Tehnici imagistice de clasificare a celulelor aflate în diferite [302097]

Universitatea “Politehnica” [anonimizat] a celulelor aflate în diferite

stadii de malignitate

Lucrare de disertație

prezentată ca cerință parțială pentru obținerea titlului de

Master în domeniul Electronică Aplicată și Tehnologia Informației

programul de studii de masterat Electronică și Informatică Medicală

Conducători științifici Absolvent: [anonimizat]. Valentina Alexandra BĂLUȚĂ

Prof. Dr. Ing. Sever PAȘCA

2018

Cuprins

Abstract

Introducere

Generalități culturi celulare

Aplicarea unor pulsuri regulate de tensiune în culturile celulare

Microscopia holografică

Configurații holografice digitale

Investigarea culturilor celulare prin microscopie holografică

Proceduri experimentale

II.1. Proiectarea unei incinte 3D

II.2. Componentele montajului experimental

II.3. Electroporarea celulelor B16F10

II.4. Înregistrarea digitală și reconstrucția numerică a hologramelor

Prelucrarea imaginilor reconstruite din hologramele înregistrate

III.1. Segmentarea manuală a imaginilor înregistrate

III. 2. Obținerea coeficienților de caracterizare a celulelor

III.2.1. Comparație celule maligne porate și neporate

III.2.2. Comparație celule aflate în diferite stadii de malignitate

Concluzii

Tendințe viitoare

Bibliografie

Anexe

Abstract

Procedura de electroporare reprezintă o platformă tehnologică utilă pentru aplicații biologice și industriale multiple. Se bazează pe aplicarea unor impulsuri electrice ce induc permeabilizarea membranelor celulare. În funcție de caracteristicile pulsului (durata – [anonimizat]), [anonimizat]. În ultima decadă, s-[anonimizat], electrofuziunea celulară și electroablația. În industria alimentară și a biomasei, electroporarea a [anonimizat].

În paralel cu dezvoltarea rapidă a aplicațiilor existente, s-a manifestat un interes constant în cercetarea fundamentală deoarece mecanismele intrinseci ale electroporării sunt încă în studiu. Modificările celulare și moleculare care apar în timpul procesului de electroporare și de recuperare a celulelor, nu sunt încă bine cunoscute și descrise în detaliu datorită dinamicii lor rapide. [anonimizat] o sensibilitate ridicată prin tehnici optice și electrice. Îmbunătățirea eficienței aplicațiilor medicale necesită totuși o mai bună înțelegere a evenimentelor fizice apărute în celulele electroporate atât în timpul porării cât și după aplicarea pulsului.

Metodele optice pot oferi informații semnificative cu privire la modificările morfologice ale celulelor care însoțesc electroporarea. [anonimizat] (DHM) ca tehnică inovativă pentru studiul modificărilor celulare ulterioare electroporării. DHM a [anonimizat], pentru a [anonimizat], [anonimizat]. [anonimizat] a imaginilor cantitative de fază (QPIs) oferite de DHM, această metodă a fost utilizată pentru a evalua dinamica producerii și reparării daunelor după microchirurgia cu laser și micromanipularea optică a celulelor. Totodată, DHM permite obținerea, pentru o singură celulă, a unei hărți cu valori ale indiciilor de refracție. Microscopul de fază a fost dezvoltat pentru a efectua măsurători, a obține valori ale indicilor de refracție, corespunzători celulelor atașate la substrat sau a organismelor multicelulare și a observa modificările dependente de timp ale indicilor din celulă.

DHM poate fi utilizată pentru reconstrucția imaginilor din eșantioane transparente după o singură achiziție a unei imagini, în fracțiuni de secunde, fără a folosi nici un fel de marker-i sau substanțe chimice de contrast. Principiul fizic al metodei se bazează pe schimbările de fază introduse în frontul fascicolului difuzat de specimen datorită diferitelor lungimi ale căii optice, în fiecare punct al eșantionului. Atunci când acest fascicol interferă cu fascicolul de referință, suprapunerea lor produce imaginea holografică, care conține valorile diferenței de fază, corespunzătoare specimenului, în fiecare punct. Mai mult, reconstrucția folosind teoria scalară a difracției, analiza Fourier și tehnicile specifice de procesare a imaginii recuperează informații despre forma și proprietățile optice ale eșantionului. Celulele vii, aflate în mediul lor natural lichid pot fi astfel caracterizate prin conservarea viabilității celulare. În consecință, DHM reprezintă o tehnică non-distructivă, neinvazivă, ce nu implică utilizarea markerilor cromatografici, cu rezoluție nanometrică de-a lungul axei de propagare a fascicolului laser.

Pentru caracterizarea potențialul metastatic celular, am propus biomarkeri optici noi, pornind de la DHM: analiza bimodală QPI, combinată cu calculul indicelui de refracție (RI) și al densității maselor uscate (DM). Rezultatele obținute arată că sublinia celulară cu potențial metastatic mai mare prezintă o histogramă unimodală, un indice de refracție mai mare și o densitate mai mică de masă uscată.

În domeniul patologiei cancerului, s-a raportat că RI, măsurat pe celule individuale, este mai mare la celulele maligne decât la cele normale. Această caracteristică a fost atribuită conținutului mai mare de proteine ​​din celulele canceroase, proteine care susțin procesul de diviziune. S-a demonstrat că "celulele neimplicate" (celule histopatologice normale, identificate în tumorile colectate de la pacienții cu cancer) au RI crescut. Măsurarea RI a fost efectuată fie pe celule aderente, fie pe celule atașate de substrat. Întreaga analiză a ținut cont de faptul că măsurarea RI este puternic dependentă de starea experimentală (celule vii sau fixe, o singură celulă față sau un țesut, temperatura, osmolaritate) și de rezoluția metodei (harta efectivă RI sau 3D RI).

Lucrarea a pornit de la utilizarea metodei DHM, în configurație off-axis, pentru a descoperi diferențele dintre două sublinii (F1 și F10) ale celulelor B16 de melanom murin, caracterizate prin potențial metastatic diferit. S-au calculat RI-urile celulelor aderente în zone specifice, densitatea de masă uscată a ambelor sublinii și s-au caracterizat distribuțiile de schimbare a fazei ale imaginilor cantitative reconstruite folosind coeficientul de bimodalitate. Corelațiile observate ale profilurilor bimodalității RI, densității maselor uscate și bimodalității QPI cu potențialul metastatic celular au fost validate prin alte două standarde care cuantifică rata de proliferare a celulelor: teste clonogenice și înregistrări ale indexului de celule bazat pe impedanță.

Listă figuri

Fig. 1.1….……………………………………………………………………………………………….15

Fig. 1.2….……………………………………………………………………………………………….15

Fig. 1.3…..………………………………………………………………………………………………15

Fig. 1.4…..………………………………………………………………………………………………17

Fig. 1.5…..………………………………………………………………………………………………20

Fig. 1.6…..………………………………………………………………………………………………20

Fig. 1.7…..………………………………………………………………………………………………21

Fig. 1.8…..………………………………………………………………………………………………22

Fig. 2.1…..………………………………………………………………………………………………26

Fig. 2.2…….……………………………………………………………………………………………..26

Fig. 2.3…….……………………………………………………………………………………………..27

Fig. 2.4…….……………………………………………………………………………………………..27

Fig. 2.5…….……………………………………………………………………………………………..28

Fig. 2.6…….……………………………………………………………………………………………..29

Fig. 2.7…….……………………………………………………………………………………………..31

Fig. 2.8..……..……………………………………………………………………………………………31

Fig. 2.9..……..…………………………………………………………………………………………..33

Fig. 2.10…………………………………………………………………………………………………..34

Fig. 2.11…..……………………………………………………………………………………………..35

Fig. 2.12………..………………………………………………………………………………………..36

Fig. 2.13………..………………………………………………………………………………………..36

Fig. 3.1…..……………………………………………………………………………………………39-41

Fig. 3.2…….……………………………………………………………………………………….…42-44

Fig. 3.3…….……………………………………………………………………………………………..45

Fig. 3.4…….……………………………………………………………………………………………..46

Fig. 3.5…….……………………………………………………………………………………………..47

Fig. 3.6…….……………………………………………………………………………………………..47

Fig. 3.7…….……………………………………………………………………………………………..48

Fig. 3.8..……..……………………………………………………………………………………………48

Fig. 3.9..……..…………………………………………………………………………………………..50

Fig. 3.10…………………………………………………………………………………………………..52

Fig. 3.11…………………………………………………………………………………………………..53

Fig. 3.12…………………………………………………………………………………………………..58

Fig. 3.13…………………………………………………………………………………………………..58

Fig. 3.14…………………………………………………………………………………………………..59

Fig. 3.15…………………………………………………………………………………………………..60

Listă tabele

Tabel 1….………………………………………………………………………………………………..51

Tabel 2….………………………………………………………………………………………………..51

Tabel 3….………………………………………………………………………………………………..54

Tabel 4….………………………………………………………………………………………………..54

Tabel 5….………………………………………………………………………………………………..55

Tabel 6….………………………………………………………………………………………………..55

Tabel 7….………………………………………………………………………………………………..56

Tabel 8….………………………………………………………………………………………………..57

Abrevieri

DHM = Digital Holographic Microscopy

AFM = Atomic-Force Microscopy

SEM = Scanning Electron Microscopy

PI = Propidium Iodide

HI = Holographic Interferometry

CGH = Computer Generated Holography

CCDs = Charged Coupled Devices

DMD = Digital Micromirror Device

BS = Beamsplitter

DM = Dry Mass

OPD = Optical Phase Differences

OPS = Optical Phase Synchronization

QPIs = Quantitative Phase Images

Introducere

I.1. Generalități culturi celulare

Celula reprezintă blocul de construcție pentru viața umană. De exemplu, materialul genetic al fiecărei celule din corpul uman, ce se compune din 100 trilioane de celule, deține secretul unor boli ereditare, cum ar fi Tay Sachs, fibroza chistică, boala Alzheimer și alte boli complexe precum cele de inimă. Cultura de țesut a fost dezvoltată prima oară la începutul anilor 1900 pentru studiul comportamentului celular – fără variații ce ar putea apărea în întregul organism – prin expunerea la stres normal sau indus. Inițial, oamenii de știință au folosit fragmente de țesuturi însă, tehnicile dezvoltate treptat pentru studiul comportamentul celulelor au schimbat numele în culturi de celule.

În forma sa cea mai simplă, cultura celulară implică dispersarea celulelor într-un mediu artificial compus din soluții de nutrienți, pe o suprafață adecvată pentru a susține creșterea celulelor, precum și condiții ideale de temperatură, umiditate și atmosferă gazoasă. Într-un astfel de sistem, un cercetător poate măsura cu precizie răspunsul alterărilor celulare din cultură, prezența sau absența altor tipuri de celule, agenți cancerigeni și virusuri.

Celulele pentru culturi, ADN-ul sau fragmente mici de țesut (biopsii) pot fi extrase din organism. Limfocitele pot fi imortalizate cu ajutorul virusul Epstein-Barr și apoi reproduse pe termen nelimitat în mediul de cultură. Fibroblastele (celule de la o biopsie a pielii) pot fi folosite pentru a stabili o linie de celule, deși creșterea lor în mediul de cultură este limitată în timp.

Cultura celulară se referă la preluarea celulelor de la un organism animal sau de la o plantă și creșterea ulterioară a acestora într-un mediu artificial favorabil. Celulele pot fi eliminate din țesutul direct și dezagregate cu ajutor enzimatic sau mecanic înainte de cultivare, sau pot fi derivate dintr-o linie celulara [1].

În prezent, există trei clase generale de culturi celulare:

Cultura celulară primară

Cultura celulară primară permite menținerea creșterii celulelor disociate din țesutul parental (cum ar fi rinichi sau ficat), folosind metode mecanice sau enzimatice, în mediul de cultură, cu recipiente de sticlă sau plastic adecvate. Cultura primară de celule se poate realiza în două moduri, în funcție de tipul de celule din cultură și de scopul analizei.

Culturi pentru celule aderente – celule ce necesită atașament pentru creștere; se spune că sunt celule dependente de ancorare. Celulele aderente sunt, de obicei, derivate din țesuturi de organe, cum ar fi rinichi în cazul în care acestea sunt imobile și încorporate în țesutul conjunctiv.

Culturi pentru celule în suspensie – celulele care nu necesită atașament pentru creștere, nu se atașează de suprafața vaselor de cultură. Toate culturile în suspensie sunt derivate din celule ale sistemului sanguin deoarece aceste celule sunt, de asemenea, suspendate în plasma in vitro, așa cum sunt, de exemplu, limfocitele.

Culturile celulare secundare

Atunci când o cultură primară este subcultivată devine ceea ce se numește cultură secundară sau linie celulară. Subcultura se referă la transferul de celule dintr-un vas de cultură într-un alt vas. Acest lucru este necesar în mod periodic pentru a furniza substanțe nutritive proaspete și spațiu de creștere pentru linii de celule în continuă dezvoltare. Procesul conduce la eliminarea mediul de creștere și disocierea celulelor aderente (de obicei, pe cale enzimatică). Astfel de culturi pot fi numite culturi secundare.

Linii celulare

O linie de celule sau tulpina celulei poate fi finită sau continuă. În funcție de durata de viață a culturii, liniile de celule sunt clasificate în două categorii:

Liniile celulare finite – Linii celulare care au o durată de viață limitată, trec printr-un număr limitat de generații de celule (de obicei, 20-80 dublări de populație) și sunt cunoscute ca fiind linii celulare finite. Aceste linii de celule prezintă proprietatea inhibării de contact, limitarea densității și a dependenței de ancorare. Rata de creștere este lentă și timpul de dublare este de aproximativ 24-96 de ore.

Liniile celulare continue – Linii celulare transformate în condiții de laborator sau în condiții de cultură in vitro ce dau naștere unor linii celulare continue. Aceste linii celulare prezintă proprietatea ploidiei (aneuploidie sau heteroploidie), lipsa inhibiției de contact și dependența de ancorare. Ele cresc fie într-un monostrat, fie în suspensie. Rata de creștere este rapidă și timpul de dublare poate fi de 12-24 ore.

Pe scurt, liniile celulare finite cuprind celule normale ce se divid de un număr limitat de ori înainte de a-si pierde capacitatea de proliferare, eveniment determinat genetic, cunoscut sub numele de senescență. Cu toate acestea, unele linii celulare devin nemuritoare printr-un proces de transformare care poate să apară spontan sau poate fi indus chimic și viral. Atunci când o linie celulară finită suferă transformări și dobândește capacitatea de a se diviza la nesfârșit devine o linie continuă de celule.

Printre modalitățile de realizare a culturilor de linii se pot aminti:

Culturile monostrat – De obicei, baza vasului de cultură este acoperită cu un strat continu de celule, denumite generic culturi monostrat.

Culturile in suspensie – Majoritatea liniilor celulare continuă să crească ca monostraturi. Unele dintre celule sunt antiadezive (de exemplu, celule de leucemie) și pot fi păstrate mecanic în suspensie sau pot fi propagate în suspensie [1].

Condițiile de cultură variază foarte mult de la un tip de celulă la altul. Mediul artificial în care celulele sunt cultivate în mod invariabil constă dintr-un vas adecvat ce conține un substrat sau un mediu care furnizează substanțele nutritive esențiale (aminoacizi, carbohidrați, vitamine, minerale), factori de creștere, hormoni și gaze (O2, CO2). Cele mai multe celule trebuie să fie cultivate atunci când sunt atașate de un substrat solid sau semisolid, în timp ce altele pot fi cultivate plutind în mediul de cultura (cultură în suspensie).

