Tehnologia de purificare a [604935]

Universitatea “Babeș – Bolyai”
Facultatea de Chimie și Inginerie Chimică

Tehnologia de purificare a
hemoglobinei bovine și utilizarea ei î n
studiul compuș ilor antitumorali

Student: [anonimizat]: IV IB

Cuprins
Partea I
1. Obiectivele p roiectului. Prezentarea generală a produsului
2. Procese de obținere; justificarea alegerii procesul ui adoptat. Studiu de literatură
3. Analiza desfășură rii procesului
3.1. Chimismul procesului de bază
3.2. Modelarea procesului
3.2.1. Bilanț de masă
3.3. Schema de operaț ii
3.4. Schema fluxului tehnologic
3.5. Schema de măsurări în proces ș i control
4. Proiectarea tehnologică: Dimensionarea tehnologică a unui utilaj cheie
5. Aspecte ecologice și de protecț ia mediului
Partea II
1. Generalitati
1.1. Medicamente antitumorale
1.2. Stresul oxidativ si nitrozativ
1.3. Structuri proteice
2. Materiale și metode
3. Rezultate și discuții. Influențele diverșilor parametri
3.1. Reacția dintre structurile proteice de interes și compușii antitumora li
3.1.1 . Metode spectroscopice de absorbție moleculară UV -vis
3.1.2 . Metode spectroscopice de fluorecență moleculară
3.2. Reacția de autooxidare a hemoglobinei în prezența compușiilor antitumora li
3.3. Activitatea ascorbat peroxidazică a hemoglobinei în prezența compușilor
antitumorali
3.4. Reacția hemoglobinei cu azotitul
3.4.1 . Reacția dintre azotit și compușii antitumorali
3.4.2 . Reacția hemoglobinei cu azotitul în prezența compușilor
antitumorali
3.4.3 . Activitatea enzimatică a catalazei

Partea II I
1.Concluzii
2.Lista de simboluri
3.Lista programelor folosite
4.Bibliografie

Partea I

1. Obie ctivele proiectului. Prezentarea generală a produsului
Să se întocmească proiectul de inginerie tehnologică a unei instalații pe ntru purificarea
hemoglobinei bovine din sânge. Instalația tehnologică va funcționa în regim discontin uu și va
avea capacitatea de 1.8 K g/șarjă. Se urmă rește obț inerea un ui produs finit de o puritate cât mai
avansată și cu o instalație cât mai simplă care să implice costuri cât mai reduse .

Prezentarea generală a produsului
Produsul finit este utilizat în partea a doua a studiului în vederea urmă riri toxicității
compuș ilor antitumorali asupra hemoglobinei din sâ ngele bovin .
Globinele descriu o clasă vastă de proteine care au ca numitor comun echipamentul
proteic de bază necesar existenței vieții. Din punct de vedere str uctural această clasă de proteine
este definită de prezența unui rest proteic , bogat în α-helixuri , dispu s în jurul unei grupări
specific e numite hem .[¹] Astfel molecula standard de globin ă este caracterizată de pliere a
canonică, elicoidală , a unui lanț p roteic hidrofob în proximitatea grupării heminice al că rei centru
activ es te un atom de fier . Aspectul funcț ional prezintă interes deosebit datorită diversității
acestuia. Principala funcție a acestor proteine este aceea de a lega reversibil oxigenul în vederea
transportăr ii și depozitării lui, dar de o importanță majoră este și rolul citoprotector împotriva
speciilor oxidative, capacitatea de semnalizare în căile metabolice dependende de oxigen și
proprietăți care implică transferul de liganzi și electroni .
Metaloproteinele sunt caracterizate de prezența unei grupări specifice denumite hem,
extre m de activă chimic, care este implicată în numeroase funcții biologice incluzând funcția de
transport prin membrană și prin spațiile intercelulare pentru diferiți ioni și molecule, funcția de
selectivitate în vederea facilitării accesului substanțelor biol ogic active până în interiorul cel ulei,
capacitatea de legare a liganziilor ( O2, NO, CO ), neutralizarea speciilor redox lib ere, ș.a.
Specificitatea funcțională a grupării heminice precum și activitatea acesteia este direct corelată
cu aranjamentul proteic hidrofob și tridimensional cu care această grupare este asociată .[²]

Proprietățiile funcționale ale globinelor pot fi modulate de mecanisme non -covalente
(alosterice), care implică inducerea de intereracțiuni non -covalente de către ligand, sau prin
mecanisme de reglare cov alene care se raportează la legă turile de fosforilare respectiv de
defosforilare.
Dintre globine prezintă interes următoarele:
Mioglobina (Mb ), este o globină monomerică care îndeplineș te rolul de stocare și
facilitare a difuziei de oxigen la nivel ul celulelor musculare striate și la nivelul celulelor
mușchiului cardiac. Mai mult decât atât mioglobina catalizează că ile de detoxifiere pseudo –
enzimatică ale speciilor reactive de oxigen și azot , protejea ză respirația celulară, influențează
căile redox î n mușchiul c ardiac și protejează inima de daunele oxidative . În plus, proprietăț ile
funcționale ale mioglobinei par să fie modulat e și non -hemic de către conformațiile stabilite cu
diferiț i liganzi. Ca vitățile din interiorul matricei proteice a mioglobinei facilitează multiple
conexiuni ligand -hem, care îndeplinesc numeroase funcții cum ar fi stocar ea, reacțiile multi –
ligand, ș i tranziți ile conformaț ionale ale liganzilor care susțin legarea.
Citoglobina (CYGB ), cunoscută și sub numele de histoglobină este o globină ce se
asoci ază cu funcția de activare a celulelor stelate și se găsește î n concentrații semnificative în
creier, ochi, ficat, inimă și mușchi scheletici. Funcția princi pală a cit oglobinei este neclară , deși
au fost propuse numeroase roluri ale citoglobinei cum ar fi: rolul de a asista la transportul O 2 în
lanțul respirator mitocondrial, rolul enzimatic de a funcționa ca o NO -dioxigenază , facilitarea
reducerii azotitului și reglare a concentrației de NO î n celule, precum și protejarea celulei
împotriva stresului oxidativ printr -un mecanism redox de consum al peroxidului de hidrogen.
Exprimarea citoglobinei la nivelul celulelor tumorale ca agent de suprimare a dezvoltării acestora
o convertește într -un nou target în terapia cancerului.
Neuroglobina (NGB) este un mono mer hem -proteic hexa -coordinat, exprimat nu numai
în neuronii sistemului nervos central da r și în cel periferic și în tractul gastro -intestinal și
organele en docrine. Neuroglobina se leagă de mai mulți liganzi, inclusiv O 2, CO, și NO, afișând
proprietăț i pseudo -enzimatice și joacă un rol important în diminuarea stresului oxidativ . Cu toate
acestea, aprovizionarea cu O 2 prin neuroglobină la mitocondriile celulel or neuron ale este un
subiect intens dezbătut deoarece în vitro, în prezența unor concentrații ridicate de O 2
neuroglobina reduce nivelul de NO, însă la concentrații scă zute de O 2, neuroglobinele pot
reacț iona cu NO 2 cu formare de NO. [³]

Hem oglobina truncată (tHb) prezentă î n bacte rii și organismele inferioare ș i leg-
hemoglobina (leg-Hb) care se găsește în plante, în general î n legume, sunt o altă clasă de globine
cunoscute ca globine cu funcție enzimatică .[⁴]
Hemoglobina joacă unul dintre cele mai importante roluri în rândul globinelo r fiind
cunoscută ca o metalopro teină specializată î n transportul oxigenului de la plămâ n spre celulele
corpului und e aceasta este implicată în realizarea proceselor oxidative. [⁵] Hemoglobi na apare în
circulația sanguină în urma eritrocitolizei și reprezint ă cca. 90% din masa uscată eritrocitară .[⁶]
Aceasta prezintă o structură cuaternară, tetramerică, fiind formată din două tipuri de catene
polipeptidice pliate (α cu 141 de aminoaciz i și β cu 146 d e aminoacizi , pentru HbA) fiecare
conținând câte 8 α -helixuri (notate de la A la H) .[⁶] [⁷] Structura proteinei este stabilizată prin
legăturile de hidrogen, forț e van der Waals și legături intra – și intermoleculare .[⁸]
Hemul este o cavitate h idrofobă în formă de V , poziționată în apropierea suprafețelor
celor patru subunități tetramerice , care conține un centru de fier coordinat de porfirină . În cazul
hemoglobinei atomul de Fe stabilește 4 legă turi cu sistemul imidazolic și o legatură cu histi dina
proximală din lanțul polipeptidic, dev enind astfel un centru pentacoordinat , cu o singură poziție
liberă , caracteristic formei deoxi -hemoglobinei. În poziție trans față de cea mai apropiată
histidină coordinată la Fe, aceasta definește împreună cu histidina distală a lanțului polipeptidic o
cavitate cu dimensiuni limitate, deasupra atomul ui de Fe destinată legării oxigenului , caz în care
atomul de Fe devine hexacoordinat , formă specifică oxi-hemoglobinei . În conformaț ia oxi-
hemoglobi nei atomul de Fe st abileș te o legatură de hidrogen prin intermediul oxigenului
molecular cu histidina distală .[⁵][⁹] Conformația terțiară a hemoglobinei reglează frecvența
vibrațiilor helixurilor din proteină utilizând un model alosteric dinamic . Aceasta frecvență
modulează probabilitatea ca molecula de oxigen s ă se fixeze la atomul de fier , modificând
afinitatea subunităț ilor hemoglobinei pentru oxigenul molecular. Astfel o frecvență scăzută este
asociată cu o probabilitate mare de a fixa oxigenul, iar o frecvență mare cores punde unei
probabilități reduse de a fixa oxigenul. În condiții normale, la omul matur, eliberarea oxigenului
și procesul de livrare a acestuia către cel ule este modulat de prezența 2,3 -difosfogliceratului, un
produs intermediar al metabolismului glucidelo r, care acționează ca un efector alosteric, de
anumi ți anioni anorganici cum ar fi cloruri, fosfați sau chiar de protoni .[⁵] În afara spațiului
eritrocitar, hemoglobina este susceptibilă denaturării ca urmare a acțiuniilor toxice ale unor

contaminanți, de aceea , pentru ca aceaasta s ă își păstreze funcția de transportor al oxigenului
molecular și în spațiul extrace lular, ea trebuie izolată și purificată în prealabil. [⁸]

