Tehnici Cromatografice de Analiza a Antibioticelor

Tehnici cromatografice de analiză a antibioticelor

Nanomaterialele sunt definite de către National Nanotechnology USA, ca materiale care au cel puțin o dimensiune în intervalul de 1 la 100 nm. Există un interes enorm pentru aplicarea nanomaterialelor într-o varietate de industrii.

Nanomaterialele au devenit un subiect interesant de cercetare, în mai multe domenii, inclusiv cel legat de mediu înconjurător, electronică, informare, comunicare și nu în ultimul rând cel medical. Este anticipat impactul pe care nanomaterialele, îl vor avea în domeniul medical, deoarece reprezintă cele mai mari molecule biologice, dar și cele mai mici dispozitive create de om.

În nanomedicină, substanțele farmaceutice active sunt defnite în linii mari, ca vehicule de livrare, care prezintă o dimensiune medie între 10 și 200 nm, iar acestea cuprind: lipozomi, micele, nanoparticule polimerice, dendrimeri și macromolecule. Nanoparticulele corect formulate se sustrag de la 5 nm filtrare renala [1-3] și prezintă o circulație îndelungată în sânge, oferind acestor particule o oportunitate mai mare de a interacționa cu țesuturile tumorale.

Nanoparticulele sunt cele mai utilizate obiecte de aceste dimensiuni (Maury și colab., 2007) datorită unui numar mare de avantaje precum:

plasarea țintită a acestora în locul dorit

utilizarea în imagistica medicală (rezonanța magnetică nucleară)

creșterea biodisponibilitații unor substanțe medicamentoase

controlul ratei de eliberare a unor medicamente, etc.

Prin urmare, aplicațiile biomedicale ale nanoparticulelor în general, pot fi împărțite în două mari categorii: diagnosticare și terapie cu promițătoare tehnologii și utilizări potențiale în biosensing, imagistică medicală, administrarea medicamentelor, în special pentru tratamentul cancerului (și colab., 2008).

Cu un design propriu, particulele pot acoperi ambele funcții terapeutice și de diagnostic, așa-numita terapie individualizată. În ceea ce privește funcția de terapie, progresele recente în domeniul nanotehnologiei au fost deja implementate în industria farmaceutică. Cu toate acestea, utilizarea acestora în industria farmaceutică este în continuare limitată datorită aplicabilitații scăzute, incompatibilitaților față de corpul uman, sarcină utilă scăzută și un proces de preparare complex.

Astfel, oamenii de știință au făcut nenumarate eforturi în cercetatarile lor cu scopul de a depași aceste impedimente. Pentru diagnosticul biomedical, detectarea agenților biologici și a bolilor este un obiectiv important îndeplinit de proprietațile fizico-chimice unice ale nanoparticulelor. Printre nanoparticulele utilizate pentru diagnosticul biomedical, punctele cuantice folosite pentru imagistică (Wang et al., 2007) și nanoparticule magnetice (MNPs) utilizate pentru imagistica prin rezonanță magnetică (RMN) (Kirsch, 1991) sunt cele două tipuri de nanoparticule care au jucat un rol important.

Puncte cuantice sunt caracterizate prin emisii stabile, fluorescență îngustă, un avantaj față de vopseaua organică care suferă rapid un proces de fotoalbire/decolorare. MNPs-urile, pe de altă parte, pe baza fenomenului de rezonanță magnetică nucleară, sunt larg utilizate pentru diagnostic pentru a oferi posibilitatea de a detecta tumorile maligne precoce, cu ajutorul agenților de contrast adecvați.

Aranjamentul distal al distribuției lor spațiale prin câmpuri magnetice atât in vitro cât și in vivo și prin urmare, asocierea cu orice entitate, cum ar fi substanțele medicamentoase, biomolecule, celule sau virusuri, a condus la apariția de noi cereri biomedicale de MNP, inclusiv îmbunătățirea contrastului pentru RMN, de livrare de medicamente țintă, magnetic orientate, hipertermie magnetică fluidă, etc.

Interesul în creștere pentru MNP este datorat capacitații de a induce particulelor mișcare și rotație, folosind un câmp magnetic exterior cuplat cu dimensiunea lor cea mai mică (Herrera și colab., 2010). MNP-ul a fost testat pentru prima oară în anul 1950 de către Gilchrist în tratarea nodulilor limfatici și a metastazelor prin injectarea unor particule magnetice, preîncălzite într-un câmp magnetic.

După aceea, MNP au fost studiate pe scară largă ca probă de diagnostic și agent terapeutic pentru mai multe tipuri de aplicații biomedicale cu sau fără modificări aferente. Modificarea suprafeței acestor nanoparticule cu menținerea intensității semnalului de contrast al substanței este o caracteristică esențială pentru a detecta tumori mici și o caracteristică importantă, de exemplu, a MNP-ului în cadrul terapiei individualizate.

Straturile anorganice sau polimerii folosiți pentru acoperirea sau funcționalizarea nanoparticulelor magnetice minimizează interacțiunile hidrofobe, sporind astfel proprietățile dorite, cum ar fi dispersia coloidală și biocompatibilitatea permițând modificarea suprafețelor cu grupări funcționale necesare pentru aplicații bazate pe interacțiuni specifice.

Figura 1. Nanoparticulă magnetică de tip core-shell cu miez feromagnetic si diverse învelișuri. (http://www.nist.gov/mml/msed/functional_nanostructure/magnetic_nanoparticle_metrology.cfm)

Mai mult decât atât, suprafața de acoperire are efecte importante asupra vieții nanoparticulelor înainte de a fi eliminate din sistem, având ca și scop specificitatea acestora și cantitatea de nanoparticulelor internalizate în celulă (de Ha ¸ n, 2001). Surfactanți, polimeri, anticorpi, enzime, proteine și liganzi specifici fac parte din materialele frecvent utilizate pentru acoperirea miezului magnetic de ferită, care fac posibilă legarea de alți compuși biologic activi sau receptori de pe suprafața celulară.

După funcționalizare pentru a permite anumite legături, nanoparticulele magnetice pot fi convenabil poziționate in vitro și in vivo, prin aplicarea distală a unui câmp magnetic. Astfel de particule pot fi, de asemenea, încălzite magnetic după atingerea obiectivelor lor in vivo, astfel inducerea putând localiza celulele moarte.

Aceste funcții facilitează utilizarea nanoparticulele magnetice în diverse combinații cu medicamente și alte molecule țintă în tratarea diferitelor tipuri de cancer și alte boli, aceasta fiind o aplicabilitate recentă și promițătoare a nanoparticulelor.

Magnetita/oxid feroferic (Fe3O4) și oxid de fier (II)/hematit (y-Fe2O3) sunt materiale adecvate utilizate pentru aplicațiile in vivo ale nanoparticulelor magnetice. Deoarece alți compuși precum cobaltul și nichelul sunt toxici și susceptibili la oxidare, deși prezintă moment magnetic mai mare, utilizarea acestora în domeniul biomedical este limitată.

În ceea ce privește posibila toxicitate a acestor nanoparticule, biocompatibilitatea mare cu particule de Fe3O4 și y-Fe2O3 este remarcabilă deoarece homeostazia celulelor de fier este menținută sub control prin absorbție, eliminare și depozitare. Această proprietate remarcabilă, de asemenea, vine de la faptul că excesul de fier este eliminat eficient din organism (Sanvicens și Marco, 2008).

Mai mult decât atât, nanoparticulele de Fe3O4 pot fi privite ca un indicator de biosecuritate deoarece acestea nu provoacă stres oxidativ și pot fi utilizate în doze mari (Lubbe și colab, 1996;. Hohnholt și colab., 2011).

În plus, caracteristicile nanoparticulelor magnetice inclusiv uniformitate, formă, suprafață, biocompatibilitate, momentul magnetic sunt funcții foarte importante în timpul procesului de producție și pot fi reglate în funcție de scopul pentru care vor fi utilizate, de asemenea, abordate în aspectul analizelor instrumentale inclusiv microscopia electronică de transmisie (TEM), microscopia electronică de transmisie de înaltă rezoluție (HRTEM), difracția de raze X (XRD), RMN,etc.

Nanoparticulele magnetice au fost investigate pentru aplicații biomedicale de mai mult de 30 de ani. În medicină sunt utilizate în mai multe domenii, cum ar fi separarea magnetică a celulelor și rezonanță magnetică nucleară (RMN). În studiul realizat în anul 2006, de R Jurgons și colab., a fost vizat un model de cancer indus experimental, la iepure, în care a fost cercetat transportul de medicamente cu ajutorul nanoparticulelor magnetice de oxid de fier, de care a fost legat un agent chimioterapeutic, și care au fost apoi atrase de un câmp magnetic exterior către o tumoră indusă experimental (orientare magnetică, sub acțiunea unui câmp magnetic, a medicamentelor). Scopul acestiu studiu fiind realizarea unei remisii complete a tumorii.

Un important avantaj al acestor transportori este posibilitatea de a detecta aceste nanoparticule după utilizarea tehnicilor imagistice commune, ca: computer tomografie, raze x, magnetometrie, imagistică prin rezonanță magnetică), care pot fi corelate cu histologia.