Pe baza formei și aspectului, culturile celulare pot fi împărțite în trei categorii de bază:

fibroblastice: celulele sunt bipolare sau multipolare, au forme alungite și cresc atașate la un substrat.

Fig. 1.1: Celule fibroblaste [url-1.1]

epiteliale: celulele au formă poligonală cu mai multe dimensiuni, cresc atașate la un substrat în patch-uri discrete.

Fig. 1.2: Celule epiteliale vezicale [url-1.2]

celulele limfoblaste: sunt piese de formă sferică și, de obicei, cultivate în suspensie, fără a fi atașate la o suprafață.

Fig. 1.3: Limfoame maligne [url-1.3]

Prin urmare, metoda culturilor celulare este una dintre cele mai importante instrumente utilizate în biologia celulară și moleculară oferind sisteme model excelente pentru studierea fiziologiei normale și a biochimiei celulare (de exemplu studii metabolice, îmbătrânirea), efectele medicamentelor și a compușilor toxici asupra celulelor, mutageneza și carcinogeneza. De asemenea, sunt utilizate în screening-ul de droguri și de fabricație pe scară largă a compușilor biologici (de exemplu vaccinuri, proteine terapeutice). Avantajul major al utilizării culturilor celulare pentru oricare dintre aceste aplicații este consistența și reproductibilitatea rezultatelor care pot fi obținute de la utilizarea unui lot de celule clonale.

I.2. Aplicarea unor pulsuri regulate de tensiune în culturile celulare

Conceputul de electroporare poate fi ilustrat cu ajutorul mai multor definiții:

Electroporarea constă în aplicarea unor impulsuri de tensiune mare și durată mică la nivelul celulelor și țesuturilor. Aceste impulsuri electrice speciale acționează la nivelul membranelor celulare, în special, în spațiile intercelulare lipidice, determinând modificări moleculare ce produc formarea unor ultramicropori ce cresc permeabilitatea. Fenomenul formării acestor ultramicropori este complet reversibil deoarece moleculele lipidice revin la structura lor inițială atunci când descărcarea electrică încetează. Această formare și dispariție continuă a porilor produce o creștere semnificativă a permeabilității nespecifice în favoarea gradienților de concentrație. Cercetătorii susțin că formarea ultramicrocanalelor de origine electrică survine în structura lipidică a stratului cornos care cimentează keratinocitele. În funcție de zona cutanată de interes, această structură lipidică reprezintă aproximativ 5-30%, fiind principala barieră a pielii pentru penetrarea substanțelor.

Electroporarea este o metodă de transfecție fizică care utilizează un impuls electric pentru a crea temporar pori în membranele celulare, prin care substanțele, cum ar fi acizii nucleici, pot trece în celule. Este o strategie extrem de eficientă pentru introducerea acizilor nucleici străini în multe tipuri de celule, inclusiv bacterii și celule ale unor mamifere.

Electroporarea poate fi folosită și ca metodă fizică de livrare a genei. Din acest motiv, se aplică pe scară largă pentru o varietate de tipuri de celule, inclusiv animale, plante și microbi [2]. În timpul electroporării, celulele sunt expuse la un puls de înaltă tensiune în prezența acidului nucleic exogen. Tensiunea mare face ca membrana celulară să fie tranzitoriu permeabilă, permițând acizilor nucleici străini să intre în celule [3 – 5]. Este de notat faptul că fiecare tip de celulă necesită condiții de electroporare ușor diferite, ce trebuie determinate experimental.

Cei mai importanți parametri pentru electroporarea efectivă sunt intensitatea câmpului electric [kV/cm] și intervalul de timp în care se aplică câmpul electric (lungimea pulsului [ps]). Printre numeroasele utilizări ale electroporării se numără și tratarea tumorilor [6 – 7], aceasta fiind considerată una dintre tehnicile cele mai utile în terapia genică [8].

Acțiunea unui impuls electric de amplitudine joasă este capabilă să producă o permeabilizare reversibilă a membranei [9 – 10]. În tot acest timp, molecule exogene, pentru care în mod normal membrana nu este permeabilă, pot depăși bariera membranei prin difuzie. În terapia cancerului, această tehnică a fost folosită cu succes pentru a îmbunătăți eficiența citostaticelor [7] [11]. O metodă derivată este electroporarea transdermică. Pulsurile electrice se aplică peste stratul dermal, fapt ce conduce la creșterea difuzivități medicamentelor prin ea.

Florin Ciobanu et all. au arătat faptul că electroporarea în prezența bromurii de etidiu s-a dovedit a fi utilă pentru crearea celor mai bune conditii de electroporare a celulelor maligne B16F10. Aplicarea repetată a unui puls scurt (100 ps, 1 kV/cm) a permis creșterea procentului de celule viabile porate (peste 70%). Condițiile electrice descrise în cadrul acestui articol poate fi utilizate și pentru încapsularea altor molecule mici în celulele B16F10, cu observația că optimizarea trebuie făcută pentru fiecare tip de moleculă în parte [12].

Având în vedere toate cele de mai sus, principalul avantaj al electroporării este aplicabilitatea sa pentru transfecția tranzitorie și stabilă a tuturor tipurilor de celule. Mai mult decât atât, pentru ca electroporarea să fie ușoară și rapidă, este nevoie de a transfecta un număr mare de celule într-un timp scurt, odată ce sunt determinate condițiile optime de electroporare. Dezavantajul major al electroporării este moartea substanțială a celulelor, provocată de impulsurile electrice de înaltă tensiune și doar

Preparerea culturilor celulare Aplicarea pulsului electric Întoarcerea la condițiile de crestere Testarea celulelor
Fig. 1.4: Fluxul de lucru al electroporării

În Fig. 1.4. este prezentată o schemă a principalelor etape ale procesului de electroporare, începând cu prepararea culturilor celulare și terminând cu analiza acestora după ce au fost aplicate pulsuri de electroporare.

I.3. Microscopia holografică

La început, observarea culturilor celulare cu ajutorul microscoapelor optice a adus multe informații noi și folositoare în studiul culturilor celulare și nu numai. Microscopia în câmp luminos necesită probe colorate, de amplitudine, lucru care conduce la moartea celulelor. Microscopia de fluorescență necesita, de asemenea, markeri specifici pentru observarea stării celulelor.

Cu timpul, două aspecte au fost mai dificil de rezolvat în cazul tehnicilor microscopice. Primul dintre acestea este limita optică de difracție care este aproximativ jumătate din lungimea de undă a luminii folosite la microscop. Acest lucru face aproape imposibilă distingerea structurilor intracelulare care sunt mai mici decât limita de difracție. O altă problemă este diferența scăzută a indicelui de refracție între o celulă și mediul înconjurător, diferență care în mod normal este mai mică de 0,1. Deci, o singură celulă arată ca fiind aproape transparentă, lucru ce face ca obținerea de imagini cu contrast ridicat să fie dificilă atunci când sunt utilizate microscoape optice clasice. În aceste condiții, în care o singura celulă se prezintă ca aproape transparentă, utilizarea de microscoape optice clasice face anevoioasă obținerea de imagini cu contrast ridicat.

În acest scop, diferite tehnici au fost dezvoltate pentru a depăși problema indicelui de refracție. Una dintre metodele bine dezvoltate este posibilitatea de a utiliza markeri pe post de agenți de contrast, cum ar fi coloranți de fluorescență și puncte cuantice, ce sunt capabile să fie atașate pe unele părți ale celulei. Aceste metode au probleme cauzate de agentul de contrast, cum ar fi foto-oxidarea sau toxicitatea pentru probele biologice, probleme întalnite și la tipurile anterioare de microscoape.

Cealaltă metodă bine cunoscută pentru a îmbunătăți contrastul imaginii este de a profita de schimbarea de fază a trecerii luminii prin proba transparentă. Descoperirea microscopului holografic a permis “investigarea” celulelor biologice în scopul observării morfologiei celulei sau a grosimii acesteia în timp real, schimbarea volumului și asa mai departe [13].

Istoria holografiei a început în 1948, când Dennis Gabor a introdus o metodă de evitare a aberației de sferice și de îmbunătățire a calitații imaginii în microscopia electronică, metodă cu ajutorul căreia se economisesc lentile în instalația experimentală [Gabor, 1948]. În arhitectura de bază, Gabor definește o configurație în linie în cazul în care două fascicole ajung în planul de înregistrare: fascicolul de obiect datorat difracției pe probă și fascicolul de referință datorat nondifracției de lumină ce trece prin eșantion. Deoarece ambele fascicole de lumină, care interferă, se propagă în aceeași direcție, reconstrucția obiectului complex a frontului de undă se suprapune cu imaginea obiectului ce corespunde frontului de undă conjugat și cu ordinul zero (intensitatea undei de referință). Prin urmare, holografia Gabor suferă de zgomotul datorat suprapunerii între termeni, în procesul de reconstrucție. Cea mai importanta limitare vine de la faptul că abordarea Gabor prezintă aplicabilitate doar atunci când se analizează probe de difracție slabe, sau cu alte cuvinte, procesul trebuie explicat prin holografie si nu prin difracție [14].

Pentru a elimina aceste deficiențe, fascicolul de referință poate fi introdus din exterior la planul de înregistrare, permițând astfel ca holografia să domine procesul de înregistrare, indiferent dacă proba trebuie sau nu să fie considerată ca și o difracție slabă. Suprapunerea la planul de înregistrare atât a unui fascicol de referință filtrat spațial, cât și a unui fascicol de imagistică ce transportă informația despre probă, produce figura de interferență. Se poate distinge între diferite moduri de introducere a fascicolului de referință, dar, în esență, există două opțiuni: off-axis [15] și configurația on-axis [16]. Anteriorul evită distorsiunile cauzate de suprapunere, în direcția de observare, din cei trei termeni holografici primiți de la configurația în linie de la imagini reale și virtuale propagate la diferite unghiuri. Și aceasta din urmă are nevoie de înregistrarea mai multor holograme, obținute prin varierea fazei fascicolului de referință, cu scopul de a evita denaturarea.

Actualmente, microscopia holografică digitală se dezvoltă rapid și are drept scop depășirea multor obstacole pentru obținerea unor imagini de înalta calitate. Văzută ca o tehnologie modernă ce permite studii imagistice 3D, cantitative, de fază, în timp real, care nu distruge proba și nu folosește markeri și colorații, DHM capătă un rol important în ceea ce privește aplicațiile biomedicale.

Conceptul de bază în holografia digitală este înregistrarea figurii de interferență care se obține din suprapunerea undei de referință cu cea de obiect. Această înregistrare se realizează pe o cameră video și nu pe placă holografică, așa cum se realiza în mod clasic. Aceasta este transmisă apoi către computer și, de aceea, reconstrucția se realizează digital, prin simularea propagării undei prin hologramă.

Prin prelucrarea cu ajutorul unui calculator, este posibil să se recupereze informațiile complete ale formelor de undă complexe, difractate de către obiect, adică amplitudinea și faza. Metoda de obținere a acestei informații include un proces de filtrare, în spațiul Fourier, în scopul de a diferenția imaginea reală de cea virtuală, care se obținea în ordinele +1 și -1 de difracție. După filtrare, holograma digitală rezultată este multiplicată cu o undă de referință numerică care se potrivește cu referința fizică utilizată pentru înregistrarea hologramei digitale (simulând astfel procesul de propagare). Apoi, se poate face o reconstrucție numerică bazată pe integrala Fresnel – Kirchhoff, permițând astfel să se calculeze amplitudinea și faza corespunzătoare obiectului (probei). Ecuațiile folosite oferă posibilitatea ca reconstrucția să se realizeze în planuri diferite și, în special, în vecinătatea planului focar unde se obține imaginea focalizată a obiectului. Din acest motiv, se consideră că există posibilitatea focalizării digitale și a scanării axiale cu precizie nanometrică a imaginii reconstruite.

Ca orice tehnică holografică și microscopia holografică digitală respectă două etape:

1. Înregistrarea hologramei;

2. Reconstrucția imaginii obiectului.

Prima etapă este experimentală și constă în realizarea unui montaj în care este introdus obiectul real și care permite înregistrarea hologramei obținută prin suprapunerea dintre o undă de obiect (reflectată sau transmisă de obiect) și una de referință. Această figură de interferență se înregistrează pe senzorul unei camere video sau foto.

A doua etapă este numerică și pornește de la holograma înregistrată experimental sub forma unei imagini digitale, care, transmisă la computer, devine o matrice de numere ce poate fi prelucrată folosind operații specifice. În această etapă, se realizează reconstrucția imaginii 3D a obiectului, prin simularea propagării, pornind de la hologramă și utilizând un soft specializat, bazat pe teoria scalară a difracției, în aproximația Fresnel în câmp apropiat.

I.3.1. Configurații holografice digitale

O privire de ansamblu asupra principalelor tipuri de configurații interferometrice utilizate în holografia digitală este importantă întrucât, înainte de începerea unui experiment practic trebuie puse în ordine toate aspectele legate de instalația experimentală, în vederea obținerii ulterioare a celor mai bune rezultate. În primul rând, holografia Fresnel se referă la o configurație în care obiectul se află la o distanță finită față de planul hologramei, iar referința este, de obicei, o undă plană. Imaginile se formeaza atunci când poziția obiectului și poziția sa în oglindă, relativ la hologramă, respectă mărirea unitate, fapt ilustrat și în fig. 1.5. Pentru a evita suprapunerea dintre imaginea reală și cea virtuală după reconstrucție, undele de referință si cele ale obiectului sunt deplasate cu un unghi, lucru încercat inițial de către Leith și Upatnieks. Poziția imaginii și mărirea pot fi manipulate prin utilizarea unei alte referințe. Plasarea la o distanță suficient de mare și utilizarea transformatei Fresnel, în etapa de reconstrucție, permit imagistica unui obiect mai mare decât dimensiunea matricei CCD, lucru favorabil mai ales în aplicații metrologice macroscopice [17].

Fig. 1.5 – Holografia Fresnel off-axis [url-1.4]. Cu albastru sunt reprezentate fascicolele de

referință iar cu roșu modul de propagare al unui punct pe un obiect :

( a ) de înregistrare și ( b ) de reconstrucție

Holografia off-axis este necesară pentru a evita suprapunerea dintre ordinul zero și imaginile holografice. Acest lucru reduce însă conținutul de informații al hologramei la un sfert din numărul de pixeli.

Cu un alt tip de configurație holografică, mai exact prin intermediul configurației in-line, câmpul obiectului este aliniat perfect cu fascicolul de referință, iar întregul număr de pixeli al hologramei este utilizat, fapt ce conduce la distanțe minime mai scurte pentru reconstrucția Fresnel și o rezoluție mai mare a imaginii rezultate. Au fost propuse și demonstrate mai multe metode pentru a reduce sau elimina efectul ordinului zero și al imaginilor duble. Termenul de ordinul zero (sau DC) poate fi parțial suprimat prin simpla scădere a intensității medii a întregii holograme sau alternativ, prin aplicarea unui filtru trece-sus transformatei Fourier a hologramei în apropierea frecvenței de zero. Eficacitatea filtrului trece-sus depinde de conținutul spectral al obiectului. Expunerile separate ale referinței, obiectului și scăderea lor din hologramă, înainte de filtrarea de ordin zero, îmbunătățesc rezultatul. Eliminarea așa-numitor imagini duble este mai dificilă și necesită tehnici speciale. Totusi, metoda de aplicare a unui filtru trece-sus poate fi eficientă atunci când natura dinamică a obiectului se opune metodei de defazare [17].

