STUDIUL FACTORILOR DE PROGNOSTIC ÎN CARCINOAMELE SCUAMOASE LARINGIENE CONDUCĂTOR DE DOCTORAT: PROF. UNIV. DR. SIMIONESCU CRISTIANA EUGENIA STUDENT -… [303728]

Doctorat

STUDIUL FACTORILOR DE PROGNOSTIC ÎN CARCINOAMELE SCUAMOASE LARINGIENE CONDUCĂTOR DE DOCTORAT: PROF. UNIV. DR. SIMIONESCU CRISTIANA EUGENIA STUDENT -… [303728]

Byadmin ianuarie 1, 2024

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE

DIN CRAIOVA

ȘCOALA DOCTORALĂ

TEZĂ DE DOCTORAT

STUDIUL FACTORILOR DE PROGNOSTIC ÎN

CARCINOAMELE SCUAMOASE LARINGIENE

CONDUCĂTOR DE DOCTORAT:

PROF. UNIV. DR. [anonimizat]: [anonimizat]. MÎRȘAN (CERCELARU) LILIANA

CRAIOVA

2017

CUPRINS

INTRODUCERE

STADIUL CUNOAȘTERII

CAPITOLUL I

CONSIDERAȚII EPIDEMIOLOGICE ȘI FACTORI DE RISC ÎN CARCINOAMELE SCUAMOSE LARINGIENE 2

I.A. CONSIDERAȚII EPIDEMIOLOGICE ÎN CARCINOAMELE SCUAMOASE LARINGIENE 2

I.B. FACTORI DE RISC ÎN CARCINOAMELE SCUAMOASE LARINGIENE 5

CAPITOLUL II

CANCEROGENEZA LARINGIANĂ: MECANISM, CONSECINȚE 10

CAPITOLUL III

FACTORI DE PROGNOSTIC ÎN CARCINOAMELE SCUAMOASE
LARINGIENE 24

CAPITOLUL IV

CLASIFICAREA TUMORILOR LARINGIENE 30

CONTRIBUȚII PROPRII

OBIECTIVELE STUDIULUI 38

CAPITOLUL V

MATERIAL ȘI METODE 39

V.A. MATERIALUL CERCETAT 39

V.B. METODE UTILIZATE ÎN CERCETARE 40

CAPITOLUL VI

REZULTATE 46

VI.A. [anonimizat] 46

VI.B. STUDIUL MORFOLOGIC AL PACIENȚILOR CU CARCINOAME SCUAMOSE LARINGIENE 53

VI.C. STUDIUL IMUNOHISTOCHIMIC AL CARCINOAMELOR SCUAMOASE LARINGIENE 84

CAPITOLUL VII

DISCUȚII 116

VII.A [anonimizat] A PACIENȚILOR CU CARCINOAME SCUAMOSE LARINGIENE 116

VII.B ANALIZA MORFOLOGICĂ A PACIENȚILOR CU CARCINOAME SCUAMOSE LARINGIENE 121

VII.C ANALIZA IMUNOHISTOCHIMICĂ A CARCINOAMELOR SCUAMOASE LARINGIENE 128

CAPITOLUL VIII

CONCLUZII 138

BIBLIOGRAFIE 143

INTRODUCERE

Cancerele capului și gâtului se află pe locul opt în lume ca și frecvență iar dintre acestea carcinoamele laringiene reprezintă 30-40%. Carcinomul laringian constituie 2,4% din totalitatea neoplasmelor diagnosticate anual. Carcinomul scuamos laringian este considerat o afecțiune a [anonimizat] 40-70 [anonimizat]. Printre factorii de risc amintim stilul de viață (tutun, alcool), dietă, ocupația, [anonimizat]-[anonimizat].

[anonimizat] a numeroase fenomene genetice și moleculare. [anonimizat], cum sunt predispoziția genetică sau factorii externi.

[anonimizat] 90% [anonimizat] o supraviețuire între 30-50% din cazuri. De aceea identificarea unor factori prognostici ar permite o diagnosticare cât mai precisă și astfel ar exista un management calitativ încă de la început permițând folosirea unui tratament individual.

Studiul nostru a fost efectuat pe un număr de 293 de cazuri de carcinoame scuamoase laringiene. [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat]. Studiul imunohistochimic l-am realizat pe un număr de 38 de cazuri de carcinoame scuamoase laringiene în care am urmărit expresia unor markeri ai factorilor de creștere și proliferare (EGFR și ki-67), markeri ai apoptozei (p53 și bcl-2), molecule de adeziune (E-caderina, P-caderina și β-catenina), proteine ale ciclului celular (ciclin D1) și factori de transcripție (Snail). Am analizat din punct de vedere statistic și relația acestor markeri cu parametrii clinico-epidemiologici și histopatologici investigați.

În urma studiului realizat, am constatat: predominanță netă a cancerului la sexul masculin iar principalii factori de risc implicați au fost fumatul și consumul de alcool; majoritatea formelor histopatologice au aparținut formelor cheratinizate și necheratinizate și au fost întâlnite în toate cele trei etaje ale laringelui: supraglotic, glotic și infraglotic; cele mai multe cazuri au corespuns stadiilor avansate, III și IV; am observat o expresie înaltă pentru EGFR și ki-67, aspect care se corelează cu o evoluție nefavorabilă, cu prezență de metastaze și recurențe; supraexpresia p53 alături de supraexpresia bcl-2 în formele slab diferențiate am obținut în cazurile noastre, acest aspect fiind specific prognosticului rezervat; imunoexpresia ciclin D1 a crescut cu gradul de diferențiere, cele mai mari valori fiind obținute în formele slab diferențiate, aspect ce corespunde unui stadiu avansat de boală cu un prognostic rezervat; am obținut și asocieri semnificativ statistic între markeri și diverși parametrii, precum între p53, bcl-2 și gradul de diferențiere și stadiul pTNM sau Snail și gradul de diferențiere, categoria N și stadiul pTNM.

Mulțumesc Doamnei Prof. Univ. Dr. Simionescu Cristiana pentru șansa acordată de a realiza această lucrare dar și pentru sprijinul acordat în finalizarea ei.

Mulțumesc colectivului Disciplinei de Morfopatologie din cadrul Universității de Medicină și Farmacie Craiova pentru ajutorul acordat.

Mulțumesc familiei mele pentru răbdarea, susținerea și puterea pe care mi le-au acordat în această perioadă.

STADIUL CUNOAȘTERII

CAPITOLUL I

CONSIDERAȚII EPIDEMIOLOGICE ȘI FACTORI DE RISC ÎN

CARCINOAMELE SCUAMOSE LARINGIENE

I.A. CONSIDERAȚII EPIDEMIOLOGICE ÎN CARCINOAMELE SCUAMOASE LARINGIENE

Cancerul reprezintă o problemă de sănătate publică la nivel mondial, atât în țările dezvoltate cât și cele subdezvoltate [1]. Cancerele capului și gâtului se află pe locul opt în lume ca și frecvență iar dintre acestea carcinoamele laringiene reprezintă 30-40% [2,3]. Carcinomul laringian reprezintă 2,4% din totalitatea neoplasmelor diagnosticate anual, la nivel mondial [4]. Carcinomul scuamos constituie cea mai frecventă tumoră malignă localizată la nivelul acestei regiuni anatomice, fiind întâlnită în peste 95% din cazuri [5].

Incidența mondială a cancerului laringian este variabilă, pe primele locuri aflându-se Franța, Italia, Spania, Portugalia dar și țări din America de Sud. O incidență scăzută a fost înregistrată în rândul populațiilor din Africa, Asia, Australia sau Noua Zeelandă [9].

Cu toate că un număr crescut de pacienți decedează datorită acestei boli, carcinomul scuamos laringian reprezintă o boală curabilă. Rata de supraviețuire la cinci ani, în cazul subiecților de sex masculin este de 60-80% [6,24]. O rată crescută a supraviețuirii a fost înregistrată în Japonia, indiferent de vârstă. Spre deosebire de această țară, în Europa și America, supraviețuirea mai ridicată este prezentă în rândul lotului de pacienți tineri [24]. Rata de supraviețuire în rândul populației feminine este cuprinsă între 40-100%, indiferent de vârstă sau continent [24]. În funcție de asocierea anumitor factori de risc se înregistrează modificări. În cazurile de carcinom scuamos laringian diagnosticate și tratate corespunzător încă din stadiile incipiente, supraviețuirea ajunge până la 90% în timp ce stadiile avansate sunt asociate cu procente mult mai mici de 30-50% [6]. Unul dintre cei mai importanți factori care influențează supraviețuirea este prezența sau absența metastazelor. Identificarea acestora corespunde unei scăderi a procentului supraviețuirii la 5 ani până la 30% [6].

Carcinomul scuamos laringian fiind considerat o afecțiune a sexului masculin este însoțit de mortalitate crescută în rândul acestora, mult superioară femeilor. O incidența crescută a mortalității fiind întâlnită în țări din estul și sudul Europei sau America de Sud (Brazilia, Uruguai, Argentina). Decesul datorat carcinomului scuamos laringian în rândul sexului feminin este rar întâlnit reprezentând aproximativ 0,4% din totalitatea deceselor, la nivel mondial, cauzate de tumorile maligne [9]. Pentru anul 2004, au fost raportate 89.000 de decese în cazul sexului masculin și 12.000 de decese în rândul sexului feminin, la nivel mondial [6].

În patologia umană, nu există un alt cancer nongenital care să prezinte o predilecție ridicată pentru sexul masculin ca în cazul cancerului laringian. Frecvența ridicată este datorată, cel mai probabil, expunerii superioare la tutun și alcool, incidența cea mai mare a fost înregistrată în Europa și Brazilia [5]. Nu trebuie exclusă nici ipoteza conform căreia hormonii masculini ar fi implicați în această predominanță a bolii [6]. Au fost identificate diferențe semnificative ale raportului bărbați/femei în diferite zone geografice; de exemplu în Europa raportul este de 7/1 [6]. Dar in ultimii ani s-a identificat o creștere a acestei patologii și în rândul pacienților de sex feminin cel mai probabil datorită deprinderii obiceiului de a fuma sau a consuma alcool [5-6]. Cea mai mare frecvență a carcinomului scuamos a fost identificată la populația neagră, de sex feminin, din SUA. Un alt exemplu ar fi India, unde cea mai mare incidență a carcinomului scuamos laringian este întâlnită la femeile care mestecă tutun sau derivați de tutun [5]. O frecvență crescută a fost identificată și în țări din Asia și Europa; în timp ce în Franța și Spania incidența carcinomului scuamos laringian este extrem de redusă [9].

Carcinoamele scuamoase laringiene au fost de obicei identificate la pacienții cu vârsta cuprinsă între 40-70 de ani, vârsta medie de diagnosticare fiind de 66 de ani. În cazul leziunilor benigne s-a identificat o frecvență crescută de diagnosticare între 21-30 de ani și comparând valorile s-a demonstrat o tendința de creștere a incidenței leziunilor maligne odată cu înaintarea în vârstă [7]. Cancerul laringian la copii reprezintă o patologie rară, nefiind raportate foarte multe cazuri în literatură. Primul caz de carcinom scuamos laringian la copil a fost diagnosticat în 1868 la un copil de trei ani [8].

În ceea ce privește localizarea tumorii la diferitele etaje ale laringelui, localizarea glotică este cea mai frecventă localizare întâlnită, cel mai rar fiind diagnosticată localizarea la nivelul etajului infraglotic. Tumorile care interesează etajul glotic sunt diagnosticate într-un număr superior fiind însoțite de simptomatologie încă din stadiile incipiente, în timp ce tumorile supra și infraglotice sunt mult timp asimptomatice fiind diagnosticate într-un stadiu mult mai avansat [9]. La nivel mondial exista diferențe în ceea ce privește localizarea tumorilor la nivelul diverselor etaje ale laringelui. În țările scandinave, în Franța, în Grecia cele mai frecvente tumori au fost localizate la nivelul etajului glotic. În Italia, jumătate din cazuri au fost identificate în etajul glotic iar cealaltă jumătate la nivel supraglotic. Dar există și țări precum Uruguai sau Statele Unite ale Americii unde au fost înregistrate valori de 60% și respectiv 60-70% în favoarea etajului supraglotic [6].

Mortalitatea în cazul carcinomului scuamos laringian prezintă variații în funcție de aria geografică dar și de sexul pacienților. În cazul subiecților de sex masculin, între anii 1980-1981 s-a înregistrat mortalitate crescută în următoarele țări: Franța (10,9/100000), Spania (7,6/100000) urmate de Italia și Rusia. Incidența cea mai scăzută fiind observată în țările nordice: Suedia (0,8/100000) și Norvegia (1/100000). În anii următori, cel mai probabil prin introducerea unor tehnici de diagnosticare în stadii incipiente s-a observat o scădere a mortalității în aceste țări, pe primele locuri în anii 2000-2001 situându-se Croația, Ungaria și Rusia (7-8/100000). Procentul scăzut nu a prezentat variații, menținându-se în țările nordice [25]. Incidența crescută pentru sexul feminin, între anii 1980-1981, a fost stabilită în Irlanda (0,8/100000) și România (0.5/100000) în timp ce incidența scăzută a fost prezentă tot in țările nordice (0,2/100000). Anii 2000-2001 aduc schimbări, astfel că pe primele locuri ca și mortalitate în carcinomul scuamos laringian se afla Moldova (1,1/100000), Ungaria (0,7/100000) și Polonia (0,5/100000) [25]. Cel mai probabil aceste variații geografice sunt rezultatul influenței factorilor de risc, în special fumatul și consumul de alcool. De asemenea descoperirea unor noi tehnici de diagnostic încă din stadiile incipiente precum și modalitățile de tratament influențează mortalitatea. Conform ultimelor statistici, în urma studiului lui Chatenoud L. și colaboratorii, incidența crescută a mortalității este prezentă în Ungaria, Moldova și Romania (>6/100000) în timp ce incidența scăzută este menținută în țările nordice [26]. Spre deosebire de subiecții masculini unde s-a înregistrat o scădere a mortalității în lume, în cazul sexului feminin incidența s-a menținut la aproximativ aceleași valori de 0,29/100000 în ultimele două decenii [26].

I.B. FACTORI DE RISC ÎN CARCINOAMELE SCUAMOASE LARINGIENE

Incidența carcinoamelor scuamoase laringiene în lume este determinată de interacțiunea cu numeroși factori de risc. Acești factori de risc includ stilul de viață (tutun, alcool), dietă, ocupația, diverși agenți externi, statusul socio-economic dar și moștenirea genetică [9].

Fumatul și consumul de alcool reprezintă principalii factori de risc implicați în apariția carcinomului scuamos laringian. Riscul este mult mai mare în cazul consumului concomitent de tutun și alcool. În absența fumatului, riscul de apariție al carcinomului scuamos laringian este crescut doar în cazul consumului de alcool în cantitate mare [10]. Riscul indus de stilul de viață s-a demonstrat că depinde de durata de expunere la acești factori precum și de cantitatea lor [6,9]. Fumatul contribuie la dezvoltarea tumorilor maligne, ca și mecanism trigger, prin mutații ale ADN-ului dar și modificări ale diviziunii și proliferării celulare normale [6]. Acest factor de risc a fost observat în peste 95% din cazurile de carcinoame scuamoase laringiene, fiind cel mai frecvent corelat cu localizarea glotică [6]. Pe de altă parte alcoolul prin menținerea unor procese inflamatorii cronice la nivelul epiteliului de acoperire determină apariția unor perturbări în proliferarea celulară. Etajul supraglotic este mai des interesat în cazul consumului de alcool comparativ cu etajele glotic sau infraglotic [10]. Într-un studiu realizat în SUA s-a demonstrat că există un risc de 10 ori mai mare de dezvoltare a carcinoamelor supraglotice comparativ cu cele glotice la consumatorii cronici de alcool în cantitate mare [6].

Conform literaturii de specialitate s-a stabilit cu certitudine o legătură directă între apariția leziunilor maligne și obiceiurile alimentare. Orice deficiență nutrițională are rol în carcinogeneză, în special vitamina C și E. Consumul de carne roșie, procesată, ouăle și peștele este asociat cu un risc crescut în apariția cancerului laringian. Surprinzător, peștele, prin conținutul bogat în lipide polinesaturate și omega-3, cunoscute pentru proprietățile benefice, consumat prăjit constituie și el un factor de risc [11]. Conform unui studiu efectuat în Uruguai, consumul de carne sărată și mai ales cantitatea totală de lipide ingerate reprezintă aspecte importante de asemenea corelate cu un risc crescut [9]. Alte elemente din alimentație precum legumele (legumele verzi sau galbene, usturoiul), fructele (portocale, mandarine) sau uleiul de măsline prezintă un rol protector și absența acestora din alimentație se asociază cu posibilitatea apariției cancerului [11,12]. Dieta vegetariană reprezintă o bogată sursă de antioxidanți și se pare că reprezintă un factor protector împotriva apariției leziunilor tumorale [23]. Consumul caloric exagerat reprezintă și el un alt factor de risc. Acizii grași prin implicarea in destabilizarea membranară, creșterea peroxidazei lipidice precum și perturbarea anumitor căi metabolice, reprezintă un factor favorizant în apariția leziunilor tumorale [23].

Stresul oxidativ, ca și rezultat al unei diete dezechilibrate dar și al unui anumit stil de viață, este implicat prin alterarea ADN-ului în patogeneza tumorilor maligne [23].

Cancerul cu localizare laringiană poate fi asociat cu factori de risc profesionali. Acesta este mai frecvent identificat la persoanele care sunt expuse prin natura profesiei la o serie de substanțe toxice: hidrocarburi aromate, ciment, azbest, lac, rumeguș de lemn [9]. Într-un studiu efectuat în Europa de Sud s-a evidențiat riscul crescut de dezvoltare al carcinomului scuamos laringian pentru muncitorii din domeniul chimic [6]. De Stefani E și colaboratorii au evidențiat, într-un studiu în Uruguai, relația direct între cancerul laringian și diverse ocupații profesionale, precum: măcelari, viticultori sau brutari [13]. Un studiu amplu a concluzionat o frecvență crescută a cancerului laringian în ceea ce privește mediu de lucru cu formaldehida, azbest și solvenți chimici. Dintre acești factori, solvenții chimici s-au asociat cu un risc dublu de apariție a cancerului, mai ales în cazul expunerii la alcool și fumat [22].

Majoritatea pacienților diagnosticați cu carcinom scuamos laringian aparțin claselor și mediilor socio-economice inferioare în care predomină consumul de tutun și alcool, dieta săracă, igiena personală precară [6].

S-a încercat punerea în evidență a unei relații între anumiți viruși și carcinomul scuamos laringian. HPV este un binecunoscut factor etiologic implicat în cancerul de col uterin iar prima relatare despre implicarea acestui virus în cancerele de cap și gât datează din 1985 [14]. Prezența acestui virus a fost evidențiată atât la nivelul mucoasei normale laringiene cât și în cazul mucoasei transformată malign. A fost emisă ipoteza conform căreia prezența HPV-ului în cazul unui papilom laringian asociază un risc crescut de transformare malignă a bolii. De asemenea, prezența concomitentă a infecției cu virusul herpes simplex, virusul Ebstein-Barr sau virusul citomegalic determină un caracter mult mai agresiv al bolii [16]. Torrente MC și colaboratorii au demonstrat într-un studiu recent implicarea HPV în leziuni benigne cât și maligne laringiene. Cu ajutorul ADN-ului viral au fost identificate varietăți de tulpini HPV, astfel tipurile 6 și 11 au fost asociate cu leziuni benigne în timp ce tulpinile 16 și 18, considerate agresive, au fost in relație cu carcinomul scuamos laringian [15].

La ora actuală refluxul gastro-esofagian este considerat un factor de risc important implicat în apariția carcinomului scuamos laringian [9]. Într-un studiu efectuat pe un lot de 21 de pacienți cu carcinom scuamos laringian și/sau hipofaringian s-a urmărit prezența refluxului gastro-esofagian. Acesta a fost evidențiat la 80,9% din pacienți. Patru pacienți din lotul studiat au prezentat aclorhidrie, ceea ce i-a determinat pe autori să emită ipoteza conform căreia refluxul gastro-esofagian acid și alcalin reprezintă factori carcinogeni care duc la apariția carcinomului laringian [17]. Olson atrage atenția că cel mai important factor care duce la iritația cronică a mucoaselor la pacienții cu reflux gastro-esofagian nu este caracterul acid al sucului gastric ci prezența bilei și a pepsinei care acționează agresiv pe mucoasa normală [18]. S-a demonstrat că unii dintre pacienții gastrectomizați (15%) prezentau leziuni pre neoplazice sau antecedente tumorale laringiene. Aceste leziuni au fost mult mai des întâlnite la pacienții supuși unei gastrectomii totale, fiind emisă astfel ipoteza conform căreia rezecția gastrică reprezintă un factor adițional de risc sau un cofactor în apariția leziunilor preneoplazice sau a leziunilor tumorale maligne laringiene [17].

Leziunile precursoare maligne reprezintă modificări ale epiteliului laringian cu risc crescut de a se maligniza în evoluția bolii. Mecanismele moleculare ale acestei transformări maligne nu sunt încă complet elucidate dar sunt clar datorate alterării proliferării celulare [19]. Modificările citologice și arhitecturale care afectează epiteliul laringian corespund leziunilor scuamoase intraepiteliale (SIL), termen care cuprinde de la leziuni de tip reactiv până la carcinom „in situ” [20]. Leucoplazia și laringita cronică reprezintă principalele modificări întâlnite la nivelul laringelui care predispun la malignizare, aceste leziuni fiind frecvent asociate cu fumatul, consumul de alcool dar și refluxul gastro-esofagian [21].

Carcinomul scuamos laringian nu trebuie considerat numai un cancer exogen, ipoteza susținută de faptul că unele persoane care au fumat puțin sau nu au fumat niciodată dezvoltă un carcinom. Se pare că există și factori endogeni incriminați, cum ar fi predispoziția genetică. Riscul de apariție al carcinomului scuamos laringian este foarte crescut în cazul existenței carcinomului la o ruda de gradul I și doar crescut în cazul unei patologii maligne de cap și gât [6].

Tratamentul utilizat în cancerele laringine este variat și include tratament chirurgical, radioterapie sau chimioterapie. Acest tratament, în special cel chirurgical, este de multe ori mutilant, cu repercusiuni asupra calității vieții pacientului și depinde de stadiul în momentul diagnosticării.

Pentru cazurile de carcinoame scuamoase laringiene diagnosticate în stadiile incipiente tratamentul include intervenție chirurgicală cât și radioterapie [243]. În ceea ce privește intervenția chirurgicală, laringectomia orizontala sau verticală a reprezentat intervenția de elecție. În urma studiului lui Jones AS și colaboratorii rezultate asemănătoare au fost obținute atât în urma utilizării radioterapiei cât și a laringectomiei [243].

Pentru stadiile avansate tratamentul de elecție era reprezentat de intervenția chirurgicală, care îmbracă diverse aspecte de la intervenții minim invazive până la laringectomii frontale totale [244]. Această abordare este însoțită de frecvente modificări în ceea ce privește fonația și confortul pacientului. De aceea, în ultimii ani, pentru a împiedica apariția diverselor sechele se utilizează din ce în ce mai mult metode non-chirurgicale de tipul chimio și radioterapiei [244]. Cu toate acestea, conform lui Megwalu UC și colaboratorii, pacienții diagnosticați în forme avansate de boală tratați prin metode non-chirurgicale au prezentat un risc de 30% mai mare de deces decât cei tratați chirurgical [245].

CAPITOLUL II

CANCEROGENEZA LARINGIANĂ: MECANISM, CONSECINȚE

Evoluția normală a unui proces malign presupune un proces multistadial. Sediul inițierii procesului canceros poate fi reprezentat de orice țesut normal, inclusiv laringele. Cancerogeneza este considerată un proces multisecvențial complex, care se traduce prin perturbarea a numeroase fenomene genetice și moleculare. Cancerul apare în urma unor modificări repetate și conectate între ele, fiind influențate de predispoziția genetică dar și de factorii externi [92]. Toate modificările duc la apariția unor celule cu creștere selectivă, puțin sensibile la factorii reglatori ai creșterii. Astfel celulele pot să scape apoptozei, prezintă capacitate mare de proliferare, stimulează angiogeneza pentru ca în final să determine metastazare [35]. Alterarea balanței genetico-moleculare este întâlnită încă de la primii pași ai tumorogenezei, în care sunt implicate genele tumorale supresoare și proto-oncogenele. Suprimarea genelor supresoare și activarea oncogenelor permit apariția celulelor tumorale care încep să prolifereze pentru ca în final să formeze tumora primitivă [114]. Urmează etapa de invazie, în care celulele se detașează unele de altele și încep să migreze. În această etapă acționează alte mecanisme care presupun alterări ale adezivității celulare, ale matrixului extracelular sau apariția angiogenezei tumorale [114].

Sistematizând modificările care stau la baza cancerogenezei laringiene, acestea pot fi împărțite astfel:

alterări genetice care inițiază procesul canceros (supresia genelor tumorale supresoare și activarea proto-oncogenelor),

perturbarea mecanismelor care intervin în menținerea arhitecturii tisulare normale și care permit progresia și metastazarea tumorală, din care fac parte pierderea fenotipului și a adezivității, degradarea matrixului extracelular și angiogeneza.

ALTERĂRI GENETICE CARE INIȚIAZĂ PROCESUL CANCEROS

Gene tumorale supresoare

O primă etapă a procesului multisecvențial al cancerogenezei implică pierderea funcțiilor diverselor gene tumorale supresoare. Dintre acestea amintim: p16, p53, p21, proteina RB dar și altele. Rolul acestor gene este bine definit și anume de a nu permite celulelor normale să capete caractere specifice malignității, prin intervenția la nivelul ciclului celular, replicarea ADN-ului dar și a mitozelor [67].

p53 reprezintă una dintre cele mai studiate gene, aberațiile moleculare ale acesteia fiind prezente în numeroase tipuri de cancer [34]. Mutațiile care apar la nivelul acestei gene au fost identificate inclusiv în cazul cancerului laringian [27,28]. Modificările identificate au evidențiat faptul că aceasta genă nu doar își pierde activitatea supresoare dar se pare că poate să obțină funcții oncogenice cu stimularea creșterii, proliferării și supraviețuirii celulelor canceroase [34,35]. Gena p53 este implicată în controlul ciclul celular, sinteza și repararea ADN-ului dar și moartea celulară astfel a devenit una dintre cele mai studiate gene tumorale supresoare implicate în procesul multisecvențial al cancerului laringian [29,30]. Mutațiile și expresiile anormale ale acestei gene au fost evidențiate în cazul leziunilor preneoplazice, displazice dar și zonele de carcinom in situ, astfel putem considera că mutațiile genei p53 reprezintă un eveniment timpuriu important în dezvoltarea tumorală [27-28,31]. Aceasta genă tumorală se consideră a fi implicată și în cazul răspunsului la radioterapie [32]. S-a demonstrat faptul că mutațiile de la nivelul genei p53 se asociază cu un risc crescut de răspuns negativ la tratamentul local dar și o perioadă mult mai scurtă fără boală după radioterapie [33]. De asemenea această genă este implicată și în apariția chimiorezistenței [35-37].

p16 reprezintă o altă genă tumorală supresoare intens studiată și ale cărei aberații au fost întâlnite în numeroase tipuri de cancer [38]. În perturbările care stau la baza apariției cancerului se pare că nu mutațiile acestei gene sunt implicate ci mai degrabă procesul de hipermetilare și pierderea heterogenității [45-46]. Aceste fenomene au fost identificate în cancerele de cap și gât în procente de 20% și respectiv 72% [45-46]. Modificările de la nivelul genei p16 alături de alterările genei p53 sunt cele mai timpurii aspecte ale procesului multisecvențial de cancerogeneză [42]. Această genă este intens implicată în ciclul celular, inclusiv în proliferare, diferențiere și apoptoză astfel că alterările proteinei p16 vor permite celulelor canceroase să se dezvolte necontrolat [38,43]. Exista o legătura și între expresia genei p16, prognostic și răspunsul la terapie. Conform unor studii expresia pozitivă este corelată cu un prognostic și un răspuns bun la terapie în timp ce expresia slabă sau negativă s-ar asocia cu un prognostic prost și progresie tumorală [44]. Cu cât expresia este mai slabă cu atât tumora tinde să aibă dimensiuni mai mari și o categorie T mai mare [38].

O altă genă tumorală supresoare implicată în cancerogeneza este gena p21. Acestă genă este una dintre cele mai noi gene studiate și s-a constat că expresii anormale ale acesteia au fost identificate în cazul cancerului laringian [47]. Expresia pozitivă și intensă este asociată cu un prognostic prost, pacienții cu o astfel de expresie a p21 prezentând un risc înalt de a dezvolta metastaze, recurențe dar și o perioadă de supraviețuire mai mică. În plus, s-a evidențiat faptul că asocierea expresiei p21 cu Ki67 indică un prognostic și mai prost [51]. Această genă este implicată în reglarea ciclului celular, prin acțiunea asupra ciclin-kinazei. Proliferarea celulară este un proces dependent de activitatea ciclin-kinazei iar o activitate anormală a acesteia a fost identificată în numeroase tipuri de cancer, inclusiv în cazul cancerului laringian [48]. Procesul de proliferare implică activarea ciclin-kinazei prin intermediul ciclinelor în timp ce o limitare a proliferării apare în cazul acțiunii p21 dar și p27 asupra ciclin-kinazei [49]. În funcție de concentrația acestei proteine efectul este diferit asupra ciclin-kinazei. S-a demonstrat că prezența într-o cantitate mică are un efect pozitiv prin stimularea formării complexului cdk4/ciclin D1 în timp ce prezența în cantitate mare se corelează cu inhibarea activității [50].

Inhibarea genei tumorale supresoare PTEN este un eveniment cunoscut și întâlnit în diverse tipuri de cancer. PTEN este implicată în fenomene de proliferare și creștere celulară prin acțiunea asupra căii PI3K-AKT-mTOR [52]. Reprezintă una dintre cele mai frecvent interesate căi corespunzând unui procent de 30.5% din cazuri în cazul cancerelor de cap și gât și este asociată cu creșterea celulară, invazia locală sau metastazarea [61-62]. Prin activarea mecanismului acestei căii se identifică modificări de tipul inhibiției procesului de apoptoză și al proliferării celulare sau afectarea ADN-ului. PTEN este o proteină responsabilă de blocarea acestei căi, prin blocarea selectivă a activării PI13K. În cazul în care apare o alterare a acestei gene, inactivare sau mutații, PI3K se acumulează în cantitate mare la nivel celular și astfel calea PI3K-AKT-mTOR se activează permițând apariția leziunilor preneoplazice [56-60]. Prin asocierea cu mecanismele terapiei și hipoxia, această genă inactivată este însoțită și de rezistență la radioterapie [53-55].

Proteina Rb reprezintă una dintre cele mai importante proteine ale ciclului celular, fiind implicată în faza G1. În reglarea mecanismului acestei proteine sunt implicate p16 dar și ciclin D1 [63]. Această proteină inițial a fost considerată a fi implicată doar în apariția retinoblastomului la copii dar ulterior s-a constatat că alterarea funcției acesteia se asociază cu apariția diverselor tipuri de tumori [64]. Gena se găsește localizată la nivelul cromozomului 13 și își exercită acțiunea în primele două treimi ale fazei G1 a ciclului celular [65]. S-a identificat că există o legătură strânsă între proteina Rb și factorul de transcripție E2F, implicat în trecerea în faza S a ciclului celular. S-a constatat faptul că în stimularea acțiunii proteinei precum și în interacțiunea acesteia cu factorul de transcripție este implicat procesul de fosforilare [64]. Calea Rb/E2F reprezintă una dintre căile implicate în creșterea normală celulară, în replicarea ADN-ului dar și trecerea în faza S a ciclului celular. Astfel orice anomalie a acestei căi va duce la apariția unor dezechilibre cu potențial malign [64,67]. În activitatea anormală a acestei căi sunt implicate mai multe cauze: principala o reprezintă pierderea proteinei Rb urmată de proteina p16. Aceasta influențează calea RB/E2F prin acțiunea asupra activității ciclinD/cdk4 kinazei, care în absența proteinei p16, se acumulează ducând la fosforilarea proteinei Rb și acumularea E2F [64].

