Tehnici DE Biologie Moleculara In Analiza Si Epidemiologia Enterovirusurilor

Cuprins

Introducere……………………………………………………………………. pag. 1

Capitolul I : Enterovirusuri

1. Încadrare taxonomica……………………………………………………..…pag.5

2. Genomul viral………………………………………………………………pag.7

2.1.Regiunea 5’ necodata……………………………………………………..pag.8

2.2.Regiunea 3’ necodata……………………………………………………..pag.8

2.3.Regiunea codata a poliproteinei virale……………………………………pag.10

3. Proteine virale………………………………………………………………pag.11

3.1.Proteine structurale……………………………………………………….pag.11

3.2.Proteine nestructurale…………………………………….………………pag.12

4. Virionul……………………………………………………………………………………………pag.16

4.1.Arhitectura virionului…………………………………………………….pag.16

4.2.Proprietati fizico-chimice…………………………………………………pag.17

4.3.Determinanti antigenici……………………………………………………pag.18

5. Receptori celulari…………………………………………………………….pag.20

6.Multiplicarea virala…………………………………………………………..pag.23

6.1.Etapele precoce…………………………………………………………….pag.24

6.2.Sinteza virala………………………………………………………………pag.25

6.3.Etapele tardive……………………………………………………………..pag.28

7.Epidemiologia…………………………………………………………………pag.29

7.1.Moduri de transmitere………………………………………………………pag.29

7.2.Epidemiologia moleculara…………………………………………………pag.29

8. Patogeneza…………………………………………………………………….pag.30

Capitolul II :Tehnici de biologie moleculara

Reactia de polimerizare ȋn lant(PCR)………………………………………….pag.33

Generalitati…………………………………………………………………pag33

Componentele reactiei……………………………………………………..pag.34

Matrita ADN………………………………………………………….pag.34

Primeri oligonucleotidici……………………………………………..pag.35

ADN polimerazele termostabile………………………………………pag.35

Deoxinucleotid trifosfați ( dNTP)…………………………………….pag.37

Tamponul de reacție …………………………………………………pag.38

Uleiul mineral………………………………………………………..pag.38

3.Detectarea produsilor PCR…………………………………………… …..pag.38

3.1.Contaminarea si evitarea contaminarii in reactia PCR………………….pag.39

3.2. Probleme ce apar in reactiile PCR…………………………………… .pag. 40

3.3.Specificitatea reactiei……………………………………………………pag.41

3.4. Variante de PCR………………………………………………………..pag.41

3.5.Aplicatii ale tehnologiei PCR……………………………………………pag.43

4.Restrictia enzimatica………………………………………………………pag. 44

PARTEA EXPERIMENTALA

1.PCR pentru enterovirusuri non-polio……………………………………….pag. 48

2.Extractie ARN viral…………………………………………………………..pag.49

3.Reverstranscriere pentru originea genomica VP1-2A………………………pag.51

4.Reactia PCR pentru regiunea genomica VP1-2A……………………………pag.52

5.Electroforeza in gel de agaroza……………………………………………….pag.54

6.Incarcarea ampliconilor in gel si migrarea……………………………………pag.56

7.Concluzii…………………………………………………………………………………………………pag.58

8.Bibliografie…………………………………………………………………… pag.59

=== ENTEROVIRUSURILOR ===

Cuprins

Introducere……………………………………………………………………. pag. 1

Capitolul I : Enterovirusuri

1. Încadrare taxonomica……………………………………………………..…pag.5

2. Genomul viral………………………………………………………………pag.7

2.1.Regiunea 5’ necodata……………………………………………………..pag.8

2.2.Regiunea 3’ necodata……………………………………………………..pag.8

2.3.Regiunea codata a poliproteinei virale……………………………………pag.10

3. Proteine virale………………………………………………………………pag.11

3.1.Proteine structurale……………………………………………………….pag.11

3.2.Proteine nestructurale…………………………………….………………pag.12

4. Virionul……………………………………………………………………………………………pag.16

4.1.Arhitectura virionului…………………………………………………….pag.16

4.2.Proprietati fizico-chimice…………………………………………………pag.17

4.3.Determinanti antigenici……………………………………………………pag.18

5. Receptori celulari…………………………………………………………….pag.20

6.Multiplicarea virala…………………………………………………………..pag.23

6.1.Etapele precoce…………………………………………………………….pag.24

6.2.Sinteza virala………………………………………………………………pag.25

6.3.Etapele tardive……………………………………………………………..pag.28

7.Epidemiologia…………………………………………………………………pag.29

7.1.Moduri de transmitere………………………………………………………pag.29

7.2.Epidemiologia moleculara…………………………………………………pag.29

8. Patogeneza…………………………………………………………………….pag.30

Capitolul II :Tehnici de biologie moleculara

Reactia de polimerizare ȋn lant(PCR)………………………………………….pag.33

Generalitati…………………………………………………………………pag33

Componentele reactiei……………………………………………………..pag.34

Matrita ADN………………………………………………………….pag.34

Primeri oligonucleotidici……………………………………………..pag.35

ADN polimerazele termostabile………………………………………pag.35

Deoxinucleotid trifosfați ( dNTP)…………………………………….pag.37

Tamponul de reacție …………………………………………………pag.38

Uleiul mineral………………………………………………………..pag.38

3.Detectarea produsilor PCR…………………………………………… …..pag.38

3.1.Contaminarea si evitarea contaminarii in reactia PCR………………….pag.39

3.2. Probleme ce apar in reactiile PCR…………………………………… .pag. 40

3.3.Specificitatea reactiei……………………………………………………pag.41

3.4. Variante de PCR………………………………………………………..pag.41

3.5.Aplicatii ale tehnologiei PCR……………………………………………pag.43

4.Restrictia enzimatica………………………………………………………pag. 44

PARTEA EXPERIMENTALA

1.PCR pentru enterovirusuri non-polio……………………………………….pag. 48

2.Extractie ARN viral…………………………………………………………..pag.49

3.Reverstranscriere pentru originea genomica VP1-2A………………………pag.51

4.Reactia PCR pentru regiunea genomica VP1-2A……………………………pag.52

5.Electroforeza in gel de agaroza……………………………………………….pag.54

6.Incarcarea ampliconilor in gel si migrarea……………………………………pag.56

7.Concluzii…………………………………………………………………………………………………pag.58

8.Bibliografie…………………………………………………………………… pag.59

INTRODUCERE

Enterovirusurile reprezintă un gen foarte larg aparținând familiei Picornaviridae. Virusurile cu ARN de polaritate pozitivă din această familie se remarcă prin faptul că sunt cele mai mici ribovirusuri cunoscute (picos = mic) si reprezintă patogeni importanți pentru om și zootehnie. Datorită importanței economice și medicale a picornavirusurilor studiul lor a adus o contribuție substanțială la dezvoltarea virusologiei moderne.

Apartenența la grupul virusurilor ARN de polaritate pozitivă este justificată de faptul că genomul enterovirusurilor funcționează ca ARN mesager și prezintă o ARN replicază dependentă de ARN.

Numelele generic de enterovirusuri provine de la faptul că majoritatea colonizează tractul digestiv. Pe langă infecții ușoare sau asimptomatice, cele 66 serotipuri de enterovirusuri umane cunoscute pana in prezent pot provoca și infecții foarte grave cum sunt meningitele aseptice sau miocardita acuta.

Clasificarea inițiala a enterovirusurilor s-a bazat pe diferențele antigenice, pe capacitatea de a se replica intr-o anumita linie celulară umană sau animală.

CAPITOLUL I

ENTEROVIRUSURI

ÎNCADRARE TAXONOMICA

ETIOLOGIE

Enterovirusurile (E.V.) fac parte din familia PICORNAVIRIDAE (pico = foarte mic, RNA =tipul de acid nucleic), con in ARN, sunt icosaedrale, de aproximativ 30 nm diametru și nu au anvelopă. Clasificarea enterovirusurilor în mai multe subgrupe se bazează pe diferențe de patogenitate și gazde, iar divizarea în serotipuri se face prin seroneutralizare:

Virusurile Poliomielitice – (V.P.)

Serotipurile 1-3 (tipul 1- Brunhilde; tipul 2 – Lansing; tipul 3 – Leon) cultivă în culturi celulare de primate.

Tipul 2 Lansing a fost adaptat la rozătoare. Provoacă leziuni histopatologice caracteristice prin inoculare directă în SNC la primate.

Virusurile Coxsackie sunt divizate în 2 grupuri:

Coxsackie grup A – produc la șoricelul inoculat miozita generalizată, cu paralizie flască și cuprind serotipurile 1-24 (în prezent 23 serotipuri);

Coxsackie grup B – produc miozita focală, cu infecție generalizată în miocard, pancreas, SNC cu paralizie spastică și cuprind serotipurile 1-6;

Virusurile ECHO

Acestea produc efecte citopatice în culturi celulare de primate și cuprind 31

serotipuri recunoscute. Inițial au fost 34 serotipuri, însa în urma studiilor virusologice s-au restrâns la 31. Enterovirusuri nou descoperite au fost numerotate 68-72, cu excluderea virusului hepatitic A (enterovirus 72).

2. GENOMUL VIRAL

Genomul enterovirusurilor este constituit dintr-o moleculă de ARN monocatenar, de polaritate pozitivă, având aproximativ 7400 de nucleotide. ARN-ul viral, infectat, funcționază ca ARN mesager în timpul translației și ca matriță pentru formarea catenei complementare de polaritate negativă în timpul replicării genomului viral. Extremitatea 3’ a genomului este poliadenilată iar extremitatea 5’ este legată covalent cu o proteină de talie mică ( 22 de aminoacizi ), VPg, cu un rol important se pare în inițierea sintezei ARN-ului. Molecula de ARN prezintă o singură fază de citire deschisă, ORF

(,, open reading frame’’), încadrată de două regiuni necodante. (NC) în 5’ și 3’ (Rueckert, 1996)

. Regiunea 5’ necodantă ( 5’ NC)

În comparație cu ARN mesageri celulari, regiunea 5’NC a enterovirusurilor este neobișnuit de lungă. Este constituită din aproximativ 750 de nucleotide ( ~ 10% din lugimea totală a genomului) și are un grad înalt de conservare în cadrul enterovirusurilor. Aceste caracteristici se datoresc functiilor importante îndeplinite de regiunea 5’NC, funcții care depind atât de structura sa secundară, cât și de cea primară. Structura sa secundară complexă, compusă din duble helixuri și bucle, conține două domenii funcționale diferite implicate în sinteza ARN viral și în inițierea translației proteinelor virale. Primele 100 de nucleotide au o structura caracterisică în formă de treflă, implicată în replicarea catenei de polaritate pozitivă dar care este indispensabila sintezei catenei de polaritate negativă. În plus, această structură sub forma de frunza de trifoi ar putea conține semnale comune atât pentru translație cât și pentru replicarea virală și pare să intervină în supresia translației eucariote în favoarea inițierii sintezei de ARN viral prin intermediul interacțiilor ARN-proteine. Urmeaza al doilea domeniu funcțional, care est necesar în translația virală și care conține o strucutură numită IRES

(,, Internal Ribosome Entry Site’’, sediul intern de acces la ribosom), implicată în interacția cu proteine celulare. Mecanismul propus pentru enterovirusuri, în care IRES joacă un rol important în inițierea internă a sintezei poliproteinei virale (lipsind o structură de tip ,,bonetă’’ – ,,cap’’ – în extremitatea 5’ a genomului ), este diferit de cel de scanare a ribozomilor, specific pentru ARN mesageri celulari. Recent, a fost demostrat faptul ca IRES este bivalent pentru ca ar conține și secvențe cu acțiune în cis, necesare pentru replicarea genomului viral.