2. Procese de obținere; justificarea alegerii pr ocesul ui adoptat.
Studiu de literatură

Hemoglobina are un rol esențial în transportul și livrarea oxigenului și dioxidului de
carbon, având de asemenea și o lungă istorie de utilizare clinică. Necesitatea acesteia în sistemul
sanitar, pr ecum și lipsa de sânge asociată cu o creștere substanțială a cererii aceste ia, au
intensificat c ercetăr ile în cee a ce privește izolarea și purificarea hemoglobinei în vederea
studierii efectelor pe care anumi ți factori le pot avea asupra acesteia. [⁸]
Purificarea hemoglobinei este esențială în determinarea ș i evitarea unor inter ferențe pe
care compusii cu care se găsește asociată i le-ar putea produce î n utilizare. Deasemenea
purificarea hemoglo binei este un prim pas necesar în si nteza purtătoriilor de oxigen dezvoltați în
aplicațiile din medicina transfuzională. Pentru a obț ine o e ficiență cât mai bună a procesului este
necesar să se dezvolte o metodă cât mai simplă de purificare având ca material de pornire
sângele bovin și urmăr ind obț inere a unui produs finit , un tetramer cu un grad înalt de puritate ș i
randament ridicat.
Hemoglobina este izolat ă din sâ ngele bo vin prin supunerea celulelor roșii ale sângelui la
etape succesive de spălare, centrifugare și filtrare, eta pe care descriu un proces de dezintegrare
celulară . Dezintegrarea celulară este o operație care are ca rezultat eliberarea constituenț ilor
citoplasmatici ai eritrocitelor prin ruperea perețiilor celulari și a membranelor . Pentru realizarea
acestei operații se folosesc î n general metode me canice de dezintegrare, datorită simplității,
costului redus și riscului minim de contaminare. Principalele metode mecanice utilizate sunt
dezintegrarea prin destin dere, utilizarea de abrazivi sau dezintegrarea ultrasonică a extractelor
care conț in proteina de interes . Deasemenea în vederea efectuă rii procesului de dezintegrare
putem utiliza și metode nemecanice, adică metode chimice sau enzimatice care ajut ă la ruperea
membranei și eliberarea componenț ilor celulari. Amestec ul rezultat în urma operației de
dezintegrare celulară poartă numele de omogenat celular și este supus unei etape de fracționare

prin centrifugare, după care este indentificată fracțiunea car e conține proteina de interes, aceasta
urmând o etapă de purifica re.
Se cunosc numeroase tehnici de purificare a hemoglobinei din eritrocite , dezvoltate de -a
lungul timpul ui care descriu metode ce se bazează pe proprietăți legate d e masa moleculară, p e
proprietăți elect rice, p e proprietăți hidrofob -hidrofil e precum ș i metode legate de specificitatea
legăturilor.[⁶]
Metoda de bază aplicată are ca prim pas o etapă de centrifugare prin care se urmărește
îndepărtarea proteinelor plasmatice, urmată de adăugarea unei soluții tampon, hipotonice pentru
a extrage hemoglobina din celulele roșii ale sângelui. Această etapă uneori este urmată de
adăugarea unui solvent organic, cum ar fi toluenul, pentru a îndepărta resturile celulare, însă
această metodă prezintă un dezavantaj major, deoarece solventul orga nic poate rămâne î n
cavitatea hidrofob ă a hemoglobinei. Pentru a evita utilizarea solvențiilor organici, au fost
dezvoltate metode de purificare care implică etape de microfiltrare, ultrafiltrare și hemoliză, însă
nici această metodă nu pare a fi eficientă deoarece excese le de reziduri celulare au tendința de a
bloca porii membranelor, fapt ce compromite integritatea acestora. [⁷]
O altă tehnică aplicată este cromatografia de schimb ionic, o cromatografie de absorbție,
în care un analit ionic in teracționează electrostatic cu o fază staționar ă, dar această tehnică s -a
doved it a avea o eficiență redusă existând probabilitatea ca și alte proteine sau lipide să elueze în
produsul final. [⁷]
Specific separării și purificării proteinelor e ste aplicarea unei metode bazate pe
precipitarea fracționată sau diferențiată, care implică două procedee, și anume precipitarea prin
efect salin , reglarea solubilității proteinelor prin variații ale concentrațiilor ionilor salini, și
precipitarea la punct ul izoelectric ,precipitarea proteinelor prin ajustarea pH -ului la punctul de pH
izoelectric .[⁶] Curent folosită, tehnica de precipitare fracționată este o metodă eficientă de
purificare a proteinelor, cu costuri relativ reduse, ce prezintă aplicabilitate ș i în cazul
hemoglobinei.

Justificarea alegerii procesului adoptat

Procesul adoptat este puri ficarea hemoglobinei bovine utilizând o metodă de precipitare
fracționată, și anume precipitarea cu sulfat de amoniu . Această variantă a fost aleasă datorită
eficienței, simplității și costurilor reduse ale procesul ui. Metoda prezintă avantajul obținerii unui
produs finit, hemoglobina bovină, de o puritate ridicată , la o scară largă, fără a exista riscul unei
denaturări ireversibile .

3. Analiz a desfășură rii procesului

3.1 Chimismul procesului de bază

Principalele metode utilizate î n izolarea și purific area proteinelor sunt metodele de
înaltă rezoluție, care implică utilizarea tehnicilor cromatografice pe coloană sau el ectroforeza, și
metodele de separare brută, care au ca principiu de funcționare solubilizare a diferențială a
proteine lor utilizând precipitarea diferențiată la punctul izoelectric sau prin efect salin. Metoda
utilizată pentru purificarea h emoglobinei bovin e este o metodă de separare brută și constă în
precipitarea la rece cu să ruri.
Precipitarea cu săruri poartă numele de salefie re sau efect salting și are ca principiu de
funcționare modificar ea solubilității proteinelor pe baza interacțiuni ilor dintre grupăriile
ionogene ale acestora și ionii salini din soluție . Ionii salini , prin asociere cu moleculele proteice ,
joacă un rol de liant , care la concentrații mici crește volumul sferelor de hidratare ale proteinelor
(efect salting in) , iar la concentrații semnificative determină apariția unei concurențe cu structura
proteică pentru apa de hidratare ce are ca efect îndepă rtarea stratului de hidratare din jurul
moleculei proteice și precipitarea proteinei în soluția apoasă (efect salting out) . [⁶][¹ș]
Cea mai utilizată sare în tehnicile de precipitare fracționată prin efect salin este sulfatul
de amoniu deoarece acesta este o substanță ionică cu o solubilitate relativ ridicată , iar efect ul de
reglaj apare la concentraț ii ma i scăzut e decât la alți ioni . În vederea precipită rii proteinelor utile

(albumine, globuline ș i fibrinogen) este necesară utilizarea unei concentrații de 35% soluție de
sulfat de amoniu, iar restul proteinelor plasmatice rămân în soluț ie.
Pentru înde părtarea soluției ionice utilizată la precipitare se aplică o etapă de dializă .
Dializa este o operație de separare necesară pentru a scoate din prepara tul proteic sulfatul de
amoniu și pentru a modifica pH -ul soluției. Masa brută de proteine izolată este supusă unei etape
de dializă prin utilizarea unui sac membranar semipermeabil, cu dimensiunea porilor controlată,
care se plasează într -un volum mare de soluție tampon. Scopul acestei operații este producerea
unui schimb de substanțe până la atingerea unui echilibru, astfel încâ t proteinel e mari sunt
reținute î n interiorul sacului , iar sărurile și moleculele mai mici difuzează spre mediul exterior.
[⁶]

3.2 Modelarea procesului

Modelarea matematică a unui proce s chimic constituie baza calcu lelor tehnologice care
leagă mărimile de ieșire cu cele de intrare. [¹¹] Bilanțul de materiale are rolul de a estima
consumul specific de materiale și de a determina numărul ș i dimensiunile principale ale
aparatelor necesare realizări i unui proces dat, în condițiile unei cantități de producț ie impuse. [¹²]
Bilanțul de materiale este o expresie a conservării masei î n sistemele chimice.
Ecuația generală de bilanț de material are următoarea formă :
∑ (𝐌𝐢)𝒏
𝒌=𝟏 =∑ (𝐌𝐞)𝒏
𝒌=𝟎 +∑ (𝐌𝐫)𝒏
𝒌=𝟎 +∑ (𝐌𝐩)𝒏
𝒌=𝟎
Unde:
Mi- materiale intrate î n sistem
Me- materiale ieș ite din sistem
Mr- materiale rămase î n sistem
Mp- materiale pierdute î n sistem

3.2.1 Bilanț de masă

Bilanțul de masă se raportează la latura cantitativă a transformărilor de natură fizico –
mecanică, chimică sau biochimică , la care sunt supuse materiile pe parcur sul unui proces
tehnologic.
Ps =𝑷𝒂
𝒏𝒔 Ps-producția pe șarjă
ns-numărul de șarje

ns=𝐅𝐚
𝐭𝐬 Fa-fondul anu al de timp
ts-durata unei șarje

ts=tr+taux

tr-durata procesului, care va fi 36 ore (dia liza fiind cel mai lung proces -24 h)
taux-timpul auxiliar necesar pregătirii instalației, t aux=5 h

ts=36h+5h=41 h
Fa=365 zile* 20,5h/zi=7482,5 h
ns=7482 ,5
41=182 șarje
Ps=0.18 Kg Hb liofilizată
Pa=Ps·ns
Pa =1,8 kg·182 șa rje =32 7,6 Kg Hb liofilizată

Prepararea soluție izotonice de NaCl
Pentru a menține elementele celulare ale sângelui, în special eritrocitele , intacte este
necesară utilizarea unei soluții izot onice, care are presiunea osmotică egală cu cea a serul ui
sanguin. Astfel se prepară 232,59 kg soluție de NaCl de concentrație 1% .
𝐂%=𝒎𝒅 ∗𝟏𝟎𝟎
𝒎𝒔
md=𝑚𝑠∗𝐶
100
ms=md+m apă
ms=2150 Kg
c=1%
md=21,5 Kg NaCl
mapă=2128,5 Kg apă ultrapură
În vederea eliminării plasmei, leucocitelor și tromb ocitelor , componentele celulare ale
sângelui se spală cu o soluție izotonică de NaCl 1%, utilizând un raport volumic sânge:sol.NaCl
de 1:5 . Amestecul format va fi supus la 4 etape de centrifug are, în urma cărora supernatantul va
fi aruncat și se va compl eta cu soluție izotonică până la volumul inițial . Se vor utiliza 1 00 l sânge
bovin cu densitatea de 1,050 g/cm³ .
𝛒=𝒎
𝒗
m=ρ*v
msânge=105 kg (sânge bovin)
Precipitarea cu sulfat de amoniu
Pentru a avea loc precipitarea proteinelor se pr epară o soluț ie de sulfat de amoniu , care se
amestecă cu soluția diluată de precipitat proteic obținut ă în urma centrifugăriilor în raport sulfat
de amoniu :sol. proteică diluată 1:4 (v:v) . Astfel pen tru 236,8 l sol. proteică diluată (ρ ≅1g/cm³) s e
prepară 59,2 l soluție de s ulfat de amoniu cu (ρ =1,769g/cm³ la 20șC) concentrația 35%.
𝛒=𝒎
𝒗
m=ρ*v
𝐂%=𝒎𝒅 ∗𝟏𝟎𝟎
𝒎𝒔

md=𝑚𝑠∗𝐶
100
vsol.=59,2 l sol. sulfat de amoniu
ms=104,72 Kg
c=35%
md=36,65 Kg sulfat de amoniu
mapa= 68,06 Kg apă ultrapură
Prepararea soluției tampon de fosfat salin
Pentru a obține un produs finit cât mai pur și pentru a elimina din amestecul proteic soluția
ionică utilizată la precipitare, soluția proteică este trecută printr -o etapă de dializă care utilizează
un volum mare de soluție tampon. Soluția tampon ultilizată este o soluție salină de fosfat, PBS
(phosphate -buffered saline), cu pH -ul de 7,4, preparată după o rețetă standard. [¹³] Astfel,
necesarul de substanțe utilizate pentru 1000 l sol. PBS este:
-NaCl 8 Kg
-KCl 0,2 Kg
-Na2HPO 4 1,44 Kg
-KH 2PO4 0,24 Kg
-apă ultrapură 1000 l