Calea TGF-beta este implicată și ea în fenomenele de apariție ale cancerului. Acțiunea acestei căi a fost pusă în evidență chiar și la nivelul țesuturilor normale sau în etapele inițiale ale cancerogenezei unde s-a constatat un efect supresor asupra creșterii tumorale dar și stimularea apoptozei. Rolul se modifică odată cu progresia tumorală când apare o supraexpresie a TGF-beta care determină o reducere a efectului supresor și stimularea creșterii și dezvoltării celulelor tumorale [68]. Invazia locală și metastazarea sunt alte două fenomene încurajate de mutațiile căii TGF-beta prin implicarea acesteia în fenomenul de tranziție epitelio-mezenchimală [69]. Activarea căii începe odată cu intervenția celor doi receptori TGF-betaRI și RII. Are loc autofosforilarea RII care ulterior duce la transfosforilarea RI, ceea ce duce la activarea familiei Smad, ce reprezintă mediatori intracelulari ai căii TGF-beta [70-71]. Rolul receptorului RI este mai puțin studiat dar au fost identificate mutații ale acestuia în 19% din metastazele din cancerele de cap și gât [72]. Reducerea expresia TGF-betaRII a fost identificată în cancerele de cap și gât și a fost asociată cu mecanismul de diferențiere tumorală slabă (G3) dar și cu un prognostic prost [73-74]. Au fost raportate și modificări ale mediatorilor intracelulari Smud. La nivelul cromozomului 18 se găsesc localizate Smud2 și Smud4, a căror pierdere sau reducere a expresiei este asemănătoare. Pierderea Smud2 se asociază cu un grad slab de diferențiere, fiind întâlnită până la 38% din cancerele de cap și gât iar pierderea expresiei Smud4 este de asemenea asociată cu o evoluție nefavorabilă [75-76]. Un alt receptor al familiei TGBβ este ALK-1 (activin receptor-like kinase 1). Acest receptor este exprimat la nivelul celulelor endoteliale în prezența unei leziuni. Rolul acestui receptor în cazul cancerogenezei este legat de faza de maturare a procesului de angiogeneză tumorală [129].

Calea Notch este o nouă abordare în ceea ce privește noi cauze ale cancerului de cap și gât. Anomaliile acestei căi se corelează cu fenomene de metastazare [100]. Mutații ale Noctch1 au fost raportate ca fiind frecvente în cancere, procentul de 15% din cazuri făcând din acestea a doua cea mai frecventă mutație după p53 în cazul cancerelor de cap și gât [94,100].

FHIT (Fragile Histidine Triad) este o nouă genă tumorală supresoare localizată la nivelul regiunii FRA3B, mai exact 3p14.2, unde se găsește una dintre cele mai fragile zone ale genomului uman [114,125]. Rolul acestei gene a fost legat de stimularea unor semnale pro-apoptotice dar și controlul ciclului celular [125]. În cazul carcinoamelor de cap și gât s-a pus în evidență o reducere sau chiar absența expresiei FHIT până la 68% dintre cazuri, fenomene care se corelează cu un prognostic nefavorabil și o incidență crescută pentru apariția metastazelor [114]. Prin corelarea cu expresia crescută a Ki-67 s-a pus în evidența posibilitatea deținerii de către această genă a unui potențial proliferativ crescut [114]. Prezența implicării acestei gene în procesul de cancerogeneză a fost observat încă din primele etape. Implicarea în leziunile displazice este posibilă prin pierderea ambelor alele. Într-o primă etapă s-a constatat pierderea primei alele în urma acțiunii diverșilor factori de risc. Dacă această acțiune continuă urmează pierderea celei de a doua alele și astfel se obține o pierdere totală a expresiei acestei gene [126].

Oncogene

Oncogenele apar în urma mutațiilor ce acționează asupra proto-oncogenelor, cu rol în creșterea și diferențierea normală celulară [77]. Mutațiile punctiforme, amplificarea și supraexpresia genică se găsesc printre cele mai frecvente mecanisme de activare ale oncogenelor [78].

Ciclinele fac parte dintre principalii reglatori ai ciclului celular. Orice anomalie asupra acestora se traduce prin participarea ciclinelor în procesul tumoral, acestea căpătând un rol oncogenic [79]. CiclinD1 reprezintă una dintre cele mai studiate oncogene în diverse tipuri de cancer: sân, plămân, ficat, vezică urinară dar și limbă, faringe și laringe [79-80]. Desfășurarea normală a ciclului celular permite o perioadă “rest” celulei în care înainte de începerea proceselor de creștere, mitoze și diviziune, să repare posibilele mutații ADN. Rolul ciclinD1 este acela de a permite trecerea din faza G a ciclului celular în faza S, prin formarea de complexe cu ciclin-kinazele dependente 4 și 6 [79]. Independent de ciclinD1, ciclin-kinazele dependente 4 și 6 pot intervin în dereglarea ciclului celular prin supraexprimare [83]. Mutații ale ciclinD1 pot determina o grăbire a trecerii în faza S, fără a mai permite celulelor perioada “rest” și astfel repararea ADN-ului. În absența acestei etape celulele nou apărute pot prezenta modificări genetice dar și o creștere rapidă și dezordonată [81]. Supraexprimarea și amplificarea reprezintă principalele modificări ale ciclinD1 întâlnite în cancerele de cap și gât. Diverse studii remarcă că o supraexprimare a ciclinD1 se asociază cu un răspuns negativ la radioterapie iar amplificarea este mai frecvent asociată cu apariția recurențelor [81-82].

Unul dintre procesele biologice importante este reprezentat de proliferarea celulară, care la rândul ei este implicată în creșterea celulară. Fenomenul de oncogeneză este frecvent asociat cu proliferarea necontrolată [84]. Ki67 face parte dintre cei mai studiați markeri ai proliferării celulare. Ki67 este o proteină identificată la nivel nuclear exprimată în fazele active ale proliferării celulare și absența în fazele nonproliferative [85]. Astfel putem identifica prezența acestuia, fiind intens implicat în interfază, profază, metafază, anafază și telofază și absența în faza nonproliferativă G0 [86]. Acest marker al proliferării celulare a fost studiat și în cazul leziunilor precursoare maligne și s-a constatat că este un bun indicator al acestora [87]. Pe lângă rolul din procesul de proliferare, Bullwinkel J și colaboratorii a demonstrat o asociere a Ki67 cu sinteza ARN-ului. Studiul a demonstrat o asociere a pKi67 cu etapele inițiale ale sintezei ARN-ului, în timpul interfazei și mitozei, prin intermediul legăturii cu cromatina promotorului și regiunea transcripțională a genei rARN [88]. O rată redusă a proliferării tradusă printr-o cantitate mică de Ki67 este asociată cu rezistență la radioterapie în timp ce o valoare crescută a acestuia se asociază cu forme slab diferențiate de carcinoame scuamoase laringiene și un prognostic mai prost [85-86].

Controlul ciclului celular este realizat prin intermediul ciclin-kinazelor dependente, asupra cărora intervin ciclinele și inhibitorii ciclin-kinazelor dependente. p27 reprezintă unul dintre factorii inhibitori implicați în acest proces, aparținând familiei Cip/Kip. Rolul său a fost studiat și corelat cu progresia din faza G1 în faza S a ciclului celular [89-90]. Ciclinele D și E formează complexe cu ciclin-kinazele dependente 4, 6 și respectiv 2, formare dependentă de acțiunea inhibitoare a p27. Formarea acestor complexe, care este urmată de activarea lor permite activarea genei pRb cu acțiune asupra factorului de transcripție E2F, necesar tranziției spre faza S [91]. Studiile au demonstrat că o supraexprimare a acestuia determină inhibarea activării complexelor ciclin/ciclin-kinazelor dependente, împiedicând progresul ciclului celular [92]. Relația dintre cancer și p27 a fost studiată intens și s-a constatat că o subexprimare a acestui inhibitor este corelată cu un prognostic nefavorabil, tradus prin grad de diferențiere slab și prezența de metastaze [91-92].

EGFR este o proteină transmembranară a familiei ErbB/HER2 implicată în activarea sistemului proteic tirozin-kinazic. Rolul proteinei este reprezentat de implicarea în proliferarea și diferențierea celulară dar și migrare [93-94]. Activarea anormală a receptorului este responsabilă de activarea de căi oncogenice: Ras/ERK, P13K/AKT sau JAK/STAT. Amplificarea genei sau mutațiile punctiforme reprezintă frecvente modificări dovedite în cazul cancerului de cap și gât [94]. Una dintre mutațiile frecvent studiate ale genei EGFR este mutația EGFRvIII care a fost identificată și la pacienții cu tumori de cap și gât, fiind întâlnită în 42% din cazuri [95]. Supraexprimarea proteinei se asociază cu o evoluție nefavorabilă a cancerului, fiind frecvent însoțită de recurențe și o perioadă scurtă de supraviețuire [93-95]. EGFR reprezintă și o țintă a terapiei în cancerele de cap și gât. S-au obținut rezultate pozitive în cazul utilizării anticorpilor monoclonali îndreptați împotriva EGFR în asociere cu radioterapia [93-94]. Studiile clinice urmăresc să găsească noi terapii prin utilizarea de inhibitori de tirozin-kinaze cum ar fi Gefitinib sau Erlotinib, datorită proprietății de a bloca activarea EGFR-ului [93].

p63, este o genă relativ nou descoperită care, alături de p73, face parte din familia p53. Această genă se găsește localizată la nivelul cromozomului 3q27-29; regiunea 3q este frecvent afectată de mutații în cazul cancerelor de cap și gât [96]. Muzio L și colaboratorii într-un studiu despre carcinoamele scuamoase orale evidențiază asocierea unei evoluții nefavorabile cu expresie crescută a p63, în timp ce în cazul carcinoamelor scuamoase laringiene Borba M și colaboratorii obțin o relație între expresia scăzută a p63 și evoluția nefavorabilă [97-98].

Activarea oncogenei Met se traduce prin creștere tumorală rapidă, favorizarea procesului de invazie tumorală și apariția metastazelor. Activarea acesteia presupune asocierea cu HGF (factor de creștere hepatocitar) prin mecanism paracrin [99]. Met și HGF sunt supraexprimate în cancerele de cap și gât și au fost asociate cu un prognostic nefavorabil [94]. Fenomenele de metastazare dar și rezistență la tratament au fost corelate mai ales cu Met [94]. Pe lângă această supraexprimare în cazul cancerelor de cap și gât, au fost identificate și mutații somatice ale Met cu repercusiuni asupra proliferării și metastazării tumorale [99].

PI3- kinazele reprezintă o familie de enzime în mecanismele reglatoare ale ciclului celular. S-a demonstrat implicarea acestor enzime în creșterea, diferențierea, proliferarea și migrarea celulară [129]. Activitatea aberantă a caii PI3k este prezentă în cazul carcinoamelor scuamoase de cap și gât, până la 30,5% din cazuri [130]. PIK3CA a fost identificată ca fiind cea mai frecventă mutație genică a acestei căi, prezența sa corespunzând unui procent de până la 20% din cazurile de cancer de cap și gât [129-130]. Prezența acestei gene mutante a fost descrisă în special în tumorile HPV-pozitive [130]. Mutațiile acestei căi favorizează progresia tumorală în absența altor mutații sincrone, cum ar fi gena p53 [129]. Această cale reprezintă o importantă țintă în terapie, actual în trialurile clinice fiind studiat efectul utilizării inhibitorilor PI3K în asociere cu chimioterapia și Centuximab în cazul cancerelor de cap și gât [94].

PROGRESIA ȘI METASTAZAREA TUMORALĂ

După pierderea funcțiilor supresoare tumorale și activarea oncogenelor noi mecanisme intervin pentru a permite celulelor tumorale o dezvoltare completă și o extindere locală dar și la distanță. Alterări ale profilului citokeratinelor, pierderi ale adezivității celulare sau angiogeneza sunt doar unele din modificările care urmează să fie prezentate.

Alterarea profilului citokeratinelor

Citokeratinele reprezintă filamente proteice intermediare care intră în structura celulară, în special la nivelul citoscheletului, fiind asociate cu gradul de diferențiere al acestora [101]. Epiteliul stratificat este caracterizat de un profil al citokeratinelor diferit, în funcție de straturile celulare. Stratul bazal, care este asociat cu caractere proliferative, exprimă Ck5, Ck14 si Ck17 [102]. Aspectul hiperproliferativ este asociat și cu Ck6 și Ck16, prezente în straturile celulare suprabazale [102]. Ck17 s-a asociat cu o expresie pozitivă și intensă în cancerul scuamos laringian dar și în displazie astfel îl putem considera un marker implicat în transformarea malignă [103]. Rolul Ck13 a fost și el investigat și s-a corelat cu formele bine diferențiate de carcinom scuamos laringian [104]. Studiile au confirmat faptul că există o modificare a profilului citokeratinelor odată cu transformarea malignă. În timp ce formele bine diferențiate de carcinom scuamos sunt asemănătoare cu normalul, în formele slab diferențiate se constată o reducere a stratificării cu o predominanța a straturilor bazale. Aspect evidențiat și în cazul citokeratinelor, predominând markerii straturilor bazale și cei ai hiperproliferării [105].

Pierderea adezivității celulare

Stabilitatea epitelială este posibilă datorită contactului dintre celule sau a joncțiunilor formate. Pierderea arhitecturii normale presupune deplasarea celulelor de la locul de origine, distrucția matrixului extracelular, capacitatea de deplasare și în final posibilitatea de a invada și forma metastaze într-un teritoriu nou [106]. Caderinele împreună cu cateninele sunt principalele proteine implicate. Dintre caderine, E și P-caderina au fost cele mai studiate. E-caderina este legată de o expresie diminuată sau chiar absentă în carcinoamele scuamoase. Procesul de metilare pare a fi mecanismul de diminuare al E-caderinei [107]. În cazul cancerelor de cap și gât a fost observată prezența unui fenomen “switch”, fenomen care asociază scăderea expresiei E-caderinei cu creșterea N-caderinei; N-caderina fiind considerată un factor pro-oncogen [107]. Asocierea E-caderinei cu Vimentina a fost studiată de Nijkamp MM și colaboratorii, în cadrul studiului diminuarea E-caderinei a fost asociată cu un nivel crescut de Vimentină prezentând un risc înalt de metastazare [108]. Cateninele reprezintă și ele componente ale sistemului de adeziune, iar dintre acestea cele mai studiate sunt beta-cateninele. Relocalizarea beta-cateninei alături de reducerea E-caderinei sunt fenomene frecvente ale cancerelor de cap și gât metastazante [107]. Integrinele sunt și ele implicate în procesul de menținere al adezivității celulare. Prezența unei expresii aberante ale acestora este asociată cu fenomene de invazie tumorală și metastazare [107]. Cea mai studiată integrină este integrina αvβ6, exprimată în mod normal la nivelul stratului bazal celular și expresia anormală este corelată cu dezvoltarea cancerelor scuamoase [109]. CD44, o glicoproteină transmembranară cu numeroase izoforme, este asociată cu procesele de menținere a arhitecturii normale tisulare dar și diseminarea tumorală [110]. De asemenea s-a dovedit faptul că CD44 este implicat și în alte procese precum motilitatea celulară, transmiterea unor semnale sau degradarea acidului hialuronic, component al matrixului extracelular [111]. Expresia CD44 în carcinoamele scuamoase laringiene este diferită de expresia altor elemente din cadrul sistemului de adeziune, fiind crescută în formele agresive, slab diferențiate de cancer [112]. O concentrație crescută a acestei glicoproteine a fost identificată în sângele periferic al pacienților diagnosticați cu cancere de cap și gât iar un procent crescut de celule CD44 pozitive este direct legat de apariția recurențelor [94]. În cazul carcinoamelor scuamoase s-a dovedit o legătură între expresia CD44 și răspunsul pozitiv la radioterapie [94].

Alterarea matrixului extracelular

Matrixul extracelular are rolul de a nu permite celulelor tumorale posibilitatea de a se deplasa de la locul de origine. În urma studiilor efectuate au fost identificate o serie de mecanisme capabile de degradarea matrixului, prin degradarea macromoleculelor componente și implicit a membranei bazale [113]. Au fost identificate peste 20 de tipuri de matrix-metaloproteinaze (MMP) cu rol în distrugerea membranei bazale dar și a stromei, penetrarea peretelui vaselor de sânge sau metastazare [115]. MMP2 și MMP9 sunt cele mai studiate matrix-metaloproteinaze în carcinoamele scuamoase laringiene, cu rol în degradarea colagenului IV din membrana bazală [115]. Prezența și supraexprimările acestor gelatinaze au fost corelate cu un prognostic nefavorabil și prezența de metastaze [113-115]. MMP9 a fost identificat în 92% din cazurile de carcinoame și prezența sa a fost corelată cu formele slab diferențiate și stadii tumorale avansate [114]. Studiile au confirmat și legătura dintre MMP2 și apariția metastazelor și a unei perioade mai scurte până la apariția recurențelor [114].

În distrugerea componentelor matrixului extracelular sunt implicate și catepsinele, o familie de endopeptidaze lizozomale [113]. Catepsina B și Catepsina D au fost studiate în relație cu cancere de cap și gât și s-a stabilit o legătură între acestea și tendința crescută de invazie și metastazare [116]. Într-un studiu efectuat pe 63 de pacienți cu carcinom scuamos laringian, Maurizi M și colaboratorii au demonstrat relația dintre valori mari ale catepsinei D și prezența metastazelor la nivelul gâtului [117]. Aceiași autori au emis și ipoteza conform căreia catepsina D este asociată cu identificarea pacienților cu un risc mare de dezvoltare a metastazelor și evoluție nefavorabilă a bolii, indiferent de prezența sau absența metastazelor la nivelul gâtului în momentul diagnosticării [117].

Angiogeneza tumorală

Angiogeneza tumorală constituie un mecanism biomolecular important, implicat în dezvoltarea tumorală care apare în urma unui dezechilibru între factorii pro și anti-angiogenici eliberați atât de celulele normale cât și de cele tumorale [113]. Formarea noilor vase permite celulelor tumorale pătrunderea în circulație și posibilitatea invadării unor teritorii aflate la distanță, adică apariția metastazelor [118]. La ora actuală se consideră utilă pentru angiogeneză determinarea densității microvasculare (MVD), prin folosirea de diverși markeri imunohistochimici. Această MVD este considerată un marker indirect al angiogenezei și se corelează cu evoluția cancerului și apariția de metastaze [113,119]. Angiogeneza a fost cuantificată prin intermediul diverșilor markeri: CD31, CD34, CD105 sau factorul von Willebrand. Dintre aceștia CD105 sau endoglina s-a dovedit a fi cea mai investigată. Endoglina, o glicoproteină membranară, este intens exprimată în timpul procesului de angiogeneză tumorală și absentă sau slab reprezentată în vasele de sânge din teritoriile normale [113]. Zvrko în studiile sale a stabilit o legătură între endoglină și carcinomul scuamos laringian. Rezultatele sale au demonstrat o relație între valorile mari ale endoglinei și agresivitatea tumorală, tradusă prin stadii tumorale avansate III și IV dar și apariția recurențelor [120-121]. Dintre factorii proangiogenici importanți amintim VEGF (vascular endothelial growt factor), cu rol în stimularea proliferării celulelor endoteliale. Se cunosc mai mulți membri ai familiei VEGF iar dintre aceștia, expresia VEGF-A și VEGF-C a fost analizată în cancerele de cap și gât și creșterea expresiei a fost asociată cu etapele inițiale ale angiogenezei și metastazele ganglionare [122].

Angiopoietinele 1 și 2 împreună cu receptorii lor tirozin-kinazici (Tie1 și 2) sunt implicați în procesul de angiogeneză [123]. Angiopoietina 1 este implicată în procese de maturare vasculară și funcții ale celulelor endoteliale în timp ce Angiopoietina 2 împreună cu VEGF stimulează angiogeneza tumorală, valori crescute ale acestora sugerând un prognostic nefavorabil [123].

Rolul macrofagelor în diverse etape ale cancerogenezei a reprezentat subiectul diverselor studii. Macrofagele din țesuturile tumorale, cunoscute sub numele de Tamaș (tumor-associated macrophages), sunt implicate în creșterea tumorală, angiogeneză dar și metastazare [124]. S-a constatat că hipoxia reprezintă un mediu propice ce duce la activarea TAMs, acestea la rândul lor posedând proprietăți pro-angiogenice și împreună cu VEGF intervin în procesul de angiogeneză tumorală [124].

Un rol important în mecanismul de apariție al carcinomului scuamos laringian îl are și hipoxia, prin intermediul complexului HIF-1. Acest proces intratumoral caracterizează neoplaziile cu un caracter agresiv, reducerea indicelui apoptotic, risc crescut de metastazare dar și rezistența la tratament [94,107,128]. Sub influența unui teren hipoxic, HIF-1 stimulează apariția cancerului prin stimularea angiogenezei, implicarea în procesul de tranziție epitelio-mezenchimală dar și activarea unor enzime cu rol în promovarea invazivității celulelor maligne [128]. Angiogeneza este stimulată prin acțiunea asupra VEGF. HIF-1α (factorul inductor al hipoxiei 1α) este citat ca fiind un marker al procesului de progresie malign și metastazare [94,107]. Mai mult expresia sa este corelată, alături de Snail și Twist, de progresia tumorală rapidă și deces în cazul cancerelor de cap și gât [127]. Un alt rol al acestui factor de transcripție s-a observat în ceea ce privește activarea MMP-17, proteinaza asociată la rândul său cu prognosticul nefavorabil, favorizând astfel procesul de invazivitate [128].

Modificările metabolice sunt alte aspecte prezente in procesul de cancerogeneză. Studiile au confirmat faptul că celulele tumorale necesită o cantitate mult mai mare de glucoză, comparativ cu celulele normale, pentru necesitățile de energie și sinteză mult mai crescute [94]. Pătrunderea glucozei la nivel celular este posibilă prin intermediul unor transportatori GLUT. GLUT-1 este frecvent supraexprimat în cancerele de cap și gât iar expresia sa este corelată cu evoluția nefavorabilă a bolii [131]. Într-un studiu efectuat pe 48 de pacienți, expresia crescută a GLUT-1 a fost însoțită și de o creștere a expresiei GLUT-3, iar acele cazuri au fost carcinoame laringiene slab diferențiate cu prognostic prost al bolii [132].

IL-1α, IL-6 sau IL-8 sunt citokine inflamatorii care au fost legate de evoluția nefavorabilă a cancerelor de cap și gât. Prin conexiunile cu Snail și Twist, IL-6 este implicată în favorizarea procesului de tranziție epitelio-mezenchimală, care în final duce la apariția metastazelor [107].

În cancerele de cap și gât, ultimele teorii descriu implicarea în apariția și progresia cancerului a celulelor stem canceroase. Aceste celule reprezintă o subpopulație celulară prezentă intratumoral, capabile de regenerare și posibilitatea de diferențiere [94]. Ținta terapiilor în cancere o reprezintă celulele capabile de diviziune. Aceste celule tumorale prin capacitățile mici de diviziune sunt rezistente atât la chimioterapie cât și radioterapie [94].

Mutații ale proto-oncogenelor Ras au fost identificate în 20-30% din cazurile de cancer de cap și gât. Dintre genele Ras se pare că gena H-ras este asociată mai frecvent cu această patologie, fiind întâlnită în 4-5% din cazuri [94].

Calea Jak/STAT este legată de procese precum dezvoltarea embrionară dar și în hematopoieză sau răspunsul inflamator [148]. Jaks (janus kinases) fac parte dintr-o familie inactivă de tirozin-kinaze. Prin interacțiunea cu citokinele sunt implicate în recrutarea STAT [148]. STAT este fosforilat de Jaks și astfel sunt implicate în transcripția diverselor gene [94]. Creșterea celulară, angiogeneza și suprimarea imunității reprezintă principalele efecte ale activării căii Jak/STAT [94]. Familia STAT conține mai mulți membri iar dintre aceștia STAT3 și STAT 5 au fost asociați cu oncogeneza. STAT3, activat prin intermediul IL-6, s-a identificat în cazurile de cancer de cap și gât, unde supraexpresia este corelată cu progresia tumorală prin efectul activator al CDKs [148]. Implicarea STAT3 s-a observat și în alte etape ale procesului tumoral. Angiogeneza este un astfel de proces, unde stimulează expresia VEGF. Invazia tumorală și metastazarea sunt vizate prin acțiunea asupra Twist și MMP-2 [148].

CAPITOLUL III

FACTORI DE PROGNOSTIC ÎN CARCINOAMELE

SCUAMOASE LARINGIENE

FACTORI CLINICI

Studiile au analizat influența anumitor factori asupra prognosticului carcinomului scuamos laringian. Astfel s-a pus în evidență o legătură între carcinomul scuamos laringian și vârsta, sexul sau mediul social al pacienților. Într-un studiu amplu, în care au fost incluși 690 de pacienți, Jaimanti și colaboratorii au constatat o predilecție net crescută pentru pacienții de sex masculin, numărul acestora ridicându-se la 647 de cazuri [133]. S-a constatat o tendință a creșterii frecvenței leziunilor maligne odată cu înaintarea în vârstă, acestea fiind diagnosticate mai ales între 40-70 de ani [7]. Mediul social al pacienților diagnosticați cu carcinom scuamos poate fi considerat un factor prognostic. Incidența crescută a cancerului întâlnită în mediul rural este corelată cu un mediu socio-economic inferior în care predomină consumul de tutun și alcool dar și lipsa unei educații medicale sau a unui suport social consistent [6].

S-a pus în evidență și prezența unei legături între localizarea tumorii și prognosticul pacienților. Localizarea glotică predomina, ca și frecvență, comparativ cu localizările supra și infraglotică [6]. În cadrul studiilor efectuate au existat totuși diferențe: țările scandinave și Franța prezentând o predominanță cu un procent >50% în favoarea etajului glotic, în timp ce continentul american a prezentat etajul supraglotic mai frecvent implicat [6]. Aria glotică prezintă un număr redus de vase limfatice, rar fiind asociată cu apariția metastazelor ganglionare [4]. Localizarea carcinoamelor la nivelul etajului supraglotic reprezintă un factor de prognostic negativ datorită riscului mai mare de apariție a metastazelor, comparativ cu leziunile diagnosticate în celelalte localizări, lucru explicat printr-o rețea limfatică mai bine reprezentată [4]. Au fost asociate localizările carcinoamelor și cu fumatul și alcoolul. În timp ce fumatul a fost direct asociat de implicarea etajului glotic, alcoolul a fost asociat cu cancerele supraglotice [6, 10].

FACTORI HISTOPATOLOGICI

Prezența metastazelor ganglionare este unul dintre cei mai importanți factori de prognostic. Invazia capsulară ganglionară precum și numărul ganglionilor interesați reprezintă două aspecte importante cu repercusiuni în ceea ce privește riscul de apariție al metastazelor la distantă precum și prognosticul pacienților [134]. În cazul diagnosticării invaziei ganglionare, examenul de bază este cel histopatologic în ciuda faptului că invazia ganglionară sau chiar depășirea dincolo de capsula ganglionară pot fi examinate prin tehnici imagistice [134].

Rata de supraviețuire la 5 ani în cazul carcinoamelor laringiene fără invazie ganglionară reprezintă un procent de 60% [6]. Identificarea metastazelor a dus la raportarea unei scăderi semnificative a acestei rate de supraviețuire până la 30% după unii autori [6]. Conform rezultatelor lui Jakobsen J și colaboratorii prezența metastazelor ganglionare în momentul diagnosticării a fost de 1% în cazul carcinoamelor glotice și 29% în carcinoamele supraglotice [135]. Etajul glotic prezintă rate de supraviețuire mult mai mari în comparație cu etajul supraglotic. Rata de supraviețuire în cazul implicării zonei glotice atinge un procent până 95% în stadiile T1 și T2 comparativ cu stadiile avansate, asociate cu prezența de metastaze, unde procentul poate să atingă valori de 30% [6]. Procentele în cazul carcinoamelor supraglotice sunt mai mici, ajungându-se la o rată de supraviețuire la 5 ani < 30% a pacienților [6]. A fost sugerată o asociere între prezența metastazelor ganglionare și marginile de rezecție invadate iar acești doi factori au fost la rândul lor asociați cu un prognostic nefavorabil [6].

Un alt factor histopatologic de prognostic important este stadiul tumoral. Carcinomul scuamos laringian diagnosticat în stadii incipiente (I și II) ale neoplaziei se asociază cu o probabilitate crescută de vindecare dar majoritatea cazurilor se prezintă tardiv la medici, datorită lipsei simptomatologiei în fazele inițiale și astfel sunt diagnosticați în stadii avansate (III și IV) [136]. Stadiile avansate reprezintă 73,6% din cazuri și sunt asociate cu un prognostic nefavorabil de evoluție al bolii, agresivitate și apariția rapidă a recurențelor [137]. Rata de supraviețuire la 5 ani în cazul stadiilor incipiente atinge valori între 73-92% în timp ce în cazul stadiilor avansate scade la 35-64% [4]. Stadiul tumoral avansat a fost diagnosticat frecvent în cazul localizărilor supraglotice ale carcinoamelor laringiene, localizare asociată și ea cu un prognostic nefavorabil [4].

Stabilirea gradului de diferențiere este un alt factor histopatologic util în aprecierea comportamentului tumoral și evaluarea prognosticului. Este cunoscut faptul că în funcție de gradul de diferențiere carcinoamele scuamoase laringiene pot fi bine, moderat sau slab diferențiate. Asocierea cu prognosticul nefavorabil revine gradului slab de diferențiere. Markou K și colaboratorii au stabilit un procent ridicat de 31,4% al prezenței metastazelor ganglionare în cazul formelor slab diferențiate ale carcinoamelor scuamoase laringiene comparativ cu procentul de doar 4.9% în cazul formelor bine diferențiate [6].

Tipul histologic prin diferitele forme de carcinom scuamos este asociat cu un prognostic rezervat. O formă rar întâlnită, adesea confundată cu leziunile benigne, este carcinomul verucos. Acest tip de carcinom scuamos este o formă bine diferențiata și este frecvent descrisă în cancerele de cap și gât la nivelul cavității orale [138]. A doua localizare ca și frecvență în cancerele de cap și gât a carcinoamelor verucoase este la nivelul laringelui, reprezentând până la 1% din cazuri [138]. Frecvența ridicată a fost stabilită în rândul populației de sex masculin, rasa albă și vârsta mai mare de 60 ani [138-139]. În ceea ce privește localizarea, etajul glotic este frecvent interesat și prezența metastazelor este rar amintită, astfel este însoțit de un prognostic excelent [138]. O formă de asemenea rară, sub 1% din carcinoamele laringiene, este carcinomul bazaloid. Această formă rară de carcinom laringian este o tumoră de grad înalt, extrem de agresivă, cu apariție rapidă de metastaze loco-regionale dar și la distanță [140]. Această tumoră este de asemenea întâlnită, în special, în rândul sexului masculin, vârsta 60-80 de ani [140-141]. Cele mai multe cazuri s-au localizat la nivel supraglotic și 64% din cazuri în momentul diagnosticării au prezentat metastaze loco-regionale [141].

