“Studiul expresiei proteinei precursoare a amiloidului în creierul șoarecilor knockout la caveolina-1” Coordonator științific, Profesor Dr. Mihail E…. [305005]

Universitatea de Medicină și Farmacie “Carol Davila” București

Facultatea de Medicină

LUCRARE DE LICENȚĂ

“Studiul expresiei proteinei precursoare a amiloidului în creierul șoarecilor knockout la caveolina-1”

[anonimizat]. Mihail E. [anonimizat]. Ana-Maria Enciu

Absolvent: [anonimizat]

2017

CUPRINS

INTRODUCERE 5

CAPITOLUL I 6

[anonimizat] 6

1.1. Date generale despre boala Alzheimer 6

1.2. Diagnosticul de boală Alzheimer 7

1.3. Patogeneza bolii Alzheimer 8

1.3.1. Teoria colinergică 8

1.3.2. Teoria proteinei tau 9

1.3.3. Teoria cascadei amiloidului 9

i) Argumente genetice 10

ii) Argumente prin terapia bazată pe cascada amiloidului 11

1.4. Rolul peptidului Aβ în neurodegenerare 11

CAPITOLUL II 14

Proteina precursoare a amiloidului în neurodegenerare 14

2.1. Familia APP 14

2.2. Structura proteinei precursoare a amiloidului 15

2.3. Ciclul celular al proteinei precursoare a amiloidului 16

2.3.1. Fosforilarea 16

2.3.2. Căile de metabolizare a APP 17

i) α-SECRETAZA 18

ii) β-SECRETAZA 18

iii) γ-SECRETAZA 19

2.4. Relația dintre APP și microdomeniile membranare 20

2.5. Funcțiile APP 21

2.5.1. Adeziunea celulară 21

2.5.2. Supraviețuirea neuronală și plasticitatea sinaptică 23

2.5.3. Semnalizare celulară și receptor de suprafață 24

2.6. Modele animale transgenice pentru gena APP 24

CAPITOLUL III 25

Caveolinele în biologia sistemului nervos central 25

3.1. Introducere în biologia caveolelor 25

3.2. Structura caveolelor 26

3.3. Rolurile caveolelor 29

3.3.1. Caveolele și transportul celular 29

3.3.2. Caveolele și homeostazia colesterolului 29

3.3.3. Semnalizarea celulară și caveolele 30

3.3.4. Alte funcții ale caveolelor 31

3.4. Caveolina-1 la nivel cerebral 32

3.4.1. Rolul caveolinei-1 în neurogeneză 32

3.4.2. Rolul caveolinei-1 în îmbătrânirea neuronală 32

3.5. Corelații între caveolina-1 și boala Alzheimer 34

3.6. Interacțiunea dintre APP și caveolina-1 34

CAPITOLUL IV 36

4.1. Premise și ipoteze de lucru 36

4.2. Obiective 37

4.3. Materiale și metode 37

4.3.1. Animale de laborator 37

4.3.2. Lizatul de proteine 38

4.3.3. Determinarea concentrației de proteine 38

4.3.4. Western Blot (WB) 39

4.3.5. Electroforeză nativă (EN) 40

4.3.6. Densitometria optică și analiza statistică 41

4.3.7. Extracție de ARNmesager 41

4.3.8. Dozarea ARN 42

4.3.9. Reverse Transcriptase Polimerase Chain Reaction (RT-PCR) 42

4.3.10. Q-RT PCR (semicantitativ) 43

4.4. Rezultate 44

4.4.1 Analiza nivelului caveolinei-1 și a proteinei precursoare a amiloidului în creierul șoarecilor C57Bl/6J 44

4.4.2 Analiza modificărilor de nivel al proteinei precursoare a amiloidului în creierul șoarecilor transgenici Cav1tm1Mls/J, comparativ cu tulpina C57Bl/6 46

4.4.3 Analiza modificărilor cantitative ale proteinei precursoare a amiloidului, [anonimizat]1tm1Mls/J și tulpina control 47

4.4.4. Testarea asocierii dintre caveolina-1 și APP prin electroforeză nativă 49

4.4.5.Testarea fosforilării proteinei precursoare a amiloidului la șoarecii control C57Bl/6J versus șoarecii transgenici Cav1tm1Mls/J 49

4.4.6. Evaluarea expresiei genice a proteinei precursoare a amiloidului prin PCR cantitativ 51

4.5. Discuții 54

Concluzii și direcții viitoare 61

ANEXE 63

Anexa 1. Articole publicate 63

Anexa 2. Participări la congrese cu prezentări orale și premii obținute 75

Anexa 3. Lista figurilor 76

Anexa 4. Lista tabelelor 77

Anexa 5. Lista abrevierilor 78

BIBLIOGRAFIE 79

INTRODUCERE

Lucrarea de licență cu titlul “Studiul expresiei proteinei precursoare a amiloidului în creierul șoarecilor knockout la caveolina-1” propune evaluarea expresiei proteinei precursoare a amiloidului, implicată în patologia bolii Alzheimer, într-un model non-mutațional de neurodegenerare – șoarece de laborator knockout pentru gena caveolinei-1.

Prima parte a lucrării prezintă noțiuni generale despre boala Alzheimer, verigi implicate în patogeneză și prezentarea detaliată a proteinei precursoare a amiloidului (ciclu celular, clivaj enzimatic, activare prin fosforilare). Pentru a explica relația dintre neurodegenerare și caveolina-1, ultimul capitol al părții generale este dedicat caveolelor și rolului lor biologic, accentul fiind pus pe neurobiologie.

Partea specială a fost efectuată în Institutul Național de Patologie “Victor Babeș” din București, în cadrul unui proiect PNII Resurse Umane. Folosind tehnici de biologie celulară și moleculară (electroforeză de proteine, western blot, reacție de polimerizare în lanț în timp real), am demonstrat că în creierul șoarecilor knockout pentru caveolina-1 scade nivelul proteinei precursoare a amiloidului, iar scăderea nivelului proteic variază cu regiunea analizată. În final, am investigat modificările fosforilării proteinei precursoare a amiloidului induse de lipsa caveolinei-1.

Activitatea de cercetare desfășurată s-a concretizat în publicarea a 2 articole (1 articol ISI, 1 articol indexat în baze de date internaționale) și participarea în cadrul a 3 congrese cu prezentări orale (2 congrese naționale, 1 congres studentesc internațional), în urma cărora am obținut două premii întâi ( unul național, unul internațional).

CAPITOLUL I

Demența Alzheimer – model de boală neurodegenerativă

Boala Alzheimer descrisă pentru prima dată în 1907 de medicul german Alois Alzheimer, este cea mai comună formă de demență neurodegenerativă, ireversibilă și progresivă, ce afectează arii întinse din cortexul cerebral. Acest tip de demență este asociat cu acumularea unei proteine insolubile numită β-amiloid (Aβ) sub formă de plăci extracelular și în pereții vaselor cerebrale împreună cu agregate intraneuronale formate din proteine tau hiperfosforilate.

1.1. Date generale despre boala Alzheimer

Prevalența bolii Alzheimer este de 10-30% în populația peste 65 ani cu o incidență de 1-3%50 în populația generală. În ceea ce privește distribuția pe sexe, există o mai mare prevalența în rândul femeilor, însă pacienții de sex masculin au o speranța de viață mai scăzută, ajungând să decedeze din alte cauze înainte ca demența să se manifeste clinic. În România se consideră că există peste 270.000 de pacienți cu demență Alzheimer, dintre care mai mult de jumătate sunt pacienți de sex feminin.

Au fost identificate două forme ale acestei boli: boală Alzheimer familială (1-5%) și boală Alzheimer sporadică (>95%). Modificările genetice care duc la apariția BA familiale sunt mutații autozomal dominante la nivelul genei APP (Goate și colab., 1991), genei pentru PS1 și PS2 (Campion și colab., 1995; Sherrington și colab., 1996), care duc la procesarea deficitară a proteinei precursoare a amiloidului. Forma sporadică se consideră a fi cumulul unor factori genetici dar și din mediul înconjurător (Huang & Mucke, 2012). În funcție de vârsta de debut poate fi clasificată în două forme: cu debut rapid (<60 ani) sau cu debut tardiv (>60 ani), fiind consecința incapacității de eliminare de la nivelul creierului a peptidului Aβ.

1.2. Diagnosticul de boală Alzheimer

Datorită polimorfismului simptomelor din demență, atribuirea bolii Alzheimer unui pacient pe considerente strict clinice este dificilă și poate să îi excludă pe cei cu modificări cognitive ușoare (figura 1.1.). Diagnosticul de boală Alzheimer se poate pune cu acuratețe folosind tehnici de imagistică PET moleculară pentru Aβ dar și prin nivelul peptidului în lichidul cefalorahiadian după puncția lombară58. Utilizând aceste metode a fost demonstrat faptul că depozitele se acumulează cu mult înaintea apariției simptomelor și a atrofiei cerebrale, factorii genetici având un rol modulator.

Figura 1.1.-Progresia leziunilor neuronale și gliale în cadrul bolii Alzheimer (BA)

a. Interacțiunea între neuroni și celulele gliale în creierul sănătos; b. Stadiul prodromal caracterizat de formarea fibrilelor de β-amiloid depozitate extracelular, contribuind la disfuncția precoce a circuitelor neuronale și declansarea neuroinflamației cu absența manifestărilor clinice; c. În stadiile manifeste de boală, există atât plăci de amiloid acumulate datorită unui clereance deficitar, proteine tau hiperfosforilate intraneuronal cât și proliferare a celulelor gliale datorită inflamației însă cu scăderea capacității de autofagie; acestea alterează semnificativ circuitele cerebrale scăzând tonusul inhibitor cu hiperexcitabilitatea neuronilor excitatori (adaptat după Li-Huei Tsai și colab., Nature, 2016)

Puncția lombară este o metodă de diagnostic des folosită în practica curentă neurologică. În cazul bolii Alzheimer cel mai adesea sunt identificați în LCR Aβ-42, proteina tau sau proteina tau fosforilata (P-tau) la Thr-181. Nivelul în LCR de Aβ-42 reflectă depozitele de amiloid din creier; nivelul de proteină tau este crescut și în alte boli neurodegenerative având legătură cu intensitatea procesului de degenerare axonală și neuronală; nivelul LCR de P-tau se corelează cu rata de atrofie a hipocampului și progresia clinică rapidă. Dorința de a face cât mai ușor și facil diagnosticul maladiei Alzheimer a dus la apariția mai multor biomarkeri din plasmă și mai ales din LCR. Creșterea expresiei BACE-1 și a activității sale enzimatice a fost pusă în evidență în creierul prelevat postmortem de la pacienții diagnosticați cu Alzheimer54-58. Forma solubilă a APP este secretată în spațiul extracelular și apoi în LCR (sAPPα ori sAPPβ), însă nivelul acestora rămâne nemodificat pe parcusul evoluției bolii. Prezența oligomeriilor Aβ în LCR este greu de pus în evidență și de monitorizat prin comparație cu isoformele β-amiloidului, fiind în studiu la momentul actual inclusiv utilizarea de autoanticorpi pentru diagnostic, însă din cauza variabilității valorilor, nu au relevanță clinică momentan.

1.3. Patogeneza bolii Alzheimer

Pentru a explica patogeneza acestei boli neurodegenerative au fost formulate mai multe ipoteze: i) Ipoteza colinergică; ii) Ipoteza proteinei tau; iii) Ipoteza cascadei amiloidului.

1.3.1. Teoria colinergică

Este cea mai veche ipoteză, plecând de la observarea unui nivel scăzut de colin-acetil-transferaza și acetil-colin-esteraza în cortexul cerebral (Davies & Maloney, 1975). Studii in vitro au arătat că peptidul Aβ inhibă neurotransmițătorii colinergici (Karl & Auld, 1998). Pentru a îmbunătății transmiterea nervoasă, au fost utilizați agenți terapeutici ce acționează ca stimul pre- și postsinaptic colinergic (Hebert și colab., 2003), fiind aprobați pentru tratamentul BA ușoare și medii patru inhibitori de colinesterază: tacrine, donezepil, rivastigmina și galantamina. Administrarea pe o perioada lungă de timp la pacienții cu afectare cognitivă ușoară (Mild Cognitive Impairment) nu a dus la reducerea riscului de apariție sau întârziere a debutului bolii. Reacțiile adverse precum tulburări gastrointestinale, cardiovasculare, neuromusculare fac dificilă administrarea lor în BA (Raschetti și colab., 2007).

Neurotrofinele au un rol important în reglarea funcțiilor neuronale, modificările acestora duc la scăderea transmiterii colinergice (Schindowski și colab., 2008) mai ales în neocortex și hipocamp în cadrul BA (Murrer și colab., 2001). Familia de proteine include factorul de creștere neuronală (NGF – nerve growth factor), factorul neurotrofic cerebral (BDNF – brain-derived neurotrophic factor), neurotrofina-3 (NT-3), neurotrofina-4=5 (NT-4=5) și neurotrofina-6 (NT-6). Utilizarea neurotrofinelor în tratamentul bolii Alzheimer reușește să readucă la normal funcțiile neuronale. Deoarece nu traversează barieră hematoencefalica, au fost injectate intracerebral fibroblaste modificate genetic care au capacittea de a secretă NGF, astfel are loc îmbunătățirea memoriei și scăderea turnoverul colinergic (Tuszyncki și colab., 2005).

1.3.2. Teoria proteinei tau

Din punct de vedere anatomopatologic, putem diagnostica boala Alzheimer prin prezența intraneuronala a unor neurofibrile alcătuite dintr-o rețea de proteine tau hiperfosforilate (Forman și colab., 2004). În mod fiziologic, aceste proteine se găsesc majoritar la nivel neuronal aparținând familiei de proteine asociate microtubulilor, cu rol principal în asamblarea și stabilizarea rețelei citoscheletale. Fosforilarea proteinei tau apare din stadiul fetal continuând apoi în cortexul adultului, proteinele implicate în acest proces fiind GSK-3β, cdk 5, MAPK cu p25. Hiperfosforilarea la nivelul aa. 181 sau aa. 231 este evenimentul patogenic care duce la creșterea anormală a proteinei tau în citosol și la polimerizare cu formare de filamente care se organizează într-o rețea dezorganizată de neurofibrile (Kopke și colab., 1993). Astfel, funcția pe care proteină tau o are la nivel cerebral se pierde, fiind afectată atât morfologia cât și transportul axonal al neurotransmițătorilor din cauza modificărilor citoscheletului (Roy și colab., 2005). Deoarece mecanismul patogenic identificat este hiperfosforilarea urmată de împachetarea deficitară și agregarea proteinelor tau, au fost propuse ca și țintă terapeutică kinazele implicate (litiu cu inhibiția GSK-3β, flavopiridol cu inhibiția cdk 5) dar și fosfataze care să acționeze asupra P-tau. Având în vedere multitudinea substraturilor asupra cărora aceste enzime acționează, terapiile au multe reacții adverse, reprezentând momentan un impediment (Gong & Iqbal, 2008).

1.3.3. Teoria cascadei amiloidului

Neurodegenerarea apare, conform ipotezei cascadei amiloidului, datorită acumulării plăcilor Aβ în regiuni variate ale creierului (Hardy & Higgins, 1992; Evin & Weidemann, 2002) care duc la disfuncție și moarte, fiind specifice bolii Alzheimer (figura 1.2.).

Figura 1.2. – Ipoteza cascadei amiloidului la nivelul sistemului nervos central

Conform (1) are loc clivajul enzimatic al APP cu generarea Aβ urmată de eliberarea formei solubile care poate urma două căi: în circulația generală prin intermediul astrocitelor și al capilarelor cerebrale (2) sau cu formarea de agregate insolubile (3) și plăci de amiloid care afectează sinapsele ducând la neuroinflamație (5) însă pot fi degradate (4) de către macrofage și microglii (adaptat după Cummings și colab., Nature, 2015)

Această teorie susținută de aspecte genetice, biochimice și elemente anatomopatologice, propune ca prim eveniment și cauză principală pentru apariția demenței, acumularea de peptid Aβ (Goate și colab.,1991; Chen și colab., 2000; Kayed și colab., 2003).

Componentul principal al plăcilor senile este peptidul Aβ, rezultat prin clivajul secvențial al β-secretazei și γ-secretazei asupra proteinei precursoare a amiloidului de la nivelul membranei celulare. Lungimea acestui peptid variază în funcție de situsul de acțiune al secretazelor, Aβ1-40 este cel mai frecvent, dar și Aβ1-42, cu caracter hidrofob și cu ritm de agregare rapid. Plăcile de amiloid înconjoară axonii și dendritele ducând la pierdere neuronală și atrofie cerebrală globală, însă gradul de acumulare al peptidului nu se corelează cu gradul disfuncției cognitive sau cu numărul de neuroni pierduți. Mai mult, studiul modelelor animale pentru demonstrarea neurotoxicitatii peptidului Aβ nu a elucidat complet teoria propusă, un intermediar cheie între procesul de amiloidogeneză și neurodegenerare este necesar pentru un mecanism patogenic complet (Nelson și colab., 2012; Serrano-Pozo și colab., 2013).

i) Argumente genetice

Mutațiile genei pentru APP, PS1 și PS2 (presenilină) sunt autozomal dominante și se regăsesc frecvent în cadrul demenței Alzheimer familiale, cu creșterea anormală a producție de peptid Aβ. În afară de acestea, a fost identificată alela ε4 pentru gena apolipoproteinei E (APOEε4), ca factor de risc independent pentru boala Alzheimer cu debut lent. Gena pentru APOE este localizată pe cromozomul 19 și reprezintă factorul de risc cel mai important pentru dezvoltarea bolii Alzheimer. APOE este implicat în catabolismul lipoproteinelor bogate în trigliceride și este exprimată puternic la nivel cerebral. Apolipoptroteina E crește nivelul de peptid și agregarea sa, împiedicând inclusiv clearance-ul de la nivel cerebral (Ma și colab., 1994; Wisniewski și colab., 1994; Castano și colab., 1995).

ii) Argumente prin terapia bazată pe cascada amiloidului

Scăderea producției de Aβ se face prin inhibarea β sau γ-secretazei ori prin activarea α-secretazei.

i) inhibarea BACE-1: deși acești inhibitori scad nivelul Aβ atât la modele animale cât și în culturile celulare, capacitatea lor de a penetra bariera hematoencefalica este scăzută (Hong-Qi și colab., 2012);

ii) inhibarea γ-secretazei: există mai mulți inhibitori selectivi pentru PS1 sau PSEN2, însă interacționează cu procese fiziologice dintre care cel mai important este calea semnalizării Notch (Borgegard și colab., 2012); există anti-inflamatoare nonsteroidiene precum ibuprofen, indometacin care scad producția de Aβ1-40 și cresc producția de Aβ1-38 (Weggen și colab., 2003).

iii) activatori ai α-secretazei: proteaze din familia ADAM și TACE (tumor necrosis factor-α convertase) au acțiune asemănătoarei secretazei ce clivează APP; șoarecii transgenici pentru ADAM10 au depozite de amiloid scăzute în hipocamp cât și funcții neurologice îmbunătățite (Postina și colab., 2004); există kinaze ce activează α-secretaza sau substanțe (exemplu: sirtuin-1) ce cresc expresia ADAM10 cu efecte pozitive asupra plăcilor de amiloid (Donmez, 2010).

1.4. Rolul peptidului Aβ în neurodegenerare

Monomerul Aβ (~4 kDa) este produsul majoritar obținut din APP (~120 kDa) prin clivaj succesiv al β- respectiv γ-secretazelor. După cum am detaliat mai sus, există o heterogenitate a peptidelor generate mai ales de clivajul γ. Acestea au solubilitate, stabilitate și toxicitate diferită în funcție de numărul de aminoacizi. Se formează aproximativ 20 de tipuri de peptide (Aβ40 în mod majoritar) cu rol fiziologic în creierul sănătos și tendința mare la agregare, cu formare de oligomeri și protofibrile. Deși studiile s-au concentrat pe peptidul Aβ42, mecanismul de apartitie a bolii ar putea să fie influențat de prezența altor specii de peptide (Poertelius și colab., 2010). Studiile demonstrează că formarea oligomerilor Aβ este un proces complex, aceștia fiind stabili și cu mare potențial neurotoxic (Lee și colab., 2011).

