Studiul interacțiunii dintre ionul de Ca2+ si canalul ASIC1a prin metode de modelare moleculară Conducator Științific Prof. Dr. Dan Florin Mihailescu… [305229]

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

TEZĂ DE DOCTORAT

Studiul interacțiunii dintre ionul de Ca2+ si canalul ASIC1a
prin metode de modelare moleculară

Conducator Științific

Prof. Dr. Dan Florin Mihailescu

Doctorand: [anonimizat]

2019

Mulțumiri,

[anonimizat], Domnul Prof. Univ. Dr. Dan Florin Mihăilescu pentru că mi-a [anonimizat].

Realizarea acestei teze nu ar fi fost posibilă fără suportul și implicarea directă a mai multor oameni. Profunde mulțumiri doresc să adresez Domnului Conf. Univ. Dr. [anonimizat]. Univ. Dr. Dana Cucu .

Aș dori să mulțumesc îndrumătorilor mei Asist. univ. dr. Maria Mernea și Asist. univ. dr. [anonimizat].

Doresc să aduc mulțumiri și membrilor comisiei doctorale pentru eforturile de evaluare a tezei de doctorat.

[anonimizat]-au oferit-o pe parcursul realizării studiilor doctorale.

Cuprins

I. Introducere………………………………………………………………………………………………….5

1. Filogeneza canalelor ASIC…………………………………………………………………………….5

2. Rolul și distribuția în țesuturi………………………………………………………………………….6

3. Funcția și modularea canalelor ASIC………………………………………………………………7

4. Modulatori / activatori ai canalului ASIC1……………………………………………………..10

II. Stadiul actual al cunoașterii

1. Structura canalelor ASIC

2. Prezentarea principalelor domenii si subdomenii ale ASIC1a

3. Modificări conformaționale ale canalului ASIC1a

4. Modularea de către Ca2+ a deschiderii canalului ASIC1a

III. Scopul si obiectivele lucrării

IV. Metodologia utilizată

1. Alegerea modelului proteinei:

2. Prepararea proteinei

3. Construcția proteinelor cu mutații

4. Protonarea structurilor

5. Studii de dinamică moleculară

6. [anonimizat]

7. Distribuția potențialului electrostatic

V. Rezultate

1. Model general 2QTS

2. 2QTS_WT _pH 7.2

3. 2QTS_WT la pH 6.8

4. 2QTS_WT la pH 6.0

5. 2QTS_D433C_E426G_pH 7.2

6. 2QTS_D433C_E426G _ pH 6.8

7. 2QTS_D433C_E426G_pH 6

8. 2QTS_D433_E426G_D79N_ pH 7.2.

9. 2QTS_D433_E426G_D79N_ pH 6.8

10. 2QTS_D433_E426G_D79N_ pH 6

VI. Discuții și Concluzii

VII. Concluzii finale:

Structura și flexibilitatea canalului ASIC1a

[anonimizat]+ [anonimizat]. [anonimizat], nematode, [anonimizat] ’90 pe baza omologiei lor structurale (Figura 1) (Grunder și Chen, 2010). Canalele ASIC sunt activate de acidifierea mediului extracelular (senzori de pH) [anonimizat] ( Sakai și colab., 1999; Schaefer și colab., 2000; Lingueglia și colab., 2007; Alexander și colab., 2017).

Genele care codifică canalele ASIC la mamifere sunt ACCN1-4, iar acestea codifică opt variante de canale ASIC funcționale ( ASIC1a/b , ASIC2a/b , ASIC3a/b/c și ASIC4) (Canessa,C., 2015). Aceste subunități formează canale ASIC homo/heteromerice care au diferite sensibilități la pH. Există și gena ACCN5 care codifică canalul BLINaC (brain-liver-intestine Na+ channel), numit și BASIC, dar care are identici doar 26% din aminoacizi cu ASIC și nu este activat de protoni (Sakai și colab., 1999; Akopian și colab., 2000; Kellenberger și Schild, 2015).

Filogeneza canalelor ASIC

Canalele ASIC fac parte din familia canalelor DEG/ENaC, deoarece prezintă omologie în secvența peptidică și cu canalele mecanosenzitive DEG (degenerine) de la C.elegans (Kellenberger și Schild, 2002) , dar și cu canalele activate de peptide FMRF amide de la moluște (Lingueglia și colab., 1995).

(modificată după Grunder și Chen, 2010)

Figura 1. Arborele filogenetic al canalelor ASIC

A. Arborele filogenetic al canalelor ASIC ; B. Arborele filogenetic al ASIC de la vertebrate

Canalele ASIC se găsesc la vertebrate, putând fi clonate de la ciclostomi, rechini, de la pești osoși, de la găină (Paukert și colab., 2004) și de la mamifere (șoarece, șobolan, om) (Figura 1). Canalele ASICs sunt relativ bine conservate la mamifere (omologia între hASIC1,2,4 și rASIC1,2,4 este de aproape 100% și 83% ptr ASIC3 ), dar și în alte vertebrate (hASIC1 și cASIC1 de aproape 90% ).

În 1997 a fost clonat canalul ASIC1a activat de H ⁺, de la neuroni de șobolan. Acest canal a fost clonat pe baza omologiei cu canalele ENaC (canale de Na+ epiteliale), cu care au o identitate de secvență de 25% (Waldmann și colab., 1997).

Rolul și distribuția în țesuturi

Canalele ASIC sunt exprimate majoritar în neuroni și în câteva celule gliale, deși transcripte (ARMm) sau proteine ale unor canale ASIC au fost găsite și în alte țesuturi, dar activitatea funcțională susținută a fost detectată doar în sistemul nervos-central sau în sistemul nervos periferic.

Toate canalele ASIC sunt exprimate în sistemul nervos central (cu excepția ASIC1b – prezent doar în sistemul nervos periferic), cel mai des întâlnit este homomerul ASIC1a și heteromerul ASIC1a/2a (Waldmann și colab., 1995). În sistemul nervos central, ASIC 1, 2 și 4 se găsesc în cortex (Xiong și colab., 2004) , hipocamp (Baron și colab., 2001; Baron și colab., 2002; Askwith și colab., 2004) , cerebel, amigdală (Wemmie și colab., 2003) , striatum dar și bulbul olfactiv (Vukicevic și Kellenberger, 2004). ASIC1a este localizat la nivelul membranei postsinaptice unde contribuie la producerea curentului excitator postsinaptic (Wemmie și colab., 2002). Există dovezi că ASIC1a determină densitatea spinelor dendritice la nivelul neuronilor (Zha și colab., 2006).

În sistemul nervos periferic, ASIC 1,2b și 3 se găsesc în nociceptori și în neuronii senzitivi din ganglionii spinali , cu rol în detecția stimulilor dureroși (Voilley și colab., 2001; Deval și colab., 2011). ASIC3 se găsește și în aferentele simpatice cardiace, având rol în perceperea durerii din ischemia cardiacă (Sutherland și colab., 2001; Xie și colab., 2003).

Canalele ASIC au rol fiziologic în învățare, memorie (LTP), nocicepție, dar și patologic, în cazul ischemiei după un accident vascular cerebral, în boli inflamatorii autoimune, în durerea asociată inflamației, dar și în epilepsie (Ziemann și colab., 2008). Contrar acțiunii sale neurotoxice, excitatoare, există dovezi că, în cazul epilepsiei ASIC1a are rol protector, antiepileptic, ajutând la reducerea crizelor (McKhann II, 2008). Are rol și în vedere, implicate fiind celulele cu conuri din retină (Ettaiche și colab., 2006).

Activarea ASIC1a în cazul ischemiei cerebrale are un efect neurotoxic, ducând la moartea neuronilor (Pignataro și colab., 2006). Introducerea prin injecție intraventriculară într-un model de ischemie focală a unor blocanți ai acestor canale (PcTx1 sau amiloridă) are un efect neuroprotectiv (Snyder și colab., 1994; Renard și colab., 1994; Xiong și colab., 2004; Chen și colab., 2010; Liu și colab., 2015).

Creșterea densității canalelor ASIC în cazul inflamației se datorează eliberării locale a unor substanțe pro-inflamatoare ca bradikinina, serotonina, IL1, NGF, BDNF ceea ce duce la apariția durerii inflamatorii mediate de canalele ASIC (Babeș, 2007).

Funcția și modularea canalelor ASIC

Canalele ASICs sunt canale pH dependente, cu diferite praguri de activare/inactivare, (în general la pH puțin sub 7 începe activarea-deschiderea canalelor), având pH50 de la 6,6 – 6,7 până la pH 4,0 la activare și de la pH 7,2 la 5,6 pentru inactivare, ASIC4 fiind foarte puțin dependent la acidifiere (Tabel 1 – valori activare / inactivare canale ASIC 1,2,3). Activarea și inactivarea canalului au loc la schimbări de pH rapide în soluție (din cauza ratei de inactivare foarte rapide a canalului) (Coric și colab., 2003; Hesselager și colab., 2004; Poirot și colab., 2004) , iar dacă sunt expuse la pH ușor acid pot trece din starea închisă în starea inactivă fără deschidere aparentă (la pH 7,2 ASIC1a) (Alijevic și Kellenberger, 2012; Blanchard și Kellenberger, 2011). Canalele ASIC sunt permeabile pentru Na+ și pentru cationii monovalenți mai mici decât Cs+ ( cu o rată Na+ /K+ de aproximativ 1:10) (Kellenberger și Schild, 2002), la H+/Na+ cu o rată de permeabilitate între H+ și Na+ de aproximativ 5:1 (Chen și colab., 1998; Chen și Gründer, 2007). Chiar și în aceste condiții, curenții tranzienți sunt de Na+, deoarece concentrația de H+ este mult mai mică decât cea de Na+ (cu un ordin de mărime). Homomerii ASIC1a și heteromerii ASIC1a/2b au și o permeabilitate scăzută pentru Ca2+ (Wang și colab., 2006), acest aspect ridicând o serie de întrebări încă neelucidate pe deplin (mecanismul de competiție H+ / Ca2+ , situsurile de docare, modificările alosterice asociate (Bässler și colab., 2001; Yermolaieva și colab., 2004; Samways și colab., 2009; Sherwood.și colab., 2009; Sherwood și colab., 2011).

Tabel 1. Dependența de pH a funcționării canalelor ASIC

Funcția canalelor ASIC este modulată de ioni, diferite proteine și mici molecule (Tabel 2). Printre inhibitori se numără amilorida, diferite peptide de mici dimensiuni (40-60 aminoacizi) izolați din diversee veninuri ( PcTx1 – 40 aminoacizi – izolat din veninul tarantulei Psalmopoeus Cambridgei (Escoubas și colab., 2000; Escoubas și colab., 2003; Chen și colab.,2005; Mazzuca și colab., 2007), APETx2-42 aminoacizi- izolat din veninul anemonei de mare Anthopleura elegantissima, Mambalgin 1 și 2 – 58 aminoacizi – izolați din veninul mambei negre) , antiinflamatoare nonsteroidiene (NSAID- flurbiprofen, acid salicilic, diclofenac), diminazen, diarylamide și altele (Voilley și colab., 2001; Diochot și colab., 2004; Chu și colab., 2004; Donier și colab., 2005; Dube și colab., 2005; Diochot și colab., 2007; Staruschenko si colab., 2007; Ugawa și colab., 2007; Chen și colab.,2010; Diochot și colab., 2012; Dawson și colab., 2012; Baconguis și Gouaux, 2012). Inhibiția canalelor ASIC de către peptidele – toxină, conduce la analgezie în inflamațiile cronice și acute (conform rezultatelor in vitro).

Analgezia este produsă atât pentru sistemul nervos periferic cât și pentru sistemul nervos central (APETx2 – în modelul rozătoarelor , pentru durere inflamatorie postoperatorie, iar PcTx1 în inflamație cronică și acută) (Bohlen și colab., 2011).

Tabel 2. Inhibitori ai canalelor ASIC

Modulatori / activatori ai canalului ASIC1:

Printre activatorii canalelor ASIC, MitTx (o peptidă izolată din veninul de șarpe texas coral) este cel mai puternic activator independent al canalului ASIC1a (Baconguis și colab., 2014). Interesantă este acțiunea PcTx1, care la concentrații mici este inhibitor iar la concentrații mai mari devine activator. Celelate substanțe prezentate în Tabelul 3 (și alte substanțe neprezentate) , acționează ca un catalizator al activării în urma acidifierii, dar nu pot activa independent canalul (Chen și colab., 2005; Bohlen și colab., 2011, Baconguis și Gouaux, 2012). Printre alți modulatori ai ASIC se numără și: radicali liberi, agenți redox, acid arahnoidic, kinaze, proteaze.

Tabel 3. Activatori ai canalelor ASIC

Stadiul actual al cunoașterii

Structura canalelor ASIC

Canalele ASIC reprezintă o proteină alcătuită din aproximativ 550 aminoacizi , sub formă de trimer. Fiecare subunitate este alcătuită din două domenii transmembranare hidrofobe alcătuite din 20 aminoacizi, capete N și C terminale intracelulare scurte de 35-90 aminoacizi și o buclă extracelulară de 370 aminoacizi (topologie comună cu ENaC / Deg) (Saugstad și colab., 2004; Carnally si colab., 2008).

Bucla extracelulară are rol foarte important în controlul activității canalelor ASIC, conținând senzorul de protoni, fiind implicată în activarea și inactivarea canalului (Canessa și colab., 1994; Snyder și colab., 1999).

Prima treime din bucla extracelulară conține câteva reziduuri de aminoacizi diferiți, fiind mai variabilă, în timp ce următoarele treimi prezintă o mare omologie între membrii ASIC.

Toate canalele ASIC au în bucla extracelulară 14 resturi de cisteină Cys înalt conservate, care stabilizează structura buclei prin formarea legăturilor disulfidice (Firsov și colab., 1999). În partea distală a buclei extracelulare se găsesc 2 glicani la ASIC1a și 4 glicani la ASIC1b (2 în partea distală, identici cu ASIC1a și 2 în partea proximală). Cei 2 glicani proximali au rol în formarea structurii buclei extracelulare , diferită între ASIC1a și ASIC1b (Kadurin și colab., 2008).

La toate canalele ASIC , în centrul domeniului transmembranar se găsesc 3 aminoacizi: Gly442- Ala443- Ser444, care reprezintă filtrul de selectivitate GAS (Baconguis și colab., 2014).

Domeniul transmembranar este identic între ASIC1a și ASIC1b, chiar dacă ASIC1a este permeabil pentru Ca²⁺, în timp ce ASIC1b nu este permeabil. Astfel, s-a sugerat că selectivitatea pentru Ca²⁺ se datorează diferenței existente între cele 2 canale în capătul N terminal (Babini și colab., 2002), care ajută la formarea structurii porului (Pfister și colab., 2006; Gonzales și colab., 2009) și la selectivitatea ionilor (Coscoy și colab., 1999).

În domeniul N terminal se găsesc 2 aminoacizi – His și Gly, care sunt înalt conservați la toți membrii familiei DEG/ENaC (Gründer și colab., 2000), ceea ce demonstrează că au un rol foarte important, intrând în alcătuirea “gating domain” ca și la canalele ENaC (“HG motiv”) (Gründer și colab., 1997; Gründer și colab., 1999).

Domeniul C terminal este scurt, identic între ASIC1a și ASIC1b, nu este necesar pentru activitatea canalelor ASIC, dar este important pentru reglarea funcției acestor canale. La canalul ASIC1a, acesta interacționează cu o protein kinaza PICK1 (Strader și colab., 1994).

În anul 2007 a fost reprezentată prima structură 3D a canalului ASIC1 de chicken (Jasti și colab., 2007) , obținută prin cristalografie cu raze X. Structura canalului ASIC1 , la o rezoluție de 1.9 Å, a fost făcută prin cristalizarea unui mutant ASIC1 de găină nefuncțional. ASIC1a de găină are omologie de secvență de aproximativ 90% cu ASIC1a de șobolan și ASIC1a uman. O altă structură a unui ASIC funcțional, care prezintă capătul N terminal, cu rol în “gating ”, a fost realizată la o rezoluție de 3Å (Gonzales și colab., 2009). Ambele au fost cristalizate la pH scăzut, evidențiind astfel conformația canalului ASIC1 în stare inactivă.

Ulterior au fost reprezentate prin aceeași metodă și alte structuri ale canalului ASIC1 (Tabel 4) (Gonzales și colab, 2009; Dawson și colab., 2012; Baconguis și Gouaux, 2012; Baconguis și colab., 2014; Yoder și colab., 2018; Yoder și Gouaux, 2018).

