“Studiul expresiei proteinei precursoare a amiloidului în creierul ș oarecilor knockout la caveolin a-1” Coordonator științific, Profesor Dr. Mihail… [613932]

Universitatea de Medicină și Farmacie “Carol Davila”
București
Facultatea de Medicin ă

LUCRARE DE LICEN ȚĂ

“Studiul expresiei proteinei precursoare a
amiloidului în creierul ș oarecilor knockout la
caveolin a-1”

Coordonator științific,
Profesor Dr. Mihail E. Hinescu
Îndrumă tor,
Șef de lucrări Dr. Ana -Maria Enciu
Absolvent: [anonimizat]

2017

2

CUPRINS
INTRODUCERE ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 5
CAPITOLUL I ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………….. 6
DEMENȚA ALZHEIMER – MODEL DE BOALĂ NEURO DEGENERATIVĂ …………. 6
1.1. Date generale despre boala Alzheimer ………………………….. ………………………….. ………… 6
1.2. Diagnosticul de boală Alzheimer ………………………….. ………………………….. …………………. 6
1.3. Patogeneza bolii Alzheimer ………………………….. ………………………….. …………………………. 8
1.3.1. Teoria colinergică ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……… 8
1.3.2. Teoria proteinei tau ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……. 8
1.3.3. Teoria cascadei amiloidului ………………………….. ………………………….. …………………….. 9
i) Argumente genetice ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……. 10
ii) Argumente prin terapia bazată pe cascada amiloidului ………………………….. ……………. 10
1.4. Rolul peptidului Aβ în neurodegenerare ………………………….. ………………………….. ……. 11
CAPITOLUL II ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 14
PROTEINA PRECURSOARE A AMILOIDULUI ÎN NE URODEGENERARE ……….. 14
2.1. Familia APP ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………… 14
2.2. Structura proteinei precursoare a amiloidului ………………………….. ……………………….. 15
2.3. Ciclul celular al proteinei precursoare a amiloidului ………………………….. ……………… 16
2.3.1. Fosforilarea ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………….. 16
2.3.2. Căile de metabolizare a APP ………………………….. ………………………….. …………………. 17
i) α-SECRETAZA ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………. 18
ii) β-SECRETAZA ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………… 18
iii) γ-SECRETAZA ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……….. 19
2.4. Relația dintre APP și microdomeniile membranare ………………………….. ……………….. 20
2.5. Funcțiile APP ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………. 21
2.5.1. Adeziunea celulară ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 21
2.5.2. Supraviețuirea neuronală și plasticitatea sinaptică ………………………….. ………………… 23
2.5.3. Semnalizare celulară și receptor de suprafață ………………………….. ……………………….. 24

3
2.6. Modele animale transgenice pentru gena APP ………………………….. ……………………….. 24
CAPITOLUL III ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………… 25
CAVEOLINELE ÎN BIOLOGIA SISTEMULUI NERVOS CENTRAL ……………………. 25
3.1. Introducere în biologia caveolelor ………………………….. ………………………….. …………….. 25
3.2. Structura caveolelor ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 26
3.3. Rolurile caveolelor ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……….. 29
3.3.1. Caveolele și transportul celular ………………………….. ………………………….. ………………. 29
3.3.2. Caveolele și homeostazia colesterolului ………………………….. ………………………….. ….. 29
3.3.3. Semnalizarea celulară și caveolele ………………………….. ………………………….. ………….. 30
3.3.4. Alte funcții ale caveolelor ………………………….. ………………………….. ……………………… 31
3.4. Caveolina -1 la nivel cerebral ………………………….. ………………………….. …………………….. 32
3.4.1. Rolul caveolinei -1 în neurogenez ă ………………………….. ………………………….. …………. 32
3.4.2. Rolul caveolinei -1 în îmbătrânirea neuronală ………………………….. ……………………….. 32
3.5. Corelații între caveolina -1 și boala Alzheimer ………………………….. ………………………… 34
3.6. Interacțiunea dintre APP și caveolina -1 ………………………….. ………………………….. …….. 34
CAPITOLUL IV ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………… 36
4.1. Premise și ipoteze de lucru ………………………….. ………………………….. ………………………… 36
4.2. Obiective ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………… 37
4.3. Materiale și metode ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……… 37
4.3.1. Animale de laborator ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 37
4.3.2. Lizatul de proteine ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 38
4.3.3. Determinarea concentrației de proteine ………………………….. ………………………….. …… 38
4.3.4. Western Blot (WB) ………………………….. ………………………….. ………………………….. ….. 39
4.3.5. Electroforeză nativă (EN) ………………………….. ………………………….. ……………………… 40
4.3.6. Densitometria optică și analiza statistică ………………………….. ………………………….. …. 41
4.3.7. Extracție de ARNmesager ………………………….. ………………………….. ……………………… 41
4.3.8. Dozarea ARN ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 42
4.3.9. Reverse Transcriptase Polimerase Chain Reaction (RT -PCR) ………………………….. … 42
4.3.10. Q -RT PCR (semicantitativ) ………………………….. ………………………….. …………………. 43
4.4. Rezultate ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………… 44
4.4.1 Analiza nivelului caveolinei -1 și a proteinei precursoare a amiloidului în creierul
șoarecilor C57Bl/6J ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………… 44
4.4.2 Analiza modificărilor de nivel al proteinei precursoare a amiloidului în creierul
șoarecilor transgenici Cav1tm1 Mls/J, comparativ cu tulpina C57Bl/6 ………………………….. 46

4
4.4.3 Analiza modificărilor cantitative ale proteinei precursoare a amiloidului, diferenți at pe
zone corticale, la șoarecii Cav1tm1Mls/J și tulpina control ………………………….. …………….. 47
4.4.4. Testarea asocierii dintre caveolina -1 și APP prin electroforeză nativă …………………. 49
4.4.5.Testarea fosforil ării proteinei precursoare a amiloidului la șoarecii control C57Bl/6J
versus șoarec ii transgenici Cav1tm1Mls/J ………………………….. ………………………….. ………… 49
4.4.6. Evaluarea expresiei genice a proteinei precursoare a amiloidului prin PCR cantitativ
………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 51
4.5. Discuții ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………… 54
CONCLUZII ȘI DIRECȚI I VIITOARE ………………………….. ………………………….. …………. 61
ANEXE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …. 63
Anexa 1. Articole publicate ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 63
Anexa 2. Participări la congrese cu prezentări orale și premii obținute …………………….. 75
Anexa 3. Lista figurilor ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……… 76
Anexa 4. Lista tabelelor ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……… 77
Anexa 5. Lista abrevierilor ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 78
BIBLIOGRAFIE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………….. 79

5

INTRODUCERE

Lucrarea de licență cu titlul “ Studiul expresiei proteinei precursoare a amiloidului în
creierul șoarecilor knockout la caveolina -1” propune evaluarea expresiei proteinei
precursoare a amiloidului, implicat ă în patologia bolii Alzheimer, într -un model non –
mutațional d e neurodegenerare – șoarece de laborator knockout pentru gena caveolinei -1.
Prima parte a lucrării prezintă noțiuni generale despre boala Alzheimer, verigi
implicate în patogene ză și prezentarea detaliată a proteinei precursoare a amiloidului (ciclu
celular, clivaj enzimatic, activare prin fosforilare). Pentru a explica relația dintre
neurodegenerare și caveolina -1, ultimul capitol al părții generale este dedicat caveolelor și
rolului lor biologic, accentul fiind pus pe neurobiologie.
Partea specială a fost efectuată în Institutul Național de Patologie “Victor Babeș” din
București, în cadrul unui proiect PNII Resurse Umane. Folosind tehnici de biologie celulară și
moleculară (elect roforeză de proteine, western blot, reacție de polimerizare în lanț în timp
real), am demonstrat că în creierul șoarecilor knockout pentru caveolina -1 scade nivelul
proteinei precursoare a amiloidului, iar scădere a nivelului proteic variază cu regiunea
analizată. În final, am investigat modificările fosforil ării proteinei precursoare a amiloidului
induse de lipsa caveolinei -1.
Activitatea de cercetare desfășurată s -a concretizat în publicarea a 2 articole (1 articol
ISI, 1 articol indexat în baze de date in ternaționale) și participarea în cadrul a 3 congrese cu
prezentări orale (2 congrese naționale, 1 congres studentesc internațional), în urma cărora am
obținut două premii întâi ( unul național, unul internațional).

