Studiul Obtinerii Ergosterolului Prin Biosinteza Saccharomyces Cerevisiae

CUPRINS

Introducere

Partea I – Studiu de literatura

Ergosterolul………………………………………………………………………………………………….6

Scurt istoric……………………………………………………………………………………..6

Structura și proprietățile ergosterolului………………………………………………..7

Obținerea ergosterolului…………………………………………………………………….8

Biosinteza ergosterolului………………………………………………………………….10

Inhibitorii ergosterolului………………………………………………………………….14

Drojdii………………………………………………………………………………………………………..17

Scurt istoric……………………………………………………………………………………17

Generalități……………………………………………………………………………………..18

Impotanță………………………………………………………………………………………18

Răspândire în natură………………………………………………………………………19

Caracteristici morfologice………………………………………………………………..19

Structura celulei de drojdie……………………………………………………………..20

Caracteristici fiziologice………………………………………………………………….24

Compoziția chimică…………………………………………………………………………25

Reproducerea drojdiilor………………………………………………………………….26

Nutriția drojdiilor……………………………………………………………………………30

Clasificarea generală a drojdiilor………………………………………………………..31

Saccharomyces cerevisiae……………………………………………………………………………….33

3.1. Introducere………………………………………………………………………………………….33

3.2. Particularități……………………………………………………………………………………….33

3.3. Biosinteza Saccharomyces cerevisiae…………………………………………………….36

Partea a II-a – Contribuții experimenale originale

Introducere……………………………………………………………………………………………………42

Materiale și metodă de lucru……………………………………………………………………………43

Tehnică experimentală……………………………………………………………………………………45

Rezultate și discuții………………………………………………………………………………………..50

Concluzii………………………………………………………………………………………………………58

Bibliografie

INTRODUCERE

Sterolii sunt compuși esențiali ai tuturor celulelor eucariote. Fitosterolii sunt sterolii care se întâlnesc în plante. Sterolul predominant din drojdia Saccharomyces cerevisiae este ergosterolul, echivalentul colesterolului din celulele animale. Ca în orice celulă eucariotă și în celulele de Saccharomyces cerevisiae, sterolii sunt prezenți sub două forme: ca steroli liberi și sub formă de esteri (esterificată).

Sterolii liberi se găsesc cu preponderență în membrana plasmatică a celulelor și asigură fluiditatea și permeabilitatea acesteia. Esterii de sterol sunt localizați în particolele lipidice din citosolul celulelor cu rol în homeostazia sterolilor.

Ergosterolul este o substanță prezentă în diverse țesuturi animale și vegetale, a cărei activare, prin iradiere cu raze ultraviolete, produce vitamina D2-ergosterina. Ergosterolul este un component esențial al celulelor de drojdie, cu rol în menținerea integrității celulare. Acest compus reprezintă provitamina (precursorul) vitaminei D2.

Acest compus poate fi obținut prin mai multe metode, însă cea mai utilizată este cea a obținerii sale printr-un proces de fermentație cu drojdia Saccharomyces cerevisiae.

Saccharomyces cerevisiae este una dintre puținele drojdii capabile să crească rapid în condiții anaerobe. Fermentația anaerobă a Saccharomyces cerevisiae joacă un rol major în producția băuturilor alcoolice și a pâinii.

Sinteza de ergosterol nu este determinată de creșterea masei celulare ci de rata consumului de O2 din mediu. Creșterea coeficientului volumic de transfer de oxigen în mediu, se face prin adăugarea în lichidul de fermentație a unui component care va facilita transportul oxigenului. S-a introdus noțiunea de oxigen-vectori pentru acei compuși care adăugați mediului conduc la intensificarea procesului de transfer al oxigenului. În biotehnologie, principalii oxigen-vectori utilizați sunt hidrocarburile parafinice și hidrocarburile perfluorurate.

La realizarea acestui studiu, ca oxigen-vector s-a folosit n-dodecanul.

Obiectivele acestui studiu au constat în investigarea comportamentului unei tulpini de drojdie în condiții de fermentație aerobă cu alimentare semicontinuă de glucoză, în prezența respectiv absența oxigen vectorilor în scopul obținerii de produs intracelular specific, ergosterolul, precum și investigarea unei proprietăți importante a acestui compus, cea a toleranței celulelor de drojdii la etanol. În vederea realizării acestui obiectiv s-a parcurs la trecerea de la fermentația aerobă / producere de biomasă (produs intracelular ergosterolul), la fermentația anaerobă / alcoolică cu producere de etanol.

PARTEA I

STUDIU DE LITERATURĂ

Ergosterolul

Ergosterolul este utilizat ca medicament antifungic și antiprotozor. Ergosterolul,

pe langă faptul că este prezent în membranele celulare ale ciupercilor, este prezent și în memebranele celulalare ale protistelor.

Ergosterolul este un precursor al vitaminei D2 a cărei denumire chimică este ergocalciferol. Expunerea la lumină ultravioletă provoacă o reacție fotochimică care convertește ergosterolul în ergocalciferol.

Scurt istoric

În 1889, Tanret a izolat un produs din ciuperca de creștere a cornului de secara, produs pe care l-a numit ”ergosterină”. În 1895, Gerard a preparat ergosterol din drojdie și l-a recunoscut drept analogul colesterolului. Deși J. Zellner a obținut ”ergosterină” din ciuperci otrăvitoare, în 1919 Ikeguchi a izolat un sterol din fungi numindu-l mucosterol. Ulterior, Thomas a obținut ergosterol din drojdie. Din acel moment analiza sterolilor s-a extins la numeroase specii de ciuperci.

Ergosterolul este un sterol ce se găsește în membranele celulare ale fungilor și protozoarelor. El are aceleași funcții pe care le are colesterolul în celulele animale. Deoarece fungii și propozoarele nu pot supraviețui fără ergosterol, enzimele cuprinse în el au devenit importante în obținerea medicamentelor. Ergosterolul este un precursor al vitaminei D2 și cortizonului (Arnezeder, C. Si W.A. Hampel,1990), care expus la lumină ultravioletă determina o reacție chimică ce produce vitamina D2 .

Ergosterolul este un metabolit important obținut din Saccharomyces cerevisiae. El joacă un rol important în funcțiile fiziologice și în studiile clinice, fiind utilizat în tratamentul rahitismului și al infecțiilor fungice, boli cauzate de deficitul de vitamina D2. De asemenea, este responsabil de caracteristile structurale ale membranei, cum ar fi integritatea, fluiditatea, permeabilitatea( Parks, L.W și W.M. Casey, 1995).

Ergosterolul are un rol foarte important în organizarea structurală și în activitatea vitală a tuturor organismelor vii, inclusiv a microorganismelor. Ca parte componentă a protoplastului, ergosterolul posedă o înaltă activitate biologică, formând împreună cu proteinele și glucidele macrocompuși. Un alt aspect important, este faptul că acesta are rolul de reglator în procesul de peroxidare a componentelor lipidice din membrană. Este localizat în unele organite celulare (mitocondrii, microsomi), și se poate găsi în stare liberă sau esterificat cu acizii grași înalt moleculari.

Structura si proprietățile ergosterolului

Ergosterolul aparține familiei sterolilor si este legat chimic de colesterol.

Ergosterolul este o substanță prezentă în diverse țesuturi animale și vegetale, a cărei activare, prin iradiere cu raze ultraviolete, produce vitamina D2-ergosterina.

Formulă chimică

Formula moleculară a ergosterolului este C28H44O și denumirea dupa IUPAC este ergosta-5,7,22-trien-3β-ol.

Sterolii sunt monoalcooli ciclici, ce derivă de la o hidrocarbură policiclică – steran, nucleul de bază este de natură ciclopentanperhidrofentrenică. Aceștia conțin în moleculă și alte elemente constitutive: la C3 au o grupare hidroxilică care le conferă statutul de alcooli secundari; la C17 au fixată o catenă laterală formată din 8-10 atomi de carbon care se termină printr-un radical izopropilic; la punctele de legătură dintre cicluri, respectiv la C10 și C13, sunt fixați doi radicali metil, notați C18 și C19, acești substituenți se numesc metili angulari; ciclurile și catena laterală pot fi saturate complet sau pot conține 1-3 legături duble.

Fig.1.1 Formula chimică a ergosterolului

Proprietăți fizice

Ergosterolul este o substanță albă, cristalină, insolubilă în solvenți organici.

Greutatea moleculară a ergosterolului este 396.65, punctul de topire este 156-158ºC și punctul de fierbere este de 250ºC.

Praful de ergosterol este iritant pentru piele, ochi și tractul respirator. Ingerarea unor cantități mari de ergosterol poate provoca hipercalcemie, care (dacă se prelungește) poate duce la depozite de sare de calciu în țesuturile moi și în special în rinichi.

Obținerea ergosterolului

Sursele folosite pentru obținerea ergosterolului sunt: fungi, alge verzi și brune, drojdii( Saccharomyces ellipsoideus, Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula glutinis), mucegaiuri( Penicillium weslingii, Aspergillus spp.), bacterii(Mycobacterium rubrum).

În principal, ergosterolul este obținut prin doua metode diferite. Prima metodă constă în extracția ergosterolului în urma degradării miceliului prin fermentația penicilinei. A doua metodă este extracția ergosterolului prin fermentația drojdiilor. Fermentația discontinuă este aplicată în general pentru a obține o producție eficientă de proteine sau alte produse intracelulare din Saccharomyces cerevisiae(Hensing, M.C.M., 1995).

Tradițional, ergosterolul se obține din biomasa drojdiilor de panificație și bere, mai rar din drojdiile de vin sau miceliul ciupercilor – deșeuri ale producerii acizilor organici și antibioticilor. Producătorii performanți de ergosterol sunt drojdiile din genul Saccharomyces care conțin în jur de 12,3…31,5% steroli din suma fracțiilor de lipide sintetizate. În paralel cu sacharomicetele, în calitate de surse de perspectivă a sterolilor se precaută și biomasa drojdiilor din genurile Candida și Rhodotorula, care conține până la 8,5…11,0 % steroli.

Microorganismele eucariote, și îndeosebi drojdiile, sunt considerate producători specializați în biosinteza sterolilor, componentul de bază fiind ergosterolul. Conținutul acestuia variază în limitele 60-90% din totalul sterolilor celulei. O serie de tulpini de drojdii se caracterizează și prin conținut ridicat de 24(28)-dehidroergosterol, unele acumulează zimosterol, lanosterol. În general celulele drojdiilor pot conține până la 20 tipuri de steroli.

La nivel industrial ergosterolul este obținut din drojdiile de panificație și cele de bere, ce aparțin genului Saccharomyces, conținutul căruia ajunge în limitele 0,2-11% din masa uscată a drojdiilor.

Extracția ergosterolului din drojdie

Ergosterolul este obținut prin izolare din conținutul total de steroli din produsul de fermentație și separarea ulterioara a ergosterolului de ceilalți steroli. Izolarea conținutului de steroli implică extracția totală a componentei cu grasimi, saponificarea și extragerea porțiunii nesaponificată, de obicei, cu un eter.

O altă metodă este saponificarea intregului produs de fermentație, urmată de izolarea fracției nesaponificată. Separarea sterolilor din această fracție este făcută prin cristalizare folosind un solvent adecvat( acetonă sau alcool). Ergosterolul este recristalizat din diclorura de etilenă, singur sau în amestec cu metanol.

Ergosterolul este deosebit de dificil de extras din drojdie prin simplă extracție, deoarece se obține aproximativ 25% din conținutul total de ergosterol.