Tabel 4. ASIC 1 – Structuri 3D publicate

Ambele structuri cristalizate au demonstrat asamblarea canalelor ASIC sub formă de trimeri. Fiecare din cele 3 subunități au o buclă extracelulară de forma unei mâini încleștate ce prezintă 5 subdomenii: ”palmă, domeniul degete, domeniul deget mare, articulație și sferă β” (Baconguis și colab., 2014; Gonzales și colab, 2009) prezentate grafic în Figura 2 și Figura 3. Configurația de trimer a fost confirmată și prin studii de microscopie de forță atomică (Carnally și colab., 2008).

Prezentarea principalelor domenii si subdomenii ale ASIC1a

Domeniile transmembranare (TM1 și TM2) sunt înclinate cu 50 grade față de membrana celulară și se încrucișează în mijlocul membranei (Gonzales și colab., 2009). Aceste helixuri transmembranare discontinue aliniază porul canalului și se leagă de foile β pliate ale domeniului palmă, care este poziționat de-a lungul axului central vertical, deasupra acestuia aflându-se domeniile sferă-β și articulație. Spre partea exterioară se află domeniul degete (formând colțul extern superior al canalului) și domeniul deget mare.

Domeniul deget mare – este o structură rigidă formată din α helixuri, stabilizată de punți disulfidice și este legat de domeniul palmă prin două bucle, care interacționează cu capătul superior al TM1 prin structura – răsucire (buclă) β.

Figura 2. Structura canalului cASIC1a

Domeniile ASIC1a (modificată după Baconguis și colab., 2014)

Domeniile ASIC1a: Roz- domeniul transmembranar, galben-palmă, albastru – deget mare, violet – deget, portocaliu – sferă- β, turcoaz – articulație. modificată după Kellenberger și Schild, 2015)

Cele trei subunități sunt aranjate simetric față de axul central-vertical și formează 4 cavități, numite vestibule, aliniate de-a lungul axului central și separate între ele prin constricții : vestibulul superior, central, extracelular și intracelular – ultimele două fiind încărcate electronegativ, atrăgând cationii (Jasti și colab., 2007; Gonzales și colab., 2009; Baconguis și Gouaux, 2012; Zheng și colab., 2015; Kellenberger și Schild, 2015). Aceste constricții dintre vestibule se lărgesc și duc la formarea unui tunel central prin care cationii ajung către porul canalului, dirijați de reziduurile acide ale vestibulelor (Figura 4c).

Există și un acces direct al cationilor către vestibulele extracelulare, prin cele 3 fenestrații laterale (Figura 10 A) (Donier și colab., 2005; Li și colab., 2011). Totuși, ionii nu pot trece prin porul canalului, deoarece în conformația inactivă segmentele transmembranare se încrucișează, grație Gly435 în mijlocul membranei celulare, închizând porul canalului. Aceasta constituie poarta de inactivare, o blocare fizică a porului canalului de către cele 2 helixuri transmembranare.

O particularitate a canalelor ASIC (mai departe voi trata ASIC1a, acesta având structura cunoscută și, în același timp, unul dintre cele mai mari răspândiri) este așa numitul buzunar acid (“acid pocket”) care conține trei perechi de aminoacizi cu caracter acid, puternic încărcate negativ și care, la protonare inițiază modificări alosterice care conduc la deschiderea / închiderea / inactivarea canalului.

(modificată după Canessa C., 2015)

Figura 3. Prezentare schematică a cASIC1 cu evidențierea domeniilor/subdomeniilor

Deget (albastru) , Sferă- β (verde), Articulație ( turcoaz), Deget mare (portocaliu), Palmă (galben), Domenii transmembranare TM1 si TM2 (roșu), Capete terminale –N si –C (violet)

La ASIC1a buzunarul acid este localizat între domeniul deget mare, domeniul deget și sferă-β, și se presupune că, în starea închisă a canalului, perechile de aminoacizi sunt mai depărtate decât în starea deschisă, iar protonarea ar permite domeniului deget mare să se apropie de domeniul deget și de domeniul sferă-β, presupunere susținută de experimente de mutageneză care duc la modificarea forțelor de atracție dintre deget mare, domeniul degete și domeniul sferă-β, având ca și consecință modificarea valorilor de pH la care se activează canalul ASIC1a (Jasti și colab., 2007; Krauson și colab., 2013).

În zona buzunarului acid se află o punte de sare (Asp107 – Arg160), care are rol de legătură între zona rigidă- Arg99, Glu159, Asp160, Asp216, Gln218, Gln219, Glu220, Glu221 și domeniul deget (care este cea mai flexibilă zonă a canalului ASIC) (Yang și colab., 2012). Se presupune că buzunarul acid este format din perechile de aminoacizi: Asp237-Asp349; Glu238-Asp345; Glu219-Asp407 și au un rol foarte important în activarea canalului ASIC1a (Paukert și colab., 2008).

Modificări conformaționale ale canalului ASIC1a

Dovezile și presupunerile asupra modificărilor conformaționale ale canalului ASIC1a sunt furnizate de câteva metode : microscopie de forță atomică, comparația între starea activă și inactivă a canalului (starea închisă nefiind pe deplin stabilită), studii de mutageneză, patch-clamp (Amuzescu și colab., 2017), metode computaționale și VCM (voltage-clamp fluorometry). Aceste modificări apar la activarea / inactivarea canalului sau la docarea liganzilor.

Un studiu de microscopie de forță atomică a arătat că există modificări conformaționale ale buclei extracelulare la ASIC1a, aceasta înălțându-se de la 4nm ( pH 7) la 6nm (pH 6) (Yokokawa și colab., 2010).

De asemenea, comparațiile între starea activă și starea inactivă au evidențiat schimbări conformaționale în mai multe domenii ale canalului.

În 2012, Baconguis și Gouaux, au determinat, prin metoda cristalografiei cu raze X, două structuri funcționale ale complexului cASIC1a – PcTx1, ambele reprezentând canalul în stare activă. Una dintre structuri a fost determinată la pH 5,5 ( cod PDB : 4FZ0) fiind Na+ selectivă și inhibată de amiloridă; cea de a doua structură a fost determinată la pH 7,25 (cod PDB: 4FZ1) fiind non-selectivă și rezistentă la amiloridă.

a; b – (modificată după Baconguis și Gouaux, 2012)

c.

c. (modificată după Baconguis și colab., 2014)

Figura 4. Modificări conformaționale – în zona vestibulelor formate între subunități

Canalul ASIC1a în complex cu PcTx1 (în partea stângă-linia negră reprezintă axa în jurul căreia are loc rotația domeniilor încheietură și palmă ; în partea dreaptă, distanța dintre subunități se mărește cu 2-3 Å ca urmare a rotației);

foile β-pliate ( β1-β2/β11-β12) care fac legătura între domeniul extracelular și domeniul transmembranar TM1 ( stare activă – portocaliu, stare inactivă – gri)

Conformația vestibulelor: A – canalul ASIC1a : în stare activă B și în stare inactivă C.

Conform Baconguis și Gouaux, 2012, comparația structurală a complexului cASIC1a – PcTx1 (forma activă-cod PDB 4FZO,4FZ1) cu cASIC1a (forma inactivă – cod PDB 3HGC) a arătat că: foile β ale părții superioare din domeniile palmă și articulație fac parte dintr-o structură rigidă tip “schelă ” care își conservă forma între cele două stări ale canalului (fapt contrazis de studii de fluorometrie-voltage clamp și de înlocuire cu fluorofori, care arată și în aceste zone modificări conformaționale în cazul activării / inactivării) (Bonifacio și colab., 2014)– voi reveni în cursul lucrării cu studiul acestei inadvertențe și cu o ipoteză asupra ei.

Astfel, domeniul încheietură și domeniul palmă inferior se rotesc cu 130 în jurul unui ax aflat sub “schelă” (Figura 4a-stânga), iar din această cauză domeniul deget mare se îndepărtează de domeniul palmă al subunității alăturate, această mișcare ducând la creșterea dimensiunilor vestibulului central, delimitat de înfășurarea domeniului palmă (Figura 4) (Baconguis și Gouaux, 2012; Baconguis și colab., 2014). Distanța între subunități (având ca reper reziduul Val75) fiind 11-12 Å (la pH diferit) în stare activă și de 7 Å în stare inactivă (Figura 4a- dreapta).

În sprijinul ipotezei acestei modificări în zona vestibulului central, vine un studiu realizat pe ASIC3, având mutantul E79C ( E79 fiind omologul lui Glu80 în ASIC1)– aflat pe fața interioară a vestibulului central, care conduce la modificarea parametrilor inactivării, dar nu afectează activarea (Cushman și colab., 2007). Toate aceste aspecte conduc la ideea că vestibulul central se contractă în timpul inactivării.

Alte mișcări conformaționale de notat în domeniul palmă: o îndepărtare a foii pliate β1 de foaia omoloagă din subunitatea vecină (Figura 4b), cauzată de inversarea la 1800 a legăturii între reziduurile Arg85 și Thr84 (Figura 5) aflate în zona β1-β2; În conectorii β11-β12 reziduurile- Leu 414, Asn415 și Ala 413 își schimbă conformația – prin inversarea pozițiilor lui Leu 414 cu Asn 415 (distanța între Ala413-Ala82 fiind de 8,1 Å la pH ridicat și de 6,4 Å la pH scăzut se presupune că se formează o punte disulfidică, stabilizând conformația inactivă – similar cu sASIC), conducând la modificare conformațională a acestor conectori.

Clarificări asupra modificărilor conformaționale au fost aduse în 2014 de Baconguis și colab., care au făcut o structură 3D prin cristalografie cu raze X a complexului cASIC1-MitTx (peptidă izolată din veninul de șarpe texas coral ), printre principalele descoperiri fiind structura și modificările conformaționale în domeniul transmembranar (atât TM1, cât și TM2), precum și “GAS motiv”, o structură importantă în selectivitatea ionilor și în activitatea porului.

Față de structurile 3D prezentate anterior, în care domeniile transmembranare sunt prezentate continue, în structura nouă (cod PDB : 4NTW ), domeniul transmembranar 2 este întrerupt la cca 1/3 din înălțime ( 2/3 față de membrană) și prezintă o structură numită “GAS motiv” (Figura 5 D). Astfel, forma de helix a lui TM2 se termină la Gly443 unde se formează o structură de conformație extinsă ( aproximativ paralelă cu membrana ) din reziduurile- Gly443, Ala444, Ser445. Ulterior, TM2 își recăpătă forma de α helix începând de la Ile446 la Ala456 (Kadurin și colab., 2008). Descoperirea este susținută de reinterpretarea 3HGC / 4NYK

(modificată după Baconguis și colab., 2014)

Figura 5. Reprezentare 3D a complexului cASIC1–MitTx

5A si 5B. Modul legare a peptidei MitTx (cu cele 2 subunități α și β) de cASIC1 (cu cele 3 subunități); C. Reprezentarea legăturii pentru o subunitate cASIC1 ; D. Structura cASIC, inclusiv TM2, reprezentat discontinuu și cu evidențierea “GAS motiv”

Motivul GAS funcționează ca o rețea (centură) de aminoacizi care împarte TM2 în TM2a și TM2b – care interacționează cu partea intracelulară a lui TM1 din subunitatea adiacentă. Centura GAS este structură din domeniul transmembranar relativ stabilă în modificările conformaționale ce au loc în timpul activării / inactivării .

(modificată după Baconguis și colab., 2014)

Figura 6. Filtrul GAS si rearanjarea domeniului transmembranar

Reprezentarea domeniului transmembranar al complexului cASIC1a (tip ‘cartoon’) – domeniul de deasupra centurii GAS este notat TM2a, iar cel de jos TM2b ; B. Harta cu densitatea atomilor ( au fost omiși Leu450 și Ile442); C. Vedere asupra domeniului transmembranar (din interiorul celulei); D. Vedere în detaliu , cu Ser445 “agățând ” subunitatea adiacentă.

(modificată după Baconguis și colab., 2014)

Figura 7a. Modificările conformaționale ale domeniului transmembranar

A. Forma inactivă canalului; B. Forma activă a canalului (fără domeniile deget mare și domeniul degete; cu albastru – structura conservată a canalului)

(modificată după Baconguis și colab., 2014)

Figura 7b. Modificările conformaționale ale domeniului transmembranar

C. Modificările segmentelor transmembranare (de tip iris); D. TM2a are o rotație în planul

mebranei de 440 ; E. Forfecarea segmentelor transmembranare, în planul perpendicular pe membrană, TM1 40 și TM2 100 ; F. Poziția domeniilor transmembranare TM1 și TM2 a unei subunități.

Astfel, prin comparația stării inactive cu starea activă a complexului cASIC1 – MitTx, se evidențiază următoarele conservări / modificări conformaționale :

În domeniul extracelular se conservă “schela” formată din domeniul palmă superior și domeniul articulație; domeniul palmă inferior se flexează în zona de înfășurare a foilor β pliate, lărgind vestibulul central și pe cel extracelular . Poarta de inactivare, aflată în jumătatea superioară a domeniului transmembranar, formată dintr-o ocluziune de 8 –9 Å se deschide (Figura 4c, Figura 7A și B) (Gründer și Augustinowski, 2012; Kellenberger și Schild, 2015). Flexarea foilor β pliate ale domeniului palmă închide (în stare inactivă) ocluziunea dintre vestibulul central și cel extracelular (distanța dintre subunități devine 9 Å la inactivare, față de 16 Å la activare : reper Ala424). Această constricție are ca margini Leu78-Val75 (în stare inactivă) și are dimensiunea de circa 9 Å, iar în stare activă (cASIC-MitTX ) Val 75 se îndepărtează de axul central (Baconguis și Gouaux, 2012; Baconguis și colab., 2014) ; are loc o modificare ușoară a pozițiilor între β1-β2 și β11-β12, în zona Leu78 (Kellenberger și Schild, 2015), care funcționează ca un pivot, posibil pentru a transmite mișcarea către domeniul transmembranar (Li și colab., 2009; Springauf și colab., 2011). Are loc o modificare conformațională severă a reziduurilor Asn415 și Leu414, cu schimbare de poziții, orientare și interacțiuni cu alte reziduuri (Li și colab., 2011; Baconguis și colab., 2014).

În domeniul transmembranar: modificările conformaționale ale domeniului transmembranar induc o deschidere a porului de tip iris. Domeniile transmembranare se rotesc în jurul celor 3 axe cu diferite valori: TM1 -170 , TM2a-40 și TM2b 440 (Figura 7 C,D,E) (Baconguis și colab., 2014). Aceste rotații au o structură rigidă (imobilă) pe post de pivot în zona filtrului GAS: Phe441, Leu57, Leu58 de deasupra GAS și Leu447, Cys50, Phe51 de sub GAS (Baconguis și Gouaux, 2012; Baconguis și colab., 2014).

Astfel, după Baconguis și colab., 2014, mecanismul de “gating” al canalului cASIC1a este bazat pe o structură rigidă dată de domeniile-palmă (superior) și articulație, care acționează ca o schelă, înconjurată de domeniile flexibile degete, deget mare, palmă (inferior) și încheietură, care suferă modificări conformaționale variate în funcție de starea canalului ASIC (activat, inactivat și închis).

(modificată după Baconguis și colab., 2014)

Figura 8a. Domeniul transmembranar și dimensiunea porului în diferite stări / complexe

A. B. C. cASIC1a-MitTx , corespondența vestibulelor, B. stare activă, C. stare inactivă (B și C generate cu software HOLE) , unde mov >2,3 Å> verde >1,15 Å>roșu;

(modificată după Baconguis și colab., 2014)

Figura 8b. Domeniul transmembranar și dimensiunea porului în diferite stări / complexe

D. – dimensiunile deschiderii porului ( domeniul transmembranar): verticală -adâncimea porului; orizontală – deschiderea maximă a porului pentru diferite structuri / stări ; E. Vedere de aproape a porului ( reprezentat doar TM2 – pentru claritate).

Parte a mecanismului de activare al cASIC1a  este transmiterea mișcării dată de înfășurarea foilor β pliate din domeniul palmă inferior către domeniul transmembranar (în formă inactivă a canalului, porul acestuia este obstrucționat prin ocluzia de 9 Å , dată de domeniul transmembranar 2), unde antrenează în mișcare tip “iris” rotații ale domeniilor transmembranar1, transmembranar 2a și transmembranar 2b în jurul axelor și mișcări de forfecare între domeniile transmembranar1si 2 din aceeași subunitate, iar rearanjarea domeniului transmembranar 2 conferă porului o conformație simetrică care permite trecerea ionilor de Na+ ( filtrul de selectivitate GAS având dimensiunea de 3.8 Å -cât dimensiunea unui ion de Na+ hidratat).