6

CAPITOLUL I

Demența Alzheimer – model de boal ă neurodegenerativ ă

Boala Alzheimer descrisă pentru prima dată în 1907 de medicul german Alois
Alzheimer, este cea mai comună formă de demență neurodegenerativă, ireversibilă și
progresivă, ce afectează arii întinse din cortexul cerebral. Ace st tip de demență este asociat cu
acumularea unei proteine insolubile numită β -amiloid (Aβ) sub formă de plăci extracelular și
în pereții vaselor cerebrale împreună cu agregate intraneuronale formate din proteine tau
hiperfosforilate.
1.1. Date generale despre boala Alzheimer
Prevalența bolii Alzheimer este de 10 -30% în populația peste 65 ani cu o incidență de
1-3%50 în populația generală. În ceea ce privește distribuția pe sexe, există o mai mare
prevalența în rândul femeilor, însă pacienț ii de sex masculin au o speranța de viață mai
scăzută, ajungând să decedeze din alte cauze înainte ca demența să se manifeste clinic. În
România se consideră că există peste 270.000 de pacienți cu demență Alzheimer, dintre care
mai mult de jumătate sunt pa cienți de sex feminin.
Au fost identificate două forme ale acestei boli: boală Alzheimer familială (1 -5%) și
boală Alzheimer sporadică (>95%). Modificările genetice care duc la apariția BA familiale
sunt mutații autozomal dominante la nivelul genei APP (Go ate și colab., 1991), genei pentru
PS1 și PS2 (Campion și colab., 1995; Sherrington și colab., 1996), care duc la procesarea
deficitară a proteinei precursoare a amiloidului. Forma sporadică se consideră a fi cumulul
unor factori genetici dar și din mediul înconjurător (Huang & Mucke, 2012). În funcție de
vârsta de debut poate fi clasificată în două forme: cu debut rapid ( <60 ani) sau cu debut tardiv
(>60 ani), fiind consecința incapacității de eliminare de la nivelul creierului a peptidului Aβ.
1.2. Diagno sticul de boală Alzheimer
Datorită polimorfismului simptomelor din demență, atribuirea bolii Alzheimer unui
pacient pe considerente strict clinice este dificilă și poate să îi excludă pe cei cu modificări
cognitive ușoare (figura 1.1.) . Diagnosticul de boa lă Alzheimer se poate pune cu acuratețe

7
folosind tehnici de imagistică PET moleculară pentru Aβ dar și prin nivelul peptidului în
lichidul cefalorahiadian după puncția lombară58. Utilizând aceste metode a fost demonstrat
faptul că depozitele se acumulează cu mult înaintea apariției simptomelor și a atrofiei
cerebrale, factorii g enetici având un rol modulator .

Figura 1.1 .-Progresia leziunilor neuronale și gliale în cadrul bolii Alzheimer (BA)
a. Interac țiunea î ntre neuroni și celulele gliale î n creierul s ănătos; b. Stadiul prodromal
caracterizat de formarea fibrilelor de β-amiloid depozitate extracelular, contribuind la
disfunc ția precoce a circuitelor neuronale și declansarea neuroinflamaț iei cu absența
manifestărilor clinice ; c. În stadiile manifeste de boală, există atât plăci de amiloid acumul ate
datorit ă unui clereance deficitar, proteine tau hiperfosforilate intraneuronal cât și proliferare a
celulelor gliale datorită inflamație i însă cu scăderea capacității de autofagi e; acestea altereaz ă
semnif icativ circuitele cerebrale scăzâ nd tonusul inhibitor cu hiperexcitabilitatea neuronilor
excitatori (adaptat după Li-Huei Tsai și colab., Nature, 2016)
Puncția lombară este o metodă de diagnostic des folosită în practica curentă
neurologică . În cazul bolii Alzheimer cel mai adesea sunt identificați în LCR Aβ -42, proteina
tau sau proteina tau fosforilata (P-tau) la Thr -181. Nivelul în LCR de Aβ -42 reflectă
depozit ele de amiloid din creier; nivelul de proteină tau este crescut și în alte boli
neurodegenerative având legătură cu intensitatea procesului de degenerare axonală și
neuronală; nivelul LCR de P -tau se corelează cu rata de atrofie a hipocampului și progresia
clinică rapidă. Dorința de a face cât mai ușor și facil diagnosticul maladiei Alzheimer a dus la
apariția mai multor biomarkeri din plasmă și mai ales din LCR. Creșterea expresiei BACE -1
și a activității sale enzimatice a fost pusă în evidență în creierul prelevat postmortem de la
pacienții diagnosticați cu Alzheimer54-58. Forma solubilă a APP este secretată în spațiul
extracelular și apoi în LCR (sAPPα ori sAPPβ), însă nivelul acestora rămâne nemodificat pe
parcusul evoluției bolii. Prezența oligomeriilor Aβ în LCR este greu de pus în evidență și de
monitorizat prin comparație cu isoformele β -amiloidului, fiind în studiu la momentul actual
inclusiv utilizarea de autoanticorpi pentru diagnostic, însă din cauza variabilității valorilor, nu
au relevanță clini că momentan.

8
1.3. Patogeneza bolii Alzheimer
Pentru a explica patogeneza acestei boli neurodegenerative au fost formulate mai multe
ipoteze: i) Ipoteza colinergică ; ii) Ipoteza proteinei ta u; iii) Ipoteza cascadei amiloidului .
1.3.1. Teoria colinergică
Este cea mai veche ipoteză , plecând de la observarea unui nivel scăzut de colin -acetil –
transferaza și acetil -colin -esteraza în cortexul cerebral (Davies & Maloney, 1975). Studii in
vitro au arătat că peptidul Aβ inhibă neurotransmițătorii colinergici (Karl & Auld, 1998).
Pentru a îmbunătății transmiterea nervoasă, au fost utilizați agenți terapeutici ce acționează c a
stimul pre – și postsinaptic colinergic (Hebert și colab., 2003) , fiind a probați pentru tratamentul
BA ușoare și medii patru inhibitori de colinesterază: tacrine, donezepil, rivastigmina și
galantamina. Administrarea pe o perioada lungă de timp la pacienții cu afectare cognitivă
ușoară (Mild Cognitive Impairment) nu a dus la re ducerea riscului de apariție sau întârziere a
debutului bolii. Reacțiile adverse precum tulburări gastrointestinale, cardiovasculare,
neuromusculare fac dificilă administrarea lor în BA (Raschetti și colab., 2007).
Neurotrofinele au un rol important în reglarea funcțiil or neuronale, modificările
acestora duc la scăderea transmiterii colinergice (Schindowski și colab., 2008) mai ales în
neocortex și hipocamp în cadrul BA (Murrer și colab., 2001). Familia de proteine include
factorul de creștere neuronală (NGF – nerve growth factor), factorul neurotrofic cerebral
(BDNF – brain -derived neurotro phic factor), neurotrofina -3 (NT -3), neurotrofina -4=5 (NT –
4=5) și neurotrofina -6 (NT -6). Utilizarea neurotrofinelor în tratamentul bolii Alzheimer
reușește să readucă la normal funcțiile neuronale. Deoarece nu traversează barieră
hematoencefalica, au fost injectate intracerebral fibroblaste modificate genetic care au
capacittea de a secretă NGF, astfel are loc îmbunătă țirea memoriei și scăderea turn overul
colinergic (Tu szyncki și colab., 2005).
1.3.2. Teoria proteinei tau
Din punct de vedere anatomopatologic, putem diagnostica boala Alzheimer prin
prezența intraneuronala a unor neurofibrile alcătuite dintr -o rețea de proteine tau
hiperfosforilate (Forman și colab., 2004 ). În mod fiziologic, aceste proteine se găsesc
majoritar la nivel neuronal aparținând familiei de proteine asociate microtubulilor, cu rol
principal în asamblarea și stabilizarea rețelei citoscheletale. Fosforilarea proteinei tau apare
din stadiul fetal c ontinuând apoi în cortexul adult ului, proteinele implicate în acest proces
fiind GSK -3β, cdk 5, MAPK cu p25. Hiperfosforilarea la nivelul aa. 181 sau aa. 231 este
evenimentul patogenic care duce la creșterea anormală a proteinei tau în citosol și la