Tabelul 1. Bilanț de materiale

Randamentul global al procesului ƞ=0.9727

Operația Materiale intrate Materiale ieșite
Denumir e kg/șarjă Denumire kg/șarjă
Dizolvare NaCl 21,50 sol. izotonică NaCl 2150
apă ultrapură 2128,5
Total 2150 Total 2150
Centrifugare
(ƞ=0.98) sânge bovin 105 Supernatant 540,38
Pierderi 12,10
sol. NaCl 500 Precipitat 52,52
TOTAL 605 TOTAL 605
Centrifugare
(ƞ=0.982) sol. proteică 52,52 Supernatant 541,86
Pierderi 10,85
sol. NaCl 550,48 Precipitat 50,28
TOTAL 603 TOTAL 603
Centrifugare
(ƞ=0.9815) sol. proteică 50,28 Supernatant 534,66
Pierderi 11,13
sol. NaCl 551,72 Precipitat 56,20
TOTAL 602 TOTAL 602
Centrifugare
(ƞ=0.98) sol. proteică 56,20 Supernatant 532,72
Pierderi 12,08
sol. NaCl 547,80 Precipitat 59,20
TOTAL 604 TOTAL 604
Resolubilizare masa brută de proteine 59,20 sol. proteică
diluată 236,80
apă ultrapură 177,60
TOTAL 236,80 TOTAL 236,80
Dizolvare sulfat de amoniu 36,65 sol. sulfat de amoniu 104,72
apă ultrapură 68,06
Total 104,72 Total 104,72
Precipitare
(ƞ=0.9795) sol. proteică diluată 236,80 suspensie
proteică 334,52
sol. sulfat de amoniu 104,72
Pierderi 7
TOTAL 341,52 TOTAL 341,52
Centrifugare
(ƞ=0.979) suspensie
proteică 334,52 Precipitat 88,24
Pierderi 7,02
supernatant
(sol. proteică) 239,25
TOTAL 334,52 TOTAL 334,52
Dializă
(ƞ=0.99 5) sol. proteică 239,25 sol. rezidual ă 1216,85
Pierderi 6,19
sol. tampon PBS 1000 sol. hemoglobină 16,20
TOTAL 1239,25 TOTAL 1239,25
Liofilizare
(ƞ=0.9103) sol. hemoglobină 16,20 sol. reziduală 13,10
Pierderi 1,30
hemoglobină liofilizată 1,80
TOTAL 16,20 TOTAL 16,20

3.3 Schem a de operații

sol. NaCl supernatantul

masă brută de proteine
sol. NaCl supernatantul

sol. NaCl supernatantul

sol. NaCl supernatantul

apă ultrapură

sol. sulfat de amoniu

precipitatul

supernatant ul
PBS, pH 7,4

CENTRIFUGARE
CENTRIFUGARE
CENTRIFUGARE
RESOLUBILIZARE
PRECIPITARE
CENTR IFUGARE
DIALIZĂ
LIOFILIZARE
NaCl apă ultrapură
CENTRIFUGARE DIZOLVARE
(NH 4)2SO4 apă ultrapură
DIZOLVARE sânge bovin

Pentru izolarea și purificarea hemoglobinei din sâ nge se va urma procedeu l descris de
Antonini și Brunori .[¹⁴] În vederea eliminării plasmei, leucocitelor și trombocitelor se vor
parcurge o serie de etape de centrifugare succesive . Sângele se amestecă cu o soluție izotonică de
NaCl de concentrație 1%, î n raport 1 :5, obținâ ndu-se astfel un amestec care se supune
centrifugării timp de 15 minute la 2000 r.p.m. După centrifugare supernatantul se aruncă ș i se
completează cu soluție izotonică până la volumul iniț ial; operația se repetă de patru ori.
Volumul final de precipitat rezultat în urma centrifugăriilor ce conține masa brută de
proteine se diluează cu trei volume de apă ultra pură rece. în vederea spargerii celulelor, și se
păstrează la rece timp de 30 -60 minute, agitâ nd ocazional. P este amestecul format se adaugă o
soluție satura tă de sulfat de amoniu (4:1) și se lasă să stea timp de 15 -30 minute, în scopul
precipită rii celorlalte proteine existente în celulele roșii ală turi de Hb. Amestecul se
centrifughează timp de 30 minut e la 10000 r.p.m. apoi se aruncă precipitatul iar supernatant ul
(Hb brută ) se dializează la rece, într -un mediu de dializă PBS Ph 7,4 (între 36 – 48 ore). După
dializă , hemoglobina este supusă unui proce s de liofilizare în vederea obținerii pulberii de
hemoglobină .
3.4 Schema fluxului tehnologic

1 -reactor de precipitare cu sulfat de amo niu 12 -vas de amestecare
2 – pompă Montejous 13 -vas de amestecare
3 -ventil 14 -vas de amestecare
4 -ventil 15 -cântar
5 -vas de masură sol. NaCl 16 -separator cu membrane (dializor)
6 -vas de masură apă ultrapură 17 -ventil
7 -vas d e masură soluți e tampon 18 -pompă de vid
8 -rezervor stocare soluț ie mumă 19 -liofilizator
9 -pompă Montejous
10 -centrifugă
11 -centrifugă

3.5 Schema de măsurări în proces ș i control

Automatizarea procesului tehnologic are ca scop asigurarea unor performanțe ridicate
de funcționare a instalațiilor u tilizate în vederea obținerii unui produs finit de calitate superioară
cu costuri cât mai reduse. Utilizând o treaptă înaltă de control , automatizarea și optimizarea
proceselor chimice se aplic ă în scopul reglării parametriilor care stabilesc echilibrul
termodinamic, transformările izoterme, debitul de alimentare, constanta de viteză, pH -ul etc. În
cazul unui proces biochimic, datorită sensibilității ridicate la factorii mediului extern, se impune
un control riguros al parametrilor și echiparea instalației cu sisteme de reg lare performante.[¹¹]
În cadrul procesului de p urificare a hemoglobinei bovine , condiția termică impusă
sistemului pentru a se evita denaturarea proteinei este menținerea temperaturii la 5șC în etapa de
precipitarea cu sulfa t de amoniu.
Debitele de intrare trebuie să fie reglate la condiț iile prestabilite pentru a se evita
modificarea concentr ațiilor ș i impurificarea produsului finit. Acestea pot fi reglate prin
strangularea venei de fluid, adică modificarea căd erii de presiune pe conducta de transport, sau
prin modificarea turației pompelor. [¹¹]

Fig Controlul debitelor Fig Controlul temperaturii

4. Proiecta rea tehnologică: Dimensionarea tehnologică a unui
utilaj cheie , reactorul de precipitare

Opera ția de precipitare a principalelor proteine (fibrinogen, al bumine, globuline) se
realizează î ntr-un reactor discontinu cu amestecare prevă zut cu o manta de răcire. Principala
caracteristică ce definește un reactor cu funcționare disconutinuă este operarea printr -un model
ce presupune o amestecare ideală și prelucrarea masei de reacție în șarje. [¹⁵] Reactorul este de
formă cilindrică cu fund și capac elipsoidal, iar dimensiunile acestuia sunt determinate de tipul
procesului t ehnologic și de volumul masei de reacție ce urmează a fi prelucrată în acesta. [¹⁶] [¹⁷]
Calculul volumului reactorului de precipitare:
Volumul soluț iei din reactor:
Vsol . = Vsol.s ulfat + Vsol.proteică
Vsol.proteică=Msol.proteică diluată=236,80 l, ρ≅1g/cm³
Vsol.sulfat= 59,20 l
Vsol . =236,80+59,20 =296 l
Unde:
Vsol -volumul total al soluț iei
Vsol.sulfat -volumul soluț iei de sulfat d e amoniu 35%
Vsol.proteică -volumul soluției obț inut în urma resolubilizării
Capacitatea efectivă a v olumul ui reactorului se calculează din relaț ia:
Vsol=ε*Vreactor
Vreactor =𝑉𝑠𝑜𝑙
ε
Unde ε reprezintă coeficient ul de umplere (fracț ia de goluri), se alege ε=0,8 . [¹⁶]
Vreactor =296
0,5

Vreactor= 370 (l)=0,37 (m³)
Conform STAS 464 5-78, pentru o capacitatea reală a volumului reactorului de
Vreactor= 0.37 m³, se alege capacitatea nominală Vreactor=0,4 m³. [¹⁸] Abateri le limită cu care
capacitatea reală a recipientului poate diferi de cea nomin ală se încadrează în intervalul +/- 5%.
Acest volum include volumul cilindric al reactorului dar și volumul cap acului, respectiv volumul
fundului, fară însă a ț ine seama de con strucțiile interioare (serpentine, căptușeli, amestecatoare,
etc.) și de volumul racordurilor. [¹⁸] [¹⁹]
Calculul înălțimii ș i diametrului reactorului:
Volumul reactorului este:
Vreactor =Vrecipient -cilindric +2*Vfund,capac
Unde :
Vreactor -volumul reactorului
Vrecipient -cilindric -volumul recipientului, virola cilindric ă
Vfund,capac -volumu l capacului sau al fundului
𝐕𝐫𝐞𝐜𝐢𝐩𝐢𝐞𝐧𝐭 −𝐜𝐢𝐥𝐢𝐧𝐝𝐫𝐢𝐜 =п∗𝑫𝒊²
𝟒∗𝑯𝒓𝒆𝒄𝒊𝒑𝒊𝒆𝒏𝒕
Se consider ă simplexul geometric între diametrul interior și înălțimea virolei cilindrice ca
fiind : Hrecipient
Di=1,5 [²ș] → Hrecipient=1, 5*Di
Vrecipient −cilindric =п∗𝐷𝑖²
4∗1,5∗𝐷𝑟=1,177 ∗𝐷𝑖³
Recipientul este prevăzut cu fund și capac ellipsoidal care prin STAS 7949 -81 [¹⁸] au o
formă prevăzută cu o zonă bombată și una cilindrică ce desc riu un semielipsoid de rotați e și care
se pot asambla prin flanș e plate pentru recipient sau prin sudare direct la manta. Săgeata fundului
are valoriile cuprinse între 0,2*Di ≤Hfund,capac ≤0,5Di. Volumul fundului ,capacului este:
Vfund ,capac =𝟐
𝟑*п*𝐃𝐢²
𝟐²*Hfund ,capac
Se consideră : H fund ,capac
Di=0,25→ H fund,capac =0,25*Di [¹⁶]

Vfund ,capac =2
3*п*Di²
2²*0,25*Di=0,131*Di ³
Înlocuind în relaț ia pentru volumul reactorului obț inem:
Vreactor=Vrecipient -cilindric +2*Vfund ,capac=(1,177+2*0,131)* Di³
Di=√𝑉𝑟𝑒𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟
1,4393 =0,65 m
Conform STAS 7159 -74 [¹⁸] diametrul nominal Dn=0,65 m
Vrecipient -cilindric =0,323 m³
Vfund,capac=0,036 m³
Înălțimea react orului se poate calcula cu relaț ia:
Hreactor =Hrecipient -cilindric +2*Hfund,capac
Unde :
Hreactor -înălțimea reactorului
Hrecipient -cilindric -înălțimea recipientului cilindric
Hfund,capac -înălțimea fundului ,respectiv a capacului
Se calculează înălț imea recipientului și înălț imea fundului:
Hrecipient -cilindric =1,5*0,7 =0,975 m
Hfund ,capac =0,25*0,7 =0,162 m
Hreactor =0,975 +2*0, 162=1,3 m
Valoarea teoretică a capacității unui fund elipsoidal sudat cap la cap direct la mantaua
recipientului confo rm STAS 7 949-81 pentru un diametru de Dn=0,65 m și înă lțimea părții
cilindrice de h=30 mm este de Vcapac= 0,0362 m³.[¹⁸] Astfel, nivelul coloanei de lichid pe
înălțimea virolei cilindrice este:
𝐇𝐥𝐢𝐜𝐡𝐢𝐝 =𝑽𝒔𝒐𝒍 −𝑽𝒇𝒖𝒏𝒅 ,𝒄𝒂𝒑𝒂𝒄
п
𝟒∗𝑫𝒊²

Hlichid =0,296 −0,036
0,785 ∗0,65²=0,783 m
Calculul timpului de răcire a l amestecului de reacț ie
Răcirea amestecului de reacție în timpul precipitării cu sulfat de amoni u la 5șC se
realizează utilizând un agent de răcire care să corespundă unui cost economic minim și unui
consum energetic redus , [¹⁶] astfel agentul de răcire ales este apa, care se introduce î n ma ntaua
reactorului la temperatura iniț ială de 0 șC .

