Studiul in vitro al răspunsului imun celular nespecific prin citometrie în flux Coordonator științific Luminița Maruțescu Absolvent, Ioana Lupu… [618013]

1

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOLOGIE

LUCRARE DE LICENȚĂ

Coordonator științific
Luminița Maruțescu
Absolvent: [anonimizat] 2018

2

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOLOGIE

LUCRARE DE LICENȚĂ
Studiul in vitro al răspunsului imun celular nespecific prin
citometrie în flux

Coordonator științific
Luminița Maruțescu
Absolvent: [anonimizat] 2018

1
Cuprins
Introducere
1 Capitolul 1 Citometria în flux
1.1 Principiu
1.2 Aplicații și utilizări
1.3 Prezentarea general a componentelor
1.4 Componente tehnice
1.4.1 Sistemul de detecție
1.4.2 Sistemul de iluminare
1.4.3 Sistemul fluid
1.4.4 Sistemul optic
1.4.5 Sistemul electronic
1.4.6 Achiziția și analiza datelor
1.5 Fluoresența
1.5.1 Reactivii fluorocromi
2 Capitolul2 Sistemul Imunitar
2.1 Sistemul imunitar înnăscut
2.1.1 Specificitatea răspunsului imun înnăscut
2.1.2 Receptorii celulari pentru microorganisme și celule lezate
2.1.3 Componente ale sistemului imun
2.1.4 Reacțiile imune înnăscute
2.2 Imunodeficiența
2.2.1 Imunodeficiențe primare
2.2.2 Defecte ale imunității înnăscute
3 Capitolul 3 Studiul fagocitozei realizată de către neutrofile
3.1 Procedeul de analizare
3.1.1 Probe de sânge
3.1.2 Măsurarea activității bactericide
3.2 Rezultate și discuții
Concluzie
Bibliografie

2
Introducere

Fagocitoza reprezintă un mecanism de apărare fundamental, cu rol esențial în rezistența
organismului uman și animal față de agenții infecțioși. În acest proces, celulele specializate, ale
imunitatății nespecifice înnăscute, cu funcții efectoare: leucocite polimorfonucleare (neutrofile
granulocitele), macrofage și celule dendritice distrug și descompun microorganismele (bacterii
extracelulare). Fagocitoza este facilitată de produși plasmatici, preum componente ale sistemului
complement și anticorpi. Fagocitele conțin un arsenal de enzime pentru proteoliză și producerea
de specii reactive de oxigen ( reactive oxidative species , ROS). Capturarea agenților infecțioși
declanșează activarea complexului enzimatic al NADPH oxidazei, care produce NADP+, ion
superoxid (O 2ˉ) și peroxid de hidrogen (H 2O2). Mieloperoxidaza convertește aceste specii la
radicali hidroxili și hipoclorit, foarte eficiente în omorârea și digestia particulelor ingerate,
inclusiv a bacteriilor și fungilor (activitate microbicidă). Deficiențe înnascute ale complexului
enzimatic NADPH oxidazei sau mieloperoxidazei determină deficiente în producerea de ROS și
acumularea de produși fagocitați ce conduc la boala cronică granulomatoasă ( Chronic
Granulomatous Disease (CGD)). Sindromul este caracterizat prin predispoziția la infecție cu
organisme nepatogene și activitate diminuată a fagocitelor, asociate cu o reacție tisulară
granulomatoasă. Sindromul CGD este rar, și este studiat ca model pentru mecanismele prin care
fagocitele omoară și digeră microorganismele. Majoritatea cazurilor clinice (70%) de CGD se
datorează mutației unei gene situată pe cromosomul X: citocromul b558 nu este sintetizat. Restul
de 30% dintre cazurile CGD sunt datorate mutațiilor recesive ale genelor autozomale: citocromul
b558 este sintetizat, dar nefuncțional (nu transportă electronii de la NADPH la O 2), datorită unei
mutații a genei care codifică subunitatea mare.
Activitatea microbicidă poate fi măsurată prin capacitatea fagocitelor de a produce ROS,
utilă în diagnosticul CGD și imunoparaliziei. Activitatea microbicidă a fagocitelor poate fi
măsurată prin citometrie în flux, bazată pe măsurarea producției de ROS. ROS induce oxidarea
dihidrorodamina 123 (DHR123) la rhodamina fluorescentă 123 (R123) care poate fi măsurată la
nivelul celulelor individuale prin citometria de flux.
Scopul studiul a fost analiza activității bactericide a granulocitelor prin citometrie în
flux. Pentru atingerea acestui scop, s-a realizat determinarea cantitativă cu ajutorul citometriei în
flux a exploziei oxidative a granulocitelor după stimulare cu E. Coli.

3
CAPITOLUL 1 CITOMETRIA ÎN FLUX

Citometria în flux este o parte integrală atât a cercetării biologice de bază, dar și a
diagnosticării clinice în patologie și este o metodă foarte importantă ce permite analiza rapidă a
particulelor/celulelor ce trec una câte una prin dreptul unei raze laser. Această tehnologie permite
analiza calitativă si cantitativă, precum și sortarea particulelor microscopice, suspendate într-un
mediu lichid, în mod individual, una câte una, din punct de vedere al dimensiunii, granularității
și fluorescenței.
Din acest punct de vedere, citometria în flux este o metodă foarte performantă pentru
analiza detaliată a unui numărul mare de evenimente (500 000 evenimente) care pot fi
înregistrate în câteva secunde până la un minut. Această tehnică are multiple aplicații medicale și
în cercetare, fiind frecvent utilizată în laboratoarele de hematologie pentru caracterizarea
populațiilor și subpopulațiilor limfocitare și diagnosticarea malignităților hematologice.
Citometria în flux este utilizată în imunofenotiparea unei varietăți mari de eșantioane,
prinre care sângele, măduva osoasă, lichidul din cavitățile seroase, lichidul cerebrospinal, urină și
din țesuturi. Caracteristice ce pot fi măsurate prin această metodă includ mărimea celulelor,
complexitatea citoplasmatică, conținutul de ADN sau ARN dar și o gamă largă de receptori
membranari și proteine intracelulare.

1.1 Principiu

Citometria în flux (lb gr. kytos = celulă, metrion = măsurare) este o tehnică rapidă și
dinamică, care permite măsurători rapide, cu rezoluții superioare metodelor clasice, ce
analizează împrăștierea luminii ( light scatter ) și fluorescența emisă de celule/ particule în
momentul în care acestea trec prin punctul de interogare al unei raze laser (Roederer, 2002)
(Sack, Tarnok, & Rothe, 2009).
Această tehnică se bazează pe proprietățile de dispersie a luminii de către celulele care
sunt analizate, incluzând emisia fluorescentă. Lumina dispersată din diferite unghiuri pune în
evidență diferențe din punct de vedere al mărimii și al complexității interne a celulelor, în timp
ce lumina emisă de anticorpii marcați fluorescent poate identifica o gamă largă de celule de

4
suprafață și antigene citoplasmatice. Această metodă poate fi combinată cu sortarea electrică sau
mecanică a celulelor.
Fluorescența poate fi asociată cu coloranți sau cu anticorpi specifici pentru molecule
situate fie la suprafață, fie în compenentele intracelulare ale celulei. Prin citometria în flux se
măsoară caracteristicile fiecărei celule sau particule cu dimensiuni între 0,5 și 150 µm, dar nu se
măsoară media întregii populații celulare, realizându-se analize multiparametrice simultane.
Astfel, probele sunt suspensii celulare transportate de sistemul fluidic la raza laser, prin dreptul
căreia trec în ”șir indian”. În funcție de intrumentul utilizat, sistemul fluidic poate avea un debit
ce variază între 10-120 µl/min, iar rata de achiziție a evenimentelor poate ajunge până la 50000
celule/secundă. Semnalul luminos detectat va fi transformat ulterior într-un semnal electronic ce
va fi analizat prin intermediul histogramelor sau al diagramelor prin puncte (Longobardi Givan,
2001).
1.2 Aplicații și utilizări
Metoda a fost inițial dezvoltată de către imunologi care doreau separarea diferitelor
populații celulare pentru utilizarea acestora în cadrul experimentelor ulterioare cu multiple
culturi pentru a determina funcția celulelor din cadrul sistemului imunitar. În final, acest scop a
fost îndeplinit utilizând sortarea celulară activată fluorescent (FACS) în cadrul citometriei în
flux. Instrumentul inițial era capabil să analizeze una sau două culori fluorescente, în timp ce
astăzi instrumentele sunt capabile să analizeze până la 11 culori ale fluorescenței (Marion G.,
2007).
Utilizarea citometriei în flux în laboratoarele clinice a crescut în ultimii ani (Tabel 1), atât
datorită dezvoltării unor aparate din ce în ce mai mici, mai ușor de utilizat și mai ieftine, cât și
datorită creșterii aplicabilității metodei în laboratoare. Astăzi, citometrele în flux au dimensiuni
mult mai mici, sunt mai puțin costisitoare și mult mai ușor de utilizat.

5

Astfel, astăzi cu ajutorul citometrului în flux se pot analiza (fig.1):

1. Probe fluorescente – anticorpi marcați fluorescent:
• Proteine de suprafață
• Proteine intracelulare
2. Proteine fluorescente (GFP)
3. Probe fluorescente – activitatea funcțională a celulelor:
• ADN
• Mitocondrii
• Enzime
De asemenea, citometrul în flux facilitează:
1. Numărarea particulelor/ celulelor în suspensie
2. Separarea între particule viabile și moarte și între sisteme biologice și nonbiologice
3. Evaluarea particulelor, realizează în mai puțin de un minut
4. Măsurarea împrăștierii luminii, precum și autofluorescență (fluorescența intrinsecă) și
fluorescența extrinsecă
5. Sortarea particulelor, care vor fi mai apoi analizate
Figure 1Tipuri de probe

6
Tabel 1 Aplicații clinice ale citometriei în flux Sursă: (Brown & Wittwer, 2000)
Domeniu Aplicație clinică Caracteristici măsurate

Imunologie Histocompatibilitate IgG. IgM
Respingerea Transplanurilor CD3, OKT3 circulant
Detectarea HLA-B27
Studierea imunodeficiențelor CD4, CD8
Oncologie Conținutul ADN și faza S a tumorilor ADN
Măsurarea markerilor de proliferare Ki-67, PCNA
Hematologie Fenotiparea leucemiei și limfoma Ag suprafeței leucocitare
Identificarea subgrupurilor cu prognostic important TdT, MPO
Numărarea celulelor progenitoare hematopoietice CD34
Diagnosticul de mastocitoză sistemică
Enumerarea reticulocitelor CD25, CD69
ARN
Tulburări autoimune și alloimune
Anticorpi anti-plachetari IgG, IgM
Anticorpi anti-neutrofili IgG
Complexe imune Complement, IgG
Keto-hemoragie feto-maternă
Hemoglobina F
Transfuzia
sângelui
Imunohematologie

Evaluarea contaminării cu leucocite a componentelor
sanguine
Antigeni ai suprafeței eritrocitare
Antigeni ai suprafe ței leucocitare

7

1.3 Prezentarea generală a componentelor

Figure 2Prezentarea generală a componentelor

Proprietățile măsurate prin citometria în flux sunt determinate utilizând un sistem de
cuplare optic-electronic care înregistrează modul în care celula sau particula împrăștie lumină
incidentă laser și emite fluorescență. Astfel, componentele majore ale citometrului în flux (fig. 2)
sunt sistemul fluidic, sistemul optic cu detectoarele optice și sistemul electronic. De asemenea,
Modificări
genetice PNH

Deficiența adeziunii leucocitare CD55, CD59
Complex CD11/ CD18
Biologia
Cancerului
Microbiologie
Parazitologie
Farmacologie
Toxicologie
sânge, măduva osoasă, seroase, LCR, urină, țesuturi

8
după prelucrare semnalelor este necesară achiziția și analiza datelor, care este efectuată utilizând
un computer, un monitor, o imprimantă și un software specializat.
Sistemul fluidic transportă particulele/ celulele în fluxul de fluid, în șir indian, către
punctul de interogare, unde interactioneaza cu sursele de excitatie (lasere).
Sistemul optic este compus din lasere care au rolul de a “interoga” particulele (marcate
sau nemarcate fluorescent) din fluxul fluid, din filtre optice și oglinzi dicroice care au rolul de a
direcționa semnalele optice rezultate către detectorii specifici.
Sistemul electronic se ocupă de convertirea semnalelor optice detectate anterior în
semnale electronice. Acestea sunt stocate în vederea analizei ulterioare cu ajutorul unui computer
și a unui program adecvat. De asemenea, unele instrumente conțin în alcătuire și componente de
sortare, în acest caz sistemul electronic având și rolul de a iniția decizii de sortare (Becton &
Dickinson, 2002).

1.4 Componente tehnice

Dintre componentele tehnice mai fac parte, în afară de sistemele anterior menționate
sistemul de detecție și sistemul de iluminare.

1.4.1. Sistemul de detecție
Alcătuit din 3-9 tuburi de (PMTs) și diode care detectează lumina împrăștiată, sistemul de
detecție analizează simultan numeroase caracteristici fizice ale particulelor microscopice, în mod
individual, una câte una, pe măsură ce acestea sunt transportate în fluxul de lichid prin fața sursei
laser de excitație.

1.4.2 Sistemul de iluminare
Sursele laser de excitație pot fi reprezentate fie de lasere (350-363, 405, 420, 457, 488,
514, 532, 600, 633 nm) cu Argon ion, Krypton ion, HeNe, HeCd, Yag sau de lămpi arc cu
Mercur sau Mercur-Xenon. Cea mai utilizată sursă de lumină din cadrul unui instrument clinic
cu o singură rază de lumină este o sursă de lumină monocromatică, cel mai adesea un laser cu
argon (488 nm lungimea de undă).

9
1.4.3 Sistemul fluid

Sistemul fluidic (fig. 3) transportă particulele printr-un curent către fasciculul laser pentru
analiză (interogare). Celulele în suspensie sunt aliniate, una după alta, în vederea prezentării
individuale a sitemuli de excitare.
Rolul jucat de acest sistem în funcționarea citometrului este de a transporta particulele în
flux către punctul de interogare. Astfel, fluxul de particule din fluid trebuie poziționat în centrul
unei raze laser pentru a interacționa și pentru ca acestea să fi excitate. De asemenea, particulele
trebuie să se deplaseze una câte una prin punctul de interogare la un moment dat.
Principiul de bază al funcționării sistemului fluidic este focalizare (concentrare)
hidrodinamică , ce constă în alinierea succesivă a particulelor în fața punctului de interogare.
Curgerea în regiunea centrală a coloanei de fluid a celulelor/ particulelor aflate în suspenstie în
mediu lichid este restricționată de o teacă de fluid generată prin fenomenul de focalizare
hidrodinamică. Sistemul fluidic este format din două coloane de fluid, fluidul de antrenare/ sheat
fluid (o soluție salină izotonă) și fluidul din probă (soluție salină), care se deschid în regiunea
superioară de la nivelul unei camere de flux (lb. engl. flow chamber – fig.4). În conditii normale,
particulele aflate în suspensie în mediu lichid sunt aliniate în partea centrală a canalui și nu se
amestecă cu lichidul de antrenare (sheat fluid), existând un flux laminar. În această curgere
laminară a fluidelor reale (fluide care prezintă vâscozitate) vitezele straturilor de fluid vor avea
valori diferite. Vitezele frontului de fluid vor avea aspect parabolic, cea mai mare viteză a
straturilor de fluid fiind în regiunea centrală, iar cea mai redusă viteză fiind în regiunea Figure 3 Sistemul fluidic

10
marginală. Profilul parabolic al vitezelor de curgere a fluidului va antrena particulele din
suspensie în regiunea centrală a coloanei de fluid. Odată ce proba este injectată în lichidul de
antrenare în regiunea de constricție a camerei de flux, are loc focalizarea hidrodinamică a
lichidului din probă și astfel, proba se va concentra într-un canal central foarte îngust în care vor
fi antrenate celulele.
Focalizarea hidrodinamică poate fi definită ca fiind o tehnică ce se bazează pe
comprimarea unuia dintre fluxurile de fluid într-o intersecție cu 4 microcanale prin 2 fluxuri
laterale și remodelarea acestuia aval într-un film subțire cu teacă.
Tipul de curgere a fluidelor este determinat de numărul lui Reynolds( Re), o constantă
adimensională ce furnizează informații despre stabilitatea traseului fluidelor. Astfel, dacă
Re<2300, fluxul este laminar, iar dacă Re>2300, fluxul este turbulent (Shapiro, 2003) (Serway &
Vuille, 2014). Curgerea laminară are loc în cazul eritrocitelor umane cu aspect elongat, orientate
uniform datorită focalizării hidrodinamice iar curgere turbulentă are loc în apropierea peretelui
tubului, unde celulele sunt deformate, iar deplasarea acestora este perturbată.
NR = dρv/η
unde, NR = numărul lui Reynolds (adimensional), d= diametrului fluxului [m], ρ (rho) =
densitatea fluidului [kg/m3], η (eta) = vâscozitatea fluidului [kg/m∙s], iar v= viteza medie a
fluidului pe direcția de curgere [m/s]. Figure 4 Camera de flux (Adaptare după Shapiro H.M.,
2003, Practical Flow Cytometry).