9
polimerizare cu formare de filamente care se organizează într -o rețea dezor ganizată de
neurofibrile (Kopke și colab., 1993). Astfel, funcția pe care proteină t au o are la nivel cerebral
se pierde, fiind afectată atât morfologia cât și transportul axonal al neurotransmițătorilor din
cauza modificărilor citoscheletului (Roy și colab., 2005). Deoarece mecanismul patogenic
identificat este hiperfosforilarea urmată de împachetarea deficitară și agregarea proteinelor
tau, au fost propuse c a și țintă terapeutică k inazele implicate (litiu cu inhibiția GSK -3β,
flavopiridol cu inhibiția cdk 5) dar și fosfataze care să acționeze asupra P -tau. Având în
vedere multitudinea substraturilor asupra cărora aceste enzime acționează, terapiile au multe
reacții adverse, reprezen tând momentan un impediment (Gong & Iqbal, 2008).
1.3.3. Teoria cascadei amiloidului
Neurodegenerarea apare, conform ipotezei cascadei amiloidului, datorită acumulării
plăcilor Aβ în regiuni variate ale creierului (Hardy & Higgins, 1992; Evin & Weidemann,
2002) care duc la disfuncție și moarte, fiind specifice bolii Alzheimer (figura 1.2.) .

Figura 1.2. – Ipoteza cascadei amiloidului la nivelul sistemului nervos central
Conform (1) are loc clivajul enzimatic al APP cu generarea Aβ urmată de eliberarea formei
solubile care poate urma două căi: în circulația generală prin intermediul astrocitelor și al
capilarelor cerebrale (2) sau cu formarea de agregate insolubile (3) și plăci de amiloid care
afectează sinaps ele ducând la neuroinfl amație (5) însă pot fi degradate (4) de către macrofage
și microglii ( adaptat după Cummings și colab., Nature, 2015)
Această teorie susținută de aspecte genetice, biochimice și elemente
anatomopatologice, propune c a prim eveniment și cauz ă principal ă pentr u apariția demenței,
acumularea de peptid Aβ (Goate și colab.,1991; Chen și colab., 2000; Kayed și colab., 2003).

10
Componentul principal al plăcilor senile este peptidul Aβ, rezultat prin clivajul
secvențial al β -secretazei și γ -secretazei asupra proteinei precursoare a amiloidului de la
nivelul membranei celulare. Lungimea acestui peptid variază în funcție de situsul de acțiune
al secretazelor, Aβ1 -40 este cel mai frecvent, dar și Aβ1 -42, cu caracter hidrofob și cu ritm de
agregare rapid. Plăcile de amiloid înconjoară axonii și dendritele ducând la pierdere neuronală
și atrofie cerebrală globală, însă gradul de acumulare al peptidului nu se corelează cu gradul
disfuncției cognitive sau cu numărul de neuroni pierduți. Mai mult, studiul modelelor animale
pentr u demonstrarea neurotoxicitatii peptidului Aβ nu a elucidat complet teoria propusă, un
intermediar cheie între procesul de amiloidogenez ă și neurodegenerare este necesar pentru un
mecanism patogenic complet (Nelson și colab., 2012; Serrano -Pozo și colab., 2013).
i) Argumente genetice
Mutațiile genei pentru APP, PS1 și PS2 (presenilin ă) sunt autozomal dominante și se
regăsesc frecvent în cadrul demenței Alzheimer familiale, cu creșterea anormală a producție
de peptid Aβ. În afară de acestea, a fost identificată alel a ε4 pentru gena apolipoproteinei E
(APOEε4), ca factor de risc independent pentru boala Alzheimer cu debut lent. Gena pentru
APOE este localizată pe cromozomul 19 și reprezintă factorul de risc cel mai important pentru
dezvoltarea bolii A lzheimer. APOE este implicat în catabolismul lipoproteinelor bogate în
trigliceride și este exprimată puternic la nivel cerebral. Apolipoptroteina E crește nivelul de
peptid și agregarea sa, împiedicând inclusiv clearance -ul de la nivel cerebral (Ma și co lab.,
1994; Wisniewski și colab., 1994; Castano și colab., 1995).
ii) Argumente prin terapia bazată pe cascada amiloidului
Scăderea producției de Aβ se face prin inhibarea β sau γ -secretazei ori prin activarea α –
secretazei.
i) inhibarea BACE -1: deși aceșt i inhibitori scad nivelul Aβ atât la modele
animale cât și în culturile celulare, capacitatea lor de a penetra bariera hematoencefalica este
scăzută (Hong -Qi și colab., 2012);
ii) inhibarea γ -secretazei : există mai mulți inhibitori selectivi pentru PS 1 sau
PSEN2, însă interacționează cu procese fiziologice dintre care cel mai important este calea
semnalizării Notch (Borgegard și colab., 2012); există anti -inflamatoare nonsteroidiene
precum ibuprofen, indometacin care scad producția de Aβ1 -40 și cresc produ cția de Aβ1 -38
(Weggen și colab., 2003).
iii) activatori ai α -secretazei : proteaze din familia ADAM și TACE (tumor
necrosis factor -α convertase) au acțiune asemănătoarei secretazei ce clivează APP; șoarecii