. Regiunea 3’ necodantă ( 3’NC)

Regiunea 3’NC este de mărime variabilă în funcție de tipul de enterovirus, de exemplu de 72 de nt la polivirus sau de 100 nt la coxackievirus B. Prezintă două sau trei domenii distincte (al treila nu est prezent decât la două din cele cinci grupuri filogenetice ale enterovirusurilor) , desemnate ,,X’’, ,,Y’’, ,,Z’’, cu structuri în ac de păr. Această regiune pare să aibă un rol primordial în inițierea sintezei ARN de polaritate negativă în timpul replicării genomului viral, grație structurii sale primare dar și a celei terțiare, sub formă de pseudo-nod. Proteinele virale și celulare recunosc specific complexul ribonucleoproteic format la originea replicării de către 3’NC în procesul de inițiere a sintezei catenei de polaritate negativă.

Regiunea 3’NC este urmată de o secvență poliadenilată codificată genetic, de aproximativ 75 nt, a cărei funcție nu este încă foarte bine definită. Aceasta secventa pare să fie implicată în infectivitatea ARN și poate interveni și în procesul de replicare ( Sarnow, 1989 ).

. Regiunea codantă a poliproteinei virale

Cadrul de lectură deschis (ORF) codifică o poliproteină de aproximativ 250 kDa, care este clivată în etape succesive în timpul translației de către proteaze virale. Se obțin astfel 11 proteine virale (Fig. 2). Poliproteina nu a fost niciodată detectată în celulele infectate deoarece est clivată în timpul sintezei sale. Este împărțită în 3 regiuni: P1, P2, P3, corespunzând celor trei polipeptide precursoare ale proteinelor virale.

Regiunea P1 codifică poliproteina P1, precursoare a proteinelor structurale VP1,VP2, VP3 și VP4, care constituie capsida virală.

Regiunea P2 și P3 codifică poliproteinele P2 și respectiv P3, ca precursoare ale proteinelor nestructurale, implicate în clivarea proteolitică, în replicarea genomului viral precum și în înhibarea funcțiilor celulare. Poliproteina P2 este precursoarea proteinelor mature 2A, 2B și 2C. Poliproteina P3 este precursoare pentru proteinele mature 3A, 3B, 3C și 3D.

Procesarea poliproteinelor virale (dupa Allan )

3. PROTEINE VIRALE

Regiunile P1, P2, P3 ale proteinelor virale

Proteine structurale

Regiunea P1, prima din ORF, codifică polipeptidul P1 care eate precursor al celor patru proteine mature ale capsidei VP4,VP2, VP3, VP1 (ordinea din P1). Imediat ce P1 este separat de restul poliproteinei de către proteinaza virală 2A, ea este la rândul său clivată grație activității proteazice a proteinei 3CD. Se obțin astfel polipeptidele VP0,

VP3 și VP1.

Si proteina VP0 este clivată ulterior, în timpul asamblării finale a virionului, pentru a produce proteinele structurale VP4 și VP2. Proteina VP0 rămâne totusi prezentă, în număr redus (două molecule per virion), în capsida virionului. O descrire detaliată a acestor proteine este prezentată în paragraful D.1 din capitolul ,,Arhitectura virionului’’.

Proteine mature de capsida ( VP1,VP2,VP3, VP4)

Proteine nestructurale

Regiunea P2 codifică polipeptida P2 care est precursoare polipeptidelor mature 2A, 2B Și 2C. Produsul precursor 2BC este stabil și ar putea fi implicat în sinteza ARN viral.

Proteina 2A este o protează care se eliberează intr-un proces autocatalitic de poliproteina virala. Un prim clivaj se realizează in în cis la nivelul Tyr/Gly, pentru a elibera extremitatea N-terminală a acestei enzime, separând astfel precursorul proteinelor de capsidă ( P1) de precursorii proteinelor nestructurale ( P2-P3). Proteina 2A este responsabilă și de un clivaj alternativ, neesențial, al precursorului 3CD pentru a

genera produșii maturi 3C’ și 3D’. Riolul acestui clivaj alternativ nu este încă cunoscut. Proteina 2A ar putea fi un element esențial în replicarea ARN deoarece nu a fost observată sinteza virală în celulele transfectate cu ARN dicistronice, având această proteină delatata. Acțiune proteazei 2A asupra proteinelor celulare are gazdei în timpul infecției enterovirale a fost intens studiată. Proteinele 2Apro ale poliovirusurilor și coxackievirusurilor sunt responsabile de clivarea factorului de inițiere a translației eucariote, eIF4G, prin care se blochează translatia ARN mesageri ai celulei gazdă (,,shut-off’’). Structura ARN mesageri din celula eucariotă, numită de autorii englezi ,,cap’’., indispensabilă pentru inițierea translației și așezarea corectă a ARN pe

ribozomi, lipsește la enterovirusuri. Înhibarea inițierii sintezei proteiceeucariote ,,cap’’-dependente de către proteaza virală conduce la stimularea translației ARN enteroviral, lipsit de ,,bonetă’’, dirijată de către IRES. O altă țintă celulară a proteazei 2A este

,, poly( A)- binding protein’’ ( PABP). Clivarea acestei proteine, din familia proteinelor eucariote care se leaga la ARN, ar putea constitui un alt mecanism prin care

enterovirusurile induc procesul de ,,shut-off’’ celular (blocarea sintezei proteinelor celulare). Recent a fost demonstrat faptul că 2Apro a coxackievirusurilor clivează in vitro distrofina umană și de șoarece. Distrofina poate fi clivată și in vivo în cardiomiocitele șoarecilor în timpul infecției cu coxackievirus B3. Clivarea acestei proteine de citoschelet, a cărei deficiență de origine genetică determină o cardiomiopatie dilatantă ereditară, ar putea fi la originea mecanismului molecular prin care infecția enterovirală contribuie la patogeneza cardiomiopatiei dilatante dobândite. De puțin timp 2Apro este suspectată de a fi implicată și în procesul de moarte celulară prin apoptoză.

Proteina 2BC pare să inducă o proliferare membranară, la nivelul membranelor citoplasmatice, ceea ce determină o acumulare de vezicule induse de virus pe care se ancorează complexele de replicare. De asemenea, proteina 2BC ar bloca și transportul

proteinelor prin reticulul endoplasmic către aparatul Golgi și ar putea mări permeabilitatea membranelor celulare.

Proteina 2B pare să joace un rol structural în complexele de replicare virală, dar funcția sa exactă rămâne incă neelucidată. Se bănuiește că blochează procesul de secreție a proteinelor celulare la nivelul reticulului ensoplasmic și perturbă integritatea aparatului Golgi.

Proteina 2C este cea mai conservată dintre proteinele enterovirale, dacă se ia în considerare structura primară. Conține trei domenii bine caracterizate: o structură helicoidală amfipatică la capătul amino, un situs de legare pentru nucleozid trifosfați

(,, NTP binding’’) caracteristic helicazelor. Această proteină conține și locusul de rezistență la guanidină, substanță care blochează sinteza ARN de poliovirus, fiind

capabilă să inhibe complet replicarea enterovirusurilor la concentrații milimolare. Proteina 2C ar interveni mai ales în cursul inițierii sintezei catenei ARN de polaritate negativă. În complexele de replicare, proteina 2C și precursorul său 2BC, sunt strâns asociate împreună cu ARN viral de membranele veziculelor din reticulul endoplasmic și joacă un rol în formarea și organizarea spațiala a complexelor de replicare la nivelul acestor vezicule. De asemenea, ar putea fi implicată în eliberarea ARN viral din complexul de replicare precum și în etapele tardive ale replicării, în încapsidarea genomului virel și asamblarea virionilor.

Regiunea P3 codifică polipeptidul P3, precursor al polipeptidelor mature 3A pana la 3D. Proteinele 3 AB și 3CD sunt stabile, având funcții distincte față de cele ale produșilor de clivare 3A, 3B, 3C și 3D.

Proteina 3AB intervine la mai multe niveluri în cursul replicarii genomului viral: este precursorul direct al proteinei 3B care este legată la extremitatea 5’ a ARN virali de polaritate pozitivă și negativă, fiind și un presupus co-factor al polimerazei 3Dpol. Proteina 3AB se leagă nespecific de ARN și, în asociere cu proteina 3CD, poate realiza o legătură specifică cu structură treflată din capătul 5’NC al genomului. Date genetice și biochimice au demonstrat că acest complex nucleoproteic joacă un rol esențial în replicare ARN viral. In plus, asocierea peoteinei 3AB cu proteina 3CD ar stimula

autoclivarea precursorului stabil 3CD în proteinele mature 3C și 3D. În același timp proteina 3 AB prezintă o afinitate pentru polimeraza 3Dpol și această interacție ar avea un rol central în recunoașterea de către polimerază a matriței, precum și în activitatea sa enzimatică.

Proteina 3A, acesteia i se raibuie un rol în inhibarea comunicării dintre reticulul endoplasmic și aparatul Golgi. Conține o secvență de 22 aminoacizi hidrofobi, responsabilă de interacția polipeptidului cu membranele și de modificarea permeabilității acestora. Mai recent, analiza mutanților a sugerat un rol al proteinei 3A în efectul citopatogen indus viral.

Proteina 3B ( VPg ) se leagă la extemitatea 5’ a ARN genomic. Ea participă direct la replicarea genomului viral. Un studiu recent a demostrat ca VPg, ar putea servi ca amorsă (,, primer’’) pentru ARN polimerază în timpul sintezei ARN viral.

Proteina 3CD este precursorul direct al proteazei virale 3Cpro și al polimerazei virale 3Dpol. Este și proteaza direct implicată în procesarea proteolitica la nivelul situsurilor Gln/Gly din regiunea P1, precursor al proteinelor capsidei. Recent, proteina

3CD a fost implicată șin în replicarea virală. Ea ar forma un complex ribonucleoproteic cu extremitatea 5’ în formă de treflă a genomului și o proteină celulară asociată

ribozomilor. Pentru a iniția în trans sinteza ARN de polaritate pozitivă, proteina 3CD poate să se asocieze și cu proteina 3AB și să formeze un complex 3Cdpro/3AB/ARN, implicat în sinteza ARN viral.

Proteina 3C este proteaza virală majoră responsabilă de clivajul legăturilor dipeptidice Gln/Gly din precursorii P2 și P3., de clivajul primar dintre proteinele 2C și 3A și de autoclivarea sa din precursorul 3DC. Recent, strctura proteazei 3C a poliovirusului a fost determinată prin cristalografie cu raze X.: ea prezintă o strcutură asemănătoare cu cea a unei serin-proteaze, de tip chemotripsină. Această proteină ar

cliva și anumite proteine celulare printre care: factorul de transcriere TFIIIC ,,TATA-binding protein’’ (TBP, sub-unitate a factorului de trasncriere TFIIID) și factorul de transcriere CREB (,, c-AMP-responsive element-binding protein’’). Consecința directă a inactivării acestor factori de transcriere este inhibarea trascrierii genelor celulare asigurată de către ARN polimerazele celulare I, II, și III.

Proteina 3D este ARN polimeraza dependentă de ARN, responsabilă de sinteza ARN de polaritate pozitivă și negativă. Activitatea sa este strict legată de prezența unui primer nucleotidic împreună cu matrița. In plus, 3Dpol prezintă și una din proprietățile helicazelor și anume cea de a derula duplexul ARN. I se atribuie și activitate de terminal adenil transferază cu rol ipotetic în replicare. Este bine stabilit că 3Dpol se asociază cu factori virali, cum este proteina 3AB sau VPg, dai și cu proteine celulare pentru a forma

complexe de replicare. Structura cristalografică a polimerazei 3D a permis localizarea a 4 domenii: A, B, C și D, înalt conservate printre ARN polimerazele virale.

VIRIONUL

Arhitectura virionului

Studiile de microscopie electronicã cât și apoi cele de difracție cu raze X au arãtat ca virionul are un diametru de 24-30 nm și posedã o capsidã cu simetrie icosaedricã lipsitã de un înveliș lipoproteic. Structura tridimensionalã a diferitelor enterovirusuri umane a fost elucidatã prin cristalografie cu raze X : poliovirusul de tip I ( Hogie et.al, 1985 ) , cokackievirus B3 ( Muckelbauer et.al., 1995 ) , echovirus 1 ( Filman et. al., 1998 ) . Toate aceste enterovirusuri au o arhitecturã a virionului similarã cu celelalte enterovirusuri din familia Picornaviridae. Capsida viralã este constituitã din 60 de protomeri identici, fiecare compus din cele patru proteine structurale ; VP1,VP2, VP3 și VP4. Cinci protomeri formeazã un pentamer și asocierea cu 12 pentameri constituie

procapsida. Cãnd acești 12 pentameri sunt asamblati, proteinele VP 1 sunt orientate în direcția axelor de simetrie de ordinul 5, în timp ce pe axele de simetrie de ordinul 3apare o protuberanțã formatã din proteinele VP2 Și VP 3. Proteinele VP4, situate exclusiv în interior, cãptușesc capsida în strânsã legãturã cu ARN genomic.