Fig. Diagrama termică

Relația generală de bilanț termic este:
Qcedat=Qtransferat=Qprimit+Qpierderi

Caldura cedată este:
Qprimit =Qam+Qr

Unde:
Qced at-căldu ra care trebuie îndepărtată
Qtransferat – căldura transferată prin manta
Qprimit – căldura p rimită de amestecul de reacție
Qpierderi – căldura pierdută
Qam -căldura amestecului de reacție
Qr-căldura reactorului

Qam= mam*Cp sol. *ΔTam
mam-masa amestecului supus răcirii , 341,52 K g
Cp sol. -căldura specifică a soluției , apă la temperatura de 20șC, 4,179 𝐾𝐽
𝐾𝑔∗𝐾 [²¹]
ΔTam -diferența de temperatură
Qam= 341,52 *4,179*(20-5)=21408,181 KJ
Qr=mr*Cp r. *ΔTr
mr-masa reactorului; aceasta se calculează ținând seama de greutatea pieselor de asamblare și a
dispozitivelor de amestecare, care se consideră 10% din greutatea materialului de construc ție ,
precum și de materialul din care este confecționat reactorul, oțel ρoțel=7850 K g/m³, de grosimea
peretelui δ=0,015 m și de diametrele Di =0,8 m , diametrul interior, și Dm =1 m , diametrul mantalei [²¹]¹⁶[]
Cp r. -căldura specifică a oțelului din care este confecționat reactorul, 0,5 𝐾𝐽
𝐾𝑔∗𝐾[²¹]
ΔTr-diferența de temperatur ă
mr=ρ*Vmaterial+𝟏𝟎
𝟏𝟎𝟎* ρ*Vmaterial

mr=1,1* ρ*Vmaterial

mr=1,1*ρ*δ*п*(Di*Hvirolă+2*1
4*Di²+Dmanta*Hlichid+1
4*Dmanta)
mr=429,89 K g
Qr=429,89 *0,5*(20-5)=3224,175 KJ
Astfel Qprimit =21408,181 +3224,175=24632,356 KJ
Din bilanțul termic global se determină cantitatea de apă de racire necesară pentru a răci
amestecul de reacț ie:
Qcedata=Qprimit +Qpierderi
Pierderile se consideră 5% din cantitatea de căldură total transferată.
Qcedat=Qprimit+ 5
100∗Qcedat
Qcedat=𝑄𝑝𝑟𝑖𝑚𝑖𝑡
0,95=25928,79 KJ
magt-masa agentului de răcire , apă 0⁰C
ragt-căldura latentă de topire pentru gheață 335 KJ/K g [²²]
cpagt-căldura specifică a agentului de răcire , pentru apă la 0șC este 2,05 𝐾𝐽
𝐾𝑔∗𝐾[²¹]
magt=𝐐𝐜𝐞𝐝𝐚𝐭
𝐫𝐚𝐠𝐭
magt= 77,299 Kg
Din relația de transfer de căldură se determină timpul de ră cire:
Qcedat=K*A*ΔTmed*t ră cire
t răcire=𝟏.𝟎𝟓∗𝐐𝐜𝐞𝐝𝐚𝐭
𝐊∗𝐀∗𝚫𝐓𝐦𝐞𝐝
Unde:
K-coeficient total de transfer te rmic

A-aria de tran sfer termic 1,644 m²
ΔTmed -forța mo trice a procesului
Coeficientul total de transfer termic se calculează cu relați a:
K=𝟏
𝟏
𝒂𝟏+𝟏
𝒂𝟏+𝚺𝐫𝐩
Unde:
α1 ,α2 -coeficienți parț iali de transfer termic , α=1000…10000 W/K*m² [²¹], se admite
α2=1500 W/K*m²
Σrp-suma rezistenț elor termice , 𝚺𝐫𝐩 =𝛅𝐩
𝝀𝒑
Σrp =0,015
46,5 =0.000322 W/K*m²
Coeficientul parț ial de transfer a l căldurii la ames tecarea lichidelor în aparate le cu manta se
calcu lează cu ajutorul relaț iilor:
Nu=C*Re ᵐ*𝑷𝒓𝟎.𝟑𝟑( 𝛈
𝛈𝒑)𝟎.𝟏𝟒
*ᴦ−𝟏
Criteriul Nusselt:
Nu=𝛂𝟏∗𝐃𝐚
𝛌
Criteriul Reynolds:
Re=𝛒𝐚𝐦 ∗𝐧∗𝐃𝐚²
ƞ 𝐚𝐦
Criteriul Prandtl:
Pr=𝐜𝐩 𝐚𝐦∗ƞ𝐚𝐦
𝛌

Unde
C,m -constante fizice care pentru a parate le cu manta au valoriile C= -0.38, respectiv m=0.67;
η -vâscozitatea dinamică a lichidului la 20șC , η=0,4*10ˉ ³ Pa*s (1705)
ηp -vâscozitatea dinamică a lichidului la temperatura peretului mantalei , ηp=0,71 *10ˉ ³ Pa*s
ᴦ -2.5-4 pentru agitatoare cu elice, în aparate cu diametrul pana la 1.5; s e va admite ᴦ=3,
Da-diametrul paletei agitatorului , ᴦ=Di
D𝑎 𝐷𝑎=𝐷𝑖
ᴦ =0,266 m
α1 -coeficientul parțial de transfer termic
λ -conductivitat ea termică, λ=0.61 W/K*m² [²³]
ρ – densitatea amestecului de reacție , ρ = 1050 kg/m3
n -viteza de turați e a agitatorului, n = 120 rot/min =2rot/s
cp -căldura specifică a amestecului de reacție , cp =4,179 𝑘𝐽
𝑘𝑔∗𝐾
Re=1050 ∗2∗0,266 ²
0,4∗10ˉ ³=37146 9
Pr=4,179 ∗0,4∗10ˉ ³
0,61=2,74
Nu=0.38* 3714690.67*2,740.33*0,4∗10ˉ ³
0,71∗10ˉ ³0.14
*3−1
Nu=878,395
α1=Nu∗λ
d𝑎= 2014,36 W/K*m²
Calculul coeficientului total de transfer termic
K=1
1
2014 ,36+1
1500+0.000322=673,854 W/K*m²
Forta mo trice este:
ΔTmed=𝚫𝐓𝐌 −𝚫𝐓𝐦
𝐥𝐧𝚫𝐓𝐌
𝚫𝐓𝐦
Unde Δ TM=293,15 K, ΔTm=274 ,15 K- diferențele maxime și minime de temperatură
ΔTmed =283,58 K

Timpul de răcire:
t răcire=1.05∗Qcedat
K∗A∗ΔTmed=1.05∗25928 ,79∗10³
673 ,854 ∗1,644 ∗283 ,58=86,661 s=1,444 min

5. Aspecte ecologice și de protecția mediului

Dezvoltarea proceselor tehnologice la nivel industrial prezintă o problemă de
actualitate datorită impactului asupra mediului înconjurător prin creșterea gradului de poluare.
Astfel prevenirea poluării mediului prin dezvoltarea unor biotehnologi moderne, ecologice a
devenit o necesitate. Utilizarea acestor biotehnologii prezintă avantaje ca lipsa produșiilor nocivi
și utilizarea unor condiții de lucru ce implică valori mici de tem peratură și presiune. Datorită
faptului ca acest proces are loc în șarje și presupunând că se desfășoară în instalații etanșe, fără
emisii necontrolate (ga ze, soluții, substante solide), procesul nu prezintă un risc ridicat din punct
de vedere ecologic, ce a mai mare problemă este cea a r ezidurilor rezultate din proces ș i eventual
a ambalajelor de materii prime. Rezidurile l ichide rezultate din proces sunt în principiu soluț ii de
centrifugare cu diferite concentrații în sulfat de amoniu și săruri ale soluț iei tampon. Această
problemă se poate rezol va prin colectarea acestor soluții în rezervoare ș i preluarea acestora de o
firmă specializată . De asemenea, rezidul solid de proteine, precum ș i ambalajele sunt prel uate tot
de o firma specializată în scopul incine rării acestora.
Reactivii utilizați î n principal în procesul tehnologic sunt sulfatul de amoniu și clorura
de sodiu. A spect ele legate de siguranța și protecția mediului precum și a personalului în vederea
utilizării celor doi reactivi cup rind preveniri în ceea ce privește depozitarea sau deversarea în
mediul înconjurător, ambele substanțe fiind stabile și neinflamabile. [²⁴]

Partea II
1.Generalit ăți
1.1 Medicamente antitumorale
Creșterea accentuată a cazurilor de boli cara cterizate de prezența tumorilor maligne a
generat necesitatea de a înțelege natura cancerului și de a dezvolta diagnostice și tratamente
eficiente în remedierea acestuia. O parte cheie în tratare a tumorilor și evitarea recurenței lor o
constituie chemoterapia, un tratament complex cu compuși cu potențial antitumoral care deși s –
au dovedit a fi eficienți prezintă însă un nivel de toxicitate ridicat. [²⁵]
Taxolii sunt o clasă de medica mente antineoplazice cu efect citotoxic care au ca
mecanism de acțiune inducerea apoptozei celulare și sunt utilizați ca tratament standard pentru
diferite tipuri de tumori cum ar fi cancer la sâ n, pulmonar, ovarian, etc. [²⁶]
Efectul terapeu tic al medicamentelor din clasa taxolilor este mediat de perturbarea
funcțiilor microtubulare prin legarea agentului citotoxic la subunitățiile de β tubulină. Acestă
interacțiune determină asamblarea microtubulilor și a compusului citostatic într -un comple x care
nu se poate dezasambla și care prin scurtarea lungimii microtubulilor și suprimarea dinamicii
acestora distrug abilitatea celulei de a folosi citoscheletul în timpul diviziunii celulare. Astfel, în
cele din urmă compușii citostatici vor interfera cu ciclul celular mitotic și vor induce o moarte
fiziologică programată în celulele tumorale prin complexul format oprind activitatea proteinelor
cancerigene c um ar fi bcl -2, p-53, bcl -x.[²⁷][²⁸]

Fig1.1 Mecanismul de acțiune al taxolilor

Un subiect de o importanță majoră îl constituie efectului toxic pe care această clasă de
medicamente îl manifestă. În cadrul lucrării de față s -au studiat int eracțiuni le dintre doi com puși
din familia taxolilor, p aclita xel și derivatul semi -sintetic d ocetaxel, și anumite proteine relevante
biologic ( hemoglobina, albumina) printr -o serie de reacții specifice pentru stresul nitrozativ și
oxidativ. Un aspect relevant investigat în acest s tudiu îl reprezintă potențiala activitate biologică
a compușilor antitumorali, și anume capacitatea acestora de a avea efecte benefice sau adverse
atunci când interacționează cu un sistem biologic. Datele preliminare obținute confirmă existența
unei punți de legare între hemoglobină și taxoli precum și predispoziția ca funcțiile acesteia să
fie afe ctate de cele două medicamente.
Inițial p aclitaxel a fost izolat din Taxus brevifolia , din scoarță de tisă din zona
Pacificului și a fost încadrat în familia taxolilor datorită interferenței acestuia în ciclul mitotic al
celulei și i nducerea apoptozei celulare. [²⁵] Insolubilitatea ridicată în apă a compusului a
determinat încetinirea drastică a de zvoltării clinice a citostaticului, însă cu toate acestea cea mai
viabilă obțiune de administrare s -a dovedit a fi utilizarea uleiului de ricin ca excipi ent, cunoscut
sub denumirea de Cremophor EL. Astfel soluția de p aclitaxel utilizată curent este formtă dintr -un
amestec de compus citostatic și soluție de Cremophor EL și alcool dezhidratat în raport 1 :1.
Administrarea intravenoasă în această formulă este a sociată cu un risc de infecție,
hipersensibilitate și modificări oxidative la nivelul eritrocitelor. [²⁹]