Nanoparticulele magnetice pot deschide un câmp larg cu posibile aplicații în medicină. Până în prezent, nanoparticulele magnetice au fost folosite în medicină în tehnici de separare magnetică (Varshney M, Yang L, Su X L and Li Y 2005 Magnetic nanoparticle–antibody conjugates for the separation of Escherichia coli O157:H7 in ground beef J. Food. Prot. 68 1804–11), ca agenți de contrast în imagistica prin rezonanță magnetică [Pouliquen D, Perdrisot R, Ermias A, Akoda S, Jallet P and Jeune J J 1989 Superparamagnetic iron oxide nanoparticles as a liver MRI contrast agent: contribution of microencapsulation to improved biodistribution Magn. Reson. Imaging 7 619–27], pentru hipertermie locală sau ca transportori magnetici țintiți pentru mai multe sisteme de transport ale medicamentelor [Ito A, Shinkai M, Honda H and Kobayashi T 2005 Medical application of functionalized magnetic nanoparticles J. Biosci. Bioeng. 100 1–11)

Pentru a avea aplicabilitate în organismele vii, nanoparticulele trebuie să fie biocompatibile. S-a demonstrat că, în general, nanoparticulele magnetice de oxid de fier funcționalizate cu amidon sunt tolerate destul de bine de organism. [Tiefenauer L X, Tschiky A, K¨uhne G and Andres R Y 1996 In vivo evaluation of magnetite nanoparticles for use as a tumor contrast agent in MRI Magn. Reson. Imaging 14 391–402].

Din acest motiv și datorită faptului că aceste tipuri de nanoparticule sunt produse și utilizate deja ca agenți de contrast în RMN pentru investigații imagistice (Combidex®, Resovist®, Endorem®, Sinerem®), nanoparticulele de oxid de fier par să fie un material suport convenabil pentru sistemul de direcționare al transportului medicamentelor.

Particulele au dimensiuni suficient de mici pentru a preveni blocajele sistemului vascular, în special la nivelul capilarelor, dimensiunea nanoparticulelor trebuiind să fie mai mică de 5 µm [M¨uller R H, Jakobs C and Kayser O 2001 Nanosuspensions as particulate drug formulations in therapy—Rational for development and what we can expect for the future Adv. Drug Deliv. Rev. 47 3–19]. Pe de altă parte, nanoparticulele magnetice nu trebuie să fie prea mici, datorită atracției lor de către un gradient de câmp magnetic exterior. Investigații legate de distribuția acestor particule în organism au arătat că particulele mai mari de 100 nm în diametru sunt interceptate mai mult de celulele sistemului reticuloendotelial (RES) decât particulele mai mici [Sachdeva M S 1998 Drug targeting systems for cancer therapy Expert Opin. Invest. Drugs. 7 1849–64].

După administrarea intravenoasă sau administrarea parentereală regulată, nanoparticulele magnetice pot fi găsite în macrofagele din ficat, splină și plămân, din cauza așa-numitul efect de prim pasaj (Alexiou C, Jurgons R, Schmid R, Bergemann C, Henke J, Erhardt W, Huenges E and Parak F G 2003 Magnetic drug targeting—biodistribution of the magnetic carrier and the chemotherapeutic agent Mitoxantron after locoregional cancer treatment J. Drug Target. 11 139–49].

Investigațiile privind distribuirea nanoparticulelor în organe și țesuturi au arătat o acumulare mare de nanoparticule magnetice în regiunea tumorii, în contrast cu alte părți ale corpului și anume ficatul sau splina. În experimentele în care au fost folosite nanoparticule radioactive de Fe59, a fost detectată o activitate de 114 de ori mai intensă în regiunea tumorală după administrarea medicamentelelor direcționate magnetic față de un martor asupra căruia nu s-a folosit câmp magnetic [Alexiou C, Jurgons R, Schmid R, Bergemann C, Henke J, Erhardt W, Huenges E and Parak F G 2003 Magnetic drug targeting—biodistribution of the magnetic carrier and the chemotherapeutic agent Mitoxantron after locoregional cancer treatment J. Drug Target. 11 139–49].

Investigarea cu ajutorul razelor X a unui fragment de țesut tumoral după direcționarea nanoparticulelor magnetice funcționalizate cu medicamente pune în evidență prezența nanoparticulelor de oxid de fier în sistemul vascular al tumorii, după direcționarea medicamentelor magnetice în sistemul vascular al tumorii.

Suspensiile de nanoparticule de oxid de fier comerciale, utilizate ca agenți de contrast în RMN, aprobate de Food and drug administration (FDA), trebuie să fie administrate strict intravenos și foarte diluate în apă deionizată, pentru a evita embolizarea cauzată de pierderea stabilității coloidale și formarea de conglomerate mai mari [M¨uller R H, Jakobs C and Kayser O 2001 Nanosuspensions as particulate drug formulations in therapy—Rational for development and what we can expect for the future Adv. Drug Deliv. Rev. 47 3–19].

Acoperirea/funcționalizarea și starea de încărcare a suspensiilor de nanoparticule sunt responsabile pentru compatibilitatea lor în organism. [Brigger I, Morizet J, Laudani L, Aubert G, Appel M, Velasco V, Terrier-Lacombe M J, Desmaele D, d’Angelo J,Couvreur P and Vassal G 2004 Negative preclinical results with stealth nanospheres-encapsulated Doxorubicinin an orthotopic murine brain tumor model J. Control. Release 100 29–40]. Prin aplicarea unui câmp magnetic exterior, după administrarea intraarterială de nanoparticule, are loc o acumulare locală de nanoparticule cu un potențial crescut de formare de conglomerate și de apariție de blocaje intravasculare. Prin urmare, trebuie efectuate numeroase studii pentru investigarea stabilității coloidale a suspensiilor de nanoparticule de oxid de fier, în diferite soluții fiziologice și pentru administrare injectabilă.

În ultimele decenii ingineria biomedicală și-a pus amprenta în domeniul științei, având un spectru larg de aplicabilitate în numeroase domenii. Un exemplu clar care atestă acest fapt este aplicabilitatea versatilă a nanoparticulelor magnetice în terapia individualizată, datorită proprietăților lor precum biocompatibilitate, absența toxicitații comparativ cu alți derivați metalici.

Aplicații ale nanoparticulelor magnetice

În ultimii ani, oamenii de știință au contribuit continuu prin lucrările lor de sinteză publicate în reviste de prestigiu, despre aplicațiile nanostructurilor magnetice. Prima dintre ele, este o lucrare publicată în revista „Nature material” de Piao și colab., în anul 2008 (Piao et al., 2008). Ei au investigat nanocapsule, sintetizate din magnetit, dispersabile în apă și folosite cu succes nu numai ca un vehicul de livrare al medicamentelor, dar, și ca bun agent de contrast în imagistica prin rezonanță magnetică

O altă metodă nouă de asociere reversibilă a nanoparticulelor superparamagnetice de oxid de fier (SPION) cu un agent anticancer, doxorubicina (DOX), a fost realizat în același de Maunnier și colab. Cu scopul orienării magnetice a chimioterapicului (Munnier et al., 2008).

Suspensiile apoase de SPION denumite și ferofluide, au fost preparate prin coprecipitare din cloruri ferice și feroase în mediu alcalin, urmată de oxidarea suprafaței cu azotat feric și urmat apoi de tratament de suprafață cu ioni citrat. Ferofluidele au fost încărcate cu DOX folosind un complex preformat DOX-Fe2+ cu conținut de medicament mare, 14% (g/g), o valoare impresionantă cunoscută până în prezent.

În anul 2011, Omer și colab., au dezvoltat o cale nouă în ceea ce privește tratamentul termic, pentru pregătirea nanoparticulelor magnetice; pentru sinteza termo-sensibilă, în mediu apos, a nanoparticulelor de tip miez-înveliș, care constau din miez de magnetită și înveliș de poli-N-isopropilacrilamidă (Omer și colab., 2011). Doxorubicina este un medicament încărcat în aceste nanoparticule și cinetica sa de eliberare, a fost evaluată in vitro. Cantitățile de medicament eliberate au fost active și eficiente în a distruge celulele tumorale de prostată.

Soluțiile apoase de nanoparticule magnetice dispersate cu poli-N-isopropilacrilamidă au arătat că încălzirea magnetică este mai mare, datorită unei proprietăți superparamagnetice. Combinația dintre aceste proprietăți este importantă datorită potențialului crescut în livrarea țintă de agenți terapeutici in vivo, tratamentul hipertermic al tumorilor, agenți de contrast în RMN, refacerea țesuturilor, teste imunologice, separarea celulelor, separarea biomagnetică a biomoleculelor, etc.

În plus, oamenii de știință au sintetizat nanoparticule SPION folosind "metoda sonochimică", .procedură de obținere a fluidelor magnetice, care cuprind polielectroliți stabilizați de MNP, creând astfel ferofluide cu bună biocompatibilitate și potențial crescut pentru diagnosticare in vivo în RMN (Corr et al, 2008;. Pantic, 2010).

Un alt studiu Bhattarai et al. (2007) a propus utilizarea de policationi modificați hidrofobic (de chitosan N-acilat, Nac) stabilizați de nanoparticule de oxid de fier pentru a forma o nouă nano-matrice ce posedă o structură tridimensională (3D) pentru fabricarea controlată de hidroxiapatită (HAP). Principalele avantaje ale nanocompozitelor poroase HAP/y-Fe2O3/Au sunt că au o capacitate de încărcare mare cu biomolecule cu bioactivitate bine conservată și biomolecule de recunoaștere (Zhang et al., 2008).

În anul 2010, pentru prima dată au fost sintetizate, într-un sistem apos, emulgator, la temperatura camerei, noi nanoparticule magnetice de Fe3O4/chitosan cu forma și structura spiralată (Zhang et al., 2010). Chitosanul este într-adevăr un polimer utilizat frecvent în pregătirea MNP-urilor Qiao și colab. ( 2011).

De asemenea, în anul 2011, noi MNP încărcate cu doxorubicină și acoperite cu poli-lactid – co-glicolidă (PLGA) au fost preparate prin metoda de emulsionare A/U, U/A (Li et al ., 2011). Rezultatele au arătat că nanoparticulele ar putea fi considerate un sistem promițător de eliberare a medicamentului chimioterapic cu potențiale aplicații în terapia cancerului.