Fig. 1.6 – Holografia on-axis [url-1.5]: ( a ) suprapunerea dintre unda de obiect și cea de referință; ( b ) reconstrucția imaginii obiectului (ordinul +1) cu dezavantajul că există atât ordinul

zero cât și imaginea dublă/geamănă (ordinul -1)

Pe de altă parte, microscopia holografică digitală in-line sau on-axis constituie un instrument potrivit pentru aplicații biologice, fiind un model superior microscopiei convenționale cu lumină compusă. Avantajele holografiei digitale in-line constau în:

Simplitatea microscopului: holografia in-line este un tip de microscopie fără obiective. Hardware-ul necesar constă dintr-un laser, un orificiu și o cameră (CCD).

Simplitatea de pregătire a probelor: secționarea sau colorarea nu sunt necesare. Astfel, pot fi vizualizate celulele în starea lor naturală.

Viteza: modificările în specimen pot fi urmărite cu o viteză egală cu numărul de frame-uri ale camerei CCD.

Multitudinea de informații: o singură hologramă conține toate informațiile cu privire la structura tridimensională a obiectului.

Rezoluția maximă: rezoluția optimă, de ordinul lungimii de undă a laserului; poate fi obținută cu ușurință [18].

Fig. 1.7 – (A) Aranjamentul de bază al holografiei in-line; (B) Schema aranjamentului experimental folosit pentru a înregistra o imagine optică și o hologramă a aceluiași obiect [url-1.6]

Montajul experimental al configurației in-line (fig. 1.7) cuprinde:

Un laser (L) iluminează un orificiu (P), care acționează ca o sursă punctiformă. Undele sferice care pornesc din orificiu ilumineaza obiectul (O), iar interferența la ecran (C) a undelor împrăștiate ( – – – ) cu unda de referință ( – ) constituie holograma.

Ocularul (f), camera (g), oglinda (h) și obiectivul (b) fac parte dintr-un microscop inversat. Pentru a înregistra holograma, lumina de la un laser (a) este reflectată pe o oglindă și, mai apoi, concentrată de obiectiv pe orificiu (c). Lumina care iese din orificiu trece prin obiect, prin substratul de sticlă (d) și formează o hologramă pe cipul CCD (e). Pentru a înregistra o imagine optică conventională a obiectului, oglinda este transformată pentru a permite ca lumina albă de la o lampă (nu apare reprezentată în fig. 1.7), ce luminează obiectul, să ajungă la un al doilea cip CCD atașat la ocular.

Având în vedere cele de mai sus, cât și urmarea principiului interferometric de bază, diferite structuri clasice pot fi utilizate pentru a asambla o configurație DHM.

În acest sens, Mach-Zehnder [19], Michelson [20], Twyman-Green [21] au fost propuse ca și arhitecturi interferometrice de bază. Dintre acestea, configurația Mach-Zehnder este de departe cea mai utilizată în practica DHM [22].

I.3.2. Investigarea culturilor celulare prin microscopie holografică

Căutarea unei metode destinate studiului celular cu exactitate, fără utilizarea de markeri sau colorare, a condus la apariția mai multor tehnici microscopice cantitative interferometrice folosind proprietățile de fază ale luminii coerente pe imaginea unui eșantion. Una dintre ele este holografia digitala. Așa cum a fost specificat și în subcapitolul anterior, în anul 1948, Dennis Gabor a inventat o modalitate de a codifica faza luminii, atât ca informație, cât și ca o înregistrare ce conține toate informațiile într-o singură înregistrare, adică holograma [23].

Hologramele sunt frecvent utilizate ca piese de artă și sunt afișate ca imagini 3D iluminate. Descoperirile lui Denis Gabor au stat la baza dezvoltării holografie digitale în anii 1990 [24 – 25], în care, informațiile referitoare la un obiect, se colectează pe un senzor digital iar mai apoi sunt introduse într-un computer.

Cu ajutorul microscopiei holografice este posibilă observarea formei celulei, înregistrarea diferenței de fază introdusă, din care se poate calcula apoi volumul și masa uscată fără nici un fel de alte substanțe chimice utilizate și cu o sursă de lumină de intensitate foarte scăzută [26-28], caz în care intensitatea este mult sub ceea ce este considerata fi fototoxic pentru culturile celulare sau alte preparate biologice. În fig. 1.9, o cultură de celule, fibroblaste de șoarece L929, este prezentată după ce a fost înregistrată folosind atât microscopia cu contrast de fază cât și DHM. Se poate observa faptul că imaginile DHM arată similar cu imaginile de contrast de fază, dar, în plus, oferă informații cantitative în a treia dimensiune (de-a lungul axei), ceea ce microscopia clasică nu oferă, în niciuna dintre variantele sale. Din această informație cantitativă, se pot calcula apoi alți parametri folositori care oferă informații utile la nivel de celulă singulară [29].

Fig. 1.8 – O cultură celulară capturată cu ajutorul microscopiei holografice digitale (A) și cu microscopia cu contrast de fază (B). Celulele sunt fibroblaste de șoarece

BN7005-H1D2 și au aproximativ 20 µm în diametru [url-1.7]

Un alt avantaj al DHM este faptul că permite înregistrarea obiectelor aflate în mișcare, viteza de achiziție a hologramelor fiind cea dată de viteza senzorului CCD. Din acest motiv, ea este foarte potrivită pentru studiul proceselor rapide. Acest avantaj se datorează faptul că, în montajul experimental, nu se folosește procedura de scanare, ca în cazul AFM, SEM, microscopie confocală. În DHM, toată imaginea se înregistrează dintr-o dată.

Celulele se deplasează în mod continu, atât in vivo, cât și in vitro. Atunci când celulele sunt în cultură, mișcarea este adesea aleatoare, în timp ce mișcarea celulară normală dntr-un organism este mai organizată. Studiile despre cancer metastatic implică, de cele mai multe ori, studii de migrare sau de motilitate. Cu toate acestea, studiile de migrare celulara sunt dificile atunci când se utilizează metode standard de filtrare, de exemplu camera Boyden [30], Zigmond [31] sau Dunn [32]. Studiile ce presupun intervale de timp între analize sunt foarte utile însă necesită setup-uri costisitoare cu lumină albă sau microscopie de fluorescență. Alte două teste utilizate în mod obișnuit pentru studiul motilității sunt: testul ce constă în scrijelirea rănii și testul de migrare trans-endoteliala [33 – 34]. Este important de precizat faptul că numai un număr limitat de linii celulare poate fi studiat prin aceste metode.

DHM poate furniza informații în timp real despre mișcarea celulei folosind un spectru mult mai larg de celule și linii celulare. Primele studii în acest sens au ilustrat migrația fibroblastică [35]. Un alt studiu a utilizat abilitatea 3D a tehnicii DHM pentru dezvoltarea unei metode de migrare a celulelor în prezența cancerului, cum ar fi condițiile in vivo [36]. Astfel, mediul 3D in vivo a fost creat utilizând o matrice de geluri. Cea de-a treia dimensiune a fost utilizată în continuare de către Garcia-Sucerquia și colaboratorii săi în studiile lor de miscare prin lichide [37]. Au urmat algele și protozoarele cărora le-au fost determinate mișcarea prin lichid.

Celulele în suspensie sunt dificil de urmărit folosind microscopia traditionala. Tehnica DHM a fost folosită pentru a analiza populația de celule endoteliale umane în traiectoria lor 3D printr-o soluție [38]. Celulele au fost urmărite pe o distanță de 189 µm de-a lungul axei Z. Sun si colegii săi au urmărit linia de celule leucemice umane HL-60 dintr-o suspensie. Langehanenberg et all. au prezentat un studiu în care celulele fibrosarcom au crescut într-un model de țesut pe bază de colagen [39]. Cu ajutorul DHM, s-a urmărit cu succes mișcarea celulele prin modele de tesut. Recent, s-a utilizat DHM-ul pentru a urmări mișcarea celulară și pentru a arăta corelația mișcării celulei cu morfologia acesteia [40]. Cel mai recent studiu din acest domeniu indică faptul că atât celulele mici, cât și cele mari dintr-o populație, de multe ori, se deplasează într-un mod diferit, în comparație cu celulele mijlocii, iar traiectoria mișcării celulei este dependentă de linia celulară [41].

Analizând studiile amintite mai sus, se poate afirma faptul că DHM este potrivită pentru studiile ce presupun intervale de timp în care se studiază mișcarea și evoluția unei linii celulare, analiza putând fi realizată până la nivel de unică celulă.

Proceduri experimentale

Partea experimentală a lucrării implică parcurgerea următoarelor etape:

realizarea montajului experimental necesar achiziționării hologramelor digitale;

proiectarea unei incinte 3D în care să poată fi fixat specimenul celular;

proiectarea circuitului de microfluidică util pentru electroporarea celulelor B16F10;

înregistrarea digitală și reconstrucția numerică a hologramelor;

segmentarea manuală a imaginilor celulelor de control B16F1 și, respectiv, electroporate B16F10;

obținerea unor coeficienți de caracterizare a celulelor.

II.1. Componentele montajului experimental

Montajul experimental (fig. 1.9), utilizat pentru achiziția hologramelor, este compus din următoarele elemente principale:

Sursa este un laser cu He-Ne, cu lungimea de undă λ= 632.8nm, dublu stabilizat în amplitudine și frecvență pentru obținerea unor imagini la parametrii constanți, timp îndelungat;

De la laser prima dată avem un beam splitter care împarte fascicolul în alte două fascicole: fascicolul de referință și fascicolul obiect. Cu alte cuvinte, beam splitter-ul are rolul de a transmite o parte a radiației laser, iar cealaltă parte o reflectă;

Două oglinzi așezate la 45ᵒ față de fascicolul incident. Fiecare dintre acestea reflectă câte unul dintre fascicolele obținute mai sus;

Un fascicol este denumit ”de obiect” deoarece trece prin proba care se analizează;

Un obiectiv este plasat după probă pentru a-i mări detaliile micrometrice ale acesteia. Distanța dintre probă și obiectiv se poate modifica realizând astfel focalizarea pentru obținerea unor imagini cu detalii clare;

Cel de-al doilea fascicol este denumit ”de referință” deoarece ajunge direct la mediul de înregistrare. Acesta trece doar printr-un obiectiv, identic cu cel din fascicolul de obiect, cu scopul de a asigura aceeași curbură a frontului de undă pe senzorul camerei video CCD unde se suprapun cele două fascicole;

Compensatorul Soleil-Babinet, plasat în fascicolul de referință este format din două prisme care alunecă una față de cealaltă, permitând astfel introducerea unei diferențe de fază controlată în drumul optic;

Un ultim beam splitter este plasat astfel încât să recombine cele două fascicole;

Ca și mediu de înregistrare, se folosește o cameră video CCD care înregistrează holograma, adică figura de interferență obținută prin suprapunerea celor două fascicole: de obiect și de referință.

Fig. 2.1 – Schema bloc a instalației experimentale

Rezoluția minimă în planul transversal este puțin mai mică de 1μm în timp ce rezoluția axială este de ordinul nanometrilor prin softul de reconstrucție a imaginii obiectului din holograma înregistrată experimental.

Exista două locuri în care se poate vedea imaginea. De aceea, într-unul dintre acestea se montează camera CCD.

Observații: 1) Obiectivele sunt identice pentru a putea exista interferență.

2) În afară de obiectiv, camera oferă o mărire a imaginii, prin poziționarea ei la o

distanță mai mare față de al doilea beam splitter.

În configurația off-axis (cea folosită în cadrul prezentei lucrări), între cele două fascicole care interferă exista un mic unghi.

Fig. 2.2 – Reprezentarea instalației propriu-zise

II.2. Proiectarea unei incinte 3D

Necesitatea unei astfel de incinte a apărut ca urmare a faptului că probele ce se doresc a fi analizate sunt lichide. Simpla plasare a celulelor pe un coverslip (fig. 2.3.) conduce la fenomenul de „uscare a celulei” și, implicit, la imposibilitatea de achiziționare a imaginilor.

Fig. 2.3 – Modele de coverslip-uri utilizate pentru analiza celulară [url-1.8]

În vederea soluționării problemei mai sus menționate, am recurs la realizarea unui „rezervor” care să fixeze coverslip-ul. Pentru realizarea propriu-zisă a acestuia, a fost necesară proiectarea în AutoCAD 3D a unei incinte (fig. 2.4).

Fig. 2.4 – Proiectarea în AutoCAD 3D a incintei

Ulterior, realizarea fizică a incintei a fost posibila cu ajutorul unei imprimante 3D.

Observație: A fost necesară proiectarea incintei într-un program specializat de grafică inginerească 3D deoarece imprimanta utilizează doar fișierele produse cu ajutorul unor pachete software de grafică 3D sau CAD. Obiectele conținute în aceste fișiere sunt discretizate (feliate) în suprafețe bidimensionale, suprafețe care atunci când sunt suprapuse, formează obiectul inițial. Fiecare suprafață corespunde unei depuneri de pulbere de 0,1 mm.

Cu alte cuvinte, imprimarea 3D are la bază un principiu asemănător unui Computer Tomograf: discretizarea obiectului în felii 2D și suprapunerea acestora.

II.3. Electroporarea celulelor B16F10

În cadrul aceastei lucrări de cercetare, s-au electroporat celule epiteliale de șoarece, cunoscute sub numele de celule B16F10.

Celulele de melanom murin B16F10 au fost cultivate într-un mediu Eagle, modificat de Dulbecco cu concentrație ridicată de glucoză (Mediul Eagle modificat de Dulbecco = varianta lichidă a formei Dulbecco originale, cu o singură modificare adusă: piridoxal, care este o aldehidă, a fost înlocuit cu piridoxină. Această modificare a demonstrat că îmbunătățește stabilitatea mediului). Mediul astfel rezultat, format din 1 mM L-glutamină, peste care s-a adaugat 10% ser fetal bovin, a fost introdus în incubator la 37 °C și 5% concentrație de C02 (Heracell 150i, Thermo Scientific, USA). Toate produsele de cultură au fost achiziționate de la Sigma Aldrich Chemie GmbH, Germania. Cu 24 de ore înainte de realizarea experimentelor, celulele au fost recoltate prin tripsinizare (0,5% porcină tripsinica, în vacutainere cu EDTA, Gibco, UE) și însămânțate la 5-10 x 104 celule / ml în camera optică cu bază din sticlă (2 micro-godeuri, Ibidi, Germania). În momentul experimentelor holografice, celulele acopereau numai 20-30% din cameră (fig. 2.5.c). Această densitate celulară scăzută evită suprapunerea celulelor și asigură un câmp electric omogen în zona celulei ce se dorește a fi observată. Astfel, este permisă prelucrarea digitală a imaginii unei singure celule.