11
Fluxul celor două lichide este controlat de sistemele de presiune: un sistem de presiune ce
acționează asupra lichidului de antrenare și un sistem de presiune care reglează debitul din proba
de analizat. Dacă proba este injectată lent în centrul lichidului de antrenare (debit de 12 µl/mim,
de exemplu, analiza ADN) atunci diametrul regiunii centrale/ al probei este de aproximativ 20
µm, iar dacă proba este injectată rapid (debit de 60 µl/min, de exemplu, imunofenotipare)
diametrul regiunii centrale/ al probei poate ajunge la 60 µm. Acest aspect este important pentru
măsurătorile de ciclu celular când se dorește o înregistrare a datelor cu rezoluție crescută pentru a
caracteriza ploidia probei analizate. În afara rezervorului cu lichid de antrenare, citometrul în
flux este echipat cu un rezervor pentru îndepărtarea deșeurilor lichide, care trebuie să conțină o
soluție pe bază de clor pentru a preveni dezvoltarea fungilor sau a bacteriilor. Acest rezervor se
golește periodic, conform normelor privind îndepărtarea deșeurilor biologice pentru a preveni
contaminarea mediului (Longobardi Givan, 2001) (Sack et al., 2009).
Lichidul de antrenare și lichidul din probă sunt soluții izotonice în care solventul este apa.
De aceea pentru leucocite și pentru celulele mamaliene se utilizează soluții tampon saline . Dacă
suspensia celulară conține aglomerări/ flocoane vizibile, se recomandă filtrarea cu filtre care au
diametrul porilor de maxim 40 µm. Particulele cu dimensiuni cuprinse între 50 și 250 µm pot
bloca sistemul de aspirare sau orificiul duzei (lb. engl. nozzle) în cazul citometrelor cu funcție de
sortare. Citometrele în flux care au și funcție de sortare sunt restricționate de diametrul duzei prin
care va trece fluxul de curgere, cu valori între 50-100 µm (Longobardi Givan, 2001) (Ormerod,
2000).
1.4.4 Sistemul Optic
Sistemul optic are rolul de a ilumina proba, particulele marcate/ ne-marcate fluorescent și
de a detecta semnalele luminoase emise de probă, respectiv împrăștierea luminii și fluorescența
(fig.5). Iluminarea probelor se realizează cu o sursă laser, în timp ce fenomenul de împrăștiere a
luminii are loc la 180° și este definit ca forward scatter, precum și la 90°, side scatter, față de
sursa de lumină, iar ultima etapă mediate de sistemul optic este colectarea semnalului luminos,
care se realizează cu ajutorul oglinzi dicroice, filtre optice și fotofotodetectoare.

12

Figure5 Forward scatter (FSC) versus side scatter (SSC)
Împrăștierea luminii furnizează două tipuri de informații (fig. 5): direcția forward scatter
(FSC), lumina împrăștiată la unghiuri mici (0.5-5ș), oferă informații privind dimensiunea celulei,
însă este afectată și de alti factori precum indexul de refracție, în timp ce direcția side scatter
(SSC), lumina împrăștiată la unghiuri mari (15-150ș) oferă informații despre granularitatea
internă și rugozitatea suprafeței celulare. De asemenea, FSC poate fi utilizată pentru diferențierea
celulelor moarte de celulele vii iar SSC poate fi utilizată pentru diferențierea celulelor cu
granularitate ridicată de celulele cu conținut omogen.
După interacțiunea radiației laser cu o celulă și detectarea împrăștierii luminii pe ambele
direcția FSC, cât și SSC, care furnizează informațiile necesare, acesrea sunt corelate și permit
mai apoi identificarea populațiilor de celule dintr-o suspensie heterogenă. Pentru majoritatea
citometrelor în flux este necesară utilizarea unei mese antivibrație care să mențină sistemul optic
stabil, deoarece modificările în alinierea laserelor sau a detectoarelor pot conduce la achiziția
datelor eronate. Componentele unui sistem optic sunt reprezentate în fig. 6.
Citometrele în flux sunt echipate cu sisteme laser ca surse de lumină, iar sistemul optic
este compus din lentile care se focuseză și modelează fasciculul iluminat de aceste sisteme astfel
încât să poată oferi o zonă de iluminare optimă pentru fluxul de celule, iluminând fiecare celulă
individual. Radiația laser este monocromatică, polarizată, coerentă, intensă, destinată iluminării
unor particule de dimensiunimici ce trec cu viteză crescută prin dreptul ei. Punctul unde are loc
intersecția dintre fluxul de curgere și radiația laser poartă denumirea de punct de interogare .
Pentru înregistrarea optimă a radiației luminoase citometrele sunt dotate cu sisteme ce permit

13
formarea de raze laser eliptice (20/ 60 µm). De exemplu, o celulă ar putea trece nedetectată pe
lângă raza laser circulară cu diametrul de 20 µm , iar o rază laser circulară cu diametrul de 60 µm
ar putea aduce informația de la trei celule simultan, ceea ce nu este de dorit (Longobardi Givan,
2001) (Ormerod, 2000). Lumina iluminează ficare celulă sau particulă în punctul de observare
(analiză), ceea ce duce la difuzia fasciculului incident și emisia luminii fluorescente. Aceste
semnale variate (emise și fluorescente) sunt mai apoi colectate, colmatate și direcționate prin
filtrele aranjate apropiat, spre fotodetectori (Martin, Stevenson, & Jack, 2001)
Filtrele optice sunt utilizate pentru a detecta, separa și a selecta diferite semnale
fluorescente (albastru, verde, galben, portocaliu și roșu). Alegerea diferențiată a filtrelor, precum
și dispunerea lor, permite evaluarea simultană a mai multor parametri pentru fiecare celulă, chiar
dacă una dintre culori este mult mai strălucitoare decât celelalte (Martin et al., 2001).
În funcție de modul în care transmit semnalul luminos, filtrele utilizate sunt:

1) filtre optice de margine: short pass SP- transmit semnalul luminos cu lungime de undă scurtă
și blochează radiația cu lungime de undă mare (de exemplu, SP560 transmite semnalul luminos
sub 560 nm și blochează semnalul luminos peste 560 nm) și long pass LP- transmit semnalul
luminos cu lungime de undă lungă și blochează semnalul cu lungime de undă mică;
2) filtre optice band pass – transmit semnalul luminos dintr-o regiune spectrală sub formă de
bandă (un filtru optic band pass 530/30 va selecta lungimea de undă cuprinsă între 530 ± 15 nm;
va transmite semnalul luminos între 515 și 545 nm) Regiunea de 530 nm se numește regiunea
centrală a filtrului , iar ± 15 nm reprezintă fereastra filtrului .
3) filtre optice dicroice- (oglinzi dicroice/ divizoare de fascicul- lb. engl. dichroic mirrors/ beam
spliters) reflectă radiația luminoasă cu lungime de undă scurtă și transmit radiația luminoasă cu
lungime de undă mare (Longobardi Givan, 2001) (Ormerod, 2000).

14

Figure 6 Principalele componente ale Sistemului Optic O sursă laser ce emite la o lungine de
undă de 488 nm interacționează cu particulele/ celulele la nivelul punctului de interogare.
Radiația FSC este detectată de o fotodiodă (lb engl. photodiode, PD), iar radiația SSC este
detectată de un tub fotomultiplicator (lb engl. photomutiplier tube , PMT). Fluorescența este
detectată cu PMT și cu filtrele corespunzătoare. Oglinzile dicroice LP (lb engl. dichroic mirror ,
DM) permit trecerea radiației cu lungime de undă mai mare decât valoarea înscrisă și reflectă
radiația cu lungime de undă mai mică. LP, long pass (adaptare după (Telford, 2012).
Semnalul luminos emis de probă este recepționat de fotodetectoare ce pot fi fotodiode-
PD (recepționează semnalul FSC) sau tuburi fotomultiplicatoare-PMT (recepționează semnalul
SSC și fluorescența). Fotodetectoarele au rolul de a transforma semnalul luminos în semnal
electric, în timp ce tuburile fotomultiplicatoare amplifică semnalul la o rată de107 electroni/foton
incident. Fotodioda pentru direcția FSC prezintă în regiunea centrală o placă obturatoare (o bară
metalică) ce blochează trasmiterea radiației laser principale și permite numai înregistrarea
semnalului FSC. În fața fiecărui fotodetector este plasat un filtru pentru culoarea albastră, pentru
semnalele FSC și SSC, în timp ce unn PMT în asociere cu filtrul corespunzător este responsabil
de decția unei singure culori. De asemenea, pentru detectarea fluorescenței, în fața
fotomultiplicatoarelor sunt plasate filtre în ordinea crescătoare a lungimii de undă.
Fotodetectoarele nu pot identifica culoarea (lb. engl. color blind ), dar utilizarea filtrelor permite

15
recunoașterea culorii pe care o emite fiecare celulă marcată fluorescent. Astfel, există filtre
pentru culoarea verde, portocalie, roșie și așa mai departe. Unele citometre pot detecta până la 17
culori. Detectoarele pot avea diferite aranjamente: trigon, octogon sau zig-zag în funcție de
compania producătoare a citometrului în flux. Radiația luminoasă este direcționată la nivelul
detectoarelor de oglinzi dicroice , ce permit să treacă o anumită lungime de undă, iar o altă
lungime de undă este reflectată (Ormerod, 2000). De aici, semnalele luminoase sunt direcționate
către un preamplificator și mai apoi amplificate.
1.4.5 Sistemul electronic
Sistemul electronic (fig. 7) are rolul de a monitoriza și a controla operațiile citometrului
în flux, de a converti semnalele electronice (curent electric de intensitate mică) în date digitale/
numerice și explică rolul setării unor valori prag pentru efectuarea măsurătorilor. Pentru unele
instrumente care sunt echipate cu un element de sortare, sistemul electronic este de asemenea
capabil să inițializeze decizii de sortare pentru a încărca și a devia particule (Becton &
Dickinson, 2002). Intensitatea acestor semnale convertite este măsurată pe o scară relativă care
în mod obișnuit este setată fie la 256 sau 1.024 canale egale. Acești paramentri corelați sunt
acumulați, digitalizați și stocați pentru a fi preluați pentru analize ulterioare cu ajutorul unor
programe specifice.
Procesarea semnalului are loc prin intermediul fotodetectoarelor, care convertesc
semnalul luminos în semnal electric, amplitudinea semnalului electric fiind corelată cu
intensitatea semnalului luminos. Astfel, în momentul achiziției datelor, PMT exercită control
asupra voltajului, modificând tensiunea electrică aplicată fotomultiplicatorului (lb. engl.
voltage), iar apoi modifică amplitudinea intensității curentului electric după ce părăsește
fotomultiplicatorul (lb. engl. amplification gain ).

16

Figure 7 Sistemul electronic
Amplificarea poate fi de două tipuri, liniară (de exemplu, de la 0 la 1023 canale) sau
logaritmică (de exemplu, patru decade/ de la 1 la 10000 canale), iar un aspect important îl
constiuie factorul de amplificare. Amplificarea logaritmică liniară este, de obicei, utilizată pentru
măsurarea fluorescenței particulelor, această tehnică mărind scala în cazul semnalelor slabe și
comprimând-o în cazul semnalelor fluorescente puternice. Scala logaritmică are rolul de a
amplifica semnalele cu intensitate scăzută și de a comprima semnalele cu intensitate crescută. De
regulă semnalele pentru imunofenotipare se achiziționează pe scala logaritmică, iar cele pentru
analiza ADN (a ciclului celular) pe scala liniară. De asemnea, semnalele FSC și SSC pentru
celulele mamaliene se achiziționează pe scala liniară, iar cele de la bacterii și fitoplancton se
achiziționează pe scala logaritmică. Tot în momentul prelucrării semnalului electric se pot
corecta suprapunerile spectrale dintre două molecule fluorescente. Procedeul poartă denumirea
de compensare spectrală, fiind analizat în cadrul analizei fluorescenței (Longobardi Givan,
2001) (Ormerod, 2000).
Pentru efectuarea optimă a măsurătorilor, sistemul electronic oferă posibilitatea stabilirii
unei valori prag (fig.8) pentru a se înregistra numai celulele care au un semnal al intensității
luminoase adecvat, mai mare decât valoarea prag. De regulă valoarea prag este stabilită pentru
detectarea semnalului FSC. În acest mod vor fi îndepărtate din proba de analizat resturile
celulare și zgomotul electronic produs de aparat. Selectarea optimă a valorii prag este critică

17
deoarece o valoare prag prea mare poate conduce la îndepărtarea semnalului de interes în
momentul înregistrării probei (Longobardi Givan, 2001) (Ormerod, 2000) (Shapiro, 2003).

Figure 8 Valoarea Prag (Ormerod, 2000)
1.4.6 Achiziția și analiza datelor
Cea mai importantă parte a analizei datelor citometriei în flux constă în prezentarea
grafică
a acestora, care se realizează în funcție de aplicațiile protocolului experimental, precum și de
datele ce vor fi analizate. Cele mai utilizate modalități de reprezentare grafică a datelor sunt:
 histogramele (este reprezentat grafic un singur parametru)
– scala lineară- FSC/SSC versus cell
– scala log- Intensitatea fluorescenței (IF) versus cell counts
 diagramele prin puncte (sunt reprezentați grafic doi parametri)
– Dot plot
– Countour plot
– Density plot
 tomograma (sunt reprezentați garfic trei parametri)

Cele mai importante aspecte ale reprezentării grafice sunt selectarea unui tip de grafic și
menținerea sa de-a lungul analizei, notatarea axelor graficului astfel încât acesta să include cel
puțin reactivul măsurat, iar în cazul marcării cu anticorpi este necesară atât notarea specificitatea,
cât și a fluorocromului și de asemenea, indicarea numărului de evenimente expuse pe orice tip de

18
grafic. Achiziția datelor de citometrie în flux se realizează sub forma fișierelor flow cytometry
standard (FCS).