O altă tehnică, care este, de asemenea, legată de problema funcționalizării suprafețelor nanoparticulelor magnetice, este modificarea suprafeței acestor nanoparticule pentru direcționarea specifică spre tumori. În anul 2010, pentru a prepara nanoparticule care posedă proprietăți magnetice specifice în prezența unui câmp magnetic exterior și agenți de contrast pentru RMN, Ke și colab. ( Ke și colab ., 2010 ) au unit nanoparticule superparamagnetice de oxid de fier, foarte solubile în apă cu suprafețele de complexare cu poli-acid acrilic și apoi au legat covalent un colorant fluorescent, Rodamină 123, cu grupările carboxilice libere expuse pe suprafața de aplicații în imagistica fluorescenta.

Mai mult decât atât, pentru a viza celulele canceroase și pentru a preveni recunoașterea de către sistemul reticuloendotelial (SRE), acidul folic a fost conjugat în continuare pe nanoparticule. Cea mai recentă lucrare publicată de Chen și colab., în anul 2012, a fost o dezvoltarea de noi nanoparticule pentru terapia tumorală, cu dublă direcționare: câmp magnetic ghidat și peptida influențată de direcționare.

MNP au apărut ca sisteme eficiente de livrare a substanțelor medicamentoase, care pot fi orientate cu ajutorul câmpurilor magnetice aplicate pe plan extern și sunt ca un mulaj, în special datorită proprietăților funcționale și capacității terapeutice sau ca agenți de formare și îmbunățire a imaginii la nivelul anumitor țesuturi, organe sau tumori. Din cauza beneficiilor potențiale ale funcționalității în aplicațiile biomedicale, oamenii de știință au proiectat și fabricat MNP multifuncționale.

Există două strategii comune pentru a fabrica MNP multifuncționale ( Gao et al ., 2009 ). Prima dintre ele este funcționalizarea moleculară, care implică conjugarea fragmentelor de țintire – peptide, anticorpi, aptameri, molecule mici – pe suprafața nanoparticulelor, de localizarea lor la locul țintă. După conjugarea lor cu astfel de medicamente adecvate, biofuncționalitatea MNP-urilor este obligatoriu foarte selectivă pentru aplicații biomedicale.

O altă metodă integrează MNP cu alte nanocomponente funcționale, cum ar fi puncte cuantice (QDs) sau nanoparticulele metalice. Deoarece acestea pot prezenta mai multe caracteristici sinergice și pot să îndeplini mai mult de o funcție în acelaș timp, astfel de MNP-uri multifuncționale ar putea avea avantaje unice în aplicații biomedicale, inclusiv îmbunătățirea imagisticii medicale și livrarea controlată de substanțe medicamentoase.

Implicațiile promițătoare ale acestor platforme pentru dezvoltarea diagnosticului diferitelor tipuri de neoplasm și terapiei au fost raportateă în numeroase studii. În anul 2009, Jarzyna și colab. a dezvoltat o nouă platformă multimodală de nanoparticulele de oxid de fier pe bază de emulsii U/A pentru țintirea tumorilor și imagistică medicală.

Perspectiva MNP-urilor în aplicațiile biomedicale viitoare

Proprietățile unice și aplicațiile versatile în domeniul biomedical au stimulat expansiunea în design și inginerie a MNP-urilor pentru ultimele câteva decenii. Într-o cercetare pentru aplicații biomedicale, Haddad și echipa sa au investigat structura și morfologia de oxid de fier a MNP-urilor în condiții diferite (Haddad et al., 2008). Acesta este un mod comun de a controla sinteza MNP. Pentru o aplicație în curs de dezvoltare, MNP ar trebui să fie controlată în formă, mărime, cristalinitatea și caracteristicile de suprafață, în special pentru aplicațiile directe în imagistica bazată pe rezonanță magnetică nucleară pentru investigarea tipurilor de cancer și de livrare a medicamentelor din cauza capacității unice de a funcționa la nivel celular și molecular a interacțiunii biologice, vizând în special țesutul tumoral și, prin urmare, tratarea acestuia fără a afecta în mod negativ întregul organism.

Nanoparticulele cu potențial favorabil în terapeutică presupun:

un miez magnetic (pentru a direcționa nanoparticulele pentru apropierea de țintă și, de asemenea, de efectele hipertermice ale particulei sau eliberarea medicamentului să fie sporită la temperaturi înalte)

un strat de recunoaștere (la care sunt atașati moleculei receptori adecvați/de recunoaștere);

o sarcină terapeutică (în interiorul porilor sau găzduite în interiorul cavităților interne ale particulelor) ( Chomoucka și colab., 2010 ).

Nu toate aplicațiile nanoparticulelor sunt concepute pentru a avea toate cele trei părți. Unele pot fi lipsite de o sarcină terapeutică sau pot avea numai două funcții pentru a avea un impact asupra acțiunilor specifice.

În prezent, este cercetată folosind MNP-urilor in vivo, la om, pentru detectarea cu ajutorul RMN-ului a plăcilor aterosclerotice, având ca și scop identificarea inflamației de. Domeniile de pierdere a semnalului focal pe imagini RMN s-au dovedit a corespunde la acumularea de particule de fier în placa de macrofage (Yuan și Kerwin, 2004). Prin urmare, aceasta permite detectarea din timp și tratarea pacienților cu risc crescut de accident vascular cerebral major, din cauza îngustării carotidei cauzate de plăci aterosclerotice.

Tehnicile de sortare în cazul celulelor magnetice în prezent, de asemenea, s-au dovedit a fi eficace în aplicații cum ar fi purificarea celulelor stem embrionare (David și colab., 2005) și în îmbogățirea celulelor plasmatice din măduva osoasă de șoarece (Minges Wols și Witte, 2008). Aceste tehnici au arătat procesul de interacțiune între celule și nanoparticule specifice, în mod special proiectate pentru a viza celulele și țesuturile bolnave.

Mai mult decât atât, MNP-urile au atras atenția din cauza unui alt potențial ca mediatori de încălzire pentru tratamentul cancerului (hipertermie). De exemplu, cererile de funcționalizare a MNP-urilor cu caracteristicile lor unice într-o cercetare de Ito și colab. 2005 ) au îmbunătățit în continuare tehnicile medicale.

Lipozomii cationici de magnetită (MCLs), unul dintre grupurile de particule magnetice cationice, pot fi utilizați ca purtători pentru a introduce nanoparticulele de magnetită în celule țintă, deoarece suprafața lor încărcată pozitiv interacționează cu suprafața celulei încarcate negativ, în plus, aceștia pot avea aplicații pentru tratamentele hipertermice (Ito și colab., 2005).

Nanoparticulele conjugate cu anticorpi (magnetolipozomi-anticorp conjugați, AMLs) sunt, de asemenea, aplicate în hipertermie, prin administrare sistemică, pentru îmbunătățirea contrastului în RMN, în cazul tumorilor specifice. Această aplicație a MNP se numește hipertermie magnetic fluidă (MFH) ale căror efecte terapeutice se datorează miezului magnetic, o termoterapie astăzi utilizată în tratamentul unor tumori.

Hipertermia magnetic fluidă (MFH) constă în direcționarea MNP-urilor către tumorile canceroase și aplicarea unui câmp magnetic oscilant în regiunea tumorii, particulele dispersând energia sub formă de căldură. Creșterea temperaturii face ca la nivelul celulelor canceroase să se producă apoptoza. Nanoparticulele funcționalizate cu molecule specifice și direcționarea prin intermediul suprafaței de recunoaștere reprezintă factori importanți, care determină biocompatibilitatea și adeziunea celulelor hipertermice.

Hipertermia magnetic fluidă (MFH) ar putea avea un rol important în tratamentul neinvaziv al cancerului și a altor boli sensibile la temperatură, cu toate că livrarea unui material hipertermic într-o zonă țintă specifică și încălzirea din jur a țesuturilor sănătoase (efecte secundare) este o problemă esențială (Kim et al., 2009) (Cherukuri și colab., 2010). Încălzirea interstițială folosind MNP (studiu prospectiv de faza I) a fost posibilă la pacienții cancer de prostată recurent (Johannsen et al., 2007).

Glioblastomul multiform (GBM), este cea mai comună și cea mai agresivă tumoră primară a creierului, cu șanse mari de recidivă la locul tratamentului, deoarece celulele canceroase se infiltrează în țesutul cerebral normal ce rezistă la terapie sau netratat. MFH este, de asemenea, utilizată pentru tratamentul glioblastomului (Hadjipanayis et al, 2010;.. Maier-Hauff et al, 2011). Echipa lui Hadjipanayis a proiectat nanoparticule de oxid de fier mici (≥ 10 nanometri), conjugate cu un anticorp purificat, ce se leagă selectiv de receptorul factorului de creștere epidermal (EGFR) eliminând mutația (EGFRvIII) prezentă pe celulele GBM umane.

Nanoparticulele astfel sintetizate și funcționalizate au fost folosite pentru direcționarea terapeutică, pentru a ucide celulele de glioblastom uman, fără toxicitate asupra astrocitelor umane normale, care cuprind cea mai mare parte a celulelor din creier și pentru îmbunătățirea contrastului RMN în studiul experimental al glioblastomului.

Prin urmare, mulți mediatori, cum ar fi factori de creștere, anticorpi, hormoni, etc., pot fi asociați cu MNP și s-a demonstrat un potențial ridicat pentru posibila tratare a diferitelor tipuri de cancer. Aceste nanoterapii pe bază de mediator sunt potrivite pentru receptarea tumorilor specifice, atunci când este indusă apoptoza celulară, schimbarea în metabolismul celular, sau pur și simplu pot acționa ca un pod care face legătura între nanoparticulă și celula tumorală, care să permită astfel transferul de medicamente.