Peptidului Aβ are un rol central în patogeneză demenței Alzheimer, însă mecanismul exact nu este cunoscut. Este acesta trigger al procesului de neurodegenerare? Oare acumularea peste un nivel prag duce la moarte neuronală sau este un proces continuu de acumulare și apoptoză neuronală? Faptul că mutațiile genelor pentru APP sau PS duc la acumularea substratului patogenic pentru dezvoltarea demenței, leagă Aβ de boala Alzheimer însă este necesar un mecanism care să explice moartea neuronală și implicit apariția neurodegenerarii. Cantitatea de β-amiloid nu se corelează cu gradul deficitului cognitiv, în creierul uman se găsesc plăci de amiloid cu mult înaintea debutului semnelor clinice. Experimentele sugerează existența mai multor specii Aβ solubile, care au efect sinaptotoxic, însă nu se cunoaște dacă toxicitatea este asociată cu dimeri, trimeri, amilosferoide sau protofibrile – ansambluri sferice de aprox 5 nm diametru asociate în structuri de 200 nm lungime. Ipoteza oligomerilor Aβ toxici a fost propusă deoarece există o lipsa de corelație între cantitatea depozitelor de amiloid și efectul neurodegenerativ, de scădere a funcțiilor cognitive descris în boala Alzheimer. Aproape toate tipurile de oligomeri induc modificări sinaptice și de potențial în hipocamp, afectează neurotrasmiterea și duc la deficite de memorie la modele murine. Sinaptotoxicitatea Aβ-oligomer mediată se corelează cu deficitul cognitiv observat la începutul bolii. La acest efect toxic se adaugă efectele oligomerilor dar și acțiunea proteinei tau, ducând la neurodegenerare ireversibilă.

Se presupune existența unui feedback între agregatele Aβ și proteina din care peptidele sunt generate (APP), deoarece există dovezi că oligomerii activează procesarea APP în neuroni (Salinas și colab., 1995), dar și faptul că producția și acumularea Aβ, deși majoritar sinaptică, are potențialul de a se lega de APP cu distribuția sinaptică a depozitelor de amiloid atât la șoarecii transgenici cât și în boală Alzheimer (Harris și colab., 2010; Lazarov și colab., 2002; Sheng și colab., 2002; Thal și colab., 2002). Forma fibrilară și nu cea monomerica promovează acumularea și multimerizarea APP-ului la nivelul suprafeței celulare în astrocite și neuroni (Lu și colab., 2003; Melchor și colab., 2000; Tsuruma și colab., 2012; White și colab., 2003). În creier s-a demonstrat că APP-ul se acumulează în neuroni în apropierea plăcilor fibrilare de Aβ (Grace și Busciglio, 2003). Supraexpresia APP-ului la nivelul neuronilor în cadrul demenței familiale promovează apoptoza printr-un mecanism ce implică Go, c-Jun kinaza dar și activare prin kinaza p21 (Niikura, 2004; McPhie, 2003). Atât în creierul bolnavilor de Alzheimer cât și în creierul șoarecilor transgenici, neuronii exprimă o activitatea crescută a PAK în jurul plăcilor de amiloid (Ma și colab., 2008).

Sinaptotoxicitatea presupune inhibiția LTP în regiunea CA1 a hipocampului, împreună cu reducere în dimensiuni și densitate a spinelor dendritice, dar facilitarea LTD. LTP (potențarea de lungă durată) a fost pentru prima dată descrisă în 1966 de către Terje Lomo și Tim Bliss, demonstrând că aplicarea unor stimuli electrici de frecvență mare la nivelul neuronilor din hipocamp duce la un răspuns sinaptic mai eficient, mai puternic. Acesta este considerat a fi unul din mecanismele principale implicate în învățare și memorie care, datorită persistenței fenomenului (între câteva minute până la câteva luni), îl diferențiază de alte forme de plasticitate sinaptică (Bliss și colab., 2006). Stimularea cu frecevență înaltă determina eliberarea neurotransmițătorilor (glutamat) în fantă, activează LTP și o serie de protein kinaze (PKA, PKC, CaMKII) care duc la transcriere genică, sinteză de proteine și modificări de expresie genică (Lynch M., 2004). Tot prin aceste kinaze și mai exact prin CaMKII este crescută conductanța AMPA datorită fosforilării receptorului AMPA (AMPA-R-receptor non-NMDA pentru glutamat care este mediază transmiterea sinaptică rapidă în SNC, cu transport al ionilor de Na+ și K+). LTD sau depresiunea de lungă durata are ca efect “scăderea” răspunsului sinaptic de stimulare a aferențelor neuronilor după o stimulare cu pulsuri de mică frecvență (2-10 Hz) un timp îndelungat (spre exemplu: 15 minute). În mecanismul AMPAR-LTD cunoscut defapt că NMDAR-LTD (A) Ca2+ care intră prin aceste canale se leagă de calmodulina care activează protein fosfataza 2B (PP2B – calcineurină), care prin defosforilare duce la activarea proteinei fosfatazei 1 (PP1). PP1 poate elimina –PO4 de la nivelul mai multor proteine țintă, cu internalizarea receptorilor AMPA prin endocitoză cu vezicule acoperite de clatrină și implicit la LTD.

Având în vedere rolul LTP de la nivelul hipocampului și faptul că demența senilă afectează această structură, există studii care încearcă să găsească un mecanism care să lege cele două procese. Rowan propune în 2003 un model prin care apare scăderea LTP în boala Alzheimer. În urmă procesării deficitare a proteinei precursoare a amiloidului se formează peptidul Aβ, forma solubilă și forma fibrilară de la nivelul plăcilor de amiloid. Acumularea Aβ solubil duce la scăderea potențării sinaptice de lungă durată, afectând hipocampul în fazele precoce ale bolii, pe când depozitele de amiloid duc la un declin cognitiv tardiv.

CAPITOLUL II

Proteina precursoare a amiloidului în neurodegenerare

Descoperită în 1987 de Kang și colaboratorii ca sursă pentru β-amiloid, mai târziu fiind pusă în evidență gena responsabilă de codificarea proteinei la nivelul cromozomului 21 de către Goldgaber și Tanzi, funcția fiziologică a acestei proteine este și la momentul actual puțin înțeleasă.

2.1. Familia APP

Din familia proteinelor precursoare a amiloidului (APP) fac parte 3 isoforme ale APP (APP695, APP751, APP770) și 2 proteine APP-like: APLP1 si APLP2 (Sprecher & Wasco, 1993). Aceste 3 isoforme se formează prin splicing între exonul 7 și 8 al brațului lung al cromozomului 21, APP având până la 770 de aminoacizi în formă cea mai lungă (figura 1.3.). La nivel neuronal, APP695 se găsește în proporție mult mai mare comparativ cu celelalte două forme, acestea variază în funcție de regiunea cerebrală, dar și de patologie, având roluri diferite funcțional și metabolic. Celelalte două isoforme sunt exprimate în celulele gliale.

Figura 1.3. – Structura proteinelor din familia APP

Glicoproteine membranare tip I: APLP1 și APP695 nu prezintă domeniu KPI (Kunitz protease inhibitor) și OX2, care însă este prezent la APLP2 și APP770 , în timp ce APP751 prezintă doar domeniul KPI (adaptat după Nalivaeva și Turner, Elsevier, 2013)

De-a lungul dezvoltării cerebrale, cele 3 isoforme sunt exprimate diferit, expresia genei fiind reglată de hormoni, factori de creștere și interleukine9,83 . Recent a fost demonstrat rolul microRNA-urilor, în special miR-101 și miR-153, care reglează expresia genică, scăzând nivelul de proteină precursoare a amiloidului, cu o contribuție majoră în neurodegenerare, în special boala Alzheimer. Proteina precursoare a amiloidului are la nivel neuronal o localizare membranară și o procesare enzimatică diferită de alte celule periferice: limfocite, hepatocite sau celule pancreatice. Deși secvența aminoacizilor din structura APP este conservată, există o diferența de 3 aminoacizi la nivelul β-amiloidului între cel uman și cel al rozătoarelor. Acest lucru face ca și capacitatea peptidul β1-42 de a formă agregate de amiloid să fie mai scăzută la acest tip de mamifere, fiind protejați constitutiv de acțiunea proteolitică a β-secretazei9,83 astfel șoarecii folosiți ca și modele animale pentru boala Alzheimer sunt modele transgenice, care exprimă proteina umană, isoforma 695.

2.2. Structura proteinei precursoare a amiloidului

Proteina precursoare a amiloidului este o glicoproteina membranară de tip I, cu un capăt N-terminal voluminos, un domeniu transmembranar unic și porțiunea C-terminală intracitoplasmatică, fiind exprimată atât la nivel neuronal cât și non-neuronal, de la nematode până la mamifere.

Tabelul I – Funcțiile domeniului intracitoplasmatic și al formei solubile a APP

Ectodomeniul proteinei precursoare a amiloidului are o structura complexă, se împarte în domeniile E1 și E2, primul având două subdomenii importante: domeniul de legare pentru Cu2+ și domeniul asemănător factorului de creștere. Domeniul intracitoplasmatic (AICD) este scurt și reprezintă zona care interacționează cu alte proteine, zona aa.682-687 fiind conservată de la C. elegans la oameni. Structura spațială a zonei intracitoplasmatice depinde de proteinele cu care formează legături, legarea duce la stabilizarea proteinei (DeStrooper și Annaert, 2000). Fosforilarea domeniului AICD este esențială pentru legarea unor proteine precum Fe65, Fe65L1, Mint1/X11α, Dab1, familia kinazelo c-Jun (Ando și colab., 2001). Domeniul intracitoplasmatic conține 8 situsuri de fosforilare însă fosforilarea treoninei din poziția 668 este cea mai studiată datorită implicării în diferențierea neuronală. Acest proces de fosforilare se pare că influențează atât formarea cât și stabilitatea complexului AICD-ligand dar participă și în semnalizare, ducând la activarea γ-secretazei cu clivarea proteinei precursoare a amilodului (Lee și colab., 2003).

Studiile au arătat că proteina precursoare a amiloidului are rol în reglarea adeziunii celulare, contribuind la creșterea neuronală și sinaptogeneza, fără să aibă o structura ce se aseamănă cu molecule implicate în adeziune precum integrinele. Porțiunea intracitoplasmatică este responsabilă de interacțiunea cu citoscheletul, astfel clivajul proteolitic al APP și porțiunea C-terminală ar putea să fie implicate în semnalizare. Funcția ectodomeniul este mai puțin cunoscută, homeostazia cuprului și formarea dimerilor fiind doar o parte din funcțiile descoperite momentan.

2.3. Ciclul celular al proteinei precursoare a amiloidului

APP-ul imatur este sintetizat la nivelul reticulului endoplasmatic, transportat către aparatul Golgi unde au loc procesele de N-glicozilare, O-glicozilare precum și fosforilarea ectodomeniului și a porțiunii intracitoplasmatice rezultând astfel proteina matură împachetată în vezicule secretorii. Această proteină este transportată la nivelul membranei neuronale, de unde poată să fie internalizată prin endosomi în câteva minute și recirculată către alte compartimente (dendrite) sau degradată lizozomal (Back și colab., 2007). Majoritar, proteina precursoare a amiloidului se găsește intracelular și în procent de 10-20% la nivel plasmalemal, pre- și postsinaptic în structuri ale țesutul nervos central și periferic, având rol de creștere și plasticitate neuronală (Ashley și colab., 2005).

2.3.1. Fosforilarea fiziologică a APP-ului are loc majoritar la nivelul Thr668 fiind observată în neuroni (APP matur) dar și în celulele aflate în diviziune (APP imatur în special) sau în condiții de stress celular. Aceste proces de fosforilare dependent de CDK5, GSK-3β și JNK induce modificări conformaționale ale regiunii citoplasmatice, care duc la reglarea și inducera interacțiunii cu alte proteine precum Fe6529,63. La nivelul intracitoplasmatic există 8 regiuni de fosforilare ale proteinei precursoare a amiloidului: Tyr-653; Thr-654; Ser-655; Ser-675; Thr-668; Tyr-682; Thr-686 și Tyr-687 pentru isoforma APP695. În urmă acestui proces fiziologic există modificări ale procesării enzimatice și localizării celulare a APP. Se consideră că fosforilarea Thr-668 contribuie la normalizarea funcțiilor neuronale însă rolul exact fiziologic nu se cunoaște. Există studii prin care se demonstrează că fosforilarea proteinei precursoare a amiloidului la acest nivel este implicată direct în patogeneza bolii Alzheimer, prin modificarea conformației și a interacțiunii cu alte proteine/metale (Ramelot și colab., 2001). Atât în creierul șoarecilor dar și în creierul pacienților cu BA, doar forma matură APP (O-glicozilat) este fosforilată. GSK3β, SAPK1b/JNK3 și Cdk5 sunt kinazele implicate în acest proces la nivel neuronal, fiind asociate cu neurotoxicitate dar și alte boli neurodegenerative (Iijima și colab., 2000; Liu și colab., 2003; Rockenstein și colab., 2007). Acidul okadaic , inhibitor al fosfatazei-2A, a fost folosit pentru a crește procesul de fosforilare la modele animale inducând în cele din urmă moarte neuronală. AO duce la creșterea nivelului APP și acumularea la nivel axonal, cale care este reglată de c-Jun N-terminal kinaza (c-JNK)5. Cdk-5 este o kinaza de dimensiuni mici implicată în dezvoltarea SNC, având că subunitate reglatorie p35, cuplarea celor două proteine ancorate la membrana celulară declanșează fosforilarea (Liu și colab., 2003).

Această procesare a APP facilitează clivajul de către BACE-1, contribuind la creșterea cantității de amiloid-β (Lee și colab., 2003). Într-un studiu din 2012 a fost demonstrat faptul că formele non-fosforilate ale CTF sunt asociate microdomeniilor membranare/plutelor lipidice unde se găsește cu precădere γ-secretaza, pe când fragmentele fosforilate se regăsesc în fracțiunile citoplasmatice (Matsushima și colab., 2012). Astfel fosforilarea la Thr-668 influențează conformația porțiunii intracitoplasmatice, localizarea subcelulară APP-ului și procesarea de către γ-secretază.

2.3.2. Căile de metabolizare a APP

Proteina precursoare a amiloidului va fi procesată prin clivaj proteolitic, în două etape succesive, sub acțiunea unor enzime denumite secretaze datorită secreției substratului clivat. Există două căi de metabolizare: calea non-amiloidogenica, sub acțiunea α-secretazei și calea amiloidogenica, sub acțiunea β-secretazei (figura 1.4.). Cele două căi se influențează reciproc deoarece a fost observat atât în culturi celulare cât și la modele animale că stimularea activității α-secretazei duce la scăderea producerii Aβ și chiar a formării plăcilor senile (Postina și colab., 2004).

Peste 90% din metabolismul proteinei implică acțiunea α-secretazei urmată apoi de γ-secretază, ducând la formarea formei solubile a APP (sAPPα). Din calea non-amiloidogenetică rezultă această proteină cu o greutate moleculară de 100-120 kDa și funcție neuroprotectivă, alături de domeniul intracelular al proteinei (AICD) cu rol în semnalizarea nucleară (Kojiro & Selkoe, 2003; von Rotz și colab., 2004) și fragmentul polipeptidic p3 spre capătul N-terminal.

În calea amiloidogenica, clivarea APP-ului sub acțiunea β-secretazei formează sAPPβ și un fragment C-terminal ancorat de membrana celulară (C99-βCTF), care apoi este clivat de γ-secretaza (Nunan & Small, 2000). Se formează peptidul Aβ alături de domeniul intracelular al proteinei. Peptidul Aβ este principalul component al plăcilor amiloide extraneuronale, elementul patogenic central din boala Alzheimer. Deoarece γ-clivajul este heterogen, peptidul generat poate să aibă lungimi diferite, Aβ1-40 fiind cel mai abundent și solubil pe când Aβ1-42 cel mai agregabil (McGowan și colab., 2006).

Figura 1.4. – Căile de metabolizare a APP

(Sursă: Hooper si colab., Trends in molecular medicine, 2005)

i) α-SECRETAZA acționează la nivelul domeniului amiloidogenic între Lys16 și Leu17 rezultând sAPPα și CTF-α (C83), fiind activată de protein kinaza C (PKC). Există zinc-metaloproteinaze că ADAM9, ADAM10, TACE/ADAM17 și ADAM19 ce pot funcționa ca și α-secretaze, Kuhn demonstrând că cel puțin la nivel neuronal principala activitate de clivare o are ADAM10. Proteine precum Notch, TNFα dar și alte proteine transmembranare de tip I sunt clivate sub acțiunea unei α-secretaze. Dacă calea patogenică este favorizată în neuroni datorită abudenței BACE1, calea non-amiloidogenică este predominantă în toate celelalte tipuri celulare. Supraexpresia ADAM10 în culturi celulare sau modele transgenice duce la scăderea procesării BACE1 și implicit la scăderea depozitelor de amiloid. În condiții fiziologice, ADAM10 este exprimat în țesutul hipocampic și în cortex, fiind co-exprimat cu BACE1 în neuronii corticali maturi. Scăderea colesterolului stimulează α-clivajul, mecanismul implicat nu este specific pentru APP (Matthews și colab., 2003).

ii) β-SECRETAZA mediază inițierea și procesul limitativ de generare a peptidului Aβ (Vassar, 2004) fiind singura descoperită cu activitate amiloidogenica iar knockout-ul genei blochează întreagă generare a peptidului Aβ (Cai și colab.,2001, Luo și colab., 2003). A fost identificată o singură β-secretază primind numele general acceptat de BACE-1 (β-site APP cleaving enzyme-1/ enzima de clivare a β-sitului APP) , o aspartil-protează cu activitate la nivel luminal/ spațiu extracelular, exprimată ubiquitar, cu cel mai mare nivel în creier și pancreas. BACE-2, o protează homoloaga a fost descoperită, însă această are o acțiune asemănătoare cu α-secretaza, exercitând un efect protector anti-amiloidogenic la nivel non-neuronal (Fluhrer și colab., 2002; Basi și colab., 2003). Faptul că la nivel cerebral este exprimată concomitent și proteina precursoare a amiloidului împreună cu această protează face ca în creier să se genereze cantități mari de peptid Aβ, explicând de ce boala Alzheimer este una ce afectează creierul deși enzimele sunt exprimate ubiquitar.

BACE1 este o țintă terapeutică importantă, deoarece inhibiția duce nu numai la reducerea nivelului Aβ dar previne și acumularea de fragmente C-terminale β (βCTF), ce conțin întreg domeniul responsabil de generarea peptidului și servind în final la producerea lui prin clivaj. Șoarecii knockout pentru gena BACE1 sunt viabili și fertili, fără să exprime modificări morfologice, de dezvoltare sau de comportament (Cai și colab., 2001, Roberds și colab., 2001). Deoarece nivelul BACE 1 este mult ridicat postnatal, a fost pus în legătură cu mielinizarea care se derulează în primii 2 ani de viață, astfel a fost observat un fenotip hipomielinizant la șoarecii K.O. pentru β-secretază.

iii) γ-SECRETAZA este un complex alcătuit din 4 subunități, presenilina 1 (PS1) sau presenilina 2 (PS2), nicastrina (NCT), APH-1a/APH-1b și activatorul de presenilina ( PEN-2/ presenilin enhancer). Aceste 4 componente sunt necesare și suficiente pentru activitatea enzimatică a γ-secretazei la nivelul domeniului transmembranar, eliberând peptidul Aβ. Locul de acțiune al secretazei nu este restricționat, în condiții fiziologice putând avea loc între poziția 37 și 43 din domeniul de generare al peptidului. Diferențele nu sunt relevante pentru înțelegerea patogenezei Alzheimerului, însă cu cât proteina este mai lungă cu atât are un potențial mai mare de agregare și prin urmare neurotoxic (Haass & Selkoe, 2007). Are loc o procesare secvențială a proteinei precursoare amiloidului, proteoliză intramembranară începând la situl de ε-clivare între aminoacizii 48 și 49, urmat apoi de ζ-clivare între aminoacizii 46 și 45, în final se face γ-clivajul cel mai frecvent la nivelul 40 sau 42 (dar și după aminoacizii 37, 38, 39, 43). Există astfel două căi care duc la fomarea predominantă fie a Aβ42 care este majoritar în plăcile senile și fie a Aβ-40 majoritar în lichidul cefalorahidian și plasmă, clivajul putând fi modulat terapeutic astfel încât să se prevină generarea de Aβ-42.

Acest peptid se asamblează sub mai multe forme ce au fost puse în evidență în creierul afectat de boala Alzheimer. Astfel se găsesc fibrile insolubile ce se organizează în plăcile senile, protofibrile solubile, oligomeri și inclusiv dimeri sau trimeri ce co-există într-un echilibru dinamic (Roychaudhuri și colab., 2009). Efectul toxic al acestor agregate a fost demonstrat in vitro fiind defapt corelat cu o interacțiune anormală cu alte proteine neuronale, ducând la modificarea funcțiile fiziologice ale neuronilor (Olzcha și colab., 2011). Experimente recente sugerează că agregatele Aβ interacționează cu APP-ul, declanșând evenimente patogenic regăsite în demența Alzheimer.