Marginea de rezecție este un alt factor asociat cu prognosticul pacienților. O margine de rezecție pozitivă se traduce prin prezența de celule tumorale post intervenție chirurgicală, fenomen asociat cu apariția rapidă de recurențe dar și metastaze loco- regionale [4].

Invazia limfovasculară și perineurală în cazul carcinomului scuamos se poate asocia cu risc crescut de apariție al metastazelor loco-regionale cât și la distanță [5]. Fenomenul de invazie a fost corelat cu forme agresive de cancer aflate în stadii avansate, posibilitatea de apariție rapidă a recurențelor și o perioadă de supraviețuire mică [5].

Stabilirea patternului de invazie este util, fiind importantă asocierea acestui parametru cu prognosticul. Patternul de invazie expansiv indică un prognostic mai bun în comparație cu patternul infiltrativ care este asociat frecvent cu evoluția nefavorabilă a carcinoamelor [5].

FACTORI MOLECULARI

Transformarea unui epiteliu normal laringian într-un carcinom scuamos presupune un proces de durata, un proces complex, ce implică numeroase alterări genetice cu apariția unei noi populații celulare modificate.

Încă din primele etape ale transformării maligne s-a constatat pierderea regiunii 9p21, ce conține gena p16 [114]. Pierderea acestei gene, prezența până la 82% din cazuri a fost legată de scăderea perioadei de supraviețuire [114]. Prezența metastazelor la distanță reprezintă un martor al evoluției nefavorabile și s-a constatat o legătură între acestea și alterările genetice ale genei p16 și anume deleția acesteia [114].

Mutații ale genei p53 sunt prezente în 50-69% din cazurile de cancer de cap și gât. Apariția genei mutante este posibilă prin ștergerea ambelor alele și corespunde unui prognostic nefavorabil cu risc crescut de apariție a recurențelor [114]. Supraexprimarea genei p53 mutante, bine reprezentată în cazul carcinoamelor laringiene, denotă o perioadă de supraviețuire mică [114].

Supraexprimarea sau/și amplificarea ciclinei D1 (CCND1) este prezentă în 17-79% dintre carcinoamele scuamoase de cap și gât, în special la nivel laringian [114].

Ciclin D1 este un important reglator al tranziției celulare din faza G1 în faza S a ciclului celular [81]. Alterările genetice ale ciclin D1 constituie factori de risc implicați în apariția metastazelor și a stadiilor avansate de boală [114].

Perturbarea activității factorului de creștere epidermal (EGFR) a fost observată în cazul cancerelor de cap și gât, corelându-se cu progresia tumorală și riscul de metastazare [113]. Studiile au stabilit o implicare a EGFR-ului prin două tipuri de alterări genetice. Într-o primă etapă supraexprimarea EGFR a fost notată pentru ca într-o a doua etapă amplificarea EGFR să definitiveze apariția carcinomului scuamos [114].

Agresivitatea carcinoamelor scuamoase laringiene a fost studiată și prin corelații cu familia matrix-metaloproteinazelor (MMP). Expresia pozitivă a MMP-2 și MMP-9 caracterizează o evoluție nefavorabilă a carcinomului laringian [113]. Forme agresive, tot cu evoluții nefavorabile au fost evidențiate în cazurile tumorile pozitive pentru MMP-13 și MMP-14 [5].

Un marker al agresivității carcinoamelor scuamoase laringiene este reprezentat de prezența metastazelor. Prezența sau absența metastazelor poate fi corelată cu determinarea anumitor enzime. Cox-2 (ciclo-oxigenaza 2) este în mod normal nedetectabilă în celulele normale dar expresia sa a fost identificată în cancerele de cap și gât, stabilându-se astfel o conexiune cu etapele inițiale ale procesului de cancerogeneza dar și progresia tumorală [114]. Metodele de identificare folosite au fost atât imunohistochimice cât și prin PCR, procentele obținute fiind asemănătoare: 70-88% respectiv 87% [114] Caracteristic expresiei crescute este asocierea cu prezența metastazelor ganglionare încă din momentul diagnosticului și a stadiului avansat de boală [142].

Catepsina D este o endopeptidază implicată în distrugerea matrixului extracelular a cărei supraexpresie este corelată cu diferite tipuri de cancer, printre care și carcinomul scuamos laringian [113]. Supraexprimarea catepsinei D a fost identificată în cazurile de carcinoame cu prezența de metastaze loco-regionale și chiar a fost emisă ipoteza conform căreia catepsina D poate fi considerată un marker de prognostic, fiind asociată cu evoluția nefavorabilă [117].

Ultimele studii privind factorii de risc implicați în apariția cancerelor de cap și gât citează infecția cu virusul HPV ca având un rol benefic [93]. S-a pus în evidențiază relația între riscul crescut al progresiei cancerului și tumorile HPV- negative [143]. Tumorile HPV- pozitive, post radioterapie și chimioterapie, prezintă o rată de progresie mult mai mică dar și un risc de deces mult mai mic comparativ cu tumorile HPV- negative [144]. Tumorile maligne situate la nivelul etajului glotic sunt mai frecvent asociate cu infecția HPV, conform unui studiu [145]. Același studiu concluzionează că infecția HPV este un factor de prognostic favorabil în cazul carcinoamelor scuamoase laringiene [145].

CAPITOLUL IV

CLASIFICAREA TUMORILOR LARINGIENE

Ultima clasificare publicată de Grupul de Lucru pentru Tumorile de Cap și Gât din cadrul Organizației Mondiale a Sănătății datează din anul 2005 [5]:

I. TUMORI EPITELIALE MALIGNE

Carcinom scuamos

Carcinom verucos

Carcinom scuamos bazaloid

Carcinom scuamos papilar

Carcinom cu celule fuziforme

Carcinom scuamos acantolitic

Carcinom adenoscuamos

Carcinom limfoepitelial

Carcinom cu celule gigante

Tumora malignă a glandelor salivare?

Carcinom mucoepidermoid

Carcinom adenoid chistic

II. TUMORI NEUROENDOCRINE

Carcinoid- forma clasică

Carcinoid atipic

Carcinom cu celula mică- forma neuroendocrină

Carcinom cu celula mică- forma combinată

III. TUMORI EPITELIALE BENIGNE

Papilom

Papilomatoză

Adenoame ale glandelor salivare?

Adenom pleomorf

Chistadenom papilar oncocitar

IV. TUMORI DE ȚESUTURI MOI

Tumori maligne

Fibrosarcom

Histiocitom fibros malign

Liposarcom

Leiomiosarcom

Rabdomiosarcom

Angiosarcom

Sarcom Kaposi

Tumora maligna a tecii nervului periferic

Sarcom sinovial

Tumori borderline/LMP

Tumora miofibroblastică inflamatorie

Tumori benigne

Schwanom

Neurofibrom

Lipom

Leiomiom

Rabdomiom

Hemangiom

Limfangiom

Tumora cu celule granulare

V. TUMORI HEMATOLIMFOIDE

VI. TUMORI OSOASE ȘI CARTILAGINOASE

Condrosarcom

Osteosarcom

Condrom

Tumora cu celule gigante

VII. MELANOM MALIGN LA NIVELUL MUCOASEI

VIII. METSTAZE TUMORALE

STADIALIZARE T.N.M.

Prima propunere pentru utilizarea clasificării TNM datează încă din anul 1944 dar abia în anul 1958 a fost publicată prima clasificare, în care au fost incluse tumorile de sân și laringe [146,147].

Definitivarea celor trei categorii clinice ce constituie clasificarea clinică TNM (tumoră, adenopatie, metastaze) a fost realizată de OMS și UICC. Ulterior în vederea obținerii unui diagnostic și a unei terapii cât mai precise, clasificarea a fost revizuită și introduse doua noțiuni: clasificarea TNM clinică preterapeutică (c) și TNM postterapeutică (p).

Clasificarea TNM în cazul cancerelor laringiene este următoarea [5]:

T- tumora primară

Tx- tumora primară nu poate fi evaluată

T0- nu exista dovezi ale prezenței tumorii primare

Tis- carcinom in situ

Etajul supraglotic

T1- tumoră localizată la nivel supraglotic, cu păstrarea mobilității normale a corzilor vocale

T2- tumora invadează mucoasa sau una dintre regiunile supraglotice sau glotice, sau depășește zona supraglotică (mucoasa de la baza limbii, valecula, peretele medial al sinusului piriform), cu păstrarea mobilității

T3- tumoră limitată la nivelul laringelui, cu fixarea corzilor vocale și/sau invadarea următoarelor structuri: aria postcricoidă, țesuturi preepiglotice, spațiul paraglotic și cu/fără prezența de eroziuni minime ale cartilajului tiroid

T4a- tumora invadează cartilajul tiroid și/sau structurile adiacente: trahee, țesuturi moi ale gâtului inclusiv mușchii extrinseci ai limbii (genioglos, hipoglos, palatoglos, stiloglos), tiroidă, esofag

T4b- tumora invadează spațiul prevertebral, structuri mediastinale sau înconjoară artera carotidă

Etajul glotic

T1- tumora invadează corzile vocale, cu păstrarea mobilității

T1a- tumoră limitată la o singură coardă vocală

T1b- tumora invadează ambele corzi vocale

T2- tumora se extinde la nivel supraglotic și/sau subglotic, și/sau cu păstrarea mobilității normale doar la o coardă vocală

T3- tumoră localizată la nivelul laringelui cu pierderea mobilității corzilor vocale și/ sau invadarea spațiului paraglotic și/sau prezența de eroziuni minime ale cartilajului tiroid

T4a- tumora invadează cartilajul tiroid și/sau structurile adiacente: trahee, țesuturi moi ale gâtului inclusiv mușchii extrinseci ai limbii (genioglos, hipoglos, palatoglos, stiloglos), tiroidă, esofag

T4b- tumora invadează spațiul prevertebral, structuri mediastinale sau înconjoară artera carotidă

Etajul infraglotic

T1- tumoră localizată infraglotic

T2- tumoră extinsă la nivelul corzilor vocale cu păstrarea mobilității normale a corzilor vocale sau doar la o singură coardă vocală

T3- tumoră limitată la nivelul laringelui, cu pierderea mobilității corzilor vocale

T4a- tumora invadează cartilajul cricoid sau tiroid și/sau structurile adiacente: trahee, țesuturi moi ale gâtului inclusiv mușchii extrinseci ai limbii (genioglos, hipoglos, palatoglos, stiloglos), tiroidă, esofag

T4b- tumora invadează spațiul prevertebral, structuri mediastinale sau înconjoară artera carotidă

N- limfonoduli regionali

Nx- ganglionii limfatici regionali nu pot fi evaluați

N0- fără metastaze regionale

N1- metastază într-un singur ganglion ipsilateral, cu diametru mai mic sau egal cu 3 cm

N2a- metastază într-un singur ganglion ipsilateral, cu diametru celei mai mari dimensiuni mai mare de 3cm dar nu mai mare de 6 cm

N2b- metastaze în mai mulți ganglioni ipsilaterali, diametrul celei mai mari dimensiuni sub 6 cm

N2c- metastaze în ganglioni bilateral sau contralateral, diametrul celei mai mari dimensiuni sub 6 cm

N3- metastază într-un singur ganglion, diametrul celei mai mari dimensiuni peste 6 cm

M- metastaze la distanță

M0- metastaze la distanță absente

M1- metastaze la distanță prezente.

Pentru clasificarea histopatologică post- intervenție chirurgicală se utilizează aceleași categorii pentru pT, pN și pM, dar se adaugă gradul de diferențiere și statusul tumorii reziduale.

În funcție de gradul de diferențiere, clasificarea se face astfel:

Gx- gradul de diferențiere nu poate fi evaluat

G1- bine diferențiat

G2- moderat diferențiat

G3- slab diferențiat

G4- nediferențiat

Prezența sau absența tumorii reziduale după tratament se notează prin litera “R”:

Rx- prezența tumorii reziduale nu poate fi evaluată

R0- tumora reziduală absentă

R1- tumora reziduală evidențiabilă microscopic

R2- tumora reziduală evidențiabilă macroscopic.

Tabel I.1. Stadializarea pe baza actualei clasificări TNM

CONTRIBUȚII PROPRII

OBIECTIVELE STUDIULUI

Prezentul studiu prezintă o investigare a factorilor de prognostic dar și a procesului de cancerogeneză pentru carcinoamele scuamoase laringiene, pentru care au fost folosite atât metode clasice de investigare, cât și metode moderne, cum este tehnica imunohistochimică.

Cancerul laringian reprezintă o problemă de sănătate majoră prin incidența care este în continuă creștere precum și de un număr crescut de decese, in special in rândul sexului masculin. Principalele cauze ale decesului sunt reprezentate de recurența locală, metastazele ganglionare dar și a metastazelor la distanță. Aceste aspecte ale cancerului laringian duc la identificarea unor noi posibilități terapeutice care sa ajute la îmbunătățirea vieții precum și a supraviețuirii pacienților.

Procesul de cancerogeneză presupune alterarea materialului genetic astfel este importantă cercetarea modificărilor genetice care apar in carcinomul scuamos laringian, pentru a se putea stabili relația acestora cu factorii de risc.

Este necesară identificarea numeroaselor fenomene care intervin în apariția și progresia cancerului, pentru că aduc informații utile atât pentru procesul de cancerogeneză cât și posibilitatea identificării unor factori de prognostic. Prezentul studiu a urmărit evaluarea unor markeri clinico-epidemiologici, histopatologici și imunohistochimici pentru identificarea unor posibile ținte prognostice dar și o diagnosticare cât mai precisă cu folosirea unui tratament cât mai util încă din primele etape.

Principalele obiective ale acestui studiu au fost reprezentate de:

• Evaluarea factorilor de risc frecvent implicați in etiologia cancerelor laringiene,

• Extinderea noțiunilor despre diverși factori clinico-epidemiologici, histopatologici și imunohistochimici care intervin in carcinogeneza laringiana, cu scopul diagnosticării carcinoamelor scuamoase cât mai precoce și aplicării unei terapii individuale țintite,

• Aducerea de informații noi care sa ajute la identificarea mecanismelor și a markerilor implicați în invazia și agresivitatea carcinoamelor scuamoase laringiene,

• Identificarea markerilor care permit evaluarea riscului de recidivă al carcinoamelor,

• Identificarea acelor markeri specifici care permit evaluarea prognosticului în carcinoamele scuamoase laringiene.

CAPITOLUL V

MATERIAL ȘI METODE

V.A. MATERIALUL CERCETAT

Prezentul studiu a fost realizat pe o perioadă de 3 ani (2010-2012), cuprinzând un număr de 293 cazuri de carcinoame scuamoase laringiene.

Materialul utilizat pentru cercetare a fost reprezentat de material uman provenit de la pacienți internați în Clinica de ORL a Spitalului Clinic Județean de Urgență Craiova. În prezentul studiu au fost utilizate și blocurile de parafină din histoteca Laboratorului de Anatomie Patologică precum și foile de observație din Clinica ORL ale Spitalului Clinic Județean de Urgență Craiova.

Materialul uman recoltat a provenit din piese de exereză chirurgicală și din fragmente biopsice. Din numărul total de 293 cazuri cu diagnosticul de cancer laringian, un număr de 67 cazuri au fost reprezentate de piese de exereză chirurgicală și un număr de 226 cazuri au fost diagnosticate pe fragmente biopsice (tabel V.A.1).

Tabel V.A.1.- Distribuția carcinoamelor scuamoase laringiene în funcție de tipul intervenției chirurgicale

Datele clinice sau anamnestice au fost obținute în urma consultării foilor de observație ale pacienților. Datele obținute au fost în legătură cu: vârsta și sexul pacienților, localizarea, factori de risc asociați (fumat, alcool), antecedente personale patologice (afecțiuni preexistente, tumoră primitivă, recidivă tumorală), simptomatologia, etc.

Aspectele macroscopice (forma, culoare, dimensiuni, localizare, consistență) și diagnosticul histopatologic pentru cazurile retrospective au fost obținute din registrele anatomo-patologice de înregistrare a cazuisticii Laboratorului de Anatomie Patologică.

V.B. METODE UTILIZATE ÎN CERCETARE

În prezentul studiu, într-o primă etapă, am obținut date epidemiologice și clinice despre:

Sexul și vârsta pacienților,

Mediul de proveniență,

Factorii de risc,

Localizarea tumorii.

Materialul obținut, piese provenite din exereză chirurgicală dar și fragmente biopsice, a fost prelucrat în Laboratorul de Anatomie Patologică al Spitalului Clinic Județean de Urgență Craiova conform tehnicii uzuale de includere la parafină. Piesele au fost fixate în formol 10%, neutralizarea a fost realizată cu carbonat de calciu. Procesul de fixare a fost urmat de prelucrare, realizată cu ajutorul procesorului automat de țesuturi, includerea la parafină și secționarea cu ajutorul microtomului, rezultatul fiind obținerea unor secțiuni seriate cu grosimi cuprinse între 3-5 microni. Secțiunile obținute au fost colorate conform tehnicii standard cu Hematoxilină-Eozină.

În analiza histopatologică am inclus parametrii:

Aspectul macroscopic al tumorii,

Varietate histopatologică,

Gradul de diferențiere,

Prezența infiltratului inflamator,

Pattern de invazie,

Prezența sau absența invaziei perineurale/vasculare,

Prezența sau absența adenopatiei satelite,

Stadiul pTNM.

Din cazurile de exereză chirurgicală într-un număr de 67 cazuri a fost posibilă stadializarea clinică și morfologică, precum și includerea în stadiile clinico-morfologice.

Evaluarea diverșilor parametrii histopatologici ne-a permis selecția anumitor cazuri pentru investigația imunohistochimică. Cazurile în care au fost identificați anumiți parametrii precum necroza sau ulcerații extinse au fost excluse.

Tehnica imunohistochimică a cuprins un total de 38 cazuri, a fost realizată pe secțiuni seriate cu grosimea de 4 μm aplicate pe lame cu polilizină și incluse la termostat la 37˚C timp de 6 ore.

Am utilizat ca și metodă de lucru tehnica LSAB2-HRP (Labelled Streptavidin-Biotin 2 System; DAKO, Redox, cod K0675), care presupune mixarea optima dintre streptavidină și enzima biotilinizată, preparată cu 30 minute înainte de examinare. Vizualizarea semnalului a fost realizată cu ajutorul cromogenului (DAB, DAKO, cod 3467). Principalele etape ale tehnicii imunohistochimice au fost reprezentate de:

Deparafinarea în baie de benzen,

Hidratarea secțiunilor în băi de alcool cu concentrații descrescânde,

Demascarea antigenului la microunde,

Blocarea peroxidazei endogene în apă oxigenată, urmată de spălare cu apă distilată,

Incubarea cu anticorpul primar, în funcție de tipul anticorpului și apoi spălare cu soluție de lavaj-PBS,

Incubarea cu anticorpul secundar în camera umedă, urmată de spălare cu soluție de lavaj-PBS,

Incubare cu streptavidină, urmată de spălare cu soluție de lavaj-PBS,

Developare cu cromogen DAB (3,3 diaminobenzidină), ulterior spălare în apă distilată,

Contracolorarea secțiunilor cu hematoxilină-eozină, urmată de spălare în apă distilată,

Montarea secțiunilor cu balsam de Canada.

Examinarea secțiunilor obținute în urma reacțiilor imunohistochimice au fost examinate cu ajutorul microscopului Nikon Eclipse E600 dotat cu cameră de preluat imagini și soft Lucia 5.

Panelul de anticorpi utilizați este prezentat în tabelul de mai jos (tabel V.B.1):

Tabel V.B.1. Panelul de anticorpi utilizați

Pentru asigurarea controlului calitativ al reacțiilor imunohistochimice se vor realiza atât controale pozitive externe- se utilizează țesuturi susceptibile la anticorpii utilizați, cât și controale negative externe- același tip de țesut dar nu se adaugă anticorpul primar.

Interpretarea reacțiilor imunohistochimice a presupus evaluarea expresiei markerilor la nivelul celulelor tumorale și a elementelor stromale. Prezența marcajului pozitiv a fost reprezentat prin identificarea colorației brun la nivel nuclear, citoplasmatic sau membranar. Interpretarea a presupus atât o analiză calitativă prin aprecierea procentului de celule pozitive cât și o analiză cantitativă prin aprecierea intensității imunomarcajului.

Pentru intensitate am cuantificat reacțiile astfel: slab pozitiv (scor 1), moderat pozitiv (scor 2) și reacții intens pozitive (scor 3).

În ceea ce privește numărul celulelor tumorale marcate am considerat: scor 1 (<25% celule pozitive), scor 2 (>26-50% celule pozitive), scor 3 (51-74% celule pozitive) și scor 4 (>75% celule pozitive).

Scorul final obținut în urma înmulțirii scorului intensității și al procentului celulelor marcate, a prezentat valori cuprinse între 1 și 12. Aceste valori au fost utilizate pentru analiza statistică a datelor, astfel valorile cuprinse între 1 și 4 au fost considerate scăzute iar între 6 și 12, crescute.

Pentru scorul markerilor Ki-67 și bcl-2 am folosit un alt sistem de cuantificare. Valoarea scorului a fost obținută prin raportarea numărului de celule pozitive la numărul total de celule numărate (aproximativ 500 de celule), rezultatul fiind înmulțit cu 100.

Datele obținute în urma investigațiilor clinico-epidemiologice, histopatologice și imunohistochimice au fost prelucrate statistic. Între diferitele loturi studiate am realizat o analiza statistică (medii, deviație standard) precum și teste de comparație a mediilor (testul Chi-pătrat, testul Anova) din cadrul softului automat SPSS 20, care implementează algoritmi specifici de studiu multiparametric. Rezultatele cu valoare sub 0,05 au fost considerate semnificative.

FIȘA DE INVESTIGARE A PACIENȚILOR

Date de identificare

Număr de înregistrare

Nume/ Prenume

Vârsta

Sex

Date epidemiologice

Mediul de proveniență

Fumat/ Alcool

Antecedente personale patologice

Antecedente heredo-colaterale

Examinare macroscopică

Aspect

Dimensiune

Culoare

Examinare microscopică

Tip histopatologic

Grad de diferențiere

Pattern de invazie

Infiltrat inflamator

Invazie vasculară

Invazie perineurală

Metastaze ganglionare

pTNM

Stadiul tumoral

Examinare imunohistochimică

EGFR

Ki-67

p53

bcl-2

E-caderină

P-caderină

β-catenină

ciclin D1

Snail

CAPITOLUL VI

REZULTATE

VI.A. STUDIUL CLINICO-EPIDEMIOLOGIC AL PACIENȚILOR CU CARCINOAME SCUAMOSE LARINGIENE

În toate cazurile de carcinoame scuamoase laringiene prezente în studiu ne-au interesat anumite date epidemiologice precum: anul diagnosticului, vârsta pacienților, sexul pacienților și diverși factori de risc asociați.

PERIOADA DE STUDIU

În prezentul studiu am inclus 293 de cazuri diagnosticate cu carcinom scuamos laringian într-un interval de 3 ani, cuprins între 2010-2012. În ordinea frecvenței am identificat următoarea distribuție pe ani calendaristici a cazurilor: 89 de cazuri (30,7%) în anul 2010, 96 de cazuri (32,7%) în anul 2011 și 108 cazuri (36,8%) în anul 2012 (tabel VI.A.1). Maximul incidenței a fost înregistrat în anul 2012.

Tabel VI.A.1. Distribuția carcinoamelor scuamoase laringiene pe ani calendaristici

Cazurile analizate au fost repartizate inegal în cei trei ani dar cu oscilații mici de la un an la altul. S-a remarcat o tendință de creștere a numărului de cazuri diagnosticate în fiecare an, mai ales pentru ultimul an luat în studiu, când s-a înregistrat și incidența maximă, reprezentând aproximativ o treime din cazuri.

GRUPE DE VÂRSTĂ

Analizând repartiția carcinoamelor scuamoase laringiene luate în studiu în funcție de grupele de vârstă, am observat că tumorile au fost diagnosticate la pacienți cu vârsta cuprinsă într-un interval destul de lung, care a variat între decadele V și IX de viață (tabel VI.A.2).

Tabel VI.A.2 Distribuția carcinoamelor scuamoase laringiene în funcție de grupele de vârstă

Am remarcat faptul că incidența carcinoamelor scuamoase laringiene a prezentat o creștere progresivă din decada V până în decada VII de viață. Intervalul de vârstă al pacienților incluși în studiu a fost destul de întins, cel mai mare număr de cazuri analizate, și anume 118 cazuri (40,2%) s-a întâlnit în intervalul cuprins între 60-69 ani. În primele patru decade de viață nu a fost prezent niciun caz, iar în decada a V-a de viața, leziunile au fost reduse numeric, respectiv la numai 26 cazuri (8,8%).

Peste vârsta de 70 de ani incidența leziunilor a prezentat o scădere față de decadele anterioare, cele mai puține cazuri fiind înregistrate în decada a IX-a de viața (3,4%). Cel mai tânăr pacient a avut 42 de ani, iar cel mai vârstnic 87 de ani.

GRUPE DE SEX

În ceea ce privește incidența pe sexe a leziunilor, am constatat o predominanță netă a afecțiunilor la sexul masculin, în 288 (98,3%) cazuri din totalul de 293 de cazuri luate în studiu (tabel VI.A.3).

Tabel VI.A.3. Distribuția carcinoamelor scuamoase laringiene în funcție de sex

În cazul sexului feminin am constatat prezența carcinomului scuamos laringian în doar 1,7% din cazuri care reprezintă 5 cazuri dintre cele analizate.

MEDIUL DE PROVENIENȚĂ

Analiza mediului de proveniență al pacienților a reprezentat un alt aspect al studiului nostru. Astfel am observat că un număr de 216 de pacienți (73,7%) diagnosticați cu carcinom scuamos laringian au provenit din mediul rural, spre deosebire de mediul urban pentru care numărul cazurilor a fost mult mai redus, respectiv la doar 77 de cazuri (26,3%) (tabel VI.A.4).

Tabel VI.A.4. Distribuția carcinoamelor scuamoase laringiene în funcție de mediul de proveniență

FACTORII DE RISC

Datele curente precum și datele retrospective obținute din foile de observație ale pacienților ne-au permis identificarea unor factori de risc implicați în apariția carcinomului scuamos laringian. Dintre aceștia am putut obține informații referitoare la fumat și consumul de alcool, precum și leziunile preexistente la nivelul mucoasei laringiene sau asocieri ale acestora (tabel VI.A.5).

Tabel VI.A.5. Distribuția carcinoamelor scuamoase laringiene în funcție de factorii de risc

Am observat faptul că într-un număr mare de cazuri factorii de risc s-au asociat între ei, fiind vorba în special de fumat și alcool sau fumat, alcool și leziunile preexistente. Dacă fumatul sau etilismul cronic s-au regăsit în antecedentele pacienților în proporție de 91,8% și respectiv, 34,8%, factorii de risc asociați au fost prezenți la un număr de 137 de pacienți, reprezentând 46,7% dintre cazurile luate în studiu. Leziunile preexistente au fost întâlnite la un număr de 61 de cazuri (20,8%). Din precedentele 33 de cazuri (11,3%) au corespuns refluxului gastro-esofagian iar restul de 28 cazuri (9,5%) revenind leucoplaziei și laringitei cronice.

Un factor de risc important, implicat în etiopatogenia carcinomului scuamos laringian îl reprezintă tutunul, prezent în majoritatea cazurilor luate în studiu, izolat dar și în asociere cu alți factori de risc.

În prezentul studiu un număr de 269 de pacienți (91,8%) au fost fumători activi în timp ce doar 24 de pacienți (8,2%) nu au fost fumători, raport care evidențiază un rol major pentru fumat în cancerogeneza laringiană (tabel VI.A.6).

Tabel VI.A.6- Distribuția pacienților fumători, diagnosticați cu carcinoamelor scuamoase laringiene

Vârsta de debut a fumatului a reprezentat un parametru investigat și am constatat faptul că un număr de 106 pacienți (39,5%) au început să fumeze sub vârsta de 20 ani. Restul pacienților (163 cazuri) au deprins acest obicei după vârsta de 20 ani.

Tabel VI.A.7- Distribuția pacienților în funcție de vârsta de debut a obiceiului de a fuma

Un alt aspect important este legat și de perioada de timp cât a fost practicat obiceiul de a fuma.

Am observat faptul că din cei 269 de pacienți-fumători activi, 112 pacienți (41,6%) fumau de peste 25 de ani,88 (32,8%) fumau de 20 ani, 48 dintre aceștia (17,9%) fumau de 15 de ani, 16 pacienți (5,9%) fumau de aproximativ 10 ani și doar un număr de 5 cazuri (1,8%) nu au putut preciza acest aspect (tabel VI.A.8).

Tabel VI.A.8- Distribuția carcinoamelor scuamoase laringiene în funcție de perioada practicării fumatului

Numărul de țigări fumate zilnic de către pacienți reprezintă un alt parametru investigat în studiul nostru. Am constatat că majoritatea pacienților au fumat un pachet/20 de țigări pe zi, respectiv un număr de 174 de pacienți (64,7%), 64 de pacienți (23,8%) au fumat mai puțin de un pachet în timp ce doar 31 dintre aceștia (11,5%) au fumat mai mult de un pachet de țigări pe zi (table VI.A.9).

Tabel VI.A.9- Distribuția carcinoamelor scuamoase laringiene în funcție de numărul de țigări fumate zilnic

Un alt factor etiologic implicat în apariția carcinomului scuamos laringian, independent sau asociat cu alți factori de risc este consumul de alcool. Încadrarea pacienților în trei categorii ale consumului de alcool a fost posibilă prin analiza acestui factor și anume: consumator ocazional- doar în anumite ocazii, consumator obișnuit- 1-2 pahare zilnic și consumator regulat- cantitate mare de alcool zilnic. Cea mai mare parte a pacienților și anume 44 de cazuri (43,1%) s-au încadrat în categoria consumatorilor obișnuiți, urmată apoi de categoria consumatorilor regulați cu 32 de cazuri (31,4%) și consumatori ocazionali în 26 de cazuri (25,5%) (tabel VI.A.10).

Tabel VI.A.10- Distribuția carcinoamelor scuamoase laringiene în funcție de tipul consumatorului de alcool

LOCALIZAREA CARCINOAMELOR SCUAMOASE LARINGIENE

În funcție de etajul laringelui afectat, am constat următoarea frecvență a localizării carcinoamelor scuamoase laringiene: etajul glotic, etajul supraglotic și etajul infraglotic (tabel VI.A.11).

Tabel VI.A.11- Distribuția carcinoamelor scuamoase laringiene în funcție de localizarea leziunilor

Majoritatea tumorilor analizate au prezentat origine la nivelul etajului glotic al laringelui în 199 de cazuri (67,9%). Localizarea de la acest nivel a fost urmată ca și frecvență de etajul supraglotic, unde am constatat o afectare în 89 de cazuri (30,4%). Doar un număr de 5 cazuri (1,7%) dintre tumorile analizate au prezentat origine infraglotică(fig.VI.A.1, fig.VI.A.2, fig.VI.A.3).

Figura.VI.A.1. Carcinom scuamos laringian cu localizare la nivelul etajului supraglotic, imagine intraoperatorie

Figura.VI.A.2. Carcinom scuamos laringian cu localizare la nivelul etajului glotic, imagine intraoperatorie

Figura.VI.A.3. Carcinom scuamos laringian cu localizare la nivelul etajului infraglotic, imagine intraoperatorie

VI.B. STUDIUL MORFOLOGIC AL PACIENȚILOR CU CARCINOAME SCUAMOSE LARINGIENE

Din punct de vedere morfologic am analizat atât aspectele macroscopice cât și pe cele microscopice ale cazurilor luate în studiu.

