dializă.

Frecventa infectiei tractului urinar este definit ca având boala mai mult de trei ori pe an și poate include: sex, condiție fizică, vârstă, urinare, și catetere de sânge, diabet zaharat, pietre urinare, utilizarea recentă de antibiotic, durata de spitalizare. Modelul rezistenței la medicamente variază în funcție de localizarea geografică și se poate datora interferențelor cromozomiale, plasmidiale și extra-cromozomiale. Rezistența la medicamente este, de asemenea, influențată de durata și cantitatea de agenți antibacterieni utilizați, de exemplu, utilizarea crescută a fluorochinolonelor în spital este direct asociată cu creșterea rezistenței bacteriene la fluorochinolone .

I.4. Infectiile tractului urinar cauzate de tulpini uropatogene de Escherichia coli

Cele mai frecvente bacterii care provoacă UTI sunt bacteriile Gram-negative, în principal tulpinile aparținând genurilor de E. coli uropatogenic (UPEC). Antibioticele sunt cea mai prescrisă terapie pentru tratarea UTI-urilor însă, cu toate acestea, tulpini UPEC rezistente la medicamente (MDR) au apărut recent, împiedicând astfel tratamentul și controlul acestor infecții. În consecință, WHO a inclus E. coli într-o listă de agenți patogeni, pentru o atenție specială datorită profilului lor de MDR și a dificultății pe care aceasta le prezintă pentru tratamentul și controlul bolilor la care aceste bacterii dau naștere. De asemenea, a încurajat dezvoltarea unor terapii alternative pentru tratamentul acestor boli. În Mexic, UTI sunt a treia cauză de morbiditate în rândul populației generale și a doua la femei. Mai mult, se știe că UTI persistente sunt frecvente și boala devine recurentă în majoritatea cazurilor.

Cele mai multe UTI sunt inițiate atunci când bacteriile UPEC intră în tractul urinar prin meatul urinar înainte de a urca în sus în uretră și în lumenul vezicii urinare. Infecțiile izolate ale vezicii urinare și ale tractului urinar inferior fără semne sau simptome ale tractului urinar superior sau infecție sistemică sunt denumite „cistită necomplicată” sau „simplă cistită”. În aproximativ 0,34% din cazuri, agenții patogeni care provoacă cistită urcă mai departe prin uretere în rinichi, unde provoacă o infecție a pelvisului renal, calicilor și cortexului care duce la semnele și simptomele clinice ale pielonefritei. Dacă este lăsată netratată, agenții patogeni se pot răspândi din rinichi în fluxul sanguin (bacteriemie) și dacă este prezent un răspuns inflamator sistemic concomitent, acest lucru poate duce la septicaemie.

E. coli uropatogen (UPEC) determină marea majoritate a UTI, dar agenți patogeni mai puțin obișnuiți, cum ar fi Enterococcus faecalis și alți enterococi, profită frecvent de un tract urinar anormal sau cateterizat pentru a provoca infecții oportuniste. În timp ce terapia cu antibiotice a avut un succes istoric în controlul UTI, rata ridicată a recurenței rămâne o problemă majoră și multe persoane suferă de UTI recurent cronică, necesitând regimuri antibiotice profilactice pe termen lung pentru a preveni recurenșa UTI. Avansul cuantic în tehnologiile biologice moleculare și imagistice din ultimii 15 ani, împreună cu maturizarea științei genomice, au dus la o extindere fără precedent a înțelegerii noastre despre patogeneza UTI și la identificarea mecanismelor de virulență necunoscute anterior.

De exemplu, știm acum că UPEC invadează celule epiteliale ale vezicii urinare și au capacitatea de a se reproduce rapid în citoplasma celulelor fațetale superficiale ale uroteliului vezicii urinare, producând între 10.000 și 100.000 de celule fiice dintr-o singură bacterie invazivă în 12-16 ore. Mai mult, apariția globală a UPEC rezistentă la mai multe medicamente în ultimii zece ani evidențiază necesitatea unor strategii terapeutice și preventive alternative de combatere a UTI, inclusiv terapii anti-infecțioase și vaccinuri..