Influența unor factori de cultivare asupra biosintezei ergosterolului

Din seria de factori importanți pentru cultivarea drojdiilor fac parte temperatura, concentrația ionilor de hidrogen, concentrația oxigenului, componența mediului de nutriție. Modificarea unuia dintre parametri atrage după sine modificarea celorlalți, iar influența asupra proceselor biosintetice este semnificativă. Celulele de drojdii sunt facultativ aerobe, iar respirația aerobă intensă este o condiție indispensabilă pentru generarea de masă celulară și de sinteză a principiilor bioactive. Conținutul de steroli suferă schimbări vizibile în urma modificării condițiilor de cultivare. De la o trecere de la condițiile anaerobe la cele aerobe are loc o acumulare bruscă a sterolilor, astfel încât se modifică și corelația fracțiilor acestora: conținutul sterolilor legați (eteri de steroli) în condiții aerobe poate ajunge pînă la 85-90% din conținutul total de steroli, iar fracția de steroli liberi ajunge până la 10-15%. Cunoașterea modului în care fiecare factor influențează gradul transformărilor metabolice permite stabilirea principiilor de modelare și de optimizare a proceselor de fermentație. Eficientizarea condițiilor optime de cultivare a tulpinii producătoare poate duce la majorarea performanței proceselor de biosinteză.

Biosinteza ergosterolului la drojdii depinde de starea fiziologică a culturii. Conținutul de ergosterol crește odată cu îmbătrânirea organismului, atât animal și vegetal cât și microbian. Conținutul de ergosterol crește odată cu prelungirea duratei de cultivare.

Un rol important pentru biosinteza ergosterolului la drojdii îl au factorii exogeni, cum ar fi: temperatura, cantitatea de aer, pH-ul . Temperaturile ridicate induc represia enzimelor de sinteză a acidului mevalonic, iar temperaturile scăzute duc la micșorarea conținutului de steroli în celulă.

Biosinteza ergosterolului

Calea mevalonat

Cel puțin 20 de procese metabolice sunt necesare pentru a sintetiza steroli, cum ar fi ergosterol, cu câteva etape care implică enzime specifice care diferă între celulele de mamifere și microorganisme. Scheletul de carbon a moleculei de ergosterol derivă din acetil-CoA, cu excepția grupării metil C24 din catena laterală a ergosterolului. Primele reacții în procesul de bosinteză implică condensarea a două unități acetil-CoA, pentru a forma acetoacetil-CoA, urmată de adăugarea unei a treia unitate pentru a forma 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA(HMG-CoA), care este apoi redusă de NADPH( nicotinamid adenin dinucleotid fosfat) pentru a forma acidul mevalonic. Aceste trei etape cuprind calea mevalonat și sunt catalizate de enzima citosolică acetoacetil-CoA tiolaza și doua enzime mitocondriale(HMG-CoA sintaza și HMG-CoA reductaza).

Fig. 1.2 Obținerea mevalonatului

Conversia mevaloatului în două izoprene active

În următoarea etapă a sintezei ergosterolului, trei grupari fosfat sunt transferate de la trei molecule de ATP în mevalonat. Fosfatul atașat la gruparea C3 hidroxil a mevalonatului în intermediarul 3-fosfo-5-pirofosfatmevalonat este o grupare scindabilă. În urmatoarea etapă, atât gruparea fosfat cât și gruparea carboxil din apropiere se scindează, producând o legătură dublă la carbonul 5 rezultat, – izopentenil pirofosfat. Aceasta este una din cele doua izoprene active necesare formării de ergosterol. Izomerizarea acesteia duce la a doua izoprena activă, dimetilalil pirofosfat.

Fig. 1.3 Conversia mevalonatului în izoprene active

Obținerea de scualen

Scualenul este un compus organic cu formula chimică C30H50. Cel mai des este obținut din ulei de ficat de rechin și se prezintă sub forma unui lichid gălbui translucid. Scualenul este un produs intermediar în procesul de metabolizare al colesterolului. Consumul de scualen contribuie la eliminarea colesterolului din organism. Acesta, exercită, de asemenea, un efect antiinflamator puternic și antioxidant. Are capacitatea de a satura țesuturile cu oxigen, împiedicând astfel acțiunea distrugătoare a radicalilor liberi asupra celulelor.

Izopentenilul pirofosfat si dimetilalul pirofosfat suferă o condensare cap-la-coada, în care o grupare pirofosfat este dislocată se formează generanil pirofosfat, un lanț de 10 atomi de carbon. Geranil pirofosfat suferă o altă condensare cap-la-coada cu izopentenil pirofosfat formând farnesil pirofosfat, un lanț de 15 atomi de carbon. În final, doua molecula de farnesil pirofosfat se unesc cap-la-cap, cu eliminarea gruparilor pirofosfat, pentru a forma scualen.

Fig. 1.4 Obținerea scualenului

Conversia scualenului în structură ciclică și obținerea ergosterololului

După producerea de scaulen, trebuie obținută structura ciclică a sterolilor. Toți sterolii au în structura lor patru inele condensate care formează nucleul steroidic, și toate sunt alcooli, cu o grupare carboxil la carbonul 3, de aici denumirea de ”sterol”.

Biosinteza ergosterolului continuă cu sinteza de epoxid scualen(2,3-oxidoscualen) într-o reacție catalizată de enzima scualen epoxidaza. Aceasta este prima etapă în transformarea lanțului de scualen de 30 de carbon în schelet sterol tetraciclic. Scualen epoxidaza este prima enzimă din proces care necesită oxigen molecular, iar această reacție este realizată printr-un complex microzomial constând dintr-o flavoproteină.

Cea mai importantă reacție în procesul de biosinteză este transformarea epoxidului de scualen în lanosterol, precursorul inițal al biosintezei.

Compușii azolici inhibă enzima citocrom P450 (lanosterol 14-α demetilaza) codificată de gena ERG11, enzimă care catalizează transformarea lanosterolului în ergosterol.

Triazolii (fluconazol, itraconazol, voriconazol și posaconazol) se leagă la gruparea hem a enzimei țintă și blochează demetilarea lanosterolului la C-14, care are ca efect depleția ergosterolului și acumularea de steroli intermediari toxici. Dintre acești steroli intermediari fac parte 4,14-dimetilzimosterol și 24-metilendihidro-lanosterol care intră în compoziția membranei plasmatice și, ca urmare, Fig. 1.5 Obținerea ergosterolului

are loc alterarea structurii și funcției acesteia. Acțiunea antifungică a triazolilor este în general fungistatică împotriva speciilor de drojdii, ca de exemplu speciile genului Candida, dar fungicidă împotriva infecțiilor cauzate dediferite specii de mucegaiuri (de ex. Aspergillus).

Inhibitorii ergosterolului

Cu excepția 5-flucitozinei, majoritatea antifungicelor actuale au drept țintă ergosterolul, component esențial al peretelui celular fungic. Dintre clasele de antifungice folosite în terapie, de menționat ar fi urmatoarele:

– Polienele;

– Azolii;

– Alilaminele;

– Morolfinele.

Polienele

Polienele (amfotericina B, nistatina) se intercalează în membranele care conțin ergosterol.

Amfotericina B este o macrolidă polienică care are afinitate crescută pentru ergostreol și se leagă ireversibil de ergosterol. Ea formează canale la nivelul peretelui și membranei celulare a fungului, determinând efluxul ionilor de potasiu și a altor componente celulare, ducând la o afectare ireversibilă a echilibrului ionic al celulei. Ca urmare, se formează o serie de canale membranare care duc la distrugerea legăturilor chimice, urmată de ieșirea diferitelor molecule cu masă moleculară mică din interiorul celulei și în final la moartea acesteia. De regulă se administrează intravenos, ca tratament de elecție al infecțiilor micotice sistemice rapid progresive la bolnavii imunodeprimați (SIDA).

Nistatina (stamicin) este un antibiotic polenic ce interfera(prin legarea sterolilor, în principal a ergosterolului) cu permeabilitatea membranei celulare a fungilor sensibili. Este mai toxică decât amfotericina B, de aceea nu se folosește sistemic, ci numai pentru tratamentul candidozelor locale (cutanate, vaginale, orale). Utilitatea lor este limitată din cauza toxicității lor crescute asupra organismului uman (datorită asemănărilor între ergosterol și colesterolul membranelor celulare umane).

Fig. 1.6 Inhibitorii ergosterolului

Azolii (fluconazolul, itraconazolul și ketoconazolul)

Azolii sunt folosiți cu succes în majoritatea infecțiilor fungice. Ei acționeaza în mod diferit, prin inhibarea sintezei ergosterolului din lanosterol. Ergosterolul este o moleculă mai mica decât molecula de lanosterol, este sintetizată prin combinarea a două molecule de farnesil pirofosfat, o terpenoidă de 15 carboni lungime, în lanosterol care are 30 atomi de carbon. Apoi, doua grupe metil sunt îndepărtate pentru a obține ergosterolul. Clasa ”azol” de medicamente antifungice inhibă enzima care produce aceste etape de demetilare în procesul de biosinteză dintre lanosterol și ergosterol.

a. Fluconazolul este un bi-triazol, fungistatic, cu două grupe triazol, fiecare conținând 3 atomi nitrogen. Atomii fluorinați în pozițiile 2 și 4 ale inelului fenil contribuie la lipofilia scăzută a fluconazolului și determină rezistența la metabolizare, specificitate crescută și potența mai înaltă în comparație cu alți agenți antifungici. El acționează prin inhibarea 14alfa dimetilazei, enzimă care convertește lanosterolul în dimetillanosterol, inhibând astfel formarea ergosterolului, component esențial al membranei fungice, care asigură integritatea și creșterea fungilor. Inhibarea enzimei are drept rezultat depleția ergosterolului și acumularea în celulă a sterolilor 14α metilați. Acest mecanism are drept rezultat stoparea creșterii celulare și nu moartea celulară, azolii având efect fungistatic.

b. Itraconazolul este un agent antifungic triazolic, fungistatic in vitro. El împiedică sinteza ergosterolului în celula fungică prin blocarea enzimei lanosterol C14 alpha demetilaza dependentă de citocromul P450. Astfel, are loc scăderea ergosterolului și creșterea lanosterolului pe membrana celulei fungice, determinând alterarea permeabilității și funcției acesteia.

c. Ketoconazolul este primul antifungic cu spectru larg din grupul azolilor, disponibil pentru administrare orală din 1980. Este în principal fungistatic. Inhibă lanosterol 14 demetilaza din citocromul P450 și consecutiv conversia lanosterolului în erogosterol. Are loc acumularea sterolilor C14 cu depleția membranară de ergosterol. În interiorul celulei fungice se petrece o inhibiție a sintezei de trigliceride și fosfolipide. Sinteza de chitină este de asemenea inhibată.

1.5.3. Alilaminele (terbinafina)

Terbinafina are un mecanism de acțiune diferit de cel al azolilor. Blochează sinteza ergosterolului prin inhibiția scualen – epoxidazei fungice, enzimă care nu aparține familiei citocromului P450. Această inhibiție duce la acumularea intracelulară a unor cantități mari de scualen și scăderea sintezei ergosterolului. Efectul fungicid al terbinafinei s-ar datora mai degrabă acumulării de scualen decât scăderii sintezei ergosterolului.

Morolfinele (amorolfina)

Morolfinele inhibă două enzime din calea de biosinteză a ergosterolului, C-14 sterol reductaza și C- 8 sterol izomeraza.