VI.B.1. STUDIUL MACROSCOPIC AL CARCINOAMLEOR SCUAMOASE LARINGIENE

Unul dintre parametrii analizați este reprezentat de forma tumorilor maligne ale laringelui. Am utilizat următoarele categorii pentru încadrarea tumorilor maligne: leziune infiltrativă, leziune vegetantă la care s-a adăugat și aspectul ulcerativ (tabel VI.B.1).

Tabel VI. B.1- Distribuția carcinoamelor scuamoase laringiene în funcție de aspectul macroscopic al leziunilor

Cele mai puține cazuri au aparținut formei infiltrative, fiind prezentă în 74 de cazuri (25,3%). Leziunea a avut un aspect de leziune plană, imprecis delimitată, cu consistență și dimensiune variabilă. Următoarea categorie identificată a corespuns formei vegetante, în 96 de cazuri (32,8%) din cele 293 de cazuri luate în studiu. Acestea au prezentat o suprafață proeminentă, uneori cu suprafața acoperită de cruste hematice, dimensiuni variabile, contur neregulat, consistență mai des redusă, culoare albicioasă-cenușie și pe secțiune aspect neomogen.

Figura.VI.B.1 Carcinom scuamos laringian, forma vegetantă

Majoritatea cazurilor, 123 de cazuri (41,9%), au corespuns formelor ulcero-vegetante. În aceste cazuri la aspectul vegetant, descris anterior, s-a asociat și prezența unei zone ulcerate, cu aspect de pierdere de substanță (fig.VI.B.1).

VI.B.2. STUDIUL HISTOPATOLOGIC AL CARCINOAMELOR SCUAMOASE LARINGIENE

Din punct de vedere microscopic am analizat următorii parametrii: varietăți histopatologice, gradul de diferențiere, aspectul infiltratului inflamator, patternul de invazie tumoral, prezența sau absența invaziei vasculare și perineurale, prezența adenopatiei metastatice și stadiul pTNM.

VARIETĂȚI HISTOPATOLOGICE

Varietățile histopatologice ale tumorilor laringiene cuprinse în studiu le-am stabilit conform criteriilor OMS [5] de clasificare și astfel am identificat: carcinom scuamos cheratinizat, carcinom scuamos necheratinizat, carcinom scuamos bazaloid, carcinom scuamos verucos și carcinom scuamos papilar (tabel VI.B.2).

Am constatat faptul că cele mai multe dintre cazurile de carcinoame scuamoase laringiene au fost reprezentate de formele necheratinizate cu un număr de 241 de cazuri (82,3%). În ordinea frecvenței am mai întâlnit un număr de 48 de cazuri (16,4%) corespunzătoare formei cheratinizate, forma bazaloidă în 2 cazuri (0,7%) și carcinom verucos în același număr cu carcinomul papilar, fiecare cu câte un caz (0,3%).

Tabel VI.B.2- Repartiția carcinoamelor scuamoase laringiene în funcție de varietatea histopatologică

Cele mai multe cazuri au aparținut formelor cheratinizate și necheratinizate și au fost întâlnite în toate cele trei etaje ale laringelui: supraglotic, glotic și infraglotic. Forma bazaloidă a fost întâlnită atât la nivel supraglotic cât și glotic iar cele mai rare forme, verucos și papilar, au fost prezente doar în localizarea glotică.

Forma cheratinizată de carcinom scuamos laringian a corespuns unui număr de 48 de cazuri (16,4%), și a fost reprezentată de o populație celulară formată din celule scuamoase bine diferențiate, de forme și dimensiuni variabile. Celulele tumorale au reprodus aspectul unui epiteliu stratificat scuamos format din celule de formă poligonală sau chiar rotundă, talie mare, limite celulare vizibile, citoplasmă abundentă, eozinofilă și nuclei cu dimensiuni variabile, pleomorfi, cu activitate mitotică redusă. Celulele tumorale au fost dispuse sub formă de insule sau cordoane de celule izolate. Fenomenul de cheratinizare a fost prezent în interiorul insulelor sub forma unei zone centrale lamelară, eozinofilă (fig.VI.B.1, fig.VI.B.2).

Figura.VI.B.1. Carcinom scuamos laringian cheratinizat,

Col HE, Ob X100

Figura.VI.B.2. Carcinom scuamos laringian cheratinizat,

Col HE, Ob X200

Stroma tumorală a prezentat reacție desmoplazică de intensitate variabilă, infiltrat inflamator acut sau cronic, care în anumite cazuri a îmbrăcat și aspectul de reacție inflamatorie granulomatoasă de corp străin, cu prezența de celule gigante multinucleate.

Carcinoamele scuamoase laringiene necheratinizate au fost diagnosticate într-un număr de 241 de cazuri (82,3%) și au prezentat aspect de cuiburi sau cordoane de celule tumorale. Celulele tumorale au prezentat forme și dimensiuni variabile, citoplasmă destul de abundentă, eozinofilă, limite celulare mai puțin vizibile, nuclei rotunzi-ovalari, veziculoși, atipii și frecvente mitoze atipice (fig.VI.B.3,fig.VI.B.4).

Figura.VI.B.3. Carcinom scuamos laringian necheratinizat,

Col HE, Ob X100

Figura.VI.B.4. Carcinom scuamos laringian necheratinizat,

Col HE, Ob X200

Aspectul de cheratinizare a fost identificat rar dar sub aspectul de cheratinizare unicelulară și a interesat grupuri mici de celule. A putut fi observată și stroma tumorală, care în general a fost redusă cantitativ și la nivelul căreia am putut observa prezența unui infiltrat inflamator variabil, reprezentat de limfocite și plasmocite.

Carcinoamele scuamoase laringiene de tip bazaloid reprezintă forme agresive de carcinom scuamos. Acestea au fost diagnosticate în două cazuri, reprezentând 0,7% din totalul cazurilor studiate. Proliferarea tumorală a fost alcătuită din celule de talie mică, rotunde sau ovalare, citoplasmă redusă și nuclei hipercromi, fără nucleoli, cu activitate mitotică intensă. Această proliferare tumorală a fost dispusă sub formă de cordoane sau insule, uneori au prezentat zone de necroză de tip comedo iar la periferie, inconstant, a putut fi observată o dispunere de tip palisadic a celulelor. Stroma tumorală a fost redusă cantitativ (fig.VI.B.5, fig.VI.B.6).

Figura.VI.B.5. Carcinom scuamos laringian bazaloid,

Col HE, Ob X100

Figura.VI.B.6. Carcinom scuamos laringian bazaloid,

Col HE, Ob X200

Carcinomul scuamos verucos (tumora Ackerman) l-am întâlnit în doar un caz și reprezintă 0,3% din cazuistica studiului. Neoplazia a prezentat un aspect de structură papilară, filiformă, tapetată de un epiteliu scuamos îngroșat, cu suprafața intens cheratinizată și axe conjunctivo-vasculare slab reprezentate sau chiar absente. Populația celulară tumorală a fost formată de celule bine diferențiate, mature cu nuclei ușor măriți de volum, cromatina dispusă în grămezi și absența mitozelor (fig.VI.B.7, fig.VI.B.8).

Figura.VI.B.7. Carcinom scuamos laringian verucos,

Col HE, Ob X40

Figura.VI.B.8. Carcinom scuamos laringian verucos,

Col HE, Ob X100

La nivelul stromei tumorale am identificat un abundent infiltrat inflamator cronic cu limfocite și plasmocite, care pe alocuri a prezentat și reacție granulomatoasă de corp străin datorită cantității mari de cheratină.

O varietate distinctă de carcinom scuamos este carcinomul scuamos papilar, prezent și în studiul nostru, în doar un caz. Tumora s-a caracterizat printr-un pattern de creștere papilar, fiind alcătuită din proiecții papilare, alcătuite la rândul lor din ax conjunctivo-papilar tapetat de epiteliu stratificat. Pleomorfismul celular a putut fi observat, precum și prezența numeroaselor mitoze atipice (fig.VI.B.9).

Figura.VI.B.9. Carcinom scuamos laringian papilar,

Col HE, Ob X100

Invazia tumorala s-a tradus prin prezența de celule tumorale unice sau dispuse sub formă de cuiburi, la care s-a asociat și un abundent infiltrat inflamator cronic.

GRADUL DE DIFERENȚIERE

Un alt criteriu histopatologic al studiului nostru a fost gradul de diferențiere, care ne-a permis identificarea a 52 de cazuri de carcinoame scuamoase bine diferențiate,148 de cazuri moderat diferențiate și 93 de cazuri carcinoame scuamoase laringiene slab diferențiate (tabel VI.B.3).

Tabel VI.B.3- Distribuția carcinoamelor scuamoase laringiene în funcție de gradul de diferențiere

Carcinoamele scuamoase laringiene bine diferențiate au fost prezente în 52 de cazuri și au reprezentat 17,7% din cazuistica studiată. Celulele tumorale au îmbrăcat aspect de celule mature, dimensiuni mari, limite celulare prezente, citoplasmă bine reprezentată, eozinofilă și nuclei mari, dimensiuni variabile și hipercromi, mitoze rare.

Figura.VI.B.10. Carcinom scuamos laringian bine diferențiat,

Col HE, Ob X100

Figura.VI.B.11. Carcinom scuamos laringian bine diferențiat,

Col HE, Ob X200

Carcinoamele moderat diferențiate au reprezentat aproximativ jumătate dintre cazurile noastre, fiind în număr de 148 (50,5%).

Proliferarea tumorală a fost formată din celule de formă poligonală, cu limite celulare mai puțin evidente, citoplasmă mai puțin cantitativă, eozinofilă și nuclei cu un grad mai mare de atipie și mitoze atipice. Celulele au fost dispuse tot sub formă de insule sau cordoane iar cheratinizarea, în cazurile în care a mai fost prezentă, a luat aspectul de cheratinizare unicelulară(fig.VI.B.12, fig.VI.B.13).

Figura.VI.B.12. Carcinom scuamos laringian moderat diferențiat,

Col HE, Ob X100

Figura.VI.B.13. Carcinom scuamos laringian moderat diferențiat,

Col HE, Ob X200

Carcinoamele slab diferențiate au fost prezente în 93 de cazuri, reprezentând 31,8% din tumorile investigate. Populația tumorală a fost reprezentată de celule de talie mică, ovalare, cu limite celulare indistincte, citoplasmă redusă cantitativ și nuclei hipercromi, uneori multipli. Mitoze tipice și atipice au fost identificate într-un procent ridicat, comparativ cu formele bine și moderat diferențiate. Cheratinizarea nu a fost prezentă(fig.VI.B.14, fig.VI.B.15).

Figura.VI.B.14. Carcinom scuamos laringian slab diferențiat,

Col HE, Ob X100

Figura.VI.B.15. Carcinom scuamos laringian slab diferențiat,

Col HE, Ob X200

INFILTRATUL INFLAMATOR

La nivelul interfeței tumoră/gazdă precum și printre proliferările tumorale am constatat prezența de infiltrat inflamator cu amploare diferită. Identificarea infiltratului inflamator a fost posibilă în 272 de cazuri. Reacția inflamatorie a îmbrăcat mai multe aspecte: bandă continuă, densă (infiltrat abundent) în 73 de cazuri, bandă discontinuă (infiltrat moderat) în 118 cazuri și limitat la doar mici grupuri de celule (infiltrat redus) în 81 de cazuri (tabel VI.B.4).

Tabel VI.B.4- Distribuția carcinoamelor scuamoase laringiene în funcție de infiltratul inflamator

Astfel în cele mai multe dintre cazurile investigate, 118 cazuri (43,4%) am identificat o amploare moderata a infiltrării inflamatorie. În aceste cazuri reacția inflamatorie a avut un aspect de bandă discontinuă, formată predominant din limfocite și plasmocite (fig.VI.B.16).

Figura.VI.B.16. Carcinom scuamos laringian cu infiltrat inflamator moderat,

Col HE, Ob X100

A urmat în ordinea frecvenței infiltratul inflamator redus la câteva grupuri de limfocite și plasmocite (infiltrat redus), în 81 de cazuri (29,8%) (fig.VI.B.17).

Figura.VI.B.17. Carcinom scuamos laringian cu infiltrat inflamator redus,

Col HE, Ob X100

Cel mai puțin întâlnite au fost cazurile de carcinom scuamos laringian care au prezentat un infiltrat inflamator intens, acestea reprezentând un număr de 73 de cazuri din cele investigate. Astfel în 29,8% din cazuri am notat prezența unui infiltrat inflamator abundent, dispus sub forma unor benzi continue și dense (fig.VI.B.18). În 19 din aceste cazuri am remarcat și prezența unei reacții inflamatorii granulomatoase de corp străin (fig.VI.B.19).

Figura.VI.B.18. Carcinom scuamos laringian cu infiltrat inflamator abundent, Col HE, Ob X100

Figura.VI.B.19. Carcinom scuamos laringian cu reacție inflamatorie

de tip granulomatos, Col HE, Ob X100

PATTERNUL INVAZIEI TUMORALE

Am putut aprecia patternul de invazie doar în cazurile pieselor de exereză chirurgicală și anume 67 de cazuri. Acesta a fost de tip coeziv, discoeziv sau mixt (tabel VI.B.5).

Table VI.B.5- Distribuția carcinoamelor scuamoase laringiene în funcție de patternul invaziei

Frontul de invazie coeziv (expansiv) l-am întâlnit în 21 de cazuri, care au constituit 31,3%. Aspectul s-a tradus prin prezența unor structuri insulare neoplazice formate din celule tumorale de dimensiuni mari, coezive, cu aspect bine diferențiat (fig.VI.B.20, fig.VI.B.21).

Figura.VI.B.20. Carcinom scuamos laringian cu pattern de invazie coeziv,

Col HE, Ob X40

Figura.VI.B.21. Carcinom scuamos laringian cu pattern de invazie coeziv,

Col HE, Ob X100

În cele mai multe cazuri am identificat frontul de invazie discoeziv (infiltrativ). Astfel, în 28 de cazuri (41,8%) am depistat prezența de cordoane tumorale necoezive, cu margini slab diferențiate sau chiar prezența de câteva celule neoplazice izolate (fig.VI.B.22, fig.VI.B.23).

Figura.VI.B.22. Carcinom scuamos laringian cu pattern de invazie discoeziv,

Col HE, Ob X40

Figura.VI.B.23. Carcinom scuamos laringian cu pattern de invazie discoeziv,

Col HE, Ob X100

Restul de 18 cazuri au corespuns unui aspect mixt, în care au existat atât aspecte expansive cât și infiltrative.

INVAZIA VASCULARĂ ȘI PERINEURALĂ

Invazia spațiilor vasculare și perineurală a fost identificată în cazuistica luată în studiu. Luând în considerare prezența sau absența acestor invazii am împărțit cazurile în 2 categorii înscrise în tabelul de mai jos (tabel VI.B.6).

Table VI.B.6- Distribuția carcinoamelor scuamoase laringiene în funcție de invazia vasculară și perineurală

Invazia vasculară a fost prezentă sub forma unor mici grupuri de celule tumorale vizibile în interiorul unor lumene vasculare sanguine sau limfatice (fig.VI.B.24, fig.VI.B.25).

Figura.VI.B.24. Carcinom scuamos laringian embol vascular,
Col HE, Ob X100

Figura.VI.B.25. Carcinom scuamos laringian embol vascular,
Col HE, Ob X200

Într-un număr de 169 de cazuri am constatat prezența unor insule de celule tumorale care au invadat perinervul (fig.VI.B.26, fig.VI.B.27). Acest aspect, corespunzător invaziei perineurale, a fost mai des întâlnit în cazurile de carcinoame scuamoase moderat și slab diferențiate.

Figura.VI.B.26. Carcinom scuamos laringian, invazie perineurală,

Col HE, Ob X100

Figura.VI.B.27. Carcinom scuamos laringian, invazie perineurală,

Col HE, Ob X200

ADENOPATIA METASTATICĂ (categoria N)

Un parametru morfologic important urmărit în studiul nostru este statusul limfoganglionilor. Majoritatea cazurilor de carcinoame scuamoase laringiene, respectiv 50 de cazuri (74,6%) nu au asociat prezența adenopatiei metastatice. Aceste invazii limfoganglionare fiind observate doar în 17 cazuri dintre cele 67 analizate. Categoria N1 a fost prezentă în 7 cazuri (10,5%) și a constat în prezența invaziei tumorale într-un singur ganglion ipsilateral, cu diametrul mai mic de 3 cm. Restul de 10 cazuri (14,9%) au aparținut categoriei N2 și au prezentat următoarea distribuție: N2a-8 cazuri, cu metastază într-un singur ganglion ipsilateral, cu diametrul maxim cuprins între 3 și 6 cm și N2b- 2 cazuri în care am constatat prezența invaziei tumorale în mai mulți ganglioni ipsilaterali, cu diametrul cel mai mare sub 6 cm (tabel VI.B.7).

Table VI.B.7- Distribuția carcinoamelor scuamoase laringiene în funcție de prezența sau absența metastazelor ganglionare

Aspectul microscopic al ganglionilor limfatici a evidențiat o ștergere parțială a aspectului normal ganglionar și înlocuirea cu o proliferare tumorală similară ca formă și grad de diferențiere cu tumora primitivă. Invazia capsulei ganglionare nu a fost observată în niciunul dintre cazurile investigate (fig.VI.B.28, fig.VI.B.29).

Figura.VI.B.28. Metastază ganglionară de carcinom scuamos laringian,

Col HE, Ob X40

Figura.VI.B.29. Metastază ganglionară de carcinom scuamos laringian,

Col HE, Ob X100

STADIUL pTNM

Stadiul pTNM a reprezentat unul dintre cele mai importante aspecte ale studiului nostru. Din cele 293 de cazuri cuprinse în studiu, acest aspect l-am putut stabili doar pe 67 de cazuri, toate provenite din piesele de exereză chirurgicală. În aceste cazuri ne-au interesat profunzimea invaziei tumorale, prezența sau absența metastazelor ganglionare dar și la distantă, criterii care ne-au permis încadrarea tumorilor în clasificarea TNM.

În urma analizei profunzimii invaziei tumorale am constatat: localizarea tumorii maligne la nivelul etajului afectat- categoria T1- în 3 cazuri (4,5%), pentru 15 cazuri (22,4%) am identificat extinderea tumorală minimă în alt etaj al laringelui, diferit de originea tumorii- categoria T2, 40 cazuri (59,7%) au corespuns limitării invaziei tumorale la nivel laringian- categoria T3 iar restul de 9 cazuri (13,4%) au prezentat invazia cartilajului tiroid și/sau cricoid, țesutului muscular sau a spațiului prevertebral și au putut sa fie încadrate în categoria T4 (fig.VI.B.30, fig.VI.B.31).

Figura.VI.B.30. Carcinom scuamos laringian invaziv în țesut cartilaginos,

Col HE, Ob X40

Figura.VI.B.31. Carcinom scuamos laringian invaziv în țesut muscular,

Col HE, Ob X100

Doar 17 cazuri s-au asociat cu prezența metastazelor ganglionare astfel: categoria N1 a fost prezentă în 7 cazuri (10,5%) și categoriei N2 în 10 cazuri (14,9%)(tabel VI.B.8).

În niciunul dintre cele 67 de cazuri nu am întâlnit metastaze la distanță, astfel toate cazurile au fost încadrate în categoria M0.

Odată încadrate leziunile corespunzătoare fiecărei categorii de mai sus am putut stabili și stadiile pTNM.

Am observat o majoritate a stadiilor avansate, respectiv stadiile III și IV. În stadiul al III-lea au fost cuprinse 37 de cazuri (55,2%) după cum urmează: T2N1M0- 3 cazuri, T3N0M0- 31 cazuri și T3N1M0- 3 cazuri. Pentru stadiul al IV-lea am identificat un număr de 17 cazuri (25,4%), distribuite astfel: 2 cazuri corespunzătoare T2N2M0, 6 cazuri corespunzătoare T3N2M0, 5 cazuri corespunzătoare T4N0M0, 2 cazuri corespunzătoare T4N1M0 și 2 cazuri corespunzătoare T4N2M0. În ordinea frecvenței au urmat stadiul II (T2N0M0) cu 10 cazuri (14,9%) și stadiul I cu 3 cazuri (4,5%) (tabel VI.B.8).

Tabel VI.B.8- Distribuția carcinoamelor scuamoase laringiene în funcție de stadiul pTNM

• Analiza statistică a studiului histopatologic a fost efectuată utilizând testul chi-pătrat și valorile p<0,05 au fost considerate semnificativ statistic.

Am obținut diferențe semnificative între gradul de diferențiere și varietățile histopatologice (fig.VI.B.32).

Figura.VI.B.32- Distribuția carcinoamelor scuamose laringiene în funcție de gradul de diferențiere și varietățile histopatologice

Analiza statistică a evidențiat asocieri semnificative și între localizarea carcinoamelor scuamoase laringiene cu gradul de diferențiere, localizarea glotică fiind asociată cu formele moderat diferențiate de carcinoame (fig.VI.B.33).

Figura.VI.B.33- Distribuția carcinoamelor scuamoase laringiene în funcție de localizare și gradul de diferențiere

De asemenea, am obținut diferențe semnificative între stadiul pTNM, categoria T și categoria N (p<0,05), acestea din urmă fiind mai frecvente în stadiile avansate III și IV (fig.VI.B.34-35).

Figura.VI.B.34- Distribuția carcinoamelor scuamose laringiene în funcție de stadiul pTNM și categoria T

Figura.VI.B.35- Distribuția carcinoamelor scuamose laringiene în funcție de stadiul pTNM și categoria N

Testul chi-pătrat a demonstrat asociere semnificativă (p=0,003) și între stadiul pTNM și invazia vasculară și perineurală, acestea fiind prezente într-un număr superior în stadiile III și IV (fig.VI.B.36).

Figura.VI.B.36- Distribuția carcinoamelor scuamose laringiene în funcție de stadiul pTNM și invazia vasculară și perineurală

VI.C. STUDIUL IMUNOHISTOCHIMIC AL CARCINOAMELOR SCUAMOASE LARINGIENE

Un număr de 38 de cazuri din totalul de 67 de piese de exereză chirurgicală au fost supuse tehnicii imunohistochimice. Au fost selectate cazuri de carcinoame laringiene cu grade diferite de diferențiere și anume: 7 cazuri bine diferențiate, 22 de cazuri de forme moderat diferențiate și 9 slab diferențiate. Am urmărit expresia unor markeri implicați atât în patogenia tumorală cât și ca factori de prognostic. Astfel am investigat expresia unor markeri ai factorilor de creștere și proliferare, apoptozei, molecule de adeziune, factori ai ciclului celular și factori de transcripție.

FACTORI DE CRESTERE ȘI PROLIFERARE

IMUNOEXPRESIA EGFR

Imunomarcajul markerului EGFR a fost identificat în 34 de cazuri din cele 38 de cazuri incluse în studiu în 54,7% din celule. Imunomarcajul pentru acest marker a fost membranar și citoplasmatic, având distribuție și intensitate variabile. Analizând cazurile bine diferențiate de carcinoame am constatat o pozitivitate medie a celulelor tumorale de 26,04±8,4, intensitate variabilă și un scor mediu de 2,8 (fig VI.C.1, tabel VI.C.1).

Figura.VI.C.1- Imunomarcaj EGFR, carcinom scuamos laringian G1, X100

În cele 18 de cazuri de carcinoame moderat diferențiate am obținut o valoare procentuală medie a celulelor marcate de 53,3±13,9, intensitate medie și crescută și un scor mediu de 6,5 (fig VI.C.2, tabel VI.C.1).

Figura.VI.C.2- Imunomarcaj EGFR, carcinom scuamos laringian G2, X100

Valorile cele mai mari le-am obținut în formele slab diferențiate și anume o pozitivitate medie a celulelor tumorale de 79,9±12,2, intensitate variabilă și un scor mediu de 6,7 (fig VI.C.3, tabel VI.C.1).

Figura.VI.C.3- Imunomarcaj EGFR, carcinom scuamos laringian G3, X100

Stadiile incipiente, I și II, au prezentat valori procentuale medii de 41,8±22,7 și 52,7±27, intensități medii și crescute și scoruri medii de 3 și respectiv 6,6. Asemănător în stadiile avansate valorile procentuale medii au fost de 59,1±20,5 și 52,2±23,9, intensități medii și crescute și scoruri medii de 6,7 și respectiv 4,6 (tabel VI.C.1).

Tabel VI.C.1- Imunoexpresia EGFR în raport cu parametrii clinico-morfologici

stdev=Deviație standard, BD=Bine diferențiat, MD=Moderat diferențiat, SD=Slab diferențiat

IMUNOEXPRESIA KI-67

Analiza imunomarcajului Ki-67 a indicat o pozitivitate nucleară în 42,6% din cele 38 de cazuri analizate. Studiul imunoexpresiei Ki-67 a indicat pozitivitate pentru cazurile de carcinoame bine diferențiate și am obținut o valoare procentuală medie a celulelor tumorale marcate de 8,67±1,6.

Figura.VI.C.4- Imunomarcaj ki-67, carcinom scuamos laringian G1, X100

Figura.VI.C.5- Imunomarcaj ki-67, carcinom scuamos laringian G2, X100

Figura.VI.C.6- Imunomarcaj ki-67, carcinom scuamos laringian G3, X100

Valori ale indexului Ki-67 mult mai mari au corespuns formelor moderat și slab diferențiate de 45,4±9,5 și respectiv 69,7±11,1. Pentru stadiile pTNM am obținut următoarele procente medii: stadiul I-37,8±25,04, stadiul II-42,3±32,3, stadiul III-42,5±17,6 și stadiul IV- 46,4±27,3 (fig.VI.C.4-6, tabel VI.C.2).

Tabel VI.C.2- Imunoexpresia Ki-67 în raport cu parametrii clinico-morfologici

stdev=Deviație standard, BD=Bine diferențiat, MD=Moderat diferențiat, SD=Slab diferențiat

MARKERI AI APOPTOZEI

IMUNOEXPRESIA p53

Analiza imunoexpresiei markerului p53 ne-a indicat o pozitivitate nucleară în 52,5% din cele 38 de cazuri prezente în studiu. Procentul de celule tumorale pozitive precum și intensitatea reacției a variat în funcție de gradul de diferențiere dar și stadiul pTNM.

Valorile medii procentuale cele mai mari de 75,7±21,1 au fost obținute în formele slab diferențiate, unde am întâlnit o intensitate variabilă și un scor mediu de 6,5 (fig.VI.C.7, tabel VI.C.3).

Figura.VI.C.7- Imunomarcaj p53, carcinom scuamos laringian G3, X100

Pentru carcinoamele scuamoase laringiene moderat diferențiate am obținut o valoare medie de 52,4±11,8, intensitate variabilă și un scor mediu de 6,5 (fig.VI.C.8, tabel VI.C.3).

Figura.VI.C.8- Imunomarcaj p53, carcinom scuamos laringian G2, X100

Cele mai mici valori în cazul markerului p53 au corespuns formelor bine diferențiate de cancer, unde am înregistrat o valoare procentuală medie de 23,1±4,2, intensitate variabilă și un scor mediu de 3,1 (fig.VI.C.9, tabel VI.C.3).

Figura.VI.C.9- Imunomarcaj p53, carcinom scuamos laringian G1, X100

Analiza imunomarcajului p53 pentru stadiile pTNM a relevat valori asemănătoare. Am obținut pentru stadiul I un procent mediu de celule tumorale pozitive de 58,6±34,9, intensitate slabă/moderată și scor mediu de 5,3. În stadiul II am stabilit un procent mediu de 44,2±23,08, intensitate de asemenea variabilă și un scor mediu de 3,6. Stadiile III și IV au prezentat valori procentuale medii de 53±19,1 și 54,9±24,1, intensități moderate/intense și scoruri medii de 7 și respectiv 5,5 (tabel VI.C.3).

Tabel VI.C.3- Imunoexpresia p53 în raport cu parametrii clinico-morfologici

stdev=Deviație standard, BD=Bine diferențiat, MD=Moderat diferențiat, SD=Slab diferențiat

IMUNOEXPRESIA BCL-2

Imunomarcajul citoplasmatic a fost interpretat ca pozitiv pentru markerul bcl-2 și a fost identificat în 33 din cazurile studiului imunohistochimic. Pentru cele 7 cazuri de carcinoame bine diferențiate am obținut un procent mediu de 20,03±26,5.

Figura.VI.C.10- Imunomarcaj bcl-2, carcinom scuamos laringian G1, X100

Figura.VI.C.11- Imunomarcaj bcl-2, carcinom scuamos laringian G2, X100

Figura.VI.C.12- Imunomarcaj bcl-2, carcinom scuamos laringian G3, X100

Valori net superioare am constatat în carcinoamele cu risc crescut (formele moderat și slab diferențiate) unde valorile procentuale medii ale celulelor marcate tumorale au fost de 44,05±22,8 și 57,6±26,4. Am remarcat diferențe semnificative și între stadiile incipiente (18,8±2,2 și 24,6±27,4) și cele avansate (43,1±23,2 si 62,1±26,6) (fig.VI.C.10-12, tabel VI.C.4).

Tabel VI.C.4- Imunoexpresia bcl-2 în raport cu parametrii

clinico-morfologici

stdev=Deviație standard, BD=Bine diferențiat, MD=Moderat diferențiat, SD=Slab diferențiat

MOLECULE DE ADEZIUNE

IMUNOEXPRESIA E-CADERINEI

Imunoexpresia E-caderinei a fost identificată la nivel membranar în 22,8% din cele 38 de cazuri. Pentru formele bine diferențiate valoarea procentuală medie a celulelor marcate a fost de 53,6±6,6, un scor mediu de 5,5 și o intensitate a reacției variabilă.

Figura.VI.C.13- Imunomarcaj E-caderină, carcinom scuamos laringian G1,
X100

Figura.VI.C.14- Imunomarcaj E-caderină, carcinom scuamos laringian G2,
X100

Figura.VI.C.15- Imunomarcaj E-caderină, carcinom scuamos laringian G3,
X100

Comparativ cu formele bine diferențiate în cele moderat și slab diferențiate am obținut procente medii mici de 19,8±5,3 și 17,4±5,8, intensități de asemenea variabile și scorurile medii de 1,8 și 1,7 (fig.VI.C.13-15, tabel VI.C.5).

Tabel VI.C.5- Imunoexpresia E-caderinei în raport cu parametrii clinico-morfologici

stdev=Deviație standard, BD=Bine diferențiat, MD=Moderat diferențiat, SD=Slab diferențiat

Imunoreacția stadiilor pTNM a fost și ea investigată și am constatat pentru stadiul I procentul mediu al celulelor tumorale marcate de 32,2±26,8, intensitate variabilă și scor mediu 3,6 iar pentru stadiul II procentul mediu de 29,5±15,7 și scorul mediu de 3,3. Valori mai mici am întâlnit în stadiile III și IV, unde valorile procentuale medii au fost de 22,4±12,8 și 26,8±14,3, cu scorurile 2,4 și respectiv 1,8 (tabel VI.C.5).

IMUNOEXPRESIA P-CADERINEI

Un alt marker studiat este P-caderina care a fost identificată în 46,09% din cazurile din studiul imunohistochimic. Și în cazul acestui marker am obținut valori diferite în funcție de gradele de diferențiere, raportându-ne la procentul mediu de celule marcate pozitiv și intensitatea reacției. Prezența marcajului la nivel membranar și citoplasmatic a fost interpretată ca și reacție pozitivă.

Carcinoamele scuamoase laringiene bine diferențiate au prezentat un procent mediu de celule tumorale marcate de 16,7±8,6, intensitate slabă/moderată și un scor mediu de 1,8 (fig.VI.C.16, tabel VI.C.6).