In ciuda diferențelor majore la nivelul structurii lor primare, cele trei proteine: VP1, VP2 și VP3 prezintã o structurã tridimensionalã relativ asemanãtoare. Aceastã structurã este compusã din douã helixuri de tip alfa și din opt planuri beta antiparalele, pliate și legate între ele prin patru bucle de conexiune scurte. Extremitãțile amino ale proteinelor VP1, VP2 și VP3 formeazã o rețea pe partea internã a capsidei, în asociere cu VP4.

Buclele de conexiune ale proteinelor VP1, formeazã platouri în jurul axelor de simetrie de ordinul 5. Acestea sunt înconjurate de o depresiune destul de profundã la

poliovirus și rhinovirus, constituitã din aminoacizii celor trei proteine: VP1, VP2 și VP3, numitã ,, canion’’ , aceastã structurã a fost propusã ca situs de atașare la receptorul celular, atât pentru grupul rhinovirus ( Colonno et.al. , 1998 ) și pentru poliovirus.

Descifrarea structurii tridimensionale a capsidei mai multor enterovirusuri a determinat un progres considerabil ȋn ȋnțelegerea funcțiilor acestei organizӑri, protejarea genomului viral de nucleazele de mediu, recunoașterea receptorului celular specific ca prim determinant ȋn specificitatea de gazdӑ și ȋn tropismul celular, suport pentru determinantii antigenici, sediu pentru informațiile privind ȋncapsidarea genomului viral și maturarea virionilor, ca și pentru maturarea virionilor, ca și pentru eliberarea genomului viral ȋn celulele țintӑ ale gazdei.

Proprietӑțile fizico-chimice

Enterovirusurile sunt, ȋntre altele, definite și prin proprietӑțile lor fizico-chimice, caracteristice acestui gen. Ele sunt rezistente la alcool etilic 70%, lizol 5%, amoniu

cuaternar 1% și fatӑ de alți compuși similari cu rol dezinfectant. De asemenea, sunt rezistente la tratamentul cu eter, dezoxicolat și alți solvenți organici sau detergenți. În schimb, enterovirusurile sunt termolabile : expunerea la temperaturi de 500C le distruge rapid, dar inactivarea este parțialӑ ȋn prezența clorurii de magneziu 1 M. Sunt virusuri foarte stabile la ph-uri acide ( ȋncepȃnd cu 2,5 ) ceea ce ilustrazӑ o perfectӑ adaptare la mediu : enterovirusurile trebuie sӑ treacӑ prin mediul acid din stomac ȋnainte de a ajunge ȋn zonele primare de replicare din intestin.

Determinanți antigenici

Proprietӑțile antigenice ale virusurilor au permis dezvolatarea principalelor metode de diferențiere a acestora, implicit de identificare și clasificare. Trebuie sӑ se tinӑ seama de sistemul de identificare serologicӑ, bazat pe antigenitatea virusurilor. In plus, ȋn cadrul profilaxiei maladiilor provocate de infecții cu enterovirusuri, va trebui sӑ se ținӑ seama ȋntotdeauna de antigenitatea acestora pentru prepararea vaccinurilor.

Una din caracteristicile familiei Picornaviridae este un numӑr impresionant de serotipuri ( peste 200 ) . Serotipul este definit cu ajutorul unui antiser monospecific care este capabil sӑ neutralizeze infectivitatea viralӑ. Antiserul este produs prin imunizarea unui animal care nu a fost expus anterior infecției cu virusul care este investigat. Statusul antigenic al unui virion integru poate fi conservat și ȋn cazul unei particule virale, a cӑrei infectivitate a fost abolitӑ ȋn urma tratamentului cu formaldehidӑ. Acesta este principiul de preparare al vaccinului polio inactivat ( VP1 ) . Diverse tratamente fizice sau chimice determinӑ o denaturare a virusului, incapabil de a se mai adsorbi pe celula gazdӑ. El prezintӑ un status antigenic modificat care este putin specific decȃt cel al virusului ȋn stare nativӑ deoarece proteinele de la suprafața virusului au o conformație modificatӑ. ( Minor et.al. , 2000) de aceea, metodele care se bazeazӑ pe identificarea

virusurilor dupa astfel de tratamente ( ex: tehnicile imunochimice ca: Elisa sub imunoblot) trebuie completate cu alte tehnici mai fiabile.

Localizarea situsurilor antigenice de la suprafața virionului este de importanțӑ majorӑ pentru ȋnțelegerea mecanismelor de neutralizare viralӑ precum și a bazelor moleculare ale diversitӑții serotipuilor. Una dintre principalele caracteristici ale enterovirusurilor este numӑrul im presionant de serotipuri ( 64 pana ȋn prezent ) . Situsurile antigenice sunt reflectate de secvența proteinelor structurale recunoscute de cӑtre sistemul imun al

unui animal injectat cu antigenele virale și sunt capabile sӑ inducӑ anticorpi care neutralizeazӑ infectivitatea virionului nativ. Caracterizarea mutatiilor de poliovirus care au rezistat la neutralizarea cu anticorpi monoclonali precum și a structurii tridimensionale a capsidei au permis localizarea situsurilor antigenice de neutralizare ȋn proteinele VP1, VP2 și VP3, la nivelul buclelor hidrofile expuse la suprafața particulei virale. Secvențele de aminoacizi implicatii ȋn eptopi de neutralizare sunt grupate ȋn trei situsuri antigenice de neutralizare : situsurile 1,2,3 , ultimul fiind divizat ȋn trei domenii 3a, 3b, 3c ( Hogle & Filman, 1989 ; Mateu, 1995; Minor et.al., 1986 ; Page et.al., 1988)

Cele mai multe situsuri antigenice de neutralizare sunt de fapt epitopi discontinui. Aceștia sunt compuși fie din secvențe peptidice scurte și cel mai adesea necontinue, fie din secvențe situate pe proteine diferite de capsidӑ. Diferențele de conformație cele mai semnificative ȋntre serotipurile de polivirus sunt localizate la nivelul buclelor. Astfel, existӑ o diferențӑ importantӑ de conformație la nivelul buclei B-C din VP1. Aceasta este mult mai expusӑ ȋn cazul poliovirusului de tip 3 Sabin. O mai bunӑ accesibilitate a sa ar putea fi responsabilӑ de imunodominanța situsului antigenic 1. Aceastӑ buclӑ B-C este supusӑ unei variații intense de secvențӑ ( modificӑri de lungime prin inserții sau deleții) , ȋntre enterovirusuri aparținȃnd unor grupuri taxonomice diferite și constituie , probabil, o structurӑ importantӑ ȋn diversificarea enterovirusurilor.

Deși situsurile antigenice au fost intens studiate pentru poliovirusuri, cele ale altor enterovirusuri sunt ȋnca puțin cunoscute. Probabil cӑ structura antigenicӑ a acestora este asemӑnӑtoare cu cea a poliovirusului. Construcția de virusuri himerice coxsackieivirus B3/B4 a permis identificarea unui situs antigenic de neutralizare specific de serotip la nivelul buclei B-C din VP1 la coxackie B4 ( Reimann et.al., 1991 ) totuși , aceastӑ caracteristicӑ nu se poate extinde la totatlitatea enterovirusurilor. Analiza antigenicӑ a virusului coxackie A 9, a revelat faptul cӑ anumite situsuri antigenice corespund cu

localizarea situsurilor 2 si 3 de la poliovrus , dar nici un epitop de neutralizare nu a fost similar situsului antigenic 1 ( Pulli et.al., 1998 ) .

Patogenitatea, capacitatea virusurilor de a induce manifestӑri clinice ȋn organismele infectate, este rezultatul unor interacțiuni complexe la care participӑ factori implica manifestӑri clinice ȋn organismele infectate, este rezultatul unor interacțiuni complexe la care participӑ factori implicați ȋn carcteristicile biologice, biochimice și genetice ale virusului, pe de o parte, și reactivitatea gazdei, pe de altӑ parte. Boala se manifestӑ clinic dacӑ funcții importante sau vitale ale unor grupe de celule sunt afectate de replicarea viralӑ. In general, nu toate celulele și țesuturile din organismul infectat sunt sensibile fațӑ de infecția viralӑ. Tropismul unui virus pentru o celulӑ gazdӑ reprezintӑ, ȋn primul rȃnd, o interacțiune ȋntre componentele de suprafațӑ ale virusului și receptorii de la nivelul membranei celulelor infectate. De aaemenea ,ȋn acest proces intervin și molecule intracelulare necesare multiplicӑrii virale,

Receptorii celulari

Evenimentul inițial din ciclul infecțios al virusurilor este adsorbtia pe membrana celularӑ unde se gӑsesc receptorii specifici. Enterovirusurile, care induc o patologie foarte diversӑ, recunosc diferiți receptori celulari, ȋn ciuda unei anumite unitӑți strcturale

și genetice. Unele variante mutante se multiplicӑ ȋnsӑ ȋn celule care nu sunt permisive pentru tulpinile parentale, ceea ce reflectӑ o anumitӑ flexibilitate a interacțiunii dintre virus și gazdӑ. Probabil cӑ aceasta reprezintӑ o strategie viralӑ pentru a permite o mai mare variabilitate a tropismului celular și o paletӑ mai largӑ de gazde, dȃnd sanse mai mari supraviețuirii genului viral ( Evans & Almond, 1998 ). In plus receptorii nu ar fi responsabili numai de fixarea virusului la suprafața celulei gazda ci ar putea interveni și ȋn etapele precoce ale ciclului viral ( decapsidare și eliberarea ARN viral ȋn celulӑ).

Receptorul poliovirusului ( PVR ) este prezent numai pe suprafața anumitor celule de primate. Gena care codificӑ pentru PVR uman se gӑsește pe cromozomul 19. ( Koike, et.al., 1990 ) . Acest receptor specific este o glicoproteinӑ din familia imunoglobulinelor ( Mendelsohn, et.al., 1989 ) , al cӑrei rol fiziologic nu este ȋncӑ cunoscut. Existӑ patru isoformeare PVR uman ( douӑ forme membranare( α și δ), care funcționeazӑ ca receptori și douӑ forme secretat ( β și γ) care nu sunt funcționale pentru infecția viralӑ. Aceastӑ moleculӑ, puternic glicozilatӑ, comportӑ trei domenii extracelulare cu o configurație de tip V2-C2-C2, o regiune transmembranarӑ și un domeniu intracelular. A fost demonstrat faptul cӑ cel care interacționeazӑ cu particula viralӑ este domeniul V2 ( Kolike, et.al., 1991 ) . Cu ajutorul anticorpilor monoclonali, care au blocat infecția viralӑ a unor celule, au putut fi identificați receptori potențiali, ai altor enterovirusuri, astfel receptorul celular pentru echovirus ( acum recunoscuți ca fiind un singur serotip ) a fost identificat ca fiind integrina VLA-2 , ai cӑrei liganți naturali sunt colagenul și

laminina ( Bergelson et.al., 1992 ). Aceeasi autori au demostrat ca infecția celulelor de cӑtre acest echovirus depinde de subunitatea α2 din VLA-2. Integrinele, glicoproteinele membranare heterodimerice, sunt moleculele responsabile de adeziunea intercelularӑ și de interacțiunile celulelor cu matricea extracelularӑ, dar și de atașarea viralӑ la celule și infectarea acestora. Un prim motiv identificat din proteinele matricei extracelulare care interacționeazӑ cu integrinele este tripeptidul RGD. Nu ȋntamplӑtor, coxackievirus A9

prezintӑ o inserție de 17 aminoacizi la extremitatea C-terminalӑ a proteinei de capsidӑ VP1 care include și motivul RGD. ( Rovainen, et.al., 1991 ), au demontrat ca peptidele sintetice care conțin motivul RGD blocheazӑ atașarea virusului coxsackie A9 pe celule, ceea ce sugereazӑ faptul cӑ o integrinӑ servește ca receptor pentru acest virus. Este vorba de integrina αv β3 ( pentru care ligandul natural este vitronectina ), receptorul celular pentru Coxackievirus A9 ( Rovainen , et.al., 1994 ). A fost demostratӑ existența

unor receptori suplimentari pentru CV-A9 ( β2 microglobulina și o proteinӑ de 70 KDa asociatӑ CMH de tip 1 ), necesari ȋn evenimentele de internalizare ( Triantafilou , et.al., 2000 ). A fost sugerat și faptul cӑ β2 microglobulina reprezintӑ un cofactor ȋn etapele precoce ale ciclului viral pentru echovirus 7 ( Ward, et.al, 1998 ), integrina αv β3 este moleculӑ candidatӑ și pentru receptorul celular al echovirusului 9 Barty. Aceastӑ secvențӑ RGD ar putea explica caracterul patogen al acestei tulpini pentru șoriceii nou-nӑscuți, motiv care lipsește din capsida tulpinii nepatogene de Echovirus 9.