Fig. 1.2 Structura chimică a compusului paclitaxel

Docetaxel este produs semi -sintetic având ca precursor diacetilbecatina III, compus
extras din acele de tisă europeană regenerabilă și ușor de procurat. Având un puternic efect anti –
mitotic este des utilizat în tratarea diferitelor tipuri de cancer. Deși prezintă ace lași mecanism de
acțiune ca și p aclitaxel datorită efectului asupra axului mitotic al centrozomului , docetaxel s -a
dovedit a fi mai potent decât p aclitaxel, însă acesta din urmă prezint ă mai puține efecte
secundare .[³ș] Eficacitatea tratamentului cu cele două medicamente este limitată de dezvoltarea
unei rezistențe celulare prin diferite mecanisme. [²⁵]

Fig. 1.3 Structura chimică a compusului d ocetaxel

1.2 Stresul oxidativ și nitrozativ
Toxicitatea me dicamentelor antineoplazice la nivelul eritrocitelor se explică prin
implicarea hemoglobinei într -un ciclu de reacții care au ca rezultat producerea unor forme de
stres, și anume stresul oxidativ și stresul nitrozativ, care alterează capacitatea proteinei de a lega
și a transporta oxigenul.
Stresul oxidativ este conditionat de existența unui dezechilibru între generarea și
neutralizarea speciilor oxidative rezultând degradarea oxidativă a biomolec ulelor ca lipide,
proteine si acizi nucleici .[³¹] Din clasa speciilor oxidative se disting oxigenul singlet, ozonul, apa
oxigenată, hidroxilul și superoxidul, acesta din urmă fiind generat semnificativ în organism la

nivelul mitocondriei, prin lanțul transportor de electroni care are ca acceptor final oxigenul, dar
și la nivelul altor organite celulare cum ar fi reticulul endoplasmatic, microzomii și peroxizomii.
Neutralizarea speciilor oxidative se realizează prin utilizarea unor agenți de contracarare
cunoscuț i sub denumirea de antioxidanți. [³¹]
Efectele toxice induse de tratamentul cu compuși din clasa taxolilor, paclitaxel și
docetaxel, au fost corelate cu un m ecanism de stres oxidativ prin membrană -asociată provocat de
activitatea NADPH oxidazei care generează extracelular peroxid de hidrogen, un puternic agent
oxidant.
Stresul nitrozativ este definit ca o formă de stres celular ce descrie un exces de oxizi
sau oxianioni ai azotului. Ca specii principale implicate în declanșarea stresului nitrozativ se
remarcă azotitu l (NO2ˉ), monoxidul de azot (NO), dioxidul de azot (NO2), etc. Efectele negative
la nivel celular în condiți i de stres nitrozativ sunt consecințele declanșării unui lanț de reacții
autocatalitice cu im plicarea radicalilor liberi. [³²] [³³]
Condițiile de stres oxidativ și nitrozativ determină ca hemoglobina să fie susceptibilă la
toxicitate prin implicarea fierului heminic în reacții generatoare de radicali liberi și stări d e
oxidare mari ale fierului. [³⁴] Interfer ența medicamentelor citotoxic e docetaxel și paclitaxel cu
hemoglobina are ca rezultat amplificarea condițiilor de stres și accelerarea transformării formei
oxi (Fe²+) în fier hemin ic nefuncțional, met (Fe³+). [³⁴]

1.3 Structuri proteice

Structurile proteice care prezintă relevanță în studiul interacțiunii cu complecșii
citostatici din familia taxolilor și care reflectă modificări semnificative ale activității biologice ca
urmare a acestei interferențe sunt proteinele care au ca funcție principală funcția de transport.
Din clasa acestor proteine am urmărit efectul citostaticilor exprimat la nivelul hemoglobinei și al
albuminei. Aceste interacțiuni pot fi mediate și inhibate sau accelerate de o altă clasă de proteine
ce prezintă interes, și anume clasa enzimelor, iar dintre acestea se remarcă catalaza.
Hemoglobina este o metaloproteină încadrată în clasa globinelor specializate în
transportul oxigen ului. Anumite forme de stres celular pot avea ca repercursiuni implicarea
hemoglobinei în reacții redox toxice cu a genți ai stresului oxidativ cum ar fi peroxidul, cu
formarea de fier heminic într -o stare înaltă de oxidare și acumularea de radicali liberi. Aducții

formați cu compușii antitumorali pot avea un impact asupra acestor reacții și pot afecta viteza de
autooxi dare și activitatea peroxidazică a hemoglobinei. [³²]
Albumina serică umană este cărăușul natural al organismului pentru moleculele
hidrofobe cum ar fi acizii grași, hormonii, vitaminele liposolubile, dieriți metaboliți și
medicamente , fiind cea mai abu ndentă proteină din plasmă. [³⁵] Datorită structurii sale ce
prezintă un strat extern hidrofil datorat prezenței aminoacizilor încărcați negativ, a 17 punți
disulfurice și un tiol liber la Cys34, aceasta este susceptibilă interferenței cu com pușii taxolici.
Legarea medicamentelor la albumina serică umană modifică capacitatea acestora de distribuț ie și
retenție în organism. [³⁵]
Catalaza este o enzimă heminică ce joacă un rol principal în protejarea celulelor de
efectele toxice ale peroxidului de hidrogen printr -un mecanism de aparare antioxidantă ce constă
în controlul concentrației derivaților citotoxici ai oxigenului. Aceasta dezvoltă un sistem de
protecție ce presupune catalizarea reacției de descompunere a apei oxigenate în oxigen molecular
și apă, far ă a produce radicali liberi. [³⁶] [³⁷]

2. Materiale și metode
Principalele materii prime utilizate în experimentele desfașurate sunt hemoglobina
bovină și albumina serică. Hemoglobina a fost obținută din sânge și p urificată în prealabil
conform protocolului general descri s de Antonini și Brunori [¹⁴] și păstrată în soluție tampon
(PBS), pH 7,4. Concentrația proteinei utilizată este data per hem, nu per tetramer. Albumina
serică a fost obținută din plasmă prin utiliza rea unor metode de fracționare și amume precipitarea
cu sulfat de amoniu urmată de o precipitare cu etanol. [³⁸] Medicamentele paclitaxel și d ocetaxel
au fost utilizate sub forma preparatelor comerciale existente în farmacii (Paclitaxel Kabi 6
mg/ml, produ cător Fresenius Kabi Oncology Plc.; Docetaxel Kabi 180 mg/9 ml, producător
Fresenius Kabi Oncology Plc.).
Conformația proteinelor utilizate poate fi afectată de modul în care medicamentele
antitumorale se vor atașa la acestea favorizând acce sul agenților toxici la centrul activ al
proteinelor. Capacitatea citostaticelor de a induce starea de stres și de a altera conformația
proteinelor a fost asociată cu modificările aparute la nivelul stării de oxidare a metalului din
structura proteică. Sch imbăriile produse au fost monitorizate prin metodele spectroscopiei UV –

vis, cu un instrument Cary 50 (Varian, Inc) ș i PerkinElmer , într -o cuvă de sticlă, permițând
înregistrarea spectrelor în domeniul 200 -800 nm, respectiv metodele spectroscopiei de
fluor escența de raze x, cu un spectrofotometru de fluorescența PerkinElmer LS55,fluorescența
probei fiind urmărită printr -o excitație la 295 nm, iar măsurătorile au fost efectuate într -o cuvă cu
pereți de sticlă.
Spectrometria de absorție mole culară în UV -vis este o metodă simplă și cu o
aplicabilitate ridicată pentru a determina modificăr ile structurale ale proteinelor ce presupune
emiterea unui fascicol primar de către o sursă externă de spectru continuu asupra unei probe de
interes. Speciile moleculare absorbante din probă absorb o parte din radiația incidentă la nivelul
electroniilor din straturile de valență și emit o putere radiantă prin cuvă care este măsur ată cu un
detector optic. [³⁷] [³⁹]
Spectroscopia de fluorescență e ste o tehnică care oferă informații despre mediul micro –
molecular al unei probe și presupune iluminarea acesteia cu un fascicul primar de excitare emis
de o sursă primară urmată de absorția acesteia la nivelul atomiilor și moleculelor și de
dezexcitare pri n emiterea radiației de luminescență. Aceasta se m ăsoară de regulă la un unghi
drept față de radiația primară de excitare. Astfel fluorescența este reprezentată de trei etape și
anume excitare, durată de viață excitată și emisie de fluorescență și are loc în molecule capabile
să reemită radiația la lumina de excitare, numite fluorofori. Fluorescența în proteine se
evidențiază prin urmărirea radiațiilor emise de către resturile de aminoacizi aromatici tirozina,
fenilalanină și triptofan, acesta din urmă prez entând un interes deosebit datorită capaci tății de a
emite cel mai intens. [³ș] [⁴ș]
Viteza de autooxidare a hemoglobinei se eviden țiază ca fiind una dintre reacțiile
specifice stresului oxidativ și descrie trecerea oxi -hemoglobinei (Fe²+) în met -hemoglobină
(Fe³+), obținându -se hemul nefuncțional, toxic. Pentru analiza tendinței de autooxidare
hemoglobina a fost trecută în prealabil în stare oxi prin adăugare a de ditionit de sodiu urmată de
trecerea acesteia pe o coloană de desalifiere (coeficie ntul de extincție a oxi -hemoglobinei fiind
125000 cm-1M-1). Rea cția de autooxidare a hemoglobinei (10 μM) a fost urmărită în soluție
salină PBS, pH 7.4 , în prezența celor doua medicamente în concentrații variate (10, 30, 50, 100,
300, 600 μM). Absorbanța spectrelor a fost măsurată după incubarea probelor timp de 4 ore la o
temperatură de 37șC. Dovezile apariției met -hemoglobinei sunt evidențiate prin deplasarea celei
mai intense benzi corespunzătoare oxi -hemoglobinei, banda Soret de la 415 nm, spre 405 nm și