Fig. 2.5 – Lamele din oțel inoxidabil în formă de L; (B) profilul pulsului de electroporare: a fost aplicat un tren de patru impulsuri cu o frecvență de 1 kHz; (C) celule atașate la cameră, acoperind

doar 20-30% din suprafața acesteia, permițând analiza separată a unei singure celule;

electropermeabilizarea membranelor verificată cu ajutorul ioduri de propidiu;

acumularea probelor fluorescente pentru permeabilizarea membranei celulare

În timpul experimentelor, au fost utilizate două soluții de cufundare a celulelor:

soluția M: 300mM soluție manitol (Aldrich Chemistry, Franta) cu o conductivitate de până la 0,001 S/m și 305 ± 10 mOsmoli, preparată cu apă ultrapură (18,2 MΩ × cm la 25 °C, Sistem inteligent de apă ultrapură Smart2Pure, TKA, Germania). pH-ul soluției a fost ajustat la 7,2 prin adăugarea a 20 µl de NaOH 1 M peste 500 ml de soluție M (concentrație finală de sodiu 40 µM).

soluția D: mediu Eagle modificat de Dulbecco fără fenol roșu, cu 1 g/l D-glucoză și piruvat (Gibco Invitrogen, USA). Prin măsurare, s-a constatat că osmolaritatea (Osmomat 030, Gonotec, Germania) acestei soluții este de 298 ± 2 mOsmoli.

Indicii de refracție ai acestor soluții au fost măsurați cu un refractometru Abbe (Novex, Holland): nM = 1,3412 ± 0,0003 și nD = 1,3356 ± 0,0002.

Pentru testele care pun în evidență realizarea procesului de electroporare s-a utilizat soluție de iodură de propidiu (PI) (Fluka Biochemica, USA) (concentrație finală de 0,15 µM). Soluția stoc PI (75 mM) a fost păstrată la întuneric, la o temperatură de 4 °C și preparată ulterior în apă ultrapură.

Electroporarea celulelor atașate a fost efectuată în soluție M, în camera celulară Ibidi, utilizând un generator de impulsuri (ELECTRO cell B10, Betatech, Franța). S-a aplicat o secvență de patru impulsuri bipolare rectangulare (intensitatea câmpului electric de 1 kV/cm pentru ambele impulsuri pozitive și negative, cu caracteristicile de timp descrise în fig. 2.5 (b)). S-au folosit electrozi plați din oțel inoxidabil în formă de L, ce atingeau baza camerei; distanța dintre electrozii a fost de 0,5 cm (fig. 2.5 (a)). Electroporarea celulară a fost verificată prin pătrunderea colorantului fluorescent iodură de propidiu [42] (fig. 2.5 (c) și 2.5 (d)).

Fig. 2.6 – Schema de ansamblu a montajului experimental

II.4. Înregistrarea digitală și reconstrucția numerică a hologramelor

O hologramă reprezintă o figură de interferență înregistrată pe un mediu sensibil sau, altfel spus, suprapunerea dintre un front de undă difractat de către obiect și un front de undă de referință, ambele în lumină coerentă. O hologramă este, de obicei, înregistrată pe o suprafață plană. Cu toate acestea, holograma conține informații despre întregul front de undă tridimensional.

Această informație este codificată sub formă de microinterferențe cu maxime și minime, care nu pot fi văzute cu ochiul liber din cauza frecvențelor spațiale ridicate (distanțe mici). Unda obiect poate fi reconstruită prin iluminarea hologramei cu unda de referință. Această undă reconstruită nu poate fi distinsă de unda obiectului original. Un observator vede o imagine tridimensională care prezintă toate efectele perspectivei și profunzimii focalizării.

În configurația inițială a lui Gabor, fascicolul de referință și fascicolul de obiect sunt situate de-a lungul axei normale față de placa fotografică. Această configuratie conduce la o imagine reconstituită suprapusă peste unda strălucitoare de reconstrucție și o a doua imagine, așa-numita "imagine geamănă". Îmbunătățirile semnificative ale acestei holograme “in-line” au fost făcute de Leith și Upatnieks [43] [15] care au introdus o undă de referință în afara axei. Prin configurația propusă, cele două imagini și unda de reconstrucție sunt separate spațial. O aplicație majoră a holografiei este interferometria holografică (HI), dezvoltată la sfârșitul anilor 1960 de către Stetson, Powell [44 – 45] și alții. Cu HI a fost posibilă maparea suprafețelor cu o precizie micrometrică.

Dezvoltarea tehnologiei informatice a permis transferul procesului de înregistrare sau a procesului de reconstrucție în computer. Prima abordare a condus la holografia generată de calculator (CGH), care ne permite să generăm holograme artificiale prin metode numerice. Aceste holograme generate de calculator sunt apoi reconstruite optic. Reconstrucția holografică numerică a fost inițiată de Yaroslavskii et al [46-48]. Ei au extras, în mod optic, părți extinse ale hologramelor “in-line” și Fourier înregistrate pe o placă holografică. Mai apoi, hologramele digitizate, "convenționale" au fost reconstruite numeric. Onural și Scott [49 – 51] au îmbunătățit algoritmul de reconstrucție și au aplicat această metodă la măsurarea particulelor. Haddad et al. [52] au descris un microscop holografic bazat pe reconstrucția numerică a hologramelor Fourier.

Un mare pas a fost dezvoltarea înregistrării directe a hologramelor Fresnel cu dispozitive cuplate (CCD) de către Schnars și Juptner [53] [24]. Această metodă permite înregistrarea digitală completă și prelucrarea hologramelor, fără înregistrarea fotografică ca pas intermediar. Schnars și Juptner au aplicat metoda de interferență și au demonstrat că reconstrucția holografică digitală oferă mult mai multe posibilități decât procesarea convențională (optică).

Fazele fascicolelor înregistrate și diferențele de fază dintre ele pot fi calculate direct de la hologramele digitale, fără a genera interferograme deplasate în fază [54].

Pe la mijlocul anilor 1990, holografia digitală a fost modificată, îmbunătățită și aplicată în multe tehnici de măsurare, dintre care, cele mai importante sunt următoarele:

îmbunătățirea tehnicilor experimentale și a algoritmului de reconstructie;

aplicații în analiza deformațiilor și măsurarea formei;

dezvoltarea holografiei digitale cu schimbarea fazelor;

aplicații în imagistică, urmărirea particulelor și microscopie;

măsurarea distribuțiilor indicelui de refracție în medii transparente;

aplicații în criptarea informațiilor;

dezvoltarea holografiei digitale comparative.

Recent, s-a demonstrat cum se pot reconstrui optic hologramele digitale folosind un dispozitiv cu cristale lichide (LCD) [55] sau un dispozitiv digital cu micro-oglinzi (DMD) [56].

Fig. 2.7 – Înregistrarea hologramelor

Aranjamentul general pentru înregistrarea hologramelor, în configurație off-axis, este prezentat în fig. 2.6 [57 – 58]. Fascicolul laser, cu o lungime de coerență suficientă, este împărțit în două părți de către un beam-splitter (BS). O undă ce luminează obiectul este împrăștiată și reflectată, de exemplu pe o placă fotografică. A doua undă, numita undă de referință, iluminează direct mediul de înregistrare. Mai apoi, fascicole se suprapun și interferează.

Unda originală a obiectului este reconstruită prin iluminarea hologramei cu unda de referință, fig. 2.7. Un observator vede o imagine virtuală ce nu poate fi diferențiată de imaginea originala a obiectului. Imaginea reconstruită prezintă toate efectele perspectivei și profunzimea focalizării.

Fig. 2.8 – Reconstrucția hologramelor

Procesul holografic este descris matematic după cum urmează:

O (x, y) = o (x, y) exp (iφo (x, y)) (2.1)

este amplitudinea complexă a undei obiectului de amplitudine o și faza φo iar

R (x, y) = r (x, y) exp (iφR (x, y)) (2.2)

este amplitudinea complexă a undei de referință de amplitudine r si faza φR.

Ambele unde interferă la suprafața mediului de înregistrare. Intensitatea obținută după suprapunere este calculată astfel:

I (x, y) = |O(x, y) + R (x, y)|2

= (O(x, y) + R (x, y)) (O(x, y) + R(x, y))*

= R(x, y) R*(x, y) + O(x, y) O*(x, y)

+ O (x, y) R * (x, y) + R (x, y) O *(x, y) (2.3)

unde * reprezintă complexul conjugat.

Amplitudinea funcției de transmisie h(x, y) a plăcii fotografice dezvoltate (sau orice alt suport de înregistrare) este proporțională cu I(x, y):

h (x, y) = h0 + βτ I (x, y) (2.4)

unde β este o constantă, τ este timpul de expunere iar h0 este amplitudinea de transmisie

a plăcii ne-expuse. h(x, y) se mai numeste și funcție hologramă.

Pentru a descrie matematic reconstrucția hologramei, amplitudinea funcției de transmisie trebuie înmulțită cu amplitudinea complexă a undei de reconstrucție (aceasta descrie procesul de iluminare a hologramei cu unda de referință):

R (x, y) h (x, y) = [h0 + βτ (r2 + o2)] R (x, y)

+ Βτr2O (x, y) + βτ R2(x, y) O*(x, y) (2.5)

Primul termen din partea dreaptă este unda de referința, înmulțită cu un factor. Acesta reprezintă undă nedifuzată care trece prin hologramă (ordinul zero al difracției). Al doilea termen este unda obiectului reconstruit, care formează imaginea virtuală. Factorul βτr2 influențează numai luminozitatea imaginii. Al treilea termen produce o imagine reală, distorsionată a obiectului. Pentru holografia în configurație off-axis, imaginea virtuală, imaginea reală și unda nedifuzată sunt separate spațial.

Instalația experimentală folosita pentru holografia digitală se bazează pe schema interferometrului Mach-Zehnder în configurație "off-axis", care funcționează în transmisie, fiind adecvat pentru probe transparente [59]. În configurația experimentală utilizată, unghiul dintre razele de referință și obiect a fost setat pentru a îmbunătăți rezoluția laterală, prin obținerea interfranjei la o valoare optimă de 8-12 pixeli.

Am folosit un laser He-Ne dublu stabilizat în amplitudine, cu o lungime de undă egală cu 632,8 nm (Spectra Physics) și o cameră CCD pentru achiziția imaginilor (Pike, F421C echipată cu senzor Kodak de 2048 × 2048, 6.7 pixeli). Un obiectiv de microscop de 40x (N = 0,85) (Nikon) a asigurat o rezoluție laterală de 0,9 μm, permițând un câmp optic de aproximativ 200 μm.

Un set de 14 holograme a fost înregistrat pentru fiecare celulă singulară aleasă – neporată sau electroporată. O probă a unei astfel de holograme, corespunzătoare unei celule electroporate, este prezentată în fig. 2.9 (a).

În ceea ce privește celulele electroporate, primele două holograme ale aceleiași celule au fost înregistrate în soluțiile D și, respectiv, M. Soluțiile utilizate s-au obținut folosind un sistem manual de perfuzie, fără a se îndepărta camera Ibidi cu celule din montajul experimental DHM, evitând astfel orice deplasare a celulei. Apoi, s-a aplicat trenul de impulsuri de electroporare descris în fig. 2.9 (b). A treia hologramă a fost înregistrată la 2 secunde după livrarea pulsului, în soluția M. Hologramele ulterioare ale celulei au fost înregistrate la fiecare minut, în decursul a 10 minute de la livrarea pulsului. Electroporarea și achizitia imaginilor au fost realizate la temperatura camerei.

Hologramele celulelor neporate au fost înregistrate în fiecare minut, în decursul a 13 minute, pentru a păstra același procedeu ca și în cazul celulelor porate. Scopul înregistrarii în timp a fost de observare a variațiilor coeficienților de caracterizare a celulelor în timp. Pe scurt, seturile de celule neporate au jucat rolul unor referințe în comparație cu care s-au analizat celulele supuse unor pulsuri de tensiune continuă.

Fig. 2.9 – Etapele experimentale și numerice ale achiziției și prelucrării imaginilor holografice corespunzătoare celulelor electroporate: (a) hologramă, (b) și (c) imagini cantitative reconstruite,

(d) secțiunea transversală prin imaginea cantitativă reconstituită

Reconstrucția imaginii a fost realizată utilizând software-ul comercial dedicat KOALAR [60]. Procedura constă în urmărirea rutinelor standard ale software-ului [61]:

Transformarea hologramei înregistrate în imagine cu nivele de gri;

Importarea în soft-ul de reconstrucție;

Aplicarea transformatei Fourier (în scopul de a izola informațiile obiectului complex de amplitudine codificat în holograma digitală);

Selectarea ordinului +1 (-1 obiect virtual, +1 obiect real);

Simularea propagării utilizând operatorul asociat difracției Fresnel, în câmp apropiat;

Obținerea matricei de numere complexe și descompunerea lor pentru a determina amplitudinea și faza;

Aplicarea unor filtre de corecție, în spațiul Fourier, pentru corectarea aberațiilor de sfericitate, de înclinare, pentru îndepărtarea anumitor zgomote;

Obținerea imaginii de fază și reprezentarea 3D a acesteia.

În final, rezultă o imagine cantitativă de fază a celulei (o imagine care atribuie o valoare de diferență de fază fiecarui pixel) (fig. 2.9 (b) și 2.9 (c)). Profilul de schimbare a fazei optice (fig. 2.9 (d) a fost trasat de-a lungul unei direcții paralele cu câmpul electric aplicat, prin punctul în care diferență de fază este maximă.

Procedura de achizitie a hologramelor și, mai apoi, de reconstrucție a imaginilor 3D de fază, s-a realizat atât pentru celulele de control, B16F1, cât și pentru cele electroporate, B16F10. Două tipuri de experimente au fost realizate:

Experimente de electroporare, unde au fost folosite doar celule B16F10. Două tipuri de probe:

a.1. culturi de celule B16F10 electroporate;

a.2. culturi de celule B16F10 ne-electroporate, considerate de control.

Experimente de stabilire a unor parametri cu valori diferite, pentru celule aflate în diverse stadii de malignitate. Două tipuri de probe:

b.1. culturi de celule B16F1 ne-electroporate;

b.2. culturi de celule B16F10 ne-electroporate.

Fig. 2.9 prezintă câte un exemplu pentru fiecare specimen celular utilizat în cadrul acestei lucrări.

Fig. 2.10 – Holograme celulare: celulă B16F1 (stânga) și celulă B16F10 (dreapta);

imagini cantitative de fază 3D ale aceleiași celule B16F1 (stânga) și

B16F10 (dreapta) reconstruite folosind software-ul dedicat KOALAR

Fig. 2.10 prezintă un set de imagini holografice consecutive ale unei celule B16F10, achiziționate în soluții D și M înainte de electroporare și la momente diferite de timp după aplicarea pulsului. Schimbările optice de fază sunt codificate în culori (albastru reprezintă cea mai mică diferență de fază, roșu cea mai înaltă). Modificările valorilor optice de deplasare a fazelor, care reflectă variațiile în forma celulară și indicele de refractie, sunt observate după livrarea pulsului.

Fig. 2.11 – Imagini holografice consecutive ale unei celule B16F10 atașate în două soluții (D și M) la diferite momente de timp. În partea de sus: (a) holograma înregistrată în soluția D înainte de eliberarea pulsului electric; (b) holograma achiziționată în soluția M înainte de livrarea pulsului electric; (c) holograma achiziționată în soluția M la 2 secunde după livrarea pulsului; (d) în soluția M la 10 minute după livrarea pulsului. Partea inferioară: profilele de fază de-a lungul secțiunilor transversale, prin punctul de deplasare maximă a fazei corespunzătoare fiecărei holograme

Schimbarea de fază depinde atât de înălțimea cât și de indicele de refracție al celulei în fiecare pixel (x, y) al imaginii. Pentru a determina individual aceste valori, a fost propusă o așa-numită metodă de decuplare [28], bazată pe înregistrarea a două holograme din aceeași regiune în două lichide, cu indici de refracție ușor diferiți. Am folosit în cadrul experimentul soluțiile D și M, obținând două imagini de schimbare a fazei caracterizate în fiecare punct de coordonatele (x, y) prin valori ale diferenței de fază ΔD(x, y) și ΔM(x, y), respectiv:

ΔD(x, y) = [n(x,y) – nD]*h(x,y) (2.6)

ΔM(x, y) = [n(x,y) – nM]*h(x,y) (2.7)

unde λ = 632,8 nm este lungimea de undă a laserului, h este înălțimea iar n este indicele de refracție al celulei în punctul de coordonate (x, y).