2.4. Relația dintre APP și microdomeniile membranare

Plutele lipidice formate din sfingolipide și colesterol sunt compartimente active biologic, generarea Aβ fiind dependentă de integritatea lipidică a membranei, de cantitatea de colesterol și GM1 (Yanagisawa și Ihara, 1998). Colesterolul este implicat în reglarea clivajul proteinei precursoare a amiloidului de către α- și β-secretază (Simons și colab., 2001) prin legarea porțiunii din zona transmembranara a APP, regiunea regăsită și la polipetidul obținut prin clivajul α-secretazei (C83). Concentratiile crescute de colesterol duc la activare enzimatică a β- și γ-secretazei, fiind regăsite în plutele lipidice și astfel implicate în calea amiloidogenică. BACE1 dar și componente ale γ-secretazei (Aph-1 și nicastrina) au nevoie de plute lipidice intacte. Kojiro ipotetizează că APP este prezent în două regiuni membranare diferite din punct de vedere funcțional, o zona în care plutele lipidice sunt asociate cu generarea de Aβ și o altă zona unde își exercită activitatea α-secretaza independent de inclavarea în plute . Nu există o explicație clară privind modalitatea diferită de procesare a aceleași proteine, co-localizarea secretazelor fiind o explicație, însă nu se cunoaște procesul de reglare. Există 3 populații evidențiate la nivel membranar: APP/C99 nelegat de colesterol asupra căruia acționează α-secretaza, APP/C99 legat de colesterol din zonele membranare non-raft și APP/C99 legat de colesterol la nivelul plutelor lipidice cu implicare în calea amiloidogenică. Procentajul în care acestea se regăsesc depinde de cantitatea de colesterol care modulează atât activitatea enzimatică cât și procesarea APP.

Aproximativ 10% din APP trece printr-un proces post-translațional de palmitolare la nivelul Cys-186 și Cys-187 pentru a crește hidrofobicitatea, formă palmitolată fiind regăsită cu precădere la nivelul plutelor lipidice4. BACE1 dar și componente ale γ-secretazei (Aph-1 și nicastrina) sunt modificate prin palmitolarea capetelor C-terminale (Cheng și colab., 2009). Atunci când se induc mutații punctiforme strict la nivelul acestor regiuni de palmitolare, generarea de APP scade. Cantitatea de palAPP crește cu vârstă în creierul șoarecilor nontransgenici (3 luni vs. 18 luni), important pentru că acest proces reglează generarea de APP cu direcția către plutele lipidice unde se află BACE-1, APP urmând apoi calea amiloidogenica4. Studiile efectuate pe iepuri și șoareci confirmă că o dietă bogată în colesterol contribuie la formarea de plăci senile (Refolo și colab., 2000); în mod contrar, depleția colesterolului duce la scăderea Aβ în culturi celulare și la modelele animale (Fassbender și colab., 2001). Mai mult, APOE reprezintă un factor de risc major pentru boala Alzheimer, nivelul crescut de Aβ în creier fiind corelat cu colesterolul seric total și LDL elevate în sânge (Kuo și colab., 1998). In vitro, colesterolul formează agregate cu peptidul Aβ (Ardulov și colab., 1997), datele fiind dificil de extrapolat la condițiile fiziopatologice umane.

2.5. Funcțiile APP

Funcțiile in vivo ale proteinei precursoare a amiloidului și a omologilor săi sunt puțin înțelese. Modele murine knockout pentru APP sunt viabile și fertile, sugerând că această proteină nu este esențială pentru dezvoltarea embrionară, însă aceștia au modificări fenotipice: greutate mai mică, scădere a motilității, deficite de memorie și atenție (Ring și colab., 2005).

2.5.1. Adeziunea celulară

Familia APP joacă un rol important în interacțiunea celulă-celulă dar și adeziunea la substrat. Formele APP care rămân cantonate la nivel membranar participă la adeziunea între celule în urma homo- sau heterodimerizarii (Baumkotter și colab., 2012). Domeniul extracelular al APP interacționează prin intermediul domeniilor sale cu componente ale matrixului extracelular precum laminina, colagenul de tip I, integrina α3β1 (Hoe și colab., 2009).

Este cunoscută capacitatea APP de a formă homodimeri și heterodimeri cu APLP1 și APLP2 atât in vitro cât și in vivo. Generarea dimerilor stabili are loc la nivelul reticulului endoplasmatic migrând apoi spre membrană. Există un echilibru celular al APP monomer-dimer, care poate să varieze în compartimentele celulare dependent de stadiu redox. Într-un studiu din 2001 se demonstrează că dependent de porțiunea N-terminală, APP full-length formează dimeri cât și tetrameri. Există cel puțin 4 domenii care promovează dimerizarea APP: domeniul E1 cu GFLD (Growth factor like domain) și CuBD (Copper binding domain), domeniul E2, porțiunea juxtamembranara și domeniul transmembranar. Dimerii APP-APP se formează prin interacțiuni covalente cross-linkate la nivelul suprafeței celulare, dar și prin legături disulfidice ce necesită aa. 91-111 pentru stabilizarea structurii homodimerice. Homodimerizarea este dependentă de rezidurile de cisteină de la nivelul E1, deletia întregului domeniu bogat în cisteină duce la absența formării dimerilor APP-APP43. Zona de legături S-S formează o buclă ce interacționează prin forțe hidrofibice cu domeniul E1 scăzând generarea sAPPβ dar și a Aβ-40/Aβ-42, așa cum a fost observat când peptidul sintetizat după această regiune a fost adăugat în culturile celulare ce exprimă APP. APP695 interacționează formând cis-dimeri în cadrul aceleași celule, APP770 nu formează dimeri, probabil domeniul KPI inhibă interacțiunea regiunilor E1. A fost observat că la nivelul celulelor Drosophila S2 dimerizarea nu depinde de isoforma APP, având loc o trans-dimerizare între proteina de la suprafața a două celule diferite43(figura 1.5.). Trans-dimerizare are ca potențial rol adeziunea intercelulară, iar cis-dimerizarea putând avea rol de factor de creștere.

Figura 1.5. – Formarea homodimerilor APP prin cis-dimerizare și trans-dimerizare

(adaptat după Isbert și colab., Cell and molecular life sciences, 2012)

sAPP poate să dimerizeze într-o soluție in vitro atunci când acesta se găsește în concentrații crescute sau în prezența heparinei (Wang&Ha, 2004; Lee și colab., 2011). Dimerizarea afectează în mod direct clivarea γ-secretazei, nefiind necesară pentru a putea să fie produs Aβ. Au fost atribuite mai multe roluri fiziologice. Eggert demonstrează că formarea dimerilor/multimerilor duce la scăderea cu peste 50% a formării de Aβ, dar cu creșterea AICD, acestea fiind observate în culturi celulare fără să știm procentul dimerizării in vivo și prin urmare a amiloidului. Există multe studii contradictorii în ceea ce privește rolul dimerilor APP-APP în modularea căii enzimatice a formării amiloidului. Scheuermann sugerează că cis-dimerizarea duce la activarea β-secretazei cu creșterea producerii de peptid. De asemena, Cu2+ induce dimerizarea in vitro, iar la nivel celular o concentrație de 100µM formează legături APP-APP, cuprul fiind reglator al trans-dimerizării la nivel sinaptic. Homodimerizarea la nivel C99 protejează APP de clivajul γ-secretazei (Winkler și colab., 2015). Prezența oligomerilor de APP nu a fost clar dovedită stintific, însă dimerii și tetramerii au fost raportați în literatura de specialitate, formarea lor începând la nivelul reticului endoplasmatic fără însă să se cunoască rolul exact al acestora. La acest nivel se poate acționa terapeutic prin inhibarea formării dimerilor, proces ce induce atât fosforilarea APP cât și reducerea formării Aβ, cu beneficii asupra prognosticului BA.

Interacțiunea dintre fibrile de Aβ și APP conduc la acumularea și formarea de multimeri de APP integral (holo) la suprafața celulelor precum neuroni, astrocite și celule musculare nedete cerebrovasculare (Lu și colab., 2003; White și colab., 2003). Multimerizarea APP indusă de peptidul neurotoxic este legată de pierderea rapidă a legăturilor neuronale. În culturile de neuroni hipocampici, această multimerizare toxic indusă se realizează aberant la nivelul adeziunilor focale, în apropierea plăcilor senile în creierul afectat de demență (Grace și Busciglio., 2003; Phinney și colab., 1992). Neuronii din creierul rozătoarelor knockout pentru APP erau parțial rezistenți la Aβ toxicitate (Lorenzo și colab., 2000), reciproca fiind valabilă (Sola Vigo și colab., 2009), acestea fiind reglate de calea caspazelor dar și a proteinelor Go heterotrimerice cu efectele neurotoxice. Formarea de multimeri holo-APP la nivelul suprafeței celulare duce la alterări ale semnalizării intracelulare. Supraexpresia APP în neuronii primari promovează apoptoza printr-un mecanism ce implică activarea Go, c-Jun și p21-kinaza activatoare (PAK)43, ultima acumulându-se ca proteină activă în jurul plăcilor de amiloid (Ma și colab., 2008).

2.5.2. Supraviețuirea neuronală și plasticitatea sinaptică

Rolul APP și al fragmentelor în plasticitatea sinaptică a fost investigat în numeroase experimente. Plecând de la studiul din 1994 al șoarecilor transgenici pentru supraexpresia genei sălbatice a APP unde a fost pusă în evidență prezența a unui număr crescut de sinapse în SNC, recent a fost propus ca și moleculă de adeziune sinaptică având proprietăți similare cu neuroxinele/neurologinele (Wang și colab., 2009). În culturile de fibroblaste a fost demonstrat că sAPP modulează diviziunea celulară astfel că acesta are un efect trofic neuronal. Introducerea sAPP în culturi primare neuronale promozeaza supraviețuirea pe termen lung, stimulează creșterea sinaptică și protejează de stimuli toxici (Matsson, 1997). A fost încercată introducerea intracraniană a anticorpilor specifici anti-sAPP, cu efect de stimulare a memoriei, rezultatele obținute arătând că este implicat în procesele cognitive (Meziane, 1998). Mecanismul prin care are efect de protecție și suport trofic este legarea sAPP și reglarea dimerizării APP-ului la nivelul membranei plasmatice, dar și balanța dintre sAPP și fragmentul de APP cantonat membranar (Gralle și colab., 2009; Yoshikawa și colab., 1992).

La nivelul creierului adult, atât în celulele neuronale cât și în cele non-neuronale, sAPPα are efectul unui factor proliferativ, dar crește și motilitatea keratinocitelor (Caille și colab., 2004). În liniile neuronale imortalizate sAPPα duce la creșterea terminațiilor nervoase și a arborizatiilor neuronale, cu efecte neuroprotective împotriva ischemiei și excitotoxicității. Injecțiile intracerebrale cu sAPPα duc la creșterea performanțelor la șoareci adulți, mecansimul fiind fie de modelare sinaptică fie de neuroprotecție (Meziane și colab., 1998). În dezvoltarea creierului, APP este important pentru formarea sinapselor funcționale. În culturile de neuroni hipocampici, creșterea APP duce la un răspund mai bun la glutamat (Tominaga-Yoshino și colab., 2001), putând fi evidențiat prin studii electrofiziologice efectul asupra răspunsului sinaptic atunci când APP lipsește (Priller și colab., 2006). Șoarecii knockout pentru APP și APLP2 nu formează terminații sinaptice funcționale, cu scăderea dramatică încă din prima zi de viață a activitățiilor cerebrale și moarte câteva zile mai târziu (Yang și colab., 2005). La nivelul SNC, proteina precursoare a amiloidului este importantă pentru maturarea subtipurilor neuronale (Saulbaum și Ruddle, 1994).

2.5.3. Semnalizare celulară și receptor de suprafață

Structura proteică sugerează că are funcție de receptor dar și de factor de creștere. Cea mai conservată regiune este porțiunea intracelulară, motivul GYENPTY, ce mediază interacțiunea cu proteine denumite proteine adaptor (Fe65, familia Mint/X11, kinaza c-Jun N-terminal, Shc). Interacțiunea cu aceste proteine generează fragmente AICD, care împreună cu Fe65 duc la formarea unui complex transcriptional ce controlează expresia genică pentru KAI1, neprilisina, receptorul EGF și altele (Zhang și colab., 2007). Există o similaritatea între APP și Notch în ceea ce privește clivajul făcut de secretaze și reglarea transcrierii genice prin intermediul unor fragmente, fiind încă un argument pentru rolul de receptor de suprafață. Deși pentru interacțiunea cu calea proteinelor G receptorul trebuie să aibă cel puțin 7 domenii transmembranare, există proteine precum receptorul pentru EGF și receptorul pentru FGF cu un singur domeniu transmembranar care pot să participe la semnalizare prin intermediul acestor proteine. Deyts demonstrează în 2012 că, printr-un mecanism dependent de activarea Gs, proteina precursoare a amiloidului stimulează creșterea axonală și dendritică în neuronii mamiferelor fiind astfel factor de creștere la nivel cerebral.

2.6. Modele animale transgenice pentru gena APP

Funcțiile multiple ale APP au dus la studiul animalelor transgenice pentru genele responsabile de această proteină. Șoarecii knockout pentru APP au o greutate mai mică și o dată cu vârstă prezintă alterări ale forței musculare a extremităților. Mai mult, aceștia au alterări are transmiterii sinaptice cu deficite de învățare și memorie (Damwson și colab., 1999). Animalele Aplp2-/-/Aplp1-/- și APP-/-/Aplp2-/- dublu mutate spre deosebire de APP-/-/Aplp1-/- au o creștere a mortalității postnatale, ceea ce sugerează că funcțiile proteinelor ce fac parte din această familie se suprapun parțial (Anliker și Muller, 2006). Deficiența a celor 3 gene duce la moarte rapidă, împreună cu displazie corticală ce sugerează anomalii ale migrării neuroblaștilor și pierderea de celulele Cajal-Retzius (Herms și colab., 2004). Toate studiile arată că această familie are un rol important în dezvoltarea sistemului nervos ca structură și funcționalitate a sinapselor dar și a migrării neuronale în perioada fetală.

CAPITOLUL III

Caveolinele în biologia sistemului nervos central

Membrana plasmatică este mai mult decât o barieră selectivă între celulă și mediul exterior, cu o compoziție complexă alcătuită din colesterol, fosfolipide precum și o varietate de proteine. Astfel, se formează o structură înalt organizată cu funcții multiple la nivel celular. Plecând de la modelul mozaicului fluid propus de Singer și Nicholson în care componentele membranare erau distribuite aleator, în anii 70' Stier & Sackmann au dovedit existența unor microdomenii membranare, explicând modul în care celula, prin intermediul plasmalemei, comunică cu exteriorul. Membrana celulară este un “mozaic” de microdomenii funcționale, între care se remarcă plutele lipidice și un subset al acestora ce poartă denumirea de caveolele, structuri implicate în semnalizarea și homeostazia celulară. Plutele lipidice sunt domenii dinamice de dimenisuni mici, heterogene, bogate în steroli și sfingolipide și pot interacționa cu proteine. Caveolele sunt structuri colesterol-dependente, intens studiate în ultimii ani, însă rolul precis pe care îl au, mai ales în semnalizarea celulară, nu este cunoscut pe deplin.

Caveolele, abundente în țesuturile mamiferelor, formează microdomenii membranare remarcabile ca stabilitate implicate în procesul de endocitoza și exocitoza. În ultimii ani, studiul acestor structuri a luat amploare și percepția despre importanța lor în economia celulei s-a modificat. Parton și colaboratorii definesc caveolele ca “senzori ai membranei plasmatice care pot răspunde la stresul celular și modelează interacțiunea cu mediul extern”. Importanța caveolelor ca și structură membranară reiese din rolurile de protecție, de organizare și de senzor celular, descoperite datorită bolilor apărute ca rezultat al modificării expresiei proteice: distrofii musculare și procese tumorale.

3.1. Introducere în biologia caveolelor

Caveolele, descrise pentru prima dată de G.E. Palade în 1953, au fost identificate prin microscopie electronică, fiind prezentate ca invaginări ale membranei plasmatice cu forma literei Ω și diametru de 60-80 nm. Caveolina-1, proteina principala ce formează aceste structuri, a fost identificată 40 de ani mai târziu (Kurzchalia și colab., 1992, Rothberg și colab., 1992), urmată de caveolina-2 (Scherer și colab., 1996) și caveolina-3, proteină cu distribuție predominant musculară (Way și Parton, 1995). O nouă famile de proteine alcătuită din 4 proteine numite cavine a fost descoperit că se asociază și stabilizează structura caveolară (Bastiani și colab., 2009, McMahon și colab., 2009). Caveolele au fost identificate pentru prima dată în celulele endoteliale ale capilarelor (“Fine structures of blood capillaries”, 1953) urmând că apoi să fie descrise la nivelul multor celule și țesuturi.

Până în prezent, majoritatea cercetărilor au studiat prezența caveolinelor la mamifere, însă aceste proteine se regăsesc inclusiv la Xenopus laevis, Fugu rubripes și Caenorhabditis elegans. Caveolele sunt prezente în majoritatea celulelor, existând și excepții precum eritrocite, trombocite, limfocite (Fra și colab., 1995). Densitatea caveolelor diferă în funcție de țesuturi, cel mai mare nivel de caveolina-1 regăsindu-se în adipocite, celulele endoteliale, fibroblaste și pneumocite de tip I. Suprafața membranară este crescută cu ajutorul acestor structuri, peste 50% din suprafață endoteliul și mai mult de 20% din suprafață adipocitara este acoperită de caveole (Sheldon și colab., 1962). La nivelul țesutului nervos au fost descrise caveole în astrocite25, dar nu în neuroni62-63, caveolinele fiind implicate în procese de diferențiere astrocitară93 și transcitoză8 atât în perioada embrionară cât și postnatal7.

Mutațiile în genele familiei caveolinelor sunt corelate cu o varietate de boli din patologia umană: distrofii musculare, boli cardiace și neoplazii. În cazul anumitor cancere de sân, expresia caveolinei-1 este scăzută existând mutații sporadice ale genei, pe când în progresia cancerului prostatic caveolina-1 stimulează supraviețuirea și creșterea tumorală. Au fost descrise multiple mutații la nivelul genei caveolinei-3 fiind asociate cu distrofii și boli musculare51.

3.2. Structura caveolelor

La nivelul celulelor eucariote există trei proteine descrise că și componente ale caveolelor: caveolina-1 (Cav-1), caveolina-2 (Cav-2) și caveolina 3 (Cav-3). Mai mult, atât caveolina-1 cât și caveolina-2 prezintă izoforme: Cav-1α și Cav-1β respectiv Cav-2α, Cav-2β și Cav-2γ a căror semnificație funcțională nu este pe deplin cunoscută. Deși aceste proteine sunt diferite, caveolina-1 este în proporție de 38% identică cu caveolina-2 și în proporție de 65% cu caveolina-3, fiind conservate de-a lungul evoluției. Motivul FEDVIAEP este o secvență de 8 aminoacizi identică la toate cele 3 proteine fiind considerată “secvența de semnătură a caveolinei”. Expresia genelor diferă între cele 3 tipuri de proteine, cav-1 și cav-2 apar în marea majoritatea a celulelor diferențiate iar cav-3 în mușchii scheletici și miocard51.

Ca și prototip al familiei proteinelor caveolare, caveolina-1 are o greutate moleculară de 22 kDa fiind suficientă și necesară pentru a forma caveole, prin oligomerizarea în medie a 140-150 de molecule cav-1 alături de colesterol și sfingolipide. Din punct de vedere structural, este o proteină transmembranara cu o dispoziție aparte, atât capătul N-terminal cât și cel C-terminal se găsesc intracitoplasmatic. Prezintă zone care interacționează cu componente celulare: C-MAD (aa. 135-150) și N-MAD (aa. 82-101) importante pentru atașarea de membranară, porțiunea transmembranara (aa. 102-134) care se înseră în bistratul lipidic, domeniul responsabil de oligomerizare (aa. 61-101) prin care interacționează cu alte molecule cav-1, domeniul de ancorare “scaffold” (aa. 82-101) care recunoaște o porțiune hidrofobă prezentă în structura a multor proteine implicate în semnalizare (figura 1.6.)51-53.

Figura 1.6. – Structura caveolinei-1

(adaptat după Lisanti si colab., APS Journals, 2004)

Domeniul de oligomerizare mediază formarea de homo-oligomeri din 14-16 molecule de caveolina-1 (figura 1.7.), care apoi se asociază și formează complexe caveolare cu masă moleculară de 400 kDa (Monier și colab., 1995; Kurzchalia și colab., 1992). Caveolina-2, spre deosebire de celelalte două proteine din aceeași familie, nu poate forma caveole, necesitând prezența caveolinei-1 pentru a forma complexe hetero-oligomerice încă de la nivelul reticulului endoplasmatic. Domeniul “scaffold” funcționează asemeni unui receptor ce recunoaște o regiune din structura anumitor proteine numită domeniul de legare caveolara (CBM- caveolin binding motif) cu rol dublu, acționează ca și ancorare pentru proteine și reglează prin inhibare sau stimulare activitatea de semnalizare celulară a acestor proteine.

Caveolina-1 este palmitolata la nivelul a trei reziduri de cisteină (aa. 131, 143 și 156), fiind necesare pentru interacțiunea cu colesterolul din membrana celulară. Dacă în structura unei caveole se estimează că există 140-150 de molecule de caveolina, cantitatea de colesterol este de 100 de ori mai mare, aproximativ 20.000 molecule, scăderea nivelului colesterolului ducând la modificări importante în structura finală. Astfel, caveolele sunt structuri specializate ce conțin domenii sfingolipidic-colesterol distincte stabilizate prin proteine ce aparțin familiei caveolinelor.