deplasările sesizate la absorbanțele corespunzătoare lungimii lor de undă 574 nm, respectiv 630
nm. Graficele reflectă raportul diferențelor dintre absorbanțele probelor la 630 nm și 574 nm
𝐴𝑓
𝐴𝑖=𝐴𝑓630 −𝐴𝑓574
𝐴𝑖630 −𝐴𝑖574 , Af 630 absorbanța finală la 630 nm, Ai630 absorbanța inițială la 630 nm, Af
574 absorbanța finală la 574 nm, , Ai 574 absorbanța inițială la 574 nm.
Activitatea peroxidazică a hemoglobinei descrie trecerea met -hemoglobinei în
compusul I, care conține un radical localizat pe nucleul porfirinic (FeV) și mai apoi în c ompusul
II ,feril ( FeIV) printr -un mecanism acceptor de electroni generați de către ascorbat. Pentru analiza
activității peroxidazice hemoglobina a fost trecută în prealabil în stare met prin adăugare de
fericianură (coeficien tul de extincție a met -hemoglobinei fiind 178000 cm-1M-1). Reacția a fost
monitorizată spectofo tometric, utilizând o cuvă de cuarț, variația absorbanței fiind urmărită la
lungimea de unda 290 nm, lungime de undă specifică modificărilor la nivelul ascorbatului
(coeficientul de extincție al ascorbatului fiind 2107 cm-1M-1). Reactivii au fost adăugați în
ordinea : soluție de acetat pH 5,5, ascorbat (350 μM), hemoglobină (12 μM). Probele au fost
tratate cu diferite concentrații de compușii citostatici (0, 10, 30, 50, 80, 100 μM) chiar înaintea
reacției cu peroxid (800 μM).
Reacția hemogl obinei cu azotitul implică formarea met -hemoglobinei prin supunerea
oxi-hemoglobinei unor cicluri de reacț ii redox la nivelul hemului. [³⁴] Cinetica reacției a fost
monitorizată în prezența c ompuș ilor antitumorali la 540 nm. Probele au constat în soluție t ampon
(PBS), proteină (10 μM), azotit (400 μM) și med icament (10,50,100,300,600 μM).
Activitatea enzimatică a catalazei a fost evidențiată în reacția hemoglobinei cu azotitul,
caz în care enzima inhibă reacția și acționează ca un antioxidant , suprimând denaturarea
proteinei. Studiul a urmărit compararea activității prooxidante a azotitului în raport cu activitatea
antioxidantă a catalazei, în prezența celor două medicamente antitumorale. Astfel la conținutul
probelor utilizate în experimentul anterior am adăugat catalaza în concentrații variate pornind de
la 10 U până la 150 U (unitate de activitate). Monitorizarea activității enzimatice a catalazei a
fost făcută spectofotometric la o lungime de undă de 540 nm.

3. Rezultate și discuții. Influ ențele diverșilor parametrii
3.1 Reac ția dintre structurile proteice de interes și compușii citostatici
Monitorizarea interacțiuniilor dintre compușii antitumorali și proteinele de interes,
albumina și hemoglobina, a constituit un factor major în cuantificarea modului în care
mobilitatea și funcționalitatea structurilor proteice a fost afectată de prezența medicamentelor
antitumorale. Efectele compușiilor taxolici asupra reactivității proteinelor analizate au fost
urmărite utilizând atât spectro metria de absorție moleculară UV -vis cât și prin spectrometria de
fluorescență, modificăriile spectrale confirmând formarea unui compex proteină -medicament
citostatic.
3.1.1 Metode spectroscopice de absorbție moleculară UV -vis
Astfel, în c azul hemoglobinei , spectrele moleculare UV -vis ale formei oxi -Hb, respectiv
met-Hb sunt reprezentate în Fig.2.1 și Fig.2.2, în prezența compușiilor citostatici, imediat după
amestecare, la temperatura camerei, în soluție de PBS, pH 7,4.
După cum il ustrează și Fig.2.1 respectiv Fig 2.2, forma oxi -Hb suferă o scădere a
absorbanței la 574 nm (lungime de undă caracteristică formei oxi) și o creștere a absorbanței la
630 nm (lungime de un dă caracteristică formei met). Efectul hipsocrom este evidențiat pr in
deplasare a benzii corespunzătoare lungimii de undă 415 nm (cea mai intensă bandă a oxi -Hb,
banda Soret) spre 405 nm (banda corespunzătoare met -Hb), ceea ce se traduce prin oxidarea
formei oxi la met, printr -o reacție redox de transfer electronic.

Fig.2. 1 Spectrele UV -vis ale oxi -Hb tratată cu paclitaxel, în PBS, pH=7.4
00.20.40.60.81
360 460 560 660absorbanta
lungimea de unda (nm)paclitaxel (50 μM) + oxi -Hb (10 μM)
oxi-Hb (10 μM)
00.050.10.15
520 570 620 670absorbanta
lungimea de unda (nm)paclitaxel (50 μM) + oxi -Hb (10 μM)
oxi-Hb (10 μM)

Fig.2.2 Spectrele UV -vis ale oxi -Hb trata tă cu docetaxel, în PBS, pH=7.4
Pentru forma met a hemoglobinei compușii antitumorali nu prezintă efecte
semnificativ e, deoarece aceasta este mult mai stabilă decât forma oxi, ea putând fi oxidată doar
de oxidanți puternici cum ar fi peroxidul și formând aducți doar cu anumiți compuși, cum ar fi
azotitul, azida, monoxidul de carbon, etc. În cazul formei met -hemoglobinei este de așteptat ca
medicamentele citostatice să nu se lege la Fe, deoarece aceastea prezintă un volum mare, care nu
ar putea să intre în buzunarul catalitic al hemoglobinei. După cum se poate observa și în Fig.2.3,
maximul absorbanței asociat lungimii de undă 405 nm nu se modifică, ceea ce indică faptul că
interacțiuni le dintre compuși și met -hemoglobină nu afectează structura grupării heminice.

Fig.2.3 Spectrele UV -vis ale met -Hb tratată cu paclitaxel,respectiv docetaxel în PBS, pH=7.4
00.20.40.60.81
370 470 570 670absorbanta
lungimea de unda (nm)docetaxel(50 μM) + oxi -Hb(10 μM)
oxi-Hb (10 μM)
00.050.10.15
520 570 620 670absorbanta
lungimea de unda (nm)docetaxel(50 μM) + oxi -Hb(10 μM)
oxi-Hb (10 μM)
00.10.20.30.40.50.60.70.8
370 470 570 670absorbanta
lungimea de unda (nm)met-Hb (10 μM)
paclitaxel (50 μM) + met -Hb (10 μM)
00.10.20.30.40.50.60.70.8
370 420 470 520 570 620absorbanta
lungimea de unda (nm)docetaxel (50 μM) + met -Hb (10
μM)

În cazul albuminei am urmărit în timp (2 ore) capacitatea compușiilor antitumorali de
a forma punți de legătură și cu alte structuri proteice, utilizând metodele analizei spectrale
moleculare UV -vis. Din interpretarea spectrelor redate în Fig.2.4 putem t rage concluzia că
albumina formează un complex cu cele două medicamente facilitând transportul acestora de la
endoteliul vaselor de sânge spre interiorul celulelor tumorale.

Fig.2.4 Spectrele UV -vis ale albuminei tratată cu paclitaxel,respectiv do cetaxel în PBS,
pH=7.4

3.1.2 Metode spectroscopice de fluore scență moleculară
O altă metodă de monitorizare a i nteracțiuni lor dintre compușii antitumorali și
proteinele analizate este spectrometria de fluorescență care evide nțiază m odificări le structurale la
nivelul aminoacidului triptofan în momentul formării complexului proteină -medicament prin
exicitarea aminoacidului la 295 nm și urmărirea emisiei acestuia în intervalul 338 -340 nm.
Datele experimentale iulstrează v ariațile intensități i fluorescenței complexului în timp (6 ore)
utilizând o concentrație constantă de medicament (10 μM ) și proteină (10 μM ) în soluție
tampon, pH 7.4. 00.20.40.60.811.21.4
200 300 400 500absorbanta
lungimea de unda (nm)albumina (5 μM) + paclitaxel (50 μM) (i)
albumina (5 μM) + paclitaxel (50 μM) (2h)
albumina (5 μM)+ alcool (50 μM)
albumina (5 μM)
paclitaxel (50 μM)
00.20.40.60.811.2
200 300 400 500absorbanta
lungimea de unda (nm)albumina (5 μM) + docetaxel (50 μM) (i)
albumina (5 μM)+docetaxel (50 μM) (2h)
albumina (5 μM)+ alcool (50 μM)
albumina (5 μM)
docetaxel (50 μM)

După cum se poate observa în spectrele atașate atât compușii citostatici ana lizați cât și
proteinele utilizate, hemoglobina și albumina , dețin proprietatea de a emite în spectru de
fluorescență, cel mai probabil datorită resturilor aromatice prezente în structurile acestora. În
timp ce intensitatea fluorescenței în cazul proteinel or nu variază în timp, spectrele de
fluorescență pentru compușii antitumorali, precum și spectrele complexului proteină -medicament
ilustrează o creștere a intensității fluorescenței direct proporțională cu intervalul de timp, și
anume la momentul initial p e parcursul a 6 ore.
Intensitatea fluorescenței aductului hemoglobină -taxol este reprezentată în Fig.2.5 și
Fig.2.6 ca o medie variabilă între intensitățiile celor două com ponente ale complexului format . O
posibilă explicație pentru acest feno men ar fi legarea compusului citostatic la proteină care ar
putea determina mod ificări ale conformației proteinei. În cazul hemoglobinei crește nivelul de
expunere a triptofanului și astfel fluorescența se intensifică, iar în cazul medicamentului prin
legarea la hemoglobină fluorescența este masc ată

Fig.2.5 Spectrele de fluorescență ale hemoglobinei în prezența compusului paclitaxel, în timp 6h

Fig.2.6 Spectrele de fluorescență ale hemoglobinei în prezența compusului docetaxel, în timp 6h

Semnalele de fluorescență emise de proba de analizată precum și modificăriile
spectrului de absorbție moleculară UV -vis al structurii proteice confirmă existența unui sistem de
legare între hemoglobină și taxol, care are ca rezultat formarea unui complex c e alterează
funcțiile și structura proteinei.
Fig.2.7 respectiv Fig.2.8 ilustrează spectrele de emisie în cazul albuminei. Aceasta,
aflată în contact cu cele două medicamente, emite o fluorescență a cărei intensitate este
reprezentată ca o însumare a intensitățiilor fluorescentei celor două specii.

. Fig.2.7 Spectrele de fluorescență ale albuminei în prezența compusului paclitaxel, în timp 6h

Fig.2.8 Spectrele de fluorescență ale albuminei în prezența compusului docetaxel, în timp 6h

Interpretarea spectrelor sugerează o variație accentuată a intensității fluorescenței
soluției formată din albumină și compușii antitumorali timp de 6 ore, explicate prin modificarea
conformației protei nei și apariția efectului hipercrom des cris de creșterea semnificativă a
intensității fluorescenței. Această variație poate fi sesizată și în spectrele de absorbție moleculară
UV-vis și ne indică atașarea citostaticelor paclitaxel și docetaxel la nivelul albuminei.
În urma comp arării spectrelor analizate se observă că deși există o punte de legătură
între compușii din clasa taxolilor și cele două proteine, însă modul în care această conexiune se
stabilește diferă, fiecare proteină utilizând un mecanism specific.

3.2 Reacția de autoo xidare a hemoglobinei în prezența compușiilor citostatici

Încadrându -se în clasa metaloproteinelor, hemoglobina poate exista sub diferite forme în
funcție de starea de oxidare a fierului. Reacția de autooxidare, specifică pentru această clasă de
proteine, poate fi evidențiată și în cazul oxi -Hb (Fe²+) prin formarea hemului toxic și
nefuncțional (Fe³+) și a ionului superoxid (O2•ˉ), care va genera apa oxigenată (H 2O2), un agent
oxidant care declanșează o cascadă oxidativă ce poate denatura celu lele ducând până la apoptoza
celulara.