Primul pas pentru analiza datelor este schițarea histogramei (fig. 9) cu un singur
parametru, care ilustrează pe axa 0Y numărul de evenimente iar pe axa 0X intensitatea luminii
fluorescente. Astfel, integrarea zonelor de curbă oferă date privind numărul de celule definite în
limitele intensității fluorescente selectate, putând fi obținute nu numai coeficientul median de
variație, dar și decalajul distribuției. Intervalul de detecție al celulelor variază de la 100% celule
care exprimă un anumit antigen dat, până la 0.01% celule (o celulă din 10 000 de celule). !!!
Histogramele pot fi suprapuse pentru a se evalua diferențele între populații sau efectele unor
tratamente asupra unei populații celulare. De asemenea, în imunofenotipare prin histograme se
pot identifica populațiile negative (intensitate scăzută) și populațiile pozitive (intensitate
crescută) pentru un antigen de suprafață marcat fluorescent (de exemplu, CD3-FITC)
(Longobardi Givan, 2001) (Ormerod, 2000). Un exemplu îl constituie limfocitele din sângele
periferic care sunt un mix complex de subpopulații de celule care demonstrează combinarea
dintre celule negative și pozitive, definite de separarea liniei de bază. Cu toate acestea, este
posibilă și evaluarea celulelor care prezintă histograme de fluorescență suprapuse, însă
interpretarea datelor este mai complicată dar această problemă poate fi evitată prin alegerea
reactivilor corespunzători și strategiile de desemnare a porților. Prin această tehnică, populația Figure 9 Achiziția și analiza datelor

19
negativă oferă informații privind nivelul de legare nespecifică dintre reactivi și autofluorescența
celulară.
A doua etapă a analizării datelor implică o histogramă colorată în două culori, utilizate
pentru a codifica diferite frecvente ale evenimentelor, care poate fi expusă ca un punct, ca un
contur sau ca o densitate, reprezentând corelarea datelor provenite de la doi parametrii.
Diagramele prin puncte (lb. engl. dot plot) sunt reprezentări grafice ale intensității semnalului
luminos pe axele 0X și 0Y pentru doi parametri simultan, fiecare punct corespunzând unei
celule/particule analizate prin citometrie in flux. Uneori sunt denumite citograme . Analiza
cadranelor într-o diagramă prin puncte va permite identificarea populațiilor celulare pozitive
numai pentru un parametru, populații pozitive pentru ambii parametri sau negative pentru ambii
parametri (Longobardi Givan, 2001) (Ormerod, 2000).
Această metodă este utilizată mai ales pentru detectarea subpopulațiilor suspectate sau
ascunse în distribuția cu un singur parametru. Expunerea în două culori este recomandată în
citometria clinică în flux oricând este posibil (‘Clinical applications of flow cytometry:
Immunophenotyping of leukemic cells’, 1998) , fiecare generând patru imunofenotipuri diferite.
Trei reactivi, atunci când sunt utilizați simultan, creează opt imunofenotipuri diferite, în timp ce
o combinație de patru reactivi produc 16 subpopulații (2n subpopulații) (Martin et al., 2001) .
O analiză fenotipică detaliată poate determina alinierea și clonalitatea unei celule, cât și
gradul de diferențiere celulară și activare, însă aceasta este utilă și pentru diagnosticarea
diferențială sau în clarificarea tulburărilor limfoproliferative strâns legate (Martin et al., 2001) .
Variante ale diagramelor prin puncte ale histogramelor cu doi parametrii sunt diagramele
în funcție de densitatea populației (lb. engl. density plot ) și diagramele sub forma unor hărți (lb.
engl. contour plot ) în care intensitatea semnalului luminos este reprezentată sub forma de
contururi (Longobardi Givan, 2001) (Ormerod, 2000). Capacitatea de a urmări subpopulațiile de
celule codate după culoare în diferitele porțiuni bivariate este eficace pentru analiza utilizând
metoda citometriei în flux, corelarea informațiilor furnizate de cei doi parametrii permițând
diferențierea tipurilor celulare într-o populație celulară heterogenă.
Un aspect foarte important este faptul că toate programele software pentru conturare care
există pe piață nu operează egal, în același fel,astfel încât, pentru analiza evoluată a datelor se
utilizează chiar și inteligența artificială care interpretează populațiile de limfocite.

20

Datele pot fi analizate fie imediat după achiziție, fie ulterior, utilizând programe dedicate
de analiză. De asemenea, în cazul utilizării citometrelor digitale, este posibil să se realizeze
compensarea datelor după ce acestea au fost achiziționate (compensări off-line). Citometrele în
flux generează o cantitate mare de date, de aceea este de preferat să existe o modalitate de
stocare a acestor date (Ormerod, 2000).
Analiza datelor de citometrie se realizează utilizând regiunile și porțile. O regiune poate
fi definită ca un set de puncte atent selectate de către operator care delimitează o zonă pe un
grafic, însă pot fi definite pe același grafic mai multe regiuni care pot avea forme diferite.
Construirea unei regiuni permite izolarea clusterelor/ grupurilor/ populațiilor de interes în funcție
de profilul de expresie a unui marker (ilustrat într-o histogramă) sau a doi markeri distincți
(ilustrat într-un grafic bi-parametric).
Porțile (fig.10) reprezintă combinații de regiuni, utilizate pentru a delimita un subset de
particule sau populații pe un plot, astfel încât analiza să se focalizeze asupra parametrilor
specifici numai pentru acel subset de particule și asupra unui grup de evenimente definit prin
utilizarea succesivă a mai multor regiuni, în funcție de scopul urmărit. În mod frecvent, întreg
procedeul(lb. engl. gating strategy ) este cunoscut sub denumirea de strategie de selectarea
porților (Longobardi Givan, 2001) (Ormerod, 2000).
Figură 10 Formarea porții și corelarea a 2 parametrii

21
În funcție de scopul utilizării, există 3 tipuri de porți:
 Rectangulare- definirea unei regiuni
 Poligonale- definirea unei populații de interes
 Quadrat – utilizată în analizele cu mai multe culori pentru distingerea populațiilor
negative pentru un parametru, de cele positive pentru unul sau doi parametri.

1.5 Fluorescența

Fluorescența (fig.11) este proprietatea unor substanțe de a emite semnale luminoase atâta
timp cât absorb lumină sau se află sub influența altei forme de radiație electromagnetică (fig. 18).
După absorbția unui foton (a unei cuante de lumină-lumina albastră in fig. 18), un electron se
deplasează pe un nivel energetic superior, în stare excitată, pentru un interval foarte scurt. După
o scurtă perioadă de timp (absorbția fotonului 10-15 s, iar emisia 10-11– 10-14 s), electronul se
reîntoarce la nivelul energetic fundamental cu emiterea unei cuante de lumină( lumina verde în
fig. 18). Astfel, la interacția moleculelor cu un fascicul de radiații pot avea loc fenomene de
absorbție a radiației, ce constă în tranziția moleculelor din stare fundamentală în stare excitată și
emisia radiației. Prin acest fenome, moleculele aflate în stare excitată pot reveni la stări cu
energie mai mică prin emisie de energie: fenomene de fluorescență și fosforescență.

Figure 11 Fluorescența 2012, Hellen C. Ishikawa Ankerhold et al., Molecules
Natura radiației electromagnetice se bazează pe proprietățile de undă și pe proprietățile de
particulă. Din prima categorie fac parte lungimea de undă λ, notată cu litera grecească Lambada
și frecvența ν, notată cu litera grecească Nu, iar proprietățile de particulă se rezumă la fasciculul
de fotoni.

22

Lungimea de undă a radiației emise ( λ = 515 nm) este mai mare decât lungimea de undă a
radiației absorbite ( λ = 488 nm), în spectrul vizibil cele două lungimi de undă corespunzând
radiației de culoare verde și respectiv de culoare albastră (Sack et al., 2009) (Serway & Vuille,
2014).
Diferența dintre maximul lungimii de undă la emisie și maximul lungimii de undă la
absorbție(câțiva zeci de nm) a primit denumirea de deplasarea Stokes (lb. engl. Stokes shift –
fig.12). Această diferență este produsă de pierderea de energie din momentul deplasării
electronilor pe diferite niveluri de excitare, energia unui foton fiind invers proporțională cu
lungimea de undă:

𝐸 = ℎ𝜈 = ℎ𝑐
𝜆
unde, E = energia fotonilor, h = constanta lui Planck (6,626 ∙ 10-34 J∙s), ν = frecvența, c = viteza
luminii în vid (3 ∙ 108 m/s), λ = lungimea de undă (Shapiro, 2005).
Caracteristicile principale ale fluorescenței sunt randamentul cuantic (quantum yield, Φ)
și durata fluorescenței (fluorescence lifetime, τ). Rnadamentul cuantic reprezintă o măsură a
eficienței emisiei fluorocromului, fiind egal cu raportul dintre numărul de fotoni emiși și numărul
de fotoni absorbiți iar durata fluorescenței este durata medie de timp pe care un electron o
petrece în stare excitată înainte de a se reîntoarce la starea fundamentală.
În imunofenotipare se utilizează anticorpi monoclonali marcați fluorescent pentru
detectarea antigenelor celulare, moleculele fluorescente fiind cuplate cel mai adesea, cu
anticorpii. Spectrele de absorbție și emisie ale moleculelor fluorescente sunt foarte variate și Figure 12 Deplasarea Stokes

23
acoperă atât domeniul vizibil (400 – 700 nm), cât și o parte din spectrul ultraviolet sau infraroșu.
Preocuparea continuă a companiilor care construiesc citometre este de a crește performanța prin
creșterea numărului de parametri celulari identificabili concomitent (analiza multiparametrică).
Deoarece există constrângeri de natură tehnică care limitează numărul de lasere și de detectoare
care se pot insera în construcția unui citometru în flux, creșterea numărului de parametri
analizabili a fost posibilă prin utilizarea moleculelor fluorescente în tandem (de exemplu, PE-
Texas Red, PE-Cy5, PerCP-Cy5.5, APC-Cy7, tabelul 1). La baza funcționării moleculelor
tandem stă fenomenul de transfer de energie între molecule fluorescente/ tranfer de energie prin
rezonanță de tip Förster (lb. engl. Fluorescence resonance energy transfer/ Förster resonance
energy transfer/ FRET ) (Zlei & Mocanu, n.d.). FRET depinde de apropierea dintre cele două
molecule fluorescente (donor și acceptor), distanța optimă dintre dintre ele fiind mai mică de 10
nm. Astfel, molecula fluorescentă donor absoarbe lumina laserului și emite la o lungime de undă
care excită molecula acceptor; acesta va emite la rândul său un semnal fluorescent și doar această
ultimă emisie este înregistrată de citometru. Pe lângă avantajele utilizării moleculelor tandem,
există și dezavantaje: moleculele fluorescente au stabilitate redusă, iar după degradare are loc
decuplarea donorului de acceptor, generând artefacte (date fals pozitive sau fals negative) cu
impact negativ asupra rezultatelor investigațiilor (Shapiro, 2003).
1.5.1. Reactivii Fluorocromi

Anticorpii monoclonali marcați direct fluorescent sunt probele obișnuite utilizate în
clinică în citometria în flux, deoarece simplifică combinarea anticorpilor în analizele care
utilizează mai multe culori. În plus, colorarea indirectă se poate efectua în prima fază cu un
anticorp nemarcat, urmat de un anticorp secundar conjugat. Deoarece citometrul în flux utilizat
în clinică este echipat cu un singur laser de argon cu un fascicul de excitație de 488 nm,
fluorocromii selectați trebuie să fie compatibili, excitații de lumină la 488nm. Printre acești
fluorocromi se numără: fluoroscein izotiocianat (FITC), ficoeritrina (PE), propid de iod (PI), 7-
amino-actinomicin D (7AAD), proteina peridin-cloropfill-A (PerCP) și dimeri de oranj tiazol
(TOTO-1), însă recent s-au descoperit o serie de conjugați Alexa Fluor care au fost descriți ca
fiind mai luminoși, mai stabili și independenți de pH, comparativ cu FITC.
Utilizarea fluorocromilor care nu pot fi excitați la lungimea de undă de 488nm necesită
utilizarea unor lasere adiționale cu lungimi de undă corespunzătoare excitării, un astfel de

24
exemplu fiind utilizarea unui laser care furnizează lumină cromatică la o lungime de undă
superioară (neon heliu- HeNe), pentru o fluoro proteină, alloficocianină (APC). Mai mult decât
atât, un laser ultraviolet (helium cadmium) s-a dovedit a fi foarte folositor pentru detectarea
reactivilor indolici în decursul evaluării fluxului de calciu asociat cu activarea celulelor
coloranților ADN-ului, 4, 6-diamidino-2fenilindol (DAPI) și Hoechst.
De asemenea, o altă clasă de compuși fluorocromi face referire la conjugații în tandem, un
exemplu fiind combinarea PE cu cianina indodicarbonică (Cy5), sub denumirea PE-Cy5. Energia
emisă de către molecula PE este transferată sau cuplată cu molecula Cy5, legată covalent,
furnizând excitare pentru acest fluorocrom, care are fluorescența la o lungime de undă mai mare
(Shapiro, 2003).
Atunci când se utilizează doi sau mai mulți fluorocromi, trebuie luată în considerare
problema suprapunerii fluorescente, după cum se întâmplă atunci când emisia unui fluorocrom
intervine în detectarea celui de-al doilea fluorocrom. Semnalul indezirabil se datorează
suprapunerii spectrale și trebuie îndepărtat (compensat) obligatoriu. Această scădere poate fi
realizată direct în hardware, denumită compensare bazată pe scăderea electronică sau utilizând
un software adecvat (Martin et al., 2001).

25
CAPITOLUL 2 SISTEMUL IMUNITAR

Imunitatea este definită ca fiind rezistența la boli, în mod special rezistența la boli
infecțioase, astfel încât multitudinea de celule, țesuturi și molecule care mediază rezistența la
infecții se găsește sub denumirea de sistem imun. Acesta are rolul de a oferi apărare față de
infecția cu patogeni, iar reacția care se produce odată cu pătrunderea patogenilor în organism
este denumită răspuns imun. Cea mai importantă funcție fiziologică a sistemului imun este cea
de a preveni și de a eradica infecțiile și cea care are la bază patru acțiuni principale: de a
recunoaște agenții străini (sau non-self); de a elimina acești agenți prin diverse funcții efectoare,
una dintre ele fiind cea fagocitară; de a reglementa atenuarea răspunsului imun pentru a proteja
organismul împotriva daunelor colaterale și de a reține agenți de intruziune, astfel aceștia nu vor
fi capabili să provoace infecție din nou. (Nordenfelt, 2010).
În mod normal, sistemul de apărare al organismului gazdă care acoperă toate aceste
mecanisme este împărțit în două subgrupe, imunitatea înnăscută și imunitate dobândită. În timp
ce imunitatea înnăscută oferă protecție imediată împotriva invaziei microbiene și este prezentă în
toate organismele multicelulare, cea dobândită se dezvoltă mai încet, oferind o protecție
specializată împotriva infecțiilor și este specifică vertebratelor. Aceste două ramuri diferite ale
sistemului imunitar se completează și lucrează împreună pentru a-și îndeplini funcțiile (fig.13).
Imunitatea înnăscută (naturală sau nativă) este prezentă mereu la indivizii sănătoși, pregătită să
blocheze intrarea microbilor și să îi elimine în cazul în care reușesc să intre în țesuturile gazdă,
bazându-se pe identificarea unor modele mai conservate, prezente în majoritatea patogenilor.
Imunitatea dobândită (specifică) necesită extinderea și diferențierea limfocitelor ca răspuns la
agenții patogeni înainte de a putea oferi o apărare eficientă, bazându-se pe recunoașterea
modelelor specifice ale unei unei specii.

26

Figure 13 Sistemul imunitar înnăscut și dobândit
Un indiciu esențial asupra importanței sistemului imunitar în sănătatea organismului este
faptul că persoanele care prezintă răspunsuri imune deficitare sunt susceptibile la infecții grave,
care pot amenința viața individului. În schimb, un mod de a preîntâmpina această situație și de
protejare este vaccinarea, prin care se produce stimularea răspunsurilor imune împotriva
infecțiilor. În afară de această funcție esențială, sistemul imunitar împiedică creșterea anumitor
tumori (inclusiv cancer), participă la îndepărtarea celulelor moarte și la inițierea reparării
țesuturilor (tabel 2).
În contrast, răspunsurile imune anormale pot determina multe boli inflamatorii cu
morbiditate și mortalitate grave. Răspunsul imun este bariera majoră în calea transplantului de
organe, care este adesea utilizat pentru a trata insuficiențele organelor. Produsele celulelor imune
pot fi, de asemenea, de mare folos practic (anticorpii).