În contradicție cu cele spuse mai sus, vine un studiu de voltage-clamp flurometrie (Bonifacio și colab., 2014), care prin mutații cu fluorofori determină ordinea mișcărilor la activarea și inactivarea canalului.

Astfel pentru activare, primele reziduuri care se mișcă sunt :

1. Cu viteză mare -câteva reziduuri din domeniul deget, urmate de Glu355 din domeniul deget mare, Glu427 de la intrarea în por, Ile281 din bucla palmă-deget mare;

2. Cu viteză medie – alte reziduuri din domeniul degete, din domeniul knuckle și din bucla palmă-deget mare;

3. Cu viteză mică – reziduul Asp78 din domeniul palmă (Figura 9).

Față de studii precedente asupra mișcării domeniilor, bazate pe comparația între starea deschisă (cu liganzii PcTx1 și MitTx) (Baconguis și Gouaux, 2012) , acest studiu bazat pe mutații cu fluoroflori arată modificări și în domeniile articulație și palmă superior (practic domeniul degete este cel mai flexibil, apoi au loc mișcări în domeniile articulație, deget mare și palmă).

Această inadvertență este explicată de autorii studiului prin posibilitatea ca această conformație deschisă a canalului cu ligandul PcTx1 să fie diferită de conformația deschisă prin protonare

(modificată după Bonifacio și colab., 2014)

Figura 9. Ordinarea de mișcare a domeniilor / reziduurilor în activare / inactivare

Ordine activare ; B. Ordine inactivare ; C. Ordine revenire din inactivare

. (modificată după Grunder și Chen, 2010)

Figura 10. Canalul cASIC1a – ipoteză asupra situsurilor de legare

A . cASiC1a – distribuția reziduurilor încărcate negativ în vestibulele central și extracelular; Fenestrația laterală permite și ea trecerea cationilor.

B . Situsurile de legare a cationilor

Pentru a stabili toate modificările conformaționale ale canalului, trebuie înțeles mecanismul de deschidere, cu stabilirea următoarelor repere/etape :

1. protonarea situsurilor de tip senzor de protoni (inițial se credea că singurul situs de tip “senzor de pH” este buzunarul acid), prin înlocuirea ionilor de Ca2+ cu H+ (Figura 11);

2. Inițierea mișcărilor alosterice ale domeniului extracelular;

3. Transmiterea mișcărilor alosterice (calea de semnalizare) către por (către domeniul transmembranar);

4. Adoptarea conformației deschise a porului ( mișcările pre-transmembranare și rearanjarea domeniului transmembranar).

Modelele inițiale propun înlocuirea Ca2+ cu H+ (Immke și McCleskey, 2003) din situsurile buzunarului acid și din domeniul pre-transmembranar și mișcarea domeniului palmă inferior către domeniul deget mare, concomitent cu mișcarea domeniului deget mare superior către domeniul degete (Figura11) (Paukert și colab., 2008).

(modificată după Paukert și colab., 2008)

Figura 11. Conformație activă / inactivă a cASIC1a propusă în 2008 Paukert și colab.

Partea stângă – canalul în conformație închisă, cu situsurile de legare ale cationilor (Ca2+ )

Partea dreaptă – canalul în conformație activă.

În urma studiilor de mutageneză, de comparație a structurilor active cu cele inactive și a studiilor de voltage-clamp fluorometrie, un studiu din 2015 realizat de Kellenberger și Schild, propune un model de mecanism de activare / inactivare, astfel:

Activare : acidifierea mediului conduce la protonarea unor reziduuri în diferite domenii ( buzunarul acid, domeniul deget, palmă și încheietură) (Paukert și colab., 2008; Shaikh și Tajkhorshid, 2008; Liechti și colab., 2010; Krauson și colab., 2013) , care conduce la mișcări rapide în zona vestibulului central și în domeniul degete (helixul α2) care se îndepărtează de sferă-β (acesta la rândul lui are o mișcare în direcție opusă ) (Passero și colab., 2009; Bonifacio și colab., 2014), domeniul deget mare se apropie de domeniul sferă-β și de domeniul degete (Figura 12).

Mecanismul de transmitere al mișcării de la domeniul deget la domeniul transmembranar nu este pe deplin elucidat, existând două ipoteze :

1. Prin partea externă: domeniul deget mare și bucla deget mare-palmă;

2. Prin partea internă: palmă către vestibulul extracelular.

Aceste mișcări alosterice în sinergie cu mișcările domeniilor palmă și încheietură conduc la deschiderea porului (anume a “porții de inactivare” localizată între Gly432 și Gln437) (Li și colab., 2011) și la rearanjarea domeniului transmembranar (posibil în maniera arătată la comparația 2QTS-4NTW) (Baconguis și colab., 2014).

Inactivare: mișcările de apropiere ale domeniilor palm inferior din subunitățile adiacente și îngustarea vestibului central conduc la închiderea porții de inactivare (Baconguis și colab., 2014).

În mecanismul de activare propus în Figura 12, autorii nu fac reprezentarea mișcărilor domeniilor palmă și articulație la activare, aceste mișcări fiind în continuare controversate (Kellenberger și Schild, 2015).

(modificată după Kellenberger și Schild, 2015)

Figura 12. Mecanismul de activare al cASIC1a

Deplasările domeniilor la activare / inactivare ( cu săgeți roșii – deplasările în cazul activării, cu săgeți negre – în cazul inactivării).

Deși există evidențe în studiile de mutageneză efectuate pe ASIC, interpretarea rezultatelor acestor studii necesită o diferențiere a efectelelor înregistrate. Motivația acestui fapt derivă din modul complex în care ASIC1a răspunde la acidifierea mediului și anume:

1. Situsurile de tip “senzor de protoni” sunt multiple și (se pare) redundante, în multe studii făcându-se mutații corelate ale mai multor reziduuri (cu mutații duble și triple)

2. Disfuncțiile înregistrate în urma mutațiilor pot fi cauzate de rolul reziduului (fie de “senzor de protoni”; fie de inițiere a mișcărilor alosterice sau de susținere a mișcărilor alosterice), precum și – cum arată studiul nostru- prin modificarea la diferiți aminoacizi a distribuției potențialului electrostatic de suprafață)-având, individual sau într-o structură, rolul de stabilizare a unor conformații ale canalului, rolul de pivot sau rol atracție / respingere datorate încărcării electrostatice.

3. Nu toate studiile au fost făcute pe același tip de ASIC1a, multe studii bazându-se pe omologia reziduurilor acestui canal cu alte tipuri de ASIC.

Modularea de către Ca2+ a deschiderii canalului ASIC1a

În cadrul studiului canalului ASIC1a a fost observată o corelație între modul / caracteristicile tranziției între stări ale canalului și concentrația de cationi bivalenți organici sau anorganici, care au un rol dual: atât inhibitori cât și activatori; de multe ori aceeași substanță putând avea ambele proprietăți în funcție de concentrația ei sau în funcție de pH.

Între acești cationi – Ca2+ se evidențiază în mod special, influențând într-o manieră de dependență tranzițiile între stări – mutând practic curbele de activare / deschidere și desensitizare / închidere cu un ΔpH 0.2; în funcție de concentrația de ioni Ca2+ aflată în soluția extracelulară, chiar și la pH-uri foarte acide, când canalele sunt deschise în proprotie de 100% – amplitudinea curenților poate fi redusă cu până la 60 %.

Activarea canalului se face prin reducerea rapidă a pH-ului de la 7,4 la valori mai mici de 6,9; la descreșterea lentă de la 7,4 la 6,9 canalul se inactivează; pentru acuratețea rezultatelor peak-ului de curent, atât la activare cât și la inactivare, pHul se reduce / crește rapid de la 7,4 la < 6,9 și invers.

(Grunder și Pusch, 2015)

Figura 13. Valorile parametrilor electrofiziologici ale canalului ASIC1a.

(modificată după Babini și colab., 2002)

Figura 14. A. Curenții obținuți la diferite pHuri (pulsuri de 3,5 s) având pHul de condiționare de 7,4; B. Curenții obținuți la pulsuri de pH 6 și pHuri de condiționare diferite

(modificată după Zhang și colaboratorii, 2006)

Figura 15 . Amplitudinea curenților și dependența de gradientul Ca2+

Peak-ul curentului inward crește odată cu scăderea pH-ului (la acidifierea mediului extracelular), având următoarele caracteristici :

• La pH5: avem curenți de 100pA pentru 65-90ms versus la pH7.2 : curenți de 1-12 pA / 1,4s

• De la pH 7.0 la pH6.8 avem primele canale deschise izolate (2-3) versus de la pH6.0 – la pH5.0 aproape 100% canale deschise sincron. In intervalul de pH de la 6.9 la 5.0 avem prezenti curenți de ~1,2 pA la aplicarea unui curent de -40mV.

O altă particularitate importantă a canalului ASIC1a este tahiflexia la aplicații repetate de pH scăzut a canalului. Tahiflexia este explicată de mecanismul de tranziție între stările de repaus și activare, tranziție care se face printr-o stare intermediară- starea de desensitizare .

(modificată după Chen și Gründer, 2007)

Figura 16. A. si B. Reducerea curenților amplitudinii curenților la ASIC1a în funcție de reducerea pHului; C. Comparație a tahiflexiei în familia canalelor ASIC

Se observă că fenomenul de taxiflexie este singular pentru ASIC1a în familia ASIC. Studii ulterioare ar putea fi utile pentru a înțelege semnificația fiziologică și farmacologică a acestui fenomen.

(modificată după Babini și colab., 2002)

Figura 17. A. Ca2+ mută, curba activării canalului ASIC1a într-o manieră dependentă de concentrație; B. Ca2+ mută, curba activării canalului ASIC1a într-o manieră dependentă de concentrație

În Figura15 și în Figura17 se observă că ionul Ca2+ modulează deschiderea și desensitizarea canalului într-o manieră dependentă de concentrație. Astfel, la concentrații de 0,1mM de Ca2+ (atât pentru activare, cât și desensitizare / inactivare steady state) canalele nu sunt influențate din punctul de vedere al pragului de pH necesar tranziției între stări (mai mult, a fost descoperită, de către același colectiv, o acțiune catalitică a Ca2+ la concentrații mici). La concentrații de peste 1mM Ca2+ prezintă o puternică și constantă acțiune inhibitoare a activării / inactivării canalului la pHul fiziologic . Această

acțiune este accentuată sinergic la adăugarea de alți cationi divalenti. În plus, Ca2+ influențează amplitudinea curenților la pH puternic acid – amplitudinea curenților fiind redusă cu până la 60% în prezența Ca2+ în concentrații mari (Figura18).

(modificată după Paukert si colab., 2008)

Figura 18. Dependența amplitudinii curenților canalului activ ASIC1a la diferite concentrații de Ca2+

Eforturi pentru a înțelege dependența de Ca2+ a tranziției stărilor au fost făcute în mod deosebit de colectivul lui Paukert în 2004 și 2008 (Paukert și colab., 2004; Paukert și colab., 2008), aceștia făcând experimente de electrofiziologie și mutageneză pentru un număr de peste 20 aminoacizi considerați de interes pentru deschiderea și desenzitizarea canalului ASIC1a.

Practic, din toată literatura de specialitate, experimentele prezentate mai sus în Figura18 și în Figura 19 aduc rezultatele cele mai promițătoare legate de dependența de Ca2+ a canalului ASIC1a, dar și întăresc ipoteza că aminoacizii D433 și E426 sunt situsuri principale de legare a Ca2+.

În literatura de specialitate se consideră că sunt situsuri multiple de legare a Ca2+ în bucla extracelulară al căror rol nu este pe deplin înțeles. Studii recente au adus elemente noi privitoare la ASIC1a, odată cu un număr mare de structuri determinate prin cristalografie cu raze X – 6 din totalul de 17 structuri cunoscute au fost modelate și publiate în anul 2018 – completând astfel descrierea celor 3 stări ale canalului : deschis, închis / repaus și închis / desenzitizat.

(modificată după Paukert și colab., 2008)

Figura 19. A. Amplitudinea curenților în funcție de concentrația de Ca2+ , la pH 5.5 pentru ASIC1a WT și mutanții : E426G/D433C, D433C/E426G și Q437N

Amplitudinea curenților canalului ASIC1a în funcție concentrația de Ca2+ pentru varianta mutantă E426GD433C

(modificată după Yoder și Gouaux, 2018)

Figura 20. a. Situsuri de legare a cationilor la pH scăzute in canalul ASIC1a  (sfera albastra) la pH acid; b. Detaliu cu site de Ba2+ în buzunarul acid; c. Profilul porului pentru starea de repaus și starea desenzitizată; d. Detaliu cu vestibulul porului în starea desenzitizată.

Toate cele 6 structuri (Yoder și colab., 2018; Yoder și Gouaux, 2018) au secțiuni speciale dedicate situsurilor de cationi (în principal Ca2+ și Ba2+). Astfel, studiile au evidențiat situsuri de Ca2+ și în domeniul deget mare și în zona buzunarului acid. Dar situsurile de Ca2+/Ba2+ din domeniul extracelular sunt situsuri de legare la pH scăzute, acide care nu au legătură cu faza de tranziție spre deschidere.

Cu toate clarificările venite în urma studiilor din anul 2018, mecanismul modulării de către Ca2+ a tranziției între stări a canalului ASIC1a nu este pe deplin elucidat. În continuare, rezultatele experimentelor de mutageneză și electrofiziologie ale lui Paukert și colaboratorii, 2004 și 2008 oferă indicii semnificative despre aminoacizii potențial importanți implicați în această dependență.

III. Scopul si obiectivele lucrării

Ținând cont de importanța fiziologică a canalelor ASIC1a, înțelegerea mecanismelor acestora de deschidere, închidere și desensitizare ca urmare a modificării pHului în mediul extracelular prezintă o importanță deosebită în vederea descoperirii și elaborării de noi molecule care să posede calități preventive și curative pentru patologii în care sunt implicate canalele ASIC1a ( ischemie după un accident vascular cerebral, boli inflamatorii autoimune, durerea asociată inflamației, dar și epilepsie).

Astfel, înțelegerea acestor mecanisme presupune înțelegerea răspunsului canalului ASIC1a la două tipuri de modificări fiziologice a mediului intracelular a sistemului nervos:

• modificarea pH-ului mediului intracelular – care apare doar în condiții patologice

• modificarea concentrației de ioni divalenți – care apare în condiții fiziologice specifice schimburilor între mediile intracelular și extracelular; de specificat că această modulare este o condiție specifică în cadrul modificării pH-ului în mediul extracelular.

Cunoașterea actuală a elucidat cea mai mare parte a modului în care canalul ASIC1a se modulează ca urmare a modificării acidității mediului extracelular, deși rămâne o întrebare legată de starea deschisă a canalului a cărui structură a fost determinată prin cristalografie cu raze X în complex cu diferiți liganzi, și anume: mecanismul de deschidere nativ, modulat de pH este identic cu mecanismul de deschidere cu liganzi?

Dincolo de această întrebare, mecanismul de tranziție între stări este în mare parte înțeles. În schimb mecanismul modulării activității canalului de către ionii divalenți, în special de către Ca2+ prezintă încă multe aspecte de elucidat.

Plecând de la experimentele combinate de mutageneză și electrofiziologie ale lui Paukert și colaboratorii (2004, 2008), ale căror rezultate par cele mai promițătoare din lieteratura de specialitate referitoare la modularea activității canalelor ASIC1a de către Ca2+, lucarea de față își propune următoarele :

Scop: elucidarea înțelegerii, cu ajutorul metodelor computaționale, a mecanismelor la nivel molecular al interacțiunii ASIC – Ca2+ și elucidarea dependenței de Ca2+ a tranziției între stări a canalului ASIC1a cauzat de modificarea pH-ului extracelular.

Subsecvente scopului, această lucare își propune următoarele obiective:

• Dezvoltarea unui model computațional pentru experimentul lui Paukert și colaboratorii, 2008

• Pe baza modelului descris mai sus, să compare și să identifice diferențele între structurile native și mutante, precum și corelația dintre aceste diferențe și rezultatele experimentale obținute de Paukert și colaboratorii, 2008

• Prin metode computaționale să identifice factorii posibili ai dependenței activității canalului de concentrația de Ca2+ și să elucideze mecanismul acesteia.