Identificarea unei noi familii de proteine citoplasmatice ce cooperează cu caveolinele în formarea și funcția caveolei a îmbogățit înțelegerea asupra acestei structuri încă puțin cunoscute. Cavina-1 identificată prima dată ca și PTRF (Vinten și colab., 2001), cavina-2 cunoscută sub numele de SDPR (serum deprivation response protein) descrisă în 1993 de Gustincich și Scheinder, cavina-3 sau SBRC ce funcționează ca și adaptor pentru PKC (Izumi și colab., 1997) și cavina-4 identificată prima dată în mușchi (Ogata și colab., 2008) sunt cele care alcătuiesc familia cavinelor. Odată ajunse la nivel plasmalemal, oligomeri de caveolina sunt stabilizați prin complexul cavinelor, format prin homo- și hetero-oligomerizarea celor 4 proteine cavinelor. Nu se cunoaște mecanismul exact prin care cele două familii de proteine se asamblează pentru a forma caveole însă disocierea legăturilor cav-1-cavina-1 duce la aplatizarea caveolara și eliberarea în citoplasmă a cavinelor , ca răspuns la stressul celular52.

Figura 1.7. – Oligomerizarea caveolinei-1

(adaptat după Lisanti si colab., Pharmacological Reviews, 2002)

Studiul formării și traficului caveolar este crucial pentru înțelegerea rolului familiei caveolinelor. Sinteza acestor proteine începe la nivelul reticulului endoplasmatic unde se găsesc ca proteine membranare, urmând apoi prima etapă de oligomerizare. Oligomeri de mici dimensiuni sunt apoi transferați la nivelul aparatului Golgi, etapă prezentă în multe celule. De-a lungul căi de sinteză, caveolinele se asociază cu plutele lipidice și se organizează în oligomeri caracteristici. Dacă caveolina suferă mutații, aceasta se acumulează în aparatul Golgi și nu este transportată eficient către membrană, lucru evident în diverse patologii. Se pare că aceste mutații proteice sunt mai dăunătoare prin blocarea la nivel golgian decât prin lipsa totală a structurii finale. Explicația este că proteinele exocitate prin calea caveolara, pot însă să urmeze și alte căi, în absența totală a caveolinelor. Însă în cazul caveolinei mutante, aceasta va bloca aparatul Golgi împiedicând, din punct de vedere fizic, excreția proteinelor.

3.3. Rolurile caveolelor

3.3.1. Caveolele și transportul celular

Ultrastructura și dispoziția caveolelor sugerează implicarea în procesele de transport celular prin transcitoza și endocitoza (figura 1.8.). Datorită abundenței caveolelor în teritoriul vascular, procesele de transport au fost studiate intens la nivel endotelial. Importanța și rolul caveolinelor au fost investigate prin compararea animalelor sănătoase cu cele modificate genetic. Luând drept exemplu albumina, caveolele sunt responsabile, cel puțin parțial, de transportul transcelular al acestei proteine, însă în mod surprinzător nivelul albuminei este unul normal la șoarecii K.O. pentru caveolina-1. Mecanismul compensator în organismelele în care s-a dovedit absența totală a caveolelor este acela de creștere a permeabilității vasculare pentru albumină, în acest caz, prin mărirea joncțiunilor intercelulare fiind un proces mediat de creșterea oxidului nitric51-53.

Pentru a pătrunde intracelular diverși agenți patogeni sunt necesare rearanjamente ale membranei celulare, prin intermediul modificărilor citoscheletale care sunt legate de implicarea caveolinei-1. Alături de endocitoza mediată de vezicule acoperite cu clatrina, transportul caveolar internalizează o serie de macromolecule și agenți patogeni dintre care cel mai bine descris este virusul simian 40 (SV-40). Astfel, folosind această cale de transport, evita degradarea lizozomală. Virusurile, bacteriile și toxinele de dimensiuni mari sunt internalizate în zone bogate în caveole, printr-o cale non-clatrina dependentă de colesterol, existând o directă corelație între down-reglarea expresiei caveolinelor și procesul de pătrundere intracelulară a agenților patogeni61-67.

3.3.2. Caveolele și homeostazia colesterolului

Relația dintre colesterol și caveolină este complexă și cu multe implicații în fiziologia celulară. Rothberg și colaboratorii (1993) au demonstrat pentru prima dată importantă colesterolului pentru stabilizarea structurii caveolare, care prin legarea de agenți cu afinitate pentru colesterol, filipină sau nistatină, au dus la aplatizare și dezasamblarea oligomerilor formați din caveoline și cavine. Expresia caveolinei-1 și distribuția celulară este în strânsă relație cu nivelul de colesterol prin modularea transcrierii în zona promoter a caveolinei-1 dar și prin stabilizarea proteinei. De ce există diferențe tisulare între densitatea caveolelor? Din perspectiva legăturii strânse caveoline-colesterol, acestea funcționează ca "rezervor" de sfingolipide și colesterol, furnizându-le la nevoie plutelor lipidice. Se poate spune că celulele de origine animală nu folosesc doar picăturile lipidice pentru a depozita lipide ci și caveole61.

Caveolele sunt abundente la nivelul țesutului adipos fiind implicate în reglarea componentelor lipidice membranare. Caveolina-1 interacționează cu colesterolul, acizii grași și picăturile lipidice (depozite intracitoplasmatice de acizi grași și trigliceride) în culturi celulare dar și in vitro. Studiul celulelor cu expresie scăzută sau mutantă a caveolinei-1 a demonstrat că absența proteinei scade sinteza de colesterol și crește cantitatea de acizi grași esterificați. Modele murine trangenice cav-1-/- au țesutul adipos puțin reprezentat fiind rezistenți la obezitatea indusă prin dietă hiperglucidică. La polul opus, creșterea nivelului cav-1 stimulează intrarea acizilor grași în celulă și transportul colesterolului (figura 1.8.). Acest proces este important in vivo pentru că regenerarea hepatică cu implicații în supraviețuirea șoarecilor după hepatectomie necesită caveolina-151-53.

3.3.3. Semnalizarea celulară și caveolele

Caveolele au multiple roluri la nivel celular descrise mai sus, însă modularea semnalizării celulare este una dintre cele importante (figura 1.8.). Lisanti și colaboratorii au indentificat în microdomeniilor caveolare purificate biochimic o varietate de molecule de semnalizare precum tirozin kinaza Src-like sau proteine G heterotrimerice53. Astfel, caveolele acționează ca și domenii de ancorare pentru numeroși receptori de suprafață, care după activare sunt recrutați către aceste structuri facilitând astfel un răspuns specific și rapid. A fost propusă “ipoteza semnalizării caveolare” în care proteina are un rol dual de reglator al traducerii semnalului dar și de proteină de ancorare, concentrând receptori la acest nivel: receptorul pentru bradikinină B2, factorul de creștere epidermala (EGF), factorul de creștere derivat din plachete (PDGF), dar și eNOS, MAP-kinazele, Src-kinazele, h-RAS, proteinele G, protein kinaza C (PKC)67-68.

Esențial în înțelegerea implicării caveolelor în semnalizare este interacțiunea dintre domeniul bine conservat al caveolinei (aa. 82-101) numit domeniul “scaffold" și regiunile de legarea a caveolinei de la nivelul proteinelor implicate în semnalizare, descrise mai sus. Dintre cele 3 isoforme, cav-1 și cav-3 sunt cele mai asemănătoare existând însă o diferența importantă între cele două: fosforilarea cav-1 la nivelul Tyr-14. La nivel endotelial, fosforilarea duce la modificarea domeniului NH2 și astfel recrutează proteine de semnalizare că răspuns la stresul osmotic și mecanic (shear stress). Importanța caveolinei-2 în semnalizare nu este suficient definită, regiunea CSD fiind mult mai diferită. Caveolina-1 are un efect inhibitor asupra majorității proteinelor de semnalizare cu care interacționează, însă suprinzător, în cazul receptorului insulinic are un efect stimulator . În privința caveolinei-3, această modulează receptori și molecule de semnalizare având ca particularitate complexul distrofine-glicoproteine. Interacțiunea dintre caveolina-1 și eNOS este bine cunoscută și caracterizată. În condițiile unei celule nestimulate, cele două sunt asociate la nivel caveolar, împiedicând legarea calmodulinei și generarea oxidului nitric. Creșterea expresiei caveolinei-1 inhibă activitatea eNOS fără să crească formarea de caveole, mecanismul propus fiind de eliberare a caveolinei-1 în anumite condiții și la anumiți stimuli celulari.

Apariția ipotezei semnalizării caveolare descrisă mai sus sugerează că absența caveolelor ar duce la o distribuție aleatorie și dezordonată a proteinelor de semnalizare. Mai mult, dacă aceptăm această ipoteză, cum reușesc alte celule cărora caveolina-1 le lipsește fie în mod natural (limfocitele) fie prin modificări de inginerie genetică (șoarecii cav-1 -/-) să regleze semnalizarea celulară? Deși studiile pe animale transgenice au demonstrat importanța caveolelor, aceste modele sunt viabile și fertile, prin urmare sunt necesare mai multe date care să susțină ipoteza caveolinei-1 ca și signalosom64-65.

3.3.4. Alte funcții ale caveolelor

Caveolina-1 are rol antiproliferativ acționând ca și supresor tumoral (Lisanti și colab, 1995; Engelman și colab., 1997) atât în culturi celulare cât și la animalele de laborator. Proteinele localizate și inhibate de cav-1 dintre care reamintesc EGFR, Her2/Neu, componente din cascada Ras/p42/44 MAP kinaza sunt extrem de importante și implicate în semnalizarea pro-proliferativă și anti-apoptotica (Zundel și colab., 2000; Yamamoto și colab., 1999). Mai mult, genele Cav-1 și Cav-2 se află pe cromozomul 7 în apropierea unei regiuni (7q31.1) care suferă deleții ducând la apariția multor cancere de origine epitelială: cancer de sân, colorectal, prostatic și ovarian (Kerr și colab., 1996). A fost observată scăderea și chiar absența caveolelor în cancere de origine epitelială, transcripția caveolinelor fiind downreglata, astfel caveolina-1 poate să fie un factor important în diagnosticul și tratamentul neoplaziilor.

Folosind modele animale transgenice și celule cav-1 -/-, s-a studiat rolul în mecanosensibilitate, mai ales în celulele endoteliale și musculare. Celulele musculare netede în condiții de întinderi ciclice își redistribuie rapid caveolina-1 către zonele de contact intercelular, activând PI3K-AKT, MAPK, ERK și kinaza Src67. Acest răspuns este inhibat în cazul scăderii tranzitorii a caveolinei-1 în mușchiul neted K.O. pentru cav-1. La nivel endotelial, stressul cronic sau “shear stress” activează calea ERK dependentă de caveole, cu dezasamblarea structurilor ce duce la aplatizarea membranei ca răspuns la creșterea tensiunii superficiale, urmând ca în cazul dispariției stimulului acestea să se reorganizeze membanar (Sens și Turner, 2012).

Densitatea caveolară scade în liniile celulare imortalizate, fiind absente în celulele aflate în suspensie. Atunci când celulele își pierd adeziunea de substrat, endocitoza mediată de caveole joacă un rol important. În primul rând, detașarea fibroblastelor declanșează internalizarea GM1 prin endocitoza dependentă de caveolină ce este fosforilată la nivelul Tyr-14. Conluzionând, există studii care arată puternică legătură între endocitoza mediată de caveole și reglarea adeziunii celulare, însă rămâne neclar cum se corelează această informație cu aparenta dezvoltare normală a șoarecilor transgenici cav-1 -/-, cărora le lipsesc în totalitate aceste structuri caveolare.

Figura 1.8. – Principalele roluri ale caveolelor

(adaptat după Razani și colab., Elsevier, 2001)

3.4. Caveolina-1 la nivel cerebral

3.4.1. Rolul caveolinei-1 în neurogeneză

Plecând de la celulele precursoare nervoase care apar în girul dentat și în zona subventriculara, a fost studiată caveolina-1 în relație cu procesul de dezvoltare neuronală. Șoarecii cav-1 K.O. prezintă o creștere în numărul de noi neuroblaști formați, prin comparație cu șoarecii wild-type de aceeași vârstă. Însă in vitro blocarea caveolinei-1 duce la diferențierea oligodendrogliilor din celulele nervoase precursoare (Head și colab., 2010). La polul opus, creșterea nivelului caveolinei-1 stimulează diferențierea astrogliilor (Refolo și colab., 2000). Caveolina-1 mediază semnalizarea receptorului glucocorticoid și influențează diferențierea celulelor precursoare neuronale fie prin reglarea ciclului celular fie prin migrarea către poziția lor finală la nivelul cortexului cerebral (Dislich și Lichtenthaler, 2012).

3.4.2. Rolul caveolinei-1 în îmbătrânirea neuronală

Implicarea caveolinelor în îmbătrânirea celulară se studiază de mai bine de 10 ani (Cho și colab., 2005). Din ce în ce mai multe studii arată importanța caveolinei-1 în reglarea anumitor procese biologice precum creșterea, migrarea celulor, controlul nivelul antioxidanților mitocondriali dar și senescența celulară (Baker și Tuan, 2013). Celulele și țesuturile mature exprimă un nivel crescut al caveolinei, ce crește odată cu vârstă. Mai mult, supraexpresia caveolinei-1 în vitro duce la îmbătrânire prematură. Pe de altă parte, există studii care arată că pierderea expresiei caveolinei-1 favorizează apariția neurodegenerării precoce în creierul de șoarece. Suprinzător, modele animale cav-1 K.O. au arătat o scurtare a duratei de viață, din cauza funcției caveolinei-1 ca supresor tumoral, aceștia dezvoltând mult mai rapid tumori (Muller și colab., 2003). Cho și colaboratorii au propus că și explicație "Gate theory of aging" unde caveolina-1 acționează ca și paznic în modularea căilor de semnalizare, jucând un rol principal în determinarea fenotipului senescent .

Compoziția membranei celulare se modifică odată cu îmbătrânirea, expresia și distribuția caveolinelor este modificată. Țesuturile prezintă variații în ceea ce privește îmbătrânirea fiziologică: miocardul are un nivel crescut de caveoliăa-1 în fracțiunile membranare, spre deosebire de mușchiul neted, care nu își modifică expresia în caveolină-1 sau cavine (Lowalekar și colab., 2012); celulele endoteliale prezintă un nivel crescut de caveolină-1 (Ratajczak și colab., 2003).

Creierul prezintă anumite particularități în ceea ce privește îmbătrânirea celulară și expresia proteinelor caveolare. Caveolina-1 este prezentă în neuroni, mai ales neuronii piramidali ai cortexului motor, dar și în cortexul parietal, stratum oriens și stratum radiatum din hipocamp, având o expresie scăzută față de endoteliu sau fibroblaste (Kang și colab., 2006). Celulele gliale exprimă caveolina-1 însă la microscopie electronică caveolele nu au putut fi identificate, excepția fiind astrocitele. Supraexpresia caveolinei-1 la nivel neuronal duce la scăderea ramificațiilor neuronale însă creștereaa grosimii ramificațiilor (Gaudreault și colab., 2005). Șoarecii sănătoși cu vârste peste 18 luni au o expresie crescută a caveolinei-1 la nivel hipocampic, similară cu cea a pacienților cu boală Alzheimer (Gaudreault și colab., 2004). Cerebelul însă nu prezintă modificări la pacienții cu patologie neurodegenerativă dar nici în condiții de îmbătrânire fiziologică. Dacă la nivelul hipocampului se downreglează caveolina-1 are loc o reducere a plasticității sinaptice. Din această perspectivă, creșterea expresiei caveolinei-1 poate fi interepretată ca un mecanism compensator prin care organismul încearcă să recupereze funcțiile pierdute (Liu și colab., 2013). Din perspectiva transmiterii sinaptice la nivelul neuronilor glutaminergici, caveolina-1 interacționează și cu receptorii glutaminergici astfel tratamentul cu glutamat, kainat sau AMPA duce la creșterea expresiei caveolinei-1, sugerând astfel că activarea acestor receptori reglează expresia neuronală a proteinei (Head și colab., 2007).

3.5. Corelații între caveolina-1 și boala Alzheimer

Creșterea nivelului caveolinei-1 se corelează cu inducerea senescenței celulare fiind una din modificările ce apar în procesul de îmbătrânire la nivel cerebral. Deși caveolina-1 a fost pusă în legătură până acum cu senescența, ultimele studii sugerează o strânsă legătură între cav-1 și capacitatea de a exercita un rol de neuroprotecție. Mai mult, șoarecii transgenici pentru gena caveolinei-1 au la nivelul creierului modificări asemănătoare celor care apar în boala Alzheimer. Deasemenea, la modelele cav-1 K.O. există un deficit al plasticității sinaptice, cu scăderea reactivității post-leziune, prin urmare propun caveolina-1 ca factor de neuroprotecție. Din această perpsectivă, creșterea caveolinei-1 în creierul bătrân este o măsură de protecție, un mecanism compensator și nu o măsură directă a procesului în sine41-45.

Proteina precursoare a amiloidului (APP) este o proteină membranară care poate fi metabolizată pe două cai: o cale fiziologică, ce generează fragmente neurotrofice solubile, și o cale patologică, ce generează peptide β-amiloid ce agregă la nivel extracelular, formând plăcile senile din boala Alzheimer. Regiunile membranare bogate în colesterol, cum sunt caveolele, favorizează metabolizarea APP prin calea patologică cu generarea de β-amiloid. Modelul murin cav-1 -/- exprimă caracteristici ale bolii Alzheimer cu un nivel ridicat de β-amiloid și proteine tau hiperfosforilate la nivelul hipocampului, modificări cevrebrovasculare și de astroglioă având un debut precoce.

Neurodegenerarea este un proces multifactorial, alterările patologice pot fi prezente fără să existe însă o manifestare clinică, de aici și dificultatea înțelegerii fiziopatologiei neurologice. Deși există numeroase modele animale bine definite pentru studiul bolilor neurodegenerative, necesitatea dezvoltării altora a dus la apariția șoarecilor caveolin-1 knockout. Astfel, aceștia sunt primul model non-mutațional care datorită disfuncțiilor endoteliale pot fi studiați în legătură cu demența vasculară dar mai ales cu boala Alzheimer prin depozitele cerebrale specifice. Date recente legate de proteina precursoare a amiloidului și modificările expresiei la acești șoareci, aduce argumente în favoarea acestui model multifactorial pentru demența Alzheimer.

3.6. Interacțiunea dintre APP și caveolina-1

În cazul studiilor privind senescența, atât în culturile de fibroblaste cât și în țesuturile șoarecilor bătrâni (creier și splină), se observă creșterea expresiei proteinelor din familia caveolinelor (Part și colab., 2000; Wheaton și colab., 2001). Prin studii de microscopie electronică, proteina precursoare a amiloidului este exprimată cu precădere în fracțiuni membranare, mai ales în zonele bogate în colesterol unde se localizează peptidul Aβ (Lee și colab., 1998; Simons și colab., 1998). Se cunoaște că metabolizarea are loc la nivelul plutelor lipidice care influențează producția peptidului neurotoxic. Într-un studiu din 20061, expresia caveolinei-1 crește odată cu vârstă în neuronii din creierul șoarecilor bătrâni, fiind co-localizată la nivel caveolar împreună cu APP. Asocierea APP cu caveolina-1 are loc la nivelul porțiunii C-terminale intracitoplasmatice, o regiune alcătuită din 20 de aminoacizi. Mai mult, creșterea caveolinei-1 duce la activarea procesul de clivaj enizmativ al β-secretazei. Ikesu și colaboratorii arată că in vivo caveolele și interacțiunea directă cu caveolina-1 joacă un rol important în procesul de clivare a APP mediat de α-secretază la nivelul suprafeței celulare. De asemenea, caveolina-3 reglează direct procesarea APP prin creșterea activității secretazei în astrocite (Nishiyama și colab., 1999).

Dezvoltarea bolii Alzheimer este complexă cu un proces biologic de neurodegenerare ce nu poate fi explicat printr-un model liniar de acumulare a petidului Aβ. Din punct de vedere al argumentelor cu substrat genetic, alterarea expresiei genice pentru APP, PS1 și PS2 duc la apariția formei familiale a BA cu debut precoce. Formele sporadice apar clinic după 65 de ani, peste 12 gene sunt considerate a fi factori de risc, cel mai importantă fiind APOE care transportă Aβ. Se încearcă susținerea ipotezei amilodogenice însă au fost descoperite persoane care deși prezintă la examinarea PET amiloid la nivel cerebral nu dezvoltă niciodată demență (25-30%). În ceea ce privește modele murine, s-a observat că dezvoltă depozite încă de la 4 luni cu o performanță scăzută la testul Morris, însă fără modificările cognitive care pot fi corelate cu BA. Imunizarea activă sau pasivă împotriva Aβ îmbunătățește comportamentul șoarecilor, acest lucru nefiind observat însă studiile clinice umane, deși plăcile de amiloid dispar într-o proporție mare. Deoarece demența Alzheimer evoluează cu o pierdere progresivă a integrității rețelei neuronale, o scădere graduală a densității sinaptice, cu atrofie până la pierdere difuză nervoasă, există argumente pentru alte teorii: tauopatie, o deficiență a autofagiei și de pierdere a funcției lizozomale, alterarea homeostaziei Ca2+ cu activitate excitotoxică și chiar cu alterarea controlului ciclului celular, toate contribuind în cele din urmă la evenimentul central: neuroinflamația.