Figura.VI.C.16- Imunomarcaj P-caderină, carcinom scuamos laringian G1,
X100

Pentru formele moderat și slab diferențiate am constatat o creștere a valorilor procentuale medii de 43,6±15,4 și 74,02±11,5, intensități moderate/crescute și scoruri medii de 5,3 și respectiv 9 (fig.VI.C.17-18, tabel VI.C.6).

Figura.VI.C.17- Imunomarcaj P-caderină, carcinom scuamos laringian G2,
X100

Figura.VI.C.18- Imunomarcaj P-caderină, carcinom scuamos laringian G3,
X100

Analiza imunoexpresiei P-caderinei a fost studiată și în legătură cu stadiul pTNM. Am constatat pentru stadiile incipiente I și II, valori procentuale medii de 51,7±37,7 și 36,4±24,1, intensități variabile și scorurile medii de 6,3 și 4. În stadiile avansate III și IV am obținut valori asemănătoare de 46,08±19,09 și 51,2±29,6, intensități variabile în ambele stadii și scoruri medii de 5,6 și respectiv 6,5 (tabel VI.C.6).

Tabel VI.C.6- Imunoexpresia P-caderinei în raport cu parametrii clinico-morfologici

stdev=Deviație standard, BD=Bine diferențiat, MD=Moderat diferențiat, SD=Slab diferențiat

IMUNOEXPRESIA β-CATENINEI

În prezentul studiu, prezența marcajului membranar, citoplasmatic și nuclear a fost interpretat ca și marcaj pozitiv pentru β-catenina.

Analiza expresiei în formele bine diferențiate de carcinoame laringiene a indicat o valoare medie a celulelor marcate pozitiv de 47.2%±4.1, o intensitate variabilă și un scor mediu de 5,5. Am observat o reducere a imunoexpresiei pozitive membranare însoțită de o predominanță a localizării citoplasmatice și nucleare în cazul carcinoamelor cu risc crescut.

Figura.VI.C.19- Imunomarcaj β-catenină, carcinom scuamos laringian G1,
X100

Figura.VI.C.20- Imunomarcaj β-catenină, carcinom scuamos laringian G2,
X100

Figura.VI.C.21- Imunomarcaj β-catenină, carcinom scuamos laringian G3,
X100

Astfel, în formele moderat și slab diferențiate am constatat valori medii procentuale de 29.3%±3.7 și 48.6%±8, intensități variabile și scoruri medii de 4 și respectiv 5,6 (fig.VI.C.19-21, tabel VI.C.7).

Tabel VI.C.7- Imunoexpresia β-cateninei în raport cu parametrii

clinico-morfologici

stdev=Deviație standard, BD=Bine diferențiat, MD=Moderat diferențiat, SD=Slab diferențiat

În raport cu stadiile tumorale am obținut pentru stadiile incipiente I și II valori procentuale medii de 35,03%±7,5 și 40,8%±9,7, intensități variabile în ambele stadii și scoruri medii de 4,6 și respectiv 4,3. Asemănător, în stadiile avansate III și IV am constatat procente medii de 35±10,8 și 39,8±11,3, intensități variabile și scoruri medii de 4,4 și 5,5 (tabel VI.C.7).

FACTORI AI CICLULUI CELULAR

IMUNOEXPRESIA CICLIN-D1

Imunomarcajul ciclin-D1 a fost pozitiv în 36 de cazuri și negativ în 2 cazuri ale studiului imunohistochimic. Pozitivitate nucleară a fost obținută în 29,3% din cazurile investigate. Analizând carcinoamele bine diferențiate am obținut un procent mediu al celulelor marcate pozitiv de 21,5±4,8, intensitate variabilă a reacțiilor și un scor de 2,8 (fig.VI.C.22, tabel VI.C.8).

Figura.VI.C.22- Imunomarcaj Ciclin-D1, carcinom scuamos laringian G1,
X100

Pentru formele moderat și slab diferențiate procentele medii au fost 26,05±3,4 și 42,7±12,3, intensitățile variabile și scorurile medii de 3,4 și 5,6 (fig.VI.C.23-24, tabel VI.C.8).

Figura.VI.C.23- Imunomarcaj Ciclin-D1, carcinom scuamos laringian G2,
X100

Figura.VI.C.24- Imunomarcaj Ciclin-D1, carcinom scuamos laringian G3,
X100

În raport cu stadiile pTNM, valorile procentuale medii ale celulelor marcate în stadiile I și II au fost de 27,8±13,7 și 34,1±16,3, intensitățile variabile și scorurile medii de 2,6 și 5,8. Valori asemănătoare am obținut și în stadiile III și IV (28,7±6,7 și 27,05±11,4), intensități de asemenea variabile și scoruri de 4 și respectiv 2,5 (tabel VI.C.8).

Tabel VI.C.8- Imunoexpresia ciclin-D1 în raport cu parametrii clinico-morfologici

stdev=Deviație standard, BD=Bine diferențiat, MD=Moderat diferențiat, SD=Slab diferențiat

FACTORI DE TRANSCRIPTIE

IMUNOEXPRESIA SNAIL

Imunoexpresia Snail a fost observată la nivel nuclear în 61,5% din cele 38 de cazuri de carcinoame scuamoase laringiene investigate. Studiul markerului în cazurile bine diferențiate a evidențiat un procent mediu de celule marcate pozitiv în 23.9±7.6, un scor mediu de 3,5 și intensitate variabilă ca și localizare la nivelul insulelor tumorale. Astfel intensitatea a fost mai crescută la periferie comparativ cu interiorul, unde a fost prezentă o intensitate mai slabă (fig VI.C.25, tabel VI.C.9).

Figura.VI.C.25- Imunomarcaj Snail, carcinom scuamos laringian G1,
X100

În formele moderat și slab diferențiate de carcinoame scuamoase laringiene am obținut procente medii ale celulelor marcate pozitiv de 69,03±13,2 și 72,7±17,09, intensități medii și crescute, scoruri medii de 9,1 și respectiv 7,8 (fig.VI.C.26-27, tabel VI.C.9).

Figura.VI.C.26- Imunomarcaj Snail, carcinom scuamos laringian G2,
X100

Figura.VI.C.27- Imunomarcaj Snail, carcinom scuamos laringian G3,
X100

De asemenea am studiat expresia acestui marker în raport cu stadiul pTNM și am obținut următoarele valori: stadiul I- valoare procentuală medie de 38,8±20,8, intensitate variabilă și un scor mediu de 4, stadiul II- valoare procentuală medie de 42,6±2,9 și scor mediu de 3,3, stadiul III- valoare procentuală medie de 66,1±18,4 și scor mediu de 8,8 și pentru stadiul IV- valoare procentuală medie de 71,05±22,5 și scor mediu de 9,4 (tabel VI.C.9).

Tabel VI.C.9- Imunoexpresia Snail în raport cu parametrii clinico-morfologici

stdev=Deviație standard, BD=Bine diferențiat, MD=Moderat diferențiat, SD=Slab diferențiat

• În urma efectuării analizei statistice pentru studiul imunohistochimic, utilizând testul chi-pătrat, am obținut asocieri semnificative între Snail și gradul de diferențiere (p=0,004), categoria N- adenopatia metastatică (p=0,020) și stadiul pTNM (p=0,010), expresia înaltă a acestui marker fiind prezentă în stadiile avansate și formele slab diferențiate de carcinoame (fig.VI.C.28-29).

Figura.VI.C.28 Distribuția cazurilor de carcinoame scuamose laringiene Snail pozitive în funcție de stadiul pTNM

Figura.VI.C.29 Distribuția cazurilor de carcinoame scuamose laringiene Snail pozitive în funcție de categoria N

Tot cu ajutorul testului chi-pătrat am obținut valori semnificative (p=0,015) între expresia markerului EGFR și gradul de diferențiere, expresia fiind înaltă în formele slab diferențiate (fig.VI.C.30).

Figura.VI.C.30 Distribuția cazurilor de carcinoame scuamose laringiene EGFR pozitive în funcție de gradul de diferențiere

De asemenea, asocieri semnificative am obținut între gradul de diferențiere tumoral și expresia markerilor β-catenină (p=0,043), E-caderină (0,000), P-caderină (0.000), p53 (p=0,030) și ciclin-D1 (0,010) (fig.VI.C.32). Pentru markerul p53, asocieri semnificative am obținut și cu stadiul pTNM (p=0,031), expresia fiind crescută în stadiile avansate, III și IV (fig.VI.C.31).

Figura.VI.C.31 Distribuția cazurilor de carcinoame scuamose laringiene p53 pozitive în funcție de stadiul pTNM

Figura.VI.C.32 Distribuția cazurilor de carcinoame scuamose laringiene ciclin-D1 pozitive în funcție de gradul de diferențiere

Un alt test utilizat în studiul nostru este și testul Anova, care a demonstrat asocieri semnificativ statistic între gradul de diferențiere și markerii ki-67 și bcl-2 (p=0,000 și p=0,018), remarcându-se creșterea expresiei markerilor în formele moderat și slab diferențiate, comparativ cu cele bine diferențiate (fig.VI.C.33). Studiul nostru a mai evidențiat și o asociere semnificativă între expresia bcl-2 și stadiul pTNM (p=0,015), expresia fiind crescută în cazul stadiilor III și IV (fig.VI.C.34).

Figura.VI.C.33 Distribuția cazurilor de carcinoame scuamose laringiene ki-67 pozitive în funcție de gradul de diferențiere

Figura.VI.C.34 Distribuția cazurilor de carcinoame scuamose laringiene bcl-2 pozitive în funcție de stadiul pTNM

CAPITOLUL VII

DISCUȚII

VII.A ANALIZA CLINICO-EPIDEMIOLOGICĂ A PACIENȚILOR CU

CARCINOAME SCUAMOSE LARINGIENE

Carcinoamele de cap și gât reprezintă o localizare frecventă a patologiei tumorale maligne iar laringele ca și frecvență reprezintă aproximativ 30-40% dintre acestea [2,3]. Laringele îndeplinește funcții importante în organism, fiind implicat în procesele de respirație, protecție și fonație [149]. Mortalitatea și morbiditatea crescute reprezintă aspecte frecvent descrise în carcinoamele de cap și gât [150]. Diagnosticarea în stadiile incipiente de boală este de preferat și se însoțește de o rată a supraviețuirii de până la 82,4% [56. S-a constatat însă că majoritatea cazurilor sunt diagnosticate în stadii avansate în care supraviețuirea la 5 ani scade, fiind cuprinsă intre 10-40% [56, 107]. Aceste cazuri sunt candidate pentru un tratament radical, complex în care se recurge la intervenție chirurgicală mutilantă asociată cu chimio și radioterapie [94].

Aceste carcinoame sunt asociate cu anumiți factori de risc, precum fumatul, consumul de alcool sau infecția cu HPV [34].

Cele mai frecvente tumori epiteliale diagnosticate la nivelul laringelui sunt reprezentate de carcinoamele scuamoase în peste 95% din cazuri și 2,4% din numărul total de tumori maligne diagnosticate la nivel mondial [4,5].

Prezentul studiu a cuprins un număr total de 293 de cazuri, diagnosticate într-un interval de 3 ani. Distribuția cazuisticii pe ani calendaristici, în studiul nostru, a fost: 89 de cazuri (30,7%) în anul 2010, 96 de cazuri (32,7%) în anul 2011 și 108 cazuri (36,8%) în anul 2012. Am observat că maximul incidenței a fost în ultimul an al perioadei studiate, respectiv anul 2012, în care a fost diagnosticat un număr de 108 cazuri.

Literatura de specialitate a observat o tendință a creșterii incidenței carcinoamelor laringiene alături de o reducere a raportului între sexe. De exemplu, în Statele Unite ale Americii s-a constatat o creștere a incidentei la sexul masculin de la 5,9 la 9 cazuri noi la 100.000 de locuitori/an în timp ce în Polonia incidența a ajuns la 11,4 cazuri noi la 100.000 de locuitori [151-152].

Pentru anul 1990 era raportată o incidență la nivel mondial de 140.000 de cazuri noi, majoritatea cazurilor fiind subiecți de sex masculin [5]. Pentru anul 2005 incidența la nivel mondial pentru carcinoamele scuamoase laringiene, conform unor studii, a fost de 160.000 de cazuri noi pentru sexul masculin și 22.000 de cazuri noi în rândul populației feminine, aceste procente reprezentând 1,7% din cazurile noi de cancer diagnosticate anual [9]. S-a constatat o incidență crescută de 10 cazuri noi la 100.000 de locuitori în țări precum Europa Centrală sau de Sud, Brazilia sau Argentina în timp ce incidență scăzută a fost înregistrată în Asia sau Africa [5,9]. în cazul Indiei, în anul 2012, au fost diagnosticate aproximativ 25.000 de cazuri noi, dintre care peste 17.000 de persoane au decedat [153]. Cea mai redusă incidență, cu un număr de 0,7 cazuri la 100.000 de locuitori, a fost raportată pentru Qidong, China [9].

Am remarcat faptul că incidența carcinoamelor scuamoase laringiene a prezentat o creștere progresivă din decada V până în decada VII de viață. Intervalul de vârstă al pacienților incluși în studiu a fost destul de mare, majoritatea cazurilor analizate, și anume 118 cazuri (40,2%) fiind cuprins în intervalul 60-69 ani.

Carcinoamele scuamoase laringiene sunt de obicei identificate la pacienții cu vârsta cuprinsă între 40-70 de ani, vârsta medie de diagnosticare fiind de 66 de ani [7]. Într-un alt studiu vârsta medie de diagnosticare a fost de 62,1 ani, majoritatea cazurilor fiind diagnosticate în decadele 6 și 7 de viață cu doar 1,1% din cazuri diagnosticate sub vârsta de 40 ani [6].

Există studii care analizează vârsta ca și factor prognostic și care indică date diferite. Conform unor autori vârsta tânără <40 de ani se însoțește de un prognostic rezervat, prin risc crescut de recidivă, metastazare la distanță și deces rapid, comparative cu pacienții în vârstă [154]. Alți autori au afirmat diferit și anume ca vârsta tânără s-a corelat cu un prognostic mai bun și anume cu o perioadă de supraviețuire mai mare [155-156].

Carcinomul scuamos laringian reprezintă o afecțiune frecvent întâlnită în rândul populației masculine. Raportul bărbați/femei prezintă variații geografice, pentru Europa acest raport este de 7/1 în timp ce în Statele Unite ale Americii valoarea a fost de 4,5/1 [151].

În cadrul studiului nostru, din 293 de cazuri analizate 288 au fost diagnosticate la sexul masculin și doar 5 cazuri au corespuns sexului feminin. Am obținut o predominanță net superioară în cazul sexului masculin, în 98,3% din cazuri.

Similar, în literatură s-a demonstrat o incidența net crescută a carcinoamelor scuamoase laringiene în rândul sexului masculin. Jaimanti și colaboratorii au constatat că din 690 de pacienți, 647 au fost bărbați [133]. De asemenea DeRienzo DP și colaboratorii au obținut un raport bărbați/femei de 4,5/1 [151]. Într-un alt studiu efectuat pe 1088 de pacienți raportul a fost de 30/1, în favoarea sexului masculin. Din totalul de pacienți 96,8% au fost bărbați și doar 3,2% au fost diagnosticate în rândul sexului feminin [6].

Deși carcinomul scuamos laringian este o leziune mult mai frecvent diagnosticată la bărbați, în ultimii ani s-a constatat și o creștere a incidenței la femei. Acest aspect este cel mai probabil asociat creșterii consumului de alcool și fumatului la femei [5,6]. Astfel a fost raportată o creștere de la 1% la 7% a incidenței în rândul populației feminine în anul 2010 [6]. Printre țările cu număr crescut de cazuri amintim Statele Unite ale Americii sau India în timp ce în tari precum Franța sau Spania se menține totuși o incidență scăzută [5,6,9].

Analiza distribuției cazurilor de carcinoame scuamoase laringiene în funcție de mediul de proveniență ne-a indicat faptul ca un număr de 216 pacienți au provenit din mediul rural în timp ce pacienții proveniți din mediul urban au fost într-un număr mult mai mic de doar 77 de cazuri.

Literatura de specialitate asociază incidența crescută a cancerului întâlnită în mediul rural cu un mediu socio-economic inferior în care există un exces în ceea ce privește consumul de tutun și alcool la care se adaugă și lipsa unei educații medicale precum și un suport social consistent [6]. 78% dintre pacienții unui studiu au provenit din mediul rural și restul de 22% din mediul urban [133]. Conform unui studiu efectuat pe 162 de pacienți s-a constatat o incidență crescută, de 81,7% a pacienților cu educație minimă și care aparțineau unui mediu socio-economic mediocru [157].

Fumatul reprezintă principalul factor de risc asociat cu apariția carcinomului scuamos laringian. Bineînțeles că durata acestui obicei și cantitatea au roluri importante [9,154]. Studiile raportează valori mari pentru acest obicei, cuprinse între 86,8 și 95% [6,152].

În prezentul studiu, fumatul a fost identificat în 269 de cazuri, reprezentând 91,8% din cazuistică.

S-a demonstrat faptul că nitrozaminele și hidrocarburile aromate policiclice din tutun reprezintă principalele cauze ale apariției mutațiilor ADN și ale proceselor de diviziune și proliferare celulare din cancerogeneză [6]. Tuyns AJ și colaboratorii într-un studiu în care au fost incluse mai multe țări precum Franța, Spania și altele, au demonstrat că există un risc mai mare de pana la 16 ori pentru fumători de a dezvolta un cancer decât pentru nefumători [158]. În India s-a observat un risc crescut de apariție al carcinoamelor laringiene în rândul populației feminine care mestecă tutun sau derivați de tutun [5].

Alcoolul reprezintă următorul factor important implicat în apariția cancerului laringian și în studiul nostru a fost identificat în 102 cazuri din cele 293 de cazuri analizate, dintre care 44 de persoane au recunoscut faptul că zilnic servesc 1-2 pahare de alcool. În literatură s-au obținut procente mari ale consumului de alcool în rândul pacienților cu carcinom scuamos laringian, variind între 43,2 și 85,1% [6,157].

Efectul consumului de alcool în cancerogeneză se caracterizează prin perturbări în proliferarea celulară care sunt consecința proceselor inflamatorii cronice întreținute la nivelul epiteliului de acoperire [10].

Asocierea celor doi factori de risc se caracterizează printr-un risc și mai mare de apariție a cancerului în timp ce reducerea sau renunțarea la ambele vicii se însoțește de o reducere semnificativă de apariție a acestuia [159].

Cele mai multe tumori maligne laringiene, în prezentul studiu, au fost identificate ca având origine la nivelul etajului glotic al laringelui în 67,9% din cazuri. Următoarea localizare, ca și frecvență, a fost etajul supraglotic în 30,4% din cazuri și doar 1,7% dintre tumorile analizate au prezentat origine infraglotică.

Studiile menționează localizarea glotică ca fiind locul de elecție al carcinoamelor laringiene în timp ce etajul infraglotic fiind cel mai rar afectat. Diagnosticarea carcinoamelor scuamoase laringiene glotice este mai frecvent întâlnită prin simptomatologia zgomotoasă prezentată încă de la început spre deosebire de localizările supra și infraglotice mult timp asimptomatice [9]. Localizarea glotică prezintă chiar și un prognostic mai bun comparativ cu celelalte localizări prin existența unui număr redus de vase limfatice și deci o incidență mai rară a interesării ganglionare [4]. În țările precum Franța sau Grecia o incidență ridicată a fost sesizată în ceea ce privește localizarea tumorilor maligne la nivelul etajului glotic. Dar există și studii care notează o incidență crescută a localizării supraglotice în țări precum Uruguai sau Statele Unite ale Americii [6,10].

Obiceiul de a fuma și consumul de alcool reprezintă principalii factori de risc ai carcinoamelor scuamoase laringiene și s-a constatat ca exista asocieri ale acestora cu localizarea. Este descrisă pentru fumat asocierea cu localizarea patologiei maligne la nivelul etajului glotic în timp ce consumul de alcool este mai frecvent descris ca fiind implicat în localizarea supraglotică [6,10]. Un studiu efectuat în Statele Unite ale Americii a pus în evidență un risc de 10 ori mai mare de dezvoltare a cancerelor supraglotice comparativ cu cele cu localizare glotică pentru alcoolicii cronici [160].

VII.B ANALIZA MORFOLOGICĂ A PACIENȚILOR CU

CARCINOAME SCUAMOSE LARINGIENE

VII.B.1. STUDIUL MACROSCOPIC AL CARCINOAMELOR SCUAMOASE LARINGIENE

Cele mai multe cazuri în număr de 123 de cazuri au corespuns formelor ulcero-vegetante. Următoarea categorie identificată ca și frecvență a fost forma vegetantă, în 96 de cazuri iar cele mai puține cazuri au aparținut formei infiltrative, fiind prezentă în 74 de cazuri.

Formele ulcero-vegetante au fost întâlnite în toate localizările carcinoamelor scuamoase laringiene. Acestea au prezentat un aspect de formațiuni proeminente, reliefate și contur neregulat la care s-a adăugat și leziunea ulcerativă cu centru deprimat și margini proeminente.

În aproximativ un sfert din cazuri forma vegetativă a fost întâlnită în care aspectul a fost de leziune reliefată cu bază largă de implantare iar cele mai puține cazuri au fost descrise ca forme infiltrative, imprecis delimitate, consistență redusă și culoare cenușie.

Formele macroscopice descrise și întâlnite în studiul nostru corespund aspectelor redate de Organizația Mondială a Sănătății [5].

VII.B.2. STUDIUL HISTOPATOLOGIC AL CARCINOAMELOR SCUAMOASE LARINGIENE

În cazurile noastre, am constatat faptul că toate cazurile de cancer laringian au corespuns carcinomului scuamos iar ca și varietăți acestea au fost reprezentate de formele necheratinizate în 82,3% de cazuri, 16,4% din cazuri au corespuns aspectului cheratinizat, forma bazaloidă în 0,7% din cazuri și câte un caz de carcinom verucos și respectiv carcinomul papilar, reprezentând 0,3%.

Cea mai întâlnită patologie la nivelul laringelui este patologia tumorală iar dintre tumorile epiteliale de la acest nivel carcinomul scuamos este cel mai reprezentativ. Această tumoră malignă reprezintă între 95-100% dintre toate cancerele laringiene [3,7,161]. În ceea ce privește varietățile histopatologice, literatura de specialitate demonstrează o majoritate a formelor necheratinizate în 69,13% din cazuri și 27,53% corespunzător aspectelor cheratinizate [133]. Aspectul necheratinizat corespunde formelor slab diferențiate care se asociază de obicei cu un prognostic prost al evoluției pacienților [4].

Carcinomul verucos reprezintă un aspect histopatologic rar întâlnit, frecvent confundat cu leziunile benigne. Această varietate de carcinom scuamos corespunde de fapt unei forme bine diferențiată de carcinom scuamos, fiind frecvent diagnostica în cancerele de cap și gât [138]. Carcinomul verucos reprezintă până la 1% dintre cancerele de cap și gât la nivelul laringelui [138]. Această tumoră cu prognostic bun este asociată populației de sex masculin, rasa albă și vârsta mai mare de 60 ani [138-139]. Se poate localiza la nivelul oricărui etaj al laringelui dar preferă localizarea glotică și este rar însoțit de metastaze ganglionare [138]. Carcinomul verucos cu localizare la nivelul laringelui este descris ca fiind asociat cu infecția HPV și această asociere este demonstrată prin supraexpresia p16, marker surogat al infecției HPV, în aceste cancere [162].

O altă formă rară dar agresivă, întâlnită sub 1% din carcinoamele laringiene, este carcinomul bazaloid. Carcinomul laringian bazaloid fiind o tumoră de grad înalt, agresivă este asociată cu apariția metastazelor loco-regionale dar și la distanță [140]. Asocierea carcinomului bazaloid este cu sexul masculin și vârsta înaintată, peste 60 de ani [140-141]. Studiile despre această varietate de cancer au demonstrat o predominanță a localizării supraglotice și prezența metastazelor locoregionale în 64% din cazuri [141]. Soriano E și colaboratorii propun o abordare terapeutica agresivă pentru acest tip de tumoră încă de la diagnosticare, datorită prezenței metastazelor încă din acele momente [163].

Carcinomul scuamos papilar este o tumoră întâlnită și la nivelul laringelui, în special afectează etajul glotic [164]. Această varietate histopatologică este frecventă în rândul persoanelor de sex masculin, în vârstă și cu antecedente de consum de alcool și obiceiul de a fuma [164]. A fost emisă ipoteza conform căreia ar exista o legătură între papiloame cu această localizare și cancer dar acest lucru a fost infirmat de diverse studii [164-165]. Este considerată o tumoră asociată cu prognostic bun. În literatură aceste cancere au fost însoțite de dezvoltarea recurențelor în doar 35% din cazuri, metastaze loco-regionale și la distanță doar în 10% și deces în 20% din cazuri [164]. Ishiyama A și colaboratorii raportează valori chiar mai mici pentru apariția recurențelor de 13% și de 4,5% pentru metastazele ganglionare. În cadrul studiului nu s-a înregistrat nici un deces [166]. Cu toate acestea există și studii care demonstrează o legătură între carcinomul papilar și infecția HPV. Supraexpresia p16 a fost raportată în două treimi din cazurile de carcinoame papilare și ulterior hibridizarea in situ a identificat în 68% din cazuri prezența de tulpini HPV de grad înalt [167].

Gradul de diferențiere poate fi asociat cu prognosticul pacienților și anume formele slab diferențiate sunt asociate cu un prognostic rezervat al pacienților [4]. S-a demonstrat ca exista o corelație între apariția recurentelor și reducerea supraviețuirii cu carcinoamele de grad înalt [168]. Acest prognostic rezervat este datorat riscului mai mare de apariție a metastazelor în formele de gard înalt comparative cu cele de grad scăzut [169]. Acest aspect este susținut de prezența rară de 3,4% a metastazelor în formele bine diferențiate comparativ cu 31,4% de cazuri însoțite de metastaze în formele slab diferențiate [6].

Gradul de diferențiere a reprezentat un alt parametru investigat în studiul nostru și în urma stabilirii acestuia am obținut: carcinoame bine diferențiate în 17,7% din cazuistica studiată, carcinoame moderat diferențiate în aproximativ jumătate dintre cazurile noastre, 50,5% și forme slab diferențiate care au reprezentat 31,8% din tumorile investigate. De asemenea am obținut corelație semnificativă între gradul de diferențiere și localizarea tumorilor (p<0,05), localizarea glotică fiind asociată cu formele moderat diferențiate.

Un studiu realizat pe 30 de pacienți a identificat o majoritate de 50% a formelor bine diferențiate, urmate de 26,6% cazuri moderat diferențiate și 10% forme slab diferențiate [7]. Alt studiu efectuat pe 1088 de pacienți indică procente asemănătoare pentru formele bine și moderat diferențiate de 43% și respectiv 42,1%. Cele mai puține cazuri fiind reprezentate de formele slab diferențiate în 11,8% din cazuistică. Același studiu obține și asociere semnificativă statistic între gradul de diferențiere și localizare [6].

În prezentul studiu, am constatat prezența infiltratului inflamator în 272 de cazuri. Acesta a putut fi evaluat atât la nivelul interfeței tumoră/gazdă dar și printre proliferările tumorale, având amploare diferită. Am întâlnit diferite aspecte ale acestui infiltrat inflamator: infiltrat abundent în 73 de cazuri, infiltrat moderat în 118 cazuri și infiltrat redus în 81 de cazuri.

Amploarea infiltratului inflamator a reprezentat scopul diverselor studii în vederea corelării acestuia cu prognosticul, inclusiv pentru carcinomul scuamos laringian [170]. Răspunsul imun în tumorile maligne este considerat un fenomen complex fiind implicat în progresia tumorală. în mod normal, imunitatea este responsabilă de distrugerea celulelor tumorale dar este cunoscut faptul ca aceste celule dezvoltă capacitatea de imunosupresie [171].

Conform rezultatelor studiului lui Gooden MJ și colaboratorii a fost demonstrată existența unei relații între prezența infiltratului inflamator și prognosticul pacienților, în sensul că prezența acestuia se corelează cu o evoluție mai bună în timp ce amploarea redusă a acestuia s-a corelat cu apariția recurenței locale [172-173]. Există studii care au demonstrat faptul că o evoluție chiar mai bună a pacienților s-a întâlnit în tumorile HPV+, în care infiltratul inflamator a fost bine reprezentat [174].

Un alt parametru al studiului nostru a fost reprezentat de aspectul patternului de invazie pe care l-am putut studia în 67 de cazuri. Acesta a fost de tip coeziv, discoeziv sau mixt. Cele mai multe cazuri au corespuns frontului de invazie discoeziv caracterizat prin prezența de cordoane tumorale necoezive, cu margini slab diferențiate sau chiar prezența de câteva celule neoplazice izolate. Acest aspect a fost observat în 28 de cazuri din cele 67 analizate.

Există studii în literatură în care a fost urmărită asocierea aspectului patternului de invazie cu evoluția pacienților. Astfel, patternul de invazie coeziv corespunde unei evoluții favorabile, cu o durată mai mare de supraviețuire comparativ cu patternul discoeziv în care caracteristic este evoluția nefavorabilă a carcinoamelor [5]. Hoșal AS și colaboratorii, în studiul lor, au demonstrat faptul că tipul patternului de invazie se corelează cu apariția recurențelor [173].

Atât invazia vasculară cât și invazia perineurală au fost întâlnite și în prezentul studiu. Invazia vasculară a îmbrăcat aspectul de mici grupuri de celule tumorale vizibile în interiorul unor lumene vasculare sanguine sau limfatice, în 82 cazuri din totalul de 293 de cazuri. În ceea ce privește invazia perineurală, am identificat-o ca fiind prezentă într-un număr de 169 de cazuri.

Invazia vasculară este considerată a fi una dintre primele etape ale procesului de metastazare, fiind asociată cu apariția metastazelor ganglionare dar nu și la distanță [175]. Conform altor studii, mai recente, prezența invaziei limfovasculare caracterizează un grup de tumori maligne în care există un risc crescut de apariție a metastazelor loco-regionale cât și la distanță [5]. Invazia perineurală, în studiul lui Fagan JJ și colaboratorii, a fost considerat un factor important pentru aprecierea supraviețuirii pacienților cu carcinoame de cap și gât. Acest lucru a fost dovedit prin obținerea de asocieri semnificativ statistic între invazia perineurală și apariția recurențelor locale dar și apariția metastazelor locoregionale [176]. Prezența celulelor tumorale în interiorul vaselor precum și în jurul perinervului sunt aspecte caracteristice evoluției nefavorabile a cancerelor, cu apariția rapidă a recurențelor și o scurtă perioadă de supraviețuire [5].

Conform rezultatelor unui studiu din anul 2015, efectuat pe 571 de pacienți cu cancere de cap și gât, prezența invaziei limfovasculară s-a asociat semnificativ statistic cu categoria T, categoria N, stadiul tumoral dar și gradul de diferențiere [177]. Și în studiul nostru am obținut asociere semnificativ statistic între stadiul pTNM și invazia limfovasculară și perineurală (p=0,003).

Printre factorii de prognostic intens studiați se află și prezența metastazelor ganglionare. Pentru prognosticul pacienților sunt importante invazia capsulară ganglionară precum și numărul ganglionilor interesați [134]. Și în studiul nostru acest parametru a reprezentat un aspect important. Aceste invazii limfoganglionare le-am constatat doar în 17 cazuri dintre cele 67 analizate. Categoria N1 a fost prezentă în 7 cazuri (10,5%) în timp ce restul de 10 cazuri (14,9%) au aparținut categoriei N2. Markau K și colaboratorii au constatat prezența invaziei ganglionare pentru doar 32 de pacienți din cei 212 pacienți incluși în studiul lor [178].