IV. Metodologia utilizată

Alegerea modelului proteinei:

Modelul computațional al proteinei de bază folosită în toată lucarea este structura ASIC1a, prelevat de la găină, determinat în structură 3D prin metoda cristalografiei cu raze X. Structura este codificată în Protein Data Bank (Berman și colab., 2000) RCSB-PDB sub codul 2QTS și a fost descoperită și modelată de Jasti și colaboratorii în 2007. Această structură derivă dintr-un canal nefuncțional, principalul motiv pentru care am ales această structură este rezoluția de 1,9 Å – aceasta fiind cea mai bună rezoluție dintre toate structurile ASIC1a determinate în formă 3D.

Prepararea proteinei

Proteina a fost echilibrată pentru 100 ns într-un mediu apropiat mediului nativ, fiziologic compus din mebrana bi-strat DPPC (dipalmitoilfosfatidilcolinei) de dimensiune 200 x 200 Å și dintr-o cutie de solvatare (Vasile și colab., 2013). În acest studiu din simularea sistemului prezentat mai sus am selectat lipidele, apa și ionii aflați la o distanță de maxim 10 Å rezultând o simulare de sistem având:

A. Proteină având 19845 atomi, 1255 aminoacizi împărțiți în 3 lanțuri a,b si c :

Lanțul a= 417 aminoacizi de la LEU42 la GLU458, îngropat în membrană de la LEU42 la LEU71 și de la GLU426 la TYR457

Lanțul b= 420 aminoacizi de la LEU42 la LYS461, îngropat în membrană de la LEU42 la LEU71 și de la GLU426 la TYR457

Lanțul c= 418 aminoacizi de la LEU40 la TYR 457, îngropat în membrană de la LEU40 la LEU71 și de la GLU426 la TYR457

Membrana de tip DPPC având un număr de 94 molecule

Apa având 11.988 molecule

Sodiu -22 atomi

Clor – 57 atomi

Ionul de Ca2+ introdus în sistem în poziția moleculei de apă cea mai apropiată de aminoacidul ASP433

Construcția proteinelor cu mutații

Au fost dezvoltate următoarele proteine mutante:

2QTS_D433C- mutație simplă

2QTS_D433C_E426G – mutație dublă

2QTS_D433_E426G_D79N – mutație triplă

Efectuarea mutațiilor a fost făcută cu modulul Mutate al platformei program Biovia Discovery Studio 2016 (Dassault Systèmes BIOVIA, 2016).

Protonarea structurilor

Protonarea a fost făcută cu ajutorul programului Propka, pe baza calculării pK-aurilor; program al serverului PDB2PQR (Dolinsky și colab., 2004; Søndergaard și colab., 2011).

Au fost protonate 4 structuri 2QTS native și mutante:

-2QTS_WT

-2QTS_D433C- mutație simplă

-2QTS_D433C_E426G – mutație dublă

-2QTS_D433_E426G_D79N – mutație triplă.

Deoarece modelul 2QTS inițial nu avea atomii / ionii de H+ atribuiți proteinei – primul pas a fost să introducem atomii de hidrogen cu ajutorul Modulului Forcefield, cu parametrii CharmM.

Structurile au fost protonate la pHuri cuprinse între 7.2 și pH6.

Valorile pH au fost alese pentru a evidenția / simula comportamentul electrostatic la pH corespondente stărilor canalului:

• pH 7.2 – desensitizată / inactivă precedând începutul activării;

• pH 6 – deschisă / desensitizată ulterior deschiderii ;

• pentru WT și D433C_E426G : au fost făcute multiple protonări de la pH 6.9 la pH 6.6, cu un pas de descreștere de 0.1, pentru a înțelege influența Ca2+ în gradientul de pH 6.9 – 6.7 unde se evidențiază principala deosebire între cele două structuri (conform Paukert și colaboratorii, 2008).

Au fost făcute comparații intra- și inter- seturi protonate la diferite pH-uri.

Studii de dinamică moleculară

Modelarea moleculară a celor 4 seturi de structuri a fost executată cu modulul Standard Dinamic Cascade a platformei program Biovia Discovery Studio 2016 (Dassault Systèmes, 2016), care folosește modulele de calcul CharmM și NAMD. Modulul efectuează următoarele etape :

Minimizare 1: primul folosind algoritmul Steepest Descend (procedură iterativă care ajustează coordonatele în direcția negativă a gradientului, la fiecare pas al iterației) având parametrii :

Max Steps 1000 și

Gradient RMS 1.0 (toleranța aplicată gradientului mediu pe durata unjui ciclu de minimizare);

Minimizare 2: a doua etapă, aplicată pentru rafinare, se bazează pe algoritmul Adopted Basis NR (aplică un algoritm Newton-Raphson subspațiului vectorului de coordonate în funcție de coordonatele deplasării la ultima poziție) cu:

Max Steps 2000 și

Gradient RMS 0.1.

Heating cu parametrii:

Simulation Time – 4ps,

Times step – 2fs cu

Initial Temperature 50K și

Target Temperature 300 K;

Rezultatele au fost salvate la 2ps.

Echilibrare cu parametrii :

Simulation Time 10 ps,

Time Step 2fs,

Target temperature 300 K,

cu salvare rezultate la 2 ps.

Producția – realizată în modulul NAMD, de 5ns executată:

în condiții NPT (Time Steps 20fs)

Temperatura de 300 K cu o TMass 1000 (metoda temperaturii constante Hoover, operat cu Langevin Dynamics);

distanțele NonBonded 14 (Pairlist) și 12 (Cutoff);

presiune constantă cu un piston Langevin de 1000 la o presiune de referință de 1atm.

Au fost aplicate constrângeri cu ajutorul algoritmului SHAKE, folosindu-se metoda de integrare Leapfrog Verlet.

Superimpozarea proteinelor și analiza traiectoriei:

Au fost folosite modulele Analyze Trajectory și suprapuse cu Superimpose Protein.

Energiile de interacție între Ca și fiecare sistem, pentru fiecare structură:

Modulul Interaction Energy, calculează energia de interacție ca o sumă de energii van der Waals și energii electrostatice, folosind calculul Charmm.

Distribuția potențialului electrostatic;

Pe suprafața proteinelor a fost făcută cu modulul Total Grid Energy al platformei Discovery Biovia Studio.

Potențialul electrostatic al fiecărui aminoacid a fost calculat cu modulul Mean Electrostatical Energy . Acest protocol calculează potențialul electrostatic al unui sistem molecular prin rularea Delphi, un program care rezolvă ecuația Poisson-Boltzmann pe o rețea cubică utilizând metoda diferentială finită.

Potențialele medii (adică valorile potențialului electrostatic medii pe atomii fiecărui reziduu în unităti kt / e) ale fiecărui aminoacid au fost calculate cu modulul Mean Electrostatical Energy. Mean potențialul exprimă contribuția electrostatică a fiecărui aminoacid la energia totală potențială electrostatică a proteinei în condiții date (calculată statistic, pe baza teoriei electromecanicii cuantice).

V. Rezultate

Model general 2QTS

Sistemul de bază obținut ( proteină, lipide, apă, ioni) conform paragrafului “Prepararea proteinei” din secțiunea ‘Metodologie”

Figura 21. Sistem 2QTS_minimizat 100 ns; albastru – proteina; gri – membrana lipidică; roșu – apă și ioni

2QTS_WT _pH 7.2

Tabel 5. Aminoacizi protonați la 2QTS_WT pH 7.2

Figura 22. Aminoacizii protonați la 2QTS_WT_pH 7.2

Figura 23. Poziție inițială și finală ASP433 și poziția inițială și finală a Ca2+

Figura 24. Distanțe Ca2+ față de aminoacizii D433 ai fiecărui lanț în timpul simulării de dinamică moleculară : a – distanța Ca-ASP433(A); b – distanța Ca-ASP433(B); c– distanța Ca-ASP433(C)

a mediu – 2,53 Å

b mediu – 2,93 Å

c mediu – 6,67 Å

Se distinge o apropiere a Ca2+ de ASP433 din lanțul B pentru o perioadă de timp cuprinsă între ~2900 ps și ~3700 ps la o valoare medie de 2,4 Å, datorită unei răsuciri a ASP433(B), vezi figura 24. În figura 23 se observă că aminoacizii de interes au o deplasare de cca 2 Å față de poziția inițială.

Figura 25. Grafic interacție Ca2+-proteină pentru 250 de conformații rezultate în urma SDM 5ns

EI medie = -465,86 kcal/mol

Se observă că energia de interacție este mai mică decât Energia Gibson a Ca2+ (~ -397 Kcal/mol) ceea ce indică o atracție mare între Ca2+ și proteină – în linie cu rezultatele cunoscute din literatura de specialitate.

EI maximă = -335,69 kcal/mol,

Deși energia maximă crește peste -350 kcal/mol, energia de interacție se păstrează sub -400 Kcal/ mol în cea mai mare parte din simulare (peste 90%).

Acest lucru indică o interacție puternică între Ca2+ și proteină.

EI minimă = -542,82 kcal/mol

Figura 26. Grafic interacție Ca2+-sistem pentru 250 de conformații rezultate în urma SDM 5ns

EI medie = -656,46 kcal/mol

EI maximă = -509,81 kcal/mol

EI minimă = -821,11 kcal/mol

Se observă că față de interacția Ca2+ proteina 2QTS_WT_pH 7.2, Energia de interacție are o dezvoltare cu turbulențe mai mici, păstrând un model de trend cvasi-constant.

Figura 27. Grafic interacție Ca2+-apă pentru 250 de conformații rezultate în urma SDM 5ns

EI medie = -212,94 kcal/mol

EI maximă = -144,99 kcal/mol

EI minimă = -266,11 kcal/mol

Se observă că față de interacția Ca2+ proteina 2QTS_WT_ pH 7.2, Energia de interacție are o dezvoltare cu turbulențe mai mici, păstrând un model de trend. Valorile interacției Ca2+ cu apa sunt mari cu un minim de 266,49 kcal/mol, indicând o interacție scăzută cu apa, practic Ca2+ interacționează puternic cu proteina și scăzut cu sistemul și apa.

Distribuția pe suprafața proteinei a energiei electrostatice potențiale a proteinei 2QTS_WT la pH 7.2

Tabel 6: Potențialele electrostatice medii ale aminoacizilor aflați la o distanță mai mică de 4 Å de ASP433.

În jurul ASP433, într-o rază de 4 Å se află 34 de aminoacizi, toți cu potențial electrostatic slab negativ, cu excepția ASP433 pe toate lanțurile – cu un potențial puternic electronegativ pe lanțul C egal cu -56 kt.

Această electronegativiate generală se observă și în Figura 28, în zona porului – în fenestrația laterală.

Figura 28. Distribuția la suparafața expusă solventului a energiei electrostatice potențiale totale, în zona fenestrației laterale – por, la pH 7.2

2QTS_WT la pH 6.8

Rezultate protonării :

Tabelul 7. 2QTS_WT_ – aminoacizi protonați la pH 6.8

În comparație cu pH 7.2 s-au protonat adițional 8 aminoacizi – 4 reziduuri HIS și 4 GLU.

Vom dezvolta ulterior importanța HIS 74 și GLU 451.

Figura 29. Distanțe Ca2+ față de aminoacizii D433 ai fiecărui lanț în timpul simulării de dinamică moleculară : a – distanța Ca-ASP433(A); b – distanța Ca-ASP433(B); c– distanța Ca-ASP433(C)

a mediu – 2,44 Å

b mediu – 2,49 Å

c mediu – 6,56 Å

La pH 6.8, Ca2+ se situează aproape de lanțurile A (2,44 Å ± 0,3 Å, distanță care scade încă de la început- de la 4,98 Å-20ps la 2,67 Å-40ps) și B (2.49 ± 0,38 Å), și având o distanță mare față de lanțul C (6,56 Å ± 0,96 Å). Se observă că față de de pH 7.2 evoluția distanțelor este mai constantă, iar Ca2+ are o apropiere vizibilă de lanțul B.

Figura 30. Grafic interacție Ca2+-proteină pentru 250 de conformații rezultate în urma SDM 5ns

EI medie = -382,87 kcal/mol

EI maximă = -286,58 kcal/mol,

EI minimă = -461,73 kcal/mol

Se observă că energia medie de interacție a crescut față de cea de la pH 7.2 și este mai mare decât Energia Gibson a Ca2+ (~ -397 Kcal/mol) ceea ce indică o atracție mică între Ca2+ și proteină. În același timp, există multe conformații care au energia de interacție mai mică decât -400 Kcal/mol. Aceste două aspecte sunt consistente cu faptul că la pH 6.8 Ca2+ încă blochează deschiderea canalului ( interacțiunea cu proteina este încă puternică) dar interacția este din ce în ce mai slabă odată cu scăderea valorilor pH-ului. În același timp, energia de interacție prezintă ,turbulențe’ de la conformație la conformație, indicând o inconstanță în influența pe care Ca2+ o are asupra proteinei la pH 6.8 – încă o dată datele sunt în corelație cu caracteristicile fiziologice cunoscute în literatura de specialitate.

Figura 31. Grafic interacție Ca2+-sistem pentru 250 de conformații rezultate în urma SDM 5ns

EI medie = -631,27 kcal/mol

EI maximă = -513,35 kcal/mol

EI minimă = -767,94 kcal/mol

Se observă că față de interacția Ca2+ sistem 2QTS_WT la pH 7.2, energia de interacție are valori mai mari (energia de interacție mai slabă) și o dezvoltare cu turbulențe mai mare și nu mai păstrează un model de trend cvasi-constant.

Acest aspect este consistent cu rezultatele obținute la pH 6.8 la interacția Ca2+ cu proteina și Ca 2+ cu apa, evoluția fiind următoarea în comparație cu pH 7.2 :

Interacție Ca2+-proteina pH 7.2 >Interacție Ca2+- proteina pH 6.8

Interacție Ca2+-sistem pH 7.2>Interacție Ca2+- sistem pH 6.8

Interacție Ca2+-apa pH 7.2<Interacție Ca2+- apa pH 6.8

Figura 32: Grafic interacție Ca2+-apă pentru 250 de conformații rezultate în urma SDM 5ns

EI medie = -271,81 kcal/mol

EI maximă = -204,63 kcal/mol

EI minimă = -353,31 kcal/mol

Acest aspect este consistent cu rezultatele obținute la pH 6.8 la interacția Ca2+ cu proteina și Ca2+ cu apa, evoluția fiind următoarea în comparație cu pH 7.2 :

Interacție Ca2+- proteina pH 7.2 >Interacție Ca2+- proteina pH 6.8

Interacție Ca2+- sistem pH 7.2>Interacție Ca2+- sistem pH 6.8

Interacție Ca2+- apa pH 7.2<Interacție Ca2+- apa pH 6.8

Distribuția pe suprafața proteinei a energiei electrostatice potențiale a proteinei 2QTS_WT la pH 6.8

Tabelul 8. Potențialele electrostatice medii ale aminoacizilor aflați la o distanță mai mică de 4 Å de ASP433.

În jurul ASP433, într-o rază de 4 Å se află 34 de aminoacizi, aproape toți cu potențial electrostatic slab negativ, cu excepția ASP433 pe toate lanțurile – cu un potențial puternic electronegativ pe lanțul C egal cu -56 kt. Diferența față de rezultatele obținute la pH 7.2 constă în apariția a 5 reziduuri LEU care sunt slab electropozitivi.

Această modificare este vizibilă și în Figura 33 se observă și în Figura 28, în zona porului – în fenestrația laterală.

Figura 33. Distribuția la suprafața expusă solventului a energiei electrostatice potențiale totale, în zona fenestrației laterale – por, la pH 6.8

În Figura 33 se observă apariția unor zone electropozitive în fenestrația laterală / por

2QTS_WT la pH 6.0

Protonarea proteinei la pH 6:

Tabelul 9. 2QTS_WT_ – aminoacizi protonați la pH 6

La pH 6, 2QTS_WT are 37 de aminoacizi protonați.

Față de pH 6.8 se protonează încă 8 aminoacizi, 2 HIS, 1 ASP și 5 GLU.

Figura 34. Distanțe Ca2+ față de aminoacizii D433 ai fiecărui lanț în timpul simulării de dinamică moleculară: a – distanța Ca-ASP433(A); b – distanța Ca-ASP433(B); c– distanța Ca-ASP433(C)

a mediu – 2,72 Å

b mediu – 2,90 Å

c mediu – 4.08 Å

La pH 6, distanța dintre Ca2+ și aminoacizii ASP433 arată o inconstanță pronunțată de la o conformație la alta.

Practic Ca2+ oscilează cu amplitudini mari față de proteină, ceea ce este în concordanță cu electrofiziologia canalului la pH 6.0.