CAPITOLUL IV

4.1. Premise și ipoteze de lucru

Neurodegenerarea este un termen definit ca "pierdere neuronală" fiind însoțită de manifestări clinice precum tulburare cognitivă și a afectului. Însă, variabilitate leziunilor histopatologice la pacienții diagnosticați cu demență a dus la aprofundarea mecanismelor moleculare de apariție a apoptozei neuronale. Granița între îmbătrânirea fiziologică a creierului și procesele neurodegenerative este dificil de delimitat din perspectivă cognitivă. Existența noțiunii de “rezervă cognitivă” ce presupune abilitatea pacienților de a contrabalansa pierderea neuronală prin folosirea unor achiziții cognitive preexistente sau a unor abordări diferite, face dificil diagnosticul precoce al demenței. Aceste tulburări cognitive sunt o cauză de morbi-mortalitate importantă, cu incidență și prevalență crescute odată cu îmbătrânirea populației. Una din cele mai frecvente este boala Alzheimer sporadică, existând un interes mărit în cercetarea fundamentală cu scopul edificării etiologiei bolii. Mi-am propus pe parcursul acestei lucrări să abordez mecanismele molecular implicate în neurodegenerare din perspectiva teoriei căii amiloidului în cadrul unui model murin transgenic non-mutațional pentru boala Alzheimer. Premisele de la care am pornit în elaborarea ipotezelor și a designului experimentelor sunt:

Expresia caveolinei-1 influențează procesul de neurodegenare și de îmbătrânire celulară. Nivelul caveolinei-1 crește odată cu îmbătrânirea celulară, existând studii ce raportează această modificare de expresie atât în culturile de fibroblaste cât și la analiza țesutului cerebral. În hipocampul șoarecilor sănătoși se păstrează creșterea expresiei caveolinei-1 cu vârsta (20 luni vs. 4 luni), modificări ce se mențin și în creierul prelevat post-mortem (Gaudreault și colab., 2004; Kang și colab., 2006). Studiile in vitro privind manipularea genică a caveolinei-1 au arătat că supraexpresia proteinei induce un fenotip asociat cu senescență precoce. În mod surprizător, scăderea expresiei caveolinei-1 accelerează procesul de neurodegenerare ducând la scăderea densității sinapselor, îmbătrânire prematură neuronală dar și susceptibilitate crescută la leziuni ischemice post-reperfuzie (Head & Patel, 2010).

Teoria amiloidogenică a bolii Alzheimer are în centru clivarea proteinei precursoare a amiloidului, cu APP având rol neurotrofic și neuroprotector. APP are un rol cheie în stabilirea și păstrarea arhitecturii neuronale. Încă din stadiul embrionar, sAPPα și full-length APP contribuie la proliferarea, diferențierea și migrarea celulelor stem neuronale până la formarea de sinapse în sistemul nervos central și periferic. Expresia APP este crescută în timpul diferențierii neuronale dar și post-leziuni neuronale cu scop reparator (Zheng și Koo, 2006). Din punct de vedere genetic, alterarea genelor pentru APP, PS1 și PS2 duc la forma familială a BA cu debut precoce. Formele sporadice apar cu debut clinic după 65 de ani, peste 12 gene fiind considerate a fi factori de risc, cea mai importantă APOE. Având în vedere că APP este o proteina implicata în răspunsul celulelor în condiții de stress, în contextul bolii Alzheimer este posibil ca cel puțin unul din mecanismele fiziologice să fie alterat ducând la neurodegenerare precoce.

Ipotezele de la care am plecat în efectuarea experimentelor sunt:

Existența unei corelații directe între caveolina-1 și proteina precursoare a amiloidului.

Șoarecii knockout pentru caveolina-1 sunt un model non-mutațional util pentru studiul bolilor neurodegenerative cum este boala Alzheimer.

4.2. Obiective

Plecând de la premisele de mai sus mi-am stabilit următoarele obiective:

Investigarea modificărilor nivelului proteinei precursoare a amilodului în șoarecii knockout la caveolina-1, ca posibil model non-mutațional de neurodegenerare.

Corelarea modificărilor la nivel proteic cu cele de expresie genică.

Investigarea modificărilor de fosforilare a APP în șoarecii knockout la cav-1, pentru a stabili o eventuală corelație cu pierderea efectului inhibitor al caveolinei pe multiple căi de semnalizare.

4.3. Materiale și metode

4.3.1. Animale de laborator

Au fost folosite două loturi de șoareci achizițonate din laboratoarele Jackson: șoareci C57BL/6 și șoarecii Cav1tm1Mls/J (cav-1 -/-). Tulpina Black 6 este cea mai folosită în cercetare în momentul de față, fiind primul animal de laborator al cărui genom a fost secvențiat în totalitate. Șoarecii din acest lot au o durată lungă de viață cu o susceptibilitate scăzută la dezvoltarea multor tumori, însă pot exprima multiple mutații in funcție de stimulii la care sunt supuși. Aceste modele animale pot dezvolta în timp obezitate indusa prin dietă, diabet zaharat de tip 2 și ateroscleroză, patologii dependente de vârstă dar prezintă hipoacuzie cu debut rapid. Șoarecii K.O. pentru cav-1 sunt homozigoți pentru gena mutantă a cav-1 ce conține mutații țintite la nivelul exonilor 1 și 2, inserată apoi în blastocist de șoarece C57BL/6. Lotul de șoareci modificați genetic exprimă hiperproliferare vasculară, cu alterarea metabolismului lipidic cu valori ridicate ale trigliceridelor și acizilor grași în sânge. Șoarecii tineri (3-6 luni) knockout pentru gena cav-1 exprimă modificări specifice bolii Alzheimer, cu depozite crescute de β-amiloid și proteină tau. Având în vedere modul în care au fost obținuți șoarecii transgenici, drept control am utilizat lotul C57BL/6. Animalele au fost crescute într-un ciclu zi-noapte de 12 ore, în condiții de mediu controlate, sacrificate la vârste diferite (6 luni, 12 luni, 13 luni, 1 an și 11 luni) conform normelor de etică ale manipulării animalelor de laborator ale Universității de Medicină Generală și Farmacie „Carol Davila‟ București.

4.3.2. Lizatul de proteine

Am utilizat un omogenizator Potter-Elvehjem, format din piston de teflon și eprubetă din sticlă între care există un spațiu foarte mic (~0,2mm), pentru țesuturile recoltate de la cele două loturi de șoareci (creier, cerebel, hipocamp, țesut muscular). De aici încolo se lucrează pe gheață, suspensia se transferă într-un eppendorf și se centrifughează 5 minute la 3000 rpm, se aruncă supernatantul, iar peste pelletul rezultat se adaugă 250 µL Buffer urmat de resuspensie. Am folosit mai multe tipuri de Buffer pentru a obține o extracție mai bună, în funcție de proteina pe care vrem să o evidențiem la Western blot. Peste suspensia de celule în Buffer se adaugă 10% inhibitori de proteaze. Se resuspendă bine și se adaugă 10% în volum Triton X (20%) și 10% volum NP40 (20%), se vortexează și se lasă 15 minute pe gheață. Se centrifughează 10 minute la 11000 rpm și se colectează supernatantul pentru dozarea de proteine.

4.3.3. Determinarea concentrației de proteine

Am realizat determinarea concentrației de proteine în probele folosite ulterior la Western Blot prin utilizarea metodei colorimetrice folosind reactivul PierceTM 660nm Protein Assay. Se folosește o placuță cu godeuri în care se pun 10 µL de lizat proteic peste care se adaugă 150 µL din soluție, urmat de 10 minute incubat la temperatura camerei pe agitator. Rezultatul este o soluție de culoare albastră a cărei intensitate depinde de concentrația de proteine, cuantificată apoi prin citire la spectofotometru. Rezultatele citirii la 650 nm sunt comparate cu o curbă standard de diluții ale unei soluții de albumină serică bovină 2mg/ml (diluțiile sunt de 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml și un blanc de 0 mg/ml). Valorile cititite sunt apoi calculate pe baza unei ecuații de ordinul I, obținută prin extrapolarea graficului curbei standard.

4.3.4. Western Blot (WB)

Lizatele de proteine obținute prin metodele de mai sus au fost supuse mai multor situații: 1) denaturate cu ajutorul unui tampon de încărcare denumit Laemmli ce conține 60 mM Tris-Cl pH 6.8, 2% SDS, 10% glicerol, 5% β-mercaptoetanol, 0.01% albastru de bromofenol urmat de fierbere timp de 10 minute; 2) condiții de non-denaturare prin folosirea unui tampon de încărcare Laemmli fără β-mercaptoetanol și fără fierberea probelor. Am încărcat cantități egale de proteină conținută în 20 μl/godeu, diferența între volumul de lizat ce conține cantitatea dorită de proteină și volumul de încărcat se completează cu soluție tampon Laemmli 2X. Probele din prima situație sunt fierte la 100 °C timp de 10 minute pentru denaturare, apoi urmează încărcarea godeurilor și a standardului de masă. Gelurile au fost turnate la o concentrație de 10% si 7,5% acrilamidă pentru caveolina-1 și respectiv pentru proteina precursoare a amiloidului (tabel II și tabel III), urmată de migrarea la 0.02 A/ gel timp de 2h in medie.

Tabel II – Obținerea gelurilor de acrilamidă pentru migrarea proteinelor

Tabel III – Obținerea gelului de încărcare a proteinelor pentru Western Blot

Tamponul pentru gelul de migrare conține 1.5M Tris-HCl la ph 8.8 iar cel pentru gelul de încărcare 0.5 M Tris-HCl la ph 6.8. Electroforeza și separarea proteinelor s-a realizat în tampon de migrare (Tris 0,05M 6,06 g , Glicină 0,384M 28,8 g, SDS 0,1% 1g sau 5 ml din solutie SDS 20%), folosind sistemul de electroforeză de la BioRad Mini Protein (figura 1.9.).

Transferul s-a realizat timp de 1h la 100 V pe membrane de nitroceluloză și PVDF, care sunt blocate în albumină serică bovină (BSA) 5% în TBS timp de 1h la temperatura camerei pe agitator. Am incubat cu anticorpul primar (Anti proteină precursoare a amiloidului în concentrație de 1:20.000, Anti proteină precursoare a amiloidului fosforilată în concentrație de 1:1.000, Anti β-tubulina în concentrație de 1:1.000, Anti Caveolină-1 în concentrație de 1:1.000, Anti GAPDH 1:1.000) peste noapte, la 4°C, iar a doua zi se spală de trei ori câte 10 minute cu TBS +TWEEN 0,1 % și o dată cu TBS simplu 10 min. Am incubat cu anticorpul secundar în TBS +TWEEN 0,1% timp de 1 oră (capră anti iepure sau capră anti șoarece ambele în concentrație de 1:2.000). Am spălat membranele de trei ori a câte 10 minute cu TBS +TWEEN 0,1% și o dată cu TBS simplu 10 min, apoi am incubat 5 minute în soluție de chemiluminiscență (Thermo si Licor) urmată de scanarea intensității benzilor folosind C-DiGit.

Figura 1.9. – Sistem de electroforeză pentru Western Blot

4.3.5. Electroforeză nativă (EN)

Proba obținută din țesutul cerebelos provenit de la animale de laborator (șoareci de laborator tulpina C57Bl/6 și tulpina Cav1tm1Mls/J) a fost supus protocolului de EN. Peletul celular se resuspendă în tamponul de separare a fracțiunilor celulare, 250mM sucroză, prin ultracentrifugare. Soluția resuspendată este supusă unor centrifugări repetate la viteze din ce în ce mai mari: 700 G pentru separarea fracțiunii nucleare, 10.000 G pentru îndepărtarea componentelor citosolice, iar supernatantul rezultat se centrifughează 100.000 G la 4°C pentru peletarea membranelor celulare. Complexele proteice se extrag din membrane folosind un tampon ce conține imidazol 50mM, NaCl 50 mM, acid 6-aminohexanoic 2mM, triton X-1000 1%, la care se adaugă 1% cocktail de inhibitori de proteaze. Proba astfel obținută se va separa în complexe proteice mari prin migrare pe gel de poliacrilamidă, conform tabelul IV de mai jos:

Tabel IV – Gel electroforeză nativă

Separarea electroforetică se realizează pe gheață, la 10 mA/gel, constant, timp de 2-4 ore, într-un tampon de migrare format din 50mM tricină și 7,5 mM imidazol, ajustat la pH 8-10 cu granule de NaOH (0,8 g pentru 0,1 unități de pH). După migrare, gelul se pune la transfer în tampon cu rețeta de mai sus, pe membrană de PVDF sau nitroceluloză, la 100 mA constant, timp de 20-22 ore, pe gheață.

Membrana de transfer se blochează timp de 30 de minute – 1 oră în soluție de blocare (5% soluție de albumină serică bovină), apoi se incubează cu anticorpul primar anti proteină precursoare a amiloidului porțiunea C-terminal în concentrație de 1:20.000 si anticorpul primar anti caveolină-1 în concentrație de 1:1.000. Incubarea cu anticorpul primar durează minim 12 ore și este urmată de 4 spălari consecutive a câte 10 minute în TBS-Tween 20, concetrație 0,1%, iar ultima în TBS simplu. Urmează o oră de incubare în anticorp secundar cuplat cu HRP anti iepure în concentrație 1:2.000 și relevare cu soluție ECL prin scanare cu scannerul cDigit.

4.3.6. Densitometria optică și analiza statistică

Analiza semicantitativă a WB a fost realizată utilizând softul QuantityOne (BioRad). Rezultatele citirii densității optice (OD) reprezintă media a trei experimente. Pentru analiza statistică am utilizat softul SPSS, iar ca test de varianță, de obicei am ales LSD, cu p semnificativ statistic la valori mai mici de 0,05. Atât testul de varianță cat și valoarea p se regăsesc în tabelele statistice importate din SPSS și prezentate în text, după graficului corespunzător.

4.3.7. Extracție de ARNmesager

Protocolul este optimizat conform specificațiilor kitului de extracție ARN. Am lucrat în mediu fără RNaze – în hota cu flux laminar, cu mănuși chirurgicale și după curățarea prealabilă a suprafețelor cu NaOH 0,5M și alcool etilic 70%. Soluțiile (altele decât cele din kit) au fost pregătite cu apa DEPC 0,1%, iar timpul de izolare a ARN-ului a fost cât mai scurt posibil. Am prelevat steril țesutul, am spălat rapid în PBS rece și am adăugat 5-10 mg de țesut în 300 µl soluție de liză, omogenizând rapid. Etapele constau în precipitarea proteinelor și ADN-ului folosind soluția oferită în kit, omogenizare și centrifugare la 13.000-16.000 G timp de 3 minute. Proteinele și ADN-ul vor forma un pelet alb, aderent. Se pipetază supernatantul într-un eppendorf de 1,5 ml care conține 300 µl isopropanolol 100% și se omogenizează întorcând tubul cu susul în jos de 25-30 de ori până la amestecare completă. Urmează o nouă centrifugare la 13.000-16.000 G timp de 3 minute. ARN-ul va sedimenta ca un pelet translucent. Se elimină supernatantul și se usucă tubul pe hârtie de filtru curată, se adaugă 300 µl etanol 70% și se întoarce tubul de câteva ori pentru a spăla peletul și se centrifughează la 13.000-16.000 G timp de 1 minut, eliminând apoi etanolul. După ce se usucă la aer 10-15 minute, se poate păstra la -80°C până la utilizare, când va trebui rehidratat, sau se va hidrata prin adăugarea a 50 µl soluție de hidratare, pe gheață, timp de 30 minute. Înainte de utilizare se vortexează și puls-spin.

4.3.8. Dozarea ARN

Pentru dozarea ARN-ului am folosit sistemul Qubit 2.0 de la Invitrogen și kitul de dozarea ARN BR kit. Sistemul folosește o metodă fluorimetrică de dozare, raportată la o soluție standard furnizată cu kitul de măsurare. Pe scurt, după calibrarea aparatului, se pregătește soluția de lucru cu 198 μl tampon si 2μl reactiv fluorescent. Din soluția de lucru se iau 199 μl în care se adaugă 1μl solutie de ARN. Această mixtură se pune în cititor și aparatul va calcula concentrația în μg/ml.

4.3.9. Reverse Transcriptase Polimerase Chain Reaction (RT-PCR)

RT-PCRa fost efectuat imediat după extragerea ARN-ului, pentru a scădea riscul de contaminare cu RNAze și pierderea de material. Am folosit pentru experiment un cycler preîncălzit la 65 °C și am combinat următoarele într-un tub de 0,2 ml:

a. până la 5 µg de ARN (x µl ARN)

b. primeri (50ng/ µl random hexamers sau 50µM oligo (dT)20) – 1 µl

c. tampon de spiralizare – 1 µl

d. apă RNA/DNA free – până la 8µl

Apoi am incubat proba în cycler la 65 °C 5 minute, apoi imediat pus pe gheață cel puțin 1 minut. După colectarea conținutul tubului prin centrifugare scurtă, în tubul ținut pe gheață, am adăugat următoarele :

a. 2x first strand reaction mix – 10µl

b. SuperScript™ III/RNaseOUT™ Enzyme Mix 2 μl

Am vortexat scurt și centrifugat 1 minut la viteză mare, apoi 5–10 minute la 25°C, urmat de 50 min la 50°C. Am terminat reacția la 85°C pentru 5 minute, apoi am lăsat la răcit pe gheață. cDNA obținut l-am păstrat la -20°C până la utilizare.

Volumul care conține 1 µg ARN se combină cu 6µL tampon de eliminare a ADN-ului genomic și apoi se adaugă apă până la un volum final de 14µl. Amestecul astfel obținut se incubează la 37°C 5 minute, apoi reacția se oprește prin incubare pe gheață cel puțin 1 minut. Se adaugă 6 µl de amestec prestabilit de reacție pentru un volum final de 20 µl și se incubează la 42°C 15 minute, apoi se oprește reacția prin încălzire la 95°C timp de 5 minute.

4.3.10. Q-RT PCR (semicantitativ)

S-a făcut qRT pornind de la ADNul complementar (ADNc) obținut prin metoda descrisă mai sus din ARN-ul extras din creier de șoarece control și K.O. pentru cav-1, utilizând iCycler setat pentru următoarele cicluri :

Ciclul 1:( 1X) pas 1: 95.0șC timp de 05:00 minute ;

Ciclul 2:(35X) pas 1: 95.0șC, 30 sec, pas 2: 53.0șC, 30 sec, pas 3: 72.0șC, 30 sec.

Ciclul 3:( 1X) pas 1: 72.0șC, 05:00 minute ;

Ciclul 4:( 1X) pas 1: 4.0șC 30:00 minute.

Primerii folosiți au fost:

APP mouse fwd TGG-AAT-CTC-TGG- AAC-AGG-AA

APP mouse reverse: ATG-CTT-TAG-GGT-GTG-CTG-T

În fiecare godeu din placuța pentru control S18 s-au combinat următoarele, pentru un volum total de 20μL:

– 1 μL ADNc;

– 1uL primer mix de S18;

– 10μL Sybr Green qPCR master mix;

– 8μL apă RNA, DNA pură.

În fiecare godeu din placuța pentru expresia APP s-au combinat urmatoarele, la un volum total de 20 μL:

– 1μL ADNc;

– 0,75 μl primer Forward APP;

– 0,75 μl primer Reverse APP;

– 10μl Sybr Green qPCR master mix;

– 7,5μl apă RNA, DNA pură.

4.4. Rezultate

4.4.1 Analiza nivelului caveolinei-1 și a proteinei precursoare a amiloidului în creierul șoarecilor C57Bl/6J

În sistemul control, expresia proteică a caveolinei-1 crește semnificativ cu vârsta, față de cea a proteinei precursoare a amiloidului (APP) a cărei schimbare este modestă.

Am testat în Laboratorul de Medicină Celulară și Moleculară al Institutului Național de Patologie V. Babeș, creierul recoltat de la cele două tulpini de șoarecii cu vârste diferite. Determinarea concentrației de proteine din probele obținute a fost efectuată conform protocolului de la capitolul “Materiale și metode”. Tabelul V prezintă valorile curbei standard, care au dus la generarea formulei de calcul a concentrației de proteine (figura 1.10. ) care a fost aplicat valorilor spectofotometrice generate de probe (tabelul VI ).

Figura 1.10. – Curbă standard de BSA

Tabel VI – Determinarea concentrațiilor proteice din lizatul de cerebel și parietal

Pentru confirmarea asocierii caveolinei-1 cu procesul de imbătrânire raportat în literatură am analizat pentru început expresia cav-1 în creierul murin al șoarecilor C57BL/6J. Deoarece doresc să folosesc șoarecii ca și control în experimentele viitoare, am testat expresia și variația cu vârsta a APP prin tehnica Western Blot (figura 1.11.).