Ecuațiile (2.6) și (2.7) au fost folosite pentru a obține valorile n(x, y) și h(x, y) în fiecare punct investigat (x, y), cunoscând valorile diferențelor de fază introduse de celulă în fiecare punct:

h(x,y) = (2.8)

n(x,y) = (2.9)

Aceste ecuații au fost aplicate pentru prima pereche de holograme achiziționate în soluții D și M înainte de livrarea pulsului electric (în acest caz, parametrii n și h sunt denumiți nBP și hBP). Apoi, ele au fost rezolvate folosind următoarele perechi de holograme: aceeași hologramă obținută în soluția inițială D, asociată cu cele obținute în soluția M la 2 secunde, 1, 2, 3 … 7 min după livrarea secvenței de impulsuri (aici, N și h sunt denumiți nAP și hAP).

Pentru extragerea datelor celulare, au fost elaborate coduri MATLAB (adaptate pentru această serie de procesare a hologramelor). În etapa de decuplare, aceste coduri au vizat o regiune cu dimensiunea 3 x 3 pixeli în regiunea caracterizată prin schimbarea fazei maxime. Valorile medii n(x, y) și h(x, y), corespunzătoare acestei regiuni, au fost calculate folosind ecuatiile (2.8) și (2.9).

Parametrii n și h au fost calculați din perechi de holograme achiziționate înainte și după livrarea pulsului, reducând astfel riscul unor erori suplimentare, dar cu beneficii majore asupra monitorizării evoluției aceleiași celule mai mult timp după electroporare.

Pentru decuplarea calculelor, s-au utilizat numai hologramele înregistrate până la minutul 7. Pentru perioade mai lungi de timp, procedura de decuplare, bazată pe holograma inițială, nu mai este sigură, în principal datorită unei posibile deplasări a celulei.

Fig. 2.12 – Prima hologramă în mediul de cultură D, n1 = 1,3360

Fig. 2.13 – A doua hologramă în mediul M izo-omolar 300mM,

n2 = 1,3416, conductivitate = 10μS/cm

Observatii:

celula investigată este imersată succesiv în două lichide diferite, cu valori adecvate pentru indici de refracție n1 și n2, în ipoteza că indicele de refracție RI și înălțimea H rămân neschimbate;

sunt înregistrate două holograme și reconstituite imaginile corespunzătoare fiecăreia;

două hărți de fază sunt folosite ca punct de pornire pentru a rezolva în MATLAB un sistem cu două ecuații și două necunoscutele n și h (n – indicele de refracție al celulei și h – înălțimea celulei în zona corespunzătoare maximului de fază).

În concluzie, orice tehnică holografică constă din două etape:

Înregistrarea hologramelor, etapă în care sunt folosite obiecte reale;

Reconstrucția imaginii obiectului se realizează printr-o procedură digitală, folosindu-se un soft specializat care se bazează pe teoria scalară a difracției, cât și pe teoria Fresnel. Softul permite obținerea de imagini tridimensionale în care ne sunt oferite informații despre dimensiunile obiectului, cea de-a treia dimensiune fiind diferența de fază Δρ dintre o rază care trece prin celulă și una care trece pe lângă ea. Valoarea diferenței de fază este proporțională atât cu înălțimea celulei cât și cu indicele ei de refracție.

Prelucrarea imaginilor reconstruite din hologramele înregistrate

Imaginile medicale conțin o multitudine de obiecte și modele, care pot transmite informații despre mecanismele care stau la baza biologiei.

În cadrul laboratorului de Microscopie Holografică Digitală, cu ajutorul unui microscop care funcționează pe principiile tehnicii DHM, construit din componente separate, pe masă holografică, conform schemei prezentate în capitolul anterior, bazat pe interferometrul Mach-Zehnder, s-a reușit achiziționarea de imagini a unor celule neporate si, respectiv electroporate de melanom de soarece. Această metodă de achiziție a imaginilor celulelor B16F10, aflată la nivel de cercetare, folosește celulele atașate de substrat, din culturi celulare și oferă informații suplimentare de-a lungul axei de propagare a fascicolului luminos, comparativ cu microscopia optică clasică, unde sunt disponibile informații doar în plan perpendicular pe axa de propagare.

Setul de date, de imagini holografice utilizat în cadrul acestei lucrări, este format din 5 celule electroporate și 7 neporate, de control. Pentru fiecare celulă în parte au fost achiziționate 14 holograme, dintre care: prima (di) este utilizată pentru a se calcula prin comparație cu cele vecine (mi și md1, 2, 3…7) indicii de refracție și înalțimea, într-o zonă de 9 pixeli pătrați (3 x 3 pixeli).

Observatie: Hologramele din mijloc sunt cele etichetate cu mi și sunt înregistrate înainte de electroporare, în timp ce hologramele md0 – md10 sunt înregistrate la diferite momente după electroporare.

Din aceste holograme au fost reconstruite imaginile de fază ale obiectului.

Fig. 3.1 – Holograme consecutive achiziționate pentru o singură celulă B16F10 (continuare)

III.2. Segmentarea manuală a imaginilor înregistrate

Procesarea și analiza imaginilor oferă un mijloc de a extrage, de a cuantifica obiecte și modele în valori ale imaginii și de a obține răspunsuri la întrebările cu semnificație biologică. Aceste etape oferă două avantaje importante, comparativ cu metodele traditionale de analiză:

Viziunea umană poate fi ușor influențată de ideile preconcepute vis-à-vis de unele obiecte sau concepte. Analiza automată a imaginii oferă o abordare imparțială pentru extragerea informațiilor de interes dintr-o serie de imagini.

Odată ce o rutină de analiză a imaginii este concepută, ea poate fi aplicată unui număr mare de imagini microscopice, facilitând colectarea unor cantități mari de date pentru analiza statistică ulterioară.

Cu toate acestea, în unele cazuri mai dificile, cand avem de-a face cu imagini ce nu prezintă

contururi clare, procesele amintite mai sus și anume procesarea și analiza, pot conduce la rezultate eronate. Pentru rezolvarea acestor probleme, se apelează la rutine manuale sau semi-manuale în care utilizatorul decide vizual sau în urma unor analize, delimitarea celulei de restul imaginii. În prezenta lucrare, având de-a face cu astfel de imagini, se recurge la segmentarea manuală a acestora.

Segmentarea reprezintă procesul prin care o imagine este împărțită în regiunile sau obiectele constituente. Aceste obiecte pot fi prelucrate sau analizate, în continuare, pentru extragerea informațiilor cantitative.

Analiza imaginilor implică conversia caracteristicilor și a obiectelor, din date ale imaginii în informații cantitative despre aceste caracteristici și atribute măsurate. Imaginile microscopice din biologie sunt adesea complexe, zgomotoase, încărcate de artefacte și, prin urmare, necesită pași intermediari de procesare a imaginii pentru extragerea informațiilor cantitative semnificative. Uneori, combinăm segmentarea cu diferite tehnici de procesare morfologică și filtrare pentru a obține o segmentare precisă și robustă a unei imagini. O sinteză a unei strategii generale pentru analiza imaginii este prezentată mai jos:

Punctul de pornire al analizei imaginilor implică, pentru început, achizitia unei imagini digitale utilizând o cameră CCD. Imaginile microscopice obținute de camerele digitale CCD sunt supuse unor imperfecțiuni ale setării achiziției imaginilor, cum ar fi zgomotul datorat iluminării neuniforme, pixelilor defecți, etc. Adesea, trebuie să procesăm mai întâi imaginea pentru a corecta aceste defecte și, de asemenea, pentru a mări contrastul în scopul evidențierii caracteristicile de interes din imagine.

Având corectate artefactele și contrastul îmbunătățit, se pot aplica diverse tehnici de calcul pentru a extrage caracteristicile și modelele din imagini.

După ce caracteristicile biologice importante din imagine au fost segmentate, se pot obține informații cantitative din acestea. MATLAB oferă un set de instrumente ce poate fi utilizat pentru a măsura proprietățile regiunilor.

În cadrul prezentei lucrări au fost parcurți toți pașii enumerați mai sus. Achiziția imaginilor, descrisă în capitolul anterior, a fost urmată de aplicarea unor operații de filtrare, în scopul eliminării artefactelor.

(a1) (a2) (b1) (b2)

Fig. 3.3 – Filtrarea celulelor cu ajutorul software-ului KOALA:

(a1 și a2) celule B16F10 neporate; (b1 și b2) celule B16F10 porate nefiltrate;

(a1 și b1) filtrate în spațiul Fourier (b1 și b2)

După parcurgerea acestor etape, am recurs la implementarea în MATLAB a unui algoritm de segmentare manuală a celulelor porate și neporate. Inițial, am pornit cu un algoritm de segmentare automată însă, din cauza aplicării trenurilor de impulsuri, algoritmul înlătura o bună parte din urma lăsată de celula. De aceea, în urma unor discuții cu o întregă echipă de profesori de la Universitatea de Medicină și Farmacie din București, am considerat că este mai bine să ne reorientăm către un program interactiv de segmentare manuală, întrucât acea urmă lăsată de B16F10 face practic parte din celulă. În consecință, pentru a calcula zona proiectată de celule, am elaborat coduri MATLAB pentru detecția marginilor și a contururilor celulare (anexa 1).

Secțiunea de cod din anexa 1 conține un cod scris de mine, care permite segmentarea manuală a structurilor anatomice, necesare ulterior în cadrul programelor de analiză statistică. Prin modificări minore, acesta poate trasa atât contururi simple, necesare pentru a delimita nucleul celular, cât și contururi multiple pentru a putea extrage, spre exemplu, structuri asemeni citoplasmei, organitelor celulare. Cu ajutorul mouse-ului, utilizatorul poate trasa cu precizie contururile, iar odată obținute, programul retunează automat, pentru regiunea delimitată de conturul trasat, o serie de coeficienți precum aria, numărul de pixeli, media, abaterea standard, perimetrul și alții, coeficienți prezentați la finalul rulării într-o fereastră separată. Aceștia sunt stocați în variabile și pot fi bineînțeles utilizați ulterior în cadrul analizei statistice.

Importanța existenței unui program de segmentare manuală se poate identifica și în alt tip de situații. Ne putem imagina cazul în care am beneficia de ajutorul unor cadre medicale (exact cum s-a întamplat și în cazul meu), iar acestea ar putea utiliza acest program de segmentare manuală pentru a trasa o serie de contururi de referință, care ulterior ar constitui o bază de date de importanță majoră. Astfel de baze de date sunt utilizate în mai toate aplicațiile de natură medicală, iar printre posibilele utilizări ale acesteia, amintim cel puțin exemplul în care baza de date ar putea fi integrată într-o aplicație de verificare a performanțelor unui algoritm de segmentare automată.

În urma rulării programului MALTLAB, prezentat în anexa 1, se obțin ca și rezultate finale următoarele (fig. 3.5 pentru o celulă porată si fig. 3.7 pentru o celulă neporată):

Fig. 3.4 – Eliberare cursor pentru trasare contur

Fig. 3.5 – Segmentarea manuală a unei celule B16F10, la momentul t = 4s de la aplicarea pulsului electric

După cum se poate observa în fig. 3.6, toate celulele B16F10 prezintă atât nucleu, evidențiat cu roșu, cât și organite celulare, colorate cu galben. Ceea ce apare colorat cu bleu, extremitățile celulare, reprezintă urma lăsată de celulă. Așa cum am menționat și mai sus, la determinarea coeficienților celulari a fost luată în calcul și această urmă.

Fig. 3.7 – Segmentarea manuală a unei celule neporate, la momentul t = 2 min.

Folosind profilul cantitativ de fază al celulei, fără procedura de decuplare, pot fi calculați diferiți parametri. Aceștia oferă informații cu privire la structura și forma celulelor [61], modificările volumului celular și dinamica masei uscate a celulei [62].

Aria, valoarea medie, deviația standard, perimetrul și alți parametri au fost returnati la sfârșitul segmentării manuale, într-o fereastră separată. Acest lucru a fost posibil prin utilizarea instrucțiunii regionprops.

Fig. 3.8 – Parametrii returnați în urma segmentării

III.2. Obținerea coeficienților de caracterizare a celulelor

Pe baza imaginilor reconstituite din hologramele înregistrate experimental, am determinat suprafața ariei proiectate (A) și profilul mediu de schimbare a fazei optice (OPS). Pentru a calcula aria proiectată a celulelor, am elaborat coduri MATLAB pentru detecția marginilor celulare. Suprafața celulei a fost calculată ca suma tuturor pixelilor din interiorul acestui contur. Dimensiunea unui pixel a fost stabilită anterior printr-o procedură de calibrare independentă, utilizând un obiectiv micrometric. Profilul mediu de schimbare a fazei optice a celulei s-a obținut prin însumarea valorilor de fază din interiorul conturului celulei și, mai apoi, împărțind valorea obținută la numărul de pixeli din cadrul acestui contur. Masa uscată (DM) a fost calculată în conformitate cu o metodă descrisă de Popescu et al. [62] ca un element de suprafață integrat al deplasării de fază pe întreaga zonă celulară.

III.2.1. Comparație celule maligne porate și neporate

Indicele de refracție

Determinarea indicilor de refracție (RI) și a dimensiunii celulelor aderente vii aflate în cultură, a fost posibilă folosind microscopia holografică digitală în configurație off-axis, fără a utiliza agenți de contrast exogeni. Indicele de refracție celulară și densitatea maselor uscate au fost comparate pentru două sublinii ale celulelor melanomului murin B16 cu diferite potențiale metastatice. Mai mult, folosind analiza bimodală, am identificat diferite caracteristici ale distribuției de schimbare de fază în imaginile cantitative reconstituite, corespunzătoare celor două sublinii.

În studiul actual, am folosit subliniile celulare B16F1 și B16F10, din seria selectată de Isaac Fidler în 1973 [63]. Existența subliniilor melanomului murin B16, diferențiate pe baza comportamentului metastatic, oferă un bun model in vitro pentru studierea caracteristicilor biofizice ale celulelor maligne și a modificărilor din cursul transformării celulare. Selecția variantelor B16 s-a bazat pe potențialul lor crescător de a forma colonii pulmonare după injecția intravenoasă la șoareci. În acest scop, Fidler a efectuat administrarea intravenoasă a celulelor B16 urmată de subcultura tumorilor pulmonare induse în cicluri repetitive [63]. În acest fel, comportamentul metastatic a fost diferențiat: B16F1 are cel mai mic potențial de a forma tumori pulmonare în timp ce B16F10 este la polul opus.

În ceea ce privește proprietățile optice, am constatat că, în zona de deplasare maximă a fazei, F10 are un RI mai mare decât F1. Zona maximă de schimbare de fază a fost asociată, în multe lucrări, cu zona nucleului, care este, de asemenea, regiunea de înălțime maximă a celulei. Este cunoscut faptul că indicele de refracție este influențat de concentrația proteinelor, crescând cu 0,002 unități pentru fiecare procent din conținutul de proteine ​​[64]. S-a constatat că RI este heterogen în interiorul celulei și se presupune că regiunile cu RI înalte corespund componentelor celulare, dar RI-urile fiecărui organ sunt încă sub studiu [65].