Figura 35. Grafic interacție Ca2+-proteină pentru 250 de conformații rezultate în urma SDM 5ns

EI medie = -213,04 kcal/mol

EI maximă = -13,11 kcal/mol

EI minimă = -946,83 kcal/mol

Se observă că față de interacția Ca2+ proteina 2QTS_WT la pH 7.2 și 6.8, energia de interacție are valori mult mai mari (energia de interacție mult mai slabă) și o dezvoltare cu turbulențe mai mare- oscilatorie cu amplitudini mari.

Acest aspect indică faptul că la pH 6, Ca2+ în funcție de momentul oscilației, în anumite momente interacționează puternic cu proteina – ceea ce este în concordanță cu electrofiziologia canalului la pH 6.0 (canalul se deschide, dar în prezența Ca2+, curenții au o amplitudine cu până la 60% mai mică).

Figura 36. Grafic interacție Ca2+-sistem pentru 250 de conformații rezultate în urma SDM 5ns

EI medie = -213,04 kcal/mol

EI maximă = -13,11 kcal/mol

EI minimă = -946,83 kcal/mol

Se observă că față de interacția Ca2+ sistem 2QTS_WT pH 7.2 și 6.8, energia de interacție are valori mult mai mari (energia de interacție mult mai slabă) și o dezvoltare cu turbulențe mai mare- oscilatorie cu amplitudini mari

Interacție Ca2+-proteina pH 7.2 >Interacție Ca2+-proteina pH 6.8>pH 6.0

Interacție Ca2+-sistem pH 7.2>Interacție Ca2+-sistem pH 6.8>pH 6.0

Interacție Ca2+-apa pH 7.2<Interacție Ca2+-apa pH 6.8>6.0

Figura 37. Grafic interacție Ca2+-apă pentru 250 de conformații rezultate în urma SDM 5ns

EI medie = -387,5 kcal/mol

EI maximă = –3,80 kcal/mol

EI minimă = -1844,73 kcal/mol

Se observă că față de interacția Ca2+ sistem 2QTS_WT pH 7.2 și 6.8, energia de interacție are valori mult mai mari ( energia de interacție mult mai slabă) și o dezvoltare cu turbulențe mai mare- oscilatorie cu amplitudini mari.

Interacție Ca2+-proteina pH 7.2 >Interacție Ca2+-proteina pH 6.8>pH 6.0

Interacție Ca2+-sistem pH 7.2>Interacție Ca2+-sistem pH 6.8>pH 6.0

Interacție Ca2+-apa pH 7.2<Interacție Ca2+-apa pH 6.8>6.0

Distribuția pe suprafața proteinei a energiei electrostatice potențiale a proteinei 2QTS_WT la pH 6.

Tabelul 10. Potențialele electrostatice medii ale aminoacizilor aflați la o distanță mai mică de 4 Å de ASP433.

În jurul ASP433, într-o rază de 4 Å se află 33 de aminoacizi, 21 cu potențial electrostatic slab negativ, cu excepția ASP433 pe toate lanțurile – cu un potențial puternic electronegativ pe lanțul C egal cu -61,58 kt.

În schimb apar 10 aminoacizi pozitivi, din care ARG 65 de pe lanțul C , puternic electropozitivă 31,84 KT și se află o distanță de mai puțin de 2 Å de ASP 433.

Această modificare este vizibilă și în Figura 38, în zona porului – în fenestrația laterală.

Figura 38. Distribuția la suprafața expusă solventului a energiei electrostatice potențiale totale, în zona fenestrației laterale – por, la pH 6.6

În figura 38 se observă că zona de interes în jurul aminoacizilor ASP433 devine o zonă pronunțat electropozitivă, schimbând practic electropozitivitatea în zona fenestrației laterale din por.

2QTS_D433C_E426G_pH 7.2

Protonarea aminoacizilor:

Tabel 11. 2QTS_ D433C_E426G _ – aminoacizi protonați la pH 7,2

La pH 7.2, la mutația dublă 2QTS_D433C_E426G -aminoacizi protonați sunt în număr de 21 și sunt identici cu aminoacizii protonați la proteină nativă, WT.

Figura 39. Distanțe Ca2+ față de aminoacizii D433 ai fiecărui lanț în timpul simulării de dinamică moleculară : a – distanța Ca-ASP433(A); b – distanța Ca-ASP433(B); c– distanța Ca-ASP433(C)

a mediu – 7,74 Å

b mediu – 5,90 Å

c mediu – 9,86 Å

Deși distanțele Ca2+ față de aminoacizii ASP433 au un trend cvasi-constant, acestea sunt mai mari decât la proteina fără mutații și dezvoltarea are o evoluție oscilatorie, tip dinți de fierăstrău.

Rezultatele sunt în concordanță cu rezultatele electrofiziologice obținute de Paukert și colaboratorii, 2008.

Figura 40. Grafic interacție Ca2+-proteină pentru 250 de conformații rezultate în urma SDM 5ns

EI medie = -108,10 kcal/mol

EI maximă = -21,71 kcal/mol

EI minimă = -215,51 kcal/mol

Se observă că față de interacția Ca2+-proteina 2QTS_WT_pH7.2, la 2QTS_D433C_E426G energia de interacție are valori mult mai mari (energia de interacție mult mai slabă) și o dezvoltare cu turbulențe mare- oscilatorie cu amplitudini mari.

Acest aspect indică faptul că încă de la pH 7.2, proteina 2QTS_D433C_E426G are o interacție slabă cu Ca2+, rezultate în acord cu Paukert și colaboratorii, 2018.

Figura 41. Grafic interacție Ca2+-sistem pentru 250 de conformații rezultate în urma SDM 5ns

EI medie = -550,74 kcal/mol

EI maximă = -387,58 kcal/mol

EI minimă = -703,24 kcal/mol

Se observă că față de interacția Ca2+-sistemul 2QTS_WT_pH 7.2 , la 2QTS_D433C_E426G energia de interacție are valori mai mari ( energia de interacție mult mai slabă) și o dezvoltare cu turbulențe mare- oscilatorie cu amplitudini mari.

Acest aspect indică faptul că încă de la pH 7.2, întregul sistem 2QTS_D433C_E426G are o interacție mai slabă cu Ca2+, rezultate în acord cu Paukert și colaboratorii, 2018.

Figura 42: Grafic interacție Ca2+-apă pentru 250 de conformații rezultate în urma SDM 5ns

EI medie = -501,95 kcal/mol

EI maximă = -249,14 kcal/mol

EI minimă = -590,52 kcal/mol

Se observă că față de interacția Ca2+- apa 2QTS_WT pH 7.2 , la 2QTS_D433C_E426G energia de interacție are valori mai mici ( energia de interacție mult mai puternică) și o dezvoltare cu turbulențe mici- cu trend cvasi-constant

Acest aspect indică faptul că încă de la pH 7.2, întregul sistem 2QTS_D433C_E426G are o interacție mai slabă cu Ca2+, acesta interacționând prioritar cu apa.

Distribuția pe suprafața proteinei a energiei electrostatice potențiale a proteinei 2QTS_ D392C_E385G_Ca_pH7.2

Tabelul 12. Potențialele electrostatice medii ale aminoacizilor aflați la o distanță mai mică de 4 Å de ASP433.

În jurul ASP433, într-o rază de 4 Å se află 33 de aminoacizi toți cu potențial electrostatic electropozitiv, cu cele mai mari valori pentru ARG 65 pe lanțul C (36,56 KT) și TYR423 pe lanțul B. Diferența față de rezultatele obținute la pH 7.2 dintre mutația dublă și WT este de electronegativitate / pozitivitate între toți aminoacizii aflați la mai puțin de 4 Å de reziduul 433 ASP / CYS Această modificare este vizibilă și în Figura 43 .

Figura 43. Distribuția la suprafața expusă solventului a energiei electrostatice potențiale totale, în zona fenestrației laterale – por, la 2QTS_D433C_E426G pH 7.2

Se remarcă faptul că în zona porului, distribuția electrostatică a potențială este predominant electropozitivă, în opoziție cu distribuția întâlnită la proteina nativă la pH 7.2

2QTS_D433C_E426G _ pH 6.8

Protonarea aminoacizilor

Tabelul 13. Aminoacizi protonați la proteina 2QTS_D433C_E426G, pH 6.8

La pH 6.8, la mutația dublă 2QTS_D433C_E426G -aminoacizi protonați sunt în număr de 29 și sunt identici cu aminoacizii protonați la proteină nativă, WT la același pH.

Figura 44. Distanțe Ca2+ față de aminoacizii D433 ai fiecărui lanț în timpul simulării de dinamică moleculară : a – distanța Ca-ASP433(A); b – distanța Ca-ASP433(B); c– distanța Ca-ASP433(C)

a mediu – 5,77 Å

b mediu – 8,93 Å

c mediu – 10,31 Å

În comparație atât cu 2QTS_D433C_E426G la 7.2, cât și cu 2QTS_WT pH la 6.8, distanțele dintre Ca 2+ și proteina mutantă la pH6.8 sunt mult mai mari și sugerează o interacție slabă între proteină și Ca 2+

Rezultatele sunt în concordanță cu rezultatele electrofiziologice obținute de Paukert și colaboratorii, 2008.

Figura 45. Grafic interacție Ca2+-proteină pentru 250 de conformații rezultate în urma SDM 5ns

EI medie = -96,11 kcal/mol

EI maximă = 15,15 kcal/mol

EI minimă = -177,67 kcal/mol

Se observă că față de interacția Ca2+-proteina 2QTS_WT_pH 7.2, 6.8 și 6, la 2QTS_D433C_E426G energia de interacție are valori mult mai mari (energia de interacție mult mai slabă) și o dezvoltare cu turbulențe mare- oscilatorie cu amplitudini mari.

Acest aspect indică faptul că încă de la pH 6.8, proteina 2QTS_D433C_E426G are o interacție foarte slabă cu Ca2+, rezultate în acord cu Paukert și colaboratorii, 2018.

Figura 46. Grafic interacție Ca2+- sistem pentru 250 de conformații rezultate în urma SDM 5ns

EI medie = -532,16 kcal/mol

EI maximă = -372,20 kcal/mol

EI minimă = -650,93 kcal/mol

Se observă că față de interacția Ca2+ -sistemul 2QTS_WT_pH 7.2,6.8 și 6, la 2QTS_D433C_E426G energia de interacție are valori mult mai mari mai mari ( energia de interacție mult mai slabă) și o dezvoltare fără turbulențe mari, ceea ce indică o interacție slabă, neutră cu Ca2+.

Figura 47. Grafic interacție Ca2+-apă pentru 250 de conformații rezultate în urma SDM 5ns

EI medie = -470,03 kcal/mol

EI maximă = -363,07 kcal/mol

EI minimă = -557,42 kcal/mol

Se observă că față de interacția Ca2+ apa 2QTS_WT_pH 7.2, 6.8 și 6.0 , la 2QTS_D433C_E426G energia de interacție are valori mai mici (energia de interacție mult mai puternică) și o dezvoltare cu turbulențe mici- cu trend cvasi-constant .

Acest aspect indică faptul că la pH 6.8, întregul sistem 2QTS_D433C_E426G are o interacție slabă cu Ca2+, acesta interacționând prioritar cu apa.

Distribuția pe suprafața proteinei a energiei electrostatice potențiale a proteinei 2QTS_ D392C_E385G_Ca_pH 6.8

Tabelul 14. Potențialele electrostatice medii ale aminoacizilor aflați la o distanță mai mică de 4 Å de ASP433.

În jurul ASP433, într-o rază de 4 Å se află 33 de aminoacizi toți cu potențial electrostatic electropozitiv, cu cele mai mari valori pentru ARG 65 pe lanțurile A și B (69,46 KT).

Diferența față de rezultatele obținute la pH 6.8 dintre mutația dublă și WT este de electronegativitate / pozitivitate între toți aminoacizii aflați la mai puțin de 4 Å de reziduul 433 ASP / CYS. Această modificare este vizibilă și în Figura 48, în zona porului – în fenestrația laterală.

Figura 48. Distribuția la suprafața expusă solventului a energiei electrostatice potențiale totale, în zona fenestrației laterale – por, la 2QTS_D433C_E426G_pH 6.8

Se remarcă faptul că în zona porului, distribuția electrostatică potențială este predominant electropozitivă, în opoziție cu distribuția întâlnită la proteina nativă la pH 7.2.

2QTS_D433C_E426G_pH 6

Protonarea aminoacizilor

Tabelul 15. Aminoacizi protonați la proteina 2QTS_D433C_E426G, pH 6.

La pH 6, la mutația dublă 2QTS_D433C_E426G -aminoacizii protonați sunt în număr de 37 și sunt identici cu aminoacizii protonați la proteină nativă, WT la același pH.

În acest context al studiului, devine evident că diferențele de comportament electrofiziologic în prezența ionului de Ca2+ nu sunt cauzate de diferențe în protonarea diferită a anumitor aminoacizi.

Figura 49. Distanțe Ca2+ față de aminoacizii D433 ai fiecărui lanț în timpul simulării de dinamică moleculară: a – distanța Ca-ASP433(A); b – distanța Ca-ASP433(B); c– distanța Ca-ASP433(C)

a mediu – 4,49 Å

b mediu – 6,54 Å

c mediu – 6,59 Å

Se observă că la pH 6 distanțele Ca2+ față de aminoacidul ASP433 al mutației duble 2QTS_D433C_E426G urmează în continuare alt tipar față de distanțele regăsite în cazul proteinei native.

Astfel, Ca2+ este mult mai depărtat față de lanțul A, lanțul B și lanțul C, fără a arăta ‘rupturi’ de linie cum este în cazul proteinei native la pH 6, ceea ce denotă un tip de acțiune neutră a Ca2+ față de proteina mutantă 2QTS_D433C_E426G.

Figura 50. Grafic interacție Ca2+-proteină pentru 250 de conformații rezultate în urma SDM 5ns

EI medie = -67,55 kcal/mol

EI maximă = -0,10 kcal/mol

EI minimă = -289,99 kcal/mol

Se observă că energia de interacție între Ca2+ și proteină este foarte mică, având oscilații foarte mari. Astfel, energia maximă este aproape ‘0’. Iar energia minimă de interacție nu scade sub -290 Kcal/mol, ceea ce confirmă lipsa influenței Ca2+ asupra proteinei mutante. Aspectul oscilatoriu al interacției nu are relevanță, atât timp cât energia de interacție se păstrează la valori mari (energie de interacție mică).

Figura 51. Grafic interacție Ca2+-sistem pentru 250 de conformații rezultate în urma SDM 5ns

EI medie = -472,82 kcal/mol

EI maximă = -38,35kcal/mol

EI minimă = -980,46 kcal/mol

Se observă că energia de interacție medie a întregului sistem 2QTS_D433C_E426G cu ionul Ca2+ este mai mică decât energia de interacție medie a sistemului cu proteină nativă și prezintă o inconstanță ridicată de la configurație la configurație. Coroborând energia de interacție a proteinei 2QTS_D433C_E426G, sistemului și a apei cu Ca2+ cu energia minimă de interacție a sistemului cu Ca2+ putem concluziona că, în acest caz, ionul Ca2+ are interacție sporadică cu elemente ale sistemului diferite de proteină (în special cu apa).

Figura 52. Grafic interacție Ca2+-apă pentru 250 de conformații rezultate în urma SDM 5ns

EI medie = -446,32 kcal/mol

EI maximă = – 0,34 kcal/mol

EI minimă = -1986,15kcal/mol

Se observă din energia de interacție a apei din sistemul 2QTS_D433C_E426G că avem una dintre cele mai inconstante interacții întâlnite în acest studiu. Explicația pe care o dăm acestui rezultat este că Ca2+ în sistemul respectiv are o mișcare accentuată la o distanță de aminoacizii ASP433 care este înafara distanței normale de interacție, dar la limita ei.

Distribuția pe suprafața proteinei a energiei electrostatice potențiale a proteinei 2QTS_ D392C_E385G_Ca_pH 6.0

Tabelul 16. Potențialele electrostatice medii ale aminoacizilor aflați la o distanță mai mică de 4 Å de ASP433 dublă_pH6

Potențialele electrostatice medii ale aminoacizilor aflați la o distanță mai mică de 4 Å de ASP433.

În jurul ASP433, într-o rază de 4 Å se află 33 de aminoacizi toți cu potențial electrostatic electropozitiv, cu cele mai mari valori pentru ARG65 pe lanțul C(32,9kT).

Diferența față de rezultatele obținute la pH 6.8 dintre mutația dublă și WT este de electronegativitate / pozitivitate între toți aminoacizii aflați la mai puțin de 4 Å de reziduul 433 ASP / CYS. Această modificare este vizibilă, se observă și în Figura 53, în zona porului – în fenestrația laterală.