Drojdii

Istoric

Drojdiile reprezintă un grup taxonomic complex și heterogen de microorganisme monocelulare de tip eucariot care se înmulțesc prin înmugurire, ca formă generală de reproducere și prin ascospori formați pe cale asexuată și sexuat.

Fără să știe nimic despre metabolismul drojdiei, despre celule și detaliile unui proces de fermentație, oamenii au descoperit că există un organism care face berea și vinul să fermenteze, iar aluatul de pâine să crească. Acele organisme erau drojdiile sălbatice, prezente în aer sau pe coaja bobului de strugure, de fapt mai peste tot în jur, și care, ajunse într-un mediu prielnic( unul cu multe zaharuri) începeau procesul de fermentație, descompunând zaharurile și producând alcool etilic și dioxid de carbon. Cu timpul, oamenii au stăpânit tot mai bine acest proces și au renunțat în mare măsură la drojdiile sălbatice, la ora actuală se recurge, în general, la tulpini selecționate de drojdii, produse industrial. Dar esența procesului a rămas aceeași, iar drojdiile sunt la fel de utile, economic și cultural, civilizației umane.

Cercetările au scos la iveală dovezi ale utilizării unor procese de fermentație cu drojdii, pentru fabricarea berii și a pâinii, încă de acum 4.000 de ani, în Egipt, și indicii ale fabricării vinului încă de acum cel puțin 6 milenii în Georgia, Armenia, Grecia. Organismul care făcea posibile aceste procese, a fost observat la microscop în 1680 de către Anton van Leeuwenhoek, naturalistul olandez considerat "părintele microbiologiei", inventator al microscopului și primul om care a observat și studiat organisme unicelulare. Totuși, în privința drojdiei se pare că s-a înșelat, deoarece, când a văzut celulele de drojdie la microscop, a crezut că nu este vorba despre forme de viață, ci despre niște formațiuni globulare oarecare. Rolul drojdiei în fermentație a fost lămurit abia în 1857, de Louis Pasteur, care a explicat în lucrarea sa ”Mémoire sur la fermentation alcoolique” că fermentația alcoolică era produsă de un organism viu, Saccharomyces cerevisiae, și nu de un catalizator chimic, așa cum credeau mulți până la el. Pasteur a observat că fermentația zaharurilor din fructe sau din alte surse este un proces legat de funcția vitala a celulelor de drojdie, iar Liebig a susținut că fermentația se datorește descompunerii proteinelor din celulele drojdiei, proces care antrenează și descompunerea zaharurilor.

Generalități

Drojdia este folosită ca organism model în biologia modernă a celulei și este printre cele mai cercetate organisme eucariote. În ultima vreme, s-a constatat că drojdia poate fi folosită pentru a genera energie electrică și că poate produce etanol.

Au fost cercetate până în prezent peste 1.500 de specii de drojdie, fiecare având diferite mărimi, variind între 3 și 7 micrometri în diametru. Cu toate acestea, se presu-pune că doar 1% din toate speciile de drojdie ar fi fost descoperite. Drojdia nu necesită lumină pentru a crește. Pentru acest scop ea utilizează resurse organice ca surse de energie. Unele specii necesită oxigen pentru “respirație”, altele, deși anaerobe, necesită oxigen pentru înmulțire. Drojdia se reproduce sexuat sau asexuat.

Două forme de celule de drojdie fungice pot supraviețui și pot crește: haploide și diploide. Celulele haploide, supuse ciclului de viață, mitoza și creștere, și în condiții de stres ridicat, în general mor. Aceasta este forma asexuată a drojdiei. Celulele diploide, sunt supuse în mod similar ciclului de viață. În condiții de stres, celulele diploide pot suferi sporulare, formând patru spori haploizi care se pot împerechea. Aceasta este forma sexuată a ciupercii. Cu toate acestea, ratele de creștere variază enorm, atat între tulpinile de drojdie cât și între medii. Valoarea medie de viață este de 26 de diviziuni celulare.

Pentru fiecare specie de drojdie, raportul între lungime si lățime este un element caracteristic. În anumite medii de cultură, de regulă în medii lichide, drojdiile se acoperă cu o pânză fragilă. În mediile solide, drojdiile formează colonii de diferite culori.

Importanță

Având drept caracteristică principală capacitatea de a produce fermentarea glucidelor simple în anaerobioză, cu formare de alcool etilic și dioxid de carbon, drojdiile fermentative sunt utilizate industrial în biotehnologii alimentare la fabricarea spirtului de fermentație, a vinului, a berii și a pâinii. Drojdiile au o compoziție chimică valoroasă și după cultivare în condiții de aerare și prelucrare sunt utilizate ca sursă de proteine în alimentația umană (cu denumirea de SCP – single cell protein – proteine monocelulare) sau în alimentația animalelor, deoarece, pe lângă 45-55% proteină brută s.u., aduc în rație aminoacizi și vitamine ale grupului B. În microbiologia industrială din biomasa de drojdie se obțin: plasmolizate, autolizate, folosite ca aditivi alimentari sau pentru îmbogățirea în substanțe azotate a mediilor de cultură destinate fermentațiilor. Cu ajutorul drojdiilor se pot obține avantajos. În condiții industriale, vitaminele hidrosolubile (B1, B2, PP, ergosterol), enzime (β-fructofuranozidaza și β-galactozidaza), iar prin metode de inginerie genetică, din mutanți ai speciei Saccharomyces cerevisiae, s-a obținut interferonul – substanță cu efect antiviral și citostatic.

Răspândire în natură

Drojdiile au o largă răspândire în mediul ambiant, fiind întâlnite în toate habitatele naturale: sol, ape, aer, plante, animale. În sol, celulele de drojdie se întâlnesc în straturile superficiale, până la adâncimi de aproximativ 30 cm. Cantitatea crește în solurile viilor și grădinilor, ca urmare a îmbogățirii solului în substanțe nutritive furnizate de fructele care cad la sol și suferă lent putrezirea.

Din sol, prin acțiunea unor factori fizici, mecanici și biologici, microorganismele ajung temporar în aer și se răspândesc la distanțe mari; din sol și aer drojdiile pot ajunge în apă, unele specii fiind întâlnite chiar la adâncimi de 4000 m. În mod permanent, drojdiile se află în microbiota epifită a plantelor( flori, fructe, frunze, rădăcini). Răspândirea drojdiilor este favorizată de insecte, care, o dată cu nectarul/sucul, preiau și celule de drojdii care pot hiberna în tractul digestiv al insectelor. În organismul animal, drojdiile sunt prezente în biocenoza intestinală și se elimină pe căi naturale prin produsele de dejecție; în cantități mai reduse se întâlnesc în cavitatea bucală și pe piele. Un grup restrâns de drojdii sunt patogene (Candida albicans, Cryptococcus neoformans) și dau îmbolnăviri la om și la animale.

Caracteristici morfologice

Celula de drojdie are în mod obișnuit formă sferică, ovală sau cilindrică, cu dimensiuni medii de la 4-14 µm. Unele tulpini sunt monomorfe, deci prezintă în cultura pură celule de un singur tip morfologic, iar altele sunt dimorfe sau polimorfe. Forma și dimensiunea celulelor este un caracter de gen și specie, dar acestea pot fi influențate de starea fiziologică și de condițiile de cultivare. Dintre formele caracteristice unor genuri, cu importanță în industria alimentară, se menționează:

– forma ovală (elipsoidală) specifică drojdiilor fermentative ce aparțin genului Saccharomyces;

– forma sferică: predomină la drojdii din genul Torulopsis;

– forma apiculată (de lămâie), întâlnită la genurile Kloeckera și Hanseniaspora;

– forma cilindrică (alungită), specifică drojdiilor din genul Candida și genul Pichia;

– forma de sticlă, specifică drojdiilor din genul Saccharomyces.

Structura celulei de drojdie

Celula eucariotă de drojdie se deosebește puțin de celula animală; de celula vegetală se diferențiază prin absența cloroplastelor și a învelișului celulozic. Unele structuri subcelulare se pot vizualiza cu ajutorul microscopului fotonic (nucleu, mitocondrii, vacuole, perete celular, citozol), în timp ce ultrastructurile (membrana citoplasmatică, reticulul endoplasmatic, aparatul Golgi) au putut fi observate doar cu microscopul electronic( x 20 000). Cunoașterea organizării arhitecturale complexe a celulei de drojdie este utilă pentru înțelegerea potențialului funcțional al diferitelor componente.

Fig. 2.1 Structura celulei de drojdie

Învelișurile celulare sunt reprezentate de peretele celular și plasmalemă, care limitează celula și intervin în toate procesele biologice fundamentale ce se desfășoară la nivel celular.

2.6.1. Peretele celular

Peretele celular are o grosime de aproximativ 250 nm și poate să reprezinte o pondere de 5-15 % din biomasa uscată de drojdie. Din punct de vedere structural, peretele celular are aspect laminar și este alcătuit din 2-3 straturi.

Stratul extern are o suprafață rugoasă și în anumite zone prezintă așa-numite cicatrice mugurale, locul de desprindere a celulelor rezultate prin înmugurire. În componența stratului extern predomină mananul cuplat prin legături covalente și radicali fosfat din molecule de proterine, formând complexe macromoleculare.

Stratul intern are o suprafață ornamentată cu riduri proeminente, formate din fibre constituite din molecule liniare de glucan, care formează complexe cu proteine și asigură rigiditatea sau elasticitatea peretelui celular. La nivelul peretelui celular sunt localizate și enzime (invertaza, fosfataza, endoglucanaze, permeaze) implicate în biosinteza compușilor peretelui celular și în procesele de transfer al substanțelor.

Peretele celular are rol esențial în asigurarea formei celulei și de pretecție față de factorii mediului ambiant. În cooperare cu plasmalema participă la creșterea și reproducerea celulară, în biosinteză și catabolism. Prin îndepărtarea peretelui celular, prin metode enzimatice, se obțin protoplaști folosiți în ingineria genetică pentru obținerea prin fuziune a hibrizilor cu importanță practică. Prin amplasarea protoplaștilor pe mediu nutritiv, în timp de 8-12 ore, are loc regenerarea peretelui celular.

2.6.2. Plasmalema

Plasmalema (membrana citoplasmatică) reprezintă un strat lamelar cu o grosime de circa 8-9 nm, care delimitează protoplastul la exterior. Plasmalema este o structură de natură lipoproteică în care lipidele (fosfolipide, steroli, acizi grași nesaturați) reprezintă 23-30%, iar proteinele (glicoproteine) 30-33% din masa nativă a membranei. Plasmalema este sediul complexelor multienzimatice cu rol în biodinteza poliglucidelor din peretele celular (glucansintetaze și chitinsintetaze), în glicoliză, fosforilare oxidativă (oxidoreductaze, citocromi, reductaze), în principalele căi metabolice ale celulei vii.

Plasmalema este o structură dinamică în care se realizează importante funcții ale celulei vii. În primul rând este o barieră osmotică, cu permeabilitate selectivă ce reglează transferul de substanțe nutritive necesare în celulă pentru a fi metabolizate, precum și eliminarea de cataboliți, iar prin sistemele enzimatice, active la acest nivel, intervine în reglarea procesului de creștere și înmulțire.