Există o literatură abundentă care investighează diferențele de RI între celulele canceroase și cele normale. Choi și colab. (2010) au apreciat că RI este mai mare în celulele maligne, propunând RI ca biomarker pentru diagnosticarea cancerului [66]. Utilizând microscopia optică de coerență, ei au reconstruit hărțile RI ale celulelor vii aderente pentru mai multe linii celulare normale și canceroase. Valorile medii ale RI s-au dovedit a fi de 1,353 ± 0,008 pentru cazurile normale și 1,371 ± 0,014 pentru celulele canceroase. Prin utilizarea diferitelor tipuri de celule, s-a observat că această concluzie este valabilă pentru orice tip de linie celulară deoarece RI este mai mare în celulele maligne [67 – 68]. Diferența de RI a fost atribuită acumulării mari de proteine ​​în organele celulare (în principal în nucleu) ca urmare a diviziunii rapide a celulelor canceroase și a ratei mai mari de proliferare. Mai mult, Bista și colab. a propus ca RI-ul nuclear să fie o măsură a densității nucleare de masă; au raportat valori ale RI nucleare de peste 1,5496 care variază în timpul ciclului celular datorită variațiile conținutului de ADN [69].

În prezent, cartografia RI cu rezoluție înaltă poate fi efectuată contribuind la evaluarea riscului de cancer [70].

Fig. 3.9 – Indicele de refracție al celulelor B16 calculat pe o suprafață de 3 × 3 pixeli, selectată în

zona de schimbare maximă a fazei

Valorile pentru RI găsite în studiul meu (1,3610 ± 0,0039 pentru B16F1 și 1,3989 ± 0,0112 pentru B16F10) [72] și evidențite pe graficul din fig. 3.9 sunt în acord cu rezultatele studiilor menționate mai sus. Valorile mai mari ale F10 ar putea fi un potențial instrument de a discrimina nu numai între celule normale și maligne, ci și între celule maligne cu potențial metastatic diferit.

Densitatea de masă uscată (DM)

Tabel 1: Tabel centralizator pentru coeficientul DM corespunzător subliniei celulare B16F10

Tabel 2: Tabel centralizator pentru coeficientul DM corespunzător subliniei celulare B16F1

Pe baza valorilor obținute pentru DM (anexa 2), centralizate în tabelele 1 si 2, am reprezentat grafic (fig. 3.9) media densitatii de masă uscată, exprimată în pg/µm2, în functie de tipul celulei B16.

Fig. 3.10 – Densitatea de masă uscată a celulelor B16 calculată folosind valoarea de schimbare de fază a fiecărui pixel înmulțită cu factorul constant (λ = 635 nm – lungimea de undă a laserului,

α = 0,2 ml/g – creșterile refractive ale proteinelor [71]). Valoarea medie ± STDEV

a fost calculată pe cinci celule (mi) pentru fiecare subliniere

Am constatat că densitatea de masă uscată, care caracterizează conținutul de proteine al întregii celule, este mai mare pentru F1 decât pentru celulele F10, lucru ilustrat și în fig. 3.10. Valorile medii (1,4261 ± 0,0844 pg/μm2 pentru F1 și 0,8003 ± 0,1771 pg/μm2 pentru F10) sunt în concordanță cu cele raportate în studiile în care acest parametru a fost urmărit în timpul ciclului celular [61, 73]).

Densitatea de masă uscată este corelată cu conținutul neapos al celulei, destul de similar cu densitatea clasică. Utilizând tehnica de separare a densității în gradient, Baniyash și colab. au arătat că în celulele tumorale B16 există populații de celule cu densități diferite [74]. Populația cu densitate mai mică s-a dovedit a fi mai reușită în colonizarea pulmonară și a fost selectată ca F10, în timp ce populația cu densitate mare a avut o capacitate de colonizare a plămânului mai scăzută și a fost selectată ca F1. Rezultatul meu confirmă observația conform căreia o capacitate metastatică mai mare este asociată cu o densitate mai mică; densitatea de masă uscată ar putea juca astfel rolul biomarkerului timpuriu pentru potențialul metastatic celular.

Coeficientul de bimodalitate

Am căutat un alt biomarker optic pentru potența metastatică utilizând metoda coeficienților de bimodalitate pentru a analiza parametrii QPIs.

Fig. 3.11 Exemple de hărți de schimbare a fazelor cantitative și histogramele asociate, corespunzătoare pentru celulele B16F1 (A) și B16F10 (B). Sunt prezentate valorile skewness (e), kurtosis (k) și coeficientul multimodal (b). Histogramele s-au calculat pe baza QPI-urilor reconstituite (pentru claritatea histogramelor, sunt inserate pe abscisă un număr mai mic de puncte, însă calculele au fost efectuate utilizând rezoluția unitară). (C) Sunt prezentate statistici ale coeficienților multimodali pentru B16F1 și F16 F10 (pentru calcule au fost utilizate cinci celule (momentul mi) din fiecare sublinie).

Din analiza fig.3.11 putem deduce că histogramele celulelor F1 prezintă distribuții bimodale ale deplasărilor de fază din celule, în timp ce histogramele celulelor F10 prezintă tendința de distribuție cu un singur vârf [72]. Deși am lucrat numai pe cinci celule aparținând fiecărei sublinii, parametrii kurtosis și skewness (anexa 3) au fost calculați pentru toți pixelii fiecărei imagini de fază, furnizând o cantitate fiabilă de date, potrivită pentru analiza de ordin înalt. Gradul de bimodalitate este o caracteristică importantă a distribuției de frecvență, deoarece sugerează neregulile existente, cum ar fi polarizarea sau două distribuții subiadiacente combinate într-una. Celulele normale prezintă distribuții multimodale cu grupuri distincte de vârfuri dominante (vârfuri pentru nucleu și citoplasmă), în timp ce tendința de distribuție cu vârf unic poate fi un semn de anomalie.

Aria celulară

Tabel 3: Tabel centralizator pentru aria celulară corespunzătoare subliniei celulare B16F10

Tabel 4: Tabel centralizator pentru aria celulară corespunzătoare subliniei celulare B16F1

Analizând valorile ariilor proiectate, obținute pentru celulele B16F10 (tabelul 3) se poate desprinde următoarea afirmație: la aplicarea primului impuls de curent continu, valoarea ariei scade cu aproximativ 10%. Ulterior acestui puls, aria continua să-și urmeze trendul descendent într-un ritm neregulat. De cealaltă parte, ariile corespunzătoare subliniei celulare B16F1 (tabelul 4) tind să-și conserve în timp valorea.

Comparând cele două tabele, se poate concluziona asupra faptului că malignitatea are influență directă asupra ariei celulare.

Volumul celular

Tabel 5: Tabel centralizator pentru volumul celular corespunzător subliniei celulare B16F10

Tabel 6: Tabel centralizator pentru volumul celular corespunzător subliniei celulare B16F1

Din valorile volumului celular (anexa 4) obținute pentru sublinia celulară B16F10 (tabelul 5)

putem concluziona asupra faptului că procesul de electroporare conduce la o descreștere în timp a volumului într-o manieră asemănătoare cu cea a ariei.

Pentru subsetul B16F1 (tabelul 6), se remarcă acealași ritm de descreștere în timp a volumului. Deși aceste celule nu suferă modificări în timp si sunt considerate drept referință în raport cu subsetul B16F10, se înregistrează o modificare a valorilor în randul volumului, ce-i drept nu la fel de mare ca și în cazul celulelor electroporate.

Conform celor de mai sus, valorile obținute pentru volum nu permit desprinderea unei concluzii universal valabile care să permită mai departe diferențierea celulelor maligne.

Diferența de cale optică

Tabel 7: Tabel centralizator pentru diferența de cale optică corespunzătoare subliniei celulare B16F10

Pe baza imaginilor reconstituite din hologramele înregistrate experimental, am determinat diferența de cale optică (OPD).

Valorile OPD au fost calculate în felul următor:

pas 1: am determinat suma tuturor valorilor de fază din interiorul conturului delimitat cu ajutorul segmentării manuale;

pas 2: am împărțit suma obținută la pasul 1 la numărul de pixeli din interiorul aceluiași contur.

Valorile obținute pentru subliniile celulare B16F10 și B16F1 (tabelele 7 și 8) demonstrează că OPD crește doar pe măsura aplicării pulsurilor de tensiune continuă.

Tabel 8: Tabel centralizator pentru diferența de cale optică corespunzătoare subliniei celulare B16F1

Astfel, OPD poate fi propus ca si biomarker util în diferențierea celulelor maligne. Alături de acest parametrul, indicele de refracție, înalțimea celulei, aria proiectată și coeficientul de bimodalitate reprezinta buni indicatori în aprecierea gradului de diferențiere între subliniile celulare B16F10 și, respectiv, B16F1.

III.2.2. Comparație celule aflate în diferite stadii de malignitate

Înălțimea celulară și variația indexului de refracție

Utilizând procedura de decuplare, atât înălțimea cât și indicele de refracție al fiecărei celule au fost calculate într-o zonă pătrată, de 3 x 3 pixeli, în regiunea de deplasare maximă a fazei, identificată cu ajutorul codurilor MATLAB descrise în anexe. Ambii parametri au fost prezentați folosind variațiile lor relative între 2 secunde, 1, 2 … 7 min după livrarea pulsului (denumiți hAP și nAP) și momentul premergător livrării pulsului (hBP și nBP). Înainte de eliberarea pulsului, înălțimea celulelor variază de la 2,87 μm până la 14,61 μm, în funcție de forma celulei. Indicele mediu de refracție a fost identificat ca fiind nBP = 1,3929 ± 0,0263. La 2 secunde după administrarea pulsului, s-a observat o modificare statistică semnificativă a înălțimii celulei (înălțimea medie a celulelor electroporate a crescut cu 33%,

p = 0,014). În același interval de timp, înălțimea medie a celulelor de control a scăzut cu 6,7% (fig. 3.12 (b)) [75] .

Fig. 3.12. Variația înălțimii celulare observată la 2 s după eliberarea pulsului (hBP – înălțimea

celulei înainte de electroporare, hAP – înălțimea celulei după electroporare). Pentru procedura de decuplare, am folosit holograma achiziționată în soluția D înainte de aplicarea impulsului:

(a) exemplu de variație tipică a înălțimii celulei, calculată pe o singură celulă;

(b) variația relativă a înălțimii celulare calculată în toate experimentele

În același timp (la 2 secunde după aplicarea pulsului), indicele de refracție a arătat o scădere statistică semnificativă (valoarea medie a scăzut cu 1,2% în celulele electroporate (p = 0,026), iar în cazul celulelor de control s-a înregistrat o creștere mică de doar 0,1%) (fig. 3.13 (b)) [75].

Fig. 3.13. Variația indicelui de refracție celulară la 2 secunde după livrarea pulsului (nBP –indicele de refracție al celulei înainte de electroporare, nAP – indicele de refracție al celulei după electroporare)

Datorită neomogenității intrinseci a celulelor în cultură, grosimea absolută și indicii de refracție au fost dispersați. În figurile 3.12 (a) și 3.13 (a) sunt date exemple de rezultate tipice pe o singură celulă. Pentru a evidenția efectul impulsurilor câmpului electric aplicat asupra grosimii celulelor și a indicilor de refracție, variația relativă a acestor parametri a fost compusă (ilustrată în figurile 3.12 (b) și 3.13 (b)). În următoarele 7 minute după picătură inițială (fig. 3.14), indicele de refracție arată o tendință constantă de recuperare, ajungând la valoarea de control după aproximativ 4 minute. În celulele de control, indicele de refracție a rămas aproximativ constant; creșterea ușoară care s-a observat poate fi atribuită condițiilor în care celulele au fost ținute în timpul experimentului [75].

Fig. 3.14. Variația relativă a indicelui de refracție celulară în decurs a 7 minute de la aplicarea impulsului. Inserția prezintă evoluția indicelui de refracție relativ în 2 secunde după porare (nBP – indicele de refracție al celulei înainte de electroporare, nAP – indicele de refracție al celulei după electroporare)

Aria proiectată a celulei, profilul de schimbare a fazei optice și evoluția masei uscate

Prin prelucrarea imaginilor cantitative de fază, am calculat trei parametri care au legătură cu morfologia întregii celule: suprafața ariei proiectate (A), profilul de schimbare a fazei medii (OPS) și masa uscată (DM). Evoluția tuturor parametrilor este reprezentată ca o variație relativă a valorilor acestora la 2 secunde, 1, 2 … 10 min după livrarea pulsului (denumită AAP, OPSAP și DMAP) și în momentul aplicării pulsului (ABP, OPSBP și DMBP) ( fig. 3.15).

O scădere dependentă de timp a ariei proiectate a fost observată ca efect al aplicării impulsului (fig. 3.15 (a)). La sfârșitul celor 10 minute, suprafața proiectată a celulelor porate a scăzut cu 19,5 ± 1,6%, în timp ce suprafața proiectată a controalelor a scăzut cu numai 8,4 ± 6,7%. În același interval de timp, OPS a crescut cu 6 ± 1%, comparativ cu o creștere a controalelor de 0,5 ± 0,3% (fig. 3.15 (c)). În ceea ce privește masa uscată, nu s-au observat modificări evidente atunci când celulele electroporate au fost comparate cu martorii (fig. 3.15(e)). După cum se poate observa în fig. 3.15 (f), modificarea relativă a masei uscate a fost în limitele a mai puțin de ± 4%, aflându-se asfel în limitele de sensibilitate ale experimentelor mele [75].

De asemenea, putem spune că celulele de control au suferit schimbări progresive ale suprafeței proiectate și ale profilul mediu de schimbare optică, fiind expuse la aceleași condiții în timpul experimentului: imersie în soluția de manitol, fără control al temperaturii si al concentrației de CO2. Cu toate acestea, modificările înregistrate în celulele porate au fost mai semnificative decât cele observate în cazul martorilor.

Prin scăderea zonei celulelor porate din cea a controalelor, în fiecare moment de timp, se poate observa răspunsul net al celulelor la aplicarea pulsului, în ceea ce privește suprafața proiectată (fig. 3.15 (b)). Un calcul similar al OPS arată evoluția profilului mediu de schimbare a fazei optice cauzat de livrarea pulsului (fig. 3.15 (d)).

După cum se observa în fig. 3.15 (b) și 3.15 (d), la 3 până la 4 minute după eliberarea pulsului, variația relativă a zonei celulare proeminente și a profilului de schimbare a fazei optice medii a devenit aceeași în celulele portate și de control (apariția platourilor). Se poate concluziona că impactul maxim al aplicării trenului de impulsuri este prezent în primele 3 minute după aplicarea pulsului. În intervalul 4 – 10 minute, suprafața celulelor porate și profilul de schimbare a fazei optice medii se comportă similar cu cel al controalelor [75].