Tabel 2Rolurile sistemului imunitar
Rolul sistemului imunitar Implicațiile

Apărare împotriva infecțiilor Imunitatea deficitară determină
creșterea susceptibilității la infecții;
ex. SIDA

27
Vaccinarea stimulează răspunsul
imun și protejează împotriva
infecțiilor
Apărare împotriva tumorilor Potențial pentru imunoterapia
cancerului
Sistemul imunitar poate răni celule
și induce inflamații Răspunsurile imune sunt cauza
alergiilor, bolilor inflamatorii și
autoimune
S.I. recunoaște și răspunde la grefele
De țesut și proteinele introduse Răspunsurile imune reprezintă
bariere pentru transplant și terapia
genică

3.3 Sistemul Imunitar Înnăscut
Nevoia de apărare a organismelor împotriva altor factori externi a existat din totdeauana,
încă din Cambrian, acum 550 de milioane de ani în urmă, iar odată cu evoluția organismelor
multicelulare (plante, nevertebrate, vertebrate), acestea au trebuit să își dezvolte un sistem de
apărare propriu împotriva infecțiilor microbiene și pentru eliminarea celulelor lezate și repararea
în urma distrugerii țesuturilor (Abbas, Lichtman, & Pillai, 2016). Astfel, mecanismul filogenetic
de apărare care s-a dezvoltat prima dată a fost cel de imunitate înnăscută, numită și nativă sau
naturală, care este mereu prezent în organism, încă de la naștere, pregătit să recunoască și să
elimine microbii și celulele moarte.
Sistemul imunitar înnăscut constituie prima linie de apărare a organismului împotriva
infecțiilor, celulele și moleculele responsabile pentru imunitatea înnăsctă alcătuind acest sistem.
Sistemul imunitar înnăscut răspunde aproape imediat în fața microbilor și a celulelor rănite, însă
expunerile repetate invocă răspunsuri imune aproximativ identice (Abbas, Lichtman, & Pillai,
2018). Astfel, apărarea este asigurată de barierele epiteliale ale țesuturilor pielii și ale mucoaselor
și de celulele și antibioticele naturale prezente în epitelii, acestea având rolul de a bloca intrarea
agenților patogeni prin aceste bariere. În cazul în care aceștia încalcă epiteliul și intră în țesuturi

28
sau în circulație, sunt atacați de fagocite, limfocite specializate numite celule limfoide înnăscute,
care includ celule naturale ucigașe și câteva proteine plasmatice, inclusiv proteine ale sistemului
complementar. Toate aceste mecanisme de imunitate înnăscuta recunosc și reacționează în mod
specific împotriva microbilor, fiind capabile să distrugă majoritatea microbilor ce intră în
organism și să regleze sau chiar să oprească infecțiile (Abbas et al., 2016).
În concluzie, răspunsul imun înnăscut este capabil să combată microbii imediat după
infectare, în contrast cu răspunsul imunitar adaptiv, care trebuie să fie indus de antigen și, prin
urmare, este întârziat. De asemenea, răspunsul imun înnăscut modulează sistemul imunitar
adaptiv pentru a răspunde microbilor în moduri eficiente pentru combaterea microbilor (Abbas et
al., 2016).

3.3.1 Specificitatea răspunsului imun înnăscut

Sistemul imunitar înnăscut își îndeplinește rolul defensiv printr-un set mai restrâns de
reacții, care sunt mai limitate decât reacțiile variate și specializate ale sistemului imunitar
dobândit.
Astfel, specificitatea imunității înnăscute este, de asemenea, diferită din mai multe privințe față
de specificitatea limfocitelor, celulele de recunoaștere a antigenului în cadrul imunității
dobândite, în special datorită recunoașterii structurilor moleculare produse de patogenii
microbiali.
Principalele reacții ale sistemului imunitar înnăscut în fața patogenilor sunt inflamarea și
apărarea antivirală, prima reacție constând în acumularea și activarea leucocitelor și a proteinelor
plasmatice la locul infecțiilor sau a leziunilor tisulare. Aceste celule și proteine acționează
împreună pentru a ucide în principal microbii extracelulari și pentru a elimina țesuturile
deteriorate. Protecția imună înnăscută împotriva virușilor intracelulari este mediată de celulele
natural killer (NK-natural criminale), care ucid celulele infectate cu virus și de citokine specifice
numite interferoni de tip I, care blochează replicarea virală în celulele gazdă (Abbas et al., 2016).
Răspunsul imun dat de cele două sisteme diferă notabil și pune în evidență specificitatea
mult mai mare a imunității dobândite, întrucât la interacții repetate cu un microb sistemul
imunitar înnăscut oferă același răspuns imun. În același timp, răspunsurile sistemul imunitar
dobândit sunt mai puternice și mai eficiente la fiecare interacțiune succesivă cu agentul patogen,

29
ceea ce indică faptul că sistemul înnăscut nu prezintă o memorie a interacțiilor cu patogenii și se
resetează după de fiecare dată la valoarea inițială, nefiind capabil să își creeze o memorie
imunologică.
Sistemul imun înnăscut recunoaște strucuturi moleculare care sunt produse de patogeni
microbiali, substanțele microbiale care stimulează imunitatea înnăscută fiind aceleași la mai
multe clase de microbi, sub denumirea de modele moleculare asociate patogenilor (PAMPs).
Diferitele tipuri de microbi (de exemplu, virusuri, bacterii gram-negative, bacterii gram-pozitive,
ciuperci) exprimă PAMPs diferite, iar receptorii imunității înnăscute care recunosc aceste
structuri sunt denumiți receptori de recunoaștere a modelului . Cu toate că sistemul înnăscut
are specificitate la un număr limitat de molecule microbiene, mult mai mic decât numărul
aproape nelimitat de antigeni microbieni și non-microbieni recunoscuți de sistemul adaptiv,
fiecare componentă a imunității înnăscute poate recunoaște multe bacterii, viruși sau ciuperci
(fagocitele exprimă receptori pentru lipopolizaharidă-LPS) (Abbas et al., 2016).
Componentele imunității înnăscute au evoluat astfel încât pot recunoaște structurile
esențiale ale microorganismelor pentru supraviețuirea și infecțiozitatea lor, ceea ce face ca
aceasta să fie un mecanism de apărare eficient întrucât microorganismei nu pot evita răspunsul
imun prin mutații sau prin neexprimarea țintelor imunității înnăscute.
Sistemul imun înnăscut prezintă specificitate și pentru moleculele eliberate din celulele
lezate sau necrotice ale organismului gazdă, denumite modele moleculare asociate leziunilor
(DAMPs). Răspunsurile ulterioare față de DAMP servesc la eliminarea celulelor deteriorate și la
inițierea procesului de reparare a țesuturilor (Abbas et al., 2016). Tot în scopul menținerii
sănătății organismului, sistemul înnăscut nu are nici un răspuns imun la celulele și țesuturile
normale, sănătoase.
Receptorii sistemului imunitar înnăscut sunt codați de către gene moștenite (germline),
identice în toate celulele, ceea ce face ca receptori identici să fie exprimați pe toate celulele de un
tip (macrofagele). Prin urmare, multe celule responsabile de imunitatea înnăscută pot recunoaște
și răspunde la același agent patogen. Pe cealaltă parte, receptorii antigeni ai sistemului imunitar
adaptiv sunt codificați de gene formate prin rearanjarea somatică a segmentelor genetice în
timpul dezvoltării limfocitelor, rezultând receptori unici în fiecare clonă a limfocitelor B și T
(Abbas et al., 2016).

30
Astfel, diversitatea receptorilor sistemului imunitar înnăscut și domeniul de specificitate
al lor sunt mici comparativ cu cele ale celulelor B și T ale sistemului adaptiv, recunoașterea
imunității înnăscute fiind mediată de aproximativ 100 de receptori diferiți ce aparțin câtorva
familii de proteine, în timp ce sistemul imunitar adaptiv se bazează pe două familii de receptori
(Abbas et al., 2018).

3.3.2 Receptorii celulari pentru microorganisme și celule lezate

În cadrul sistemului înnăscut, foarte multe celule prezintă receptori de recunoaștere, fiind
capabile să participe în elaborarea răspunsului imun înnăscut. Acești receptori sunt exprimați
într-o varietate și într-un număr foarte mare atât pe suprafața fagocitelor, cu precădere pe
macrofage, cât și pe suprafața celulelor dendritice, contribuind la rolurile acestor celule. Astfel,
ajută fagocitele în a detecta microorganismei și celulele lezate și a le ingera și contribuie la rolul
celulelor dendritice de a reacționa la microorganisme, provocând inflamații și determinând
imunitate adaptivă ulterioară.
De asemenea, ei sunt exprimați și în diferite compartimente celulare: în endozomi, unde
produșii microbiali sunt ingerați, precum și în citosol, unde au rolul de a detecta microorganisme
citoplasmatici. Receptorii de recunoaștere sunt legați de căile de transducție a semnalului
intracelular, care activează diferite răspunsuri celulare, inclusiv producerea de molecule care
promovează inflamația și molecule care distrug microorganismei (Abbas et al., 2018).

 Receptori Toll-like

Receptorii Toll-like (TLRs), prezenți la suprafața celulelor și în endozomi, reprezintă
familia cea mai importantă de receptori de recunoaștere a modelelor, recunoscând o varietate
mare de liganzi, dintre care componentele pereților celulari bacterieni și acizi nucleici microbiali
(Blasius & Beutler, 2010).
Receptorii Toll-like sunt o familie de receptori conservați evolutiv, ce au fost descoperiți
ca fiind omologi cu o proteină a Drosophilei numită Toll, descoperită tocmai pentru rolul său în
dezvoltarea musculiței, ca mai apoi să se dovedească și rolul esențial în protejarea musculiței
împotriva infecțiilor. Diferiți TLRs sunt specifici pentru diferite componente ale

31

microorganismelor, în organismal uman fiind prezente 9 tipuri funcționale de TLRs, notați de la
TLR1 până la TLR9.
Acești receptori specifici pentru proteine, lipide și polizaharide microbiene sunt localizați
la suprafața celulelor, unde recunosc aceste componente ale microorganismelor extracelulare, iar
TLR-urile care recunosc acizi nucleici sunt localizați în endozom, unde microorganismei sunt
ingerați și digerați, fiind eliberați acizii nucleici (Abbas et al., 2016). Recunoașterea de către
TLR a liganzilor microbieni determină activarea mai multor căi de semnalizare (fig.14), ceea ce
duce la activarea factorilor de transcripție care stimulează expresia genelor care codifică
citokine, enzime și alte proteine, implicate în răspunsurile inflamatorii și antivirale (Kawai &
Akira, 2011) (Abbas et al., 2016).

 Receptorii NOD-like și Inflamazomul Figură 14 Funcțiile de semnalizare ale receptorilor tip Toll. TLR-urile
activează mecanisme de semnalizare, care implică proteine adaptor și conduc
la activarea factorilor de transcripție. Acești factori de transcripție stimulează
prducția de proteine care mediază inflamația și apărarea antivirală

32
Receptorii NOD-like (NLRs) sunt o familie mare, de peste 20 de proteine citosolice
diferite, care recunosc PAMPs și DAMPs din citosol și recrutează alte proteine pentru a forma
complexe de semnalizare care promovează inflamarea. Receptori tipici au în alcătuire un
domeniu repetitiv C-terminal bogat în leucină, care semnalizează prezența ligandului, un
domeniu NOD central (domeniu nucleotidic de oligomerizare), necesar pentru ca proteinele NLR
să se lege unele de altele pentru a forma oligomeri și un domeniu efector N-terminal, care
recrutează proteine pentru a forma complexele de semnalizare. Sunt cunoscute trei subfamilii
NLR care servesc sistemul imunitar înnăscut, fiecare utilizând un domeniu efector diferit pentru
a iniția semnalizarea, acestea fiind NOD-1, NOD-2 și NLRP-3 (Chen, Shaw, Kim, & Nuñez,
2009).
NOD-1 și NOD-2 sunt protein citosolice ce prezintă domenii N-terminal CARD (asociate
caspazelor), acestea fiind specifice peptidoglicanilor bacterieni, care sunt componente comune
ale pereților bacterieni. NLRP-3 (familia de receptori asemănători NOD) este un receptor NLR
citosolic cu un domeniu de pirină N-terminal care răspunde atât la structuri microbiene
independente, cât și la modificări patologice din citosol, reacționând prin creșterea producerii Figură 15 Inflamazomul: activarea inflamazomului NLRP-3, care
determină activarea IL-1. Sinteza pro-IL-1p este indusă de diferite
PAMP sau DAMP-uri prin semnalizarea receptorului de recunoa ștere
a tiparului. Producerea ulterioară a IL- 1 biologic activă este mediată
de către inflammasomul. Inflammasomul constă din mai multe
molecule de NLRP-3, o proteină adaptoare și caspaza-1

33
citokinei inflamatoare IL-1β. De asemenea, NLRP-3 recunoaște microorganismei și substanțele
care indică lezarea celulelor și necroza, dintre acestea făcând parte și adenozina și forma inactive
a caspazei-1 și determină activarea acesteia. Caspaza-1 activă scindează o formă precursoare a
interleukinei-1β (IL-1β) pentru a genera IL-1β biologic activ, care induce inflamații acute și
provoacă febra (Abbas et al., 2016).
Acest complex citosolic multiproteic format din NLRP-3, care funcționează drept senzor,
o proteină adaptoare și caspaza-1 este cunoscut sub denumirea de inflamazom, însă pot exista
inflamazomuri activate de caspaza-1 care conțin și alte proteine senzor, în afară de NLRP3.
Inflamazomul(fig.15) se formează în urma prezenței în citosol a PAMP și DAMP, funcția
sa fiind de a genera forme active ale citokinelor inflamatoare IL-1β and IL-18, care sunt apoi
eliberate din celule și determină răspunsuri inflamatorii. Astfel, inflamazomul este important nu
numai pentru apărarea organismului gazdă, dar și datorită rolului său în mai multe boli, mutațiile
funcției NLRP-3 putând cauza sindroame autoinflamatorii rare, caracterizate prin inflamații
necontrolate. Inflamazomul mai poate contribui și la formarea aterosclerozei și a diabetului tip 2,
asociat obezității.

3.3.3 Componente ale sistemului imun

Celulele sistemului imun înnăscut au rolul de baiere în calea infecțiilor, detectînd
microorganismele și celulele lezate de la nivelul țesuturilot și îndeplinesc funcții esențiale pentru
apărarea împotriva microorganismelor. O parte din aceste celule exprimă diferiți receptori de
recunoaștere, discutați anterior, iar după recunoașterea PAMP și DAMP, celulele răspund prin
producerea de citokine inflamatorii și proteine antivirale, în timp ce alte celule ucid microbii și
celulele infectate.
Mai mult decât atât, unele dintre celulele imunății înnăscute sunt esențiale pentru stimularea
răspunsurilor imune adaptive (Abbas et al., 2018).
Astfel, dintre componentele sistemului înnăscut fac parte: celulele epiteliale, celule de
pază din țesuturi (macrofage, celule dendritice, celule mast ș.a), celulele limfoide înnăscute
(celule NK) și câteva proteine plasmatice (Abbas et al., 2016).

34
 Celulele epiteliale
Celulele epiteliale formează epitelii continue ce protejează organismul de lumea externă
și care asigură bariere fizice și chimice împotriva infecțiilor. Microorganismele pot intra în
organismele gazdă prin piele și prin mucoasele ce protejează tractul gastrointestinal, respirator și
genitourinar prin contact fizic, ingerare sau inhalare. Astfel, toate aceste portale sunt căptușite cu
epitelii continue, alcătuite din celule care formează joncțiuni strânse între ele, care prezintă
numeroase funcții, dintre care formarea unei bariere împotriva trecerii agenților patogeni
(fig.16). De asemenea, keratina de la suprafața pielii și mucusul secretat de celulele epiteliale
mucoase împiedică microorganismele să prolifereze și să producă infecția epiteliilor (Abbas et
al., 2016).
Celulele epiteliale produc, de asemenea, compuși antibiotici peptidici, denumiți defensin
și catelicidin, care formează o barieră chimică împotriva infecțiilor, omorând bacteriile. Mai mult
decât atât, epiteliile conțin limfocite din linia de celule T denumite limfocite T intraepiteliale dar
care exprimă receptori de antigen cu o diversitate limitată.