În ultimii ani, inhibitori direcționali EGFR au fost testați în clinică pentru tratarea cancerului pulmonar cu celule mici (NSCLC). Pentru a dezvolta terapii mai eficiente pentru cancerul pulmonar, anticorpul anti – EGFR (Clone225) pentru un efect terapeutic molecular MNP-urile au fost combinate cu hibrid plasmonic și testate pe celule NSCLC. Această combinație, prezentând o creștere a eficacității terapiei împotriva NSCLC ( Yokoyama și colab ., 2011).

De asemenea, diverse tipuri de nanoparticule conjugate cu receptorul factorului de creștere epidermal uman anti – 2 ( HER2 ) anticorp monoclonal, au fost create și analizate datorită rezultatelor promițătoare în aplicații biologice și preclinice în tratamentul cancerului mamar ( Colombo și colab ., 2010 ; Dilnawaz și colab, 2010). Cancerul de sân este, de asemenea, dovedit a putea fi, eventual, tratat cu nanomateriale conjugate cu hormoni.

Nanoparticulelor de oxid de fier funcționalizate cu hormon luteinizant sunt potențiale purtătoare pentru de medicamente sau ADN pentru a viza celulele canceroase în tumorile primare de sân, dar, de asemenea și în metastazele pulmonare ( Meng et al., 2009 ).

În plus față de acești mediatori, emițătoare radio, conjugate cu nanoparticule ar trebui să fie luate în considerare în astfel de aplicații biomedicale, deoarece acestea s-au axat pe mai multe experimente preclinice și clinice recente. Un nou radioimunoconjugat-131I, factor de creștere endotelial (VEGF), anticorp monoclonal (Sc-7269) MNP dextran investigat a arătat că acesta ar putea fi în siguranță și cu potențial extrem de eficient în tratarea cancerului de ficat, precum și alte tipuri de cancer.

Din moment ce MNP au caracteristici magnetice unice, există o certitudine că oamenii de știință au dezvoltat continuu cercetările lor pentru promisiunea de noi perspective și de aplicații în mai multe domenii. Au fost raportate o serie de cercetări inovative cu aplicații productive de MNP-uri, de exemplu, analiza mutațională a genei, de detectare a agentului patogen, imunologice, separarea de acizi nucleici și de celule, de purificarea de proteinelor și bazate pe forță magnetică ingineria țesuturilor.

De asemenea, aplicarea potențială a tehnicilor magnetice în farmacie este semnificativ în creștere, mai ales că MNP-ul a contribuit la îmbunătățirea cineticii și distribuției de medicament, deschizând astfel perspectiva de terapii mai sigure și mai specifice. Cercetările actuale ar putea stabili o platformă pentru dezvoltarea în continuare, în integrarea în diagnosticare și terapie, care ar putea fi utilizate nu numai ca agenți de contrast, dar, de asemenea, disponibili pentru imagistica moleculară și celulară la RMN și aplicate pe scară largă ca mijloc eficient de livrare a medicamentului la locul direcțional pentru tratament.

Metodele de preparare a MNP

Primul pas în procesul de pregătire al nanoparticulelor magnetice costă în sinteza de nanoparticule de oxid de fier. În plus pe lângă un număr mare de diferite compoziții și faze pentru sinteză, inclusiv Fe-ul pur, oxizi de fier cum ar fi Fe3O4 și y-Fe2O3, alți factori, precum alegerea cu atenție a pH-ului, concentrația reactanților, temperatură, metoda de amestecare și viteza de oxidare trebuie luați în considerare (Domingo și colab., 1994).

Competiția între mai multe procese, cum ar fi nucleația, creșterea, agregarea și adsorbția impurităților are un impact mare asupra morfologiei particulelor de oxid de fier (Cornell și Schwertmann, 1996). Cu toate acestea, dimensiunea și forma dorită, în multe cazuri, nu este posibil să fie precipitată direct de particulele specifice de oxid de fier, dar se poate face prin transformarea unui alt oxid de fier, precursor al particulei (Baker și colab.,2000).

Prin urmare, atât reproductibilitatea cât și extinderea procesului sunt afectate de sensibilitatea metodei preparative. În ultimii ani, multe rapoarte au descris mai multe proceduri chimice eficiente sintetic coloidale pentru a structura într-un mod controlat și stabil nanoparticulele magnetice monodisperate de diferite materiale. S-a observat că, procedura de sinteză care combină o nucleație lentă și continuă determină o creștera rapidă a suprafeței autocatalitice (Butter et al., 2005).

În mai multe metodologii de preparare, s-a observat că pot apare aglomerări de nanooxid, ca urmare a expunerii la aer sau o aglomerări de nanoparticule. Acest lucru poate fi prevenit prin utilizarea agenților tensioactivi sau prin îmbracarea nanoparticulelor cu polimeri sau cu acizi organici.

Selecția unui surfactant adecvat este o problemă importantă pentru stabilizarea unor astfel de nanoparticule. Există două mecanisme de control în cazul efectului de ioni organici cu privire la formarea de oxizi metalici și oxihidroxizi. În timp ce chelatizarea ionilor metalici poate preveni nucleația și poate duce la formarea de particule mai mari, datorită numărului mic de nuclee formate, sistemul fiind dominat de creșterea numărului de particule, adsorbția de aditivi pe nuclee și creșterea cristalelor poate inhiba dezvoltarea de nanoparticule care favorizează formarea de unitați mici.

În general, există mai multe metode cunoscute care pot fi utilizate pentru sinteza de înaltă calitate a nanoparticulelor magnetice, cum ar fi:

precipitarea chimică

procedee sol-gel

descompunerea termică și/sau de reducere

sinteza hidrotermală

metodele de emulsie/microemulsie, etc.

Metoda co-precipitării

Tehnica de co-precipitare poate fi considerată o cale chimică ușoară și convenabilă de a obține particule de oxid de fier (Fe3O4 fie sau y-Fe2O3) din săruri de Fe2 + / Fe3 + , prin adăugarea de substanțe alcaline în atmosferă inertă, la temperatura camerei sau la temperatură ridicată și păstrarea suspensiilor o anumită perioadă de timp.

Principalul avantaj al procesului de co-precipitare este că poate fi sintetizată o cantitate mare de nanoparticule. Un fact important în sinteza nanoparticulelor magnetice este că nanoparticule de Fe3O4 nu sunt foarte stabile în condiții ambientale și ușor de oxidat la y-Fe2O3 sau dizolvate într-un mediu acid.

Deoarece oxidarea de y-Fe2O3 nu reprezintă un impediment, nanoparticulele de Fe3O4 pot fi supuse unei oxidări pentru a le transforma în y-Fe2O3. Această transformare este realizată prin dispersarea lor în mediu acid, apoi adăugarea de azotat de fier (III). Nanoparticulele de y-Fe2O3 obținute sunt apoi stabilizate chimic în mediu alcalin sau acid (Lu și colab., 2007). Deși particulele de Fe3O4 sunt convertite în y-Fe2O3 după formarea lor inițială, impedimentul în sinteza prin co-precipitare este controlul dimensiunii particulelor și modul prin care se poate realiza o distribuție îngustă a dimensiunii particulelor.

Din păcate, nanoparticulele preparate prin co-precipitare sunt susceptibile de a fi polidisperse. În procesul de co-precipitare este bine cunoscut faptul că sunt implicate două etape și ar trebui să fie bine controlate pentru a obține MNP monodisperse de oxid de fier, o explozie scurtă de nucleație are loc atunci când concentrația speciei ajunge la suprasaturare, și atunci are loc o creștere controlată lentă a nucleelor de difuzie a substanțelor dizolvate la suprafața cristalelor.

Pentru a produce nanoparticule de oxid de fier monodispers, aceste două faze trebuie să fie separate adică, procesul de nucleație trebuie evitat în timpul perioadei de creștere (Tartaj et al., 2006).

Controlul mărimii particulelor monodisperse trebuie să fie executat în mod normal în timpul perioadei scurte de nucleație, deoarece numărul final de particule este determinat de sfârșitul nucleației și acesta nu se schimbă în timpul creșterii particulelor. Tipurile de săruri utilizate (de exemplu, cloruri, sulfați, nitrați), raportul dintre Fe2 + / Fe3 +, temperatura de reacție, pH-ul, valoarea și tăria ionică sunt factori cruciali deoarece aceștia au un impact mare nu numai asupra dimensiunii, dar, de asemenea, asupra formei și compoziției MNP-ului.

S-a observat că mărimea medie de nanoparticule poate crește odată cu raportul dintre Fe2 +/Fe3+, în timp ce randamentul de pregătire scade (Babes et al, 1999). Aciditatea și tăria ionică a mediului de precipitare sunt, de asemenea, factori care influențează dimensiunea medie a nanoparticulelor de magnetită (Fe3O4), deoarece acești parametri determină compoziția chimică a suprafeței cristalului și în consecință încărcătura de suprafață electrostatică a particulelor.

Cu cât este mai mare pH-ul și tăria ionică, cu atât va fi mai mică dimensiunea particulelor și dimensiunea lățimii acestora (Tartaj și colab., 2006). Barbotarea în soluție de azot gaz arată că este util nu numai ca o protecție împotriva oxidării magnetitei, ci și într-o reducere a dimensiunii particulelor în comparație cu metodele fără îndepărtare de oxigen (Gupta și Wells, 2004).

De altfel, în timp ce o creștere a ratei de amestecare tinde să scadă dimensiunea nanoparticulelor, ratele de flux de injectare par să nu aibă o influență preponderentă asupra nanoparticulelor de sinteză. Utilizarea unui temperaturi de reacție ridicată este de asemenea semnificativ în formarea optimă a cristalului (Sun și Zeng, 2002). Calitatea nanoparticulelor de magnetită este complet reproductibilă o dată ce sunt fixate condițiile de sinteză.