Concluzii

Electroporarea celulară reprezintă una dintre cele mai promițătoare platforme biotehnologice ale momentului, deschizând mari perspective în domeniul tratării cancerului, imunoterapiei și terapiei genetice. Impulsurile electrice controlate sunt livrate celulelor și țesuturilor, mărind permeabilitatea membranei celulare la diferite molecule mici, medicamente, proteine ​​și acizi nucleici, care, în mod normal, nu sunt permeabile. Modificările celulare și moleculare datorate permeabilizării membranei și recuperării consecutive necesită totuși o mai bună înțelegere. În cadrul acestei lucrari de disertatie mi-am propus să monitorizez proprietățile optice și geometrice ale celulelor expuse la trenurile succesive de impulsuri electrice utilizate în electrochemoterapie.

Celulele electroporate au prezentat un comportament bifazic atât din punct de vedere al parametrilor optici, cât și în ceea ce privește forma. Indicele de refracție (RI) s-a dovedit a fi un parametru cu semnificație biologică ridicată, fiind legat de conținutul celular, rata divizării celulare și permeabilitatea membranei. Metoda bazată pe DHM deschide o perspectivă mai largă în înțelegerea modificărilor celulare și moleculare induse prin electroporare.

Microscopia holografică digitală (DHM) este o tehnică interferometrică modernă care oferă, după o singură expunere, fără substanțe chimice aplicate, informații despre caracteristicile optice și geometrice ale probelor biologice transparente, fiind adecvată pentru monitorizarea dinamicii celulelor vii. Am folosit o configurație DHM off-axis (laser He-Ne care funcționează la o lungime de undă egală cu 632,8 nm). Procedura de decuplare (baie de celule fie în manitol, fie în mediul de cultură celulară) a permis calcularea RI și a înălțimii celulare, în timp ce informațiile legate de forma celulei au fost obținute din imagini cantitative de fază, reconstituite 3D. Celulele B16F10 au fost expuse unor trenuri de impulsuri rectangulare bipolare (1 kV/cm, 100 microsecunde, 1 kHz, electroporare celule B16F10, Betatech).

RI și înălțimea celulei au fost calculate într-o zonă bine definită utilizând procedura de decuplare și parametrii globali ai celulelor (aria suprafeței proiecției celulei (A), profilul diferenței de fază (OPS) și masa uscată (DM)). Monitorizarea acestora s-a facut pe o perioada de timp egală cu 10 min.

La 2 secunde după livrarea pulsului, înălțimea celulei a crescut cu 33%, RI a scăzut cu 1,2%, revenind la valoarea de control după aproximativ 4 min. Evoluția bifazică a proiecției celulare, stationaritatea DM, au fost abordate prin dinamica soluțiilor pentru membrana celulară electropermeabilizată.

Această lucrare propune biomarkeri optici noi pentru a caracteriza potențialul metastatic celular: analiza bimodală QPI, combinată cu calculul indicelui de refracție și a densității maselor de materie uscată. Pe langă aceștia, au fost luate în considerare și supuse spre analiză și rezultatele obținute pentru aria proiectată, volumul celular, coeficientul de bimodalitate si diferența de cale optică. Rezultatele obținute subliniază faptul că celulele cu potențial metastatic prezintă o histogramă unimodală, un indice de refracție mai mare și o densitate mai mică de masă uscată. Totodată, pe baza rezultatelor se mai poate evidenția faptul ca aria proietată crește iar coeficientul OPD descrește în timp, în cazul celulelor electroporate, comparativ cu sublinia de control.

Tendințe viitoare

În cadrul acestei lucrari de cercetare au fost testate si prezentate date pentru a ilustra principiul abordării. Evoluțiile viitoare, precum utilizarea celulelor sincronizate și implementarea unor algoritmi de detecție automată sunt în desfășurare. De asemenea, pe viitor trebuie luată în considerare posibilitatea extinderii metodei de la analiza unei singure celule la un număr mai mare de celule atașate și chiar la țesuturi. Măsurarea schimbării de fază prin utilizarea unui dispozitiv portabil miniaturizat, bazat pe tehnica interferometrică și prelucrarea ulterioară a datelor ar putea avea potențial clinic, contribuind la optimizarea medicației pentru cancer.

Bibliografie

[1] A. Doyle and J. B. Griffiths (Eds), John Wiley & Sons Ltd, Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology, Cell Biochemistry and Function, 332, 1999

[2] Shigekawa K, Dower W.J., Electroporation of eukaryotes and prokaryotes: A general approach to the introduction of macromolecules into cells, Biotechniques, 6:742–751, 1988

[3] Tsong T.Y., Electroporation of cell membranes, Biophys J.,60:297–306, 1991

[4] Rols M-P, Golzio M, Delteil C, Teissie J., In vitro delivery of drugs and other molecules to cells, Jaroszeski MJ, Heller R, Gilbert R, editors. Methods in Molecular Medicine. Vol. 37. Totowa, NJ: Humana Press, 83–97, 2000

[5] Rols M.P., Electropermeabilization: A physical method for the delivery of therapeutic molecules into cells,  Biochim Biophys Acta, 1758:423–428, 206

[6] Allegretti, J.P., W.R. Panje, Electroporation therapy for head and neck cancer including carotid artery involvement, Laryngoscope, 111, 52–56, 2001

[7] Okino, M., H. Mohri, Effects of a high-voltage electrical impulse and an anticancer drug on in vivo growing tumors, Jpn. J. Cancer. Res., 78, 1319–1321, 1987

[8] Dzau, V.J., M.J. Mann, A. Ehsan, D.P. Giese, Gene therapy and genomic strategies for cardiovascular surgery: the emerging field of surgiomics, J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 121, 206–216, 2001

[9] Dimitrov, D.S., A.E. Sowers, Membrane electroporation – fast molecular exchange by electroosmosis, B. B. A., 1022, 381–392, 1990

[10] M.A., L.W., S. Bagdonas, J. Moan, The photosensitizing effect of the photoproduct of protoporphyrin IX, J. Photochem. Photobiol. B, 60, 108–113, 2001

[11] Rabussay, D.P., G.S. Nanda, P.M. Goldfarb, Enhancing the effectiveness of drugbased cancer therapy by electroporation (electropermeabilization), Technol. Cancer Res. Treat., 1, 71–82, 2002

[12] Florin Ciobanu, Mihai Radu, Mihaela Moisescu, Marius Surleac, LauraBajenaru, Eugenia Kovacs, Eletroporation of malignant cells for enhanced uptake of therapeutic drugs, Romanian J. Biophys, Vol. 17, No. 3, 211–217, 2007

[13] Yoonsung Bae, Quantitative Phase-Contrast Imaging using Digital Holographic Microscope, Department of Information and Communications, Gwangju Institute of Science and Technology, 261 Cheomdan-gwagiro, Buk-gu, Gwangju 500-712, Republic of Korea, 2009

[14] V. Micó, C. Ferreira, Z. Zalevsky and J. García, Basic principles and applications of digital holographic microscopy, Formatex, 2010

[15] Leith EN, Upatnieks J., Wavefront reconstruction with diffuse illumination and three-dimensional objects, J. Opt. Soc. Am., 54: 1295-1301, 1964

[16] Gabor D, Goss WP., Interference microscope with total wavefront reconstruction, J. Opt. Soc. Am., 56: 849-856, 1966

[17] Kim Myung K. Kim, Principles and techniques of digital holopraphic microscopy, SPIE Reviews, May 14, 2010

[18] Wenbo Xu, M. H. Jericho, I. A. Meinertzhagen, and H. J. Kreuzer, Digital in-line holography for biological applications, Dalhousie University, Halifax, NS, Canada B3H 4J1, July 16, 2001

[19] Zhang T., Yamaguchi I., Three-dimensional microscopy with phase-shifting digital holography, Opt. Lett., 23: 1221-1223, 1998

[20] Iwai H, Fang-Yen C, Popescu G, Wax A, Badizadegan K, Dasari RR, Feld MS., Quantitative phase imaging using actively stabilized phase-shifting low-coherence interferometry, Opt. Lett., 29: 2399-2401, 2004

[21] Reichelt S., Zappe H., Combined Twyman-Green and Mach-Zehnder interferometer for microlens testing, Appl. Opt., 44:5786-5792, 2005

[22] Wahba HH., Kreis T., Characterization of graded index optical fibers by digital holographic interferometry, Appl. Opt., 48: 1573-1582, 2009

[23] Gabor, D. , A new microscopic principle, Nature, 1948, 161:777-778

[24] Schnars, U. & Juptner, W., Direct recording of holograms by a CCD target and numerical reconstruction, Applied Optics, 33:179-181, 1994

[25] Cuche, E.; Marquet, P. & Depeursinge, C., Simultaneous amplitude-contrast and quantitative phase-contrast microscopy by numerical reconstruction of Fresnel offaxis holograms, Applied Optics, 38, 6994–7001, 1999

[26] Rappaz, B.; Marquet, P.; Cuche, E.; Emery, Y.; Depeursinge, C. & Magistretti, PJ., Measurement of the integral refractive index and dynamic cell morphometry of living cells with digital holographic microscopy, Optics Express, 13: 9361-9373, 2005

[27] Mölder, A.; Sebesta, M.; Gustafsson, M.; Gisselsson, L.; Gjörloff-Wingren, A. & Alm, K., Non-invasive, label-free cell counting and quantitative analysis of adherent cells using digital holography, Journal of Microscopy, 232(2):240-247, 2008

[28] Rappaz, B.; Barbul, A.; Emery, Y.; Korenstein, R.; Depeursinge, C.; Magistretti, P.J. & Marquet, P., Comparative study of human erythrocytes by digital holographic microscopy, confocal microscopy and impedance volume analyzer, Cytometry Part A, 73A:895-903, 2008

[29] Mona Mihailescu, Irina A. Paun, Eugenia Vasile, Roxana C. Popescu, Alexandra V. Baluta, Diana G. Rotaru, Digital Off-Axis Holographic Microscopy: from Cells Vizualization, to Phase Shift Values, Ending with Physiological Parameters Evolution, Romanian Journal of Physics – Volume 61, Numbers 5-6, November 24, 2015

[30] Boyden, S., The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes, The Journal of Experimental Medicine, 115:453-466, 1962

[31] Zigmond, S.H. & Hirsch, J.G., Leukocyte locomotion and chemotaxis: New methods for evaluation, and demonstration, of a cell-derived chemotactic factor, The Journal of Experimental Medicine, 137:387-410, 1972

[32] Zicha, D.;Dunn, G. A. & Brown, A.F., A new direct-viewing chemotaxis chamber, Journal of Cell Science, 99(4):769-775, 1991

[33] Gabbiani, G.; Gabbiani, F.; Heimark, R.F. & Schwartz, S.M., Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro, Journal of Cell Science, 66:39-50, 1984

[34] De Becker, A.;Van Hummelen, P.; Bakkus, M.; Vande Broek, I.; De Wever, J.; De Waele, M. & Van Riet, I., Migration of culture-expanded human mesenchymal stem cells through bone marrow endothelium is regulated by matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metalloproteinase-3, Heamatologica, 92:440-449, 2007

[35] Mann, C.J.; Yu, L. & Kim, M.K., Movies of cellular and sub-cellular motion by digital holographic microscopy, Biomedical Engineering Online, 5:21, 2006

[36] Dubois, F.; Yourassowsky, C.; Monnom, O.; Legros, J.-C.; Debeir, O.; Van Ham, P.; Kiss, R. & Decaestecker, C., Digital holographic microscopy for the three-dimensional dynamic analysis of in vitro cancer cell migration, Journal of Biomedical Optics, 11:054032, 2006

[37] Garcia-Sucerquia, J.; Xu, W.; Jericho, S.K.; Klages, P.; Jericho, M.H. & Kreuzer, H.J., Digital in-line holographic microscopy. Applied Optics, 45 (5):836-850, 2006

[38] Sun, H.; Song, B.; Dong, H.; Reid, B.; Player, M.A.; Watson, J. & Zhao, M., Visualization of fast-moving cells in vivo using digital holographic video microscopy, Journal of Biomedical Optics, 13(1):014007, 2008

[39] Langehanenberg, P.; Lyubomira, I.; Bernhardt, I.; Ketelhut, S.; Vollmer, A.; Georgiev, G.; von Bally, G. & Kemper, B., Automated three-dimensional tracking of living cells by digital holographic microscopy, Journal of Biomedical Optics,14: 014018, 2009

[40] Persson, J.; Mölder, A.; Pettersson, S.-G. & Alm, K., Cell motility studies using digital holographic microscop, Microscopy, Science, Technology, Applications and Education, Méndez-Vilas, A. & Díaz, J., 2006

[41] Kersti Alm, Helena Cirenajwis2, Lennart Gisselsson, Anette Gjörloff Wingren, Birgit Janicke, Anna Mölder, Stina Oredsson and Johan Persson, Digital Holography and Cell Studies, Research and Technologies, Sweden, p. 245, 2015, 2003

[42] G. Pucihar, T. Kotnik, D. Miklavčič, and J. Teissié, Kinetics of transmembrane transport of small molecules into electropermeabilized cells, Biophys. J. 95(6), 2837–2848, 2008

[43] Leith E N and Upatnieks , Reconstructed wavefronts and communication theory, J. Opt. Soc. Am. 52 1123–30, 1962

[44] Powell R L and Stetson K A, Interferometric vibration analysis by wavefront reconstructions, J. Opt. Soc. Am. 55 1593–8, 1965

[45] Stetson K A and Powell R L, Interferometric hologram evaluation and real-time vibration analysis of diffuse objects, J. Opt. Soc. Am. 55 1694–5, 1965

[46] Kronrod M A, Yaroslavski L P and Merzlyakov N S, Computer synthesis of transparency holograms, Sov. Phys.–Tech. Phys. 17 329–32, 1972

[47] Kronrod M A, Merzlyakov N S and Yaroslavski L P, Reconstruction of holograms with a computer, Sov. Phys.–Tech. Phys. 17 333–4, 1972

[48] Yaroslavskii L P and Merzlyakov N S, Methods of Digital Holography (New York: Consultants Bureau), 1980

[49] Onural L and Scott P D, Digital decoding of in-line holograms, Opt. Eng. 26 1124–32, 1987

[50] Liu G and Scott P D, Phase retrieval and twin-image elimination for in-line Fresnel holograms, J. Opt. Soc. Am. A 4 159–65, 1987

[51] Onural L and Oz gen M T, Extraction of three-dimensional object-location information directly from in-line holograms using Wigner analysis, J. Opt. Soc. Am. A 9 252–60, 1992

[52] Haddad W, Cullen D, Solem J C, Longworth J M, McPherson A, Boyer K and Rhodes C K , Fourier-transform holographic microscope, Appl. Opt. 31 4973–8, 1992

[53] Schnars U and Juptner W, Principles of direct holography for interferometry, FRINGE 93: Proc. 2nd Int. Workshop on Automatic Processing of Fringe Patterns ed W Juptner and W Osten (Berlin: Akademie) pp 115–20, 1993

[54] Schnars U, Direct phase determination in hologram interferometry with use of digitally recorded holograms, J. Opt. Soc. Am. A 11 2011–5, 1994 (Reprinted in: Hinsch K and Sirohi R (ed), Holographic Interferometry – Principles and Techniques (SPIE Milestone Series vol 144), pp 661–5, 1997

[55] Osten W, Baumbach T, Seebacher S and Juptner W, Remote shape control by comparative digital holography, Proc. 4th Int. Workshop on Automatic Processing of Fringe Patterns ed W Juptner and W Osten (Berlin: ¨ Akademie), 373–82, 2001

[56] Kreis T, Aswendt P and Hofling R, Hologram reconstruction using a digital micromirror device, Opt. Eng. 40 926–33, 2001

[57] Harriharan P, Optical Holography (Cambridge: Cambridge University Press), 1984