I.5. Tratamenul cu antibiotice în cazul infecțiilor urinare recurente cu E.coli

Bacteriile gram-negative, în special cele din familia de Enterobacteriaceae, sunt cauze comune ale UTI-urilor dobândite în comunitate și a celor spitalizate. Aceste organisme pot achiziționa gene care codifică pentru mai multe mecanisme de rezistență la antibiotic (incluzând lactomaze cu spectru extins (ESBL), AmpC-β-lactamază și carbapenemaze), fapt pentru care evaluarea UTI-urilor suspectate include identificarea simptomelor sau semnelor caracteristice, analizei urinare, testelor cu picătură sau microscopice și cultura urinei, dacă este indicat.

Creșterea ratelor de rezistență la antibiotice necesită utilizarea judicioasă a antibioticelor prin aplicarea principiilor de administrare antimicrobiene. Cunoașterea patogenilor cauzali comuni ai UTI, inclusiv tiparele de sensibilitate locală sunt esențiale pentru determinarea terapiei empirice adecvate.

Terapia antibiotică empirică recomandată de primă linie pentru cistita bacteriană acută necomplicată la femeile adulte sănătoase, care nu sunt însărcinate, este un curs de nitrofurantoină de 5 zile, o doză unică de 3 g de fosfomicină trometamină sau un curs de pivmecilinam de 5 zile. Ratele ridicate de rezistență pentru trimetoprim-sulfametoxazol și ciprofloxacină împiedică utilizarea lor ca tratament empiric al UTI-urilor în mai multe comunități, în special în cazul pacienților care au fost expuși recent la aceștia sau la pacienții care prezintă risc de infecții cu β-lactamaze cu spectru extins (ESBL) – producerea Enterobacteriales.

Opțiunile din a doua linie includ cefalosporine orale, cum ar fi ceflexina sau cefixima, fluorochinolonele și β-lactamele, cum ar fi amoxicilina-clavulanatul. Opțiunile curente de tratament pentru UTI datorită Enterobacteriales producătoare de AmpC-β lactamază includ nitrofurantoină, fosfomicină, pivmecilinam, fluorochinolone, cefepime, piperacilină-tazobactam și carbapenemuri.

Opțiunile de tratament oral pentru UTI datorită ESBLs – E coli includ nitrofurantoin, fosfomicină, pivmecilinam, amoxicilină-clavulanat, finafloxacină și sitafloxacină.

Conform supravegherii europene a rezistenței antimicrobiene raport publicat în 2011, ratele de rezistență a infecțiilor cu E. coli la aminopeniciline au variat de la 39% în Finlanda, până la 71% în Bulgaria. Rezistența la cefalosporine din a treia generație a variat de la 4% în Lituania, Suedia și Norvegia, până la 30% în Slovacia, cu o medie de 11%.

Rezistența la fluorochinolone a variat de la 11% în Finlanda, Suedia și Norvegia, până la 42% în Cipru și Italia.

Rezistența la aminoglicozide a variat de la 3% în Islanda până la 24% în România, cu o medie de 10%.

Toate țările europene au avut rate mici de rezistență la carbapenemuri cu o medie de <0,1% ceea ce este foarte aproape de rezultatele obținute de către Muhamad Ali K. Shakhatreh și asociații săi pentru ertapenem la 0,4%.

În concluzie, tratamentul infecțiilor adevărate cu organisme rezistente la medicamente necesită o reflecție clinică suplimentară cu privire la care dintre puținele antibiotice rămase cu activitate ar trebui să fie ales, dacă terapia unică sau combinată este justificată și când spitalizați sau trecuți la tratament antimicrobian intravenos pentru pacienții bolnavi (aceștia pacienții necesită o observare mai atentă și urmărire mai în amănunt).

CAPITOLUL II.