Figura 1.11. – Testarea expresiei cav-1 și APP în creierul șoarecilor C57Bl/6

Western Blot pentru cav-1 și APP pe lizate de cortex cerebral (20 µg/godeu) obținut de la șoareci C57Bl/6 de 6 luni respectiv 20 de luni, controlul încărcării probelor a fost facut cu β-actină. Am constatat creșterea expresiei cav-1 cât și a APP odată cu vârsta în creierul șoarecilor sănătoși.

Nivelul de caveolină-1 este crescut în cortexul șoarecilor C57Bl/6 de 20 luni față de cel al șoarecilor C57Bl/6 de 6 luni, rezultatele sunt în acord cu ceea ce se regăsește în literatura de specialitate (CAV-1 în figura 1.11.). Am evaluat modificarea expresiei proteinei la acest tip de șoarece deoarece acesta este cel recomandat de crescător și contribuie cu 75% la fundalul genetic al animalului de laborator ce va fi studiat de mine, knockout pentru cav-1. Această tulpină va fi folosită ca și control în urmatoarele experimente.

Nivelul proteinei precursoare a amiloidului crește odată cu îmbătrânirea la șoarecii C57Bl/6, proteina având o expresie mai mare în creierul șoarecilor de 20 de luni prin comparație cu cei de 6 luni (APP în figura 1.11.). Șoarecii sănătoși de 6 luni exprimă APP în lizatul cerebral, însă la cei de 20 luni se observă o creștere a expresiei acestei proteine, fiind corelată cu procesul de îmbătrânire neuronală și depunere extraneuronală a peptidului Aβ.

4.4.2 Analiza modificărilor de nivel al proteinei precursoare a amiloidului în creierul șoarecilor transgenici Cav1tm1Mls/J, comparativ cu tulpina C57Bl/6

Deoarece șoarecele cav-1 -/- are un fundal genetic mixt, controlul C57Bl/6 recomandat de crescător și folosit de mine în toate experimentele contribuie cu 75% la fundalul genetic. Întâi am verificat absența expresiei cav-1 în creierul șoarecilor transgenici, controlul încărcării probelor a fost făcut în paralel cu β-actină (figura 1.12.).

Figura 1.12. – Testarea absenței cav-1 în creierul șoarecilor trangenici cav-1 -/-

Western Blot pentru cav-1 pe lizat de cortex cerebral (20 µg/godeu) obținut de la șoareci C57Bl/6 și Cav1tm1Mls/J, controlul încărcării probelor a fost făcut cu β-actină. Am demonstrat absența expresiei cav-1 în creierul șoarecii transgenici.

Următorul pas a fost testarea expresiei proteinei precursoare a amiloidului în creierul șoarecilor K.O. comparativ cu cei aleși ca și control. Folosind protocolul de Western Blot descris în ”Materiale și metode” am obținut:

Figura 1.13.- Evaluarea expresiei APP în creierul șoarecilor transgenici cav-1 -/-

Western Blot pentru APP pe lizat de cortex cerebral (20 µg/godeu) obținut de la șoareci C57Bl/6 si Cav1tm1Mls/J, controlul încărcării probelor a fost făcut cu β-actină. Am constatat scăderea expresiei APP în creierul șoarecilor transgenici prin comparație cu șoarecii control de aceeași vârstă.

Nivelul proteinei precursoare a amiloidului este scăzut în cortexul șoarecii knockout pentru caveolina-1 față de controlul de aceeași vârstă cu specimenul studiat (figura 1.13.). Am folosit anticorpi anti APP ce recunosc domeniul C-terminal al proteinei, fiind identificată la o greutate de aproximativ 100 kDa. Pasul următor a constat în studiul distribuției modificării de expresie a APP în mod diferențiat pe arii corticale.

4.4.3 Analiza modificărilor cantitative ale proteinei precursoare a amiloidului, diferențiat pe zone corticale, la șoarecii Cav1tm1Mls/J și tulpina control

Trecând de la testarea expresiei de la nivelul întregului creier unde se observă o scădere a expresiei proteinei precursoare a amiloidului, în grupul knockout la nivelul cerebelului se păstrează aceeași scădere prin comparație cu cerebelul șoarecilor C57Bl/6 de aceeași vârstă (1 an și 3 luni). Acestă scădere este păstrată atât la masculi cât și la femele, prin comparație cu controlul de aceeași vârstă și sex. În literatura de specialitate, la nivelul cerebelului nu a fost raportată modificarea expresiei caveolinei-1 cu vârsta, iar în ceea ce privește expresia APP nu există date concludente.

Figura 1.12.– Evaluarea expresiei APP în cerebelul șoarecilor transgenici cav-1 -/-

Western Blot pentru APP și GAPDH pe lizate de cortex cerebelos obținut de la șoarecii cav-1 -/- și șoarecii C57Bl/6 (20µg/godeu). Am constat scăderea expresiei APP la șoarecii K.O. indiferent de sex. Pentru analiza statistică s-a folosit testul ANOVA, cu corecție Bonferroni, iar semnificația statistică (*) a fost atinsă pentru p < 0.05.

Pentru a evalua gradul scăderii expresiei APP în cerebelul șoarecilor cav-1 -/- am efectuat densitometria optică a Western Blot-ului din figura 1.12. , urmată de analiza statistică (Bonferroni test of variance, *p< 0,05), care a arătat o scădere semnificativ statistică a nivelului de proteină precursoare a amiloidului în cerebelul șoarecilor masculi K.O. cât și a femelelor K.O. pentru caveolina-1 față de controlul de aceeași vârstă.

Figura 1.13. – Evaluarea expresiei APP în lobul parietal al șoarecilor transgenici cav-1-/-

Western Blot pentru APP (prima banda) și GAPDH (a doua banda) pe lizate de lob parietal obținute de la șoarecii cav-1 -/- și șoarecii C57Bl/6 (20µg/godeu). Am constat scăderea expresiei APP la șoarecii K.O. odata cu vârsta. Pentru analiza statistică s-a folosit testul ANOVA, cu corecție Bonferroni, însă semnificația statistică nu este atinsă.

În ceea ce privește variația expresiei APP cu vârsta la nivelul lobului parietal, în lotul șoarecilor transgenici pentru gena caveolinei-1 se evidențiaza scăderea nivelul de APP ce se menține la cei de 12 luni cât și la cei de 23 luni. Pentru a evalua gradul scăderii expresiei APP în lobul parietal al șoarecilor cav-1-/- am efectuat densitometria optica a Western Blot-ului din figura 1.13., urmată de analiza statistică (Bonferroni test of variance,*p < 0,05), însă în această regiune nu am obținut o diferență semnificativă statistic între șoarecii K.O. și control de aceeași vârstă.

Figura 1.14. – Evaluarea expresiei APP în cerebel și lobul parietal în cortexul șoarecilor transgenici cav-1 -/- și control

Western Blot pentru APP și GAPDH pe lizate de cerebel și lob parietal obținute de la șoarecii cav-1 -/- și șoarecii C57Bl/6 (20µg /godeu). Am constat scăderea expresiei APP la șoarecii K.O. la nivelul ambelor zone corticale studiate, semnificația statistică fiind atinsă pentru cerebel.

4.4.4. Testarea asocierii dintre caveolina-1 și APP prin electroforeză nativă

Pentru a vedea dacă această modificare de expresie necesită o asociere fizică între cele două proteine am efectuat electroforeza nativă conform protocolului prezentat la „Materiale și Metode” prin care am păstrat legăturile care se realizează in vivo între proteinele partenere.

Figura 1.17. – Evaluarea expresiei APP C-terminal în cerebel și a cav-1 în cerebel șoarecilor transgenici cav-1 -/- și control

Electroforeză nativa pentru APP C-terminal în lizatul de cerebel și a caveolinei-1 în fracția membranară din cerebelul obținut de la șoarecii cav-1 -/- și șoarecii C57Bl/6 (2µg/godeu). Am confirmat absența cav-1 din membrană la șoarecii knockout și am obținut benzi pentru APP și cav-1 în cerebelul șoarecilor control cu greutăți moleculare ce variază între aproximativ 1000 kDa și 700 kDa.

Am constatat că profilul obținut la electroforeză nativă pentru cele două proteine nu este decât parțial superpozabil, deci legătura dintre ele ar putea fi mai degrabă una funcțională. Având în vedere descrierea caveolinei-1 drept inhibitor al mai multor căi de semnalizare, prevenind activarea diverselor kinaze implicate, am testat mai departe efectul knockout-ului de caveolină-1 asupra fosforilării APP.

4.4.5.Testarea fosforilării proteinei precursoare a amiloidului la șoarecii control C57Bl/6J versus șoarecii transgenici Cav1tm1Mls/J

Având în vedere că am obținut modificări în expresia proteinei semnificative statistic la nivelul cerebelului, am continuat experimentele pe această zona din cortex. Știind că APP este o proteină transmembranară ce conține 8 situsuri de fosforilare la capătul C-terminal, am studiat forma fosforilată de la nivelul treoninei 743/668 neuron specifică care afectează procesarea enzimatică. Pentru testarea expresiei formei fosforilate am adaptat un protocol de electroforeză care presupune migrarea probelor în condiții reducătoare și non-reducătoare, cea din urmă păstrând legăturile disulfidice din cadrul APP. Condițiile reducătoare presupun lizatul de cerebel de la șoarecii control și adăugarea β-mercaptoetanolului urmată de fierbere timp de 10 minute, pe când la proba în condiții non-reducătoare se adaugă soluție Laemmli fără β-mercaptoetanol ș nu este urmat de fierbere.

Figura 1.18. – Evaluarea expresiei formei fosforilate a APP în cerebelul șoarecilor control

Western Blot pentru forma fosforilată a APP (Thr-743) din lizat de cerebel al șoarecilor C57Bl/6 și lizat de leucocite umane, utilizând condiții de reducere pentru prepararea probelor dar și condiții non-reductive. Am constatat prezența mai multor benzi pentru forma fosforilată cu GM diferite. Abreviere: GM – greutatea moleculara, (1) – probă lizat cerebel condiții reducătoare, (2) – probă lizat cerebel condiții non-reductoare, (3) – probă lizat leucocite condiții reducătoare, (4) – probă lizat leucocite non-reducător.

Se observă în figura 1.18. că în condițiile probei 2 există mai multe benzi cu greutate moleculară ce variază între 100 kDa și 50 kDa, acestea fiind diferite față de rezultatul obținut în condiții reducătoare. Astfel, păstrarea legăturilor S-S duce la identificarea mai multor fragmente fosforilate a proteinei precursoare a amiloidului, care nu se regăsesc în condițiile non-reducătoare la blotarea pentru porțiunea C-terminală a APP. Studiind modificările de fosforilare de la nivel cerebelos am putea explica expresia scăzută a APP la șoarecii K.O. ce prezintă modificări cerebrale regăsite în boala Alzheimer.

Am dorit să testez persistența modificării de expresie la șoareci K.O. cav-1 -/- în condiții non-reducătoare non-denaturante. Astfel, lizatul din cerebel recoltat de la șoarecii control și transgenici cu soluția Laemmli 2X fără β-mercaptoetanol și fără fierbere, urmând ca migrarea să fie pe un gel fără SDS, condițiile fiiind identice cu experimentele efectuate mai sus.

Figura 1.19. – Evaluarea expresiei formei fosforilate a APP în cerebelul șoarecilor trangenici pentru cav-1 -/- versus tulpina control

Western Blot pentru APP fosforilat (Thr-743/668) din lizatul de cerebel al șoarecilor Cav1tm1Mls/J și C57Bl/6, în condiții non-reductoare și non-denaturante. Am constatat prezenta mai multor benzi cu greutăți moleculare variate.

Se observă în figura 1.19. că rezultatele obținute se mențin și în condiții non-denaturante, apărând mai multe benzi la blotarea pentru forma fosforilată a APP Thr-743/668. Cu greutăți moleculare între 40 kDa și >250 kDa se observă în cerebelul celor două loturi de șoareci forme fosforilate a fragmentelor APP cu posibilitatea formării unor agregate din fragmentele APP care să explice existența benzilor la greutăți moleculare de peste 100 kDa.

4.4.6. Evaluarea expresiei genice a proteinei precursoare a amiloidului prin PCR cantitativ

Pentru a vedea dacă modificarea expresiei proteinei se corelează cu inhibarea transcrierii genice, am făcut determinat cantitativ ARNm a APP-ului din creierul șoarecilor cav-1 K.O.. Am extras ARN-ul creierul șoarecilor cav-1 K.O. conform protocolului prezentat în subcapitolul ”Materiale și metode”, iar pentru control am folosit cortex de șoarece C57/Bl6 de aceeași vârstă și sex cu animalul K.O.. ARN-ul extras a fost transformat în cDNA prin revers-transcripție la 50° Celsius, apoi supus amplificării prin PCR. Pentru controlul intern am folosit S18 rARN deoarece prezintă mai puțină variabilitate a expresiei față de β-actină și GAPDH, iar controlul negativ a fost reprezentat de probe la care nu am adăugat reverstranscriptaza în amestecul de RT-PCR.

Tabel VII – Citirea valorilor prag a fluorescenței pentru SYBR Green 490

”Ct” (cycle threshold) reprezintă numărul de cicluri de amplificare necesare semnalului fluorescent pentru a depăși semnalul de fond (tabelul VII). Cu cât secvența de amplificat este mai puțină cantitativ, cu atât semnalul va apărea mai târziu, iar pragul va fi mai mare. Din tabelul precedent se observă că media numărului de cicluri neceare pentru APP din cortexul șoarecilor cav-1 -/- să atingă pragul este cu aproximativ 1,5 cicluri mai mic decât a controlului recomandat de crescător. Toate probele luate în lucru au avut un semnal puternic, indicator al prezenței unei cantități suficiente de material genetic.

Pe baza înregistrării semnalului fluorescent, softul folosit a generat un grafic (figura 1.20.) în care fiecare godeu este prezentat ca o situație individuală, iar evoluția fluorescenței fiecărei situații este reprezentată printr-o curbă de anumită culoare, culoare pe care o regăsim în tabelul VII.

Figura 1.20. – Înregistrarea fluorescenței qRT-PCR pentru APP din cortexul șoarecilor cav-1 -/-

Pentru a mă asigura de corectitudinea rezultatelor am efectuat o ”curbă de topire”, care măsoară temperatura de degradare a secvențelor de ADN dublu catenar rezultate în urma PCR-ului. Energia necesară ruperii legăturilor de hidrogen dintre cele două catene complementare este dependentă de lungimea catenei, motiv pentru care, dacă în proba mea ar exista contaminari (catene de altă lungime decât cea dorită sau chiar exces de primeri dimerizați) aceștia ar apărea pe curba de topire ca vârfuri la alte temperaturi decât cea a situațiilor mele.

Figura 1.21.- Curba de topire pentru qRT-PCR APP din cortexul șoarecilor cav-1 -/-

Din figura 1.21. se obsevă două vârfuri, unul mai amplu, la 87°C, al secvenței de APP și unul mai mic, la 85,5°C, al subunității ribozomale S18. Aspectul graficului curbei de topire confirmă reușita experimentului.

Pentru cuantificarea ARNm al APP pe baza datelor de qRT-PCR am folosit formula :

unde ΔCt reprezintă normalizarea la controlul endogen de S18, adica:

Deci, raportul este 2 -(26.4-28,4)-(27.8-27,15)= 2 1,35=2,54, ceea ce presupune o upregulare a traducerii genice. Cum însă WB arată o scădere a expresiei proteice, este foarte posibilă existența unei interferențe ARN, posibil prin specii de microARN, care exercită un control posttranscripțional al expresiei APP în creierul șoarecilor cav-1 -/-.

4.5. Discuții

Cele mai frecvente patologii neurodegenerative sunt demența vasculară, boala Alzheimer și boala Parkinson, fiecare având propriul mecanism molecular de apariție. Demența este o patologie multifactorială, cercetările din domeniul biologiei moleculare au demonstrat că mecanismele se suprapun, având următoarele consecințe: 1) recunoașterea necesității unui diagnostic mai exact și prin urmare a identificării unor biomarkeri specifici și sensibili; 2) noi modele animale de boală au fost dezvoltate. Modelele animale dețin un rol important în elucidarea mecanismelor de apariție a bolii deoarece permit analiza căilor și proteinelor care aparent nu au legătură cu modificarea genetică imprimată organismului. Modelele murine neurodegenerative includ animale transgenice pentru proteina precursoare a amiloidului, proteina tau, presenilina, dar și injectare de neurotoxine în corpul striat sau ligaturarea carotidelor în cazul demenței vasculare.

Conceptul de îmbătrânire a creierului –“brain aging”- se referă la o performanță cognitivă cu deteriorare progresivă. Metodele de imagistică (tomografie computerizată, rezonanță magnetică și PET cu fluordeoxiglucoza) au demonstrat că atrofia cerebrală apare odată cu înaintarea în vârstă în creierul sănătos, fără semne de demență. Studiul modelelor animale a arătat că odată cu îmbătrânirea apare în mod normal o diminuare a numărului de neuroni alături de scăderea volumului substanței cenușii. Studii ulterioare au contrazis rezultatele inițiale, susținând conservarea numărului de neuroni în pofida subțierii cortexului cerebral. Modificările apar în substanța cenușie cât și în substanță albă, pierderea fiind mai degrabă funcțională cu modificarea circuitelor neuronale decât că scăderea numărului absolut de celule nervoase. Numărul de neuroni este păstrat inclusiv în zonele susceptibile la demență, precum lobul frontal sau medio-temporal, unde subțierea scoarței cerebrale nu este un indicator definitor de boală. Îmbătrânirea este caracterizată de neurogeneza scăzută, cu alterarea semnalizării neurotrofinei și dezechilbrul factorilor de semnalizare neuronală. În creierul îmbătrânit, macromoleculele sunt oxidate și nu mai pot fi degradate de aparatul lizozomal astfel se produce o cantitate mai mare de enzime lizozomale ce nu mai pot digera materialul celular, un bun exemplu fiind lipofuscina4. O dată cu îmbătrânirea și cu neurodegenerarea, creierul prezintă un nivel crescut al mai multor proteine dar și enzime, neuronii având un număr mai mare de endosomi și fagozomi6-8. Multiple studii subliniază importanța homeostaziei proteice, sugerând că pierderea acestui echilibru duce la îmbătrânire și inclusiv la procese neurodegenerative. Nu se cunoaște încă relevanța acestor depozite proteice anormale, neputând fi corelate modificările morfologice cu semnele clinice, deoarece sunt foarte puțini cei peste 80 de ani fără anomalii cerebrale.

Figura 1.22. – Îmbătrânirea fiziologică vs. patologică (adaptat după Tony Wyss-Coray, Ageing, neurodegeneration and brain rejuvenation, Nature, 2016)

Deși creierul are un înveliș protector, bariera hematoencefalica, există argumente că factori ai senescenței neuronale traversează bariera și influențează negativ neurogeneza. Senescența neuronală depinde de echilibrul între tipurile celulare ce se găsesc în sistemul nervos, a celulelor cu abilitatea de a cataliza speciile reactive de oxigen (SRO), de a proteja de stimulii citotoxici sau de a limita reacțiile inflamatorii care în aceste condiții sunt mult diminuată. Prin urmare, înțelegerea procesului de îmbătrânire de la nivelul creierului și diferențierea de procesul patologic de neurodegenerare este o sarcină mai dificilă prin comparație cu alte sisteme și organe, datorită mecanismelor complexe de reglare, semnalizare și interacțiune celulară.

Cunoscând importanța caveolelor în transportul celular și semnalizare dar și interacțiunea cu proteina precursoare a amiloidului ce a fost prezentată în partea generală a acestei lucrări, voi prezenta pe scurt modificările ce apar la animalele modificate genetic încă din faza embrionară și care nu mai produc caveolina-1, caveolina-2 sau caveolina-3.

a) Fenotipul șoarecilor knockout pentru caveolina-1 ( Drab și colab., 2001; Razani și colab., 2002)

După identificarea cav-1 ca principală componentă a caveolaelor, un model animal a fost dezvoltat pentru studierea funcției in vivo. Surprinzător, șoarecii cav-1 K.O. au fost viabili dar au dezvoltat anormalități vasculare, de așteptat având în vedere larga distribuție în celulele endoteliale. În țesuturile prelevate de la șoarecii cav-1 -/- este certificată absența caveolelor din endoteliu, adipocite dar și epiteliu, cu reducerea dramatică a nivelului caveolinei-2 datorită destabilizării și lizei proteice, fiind prin urmare cav-1 și cav-2 deficiente. La nivel pulmonar prezintă hiperproliferarea epiteliului cu defecte în sistemul vascular și un raspuns exagerat la stimuli prin activarea cascadei oxidului nitric alături de modificări în homeostazia lipidică, cu un nivel crescut de trigliceride. Procesele celulare sunt afectate cu o multiplicarea mai rapidă a fibroblastelor cât și defecte în endocitoza având loc o scădere a transportului albuminei.