Metoda sol-gel și tehnici de hidroliză induse

Acest proces este bazat pe hidroxilarea și condensarea de precursori moleculari în soluție, originar un "sol/soluție coloidală" de nanoparticule. Condensarea și polimerizarea anorganică conduc la o rețea tridimensională de oxid de metal denumit "gel" umed. Proprietățile unui gel sunt foarte dependente de structura creată în timpul etapei sol a procesului sol-gel.

Sinteza sol-gel de oxizi de metal oferă avantaje, cum ar fi materiale personalizate, sisteme multicomponente omogene, temperatură scăzută pentru procesarea materialelor. De la metoda sol-gel, nanoparticule de y-Fe2O3 pot fi încorporate într-o matrice de silice inertă, anorganică, transparentă, și rezistentă la temperaturi. Acesta este un proces extrem de versatil, deoarece permite formarea unei mari varietăți de oxizi metalici la temperaturi relativ scăzute, prin prelucrarea de săruri metalice sau alcoxizi de metal precursori (Mohapatra și Anand, 2010).

Pe baza condițiilor procesului de pregătire, natura precursorilor, sursa de ioni și pH-ul, se pot obține diverse structuri și compoziții de nano-oxizi prin această metodă. Inițial sinteza sol-gel de nanoparticule de oxid de fier a fost realizată pe geluri condensate de hidroxid feric, obținute din soluții de FeCl3 în NaOH. După îmbătrânirea gelului la 100° C timp de 8 zile, s-au obținut pseudo-particule cubice α-Fe2O3 monodispersate, policristale formate din subunități mult mai mici. Mai mult decât atât, deși metoda de sinteză fier oxi-hidroxid este utilizată pe scară largă cu hidroliza cationilor de Fe3+, îmbătrânirea sol preparătă prin turnarea de soluții ferice proaspete în soluții de NaOH sau KOH concentrate și trebuie să aibă loc la 60-80 C pentru o perioadă de timp cuprinsă între câteva zile până la câteva săptamani (Pascal et al., 1998).

Un alt aspect de remarcat este faptul că particulele formate prin oxidarea soluțiilor de Fe2+ în condiții neutre sunt de obicei mult mai puțin dezvoltate și cristalele sunt mai mici decât cele obținute în soluții alcaline de Fe3+ (Cornell și Schwertmann, 1996).

Metoda descompunerii termice

Pentru aplicații biomedicale, care depind foarte mult de dimensiunea nanoparticulelor, descompunerea termică este metoda, care poate oferi cel mai bun control în ceea ce priveste dimensiunea nanoparticulelor și morfologia. Mai mult decât atât, randamentul de producție pentru această metodă este ridicat și stalabil.

Până în prezent, două abordări diferite au fost utilizate pentru a produce nanoparticule magnetice. În primul rând, descompunerea termică a precursorilor carbonil metal, urmată de o etapă de oxidare cu aer, sau de oxidare folosind un oxidant la temperaturi ridicate (Hyeon și colab., 2001). Al doilea este descompunerea precursorilor cu un centru de metal cationic în absența agenților reducători (Sun și colab., 2003).

Totuși, prezența unor agenți de reducere conduce la MNP-uri chiar prin utilizarea unor precursori cationici. Nanocristale magnetice monodispersate cu dimensiuni mici pot fi sintetizate, în esență, prin descompunerea termică a compușilor organometalici în solvenți organici, cu punct de fierbere ridicat, ce conțin agenți tensioactivi de stabilizare (Sun și colab., 2000).

Utilizarea agenților tensioactivi organici fierbinți, prin descompunerea precursorilor de fier a dus la producerea unor probe cu o dimensiune bună, distribuția mărimii înguste și cristalinitate bună a nanoparticulelor magnetice individuale și dispersabile (Hyeon, 2003).

Precursorii organometalici în mod obișnuit sunt acetilacetonat de metal, [M (acac) n], (M = Fe, Mn, Co, Ni, Cr; n = 2 sau 3, acac = acetilacetonat), sau carbonil; întrucât agenții tensioactivi sunt adesea acizi grași, acid oleic și hexadecilamine.

Pentru a controla dimensiunea și morfologia MNP, rapoartele dintre reactivii de pornire incluzând compuși organometalici, surfactant și solvenți sunt parametrii cheie. În plus, temperatura de reacție, timpul de reacție, precum și perioada de îmbătrânire sunt fundamentale și pentru controlul precis al dimensiunii și morfologiei.

Descompunerea termică a precursorilor organometalici în compoziția cărora metalul este zero-valent (cum ar fi cazul carbonililor) duce inițial la o formațiune de nanoparticule de metal, dar dacă este urmată de oxidare poate conduce la un număr ridicat de oxizi metalici monodispersați.

Pe de altă parte, descompunerea precursorilor cu centre de metal cationice conduce direct la nanoparticule de oxizi metalici, de exemplu, în cazul în care [Fe (acac) 3] se descompune în prezența 1,2-hexadecanediol, oleilamină, și acidul oleic în fenol eter, acesta duce la Fe3O4 (Sun și Zeng, 2002).

În ceea ce privește dezavantajele acestei metode, unul dintre aspectele de menționat este producerea de nanoparticule organice solubile care limitează gradul de utilizare în domenii biologice.

De asemenea, este nevoie de tratament de suprafață după sinteză prin metodele de descompunere termică, care de obicei, conduc la procese complicate sau necesită temperaturi relativ ridicate.

Sinteză hidrotermală

Sinteza hidrotermală a nanoparticulelor Fe3O4 se efectuează în mediu apos, în reactoare sau autoclave unde presiunea poate fi mai mare de 2000 psi și temperatura poate fi peste 200° C (Laurent și colab., 2008). Este cel mai avanajos proces de a crește cristale din materiale diferite, proces apoi utilizat pentru creșterea particulelor unitare de cristal lipsite de dislocare, proces în urma căruia s-au format granule cu o cristalinitate mai bună față de cele din procesul anterior.

Se sugerează că granulele de Fe3O4 bine cristalizate formate în condiții hidrotermale adecvate, ar trebui să fie responsabile pentru saturația crescută de magnetizare a nanoparticulei de Fe3O4 (Wang et al., 2003). Diferite condiții în procesul hidrotermal ar duce la diferite cristalizări de particule și, prin urmare, ar duce la variații de proprietate magnetică.

Faptul că particulele bine cristalizate au un strat superficial subțire, distribuția cationica îngustă și relaxarea supermagnetică pot fi folosite pentru a interpreta acest lucru și, de asemenea, explică creșterea magnetizării de saturație în particule hidrotermale derivate.

Există două metode principale pentru formarea de ferite prin conditii hidrotermale: hidroliza și de oxidare sau de neutralizare a hidroxizilor metalici mixti. Aceste două reacții sunt foarte similare, cu excepția faptului că sărurile feroase sunt utilizate în prima metodă (Willard și colab., 2004). Solventul, temperatura și timpul sunt factori cruciali în acest proces, deoarece acestea au, de obicei, efecte importante asupra produselor.

Într-adevăr, s-a observat că dimensiunea particulei de Fe3O4 a fost crescută cu un timp de reacție prelungit și acest conținut mai ridicat de apă a dus la precipitarea particulelor mai mari Fe3O4 (Laurent și colab., 2008).

Mai mult decât atât, este de remarcat că dimensiunea particulelor în cristalizare este controlată, în principal prin intermediul proceselor de nucleație și creșterea granulelor care depind de temperatura de reacție. Nucleația ar putea fi mai rapida decât creșterea granulelor la temperaturi mai ridicate și determină o scădere a dimensiunii particulelor.

Microemulsie

În microemulsii apă/ulei (A/U), faza apoasă este dispersată ca nanopicături (de obicei de 1 – 50 nm în diametru), înconjurată de un monostrat de molecule de agenți tensioactivi în faza continuă de hidrocarburi. Molecula tensioactivă reduce tensiunea superficială între apă și ulei rezultând formarea unei soluții transparente. Forma apei acumulate este sferică și moleculele de surfactant ce înconjoară pereții nanopicăturilor acționează precum cuștile pentru particulele în creștere și, prin urmare, duce la reducerea dimensiunii medii a particulelor în timpul procesului de coliziune și de agregare.

Astfel, mărimea de nanoparticule poate fi controlată și reglată prin modificarea dimensiunii bazinului de apă și poate fi determinată prin raportul molar al apei la suprafață (Paul și Moulik, 2001). Precipitatul poate fi extras prin filtrarea sau centrifugarea amestecului prin adăugarea de solvent cum ar fi acetona sau etanolul pentru microemulsii. În acest sens, o microemulsie poate fi folosită ca un nanoreactor pentru formarea de nanoparticule, în curs de coalescență rapidă permite o amestecare, reacție de precipitare și un procese de agregare pentru sinteza MNP-urilor.

Acest proces a fost aplicat în generarea de nanoparticule de oxid de fier acoperite cu siliciu, în care miceliile inverse sunt utilizate pentru a limita și controla acoperirea de siliciu. Deși multe tipuri de MNP au fost sintetizate într-un mod controlat, folosind această metodă, dimensiunea particulelor și formele variază, de obicei, într-un domeniu larg. Nanoparticulele pot fi preparate sub forma de corpusculi sferici, dar și cu o secțiune transversală alungită sau ca tuburi (Lu șial., 2007).

Mai mult decât atât, în comparație cu alte metode, cum ar fi descompunerea termică și co-precipitare, randamentul de nanoparticule prin această metodă este scăzut și sinteza în microemulsii este de obicei destul de complicată. De asemenea, este necesar să se utilizeze o cantitate mare de solvent, pentru a sintetiza cantități apreciabile de material. Astfel, acesta nu este un proces foarte eficient și, de asemenea, destul de dificil la scară mai mare.