 Fagocitele Figură 16 Funcțiie epiteliului în imunitatea înnăscută Epiteliile prezente la portalurile de
intrare a microorganismelor asigură bariere fizice formate de keratină (în piele) sau
mucus secretat (în gastro-intestinale, bronhopulmonare și sistemele genitourinare) și prin
jonțiuni strânse între celulele epiteliale. Epiteliile produc, de asemenea substanțe
antimicrobiene (de exemplu, defensine) și porturi limfocitare care ucid microorganismele
și celulele infectate

35

Odată ce microorganismele încalcă bariera epitelială și intră în organism, celulele
fagocitare care prezintă funcții specializate fagocitare (în principal macrofagele și neutrofilele)
reprezintă prima linie de apărare.
Neutrofilele și monocitele reprezintă cele două tipuri de fagocite circulante din sânge care
sunt selectate la locul infecției pentru a recunoaște și pentru a ingera microbii, cu scopul de a-i
omorî intracelular. Neutrofilele, denumite leucocite polimorfonucleare (PMN), sunt primele
tipuri celulare care răspund infecțiilor, în special celor cu bacterii și fungi, și astfel sunt cele mai
numeroase leucocite prezente în sânge. Mai mult decât atât, ca răspuns în fața infecțiilor,
producția de neutrofile de la nivelul măduvii osoase crește rapid. Acestea ingeră microbii din
circulație și intră rapid în țesuturile extravasculare de la locurile de infecție, unde fac și
fagocitoză și distrug microbii (Abbas et al., 2016).
În contrast, monocitele sunt mai puțin abundente în sânge decât neutrofilele. De
asemenea, ele ingerează microbii în sânge și țesuturi, iar în timpul reacțiilor inflamatorii
monocitele ies în țesuturi extravasculare și se diferențiază în celule denumite macrofage care
supraviețuiesc o perioadă mai mare (Abbas et al., 2016).
Figură 17 Activarea și funcționarea macrofagelor
În răspunsurile imune înnăscute, se activează macrofagele prin produse microbiene care se
leagă la TLR-uri și prin citokine, cum ar fi interferonul-y derivat din celula NK (IFN-y), care
conduc la producerea de proteine care mediază funcțiile inflamatorii și microbicide ale acestor
celule. Receptorii complement ai suprafeței celulare promovează fagocitoza microbilor acoperi ți
cu complement, precum și activarea receptorilor macrofage.

36
În cadrul apărării gazdei, macrofagele au roluri importante întru cât ele ingeră și distrug
microorganismele, produc citokine care determină și reglează inflamația și mai apoi îndepărtează
țesuturile moarte și inițiază procesul de reparae al țesuturilor (fig.17).

 Celulele dendritice

Celulele dendritice (DC) detectează rapid și eficient agenții patogeni datorită localizării
în țesuturi și datorită faptului că exprimă numeroși receptori de recunoaștere pentru PAMP și
DAMP. Celulele dendritice răspund acestor microorganisme producând citokinele, care prezintă
două funcții: inițiază inflamația și stimulează răspunsul imun adaptive. Astfel, prin detectarea
microbilor și interacția cu limfocite, mai ales cu celulele T, celulele dendritice reprezintă legătura
dintre sistemul imun înnăscut și cel dobândit (Abbas et al., 2018).

 Mastocitele

Mastocitele își au originea în celulele progenitoare ale măduvei osoase, sunt prezente în
piele și în mucoasa epitelială și secretă citokine proinflamaorii și mediatori lipidici
(prostaglandine) care stimulează inflamarea. În citoplasma acestor celule sunt prezente granule
abundente, care conțin mediatori preformați, care sunt eliberați odată cu activarea celulelor.
Aceste granule conțin amine vasoactive (histamine) care provoacă vasodilatarea și creșterea
permeabilității capilare, citokine proinflamatorii, precum și enzime proteolitice care fie pot să
omoare bacteriile, fie pot inactive toxinele microbiale.
Mastocitele pot fi activate atât prin legarea produșilor microbiali la TLR, ca parte a
producerii răspunsului imun înnăsut, cât și printr-un mecanism special dependent de anticorpi.
Importanța acestor celule este dată de faptul că determină apărarea împotriva helminților
și a altor patogeni responsabili de simptome provocate de alergii (Abbas et al., 2016).

 Celule Limfoide Înnăscute

Celulele limfoide înnăscute sunt celule derivate din măduva osoasă cu morfologie de
limfocite, care produc citokine și a care au funcții similare cu limfocitele T, dar nu prezintă

37
receptori antigenici ai celulelor T (TCR). Aceste celule au fost împărțite în trei grupuri majore,
având la bază citokinele secretate. Aceste grupuri, numite ILC1, ILC2 și ILC3 produc citokine
diferite, care determină mai apoi rolul pe care îl au celulele în apărare și exprimă factori de
transcriere diferiți. ILC-urile determină apărarea timpurie împotriva infecțiilor și de asemenea,
ghidează răspunsul celulelor T (Abbas et al., 2018).

Celule Natural Killer (NK)

Aceste celule, considerate primele ILC descoperite, sunt celule citotoxice care joacă un
rol important în răspunsurile imune înnăscute, majoritar împotriva virusurilor și a bacteriilor
intracelulare. Celulele NK recunosc celulele infectate și cele care se află sub stress iar rolul lor
principal efector este de a răspunde prin uciderea acestor celule prin secreția citokinei IFN-γ,
care activează macrofagele pentru a distruge microbii fagocitați (fig.18).
Celulele NK conțin granule citomplasmatice abundente care prezintă proteine care
mediază ditrugerea celulelor țintă, dar care nu prezintă imunoglobuline sau recepori ai celulelor
T, dar nici receptori antigenici ai limfocitelor B sau T. Atunci când celulele NK sunt activate,
exocitoza granulară eliberează aceste proteine adiacente celulelor țintă. Perforina, proteină
Figură 18 Funcțiile celulelor NK. A. celulele NK ucid celulele gazdă
infectate cu celule intracelulare microbii, eliminând astfel rezervoarele
de infecție. B.celulele NK răspund la interleukina-12 (IL-12) produsă
prin macrofage și secrete interferon-γ (IFN-y),care activează
macrofagele pentru a ucide fagocitozele microbi.
Uciderea celulelor
infectate
Uciderea
microorganismelor
fagocitate Macroface cu
microorganisme
fagocitate Celule infectate
cu virusuri

38
granulară a celulelor NK, facilitează introducerea altor proteine granulate, denumite granzime,
în citozolul celulelor țintă. Granzimele sunt enzime proteolitice care inițiază o secvență de
evenimente de semnalizare care determină moartea celulelor țintă prin apoptoză. Prin uciderea
celulelor infectate cu virusuri și bacterii intracelulare, celulele NK elimină sursele de infecție
(Lanier, 2005).
Activarea celulelor NK este determinată de un echilibru între implicarea receptorilot
activatori și inhibitori. Receptorii activatori care recunosc moleculele de suprafață celulară
exprimate pe celule infectate cu virusuri și bacterii intracelulare, precum și celulele stresate prin
leziuni ADN, permit celulelor NK să elimine aceste celulele infectate. Unul dintre cei mai
studiați receptori de activare este NKG2D, care recunoaște moleculele asemănătoare proteinelor
complexului de histocompatibilitate majoră (MHC) de clasa I și care sunt exprimate ca răspuns
la diferite tipuri de stress celular. Receptorii care provoacă inhibarea celulelor NK prin blocarea
semnalizării prin activarea receptorilor sunt specifici pentru molecule MHC de clasă I, care sunt
exprimate pe toate celulele nucleate sănătoase. Prin urmare, expresia MHC de clasa I protejează
celulele sănătoase de distrugerea celulelor NK (Abbas et al., 2016)

 Sistemul complement

Sistemul complement este reprezentat de o colecție de proteine circulante, precum
Și asociate membranelor, cu importanță deosebită în apărarea împotriva microbilor. Multe dintre
proteinele complement sunt enzime proteolitice, avtivarea complementului implicând activarea
secvențială a acestor enzime. Cascada de reacții a complementului poate fi activată prin trei căi.
Calea alternative, component a imunității înnăscute, este declanșată când unele dintre
proteinele complement sunt activate pe suprafețe microbiene și nu pot fi controlate, deoarece
proteinele de reglare a complementului nu sunt prezente pe microbi (dar sunt prezente pe celulele
gazdă).
Calea clasică este declanșată cel mai adesea prin anticorpi care se leagă de microbi sau
de alte antigene și face parte, prin urmare, din imunitatea adaptivă.
Calea lectinei este activată atunci când o proteină plasmatică de legare a carbohidraților
lectina de legare a manozei (MBL), se leagă de terminațiile reziduurilor de manoză pe suprafața

39
glicoproteică a microbilor. Această lectină activează proteinele căii clasice, însă deoarece este
inițiată de un produs microbian în absență de anticorpi, este o componentă a imunității înnăscute.
Proteinele complement activate funcționează ca enzime proteolitice pentru a scinda alte
protein complement.
Sistemul de complementare servește trei principale funcții în apărarea gazdei:
opsonizarea și fagocitoza, inflamația și liza celulară. Opsonizarea constă în procesul de acoperire
a unui microorganism cu molecule care sunt recunoscute de receptorii de pe fagocite. Acești
microbii care sunt acoperiti cu proteinele complement sunt ingerați rapid și distruși de fagocite.

 Citokinele

Ca răspuns la microorganisme, celulele dendritice, macrofagele, celulele mastocite și alte
celule secreta citokinele care mediază cele mai multe dintre reacțiile celulare ale imunității
înnăscute.
De asemenea, citokinele sunt proteine solubile care mediază reacțiile imune și inflamatorii și
sunt responsabile de comunicarea între leucocite și între leucocite și alte celule. Majoritatea
celulelor definite ca fiind citokine sunt denumite interleukine, prin convenție, ceea ce implică
faptul că aceste molecule sunt produse de leucocite și acționează asupra leucocitelor.
În imunitatea înnăscută, principalele surse de citokine sunt celulele mastocite, celulele
dendritice și macrofagele activate prin recunoașterea microorganismelor, deși celulele epiteliale
și alte tipuri de celule secretă, de asemenea, citokine. Recunoașterea componentelor bacteriene,
cum ar fi LPS sau a moleculelelor virale, cum ar fi dsARN prin TLR și alți senzori microbieni
reprezintă un stimul puternic pentru secreția de citokine prin macrofage și celule dendritice. În
imunitatea dobândită, limfocitele T helper sunt o importantă sursă de citokine.
Ca răspuns la un stimul extern citokinele sunt secretate în cantități reduse și se leagă de
receptori cu înaltă afinitate de pe suprafața celulelor țintă. Cele mai multe citokine acționează
asupra celulelor care le produc (acțiuni autocrine) sau pe celulele adiacente (acțiuni paracrine). În
reacțiile imunitare înnăscute împotriva infecțiilor, pot fi activate suficiente celule dendritice și
macrofage încât să se producă cantități mari de citokine, care pot fi active la distanță de locul lor
de secreție (acțiuni endocrine).

40
Citokinele imunității innascute servesc diferite funcții în apărarea gazdei, factorul de
necroză tumorală (TNF), interleukina-1 (IL-1) și chemokinele fiind principalele citokine
implicate în recrutarea neutrofilele și monocitele sanguine la locurile unde au loc infecțiile.

3.3.4 Reacțiile imune înnăscute

Sistemul imunitar înnăscut are rolul de a elimina microorganismele prin elaborarea unui
răspuns acut inflamator și prin mecanisme de apărare antivirale. Diferiți agenți patogeni pot
provoca diferite tipuri de reacții imunitare înnăscute, fiecare dintre acestea fiind deosebit de
eficient în eliminarea tipului specific de microorganism. Astfel, principalele răspunsuri imune
înnăscute pentru protecția organismului în fața a diferite microorganisme sunt:
 Bacteriile și ciupercile extracelulare sunt respinse în principal de răspunsul inflamator
acut, în care neutrofilele și monocitele sunt atribuite la locul infectării și prin sistemul
complementar;
 Bacteriile intracelulare, care pot supraviețui în interiorul fagocitelor, sunt eliminate prin
fagocite, care sunt activate de receptorii Toll-like și de alți senzori, precum și de citokine;
 Apărarea împotriva virusurilor este asigurată de interferoni de tip I și de celule NK
(Abbas et al., 2016).

3.3.4.1 Inflamarea
Metoda principală prin care sistemul imun înnăscut se ocupă de infecții și leziuni tisulare
este prin stimularea inflamației acute, care reprezintă acumularea de leucocite, proteine
plasmatice și lichid derivat din sânge într-o zonă de țesut extravascular ce prezintă infecția sau
vătămarea.
Scopul este cel a încerca limitarea răspândirii infecției prin coagularea sângelui și apoi recrutarea
moleculelor și celulelor efectoare pentru omorârea microorganismelor. Inițierea inflamației are
loc prin mastocite și macrofagele tisulare, care, la infectare, eliberează citokine și chemokine
(fig.19). Aceasta declanșează un răspuns din partea celulelor endoteliale ducând la dilatarea
vaselor sanvine și scurgerea vasculară a proteinelor plasmatice în locul infectării (Nordenfelt,
2010).

41

Figură19 Răspunsul inflamator acut Citokinele și alți mediatori sunt produși de macrofage,
celulele dendritice, mastocitele și alte celule din țesuturi ca răspuns la produsele microbiene și
la celulele gazdă deteriorate. Acești mediatori măresc permeabilitatea vaselor de sânge,
conducând la intrarea proteinelor plasmatice în țesuturi și mișcarea leucocitelor din sânge în
țesuturi, unde distrug microorganismele și celulele deteriorate și promovează mai multe
inflamații și reparații
Procesul inflamației este urmat de selectarea acestor celule și circulația proteinelor
plasmatice prin vasele de sânge, precum și activarea acestora în țesuturile extravasculare, cu
scopul de a-și exercita funcțiile efectoare prin care omoară microorganismele și încep repararea
țesutului lezat. Eliminarea inițială a histaminelor, a substanței P și a altor mediatori de către
celulele mast și de către macrofage determină creșterea fluxului sanguin local, separarea
proteinelor plasmatice și declanșarea terminațiilor nervoase. Toate acestea provoacă roșeață,
eliberare de căldură, umflare și durere, acestea fiind caracteristicile inflamației. Aceasta este
deseori urmată de o acumulare locală în țesut a fagocitelor, de cele mai multe ori neutrofile, ca
răspuns pentru citokine. Fagocitele activate cuprind microorganismele și materialele moarte și
distrug aceste substanțe potențial nocive (Abbas et al., 2016).
Prima etapă în producerea inflamației este migrarea fagocitelor la locurile de infecție și
leziune tisulară (fi.20). În această etapă neutrofilele și monocitele migrează la locurile
extravasculare ale infecției prin legarea la moleculele venoase de adeziune endotelială și ca
răspuns la chemoattractanții produși de celulele țesutului care reacționează la infecție sau leziuni.
Eliminarea microbilor, a
țesuturilor moarte.
Sursă de mediatori
Complement: mediază
inflamarea, elimină
microorg. Surse de mediatori
(histamine, citokine,
prostglandine ) Mastocite ; Cel.Dendrite; Macrofage
Leucocite Polimorfo nucleare
Macrofage
Monocite Proteine plasmatice

42
Migrarea leucocitelor din sânge în țesuturi este un proces în mai multe etape în care
interacțiunile adezive slabe inițiale ale leucocitelor cu celule endoteliale sunt urmate de o
adeziune fermă și apoi de transmigrare prin endoteliu. Dacă un microorganism infecțios trece
printr-un epiteliu și intră în țesutul subepitelial, celulele dendritice reziduale, macrofagele și alte
celule recunosc microorganismele și răspund prin producerea de citokine. Două dintre aceste
citokine, TNF și IL-1, acționează asupra endoteliului venos, în apropierea locului de infectare și
inițiază procesele de migrare leucocitară în țesuturi (Abbas et al., 2016).
A doua etapă în cadrul inflamațiilor constă în în fagocitoza și distrugerea
microorganismelor, realizată prin intermediul neutrofilelor și macrofagelor care ingerează
microorganismele, realizând fagocitoza și apoi îi distrug în vezicule intracelulare.
Astfel, fagocitoza constă în procesul de ingerare a particulelor cu dimensiuni mai mari de 0.5 μm
diametru, care are loc odată cu legarea microorganismelor la receptorii membranari care au fost
anterior descriși. După ce are loc alipirea microorganismului la celulă, membrana plasmatică
fagocitară se extinde astfel încât să cuprindă particula și apoi se închide, internalizând
microorganismul într-o veziculă legată de membrană, denumită fagozom. Acesta mai apoi
fuzionează cu lizozomul, formând fagoligozomul, unde actionează o serie de enzime anterior
activate. Enzimele activate catalizează producerea mai multor substanțe toxice pentru
microorganism, în timp ce un al treilea set de enzime descompune proteinele microorganismelor.
Mai mult decât uciderea intracelulară, neutrofilele utilizează mecanisme adiționale pentru
distrugerea microorganismelor, eliberând granule microbicide în spațiul extracelular.
În tot acest proces neutrofile mor, eliberându-și conținutul nuclear pentru a forma rețele de
cromatină numitele capcane extracelulare neutrofile (NET), care conțin substanțe
antimicrobiene. Aceste rețele NET rețin bacteriile și ciupercile și ucid organismele, eliberând
enzimele și ROS, care pot răni gazd, acesta fiind motivul pentru care deși inflamațiile sunt un
răspund de protecție la infecții, acestea pot provoca leziuni tisulare (Abbas et al., 2016).