Pentru numeroase tulpini de echovirus ( E 3, 6,7,11-13, 19-21, 24, 25, 29, 30, 33 ) ca și pentru anumite coxackievirusuri B ( CV-B1, B3 și, B5 ), pentru coxackie virus A 21 sau pentru enterovirus 70, unul din elementele complexului de receptori ar fi format din molecula DAF ( ,, Decay Accelranting Factor sau CD 55) . DAF intervine ȋn reglarea activitӑții complementului și ȋn semnalizarea intercelularӑ. Exprimarea sa este ubicvitara, inclusiv pe eritrocite, ceea ce explicӑ fenotipul hemaglutinant al enterovirusurilor care utilizeazӑ acest receptor. DAF este o glicoproteinӑ de 70 KDa și este definitӑ prin șase domenii: patru regiuni SCR ( ,, Short Consensus Repeat’’) de aproximativ 60 aminoacizi, o regiune bogatӑ ȋn serinӑ/treoninӑ și o regiune C-terminalӑ membranarӑ, fixatӑ covalent pe un acid gras. Regiunea SCR-1 este necesarӑ pentru interacțiunile cu CV-A21, EV-70 și mai general cu Human Enterovirus C si D, pe cȃnd regiunea SCR-4 este necesarӑ pentru Human Enterovirus B . Dar exprimarea sa la suprafața celulei nu este suficientӑ pentru ca infecția sӑ aibӑ loc.

In ultimii ani, numeroase lucrӑri au arӑtat cӑ virusurile ( inclusiv enterovirusurile nu utilizeazӑ un receptor celular unic ci , mai degrabӑ, un complex receptor compus din mai multe elemente cuprinzӑnd proteine de atașare și molecule accesorii ( Evans& Almond, 1998) . In lumea virusurile, enterovirusurile manifestӑ cea mai mare diversitate privind tipul de receptor. Acest lucru este ilustrat foarte bine de coxackievirusurile B,

capabile sӑ utilizeze cel puțin trei receptori diferiți ( CD55, CAR și o proteinӑ mambranarӑ din familia nucleolinelor ). Pentru receptorii ale caror funții rӑmȃn a fi determinate ( de ex: CAR și PVR uman ), remarcabil este faptul cӑ aceștia reprezintӑ molecule din familia imunoglobulinelor și deci, susceptibile sӑ joace un rol ȋn imunitate. Alegerea unei familii de proteine comunӑ pentru mai multe virusuri ar putea fi consecința unei presiuni selective ȋn timpul evolutiei enterovirusurilor.

MULTIPLICAREA VIRALA

Ciclul complet de multiplicare a enterovirusurilor este unul dintre cele mai scurte si durează in vitro aproximativ 8 ore. Având o localizare exclusiv citoplasmatică, ciclul viral este inițiat prin fixarea virusurului pe receptorul celular și se termină prin liza celulei infectate și eliberarea virionilor nou formați. Studiul poliovirusului – prototipul

enterovirsurilor – a furnizat ansamblul elementelor care au permis înțelegerea ciclului

de multiplicare enterovirală.

Etapele precoce: adsorbția, pătrunderea și decapsidarea

Pentru inițierea ciclului de relicare, virusul trebuie sa interacționeze cu receptorul celular și să elibereze acidul nucleic în compatimentul celular adecvat. Dar mecanismul prin care enterovirusurile introduc ARN în celula țintă ramâne controversat. In general este admis faptul că interacțiunea enterovirusurilor cu receptorul lor specific antrenează modificări conformaționale importante ale particulei virale. La temperatură fiziologică, aceste intercțiuni determină aparitia unor particule stabile numite A ( 135S), mult mai hidrofobe decât particulele native și capabile de internalizare celulară. Această structură intermediară de 135S este obiect al unor controverse: Dove și Racaniello au sugerat ca formarea nu pare absolut necesară infecției virale productive, iar Curry et al. au arătat că aceste particule, spre deosebire de particulele native, pot infecta celule care nu exprimă receptorul. Totuși date recente pledează în favoarea rolului de intermediar al particulei 135S pentru intrarea virusului în celulă. Acești autori propun chiar o etapă suplimentară in procesul de intrare, care ar avea loc după formarea particulei 135S și ar fi asociată cu

eliberarea ARN. Schimburile conformaționale ale capsidei virale sunt, în principal, caracterizate prin pierderea proteinei VP4 și prin externalizarea extremității N-terminale hidrofobe a proteinei VP1, antrenând astfel reducerea coeficientului de sedimentare de la 160S al virionului intact la 135S pentru particula modificată. Această particulă modificată, care prezintă o mai mare afinitate pentru membrane, a fost propusă ca intermediar obligatoriu în mecanismul internalizării virusului. Într-adevăr, aceste schimbări conformaționale par a fi indispensabile decapsidării, care începe imediat ce virusul este adsorbit pe membrana celulară.

Multiplicarea la enterovirusuri

Dintre particulele adsorbite, 50% sunt internalizate, restul sunt eliberate în mediul extracelular prin procesul numit eluție.

Particulele neeluate intră în celulă fie pătrunzând direct prin membrana celulară dupa legarea de receptor, fie printr-un mecanism de endocitoză mediată de receptorul celular.

În acest ultim caz, acidifierea endozomului nu este necesară pentru decapsidare și pentru trecerea genomului viral prin membrana endozomală. S-a sugerat ca translocarea ARN viral in citoplasma celulei infectate ar putea să se realizeze prin formarea unor pori trans-membranari apăruți prin inserția extremității N-terminale a VP1 și, eventual, a

proteinei VP4 miristilate. Acest model a fost susținut prin detectarea unui canal ionic, după punerea în contact a particulelor virale cu membrane lipidice.

Sinteza virală: translația si replicarea genomului viral

După eliberarea ARN în citoplasmă, acesta este tradus direct de către aparatul translațional al celulei gazdă. Proces anticipat de clivarea proteinei VPg din extremitatea 5’a genomului de către o protează de origine celulară. Spre deosebire de ARN de la eucariote, genomul enterovirusurilor nu prezintă o structură ,,cap’’ sau ,,bonetă’’ ,etilată la extremitatea 5’. Inițierea translației se face printr-un mecanism numit ,,inițiere internă’’: subunitatea 40S a ribozomului recunoașteun segment cu o structură secundară particulară al regiunii 5’NC, IRES, care este localizat cu 150 de nucleotide situate în amonte de codonul start. Subunitatea 40S migrează apoi până la primul AUG care se găsește intr-un context favorabil inițierii translației. Se pare că buna funcționare a codonului start necesită prezența în amonte a unui tandem constituit dintr-o secvență bogată în pirimidină și intr-un AUG criptic. Este interesant de notat că regiunea 5’NC conține 6-8 codoni AUG care nu sunt utilizați pentru inițierea translației. În plus fată de

factorii ,,clasici’’ ai ințierii, activare translației virale necesită o serie de factori celulari, care se fixează specific pe structuri secundare din regiunea 5’NC, cum sunt autoantigenul LA( p52), ,,polypyrimidibe-tract-binding protein’’ (PTB), factorul eucariot de inițiere a translației eIF- 2α și ,, poly (rC)-binding protein 2’’ ( PCBP2).

Aceste proteine care se leagă de ARN ar acționaca molecule ,, chaperones’’ care ar menține IRES în conformația necesară pentru interacțiunea cu sistemul translațional celular, în special cu eIF- 2α . Așa cum a fost deja descris, genomul enterovirusurilor este în final translat într-o singură poliproteină, care este clivată cotranslațional de către

proteazele virale neosintetizate – 2Apro, 3Apro și 3Cdpro, pentru a da naștere proteinelor de capsidă și celor nestructurale.

În momentul în care suficiente proteine virale au fost sintetizate, se produce o basculare de la translație la replicarea genomului viral, în principiu aceste două fenomene neputând avea loc simultan. Gamarnik și Andino au propus existența la

nivelul structurii în treflă din 5’NC a unor semnale care controlează atât translatia cât și replicarea virală, prin formarea unor complexe ribonucleoproteice. In acest model, interacțiunea dintre PCBP celulară și această structură ar favoriza traslația. După sinteza precursorului viral 3CD, aceasta se leagă de structura treflată și înhibă astfel translatia în favoarea sintezei actenei de ARN de polaritate negativă.

Mecanismul replicării genomului enterovirusurilor este încă puțin înteles. In celulele normale nu este cunoscută o activitate de tip ARN polimerază dependentă de ARN. ARN polimeraza virală 3Dpol este strict necesară oentru virus. Totuși, această enzimă nu este suficientă și replicarea necesită nu numai proteine virale nestructurale dar și anumite proteine celulare.

Procesele replicative au loc în citoplasmă, la suprafața externă a veziculelor formate din organite celulare cum sunt: reticulul endoplasmic, aparatul Golgi și lizozomii. Aceste vezicule sunt probabil induse de proteinele virale 2BC și/sau 2C și se organizează în rozete în jurul complexelor de replicare. Aceste complexe sunt constituite din membrane celulare netede, molecule matrice de ARN, molecule în curs de a fi sintetizate, moleculele de polimerază virală 3Dpol, alte proteine virale și din alți

factori celulari. Replicarea începe prin sinteza unei catene de ARN negativ, complementar genomului viral; acesta va servi apoi la rândul său ca matrice pentru sinteza numeroaselor molecule de ARN de polaritate genomică pozitivă. În citoplasma celulei infectate se mai găsesc forme replicative (RF), constituite din actene pozitive și negative ca hibrizi în dublu helix precum și forme intermediare de replicare ( RI),

constituite dintr-o matrice asociată cu mai multe catene de polaritate opusă în curs de sinteză.

Este în general admis că numai regiunile 5’NC și 3’NC ale genomului sunt implicate în mecanismele de inițiere a replicării, grație structurilor secundare și a prezenței semnalelor de repliacare care acționează in cis, numite cre. Extremitatea 3’ ( oriR) ar interveni în inițierea în cis a sintezei catenei negative, iar extremitatea 5’ ( oriL) ar fi necesară pentru inițierea în trans a replicării catenei pozitive. Totuși, o regiune de tip cre a fost recent identificată și în regiunea care codifică pentru proteina 2C .

Etapele tardive: morfogeneza și eliberarea vironilor.

Etapa inițială a morfogenezei virale este eliberarea procursorului miristilat P1 al poliproteinei in urma activității autocatalitice a proteinei 2Apro. Precursorul P1 suferă apoi o clivare de către proteaza 3CD, pentru a da naștere proteinelor de capsidă VP0, VP1 și VP3. Procesul de asamblare virală poate astfel să înceapă: proteinele structurale se asociază pentru a forma un protomer care sedimentează la 5S și care este cea mai mică sub-unitate a capsidei. Cinci protomere se combina apoi pentru a forma sructura pentamerică de 14S. Urmează asamblarea a 12 pentamere care formează procapsida de 75S. Etapa următoare este unirea ARN viral cu capsida imatură pentru a constitui o particulă instabilă, provirionul de 125S.