Ingineria de suprafață a MNP-urilor

Pe lângă proprietățile favorabile pe care le posedă MNP-urile, cum ar fi citotoxicitate scăzută, bioactivitatea și capacitatea de a se conjuga cu molecule sau compuși activi, funcționalizarea de suprafață adecvată face MNP-urile unelte biomedicale puternice. Trebuie remarcat faptul că termenul "funcționalizarea de suprafață" este frecvent utilizat în aplicații biomedicale pentru a indica proprietățile funcționale ale nanoparticulelor și poate fi folosit alternativ cu termenul "modificare de suprafață", prin care este ilustrat mult mai direct scopul funcționalizării suprafeței nanoparticulelor.

Scopurile privind modificarea suprafeței includ:

stabilizarea suspensiei de nanoparticule conform situațiilor in vitro și in vivo

minimalizarea resturilor magnetizate

disponibilitate a grupărilor funcționale de suprafață pentru derivatizare ulterioară

creșterea solubilizării nanoparticulelor în diferiți solvenți extinzând astfel posibilitățile de aplibilitate ale acestora (de Dios și Diaz-Garcia, 2010; Parveen et al, 2012).

În urma procesului de modificare a suprafeței MNP-urilor acestea trebuie să fie non-toxice și biocompatibile și trebuie de asemenea, să permită o livrare localizată a particulelor, într-o anumită zonă, pentru terapia individualizată în cele mai multe cazuri. Din acest motiv, etapa de modificare a suprafeței de multe ori duce la formarea de MNP-uri multifuncționale. Tipurile de acoperire specifice pentru aceste nanoparticule depind de scopul cererii.

Este demn de remarcat faptul că natura acoperirilor de suprafață ale nanoparticulelor, orientarea lor, ulterioara formă geometrică (formă de bucle, trenuri, și cozi sau ca perii grefate posterior sau coji de polimeri încapsulate complet) și inclusiv greutatea moleculară determină nu numai caracteristicile antivegetative ale nanoparticulelor, dar și dimensiunea lor efectivă și hidrodinamică; toate acestea jucând un rol esențial în biocinetica și biodistribuția nanoparticulelor în organism (Gupta și Gupta, 2005).

De exemplu, în ceea ce privește dimensiunile nanoparticulelor, dimensiunea totală a particulelor trebuie să fie suficient de mică pentru a se putea sustrage absorbției de către sistemul reticuloendotelial (SRE, celulele fagocitare care se găsesc în țesuturile care formează parte a sistemului imunitar), dar suficient de mare pentru a evita clearance-ul renal.

Mai mult decât atât, este foarte important să subliniem importanța liganzilor în ceea ce privește direcționarea MNP-urilor, cum ar fi proteinele, peptidele, anticorpii și moleculele mici de la suprafața particulelor, care după ce acoperă suprafața MNP-urilor pot induce direcționarea acestor nanoparticule către orice celulă, țesut sau tumoră din organism.

Pentru a crește acumularea locală a MNP în țesutul bolnav aceasta este o abordare promițătoare, cunoscută sub numele de direcționare activă sau selecție specifică, prin conjugarea de molecule care posedă afinitate mare față de moleculele frecvent întalnite pe celulele maligne. Utilizarea de molecule mici, ca agenți de direcționare oferă avantajele de a reduce posibilitatea de pierdere a funcționalității prin sinteza unei astfel MNP, afinitate de legare crescută prin atașare multivalenta (Weissleder et al., 2005).

De exemplu, acidul folic are receptor supraexprimat pe suprafața multor celule tumorale umane, inclusiv celulele tumorale ovariane, pulmonare, mamare, endometriale, renale și de colon (Peer et al., 2007). Tabelul I prezintă unele materiale tipice utilizate pentru suprafața de acoperire a MNP-ului.

Materialul utilizat în mod obișnuit în această etapă de modificare a suprafeței este un polimer, deoarece suprafețele polimerice furnizează o barieră sterică pentru a preveni aglomerarea nanoparticulelor și pentru a evita opsonizarea și în plus oferă un mijloc de a regla caracteristicile de suprafață ale MNP-urilor ca: sarcina de suprafață și funcționalitatea chimică.

Opsonizarea trebuie avută în vedere, deoarece conduce la eliminarea rapidă din sânge de către sistemul mononuclear fagocitar (SMF) cu acumularea ulterioară în organele SRE, cum ar fi splina și ficatul (Yan et al, 2005;.. Vonarbourg et al, 2006).

Unii factori de acoperire polimerică inclusiv structura chimică a polimerului (de exemplu hidrofil/hidrofob, caracteristici de biodegradare, etc), lungimea și greutatea moleculară a polimerului, modul în care este ancorat sau atașat (de exemplu lipirea electrostatică sau covalentă), conformația polimerului, iar gradul de acoperire a suprafeței particulei poate afecta performanța MNP-ului.

Un alt factor ce trebuie luat în considerare la utilizarea învelișurilor polimerice este efectul lor asupra proprietăților magnetice ale nanoparticulei, în care magnetizarea de saturație, în general, scade concomitent cu acoperirea polimerului, dar crește grosimea (Mikhaylova și colab., 2004).

Diverse specii monomere, cum ar fi bifosfonați, acidul dimercaptosuccinic și alcoxisilani, au fost evaluați ca ancore pentru a facilita atașarea de straturi polimerice pe MNP (Sun și colab., 2008). Agenții tensioactivi sunt, de asemenea, de obicei, folosiți pentru a pasiva suprafața și a extrage particulele stabile în ceea ce privește agregarea sau creșterea granulelor.

În general, agenții tensioactivi pot fi ancorați chimic sau adsorbiți fizic de MNP pentru a forma un strat unitar sau dublu, care creează forțe de respingere pentru a echilibra forțele de atracție magnetică Van der Waals, ce acționează pe nanoparticule. Printre agenții tensioactivi tipici enumerați în tabelul I, acidul oleic este cunoscut ca cel mai favorabil stabilizator de MNP deoarece produce nanocristale, care sunt extrem de uniforme și monodisperse.

Într-un studiu a fost raportat Willis et al. (2005) că pierderea de nesaturare a acidului oleic, pe o suprafață unui nanocristal de oxid de fier are loc în timpul sintezei acestuia. În plus față de acoperiri organice, structurile interne, respectiv pentru miezul propriu-zis, se foloșește silice, aur sau alt metal nobil, carbon, etc, biocompatibil, pentru a îngloba MNP-ul, această abordare devenind extrem de utilizată pentru dezvoltarea de MNP pentru aplicații biomedicale. Deci, aceste nanoparticule au miez de oxid de fier, cu un înveliș metalic exterior din materiale anorganice. Aceste acoperiri inerte oferă nu numai stabilitate nanoparticulelor în soluție, ci și protecție împotriva degradării chimice de miezuri magnetice, previn eliberarea componentelor potențial toxice și ajută la atașarea liganzilor biologici de suprafata nanoparticulelor.

Deși siliciu este materialul cel mai utilizat în acest grup, aurul și carbonul sunt alternativele recente ce prezintă o serie de avantaje. În timp ce utilizarea siliciului trebuie să depășească unele dificultăți, cum ar fi riscul de oxidare, sinteza unui înveliș uniform de siliciu cu o grosime controlată pe scara nanometrică, complicația de depunere a siliciului direct pe suprafața nanoparticulelor de metal pur, din cauza lipsei grupărilor -OH pe suprafața metalică, etc.

În schimb, aurul, oferă mai multe avantaje ca material de acoperire pentru MNP datorită reactivității sale chimice scăzute și a capacității unice de a forma monostraturi autoasamblate pe suprafața lor folosind alcantioli (Sun și colab., 2008). Suprafața de aur poate fi mai departe funcționalizată cu grupări tiol, permițând legarea liganzilor funcționali, care pot face materialele adecvate pentru aplicații catalitice și optice.

Între timp, MNP-urile protejate de un înveliș de carbon au captat atenția oamenilor de știință, datorită materialelor pe bază de carbon, deoarece prezintă mai multe avantaje față de polimeri sau geluri precum stabilitate termică și chimică mai mare împotriva oxidării și leșierii acide și biocompatibilitate (Lu și colab., 2007).

Multe studii au arătat că MNP bazate pe structuri de carbon, grafit, cum ar fi nanotuburi de carbon-carbon MNP și onion-MNPs se formează conform unui arc, de descărcare de gestiune, ablație laser, iradierea cu electroni, oferind o barieră eficientă împotriva oxidării și eroziunii acide. Între timp, recent MNP-urile de carbon primesc mai multă atenție, deoarece materialele pe bază de carbon, au multe avantaje față de polimer sau gel precum și stabilitate termică împotriva oxidării și leșierei acide, precum și biocompatibilitate (Lu și colab., 2007).

Analiza instrumentală a MNP

Dimensiunea și forma MNP sau ale oricărui tip de nanoparticule par a fi primele caracteristici care urmează să fie investigate în orice activitate de cercetare a nanoparticulelor. Microscopia electronică de transmisie (TEM) este cel mai comun instrument pentru a caracteriza dimensiunea și forma nanoparticulelor, în special pentru evaluarea cu succes a unui preparat.

De obicei, probele TEM sunt preparate prin evaporarea solventului dintr-o picătură de soluție de particule pe o grilă TEM (Liu și colab., 2005). Deși structurile de MNP sunt dezvăluite de imagini TEM, filme subtiri (de exemplu, planuri cristaline) sunt observate mai clar în microscopia electronică de transmisie de înaltă rezoluție (HRTEM). Imaginile HRTEM sunt formate dintr-un număr de grinzi difractate cunoscut sub numele de imagistică cu contrast de fază și sunt necesare pentru a construi o imagine a rețelei cristaline (Rühle și Ernst, 2003). Specimene foarte subțiri, lipsite de obiecte de preparare sunt de obicei necesare în această tehnică. Imaginile obținute din această tehnică confirmă faptul că MNP au structură cristalină de fier, de exemplu, prezența metalului fier din structura de MNP este evidentă(fig.1).