Este demonstrată influența statusului limfoganglionilor asupra supraviețuirii pacienților astfel s-a identificat ca absența invaziei ganglionare se însoțește de o supraviețuire la 5 ani de pana la 60% din cazuri în timp ce identificarea pozitivității metastazelor ganglionare înregistrează o scădere importantă a acestei rate de supraviețuire de până la 30% [6]. Literatura de specialitate confirmă prognosticul prost al stadiilor avansate pentru carcinoamele laringiene datorate implicării metastazelor ganglionare dar și marginilor de rezecție pozitive [179]. Prin numărul mic de vase limfatice existente, interesarea glotică se însoțește de un procent mai mic de metastaze ganglionare și implicit un prognostic mai bun. Jakobsen J și colaboratorii au raportat prezența metastazelor ganglionare pentru afectarea etajului glotic în 1% din cazuri comparativ cu procentul de 29% corespunzător afectării etajul supraglotic 29% [135]. Rata de supraviețuire în cazul localizării carcinoamelor la nivel glotic reprezintă un procent de până 95% în stadiile incipiente comparativ cu stadiile avansate, în care sunt prezente și metastaze, unde procentul poate să atingă valori de maxim 30% [6].

Printre cei mai importanți parametrii ai studiului nostru a fost stabilirea stadiului pTNM. Acest lucru a fost realizat doar pe piesele de exereza chirurgicală, în 67 de cazuri. Am constatat ca cele mai multe cazuri au corespuns stadiilor avansate, respectiv stadiile III și IV. Stadiul al III-lea a fost prezent în 37 de cazuri (55,2%) iar stadiul IV în 17 cazuri (25,4%). Au urmat stadiul II cu 10 cazuri (14,9%) și stadiul I cu 3 cazuri (4,5%).

Carcinomul scuamos laringian diagnosticat în stadii incipiente, stadiile I și II sunt însoțite de șanse crescute de vindecare spre deosebire stadiile avansate, stadiile III și IV, care sunt însoțite de mortalitate și morbiditate crescute [180]. Carcinoamele scuamoase laringiene în stadii avansate sunt cele mai frecvent diagnosticate forme de boală până la 40% din numărul total de cazuri [181]. Conform altor studii, stadiile III și IV au fost principalele stadii diagnosticate acestea fiind prezente în 170 de cazuri (24,63%) și respectiv 443 de cazuri (64,2%). Conform lui Debry C și colaboratorii stadiile avansate au fost prezente în 73,6% din cazuri și sunt asociate cu un prognostic nefavorabil și agresivitate caracterizată prin apariția rapidă a recurențelor [137]. Supraviețuirea pacienților diagnosticați în stadii incipiente a fost raportată la 73-92% din cazuri comparative cu supraviețuirea din stadiile avansate unde s-a înregistrat o scădere la 35-64% [4]. S-a demonstrat și o asociere între stadiul pTNM și localizarea cancerului privind etajele interesate. Astfel ca stadiile avansate au fost frecvent diagnosticate în localizările supraglotice ale carcinoamelor laringiene, localizare asociată deja cu evoluția nefavorabilă [4].

VII.C ANALIZA IMUNOHISTOCHIMICĂ A CARCINOAMELOR

SCUAMOASE LARINGIENE

În ultimii ani, cancerul laringian a devenit una dintre patologiile des întâlnite înregistrând chiar și o scădere a raportului bărbați/femei [6]. Un număr crescut de pacienți ignoră simptomatologia inițială astfel că diagnosticarea este posibilă în stadii avansate [6]. Prin dezvoltarea de tehnici noi de tratament, supraviețuirea și calitatea vieții prezintă îmbunătățiri dar există încă consecințe grave cum sunt: edemul laringian progresiv sau fibroza laringiană [182-183]. De aceea identificarea unor markeri tumorali prognostici ar permite o diagnosticare cât mai precisă și astfel ar exista un management calitativ încă de la început permițând folosirea unui tratament individual, specific [94,182].

FACTORI DE CREȘTERE ȘI PROLIFERARE

Factorii de creștere și proliferare sunt molecule cu rol în capacitatea de înmulțire a celulelor și orice mutație la acest nivel duce la transformarea acestora în oncogene. Acești markeri de proliferare sunt utili în aprecierea evoluției și a prognosticului unor tumori maligne [184].

Receptorul factorului de creștere epidermal- EGFR este o oncogenă implicată în promovarea transformării maligne, intervenind în favorizarea creșterii tumorale prin inhibarea apoptozei, stimularea proliferării celulare și a procesului de angiogeneză dar și fenomenul de metastazare [114]. Implicarea acestei proteine tirozin-kinazice în apariția procesului canceros a fost descrisă în cancere pulmonare, carcinoame mamare dar și carcinoamele scuamoase de cap și gât [185-187]. Un procent ridicat de 80-90% din cancerele de cap și gât prezintă un nivel crescut al expresiei EGFR. Acest aspect a fost observat ca fiind prezent încă din stadiile inițiale ale cancerogenezei iar creșterea expresiei este direct proporțională cu severitatea leziunilor [187]. Supraexpresia EGFR prezentă în carcinoamele scuamoase laringiene, în cele mai multe cazuri este asociată cu evoluția nefavorabilă a bolii și o perioadă mai scurtă de supraviețuire [114,188-189].

Analiza imunoexpresiei EGFR în carcinoamele scuamoase laringiene ale studiului prezent, a indicat pozitivitate membranară și citoplasmatică în 34 de cazuri din cele 38 investigate imunohistochimic. În cazurile incluse în studiu am constatat o incidență de 54,7%, cu o expresie înaltă în formele moderat și slab diferențiate de carcinoame scuamoase laringiene comparativ cu formele bine diferențiate. Cercetând literatura de specialitate am observat diferențe în valorile expresiei EGFR. Astfel într-un studiu efectuat pe 92 de pacienți, Șimșek H și colaboratorii au obținut o valoare de 54% a expresiei EGFR [190]. Alte studii au găsit valori variabile ale expresiei EGFR de 87,5% în carcinoamele scuamoase laringiene [191]. S-a constatat faptul că există o legătură între supraexpresia EGFR și prognostic, și anume cu cât este mai mare expresia markerului cu atât prognosticul este mai rezervat și supraviețuirea mai redusă [192].

Recurența carcinoamelor este direct legată de prezența invaziei tumorale în ganglionii limfatici regionali, conform unor studii [193]. Astfel identificarea supraexpresiei EGFR precum și a TGF-α pot ajuta încă de la diagnosticare la identificarea pacienților cu risc crescut de recurență dar și orientarea terapiei [93,193]. Conform studiului lui Thomas GR și colaboratorii o supraexpresie a EGFR este asociată și cu rezistența la radioterapie și chimioterapie, astfel fiind posibilă identificarea grupului de pacienți ce necesită o terapie mult mai agresivă [114].

Blocarea funcției EGFR reprezintă principala acțiune a terapiei prin utilizarea de anticorpi monoclonali care stimulează și răspunsul imun antitumoral sau a inhibitorilor de tirozin-kinaze care inhibă procesul de fosforilare [93]. La ora actuală terapia combinată, radioterapie în combinație cu utilizarea anticorpilor monoclonali, Cetuximab, a fost însoțită de rezultate bune în formele avansate de carcinoame de cap și gât cu prelungirea supraviețuirii [93].

Unul dintre markerii intens studiați ai proliferării celulare este markerul Ki-67. Expresia nucleară a acestui marker este identificată atât în cazul leziunilor displazice cât și în cazul cancerelor, inclusiv carcinomul scuamos laringian [194]. Studiul acestui marker a demonstrat prezența lui încă din stadiul leziunilor precursoare dovedindu-se a fi util în diagnosticarea acestora [87].

În studiul nostru pozitivitatea Ki-67 a fost identificată în toate cele 38 de cazuri analizate imunohistochimic cu o valoare medie procentuală de 42,6%. Conform studiului lui Bay Y și colaboratorii valorile procentuale cele mai mari, 52%, au fost obținute în carcinoamele scuamoase laringiene comparativ cu leziunile displazice [195]. De asemenea, în studiul nostru, am obținut asociere semnificativ statistică (p=0,000) între markerul Ki-67 și gradul de diferențiere. Literatura de specialitate confirmă asocierea statistică între Ki-67 și gradul de diferențiere [86,195-196].

Identificarea Ki-67 în cazul carcinoamelor laringiene s-a corelat cu o agresivitate crescută a bolii precum și cu un prognostic rezervat al pacienților [197]. O relație între recurența tumorală și expresia înaltă a markerului a fost pusă în evidență într-un studiu efectuat pe 90 de pacienți [198]. Mai mult, expresia crescută a Ki-67 a fost asociată cu formele slab diferențiate de carcinoame scuamoase laringiene în care a fost prezent și invazia ganglionilor locoregionali comparativ cu cazurile fără metastazare ganglionară [199].

Expresia Ki-67 alături de VEGF au potențial de identificare a cancerelor laringiene cu un prognostic rezervat care necesită un tratament mai agresiv [200]. De asemenea, asocierea cu p21 indică o boală mai agresivă, cu un risc mai mare de metastazare și o perioadă de supraviețuire mai mică [51]. Studiul expresiei Ki-67 alături de p53 aduce informații noi despre posibilitatea identificării timpurii a tumorilor cu răspuns bun la radioterapie pentru a evita efectele mutilante ale intervenției chirurgicale. S-a demonstrat prezența radiorezistenței în cazul tumorilor cu o expresie mică a Ki-67 [85].

MARKERI AI APOTOZEI

Apoptoza reprezintă un proces fiziologic în urma căruia sunt distruse celule cu diverse modificări anormale. În momentul în care sunt perturbate anumite mecanisme, această capacitate de distrugere este pierdută fiind astfel posibilă dezvoltarea anumitor caractere maligne [201]. În tumorile maligne, acest fenomen apare atât spontan cât și postterapeutic [202].

p53 reprezintă o genă supresoare intens studiată datorită implicării în transformarea malignă, inclusiv în cancerele laringiene [27-28]. Mutațiile care apar la acest nivel sunt traduse prin pierderea activității supresive și obținerea capacității de proliferare și rezistență a celulelor tumorale [35]. Mutațiile sunt prezente în aproximativ 50-69% din cancerele de cap și gât, prezența acestora fiind asociată cu evoluția nefavorabilă a bolii [114]. Apariția mutațiilor p53 alături de inactivarea p16 reprezintă evenimente timpurii ale cancerogenezei de cap și gât [42].

Acest marker a prezentat o pozitivitate de 52,5% în studiul nostru din cele 38 de cazuri investigate imunohistochimic. Atât procentul cât și intensitatea reacțiilor pozitive a variat cu gradul de diferențiere și stadiul pTNM. Cele mai mari valori de 75,7% au fost obținute în formele slab diferențiate. Cercetând literatura de specialitate am observat valori variabile ale expresiei p53, între 22%-64,81% [203-205]. Analiza statistică în diverse studii a evidențiat asocieri semnificative între p53 și localizarea tumorii, stadiul pTNM și categoria N [205]. Asemănător în studiul nostru, am obținut o asociere semnificativă între p53 și stadiul pTNM (p=0,031).

Supraexpresia p53 prezentă în carcinoamele laringiene a fost asociată cu evoluția nefavorabilă a bolii, cu recurența tumorală și perioadă de supraviețuire scurtă [114]. Supraexpresia p53 este cel mai bine reprezentată în cazul cancerelor laringiene comparativ cu orice altă localizare anatomică a unui cancer și mai este asociată și cu obiceiul de a fuma [34].

S-a constatat că modificările, inactivare sau mutații, suferite de p53 sunt asociate cu o proliferare anormală și o creștere a supraviețuirii celulelor tumorale dar și apariția chimiorezistenței [37]. De asemenea răspunsul la radioterapie este influențat de supraexpresia p53, existând un răspuns mai slab la radioterapie și o perioadă fără prezența bolii mult mai scurtă [32-33].

Bcl-2 reprezintă una dintre genele implicate în controlul ciclului celular dar și apoptoză, mutații ale acesteia se manifestă prin diminuarea numărului de celule care intră în apoptoză fiind permisă dezvoltarea și supraviețuirea unei populații celulare defectuoase [206]. Supraexpresia bcl-2 împreună cu translocația t(14;18) a fost descrisă ca fiind prezentă în limfoamele non-Hodgkin iar fără alte mutații în diverse tipuri de cancer printre care și carcinoamele scuamoase laringiene [206-207]. Studiile au demonstrat o asociere între bcl-2 și p53, în sensul că identificarea supraexpresiei ambelor proteine pot aduce informații despre prognosticul pacienților. S-a constatat faptul că coexpresia acestora se asociază cu un prognostic prost și o perioadă de supraviețuire mai mică [207]. De asemenea, coexpresia bcl-2/Bax, o altă genă implicată în apoptoză, a fost corelată cu o evoluție nefavorabilă [208].

Pozitivitatea markerului bcl-2 a fost observată în 33 de cazuri din cele 38 investigate imunohistochimic în studiul nostru. În stadiile avansate, III și IV, precum și formele slab diferențiate de carcinoame am obținut cele mai mari valori iar valoarea procentuală medie a fost de 42,7%. Pozitivitate variabilă, cu valori procentuale de 10, 26,2%,74% și chiar 81% am întâlnit în diverse studii de specialitate [203,206,209]. Analiza statistică a studiului nostru a demonstrat asocieri semnificative între marker și gradul de diferențiere (p=0,018) dar și stadiul pTNM (0,015). Asemănător, alte studii au obținut asocieri între bcl-2 și gradul de diferențiere, stadiul pTNM și chiar categoria N [206].

Expresia bcl-2 a fost asociată cu răspunsul la terapie și mai exact la chimioterapie. Supraexpresia bcl-2 asociată cu chimiorezistență a fost dovedită în diverse tipuri de cancer cum ar fi prostată, colon și chiar laringe [209]. Gallo O și colaboratorii au demonstrat pentru cancerele de cap și gât o asociere între expresia înalta a bcl-2 și apariția recurențelor, cu reducerea supraviețuirii la pacienții tratați prin radioterapie [210]. Astfel identificarea cazurilor cu o expresie înaltă a bcl-2 ar permite pacienților un tratament adecvat fără a se recurge de primă intenție la tratamentul chirurgical, de cele mai multe ori mutilant și chiar utilizarea diverselor oligonucleotide împotriva bcl-2 [209].

MOLECULELE DE ADEZIUNE

Metastazele reprezintă una dintre principalele caracteristici ale cancerelor. Capacitatea de migrare și metastazare a cancerelor este datorată în principal alterării adeziunii celulare. Caderinele și cateninele reprezintă principalii pioni ai fenomenului de adeziune celulară [211].

Unul dintre primele fenomene care apare în cancerogeneză este reducerea adezivității celulare, aspect întâlnit inclusiv în carcinoamele scuamoase laringiene [212]. Principala cheie a procesului de reducere a adezivității celulare o reprezintă complexul caderină/catenină și mai exact alterarea acestuia [213]. Cateninele, cum sunt beta și gama-catenina, sunt atașate de porțiunea citoplasmatică a E-caderinei [212].

E-caderina reprezintă una dintre principalele proteine implicate în stabilitatea epitelială [106]. S-a observat o reducere sau chiar absența expresiei E-caderinei în cazul carcinoamelor scuamoase [107]. Stadiile avansate de boală caracterizate prin asocierea de metastaze ganglionare și forme slab diferențiate au fost frecvent asociate cu reducerea sau pierderea expresiei E-caderinei [212].

În studiul nostru, E-caderina a fost identificată atât la nivel membranar cât și citoplasmatic într-un număr superior, de 53,6% în cazurile bine diferențiate, 19.8% în cele moderat diferențiate și 17.4% în cazurile slab diferențiate. Cercetând literatura de specialitate am constatat în cazul carcinoamelor scuamoase laringiene, asemănări ale expresiei markerului cu studiul nostru și anume faptul că în formele bine și moderat diferențiate se menține pozitivitatea acestui marker, pentru formele slab diferențiate fiind menționată o scădere până la dispariție a marcajului E-caderinei [212]. Reducerea expresiei E-caderinei reprezintă un aspect negativ în cancere prin faptul că acest fenomen denotă o agresivitate mare a tumorii, cu o mare capacitate de invazie atât a structurilor înconjurătoare cât și a ganglionilor limfatici [212,214]. A fost studiată și relația dintre E-caderină și alți markeri, pentru obținerea de noi informații care să aducă beneficii pacienților. A fost studiată asocierea între E-caderină și markerii de proliferare (Ki-67 și PCNA). Supraexpresia Ki-67 și PCNA alături de diminuarea expresiei E-caderinei pot ajuta la diagnosticarea metastazelor oculte, chiar în absența clinică a metastazelor ganglionare [199]. În cadrul studiului lui Nijkamp MM și colaboratorii expresia E-caderinei a fost studiată împreună cu expresia vimentinei și reducerea expresiei E-caderinei a fost însoțită de pozitivitate intensă a vimentinei, ambele expresii fiind corelate cu prezența metastazelor [108]. Expresia E-caderinei a fost investigată și în alte localizări ale cancerului unde rezultatele au fost asemănătoare. În cancerul de sân, într-un studiu efectuat pe 30 de pacienți, Kowalsky PJ și colaboratorii au obținut o reducere a expresiei E-caderinei în cazurile asociate cu un prognostic prost, fiind un semn de invazie tumorală [215]. Pentru cancerul de prostată rezultatele au variat în funcție de reducerea sau absența expresiei E-caderinei. Diminuarea expresiei E-caderinei a fost prezentă în cazurile în care s-a întâlnit o capacitate mare de invazie iar absența expresiei acestui marker a corespuns cazurilor cu o rată crescută de apariție a metastazelor osoase [216].

P-caderina este una dintre glicoproteinele de adeziune, cu un rol foarte important în menținerea integrității structurale a țesutului epitelial. De asemenea, este implicată și în procesele de diferențiere celulară, creștere și migrare [217]. A fost demonstrată și o legătură între P-caderină și diverse localizări ale cancerului, cum ar fi sân, cap și gât, vezica urinară sau prostată.

În cazul patologiei maligne a vezicii urinare, localizarea membranară a markerului a fost prezentă în grupul de pacienți cu perioadă de supraviețuire mai lungă comparativ cu relocalizarea citoplasmatică asociată cu o evoluție nefavorabilă [218]. Prognosticul rezervat pentru cancerele de cap și gât, și anume cu localizare la nivelul cavității orale, a fost demonstrat în cazurile cu reducerea sau chiar absența expresiei P-caderinei [219].

Imunoreacția P-caderinei am identificat-o în 46,09% din cazurile investigate imunohistochimice. Cazurile cu evoluția cel mai probabil nefavorabilă, stadii avansate și forme slab diferențiate, au prezentat cele mai mari valori. Mai mult, am obținut și asociere semnificativă între marker și gradul de diferențiere.

Cercetând literatura de specialitate, asemănări am întâlnit în studiile efectuate la nivelul glandei mamare sau prostată. În cancerul mamar, supraexpresia P-caderinei a fost prezentă în cazurile de carcinoame de grad înalt, fiind asociate cu un comportament agresiv [220]. Această supraexpresie este responsabilă de stimularea motilității celulare precum și a capacității de invazie [221]. Asemănător, supraexpresia P-caderinei s-a asociat cu o evoluție nefavorabilă, cu prezența de metastaze osoase și în cancerele de prostată [222].

P-caderina poate să prezinte o expresie înaltă încă din primele etape ale procesului de cancerogeneză, eveniment care duce la o activare și o supraexpresie a markerului Snail, favorizând astfel capacitatea de motilitate celulară încă din stadiul de leziune displazică [217,223].

Pierderea expresiei β-cateninei este asociată cu apariția caracterelor invazive ale tumorilor maligne datorită reducerii adezivității celulare [224]. Prezența β-cateninei poate fi observată în diferite localizări: nucleară, citoplasmatică sau membranară. β-catenina este prezentată ca având un rol dublu: pe de o parte este asociată cu aderența celulară iar pe de altă parte este asociată cu calea Wnt a cancerogenezei [225]. Această cale presupune activarea unor proteine care în final duc la pierderea stabilității citoplasmatice a β-cateninei și relocarea nucleară a acesteia, relocare asociată cu modificări ale proliferării și diferențierii celulare [225]. Alt studiu, de asemenea notează asocierea pierderii membranare a acestei molecule cu apariția dediferențierii dar și a metastazelor [213].

În prezentul studiu β-catenina a fost identificată în toate localizările, membranar, citoplasmatic și nuclear, în 37.2% din cazuri. În formele moderat și slab diferențiate precum și în stadiile avansate de boală, am constatat prezența mai ales a localizării citoplasmatice și nucleare a markerului comparativ cu formele bine diferențiate. Localizarea în structurile normale este la nivel membranar, aspectele patologice putând fii observate odată cu relocalizarea β-cateninei iar localizarea nucleară demonstrează un prognostic rezervat al pacienților cu cancere de cap și gât [213,225-226]. Și în cazul β-cateninei, expresia acestui marker a fost studiată în relație cu alți markeri. Studiul expresiei β-cateninei alături de expresia înaltă a Rap-1, o proteină Ras cu rol în adeziunea și migrarea celulară, a fost asociată cu prezența metastazelor ganglionare [227]. Si WF și colaboratorii au observat o asociere între stadiul tumoral și categoria N în relația cu expresiile anormale ale E-caderinei și β-cateninei, expresii anormale reprezentate de reducerea expresiei E-caderinei și relocalizarea β-cateninei [225,228].

FACTORI AI CICLULUI CELULAR

Modificările de la nivelul ciclului celular sunt importante prin favorizarea procesului de cancerogeneză dar și a proliferării tumorale. Aceste modificări au repercusiuni asupra diverselor gene, cum ar fi p53 sau ciclin D1.

Gena ciclin D1 limitează progresia fazei G1 a ciclului celular astfel că o supraexpresie a acesteia se însoțește de o pierderea a controlului celular și accelerarea fazei G1 [229-230]. Expresia ciclin D1 a fost studiată în diverse tipuri de cancer precum cavitate orală, sân, plămân dar și laringe [79-80].

Studiul individual al ciclin D1 este util în depistarea formelor incipiente de cancer scuamos laringian, printr-o mare senzitivitate și specificitate pentru această localizare. Supraexpresia acestui marker s-a corelat și cu invazia limfatică, conform unui studiu efectuat pe 108 pacienți [231]. Mai mult valoarea expresiilor imunohistochimice ale ciclin D1 și alți markeri aduc informații folositoare. Pignataro L și colaboratorii au urmărit expresiile și relația dintre ciclin D1 și p27 și au demonstrat faptul că cele mai multe tumori asociate cu o evoluție nefavorabilă a bolii au fost ciclin D1+/p27- comparativ cu situația inversă ciclin D1-/p27+ în care pacienții au prezentat o perioadă de supraviețuire mai lungă [232]. O altă asociere care aduce informații utile este între studiul ciclin D1 și p21. S-a constatat că există o asociere pozitivă între ciclin D1 și p21, proteina p21 fiind motivul creșterii nucleare a ciclin D1 [48]. Supraexpresia celor doi markeri s-a corelat în cazurile de carcinoame scuamoase laringiene cu prezența invaziei tumorale ganglionare, deci un stadiu mai avansat al bolii [231].

În studiul nostru am obținut o pozitivitate de 29,3% în cele 36 de cazuri investigate. Expresia ciclin D1 a crescut cu gradul de diferențiere, cele mai mari valori fiind obținute în formele slab diferențiate. Supraexprimarea ciclin D1 a fost întâlnită în cancerele de cap și gât, mai ales la nivelul laringelui, între 17-79% din cazuri [114].

Diverse alte studii au concluzionat că există și o legătură între ciclin D1 și răspunsul la terapie, supraexprimarea fiind asociată cu răspunsul negativ la radioterapie [82].

FACTORI DE TRANSCRIPȚIE

Snail alături de Twist, un alt factor de transcripție, posedă proprietăți antiapoptotice și au un efect negativ, de diminuare a E-caderinei [233-234]. Expresia ambilor markeri a fost asociată cu prognosticul prost și perioadă scurtă de supraviețuire pentru pacienții cu carcinoame scuamoase de cap și gât cât și în cazurile de hepatocarcinoame [127,235]. Mai mult, asocierea HIF-1α (factorul inductor al hipoxiei 1α) la cei doi markeri descriși anterior se însoțește de deces rapid al pacienților [127]. Snail și Twist se pot asocia și cu IL-6, o citokină inflamatorie, și împreună favorizează apariția metastazelor în cancerele de cap și gât [107].

Snail reprezintă un factor asociat atât cu diverse fenomene fiziologice din embriogeneză cât și cu procese patologice ale cancerogenezei. Snail reprezintă un factor inițiator al procesului de tranziție epitelio-mezenchimală în diverse tipuri de cancer, fiind descris chiar în cancerele de cap și gât [236]. Procesul de tranziție epitelio-mezenchimală este direct asociat cu fenomene de invazie și metastazare tumorală specifice cancerelor [237]. Printre cele mai frecvente caracteristici ale celulelor implicate în procesul de tranziție epitelio-mezenchimală se descriu adezivitatea celulară, capacitatea de invazie și motilitatea celulară [238]. În același timp, Snail este responsabil de apariția rezistenței celulelor tumorale, oferindu-le capacitatea de mobilitate și metastazare [233]. Pentru carcinoamele scuamoase de cap și gât, diverse studii au evidențiat o relație directă între supraexpresia Snail și prognosticul rezervat al pacienților [127,236].

Imunoexpesia Snail a fost evidentă la nivel nuclear în 61,5% din cele 38 de cazuri analizate. Reacția a fost intensă și foarte bine exprimată în cazurile slab diferențiate și în stadiile avansate. Am obținut asocieri semnificative între expresia Snail și categoria N (p=0,020), stadiul pTNM (p=0.010) și gradul de diferențiere (p=0,004). Asemănător rezultatelor noastre, alte studii au identificat corelații între expresia pozitivă, intensă a Snail și gradul de diferențiere scăzut precum și cu adâncimea invaziei [239-240]. A fost studiată și acțiunea Snail asupra E-caderinei și a fost obținută o relație inversă între cei doi markeri, în neoplasmele în care Snail este supraexprimat, E-caderina suferă o reducere a expresiei [241-242].

CAPITOLUL VIII

CONCLUZII

Studiul nostru a fost realizat pe o perioadă de 3 ani, între anii 2010-2012, în care am inclus un număr de 293 de cazuri de carcinoame scuamoase laringiene. Am constatat următoarele aspecte:

În ordinea frecvenței am identificat următoarea distribuție pe ani calendaristici a cazurilor: 89 de cazuri în anul 2010, 96 de cazuri în anul 2011 și 108 cazuri în anul 2012; incidența maximă fiind situată în anul 2012.

În ceea ce privește repartiția pe grupe de vârstă a carcinoamelor laringiene am observat o creștere progresivă din decada V până în decada VII de viață. Cele mai multe cazuri analizate, și anume 118 cazuri (40,2%) au corespuns intervalului cuprins între 60-69 ani.

Analiza repartiției în funcție de incidența pe sexe a leziunilor a indicat o predominanță netă a afecțiunilor la sexul masculin, în 288 (98,3%) cazuri din totalul de 293 de cazuri luate în studiu.

Am constatat faptul că în funcție de mediul de proveniență, majoritatea cazurilor, respectiv 216 de pacienți (73,7%) au provenit din mediul rural.

Studiul factorilor de risc ne-a indicat o majoritate a cazurilor în care fumatul și consumul de alcool au fost principalii factori de risc, în 269 și respectiv 102 de cazuri. Asocieri ale factorilor de risc au fost întâlnite în 137 de cazuri iar cei mai puțini pacienți, ca și factori de risc, au prezentat leziuni preexistente, cum ar fi reflux gastro-esofagian sau laringită cronică.

În funcție de localizarea cancerelor, am constatat următoarea frecvență a localizării carcinoamelor scuamoase laringiene: etajul glotic, etajul supraglotic și etajul infraglotic. Cele mai multe cazuri revenind localizării glotice, în 199 de cazuri.

Analiza aspectului macroscopic al tumorilor ne-a indicat faptul că 74 de cazuri au corespuns aspectului infiltrativ, 96 de cazuri aspectului vegetant și cele mai multe cazuri,123 de cazuri, au prezentat un aspect ulcero-vegetativ.

Încadrarea tumorilor, din punct de vedere al varietăților histopatologice, a corespuns următoarelor forme: forme necheratinizate în 241 de cazuri, un număr de 48 de cazuri au corespuns formei cheratinizate, forma bazaloidă în 2 cazuri și carcinom verucos în același număr cu carcinomul papilar, fiecare cu câte un caz (0,3%).

Majoritatea au aparținut formelor cheratinizate și necheratinizate și au fost întâlnite în toate cele trei etaje ale laringelui: supraglotic, glotic și infraglotic. Forma bazaloidă a fost întâlnită atât la nivel supraglotic cât și glotic iar cele mai rare forme, verucos și papilar, au fost prezente doar în localizarea glotică.

Un alt criteriu histopatologic al studiului nostru a fost gradul de diferențiere, care ne-a permis identificarea a unei majorități de 148 de cazuri moderat diferențiate, urmate de 93 de cazuri de carcinoame scuamoase slab diferențiate și 52 de cazuri carcinoame scuamoase laringiene bine diferențiate.

Cele mai multe cazuri au prezentat un infiltrat inflamator moderat cu aspect de bandă discontinuă în 118 de cazuri urmat de aspectul redus al infiltratului inflamator în 81 de cazuri.

Analiza aspectului patternului de invazie ne-a permis identificarea patternului de invazie discoeziv în 28 de cazuri, urmat de 21 de cazuri cu un pattern coeziv și doar 18 cazuri în care a fost observat un aspect combinat, mixt al invaziei.

Am constatat prezența invaziei atât vasculare cât și perineurale. Invazia vasculară a fost prezentă în 82 cazuri iar în ceea ce privește invazia perineurală, am identificat-o ca fiind prezentă într-un număr de 169 de cazuri.

Un alt parametru morfologic important urmărit în studiul nostru este statusul limfoganglionilor și am observat că cele mai multe cazuri de carcinoame scuamoase laringiene, respectiv 50 de cazuri, nu au asociat prezența adenopatiei metastatice. Prezența invaziei limfoganglionare a fost observată în 17 cazuri: categoriei N1 i-au corespuns 7 cazuri și categoriei N2 10 cazuri.

Printre cei mai importanți parametri ai studiului nostru a fost stabilirea stadiului pTNM. Am observat că cele mai multe cazuri au corespuns stadiilor III și IV, cu 37 de cazuri care au aparținut stadiului III și 17 cazuri stadiului IV. Au urmat stadiul II cu 10 cazuri și stadiul I cu 3 cazuri.

Analiza statistică a studiului histopatologic a identificat diferențe semnificativ statistic (p<0,05) între gradul de diferențiere și localizare dar și varietățile histopatologice. De asemenea, asocieri au fost obținute și între categoria pTNM și categoria T, categoria N și invazia vasculară și perineurală.

Un număr de 38 de cazuri din totalul de 67 de piese de exereză chirurgicală au fost supuse tehnicii imunohistochimice. Am urmărit expresia unor markeri implicați atât în patogenia tumorală cât și ca factori de prognostic.

Analiza imunoexpresiei EGFR în carcinoamele scuamoase laringiene ale studiului prezent, a indicat pozitivitate membranară și citoplasmatică în 34 de cazuri din cele 38 investigate imunohistochimic, unde am obținut o incidență de 54,7%, cu o expresie înaltă în formele moderat și slab diferențiate de carcinoame scuamoase laringiene comparativ cu formele bine diferențiate. Cu cât este mai mare expresia markerului cu atât prognosticul este mai rezervat și supraviețuirea mai redusă.