Figura 53. Distribuția la suprafața expusă solventului a energiei electrostatice potențiale totale, în interiorul fenestrației laterale – por, la 2QTS_D433C_E426G_pH 6

Se remarcă faptul că întreaga zonă este o zonă puternic electropozitivă, fără niciun aminoacid care să prezinte caracteristici electronegative.

2QTS_D433_E426G_D79N_ pH 7.2

Protonarea aminoacizilor

Tabelul 17. Aminoacizi protonați la proteina 2QTS_D433_E426G_D79N_pH 7.2

La pH 7.2 în proteina 2QTS_D433_E426G_D79N se protonează 21 de aminoacizi. Nu există nicio diferență de protonare între cele 4 structuri studiate: proteină nativă-2QTS_WT, proteină cu mutație simplă 2QTS_D433, proteină cu mutație dublă-2QTS_D433_E426G.

Figura 54. Distanțe Ca2+ față de aminoacizii D433 ai fiecărui lanț în timpul simulării de dinamică moleculară: a – distanța Ca-ASP433(A); b – distanța Ca-ASP433(B); c– distanța Ca-ASP433(C)

a mediu – 2,48 Å

b mediu – 6,49Å

c mediu – 7,97Å

Se observă că proteina cu mutație triplă 2QTS_D433_E426G_D79N la pH 7.2 păstrează un model de dezvoltare a distanțelor între conformații asemănător cu cel întâlnit la proteina cu mutație dublă 2QTS_D433_E426G și anume Ca2+ este mai apropiat de lanțul A față de care păstrează o distanță cu trend cvasi-constant și cu o oscilație mică între configurații.

Figura 55. Grafic interacție Ca2+-proteină pentru 250 de conformații rezultate în urma SDM 5ns

EI medie = -8,84 kcal/mol

EI maximă = 2,37 kcal/mol

EI minimă = -21,43 kcal/mol

Se observă energia de interacție la pH 7.2 între proteina 2QTS_D433_E426G_D79N și Ca2+ este extrem de mică, putem să o catalogăm ca oscilând aproape de valoarea nulă.

Figura 56. Grafic interacție Ca2+-sistem pentru 250 de conformații rezultate în urma SDM 5ns

EI medie = -583,89 kcal/mol

EI maximă = -3,69 kcal/mol

EI minimă = -1962,851kcal/mol

Se observă energia de interacție la pH 7.2 între sistem 2QTS_D433_E426G_D79N și Ca2+ are o dezvoltare între configurații dezordonată, cu valori inconstante și uneori aberante de la o conformație la alta.

Figura 57. Grafic interacție Ca2+-apă pentru 250 de conformații rezultate în urma SDM 5ns

EI medie = -647,68 kcal/mol

EI maximă = -564,73kcal/mol

EI minimă = -767,28kcal/mol

Se observă energia de interacție la pH 7.2 între apă 2QTS_D433_E426G_D79N și Ca2+ există un tip de interacție constantă cu valori care au un trend negativ și care sugerează că în cadrul sistemului interacțiunea principală a ionului Ca2+ este cu elementul apă din sistem.

Distribuția electrostatică potențială a proteinei – contribuția aminoacizilor.

Tabelul 18. Potențialele electrostatice medii ale aminoacizilor aflați la o distanță mai mică de 4 Å de ASP433

Se observă că la pH7.2, proteina cu mutație triplă 2QTS_D433C_E426G_D79N_pH 7.2 contribuția aminoacizilor aflați aflați la o distanță mai mică de 4 Å de ASP433 la potențialul electrostatic de suprafață total este electropozitivă pentru fiecare dintre ei. Se remarcă unele valori neobișnuit de mari: GLY388(Ași B) – 139,81 kt. Este posibil ca aceasta să fie explicația pentru care canalul este unul nefuncțional – în urma mutației triple, distribuția energiei electrostatice potențiale la suprafața expusă solventului a suferit modificări electropozitive semnificative care modifică flexibilitatea proteinei. Acest aspect este surprins și în Figura 58.

Figura 58. Distribuția la suprafața expusă solventului a energiei electrostatice potențiale totale, în zona aminoacizilor aflați la o distanță mai mică de 4 Å de ASP433, la 2QTS_D433C_E426G_D79N_pH 7.2 Se observă din figura de mai sus că întreaga zonă aflată în jurul aminoacidului ASP 433 (mutat cu CYS) este complet electropozitivă.

2QTS_D433_E426G_D79N_ pH 6.8

Protonarea aminoacizilor

Tabelul 19. Aminoacizi protonați la proteina 2QTS_D433_E426G_D79N_pH 6.8

La pH 6.8 în proteina 2QTS_D433_E426G_D79N se protonează 26 de aminoacizi. Se observă că față de restul structurilor studiate-proteina nativă-2QTS_WT, proteina cu mutație simplă 2QTS_D433, proteina cu mutație dublă-2QTS_D433_E426G există o diferență de protonare și anume: HIS 74 nu se protonează pe niciunul dintre lanțuri. Practic, este singura diferență găsită între cele 4 structuri.

Ținând cont că în urma mutației triple 2QTS_D433_E426G_D79N, s-a obținut un canal nefuncțional, putem presupune că nefuncționalitatea este cauzată de neprotonarea HIS 74 împreună cu / sau din cauza faptului că – potențialul electrostatic la suprafața proteinei este modificat major față de proteina nativă.

Figura 59. Distanțe Ca2+ față de aminoacizii D433 ai fiecărui lanț în timpul simulării de dinamică moleculară: a – distanța Ca-ASP433(A); b – distanța Ca-ASP433(B); c– distanța Ca-ASP433(C)

a mediu – 6,64 Å

b mediu – 7,54 Å

c mediu – 3,35 Å

Se observă că distanțele între Ca2+ și aminoacidul CYS433, la proteina cu mutație triplă 2QTS_D433_E426G_D79N la pH 6.8, sunt modificate semnificativ față de modelele întâlnite la restul structurilor studiate (inclusiv față de proteina triplă la pH 7.2). Astfel, Ca2_ este cel mai apropiat de lanțul C, față de care Ca2+ are cea mai mare distanță la celelalte structuri.

Figura 60. Grafic interacție Ca2+-proteină pentru 250 de conformații rezultate în urma SDM 5ns

EI medie = 18,75 kcal/mol

EI maximă = 42,33 kcal/mol

EI minimă = -9,51 kcal/mol

Se observă energia de interacție la pH 6.8 între proteina cu mutație triplă 2QTS_D433_E426G_D79N și Ca2+ există un tip de interacție cu valori preponderent pozitive, fiind doar câteva conformații care au o energie de interacție mai mică de valoarea ‘0’.

Acest fapt sugerează că proteina respinge Ca2+-ceea ce indică faptul că comportamentul proteinei triplu mutante este complet modificat față de proteina inițială.

Figura 61. Grafic interacție Ca2+-sistem pentru 250 de conformații rezultate în urma SDM 5ns

EI medie = -586,65 kcal/mol

EI maximă = -324,46 kcal/mol

EI minimă = -803,69 kcal/mol

Se observă energia de interacție la pH 6.8 între sistemul cu mutație triplă 2QTS_D433_E426G_D79N și Ca2+ există un tip de interacție cu valori în sfera rezultatelor obținute la toate celelalte structuri. În condițiile în care, interacția proteinei singure este total diferită, acest rezultat este surprinzător.

Figura 62. Grafic interacție Ca2+- apa pentru 250 de conformații rezultate în urma SDM 5ns

EI medie = -586,65 kcal/mol

EI maximă = -324,46 kcal/mol

EI minimă = -803,69 kcal/mol

Se observă energia de interacție cu apa la pH 6.8 între sistemul cu mutație triplă 2QTS_D433_E426G_D79N și Ca2+ există un tip de interacție cu valori în sfera rezultatelor obținute la toate celelalte structuri.

Distribuția pe suprafața proteinei a energiei electrostatice potențiale a proteinei 2QTS_ D392C_E385G_Ca_pH 6.8

Tabelul 20. Potențialele electrostatice medii ale aminoacizilor aflați la o distanță mai mică de 4 Å de ASP433.

Se observă că la pH 6.8, proteina cu mutație triplă 2QTS_D433C_E426G_D79N contribuția aminoacizilor aflați la o distanță mai mică de 4 Å de ASP433 la potențialul electrostatic de suprafață total este electropozitivă pentru fiecare dintre ei. Nu se mai remarcă valori neobișnuit de mari cum a fost în cazul proteinei cu mutație triplă la pH 7.2. În schimb, conformația proteinei s-a schimbat și un număr de 5 atomi au intrat / ieșit din sfera 4 Å .

Figura 63. Distribuția la suprafața expusă solventului a energiei electrostatice potențiale totale, în zona fenestrației laterale – por, la 2QTS_D433C_E426G_D79N_pH 6.8

Se observă in Figura 63 că zona electropozitivă se continuă și în zona vestibulului central, superior porului și care la structura WT este puternic electronegativ.

2QTS_D433_E426G_D79N_ pH 6

Protonarea la pH 6.0

Tabelul 21. Aminoacizi protonați la proteina 2QTS_D433_E426G_D79N_pH 6

La pH 6.0 în proteina 2QTS_D433_E426G_D79N se protonează 34 de aminoacizi. Se observă că față de restul structurilor studiate-proteina nativă-2QTS_WT, proteina cu mutație simplă 2QTS_D433, proteina cu mutație dublă-2QTS_D433_E426G există o diferență de protonare și anume: HIS 74 nu se protonează pe niciunul dintre lanțuri. Practic, este singura diferență găsită între cele 4 structuri.

Ținând cont că în urma mutației triple 2QTS_D433_E426G_D79N, s-a obținut un canal nefuncțional, putem presupune că nefuncționalitatea este cauzată de neprotonarea HIS 74 împreună cu / sau din cauza faptului că – potențialul electrostatic la suprafața proteinei este modificat major față de proteina nativă.

Figura 64. Distanțe Ca2+ față de aminoacizii D433 ai fiecărui lanț în timpul simulării de dinamică moleculară: a – distanța Ca-ASP433(A); b – distanța Ca-ASP433(B); c– distanța Ca-ASP433(C)

a mediu – 7,99 Å

b mediu – 7,90 Å

c mediu – 10,51Å

Se observă că distanțele între Ca2+ și aminoacidul CYS433, la proteina cu mutație triplă 2QTS_D433_E426G_D79N la pH 6.8 sunt total diferite față de restul structurilor studiate – ionul de Ca2+ fiind departe de aminoacizii de interes și cu o mișcare oscilatorie slabă și trend constant.

Figura 65. Grafic interacție Ca2+-proteină pentru 250 de conformații rezultate în urma SDM 5ns

EI medie = -18,46 kcal/mol

EI maximă = 0,02 kcal/mol

EI minimă = -66,97 kcal/mol

Se observă energia de interacție la pH 7.2 între proteina 2QTS_D433_E426G_D79N și Ca2+ este extrem de mică, putem să o catalogăm ca oscilând aproape de valoarea nulă.

Figura 66. Grafic interacție Ca2+-sistem pentru 250 de conformații rezultate în urma SDM 5ns

EI medie = -566,08 kcal/mol

EI maximă = -8,63kcal/mol

EI minimă = -1136,53kcal/mol

Se observă energia de interacție la pH 6 între sistem 2QTS_D433_E426G_D79N și Ca2+ are o dezvoltare între configurații dezordonată, cu valori inconstante și uneori aberante de la o conformație la alta.

Figura 67. Grafic interacție Ca2+-apă pentru 250 de conformații rezultate în urma SDM 5ns

EI medie = -573,11kcal/mol

EI maximă = -0,21 kcal/mol

EI minimă = 2070,84 kcal/mol

Se observă energia de interacție la pH 6 între apa sistemului 2QTS_D433_E426G_D79N și Ca2+ are o dezvoltare între configurații dezordonată, cu valori inconstante și uneori aberante de la o conformație la alta.

Distribuția pe suprafața proteinei a energiei electrostatice potențiale a proteinei 2QTS_ D392C_E385G_Ca_pH 6.0

Tabelul 22. Potențialele electrostatice medii ale aminoacizilor aflați la o distanță mai mică de 4 Å de ASP433.

Se observă că la pH 6.6, proteina cu mutație triplă 2QTS_D433C_E426G_D79N contribuția aminoacizilor aflați la o distanță mai mică de 4 Å de ASP433 la potențialul electrostatic de suprafață total este electropozitivă pentru fiecare dintre ei. Nu se mai remarcă valori neobișnuit de mari cum a fost în cazul proteinei cu mutație triplă la pH 7.2.

Figura 68. Distribuția la suprafața expusă solventului a energiei electrostatice potențiale totale, în zona aminoacizilor aflați la mai puțin de 4 A de CYS433, la 2QTS_D433C_E426G_D79N la pH 6

VI. Discuții și Concluzii

Experimentul combinat de fiziologie și mutageneză al lui Paukert și colaboratorii, 2008, reușește să identifice pentru prima oară aminoacizi care au un rol în dependența canalului ASIC1a și anume: aminoacizii ASP433 și GLU426. Astfel, mutația dublă 2QTS_D433C_E426G elimină dependența de Ca2+ a canalului (Figura 19). Mai mult, mutația triplă 2QTS_D433C_E426G_D79N duce la obținerea unui canal nefuncțional.

Ca rezultat direct, putem considera că D433,E426 sunt aminoacizii importanți în mecanismul dependenței de Ca2+. Faptul că, prin mutație triplă se obține un canal nefuncțional, duce la concluzia că cei trei aminoacizi D433C, E426G, D79N sunt de asemenea importanți pentru tranziția între stări a canalului.

(Paukert și colaboratorii, 2008)

Fig.19(reluare) A. Amplitudinea curenților în funcție de concentrația de Ca2+, la pH 5.5 pentru ASIC1a WT și mutanții: E426GD433C, D433C,E426G și Q437N

B. Amplitudinea curenților canalului ASIC1a în funcție concentrația de Ca2+ pentru varianta mutantă E426GD433C

Discuții asupra rezultatelor obținute prin prisma obiectivelor:

Obiectivul a. Dezvoltarea unui model computațional pentru experimentul lui Paukert și colaboratorii, 2008

Pentru a verifica dacă modelul computațional dezvoltat corespunde experimentului Paukert și colaboratorii, 2008, am calculat energiile de interacție dintre Ca și proteinele construite de noi și am analizat corespondența rezultatelor noastre cu rezultatele obținute experimental. Considerăm că modelul construit de noi este un model viabil, în concordanță cu experimentele.

Astfel:

Figura 69: Energia de interacție calculată pentru fiecare configurație salvată în timpul simulării de dinamică moleculară la pH 7.2 pentru proteinele construite computațional 2QTS_WT, 2QTS_D392C_E385G și 2QTS_D392C_E385G_D38N

Interpretarea rezultatelor obținute de noi la pH 7.2- energia de interacție pentru cele 3 structuri este în concordanță cu experimentele electrofiziologice cunoscute și anume:

-2QTS_WT are cea mai mică valoare a energiei de interacție cu Ca2+, cu o valoare medie de -465,86 kcal/mol, arătând o interacție mare între Ca2+ și proteină

-2QTS_D392C_E385G, valoarea energiei de interacție mare – interacție scăzută

-2QTS_D392C_E385G_D38N, cu valoarea energiei de interacție aproape ‘0’ – interpretăm acest rezultat ca fiind cauzat de ‘nefuncționalitatea’canalului

Figura 70: Energia de interacție calculată pentru fiecare configurație salvată în timpul simulării de dinamică moleculară la pH 6.8 pentru proteinele construite computațional 2QTS_WT, 2QTS_D392C_E385G și 2QTS_D392C_E385G_D38N

Interpretarea rezultatelor obținute de noi la pH 6.8- energia de interacție pentru cele 3 structuri este în concordanță cu experimentele electrofiziologice cunoscute și anume:

-2QTS_WT are o valoare a energiei de interacție mai mare (o interacție mai scăzută) în jurul valorii de -382,88 kcal/mol – mai mare decât Energia Gibbs a Ca2+ (-397,5 Kcal/mol) – ceea ce considerăm ca precede starea de tranziție către deschiderea canalului

-2QTS_D392C_E385G, valoarea energiei de interacție mare – interacție scăzută

-2QTS_D392C_E385G_D38N, cu valoarea energiei de interacție foarte scăzută, un rezultat pe care îl considerăm aberant – aberație pe care o interpretăm ca fiind datorată ‘modelului nefuncțional’ al canalului cu mutație triplă. Rămâne întrebarea: De ce interacția cu Ca2+ este atât de puternică?