43

Figură 20 Migrarea leucocitelor la locul de infecție. Macrofagele, celulele dendritice și alte
celule care au întâlnit microorganismele produc citokine, cum ar fi factorul de necroză (TNF) și
interleukina-1 (IL-1) care activează celulele endoteliale ale venelor din apropiere pentru a
exprima selectine și liganzi pentru integrine și pentru a secreta chemokine. Selectinele mediază
legarea slabă a neutrofilelelor pe endoteliu, integrinele mediază aderența fermă a neutrofilelor,
iar chemokinele activează neutrofilele și stimulează migrarea lor prin endoteliu la locul infecției

3.3.4.2 Protecția antivirală

Un tip special de răspuns elaborat de gazde este părarea împotriva virușilor, implicând
interferonii, celulele NK și alte mecanisme. Interferonii de tip I inhibă replicarea virală și induc o
stare antivirală, în care celulele devin rezistente la infecții. Tipul I IFN-uri include mai multe
forme de IFN-α și o formă de IFN-β, este secretat de mai multe tipuri de celule infectate cu
viruși.
Atunci când tipul I de IFN-urile de tip I, secretate din celulele dendritice sau alte celule infecatte,
se leagă la receptorii specifici pentru IFN, căile de semnalizare sunt activate și inhibă replicarea
virală și provoacă distrugerea genomurilor virale. De asemenea, celulele infectate de virusuri mai
pot fi distruse de către celulele NK (Abbas et al., 2016) .

Fibrină și
fibronectină Macrofage stimulate
de microrg. Rostogolire Integrina activată
de chemoki ne Adeziune
stabilă Migrare prin
endoteliu

44
3.4 Imunodeficiența
Integritatea sistemului imun este stă la baza apărării împotriva agenților patogeni și a
produselor lor toxice, așadar este esențială pentru supraviețuirea individului. Defectele de la
nivelul uneia sau a mai multor componente, precum și ale funcțiilor sistemului imunitar
determină creșterea sensibilității la virusuri și duc la multiple tulburări, care pot fi fatale. Toate
aceste defecte sunt grupate sub denumirea de imunodeficiențe și sunt împărțite în două grupuri.
Prima categorie este cea a imunodeficiențelor congenitale, rezultate din anomalii genetice
ale componentelor sistemului, ce duc la o sensibilitate crescută la infecții, manifestată frecvent în
primii ani de viață și în copilărie, dar uneori este detectată mai târziu în viață. A doua categorie
este cea a imunodeficiențelor dobândite, care rezultă ca o consecință a mai multor condiții, cum
ar fi infecțiile (HIV, SIDA), malnutriția sau tratamentul cu medicamente imunosupresoare care
provoacă funcționarea inadecvată a componentelor sistemului imunitar.
Pe lângă creșterea susceptibilității la infecții, pacienții care suferă de imunodeficiențe
sunt de asemenea predispuși anumitor tipuri de cancer, care cel mai adesea sunt cauzate de
virusuri oncogenetice, cele mai cunoscute exemple fiind virusul Epstein Barr (EBV) și virusul
Papilloma umană (HPV) (Abbas et al., 2018).
În mod paradoxal, anumite imunodeficiențe sunt asociate cu o creștere a autoimunității,
aceasta fiind observată în general atunci când se produce atenuarea unui anumit mecanism de
reglare, datorită unei mutații hipomorfice cauzată de pierderea incompletă a unei populații sau a
unei funcții imune.
Defectele care provoacă imunodeficiențele pot avea loc atât la nivelul dezvoltării sau
activării limfocitelor, cât și în mecanismele efectoare ale imunității înnăscute și adaptive.
Deoarece sunt implicate componente diferite ale sistemului imunitar, bolile de imunodeficiență
sunt clinic și patologic eterogene (Abbas et al., 2018).

3.4.1 Imunodeficiențele primare (congenitale)
Aceste imunodeficiențe sunt cauzate de defecte genetice care duc la determinarea unor
blocaje în maturare sau în cadrul funcționării diferitelor componente ale sistemului imunitar, ale
sistemului imunitar înnăscut, precum și în dezvoltarea și răspunsul limfocitelor.

45
A fost estimat că unul dintre 500 de indivizi chestionați în SUA și Eurpoa suferă de
imunodeficiență congenitală cu severitate variabilă. Aceste imunodeficiențe prezintă câteva
proprietăți, dintre acestea făcând parte capacitatea de a dezvolta complicațiile infecțioase,
precum și varietatea mare a manifestărilor clinice și patologice. Din această cauză, unele
diagnostice sunt ușor de determinat utilizând citometria în flux a celulelor imune, măsurarea
nivelelor imunoglobulinelor serice (Ig) sau evaluând funcționarea neutrofilelor în vitro, în timp
ce pentru alte diagnostice este necesară examinarea amănunțită (Parvaneh, Casanova,
Notarangelo, & Conley, 2013) (Abbas et al., 2016).

3.4.2 Defecte ale Imunității Înnăscute
Imunitatea înnăscută prezintă două componente importante, care nu numai că formează
prima linie de apărare împotriva organismelor infecțioase, dar care participă și în faza efectoare a
imunității dobândite. Aceste două componente sunt fagocitele și sistemul complement,
deficiențele congenitale ale acestora ducând la producerea infecțiilor recurente (tabel 3). Dintre
aceste deficiențe vom studia în continuare tulburările fagocitare congenitale, deficiențele
celulelor NK, precum și defectele genetice în căile mediate de receptorii Toll-like (TLR) și în
calea interleukin-12 (IL-12)/ interferon-γ (IFN-γ). Cele mai commune tulburări determinate de
defectele fagocitare sunt infecțiile pielii și a tractului respirator cu bacterii sau fungi, abscese
profunde și stomatite orale (Abbas et al., 2018).
Tabel 3Tulburăi congenitale ale imunității înnăscute
Tulburări Deficiențe Funcționale Mecanisme ale
defectelor

Boala cronică granulomatoasă Producerea defectivă a speciilor
de oxigen reactive de către
fagocite; infecții recesive
intracelulare bacteriale și fungice Mutații ale genelor ce
codifică proteine ale
complexului fagocitic
oxidază, phox-91
Deficitul de aderare al leucocitelor
de tip 1 Aderarea deficitară a leucocitelor
la celulele endoteliale și migrarea Mutații ale genelor ce
codifică lanțul β (CD18) al

46
în țesuturi; infecții recesive
bacteriene și fungice integrinelor β2
Deficitul de aderare al leucocitelor
de tip 2 Migrarea și flotarea defectuoasă în
țesuturi legată de expresia scăzută
sau absentă a liganzilor
leucocitelor pentru selecteinele
endoteliale E și P, determinând
eșecul migrării leucocitelor în
țesuturi; infecții recesive
bacteriene și fungice Mutații în gena care
codificătransportorul-1
GDP-fucoza, necesar
pentru transportul de
fucoză în Golgi și
încorporarea lor în sialil
Lewis X

Deficitul de aderare al leucocitelor
de tip 3 Defecte ale aderenței și migrării
leucocitelor în țesuturi asociate
activării defective a integrinelor
chemokin-stimulate Mutații la nivelul
KINDLIN-3, o proteinaă
citoscheletică aoiată cu
activarea integrină

Sindromul Chédiak-Higashi Defecte ale fuziunii veziculelor și
ale funcționării lizozomale în
neutrofile, macrofage, celule
dendritice, celule NK, celule T
citotoxice; infecții recurente cu
bacterii piogenice Mutația la nivelul LYST
ce duc la alterarea
exocitozei granulelor
secretoare și a funcției
lizozomale

Deficiențe ale celulelor NK Celule NK deficiente sau absente Mutații la nivelul genei
codificatoare a factorului
de transcripție GATA-2
Defecte ale semnalizării receptorilor
Toll-like Infecții recurente cauzate de
defectele de semnalizare ale TLR Mutații la TLR3, TRIF,
TBK1, NEMO, UNC93B,

47
și CD40 și producerea defectuoasă
de interferon tip I
MyD88, IκBα și alterarea
activării NF-κB în aval de
TLR
Boli ale sensibilității mendeliene la
microbacterii Boli severe cauzate de
micobacterii nontuberculoase din
mediu, BCG și altele bacteriile
intercelulare Mutații la nivelul IL-
12p40, IL-12RB,
IFNGR1, IFNGR2,
STAT1, NEMO și ISG15

2.2.2.1 . Acticvitatea microbicidă defectivă a fagocitelor
Boala cronică granulomatoasă (CGD) este cauzată de mutații ale genelor care codifică
subunitățile enzimei fagocit oxidază, care catalizează producerea de specii reactive de oxigen
microbicid în lizozom. În urma acestei mutații a producerii defectuoase a speciilor reactive de
oxigen, neutrofilele și macrofagele nu mai posedă capacitatea de a omorî microorganismele pe
care le-au fagocitat, în special bacterii și fungi (Yazdani & McGhee, 2011). În această situație,
sistemul imun încearcă să compenseze prin aducerea mai multor macrofage și prin activarea
celulelor T, care stimulează recrutarea și activarea fagocitelor. Astfel, are loc acumularea
macrofagelor activate în jurul focarului de infecție al microorganismelor intracelulare, însă
aceștia nu pot fi ditruși efficient. Această acumulare a fagocitelor seamănă cu granuloamele, de
unde și vine denumirea bolii (Abbas et al., 2016).
Această boală este destul de rară, afectând aproximativ un individ din 200.000 de pe
teritoriul SUA, dintre care două treimi este reprezentată de forma X-linkată, cauzată de mutații
ale unei subunități a enzimei fagocite oxidază care este codificată de o genă situată pe
cromozomul X. Pacienții prezintă abscese și infecții recurente și severe cu fungi și bacterii
intracelulare (Staphylococcus), care implică în special plămânii, ganglionii limfatici cutanat și
ficatul, începând din copilărie (Yazdani & McGhee, 2011). Infecția invazivă cu ciuperca
Aspergillus este principala cauză a decesului.

2.2.2.2 . Deficitul de aderare leucocitar

48
Deficitul de aderare al leucocitelor este reprezentat de un grup de tulburări autozomale
recesive cauzat de mutații în genele codificatoare ale integrinelor, care sunt molecule necesare
pentru exprimarea liganzilor pentru selectină sau mutații ale moleculelor de semnalizare necesare
pentru a activa integrinele. Integrinele și liganzii selectinei sunt implicați în adeziunea
leucocitelor la alte celule. Ca urmare a acestor mutații, leucocitele din sânge nu au posibilitatea
de a se leaga ferm la endoteliul vascular și tot leucocitele, în special neutrofilele, nu sunt
recrutate în mod normal la locurile de infecție. Aceste deficiențe au ca rezultat incapacitatea de a
forma puroi și apariția parodontitei acute, precum și a altor infecții recidivante care apar relativ
devreme în viață. De asemenea, aceste deficiențe de adeziune ale leucocitelor sunt provovate de
mutații în gene diferite, astfel se cunosc trei tipuri diefrite ale acestei deficiențe (Abbas et al.,
2018) (Abbas et al., 2016).
Deficitul de aderare al leucocitelor tip 1 (LAD-1) este o tulburare recesivă autozomală
rară, caracterizată prin infecții bacteriene și fungice recidivante și prin vindecarea insuficientă a
rănilor. De asemenea, pacienții suferind de această boală pot prezenta întârzierea separării
cordonului ombilical și leucocitoză, iar majoritatea funcțiilor dependente de adeziune ale
leucocitelor sunt defecte (aderența la endoteliu, agregarea neutrofilelor și chemotaxia, fagocitoza
și citotoxicitatea mediate de neutrofile, cellule NK și limfocite T).
Deficitul de aderara al leucocitelor tip 2 (LAD-2) este, de asemenea, o tulburare rară în
care copii nu numai că prezintă infecții recurente și leucocitoza, așa cum se produce în cazul
LAD-1, dar aceștia suferă și de o întârziere severă la nivel mental și la nivelul creșterii.
Deficitul de aderare al leucocitelor tip 3 (LAD-3) este prezent la pacienții care suferă de
infecții repetate și de separarea întârziată a cordonului umbilical, asemănător LAD-1, însă aceștia
prezintă și tulburări de sângerare grave, care necesită transfuzii de sânge din cauza agregării
defectuoase a trombocitelor, cu toate că numărul trombocitelor sanguine este normal (Abbas et
al., 2018).

2.2.2.3 Defecte la nivelul celulelor NK și a fagocitelor
Răspândirea acestei deficiențe este destul de mică, numărul pacienților care suferă de un
nivel scăzut de celule NK este destul de mic, datorită mutațiilor autozomale dominate în gena
care codifică factorul de transcripție GATA-2. Astfel, pierderea activității factorului de
transcripție GATA-2 are ca rezultat scăderea populațiilor precursoare din măduva osoasă, ceea

49
ce duce la o pierdere a celulelor NK, precum și la scăderea numărului monocitelor, a celulelor
dendritice și a celulelor B. Pacienții prezintă infecții severe cu virusuri, în special din familia de
herpesvirusuri și papilomavirusuri.
Sindromul Chédiak-Higashi este o tulburare autozomală recesivă în care granulele
lizozomale ale leucocitelor nu funcționează normal, ceea ce afectează fagocitoza și celulele NK
și manifestă și o sensibilitate crescută la infecțiile bacteriene.
Pacienții suferind de această imunodeficiență prezintă neutrofile, monocite și limfocite ce
conțin lizozomi foarte mari, această manifestare fiind cauzată de mutații ale genei codificatoare a
proteinei LYST, care reglementează traficul intracelular de lizozomi. Mutațiile conduc la
fuziunea defectuoasă a fagosomelizomilor în neutrofile și macrofage (determinând rezistență
redusă la infecție), precum și la formarea defectuoasă a melanozomilor în melanocite (provocând
albinismul) și la anomalii lizozomale în celulele sistemului nervos (provocând defecte nervoase),
iar la nivelul trombocitelor provoacă tulburări ale sângerării. De asemenea, unii dintre precursorii
neutrofilelor mor prematur, ducând la leucopenie moderată. Neutrofile care supraviețuiesc pot
conține niveluri reduse ale enzimelor lizozomale care funcționează în mod normal în uciderea
microbiană, însă aceste celule sunt deficiente în chemotaxie și fagocitoză, astfel contribuind la
activitatea microbicidă deficitară (Abbas et al., 2016).