11
transgenici pentru ADAM10 au depozite de amiloid scăzute în hipocamp cât și funcții
neurologice îmbunătățite (Postina și colab., 2004); există kinaze ce activează α -secretaza sau
substanțe ( exemplu: sirtuin -1) ce cresc expresia ADAM10 cu efecte pozitive asupra plăcilor
de amiloid (Donmez, 2010).
1.4. Rolul peptidului Aβ în neurodegenerare
Monomerul Aβ (~4 kDa) este produsul majoritar obținut din APP (~120 kDa) prin
clivaj succesiv al β – respectiv γ -secretazelor. După cum am detaliat mai sus, există o
heterogenitate a peptidelor generate mai ales de clivajul γ. Acestea au solubilitate, stabilitate
și toxicitate diferită în funcție de numărul de aminoacizi. Se formează aproximativ 20 de
tipuri de peptide (Aβ40 în mod majoritar) cu rol fiziologic în creierul sănătos și tendința mare
la agregare, cu form are de oligomeri și protofibrile. Deși studiile s -au concentrat pe peptidul
Aβ42, mecanismul de apartitie a bolii ar putea să fie influențat de prezența altor specii de
peptide (Poertelius și colab., 2010). Studiile demonstrează că formarea oligomerilor Aβ este
un proces complex, aceștia fiind stabili și cu mare potențial neurotoxic (Lee și colab., 2011).
Peptidului Aβ are un rol central în patogeneză demenței Alzheimer, însă mecanismul
exact nu este cunoscut. Este acesta trigger al procesului de neurodegen erare? Oare acumularea
peste un nivel prag duce la moarte neuronală sau este un proces continuu de acumulare și
apoptoz ă neuronală? Faptul că mutațiile genelor pentru APP sau PS duc la acumularea
substratului patogenic pentru dezvoltarea demenței, leagă Aβ de boal a Alzheimer însă este
necesar un mecanism care să explice moartea neuronală și implicit apariția neurodegenerarii.
Cantitatea de β -amiloid nu se corelează cu gradul deficitului cognitiv, în creierul uman se
găsesc plăci de amiloid cu mult înain tea debutului semnelor clinice. Experimentele sugerează
existența mai multor specii Aβ solubile, care au efect sinaptotoxic, însă nu se cunoaște dacă
toxicitatea este asociată cu dimeri, trimeri, amilosferoide sau protofibrile – ansambluri sferice
de aprox 5 n m diamet ru asociate în structuri de 200 nm lungime. Ipoteza oligomerilor Aβ
toxici a fost propusă deoarece există o lipsa de corelație între cantitatea depozitelor de amiloid
și efectul neurodegenerativ, de scădere a funcțiilor cognitive descris în boala Alzheimer.
Aproape toate tipurile de oligomeri induc modificări sinaptice și de potențial în hipocamp,
afectează neurotrasmiterea și duc la deficite de memorie la modele murine. Sinaptotoxicitatea
Aβ-oligomer mediată se corelează cu deficitul cognitiv obse rvat la începutul bolii. La acest
efect toxic se adaugă efectele oligomerilor dar și acțiunea proteinei tau, ducând la
neurodegenerare ireversibilă.
Se presupune existența unui feedback între agregatele Aβ și protein a din care peptidele
sunt generate (APP ), deoarece există dovezi că oligomerii activează procesarea APP în

12
neuroni (Salinas și colab., 1995), dar și faptul că producția și acumularea Aβ , deși majoritar
sinaptică, are potențialul de a se lega de APP cu distribuț ia sinaptică a depozitelor de amil oid
atât la șoarecii transgenici cât și în boală Alzheimer (Harris și colab., 2010; Lazarov și colab.,
2002; Sheng și colab., 2002; Thal și colab., 2002). Form a fibrilară și nu cea monomerica
promovează acumularea și multimerizarea APP -ului la nivelul supr afeței celulare în astrocite
și neuroni (Lu și colab., 2003; Melchor și colab., 2000; Tsuruma și colab., 2012; White și
colab., 2003). În creier s -a demonstrat că APP -ul se acumulează în neuroni în apropierea
plăcilor fibrilare de Aβ (Grace și Busciglio, 2 003). Supraexpresia APP -ului la nivelul
neuronilor în cadrul demenței familiale promovează apoptoza printr -un mecanism ce implică
Go, c -Jun kinaza dar și activare prin kinaza p21 (Niikura, 2004; McPhie, 2003). Atât în
creierul bolnavilor de Alzheimer cât ș i în creierul șoarecilor transgenici, neuronii exprimă o
activitatea crescută a PAK în jurul plăcilor de amiloid (Ma și colab., 2008).
Sinaptotoxicitatea presupune inhibiția LTP în regiunea CA1 a hipocampului, împreună
cu reducere în dimensiuni și densita te a spinelor dendritice, dar facilitarea LTD. LTP
(potențarea de lungă durat ă) a fost pentru prima dată descrisă în 1966 de către Terje Lomo și
Tim Bliss, demonstrând că aplicarea uno r stimuli electrici de frecvență mare la nivelul
neuronilor din hipocamp duce la un răspuns sinaptic mai eficient, mai puternic. Acesta este
considerat a fi unul din mecanismele principale implicate în învățare și memorie care, datorită
persistenței fenomenului (între câteva minute până la câteva luni), îl diferențiază de alte forme
de plasticitate sinaptică (Bliss și colab., 2006). Stimularea cu freceven ță înaltă determina
eliberarea neurotransmițătorilor (glutamat) în fantă, activează LTP și o serie de protein kinaze
(PKA, PKC, CaMKII) care duc la transcriere genică, sinteză de proteine și modificări de
expresie genică (Lynch M., 2004). Tot prin aceste kinaze și mai exact prin CaMKII este
crescută conductanța AMPA datorită fosforilării receptorului AMPA (AMPA -R-receptor non –
NMDA pentru glutamat care este mediază transmiterea s inaptică rapidă în SNC, cu transport
al ionilor de Na+ și K+). LTD sau depresiunea de lungă durata are ca efect “scăderea”
răspunsului sinaptic de stimulare a aferen țelor neuronilor după o stimulare cu pulsuri de mică
frecvență (2 -10 Hz) un timp îndelungat (spre exemplu: 15 minute). În mecanismul AMPAR –
LTD cunoscut defapt că NMDAR -LTD (A) Ca2+ care intră prin aceste canale se leagă de
calmodulina care activează protein fosfataza 2B (PP2B – calcineurin ă), care prin defosforilare
duce la activarea proteinei fosfatazei 1 (PP1). PP1 poate elimina –PO 4 de la nivelul mai
multor proteine țintă, c u internalizarea receptorilor AMPA prin endocitoz ă cu vezicule
acoperite de clatrină și implicit la LTD.
Având în vedere rolul LTP de la nivelul hipocampului și faptul că demența senilă
afectează această structură, există studii care încearcă să găsească un mecanism care să lege

13
cele două procese. Rowan propune în 2003 un model prin care apare scăderea LTP în boala
Alzheimer. În urmă procesării deficitare a proteinei prec ursoare a amiloidulu i se formează
peptidul Aβ, forma solubilă și form a fibrilară de la nivelul plăcilor de amiloid. Acumularea
Aβ solubil duce la scăderea potențării sinaptice de lungă durat ă, afectând hipocampul în
fazele precoce ale bolii, pe când depozitele de amiloid duc la un declin cognitiv tardi v.

14
CAPITOLUL II

Proteina precursoare a amiloidului în neurodegenerare

Descoperită în 1987 de Kang și colaboratorii ca sursă pentru β -amiloid, mai târziu
fiind pusă în evidență gena responsabilă de cod ificarea proteinei la nivelul cromozomului 21
de către Goldgaber și Tanzi, funcția fiziologică a acestei proteine este și la momentul actual
puțin înțeleasă.
2.1. Familia APP
Din familia proteinelor precursoare a amiloidului (APP) fac parte 3 isoforme ale APP
(APP 695, APP 751, APP 770) și 2 proteine APP -like: APLP 1 si APLP 2 (Sprecher & Wasco,
1993). Aceste 3 isoforme se formează prin splicing între exonul 7 și 8 al brațului lung al
cromozomului 21, APP având până la 770 de am inoacizi în formă cea mai lun gă (figura 1.3.).
La nivel neuronal, APP 695 se găsește în proporție mult mai mare comparativ cu celelalte două
forme, acestea vari ază în funcție de regiunea cerebrală, dar și de patologie, având roluri
diferite funcțional și metabolic. Celelalte două isofo rme sunt exprimate în celulele gliale.