Un alt factor de creștere și proliferare, investigat în studiul nostru, alături de EGFR a fost Ki-67. Valori mari ale indexului Ki-67 au corespuns formelor moderat și slab diferențiate de 45,4±9,5 și respectiv 69,7±11,1. Expresia înaltă a markerului este întâlnită în cazurile slab diferențiate de carcinoame, cu prezența de metastaze ganglionare și apariția rapidă de recurențe.

Analiza acestor doi factori de creștere și proliferare ne-a indicat o relație invers proporțional cu gradul de diferențiere, valorile celor doi markeri fiind mai mari cu cât gradul de diferențiere al carcinoamelor scuamoase laringiene a fost mai redus.

Următoarea categorie de markeri investigată a fost cea a markerilor apoptozei, unde am studiat expresia p53 și bcl-2.

În ceea ce privește expresia p53, atât procentul cât și intensitatea reacțiilor pozitive a variat cu gradul de diferențiere și stadiul pTNM. Cele mai mari valori de 75,7% au fost obținute în formele slab diferențiate și în stadiul IV, respectiv 54,9±24,1. Supraexpresia acestui marker este asociată cu prognosticul rezervat al pacienților cu carcinoame scuamoase laringiene.

Pozitivitatea markerului bcl-2 a fost observată în 33 de cazuri din cele 38 investigate imunohistochimic în studiul nostru, având aspect asemănător expresiei p53 privind gradul de diferențiere și stadiul de boală. În stadiile avansate, III și IV, precum și formele slab diferențiate de carcinoame am obținut cele mai mari valori iar valoarea procentuală medie a fost de 42,7%.

S-a constatat faptul că coexpresia p53 și bcl-2 se asociază cu un prognostic prost și o perioadă de supraviețuire mai mică.

Dintre moleculele de adeziune, în studiul nostru, am investigat E-caderina, P-caderina și β-catenina.

În cazul E-caderinei valorile cele mai mari au fost identificate pentru carcinoamele scuamoase laringiene bine diferențiate aflate în stadiile incipiente ale bolii, stadiul I și II.

Imunoreacția P-caderinei am identificat-o în 46,09% din cazurile investigate imunohistochimic. Cazurile cu evoluția cel mai probabil nefavorabilă, stadii avansate și forme slab diferențiate, au prezentat cele mai mari valori. Mai mult, am obținut și asociere semnificativă între marker și gradul de diferențiere.

În prezentul studiu β-catenina a fost identificată în toate localizările, membranar, citoplasmatic și nuclear, în 37.2% din cazuri. În formele moderat și slab diferențiate precum și în stadiile avansate de boală, am constatat prezența mai ales a localizării citoplasmatice și nucleare a markerului comparativ cu formele bine diferențiate. Localizarea nucleară este frecvent întâlnită în cazurile de cancere de cap și gât cu un prognostic rezervat.

Printre factorii ciclului celular studiați se află ciclin D1. Am constatat că expresia ciclin D1 a crescut cu gradul de diferențiere, cele mai mari valori fiind obținute în formele slab diferențiate. Supraexpresia ciclin D1 este asociată cu invazia limfatică, metastaze ganglionare, deci un stadiu avansat de boală cu un prognostic rezervat.

Imunoexpesia Snail a fost evidentă la nivel nuclear în 61,5% din cele 38 de cazuri analizate. Reacția a fost intensă și foarte bine exprimată în cazurile slab diferențiate și în stadiile avansate. A fost pusă în evidență relația între supraexpresia Snail și prognosticul rezervat al pacienților.

Analiza statistică a indicat asocieri semnificativ statistic între gradul de diferențiere și markerii care au aparținut categoriilor factori de creștere și proliferare dar și molecule de adeziune precum și ciclin D1.

De asemenea, asocieri am obținut între p53, bcl-2 și gradul de diferențiere și stadiul pTNM.

În cazul Snail asocierile semnificativ statistic au fost între marker și gradul de diferențiere, categoria N și stadiul pTNM.

Acest studiu ne-a demonstrat un rol important al markerilor investigați și anume de factori prognostici pentru cancerul scuamos laringian permițând chiar și identificarea unor noi posibile ținte terapeutice.

BIBLIOGRAFIE

Ding N, Zhou N, Zhou M, Ren GM. Respiratory cancers and pollution. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2015; 19(1):31-7.

Wong YF, Yusof MM, Wan Ishak WZ, Alip A, Phua VC. Treatment outcome for head and neck squamous cell carcinoma in a developing country: university malaya medical centre, malaysia from 2003-2010. Asian Pac J Cancer Prev. 2015; 16(7):2903-8.

Karasmanis I, Goudakos JK, Vital I, Zarampoukas T, Vital V, Markou K. Hybrid carcinoma of the larynx: a case report (adenoid cystic and adenocarcinoma) and review of the literature. Case Rep Otolaryngol 2013; 2013:385405.

Zhang SY, Lu ZM, Luo XN, Chen LS, Ge PJ, Song XH, Chen SH, Wu YL. Retrospective analysis of prognostic factors in 205 patients with laryngeal squamous cell carcinoma who underwent surgical treatment. PLoS One. 2013, (4):e60157.

Barnes L, Eveson JW, Reichart P, Sidransky D. Hypopharynx, larynx and trachea. In: Kleihues P, Sobin LH (Eds):World Health Organization Classification of Tumours Pathology and Genetics of Head and Neck Tumours, 2005, IARC Press, Lyon, 107-62.

Markou K, Christoforidou A, Karasmanis I, Tsiropoulos G, Triaridis S, Constantinidis I, Vital V, Nikolaou A. Laryngeal cancer: epidemiological data from Νorthern Greece and review of the literature. Hippokratia. 2013; 17(4):313-8.

Sharma DK, Sohal BS, Bal MS, Aggarwal S. Clinico-pathological study of 50 cases of tumours of larynx. Indian J Otolaryngol Head Neck Surg 2013; 65(1):29-35.

J Zuckerman, B Shehata, C Hill, S Sobol. Invasive laryngeal carcinoma in a 15 year-old with neglected papillomatosis. The Internet Journal of Otorhinolaryngology 2008; 8:2.

Wünsch Filho V. The epidemiology of laryngeal cancer in Brazil. Sao Paulo Med J. 2004; 122(5):188-94.

La Vecchia C, Zhang ZF, Altieri A. Alcohol and laryngeal cancer: an update. Eur J Cancer Prev. 2008; 17(2):116-24.

Bosetti C, La Vecchia C, Talamini R, Negri E, Levi F, Dal Maso L, Franceschi S. Food groups and laryngeal cancer risk: a case-control study from Italy and Switzerland. Int J Cancer. 2002; 100(3):355-60.

Zheng W1, Blot WJ, Shu XO, Gao YT, Ji BT, Ziegler RG, Fraumeni JF Jr. Diet and other risk factors for laryngeal cancer in Shanghai. China., Am J Epidemiol. 1992; 136(2):178-91.

De Stefani E, Boffetta P, Oreggia F, Ronco A, Kogevinas M, Mendilaharsu M. Occupation and the risk of laryngeal cancer in Uruguay. Am J Ind Med. 1998;33(6):537-42.

Bădulescu F, Crișan A, Bădulescu A, Schenker M. Recent data about the role of human papillomavirus (HPV) in oncogenesis of head and neck cancer. Rom J Morphol Embryol 2010; 51(3):437-40.

Torrente MC, Rodrigo JP, Haigentz M Jr, Dikkers FG, Rinaldo A, Takes RP, Olofsson J, Ferlito A. Human papillomavirus infections in laryngeal cancer. Head Neck. 2011; 33(4):581-6.

de Oliveira DE, Bacchi MM, Macarenco RS, Tagliarini JV, Cordeiro RC, Bacchi CE. Human papillomavirus and Epstein-Barr virus infection, p53 expression, and cellular proliferation in laryngeal carcinoma. Am J Clin Pathol. 2006; 126(2):284-93.

Galli J, Cammarota G, Calò L, Agostino S, D'Ugo D, Cianci R, Almadori G. The role of acid and alkaline reflux in laryngeal squamous cell carcinoma. Laryngoscope. 2002; 112(10):1861-5.

Olson NR. Aerodigestive malignancy and gastroesophageal reflux disease. Am J Med. 1997; 103(5A):97S-99S.

Pavlovic B, Djukic V, Milovanovic J, Tomanovic N, Milovanovic A, Trivic A. Morphometric analysis of Ki-67 and p16 expression in laryngeal precursor lesions. Eur Arch Otorhinolaryngol. 2013; 270(4):1405-10.

Gale N, Zidar N, Poljak M, Cardesa A. Current views and perspectives on classification of squamous intraepithelial lesions of the head and neck. Head Neck Pathol. 2014; 8(1):16-23.

Gale N, Michaels L, Luzar B, Poljak M, Zidar N, Fischinger J, Cardesa A. Current review on squamous intraepithelial lesions of the larynx. Histopathology. 2009; 54(6):639-56.

Boffetta P, Richiardi L, Berrino F, Estève J, Pisani P, Crosignani P, Raymond L, Zubiri L, Del Moral A, Lehmann W, Donato F, Terracini B, Tuyns A, Merletti F. Occupation and larynx and hypopharynx cancer: an international case-control study in France, Italy, Spain, and Switzerland. Cancer Causes Control. 2003; 14(3):203-12.

Krajcovicová-Kudlácková M, Dusinská M. Oxidative DNA damage in relation to nutrition. Neoplasma. 2004; 51(1):30-3.

Machii R, Saika K. Five-year relative survival rate of larynx cancer in the USA, Europe and Japan. Jpn J Clin Oncol. 2014; 44(10):1015-6.

Bosetti C, Garavello W, Levi F, Lucchini F, Negri E, La Vecchia C. Trends in laryngeal cancer mortality in Europe. Int J Cancer. 2006; 119(3):673-81.

Chatenoud L, Garavello W, Pagan E, Bertuccio P, Gallus S, La Vecchia C, Negri E, Bosetti C. Laryngeal cancer mortality trends in European countries. Int J Cancer. 2016; 138(4):833-42.

Garozzo A, Cutrona D, Palmeri S, Maiolino L, Puzzo L, Allegra E. [The role of p53 tumor suppressor gene as prognostic factor in laryngeal squamous cell carcinoma]. Acta Otorhinolaryngol Ital. 1999; 19(6):342-7.

Gorgoulis V, Rassidakis G, Karameris A, Giatromanolaki A, Barbatis C, Kittas C. Expression of p53 protein in laryngeal squamous cell carcinoma and dysplasia: possible correlation with human papillomavirus infection and clinicopathological findings. Virchows Arch 1994; 425:481–9.

Brachman DG. Molecular biology of head and neck cancer. Semin Oncol. 1994; 21(3):320-9.

Greenblatt MS, Bennett WP, Hollstein M, Harris CC. Mutations in the p53 tumor suppressor gene: clues to cancer etiology and molecular pathogenesis. Cancer Res. 1994; 54(18):4855-78.

el-Naggar AK, Lai S, Luna MA, Zhou XD, Weber RS, Goepfert H, Batsakis JG. Sequential p53 mutation analysis of pre-invasive and invasive head and neck squamous carcinoma. Int J Cancer. 1995; 64(3):196-201.

Kastan MB, Onyekwere O, Sidransky D, Vogelstein B, Craig RW. Participation of p53 protein in the cellular response to DNA damage. Cancer Res 1991; 51:6304-11.

Koch WM, Brennan JA, Zahurak M, Goodman SN, Westra WH, Schwab D, Yoo GH, Lee DJ, Forastiere AA, Sidransky D. p53 mutation and locoregional treatment failure in head and neck squamous cell carcinoma. J Natl Cancer Inst. 1996; 88(21):1580-6.

Peltonen JK, Helppi HM, Pääkkö P, Turpeenniemi-Hujanen T, Vähäkangas KH. p53 in head and neck cancer: functional consequences and environmental implication of tp53 mutations. Head Neck Oncol. 2010; 2:36.

Rivlin N, Brosh R, Oren M, Rotter V. Mutations in the p53 Tumor Suppressor Gene: Important Milestones at the Various Steps of Tumorigenesis. Genes Cancer. 2011; 2(4):466-74.

Sigal A, Rotter V. Oncogenic Mutations of the p53 Tumor Suppressor: The Demons of the Guardian of the Genome. Cancer Res. 2000; 60(24):6788-93.

Bush JA, Li G. Cancer chemoresistance: the relationship between p53 and multidrug transporters. Int J Cancer. 2002; 98(3):323-30.

Yuen PW, Man M, Lam KY, Kwong YL. Clinicopathological significance of p16 gene expression in the surgical treatment of head and neck squamous cell carcinomas. J Clin Pathol. 2002; 55(1):58-60.

González MV, Pello MF, López-Larrea C, Suárez C, Menéndez MJ, Coto E. Deletion and methylation of the tumour suppressor gene p16/CDKN2 in primary head and neck squamous cell carcinoma. J Clin Pathol. 1997; 50(6): 509–512.

Waber P, Dlugosz S, Cheng QC, Truelson J, Nisen PD. Genetic alterations of chromosome band 9p21-22 in head and neck cancer are not restricted to p16INK4a. Oncogene. 1997; 15(14):1699-704.

Lang JC, Tobin EJ, Knobloch TJ, Schuller DE, Bartynski KJ, Mountain RE, Nicholson R, DeYoung BR, Weghorst CM. Frequent mutation of p16 in squamous cell carcinoma of the head and neck. Laryngoscope. 1998; 108(6):923-8.

Califano J, van der Riet P, Westra W, Nawroz H, Clayman G, Piantadosi S, Corio R, Lee D, Greenberg B, Koch W, Sidransky D. Genetic progression model for head and neck cancer: implication for field cancerization. Cancer Res. 1996; 56(11):2488-92.

Kalfert D, Celakovsky P, Laco J, Ludvikova M. The role of protein p16 in glottic laryngeal squamous cell carcinoma. Pathol Oncol Res. 2014; 20(4):909-15.

Silva SD, Nonogaki S, Soares FA, Kowalski LP. P16 has clinicopathological and prognostic impact on oropharynx and larynx squamous cell carcinoma. Braz J Med Biol Res. 2012; 45(12):1327-33.

Koscielny S, Dahse R, Ernst G, von Eggeling F. The prognostic relevance of p16 inactivation in head and neck cancer. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 2007; 69(1):30-6.

van der Riet P, Nawroz H, Hruban RH, Corio R, Tokino K, Koch W, Sidransky D. Frequent loss of chromosone 9p21-22 early in head and neck cancer progression. Cancer Res. 1994; 54(5):1156-8.

Patel V, Jakus J, Harris CM, Ensley JF, Robbins KC, Yeudall WA. Altered expression and activity of G1/S cyclins and cyclin-dependent kinases characterize squamous cell carcinomas of the head and neck. Int J Cancer. 1997; 73(4):551-5.

Coqueret O. New roles for p21 and p27 cell-cycle inhibitors: a function for each cell compartment?. Trends Cell Biol. 2003; 13(2):65-70.

Zahner G, Wolf G, Ayoub M, Reinking R, Panzer U, Shankland SJ, Stahl RA. Cyclooxygenase-2 overexpression inhibits platelet-derived growth factor-induced mesangial cell proliferation through induction of the tumor suppressor gene p53 and the cyclin-dependent kinase inhibitors p21waf-1/cip-1 and p27kip-1. J Biol Chem. 2002; 277(12):9763-71.

LaBaer J, Garrett MD, Stevenson LF, Slingerland JM, Sandhu C, Chou HS, Fattaey A, Harlow E. New functional activities for the p21 family of CDK inhibitors. Genes Dev. 1997; 11(7):847-62.

Fischer CA, Jung M, Zlobec I, Green E, Storck C, Tornillo L, Lugli A, Wolfensberger M, Terracciano LM. Co-overexpression of p21 and Ki67 in head and neck squamous cell carcinoma relative to a significantly poor prognosis. Head Neck. 2011; 33(2):267-73.

Snietura M, Jaworska M, Mlynarczyk-Liszka J, Goraj-Zajac A, Piglowski W, Lange D, Wozniak G, Nowara E, Suwinski R. PTEN as a prognostic and predictive marker in postoperative radiotherapy for squamous cell cancer of the head and neck. PLoS One. 2012; 7(3): e33396.

Chow LM, Baker SJ. PTEN function in normal and neoplastic growth. Cancer Lett. 2006; 241(2):184-96.

Shen WH, Balajee AS, Wang J, Wu H, Eng C, Pandolfi PP, Yin Y. Essential role for nuclear PTEN in maintaining chromosomal integrity. Cell. 2007; 128(1):157-70.

Bussink J, van der Kogel AJ, Kaanders JH. Activation of the PI3-K/AKT pathway and implications for radioresistance mechanisms in head and neck cancer. Lancet Oncol. 2008; 9(3):288-96.

Squarize CH, Castilho RM, Abrahao AC, Molinolo A, Lingen MW, Gutkind JS. PTEN deficiency contributes to the development and progression of head and neck cancer. Neoplasia. 2013; 15(5):461-71.

Di Cristofano A, Pesce B, Cordon-Cardo C, Pandolfi PP. Pten is essential for embryonic development and tumour suppression. Nat Genet. 1998; 4:348–355.

Engelman JA, Luo J, Cantley LC. The evolution of phosphatidylinositol 3-kinases as regulators of growth and metabolism. Nat Rev Genet. 2006; 8:606–619.

Di Cristofano A, Pandolfi PP. The multiple roles of PTEN in tumor suppression. Cell. 2000; 4:387–390.

Pedrero JM, Carracedo DG, Pinto CM, Zapatero AH, Rodrigo JP, Nieto CS, Gonzalez MV. Frequent genetic and biochemical alterations of the PI 3-K/AKT/PTEN pathway in head and neck squamous cell carcinoma. Int J Cancer. 2005; 114(2):242-8.

Lui VW, Hedberg ML, Li H, Vangara BS, Pendleton K, Zeng Y, Lu Y, Zhang Q, Du Y, Gilbert BR, Freilino M, Sauerwein S, Peyser ND, Xiao D, Diergaarde B, Wang L, Chiosea S, Seethala R, Johnson JT, Kim S, Duvvuri U, Ferris RL, Romkes M, Nukui T, Kwok-Shing Ng P, Garraway LA, Hammerman PS, Mills GB, Grandis JR. Frequent mutation of the PI3K pathway in head and neck cancer defines predictive biomarkers. Cancer Discov. 2013; 3(7):761-9.

Salmena L, Carracedo A, Pandolfi PP. Tenets of PTEN tumor suppression. Cell. 2008; 133:403–414.

Park HW, Song SY, Lee TJ, Jeong D, Lee TY. Abrogation of the p16-retinoblastoma-cyclin D1 pathway in head and neck squamous cell carcinoma. Oncol Rep. 2007; 18(1):267-72.

Nevins JR. Th e Rb/E2F pathway and cancer. Hum Mol Genet. 2001; 10(7):699-703.

Krecicki T, Smigiel R, Fraczek M, Kowalczyk M, Sasiadek MM. Studies of the cell cycle regulatory proteins P16, cyclin D1 and retinoblastoma protein in laryngeal carcinoma tissue. J Laryngol Otol. 2004; 118(9):676-80.

Tsantoulis PK, Kastrinakis NG, Tourvas AD, Laskaris G, Gorgoulis VG. Advances in the biology of oral cancer. Oral Oncol. 2007; 43(6):523-34.

Giacinti C, Giordano A. RB and cell cycle progression. Oncogene. 2006; 25(38):5220-7.

Levy L, Hill CS. Alterations in components of the TGF-beta superfamily signaling pathways in human cancer. Cytokine Growth Factor Rev. 2006; 17(1–2):41–58.

Thiery JP, Acloque H, et al. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 2009; 139(5):871–90.

Wrana JL, Attisano L, Wieser R, Ventura F, Massagué J. Mechanism of activation of the TGF-beta receptor. Nature. 1994; 370(6488):341-7.

Derynck R, Zhang Y, Feng XH. Smads: transcriptional activators of TGF-beta responses. Cell. 1998; 95(6):737-40.

White RA, Malkoski SP, Wang X-J. TGFβ signaling in head and neck squamous cell carcinoma. Oncogene 2010; 29(40):5437-5446.

Muro-Cacho CA, Anderson M, Cordero J, Muñoz-Antonia T. Expression of transforming growth factor beta type II receptors in head and neck squamous cell carcinoma.Clin Cancer Res. 1999; 5(6):1243-8.

Fukai Y, Fukuchi M, Masuda N, Osawa H, Kato H, Nakajima T, Kuwano H. Reduced expression of transforming growth factor-beta receptors is an unfavorable prognostic factor in human esophageal squamous cell carcinoma. Int J Cancer. 2003; 104(2):161-6.

Muro-Cacho CA, Rosario-Ortiz K, Livingston S, Munoz-Antonia T. Defective transforming growth factor beta signaling pathway in head and neck squamous cell carcinoma as evidenced by the lack of expression of activated Smad2. Clin Cancer Res. 2001; 7:1618–1626.

Natsugoe S, Xiangming C, Matsumoto M, Okumura H, Nakashima S, Sakita H, Ishigami S, Baba M, Takao S, Aikou T. Smad4 and transforming growth factor beta1 expression in patients with squamous cell carcinoma of the esophagus. Clin Cancer Res. 2002; 8(6):1838-42.

Campo-Trapero J, Cano-Sánchez J, Palacios-Sánchez B, Sánchez-Gutierrez JJ, González-Moles MA, Bascones-Martínez A. Update on molecular pathology in oral cancer and precancer. Anticancer Res. 2008; 28(2B):1197-205.

Bertram JS. The molecular biology of cancer. Mol Aspects Med. 2000; 21(6):167-223.

X Wang, Z P Pavelic, Y-Q Li, L Wang, L Gleich, K Radack, J L Gluckman, and P J Stambrook. Amplification and overexpression of the cyclin D1 gene in head and neck squamous cell carcinoma. Clin Mol Pathol. 1995; 48(5): M256–M259.

Lin RJ, Lubpairee T, Liu KY, Anderson DW, Durham S, Poh CF. Cyclin D1 overexpression is associated with poor prognosis in oropharyngeal cancer. J Otolaryngol Head Neck Surg. 2013; doi: 10.1186/1916-0216-42-23.

Zheng Y, Shen H, Sturgis EM, Wang LE, Eicher SA, Strom SS, Frazier ML, Spitz MR, Wei Q. Cyclin D1 polymorphism and risk for squamous cell carcinoma of the head and neck: a case-control study. Carcinogenesis. 2001; 22(8):1195-9.

Coco-Martin JM, Balkenende A, Verschoor T, Lallemand F, Michalides R. Cyclin D1 overexpression enhances radiation-induced apoptosis and radiosensitivity in a breast tumor cell line. Cancer Res. 1999; 59(5): 1134–50.

Ashok M. Shenoy. Cyclin D1 over expression as a prognostic factor in patients with tobacco-related intraoral squamous cell carcinoma. Indian J Med Res. 2011; 133(4): 364–365.

van Diest PJ, Brugal G, Baak JP.Proliferation markers in tumours: interpretation and clinical value. J Clin Pathol. 1998; 51(10): 716–724.

Couture C, Raybaud-Diogène H, Têtu B, Bairati I, Murry D, Allard J, Fortin A. p53 and Ki-67 as markers of radioresistance in head and neck carcinoma. Cancer. 2002; 94(3):713-22.

Bonhin RG, Carvalho GM, Guimarães AC, Chone CT, Crespo AN, Altemani AM, Amstalden EM. Histologic correlation of expression of Ki-67 in squamous cell carcinoma of the glottis according to the degree of cell differentiation. Braz J Otorhinolaryngol. 2014; 80(4):290-5.

Bai Y, Hong S, Peng Z. [Expression and significance of proliferation marker and apoptosis-related genes in benign and malignant epithelial lesions of the larynx]. Lin Chuang Er Bi Yan Hou Ke Za Zhi. 2003; 17(2):92-3, 96.

Bullwinkel J, Baron-Lühr B, Lüdemann A, Wohlenberg C, Gerdes J, Scholzen T. Ki-67 protein is associated with ribosomal RNA transcription in quiescent and proliferating cells. J Cell Physiol. 2006; 206(3):624-35.

Patel V, Jakus J, Harris CM, Ensley JF, Robbins KC, Yeudall WA. Altered expression and activity of G1/S cyclins and cyclin-dependent kinases characterize squamous cell carcinomas of the head and neck. Int J Cancer. 1997; 73(4):551-5.

Sherr CJ, Roberts JM. Inhibitors of mammalian G1 cyclin-dependent kinases. Genes Dev. 1995; 9(10):1149-63.

DE Almeida MR, Pérez-Sayáns M, Suárez-Peñaranda JM, Somoza-Martín JM, García-García A. p27Kip1 expression as a prognostic marker for squamous cell carcinoma of the head and neck. Oncol Lett. 2015; 10(5):2675-2682.

Wang Z, Sturgis EM, Zhang F, Lei D, Liu Z, Xu L, Song X, Wei Q, Li G. Genetic variants of p27 and p21 as predictors for risk of second primary malignancy in patients with index squamous cell carcinoma of head and neck. Mol Cancer. 2012; 11:17.

Pai SI, Westra WH. Molecular pathology of head and neck cancer: implications for diagnosis, prognosis, and treatment. Annu Rev Pathol. 2009; 4:49-70.

Suh Y, Amelio I, Guerrero Urbano T, Tavassoli M. Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer. Cell Death Dis. 2014; 5:e1018.

Sok JC, Coppelli FM, Thomas SM, Lango MN, Xi S, Hunt JL, Freilino ML, Graner MW, Wikstrand CJ, Bigner DD, Gooding WE, Furnari FB, Grandis JR. Mutant epidermal growth factor receptor (EGFRvIII) contributes to head and neck cancer growth and resistance to EGFR targeting. Clin Cancer Res. 2006; 12(17):5064-73.

Pruneri G, Pignataro L, Manzotti M, Carboni N, Ronchetti D, Neri A, Cesana BM, Viale G. p63 in laryngeal squamous cell carcinoma: evidence for a role of TA-p63 down-regulation in tumorigenesis and lack of prognostic implications of p63 immunoreactivity. Lab Invest. 2002; 82(10):1327-34.

Lo Muzio L, Santarelli A, Caltabiano R, Rubini C, Pieramici T, Trevisiol L, Carinci F, Leonardi R, De Lillo A, Lanzafame S, Bufo P, Piattelli A. p63 overexpression associates with poor prognosis in head and neck squamous cell carcinoma. Hum Pathol. 2005; 36(2):187-94.

Borba M, Cernea C, Dias F, Faria P, Bacchi C, Brandão L, Costa A. Expression profile of p63 in 127 patients with laryngeal squamous cell carcinoma. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 2010; 72(6):319-24.

Madoz-Gúrpide J, Zazo S, Chamizo C, Casado V, Caramés C, Gavín E, Cristóbal I, García-Foncillas J, Rojo F. Activation of MET pathway predicts poor outcome to cetuximab in patients with recurrent or metastatic head and neck cancer. J Transl Med. 2015; 13:282.

Sun W, Gaykalova DA, Ochs MF, Mambo E, Arnaoutakis D, Liu Y, Loyo M, Agrawal N, Howard J, Li R, Ahn S, Fertig E, Sidransky D, Houghton J, Buddavarapu K, Sanford T, Choudhary A, Darden W, Adai A, Latham G, Bishop J, Sharma R, Westra WH, Hennessey P, Chung CH, Califano JA. Activation of the NOTCH pathway in head and neck cancer. Cancer Res. 2014; 74(4):1091-104.

Fillies T, Jogschies M, Kleinheinz J, Brandt B, Joos U, Buerger H. Cytokeratin alteration in oral leukoplakia and oral squamous cell carcinoma. Oncol Rep. 2007; 18(3):639-43.

Sesterhenn AM, Mandic R, Dünne AA, Werner JA. Cytokeratins 6 and 16 are frequently expressed in head and neck squamous cell carcinoma cell lines and fresh biopsies. Anticancer Res. 2005; 25(4):2675-80.

Cohen-Kerem R, Madah W, Sabo E, Rahat MA, Greenberg E, Elmalah I. Cytokeratin-17 as a potential marker for squamous cell carcinoma of the larynx. Ann Otol Rhinol Laryngol. 2004; 113(10):821-7.

Cavicchi O, Cavazzuti PP, Caliceti U. [Cytokeratin and vimentin expression in laryngeal squamous cell carcinoma]. Acta Otorhinolaryngol Ital. 1996; 16(5):420-7.

van der Velden LA, Schaafsma HE, Manni JJ, Ruiter DJ, Ramaekers FC, Kuijpers W. Cytokeratin and vimentin expression in normal epithelium and squamous cell carcinomas of the larynx. Eur Arch Otorhinolaryngol. 1997; 254(8):376-83.

Hirohashi S, Kanai Y. Cell adhesion system and human cancer morphogenesis. Cancer Sci. 2003; 94(7):575-81.

Smith A, Teknos TN, Pan Q. Epithelial to mesenchymal transition in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncol. 2013; 49(4): 287–292.

Nijkamp MM, Span PN, Hoogsteen IJ, Van der Kogel AJ, Kaanders JH, Bussink J. Expression of E-cadherin and vimentin correlates with metastasis formation in head and neck squamous cell carcinoma patients. Radiotherapy and Oncologyn. 2011; 99(3):344–348.

Li X, Yang Y, Hu Y, Dang D, Regezi J, Schmidt BL, et al. Alphavbeta6-Fyn signaling promotes oral cancer progression. J Biol Chem 2003; 278:41646-53.

Athanassiou-Papaefthymiou M, Shkeir O, Kim D, Divi V, Matossian M, Owen JH, Czerwinski MJ, Papagerakis P, McHugh J, Bradford CR, Carey TE, Wolf GT, Prince ME, Papagerakis S. Evaluation of CD44 variant expression in oral, head and neck squamous cell carcinomas using a triple approach and its clinical significance. Int J Immunopathol Pharmacol. 2014; 27(3):337-49.

Naor D, Sionov RV, Ish-Shalom D. CD44: structure, function, and association with the malignant process. Adv Cancer Res. 1997; 71:241-319.

Chai L, Liu H, Zhang Z, Wang F, Wang Q, Zhou S, Wang S. CD44 Expression Is Predictive of Poor Prognosis in Pharyngolaryngeal Cancer: Systematic Review and Meta-Analysis. Tohoku J. Exp. Med.2014; 232:9-19.

Cortesina G, MartoneT. Molecular metastases markers in head and neck squamous cell carcinoma: review of the literature. Acta Otorhinolaryngol Ital. 2006; 26(6): 317–325.

Thomas GR, Nadiminti H, Regalado J. Molecular predictors of clinical outcome in patients with head and neck squamous cell carcinoma. Int J Exp Pathol. 2005; 86(6):347–363.

Peschos D, Damala C, Stefanou D, Tsanou E, Assimakopoulos D, Vougiouklakis T, Charalabopoulos K, Agnantis NJ. Expression of matrix metalloproteinase-9 (gelatinase B) in benign, premalignant and malignant laryngeal lesions. Histol Histopathol. 2006; 21(6):603-8.

Vigneswaran N, Zhao W, Dassanayake A, Muller S, Miller DM, Zacharias W. Variable expression of cathepsin B and D correlates with highly invasive and metastatic phenotype of oral cancer. Hum Pathol. 2000; 31(8):931-7.

Maurizi M, Almadori G, Cadoni G, Scambia G, Ottaviani F, Ferrandina G, Paludetti G, D'Abramo G, Mancuso S. Cathepsin D concentration in primary laryngeal cancer: correlation with clinico-pathological parameters, EGFR status and prognosis. Int J Cancer. 1996; 69(2):105-9.