TESTAREA IN VITRO A DOUĂ PRODUSE ÎMPOTRIVA INFECȚIILOR URINARE RECURENTE CU E. COLI

Infecțiile tractului urinar fac parte din categoria celor mai importante boli infecțioase bacteriene din țările industrializate, fiind mai frecventă în rândul pacienților de sex feminin și al pacienților cu diferite afecțiuni medicale printre care: cancer, transplant de organe, boli autoimune, diabet zaharat, vârstă înaintată sau malnutriție severă, unde riscul de infecție este mult mai ridicat.

Infecțiile uropatogene reprezinta cel mai frecvent tip de infecție urinară cauzată de ascensiunea bacteriilor de natură patogenă (patogenul nosocomial Escherichia coli) din uretră și până la rinichi , Infecțiile produse de acest patogen pot fi împărțite în 2 categorii:

Simptomatice – care din punct de vedere immunologic prezintă un raspuns imun înascut, puternic și leziuni tisulare cauzate de inflamatiile acute repetitive.

Asimptomatice – cauzate/ reprezentate de absența inflamației și a simptomelor, datorită raspunsului imun înascut mult prea slab (lipsa virulenței).

Utilizarea frecventaă a antibioticelor din clasa de fluorochinolone datorită prescripțiilor medicale nerecorespunzatoare pentru pacienti, a dus în timp la dezvoltarea mecanismului de rezistență bacteriană. Drept urmare, în ultimele decenii cercetatorii s-au axat pe descrierea. mecanismelor de rezistență la antibiotic, precum și pe metode alternative de tratament.

II.1. SCOP ȘI OBIECTIVE

Scopul acestei lucrări a fost reprezentat de testarea in vitro a rezistenței antimicrobiene față de infecțiile uropatogene recurente cu E.coli. la timpi diferiți de prelevare.

În vederea atingerii acestui scop, au fost propuse urmatoarele obiective:

Testarea viabilității probelor

II. 2. MATERIALE

Probele folosite în experiment

În experiment s-au folosit probe de urină, obținute in vitro prin intermediul unui sistem reconstituit în cadrul laboratorului, care permite investigarea etapelor de infectare/colonizare a vezicii urinare (sterile) cu un agent pathogen, și până la procesul de eliminare al urinei.

Proba inițială de la care am pornit experimentul provine de la un pacient anonim, diagnosticat cu infecție urinară recurenta cu Escherichia coli uropatogenă .

Sistemul in vitro reconstituit în cadrul laboratorului (Fig. 3.), care scopul de a imita cât mai realist posibil anatomia tractului urinar are ca sursă de inspirație:

modelul de vezică urinară dezvoltat în 1999 de către Stickler și colab.

modelul de tract urinar in vitro dezvoltat la scară mică de către Gaonkar și colab.

Modul de funcționare a sistemului in vitro – descriere

Schema tractului urinar in vitro descrie migrația agenților patogeni de-a lungul suprafeței cateterului cateter intern din meatul urinar în vezică. Modelul este format din două tuburi: tubul 1 este un tub mai îngust deschis, cu un capac la un capăt și o plută de cauciuc cu o gaură în el la celălalt capăt, iar tubul 2 este un vas mai mare care este deschis la un capăt pentru a se conecta la Tubul 1 și închis la celălalt capăt pentru a colecta urina. Toate părțile sunt sterilizate în prealabil cu dioxid de etilenă.

Porțiunea de uretră de agar este formată prin plasarea unui segment de cateter aseptic în partea superioară a tubului 1 și fixată prin împingerea prin orificiul din pluta de cauciuc înainte ca agarul topit să fie turnat pe laturile cateterului și, odată solidificat, pluta de cauciuc este îndepărtată . Tubul 1 este apoi fixat în partea de sus a tubului 2 pentru testare.