Fig.2.9 Reac ția de autooxidare a oxi -hemoglobinei

Hemoglobina este o metaloproteină susceptibilă i nteracțiun ilor cu diferite cl ase de
compușii organici, printre care se enumeră și compușii din clasa taxolilor. Un aspect relevant în
reacția de autooxidare a hemoglobinei în prezența compușiilor antitumorali este capacitatea
acestora de a genera o formă de stres oxidativ care ar acce lera trecerea oxi -hemoglobinei în
forma met -hemoglobină, sugerând astfel existența unui efect prooxidant ce explică anumite
efecte secundare ale medicamentelor, cum ar fi anemia.

Fig.2.10 Spectrele de absorbție moleculară UV -vis ale met -hemoglobinei și oxi-hemoglobinei
În Fig.2.10 se pot identifica formele oxi respectiv met ale hemoglobinei reprezentate în
domeniul spectral UV -vis. Benziile care redau informații despre starea de oxidare a metalului din
proteină sunt banda Soret, deplasată d e la forma oxi (intensitatea maximă la 415 nm) la forma
met (intensitatea maximă la 405 nm), scaderea absorbanței specifică pentru banda de la 574
(caracteristică formei oxi) și creșterea absorbanței caracteristică benzii de la 630 ( particulară
pentru form a met).

Fig.2.11 Cinetica reacției de autooxidare a hemoglobinei monitorizate timp de 4 ore, în
prezența medicamentului paclitaxel, în PBS pH 7.4 00.10.20.30.40.50.60.7
370 420 470 520 570 620 670absorbanta
lungimea de unda (nm)met-Hb (10 μM)
oxi-Hb (10 μM)
0.050.10.150.20.250.30.35
0 200 400 600 800 1000absorbanta
timp (min)control (10 μM)
paclitaxel(10 μM)
paclitaxel (100 μM)
control(100 μM)
paclitaxel(600 μM)
control(600 μM)
paclitaxel(50 μM)

Fig.2.12 Reprezentarea grafică a timpului de înjumătățire pentru viteza de autooxidare ex primat
în raport cu concentrațile de compus paclitaxel

Fig.2.13 Cinetica reacției de autooxidare a hemoglobinei monitorizate timp de 4 ore, în
prezența medicamentului docetaxel, în PBS pH 7.4
Fig.2.14 Reprezentarea grafică a timpului de î njumătățire pentru viteza de autooxidare exprimat
în raport cu concentrațile de compus docetaxel 0100200300400500600
control paclitaxel
(10 μM)paclitaxel
(50 μM)paclitaxel
(100 μM)paclitaxel
(300 μM)paclitaxel
(600 μM)t 1/2
concentratia
0100200300400500
0.7 2.7 4.7timpul de injumatatire
concentratie paclitaxel ( μM)
0.10.120.140.160.180.20.220.240.26
0 200 400 600 800 1000absorbanta
timp (min) control(10 µM)
docetaxel(10 µM)
control(100µM)
docetaxel(100µM)
control(600µM)
docetaxel(600µM)
control(50 µM)
docetaxel(50 µM)
0100200300400500600
control docetaxel
(10μM)docetaxel
(30μM)docetaxel
(50μM)docetaxel
(100 μM)docetaxel
(300 μM)docetaxel
(600 μM)t1/2
concentratia
0100200300400500
0 2 4 6 8timpul de injumatatire
concentratia docetaxel ( μM)

Experimental se evidențiază o intensificare a vitezei de autooxidare odată cu creșterea
concentrației de compuși antitumorali, după cum indic ă și spectrele reprezentate în Fig.2.11
Fig.2.12 respectiv Fig.2.13 și Fig.2.14, ceea ce se traduce prin probabilitatea ca medicamentele
analizate să afecteze stabilitatea oxi -Hb și capacitatea acesteia de a transporta oxigenul,
acționând ca un agent denat urant asupra gr upării heminice.

3.3 Activitatea ascorbat peroxidazică a hemoglobinei în prezența compușilor antitumorali
Activitatea ascorbat peroxidazică a hemoglobinei este afectată doar în prezența
medicament ului p aclitaxel. După cum indică și Fig.2.16 respectiv Fig 2.17 se constată un efect
optim de inhibare a activității peroxidazice a met -Hb, în cazul utilizării unei concent rații de 50
μM pentru compusul paclitaxel, însă citostaticul d ocetaxel nu pare a avea un efect relevant în
aceasta reacți e. Aceasta discrepanță manifestată între activitatea celor doi taxoli se explică prin
existența unei diferențe între potențial ele lor de reducere , medicamentului paclitaxel prezentând
un potențial de reducere mai pronunțat decât a l medicamentulu i docetaxel deoarece acesta deține
în strctura sa o grupare arom atică în plus.

Fig.2.15 Ciclul redox care descrie activitatea peroxidazică a hemoglobinei

Fig.2.16 Activitatea ascorbat peroxidazică a met -Hb în prezența compusului paclitaxel, în sol de
acetat, pH 5.5

Fig.2.17 Activitatea ascorbat peroxidazică a met -Hb în prezența compusului doce taxel, în sol de
acetat, pH 5.5

3.3 Reacția hemoglobinei cu azotitul
Reacția dintre azot it și formele oxi ale globinelor dezvoltă un mecanism autocatalitic
caracterizat de o cinetică divizată în mai multe branșe. Lanțul de reacții care se declanșază în
vederea oxidării formelor oxi este mediat de prezența speciilor extrem de reactive cum ar f i
peroxidul d e hidrogen și dioxidul de azot.
În cazul hemoglobinei reacția prezintă relevanță fiziologică datorită formării met –
hemoglobinei. Pentru concentrații relevante fiziologic și patologic acestă succesiune de reacții 0100200300400
0 μM 10 μM 30 μM 50 μM 80 μM100 μ Mtimp (min)
concentratie
050100150200250300
0 µM 10 µM 30 µM 50 µM 80 µM 100 µMtimp (min)
concentratie

cuprinde o et apă de acumulare a radicalilor liberi, caracterizată de o fază de inducție (perioada de
lag) urmată de numeroase etape intermediare, în care se formează specii intermediare extrem de
reactive, iar în final etapa autocatalitică de formare met -hemoglobinei.

Fig.2.18 Mecanismul propus pentru reacția de oxidare a hemo globinei în prezența azotitului
Mecamismul propus pentru reacția hemoglobinei cu azotitul este ilustrat în Fig 2.18 și
presupune existența a două căi de interacțiune între globine și azotit, prin implicarea fierului din
metaloproteine într -un ciclu de reacții redox. Prin urmare, o posibilă cale de interacțiune
presupune ca etapă de inițiere disocierea moleculei de oxigen pentru a facilita accesul azoti tului
la gruparea heminică și are ca rezultat formarea unui aduct instabil între azotit și fier, nitrozo –
feros, care se va transforma rapid sub acțiunea nitrit reductazei într -un aduct nitrozo -feric. În
acest caz NO rezultat ajuns în contact cu oxigenul mo lecular sau cu azotitul, declanșează reacții
care vor genera radicali liberi. A doua rută de interacțiune între azotit și hemoglobină implică
reacția directă a azotitului cu oxigenul legat la fier realizând o legătură de tip peroxo care va
produce hetero/h omoliză și o cantitate semnif icativă de radicali liberi.

3.4.1 Reacția azot itului cu compușii antitumorali
O importanță majoră pentru studiul efectuat este modul în care compușii citostatici
influențează cinetica reacției dintre hemoglobi nă și azotit. În vederea efectuării analizei
experimentale un pas inițial a fost elaborarea unui experiment control pentru a urmări dacă se
stabilesc interacțiuni de orice fel între azotit și compușii citostatici.

Fig.2.19 Spectrele de absorbție molecul ară UV -vis ale compusului paclitaxel în prezența
azotitului

Fig.2.20 Spectrele de absorbție moleculară UV -vis ale compusului d ocetaxel în prezența
azotitului

Experimentul a fost monitorizat în timp (30 min), utilizând o concentrație de 5 0 μM
compus citostatic, 400 μM azotit. După cum ilustrează și figurile precedente, spectrele de
absorție moleculară nu prezintă modificări semnificative care ar putea descrie stabilirea unor
interacțiuni între cei doi compuși în intervalul de timp,ele supr apunându -se perfect.
00.20.40.60.811.2
200 250 300 350 400 450 500absorbanta
lungimea de unda (nm) azotit (400µM)
paclitaxel ( 50µM)
paclitaxel i ( 50µM) + azotit (400µM)
paclitaxel 10 min ( 50µM) + azotit (400µM)
paclitaxel 15 min ( 50µM) + azotit (400µM)
paclitaxel 20min ( 50µM) + azotit (400µM)
paclitaxel 25min ( 50µM) + azotit (400µM)
paclitaxel 30 min( 50µM) + azotit (400µM)
00.20.40.60.811.2
200 220 240 260 280 300 320 340absorbanta
lungimea de unda (nm) azotit (400µM)
docetaxel ( 50µM)
docetaxel i( 50µM) + azotit (400µM)
docetaxel 10 min( 50µM )+ azotit (400µM)
docetaxel 15 min( 50µM) + azotit (400µM)
docetaxel 20( 50µM) + (azotit400µM)
docetaxel 25( 50µM) + azotit(400µM)
docetaxel 30( 50µM) + azotit (400µM)

3.4.2 Reacția hemoglobinei cu azotitul în pre zența compușilor antitumorali
În cazul desfășurării experimentului dintre hemoglobină și azotit în prezența compușilor
citostatici am urmărit efectul medicamentelor citostat ice asupra cineticii reacției.
Rezultatele prezentate în figurile următoare indică faptul că cinetica reacției analizate este
influențată de prezența taxolilor într -o manieră dependentă de concentrație. Se observă o
accelerare a cascadei oxidativ e declanșate cu creșterea concentrației de compus citostatic. O
posibilă explicație ar fi modificarea conformației proteinei și facilitarea accesului azotitului la
buzunarul catalitic datorită legării compusului citostatic la hemoglobină. Asftel un efect
accentuat al medicamentului de creștere a accesibilității la centrul heminic se evidențiază la o
concetrație de 50 μM.

Fig.2.21 Evoluția în timp a absorbanței la 540 nm a hemoglobinei incubate cu paclitaxel, pentru
40 de min, la 37°C, după amestecarea cu 400 μM azotit, în soluție PBS, pH 7.4

Fig.2.22 Evoluția în timp a absorbanței la 540 nm a hemoglobinei incubate cu docetaxel, pentru
40 de min, la 37°C, după amestecarea cu 400 μM azotit, în soluție PBS, pH 7.4
0.06
0 10 20 30 40 50Absorbanta (540 nm)
Timp (min)control Hb(10 μM)+azotit(400 μM)
control Hb(10 μM)+azotit(400 μM)+alcool(100 μM)
paclitaxel (10µM)
paclitaxel (50µM)
paclitaxel (100µM)
0.06
0 10 20 30 40 50Absorbanta (540 nm)
Timp (min)control Hb(10 μM)+azotit(400 μM)+alcool(100 μM)
docetaxel (100µM)
docetaxel (300µM)
docetaxel (600µM)
control Hb(10 μM)+azotit(400 μM)

3.4.3 Activitatea enzimatică a c atalazei
O altă ramură de interes a reacției dintre hemoglobină și azotit în prezența c ompuș ilor
citostatici este utilizarea catalazei ca inhibitor al reacției autocatalitice. Activitatea enzimatică a
catalazei a fost analizată în comparație cu efectul de accelerare a reacției oxidative pe care
compușii citostatici din clasa taxolilor îl manifestă în reacția cu azotitul. Astfel după cum redau
și Fig.2.24 respectiv Fig.2.25 și la o concentraței minimă de doar 10 U catalază, aceasta inhibă
reacția de formare a met -hemoglobinei, deci capacitatea antioxidantă a enzimei are un efect mai
intens în comparație cu influența prooxidantă manifes tată de azotit și medicammente.