Martone T, Rosso P, Albera R, Migliaretti G, Fraire F, Pignataro L, Pruneri G, Bellone G, Cortesina G. Prognostic relevance of CD105+ microvessel density in HNSCC patient outcome. Oncol. 2005; 41(2):147-55.

Nico B, Benagiano V, Mangieri D, Maruotti N, Vacca A, Ribatti D. Evaluation of microvascular density in tumors: pro and contra. Histol Histopathol. 2008; 23(5):601-7.

Zvrko E, Mikic A, Vuckovic L. CD105 expression as a measure of microvessel density in supraglottic laryngeal squamous cell carcinoma. Eur Arch Otorhinolaryngol. 2009; 266(12):1971-6.

Zvrko E, Mikic A, Vuckovic L, Djukic V, Knezevic M. Prognostic relevance of CD105-assessed microvessel density in laryngeal carcinoma. Otolaryngol Head Neck Surg. 2009; 141(4):478-83.

O-charoenrat P, Rhys-Evans P, Eccles SA. Expression of vascular endothelial growth factor family members in head and neck squamous cell carcinoma correlates with lymph node metastasis. Cancer. 2001; 92(3):556-68.

Fagiani E, Christofori G. Angiopoietins in angiogenesis. Cancer Lett. 2013; 328(1):18-26.

Sun S, Pan X, Zhao L, Zhou J, Wang H, Sun Y. The Expression and Relationship of CD68-Tumor-Associated Macrophages and Microvascular Density With the Prognosis of Patients With Laryngeal Squamous Cell Carcinoma. Clin Exp Otorhinolaryngol. 2016; 9(3):270-7.

Pecherzewska R, Nawrot B. [FHIT–tumor suppressor protein involved in induction of apoptosis and cell cycle regulation]. Postepy Biochem. 2009; 55(1):66-75.

Pichiorri F, Palumbo T, Suh SS, Okamura H, Trapasso F, Ishii H, Huebner K, Croce CM. Fhit tumor suppressor: guardian of the preneoplastic genome. Future Oncol. 2008; 4(6):815-24.

Yang MH, Wu MZ, Chiou SH, Chen PM, Chang SY, Liu CJ, Teng SC, Wu KJ. Direct regulation of TWIST by HIF-1alpha promotes metastasis. Nat Cell Biol. 2008; 10(3):295-305.

Huang CH, Yang WH, Chang SY, Tai SK, Tzeng CH, Kao JY, Wu KJ, Yang MH. Regulation of membrane-type 4 matrix metalloproteinase by SLUG contributes to hypoxia-mediated metastasis. Neoplasia. 2009; 11(12):1371-82.

Psyrri A, Seiwert TY, Jimeno A. Molecular pathways in head and neck cancer: EGFR, PI3K, and more. Am Soc Clin Oncol Educ Book. 2013; 246-55.

Iglesias-Bartolome R, Martin D, Gutkind JS. Exploiting the head and neck cancer oncogenome: Widespread PI3K-mTOR pathway alterations and novel molecular targets. Cancer Discov. 2013; 3(7):722–725.

Sandulache VC, Myers JN. Altered metabolism in head and neck squamous cell carcinoma: an opportunity for identification of novel biomarkers and drug targets. Head Neck. 2012; 34(2): 10.1002/hed.21664.

Baer S, Casaubon L, Schwartz MR, Marcogliese A, Younes M. Glut3 expression in biopsy specimens of laryngeal carcinoma is associated with poor survival. Laryngoscope. 2002; 112(2):393-6.

Jaimanti, Panda NK, Sharma S, Gupta AK, Mann SB. Survival patterns in treated cases of carcinoma larynx in north india – a 10 years followup study. Indian J Otolaryngol Head Neck Surg. 2004; 56(2):99-104.

Layland MK, Sessions DG, Lenox J. The influence of lymph node metastasis in the treatment of squamous cell carcinoma of the oral cavity, oropharynx, larynx, and hypopharynx: N0 versus N+. Laryngoscope. 2005; 115(4):629-39.

Jakobsen J, Hansen O, Jørgensen KE, Bastholt L. Lymph node metastases from laryngeal and pharyngeal carcinomas–calculation of burden of metastasis and its impact on prognosis. Acta Oncol. 1998; 37(5):489-93.

Fayette J, Pointreau Y, Bourhis J, Lefebvre JL. [Squamous cell carcinoma of the hypopharynx and larynx: evidence-based care], Bull Cancer 2014; 101(5):438-44.

Debry C, Dupret-Bories A, Vrana NE, Hemar P, Lavalle P, Schultz P. Laryngeal replacement with an artificial larynx after total laryngectomy: The possibility of restoring larynx functionality in the future, Head Neck 2014; 36(11):1669-73.

Varshney S, Singh J, Saxena RK, Kaushal A, Pathak VP. Verrucous carcinoma of larynx. Indian J Otolaryngol Head Neck Surg. 2004; 56(1):54-6.

Dubal PM, Svider PF, Kam D, Dutta R, Baredes S, Eloy JA. Laryngeal Verrucous Carcinoma: A Population-Based Analysis. Otolaryngol Head Neck Surg. 2015; 153(5):799-805.

Ereño C, Gaafar A, Garmendia M, Etxezarraga C, Bilbao FJ, López JI. Basaloid Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck A Clinicopathological and Follow-Up Study of 40 Cases and Review of the Literature. Head Neck Pathol. 2008; 2(2): 83–91.

Soprani F, Armaroli V, Stefanelli A, Emiliani E, Padovani D, Casolino D. Basaloid squamous cell carcinoma of the larynx: report of a early laryngeal cancer. Acta Otorhinolaryngol Ital. 2011; 31(3):181–185.

Gallo O, Masini E, Bianchi B, Bruschini L, Paglierani M, Franchi A. Prognostic significance of cyclooxygenase-2 pathway and angiogenesis in head and neck squamous cell carcinoma. HumPathol. 2002; 33:708–714.

Gillison ML, Koch WM, Capone RB, Spafford M, Westra WH, Wu L, Zahurak ML, Daniel RW, Viglione M, Symer DE, Shah KV, Sidransky D. Evidence for a causal association between human papillomavirus and a subset of head and neck cancers. J Natl Cancer Inst. 2000; 92(9):709-20.

Fakhry C, Westra WH, Li S, Cmelak A, Ridge JA, Pinto H, Forastiere A, Gillison ML. Improved survival of patients with human papillomavirus-positive head and neck squamous cell carcinoma in a prospective clinical trial. J Natl Cancer Inst. 2008; 100(4):261-9.

Jiang H, Lin PF. Human papillomavirus infection a favorable prognostic factor in laryngeal squamous cell carcinoma is associated with the expression of proliferating cell nuclear antigen. Pak J Med Sci. 2013; 29(5): 1173–1177.

Denoix PF. Tumor, node and metastasis (TNM). Bull Inst Nat Hyg (Paris). 1944; 1:1-69.

International Union Against Cancer (UICC). TNM classification of malignant tumors. Geneva: G de Bureu; 1968.

Thomas SJ, Snowden JA, Zeidler MP, Danson SJ. The role of JAK/STAT signalling in the pathogenesis, prognosis and treatment of solid tumours. Br J Cancer. 2015; 113(3): 365–371.

Sasaki CT, Isaacson G. Functional anatomy of the larynx. Otolaryngol Clin North Am. 1988; 21(4):595-612.

Xu Y, Fisher GJ. Role of met axis in head and neck cancer. Cancers (Basel). 2013; 5(4):1601-18.

DeRienzo DP, Greenberg SD, Fraire AE. Carcinoma of the larynx. Changing incidence in women. Arch Otolaryngol Head Neck Surg; 117(6):681-4.

Cattaruzza MS, Maisonneuve P, Boyle P. Epidemiology of laryngeal cancer. Eur J Cancer B Oral Oncol. 1996; 32B(5):293-305.

Bobdey S, Jain A, Balasubramanium G. Epidemiological review of laryngeal cancer: An Indian perspective. Indian J Med Paediatr Oncol. 2015; 36(3):154–160.

Lipkin A, Miller RH, Woodson GE. Squamous cell carcinoma of the oral cavity, pharynx, and larynx in young adults. Laryngoscope. 1985; 95(7):790-3.

Verschuur HP, Irish JC, O'Sullivan B, Goh C, Gullane PJ, Pintilie M. A matched control study of treatment outcome in young patients with squamous cell carcinoma of the head and neck. Laryngoscope. 1999; 109(2):249-58.

Misono S, Marmor S, Yueh B, Virnig BA. Treatment and survival in 10,429 patients with localized laryngeal cancer: a population-based analysis. Cancer. 2014; 120(12):1810-7.

Maier H, Tisch M. Epidemiology of laryngeal cancer: results of the Heidelberg case-control study. Acta Otolaryngol Suppl. 1997; 527:160-4.

Tuyns AJ, Estève J, Raymond L, Berrino F, Benhamou E, Blanchet F, Boffetta P, Crosignani P, del Moral A, Lehmann W. Cancer of the larynx/hypopharynx, tobacco and alcohol: IARC international case-control study in Turin and Varese (Italy), Zaragoza and Navarra (Spain), Geneva (Switzerland) and Calvados (France). Int J Cancer. 1988; 41(4):483-91.

Ramroth H, Dietz A, Becher H. Interaction effects and population-attributable risks for smoking and alcohol on laryngeal cancer and its subsites. A case-control study from Germany. Methods Inf Med. 2004; 43(5):499-504.

Muscat JE, Wynder EL. Tobacco, alcohol, asbestos, and occupational risk factors for laryngeal cancer. Cancer. 1992; 69(9):2244-51.

Wang MC, Liu CY, Li WY, Chang SY, Chu PY. Salivary gland carcinoma of the larynx. J Chin Med Assoc. 2006; 69(7):322-5.

Saito T, Nakajima T, Mogi K. Immunohistochemical analysis of cell cycle-associated proteins p16, pRb, p53, p27 and Ki-67 in oral cancer and precancer with special reference to verrucous carcinomas. J Oral Pathol Med. 1999; 28(5):226-32.

Soriano E, Faure C, Lantuejoul S, Reyt E, Bolla M, Brambilla E, Righini CA. Course and prognosis of basaloid squamous cell carcinoma of the head and neck: a case-control study of 62 patients. Eur J Cancer. 2008; 44(2):244-50.

Thompson LD, Wenig BM, Heffner DK, Gnepp DR. Exophytic and papillary squamous cell carcinomas of the larynx: A clinicopathologic series of 104 cases. Otolaryngol Head Neck Surg. 1999; 120(5):718-24.

Suarez PA, Adler-Storthz K, Luna MA, El-Naggar AK, Abdul-Karim FW, Batsakis JG. Papillary squamous cell carcinomas of the upper aerodigestive tract: a clinicopathologic and molecular study. Head Neck. 2000; 22(4):360-8.

Ishiyama A, Eversole LR, Ross DA, Raz Y, Kerner MM, Fu YS, Blackwell KE, Feneberg R, Bell TS, Calcaterra TC. Papillary squamous neoplasms of the head and neck. Laryngoscope. 1994; 104(12):1446-52.

Jo VY, Mills SE, Stoler MH, Stelow EB. Papillary squamous cell carcinoma of the head and neck: frequent association with human papillomavirus infection and invasive carcinoma. Am J Surg Pathol. 2009; 33(11):1720-4.

Geelen CP, Hordijk GJ, Ravasz LA, Terhaard CH. Degree of tumour differentiation as a prognostic factor in advanced laryngeal cancer. Acta Otorhinolaryngol Belg. 1995; 49(1):1-4.

De Stefani E, Boffetta P, Deneo-Pellegrini H, Brennan P, Correa P, Oreggia F, Ronco AL, Mendilaharsu M. Supraglottic and glottic carcinomas: epidemiologically distinct entities?. Int J Cancer. 2004; 112(6):1065-71.

Dworacki G, Kruk-Zagajewska A, Jezewska E, Sikora J, Zeromski J. Tumor infiltrating lymphocytes in HLA+ and HLA- laryngeal cancer–quantitative approach. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 1999; 47(3):161-8.

Bhardwaj N. Harnessing the immune system to treat cancer. J Clin Invest. 2007; 117(5):1130-6.

Gooden MJ, de Bock GH, Leffers N, Daemen T, Nijman HW. The prognostic influence of tumour-infiltrating lymphocytes in cancer: a systematic review with meta-analysis. Br J Cancer. 2011; 105(1):93-103.

Hoșal AS, Unal OF, Ayhan A. Possible prognostic value of histopathologic parameters in patients with carcinoma of the oral tongue. Eur Arch Otorhinolaryngol 1998; 255(4):216-9.

Badoual C, Hans S, Merillon N, Van Ryswick C, Ravel P, Benhamouda N, Levionnois E, Nizard M, Si-Mohamed A, Besnier N, Gey A, Rotem-Yehudar R, Pere H, Tran T, Guerin CL, Chauvat A, Dransart E, Alanio C, Albert S, Barry B, Sandoval F, Quintin-Colonna F, Bruneval P, Fridman WH, Lemoine FM, Oudard S, Johannes L, Olive D, Brasnu D, Tartour E. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Res. 2013; 73(1):128-38.

Batsakis JG. Invasion of the microcirculation in head and neck cancer. Ann Otol Rhinol Laryngol. 1984; 93(6 Pt 1):646-7.

Fagan JJ, Collins B, Barnes L, D'Amico F, Myers EN, Johnson JT. Perineural invasion in squamous cell carcinoma of the head and neck. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 1998; 124(6):637-40.

Adel M, Kao HK, Hsu CL, Huang JJ, Lee LY, Huang Y, Browne T, Tsang NM, Chang YL, Chang KP. Evaluation of Lymphatic and Vascular Invasion in Relation to Clinicopathological Factors and Treatment Outcome in Oral Cavity Squamous Cell Carcinoma. Medicine (Baltimore). 2015; 94(43):e1510.

Markou K, Goudakos J, Triaridis S, Konstantinidis J, Vital V, Nikolaou A. The role of tumor size and patient's age as prognostic factors in laryngeal cancer. Hippokratia. 2011; 15(1):75-80.

Zhao H, Ren J, Zhuo X, Ye H, Zou J, Liu S. Prognostic significance of Survivin and CD44v6 in laryngeal cancer surgical margins. J Cancer Res Clin Oncol. 2008; 134(10):1051-8.

Karatzanis AD, Psychogios G, Waldfahrer F, Kapsreiter M, Zenk J, Velegrakis GA, Iro H. Management of locally advanced laryngeal cancer. J Otolaryngol Head Neck Surg. 2014; 43:4.

Shah JP, Karnell LH, Hoffman HT, Ariyan S, Brown GS, Fee WE, Glass AG, Goepfert H, Ossoff RH, Fremgen A. Patterns of care for cancer of the larynx in the United States. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 1997; 123(5):475-83.

Giotakis AI, Kontos CK, Manolopoulos LD, Sismanis A, Konstadoulakis MM, Scorilas A. High BAX/BCL2 mRNA ratio predicts favorable prognosis in laryngeal squamous cell carcinoma, particularly in patients with negative lymph nodes at the time of diagnosis. Clin Biochem. 2016; 49(12):890-6.

Choi M, Refaat T, Lester MS, Bacchus I, Rademaker AW, Mittal BB. Development of a standardized method for contouring the larynx and its substructures. Radiat Oncol. 2014; 9:285.

Pávai Z, Horváth E, Jung J. Imunohistochimie. Baze teoretice. Aplicatii practice. University Press, Targu Mures, 2004, 115-116.

Bethune G, Bethune D, Ridgway N, Xu Z. Epidermal growth factor receptor (EGFR) in lung cancer: an overview and update. J Thorac Dis. 2010; 2(1): 48–51.

Abdelrahman AE, Rashed HE, Abdelgawad M, Abdelhamid MI. Prognostic impact of EGFR and cytokeratin 5/6 immunohistochemical expression in triple-negative breast cancer. Ann Diagn Pathol. 2017; 28:43-53.

Zimmermann M, Zouhair A, David Azria D, Mahmut Ozsahincorresponding M. The epidermal growth factor receptor (EGFR) in head and neck cancer: its role and treatment implications. Radiat Oncol. 2006; 1: 11.

Albanell J, Codony-Servat J, Rojo F, Del Campo JM, Sauleda S, Anido J, Raspall G, Giralt J, Roselló J, Nicholson RI, Mendelsohn J, Baselga J. Activated extracellular signal-regulated kinases: association with epidermal growth factor receptor/transforming growth factor alpha expression in head and neck squamous carcinoma and inhibition by anti-epidermal growth factor receptor treatments. Cancer Res. 2001; 61(17):6500-10.

Lee CS, Redshaw A, Boag G. Epidermal growth factor receptor immunoreactivity in human laryngeal squamous cell carcinoma. Pathology. 1997; 29(3):251-4.

Șimșek H, Han Ü, Önal B, Șimișek G. The expression of EGFR, cerbB2, p16, and p53 and their relationship with conventional parameters in squamous cell carcinoma of the larynx. Turk J Med Sci. 2014; 44(3):411-6.

Wei Q, Sheng L, Shui Y, Hu Q, Nordgren H, Carlsson J. EGFR, HER2, and HER3 expression in laryngeal primary tumors and corresponding metastases. Ann Surg Oncol. 2008; 15(4):1193-201.

Almadori G, Cadoni G, Galli J, Ferrandina G, Scambia G, Exarchakos G, Paludetti G, Ottaviani F. Epidermal growth factor receptor expression in primary laryngeal cancer: an independent prognostic factor of neck node relapse. Int J Cancer. 1999; 84(2):188-91.

Rubin Grandis J, Melhem MF, Gooding WE, Day R, Holst VA, Wagener MM, Drenning SD, Tweardy DJ. Levels of TGF-alpha and EGFR protein in head and neck squamous cell carcinoma and patient survival. J Natl Cancer Inst. 1998; 90(11):824-32.

Pastuszewski W, Dziegiel P, Krecicki T, Podhorska-Okolow M, Ciesielska U, Gorzynska E, Zabel M. Prognostic significance of metallothionein, p53 protein and Ki-67 antigen expression in laryngeal cancer. Anticancer Res. 2007; 27(1A):335-42.

Bai Y, Hong S, Peng Z. [Expression and significance of proliferation marker and apoptosis-related genes in benign and malignant epithelial lesions of the larynx]. Lin Chuang Er Bi Yan Hou Ke Za Zhi. 2003; 17(2):92-3, 96.

Golusiński W, Olofsson J, Szmeja Z, Majewski P. p53, PCNA and Ki67 in laryngeal cancer. Pol J Pathol. 1996; 47(4):175-82.

Gioacchini FM, Alicandri-Ciufelli M, Magliulo G, Rubini C, Presutti L, Re M. The clinical relevance of Ki-67 expression in laryngeal squamous cell carcinoma. Eur Arch Otorhinolaryngol. 2015; 272(7):1569-76.

Saarilahti K, Kajanti M, Kouri M, Aaltonen LM, Franssila K, Joensuu H. Cyclin A and Ki-67 expression as predictors for locoregional recurrence and outcome in laryngeal cancer patients treated with surgery and postoperative radiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2003; 57(4):986-95.

Franchi A, Gallo O, Boddi V, Santucci M. Prediction of occult neck metastases in laryngeal carcinoma: role of proliferating cell nuclear antigen, MIB-1, and E-cadherin immunohistochemical determination. Clin Cancer Res. 1996; 2(10):1801-8.

Sun D, Wang Y, Liu H, Kong W, Liu B. [Prognostic value of Ki67 and VEGF in squamous cell carcinoma of larynx]. Lin Chuang Er Bi Yan Hou Ke Za Zhi. 2006; 20(6):246-8.

Sarkar FH, Li Y. Markers of apoptosis. Methods Mol Med. 2006; 120:147-60.

Holdenrieder S, Stieber P. Apoptotic markers in cancer. Clin Biochem. 2004; 37(7):605-17.

Șimșek G, Han Ü, Önal B, Köybașioğlu FF, Akin I, Dağli M. Expression of cyclin D1, p27, p21, bcl-2, and p53 in laryngeal squamous cell carcinoma and an investigation of the correlation with conventional prognostic factors. Turk J Med Sci 2013; 43: 27-32

Shin DM, Lee JS, Lippman SM, Lee JJ, Tu ZN, Choi G, Heyne K, Shin HJ, Ro JY, Goepfert H, Hong WK, Hittelman WN. p53 expressions: predicting recurrence and second primary tumors in head and neck squamous cell carcinoma. J Natl Cancer Inst. 1996; 88(8):519-29.

Ashraf MJ, Maghbul M, Azarpira N, Khademi B. Expression of Ki67 and P53 in primary squamous cell carcinoma of the larynx. Indian J Pathol Microbiol. 2010; 53(4):661-5.

Pruneri G, Pignataro L, Carboni N, Ronchetti D, Cesana BM, Ottaviani A, Neri A, Buffa R. 173. Clinical relevance of p53 and bcl-2 protein over-expression in laryngeal squamous-cell carcinoma. Int. J. Cancer 1998; 79: 263–268.

Jäckel MC, Sellmann L, Dorudian MA, Youssef S, Füzesi L. Prognostic significance of p53/bcl-2 co-expression in patients with laryngeal squamous cell carcinoma. Laryngoscope. 2000; 110(8):1339-45.

Xie X, Clausen OP, De Angelis P, Boysen M. The prognostic value of spontaneous apoptosis, Bax, Bcl-2, and p53 in oral squamous cell carcinoma of the tongue. Cancer. 1999; 86(6):913-20.

Nix P, Cawkwell L, Patmore H, Greenman J, Stafford N. Bcl-2 expression predicts radiotherapy failure in laryngeal cancer. Br J Cancer. 2005; 92(12):2185-9.

Gallo O, Boddi V, Calzolari A, Simonetti L, Trovati M, Bianchi S. bcl-2 protein expression correlates with recurrence and survival in early stage head and neck cancer treated by radiotherapy. Clin Cancer Res. 1996; 2(2):261-7.

Kümper S, Ridley AJ. p120ctn and P-cadherin but not E-cadherin regulate cell motility and invasion of DU145 prostate cancer cells. PLoS One. 2010; 5(7):e11801.

Mittari E, Charalabopoulos A, Batistatou A, Charalabopoulos K. The role of E-cadherin/catenin complex in laryngeal cancer. Exp Oncol. 2005; 27(4):257-61.

Lopez-Gonzalez JS, Cristerna-Sanchez L, Vazquez-Manriquez ME, Jimenez-Orci G, Aguilar-Cazares D. Localization and level of expression of beta-catenin in human laryngeal squamous cell carcinoma. Otolaryngol Head Neck Surg. 2004; 130(1):89-93.

Schipper JH, Unger A, Jahnke K. E-cadherin as a functional marker of the differentiation and invasiveness of squamous cell carcinoma of the head and neck. Clin Otolaryngol Allied Sci. 1994; 19(5):381-4.

Kowalski PJ, Rubin MA, Kleer CG. E-cadherin expression in primary carcinomas of the breast and its distant metastases. Breast Cancer Res. 2003; 5(6):R217-22.

Fan L, Wang H, Xia X, Rao Y, Ma X, Ma D, Wu P,Chen G. Loss of E-cadherin promotes prostate cancer metastasis via upregulation of metastasis-associated gene 1 expression. Oncol Lett. 2012; 4(6): 1225–1233.

Vieira AF, Paredescorresponding J. P-cadherin and the journey to cancer metastasis. Mol Cancer. 2015; 14: 178.

Mandeville JA, Silva Neto B, Vanni AJ, Smith GL, Rieger-Christ KM, Zeheb R, Loda M, Libertino JA, Summerhayes IC. P-cadherin as a prognostic indicator and a modulator of migratory behaviour in bladder carcinoma cells. BJU Int. 2008; 102(11):1707-14.

Muñoz-Guerra MF, Marazuela EG, Fernández-Contreras ME, Gamallo C. P-cadherin expression reduced in squamous cell carcinoma of the oral cavity: an indicatior of poor prognosis. Cancer. 2005; 103(5):960-9.

Paredes J, Correia AL, Ribeiro AS, Albergaria A, Milanezi F, Schmitt FC. P-cadherin expression in breast cancer: a review. Breast Cancer Res. 2007; 9(5):214.

Ribeiro AS, Albergaria A, Sousa B, Correia AL, Bracke M, Seruca R, Schmitt FC, Paredes J. Extracellular cleavage and shedding of P-cadherin: a mechanism underlying the invasive behaviour of breast cancer cells. Oncogene. 2010; 29(3):392-402.

Gravdal K, Halvorsen OJ, Haukaas SA, Akslen LA. A switch from E-cadherin to N-cadherin expression indicates epithelial to mesenchymal transition and is of strong and independent importance for the progress of prostate cancer. Clin Cancer Res. 2007; 13(23):7003-11.

Lysne D, Johns J, Walker A, Ecker R, Fowler C, Lawson KR. P-cadherin potentiates ligand-dependent EGFR and IGF-1R signaling in dysplastic and malignant oral keratinocytes. Oncol Rep. 2014; 32(6):2541-8.

Padhi S, Saha A, Kar M, Ghosh C, Adhya A, Baisakh M, Mohapatra N, Venkatesan S, Hande MP, Banerjee B. Clinico-Pathological Correlation of β-Catenin and Telomere Dysfunction in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Patients., J Cancer. 2015; 6(2):192-202.

Galera-Ruiz H, Ríos-Moreno MJ, González-Cámpora R, Ortega I, Fernández A, García-Escudero A, Galera-Davidson H. The cadherin–catenin complex in laryngeal squamous cell carcinoma. Eur Arch Otorhinolaryngol. 2012; 269(4): 1183–1188.

Tsai YP, Yang MH, Huang CH, Chang SY, Chen PM, Liu CJ, Teng SC, Wu KJ. Interaction between HSP60 and beta-catenin promotes metastasis. Carcinogenesis, 2009, 30(6):1049–1057.

Goto M, Mitra RS, Liu M, Lee J, Henson BS, Carey T, Bradford C, Prince M, Wang CY, Fearon ER, D'Silva NJ. Rap1 stabilizes beta-catenin and enhances beta-catenin-dependent transcription and invasion in squamous cell carcinoma of the head and neck.Clin Cancer Res, 2010, 16(1):65–76.

Si WF, Sun W, Liu H, Liu J, Sun Y, Chen Z. [Expression and clinical significance of E-cadherin and beta-catenin proteins in human laryngeal cancer]. Lin Chung Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi. 2008; 22(10):459-61.

Sherr CJ. D-type cyclins. Trends Biochem Sci. 1995; 20(5):187-90.

Peters G. The D-type cyclins and their role in tumorigenesis. J Cell Sci Suppl. 1994; 18:89-96.

Jovanovic IP, Radosavljevic GD, Simovic-Markovic BJ, Stojanovic SP, Stefanovic SM, Pejnovic NN, Arsenijevic NN. Clinical significance of Cyclin D1, FGF3 and p21 protein expression in laryngeal squamous cell carcinoma. J BUON. 2014; 19(4):944-52.

Pignataro L, Sambataro G, Pagani D, Pruneri G. Clinico-prognostic value of D-type cyclins and p27 in laryngeal cancer patients: a review. Acta Otorhinolaryngol Ital. 2005; 25(2):75-85.

Vega S, Morales AV, Ocaña OH, Valdés F, Fabregat I, Nieto MA. Snail blocks the cell cycle and confers resistance to cell death. Genes Dev, 2004, 18(10):1131–1143.

Jouppila-Mättö A, Närkiö-Mäkelä M, Soini Y, Pukkila M, Sironen R, Tuhkanen H, Mannermaa A, Kosma VM. Twist and snai1 expression in pharyngeal squamous cell carcinoma stroma is related to cancer progression. BMC Cancer, 2011, 11:350.

Yang MH, Chen CL, Chau GY, Chiou SH, Su CW, Chou TY, Peng WL, Wu JC. Comprehensive analysis of the independent effect of twist and snail in promoting metastasis of hepatocellular carcinoma. Hepatology, 2009, 50(5):1464–1474.

Ota I, Li XY, Hu Y, Weiss SJ. Induction of a MT1-MMP and MT2-MMP-dependent basement membrane transmigration program in cancer cells by Snail1. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009; 106(48):20318-23.

Ota I, Masui T, Kurihara M, Yook JI, Mikami S, Kimura T, Shimada K, Konishi N, Yane K, Yamanaka T, Kitahara T. Snail-induced EMT promotes cancer stem cell-like properties in head and neck cancer cells, Oncol Rep. 2016; 35(1):261-6.

Masui T, Ota I, Yook JI, Mikami S, Yane K, Yamanaka T, Hosoi H. Snail-induced epithelial-mesenchymal transition promotes cancer stem cell-like phenotype in head and neck cancer cells. Int J Oncol. 2014; 44(3):693-9.

Häyry V, Mäkinen LK, Atula T, Sariola H, Mäkitie A, Leivo I, Keski-Säntti H, Lundin J, Haglund C, Hagström J. Bmi-1 expression predicts prognosis in squamous cell carcinoma of the tongue., Br J Cancer. 2010; 102(5):892-7.

Mendelsohn AH, Lai CK, Shintaku IP, Fishbein MC, Brugman K, Elashoff DA, Abemayor E, Dubinett SM, St John MA. Snail as a novel marker for regional metastasis in head and neck squamous cell carcinoma. Am J Otolaryngol.2012; 33(1):6-13.

Becker KF, Rosivatz E, Blechschmidt K, Kremmer E, Sarbia M, Höfler H. Analysis of the E-cadherin repressor Snail in primary human cancers. Cells Tissues Organs. 2007; 185(1-3):204-12.

Batlle E, Sancho E, Francí C, Domínguez D, Monfar M, Baulida J, García De Herreros A. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nat Cell Biol. 2000; 2(2):84-9.

Jones AS, Fish B, Fenton JE, Husband DJ. The treatment of early laryngeal cancers (T1-T2 N0): surgery or irradiation?. Head Neck. 2004; 26(2):127-35.

Sheahan P. Management of Advanced Laryngeal Cancer. Rambam Maimonides Med J. 2014; 5(2): e0015.

Megwalu UC, Sikora AG. Survival outcomes in advanced laryngeal cancer. JAMA Otolaryngol Head Neck Surg. 2014; 140(9):855-60.

Copyright Notice

© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.

Acest articol: STUDIUL FACTORILOR DE PROGNOSTIC ÎN CARCINOAMELE SCUAMOASE LARINGIENE CONDUCĂTOR DE DOCTORAT: PROF. UNIV. DR. SIMIONESCU CRISTIANA EUGENIA STUDENT -… [303728] (ID: 303728)

Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.

STUDIUL FACTORILOR DE PROGNOSTIC ÎN CARCINOAMELE SCUAMOASE LARINGIENE CONDUCĂTOR DE DOCTORAT: PROF. UNIV. DR. SIMIONESCU CRISTIANA EUGENIA STUDENT -… [303728]

Copyright Notice

Rezumat Visoianu (popescu) [623989]

Doresc să mulțumesc membrilor comisiei: prof. dr. ing. xxx, prof. dr. ing. xxxx și conf. dr. ing. xxx pentru evaluarea lucrării și pentru recenziile… [303767]

Cercetări teoretice și experimentale asupra curgerii fluidelor polifazate prin stația de epurare în scopul optimizării energetice Theoretical and… [611917]

Doinadrag2004@gmail.com 299 Doctorand Psihologie Text

FORMAREA ȘI DEZVOLTAREA PROFESIONALĂ A PERSONALULUI DIN SERVICIILE DE PROTECȚIA COPILULUI, CU FOCALIZARE PE CENTRE DE ZI ȘI CREȘE Coordonator… [311648]

Transpunerea directivelor Un iunii Europene în ordinea juridică internă a statelor membre REZUMAT Conducător științific: Prof. univ. dr. Augustin… [601686]

Copyright Notice

Similar Posts