Metodologia modelului dezvoltat de către Gaonkar și colab. presupune inocularea meatului urinar (zilnic) cu bacterii, apoi umplerea de sus a tubului 1 cu urină sterilă zilnic. Probele sunt prelevate din urină în vârful tubului 1 periodic pentru a evalua dacă bacteriile au migrat pe cateter și la ce concentrații (Fig. 1.).

Fig. 1. Gaonkar și colab.- schema modelului tractului urinar in vitro.

(Sursa: https://www.hindawi.com/journals/jhe/2018/2986742/)

Vezica urinară – este formată dintr-un vas, sterilizat în prealabil, umplut cu apă (temperatura apei fiind de 37 ° C ). S-a introdus apoi un cateter intern, printru-un tub de ieșire al vasului, balonul de retenție fiind umflat pentru a menține cateterul la locul său, înainte de a fi atașat la un dren. Urina sterilă este apoi pompată în model printr-o pompă peristaltică și apoi se poate scurge prin cateter în drenul atașat un vas de prelevare (Fig. 2.) .

Fig. 2. Schema unui model de vezică urinară in vitro așa cum este descris prima dată de Stickler și colab.

(Sursa: https://www.hindawi.com/journals/jhe/2018/2986742/)

Fig. 3. Modelul de tract urinar in vitro dezoltat în laborator.

Probe de urină (ATTC) utilizate în cadrul experimentului (Tabel 1.) sunt numerotate după cum urmează: P0, P1, P2, P3, P4.

Tabel 1. Probele folosite în prima parte a experimentului (martorii)

În a doua parte a experimentului realizat, probele sunt reprezentate de un ATTC care contine o cantitate cunocută (“ X “) de ciprofloxacina ( “ X” ):

P1: ATTC CIP 24h;

P2: ATTC CIP 48h;

P3: ATTC CIP 72h;

P4: ATTC CIP 96h;

Examinarea macroscopică a urinei

Probele de urina au fost examinate macroscopic, urmărindu-se:

Culoarea;

Gradul de turbiditate;

Prezența și natura sedimentului (dacă acesta există) .

Testarea viabilității probelor

Pentru a testa viabilitatea probelor s-au utilizat urmatoarele:

Metoda diluțiilor;

Tehnica însămânțării pe mediu solid.

Material biologic:

Provine de la un pacient anonim, diagnosticat cu infecție urinară recurenta cu Escherichia coli uropatogenă, de aceea probele de ATTC obținute au pornit de la o singură tulpini de referință:

Escherichia coli ATCC 25922 (prototip al bacteriilor Gram-negative).

Alte materiale:

Ser fiziologic;

Bec de gaz;

Plăci petri cu diametrul de 90 mm;

Tuburi Eppendorf;

Micropipete;

Vârfuri sterile;

Ansă Drigalski.

II. 3. REZULTATE ȘI DISCUȚII

OBIECTVUL 1: TESTAREA VIABILITĂȚII PROBELOR

Următorul obiectiv s-a realizat în condiții aseptice (hotă cu flux laminar, apropierea flăcării unui bec de gaz):

A. Realizarea dilutiilor.

B. Însămânțarea pe mediu solid selectiv MacConkey, având ca scop examinarea cantitativă și calitativă a probelor luate în lucru.

A. Pentru realizarea acestui experiment, s-a utilizat metoda diluțiilor, o metodă pretențioasă din punct de vedere tehnic și cu un consum mare de material, care permite stabilirea precisă a CMI și CMB.

Se realizează diluții crescânde pornind de la suspensiile microbiane patogene (ATTC-uri) în mediu lichid de ser fiziologic (Na 0,9%). Aceste diluții 1:10 se fac în tuburi Eppendorf astfel:

100 µl proba ATTC în 900 µl de ser fiziologi.

Diluțiile s-au facut din aproape în aproape, mergând cu ele pana la 10-7.