Figura 1.3. – Structura proteinelor din fami lia APP
Glicoproteine membranare tip I : APLP1 ș i APP 695 nu prezint ă domeniu KPI (Kunitz protease
inhibitor) ș i OX2, care î nsă este prezent la APLP2 și APP 770 , în timp ce APP 751 prezint ă
doar domeniul KPI (adaptat după Nalivaeva și Turner, Elsevier, 2013)

De-a lungul dezvoltării cerebrale, cele 3 isoforme sunt exprimate diferit, expresia genei
fiind reglată de hormoni, factori de creștere și interleukine9,83 . Recent a fost demonstrat rolul
microRNA -urilor, în special miR -101 și miR -153, care reglează expresia genică, scăzând

15
nivelul de proteină precursoare a amiloidului, cu o contribuție majoră în neurodegenerare, în
special boala Alzheimer . Proteina precursoare a amilo idului are la nivel neuronal o localizare
membranară și o procesare enzimatică diferită de alte celule periferice: limfocite, hepatocite
sau celule pancreatice. Deși secvența aminoacizilor din structura APP este conservată, există
o diferența de 3 aminoaci zi la nivelul β -amiloidului între cel uman și cel al rozătoarelor. Acest
lucru face ca și capacitatea peptidul β1 -42 de a formă agregate de amiloid să fie mai scăzută
la acest tip de mamifere, fiind protejați constitutiv de acțiunea proteolitică a β -secre tazei9,83
astfel șoarecii folosiți c a și modele animale pentru boala Alzheimer sunt modele transgenice,
care exprimă proteina umană, isoforma 695.
2.2. Structura proteinei precursoare a amiloidului
Proteina precursoare a amiloidului este o glicoproteina membranară de tip I, cu un
capăt N -terminal voluminos, un domeniu transmembranar unic și porțiunea C -terminală
intracitoplasmatic ă, fiind exprimată atât la nivel neuronal cât și non -neuronal, de la nematode
până la mamifere.

Domeniul
APP
Proteina de
legare
Func ția
Referin ță
AICD
Proteina G Molecule de semnalizare pe
calea proteinelor G Nishimoto și colab.
(1993)
Abl, Shc/Grb 2,
JIP, Dab Cascada de semnalizare
mediată de kinaze Russo și colab. (2002)
Fe65, JIP Transcrip ția genelor Roncarati și colab.
(2002)
Tarr și colab. (2002)
Nedescoperit Neurotoxic, prin semnale
GSK3β Kim și colab. (2003)
sAPP Nedescoperit
Neurotrofic
Creștere neuronal ă
Plasticitate sinaptic ă
Excitabilitate neuronal ă Revizuit in Mattson și
colab.( 1997)
Revizuit in Turner și
colab. (2003)
Tabelul I – Funcțiile domeni ului intracitoplasmatic și al formei solubile a APP
Ectodomeniul proteinei precursoare a amiloidului are o structura complexă, se împarte
în domeniile E1 și E2, primul având două subdomenii importante: domeniul de legare pentru
Cu2+ și domeniul asemănător factorului de creștere. Domeniul intracitoplasmatic (AICD) este
scurt și reprezintă zona care interacționează cu alte proteine, zona aa.682 -687 fiind conservată
de la C. elegans la oameni. S tructura spațială a zonei intracitoplasmatice depinde de proteinele
cu care formează legături, legarea duce la stabilizare a proteinei (DeStrooper și Annaert,
2000). Fosforilarea domeniului AICD este esențială pentru legarea unor proteine precum

16
Fe65, Fe65L 1, Mint1/X11α, Dab1, familia kinazelo c -Jun (Ando și colab., 2001). Domeniul
intracitoplasmatic conține 8 situsuri de fosforilare însă fosforilarea treoninei din poziția 668
este cea mai studiată datorită implicării în diferențierea neuronală. Acest proces de fosforilare
se pare că influențează atât formarea cât și stabilitatea complexului AICD -ligand dar participă
și în semnalizare, ducând la activarea γ -secretazei cu clivarea proteinei precursoare a
amilodului (Lee și colab., 2003).
Studiile au arătat că proteina precursoare a amiloidului are rol în reglarea adeziunii
celulare, contribuind la creșterea neuronală și sinaptogeneza, fără să aibă o structura ce se
aseamănă cu molecule implicate în adeziune precum integrinele. Porțiunea intracitoplasmatic ă
este responsabilă de interacțiunea cu citoscheletul, astfel clivajul proteolitic al APP și
porțiunea C -terminală ar putea să fie implicate în semnalizare. Funcția ectodomeniul este mai
puțin cunoscută, homeostazia cuprului și formarea dimerilor fiind doar o parte din funcțiile
descoperite momentan.
2.3. Ciclul celular al proteinei precursoare a amiloidului
APP-ul imatur este sintetizat la nivelul reticulului endoplasmatic, transportat către
aparatul Golgi unde au loc procesele de N -glicozilare, O -glicozilare precum și fosforilarea
ectodomeniului și a porțiunii intracitoplasmatice rezultând astfel proteina matură împachetată
în vezicule secretorii. Această proteină este transportată la nivelul membranei neuronale, de
unde poată să fie internalizată prin endosom i în câteva minute și recirculată către alte
compartimente (dendrite) sau degradată lizozomal (Back și colab., 2007). Majoritar, proteina
precursoare a amiloidului se găsește intracelular și în procent de 10 -20% la nivel
plasmalemal, pre – și postsinaptic î n structuri ale țesutul nervos central și periferic, având rol
de creștere și plasticitate neuronală (Ashley și colab., 2005).

2.3.1. Fosforilarea fiziologică a APP -ului are loc majoritar la nivelul Thr668 fiind
observată în neuroni (APP matur) dar și în celulele aflate în diviziune (APP imatur în special)
sau în condiții de stress celular. Aceste proces de fosforilare dependent de CDK5, GSK -3β și
JNK induce modificări conformaționale ale regiunii citoplasmatice, care duc la reglarea și
inducera interacți unii cu alte proteine precum Fe6529,63. La nivelul intracitoplasmatic există 8
regiuni de fosforilare ale proteinei precursoare a amiloidului: Tyr -653; Thr -654; Ser -655; Ser –
675; Thr -668; Tyr -682; Thr -686 și Tyr -687 pentru isoforma APP 695. În urmă acestui proces
fiziologic există modificări ale procesării enzimatice și localizării celulare a APP. Se
consideră că fosforilarea Thr -668 contribuie la norma lizarea funcțiilor neuronale însă rolul
exact fiziologic nu se cunoaște. Există studii prin care se demonst rează că fosforilarea