2.2.2.4 Defectele moștenite în căile TLR, factorul nuclear-κB: Semnalizarea și
interferonii de tip I
Frecvența acestor deficiențe este foarte mică, foarte puțini pacienți fiind descriși ca
suferind de aceste boli moștenite. Mutațiile afectează receptorii Toll-like (TLR) sau căile de
semnalizare în aval de TLR-uri, inclusiv moleculele necesare pentru activarea factorului de
transcripție nuclear κΒ (NF-κB). În mod surprinzător, aceste mutații determină sensibilitatea
pacienților la un număr limitat de infecții. De exemplu, mutațiile care afectează MyD88, o
proteină adaptor situată în aval de multe TLR-uri, sunt asociate cu pneumonii severe bacteriene
(cel mai adesea pneumococice), iar mutațiile care afectează TLR3 sunt asociate cu encefalita
herpesvirus recurentă, însă nu sunt determinate alte infecții virale. Aceste fenotipuri clinice
destul de limitate sugerează o redundanță considerabilă în mecanismele de apărare ale gazdei,
astfel încât defectele unei căi pot fi compensate de alte căi, iar pacienții nu sunt susceptibili la o
mare varietate de infecții (Abbas et al., 2016) .

50
Unele deficiențe imune sunt cauzate de defecte care afectează în mod specific activarea
NF-kB. Mutațiile punctuale în inhibitorul κB kinazei γ (IKKγ), contribuie la afecțiunea recesivă
X-linkată, cunoscută dub denumirea de displazie ectodermică anhidrotică cu imunodeficiență
(EDA-ID). Acești pacienți suferă de infecții cu bacterii piogenice încapsulate, precum și cu
agenți patogeni intracelulari bacterieni, dintre care micobacterii, virusuri și ciuperci, cum ar fi
Pneumocystis jiroveci (Bogaert, Dullaers, & Lambrecht, 2016).

2.2.2.5 Defecte ale căii IL-12/IFN-γ
Celulele dendritice și macrofage secretă IL-12, iar semnalizarea receptorului IL-12 (IL-12R)
stimulează sinteza IFN-γ de către celulele T helper, celulele T citotoxice și celule. Mutațiile în
genele care codifică IL-12p40, lanțul IL-12Rβ1 și ambele lanțuri ale receptorul IFN-γ duc la
sensibilitatea la speciile de Mycobacterium (adesea numite micobacterii atipice), cum ar fi
Mycobacterium avium, Mycobacterium kansasii și Mycobacterium fortuitum, pemtru aceste
tulburări utilizându-se termenul de susceptibilitate mendeliană la boli micobacteriană (MSMD)
(Casanova, 2015).
2.2.2.6 Tratamentul Imunodeficiențelor Congenitale
Tratamentul imunodeficiențelor primare variază în funcție de boală, însă cel mai utilizat
tratament este cel al transpantului de celule stem hematopietice. Acest procedeu presupune
potrivirea perfectă dintre donor și beneficiar, astfel încât să nu se dezvolte boli grave între grefă
versus gazdă. Cu toate că tratamentul ideal pentru rezolvarea tuturor imunodeficiențelor
congenitale este reprezentat de înlocuirea genei defecte, acest lucru rămâne un obiectiv greu de
atins, întru cât deși terapia cu gene a fost realizată la pacienții cu SCID X-linkat, acești pacienți
au dezvoltat consecutiv leucemia celulelor T (Fischer, Hacein-Bey Abina, Touzot, & Cavazzana,
2015).

51
CAPITOLUL 3 STUDIUL FAGOCITOZEI REALIZATĂ DE CĂTRE
NEUTROFILE PRIN CITOMETRIE ÎN FLUX

Fagocitoza microorganismelor sau a resturilor celulare constutie principala funcție a
leucocitelor polimorfonucleare (PMN). Fagocitele dețin un arsenal de enzime pentru proteoliză și
producerea de specii reactive de oxigen (ROS) (2). Ingerarea microorganismelor activează
NADPH oxidaza care produce NADP +, ion de superoxid (O2 -) și peroxid de hidrogen (H 2O2).
Ulterior, mieloperoxidaza transformă aceste specii în radicali hidroxil (OH) și hipoclorit (ClO-).
Aceste ROS nou produse sunt foarte eficiente în uciderea și digestia particulelor ingerate,
inclusiv bacterii și fungi (activitate microbicidă). Disfuncții moștenite ale oxidazei NADPH sau
mai rar ale mieloperoxidazei sunt responsabile de deficiențe ale producerii ROS și acumulării de
particule fagocitate care duc la boala granulomatoasă cronică (CGD). Activitatea microbicidă
poate fi măsurată prin capacitatea celulelor de a produce ROS pentru diagnosticul CGD.
Scopul studiul a fost analiza activității bactericide a granulocitelor prin citometrie în
flux.
Obiectiv: Determinarea cantitativă cu ajutorul citometriei în flux a exploziei oxidative /
stresului oxidativ a granulocitelor după stimulare cu E. coli.

3.1.1. Probe de sânge
Studiul a fost efectuat la Departamentul Botanică Microbiologie pe două probe de sânge
colectat de la 1 voluntar sănătos. Sânge venos, a fost prelevat pe heparină, și testat în 12 ore de la
prelevare.
3.1.2. Măsurarea activității bactericide a granulocitelor cu ajutorul citometriei în flux
Analiza exploziei oxidative a granulocitelor a fost efectuată cu ajutorul kitului de reactivi
FagoFlowEx Kit, (Cat. No. ED7042, EXBIO, Praga, Republica Cehă), ce conține liofilizat
standardizat de Eschericha coli , DHR123 în formă liofilizată, Phorbol 12-myristate 13-acetate
(PMA) în formă liofilizată, cu rol de control de stimulare și soluție de liză (formaldehidă și
metanol) ready-to-use . Dintre materialele necesare care nu se regăsesc în kit fac parte:
 Tuburi de testare adecvate de 5 ml pentru colorarea sângelui (e.g. 12 × 75 mm);

52
 Apă ultrapură demineralizată;
 Pipete automate;
 Vârfuri de unică folosință specifice pentru pipetele utilizate;
 Vortex;
 Termostat care să permite incubarea tuburilor de testat la 37 °C;

Principiul analizei exploziei oxidative / stresului oxidativ
Acest test se bazează pe măsurarea stresului oxidativ al neutrofilelor granulocitare, după
ce au fost stimulate cu bacteria E. coli. În timpul fagocitozei compușilor microbieni, fagocitele
specializate ale sistemului imunitar înnăscut își măresc consumul de oxigen prin activitatea unei
NADPH-oxidaze care generează un anion superoxid (O2-) și peroxid de hidrogen (H 2O2).
Aceștia generează alte specii reactive de oxigen, cu puternică activitate antimicrobiană și care
pot de asemenea provoca leziuni prin distrugerea țesuturilor adiacente.
În cursul procesului de ingestie a bacteriei, fagocitele activează oxidaza NADPH,
producând reactivi oxidativi intermediari. Ionii hipoclorit rezultați intracelular oxidează puternic
DHR123 (dihidrorodamină 123) la rodamină fluorescentă123, care este detectată de citometrul în
flux. În cazul deficienței de mieloperoxidază, DHR123 este oxidat cu o intensitate mult mai mică
de către alți produși de oxidare, rezultând o fluorescentă de mai mică intensitate a granulocitelor
stimulate. O probă de control pozitiv este stimulată utilizând PMA (Forbol 12-miristat 13-acetat)
care activează exploxia respiratorie a granulocitelor fără aderarea sau ingestia de
microorganisme.
Stimularea celulelor și marcarea s-a realizat într-o singură etapă, la 37 ⁰C timp de 20
minute, urmată de fixare și liza eritrocitelor conform intrucțiunilor producătorului. De asemenea,
probele colorate au fost analizate conform timpului precizat și la mai puțin de 2 ore după liză.

Preparare reactivi
 Reconsituirea bacteriei E.coli lipofilizată utilizând 250 µl de apă demineralizată.
Volumul neutilizat din suspensie este depozitat la 2-8 C până la 24 de ore. O altă variantă

53
ar fi ca suspensia să fie aliquotată, înghețată și depozitată la < -20 ⁰C pentru o utilizare
ulterioară. Se evită însă repetarea ciclurilor de îngheț/dezgheț.
 S-a reconstituit DHR123 lipolizat utilizând 650 µL de apă demineralizată și se agită ușor,
fără vortexare. Volumul neutilizat de reactiv se depozitează la 2-8 ⁰C până la 8 ore.
Alternativ, suspensia poate fi aliquotată, înghețată și depozitată la < 20 ⁰C pentru o
utilizare ulterioară. Soluția DHR123 înghețată se utilizează în maxim 14 zile. Depozitarea
recativului înghețat poate cauza o descreștere a Indexului de Stimulare de până la 20%.
 Reconstituirea Controlului de Stimulare lipofilizat (PMA) s-a realizat utilizând 250
microl de apă demineralizată, volumul neutilizat trebuie depozitat, de asemenea la 2-8 C,
până la 24 de ore sau poate fi aliqotat, înghețat și depozitat la < -20 ⁰C pentru o utilizare
ulterioară. A se evita repetarea ciclurilor de îngheț/dezgheț.
 Soluția de liză se utilizează ca atare.

Procedura de analiză
Se prepară tuburile pentru controlul negativ și pozitiv și pentru proba de analizat stimulată cu
E.coli astfel (fig. 21 ):
1) În tuburile destinate pentru:
 Stimularea probei: se adaugă 10 microl de suspensie E.coli
 Controlul negativ: nu se adaugă nimic
 Controlul pozitiv: se adaugă 10 microl de Control de stimulare (PMA)
2) Se adaugă 50microl de sânge heparinizat în toate tuburile și se vortexează ușor.
3) Se adaugă 10microl de DHR123 în toate tuburile și se vortexează ușor.
4) Se incubează tuburile la 37 C pentru 20 de minute în baia de apă sau pentru 30 de minute
în incubatorul de aer.
5) Se adaugă 50 microl de Soluție de Liză în toate tuburile, se vortexează ușor li se
incubează pentru 5-10 minute la temperatura camerei.
6) Se adaugă 1ml de apă demineralizată în toate tuburile, se vortexează ușor și se incubează
la temperatura camerei până ce eritrocitele sunt lizate.

54

Figure 21 Reprezentarea schematică a procedurii de analiză a activității microbicide a granulocitelor prin citometrie în flux
Probele au fost analizate cu ajutorul citometrului în flux Accuri C6 plus (IVD, 4 culori)
folosind programul BD Accuri C6 plus (BD, Bioscience, SUA). Citometrul în flux a fost calibrat
anterior utilizând microsfere de calibrare marcate fluorescent pentru a asigura o sensibilitate
stabile a detectorilor. Mediana intensității fluorescenței (MdIF) R123 a fost măsurată în canalul
pentru FITC, pe 5000 PMN selectate pe forward-scatter (FSC) versus side-scatter (SSC). Analiza
de date s-a realizat cu ajutorul programului de analiză BD Accuri C6 plus (BD, Bioscience,
SUA). Un exemplu de modalitate de analiză a datelor este prezentat în figura nr. 22.

55

Figure 22 Exemplu de analiza de date

Valori normale ale activității microbicide:
o Procentul granulocitelor cu activitate microbicidă (explozie oxidativă): 90-100%;
o Index de stimulare a activității microbicide (explozie oxidativă) a granulocitelor > 30.
Rezultate anormale , datorate defectelor de explozie respiratorie pot fi datorate:
1) Index de stimulare a activității microbicide (explozie oxidativă) a granulocitelor < 30.:
i) Dacă granulocitele prezintă o activitate microbicidă scăzută după stimularea lor atât
cu E. coli, cât și cu PMA, aceasta poate indica o deficiența a mieloperoxidazei
(MPO). Indicele de stimulare este redus la aproximativ 1/10 din valoarea normală
(fig.23).

56

Figure 23 Pacient cu deficiență a mieloperoxidazei (SI = 8.2)
(http://www.exbio.cz/soubor.py?idf=FIL000000000002535 )
ii) Dacă granulocitele nu prezintă activititate microbicidă (explozie respiratorie) sub
acțiune stimulatorie a E. coli, cât și cu PMA, acest lucru poate indica boala cronică
granulomatous (CGD). Indicele de stimulare depinde de mutația mai multor gene
codificatoare pentru complexului NADPH oxidază. Dacă granulocitele stimulate ale
unei paciente de sex feminin prezintă două subpopulații care diferă în ceea ce privește
activitatea microbicidă acest lucru poate indica un defect în gena X-linkată. În acest
caz, o parte din granulocite prezintă intensitate standard, iar a doua parte prezintă
intensitatea scăzută a exploziei respiratorii (fig.24).

Figure 24 Pacient de sex masculine stânga) cu boală granulomatoasă cronică și mama acestuia (dreapta) ce poartă o
mutație X-likantă a genei pentru NADPH oxidază. Pacientul de sex masculin a avut SI = 13.6. Mama a prezentat
două subpopulații de grnulocite diferite în privința indecelui de stimulare: SI scăzut:13.9, SI ridicat SI 125

57

iii) Rareori, activitatea scăzută a glucozo-6-fosfat dehidrogenazei (G6PD) care produce
NADPH, poate provoca, de asemenea, o explozie respiratorie scăzută a
granulocitelor.
Dacă controlul pozitiv stimulat de PMA este pozitiv și proba testată, stimulată cu E.coli
este negativă, este probabil ca proba testată să conțină anticoagulant EDTA sau citrat. O altă
explicație poate fi faptul că pacientul prezintă un defect în procesul de aderare sau ingestie al
fagocitozei.
Un număr relativ scăzut de granulocite pozitive poate indica faptul că eșantionul de
sânge este mai vechi sau depozitat necorespunzător, deoarece un procent mare de granulocite
deteriorate se acumulează în timp.
Detectarea rezultatelor anormale descrise mai sus indică numai suspiciunea de boală, fiind
necesară confirmarea prin efectuarea mai multor teste. Deficitul de MPO poate fi evidențiat prin
colorarea intracelulară a granulocitelor utilizând anticorpi monoclonali cu specificitate față de
MPO (de exemplu, clona CLBMPO-1/1, cat. Nr. 1F-635-T100). Defectele oxidazei NADPH
(CGD) și G6PD trebuie confirmate prin analize genetice.
Fluorescența Rodaminei123, produsă de oxidarea DHR123, a fost detectată în canalul
FITC (525 nm). Deoarece Rodamina123 este eliberată foarte rapid din granulocite, probele
trebuie măsurate cât de repede posibil (la maxim 2 ore după ce s-a produs liza). Astfel,
activitatea microbicidă este legată de producerea de specii reactive de oxigen (ROS) care pot fi
măsurate prin citometrie în flux cu ajutorul Rodaminei 123 (R123) (figura nr.).