2.6.3. Citoplasma

Citoplasma (citosolul) reprezintă o materie fundamentală a celulei vii în care sunt înglobate organitele subcelulare specifice. Citosolul este un sistem coloidal cu un conținut de 75-85 % apă, în care substanțele componente se află sub formă de sol sau gel, formând micele coloidale. Dintre substanțele organice predomină proteinele cu rol structural sau catalitic, lipidele cu rol plastic și glucidele cu rol energetic. În compoziția chimică a citosolului intră și acizii nucleici, respectiv ARN (mesager, de transfer și ribozomal) cu rol în biosinteza proteinelor celulare, ARNk (denumit killer) implicat în sinteza de proteine cu acțiune toxică pentru alte celule sensibile și ADN-extracromozomial, component al plasmidelor citoplasmatice. în citosol, în anumite faze ale creșterii celulare, se pot acumula substanțe în exces sub forma unor incluziuni de rezervă și anume:

– granule de glicogen, care se prezintă sub forma unor corpusculi sferici și care se pot evidenția prin suspendarea celulelor de drojdie în soluție Lugol, când glicogenul în prezența iodului se colorează în brun-roșcat. Glicogenul reprezintă principala substanță de rezervă a celulei și este metabolizat atunci când celula este în stare de înfometare;

– sferozomii (oleiozomii), care sunt incluziuni lipidice.

Dintre organitele celulare cu care citosolul interacționează în mod permanent, formând o unitate morfofuncționalâ, fac parte următoarele: nucleul, mitocondriile, aparatul Golgi, sistemul vacuolar.

Nucleul

Nucleul reprezintă „spațiul" genetic în care are loc stocarea, replicarea și transmiterea informației celulare. În timpul diviziunii celulare, ADN-ul nuclear se divide în 2 sau mai mulți cromozomi, în funcție de specie. În timp ce Saccharomyces cerevisiae are 17 cromozomi, la specii ale genului Hansenula au fost identificați 4. Unele drojdii sunt obligatoriu haploide, de exemplu drojdiile din genul Candida, genul Torulopsis, genul Rhodotorula, în timp ce alte genuri (Ex. Saccharomyces) pot prezenta faza haploidă (1n) – în faza de ascospori și faza diploidă (2n) – în faza vegetativă de reproducere.

Mitocondriile

Mitocondriile sunt organite mari, care pot ocupa până la 25 % din volumul citosolului, în care sunt localizate enzime de catabolism, implicate în ciclul Krebs și în β-oxidarea acizilor grași, în fosforilarea oxidativă, în sinteza de ATP pentru necesitățile energetice ale celulei . O celulă poate conține 10-50 mitocondrii.

Sistemul vacuolar

Sistemul vacuolar poate fi vizibil la microscop în faza staționară de creștere a celulei sub forma unui vacuom central prevăzut cu o membrană, tonoplasma, sau să fie alcătuit din mai multe vacuole mici, în faza de creștere exponențială. Vacuolele conțin o cantitate mare de apă și îndeplinesc funcții importante în reglarea presiunii și în menținerea stabilității chimice a citosolului.

Reticulul endoplasmatic

Reticulul endoplasmatic face legătura între nucleu și vacuom și reprezintă o rețea de vezicule – cisterne interconectate, caracterizate printr-o mare plasticitate morfologică. Reticulul endoplasmatic este sediul unor complexe enzimatice (citocromoxidaza, NADH, enzime ale lanțului transportor de electroni) și are rol în biogeneza sferozomilor, vacuolelor, corpilor Golgi; participă la expansiunea învelișului nuclear și a plasmalemei în diferite etape de dezvoltare ale celulei.

Aparatul Golgi

Aparatul Golgi este un sistem de endomembrane, alcătuit din unități funcționale dictiozomi, care face legătura între reticulul endoplasmatic și plasmalemă. Veziculele Golgi sunt privite adesea ca aparatul de sortare și dirijare a proteinelor și componentelor membranare spre locul lor de destinație; au rol în expansiunea peretelui celular.

Ribozomii

Ribozomii sunt particule nucleoproteice implicate în sinteza proteinelor celulare, răspândiți în citosol – citoribozomi, liberi sau în asociații de 5-6 ribozomi (polizomi). Au în structură ARN-ribozomal și proteine; ARNr este implicat în procese de transcripție a informației genetice pentru biosinteza proteinelor/ enzimelor necesare celulei.

Lizozomii

Lizozomii sunt structuri veziculare bogate în enzime: fosfataze, proteaze, lipaze, active la pH = 5, cu rol în digestia unor compuși ai celulei vii care nu mai funcționează eficient, în exteriorul lizozomului, în citosol, enzimele nu sunt active deoarece pH-ul este de 7,3. Când sub acțiunea unor factori, de exemplu în starea de înfometare, în absența apei care asigură transportul în exteriorul celulei a catabolițilcr formați, pH-ui în citosol scade, devin active enzimele din lizozom și celula moare datorită procesului de autoliză.

Peroxizomii

Peroxizomii sunt structuri sferice cu membrană simplă și o matrice pe care sunt localizate oxidaze, cu rol în adaptarea celulei de drojdie la condiții aerobe. Intervin în ciclul glioxilatului, în degradarea acizilor grași, a aminoacizilor (de exemplu a metioninei) și a apei oxigenate.

Caracteristici fiziologice

O proprietate importantă a unor drojdii cu importanță în industria alimentară este aceea de a fermenta în condiții de anaerobioză, glucide (hexoze, diglucide, triglucide) cu formare de alcool etilic, dioxid de carbon și produse secundare care dau aroma caracteristică produselor fermentate.

C6H12O6 → 2CH3-CH2-OH + 2CO2 + 117kj

În condiții de aerobioză, drojdiile asimilează glucidele transformându-le prin respirație în CO2 și H2O, iar energia eliberată favorizează creșterea și înmulțirea celulelor.

C6H12O6 → 2CO2 + 6H2O + 2840kj

În raport cu temperatura, majoritatea drojdiilor industriale sunt mezofile (temperatura optimă 28…32°C); există și drojdii adaptate care sunt active la temperaturi de refrigerare (drojdii de vin), sau drojdii termofile active la 35…38°C (din genul Candida).

Drojdiile se dezvoltă bine într-un domeniu larg de pH, cu valori limită între 2,5 și 8,5 și un pH optim la 5,5. Celulele de drojdie, ca și alte celule, reacționează activ la presiunea osmotică dată de concentrația substanțelor dizolvate în mediul în care se află suspendate. Dacă mediul este hipotonic, cu o concentrație a substanțelor dizolvate mai mică decât concentrația intracelulară, apa va pătrunde în celula care își mărește volumul și, dacă se prelungește această stare de turgescență, celula suferă deteriorări fizice ireversibile. În mediul hipertonic, când concentrația mediului este superioară concentrației intracelulare, apa din celulă difuzează în exterior pentru a asigura izotonia, iar celula trece în starea de plasmoliză.

În condiții naturale, se pot întâlni, ocazional (temporar), celulele de drojdii în diferite stări: fiziologică activă, în care celulele cresc și se înmulțesc; de anabioză, determinată de reducerea cantității de apă liberă din interiorul celulei, în care celula se menține în viață, în schimb activitatea enzimatică este redusă la minimum; de autoliză când, în condiții nefavorabile, are loc o solubilizare a compușilor sub acțiunea enzimelor proprii (în special proteaze), care conduce la moartea fiziologică a celulei.

Compoziția chimică

Celula de drojdie este compusă din: apă, substanțe proteice, glucide, grăsimi, substanțe minerale, vitamine și enzime.

Apa

Apa reprezintă componenta principală a celulei de drojdie și se găsește în proporție de 70-80% din conținutul total al drojdiei.

Substanțe proteice

Din grupa substanțelor proteice, în celula de drojdie se înâlnesc: polipeptide, albumine, globuline și în cantitate mare aminoacizi.

Celula de drojdie mai conține o nucleoproteidă cu aspect granular, numită volutină, tripeptidul glutationcare în forma sa redusă intervine in recțiile de oxido-reducere din mediu, determinând reducerea gruparilor –S-S- din gluten si enzime.

Ca urmare a proceselor de oxido-reducere, rezistența glutenului la atacul enzimelor scade, iar enzimele sensibile la acțiunea reducătorilor devin active. Are loc intensificarea procesului de proteoliză, ce conduce la înrăutățirea proprietăților reologice ale mediului.

Glucide

Cea mai importantă componentă din grupa glucidelor, o constituie substanța de rezervă a celulelor de drojdie. Dintre glucide, în celula de drojdie se mai găsesc zaharuri simple, hemiceluloze.

Grăsimi

Conținutul de grăsimi din celula de drojdie, depinde de vârsta celulei. Conținutul de grăsimi poate ajunge la 10%. Se găsesc atât lipide simple, cât și lipide complexe. Dintre lipidele simple, cele mai întâlnite sunt gliceridele si steridele, iar dintre lipidele complexe, se întâlnește lecitina.

Substanțe minerale și vitamine

În celula de drojdie, în cantitate mai mare se găsesc fosforul si potasiul, iar in cantitate mai mică Ca, Mg, Fe.

Celula de drojdie conține vitamine din complexul B, în mod deosebit vitaminele B1 si B2.

Enzime

Celulele de drojdie au un echipament enzimatic complex format din hidrolaze si oxido-reductaze, în mod deosebit. Enzimele din celula de drojdie se împart în două grupe:

-endoenzime, secretate de celula de drojdie acționează în interiorul celulei. Din această categorie cea mai importantă este zimaza, care declanșează procesul de fermentație alcoolica cu formare de alcool si dioxid de carbon. Zimaza este un complex de 15 enzime și 3 coenzime.

-exoenzime, secretate de celulele de drojdie și acționează în afara celulei.

În celulele de drojdie se mai găsesc, în cantități însemnate, invertază și maltază și un gen de amilaze care pot hidroliza polimerii cu un grad mic de polimerizare a glucozei. Drojdia nu conține enzime amiolitice, sau conține numai urme de asemene enzime.

Celulele de drojdie conțin enzime proteolitice, care împreună cu cele din mediu determină hidroliza proteinelor si în consecință, se reduce consistența mediului.

Echipamentul enzimatic al celulelor de drojdie, contribuie la solubilizarea și transformarea substanțelor în vederea hrănirii celulelor.

Reproducerea drojdiilor

Forma generală de reproducere a drojdiilor este înmugurirea vegetativă (calea asexuată), care are la bază un proces simplificat de mitoză, când din celula mamă se formează noua celulă, identică din punct de vedere genetic. Unele drojdii au capacitatea de a se înmulți nu numai prin înmugurire, ci și prin spori; sporularea este condiționată genetic, are loc în anumite condiții de mediu și are la bază procesul de meioză. Reproducerea prin sporulare la drojdii poate avea loc pe cale asexuată din/în celula vegetativă sau pe cale sexuală prin procese de copulare (conjugare) între celule diferențiate.

2.9.1. Reproducerea prin înmugurire

Pe cale vegetativă (asexuat), drojdiile se pot înmulți prin înmugurire propriu-zisă, caracteristică majorității lor, și prin sciziune, în urma formării unui perete despărțitor, caracteristică genurilor Schizosaccharomyces și Endomyces.

Înmugurirea are loc în condiții optime când drojdiile se află în mediu cu o concentrație de glucide simple de 2-5 %, substanțe cu azot asimilabile, săruri minerale și factori de creștere; pH-ul optim pentru înmulțire este în domeniul acid 4,5-5,5, iar temperatura optimă la valori între 25 și 32 °C. O condiție necesară pentru înmugurire este aerarea corespunzătoare a mediului, deoarece în prezența oxigenului din aer are loc asimilarea eficientă a nutrienților cu recuperarea energiei potențiale a acestora, energie folosită de celula în creștere pentru procese de biosinteză, consumatoare de energie.