O ultimă etapă de maturare este necesară pentru formarea virionului infectant, în care precursorul VP0 este clivat în VP4 și VP2 printr-un mecanism probabil autocatalitic. Această clivare și încapsidarea ARN declanșează un rearanjament structural care este un proces specific, în sensul că nici un alt tip de ARN viral sau celular nu poate fi încapsidat. Specificitatea s-ar putea explica prin cuplarea funcțională dintre morfogeneză și replicarea virală.

Asamblarea odată realizată, particulele mature se acumulează în citoplasma celulelor infectate sub forma unor incluziuni cristaline, după care sunt eliberate prin spargerea vacuolelor la suprafata celulelor. Eliberarea masivă de virioni nou sintetizați este concomitentă cu liza celulei, în care proteina virală 2B ar putea juca un rol important.

EPIDEMIOLOGIA

Transmiterea este in general de tip fecal-oral, difuzarea virusurilor fiind sporadică, endemică, epidemică și chiar pandemică, cu predilecție pentru senzorul vară-toamnă în regiunile temperate. Anumite serotipuri domină și circulă simultan timp de mai mulți ani, apoi scad ca frecvență, revenind după un timp pentru initierea unor noi epidemii. Serotipurile dominante sunt insă imprevizibile de la un an la altul.

Moduri de transmitere

Sunt cunoscute moduri de transmitere a enterovirusurilor, fiecare influentând în mod diferit caracteristicile epidemiologice ale infecției provocate. Schema principală de difuzare a enterovirusurilor este contaminarea fecalo-orală, fiind confirmată în primul rând în țările în curs de dezvlatare unde condițiile sanitare sunt precare dar și în anumite comunități din țarile dezvoltate cum sunt creșele și școlile. De fapt, enterovirusurile de

transmit de la individ la individ prin intermediul mâinilor contaminate, a obiectelor, a alimentelor lichide sau solide stropite cu salivă sau prin materii fecale. În contextul conjunctivitelor hemoragice acute provocate de enterovirus 70 sau de coxackievirus A24, secrețiile înalt infecțioase se transferă prin intermediul mâinilor și chiar prin instrumentar oftamologic insuficinet sterilizat. Calea aeriană poate să joace și ea un rol în transmiterea unor serotipuri cu tropism pentru tractul respirator. Nu este de neglijat nici transmiterea oral-orală la populații cu nivel socio-sanitar ridicat.

Epidemiologia moleculară

Epidemiologia moleculară permite recunoașterea tulpinilor diferite din aceeași specie, provenind din circumstanțe epidemiologice cariate, pe baza polimorfismului genetic. Dintre mecanismele care determină polimorfismul genetic, mai importante sunt variabilitatea naturală determinată de polimeraze (în special ARN polimeraze) și modificările genetice (deleții, inserții, recombinări, trasnlocații).

De cativa ani, epidemiologia virusurilor s-a imbogățit cu o serie de tehnici moleculare noi care permit caracterizarea diferențelor genetice și antigenice între diferite izolate. Aceste tehnici recente, fac posibile investigații privind originea și evoluția tulpinilor, avănd astfel implicații în prevenirea anumitor boli enterovirale cu importanță deosebită pentru sănătatea publică.

In același timp, epidemiologia moleculară permite ameliorarea metodelor de diagnostic și terapeutice precum și identificarea unor markeri genomici (de exemplu secvențele din genom care pot fi asociate cu o creștere a virulenței sau cele implicate în modificările către fenotipuri patogene).

PATOGENEZA

Poarta de intrare a enterovirusurilor este calea orală (cu excepția enterivirusurilor asociate cu conjuctivitele). Situsurile primare ale replicării virale sunt mucoasele faringiană și intestinală, virusurile ajungănd în intestin după ce au trecut de bariera stomacală în virtutea rezistenței lor la pH acid.

Enterovirusurile traversează bariera intestinală prin celulele M din structurile limfoide de la nivelul plăcilor Peyer. Această fază digestivă din intestinul subțire ar fi urmată de o fază limfatică prin care virusul ajunge în ganglionii cervicali șî mezenterici. Faza viremică ce urmează ar putea fi întreținută prin invadarea acestor ganglioni, precum și a altor țesuturi. Viremia tranzitorie este, din punct de vedere clinic, silenționasă sau este însoțită de semne clinice nespecifice cum sunt vomă, febră, dureri în gât, etc. După ce virusul trece în sânge, acesta se multiplică în celulele sistemului reticulo-endotelial apoi ajunge în organul țintă. Perioada de incubație, acoperind toate aceste faze, este în general de 7 la 14 zile, dar poate fi și de 2 la 35 de zile. După apariția semneleor clinice, care reflectă leziuni la nivelul organelor țintă, virusul dispare destul de repede din orofaringe, dar multiplicarea intestinală poate persista cu o excreție virală prin materiile fecale, timp de mai multe săptămâni. Fiecare tip de enterovirus are propriul său organ țintă: creier, inimă, mușchi, piele, etc. Izolarea enterovirusurilor se face din diferite tipuri de probe clinice: fecale, secreții faringiene, lichid cefalo-rahidian ( LCR), maduva spinării, creier, inimă, sânge, secreții oculare (conjunctivite) sau din leziuni ale pielii sau ale mucoaselor. Poliovirusul infectează sistemul nervos central (SNC) și astfel trebuie să traverseze bariera hemato-encefalică, fie direct, fie prin infectarea celulelor endoteliale . Deși calea sangvină rămâne ipoteza privilegiată pentru a se explica pasajul poliovirusului către SNC, s-a propus și ipoteza migrării virusului pe cale nervoasă prin nervii periferici. Ținta preferențială a poliovirusului este neuronul motor periferic din coarnele anterioare ale maduvei spinării sau din echivalentele lor de la nivelul trunchiului cerebral. Distrugerea neuronului motor periferic determină paralizia musculară flascăa zonelor dependente topografic de neuronii distruși. Infecțiile simultane de către mai multe serotipuri de enterovirusuri sunt posibile, dar pot apărea competiții la nivelul intestinului între diferitele virusuri.

Patogeneza enterovirală descrisă astfel, cu referire la o infecție acută, este cea adoptată în mod clasic, dar se cunosc șî câteva excepții. Enterovirozele cronice și conjunctivita hemoragică acută nu corespund schemei prezentate. În conjuctivita hemoragică acută, contaminarea este directă, pe cale conjunctivală și incubarea este de 24 la 48 de ore. Virusul are o temperatură optimă de replicare mai scăzută, de 33-35 °C și se izolează din secrețiile conjunctivale și din oro-faringe, dau nu șî din materii fecale.

Enterovirusurile sunt o cauza destul de frecventa de encefalita acuta virala, diagnosticul etiologie este dificil, dozarea de IgM care stabileste diagnosticul de infectie acuta nefiind efectuata intotdeauna. Un rol important il are si deficitul de IgA, precum si valoarea scazuta a complementului seric care sunt factori esentiali in mecanismele de aparare. De altfel, copiii cu diferite deficiente ale sistemului imunitar sunt predispusi la infectii cu enterovirusuri, difera atat de serotipul implicat dar mai ales de statul imun al gazdei. Este de remarcat aparitia ambelor episoade in luna august, perioada de incidenta maxima a infectiei cu enterovirusuri.

Particularitatea cazului Encefalita acuta cu enterovirusuri ( ECHO si Cocsackie), manifestata prin ataxie cerebeloasa, repetata la un interval de un an, la un copil cu deficit imunologic IgA pe fond de valori scazute ale complementului seric, cu raspuns favorabil la tratamentul patogenic si simptomatic aplicat.

CAPITOLUL II

TEHNICI DE BIOLOGIE MOLECULARA

I. Reacția de polimerizare în lanț ( PCR)

1. Generalitãți:

Reacția de polimerizare în lanț ( polymerase chian reaction, PCR), este o metodã de sintezã ADN in vitro, prin care o anumitã secvențã din aceasta este amplificatã în mod specific. Principalii reactanți care intervin în procesul de amplificare sunt:

primerii /amorse sunt douã oligonucleotide cu secvența complementarã capetelor 3’ ale fragmentului de ADN țintit, orientarea lor permițând sinteza secvenței din regiunea pe care o delimiteaza.

Deoxinucleozid trifosfații aceștia fiind unitãțile constitutive ale acizilor deoxiribonucleici, respectiv dATP, dCTP, dGTP, dTTP

ADN polimeraza termorezistentã , aceasta fiind enzima care catalizeaza construirea catenelor complementare prin extensia primerilor

Reacția se desfașoarã într-un tampon care contine Tris-HCl, KCl, MgCl2

( concentrația optimã de Mg2+ variind între 1-10 mM) și alți aditivi ( gelatina , tween 20, Nonidet P-40, Triton X-100) .

Reacția de PCR se desfașoarã pe parcursul a mai multor cicluri ( 25-45), fiecare constituit din trei etape:

denaturarea ADN se realizeazã prin expunerea la temperaturi de 94-95oC

hibridizarea primerilor la monocatenele ADN , se realizeazã la temperaturi de

45-68oC

3. extensia primerilor la capãtul 3’, respectiv sinteza de ADN la temperatura de

72oC,temperatura optima de activitate a Taq-polimerazei.

Rezultatul acestui proces ciclic repetat este o crestere exponențialã a numãrului total de fragmente ADN care includ secvențeledintre primeri PCR utilizați. Teoretic amplificarea finalã a matriței ADN țintã este de 2n, unde n reprezintã numãrul de cicluri PCR.

Produsul de reacție ( amplicon) cumuleazã dimensiunea celor doi primeri și a secvenței dintre ei. El poate fi identificat, respectiv verificat ca specificitate, în mai multe moduri. Cel mai frecvent se recurge la aprecierea lungimii sale precis definitã ( vizualizare in UV, dupã migrare în gel de agarozã și colorare cu bromurã de etidiu), exprimatã în perechi de baze azotate ( bp) și comparatã cu un martor de greutate molecularã. Acestei analize i se poate adãuga evidențierea perezenței anumitor situsuri de restricție, prin digestia ampliconului cu endonucleaze de restricție . Identificarea prodului PCR se poate face și prin hibridizarea lui cu o sondã specificã sau prin secvențiere.

Optimizarea parametrilor reacției PCR este de cea mai mare importanțã pentru sensibilitatea si specificitatea reacției.

2.Componentele reacției:

2.1. Matrița ADN

Proba PCR trebuie sã fie un ADN monocatenar sau dublucatenar, liniar sau circular. Puritatea ADN folosit ca matrițã reprezintã un factor deosebit de important ( o probã infectatã cu cantitãți mari de ARN va dispune de o activitate scãzutã a ADN polimerazei în reacție , ARN fiind rãspunzãtor de chelatarea ionilor de Mg2+ ). Cantitãțile recomandate pentru o reacție PCR sunt: maximum 500 ng pentru ADN genomic uman, 1-10 ng pentru ADN bacterian și 0,1-1 ng ADN plasmidial.

Primeri oligonucleotidici

In general dimensiunea primerilor utilizați în reacțiile PCR este cuprinsã între 15-30 nucleotide ( folosirea unor primeri mai lungi de 30 nucleotide duce la creșterea

specificitãții). De regulãprimerii sunt cinstituiti astfel încât sã aibã complementaritate perfectã sau aproape perfectã cu capetele 5’ și repspectiv 3’ a matriței de ADN. Este recomandat ca primerii sã aibã un procent molar de citozinã ( C) + guaninã ( G) cuprins între 40-60% și sã aibã o distribuție echilibratã a celor patru baze. Primerii nu trebuie sa fie complementari între ei ( pentru a nu dimeriza), sã nu prezinte secvențe cu complementaritate intracatenarã ( sã nu formeze structuri secundare interne) și sã aibã valori ale Tm ( temperatura de topire) identice sau foarte apropiate. Se recomandã ca cei doi primeri sã aibã Tm cuprins între 55-65oC ( pentru creșterea specificitãții se impun temperaturi de atașare ridicate: 62-65o C)

Concentrația optimã de primer e cuprinsã între 0,1 și 0,6 μM. Concentrații prea mari de primer duc la obținerea produșilor nedoriți.