Fig. 1. TEM (A) și HRTEM (B) imagini ale nanoparticulelor de oxid de fier sintetizate prin

metoda de co-precipitare, procedeul publicat în cercetările anterioare (Jain și colab., 2005).

HRTEM arată multe planuri ce prezinta fâșii cu cristalinitate perfectă.

Tabel 1. Materiale utilizate pentru funcționalizarea nanoparticulelor.

2.3. CONTROLUL ANALITIC AL SUBSTANȚELOR ACTIVE ȘI AL ANSAMBLELOR NANOSTRUCTURATE

În etapa de control analitic al tuturor materialelor nanostructurate obținute s-a urmărit demonstrarea transferului substanței active pe suport și evidențierea eventualelor modificări produse de asocierea cu suportul.

Practic s-a constatat experimental că cele 5 cefalosporine au fost transferate fără o degradare majoră sau modificări structurale pe suport. Etapele procesului analitic au fost următoarele:

confirmarea structurală prin spectrele IR, folosind drept referință (pentru IR) spectrele de bibliotecă (Thermo Electron) ale cefalosporinelor utilizate;

confirmarea purității compușilor utilizați prin analiză HPLC;

confirmarea transferului substanței active pe suport prin spectre IR urmărind identificarea picurilor majore specifice cefalosporinelor utilizate;

confirmarea purității compușilor depuși prin analiză HPLC, urmărind prezența eventualilor contaminanți;

Instrumentele analitice folosite, modul de lucru pentru controlul analitic al materialelor utilizate și condițiile de lucru aferente etapelor procesului analitic sunt prezentate în continuare:

Analiza FT-IR:

spectrometru FT-IR Thermo Electron model 6700 prevăzut cu dispozitiv de introducere a probelor de tip HATR cu autoconfigurare, sursă MID EverGlo, detector DLaTGS cu efect piroelectric, beamsplitter XT-KBr, interferometru Michelson, domeniu de scanare 4000 – 650 cm-1, rezoluție 4 cm-1, viteza oglinzii mobile 0.6 cm/sec, mediere pe 32 de spectre, software pentru achiziție și prelucrarea datelor OMNIC ESP cu biblioteci de spectre IR aferente. Pentru înregistrarea spectrelor FT-IR a fost utilizat un dispozitiv ATR cu simplă reflexie de tip Smart Performer, cu presarea controlată a probei pe un cristal de ZnSe. Condițiile de analiză: rezoluție 4 cm-1, mediere pe 32 scan-uri, viteza oglinzii mobile 0.6 cm/sec (spectrometrul FT-IR utilizat folosește un interferometru tip Michelson pentru producerea interferogramei), background-ul fiind procesat în aceleași condiții de analiză. Pentru dispozitivul ATR de introducere a probei folosit, cantitatea de probă necesară nu este mai mare de 5 mg datorită unui diametru mic a cristalului ZnSe (2 mm), parcursul prin probă fiinde de 1 µm. Proba se introduce direct pe cristal fără nici o prelucrare suplimentară.

Analiza HPLC

Reactivi:

solvenți pentru HPLC acetonitril (Merck, LiChrosolv), metanol (Merck, LiChrosolv)

acetat de sodiu anhidru (Merck)

apă ultrapură (Sigma Aldrich, Chromasolv)

cefalosporine de uz farmaceutic: cefuroxima sodică (Medochemie Ltd.), cefotaxim (Antibiotice S.A.), cefaclor (Arena Group S.A.), ceftriaxonă (Antibiotice S.A.), cefoperazona sodică (Medochemie Ltd.)

Soluții stoc: cele cinci soluții stoc de cefalosporine au fost preparate astfel: s-a cântărit la balanța analitică o cantitate de 50 mg cefalosporină și s-a adus cantitativ cu amestecul de solvenți din faza mobilă în balon cotat de 10 mL, completat la semn cu același amestec.

Soluții de lucru: 1 mL din fiecare soluție stoc s-a adus într-un balon cotat de 10 mL la semn, cu amestecul de solvenți din faza mobilă. Pentru analiza cefalosporinelor depuse pe cele trei tipuri de suport nanostructurat de tip core – shell, Fe3O4/acid oleic soluțiile de lucru au fost preparate astfel: s-au cântărit separat câte 10 mg suport nanostructurat/cefalosporină și s-au dispersat în 2 mL acetonitril. Probele au fost agitate manual timp de 5 minute și apoi centrifugate la 6000 rpm timp de 10 minute. În cazul compușilor nanostructurați, după o omogenizare corespunzătoare (5 minute) s-a realizat o separare magnetică, folosind un magnet de mare putere (neodim-fier-bor), ce sedimentează materialul nanostructurat. La un timp de sedimentare de 10 minute, se constată că în probă nu mai există material nanostructurat (pentru cazuri incerte se folosește centrifugarea), acest fapt fiind esențial pentru protejarea coloanei C18 folosite pentru separare.

Pentru analiza prin cromatografie de lichide a celor cinci cefalosporine de uz farmaceutic folosite în studiu și pentru materialul nanostructurat de tip nanoparticule/cefalosporine am folosit o metodă adaptată după Steven A. Signs și colaboratorii.

Aparatură:

cromatograf de lichide Agilent 1100 prevăzut cu pompă cuaternară și detector UV-VIS multicanal.

Coloana cromatografică: Zorbax C18 de 100 mm, cu diametrul de 4.5 mm și dimensiunea particulelor de 5m

Faza mobilă: amestec acetonitril/metanol (96:4, v/v) adus la pH 5.2 cu acetat de sodiu 0.01M

Detecție: 270 nm

Volum de injecție: 20 L (injecție manuală).

Acest sistem cromatografic a fost utilizat pentru confirmarea purității compușilor utilizați (cefalosporine și compuși nanostructurați) pentru toate cele trei tipuri de suporturi nanostructurate C-Fe(T), C-Fe(B-A), Fe3O4/acid oleic.

cromatograf de lichide Thermo/FINNIGAN-SURVEYOR prevăzut cu pompă cuaternară și detector DAD

Coloana cromatografică: Hypersil Gold de 250 mm, cu diametrul de 4.6 mm și dimensiunea particulelor de 5m

Faza mobilă: amestec acetonitril/metanol (96:4, v/v) adus la pH 5.2 cu acetat de sodiu 0.01M

Detecție: 254 – 270 nm

Volum de injecție: 20 µL (injecție manuală).

Acest sistem cromatografic a fost utilizat pentru studiul HPLC privind stabilitatea în timp, la 6 luni de la depunerea inițială a celor 5 cefalosporine adsorbite pe cele trei tipuri de suporturi nanostructurate de tip core – shell Fe3O4/acid oleic pentru toate variantele de lucru. În aceste condiții pot fi vizualizate eventualele picuri suplimentare provenind de la posibilii produși de degradare ai cefalosporinelor.

În cele ce urmează vor fi prezentate rezultatele pentru toate substanțele biologic active de tip betalactamic utilizate.

2.3.1. Controlul analitic al substanței active și al ansamblelor nanostructurate pentru cefuroximă

Datele analitice privind cefuroxima sunt prezentate în figurile 40 – 43 fiind în concordanță cu elementele structurale specifice (IR: amină primară – benzile largi dublate corespunzătoare vibrațiilor de valență azot-hidrogen 3466 cm-1 și 3264 cm-1, suprapuse peste banda largă corespunzătoare vibrațiilor de valență oxigen-hidrogen deplasată la număr de undă sub 3400 cm-1, benzile corespunzătoare vibrațiilor de valență carbon-hidrogen la carbon saturat la 2900 cm-1 și 2824 cm-1 respectiv nesaturat 3053 cm-1, benzile corespunzătoare vibrațiilor de valență carbon-oxigen dublu legat amidic, carboxilic respectiv lactamic 1763 cm-1, 1715 cm-1, 1663 cm-1), respectiv puritatea aferentă produsului destinat utilizării farmaceutice, confirmată și de rezultatele analizei HPLC efectuată conform metodei descrise.

Figura 41. Cromatogramele HPLC pentru cefuroxima (după extracție cu solvent de pe suport C-Fe-B-A și ferită)

De asemenea, concordanța cu spectrul IR de referință, din biblioteca spectrală este edificatoare.

Figura 43. Spectrele FT-IR pentru cefuroxima (inițial și depusă pe suport)

Studiul HPLC privind stabilitatea în timp a cefuroximei depusă pe cele trei tipuri de suporturi nanostructurate, pentru toate variantele de lucru a presupus analiza cu ajutorul unui cromatograf de lichide, prevăzut cu detector DAD.

În aceste condiții pot fi vizualizate eventualele picuri suplimentare provenind de la posibilii produși de degradare.

Cromatogramele obținute sunt prezentate în figurile 44 – 47.

Datele experimentale demonstrază degradarea parțială în timp a compușilor activi (la 6 luni de la depunerea inițială). Procesul poate fi atribuit unor reacții de descompunere, oxidare și izomerizare, favorizate de suprafața specifică mare a supotului. De asemenea, s-a constatat experimental că suportul ferită/acid oleic conduce la degradări semnificativ mai reduse ale compușilor activi.

Printre posibilii compuși de degradare ai cefuroximei, conform monografiei substanței din Farmacopeea Europeană, ed. a 4-a pot fi:

Compusul format prin ciclizare intramoleculară

Acidul (Z)-(furan-2-il)(metoxiimino) acetic

Acidul format prin ruperea legărurii esterice

Studiile efectuate nu au avut drept scop studiul produșilor de descompunere (pentru confirmare fiind necesară analiza HPLC-MS), dar cromatogramele HPLC-DAD permit evidențierea acestora.

Cel mai ridicat nivel de descompunere a fost observat la cefuroximă, probabil datorită structurii chimice specifice acesteia, mai susceptibilă la degradare.