17
proteinei precursoare a amiloidului la acest nivel este implicată direct în patogenez a bolii
Alzheimer, prin modificarea conformației și a interacțiunii cu alte proteine/metale (Ramelot și
colab., 2001). Atât în creierul șoarecilor da r și în creierul pacienților cu BA, doar forma
matură APP (O -glicozilat) este fosforilat ă. GSK3β, SAPK1b/JNK3 și Cdk5 sunt kinazele
implicate în acest proces la nivel neuronal, fiind asociate cu neurotoxicitate dar și alte boli
neurodegenerative (Iijima și colab., 2000; Liu și colab., 2003; Rockenstein și colab., 2007).
Acidul okadaic , inhibitor al fosfatazei -2A, a fost folosit pentru a crește procesul de fosforilare
la modele animale inducând în cele din urmă moarte neuronală. AO duce la creșterea
nivelul ui APP și acumularea la nivel axonal, cale care este reglată de c -Jun N -terminal kinaza
(c-JNK)5. Cdk -5 este o kinaza de dimensiuni mici implicată în dezvoltarea SNC, având că
subunitate reglatorie p35, cuplarea celor două proteine ancorate la membrana cel ulară
declanșează fosforilarea (Liu și colab., 2003).
Această procesare a APP facilitează clivajul de către BACE -1, contribuind la creșterea
cantității de amiloid -β (Lee și colab., 2003). Într -un studiu din 2012 a fost demonstrat faptul
că formele non -fosforilate ale CTF sunt asociate microdomeniilor membranare/plutelor
lipidice unde se găsește cu precădere γ -secretaza, pe când fragmentele fosforilate se regăsesc
în fracțiunile citoplasmatice (Matsushima și colab., 2012). Astfel fosforilarea la Thr -668
influențează conformația porțiunii intracitoplasmatice, localizarea subcelulară APP -ului și
procesarea de către γ -secretaz ă.
2.3.2. Căile de metabolizare a APP
Proteina precursoare a amiloidului va fi procesată prin clivaj proteolitic, în două etape
succesive, sub acțiunea unor enzime denumite secretaze datorită secreției substratului clivat.
Există două c ăi de metabolizare: calea non -amiloidogenica , sub acțiunea α -secretazei și
calea amiloidogenica , sub acțiunea β -secretazei (figura 1 .4.). Cele două căi se inf luențează
reciproc deoarece a fost observat atât în culturi celulare cât și la modele animale că stimularea
activității α -secretazei duce la scăderea producerii Aβ și chiar a formării plăcilor senile
(Postina și colab., 2004).
Peste 90% din metabolismul pr oteinei implică acțiunea α -secretazei urmată apoi de γ –
secretaz ă, ducând la formarea formei solubile a APP (sAPPα). Din calea non –
amiloidogenetic ă rezultă această proteină cu o greutate moleculară de 100 -120 kDa și funcție
neuroprotectiv ă, alături de domen iul intracelular al proteinei (AICD) cu rol în semnalizarea
nucleară (Kojiro & Selkoe, 2003; von Rotz și colab., 2004) și fragmentul polipeptidic p3 spre
capătul N -terminal.
În calea amiloidogenica , clivarea APP -ului sub acțiunea β -secretazei formează sAPP β

18
și un fragment C -terminal ancorat de membrana celulară (C99 -βCTF), care apoi este clivat de
γ-secretaza (Nunan & Small, 2000). Se formează peptidul Aβ al ături de domeniul intracelular
al proteinei. Peptidul Aβ este principalul component al plăcilor amiloide extraneuronale,
elementul patogenic central din boala Alzheimer. Deoarece γ -clivajul este heterogen, peptidul
generat poate să aibă lungimi diferite, Aβ 1-40 fiind cel mai abundent și solubil pe când Aβ1-
42 cel mai agregabil (McGowan și colab., 2006).

Figura 1.4. – Căile de metabolizare a APP
(Sursă: Hooper si colab., Trends in molecular medicine, 2005)
i) α-SECRETAZA acționează la nivelul domeniului amiloidogenic între Lys16 și
Leu17 rezultând sAPPα și CTF -α (C83), fiind activată de protein kinaza C (PKC). Există
zinc-metaloproteinaze că ADAM9, ADAM10, TACE/ADAM17 și ADAM19 ce pot funcționa
ca și α -secretaze, Kuhn dem onstrând că cel puțin la nivel neuronal principala activitate de
clivare o are ADAM10. Proteine precum Notch, TNFα dar și alte proteine transmembranare
de tip I sunt clivate sub acțiunea unei α -secretaze. Dacă calea patogenică este favori zată în
neuroni da torită abudenț ei BACE1, calea non -amiloidogenică este predominantă în toate
celelalte tipuri celulare. Supraexpresia ADAM10 în culturi celulare sau modele transgenice
duce la scăderea procesării BACE1 și implicit la scăderea depozitelor de amiloid. În cond iții
fiziologice, ADAM10 este exprimat în țesutul hipocampic și în cortex, fiind co -exprimat cu
BACE1 în neuronii corticali maturi. Scăderea colesterolului stimulează α -clivajul,
mecanismul implicat nu este specific pentru APP (Matthews și colab., 2003).
ii) β-SECRETAZA mediază inițierea și procesul limitativ de generare a peptidului Aβ
(Vassar, 2004) fiind singura descoperită cu activitate amiloidogenica iar knockout -ul genei
blochează întreagă generare a peptidului Aβ (Cai și colab.,2001, Luo și colab., 2 003). A fost

19
identificată o singură β -secretaz ă primind numele general acceptat de BACE -1 (β-site APP
cleaving enzyme -1/ enzima de clivare a β -sitului APP) , o aspartil -protează cu activitate la
nivel luminal/ spațiu extracelular, exprimată ubiquitar, cu c el mai mare nivel în creier și
pancreas. BACE -2, o protează homoloaga a fost descoperită, însă această are o acțiune
asemănătoare cu α -secretaza, exercitând un efect protector anti -amiloidogenic la nivel non –
neuronal (Fluh rer și colab., 2002; Bas i și colab ., 2003). Faptul că la nivel cerebral este
exprimată concomitent și protein a precursoare a amiloidului împr eună cu această protează
face ca în creier să se genereze cantități mari de peptid Aβ, explicând de ce boal a Alzheimer
este una ce afectează creierul deși enzimele sunt exprimate ubiquitar.
BACE1 este o țintă terapeutică importantă, deoarece inhibiția duce nu numai la
reducerea nivelului Aβ dar previne și acumularea de fragmente C -terminale β (βCTF), ce
conțin întreg domeniul responsabil de generarea p eptidului și servind în final la producerea lui
prin clivaj. Șoarecii knockout pentru gena BACE1 sunt viabili și fertili, fără să exprime
modificări morfologice, de dezvoltare sau de comportament (Cai și colab., 2001, Roberds și
colab., 2001). Deoarece niv elul BACE 1 este mult ridicat postnatal, a fost pus în legătură cu
mielinizarea care se derulează în primii 2 ani de viață, astfel a fost observat un fenotip
hipomielinizant la șoarecii K.O. pentru β -secretaz ă.
iii) γ-SECRETAZA este un complex alcătuit di n 4 subunități, presenilina 1 (PS1) sau
presenilina 2 (PS2), nicastrina (NCT), APH -1a/APH -1b și activatorul de presenilina ( PEN -2/
presenilin enhancer). Aceste 4 componente sunt necesare și suficiente pentru activitatea
enzimatică a γ -secretazei la nivel ul domeniului transmembranar, eliberând peptidul Aβ. Locul
de acțiune al secretazei nu este restricționat, în condiții fiziologice putând avea loc între
poziția 37 și 43 din domeniul de generare al peptidului. Diferențele nu sunt relevante pentru
înțeleger ea patogenezei Alzheimerului, însă cu cât proteina este mai lungă cu atât are un
potențial mai mare de agregare și prin urmare neurotoxic (Haass & Selkoe, 2007). Are loc o
procesare secvențială a proteinei precursoare amiloidului, proteoliză intramembranar ă
începând la situl de ε -clivare între aminoacizii 48 și 49, urmat apoi de ζ -clivare între
aminoacizii 46 și 45, în final se face γ -clivajul cel mai frecvent la nivelul 40 sau 42 (dar și
după aminoacizii 37, 38, 39, 43). Există astfel două căi care duc la fomarea predominantă fie
a Aβ42 care este majoritar în plăcile senile și fie a Aβ -40 majoritar în lichidul cefalorahidian
și plasmă, clivajul putând fi modulat terapeutic astfel încât să se prevină generarea de Aβ -42.
Acest peptid se asamblează sub mai mul te forme ce au fost puse în evide nță în creierul
afectat de boala Alzheimer. Astfel se găsesc fibrile insolubile ce se organizează în plăcile
senile, protofibrile solubile, oligomeri și inclusiv dimeri sau trimeri ce co -există într -un
echilibru dinamic (Ro ychaudhuri și colab., 2009). Efectul toxic al aces tor agregate a fost