ADN polimerazele termostabile

Inițial, pentru reacția PCR s-a utilizat fragmentul mare al ADN polimerazei I de la Escherichia coli – fragmentul Klenow. Marele avantaj al acestei enzime ers faptul ca se inactiva la temperaturile ridicate ale etapei de denaturare. Ca urmare, la fiecare ciclu de replicare trebuia adãugatã o nouã cantitate de enzimã în tubul de reacție.

In prezent toate reacțiile PCR folosesc ADN polimerazele termostabile derivate ( în urma manipulãrii genetice) de la variantele naturale, izolate din microorganisme termofile. Cantitatea optimã de polimerazã utilizatã este cuprinsã între 0,5-2,5 unitãți / 50 μl volum de reacție. ADN polimerazele ADN dependente termostabile se împart în mai multe clase:

Clasa Taq

Taq polimeraza -izolatã din microorganismul Thermus aquaticus. Temperatura optima de activitate este de 75-78 oC, iar la temperaturi de peste 90oC, activitatea sa

scade semnificativ. Polimerizeazã cu o vitezã de aproximativ 150 nc/ secundã. Are o activitate de polimerizare ( în direcția 5’→ 3’ ) și exonucleazicã în aceeași direcție. Este însã lipsitã de activitate exonucleazicã în direcția 3’→5’, responsabilã de citirea și încorporarea corectã a dNTP ( nu are activate proofreading). Reacția PCR mediatã de aceastã enzimã are loc în trei trepte ( atașarea primerilor și polimerizarea au loc la trepte diferite de temperaturã).

Ampli-Taq – ADN polimeraza recombinantã obținutã prin exprimarea unei forme modificate a genei de Taq pot din E.coli. Se activeazã la temperatura de 55-750C ( proprietate ce determinã simplificarea reacției PCR de la trei trepte de temperaturã la douã trepte ). Are o stabilitate mult mai mare la temperaturi de peste 90oC și prezintã în plus activitate exonucleazicã 3’→5’ ( crește specificitatea de încorporare a nucleotidelor)

Fragmentul Stoffel – este reprezentat de un Ampli-Taq trunchiat la capãtul N-terminal. Fragmentul excizat find responsabil de activitatea exonucleazicã 3’→5’, absența lui mãrește mult viteza de polimerizare, Temperaturi de polimerizare: 55-60oC. Este de doua ori mai stabilã decât Ampli-Taq și iși pãstreazã activitatea optimã pe o plaja mare de concentrații de Mg2+. Se utilizeazã în PCR cu douã trepte.

Clasa Vent și Deep Vent

Vent pol – izolatã din Thermococcus litoralis, bacterie ce trãiește în izvoarele marine calde. Temperatura optimã : 55-60oC și desfãșoarã ambele tipuri de activitate exonucleazicã ( 3’→ 5’ și respectiv 5’→3’ )

Vent pol ( exo)- similarã cu Vent pol, dar nu are activitate exonucleazicã 5’→3’

Deep Vent pol – izolatã dintr-o tulpinã de Pyrococcus, din izvoarele marine calde de mare adâncime. Temperatura optimã: 55-60oC și desfãșoarã ambele tipuri de activitate exonucleazicã, dar este mai rezinstentã decât Vent pol și Ampli Taq pol la temperaturi mai mari de 100oC.

Deep Vent Pol ( exo) – similarã cu DEP Vent pol, dar nu prezintã activitate exonucleazicã 5’→3’.

Clasa ADN polimerazelor ambivalente termostabile

rTth pol – ADN polimerazã recombinantã. Caracterul ambivalent constã în faptul cã poate fi folositã ca ADN polimerazã ARN dependentã în prezența MnCl2, dupã care, prin chelaterea ionilor de Mn2+ și adãugarea MgCl2, poate acționa ca ADN polimerazã ADN dependentã. Cantitatea optimã de enzimã utilizatã într-o reacție PCR este de 0,5-2,5 unitãți/ 50μl volum de reacție. Cantitãți crescute de enzimã sau timpi prelungiți de polimerizare pot genera artefacte, datoritã activitãții exonucleazice 5’→3’ a Taq pol.

Deoxinucleotid trifosfați ( dNTP)

DNTP ( dATP, dGTP, dCTP, dTTP ) sunt folosiți de polimerazã în etapa de elongare a PCR. În amestecul de reacție de introduc cantitãți echimoleculare din cele patru tipuri de dNTP ( în caz contar scade fidelitatea ADN polimerazei ). Cantitatea optimã utilizatã în PCR este de aproximativ 200 μm. Concentrații mai mari conduc la reducerea concentraiei de Mg2+ liber, influențând activitatea polimerazei și scade atașarea primerilor. Din acestã cauzã concentrația lor trebuie corelatã cu concentrația de Mg2+.

Tamponul de reacție

Tamponul de reacție conține : TRIS-HCl, pH=8,3, KCl, MgCl2, în soluție concentratã 10X care trebuie diluatã 1:10 ( v/v). Concentrația MgCl2 are o importanțã crucialã în reacție, ionii de Mg2+ fiind necesari pentru buna funcționare a polimerazei. Ionii de Mg2+ formeazã complexe solubile cu moleculele dNTP pentru a produce substratul propriu-zis recunoscut de adn apolimerazã. Un exces de Mg2+ va determina însã reducerea fidelitãții enzimei, creșterea valorii Tm și creșterea amplificãrilor nespecifice. Concentrația optimã intr-o reacție sã poatã fi optimizatã, existã și variante în care tamponul este livrat fãrã Mg2+, acesta fiind livrat separat.

Uleiul mineral

In cazul aparatelor fãrã capac încãlzit , un strat de ulei mineral care sã acopere amestecul de reacție este necesar, în vederea prevenirii evaporãrii volumului de reacție. Orice evaporare determinã o cocentrare a componentelor PCR și o descreștere a temperaturii.

3. Detectarea produșilor PCR

Cea mai utilizatã metodã de detecție este electroforeza în gel de agarozã sau poliacrilamidã. Se mai poate utiliza și Southern Blotting ( detectarea și identificarea produșilor PCR se realizeazã prin hibridizare cu sinde specifice marcate radioactiv sau neradioacvtiv).

Gel electroforeza- este ceam mai simplã metodã. Detectarea Produșilor PCR se realizeazã pe un gel de agarozã, de concentrație diferitã în funcție de lungimea fragmentului de amplificat. Gelul va fi marcat cu bromurã de etidiu, un colorant fluoreșcent ce se intercaleazã între perechile de baze ale ADN și favorizeazã vizualizarea benzilor carecateristice ampliconilor ( sub acțiunea UV). De asemenea, pe

gel se incarcã și un marker de greutate molecularã ( pentru identificarea fragmentului de interes), cât și martorii pozitivi și negativi.

De obicei, pentru vizulaizarea produșilor de amplificare este suficientã agaroza cu rezoluție standard . Pentru evidențierea produșilor mici se folosesc însã geluri de agarozã de înaltã rezoluție.

Contaminarea și evitarea contaminãrii în reația PCR

Potențiale surse de contaminare : probe biologice ( alt ADN ), metoda de colectare a probei, manipularea probei de mai multe persoane, utilizarea de reactivi și instrumentarul de laborator ( tuburi de reacție, pipete, tipsuri, termocycler, autoclav, centrifugi, gheațã, etc) contaminat, mediu de laborator sau aer condiționat.

Este important sã se realizeze controlul pozitiv și negativ pentru fiecare reacție PCR efectuatã. Prin martori negativi se verificã dacã reactivi sunt contaminați cu ADN , iar prin martorii pozitivi se verificã eficientã și specificitatea reacției PCR.

Evitarea contaminãrii este un lucru foarte important. Se realizeazã prin utilizareade hote de flux laminar și lampã de UV, utilizarea de mãnuși, tipsuri cu filtru, utilizarea de pipete diferite pentru mix și probã, reactivii PCR trebuie sã fie alicotați șî pãstrați la -20oC, orice material ce poate fi autoclavat trebuie sterilizat corespunzãtor.

Alte procedee de decontaminare : iradierea UV, tratamentul enzimatic,uracil N-glicolaza.

Tratamentul cu UV – ADN din tuburile PCR contaminate este degradat cu formarea dimerilor de timinã ( formã neamplificabilã ). Susceptibilitatea ADN de a fi distrus de radiații depinde și de: conținutul în pirimidine ( în special timinã ), lungimea țintei ADN , timpul de iradiere, lungimea de undã, energia.

Tratamentul enzimatic – se realizeazã cu DNA-ze și enzime de restrsicție care au situsuri de recunoaștere în ținta ADN. Acest lucru are ca dezavantaj introducerea de noi

pași în reacția PCR, ceea ce coduce la risculo crescut de contaminare și scãderea eficienței reacției PCR.

Uracil N-glicozilaza (UNG) – utilizatã pentru decontaminarea reacțiilor PCR înaintea realizãrii ciclurilor termice. dUTP se îndepãrteazã prin digestia enzimaticã cu uracil N-glicozilazã, ce se adaugã la mix ( fãrã Taq ). Atunci când reacțiile sut realizate în prezența UNG, se eliminã eventualiicontaminanți din reacțiile anterioare, ce conțin

uracil in moleculã. Metoda nu e utilizatã pentru toate polimerazele, deoarece nu toate încorporeazã dUTP atât de eficient ca Taq polimeraza.

3.2. Probleme ce apar în reacțiile PCR

a. Nici un produs nu este identificat sau este slab amplificat

Cauze posibile:

– reactie dezechilibratã → se recomandã recalcularea concentrațiilor finale a

componentelor PCR

ciclurile de amplificare → se recomandã revederea programului PCR sau creșterea

numãrului de cicluri

concentrația micã de matrițã→ se recomandã creșterea concentrației și verificarea

ei din punct de vedere calitativ

concentrația primerilor sau secvența lor → se recomandã optimizarea concentrației.

Verificarea secvenței iar dacã e necesar reconstruirea lui

– mix de reacție degradat sau incomplet → se reacomandã realizarea de controale pozitive pentru verificarea diecãrui component

temperatura de hibridizare prea mare → se recomandã reacalcularea Tm a primerilor și descreșterea temperaturii de hibridizare

temperatura de denaturare subotimalã → se recomandã optimizarea temperaturii de denaturare și durata acestei etape

timp de extensie suboptimal → se recomandã creșterea cu un minut a timpului de extensie.

b. Trene ( ‘’ Smiruri ‘’)

Cauze posibile și recomandãri :

amplificãri nespecifice → se recomandã verificarea concentrațiilor și a cilurilor de amplificare, optimizarea magneziului și a primerilor, descreșterea numãrului de cicluri, verificarea matriței, utilizarea procedeului hot start

c.Produși multimpli

Cauze posibile și recomandãri :

numãr mare de cicluri → se recomandã scãderea numãrului de ciluri

– temperaturã de hibridizare prea joasã → se recomandã creșterea temperaturii de

hibridizare

Specificitatea reacției

Condiții ce favorizeazã creșterea specificitãții : scãderea cantitãții de Mg2+, dNTP, Taq ADN polimeraza, primeri; scãderea numãrului de cicluri și scurtarea duratei etapelor ciclurilor; cresterea temperaturii de specificitate ; creșterea vitezei de rampã ; utilizarea de hot-star PCR , nested-PCR și touchdown PCR.

Specificitatea orocãrei reacții PCR depinde de specificitatea de legare a primerilor la matrițã, iar reacțiile se standardizeazã astefel încât sã se evite pãstrarea mixului mai mult decât este necesar, pânã la introducerea în Temal Cycler.