În aceste condiții, în prima etapă, celula de drojdie crește în dimensiuni în urma măririi coordonate a compușilor intracelulari; creșterea în volum fiind mai rapidă decât a suprafeței învelișurilor celulare, la un anumit stadiu se declanșează înmugurirea. Astfel, într-o zonă (placă) a peretelui celular are loc o înmuiere enzimatică a peretelui și apare o protuberantă – mugurele, care, treptat, crește în dimensiuni; între celula parentală și mugure se perfectează un canal – diverticulum – prin care se transferă, în celula nou formată, material nuclear și citoplasmatic, prin cariokineză și citokineză. Când celula-fiică va conține toate componentele necesare unei vieți independente, la nivelul canalului se formează un perete inelar cu o concentrație ridicată în chitină, ce se dezvoltă centripet, până când are loc obturarea și separarea.

Fig. 2.2 Reproducerea prin înmugurire( 1-mugure;2-canal de legătură;3-nucleu;4-vacuolă adiacentă nucleului;5-nucleol)

În condiții optime de viață, o celulă de drojdie poate forma 9-42 noi celule, apoi celula moare din punct de vedere fiziologic. Pentru drojdiile la care separarea mugurelui are loc prin sciziune, prin înmugurire se pot forma structuri liniare ce alcătuiesc miceliu adevărat.

În procesul de înmulțire a drojdiei prin mitoză, numărul original de cromozomi se păstrează constant: aceasta înseamnă că dacă celula parentală este diploidă și celulele rezultate prin înmugurire vor rămâne tot diploide (2n), respectiv, dintr-o celulă haploidă se vor forma două celule tot haploide (1n).

Înmulțirea drojdiilor prin înmugurire este un proces cu multiple aplicații industriale, în scopul obținerii, cu un randament ridicat, a biomasei de celule la fabricarea drojdiei comprimate, a drojdiilor furajere, a culturilor de drojdii selecționate folosite la fabricarea spirtului, berii, vinului, sau pentru extragerea din biomasă a unor compuși endogeni valoroși (vitamine, enzime, steroli).

Fig. 2.3 Fazele creșterii la Saccharomyces cerevisiae

Reproducerea prin sporulare

Este un proces particular întâlnit la drojdiile sporogene care au dobândit capacitatea genetică de a forma în anumite condiții, în medie, 2-14 ascospori.

Sporularea are la bază procesul de meioză, prin care numărul de cromozomi ai celulei parentale diploide se reduce la jumătate, iar celulele formate, primind un singur set de cromozomi, sunt haploide.

În cazul drojdiilor ascogene, de exemplu al celor aparținând genului Saccharomyces, sporularea poate fi indusă prin transferul celulelor din must în fermentație pe un bloc de ghips sau pe un mediu inductiv: mediul McCIary sau mediul Gorodkova. În aceste condiții, în celulă prin sporulare asexuată se formează ascosporii, ale căror număr și caractere morfologice sunt dependente de specie.

Sporularea este inițiată după circa 10 ore de expunere pe mediu de sporulare și este mai intensă după 24-48 de ore. În timp, celula generatoare de spori, denumită și ască, se poate rupe sau poate să se solubilizeze prin autoliză și ascosporii liberi, în condiții favorabile, germinează și formează prin reproducere vegetativă colonii (clone) haploide.

Ascosporii haploizi pot fi de tip „a" sau „α", în funcție de natura feromonilor specifici; în condiții favorizante, celulele ajunse la maturitate fiziologică, denumite și gârneți, pot să fuzioneze printr-un proces de conjugare pentru a forma din nou celule diploide. Dacă are loc conjugarea între celule de același tip a/a, celulele diploide sunt viabile, dar ascosporii formați își pierd această calitate.

Sub formă de ascospori, drojdiile rezistă timp îndelungat în sol, în condiții de uscăciune, în schimb termorezistența lor este apropiată cu cea a celulelor vegetative și inactivarea are loc la 75…85 °C.

Capacitatea de sporogeneză a drojdiilor este un criteriu taxonomic important în identificarea speciilor, iar lucrările de obținere a hibrizilor rezultați prin conjugare dirijată (drojdii mutante) ocupă un loc important în bioinginerie.

Fig. 2.4 Ciclul de viata al drojdiei de tipul Saccharomyces cerevisiae

Nutriția drojdiilor

Pentru a se dezvolta și înmulți, drojdiile au nevoie de hrană, pe care și-o asigură din mediul înconjurător.

Principiile nutritive pentru dezvoltarea drojdiilor sunt glucidele, lipidele, substanțele cu azot, vitaminele și substanțele minerale. Întrucât drojdiile se hrănesc prin întreaga suprafață a celulelor prin difuzie, pe calea pătrunderii prin porii fini ai membranei, a substanțelor nutritive, este necesar ca moleculele acestor substanțe să fie de dimensiuni mici. Ajungerea la substanțe cu molecule mai mici, capabile să treacă prin porii membranei celulei de drojdie, se realizează prin descompunerea hidraților de carbon și a substanțelor albuminoase, în timpul procesului de fermentație. Hidrații de carbon, și în mod deosebit sub acțiunea enzimelor amiolitice se descompun cu formare de dextrine și maltoză. În continuare în prezența maltazei, maltoza se scindează în glucoză, care are molecula de o mărime ce îi permite să treacă prin membrana celulei de drojdie, unde în prezența complexului enzimatic, numit zimază are loc descompunerea si formarea de alcool și dioxid de carbon, realizându-se astfel hrănirea celulei de drojdie.

Presiunea care se formează în citoplasma celulei de drojdie, face ca dioxidul de carbon și alcool etilic să iasă din celula și să se răspândească în toată masa de semifabricat. Alcoolul se dezvoltă și se răspândește în mod uniform în semifabricat, iar dioxidul de carbon, aglomerându-se sub formă de mici sfere de gaz, prin deplasare și dilatare, întâmpinând rezistanța glutenului formează porii.

În timpul procesului de fermentație alcoolică nu întraga cantitate de glucoză se transformă în alcool și dioxid de carbon, ci se formează de asemenea o serie de substanțe secundare, cum ar fi glicerina, alcoolul metilic, acidul acetic și alcooli superiori.

Sub acțiunea enzimelor proteolitice, substanțele albuminoase sunt descompuse în mod succesiv până la aminoacizi, care pătrund prin membrana celulei de drojdie, asigurând hrănirea acesteia. Din descompunerea substanțelor albuminoase, rezultă substanțe minerale care străbat celula de drojdie hrănind-o.

Clasificarea generală a drojdiilor

Potrivit Codului Internațional de Nomenclatură Botanică tulpinile de drojdii sunt grupate în specii, speciile în genuri, iar genurile în subfamilii și familii.

O clasificare de referință este cea propusă de Lodder și Kreger van Rij (1952) care clasifică drojdiile în 38 genuri și 349 de specii de drojdii, iar clasificarea cea mai recentă și cuprinzătoare aparține lui Kreger van Rij (1984) (60 genuri cu aproximativ 500 de specii).

 În clasificarea drojdiilor se iau în considerare următoarele caracteristici:

– Criterii morfologice:- aspectul microscopuc al celulei(formă și dimensiune) și aspectul coloniei;

– Modul de reproducere;

– Caractere fiziologice și particularități biochimice(structura chimică a pereților celulari).

În cadrul drojdiilor sunt recunoscute trei grupe: ascosprogene, basidiosprogene și imperfecte.

Tabel 2.1 Clasificarea generală a drojdiilor

Saccharomyces cerevisiae

Introducere

Saccharomyces este un gen care aparține regnului Fungi și include multe specii de drojdii.

„Saccharomyces” provine din limba greacă latinizată și înseamnă „mucegai de zahăr” sau „ciupercă de zahăr”; „saccharo” fiind forma combinată „de zahăr” și „myces” fiind „ciupercă”. Celulele de drojdie apar de multe ori sub forma unor lanțuri alungite datorită faptului că celulele nou formate rămân atașate la celula mamă, din cauza timpului scurt în care înmuguresc. Celulele au formă rotundovoidală cu diametrul cuprins între 5-10 microni.

Într-o celulă normală de drojdie se poate deosebi învelișul, în care este închisă protoplasma. În protoplasma celulei de drojdie se găsesc câteva vacuole, împlute cu sucul celular, granule – corpuscule de grăsime, precum și nucleul de natură albuminoidă.

Fig. 3.1 Saccharomices cerevisiae: formă și dimensiune

(5-10 µm, Malleshaiah et al., 2010; Blaylock, 2010)

Particularități

Particularitatea saccharomycetelor este de a forma ascospori. S-a constatat că sporii sunt formați numai din celule tinere, bine alimentate, trecute într-un mediu lipsit de substanțe nutritive, în prezența unei umidități mari și la accesul aerului. Fiecare specie de saccharomycete formează o cantitate anumită de spori ( cel mai des 2-4) și are o temperatură optimă pentru formarea sporilor de circa 27ºC.

Drojdiile din genul Saccharomyces cerevisiae se înmulțesc pe cale vegetativă prin înmugurire multilaterală și sexuat prin spori. În condiții naturale, celula diploidă se transformă în urma diviziunii meiotice într-o ască cu patru ascospori – 2α și 2s. Lindegren și Lindengren au demonstrat existența unei perechi de alele a și α, care controlează împerecherea. Pe mediu nutritiv complet sau în condiții optime de hrană în natură, între spori sau celule vegetative se realizează conjugarea, rezultând zigotul diploid. Locusul tipului de împerechere la Saccharomyces cerevisiae, denumit MAT, este localizat în cromozomul III și există sub forma a două alele MATa și MATα, care controlează diferențierea sexuată, producerea de feromoni, aglutinarea, împerecherea și sporularea.

În drojdii s-au identificat proteine complexe, între care predomină albuminele. Albuminele proprii speciei Saccharomyces cerevisiae conțin 16 aminoacizi. Drojdia este foartă bogată in complexul vitaminic B, întrecând, sub acest aspect orice alt produs natural. Mai conține biotină și vitamina D, acid paraaminobenzoic, acid pantotenic. S-au identificat în ciupercă, existența a 18 vitamine. Drojdia este săracă în vitaminele A, E și C. Ea, reprezintă de asemenea, o sursă bogată de minerale, crom (mineral esențial care ajută organismul să mențină un nivel normal de zahăr în sânge), cupru, zinc, seleniu, fier (Anghel et al., 1991). Fierul din ciupercă este legat organic, eliberându-se treptat și fără a provoca stres oxidativ.

Drojdia, Saccharomyces cerevisiae mai conține glucide( glicogenul, trehaloza). Glicogenul și trehaloza constituie rezerva hidrocarbonată a celulei de drojdie.

Tot drojdia de bere este un nutrient general complex, un regenerator metabolice, un supliment alimentar recomandat pentru toate vârstele, având aplicații medicale multiple fiind un factor important pentru sănătatea umană (Hegoczki et al., 1997).

Saccharomyces cerevisiae este, probabil, cea mai des folosită drojdie, datorită multiplelor ei utilizări în brutărie și patiserie precum și întrebuințarea ei de mii de ani în fermentația băuturilor alcoolice ( Legras et al., 2007). Se crede că a fost izolată inițial din cuticula strugurilor (care se poate observa și cu ochiul liber sub forma unui film alb, subțire, de exemplu pe cuticula unor fructe de culoare închisă, cum sunt prunele).