Figura 71: Energia de interacție calculată pentru fiecare configurație salvată în timpul simulării de dinamică moleculară la pH 6.8 pentru proteinele construite computațional 2QTS_WT, 2QTS_D392C_E385G și 2QTS_D392C_E385G_D38N

Interpretarea rezultatelor obținute de noi la pH 6.6- energia de interacție pentru cele 3 structuri este în concordanță cu experimentele electrofiziologice cunoscute și anume:

-2QTS_WT are o valoare a energiei de interacție mai mare (o interacție mai scăzută) în jurul valorii de -213,04 kcal/mol – mult mai mare decât Energia Gibbs a Ca2+ (-397,5 Kcal/mol) – ceea ce arată că influența Ca2+ este în cele mai multe cazuri scăzută. Oscilația mare o interpretăm ca fiind cauzată de o flexibilitate ridicată a interacției Ca2+ cu proteina nativă – ceea ce explică rezultatele obținute experimental: amplitudinea curenților este scăzută cu până la 60% în prezența Ca2+ la concentrații mari.

2QTS_D392C_E385G, valoarea energiei de interacție mare – interacție scăzută, cu oscilații mari – cauzate probabil de flexibilitatea ridicată a proteinei în mediul puternic acid.

-2QTS_D392C_E385G_D38N, cu valoarea energiei de interacție aproape ‘0’ – interpretăm acest rezultat ca fiind cauzat de ‘nefuncționalitatea’canalului

Obiectivul b. Pe baza modelului descris mai sus, să compare și să identifice diferențele între structurile native și mutante, precum și corelația dintre aceste diferențe și rezultatele experimentului Paukert și colaboratorii, 2008

Diferențe majore sunt observate între poziționarea Ca2+ la poteina nativă 2QTS_WT, față de proteina cu dublă mutație 2QTS_D392C_E385G. rezultat arătat în Figura 72.

Astfel, la pH 7.2 și 6.8, proteina 2QTS_WT, arată o poziționare cvasi-constantă în toate cele 250 de conformații ale simulării dinamicii moleculare. Interesant de remarcat sunt: modificarea poziției față de ASP433 lanțul B, de la prima la a doua conformație (distanța cade de la 4,98 Å-20ps la 2,67 Å-40ps) după care rămâne cvasi-constantă. La pH 6.0. deși distanțele pe ansamblu sunt mai mici, acestea prezintă o inconstanță ridicată mai ales pentru aminoacizii de pe lanțul B și C.

Figura 72. Distanțe Ca – ASP433 / CYS433 la pH 7.2; 6.8; 6.0 pentru proteinele: 2QTS_WT, 2QTS_D392C_E385G și 2QTS_D392C_E385G_D38N

Prin comparație la proteina cu mutație dublă, distanțele sunt mai mari și cu o inconstanță accentuată de la configurație la configurație, deși proteina este mai stabilă decât ccea nativă.

Cele două rezultate sugerează că, modificarea poziției este la fel de importantă ca și distanța mai mare față de aminoacizii de interes. Cu alte cuvinte, proteina mai flexibilă este cea care prezintă o influență mai scăzută a Ca2+.

Protonarea aminoacizilor in proteine

Tabelul 23: Aminoacizi protonați la pH 7.2; 6.8; 6 la proteinele 2QTS_WT, 2QTS_D392C_E385G si 2QTS_D392C_E385G_D38N

Se observă că la toate pHurile, proteinele 2QTS_WT și 2QTS_D392C_E385G se protonează identic, ceea ce ne arată că diferențele de comportament față de dependența de Ca2+ nu sunt cauzate de diferența în modalitatea de protonare.

Sigura diferență care apare este reprezentată de ne-protonarea reziduurilor HIS74 pe toate cele 3 lanțuri pentru proteina cu mutație triplă 2QTS_D392C_E385G_D38N, încă de la pH 6.8.

Figura 73: Detaliile distribuției energiei electrostatice potențiale la suprafața expusă solventului:

A. 2OTS_WT la pH 7.2 ; B. 2QTS_D433C_E426G la pH 7.2

O diferență majoră a fost descoperită între structurile 2QTS_WT și 2QTS_D392C_E385G în ceea ce privește energia potențială electrostatică a proteinelor (vezi Figura 73) cât și în potențialele medii electrostatice ale aminoacizilor , mai ales pentru aminoacizii aflați la o distanță mai mică de 4 Å de ASP433/CYS 433 (vezi Tabelul 24).

Tabelul 24: Potențialele medii electrostatice ale aminoacizilor aflați la o distanță mai mică de 4 Å de ASP433 / CYS 433-selecție

Se observă că principala diferență între structurile 2QTS_WT și 2QTS_D392C_E385G este legată de distribuția potențialelor medii electrostatice ale aminoacizilor, în special cei aflați pe o rază de 4 Å de aminoacidul ASP433. Astfel din 29 de aminoacizi:

• 2QTS_WT la pH 7.2 avem 27 aminoacizi electronegativi și 2 aminoacizi ușor electropozitivi

• 2QTS_D392C_E385G la pH 7.2 avem 29 de aminoacizi electropozitivi – dintre care 8 cu electropozitivitate mare (peste + 10KT)

• 2QTS_WT la pH 6 avem 19 aminoacizi electronegativi și 10 aminoacizi electropozitivi; din 29 de aminoacizi doar 1 aminoacid și-a crescut electronegativitatea, restul de 28 scăzând nivelul de electronegativitate sau devenind electropozitivi.

Obiectivul c. Identificare factori posibili ai dependenței activității canalului de concentrația de Ca2+ și să elucideze mecanismul acesteia.

Concluzia studiului meu este că diferențele de comportament în privința dependenței de Ca2+ dintre 2QTS_WT și 2QTS_D392C_E385G nu sunt datorate modificărilor conformaționale sau diferențelor în ceea ce privește aminoacizii protonați.

Diferențele notabile descoperite sunt :

• distribuția diferită a energiei electrostatice în toată molecula proteinei, cu o arie electronegativă în zona poziționării Ca2+ / ASP433 pentru 2QTS_WT la pH 7.2 în comparație cu distribuție electropozitivă găsită la 2QTS_D392C_E385G la toate pHurile studiate;

• 2QTS_WT la pH 6.8 și pH 6.0 prezintă caracteristici mai puțin electronegative și mai mult electropozitive în zona ASP433 / Ca2+

• Distanțele între Ca2+ și ASP433 sunt mai mari și cu perturbații mai mici la 2QTS_WT la pH 7.2.

În plus, proteina triplu mutantă nu are protonare HIS 74 pe niciunul dintre lanțuri

VII. Concluzii finale:

Propunem ca ipoteză a dependenței de Ca2+ a tranziției între stări pentru canalul ASIC1a:

În intervalul de pH 7.2-6.7, Ca2+ are o interacțiune puternică cu zona electronegativă aflată în jurul ASP433 și ‘rigidizează' această zonă, opunându-se mișcărilor de translație / rotație / răsucire inițiate în zona extracelulară. Odată cu scăderea pHului și protonarea aminoacizilor, zona din jurul ASP433 și GLU426 își schimbă electronegativitatea iar interacțiunea cu Ca2+ devine mai slabă și mai puțin constantă, aceasta oscilând ca poziție și ca interacție cu proteina, permițându-i acesteia să efectueze mișcările necesare deschiderii porului.

În plus, in cursul studiului am evidențiat că aminoacizii ASP433, GLU 426, ASP79 și HIS 74 sunt importanți atât în mecanismul deschiderii canalului cât și în mecanismul modulării canalului de către Ca2+.

VIII. BIBLIOGRAFIE

Gründer, S., Chen, X., 2010, Structure, function, and pharmacology of acid-sensing ion channels (ASICs): focus on ASIC1a, International journal of physiology, pathophysiology and pharmacology, 2(2), 73.

Schaefer, L., Sakai, H., Mattei, M. G., Lazdunski, M., Lingueglia, E., 2000, Molecular cloning, functional expression and chromosomal localization of an amiloride‐sensitive Na+ channel from human small intestine, FEBS letters, 471(2-3), 205-210.

Coscoy, S., de Weille, J. R., Lingueglia, E., Lazdunski, M., 1999, The pre-transmembrane 1 domain of acid-sensing ion channels participates in the ion pore, Journal of Biological Chemistry, 274(15), 10129-10132.

Sakai, H., Lingueglia, E., Champigny, G., Mattei, M. G., Lazdunski, M., 1999, Cloning and functional expression of a novel degenerin‐like Na+ channel gene in mammals, The Journal of physiology, 519(2), 323-333.

Zhang, P., Sigworth, F. J., Canessa, C. M.,2006, Gating of acid-sensitive ion channel-1: release of Ca2+ block vs. allosteric mechanism, The Journal of general physiology, 127(2), 109-117.

Lingueglia, E., 2007, Acid-sensing ion channels in sensory perception, Journal of Biological Chemistry, 282(24), 17325-17329.

Gründer, S., Jaeger, N. F., Gautschi, I., Schild, L., Rossier, B. C, 1999, Identification of a highly conserved sequence at the N-terminus of the epithelial Na+ channel α subunit involved in gating, Pflügers Archiv, 438(5), 709-715.

Alexander, S., Christopoulos, A., Davenport, A. P., Kelly, E., Marrion, N. V., Peters, J. A., Southan, C., 2017, The Concise Guide to Pharmacology: G protein‐coupled receptors, British journal of pharmacology, 174, S17-S129.

Strader, C. D., Fong, T. M., Tota, M. R., Underwood, D., Dixon, R. A., 1994, Structure and function of G protein-coupled receptors, Annual review of biochemistry, 63(1), 101-132.

Canessa,C., 2015, Acid sensing ion channels, Handbook of ion channels , Zheng, J. și Trudeau, M., CRC Press., 383-395

Kellenberger, S. and Schild, L., 2015, Structure, function, and pharmacology of acid-sensing ion channels and the epithelial Na+ channel, International Union of Basic and Clinical Pharmacology. XCI, Pharmacological reviews, 67(1), 1-35.

Gonzales, E. B., Kawate, T., Gouaux, E., 2009, Pore architecture and ion sites in acid-sensing ion channels and P2X receptors, Nature, 460(7255), 599-604.

Liu, S., Cheng, X. Y., Wang, F., Liu, C. F., 2015, Acid-sensing ion channels: potential therapeutic targets for neurologic diseases, Translational neurodegeneration, 4(1), 10.

Kellenberger, S., Schild, L., 2002, Epithelial sodium channel/degenerin family of ion channels: a variety of functions for a shared structure, Physiological reviews, 82(3), 735-767.

Lingueglia, E., Champigny, G., Lazdunski, M., Barbry, P., 1995, Cloning of the amiloride-sensitive FMRFamide peptide-gated sodium channel ,  Nature, 378(6558), 730.

Carnally, S. M., Dev, H. S., Stewart, A. P., Barrera, N. P., Van Bemmelen, M. X., Schild, L., Edwardson, J. M., 2008, Direct visualization of the trimeric structure of the ASIC1a channel, using AFM imaging, Biochemical and biophysical research communications, 372(4), 752-755.

Paukert, M., Sidi, S., Russell, C., Siba, M., Wilson, S. W., Nicolson, T., Gründer, S., 2004, A family of acid-sensing Ion channels from the Zebrafish widespread expression in the central nervous system suggests a conserved role in neuronal communication, Journal of Biological Chemistry, 279(18), 18783-18791.

Immke, D. C., McCleskey, E. W., 2003, Protons open acid-sensing ion channels by catalyzing relief of Ca2+ blockade, Neuron, 37(1), 75-84.

Li, T., Yang, Y., Canessa, C. M., 2009, Interaction of the aromatics Tyr-72/Trp-288 in the interface of the extracellular and transmembrane domains is essential for proton gating of acid-sensing ion channels, Journal of Biological Chemistry, 284(7), 4689-4694.

Baron, A., Schaefer, L., Lingueglia, E., Champigny, G., Lazdunski, M., 2001, Zn2+ and H+ are coactivators of acid-sensing ion channels, Journal of Biological Chemistry, 276(38), 35361-35367.

SherCoric, T., Zhang, P., Todorovic, N., Canessa, C. M., 2003, The extracellular domain determines the kinetics of desensitization in acid-sensitive ion channel 1, Journal of Biological Chemistry, 278(46), 45240-45247.

Diochot, S., Salinas, M., Baron, A., Escoubas, P., Lazdunski, M., 2007, Peptides inhibitors of acid-sensing ion channels, Toxicon, 49(2), 271-284.

Sherwood, T., Franke, R., Conneely, S., Joyner, J., Arumugan, P., Askwith, C., 2009, Identification of protein domains that control proton and calcium sensitivity of ASIC1a, Journal of Biological Chemistry, 284(41), 27899-27907.

Chu, X. P., Wemmie, J. A., Wang, W. Z., Zhu, X. M., Saugstad, J. A., Price, M. P., Xiong, Z. G., 2004, Subunit-dependent high-affinity zinc inhibition of acid-sensing ion channels, Journal of Neuroscience, 24(40), 8678-8689.

Waldmann, R., Champigny, G., Bassilana, F., Heurteaux, C., Lazdunski, M., 1997, A proton-gated cation channel involved in acid sensing, Nature , 386(6621), 173.

Wang, W., Duan, B., Xu, H., Xu, L., Xu, T. L., 2006, Calcium-permeable acid-sensing ion channel is a molecular target of the neurotoxic metal ion lead., Journal of Biological Chemistry, 281(5), 2497-2505.

Xiong, Z. G., Zhu, X. M., Chu, X. P., Minami, M., Hey, J., Wei, W. L., Simon, R. P., 2004, Neuroprotection in ischemia: blocking calcium-permeable acid-sensing ion channels, Cell, 118(6), 687-698.

Baron, A., Waldmann, R., Lazdunski, M., 2002, ASIC‐like, proton‐activated currents in rat hippocampal neurons, The Journal of physiology, 539(2), 485-494.

Akopian, A. N., Chen, C. C., Ding, Y., Cesare, P., Wood, J. N., 2000, A new member of the acid-sensing ion channel family, Neuroreport, 11(10), 2217-2222.

Gründer, S., Pusch, M.,2015, Biophysical properties of acid-sensing ion channels (ASICs), Neuropharmacology, 94, 9-18.

Askwith, C. C., Wemmie, J. A., Price, M. P., Rokhlina, T., Welsh, M. J., 2004, Acid-sensing ion channel 2 (ASIC2) modulates ASIC1 H+ -activated currents in hippocampal neurons, Journal of Biological Chemistry, 279(18), 18296-18305.

Wemmie, J. A., Askwith, C. C., Lamani, E., Cassell, M. D., Freeman, J. H., Welsh, M. J., 2003, Acid-sensing ion channel 1 is localized in brain regions with high synaptic density and contributes to fear conditioning, Journal of Neuroscience, 23(13), 5496-5502.

Ugawa, S., Ishida, Y., Ueda, T., Inoue, K., Nagao, M., Shimada, S., 2007, Nafamostat mesilate reversibly blocks acid-sensing ion channel currents, Biochemical and biophysical research communications, 363(1), 203-208.

Escoubas, P., De Weille, J. R., Lecoq, A., Diochot, S., Waldmann, R., Champigny, G., Lazdunski, M., 2000, Isolation of a tarantula toxin specific for a class of proton-gated Na+ channels,  Journal of Biological Chemistry,  275(33), 25116-25121.

McKhann II, G. M., 2008, Seizure termination by acidosis depends on ASIC1a, Neurosurgery, 63(4), N10.

Dubinnyi, M. A., Osmakov, D. I., Koshelev, S. G., Kozlov, S. A., Andreev, Y. A., Zakaryan, N. A., Grishin, E. V., 2012, Lignan from thyme possesses inhibitory effect on ASIC3 channel current, Journal of Biological Chemistry, 287(39), 32993-33000.

Escoubas, P., Bernard, C., Lambeau, G., Lazdunski, M., Darbon, H., 2003, Recombinant production and solution structure of PcTx1, the specific peptide inhibitor of ASIC1a proton‐gated cation channels, Protein Science, 12(7), 1332-1343.

Wemmie, J. A., Chen, J., Askwith, C. C., Hruska-Hageman, A. M., Price, M. P., Nolan, B. C., Welsh, M. J., 2002, The acid-activated ion channel ASIC contributes to synaptic plasticity, learning, and memory, Neuron, 34(3), 463-477.