Variante de PCR

3.4.1.Hot start PCR – este o metodã prin care se separã unul sau mai multe componenete ale reacției, astfel încât toți compușii ce iau parte la reacție sa ia contact abia dupã denaturarea matriței. Se realizeazã separarea fizicã a componentelor, cu

ajutorul unui material ce funcționeazã ca o barierã inițialã, dar care se topește odata cu creșterea temperaturii, ceea ce duce la amestecul tuturor componentelor reacției la punctul START. Avantaj : se minimizeazã hibridizarea primerilor la ținte nespecifice și se reduce obținerea oligomerilor de primeri.

Touchdown PCR – temperatura de hibridizare este scãzutã progresiv în timpul ciclurilor de reacție, de la o valoare inițialã mai mare decât a TM, pânã la o valoare inferioarã acestuia. Acest lucru încurajeazã hibridizarea optimã a primerilor la secvența țintã, iar ampliconii urmãriți se vor acumula înaintea altor produși nespecifici.

Invers PCR – utilizat pentru amplificareaunor segmente de ADN cu secvențã necunoscutã ( ex: situsurile în care se inserã traspozomii sau genomul unor virusuri) . Secvența de ADN cunoscutã ( încadratã de secvențe necunoscute ) se selecționeazã cu endonucleaze. Molecula se circularizeazã și se introduce în PCR cu primeri complementari secvenței cunoscute. Se obține secvența necunoscutã.

Multiplex PCR- în reacție se introduce mai mult de o pereche de primeri, cu scopul de a detecta mai multe ținte

Real time PCR – sinteza ADN este detectatã pe mãsurã ce se produce. Cea mai simplã metodã folosește un colorant care , prin legare la ADN dublu catenar, emite fluorenșcențã proporționalã cu cantitatea de PCR acumulat. Avantaje : nu necesitã metode de detecție suplimentarã, aceasta având loc direct în tubul de reacție; se reduc șansele de contaminare ; se reduce durata experimentului.

RT-PCR – permite amplificarea ARN cu o etapã suplimentarã de revers transcriere de la ARN la ADN complementar ( ADNc). Pentru sinteza primei catene de

ADNc se pot folosi: primeri ,, random’’ , un primer complementar cu secvența ARN , primeri oligo(dT) care hibridizeazã pe secvența poli (A) de la capãtul 3’. Polimerizarea se realizeazã cu ajutorul unei reverstranscriptaze : rTth –ADN polimerazã ambivalentã ; AMV ( Avian Myeloblastosis Virus ) – are activitate endonucleazicã și se

utilizeazã în scopul obținerii de fragmente mici de ADNc ; MMLV ( Maloney Murine Leukemia Virus ) – este lipsitã de activitate endonucleazicã și se utilizeazã pentru sinteza moleculelor mari de ADNc. Reacția are loc la temperatura ce poate fi ajustatã la o valoare între 37 oC și 55 oC ( în funcție de revers-trabscriptaza utilizatã ), în timp de 30 minute și este urmatã de o reacție obișnuitã de PCR. Aplicații : se analizeazã ARN mesager și virusuri ARN.

Aplicații ale tehnologiei PCR

Multe tehnici biochimice și genetice se bazeazã pe PCR, pentru cã de cele mai multe ori probele de ADN de analizat sunt în cantitãți insuficiente. Aplicațiile se încadreazã în douã categorii :

preparative –sintezã de ADN ( RT-PCR, clonare, sinteza și marcarea sondelor )

analitice – diagnosticul unor infecții umane sau a unor boli monogenice ; studii privind mecanisme genetice ce acompaniazã procese maligne sau chiar diagnosticul cancerului; biologia populațiilor; studii de taxonomie, sistematicã și filogenie molecularã; aplicatii în medicina legalã; amplificarea moleculelor de ADN preistoric.

Restricția enzimaticӑ

Enzimele de restricție , cunoscute și sub numele de endonucleaze de restricție, sunt responsabile de fenomenul restricție-modificare. Sistemele de restricție și modificare ( metilare) au fost descoperite în urma studiilor interactiilor bacteriofag-bacterie, în care s-a constatat cã o tulpinã bacterianã prezintã metilaze si endonucleaze care au aceeași

specificitate de secvențã ( metilaza va adãuga o grupare metil la aceeași secvențã care este recunoscutã de enzimele de restricție , astfelîncât în urm metilãrii un situs țintã

devine rezistent la restricție ) ( T.Vass, 2001 ). Metilarea reprezintã un mecanism de apãrare a celulei baxteriene fațã de propriile endonucleaze.

Endonucleazele de restricție sunt enzime care recunosc secvențe de ADN specifice, scurte, legarea fiind urmatã de clivare, fie la situsul de recunoaștere, fie la o distanțã oarecare de acesta, în funcție de tipul de enzimã.

PARTEA EXPERIMENTALA

Materiale necesare

amestec dNTP, 10 mM fiecare

Taq ADN polimeraza 5U/μl

Tampon pentru PCR 10X

primer fimH1 20pmoli/μl

primer fimH2 20pmoli/μl

apã ultrapurã sterilã

lizat termic ( ADN)

vârfuri albe și galbene cu/fãrã filtru pentru pipete ( sterile)

tuburi Eppendorf de 0,2 , 1,5ml ( sterile)

gheațã și cutii pentru gheațã

stative pentru tuburi Eppendorf

hârtie prosop

Aparaturã:

– pipete automate P10, P20, P200 ( dedicate celor douã arii de lucru)

– aparat termocycler cu capac incãlzit

– microcentrifugã

– vortex

– hota cu flux laminar

– frigider

– congelator

Mod de lucru :

Prepararea master mixului:

Se lucreazã în spațiu special ADN free, cu echipamente dedicate camerei respective

Se schimbã vârfurile de pipetã dupã adãugarea fiecãrui reactiv

1. se decongeleazã urmãtorii reactivi, pãstrându-i în gheațã:

– tamponul pentru PCR

– amestecul de dNTP

– perechea de primeri fimH1/fimH2

2. se pregãtește pe un stativ 1 tub Eppendorf de 1,5 ml și 4 tuburi de 0,2 ml.; se noteazã

pe capac cu M

pentru a efectua în paralel cele n reacții PCR, se preparã în tubul de 1,5ml

(notat M) un amestec ( master mix) adaugând volumele calculate de apã, tampon,

dNTP, primeri și Taq ADN polimeraza. Volumele corespunzãtoare se calculeazã pentru n+1 reacții. Pentru o reacție este nevoie de volumele indicate in tabelul de mai jos:

Tabelul 1: Cantitãți de reactanți pentru PCR într-un volum final de 50 μl

amestecul se vortexeazã scurt, apoi se centrifugheazã scurt

folosind un singur vârf de pipetã se distribuie câte 40μl din acest amestec în cele

4 tuburi de 0,2.

Adãugarea ADN

Se transferã tuburile în spațiul seprat de cel în care s-a preparat master mixul.

Folosind pipeta dedicatã acestei arii și vârfuri de pipetã diferite se adaugã în

Tuburi.

Se centrifugheazã scurt toate tuburile și se pun în gheațã pânã când se

introduc în mașina PCR

Amplificarea

Se pornește mașina de PCR. Se verificã programul de amplificare:

Programul de amplificare:

1 ciclu: 94oC – minute

25 cicluri: 94oC- 30 secunde

60oC- 30secunde

72oC- 1 minut

Dupã ce se verificã ca sunt bine închise, tuburile se pun în mașina și se pornește

programul de amplificare .

Dupã terminarea programului, tuburile se scot pe gheațã și se pãstreazã la +4oC

pânã la verificarea produșilor de amplificare.

PCR pentru enterovirusuri non-polio

Descriere: Metoda RT-PCR ( Reverstranscription-Polymerization Chain Reaction)

Constã în conversia ARN în ADN complementar ( ADNc) în prezența unei reverstranscriptaze și amplificare enzimaticã în regiunea genomicã VP1-2A.

Probe: Suspensie materii fecale, LCr ( lichid cefalorahidian), alte produse patologice specifice, supernatant culturã celularã)

Condiții de transport: + 4oC, condiții de securitate conform normelor în viguare. Se lucreazã la cãteva ore de la recoltare sau dupã stocare la -20oC.

Controlul reacției PCR: se face introducând în sistem doi martori : un martor negativ și un martor pozitiv. Ca martor negativ se introduce apa în loc de ARN. Scopul acestui martor este de a detecta contaminãrile din timpul lucrului sau potențialele contaminãri ale reactivilor. Martorul pozitiv conține ARN extras din enterovirusuri; prin compararea probelor cu martorul pozitiv se confirmã sau infirmã prezența virusului în proba analizatã.

Extractie ARN viral ( protocol adaptat dupa kit-ul de extracție Qiagen)

Se lucreazã la hota cu flux laminar destinatã acizilor nucleici pentru a evita .

contaminarea probei și a pentru a proteja operatorul de o potențialã infectare cu agenții patogeni din probã.

Principiul metodei:

Extracția ARN are la bazã o serie de proceduri care vizeazã dezorganizarea virionului și separarea materialului genetic de celelalte componente ale virionului.

Etapele extracției:

Dezorganizarea structurii virionilor

În acest scop se utilizeazã tamponul de lizã AVL. Acest tampon conține agenți caotropici care denatureazã proteinele virale de înveliș și deorganizeazã capsida. Deasemenea tamponul conține un inhibitor de ribonucleazã ( previne degradarea enzimaticã a ARN) și un carrier care leagã ARN.

Precipitarea ARN

Se realizeazã cu etanol 96%

Fixarea ARN pe coloana de separare

Fixarea se realizeazã prin intermediul carrier-ului conținut în AVL

spãlarea coloanei

Are ca scop îndepãrtarea celorlalte componenete din amestec provenite din materialul biologic. Se efectueazã cu tampoanele AWI și AW2

Eluarea ARN

Eluarea ARN este etapa în care ARN este desprins din coloanã și reluat sub formã purã în tamponul AVE.

Materiale necesare:

kit(Qiagen) destinat exracției ARN ( QlAamp viral RNA mini kit cat nr. 52906)

vârfuri: 200-1000 μl

tuburi Eppendorf: 1,5 ml

mãnuși de unicã folosințã

dezinfectant

stativ pentru tuburi Eppendorf

pipete automate

frizetã

vas pentru dezinfectat

Aparatura :

hotã cu flux laminar

vortex

minicentrifugã

Mod de lucru:

se pipeteazã 560μl tampon AVL într-un tub Eppendorf 1,5 ml

se pipeteazã în tub 140μl supernatant culturã celularã și se vortexeazã

se incubeazã la temperatura camerei timp de 10 minute

se pipeteazã 560μl etanol 96-100% și se vortexeazã timp de 15 secunde

din tub se reiau 630μl amestec și se introduc în coloana de extracție ( care a fost fixatã intr-un tub de colectare de 2 ml); se centrifugheazã la 6000g ( 8000rpm). Se fixeazã coloana intr0un tub nou de colectare

se repeta punctul e

coloana se spalã cu 500 μl tampon AW2 și se centrifugheazã la 20.000g ( 14.000rpm) timp de trei minute și se reia intr-un tub de colecție nou și se centrifugheazã 1 minut la 20.000rpm , pentru eliminarea completa a tamponului AW20

coloana este trasferatã intr-un tub steril de 1,5 ml și arn este eluat cu 50 μl tampon AVE. Se incubeazã la temperatura camerei timp de un minut. Se centrifigheazã la 6000g

Reverstranscriere pentru originea genomica VP1-2A

Principiul metodei:

Reverstranscrierea reprezintã transcrierea unei matrițe de ARN sub forma ADN. Procesul se întâlnește în natura la retrovirusuri și stã la baza tehnicii RT-PCR.

Pentru reverstranscriere se folosesc enzime ( reverstranscriptaze) produse de microorganisme recombinate ( în genomul microorganismului a fost introdusã gena viralã care codificã pentru reverstranscriptazã).

Reverstranscrierea necesitã: o reverstranscriptazã ( exemplu: M-MLV: Moloney-Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) și un primer ( primer =amorsa, oligodeoxinucleoid; fragment sintetic de ADN de la care începe reverstranscrierea).