58

Figure 25 Reprezentarea schematică a analizei activității microbicide prin citometrie în flux

3.2. Rezultate și discuții
Deficiențele funcționale ale fagocitozei sunt asociate cu o sensibilitate crescută la infecții.
Citometria în flux permite măsurători rapide ale celulelor aflate în suspensie, în mod individual
una câte una. După colorarea cu unul sau mai mulți fluorocromi se pot efectua examinări
funcționale ale procesului complex de fagocitoză. Tehnicile de citometrie au fost utilizate de
peste două decenii pentru evaluarea deficiențelor funcționale ale fagocitozei, acest studiu a
urmărit cuantificarea prin citometrie în flux a neutrofilelor și a stresului oxidativ.
Neutrofilele prezintă capacitatea de a fagocita particule non-self, precum bacterii și fungi.
În procesul de fagocitoză, ținta este internalizată într-un fagozom și în cele din urmă distrusă de
mediul fagozomal ostil. Studiul fagocitozei este important pentru înțelegerea modului în care
neutrofilele interacționează cu diferiți agenți patogeni și cum răspund la diferiți stimuli.
Diagnosticul CDG se bazează prin metoda citometriei în flux : neutrofilele se marchează cu
dihidro-rodamina (DHR), un fluorocrom, și se activează cu forbol-miristat-acetat . După
explozia oxidativă, DHR redusă emite fluorescență, înregistrată de citometru. Neutrofilele
pacienților CGD nu se activează și emit fluorescență mai slabă decât neutrofilele normale.
Activitatea fagocitară a granulocitelor a fost determinată prin analiza probelor marcate
utilizând citometrul în flux, acumulându-se cel puțin 5000 leucocite per probă. Vizualizarea
datelor măsurate din proba stimulată, din controlul pozitiv și negativ s-a realizat utilizând
programul de software specific aparatului, comparativ între side-scatter (SSC) și forward-scatter

59
(FSC) în puncte ( dot-plot). Într-o primă etapă, am setat poarta în jurul granulocitelor, după cum
apare în fig. 26 Ingerarea bacteriei influențează poziția granulocitelor în diagramele SSC-FSC
prin puncte ( dot-plot). Din acest motiv, este recomandat să se seteze porțile pentru fiecare probă
de sânge individual. Următorul pas parcurs este aducerea granulocitelor selectate în poartă în
histograme, după cum am procedat în figurile 28 29, 30, unde axa X reprezintă intensitatea
fluorescentă din canalul FITC (FL1).
Selectarea neutrofilelor PMN s-a realizat pe baza caracteristicilor de granularitate și
mărime (diagrama în puncte FSC / SSC).

Figure 26 Selecția granulocitelor PMN pe forward scatter versus side scatter sânge total lizat (voluntar sănătos)

Apoi s-a stabilit porțile corespunzătoare pentru a calcula procentul granulocitelor pozitive
și negative și intensitatea medianei de fluorescență (MdIF) a lor. Granulocitele stimulate care
generează o explozie oxidantă prezintă nivele ridicate ale fluorescenței (Rodaminei 123).
Activitatea microbicidă indusă a putut fi detectată și cuantificată cu ușurintă după
stimularea cu PMA (figura 27 centru) sau E. coli (figura 27 dreapta) și comparată cu proba
nestimulată (figura 27 stânga) pe populația de granulocite. Suspensia de E. coli a stimulat
activitatea microbicidă a granulocitelor (MdIF), prin comparatie cu cu granulocitele nestimulate:
tabel nr. 4 si figura 28) dar la nivele mai scăzute decât activarea realizată de PMA (table 5, figura
29).

60

Figure 27 Histograme ale fluorescenței granulocitelor PMN nestimulate (stânga), și stimulate sub acțiunea PMA (centru) sau E.
coli (dreapta) la un donor sănătos. Stimularea E. coli produce un răspuns heterogen prin comprație cu stimularea PMA.

Table 4 Analiza activității microbicide: MdIF, % celule fluorescente, index de marcare (SI)
MdIF % celule
fluorescente SI
Control negativ 423 0,6
Control pozitiv: PMA 101276 99,64 239,4232
Proba de analizat: E. coli 26626 99,4 62,94563

Figure 28 Histograme ale fluorescenței granulocitelor PMN nestimulate

61

Figure 29 Histograme ale fluorescenței granulocitelor PMN stimulate sub acțiunea PMA

Table 5 Analiza activității microbicide: MdIF, % celule fluorescente, index de marcare (SI)
MdIF % celule
fluorescente SI
Control negativ 343 0
Control pozitiv: PMA 196768 95,7 573,667
Proba de analizat: E. coli 83492 93,2 243,41

Figure 30 Histograme ale fluorescenței granulocitelor PMN stimulate sub
acțiunea E. coli la un donor sănătos. Stimularea E. coli produce un răspuns
heterogen prin comprație cu stimularea PMA.

62
Parametrii care fost utilizati pentru a indica deficiențe ale fagocitozei prin stres oxidativ
au fost:
a) Procentul de granulocite pozitive care au generat stres oxidativ după stimularea cu E. coli
b) Indicele de stimulare (index de marcare = SI) care reprezintă raportul MdIF dintre
granulocitele ale probei stimulate de E.coli și granulocitele nestimulate (control negativ).
Indicele de stimulare este utilizat pentru comparația aproximativă a intensității stresului oxidativ
între probele de sânge. Indicele de stimulare poate varia în diferite laboratoare și instrumente.
Rezultatele analizei celor două probe de sânge de la un donor sănătos nu au indicat
deficiențe ale fagocitozei.
Activitatea microbicidă a granulocitelor este alterată în deficiențe precum CGD, MPO și
G6PD, aceste tulburări prevenind acumularea unui mediul oxidativ, prin urmare fagocitele nu
sunt capabile să distrugă eficient patogenii intracelulari sau pe cei extracelulari ingerați.
Pacienții cu deficiențe ale răspunsului imunitar sunt detectați inițial clinic, prin studierea
istoricului infecțiilor recidivate. Astfel, agentul infecțios specific responsabil de producerea
infecțiilor constituie un indiciu pentru deficiențe . Deficiențele sistemului imunitar înnăscut sunt
reprezentate în special de disfuncții ale complementului sau acivității microbicide și determină o
scădere a mecanismelor de apărare împotriva infecțiilor.
Unele dintre cele mai comune defecte genetice ale sistemului imunitar înnăscut vizează
activitățile facocitare ale granulocitelor neutrofile, monocitelor și ale macrofagelor: deficiența de
mieloperoxidază (MPO), afecțiunea cronică granulomatoasă (CGD) și deficiențe ale glucoz-6-
fosfat dehidrogenazei (G6PD). Toate aceste deficiențe conduc la o infecții cronică cu patogeni
rezistenți la tratamente standard.
Deficiența MPO este o boală genetică caracterizată prin deficiențe, fie din punct de
vedere al cantității, fie al funcției, al unei enzime mieloperoxidazică din aval ce generează radical
hidroxil și hipoclorit din peroxidul de hidrogen. În timpul exploziei respiratorii se produce unul
dintre cei mai eficienți agenți care provoacă moartea, hipocloritul(Klebanoff, 2005). Enzima
G6PD ia parte la calea monofosfaților hexozici, care este una dintre principalele căi de generare
a NADPH-, și este poziționată în aval. Activitatea scăzută a enzimei poate duce atât la anemie
hemolitică cronică, cât și la o descreștere a exploziei respiratoare fagocitice (van Bruggen,
Bautista, & Petropoulou, 2002).

63
Boala cronică granulomatoasă este cea mai cunoscută, datorată deficienței activității
bactericide a neutrofilelor. Sindromul este caracterizat prin predispoziția la infecție cu organisme
nepatogene și activitate diminuată a celulelor fagocitare, asociate cu o reacție tisulară
granulomatoasă. Sindromul CGD este rar, și este studiat ca model pentru mecanismele prin care
fagocitele omoară și digeră microorganismele.
Majoritatea cazurilor clinice (70%) de CGD se datorează mutației unei gene situată pe
cromosomul X: citocromul b558 (cifra indică lungimea de undă a spectrului de absorbție) nu este
sintetizat (Dinauer, 2005).
Restul de 30% dintre cazurile CGD sunt datorate mutațiilor recesive ale genelor
autosomale: citocromul b558 este sintetizat, dar nefuncțional (nu transportă electronii de la
NADPH la O 2), datorită unei mutații a genei care codifică subunitatea mare (Oliveira-Junior,
Bustamante, & Newburger, 2011).
Neutrofilele sunt elemente cheie ale mecanismelor de apărare nespecifice, activitățile
microbicide sunt esențiale pentru combaterea infecțiilor. Interacțiunea dintre neutrofile și
patogeni declanșează o cascadă de mecanisme antimicrobiene, care au ca rezultat distrugerea
agentului patogen. În cazul neutrofilelor, procesul de fagocitoză, incluzând formarea și maturarea
fagozomului, este foarte diferit față de cel prezent în alte fagocite. Neutrofilele realizează o
fagocitoză mai rapidă, cu o intensitate mai mare a răspunsului respirator oxidativ decât
macrofagele. Calea de maturare a fagozomilor în macrofage, care este legată de calea endocitară,
este înlocuită în neutrofile prin eliberarea rapidă de granule preformate în fagosomi (Pontus &
Hans, 2011).
Din punct de vedere clinic și genetic, boala cronică granulomatoasă (CGD) face parte
dintr-un grup de boli ereditare foarte divers, caracterizată de incapacitatea fagocitului de a genera
metaboliți toxici de oxigen ca urmare a unei stimulări adecvate. CGD constă în multiple
deficiențe ale enzimelor NADPH. Se caracterizează prin infecții recurente bacteriene și fungice,
pacienții diagnosticați cu CGD pot suferi de pneumonie, abscese ale pielii, țesuturilor și
organelor, artrite purulente, osteomielite, bacteremii/fagimii și infecții superficiale ale pielii, cum
ar fi celulita (Song, Jaishankar, Saleh, & Sahni, 2011) (Kuijpers & Lutter, 2012)
În absența sau în deficitul funcțional al citocromului b558 , metabolismul oxidativ al
fagocitului nu se intensifică, nu determină ’explozia oxidativă’ și nu se generează ROI (O 2-,

64
H2O2). Microorganismele sunt fagocitate, dar nu sunt omorâte. Crește frecvența infecțiilor
localizate în ganglionii limfatici cervicali, în plămâni, în măduva osoasă, în ficat, în tegument.
Crește, în special, incidența infecțiilor cu bacterii aerobe care produc O 2-, H2O2 în
propria activitate metabolică, dar fiind catalază-pozitive, inactivează ROI și astfel supraviețuiesc:
S. aureus, cel mai comun agent patogen, Burkholderia cepacia , dar și cu microorganisme relativ
nevirulente: Seratia marcescens , Candida, Aspergillus , rezistente și la mecanismele microbicide
independente de O 2.
Pneumonia cu Burkholderia cepacia are letalitate ridicată pentru că bacteria este
rezistentă la antibiotice și infecția este persistentă până la producerea șocului endotoxic cu colaps
al funcțiilor vitale.
Limfadenita cu S. aureus, Seratia marcescens rezistente la antibiotice impun incizia și
drenajul ganglionar. Infecțiile sunt trenante și însoțite de reacții inflamatorii ample, care
evoluează în granuloame , ca o reflectare a incapacității fagocitelor de a degrada antigenul.
Calificativul “granulomatoasă” este consecința dezvoltării difuze a granuloamelor, în
țesuturi. Biopsia granuloamelor adeseori duce la diagnosticul incorect de tuberculoză.
Tratamentul : folosirea profilactică a agenților antimicrobieni, în special cotrimoxazol
(conține trimetoprim și sulfametoxazol). Administrarea IFN stimulează activitatea oxidativă a
neutrofilelor, probabil prin producerea NO. Transfuzia granulocitelor se recomandă pentru
controlul unui episod infecțios acut, dar nu pentru tratamentul unei infecții cronice.

65
Concluzii

Studiul a avut ca scop studiul activității bactericide a neutrofilelor prin măsurarea
stresului oxidativ după stimulare cu o suspensie inactivată de E. coli a două probe de sânge
integral, pe heparină, utilizând citometria în flux.
Activarea DHR123 de către PMN și E. coli a fost foarte eficientă, chiar și într-un timp
scurt de incubare. Suspensia de E. coli a activat activitatea microbicidă a granulocitelor prin
comparatie cu granulocitele nestimulate, dar la nivele mai scăzute decât activarea realizată de
PMA.
Măsurarea activității bactericide cu ajutorul citometriei în flux este o metodă rapidă
pentru detecția de rutină a deficiențelor funcționale ale fagocitozei în special în
imunodeficiențelor genetice primare sau a paraliziei imunitare dobândite.

66

Bibliografie
1. Abbas, A., Lichtman, A., & Pillai, S. (2016). Functions and Disorders of the Immune
System. In Basic Immunology (Fifth Edition). Elsevier.
2. Abbas, A., Lichtman, A., & Pillai, S. (2018). Cellular and Molecular Immunology (Ninth
Edition). Elsevier.
3. Becton, & Dickinson. (2002). Introduction to Flow Cytometry: A Learning Guide . BD
Bioscience.
4. Blasius, A. ., & Beutler, B. (2010). Intracellular toll-like receptors. In Immunity (pp. 305–
315).
5. Bogaert, D., Dullaers, M., & Lambrecht, B. (2016). Genes associated with common
variable immunodeficiency: one diagnosis to rule them all?
6. Brown, M., & Wittwer, C. (2000). Flow Cytometry: Principles and Clinical Applications
in Hematology. Clinical Chemistry , 46(8), 1221.
7. Casanova, J. (2015). Severe infectious diseases of childhood as monogenic inborn errors
of immunity .
8. Chen, G., Shaw, M., Kim, Y., & Nuñez, G. (2009). NOD-like receptors: role in innate
immunity and inflammatory disease. In Annual Review Pathology (pp. 365–368).
9. Clinical applications of flow cytometry: Immunophenotyping of leukemic cells. (1998).
National Committee for Clinical Laboratory Standards.
10. Dinauer, M. C. (2005). Chronic granulomatous disease and other disorders of phagocyte
function. In Hematology Am Soc (pp. 89–95). Hematol Educ Program.
11. Fischer, A., Hacein-Bey Abina, S., Touzot, F., & Cavazzana, M. (2015). Gene therapy
for primary immunodeficiencies.
12. Kawai, T., & Akira, S. (2011). Toll-like receptors and their crosstalk with other innate
receptors in infection and immunity. In Immunity .
13. Klebanoff, S. J. (2005). Myeloperoxidase: friend and foe. In Journal of Leukocyte
Biology (pp. 77, 598–625).
14. Kuijpers, T., & Lutter, R. (2012). Inflammation and repeated infections in CGD: two
sides of a coin. In Cellular and Molecular Life Sciences (pp. 7–15).
15. Lanier, L. (2005). NK cell recognition. Annu Rev Immunol. In Annu Review Immunology
(pp. 225–274).
16. Longobardi Givan, A. (2001). Flow Cytometry: First Principles .

67
17. Marion G., M. (2007). Flow Cytometry Principles and Applications . Humana Press.
18. Martin, E. G., Stevenson, M., & Jack, J. H. (2001, April). Introduction to Flow
Cytometry.
19. Nordenfelt, P. (2010). Phagocytosis by neutrophils – studies on phagosome dynamics and
membrane traffic modulation by Streptococcus pyogenes Lund University.
20. Oliveira-Junior, E. B., Bustamante, J., & Newburger, P. E. (2011). The human NADPH
oxidase: primary and secondary defects impairing the respiratory burst function and the
microbicidal ability of phagocytes (pp. 420–427). Scand. J. Immunol.
21. Ormerod, M. (2000). Flow Cytometry A Practical Approach .
22. Parvaneh, N., Casanova, J., Notarangelo, L., & Conley, M. (2013). Primary
immunodeficiencies: a rapidly evolving story .
23. Pontus, N., & Hans, T. (2011). Journal of Leukocyte Biology (Vol. 90).
24. Roederer, M. (2002). Compensation in Flow Cytometry .
25. Sack, U., Tarnok, A., & Rothe, G. (2009). Cellular Diagnostics: Basic Principles,
Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry .
26. Serway, R., & Vuille, C. (2014). College Physics .
27. Shapiro, H. M. (2003). Practical Flow Cytometry (Fourth Edition).
28. Song, E., Jaishankar, G., Saleh, H., & Sahni, R. (2011). Chronic granulomatous disease: a
review of the infectious and inflammatory complications. In Clinical and Molecular
Allergy (pp. 9, 10).
29. Telford, W. (2012). Basic Flow Cytometry Course.
30. van Bruggen, R., Bautista, J., & Petropoulou, T. (2002). Deletion of leucine 61 in
glucose-6- phosphate dehydrogenase leads to chronic nonspherocytic anemia,
granulocyte dysfunction, and increased susceptibility to infections. In Blood (pp. 100,
1026–1030).
31. Yazdani, S., & McGhee, S. (2011). Chronic Complex Diseases of Childhood: A Practical
Guide for Clinicians . USA.
32. Zlei, M., & Mocanu, M. (n.d.). Imunofenotiparea malignităților hematologice.