Zha, X. M., Wemmie, J. A., Green, S. H., Welsh, M. J., 2006, Acid-sensing ion channel 1a is a postsynaptic proton receptor that affects the density of dendritic spines, Proceedings of the National Academy of Sciences, 103(44), 16556-16561.

Gründer, S., Geissler, H. S., Bässler, E. L., Ruppersberg, J. P., 2000, A new member of acid-sensing ion channels from pituitary gland, Neuroreport, 11(8), 1607-1611.

Voilley, N., de Weille, J., Mamet, J., Lazdunski, M., 2001, Nonsteroid anti-inflammatory drugs inhibit both the activity and the inflammation-induced expression of acid-sensing ion channels in nociceptors, Journal of Neuroscience,  21(20), 8026-8033.

Xie, J., Price, M. P., Wemmie, J. A., Askwith, C. C., Welsh, M. J., 2003, ASIC3 and ASIC1 mediate FMRFamide-related peptide enhancement of H+-gated currents in cultured dorsal root ganglion neurons, Journal of neurophysiology, 89(5), 2459-2465.

Ziemann, A. E., Schnizler, M. K., Albert, G. W., Severson, M. A., Howard Iii, M. A., Welsh, M. J., Wemmie, J. A., 2008, Seizure termination by acidosis depends on ASIC1a, Nature neuroscience, 11(7), 816.

Ettaiche, M., Deval, E., Cougnon, M., Lazdunski, M., Voilley, N., 2006, Silencing acid-sensing ion channel 1a alters cone-mediated retinal function, Journal of Neuroscience, 26(21), 5800-5809.

Babeș, A., 2007, Canale din familia Degenerin / ENaC, Fiziologia și Fiziopatologia Canalelor Ionice, I. Craciun, Ars Docendi, 307-312.

Sutherland, S. P., Benson, C. J., Adelman, J. P., McCleskey, E. W., 2001, Acid-sensing ion channel 3 matches the acid-gated current in cardiac ischemia-sensing neurons, Proceedings of the National Academy of Sciences, 98(2), 711-716.

Hesselager, M., Timmermann, D. B., Ahring, P. K., 2004, pH Dependency and desensitization kinetics of heterologously expressed combinations of acid-sensing ion channel subunits,  Journal of Biological Chemistry, 279(12), 11006-11015.

Chen, C. C., England, S., Akopian, A. N., Wood, J. N., 1998, A sensory neuron-specific, proton-gated ion channel, Proceedings of the National Academy of Sciences, 95(17), 10240-10245.

Pignataro, G., Simon, R. P., Xiong, Z. G., 2006, Prolonged activation of ASIC1a and the time window for neuroprotection in cerebral ischaemia, Brain, 130(1), 151-158.

Poirot, O., Vukicevic, M., Boesch, A., Kellenberger, S., 2004, Selective regulation of acid-sensing ion channel 1 by serine proteases, Journal of Biological Chemistry, 279(37), 38448-38457.

Alijevic, O., Kellenberger, S., 2012, Subtype-specific modulation of acid-sensing ion channel (ASIC) function by 2-guanidine-4-methylquinazoline , Journal of Biological Chemistry, 287(43), 36059-36070.

Chen, X., Kalbacher, H., Gründer, S., 2005, The tarantula toxin psalmotoxin 1 inhibits acid-sensing ion channel (ASIC) 1a by increasing its apparent H+ affinity, The Journal of general physiology, 126(1), 71-79.

Blanchard, M. G., Kellenberger, S., 2011, Effect of a temperature increase in the non-noxious range on proton-evoked ASIC and TRPV1 activity,  Pflügers Archiv-European Journal of Physiology, 461(1), 123-139.

Chen, X., Gründer, S., 2007, Permeating protons contribute to tachyphylaxis of the acid‐sensing ion channel (ASIC) 1a, The Journal of physiology, 579(3), 657-670.

Samways, D.S., A.B. Harkins, T.M. Egan, 2009, Native and recombinant ASIC1a receptors conduct negligible Ca2+ entry, Cell calcium, 45(4), 319-325.

Amuzescu, B., Airini, R., Ghica, L., Epureanu, F., Deftu, A., Cucu, D. M., Mihăilescu, D.F., Radu, B. M., 2017, Novel approaches to proarrhythmogenic risk testing using automated patch-clamp platforms,  Romanian Journal of Biophysics, 27(1).

Sherwood, T. W., Lee, K. G., Gormley, M. G., Askwith, C. C., 2011, Heteromeric acid-sensing ion channels (ASICs) composed of ASIC2b and ASIC1a display novel channel properties and contribute to acidosis-induced neuronal death, Journal of Neuroscience, 31(26), 9723-9734.

Waldmann, R., Champigny, G., Bassilana, F., Voilley, N., Lazdunski, M., 1995, Molecular cloning and functional expression of a novel amiloride-sensitive Na+ channel, Journal of Biological Chemistry, 270(46), 27411-27414.

Vukicevic, M., Kellenberger, S., 2004, Modulatory effects of acid-sensing ion channels on action potential generation in hippocampal neurons, American Journal of Physiology-Cell Physiology, 287(3), C682-C690.

Babini, E., Paukert, M., Geisler, H. S., Gründer, S., 2002, Alternative splicing and interaction with di-and polyvalent cations control the dynamic range of acid-sensing ion channel 1 (ASIC1), Journal of Biological Chemistry, 277(44), 41597-41603.

Bässler, E. L., Ngo-Anh, T. J., Geisler, H. S., Ruppersberg, J. P., Gründer, S., 2001, Molecular and functional characterization of acid-sensing ion channel (ASIC) 1b, Journal of Biological Chemistry, 276(36), 33782-33787.

Chen, X., Qiu, L., Li, M., Dürrnagel, S., Orser, B. A., Xiong, Z. G., MacDonald, J. F., 2010, Diarylamidines: high potency inhibitors of acid-sensing ion channels, Neuropharmacology, 58(7), 1045-1053.

Cushman, K. A., Marsh-Haffner, J., Adelman, J. P., McCleskey, E. W., 2007, A conformation change in the extracellular domain that accompanies desensitization of acid-sensing ion channel (ASIC) 3, The Journal of general physiology, 129(4), 345-350.

Deval, E., Noël, J., Gasull, X., Delaunay, A., Alloui, A., Friend, V., Lingueglia, E., 2011, Acid-sensing ion channels in postoperative pain, Journal of Neuroscience, 31(16), 6059-6066.

Diochot, S., Baron, A., Rash, L. D., Deval, E., Escoubas, P., Scarzello, S., Lazdunski, M., 2004, A new sea anemone peptide, APETx2, inhibits ASIC3, a major acid‐sensitive channel in sensory neurons, The EMBO journal, 23(7), 1516-1525.

Yermolaieva, O., Leonard, A. S., Schnizler, M. K., Abboud, F. M., Welsh, M. J., 2004, Extracellular acidosis increases neuronal cell calcium by activating acid-sensing ion channel 1a, Proceedings of the National Academy of Sciences, 101(17), 6752-6757.

Diochot, S., Baron, A., Salinas, M., Douguet, D., Scarzello, S., Dabert-Gay, A. S., Lingueglia, E., 2012, Black mamba venom peptides target acid-sensing ion channels to abolish pain, Nature, 490(7421), 552-555

Paukert, M., Babini, E., Pusch, M., Gründer, S., 2004, Identification of the Ca2+ blocking site of acid-sensing ion channel (ASIC) 1: implications for channel gating, The Journal of general physiology, 124(4), 383-394.

Dube, G. R., Lehto, S. G., Breese, N. M., Baker, S. J., Wang, X., Matulenko, M. A., Brioni, J. D., 2005, Electrophysiological and in vivo characterization of A-317567, a novel blocker of acid sensing ion channels, Pain, 117(1-2), 88-96.

Snyder, P. M., McDonald, F. J., Stokes, J. B., Welsh, M. J., 1994, Membrane topology of the amiloride-sensitive epithelial sodium channel, Journal of Biological Chemistry, 269(39), 24379-24383.

Dawson, R. J., Benz, J., Stohler, P., Tetaz, T., Joseph, C., Huber, S., Rudolph, M. G., 2012, Structure of the acid-sensing ion channel 1 in complex with the gating modifier Psalmotoxin 1, Nature communications, 3, 936.

Baconguis, I., Gouaux, E., 2012, Structural plasticity and dynamic selectivity of acid-sensing ion channel–spider toxin complexes, Nature, 489(7416), 400.

Firsov, D., Robert-Nicoud, M., Gruender, S., Schild, L., Rossier, B. C., 1999, Mutational analysis of cysteine-rich domains of the epithelium sodium channel (ENaC) identification of cysteines essential for channel expression at the cell surface,  Journal of Biological Chemistry, 274(5), 2743-2749.

Bohlen, C. J., Chesler, A. T., Sharif-Naeini, R., Medzihradszky, K. F., Zhou, S., King, D., Julius, D., 2011, A heteromeric Texas coral snake toxin targets acid-sensing ion channels to produce pain, Nature, 479(7373), 410-414.

Kadurin, I., Golubovic, A., Leisle, L., Schindelin, H., Gründer, S., 2008, Differential effects of N-glycans on surface expression suggest structural differences between the acid-sensing ion channel (ASIC) 1a and ASIC1b, Biochemical Journal, 412(3), 469-475.

Saugstad, J. A., Roberts, J. A., Dong, J., Zeitouni, S., Evans, R. J., 2004, Analysis of the membrane topology of the acid-sensing ion channel 2a, Journal of Biological Chemistry, 279(53), 55514-55519.

Canessa, C. M., Merillat, A. M., Rossier, B. C., 1994, Membrane topology of the epithelial sodium channel in intact cells, American Journal of Physiology-Cell Physiology, 267(6), C1682-C1690.

Snyder, P. M., Olson, D. R., Bucher, D. B., 1999, A pore segment in DEG/ENaC Na+ channels, Journal of Biological Chemistry, 274(40), 28484-28490.

Renard, S., Lingueglia, E., Voilley, N., Lazdunski, M., Barbry, P., 1994, Biochemical analysis of the membrane topology of the amiloride-sensitive Na+ channel, Journal of Biological Chemistry, 269(17), 12981-12986.

Baconguis, I., Bohlen, C. J., Goehring, A., Julius, D., Gouaux, E., 2014, X-ray structure of acid-sensing ion channel 1–snake toxin complex reveals open state of a Na+-selective channel, Cell, 156(4), 717-729.

Pfister, Y., Gautschi, I., Takeda, A. N., van Bemmelen, M., Kellenberger, S., Schild, L., 2006, A gating mutation in the internal pore of ASIC1a, Journal of Biological Chemistry, 281(17), 11787-11791.

Gründer, S., Firsov, D., Chang, S. S., Jaeger, N. F., Gautschi, I., Schild, L., Rossier, B. C., 1997, A mutation causing pseudohypoaldosteronism type 1 identifies a conserved glycine that is involved in the gating of the epithelial sodium channel, The EMBO Journal, 16(5), 899-907.

Jasti, J., Furukawa, H., Gonzales, E. B., Gouaux, E., 2007, Structure of acid-sensing ion channel 1 at 1.9 Å resolution and low pH, Nature, 449(7160), 316-323

Donier, E., Rugiero, F., Okuse, K., Wood, J. N., 2005, Annexin II light chain p11 promotes functional expression of acid-sensing ion channel ASIC1a, Journal of Biological Chemistry, 280(46), 38666-38672.

Mazzuca, M., Heurteaux, C., Alloui, A., Diochot, S., Baron, A., Voilley, N., Zimmer, A., 2007, A tarantula peptide against pain via ASIC1a channels and opioid mechanisms, Nature neuroscience, 10(8), 943.

Yang, Y., Yu, Y., Cheng, J., Liu, Y., Liu, D. S., Wang, J., Xu, T. L., 2012, Highly conserved salt bridge stabilizes rigid signal patch at extracellular loop critical for surface expression of acid-sensing ion channels, Journal of Biological Chemistry, 287(18), 14443-14455.

Paukert, M., Chen, X., Polleichtner, G., Schindelin, H., Gründer, S., 2008, Candidate amino acids involved in H+ gating of acid-sensing ion channel 1a, Journal of Biological Chemistry, 283(1), 572-581.

Yokokawa, M., Carnally, S. M., Henderson, R. M., Takeyasu, K., Edwardson, J. M., 2010, Acid‐sensing ion channel (ASIC) 1a undergoes a height transition in response to acidification, FEBS letters, 584(14), 3107-3110.

Bonifacio, G., Lelli, C. I. S., Kellenberger, S., 2014, Protonation controls ASIC1a activity via coordinated movements in multiple domains, The Journal of general physiology, 143(1), 105-118.

Gründer, S., Augustinowski, K., 2012, Toxin binding reveals two open state structures for one acid-sensing ion channel, Channels, 6(6), 409-413.

Yu, Y., Chen, Z., Li, W. G., Cao, H., Feng, E. G., Yu, F., Xu, T. L., 2010, A nonproton ligand sensor in the acid-sensing ion channel, Neuron, 68(1), 61-72.

Li, T., Yang, Y., Canessa, C. M., 2010, Leu85 in the β1-β2 linker of ASIC1 slows activation and decreases the apparent proton affinity by stabilizing a closed conformation, Journal of Biological Chemistry, 285(29), 22706-22712.

Shaikh, S. A., Tajkhorshid, E., 2008, Potential cation and H+ binding sites in acid sensing ion channel-1, Biophysical journal, 95(11), 5153-5164.

Springauf, A., Bresenitz, P., Gründer, S., 2011, The interaction between two extracellular linker regions controls sustained opening of acid-sensing ion channel 1, Journal of Biological Chemistry, 286(27), 24374-24384.

Li, T., Yang, Y., Canessa, C. M., 2011, Outlines of the pore in open and closed conformations describe the gating mechanism of ASIC1, Nature communications,  2, 399.

Staruschenko, A., Dorofeeva, N. A., Bolshakov, K. V., Stockand, J. D., 2007, Subunit‐dependent cadmium and nickel inhibition of acid‐sensing ion channels, Developmental neurobiology, 67(1), 97-107.

Li, T., Yang, Y., Canessa, C. M., 2010, Asn415 in the β11-β12 linker decreases proton-dependent desensitization of ASIC1, Journal of Biological Chemistry, 285(41), 31285-31291.

Liechti, L. A., Berneche, S., Bargeton, B., Iwaszkiewicz, J., Roy, S., Michielin, O., Kellenberger, S., 2010, A combined computational and functional approach identifies new residues involved in pH-dependent gating of ASIC1a, Journal of biological chemistry, 285(21), 16315-16329.

Krauson, A. J., Rued, A. C., Carattino, M. D., 2013, Independent contribution of extracellular proton binding sites to ASIC1a activation, Journal of Biological Chemistry, 288(48), 34375-34383.

Passero, C. J., Okumura, S., Carattino, M. D., 2009, Conformational changes associated with proton-dependent gating of ASIC1a, Journal of Biological Chemistry, 284(52), 36473-36481.

Yoder, N., Yoshioka, C., Gouaux, E., 2018, Gating mechanisms of acid-sensing ion channels, Nature, 555(7696), 397.

Yoder, N., Gouaux, E., 2018, Divalent cation and chloride ion sites of chicken acid sensing ion channel 1a elucidated by x-ray crystallography, PloS one,  13(8), e0202134.

Vasile, I., Mernea, M., Mihailescu, D. F., 2013, Protein-membrane interaction: molecular dynamics simulation of ASIC1 in lipid bilayer, European Journal of Biophysics with biophysics letters, 42, S157.

Søndergaard, C. R., Olsson, M. H., Rostkowski, M., Jensen, J. H., 2011, Improved treatment of ligands and coupling effects in empirical calculation and rationalization of p K a values, Journal of chemical theory and computation, 7(7), 2284-2295.

Helen M. Berman, John Westbrook, Zukang Feng, Gary Gilliland, T. N. Bhat, Helge Weissig, Ilya N. Shindyalov, Philip E. Bourne, The Protein Data Bank, Nucleic Acids Research, Volume 28, Issue 1, 1 January 2000, 235–242,  https://doi.org/10.1093/nar/28.1.235

Dolinsky TJ, Nielsen JE, McCammon JA, Baker NA, 2004, PDB2PQR: an automated pipeline for the setup, execution, and analysis of Poisson-Boltzmann electrostatics calculations. Nucleic Acids Res, 32, W665-W667.  http://nar.oxfordjournals.org/content/32/suppl_2/W665.abstract

Dassault Systèmes BIOVIA, Discovery Studio Modeling Environment, Release 2017, San Diego: Dassault Systèmes, 2016, https://www.3dsbiovia.com/products/collaborative-science/biovia-discovery-studio/