In tehnica RT-PCR, reverstranscrierea se face în douã etape succesive:

RT-1: în acestã etapã primer-ul se leagã la matrița ARN prin complementaritate. Procesul se numește,, anneling’’ ( hibridizare)

RT-2: reverstranscriptaza sintetizeazã o catenã de ARN complementarã matriței ARN. Procesul se numește ,, elongation’’ ( elongare)

Materiale necesare:

inhibitor de RN-aza( Promega RNAsin 40U/μl); 20 U per probã ( 0,5 μl)

primeri EUC2a, EUC2b; 20 pmoli per probã din fiecare primer ( 2μl)

dNTP mix ( dGTP, dCTP, dATP, dTTP) ; 10 milimoli per probã ( 1μl mix)

reverstranscriptaza ( M-MLV Promega) ; 200 U per probã ( 1μl)

tampon reverstranscriptaza – concentrat 5X ( 4μl)

apã distilatã sterilã

vârfuri cu filtru 0,5-10μl

vârfuri cu filtru 2-20μl

vârfuri cu filtru 20-200 μl

tuburi Eppendorf 0,2 ml

tuburi Eppendorf 0,5 ml

mãnuși de unicã utilizare

stativ pentru Eppendorf

frizetã

pahar Berzelius pentru deșeuri

dezinfectant

gheațã

Aparatura:

-hotã cu flux laminar, vortex, minicentrifugã de masã, mașinã PCR, pipetã automatã, mașinã de gheatã, congelator, frigider.

Reacția PCR pentru regiunea genomicã VP1-2A

Principiul metodei:

Reacția PCR constã in replicarea unei matrițe ADN cu ajutorul ADN polimerazelor izolate din microorganisme termofile este necesarã datoritã faptului cã reacția PCR implicã utilizare unor valori înalte de temperaturi care ar denatura polimerazele obișnuite.

Etapele reacției:

Denaturarea

În acestã etapã se realizeazã desfacerea duplexului ADN ( trecerea din forma

bicatenarã în forma monocatenarã ) . Procesul se realizeazã la temperaturi

apropiate de valoarea 90oC.

Alinierea primerilor ( hibridizare)

Taq polimeraza necesitã fragmente scurte de ADN ( oligonucleotide ). complementare cu ADN țintã, de la care sã se inceapã sinteza. Alinierea primeri-lor la catena matrițã se face prin complementaritate. Hibridizarea are loc la temperaturi in jurul valorii de 50oC.

Extensia

Extensia reprezintã polimerizarea deoxinucleotideloraflate în amestecul de reacție prin acțiunea ADN polimerazei. Pentru sinteza catenei noi, polimeraza ,, aplicã’’ principiul complemetaritãții utilizând catena matrițã. Extensia are loc la aproximativ 70oC.

Materiale necesare:

apa distilatã sterilã

tampon Taq polimeraza – concentrat 10X; 5 μl /probã

dNTP mix ( dGTP, dCTP, dATP, dTTP ) ; 10 mM per reacție pentru fiecare deoxinucleotidã ( 1μl )

Taq polimeraza ( Q-BIOgene ); 1,25 U/ probã

Primeri: EUG2, EUG3a, EUG3b, EUG3c ; 5 picomoli/probã din fiecare primer ( 0,5 μl)

MgCl2 25 mM ; 2 mM/ probã ( 4 μl)

Vârfuri cu filtru

Electroforeza în gel de agarozã

Principiul metodei:

Electroforeza reprezintã mișcarea dirijatã a moleculelor încãrcate electric sub acțiunea unui câmp electric continuu.

Direcția de deplasare a moleculelor este disctatã de sarcina electricã totalã a acestora; moleculele cu sarcina electricã pozitivã vor migra cãtre catod ( polul negativ), iar moleculele cu sarcinã electricã negativã totalã vor migra spre anod ( polul pozitiv).

Viteza de migrare a particulelor este determinatã atât de sarcina electricã cãt si de masa lor molecularã, moleculele cu masa molecularã mai micã vor migra mai repede decât moleculele care au masa molecularã mai mare dar sunt încârcate cu aceeași sarcinã electricã.

Acizii nucleici ( ADN și ARN ) sunt încãrcați cu sarcini electrice negative datoritã grupelor fosfat ionizate, în consecințã ei vor migra de la polul negativ catre polul pozitiv. Mediul de migrare este asigurat de gelul de electroforezã; gelul este separat prin hidratarea unui polimer natural extras din alge marine ( agarozã). Agaroza este un polimer cu masã molecularã mare, cu lanțuri liniare și ramificate, alcãtuite din retsuri de glucozã și derivați ai acestuia.

În uram hidratãrii agarozei, rezultã un gel care prezintã o microretea tridimensionalã prin porii cãreia se deplaseazã acizii nucleici sub acțiunea curentului electric cintinuu.

Dimenisunea porilor este direct proporționalã cu concentrația gelului de agarozã; creștera concentrației de agarozã favorizeazã deplasarea fragmentelor mai mici de acizi nucleici și reținerea pentru un timp mai îndelungat a fragmentelor mari; acest lucru duce la o mai bunã separare a fragmentelor de acizi nucleici.

Tamponul de migrare are rolul de a menține sarcina electricã negativã a ADN ( datoritã pH-ului alcalin) dar și de a închide circuitul electric.

In funcție de mãrimea ampliconului se stabilește concentrația gelului de agarozã. Concentrația gelului este invers proporționalã cu dimensiunea ampliconului.

Materiale necesare electroforezei:

agarozã ( polimer natural extras din alege)

tampon TAE ( tris-etilaminãhidroximetan, acid acetic, EDTA ) 1 X

bromurã de etidiu soluție stoc 10 mg/ml

spatulã

vas Erlenmeyer

cilindru gradat

piepten

bandã adezivã sau dispozitiv pentru fixarea tãviței

Aparatura: pipete automate, balanța de laborator, sistem de electroforezã, tãvițã

specialã pentru formarea godeurilor, cuptor cu microunde

Mod de lucru:

se fizeazã cu bandã adezivã capetele libere ale tãviței

se cântãrește agaroza în funcție de concentrația doritã ( 0,8-2%) . Pentru migrarea ampliconilor obținuți prin tehnica prezentatã, este necesarã o cencentrație de agarozã de 1,5 %

se mãsoarã volum de tampon necesar preparãrii gelului

se încãlzește amestecul de agarozã –TAE în cuptorul cu microunde pânã la obținerea unei soluții transparente

se rãcește treptat soluția de agarozã ( soluția trebuie sã fie la aproximativ 600C)

se adaugã bromurã de etidiu ( 1,25 la 25 ml soluție agarozã ) , se omogenizeazã Si se toarnã în tãvița în care s-a fixat pieptenul

gelul se solidificã la temperatura camerei

Incãrcarea ampliconilor în gel și migrarea

Materiale necesare:

gel pregãtit anterior

tanc de electroforezã

sursã de curent continuu

pipete

vârfuri sterile fãrã filtru

– marker de masã molecularã ( Promega , 100 pb )

colorant albastru de bromfenol

parafilm

Mod de lucru:

se așeazã gelul în tancul de electroforezã și se acoperã cu TAE 1X

pe parafilm se repatizeazã un numãr de ,,n’’ picãturi albastru de abromfenol; n fiind numarul de ampliconi plus markerul de greutate molecularã

în fiecare picãturã de colorant se adaugã 5 μl amplicon și se omogenizeazã cu pipeta prin aspirare

se încarcã în godeuri ( se noteazã ordinea încãrcãrii probelor)

se seteazã parametrii de migrare

gelul se vizualizeazã la lumina UV și se forografiazã

Profil electroforectic al regiunii VP1-2A

MK 278 279 280 292 295 370 371

MK 374 375 443 476 450 Martor negativ

Amplicon de 1450 pb

Concentrație gel de agaroza 1% , tampon de migrare TAE 1X

Concluzii

Scopul acestei lucrӑri a fost evidențierea eficienței sistemului PCR-RFLP, ȋn tiparea celor mai rӑspȃndite genotipuri la noi ȋn tarӑ. Probele au fost furnizate de Insitutul de Boli Infecțioase ,, Matei Balș’’ au fost supuse restricței enzimatice. Majoritatea probelor aveau profile electroforetice ușor de interpretat prin PCR-RFLP.

Epidemiologia moleculară permite recunoașterea tulpinilor diferite din aceeași specie, provenind din circumstanțe epidemiologice cariate, pe baza polimorfismului genetic. Dintre mecanismele care determină polimorfismul genetic, mai importante sunt variabilitatea naturală determinată de polimeraze (în special ARN polimeraze) și modificările genetice (deleții, inserții, recombinări, trasnlocații). Epidemiologia virusurilor s-a imbogățit cu o serie de tehnici moleculare noi care permit caracterizarea diferențelor genetice și antigenice între diferite izolate. Aceste tehnici recente, fac posibile investigații privind originea și evoluția tulpinilor, avănd astfel implicații în prevenirea anumitor boli enterovirale cu importanță deosebită pentru sănătatea publică.

Epidemiologia studiatӑ prin tehnici de biologie molecularӑ permite ameliorarea metodelor de diagnostic și terapeutice precum și identificarea unor markeri genomici (de exemplu secvențele din genom care pot fi asociate cu o creștere a virulenței sau cele implicate în modificările către fenotipuri patogene).

BIBLIOGRAFIE

Colllier L. , Balows A., Sussman. M‘’ Microbiology and microbial infections”

Edit.Topley and Wilson’s, 1998

2. Fields B., Knipe M.D, Howlley P. ‘’ Virology’’ fourth edition, Lippincott

Williams and Wilkins vol.1, ( 2001)

3. Oprisan G. Teza de doctorat : ‘’ Markeri moleculari utilizabili ȋn ȋncadrarea

taxonomicӑ și caracterizarea enterovirusurilor ‘’ , 2002

4. Rolfs A., Schuller I., Finckh U., Weber-Rolfs I., : ‘’ PCR Clinical diagnostics and

reseaarch ‘’ Edit. Springer Laboratory, 1992

5.Rebedea I ,, Boli infecțioase’’ edit Medicalӑ , București, 2000

6.SarnbrookJ., Fritsch E.F, Maniatis T.‘’ Molecular cloning-a Laboratory manual ‘’

CSH ( 2000)

7.Vassu T., Stoica L., Csutak O.,Mușat F. ‘’ Genetica microorgansimelor și inginerie

geneticӑ microbianӑ ‘’ , Edit. Petrion, București 2001

8.Blomqvist S., Bruu A-L.,Stenvik M.,Hovi T. ‘’Characterization of a recombinant

type 3/type 2 poliovirus isolated from a healthy vaccinee and containing chimeric

capsid protein VP1‘’ Journal of General Virology 2003,vol.84,573-580

9.Brown B.,Oberste S.,Maher K.,Pallansch M. ‘’ Complete genomic sequencing

Shows that polioviruses and members of human enterovirus species C are closely

Related in the noncapsid codin region‘’Journal of Virology,vol.77,2003,8973-8984

10.Dove A.W Racaniello V.R. ‘’The Polio Eradication Effort:Should Vaccine

Eradication Be Next? ‘’ Science,1997,vol.277,779-780

11.Guillot Sophie. ‘’ Application a l’etude de la variabilite’ genetique des suoshes du

VPO.Digestion enzimatique‘’ ,2004

12.Hull h. F.,Aylward R. ‘’ Invited commentary:The Scientific Basis for Stopping

Polio Imunization‘’ American Journal of Epidemiology,1999,vol.150,1022-1025

13.Lukashev N. A ‘’ Role of recombination in evolution of enteroviruses‘’ Reviews

In Medical Virology,2004

14.Masatoshi N.,Sudhir K. ‘’ Molecular evolution and phylogenetics‘’ Edit.Oxford

University ress,2000,187-207

15.Sloan K.,Eustace B.,Steward J.,Zehetmeier C.,Torella C., Simeone H., Roy J.,

Unger C., Louis D., Ilag L., Jay D. ‘’ CD155/PVR plays a key role in cell motility

During tumor cell invasion and migration‘’ BMC Cancer,2004,vol.4,73