Deși viabili, șoarecii cav-1 K.O. au o greutate semnificativ mai mică prin comparație cu wild-type, fiind rezistenți la obezitatea indusă prin dieta hipercalorică. Șoarecii transgenici au o masă cerebrală diminuată, dezvoltă fenotipuri neurologice cu afectare motorie și de comportament, cu slăbiciune musculară și au activitate fizică redusă, dar și anormalități digestive fără să existe o afectare nervoasă. Aceste modificări ar putea fi corelate cu pierderea sinaptică, mecanismul fiind la nivelul plăcii neuromotorii. Dar, fiind o proteină membranară, caveolina-1 poate fi responsabilă de slaba mielinizare a celulelor gliale ce se înfășoară in jurul axonilor.

b) Fenotipul șoarecilor knockout pentru caveolina-2 (Razani și colab., 2002)

În țesuturile acestor modele murinice, expresia caveolinei-1 este ușor scăzută fără să fie absente caveolele. Există modificări histologice la nivel pulmonar identice cu cele ale șoarecilor K.O. pentru cav-1, demonstrând rolul important al cav-2 independent de prezența sau interacțiunea cu cav-1. În rest, vasoreglarea și transportul lipidelor sunt nealterate.

c) Fenotipul șoarecilor knockout pentru caveolina-3 (Galbiati și colab., 2001; Hagiwara și colab., 2000)

În țesuturile musculare și la nivel cardiac, se pierd caveolele mai ales în celulele care exprimă predominat cav-3. Modificări histologice ale mușchilor prezintă un fenotip asemănător distrofiei musculare a centurilor din patologia umană (Minnetti și colab., 1998).

Am ales pentru studiu modelul trangenic pentru caveolina-1 deoarece acesta prezintă la nivel cerebral modificări importante care mă intereseaza pentru studiul căii amiloidogenice a bolii Alzheimer. Astfel, prin obținerea unui lizat tisular și extracție de ARNm, am studiat expresia APP în creierul acestor șoareci comparativ cu șoarecii control de aceeași vârstă și sex, recomandați de crescător C57BL/6.

Argumentele în plus pentru studiul acestor animale sunt raportările din literatură care susțin existența unei interacțiuni semnificative între caveolina-1 si APP, interacțiune posibil modificată în boala Alzheimer. Așa cum am prezentat în partea generală, apar modificări de expresie a caveolinei-1 cu vârsta, în țesuturile senescente dar și în cortexul cerebral, în hipocamp și cerebel prin comparație cu animalul tânăr (Kang și colab., 2006). În boala Alzheimer se păstrează aceeași creștere semnificativă a expresiei caveolinei-1, atât la nivel de ARNm cât și ca proteină finală (Gaudreault și colab., 2004). Evidențierea co-localizării membranare a peptidului Aβ și a caveolinei-1, a dus la teoria prin care metabolizarea APP este influențată de interacțiunea cu caveolele, APP fiind o proteină transmembranara cu modificări de expresie în funcție de compoziția plutelor lipidice. În experimentele mele, am studiat această tulpină de șoareci transgenici deoarece prezintă de la vârsta de 3-6 luni modificări specifice bolii Alzheimer (depozite de β-amiloid și proteină tau), aceștia putând fi utilizați în viitor ca și model pentru bolile neurodegenerative, cum este boala Alzheimer.

Head și colaboratorii au publicat în 2010 un studiu în care au propus această tulpină de șoarece trangenic pentru caveolina-1 drept model de neurodegenerare accelerata. Folosind metode utilizate în studiul biologiei moleculare, au comparat creierul dar și hipocampul animalelor de vârste diferite. Aceștia au descoperit modificările prezentate mai sus și au încercat să găsească o legătura între caveolina-1 și producția crescută de peptid Aβ. Astfel au generat o cultură neuronală din creierul șoarecilor cav-1 -/- și au reexprimat gena caveolinei, în acest sistem fiind observată apoi scăderea producției de peptid amiloidogenic.

Modelul ales de mine a produs rezultate interesante, confirmând ipoteza unei interrelații între cele două proteine. Scăderea expresiei de APP obținută în urma electroforezei a fost verificată la nivel de ARNm, unde surprinzător, am constatat o creștere a transcriptului ARNm de aproape 3x față de control. Diferența de expresie între ARNm și proteina codificată de acesta presupune existența unui control posttranscripțional exercitat de microARNuri.

Din literatură, câteva mecanisme pot fi evidențiate prin care expresia sau procesarea proteinei precursoare a amiloidului poate fi modificată de catre caveolina-1:

Caveolina-1 prezintă domeniul "scaffolding" (DSC) care poate să interacționeze cu alte proteine membranare, inclusiv cu proteina precursoare a amiloidului, facilitând astfel proteoliza proteinei;

APP este exprimat în mod preferențial în domeniile bogate în colesterol, așa cum sunt caveolele, iar procesul amiloidogenic este favorizat de către hipercolesterolemie. Dispariția caveolelor la modelele K.O. pentru cav-1 redirecționează APP către plutele lipidice, ducând astfel la creșterea extracelulara a depozitelor de beta-amiloid. Astfel, ambele enzime implicate în procesul amiloidogenic sunt localizate la nivelul plutelor lipidice: BACE se găsește în domenii membranare non-caveolare și gama-secretaza la nivelul zonelor membranare detergent-rezistente;

Supraexpresia cav-1 în celulele ce exprimă BACE rezultă în scăderea producție de peptid amiloid sugerând un rol protectiv al caveolinei-1;

Caveolele și cav-1 acționează ca noduri de semnalizare, reglând activitatea kinazelor. În schimb, APP-ul are 8 situri de fosforilare la nivelul domeniului C-terminal, ce pot fi potențial modificate de expresia cav-1. Fosforilarea la Thr 743/668 este esențială pentru legarea cu Fe65 ce conduce la translocarea nucleară, urmată de activarea GSK3β și fosforilarea proteinei tau;

Pierderea cav-1 poate altera fosforilarea altor proteine implicate în traficul APP: Mint1/X11alfa este unul din cei 4 adaptori de trafic neuronal ce interacționeaza cu APP. Fosforilarea Mint1 de către tirozina Src reglează destinația APP, restricționând distribuția către ramificațiile terminale neuronale.

Deși aparent rezultatele în urma qRT-PCR obținute de mine sunt în contradicție cu cele raportate de Head, diferența poate rezulta din controalele folosite de fiecare dintre noi. În articol nu este precizată tulpina de șoarece cav-1 -/-, daca este de proveniență proprie sau achiziționată. Laboratorul Jackson, de unde au fost achiziționati șoarecii K.O., au două tulpini disponibile: B6.Cg-Cav1tm1Mls/J și STOCK Cav1tm1Mls/J, care diferă ca origine. Datorită provenienței embrionare diferite, controalele recomandate pentru aceste tulpini diferă. O altă precizare importantă este că studiul precizat mai sus se concentrează asupra hipocampului, cea mai vulnerabilă regiune a emisferelor cerebrale în patologia de tip Alzheimer și zona în care apar primele modificări. Studiul meu a implicat pentru început lizat de creier și apoi, având în vedere faptul că zonele cerebrale răspund diferit în condiții patologice, pe cerebel și lob parietal, lipsind însă din experiment hipocampul.

După cum am menționat în capitolul ”Rezultate”, expresia APP este mai accentuată în cerebel față de lobul parietal, însă se menține în ambele zone scăderea expresiei proteice. Într-un studiu publicat de Wagner și colaboratorii în aprilie 2017 este studiată implicarea cerebelului, anume a neuronilor granulari din stratul profund, în circuitele motivaționale ce privesc răspunsul învățat la recompensa, sublinind astfel și funcția non-motorie a creierului mic. Varietatea activităților asociate cu cerebelul se întinde de la sarcini precum atenție, limbaj, memorie de procesare și pe termen lung, învățare, durere dar și adicție, până la descrierea circuitului cortico-cerebelos, conturând funcțiile superioare cu implicații în comportament și care pot fi afectate în cadrul bolilor neurodegenerative. Date mai vechi relatează prezența depunerilor de amiloid în cortexul cerebelos al pacienților cu BA, ca plăci difuze în stratul molecular, uneori însoțite de amiloidoză vasculară88. Deoarece aceste depozite nu au fost vizibile cu colorațiile uzuale folosite pentru evidențierea plăcilor de amiloid, este posibil ca natura fragmentelor proteice din compoziția lor să fie diferită de cea din neocortex. Date recente din studii clinice ale încărcării cu amiloid a creierului pacienților cu tulburare cognitivă ușoară și demență, obținute prin studii imagistice de PET- amiloid, arată că normalizarea citirilor datelor imagistice la background-ul de încărcare cerebelos nu duce la o bună separare a grupurilor de pacienți de cel de control sau a grupurilor de pacienți între ei, sugerând că și cerebelul prezintă încărcare amiloidică (“Regionally specific SUVR values in earlystage AD patients screened with amyloid PET”, David Scott Joyce Suhy, Mehul Sampat, Ping Chiao, Jeff Sevigny și Gregory Klein).

Diferențele observate în gradul de scădere a expresiei proteinei precursoare a amiloidului între diversele zone ale cortexului ar fi interesant de aprofundat, deoarece zona în care modificarea a fost mai pregnantă (cerebelul), prezintă depuneri difuze de amiloid spre deosebire de zonele vulnerabile în boala Alzheimer. Știind că APP este precursorul acestor depuneri, scăderea expresiei în ambele zone, dar mai ales în cerebel, ar putea să fie explicată de rolul neuroprotectiv pe care caveolina-1 îl are, absența acestei proteine ducând la un deficit de plasticitate sinaptică cu accelerarea neurodegenerării. Creșterea expresiei proteinei precursoare a amiloidului cu vârsta la șoarecii sănătoși așa cum reiese din rezultatele obținute în capitolul 4, ar putea să fie un mecanism compensator și nu o măsură directă a îmbătrâniri cerebrale, corelație ce poate fi făcută și în cazul bolii Alzheimer14-16. Mai mult, rolul APP în cerebelul matur nu este foarte bine elucidat. Un studiu recent, care a urmărit distribuția celulelor stem mesenchimale injectate la șoareci tineri vs. șoareci vârstnici, a demonstrat că, spre deosebire de organismul tânar, unde distribuția este difuză, în majoritatea organelor, în organismele vârstnice distribuția este preferențială în neocortex. Mai mult, la șoarecii transgenici APP/PS1, aceste celule sunt atrase în cerebel25.

Interesant de remarcat este că, deși scăderea expresiei de APP se menține la nivelul tuturor ariilor investigate, comparativ cu controlul de aceeași vârstă si sex, există diferențe între zonele de cortex ale aceluiași specimen, atat cei transgenici cat si cei folosiți ca și control. Cortexul cerebelos, care nu dezvoltă modificări de boala Alzheimer, prezintă un grad de scădere a expresiei proteice accentuat față de cortexul parietal. Nu se cunoaște impactul acestei modificări deoarece există puține studii la nivelul cerebelului asupra expresiei proteinei precursoare a amiloidului.

Această scădere a expresiei de APP, preferențial în anumite zone, are potențial de exploatare mare pentru ramura aplicativă a cercetării, mai ales din perspectivă terapeutică. Tulburările cognitive nu beneficiază până la ora actuală de o terapie curativă ci doar de una simptomatică, utilizată doar pentru încetinirea evoluției bolii. Rezultatele prezentate de mine pun premisele identificării unui mecanism ce poate explica rolul și acțiunea fiziologică a APP dar și modificările patologice a căii de generare a peptidului Aβ.

Alterarea structurală a barierei hematoencefalice este deja bine documentată în diverse patologii nervoase centrale degenerative sau inflamatorii, endoteliul capilar fiind implicat în transportul transepitelial prin endocitoza mediată de receptor și endocitoza prin caveole. Peste 50 % din suprafața endoteliului capilar este alcătuit din caveole, aceste animale trangenice se caracterizează funcțional prin preluare și transcitoză deficitare. În plus, acești șoareci se caracterizează prin nivel anormal de citokine proinflamatorii (TNFα, IL-6) și homeostazie anormală a oxidului nitric care participă la realizarea unui model complex de alterare a barierei hematoencefalice. Astfel nu se poate stabili cu exactitate importanta pierderii caveolinei-1 la nivel cerebral în cadrul acestui lot de șoareci, deoarece există o unitate neurovasculară ce nu poate fi divizată fiziopatologic iar rezultatele obținute în urma experimentelor nu pot fi translatate intregral in vivo.

Studiul fosforilării de la nivelul Thr-743/668 neuron specifice a APP este util deoarece influențează expresia proteinei prin activarea clivării enzimatice a proteinei. Astfel am pus în evidență APP fosforilat dar și fragmente fosforilate care în condițiile explicate mai sus se pare că formează agregate cu greutăți moleculare mari la care poate să participe caveolina-1 ca proteina membranară din cadrul zonelor bogate în colesterol. SDS a fost exclus din protocolul de electroforeză deoarece există studii care susțin că acesta induce dimerizarea și homo-oligomerizarea in vitro. Kinazele implicate în fosforilarea APP sunt variate și au fost detaliate în partea generală a acestei lucrări, o parte importantă interacționează cu regiunea scaffold a caveolinei-1, influențând fosforilarea cu efecte asupra căii secretazelor.

Terapiile etiopatogenice sunt încă în curs de testare, dar în principal se încadrează în trei direcții majore: imunizare anti-amiloid, inhibitori ai secretazelor din calea de metabolizare și antiagregante amiloidice. Luarea în calcul a caveolinei-1 ca țintă terapeutică trebuie să țină cont de distribuția ubiquitară a acestei proteine și posibilele efecte adverse provocate de supresia sau blocarea ei. Până în acest punct al lucrării mele experimentele efectuate au dus la sublinierea unei corelații între caveolina-1 și proteina precursoare a amiloidului, la nivelul cerebelului și lobului parietal. Astfel acest model murinic de studiu poate fi folosit ca model non-mutațional de studiu al bolii Alzheimer, pentru înțelegerea patologiei neurodegenerative. Însă teoria amiloidogenica de producere a bolii Alzheimer care poziționeaza celula nervoasă în centru și acumularea liniara a peptidului Aβ nu oferă o explicație pentru observațiile clinice contradictorii printre care absența manifestărilor de demență în BA sporadică în ciuda existenței depozitelor cu 10-20 ani înainte de primele simptome. Strooper și Karran au publicat un articol în 2016 în care critica teoria amiloidogenică și prin urmare, în ciuda progreselor în cercetare, absența unui tratament etiopatogenetic eficace. Astfel, aceștia propun un mecanism numit “cellular phase theory” cu bucle de feedback și feedforward între astrocite, microglii și celulele endoteliale care duc în timp la incapacitatea de compensare a modificărilor neurovasculare cu un proces ireversibil și continuu de neurodegenerare.

Concluzii și direcții viitoare

Rezultatele obținute prin experimentele efectuate în cadrul tezei de licență confirmă ipotezele inițiale de lucru și anume existența unei corelații directe între caveolina-1 și proteina precursoare a amiloidului. Mai mult, șoarecii knockout pentru caveolina-1 sunt un model non-mutațional util pentru studiul bolilor neurodegenerative cum este boala Alzheimer.

În concluzie am demonstrat:

Metode precum Western Blot și qRT-PCR efectuate pe lizat din creier de șoarece au arătat că expresia APP este influențată de componenta principala a caveolelor, cav-1. Aceste rezultate confirmă raportările anterioare ale echipei de cercetare din cadrul laboratorului de biologie moleculara al Institutului de Patologie Victor Babeș.

Modificarea expresiei APP este diferită în funcție de zona din cortex studiată, am obținut o scădere semnificativă statistic la nivelul cerebelui atunci când am comparat cu șoarecii control de aceeați vârstă și sex. La nivelul lobului parietal scăderea proteică este observată însă la analiza densitometrică cu p având o valoare peste 0,05. Deoarece APP este o proteină cu rol important în patogeneza bolii Alzheimer, posibilitatea modulării expresiei prin acțiune la nivelul caveolinei-1 constituie o opțiune terapeutică interesantă.

Am dezvoltat un protocol pentru evidențierea formei fosforilate a proteinelor, cu pași simpli dar modificați a electroforezei clasice alături de un protocol de electroforeză nativă pentru testarea asocierii fizice între cele doua proteine studiate. Astfel am identificat fragmente de APP fosforilate atât în creierul șoarecilor control bătrâni dar și K.O. pentru caveolina-1, creând premisele pentru aprofundarea acestor mecanisme pe căi de semnalizare.

Studiul biologiei amiloidului poate beneficia de alte modele animale cu proteine umane mutante așa cum este cazul caveolinei-1, șoarecele cav-1 K.O. este primul model non-mutațional de boala Alzheimer dezvoltat de către laboratoarele Jackson și studiat intesiv până acum pentru patologii cardiovasculare și respiratorii.

Dezvoltarea bolii Alzheimer este complexă cu un proces biologic de neurodegenerare ce nu poate fi explicat printr-un model liniar de acumulare a petidului Aβ. Pocesul de neurodegenerare este multifactorial, iar studiul strict al teoriei amiloidogenice și modificările ce apar în cadrul unor tulpini animale nu pot fi extrapolate către situațiile întâlnite în practica de zi cu zi.

Direcțiile viitoare de urmat, plecând de la rezultatele mele, se încadrează în trei direcții principale:

Analiza separată a neuronilor, astrocitelor și celulelor endoteliale din perspectiva expresiei proteice si al ARNm a APP-ului, caveolinei-1 și asocierii dintre ele. Se cunoaște deja faptul că APP este exprimat la nivelul neuronilor și la nivelul astrocitelor, dar sub formă de izoforme diferite. Caveolina-1 este descrisă la nivel endotelial și există câteva studii de imunofluorescență care o descriu la nivel neuronal. Aceste studii trebuie confirmate prin qPCR, și WB pe populații celulare izolate, fie în linii celulare, fie în celule izolate prin sortare din țesut.

Evaluarea expresiei și activării celor trei enzime responsabile de clivarea APP la șoarecii K.O. Această direcție oferă răspunsuri legate de mecanismul apariției modificării de expresie proteică raportate de mine. Dacă această modificare este rezultatul unei catabolizări crescute, atunci se poate observa o activare enzimatică sau o creștere a expresiei enzimelor implicate în ciclul catabolic al APP. În funcție de care dintre enzime sunt activate, se pot face corelații mai departe cu patologia BA.

Analiza speciilor fosforilate și a kinazelor implicate în fosforilare care interacționeaza cu domeniul scaffold al caveolinei-1. În măsura în care se poate preveni fosforilarea APP care să ducă la metabolizarea patologică a proteinei, noi molecule mici terapeutice ar putea fi inhibiori de kinaze, deja testați pentru alte patologii.