Figura 44. Cromatograma HPLC-DAD pentru cefuroxima referință

Figura 46. Cromatograma HPLC-DAD pentru cefuroxima / ferită

2.3.2. Controlul analitic al substanței active și al ansamblelor nanostructurate pentru cefotaxim

Datele analitice privind cefotaximul sunt prezentate în figurile 48 – 51 fiind în concordanță cu elementele structurale specifice (IR: amină primară – benzile largi dublate corespunzătoare vibrațiilor de valență azot-hidrogen 3460 cm-1 și 3247 cm-1, suprapuse peste banda largă corespunzătoare vibrațiilor de valență oxigen-hidrogen deplasată la număr de undă sub 3400 cm-1,

Figura 49. Cromatograma HPLC pentru cefotaxim (după extracție cu solvent de pe suport de ferită)

benzile corespunzătoare vibrațiilor de valență carbon-hidrogen la carbon saturat la 2900 cm-1 și 2824 cm-1 respectiv nesaturat 3053 cm-1, benzile corespunzătoare vibrațiilor de valență carbon-oxigen dublu legat amidic, carboxilic respectiv lactamic 1759 cm-1, 1729 cm-1, 1652 cm-1), respectiv puritatea aferentă produsului destinat utilizării farmaceutice, confirmată și de rezultatele analizei HPLC efectuată conform metodei descrise.

Figura 51. Spectrele FT-IR pentru cefotaxim (inițial și depusă pe suport)

Studiul HPLC privind stabilitatea în timp, la 6 luni de la depunere, a cefotaximului depus pe toate cele trei tipuri de suport nanostructurat, pentru toate variantele de lucru, a presupus analiza cu ajutorul unui cromatograf de lichide prevăzut cu detector DAD.

În aceste condiții pot fi vizualizate eventualele picuri suplimentare provenind de la posibilii produși de degradare ai cefotaximului, conform monografiei substanței din Farmacopeea Europeană, ed. a 4-a:

Acid (6R,7R)-3-[(acetiloxi)metil]-7-[[(2E)-2-(2-aminotiazol-4-il)-2-metoxiimino) acetil]amino]-8oxo-5-tia-1-azabiciclo[4.2.0]oct-2-en-2-carboxilic(E-cefotaxim) format prin ciclizare intramoleculară

Compusul format prin dimerizare

Cromatogramele obținute sunt prezentate în figurile 52 – 55.

Datele experimentale demonstrează degradarea parțială în timp a compușilor activi.

Figura 52. Cromatograma HPLC-DAD pentru cefotaxim referință

Figura 55. Cromatograma HPLC-DAD pentru cefotaxim / ferită

2.3.4. Controlul analitic al substanței active și al ansamblelor nanostructurate pentru cefoperazonă

Datele analitice privind cefoperazona sunt prezentate în figurile 64 – 67 fiind în concordanță cu elementele structurale specifice (IR: amină secundară – o singură bandă largă la 3286 cm-1

Figura 65. Cromatograma HPLC pentru cefoperazonă (după extracție cu solvent de pe suport de ferită)

corespunzătoare vibrațiilor de valență azot-hidrogen 3644 cm-1 și 3264 cm-1, suprapuse peste banda largă corespunzătoare vibrațiilor de valență oxigen-hidrogen deplasată la număr de undă sub 3400 cm-1, benzile corespunzătoare vibrațiilor de valență carbon-hidrogen la carbon saturat la 2900 cm-1 și 2824 cm-1 respectiv nesaturat 3053 cm-1, benzile corespunzătoare vibrațiilor de valență carbon-oxigen dublu legat amidic, carboxilic respectiv lactamic 1760 cm-1, 1717 cm-1, 1680 cm-1), respectiv puritatea aferentă produsului destinat utilizării farmaceutice, confirmată și de rezultatele analizei HPLC efectuată conform metodei descrise.

Figura 67. Spectrele FT-IR pentru cefoperazonă (inițial și depusă pe suport)

Studiul HPLC privind stabilitatea în timp a cefoperazonei depusă pe toate cele trei tipuri de suport nanostructurat, pentru toate variantele de lucru, a presupus analiza cu ajutorul unui cromatograf de lichide prevăzut cu detector DAD.

În aceste condiții pot fi vizualizate eventualele picuri suplimentare provenind de la posibilii produși de degradare ai cefoperazonei, conform Farmacopeei Europene, ed. a 4-a:

1-metil-5-tio-1H-tetrazol

Acidul (6R,7R)-7-amino-8-oxo-3-[(1H-1,2,3-triazol-4-ilsulfanil)metil]-5-tia-1-azabiciclo[4.2.0]oct-2-en-2-carboxilic (format în urma ruperii derivatului N-alchilat al fenilglicinei)

Cromatogramele obținute sunt prezentate în figurile 68 – 71.

Datele experimentale demonstrază degradarea parțială în timp a compușilor activi.

Figura 68. Cromatograma HPLC-DAD pentru cefoperazonă referință

Figura 71. Cromatograma HPLC-DAD pentru cefoperazonă / ferită

2.3.3. Controlul analitic al substanței active și al ansamblelor nanostructurate pentru cefaclor

Datele analitice privind cefaclorul sunt prezentate în figurile 56 – 59 fiind în concordanță cu elementele structurale specifice (IR: amină primară – benzile largi dublate corespunzătoare vibrațiilor de valență azot-hidrogen 3330 cm-1 și 3033 cm-1, suprapuse peste banda largă corespunzătoare vibrațiilor de valență oxigen-hidrogen deplasată la număr de undă sub 3400 cm-1, benzile corespunzătoare vibrațiilor de valență carbon-hidrogen la carbon saturat la 2900 cm-1 și 2824 cm-1 respectiv nesaturat 3053 cm-1, benzile corespunzătoare vibrațiilor de valență carbon-oxigen dublu legat amidic, carboxilic respectiv lactamic 1780 cm-1, 1699 cm-1, 1608 cm-1), respectiv puritatea aferentă produsului destinat utilizării farmaceutice, confirmată și de rezultatele analizei HPLC efectuată conform metodei descrise.

Figura 58. Cromatograma HPLC pentru cefaclor (după extracție cu solvent de pe suport de ferită)

Figura 59. Spectrele FT-IR pentru cefaclor (inițial și depusă pe suport)

Studiul HPLC privind stabilitatea în timp a cefaclorului depus pe toate cele trei tipuri de suport nanostructurat, pentru toate variantele de lucru, a presupus analiza cu ajutorul unui cromatograf de lichide prevăzut cu detector DAD.

În aceste condiții pot fi vizualizate eventualele picuri suplimentare provenind de la posibilii produși de degradare ai cefaclorului, conform Farmacopeei Europene, ed. a 4-a:

Fenilglicina

Acidul (6R,7R)-7-amino-3-chloro-8-oxo-5-tia-1-azabiciclo[4.2.0]oct-2-en-2-carboxilic (format în urma ruperii fenilglicinei)

Amida formată prin legarea fenilglicinei la gruparea -NH2 liberă, acidul (6R,7R)-7-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-2-fenilacetil]amino]-2-fenilacetil]amino]-3-cloro-8-oxo-5-tia-1-azabiciclo[4.2.0]oct-2-en-2-carboxilic (N – fenilglicil cefaclor)

Cromatogramele obținute sunt prezentate în figurile 60 – 63.

Datele experimentale demonstrază degradarea parțială în timp a compușilor activi.

Figura 60. Cromatograma HPLC-DAD pentru cefaclor referință

Figura 63. Cromatograma HPLC-DAD pentru cefaclor / ferită

2.3.5. Controlul analitic al substanței active și al ansamblelor nanostructurate pentru ceftriaxonă

Datele analitice privind ceftriaxonă sunt prezentate în figurile 72 – 75 fiind în concordanță cu elementele structurale specifice (IR: amină primară – benzile largi dublate corespunzătoare vibrațiilor de valență azot-hidrogen 3630 cm-1 și 3268 cm-1, suprapuse peste banda largă corespunzătoare vibrațiilor de valență oxigen-hidrogen deplasată la număr de undă sub 3400 cm-1,

Figura 73. Cromatograma HPLC pentru ceftriaxonă (după extracție cu solvent de pe suport de ferită)

benzile corespunzătoare vibrațiilor de valență carbon-hidrogen la carbon saturat la 2937 cm-1 și 2824 cm-1 respectiv nesaturat 3053 cm-1, benzile corespunzătoare vibrațiilor de valență carbon- oxigen dublu legat amidic, carboxilic respectiv lactamic 1744 cm-1, 1649 cm-1, 1604cm-1), respectiv puritatea aferentă produsului destinat utilizării farmaceutice, confirmată și de rezultatele analizei HPLC efectuată conform metodei descrise.

Figura 75. Spectrele FT-IR pentru ceftriaxonă (inițial și depusă pe suport)

Studiul HPLC privind stabilitatea în timp a ceftriaxonei depusă pe toate cele trei tipuri de suport nanostructurat, pentru toate variantele de lucru, a presupus analiza cu ajutorul unui cromatograf de lichide prevăzut cu detector DAD.

În aceste condiții pot fi vizualizate eventualele picuri suplimentare provenind de la posibili produși de degradare ai ceftriaxonei, conform monografiei substanței din Farmacopeea Europeană, ed. a 4-a:

Compușii formați prin dimerizare și ciclizare intramoleculară, similar cefotaximului

2-metil-3-sulfanil-1,2-dihidro-1,2,4-triazin-5,6-dionă

Acidul format prin ruperea legăturii amidice

Cromatogramele obținute sunt prezentate în figurile 76 – 79.

Figura 76. Cromatograma HPLC-DAD pentru ceftriaxonei referință

Figura 79. Cromatograma HPLC-DAD pentru ceftriaxonei / ferită