20
demonstrat in vitro fiind defapt corelat cu o interacțiune anormală cu alte proteine neuronale,
ducând la modificarea funcțiile fiziologice ale neuronilor (Olzcha și cola b., 2011).
Experimente recente sugerează că agregatele Aβ interacționează cu APP -ul, declanșând
evenimente patogenic r egăsite în demenț a Alzheimer.
2.4. Relația dintre APP și microdomeniile membranare
Plutele lipidice formate din sfingolipide și colesterol sunt compartimente active
biologic, generarea Aβ fiind dependentă de integritatea lipidic ă a membranei, de cantitatea de
colesterol și GM1 (Yanagisawa și Ihara, 1998). Colesterolul este implicat în reglarea clivajul
proteinei precursoare a amiloidului de către α- și β-secretaz ă (Simons și colab., 2001) prin
legarea porțiunii din zona transmembranara a APP, regiun ea regăsită și la polipetidul obținut
prin clivajul α -secretazei (C83). Concentratiile crescute de colesterol duc la activare
enzimatică a β – și γ-secre tazei, fiind regăsite în plutele lipidice și astfel implicate în calea
amiloidogenic ă. BACE1 dar și componente ale γ -secretazei (Aph -1 și nicastrina) au nevoie de
plute lipidice intacte. Koj iro ipotetizeaz ă că APP este prezent în două regiuni membranare
diferite din punct de vedere funcțional, o zona în care plutele lipidice sunt asociate cu
generarea de Aβ și o altă zona unde își exercită activitatea α -secretaza independent de
inclavarea în plute . Nu există o explicație clară privind modalitatea diferită de procesare a
aceleași proteine, co -localizarea secretazelor fiind o explicație, însă nu se cunoaște procesul
de reglare. Există 3 populații evidențiate la nivel membranar: APP/C99 nelegat de colesterol
asupra căruia acționează α -secretaza, APP/C99 legat de colesterol din zonele membranare
non-raft și APP/C99 legat de colesterol la nivelul plutelor lipidice cu implicare în calea
amiloidogenic ă. Procentajul în care aces tea se regăsesc depinde de cantitatea de colesterol
care modulează atât activitatea enzim atică cât și procesarea APP.
Aproximativ 10% din APP trec e printr -un proces post -translaț ional de palmitolare la
nivelul Cys -186 și Cys -187 pentru a crește hidrofobicitatea, formă palmitolat ă fiind regăsită
cu precădere la nivelul plutelor lipidice4. BACE1 dar și componente ale γ -secretazei (Aph -1 și
nicastrina) sunt modificate prin palmitolarea capetelor C -terminale (Cheng și colab., 2009).
Atunci când se induc mutații punctiforme strict la nivelul acestor regiuni de palmitolare,
generarea de APP scade. Ca ntitatea de palAPP crește cu vârstă în creierul șoarecilor
nontransgenici (3 luni vs. 18 luni), important pentru că acest proces reglează generarea de
APP cu direcția către plutele lipidice unde se află BACE -1, APP urmând apoi calea
amiloidogenica4. Studii le efectuate pe iepuri și șoareci confirmă că o dietă bogată în colesterol
contribuie la formarea de plăci senile (Refolo și colab., 2000); în mod contrar, deple ția
colesterolului duce la scăderea Aβ în culturi celulare și la modelele animale (Fassbender și

21
colab., 2001). Mai mult, APOE reprezintă un factor de risc major pentru boala Alzheimer,
nivelul crescut de Aβ în creier fiind corelat cu colesterolul seric total și LDL elevate în sânge
(Kuo și colab., 1998). In vitro , colesterolul formează agregate cu peptidul Aβ (Ardulov și
colab., 1997), datele fiind dificil de extrapolat la condițiile fiziopatologice umane.
2.5. Func țiile APP
Funcțiile in vivo ale proteinei precursoare a amiloidului și a omologilor săi sunt puțin
înțelese. Modele murine knockout pen tru APP sunt viabile și fertile, sugerând că această
proteină nu este esențială pentru dezvoltarea embrionară, însă aceștia au modificări fenotipice:
greutate mai mică, scădere a motilității, deficite de memorie și atenție (Ring și colab., 2005).
2.5.1. Adeziunea celulară
Familia APP joacă un rol important în interacțiunea celulă -celulă dar și adeziunea la
substrat. Formele APP care rămân cantonate la nivel membranar participă la adeziunea între
celule în urma homo – sau heterodimerizarii (Baumkotter și c olab., 2012). Domeniul
extracelular al APP interacționează prin intermediul domeniilor sale cu componente ale
matrixului extracelular precum laminina, colagenul de tip I, integrina α3β1 (Hoe și colab.,
2009).
Este cunoscută capacitatea APP de a formă homo dimeri și heterodimeri cu APLP1 și
APLP2 atât in vitro cât și in vivo . Generarea dimerilor stabili are loc la nivelul reticul ului
endoplasmatic migrând apoi spre membrană. Există un echilibru celular al APP monomer –
dimer, care poate să varieze în compartim entele celulare dependent de stadiu redox. Într -un
studiu din 2001 se demonstrează că dependent de porțiunea N -terminală, APP full -length
formează dimeri cât și tetrameri. Există cel puțin 4 domenii care promovează dimerizarea
APP: domeniul E1 cu GFLD (Gro wth factor like domain) și CuBD (Copper binding domain),
domeniul E2, porțiunea juxtamembranara și domeniul transmembranar. Dimerii APP -APP se
formează prin interacțiuni covalente cross -linkate la nivelul suprafeței celulare, dar și prin
legături disulfidi ce ce necesită aa. 91-111 pentru stabilizarea structurii homodimerice.
Homodimerizarea este dependentă de rezidurile de cisteină de la nivelul E1, deletia întregului
domeniu bogat în cisteină duce la absența formării dimerilor APP -APP43. Zona de legături S –
S formează o buclă ce interacționează prin forțe hidrofibice cu domeniul E1 scăzând
generarea sAPPβ dar și a Aβ -40/Aβ -42, așa cum a fost observat când peptidul sintetizat după
această regiune a fost adăugat în culturile celulare ce exprimă APP. APP 695 interacționează
formând cis -dimeri în cadrul aceleași celule, APP 770 nu formează dimeri, probabil domeniul
KPI inhibă interacțiunea regiunilor E1. A fost observat că la nivelul celulelor Drosophila S2

22
dimerizarea nu depinde de isoforma APP, având loc o trans -dimerizare între protein a de la
suprafața a două celule diferite43(figura 1.5.). Trans -dimerizare are c a potențial rol adeziunea
intercelulară, iar cis -dimerizarea putând avea rol de factor de creștere.

Figura 1.5 . – Formarea homodimerilor APP prin cis-dimerizare și trans -dimerizare
(adaptat dup ă Isbert și colab., Cell and molecular life sciences, 2012)

sAPP poate să dimerizeze într -o soluție in vitro atunci când acesta se găsește în
concentrații crescute s au în prezența heparinei (Wang& Ha, 2004; Lee și colab., 2011).
Dimerizarea afectează în mod direct clivarea γ -secretazei, nefiind necesară pentru a putea să
fie produs Aβ. Au fost atribui te mai multe roluri fiziologice. Eggert demonstrează că formarea
dimerilor/multimerilor duce la scăderea cu pe ste 50% a formării de Aβ, dar cu creșterea
AICD, acestea fiind observate în culturi celulare fără să știm procentul dimerizării in vivo și
prin urmare a amiloidului. Există multe studii contradictorii în ceea ce privește rolul dimerilor
APP-APP în modulare a căii enzimatice a formării amiloidului . Scheuermann sugerează că
cis-dimerizarea duce la activarea β -secretazei cu creșterea producerii de peptid. De asemena,
Cu2+ induce dimerizarea in vitro , iar la nivel celular o concentrație de 100µM formează
legătur i APP -APP, cuprul fiind reglator al trans -dimerizării la nivel sinaptic.
Homodimerizarea la nivel C99 protejează APP de clivajul γ -secretazei (Winkler și colab.,
2015). Prezența oligomerilor de APP nu a fost clar dovedită stintific, însă dimerii și tetrame rii
au fost raportați în literatura de specialitate, formarea lor începând la nivelul reticului
endoplasmatic fără însă să se cunoască rolul exact al acestora. La acest nivel se poate acționa
terapeutic prin inhibarea formării dimerilor, proces ce induce a tât fosforilarea APP cât și
reducerea formării Aβ, cu beneficii asupra prognosticului BA.
Interacțiunea dintre fibrile de Aβ și APP conduc la acumularea și formarea de
multimeri de APP integral (holo) la suprafața celulelor precum neuroni, astrocite și cel ule
musculare nedete cerebrovasculare (Lu și colab., 2003; White și colab., 2003).