Produse cu drojdie, în principal derivate din Saccharomyces cerevisiae, au fost folosite de mulți ani ca ingrediente sau aditivi în prelucrarea produselor alimentare. Dintre acestea amintesc: arome, enzime, antioxidanți, vitamine, coloranți și polizaharide (Dawson, 2002, Abbas, 2006).

Așa cum industria alimentară este interesată de recuperarea reziduurilor valoroase, cum este cazul drojdie de bere (Saccharomyces cervisiae), material cu potențial mare în nutriție și de sănătate, tendințele actuale ale pieții urmăresc lansarea de noi produse cu drojdii și de noi tehnologii de procesare și valorificare ale acestui reziduu. Tehnologiile moderne de uscare folosite pentru a procesa compușii naturali și extractele de plante, fac parte din aceste tendințe, urmărind o evaporare protejată prin temperaturi bine controlate și o imobilizare pe matrici cât mai naturale și rezistente, în scopul de a menține concentrații mari de compuși bioactiv în produsele finale.

Saccharomyces cerevisiae este cel mai intens studiat microorganism eucariot, care ajută la cunoașterea biologiei celulei eucariote și, implicit, a biologiei umane.

            Vreme de câteva secole Saccharomyces cerevisiae a fost întrebuințată în producerea de alimente și băuturi alcoolice, iar azi acest microorganism este folosit în numeroase procese din cadrul industriei farmaceutice. Saccharomyces cerevisiae este un organism cu care se lucrează ușor, deoarece este nepatogen, și datorită multitudinii de aplicații apărute de-a lungul timpului în obținerea de produse consumabile, ca etanolul sau drojdia, a fost clasificat ca organism GRAS (generally regarded as seif = organism considerat sigur, netoxic). De asemenea, fermentația și procesele tehnologice de producție la scară largă cu Saccharomyces cerevisiae fac ca acest organism sa fie atractiv, la îndemână, pentru câteva scopuri biotehnologice. Un alt motiv important pentru a justifica utilizarea microorganismului Saccharomyces cerevisiae în cadrul biotehnologiei îl reprezintă susceptibilitățile sale la modificările genetice prin tehnologia ADN recombinant, care a fost mai departe înlesnite de accesul la secvența genomică completă a Saccharomyces cerevisiae, publicată în 1996.

            Îmbunătățirea tulpinilor de drojdie de bere s-a bazat în mod tradițional prin mutageneză la întâmplare și pe încrucișările genetice a două tulpini, urmate de screening, în funcție de calitățile de interes ale mutantelor. Dezvoltările recente ale unor metode sofisticate în domeniul tehnologiei ADN recombinant au permis să se manipuleze o anumită cale de interes și de aici să se îmbunătățească celula printr-o abordare mai directă. Totuși, acum este posibil să se introducă anumite perturbări genetice în sensul de a modifica puterea de inițiere a unei anumite gene, de a induce deleții asupra genelor sau de a introduce gene întregi în celulă.

Biosinteza Saccharomyces cerevisiae

O tehnologie de biosinteză poate fi reprezentată pritr-o schemă bloc, ca o succesiune de trepte specifice în care rolul central îl deține treapta de fermentație biochimică.

Fig. 3.2 Schema bloc a unui proces de biosinteză

Treapta A

Treapta de prelucrare A include toate procesele remergătoare fermentației biochimice, cum ar fi:

pregătirea mediilor de cultură;

sterilizarea mediilor de cultură;

sterilizarea aerului tehnologic;

sterilizarea aparaturii.

Pregătirea mediului de cultură

Pregătirea unu mediu de cultură reprezintă crearea unui mediu adecvat pentru creștera și dezvoltarea microorganismelor.

Pentru conceperea unui mediu de cultură trebuie să se țină cont de

compozițiile maselor bacteriene și de necesitățile acestora pentru o dezvoltare rapidă și eficientă.

Mediile de cultură trebuie să conțină:

Sursă de carbon și de energie (hidrați de carbon, monozaharide, dizaharide, polizaharide, alcooli, acizi);

Sursă de azot organic (aminoacizi esențiali);

Sursă de azot anorganic (săruri cu azot);

Microelemente (săruri ale unor metale);

Oligoelemente (săruri de cupru, cobalt etc);

Factori de creștere (biostimulatori și bioacceleratori);

Precursori.

Sterilizarea

Sterilizarea reprezintă procesul de distrugere și de îndepărtare a microorganismelor patogene și apatogene din aer, apă, materii prime.

Sterilizarea poate fi:

Termică;

Prin metode fizice;

Prin procedee chimice;

Prin preparare pe cale aseptică;

Sterilizarea se caracterizează prin:

Punct termic mortal (cea mai scazută temperatură care distruge în 10 minute toate bacteriile unei specii);

Timp termic mortal (valoarea timpului de expunere la o anumită temperatură la care sunt distruse toate formele sporulate și nesporulate).

Sterilizarea se poate desfășura continuu și discontinuu.

Sterilizarea discontinuă se desfășoară pe parcursul a trei etape: etapa de încălzire, etapa de menținere și etapa de răcire. O parte din microorganisme se distrug chiar din etapa de încălzire, însă cea mai mare parte a microorganismelor, inclusiv cele mai rezistente, se distrug în faza de meținere.

Sterilizarea continuă se poate desfășura în instalații care funcționează la temperaturi cuprinse între 120-140°C și în instalații care funcționează la temperaturi de peste 140°C. Avantajele sterilizării continue sunt: control automat al procesului, performață ridicată, posibilitatea sterilizării volumelor mari de mediu.

Sterilizarea aerului

Sterilizarea aerului se poate realiza atât termic cât și prin filtrare.

Pentru filtrarea aerului se utilizează: fibre de sticlă cu diametrul de 5-18µm, nitat de celuloză, teflon cu mare rezistență termică și caracter hidrofob și poliamidă (nylon).

Aerul poate fi sterilizat prin:

Filtru cu fibră de sticlă;

Filtru cu membrană;

Filtru tip lumânare.

Treapta B

În treapta B de prelucrare biochimică are loc procesul de biosinteză prin fermentație aerobă sau anaerobă, reprezentând treapta determinantă pentru performanțele biotehnologiei, performanțe dependente, pe de o parte, de productivitatea sușei folosite, legată direct de potența acesteia, compoziția mediului și gradul de sterilizare, iar pe de altă parte, de performanțele proceselor specifice ingineriei biochimice care intervin în conducerea fermentației.

Fermentația este procesul de creștere și de dezvoltare a unui microorganism unic pe un mediu de cultură adecvat în scopul elaborării unui metabolit.

Adoptarea unui anumit procedeu de fermentație este condiționată de asigurarea celor mai bune condiții de dezvoltare a microorganismelor, fără a fi neglijate caracteristicile tipurilor de microorganisme cultivate.

Procedeele de fermentație pot fi clasificate în funcție de:

Modul de realizare a culturilo microbiene (culturi în suprafață sau în profunzime);

Necesarul de oxigen (sisteme de fermantație aerobe sau anaerobe);

Modul de funcționare a instalației de fermentație (fermentație continuă sau discontinuă).

Fermentația discontinuă se caracterizează prin faptul că microorganismele parcurg într-un singur bioreactor toate etapele de dezvoltare. Deoarece în acest sistem de fermentație nu se poate asigura de la început întreaga cantitate de substrat limitativ, se impune adăugarea de substrat, precum și de precursori, pe întreg parcursul procesului fermentativ, fapt care generează probleme suplimentare în menținerea sterilității în bioreactor.

Fermentația continuă oferă o serie de avantaje comparativ cu procedeul discontinuu:

Utilizarea bioreactoarelor de capacitate redusă;

Realizarea mai eficientă aproceselor de transfer de masă, de căldură;

Productivitate sporită;

Epuizare mai avnsată a componentelor mediului de cultură.

Treapta C

Treapta C reprezintă separarea și purificarea produselor obținute în urma procesului de biosinteză.

Aceste produse se găsesc, în cea mai mare parte, în fază lichidă, dar există și numeroase cazuri în care produsele utile sunt localizate intracelular.

Pentru separare se impun a fi cunoscute următoarele proprietăți:

Solubiltatea;

Stabilitate în soluție;

Stabilitate în stare solidă;

Principalele proprietăți fizice și chimice în soluție.

Pentru separarea produselor utile di faza lichidă rezultată de la fermentație se pot aplica următoarele tehnici:

Extracția fizică cu solvenți organici;

Extracția reactică în solvenți organici cu diferiți extractanți;

Extracția cu fluide supercritice;

Extracșia în sisteme apoase bifazice;

Sorbția pe schimbători de ioni;

Distilarea;

Cromatografia;

Separarea și concentrarea prin tehnici membranare;

Precipitarea.

Influența factorilor fizico-chimici asupra fermentației Saccharomyces cerevisiae

Compoziția mediului de fermentare 

Diferitele componente ale mediului pot fi metabolizate în mod diferit. De aceea, mai ales la vinuri, în funcție de calitatea mustului, care este influențată de soiul și gradul de coacere a strugurilor, apar diferențe de aromă.

Concentrația în zahăr 

Concentrația în zahăr influențează direct proporțional viteza de fermentare atunci când se situează în limitele 5-12% (50-120 g zahăr/dm3). Cu creșterea concentrației de zahăr anumite drojdii mai sensibile suferă o inhibare în activitate prin procese de represie catabolică sau prin modificări la nivel de membrană datorate plasmolizei. Drojdiile de fermentare au în general osmotoleranță și de aceea produc fermentarea în bune condiții a mustului de struguri cu o concentrație de 170-250 g zahăr/dm3.

Concentrația în alcool

În mediile fermentative cu microbiotă naturală, dacă se ajunge la o concentrație alcoolică de 4-6º, se produce o încetinire a fermentației la drojdii care nu au rezistență la alcool (Kloeckera, Torulopsis, Hansenula), iar fermentarea este continuată de drojdii alcoolorezistente, acumulându-se 18-20º alcool (1 grad alcoolic = 1 ml alcool absolut/100 ml mediu fermentat).

pH-ul 

PH-ul are un rol important în formarea compușilor de fermentare, în funcție de pH cunoscându-se două forme ale fermentării: fermentarea alcoolică propriu-zisă, ce se desfășoară la pH 3,5-5 când produsul principal este alcoolul etilic și dioxidul de carbon, cu produși secundari în cantități mici, echilibrate și fermentarea la pH alcalin, când în afară de alcool etilic și dioxid de carbon se formează în cantitate mai mare glicerol (până la 30% din zahărul fermentat).

Temperatura

Enzimele componente ale sistemului zimazic prezintă fiecare un optim de activitate, iar proprietățile sunt determinate genetic de caracterele de specie. Fermentarea alcoolică are loc între 28-30ºC.

PARTEA a II-a

CONTRIBUȚII EXPERIMENTALE ORIGINALE

Introducere

Sterolii sunt compuși esențiali ai tuturor celulelor eucariote. Fitosterolii sunt sterolii care se întâlnesc în plante. Sterolul predominant din drojdia Saccharomyces cerevisiae este ergosterolul, echivalentul colesterolului din celulele animale. Ca în orice celulă eucariotă și în celulele de Saccharomyces cerevisiae, sterolii sunt prezenți sub două forme: ca steroli liberi și sub formă de esteri (esterificată).

Sterolii liberi se găsesc cu preponderență în membrana plasmatică a celulelor și asigură fluiditatea și permeabilitatea acesteia, cu numeroase efecte în activitatea proteinelor membranare. Esterii de sterol sunt localizați în particolele lipidice din citosolul celulelor cu rol în homeostazia sterolilor.