Fig.2.23 Schema de acțiune al catalazei

Fig.2.24 Evoluția în timp a absorbanței la 540 nm a hemoglobinei după amestecarea cu 400 μM
azotit, în prezența compusului paclitaxel și a catalazei, în soluție PBS, pH 7.4

-0.020.030.080.130.180.230.28
0 2 4 6 8 10 12 14absorbanta
timp(min)paclitaxel (30µM)+azotit (30µM)+Hb
(10µM)+catalaza (10u)
paclitaxel (30µM)+azotit (30µM)+Hb
(10µM)+catalaza (50u)
paclitaxel (30µM)+azotit (30µM)+Hb
(10µM)+catalaza (100u)
paclitaxel (30µM)+azotit (30µM)+Hb
(10µM)+catalaza (150u)
paclitaxel (30µM) +Hb (10µM)
paclitaxel (30µM)+azotit (30µM)+Hb
(10µM)
Hb (10µM)+azotit (30µM)

Fig.2.25 Evoluția în timp a absor banței la 540 nm a hemoglobinei după amestecarea cu 400 μM
azotit, în prezența compusului docetaxel și a catalazei, în soluție PBS, pH 7.4

00.050.10.150.20.25
0 2 4 6 8 10 12Absorbanta
timp (min)docetaxel (30µM)+azotit (30µM)+Hb
(10µM)+catalaza (50u)
docetaxel (30µM)+azotit (30µM)+Hb
(10µM)+catalaza (100u)
docetaxel (30µM)+azotit (30µM)+Hb
(10µM)+catalaza (10u)
docetaxel (30µM)+azotit (30µM)+Hb
(10µM)+catalaza (150u)
docetaxel (30µM) +Hb (10µM)
docetaxel(30µM)+azotit(30µM)+Hb(10µ
M)
Hb (10µM)+azotit (30µM)

Partea I II
1.Concluzii
În prima parte a aceastei lucrări a fost propus ă o metodă d e obținere și purificare a
materiei prime utilizate, hemoglobina bovină, care să prezinte aplicabilitate și accesibilitate la
scară industrială. În vederea realizării instalației procesului tehnologic au fost elaborate schema
de operații și schema fluxului tehnologic , iar etapa de dimensionare a fost realizată pentru
reactorul de precipitare conform datelor obținute la scară de laborator.
Partea experimentală a lucrării de față evidențiază o serie de investigații care se
concentrează asupra s tudiului toxicității unor compuși bilogic activi, cu acțiune antitumorală, din
clasa taxolilor , denumiți generic compuși citostatici . Metodele utilizate în acest sens au fost alese
astfel încât să corespundă aspectelor de natură econimică și de accesibilit ate practică.
În concluzie, cei doi compuși antitumorali, paclitaxel și docetaxel, determină modificări
ale spectrelor de fluorescență și UV -vis în cazul proteinelor hemoglobină și albumină, ceea ce se
traduce prin alterarea conformați lor celor două proteine. Rezultate edificatoare în vederea
stabilirii gradului de toxicitate al compușilor citostatici au fost remarcate atât în cazul unor reacți
rudimentare realizate prin simpla amestecare a celor doi compuși cu proteinele de interes,
hemoglob ină, respectiv albumină dar și în cazul unor reacți mai complexe cum ar fi reacția de
autooxidare a hemoglobinei, activitatea peroxidazică a hemoglobinei și reacția de oxidare a
hemoglobinei utilizând ca agent oxidant azotitul .
Cu toate că meca nismul exact prin care acești compuși denaturează hemoglobina nu este
cunoscut, rezultatele obținute conturează existența unor interacțiuni precum și a unei punți de
legare între medicamentele antitumorale și hemoglobină, respectiv albumina, interacțiuni c are
vor induce toxicitate la nivel celular, alterând funcționalitatea celulei.

2.Lista de simboluri
Hb: hemoglobină
Mb: mioglobină
oxi-Hb: oxi hemoglobină
met-Hb: met hemoglobină
CYGB : citoglobin ă
NGB: neuroglobin ă
tHb: hemoglobin ă trunc ată
leg-Hb: hemoglobin ă din plante

3.Lista programelor folosite
ChemCad
CaryWin UV
ChemDraw Pro 4.5
Microsoft Office Professional 2013
Origin

4. Bibliografie
1. Garrett R. H., Grisham C. M.,. 1999. Biochemistry 2nd ed. New York: Saunders College
Publishing.
2. Wajcman H., Kiger L., Marden M. C. 2009. „Structure and function evolution in the
superfamily of globins.” Comptes Rendus Biologies 332:273 -282.
3. Storz J. F., Opazo J. C., Hoffmann F. G. 2013. "Gene dupl ication, genome duplication,
and the functional diversification of vertebrate globins." Molecular Phylogenetics and
Evolution 66:469 –478.
4. Ascenzi P., Marino M., Polticelli F., Coletta M., Gioia M., Marini S., Pesce A., Nardini
M., Bolognesi M., Ree der B. J., Wilson M. T. 2013. "Non -covalent and covalent modifications
modulate the reactivity of monomeric mammalian globins." Biochimica et Biophysica Acta
1834:1750 –1756.
5. Mangin O. 2016. "High oxygen affinity hemoglobins." Rev. Med. Interne 5187 :1-7.
6. Irimie F. D. 1998. Elemente de Biochimie. Cluj Napoca: Erdelyi Hirado.
7. Dimino M. L., Palmer A. F. 2007. "Purification of bovine hemoglobin via fast
performance liquid chromatography." Journal of Chromatography 856:353 –357.
8. Andrad e C. T., Barros L. A. M., Lima M. C. P., Azero E. G. 2004. "Purification and
characterization of human hemoglobin:effect of the hemolysis conditions." International
Journal of Biological Macromolecules 34:233 –240.
9. Silaghi -Dumitrescu R. 2011. Metalel e în sistemele vii – o introducere. Cluj Napoca: Presa
Universitară Clujeană.
10. Berg J. M., Tymoczko J. L., Gatto G. J. Jr., Stryer L.,. 2002. Biochemistry 6th ed. New
York: W.H.Freeman and Company.
11. Agachi Ș. 1994. Automatizarea proceselor chimice. Cluj Napoca: Casa Cărții de Știință.
12. Bratu A. E. 1984. Operrații unitare în ingineria chimică, vol I. Cluj Napoca: Editura
Tehnică București -1981.
13. 2012. Cold Spring Harbor Protocols. 11 10. Accessed 05 04, 2017.
http://cshprot ocols.cshlp.org/content/2006/1/pdb.rec8247.
14. Antonini E., Brunori M. 1971. Hemoglobin and myoglobin in their reaction with
ligands. Amsterdam.

15. Ion G., Voicu M.,Paraschiv I.,. 1979. Tehnologia Asamblarii si Montaju lui. București:
Editura Didactica si Pedagogica.
16. Lazăr I., Anghel C.,. 1983. Recipiente sub presiune. Îndrumător de proiectare. Cluj
Napoca.
17. Floarea O., Jinescu G.,. 1989. Operații și utilaje în industria chimicǎ . București: Editura
Didacticǎ și Pedagogicǎ.
18. Lazăr, I.,. 1988. Calculul si constructia recipientelor cu amestecator. Indrumator de
proiectare. Cluj Napoca.
19. Oniscu C., Cașcaval D.,. 2002. Ingineria proceselor biote hnologice, vol I. Iași:
Interglobal.
20. Cașcaval D., Oniscu C.,. 2002. Inginerie biochimică și biotehnologie – vol.II.
Bioreactoare. Iasi: Editura InerGlobal, Iași.
21. Pavlov C. F., Romankov P. G.,. 1989. Procese și apar ate în ingineria chimică.
București: Ed.Tehnică, București.
22. Accessed 05 01, 2017. https://ro.wikipedia.org/wiki/Ghea%C8%9B%C4%83.
23. Accessed 05 04, 2017.
http://www.rasfoiesc.com/educatie/biologie/b iofizica/Coeficienti -de-vascozitate97.php.
24. Ozunu A. 2000. Elemente de hazard și risc în industrii poluante. Cluj Napoca: Accent.
25. ZUO K. Q., ZHANG X. P., ZOU J., LI D. 2010. "Establishment of a Paclitaxel
Resistan t Human Breast Cancer Cell Strain (MCF -7/Taxol) and Intracellular Paclitaxel Binding
Protein Analysis." The Journal of International Medical Research 384:1428 – 1435.
26. Frederiks C. N., Lam S. W., Guchelaar H. J., Boven E. 2015. "Geneti c polymorphisms
and paclitaxel – or docetaxel -induced toxicities: a systematic review." Cancer Treatment
Reviews 1448:1 -35.
27. Dumontet C., Sikic B. I. 1999. "Mechanisms of Action of and Resistance to Antitubulin
Agents:Microtubule Dynami cs, Drug Transport,and Cell Death." Journal of Clinical Oncology
17:1061 -1070.
28. Travaglini -Allocatelli C., Ivarsson Y., Jemth P., Gianni S. 2009. "Folding and stability
of globular proteins and implications for function." Structural Bio logy 19:3–7.
29. Yardley D. A. 2013. "nab -Paclitaxel mechanisms of action and delivery." Journal of
Controlled Release 170:365 –372.

30. Cheng H., Liu H., Bao W., Zou G. 2011. "Studies on the interaction between docetaxel
and human hem oglobin by spectroscopic analysis and molecular docking." Journal of
Photochemistry and Photobiology B: Biology 105:126 –132.
31. Campos F. C., Victorino V. J., Martins -Pinge M. C., Cecchini A. L., Panis C., Cecchini
R. 2014. "Systemic to xicity induced by paclitaxel in vivo is associated with the solvent
cremophor EL through oxidative stress -driven mechanisms." Food and Chemical Toxicology
68:78 –86.
32. Bischin C. 2012. Mecanisme de acține implicând metaloproteine, stres oxidativ și
nitrozativ și compuși cu activitate antitumorală. Cluj-Napoca.
33. Harisa G. I. 2014. "Blood viscosity as a sensitive indicator for paclitaxel induced
oxidative stress in human whole blood." Saudi Pharmaceutical Journal 238:1 -7.
34. Hathazi D., Mahut¸S. D., Scurtu F -V., Bischin C., Stanciu C., Attia A. A., Damian G.,
Silaghi -Dumitrescu R. 2014. "Involvement of ferryl in the reaction between nitrite and the oxy
forms of globins." J Biol Inorg Chem 1:1-7.
35. Cortes J., Saura C. 2010. "Nanoparticle albumin -bound (nab™) -paclitaxel: improving
efficacy and tolerability by targeted drug delivery in metastatic breast cancer." European
Journal of Cancer 8:1-10.
36. Nelson D. L., Cox M . M. 2008. Lehninger Principles of Biochemistry (4th edition). New
York: W. H. Freeman and Company.
37. Goyal M. M., Basak A. 2010. "Human catalase: looking for complete identity." Protein
& Cell 10:888 –897.
38. Odunuga O. O., Shazhko A. 2013. "Ammonium sulfate preciptation combined with
liquid cromatography is sufficien for purification of bovine serum albumin that is suitable for
most routine laboratory applications." Biochemical Compounds 805-825.
39. Cord os E., Frentiu T., Rusu A. M, Ponta M, Darvasi E. 2001. Analiza prin spectrometrie
de absorbtie moleculara in ultraviolet -vizibil. Bucuresti: Ed. Institutului National de
Optoelectromica.
40. Lakowicz J. R. 2006. Principles of Fluorescence Spectroscopy. New York: Sspringer
Science&business media.