Fig. 4. Spațiul de lucru în care s-au realizat experimentele

B. După realizarea diluțiilor, se însămânțează 100μl de suspensie din ultima diluție (atât în prima parte a experimentului, cât si in a doua parte a acestuia s-a insamanțat de la supensia 10-5 pâna la 10-7 ) pe mediul solid, lactozat semiselectiv Mac Conkey. Suspensia se dispersează cu ajutorul ansei Drigalski (sterilizata in prealabi prin flambarea port-ansei). Plăcile au fost apoi incubate 18-24 h la 37 ⁰C. După incubare, pe suprafața plăcilor s-a observat creșterea unor colonii. Însămânțarea unei cantități fixe de suspensie, reprezintă o condiție obligatorie pentru a putea aprecia numărul de germeni/ml urină. Rezultatele s-au interpretat prin examinarea macroscopică a colonilor izolate.

Pentru probelor folosite în prima parte a experimentului (ATTC-urile martor) s-au obținut următoarele rezultate:

In primele probe lucrate, pentru P1si P4 la diluția 10-7 s-a constatat apariția un număr semnificativ de colonii – 13, respectiv 25 de colonii, pe când probele de P2, P3 – la diluția 10-7 au prezentat un numar mai mic de colonii, cu aceleasi caracteristici prezentate mai sus (Fig. 5 .).

Fig. 5. Martor P1 – 24h dil 10-7 și P4 – 96h diluția 10-7

S-au facut mai multe repetari pentru o mai buna izolare a coloniilor respective, reușind astfel examinarea macroscopică a acestora. Toate probele au prezentat colonii izolate de E.coli. S-au observat astfel apariția unor colonii de tip S, lactozo-pozitive, culoarea roză fiind dată de fermentarea lactozei din mediu, precum și de modificarea ph-ului acestuia, care devine acid ( coloniile au absorbit rosul neutru și au produs acid). De asemenea culoarea galbenă a mediului sugerează apartenența acestor colonii în clasa de germeni facultativ anaerobi (Fig. 6.)

Fig. 6. Martor P3 și P4 – diluția 10-7

În cea de-a doua parte a experimentului pentru probele de ATTC cu ciprofloxacină s-au făcut diluții până la 10-8, obținându-se urmatoarele rezultate:

Pentru P1 și P3 – diluția 10-7 se observă 15 și respectiv 5 colonii de tip S (Fig. 7.) De asemenea pentru proba P1 la diluția 10-8 s-au obținut un numar de 5 colonii.

Fig. 7. E.coli ATTC cu ciprofloxacină la 24h, respective 72h

Pentru probele P2, P4 la diluția 10-7 s-au obținut un numar de 8, respectiv 4 colonii (Fig. 8.)

Fig. 8. E.coli ATTC cu ciprofloxacină la 48h și la 96h.

Cele mai relevante rezultate obținute sunt sintetizate în Tabelul 2.

Tabelul 2. E.coli (colonii lactozo-pozitive): urocultură cantitativă pe mediul solid Mac Conckey

Reprezentarea grafica a valorilor UFC/ml ale probelor P1, P2, P3, P4 se regasesc în Fig. 11, care indică faptul că probele de ATTC cu conținut de ciprofloxacină inhibă dezvoltarea coloniilor formatoare de E.coli, stimulând astfel activitatea antimicrobiană a ciprofloxacinei față de acest agent pathogen.

Fig. 11. Reprezentarea grafică a numărului de UFC/ml cuantificat la intervale de timp analizate (24h, 48h, 72h, 96h).

II. 4. CONCLUZII

Cuantificarea numărului de unități formatoare de colonii (UFC), pentru fiecare probă a indicat că că probele de ATTC cu conținut de ciprofloxacină inhibă dezvoltarea coloniilor formatoare de E.coli, stimulând astfel activitatea antimicrobiană a ciprofloxacinei față de acest agent pathogen (Escherichia coli ATCC 25922).

Interpretarea rezultatelor obținute indică faptul ca: în urina martor de la care s-a pornit experimentul prezintă cu certitudine o infectie urinară, datorita numarului de germeni identificati (≥ 100.000 germeni/ml urină – infecția urinară este certă)