[58] Kreis T, Holographic Interferometry (Berlin: Akademie), 1996

[59] M. Mihailescu, M. Scarlat, A. Gheorghiu, J. Costescu, M. Kusko, I. A. Paun, and E. Scarlat, Automated imaging, identification, and counting of similar cells from digital hologram reconstructions, Appl. Opt. 50(20), 3589–3597, 2011

[60] http://www.lynceetec.com/?s=koala

[61] P. Girshovitz and N. T. Shaked, Generalized cell morphological parameters based on interferometric phase microscopy and their application to cell life cycle characterization, Biomed. Opt. Express 3(8), 1757–1773, 2012

[62] G. Popescu, Quantitative phase imaging of nanoscale cell structure and dynamics, Methods Cell Biol. 90, 87–115, 2008

[63] Fidler, I.J., Selection of successive tumour lines for metastasis, Nature: New biology, 242 (118), 148-149, 1973

[64] Barer, R., Refractometry and Interferometry of Living Cells, J. Opt. Soc. Am., 47 (6), 545-556, 1957

[65] Liu, P.Y., Chin, L.K., Ser, W., Chen, H.F., Hsieh, C.M., Lee, C.H., Sung, K.B., Ayi, T.C., Yap, P.H., Liedberg, B., Wang, K., Bourouina, T., Leprince-Wang, Y., Cell refractive index for cell biology and disease diagnosis: past, present and future, Lab Chip 16 (4), 634-644, 2016

[66] Choi, W.J., Jeon, D.I., Ahn, S.-G., Yoon, J.-H., Kim, S., Lee, B.H., Full-field optical coherence

microscopy for identifying live cancer cells by quantitative measurement of refractive index distribution, Optics Express 18 (22), 23285-23295, 2010

[67] Liang, X.J., Liu, A.Q., Lim, C.S., Ayi, T.C., Yap, P.H., Determining refractive index of single living cell using an integrated microchip, Sensors and Actuators a-Physical 133(2), 349-354, 2007

[68] Backman, V., Wallace, M.B., Perelman, L.T., Arendt, J.T., Gurjar, R., Muller, M.G., Zhang, Q., Zonios, G., Kline, E., McGillican, T., Shapshay, S., Valdez, T., Badizadegan, K., Crawford, J.M., Fitzmaurice, M., Kabani, S., Levin, H.S., Seiler, M., Dasari, R.R., Itzkan, I., Van Dam, J., Feld, M.S., Detection of preinvasive cancer cells, Nature 406(6791), 35-36 , 2000

[69] Bista, R.K., Uttam, S., Wang, P., Staton, K., Choi, S., Bakkenist, C.J., Hartman, D.J., Brand, R.E.,

Liu, Y., Quantification of nanoscale nuclear refractive index changes during the cell cycle, J. Biomed. Opt. 16 (7), 070503-070503-070503, 2011

[70] Sun, L.X., Zhang, Y.Q., Wang, Y.J., Zhang, C.L., Min, C.J., Yang, Y., Zhu, S.W., Yuan, X.C.,

Refractive index mapping of single cells with a graphene-based optical sensor, Sens. Actuator B-Chem. 242, 41-46, 2017

[71] Popescu, G., Park, Y., Lue, N., Best-Popescu, C., Deflores, L., Dasari, R.R., Feld, M.S., Badizadegan, K., Optical imaging of cell mass and growth dynamics, American journal of Physiology, Cell physiology 295(2), C538-544, 2008

[72] Violeta L. Călin, Mona Mihăilescu, Eugen I. Scarlat, Alexandra V. Băluță, Daniel Călin, Eugenia Kovacs, Tudor Savopol, Mihaela G. Moisescu, Evaluation of the metastatic potential of malignant cells by image processing of digital holographic microscopy data, FEBS Open Bio, 2017

[73] Mir, M., Wang, Z., Shen, Z., Bednarz, M., Bashir, R., Golding, I., Prasanth, S.G., Popescu, G.:

Optical measurement of cycle-dependent cell growth, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 108 (32), 13124-13129, 2011

[74] Baniyash, M., Netanel, T., Witz, I.P., Differences in Cell Density Associated with Differences in

Lung-colonizing Ability of B16 Melanoma Cells, Cancer research 41 (2), 433-437, 1981

[75] Violeta L. Călin, Mona Mihăilescu, Nicolae Mihale, Alexandra V. Băluță, Eugenia Kovacs, Tudor Savopol, Mihaela G. Moisescu, Changes in optical properties of electroporated cells as revealed by digital holographic microscopy, Biomedical Optics Express, Vol. 8, No. 4, 2017

[url-1.1] Fibroblaști

http://www.wikiwand.com/gl/Fibroblasto (accesat la data de 30.12.2016)

[url-1.2] Analiza urinii

http://www.qreferat.com/referate/medicina/Analiza-urinii-examenul-de-uri458.php (accesat la data de 30.12.2016)

[url-1.3] Limfoame maligne

http://www.esanatos.com/boli/boli-si-tratamente/cancerul/36/limfoamele-maligne-aspecte gen85466.php (accesat la data de 30.12.2016)

[url-1.4] Principiile și tehnicile microscopiei holografice digitale http://photonicsforenergy.spiedigitallibrary.org/article.aspx?articleid=1305556 (accesat la data de 04.01.2017)

[url-1.5] Principiile și tehnicile microscopiei holografice digitale http://photonicsforenergy.spiedigitallibrary.org/article.aspx?articleid=1305556 (accesat la data de 04.01.2017)

[url-1.6] Holografia digitală in-line pentru aplicații biologice http://www.pnas.org/content/98/20/11301.full.pdf (accesat la data de 05.01.2017)

[url-1.7] Biologie computatională

http://www.annaleida.com/files/Digital_Hol.pdf (accesat la data de 08.01.2017)

[url-1.8] Coverslip

https://www.tedpella.com/histo_html/coverslp.htm#260375-1 (accesat la data de 20.04.2018)

Anexe

Anexa 1 – Segmentare

% Pregatire scriere program nou

clc; % Golire fereastra de comanda

clear; % Sterger variabile

close all; % Inchidere ferestre, cu exceptia celor create cu imtool

imtool close all; % Inchidere ferestre create cu imtool

workspace; % Afisare panou corespunzator spatiului de lucru

fontSize = 16;

% Citire imagine din folder

folder = fullfile(matlabroot, 'E:\Articol\coeficienti');

baseFileName = 'Phase_p5di.tif';

% Numele fisierului complet, cu calea prefixata

fullFileName = fullfile(folder, baseFileName);

% Verificare existenta fisier

if ~exist(fullFileName, 'file')

% Fisierul nu a fost gasit -> verificare cale fisier

fullFileName = baseFileName;

if ~exist(fullFileName, 'file')

% Nu exista fisier -> atentionare utilizator

errorMessage = sprintf('Eroare: %s fisierul nu exista in directorul caii de cautare.', fullFileName);

uiwait(warndlg(errorMessage));

return;

end

end

grayImage = imread(fullFileName);

imshow(grayImage, []);

axis on;

title('Imaginea de intrare in tonuri de gri', 'FontSize', fontSize);

set(gcf, 'Position', get(0,'Screensize'));

message = sprintf('Click stanga pentru a putea incepe trasarea conturului.\n Ridicati butonul mouse-ului pentru a finaliza conturul');

uiwait(msgbox(message));

hFH = imfreehand();

% Crearea unei imagini binare ("mask") a obiectului

binaryImage = hFH.createMask();

xy = hFH.getPosition;

% Dimensionare imagini -> utilizare subplot

subplot(2, 3, 1);

imshow(grayImage, []);

axis on;

drawnow;

title('Imaginea de intrare in tonuri de gri', 'FontSize', fontSize);

% Afisare imagini binare

subplot(2, 3, 2);

imshow(binaryImage);

axis on;

title('Masca binara a regiunii', 'FontSize', fontSize);

% Etichetare imagine binara si construire centroid si centru de masa

labeledImage = bwlabel(binaryImage);

measurements = regionprops(binaryImage, grayImage, …

'area', 'Centroid', 'WeightedCentroid', 'Perimeter','Eccentricity');

area = measurements.Area

centroid = measurements.Centroid

centerOfMass = measurements.WeightedCentroid

perimeter = measurements.Perimeter

eccentricity=measurements.Eccentricity

% Calculare arie (in pixeli) regiune delimitate

numberOfPixels1 = sum(binaryImage(:))

% Alta metoda de calcul: considerare pixeli fractionali

numberOfPixels2 = bwarea(binaryImage)

% Obtinere coordonate regiune delimitata

structBoundaries = bwboundaries(binaryImage);

xy=structBoundaries{1}; % Construire matrice n x 2 (formata din coordonatele x,y)

x = xy(:, 2); % Coloane

y = xy(:, 1); % Randuri

subplot(2, 3, 1); % Afisare peste imaginea de intrare -> suprapunere

hold on;

plot(x, y, 'LineWidth', 2);

drawnow;

% Masca = true -> setare linie la 255

burnedImage = grayImage;

burnedImage(binaryImage) = 255;

% Afisare imagine cu masca "burned in."

subplot(2, 3, 3);

imshow(burnedImage);

axis on;

caption = sprintf('Imagine cu masca interioara');

title(caption, 'FontSize', fontSize);

% Mascare imagine si afisare

% Pastrare imagine din interiorul mastii -> zero in afara mastii

blackMaskedImage = grayImage;

blackMaskedImage(~binaryImage) = 0;

subplot(2, 3, 4);

imshow(blackMaskedImage);

axis on;

title('Masca exterioara regiunii', 'FontSize', fontSize);

% Calcul valoare medie (mean)

meanGL = mean(blackMaskedImage(binaryImage));

% Calcul deviatie standard (std2)

stdGL = std2(blackMaskedImage(binaryImage));

% Marcare centroid si centru de masa('r+')

hold on;

plot(centroid(1), centroid(2), 'r+', 'MarkerSize', 30, 'LineWidth', 2);

plot(centerOfMass(1), centerOfMass(2), 'g+', 'MarkerSize', 20, 'LineWidth', 2);

% Innegrire interior regiune

insideMasked = grayImage;

insideMasked(binaryImage) = 0;

subplot(2, 3, 5);

imshow(insideMasked);

axis on;

title('Masca din interiorul regiunii', 'FontSize', fontSize);

% Decupare imagine

leftColumn = min(x);

rightColumn = max(x);

topLine = min(y);

bottomLine = max(y);

width = rightColumn – leftColumn + 1;

height = bottomLine – topLine + 1;

croppedImage = imcrop(blackMaskedImage, [leftColumn, topLine, width, height]);

% Afisare imagine decupata

subplot(2, 3, 6);

imshow(croppedImage);

axis on;

title('Imagine decupata', 'FontSize', fontSize);

% Afisare centroid si centru de masa('r+')

hold on;

plot(centroid(1)-leftColumn, centroid(2)-topLine, 'r+', 'MarkerSize', 30, 'LineWidth', 2);

plot(centerOfMass(1)-leftColumn, centerOfMass(2)-topLine, 'g+', 'MarkerSize', 20, 'LineWidth', 2);

% Centralizare rezultate

message = sprintf('Mean value within drawn area = %.3f\nStandard deviation = %.3f\nNumber of pixels = %d\nArea in pixels = %.2f\nPerimeter = %.2f\n Eccentricity = %.2f\nCentroid at (x,y) = (%.1f, %.1f)\nCenter of Mass at (x,y) = (%.1f, %.1f)\n Red crosshairs at centroid.\nGreen crosshairs at center of mass.', …

meanGL, stdGL, numberOfPixels1, numberOfPixels2, perimeter,eccentricity, centroid(1), centroid(2), centerOfMass(1), centerOfMass(2));

msgbox(message);

Anexa 2 – Histograma și densitatea de masă uscată

% Histograma_1

a=imread('1_1.tif');

a=a(:,:,1);

N=imhist(a); % obtinere histograma (cu tot cu nivelul de negru)

Val=N(2:256,1);% srocarea valoriloe din imagine, exceptand negrul

% stem(1:1:255,Val) %refacerea histogramei fara nivelul de negru

% Densitatea de masa uscata

medie=150.217;

lambda=663;

alpha=0.0018;

arie=54156.00;

intermediar= (10*lambda)/(2*pi*alpha);

dry_mass=intermediar*medie*arie

% Histograma_2

a=rgb2gray(a);

a=imread('1_1.tif');

a=a(:,:,1);

[l,c]=size(a);

b=zeros(size(a));

b=uint8(b);

for i=1:1:l

for j=1:1:c

if (a(i,j)==0)

t=0;

else

t=a(i,j);

end

b(t)=b(t)+1;

end

end

% Rolul for-ului de mai sus este de a extrage celula din imagine, de a nu lua in

% considerare si fundalul negru ce are ca si index idx=0

figure

subplot(1,2,1);

imshow(uint8(a));

title('Imaginea originala');

subplot(1,2,2);

h1=bar(a);

title('Histograma asociata imaginii');

dlmwrite('phase_p1di.txt',a, ' ');

figure

h2=bar(b,10);

title('Histograma celula normala');

%Extragere imagini si copiere in .txt

a=imread('1_1.tif');

a=a(:,:,1);

dlmwrite('valori_18mart1_2_di.txt',a, ' ');

Anexa 3 – Skewness si kurtosis

% Pregatire scriere program nou

clc; % Golire fereastra de comanda

clear all; % Inchidere ferestre

%Citire imagine

im_aux=imread('1_1','tif'); % % 1_1.tif=croppedImage (imaginea decupata rezultata in urma rularii codului existent in anexa 1)

[L,C]=size(im_aux(:,:,1));

% Inalturarea liniei de 255 corespunzatoare fazei maxime

C=C-1;

PhaseIM=im_aux(:,1:C,1);

figure, imshow(PhaseIM),colormap(jet)

%**********************************************************************************

% Se introduce valoarea OPD din tabel pentru fiecare celula in parte

OPDc=150.217;

%**********************************************************************************

%Calcul valoare sigma

sig=0;

inc1=0;

for i=1:1:L

for j=1:1:C

if (PhaseIM(i,j)~=0) % In afara celulei avem valoarea 0

sig=sig+(double(PhaseIM(i,j))-OPDc)^2;

inc1=inc1+1;

end

end

end

sig_phi=sig/inc1

% Calcul valoare skewness

skew=0;

for i=1:1:L

for j=1:1:C

if (PhaseIM(i,j)~=0)

skew=skew+(((double(PhaseIM(i,j))-OPDc)^3)/(sig_phi^3));

end

end

end

skew_phi=skew

% Calcul valoare kurtosis

kurt=0;

for i=1:1:L

for j=1:1:C

if (PhaseIM(i,j)~=0)

kurt=kurt+(((double(PhaseIM(i,j))-OPDc)^4)/(sig_phi^4));

end

end

end

kurt_phi=kurt

Anexa 4 – Volum

% Citire imagine

a=imread('1_1.tif'); % 1_1.tif=croppedImage (imaginea decupata, rezultata in urma rularii codului existent in anexa 1)

a(:,:,1)=[];

% Convertire spatiu de culoare RGB -> Gray

a=rgb2gray(a);

% Linie corespunzatoare fazei maxime

b=a(54,:);

figure

subplot(221),image(a), colormap(gray(256));

subplot(222),plot(b);xlabel('Distanta[micrometrii]'); ylabel('Diferenta de faza [grade]');

b=double(b);

% Calcul volum

volum=trapz(trapz(double(a)))