ANEXE

Anexa 1. Articole publicate

Anexa 2. Participări la congrese cu prezentări orale și premii obținute

Anexa 3. Lista figurilor

Figura 1.1.- Progresia leziunilor neuronale și gliale în cadrul bolii Alzheimer (BA) 7

Figura 1.2. – Ipoteza cascadei amiloidului la nivelul sistemului nervos central 9

Figura 1.3. – Structura proteinelor din familia APP 14

Figura 1.4. – Căile de metabolizare a APP 18

Figura 1.5. – Formarea homodimerilor APP prin cis-dimerizare și trans-dimerizare 22

Figura 1.6. – Structura caveolinei-1 27

Figura 1.7. – Oligomerizarea caveolinei-1 28

Figura 1.8. – Principalele roluri ale caveolelor 32

Figura 1.9. – Sistem de electroforeză pentru Western Blot 40

Figura 1.10. – Curbă standard de BSA 44

Figura 1.11. – Testarea expresiei cav-1 și APP în creierul șoarecilor C57Bl/6 45

Figura 1.12. – Testarea absenței cav-1 în creierul șoarecilor trangenici cav-1 -/- 46

Figura 1.13.- Evaluarea expresiei APP în creierul șoarecilor transgenici cav-1 -/- 46

Figura 1.14.– Evaluarea expresiei APP în cerebelul șoarecilor transgenici cav-1 -/- 47

Figura 1.15. – Evaluarea expresiei APP în lobul parietal al șoarecilor transgenici cav-1-/- 48

Figura 1.16. – Evaluarea expresiei APP în cerebel și lobul parietal în cortexul șoarecilor transgenici cav-1 -/- și control 48

Figura 1.17. – Evaluarea expresiei APP C-terminal în cerebel și a cav-1 în cerebel șoarecilor transgenici cav-1 -/- și control 49

Figura 1.18. – Evaluarea expresiei formei fosforilate a APP în cerebelul șoarecilor control 50

Figura 1.19. – Evaluarea expresiei formei fosforilate a APP în cerebelul șoarecilor trangenici pentru cav-1 -/- versus tulpina control 51

Figura 1.20. – Înregistrarea fluorescenței qRT-PCR pentru APP din cortexul șoarecilor cav-1 -/- 52

Figura 1.21.- Curba de topire pentru qRT-PCR APP din cortexul șoarecilor cav-1 -/- 53

Figura 1.22. – Îmbătrânirea fiziologică vs. patologică 55

Anexa 4. Lista tabelelor

Tabel I – Funcțiile domeniului intracitoplasmatic și al formei solubile a APP 15

Tabel II – Obținerea gelurilor de acrilamidă pentru migrarea proteinelor 39

Tabel III – Obținerea gelului de încărcare a proteinelor pentru Western Blot 39

Tabel IV – Gel electroforeză nativă 41

Tabel V – Valori spectofotometrice ale curbei standard 44

Tabel VI – Determinarea concentrațiilor proteice din lizatul de cerebel și parietal 45

Tabel VII – Citirea valorilor prag a fluorescenței pentru SYBR Green 490 52

Anexa 5. Lista abrevierilor

Aβ – amiloid beta

ADN – acid dezoxiribonucleic

AICD – domeniul intracelular al amiloidului

ApoE – apolipoptroteina E

APP – amyloid precursor protein (proteina precursoare a amiloidului)

ARN – acid ribonucleic

BA – Boala Alzheimer

BACE – betasecretaza (β-site APP-cleaving enzyme)

BDNF – factorul neurotrofic cerebral

BHE – bariera hematoencefalică

Cav -1 -/- – knockout de caveolină

Cav1 – caveolina 1

CTF – fragment carboxi-terminal

DO – densitate optică

EGF – factorul de creștere epidermală

eNOS – NO sintaza endotelială

GSK-3β – kinaza glicogen sintetazei 3β

K.O. – knockout

LCR – lichid cefalorahidian

LTP – potențare de lungă durată

MAPK – fosfokinaze activate de mitogeni

miARN – microARN

NGF – factorul de creștere neuronală

NT – neurotrofină

PCR – polimerase chain reaction

PET – tomografie cu emisie de pozitroni

PKA – protein kinaza A

PKC – protein kinaza C

PS – presenilina

qPCR – PCR cantitativ

RT- PCR – revers transcriptie

TNF-α – factorul de necroză tumorală

SDS – sodiu dodecil sulfat

SNC – sistem nervos central

WB – western blot

1-93

BIBLIOGRAFIE

1. Ahn JH, So SP, Kim NY, Kim HJ, Yoon SY, Kim DH. c-Jun N-terminal Kinase (JNK) induces phosphorylation of amyloid precursor protein (APP) at Thr668, in okadaic acid-induced neurodegeneration. BMB Rep. Jul 2016;49(7):376-381.

2. Badaut J, Ajao DO, Sorensen DW, Fukuda AM, Pellerin L. Caveolin expression changes in the neurovascular unit after juvenile traumatic brain injury: signs of blood-brain barrier healing? Neuroscience. Jan 29 2015;285:215-226.

3. Barage SH, Sonawane KD. Amyloid cascade hypothesis: Pathogenesis and therapeutic strategies in Alzheimer's disease. Neuropeptides. Aug 2015;52:1-18.

4. Baumkotter F, Schmidt N, Vargas C, et al. Amyloid precursor protein dimerization and synaptogenic function depend on copper binding to the growth factor-like domain. J Neurosci. Aug 13 2014;34(33):11159-11172.

5. Beel AJ, Sakakura M, Barrett PJ, Sanders CR. Direct binding of cholesterol to the amyloid precursor protein: An important interaction in lipid-Alzheimer's disease relationships? Biochim Biophys Acta. Aug 2010;1801(8):975-982.

6. Benilova I, Karran E, De Strooper B. The toxic Abeta oligomer and Alzheimer's disease: an emperor in need of clothes. Nat Neurosci. Jan 29 2012;15(3):349-357.

7. Bento-Abreu A, Velasco A, Polo-Hernandez E, et al. Albumin endocytosis via megalin in astrocytes is caveola- and Dab-1 dependent and is required for the synthesis of the neurotrophic factor oleic acid. J Neurochem. Oct 2009;111(1):49-60.

8. Bhattacharyya R, Barren C, Kovacs DM. Palmitoylation of amyloid precursor protein regulates amyloidogenic processing in lipid rafts. J Neurosci. Jul 03 2013;33(27):11169-11183.

9. Bignante EA, Heredia F, Morfini G, Lorenzo A. Amyloid beta precursor protein as a molecular target for amyloid beta–induced neuronal degeneration in Alzheimer's disease. Neurobiol Aging. Nov 2013;34(11):2525-2537.

10. Blennow K, Hampel H, Weiner M, Zetterberg H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. Mar 2010;6(3):131-144.

11. Caravia L, Dudau M, Gherghiceanu M, Tanase C, Enciu AM. Could caveolae be acting as warnings of mitochondrial ageing? Mech Ageing Dev. Mar 2015;146-148:81-87.

12. Chang KA, Kim HS, Ha TY, et al. Phosphorylation of amyloid precursor protein (APP) at Thr668 regulates the nuclear translocation of the APP intracellular domain and induces neurodegeneration. Mol Cell Biol. Jun 2006;26(11):4327-4338.

13. Chen Y, Tang BL. The amyloid precursor protein and postnatal neurogenesis/neuroregeneration. Biochem Biophys Res Commun. Mar 03 2006;341(1):1-5.

14. Cho KA, Park SC. Caveolin-1 as a prime modulator of aging: a new modality for phenotypic restoration? Mech Ageing Dev. Jan 2005;126(1):105-110.

15. Cho KA, Ryu SJ, Oh YS, et al. Morphological adjustment of senescent cells by modulating caveolin-1 status. J Biol Chem. Oct 01 2004;279(40):42270-42278.

16. Cho KA, Ryu SJ, Park JS, et al. Senescent phenotype can be reversed by reduction of caveolin status. J Biol Chem. Jul 25 2003;278(30):27789-27795.

17. Collingridge GL, Peineau S, Howland JG, Wang YT. Long-term depression in the CNS. Nat Rev Neurosci. Jul 2010;11(7):459-473.

18. Couet J, Li S, Okamoto T, Ikezu T, Lisanti MP. Identification of peptide and protein ligands for the caveolin-scaffolding domain. Implications for the interaction of caveolin with caveolae-associated proteins. J Biol Chem. Mar 07 1997;272(10):6525-6533.

19. De Strooper B, Annaert W. Proteolytic processing and cell biological functions of the amyloid precursor protein. J Cell Sci. Jun 2000;113 ( Pt 11):1857-1870.

20. Eggert S, Midthune B, Cottrell B, Koo EH. Induced dimerization of the amyloid precursor protein leads to decreased amyloid-beta protein production. J Biol Chem. Oct 16 2009;284(42):28943-28952.

21. Ehehalt R, Keller P, Haass C, Thiele C, Simons K. Amyloidogenic processing of the Alzheimer beta-amyloid precursor protein depends on lipid rafts. J Cell Biol. Jan 06 2003;160(1):113-123.

22. Engelman JA, Chu C, Lin A, et al. Caveolin-mediated regulation of signaling along the p42/44 MAP kinase cascade in vivo. A role for the caveolin-scaffolding domain. FEBS Lett. May 29 1998;428(3):205-211.

23. Engelman JA, Zhang X, Galbiati F, et al. Molecular genetics of the caveolin gene family: implications for human cancers, diabetes, Alzheimer disease, and muscular dystrophy. Am J Hum Genet. Dec 1998;63(6):1578-1587.

24. Evin G, Zhu A, Holsinger RM, Masters CL, Li QX. Proteolytic processing of the Alzheimer's disease amyloid precursor protein in brain and platelets. J Neurosci Res. Nov 01 2003;74(3):386-392.

25. Fabian C, Naaldijk Y, Leovsky C, et al. Distribution pattern following systemic mesenchymal stem cell injection depends on the age of the recipient and neuronal health. Stem Cell Res Ther. Apr 18 2017;8(1):85.

26. Frank PG, Pavlides S, Cheung MW, Daumer K, Lisanti MP. Role of caveolin-1 in the regulation of lipoprotein metabolism. Am J Physiol Cell Physiol. Jul 2008;295(1):C242-248.

27. Fridolfsson HN, Roth DM, Insel PA, Patel HH. Regulation of intracellular signaling and function by caveolin. FASEB J. Sep 2014;28(9):3823-3831.

28. Gaudreault SB, Blain JF, Gratton JP, Poirier J. A role for caveolin-1 in post-injury reactive neuronal plasticity. J Neurochem. Feb 2005;92(4):831-839.

29. Gaudreault SB, Dea D, Poirier J. Increased caveolin-1 expression in Alzheimer's disease brain. Neurobiol Aging. Jul 2004;25(6):753-759.

30. Goetz JG, Lajoie P, Wiseman SM, Nabi IR. Caveolin-1 in tumor progression: the good, the bad and the ugly. Cancer Metastasis Rev. Dec 2008;27(4):715-735.

31. Gralle M, Ferreira ST. Structure and functions of the human amyloid precursor protein: the whole is more than the sum of its parts. Prog Neurobiol. May 2007;82(1):11-32.

32. Haass C, Kaether C, Thinakaran G, Sisodia S. Trafficking and proteolytic processing of APP. Cold Spring Harb Perspect Med. May 2012;2(5):a006270.

33. Hansen CG, Nichols BJ. Exploring the caves: cavins, caveolins and caveolae. Trends Cell Biol. Apr 2010;20(4):177-186.

34. Hartmann T, Prinetti A. Going the wrong road: Fyn and targeting of amyloid precursor protein to lipid rafts. J Neurochem. Sep 2011;118(5):677-679.

35. Harvey RD, Calaghan SC. Caveolae create local signalling domains through their distinct protein content, lipid profile and morphology. J Mol Cell Cardiol. Feb 2012;52(2):366-375.

36. Head BP, Insel PA. Do caveolins regulate cells by actions outside of caveolae? Trends Cell Biol. Feb 2007;17(2):51-57.

37. Head BP, Patel HH, Insel PA. Interaction of membrane/lipid rafts with the cytoskeleton: impact on signaling and function: membrane/lipid rafts, mediators of cytoskeletal arrangement and cell signaling. Biochim Biophys Acta. Feb 2014;1838(2):532-545.

38. Head BP, Peart JN, Panneerselvam M, et al. Loss of caveolin-1 accelerates neurodegeneration and aging. PLoS One. Dec 23 2010;5(12):e15697.

39. Hehlgans S, Cordes N. Caveolin-1: an essential modulator of cancer cell radio-and chemoresistance. Am J Cancer Res. 2011;1(4):521-530.

40. Heidari A, Behmanesh M, Sahraian MA, et al. The human caveolin 1 gene upstream purine complex and neurodegeneration–a common signature. J Neuroimmunol. Jul 2011;236(1-2):106-110.

41. Herrup K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat Neurosci. Jun 2015;18(6):794-799.

42. Ikezu T, Trapp BD, Song KS, Schlegel A, Lisanti MP, Okamoto T. Caveolae, plasma membrane microdomains for alpha-secretase-mediated processing of the amyloid precursor protein. J Biol Chem. Apr 24 1998;273(17):10485-10495.

43. Isbert S, Wagner K, Eggert S, et al. APP dimer formation is initiated in the endoplasmic reticulum and differs between APP isoforms. Cell Mol Life Sci. Apr 2012;69(8):1353-1375.

44. Kang MJ, Chung YH, Hwang CI, et al. Caveolin-1 upregulation in senescent neurons alters amyloid precursor protein processing. Exp Mol Med. Apr 30 2006;38(2):126-133.

45. Kapoor A, Hsu WM, Wang BJ, et al. Caveolin-1 regulates gamma-secretase-mediated AbetaPP processing by modulating spatial distribution of gamma-secretase in membrane. J Alzheimers Dis. 2010;22(2):423-442.

46. Khalifa NB, Van Hees J, Tasiaux B, et al. What is the role of amyloid precursor protein dimerization? Cell Adh Migr. Apr-Jun 2010;4(2):268-272.

47. Kogel D, Deller T, Behl C. Roles of amyloid precursor protein family members in neuroprotection, stress signaling and aging. Exp Brain Res. Apr 2012;217(3-4):471-479.

48. Kovtun O, Tillu VA, Ariotti N, Parton RG, Collins BM. Cavin family proteins and the assembly of caveolae. J Cell Sci. Apr 01 2015;128(7):1269-1278.

49. Landis DM, Reese TS. Membrane structure in mammalian astrocytes: a review of freeze-fracture studies on adult, developing, reactive and cultured astrocytes. J Exp Biol. Dec 1981;95:35-48.

50. Li QX, Fuller SJ, Beyreuther K, Masters CL. The amyloid precursor protein of Alzheimer disease in human brain and blood. J Leukoc Biol. Oct 1999;66(4):567-574.

51. Lisanti MP, Scherer PE, Tang Z, Sargiacomo M. Caveolae, caveolin and caveolin-rich membrane domains: a signalling hypothesis. Trends Cell Biol. Jul 1994;4(7):231-235.

52. Lisanti MP, Scherer PE, Vidugiriene J, et al. Characterization of caveolin-rich membrane domains isolated from an endothelial-rich source: implications for human disease. J Cell Biol. Jul 1994;126(1):111-126.

53. Lisanti MP, Tang ZL, Sargiacomo M. Caveolin forms a hetero-oligomeric protein complex that interacts with an apical GPI-linked protein: implications for the biogenesis of caveolae. J Cell Biol. Nov 1993;123(3):595-604.

54. Liu P, Rudick M, Anderson RG. Multiple functions of caveolin-1. J Biol Chem. Nov 01 2002;277(44):41295-41298.

55. MacLeod R, Hillert EK, Cameron RT, Baillie GS. The role and therapeutic targeting of alpha-, beta- and gamma-secretase in Alzheimer's disease. Future Sci OA. Nov 2015;1(3):FSO11.

56. Marksteiner J, Humpel C. Beta-amyloid expression, release and extracellular deposition in aged rat brain slices. Mol Psychiatry. Oct 2008;13(10):939-952.

57. Marquer C, Devauges V, Cossec JC, et al. Local cholesterol increase triggers amyloid precursor protein-Bace1 clustering in lipid rafts and rapid endocytosis. FASEB J. Apr 2011;25(4):1295-1305.

58. Masters CL, Bateman R, Blennow K, Rowe CC, Sperling RA, Cummings JL. Alzheimer's disease. Nat Rev Dis Primers. Oct 15 2015;1:15056.

59. Mercier I, Jasmin JF, Pavlides S, et al. Clinical and translational implications of the caveolin gene family: lessons from mouse models and human genetic disorders. Lab Invest. Jun 2009;89(6):614-623.

60. Nishiyama K, Trapp BD, Ikezu T, et al. Caveolin-3 upregulation activates beta-secretase-mediated cleavage of the amyloid precursor protein in Alzheimer's disease. J Neurosci. Aug 01 1999;19(15):6538-6548.

61. Okamoto T, Schlegel A, Scherer PE, Lisanti MP. Caveolins, a family of scaffolding proteins for organizing "preassembled signaling complexes" at the plasma membrane. J Biol Chem. Mar 06 1998;273(10):5419-5422.

62. Parton RG, del Pozo MA. Caveolae as plasma membrane sensors, protectors and organizers. Nat Rev Mol Cell Biol. Feb 2013;14(2):98-112.

63. Parton RG, Simons K. The multiple faces of caveolae. Nat Rev Mol Cell Biol. Mar 2007;8(3):185-194.

64. Quest AF, Gutierrez-Pajares JL, Torres VA. Caveolin-1: an ambiguous partner in cell signalling and cancer. J Cell Mol Med. Aug 2008;12(4):1130-1150.

65. Quest AF, Lobos-Gonzalez L, Nunez S, et al. The caveolin-1 connection to cell death and survival. Curr Mol Med. Feb 2013;13(2):266-281.

66. Razani B, Lisanti MP. Caveolin-deficient mice: insights into caveolar function human disease. J Clin Invest. Dec 2001;108(11):1553-1561.

67. Razani B, Lisanti MP. Caveolins and caveolae: molecular and functional relationships. Exp Cell Res. Nov 15 2001;271(1):36-44.

68. Razani B, Schlegel A, Liu J, Lisanti MP. Caveolin-1, a putative tumour suppressor gene. Biochem Soc Trans. Aug 2001;29(Pt 4):494-499.

69. Reinhard C, Hebert SS, De Strooper B. The amyloid-beta precursor protein: integrating structure with biological function. EMBO J. Dec 07 2005;24(23):3996-4006.

70. Scheuermann S, Hambsch B, Hesse L, et al. Homodimerization of amyloid precursor protein and its implication in the amyloidogenic pathway of Alzheimer's disease. J Biol Chem. Sep 07 2001;276(36):33923-33929.

71. Schilling JM, Patel HH. Non-canonical roles for caveolin in regulation of membrane repair and mitochondria: implications for stress adaptation with age. J Physiol. Aug 15 2016;594(16):4581-4589.

72. Schlegel A, Volonte D, Engelman JA, et al. Crowded little caves: structure and function of caveolae. Cell Signal. Jul 1998;10(7):457-463.

73. Sebastiao AM, Colino-Oliveira M, Assaife-Lopes N, Dias RB, Ribeiro JA. Lipid rafts, synaptic transmission and plasticity: impact in age-related neurodegenerative diseases. Neuropharmacology. Jan 2013;64:97-107.

74. Stary CM, Tsutsumi YM, Patel PM, Head BP, Patel HH, Roth DM. Caveolins: targeting pro-survival signaling in the heart and brain. Front Physiol. 2012;3:393.

75. Stern Y. Cognitive reserve in ageing and Alzheimer's disease. Lancet Neurol. Nov 2012;11(11):1006-1012.

76. Suzuki T, Nakaya T. Regulation of amyloid beta-protein precursor by phosphorylation and protein interactions. J Biol Chem. Oct 31 2008;283(44):29633-29637.

77. Tacutu R, Budovsky A, Yanai H, Fraifeld VE. Molecular links between cellular senescence, longevity and age-related diseases – a systems biology perspective. Aging (Albany NY). Dec 2011;3(12):1178-1191.

78. Thinakaran G, Koo EH. Amyloid precursor protein trafficking, processing, and function. J Biol Chem. Oct 31 2008;283(44):29615-29619.

79. Trushina E, Du Charme J, Parisi J, McMurray CT. Neurological abnormalities in caveolin-1 knock out mice. Behav Brain Res. Sep 15 2006;172(1):24-32.

80. van Helmond ZK, Miners JS, Bednall E, et al. Caveolin-1 and -2 and their relationship to cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease. Neuropathol Appl Neurobiol. Jun 2007;33(3):317-327.

81. Volonte D, Zhang K, Lisanti MP, Galbiati F. Expression of caveolin-1 induces premature cellular senescence in primary cultures of murine fibroblasts. Mol Biol Cell. Jul 2002;13(7):2502-2517.

82. Wagner MJ, Kim TH, Savall J, Schnitzer MJ, Luo L. Cerebellar granule cells encode the expectation of reward. Nature. Apr 06 2017;544(7648):96-100.

83. Westmark CJ. What's hAPPening at synapses? The role of amyloid beta-protein precursor and beta-amyloid in neurological disorders. Mol Psychiatry. Apr 2013;18(4):425-434.

84. Wheaton K, Sampsel K, Boisvert FM, Davy A, Robbins S, Riabowol K. Loss of functional caveolae during senescence of human fibroblasts. J Cell Physiol. May 2001;187(2):226-235.

85. Williams TM, Lisanti MP. The caveolin proteins. Genome Biol. 2004;5(3):214.

86. Williams TM, Lisanti MP. The Caveolin genes: from cell biology to medicine. Ann Med. 2004;36(8):584-595.

87. Wyss-Coray T. Ageing, neurodegeneration and brain rejuvenation. Nature. Nov 10 2016;539(7628):180-186.

88. Yamaguchi H, Hirai S, Morimatsu M, Shoji M, Nakazato Y. Diffuse type of senile plaques in the cerebellum of Alzheimer-type dementia demonstrated by beta protein immunostain. Acta Neuropathol. 1989;77(3):314-319.

89. Yao B, Christian KM, He C, Jin P, Ming GL, Song H. Epigenetic mechanisms in neurogenesis. Nat Rev Neurosci. Sep 2016;17(9):537-549.

90. Zhang T, Yao Y, Wang J, et al. Haploinsufficiency of Klippel-Trenaunay syndrome gene Aggf1 inhibits developmental and pathological angiogenesis by inactivating PI3K and AKT and disrupts vascular integrity by activating VE-cadherin. Hum Mol Genet. Dec 01 2016;25(23):5094-5110.

91. Zhao YL, Song JN, Zhang M. Role of caveolin-1 in the biology of the blood-brain barrier. Rev Neurosci. 2014;25(2):247-254.

92. Zou H, Stoppani E, Volonte D, Galbiati F. Caveolin-1, cellular senescence and age-related diseases. Mech Ageing Dev. Nov-Dec 2011;132(11-12):533-542.

93. Zschocke J, Bayatti N, Behl C. Caveolin and GLT-1 gene expression is reciprocally regulated in primary astrocytes: association of GLT-1 with non-caveolar lipid rafts. Glia. Jan 15 2005;49(2):275-287.