Ergosterolul este un component esențial al celulelor de drojdie, cu rol în menținerea integrității celulare. Acest compus reprezintă provitamina (precursorul) vitaminei D2. Formula sa chimică este:

Fig.1.1. Stuctura chimică a ergosterolului (C28H44O)

Acest compus poate fi obținut prin mai multe metode, însă cea mai utilizată este cea a obținerii sale printr-un proces de fermentație cu drojdia Saccharomyces cerevisiae.

Saccharomyces cerevisiae este una dintre puținele drojdii capabile să crească rapid în condiții anaerobe. Fermentația anaerobă a Saccharomyces cerevisiae joacă un rol major în producția băuturilor alcoolice și a pâinii.

Totuși este cunoscut faptul că în condiții de anaerobioză, drojdiile nu mai sunt capabile să sintetizeze steroli și acizi grași nesaturați.

Producerea de steroli este dependentă de prezența oxigenului în mediu cu ajutorul a 6 ergenzime. Pentru sinteza unei molecule de ergosterol sunt necesare 12 molecule de O2.

Obiectivele acestui studiu au constat în investigarea comportamentului unei tulpini de drojdie în condiții de fermentație aerobă cu alimentare semicontinuă de glucoză, în prezența respectiv absența oxigen vectorilor în scopul obținerii de produs intracelular specific, ergosterolul, precum și investigarea unei proprietăți importante a acestui compus, cea a toleranței celulelor de drojdii la etanol. În vederea realizării acestui obiectiv s-a parcurs la trecerea de la fermentația aerobă / producere de biomasă (produs intracelular ergosterolul), la fermentația anaerobă / alcoolică cu producere de etanol.

Materiale și metodă de lucru

Tulpina

Pentru realizarea obiectivelor propuse în experimente s-a folosit drojdia Saccharomyces cerevisiae obținută de la producători locali (Pakmaya).

Mediul de cultură

Mediu de cultură solid (placa Petri): 1g peptonă, 1g glucoză, 2g Agar, 0,5 g extract de drojdie;

Mediu de cultură pentru însămânțare (50 ml): 3g glucoză, 1,56g extract de drojdie, 0,35g NaNO3, 0,185g KH2PO4, 0,155g MgSO4;

Mediul de cultură pentru fermentație (950 ml): 60g glucoză, 31,2g extract de drojdie, 7g NaNO3, 3,7g KH2PO3, 3,1g MgSO4;

Glucoză: 600g / l apă distilată, pentru alimentarea semicontinuă.

Fermentația

Două plăcuțe Petri sunt însămânțate cu tulpina de drojdie utilizată în acest studiu și incubate la 300C timp de 24h, după care o colonie este transfazată într-un recipient ce conține 50ml mediu de însămânțare și incubate iarăși la 300C și 180 rpm timp de 24h (inoculul).

Bioreactorul utilizat este de tip FerMac 310/60, prevăzut cu un sistem computerizat de monitorizare, control și înregistrare a parametrilor de operare (temperatură, valoarea pH-ului, concentrația oxigenului dizolvat, nivelul spumei, turația agitatorului, debitul de aer barbotat, debitele diferiților componenți care trebuie adăugați în timpul procesului de fermentație etc.).

Fig.2.1. Bioreactor tip FerMac 310/60 (volum util 1litru)

Bioreactorul conține 1 litru mediu de cultură, care a fost sterilizat în prealabil la autoclav la 1200C timp de 20 de minute, apoi a fost inoculat cu 5% (v/v) inocul și adăugat oxigen-vector (n-Dodecan,10ml, 30ml sau 50ml), după caz.

Fermentația s-a desfășurat pe parcursul a 48h de fermentație (fermentația semicontinuă) în următoarele condiții:

temperatură = 300C;

pH = 5-5,4 ajustat automat prin adiție de NH4OH 25%;

viteza de rotație = 300 rpm;

debit de aer = 5 l / h.

Pentru alimentarea semicontinuă a mediului în bioreactor a fost adăugată 600g/l glucoză din 30 în 30 de minute (60 ml).

Fermentația anaerobă a început în a 49-a oră de fermentație în aceleași condiții de temperatură și pH, parametrii modificați fiind viteza de rotație =50 rpm și închiderea debitului de aer.

Acest proces s-a desfășurat pe parcursul a 3 zile, până la 107h de fermentație.

În tot acest interval s-au prelevat probe la intervale de 3 ore și s-au analizat cantitatea de etanol (%) produsă în urma procesului de fermentație anaeroba a drojdiilor, cantitatea de biomasă existentă (λ=660 nm.) și cantitatea de glucoză existentă în mediu și utilizată de microorganism în vederea supraviețuirii acestuia.

Aparatură utilizată

Bioreactor de tip FerMac 310/60 cu amestecare mecanică și volum util 1litru prevăzut cu sistem automat de monitorizare, control și înregistrare a parametrilor de operare;

Incubator;

Autoclav;

Spectofotometre de tipul 830 plus DINKO pentru aflarea densității optice a biomasei și spectofotometru de tip CAMSPEC M550 UV-visible Spectophotometer;

HPLC;

Analizor Funker Garber pentru cuantificare etanol;

Centrifugă;

Baie de apă;

Vortex;

Tehnică experimentală

Metoda de lucru utilizată în vederea obținerii compusului intracelular, ergosterol a fost crearea și optimizarea unor medii de cultură utilizate în desfășurarea unor procese de fermentație cu alimentare semicontinuă, în bioreactorul de laborator cu amestecare mecanică de tip FerMac 310/60, cu o capacitate de lucru de 1 litru volum util.

În vederea realizării acestui proces s-au avut în vedere următoarele aspecte:

Sterilizarea

Pentru ca procesul de fermentație să aibe loc în condiții de strictă puritate microbiologică, înainte de pornirea propriu-zisă a acestuia trebuie să se realizeze procesul de sterilizare, atât a componentelor detașabile ale bioreactorului, cât și a mediilor de cultură. Această sterilizare are loc la autoclav la 1210C, timp de 20 minute.

Pregătirea inoculului

După ce mediul de cultură pentru însămânțare a fost sterilizat (50ml), sub nișa sterilă acesta este însămânțat cu celule aflate în faza exponențială de creștere (celule crescute la incubator în placuța Petri), acesta reprezentând inoculul adăugat în mediul de cultură din bioreactor înainte de pornirea procesului de fermentație.

Fermentația semicontinuă

După sterilizare are loc cuplarea bioreactorului la curent electric, cu pornirea senzorului pentru temperatură, pH, oxigen și pornirea agitației la 50 rpm (reglarea temperaturii), în vederea polarizării senzorului de oxigen.

Se calibrează senzorul de oxigen (punctul 0) prin decuplarea senzorului și punctul de 100 % după aproximativ o oră de barbotare la un debit și la o agitare corespunzătoare utilizate și în timpul fermentației, după care este adăugat oxigen-vectorul (n-Dodecan), inoculul, moment în care începe fermentația.

Se prelevează o primă probă (proba inițială), după care se colectează probe din oră în oră și se analizează cantitatea de biomasă și cantitatea de glucoză care se consumă. La fiecare oră este adăugată aproximativ 60ml soluție de glucoză (120 mg glucoză la 200 ml apă distilată).

Fig.3.1. Probe prelevate în timpul fermentației

Alimentarea semicontinuă începe la aproximativ 8 ore după inoculare, când glucoza atinge o concentrație mai mică de 5%.

Fermentația cu alimentare semicontinuă se aplică în general acolo unde se dorește o cantitate sporită de biomasă. Se numește fermentație semicontinuă deoarece de la a 12-a oră de fermentație până la a 22-a oră, respectiv de la a 36-a oră la a 46-a oră, alimentarea mediului din bioreactor cu soluție de glucoză are loc în mod automat prin reglarea computerizată a pompei pentru glucoză.

Pompa a fost reglată astfel încât pe parcursul a 60 minute (1h de fermentație), 2 minute aceasta să pornească și să adauge glucoză, urmând ca după 28 minute de pauză să urmeze alte 2 minute de adaos.

Fermentația anaerobă

Începând cu a 49-a oră de fermentație se trece la îndeplinirea celui de-al doilea obiectiv al acestui studiu și anume investigarea toleranței la alcool a celulelor de drojdie datorită acumulării de produs intracelular specific, ergosterol.

Păstrând aceeași parametrii ai procesului de fermentație (T=300C, pH=5/5,4), are loc închiderea debitului de aer și micșorarea turației agitatorului la 50 rpm (pentru reglarea temperaturii).

Fermentația anaerobă are loc 3 zile (până la 107h de fermentație), timp în care se colectează probe la fiecare 3h și se analizează conținutul de alcool produs în urma fermentației glucozei de către drojdie, precum și cantitatea de biomasă existentă în mediu și cantitatea de glucoză utilizată de către microorganism.

După 107h de fermentație, procesul se oprește biomasa obținută fiind cuantificată.

Extracția ergosterolului

Ergosterolul fiind un produs intracelular, cuantificarea lui se face cu eter de petrol, precedat de hidroliza bazică după cum urmează:

Probele prelevate în primele 48h de fermentație semicontinuă (aerobă) sunt păstrate la frigider la 40C. Apoi probele sunt centrifugatre la 4000 rpm timp de 15 minute.

Fig.3.2. Probe centrifugate

O cantitate de 0,4g drojdie umedă (echivalentul a 0,05g drojdie uscată) este suspendată în 32 ml soluție obținută astfel: 8g KOH, 19,2ml C2H6O, 12,8ml H2O și introduse la baia de apă la 800C timp de 2h.

Fig.3.3. Flacoane cu probe pregatite pentru trecerea pe baie de apa

După ce probele sunt scoase de pe baia de apă se lasă la răcit la temperatura camerei, se adaugă 25 ml eter de petrol, se agită la vortex 1 minut, se lasă în repaus 10 minute după care se iau 2 ml de extract și se citește la spectofotometru la lungimea de undă de 281nm.

S-a realizat o curbă de calibrare utilizând ergosterol pur (sigma), rezultatele fiind:

Fig.3.4. Curba de calibrare a ergosterolului

Tabel 3.1. Absorbanța ergosterolului (25 ml Eter de petrol, 500 mg/l *diluat de 10 ori)

Analiza glucozei

Analiza glucozei s-a realizat la HPLC, utilizându-se un echipament Dionex Ultimate 3000 cu detector refractiv utilizând o coloană carbohidrat HyperRez (300 x 7.7 mm, 8 μm), și ca fază mobilă apa 0,6 ml. și o temperatură a coloanei de 800C.

S-a realizat o curbă de calibrare, rezultatele fiind:

Fig.3.8. Cromatograma

Analiza biomasei

Biomasa a fost analizată spectofotometric la o absorbanță de 660 nm.

S-a realizat o curbă de calibrare, rezultatele fiind următoarele:

Rezultate și discuții

Fermentașie discontinuă

Fig.4.1.Consumul de glucoză de către microorganisme

Fig.4.2. Consumul de oxigen din etanol de către microorganisme

Fig.4.3. Evoluția valorii pH-ului asupra timpului de fermentație

Fig.4.4. Evoluția fermentației discontinue

Au fost efectuate studii și s-a menționat faptul că sinteza de ergosterol nu ar fi determinată atât de creșterea masei celulare ci mai curând de rata consumului de O2 din mediu.

După ce se consumă toată glucoza din mediu (se ajunge la o valoare foarte scăzută), după o scurtă perioadă de adaptare, celulele încep a consuma etanolul, ca sursă de carbon.

Se pare că întreg procesul conține două faze și anume: conținutul de ergosterol crește atunci când rata de creștere specifică a microorganismului scade.

Până în prezent s-au făcut puține studii cu privire la relațiile dintre (DO-oxigenul dizolvat, pH, temperatură) acești parametrii și dacă au vreo influență directă/indirectă cu privire la cantitatea de ergosterol acumulată și creșterea masei celulare de drojdie.

Pornind de la aceste premise se poate observa faptul că la o fermentație discontinuă (fără adaos de glucoză), cantitatea de glucoză scade în timp ce biomasa crește. După a 9-a oră de fermentație se consumă întreaga cantitate de glucoză.

În ce privește cantitatea de etanol se poate observa un maxim al cantității acesteia în jurul orei a 9-a de fermentație, după care datorită epuizării cantității de glucoză din mediu are loc consumul etanolului de către biomasă, ca sursă suplimentară de carbon. Pe măsura creșterii biomasei și a cantității de etanol, are loc o scădere a valorii procentuale a oxigenului dizolvat, ca urmare a viabilității celulare.

Au fost realizate experimente cu și fără oxigen-vector (n-Dodecan) în diferite cantități (10,30 și 50 ml) și se poate constata o creștere a cantității de biomasă acolo unde s-a utilizat în mediu oxigen-vectorul.

Fermentația semicontinuă

Fig.4.5. Evoluția consumului de glucoză ȋn timp (după adăugarea n-dodecanului)

Studiind evoluția consumului de glucoză și evoluția concentrației biomasei din mediu, in prezența, respectiv absența oxigen-vectorilor, se observă că în prezența n-dodecanului, concentrația biomasei din mediu este mai mare și consumul glucozei pe parcursul fermentației este mai mare.

Fig.4.6. Evoluția concentrației etanolului și a cantității de oxigen dizolvată în mediu

Studiind evoluția concentrației etanolului și a canității de oxigen dizolvată în mediu, în prezența respectiv absența oxigen-vectorilor, de observă o creștere a cantității de oxigen dizolvată în mediu, respectiv o scădere a concentrației etanolului în mediul de cultură.

Fig.4.7. Evoluția valorii pH-ului asupra timpului de fermentație

Fig.4.8. Evoluția fermentației semicontinue

După cum se poate observa, cantitatea de glucoză scade pe măsura avansării orelor de fermentație, ajungându-se în jurul orei a 8-a, a 9-a de fermentație la cea mai scăzută valoare, moment în care este adăugată în mediu cantitate suplimentară de glucoză, asigurându-se în acest mod o creștre a cantității de biomasă.

Fig.4.9. Consumul de glucoză de către microorganisme după adăugarea n-dodecanului

Fig.4.10. Curba de creștere a biomasei după adăugarea n-dodecanului

În ce privește cantitățile de oxigen-vector utilizate, se poate observa o sporire a biomasei la o cantitate de 30 ml oxigen-vector.

Fig.4.11. Obținerea ergosterolului

Fig.4.12. Obținerea ergosterolului

Din graficul prezentat putem observa o creștere a cantității biomasei (a cantității de ergosterol), atât în cazul fermentației discontinue cât și a celei semicontinue, la adăugarea în mediul de cultură a unei cantități de oxigen-vector.

Din acest studiu reiese un optim al cantității de oxigen-vector adăugat de 30 ml. În cazul unei cantități de 50 ml oxigen-vector avem o producție mai mare de ergosterol în cazul fermentației semicontinue.

Fig.4.13. Consumul n-dodecanului pe parcursul fermentației

Din figura 4.13. reiese ca n-dodecanul este consumat pe parcursul fermentației, atât în cazul fermentației semicontinue, cât și în cazul fermentației discontiune.

Concluzii

În partea originală a lucrării s-a studiat obținerea ergosterolului prin biosinteza Saccharomyces cerevisiae în prezența, respectiv absența oxigen-vectorilor și investigarea comportamentului unei tulpini de drojdie în condiții de fermentație aerobă cu alimentare semicontinuă de glucoză, precum și investigarea toleranței celulelor de drojdii la etanol, ȋn condițiile modificate de fermentație.

În urma rezultatelor, în ce privește cantitatea de etanol se poate observa un maxim al cantității acesteia, după care datorită epuizării cantității de glucoză din mediu, după o scurtă perioadă de adaptare, are loc consumul etanolului de către biomasă, ca sursă suplimentară de carbon.

Atât în cazul fermentației semicontinue, cât și în cazul fermentației discontinue, au fost realizate experimente cu și fără oxigen-vector (n-Dodecan) în diferite cantități (10, 30 ml și 50 ml). S-a observat o creștere accentuată a cantității de ergosterol ȋn cazul utilizării n-dodecanului. Cantitatea cea mai mare de ergosterol se obține în urma adăugării în mediu a unei cantități de 30 ml de oxigen-vector.

BIBLIOGRAFIE

Alina Burcuș, Obținerea, caracterizarea și valorificarea unor produse derivate din drojdia de bere utilizând biotehnologii avansate, Cluj-Napoca, 2012.

Anghel I., et al., Biologia și tehnologia drojdiilor,  Editura Tehnică, București, 1989.

Barnett J.A., Robinow C.F., A history of research on yeast: cytology part.I, Yeast; Vol.19, 151-182, 2002.

Bonner J. M., A study of fermentation by Saccharomyces cerevisiae, Tested studies for laboratory teaching, Vol.30, 25-40, 2009.

Bowman et all., The structure and synthesis of the fungal cell wall, BioEssay, Vol.28, 799-808, 2006.

David E. Golan, Armen H. Tashjian, Ehrin J. Armstrong, April W. Armstrong, Principles of pharmacology, the pathophysiologic basis of drug therapy, 620-624, 2008.

David L. Nelson, Michael M. Cox, Lehninger Principles of Biochemistry Fourth Edition, 2004.

Damini D., Jayasmita D., Sukriti P., Selvarajan E., Suganthi V., Mohanasrinivasan V., Fermentative production of ergosterol using Saccharomyces cerevisiae, Journal of Applied Sciences Research, Vol.9, Nr.2, 1214-1221, 2013.

Daum G., Lees N.D., Bard M., Dickson R., Biochemistry, Cell Biology and Molecular Biology of Lipids of Saccharomyces cerevisiae, Yeast, Vol.14, 1471–1510, 1998.

David Feldman, J. Wesley Pike, John S. Adams, Vitamin D-third edition, Editura Elsevier, 78-79, 2011.

Elena Rusu, Manole Cojocaru, Minerva Ghinescu, Ane Mary Anghelina, Medicamentele antifungice și dezvoltarea mecanismelor de rezistență la unele specii de drojdii, Revista română de boli infecțioase, Vol.16, Nr.4, 207-209, 2013.

Fei Shang, Shaohong Wen, Xi Wang, Tianwei Tan, High-Cell-Density Fermentation for Ergosterol Production by Saccharomyces cerevisiae, Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol.101, Nr.1, 38-41, 2006.

Fumiyoshi Abe, Toshiki Hiraki, Mechanistic role of ergosterol in membrane rigidity and cycloheximide resistance in Saccharomyces cerevisiae, Biochimica et biophysica acta- biomembranes, Vol.1788, 743-752, 2009.

He X., Huai W., Tie C., Liu Y., Zhang B., Breeding of high ergosterol producing yeast strain, Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, Vol.25, 39-44, 2000.

I. S. Ishtar Snoek1, H. Yde Steensma, Factors involved in anaerobic growth of Saccharomyces cerevisiae, Yeast; Vol.24, 1–10, 2007.

Ioan Florea Dumitru, Adrian Vamanu, Ovidiu Popa, Drojdiile, biotehnologii clasice și moderne, București, 2002.

Klein H.P., Synthesis of lipids in resting cells of Saccharomyces cerevisiae, Department of Microbiology, School of Medicine, University of Washington, Seattle,Washington, 1954.

L. W. Parks, J. D. Weete, Fungal sterols, în Physiology and biochemistry of sterols, editat de Glenn W. Patterson, W. David Nes, Editura American oil chemists, Society Champaign, Illinois, 160-168, 1991.

Leo W. Parks, James H. Crowley, Frank W. Leak, Steven J. Smith, Michele E. Tomeo, Use of sterols mutants as probes for sterol functions in the yeast, Saccharomyces cerevisiae, în Biochemistry and function of sterols, editat de Edward J. Parish, W. David Nes, 257-260, 2000.

Liu J., David Nes W., Steroidal Triterpenes: Design of Substrate-Based Inhibitors of Ergosterol and Sitosterol Synthesis, Molecules, Vol.14, 4690-4706, 2009.

M. E. Da Silva Ferreira, A. I. Colombo, I. Oaulsen, Q. Ren, J. Wortman, J. Huang, M. H. S. Goldman, G. H. Goldman, The ergosterol biosynthesis pathway, transporter genes and azole resistance in Aspergillus fumigatus, Medical mycology supplement, Vol.43, 313-319, 2005.

Mihai Leonte, Tehnologii, utilaje, rețete și controlul calității în industria de panificație, patiserie, cofetărie, biscuiți și paste făinoase, Editura Milenium, Piatra Neamț, 2003.

Paul S. Prickett, O. N. Massengale, Mycobacterium:Ergosterol content of certain species and effect of ergosterol on their growth, The journal of infectious diseases, Vol.49, Nr.4, 297-302, 1931.

Pichova A., Beran K., Behalova B., Zajicek J., Ergosterol Synthesis and Population Analysis of a Fed-Batch Fermentation in Saccharomyces cerevisiae, Folia Microbiology, Vol.30, 134-140, 1985.

Shobayashi M., Mitsueda S., Ago M., Fujii T., Iwashita K., Iefujii H., Effects of Culture Conditions on Ergosterol Biosynthesis by Saccharomyces cerevisiae, Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, Vol.69, Nr.12, 2381-2388, 2005.

Spanova M., Daum G., Squalene – biochemistry, molecular biology, process biotechnology, and applications, European Journal of Lipid Science and Technology, Vol.113, 1299–1320, 2011.

Szczebara F. M. et al., Nature Biotechnology, Vol.21, 143-149, 2003.

Tan T., Zhang Mu., Gao H., Ergosterol production by fed-batch fermentation of Saccharomyces cerevisiae, Enzyme and Microbial Technology, Vol.33, 366-370, 2003.

Wanderley de Souza, Juliany Cola Fernandes Rodrigues, Sterol biosynthesis pathway as target for anti-trypanosomatid drugs, Interdisciplinary perspectives on infectious diseases, Vol.2009, 2009.

Wayne A. Wilson, Peter J. Roach, Manuel Montero, Edurne Baroja-Fernandez, Francisco Jose Munoz, Gustavo Eydallin, Alejandro M. Viale, Javier Pozueta-Romero, Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria, 2010.

Zikmanis P.B., Auzane S.I., Auzina L.P., Margevicha M.V., Beker M.J., Changes of ergosterol content and resistance of population upon drying-rehydration of the yeast Saccharomyces cerevisiae, Applied Microbiology and Biotechnology, Vol.22, 265-267, 1985.

Zinser E., Constanze D.M., Sperka G., Fasch E-V, Paltauf F., Gunther D., Phospholipid Synthesis and Lipid Composition of Subcellular Membranes in the Unicellular Eukaryote Saccharomyces cerevisiae, Journal of Bacteriology, Vol.173, Nr.6, 2026-2034, 1991.