23
Multimerizarea APP indusă de peptidul neurotoxic este legat ă de pierderea rapidă a
legăturilor neuronale. În culturile de neuroni hipocampici, această multimerizare toxic in dusă
se realizează aberant la nivelul adeziunilor focale, în apropierea plăcilor senile în creierul
afectat de demență (Grace și Busciglio., 2003; Phinney și colab., 1992). Neuronii din creierul
rozătoarelor knockout pentru APP erau parțial rezistenți la A β toxicitate (Lorenzo și colab.,
2000), reciproc a fiind valabilă (Sola Vigo și colab., 2009), acestea fiind reglate de calea
caspazelor dar și a proteinelor Go heterotrimerice cu efectele neurotoxice. Formarea de
multimeri holo -APP la nivelul suprafeței ce lulare duce la alterări ale semnalizării
intracelulare. Supraexpresia APP în neuronii primari promovează apoptoza printr -un
mecanism ce implică activarea Go, c -Jun și p21 -kinaza activatoare (PAK)43, ultima
acumulându -se ca proteină activă în jurul plăcilor de amiloid (Ma și colab., 2008).
2.5.2. Supraviețuirea neuronală și plasticitatea sinaptică
Rolul APP și al fragmentelor în plasticitatea sinaptică a fost investigat în numeroase
experimente. Plecând de la studiul din 1994 al șoarecilor transgenici pentru supraexpresia
genei sălbatice a APP unde a fost pusă în evidență prezența a unui număr crescut de sinapse în
SNC, recent a fost propus ca și moleculă de adeziune sinaptică având proprietăți similare cu
neuroxinele/neurologinele (Wang și colab., 2009). În culturile de fibroblaste a fost demonstrat
că sAPP modulează diviziunea celulară astfel că acesta are un efect trofic neuronal.
Introducerea s APP în culturi primare neuronale promozeaza supraviețuirea pe termen lung,
stimulează creșterea sinaptică și prote jează de stimuli toxici (Matsson, 1997). A fost încercată
introducerea intracraniană a anticorpilor specifici anti -sAPP, cu efect de stimulare a
memoriei, rezultatele obținute arătând că este implicat în procesele cognitive (Meziane,
1998). Mecanismul prin care are efect de protecție și suport trofic este legarea sAPP și
reglarea dimeriz ării APP-ului la nivelul membranei plasmatice, dar și b alanța dintre sAPP și
fragmentul de APP cantonat membranar (Gralle și colab., 2009; Yoshikawa și colab., 1992).
La nivelul creierului adult, atât în celulele neuronale cât și în cele non -neuronale,
sAPPα are efectul unui factor proliferativ, dar crește și motilitatea keratinocitelor (Caille și
colab., 2004). În liniile neuronale imortalizate sAPPα duce la creșterea ter minațiilor nervoase
și a arborizatiilor neuronale, cu efecte neuroprotective împot riva ischemiei și excitotoxicităț ii.
Injecțiile intracerebrale cu sAPPα duc la creșterea performanțelor la șoareci adulți,
mecansimul fiind fie de modelare sinaptică fie de n europrotecție (Meziane și colab., 1998). În
dezvoltarea creierului, APP este important pentru formarea sinapselor funcționale. În culturile
de neuroni hipocampici, creșterea APP duce la un răspund mai bun la glutamat (Tominaga –
Yoshino și colab., 2001), put ând fi evidenț iat prin studii electrofiziologice efectul asupra

24
răspunsului sinaptic atunci când APP lipsește (Priller și colab., 2006). Șoarecii knockout
pentru APP și APLP2 nu formează terminații sinaptice funcționale, cu scăderea dramatică
încă din prim a zi de viață a activitățiilor cerebrale și moarte câteva zile mai târziu (Yang și
colab., 2005). La nivelul SNC , proteina precursoare a amiloidului este importantă pentru
maturarea subtipurilor neuronale (Saulbaum și Ruddle, 1994).
2.5.3. Semnalizare celu lară și receptor de suprafață
Structura proteică sugerează că are funcție de receptor dar și de factor de creștere. Cea
mai conservată regiune este porțiunea intracelulară, motivul GYENPTY, ce mediază
interacțiunea cu proteine denumite proteine adaptor (Fe65, familia Mint/X11, kinaza c -Jun N –
terminal, Shc). Interacțiunea cu aceste proteine generează fragmente AICD, care împreună cu
Fe65 duc la formarea unui complex transcriptional ce controlează expresia genică pentru
KAI1, neprilisina, receptorul EGF ș i altele (Zhang și colab., 2007). Există o similaritatea între
APP și Notch în ceea ce privește clivajul făcut de secretaze și reglarea transcrierii genice prin
intermediul unor fragmente, fiind încă un argument pentru rolul de receptor de suprafață. Deși
pentru interacțiunea cu calea proteinelor G receptorul trebuie să aibă cel puțin 7 domenii
transmembranare, există proteine precum receptorul pentru EGF și receptorul pentru FGF cu
un singur domeniu transmembranar care pot să participe la semnalizare prin intermediul
acestor proteine. Deyts demonstrează în 2012 că, printr -un mecanism dependent de activarea
Gs, protein a precursoare a amiloidului stimulează creșterea axonală și den dritică în neuronii
mamiferelor fiind astfel factor de creștere la nivel cereb ral.
2.6. Modele animale transgenice pentru gena APP
Funcțiile multiple ale APP au dus la studiul animalelor transgenice pentru genele
responsabile de această proteină. Șoarecii knockout pentru APP au o greutate mai mică și o
dată cu vârstă prezintă alterări ale forței musculare a extremităților. Mai mult, aceștia au
alterări are tra nsmiterii sinaptice cu deficite de învățare și memorie (Damwson și colab.,
1999). Animalele Aplp2 -/-/Aplp1 -/- și APP -/-/Aplp2 -/- dublu mutate spre deosebire de APP -/-
/Aplp1 -/- au o creștere a mortalității postnatale, ceea ce sugerează că funcțiile proteine lor ce
fac parte din această familie se suprapun parțial (Anliker și Muller, 2006). Deficiența a celor 3
gene duce la moarte rapidă, împreună cu displazie corticală ce sugerează anomalii ale migrării
neurobla știlor și pierderea de celulele Cajal -Retzius (H erms și colab., 2004). Toate studiile
arată că această familie are un rol important în dezvoltarea sistemului nervos ca structură și
funcționalitate a sinapselor dar și a migrării neuronale în perioada fetală.

25
CAPITOLUL III

Caveolinele în biologia sistemu lui nervos central

Membrana plasmatică este mai mult decât o barieră selectivă între celulă și mediul
exterior, cu o compoziție complexă alcătuită din colesterol, fosfolipide precum și o varietate
de proteine. Astfel, se formează o structură înalt organiz ată cu funcții multiple la nivel celular.
Plecând de la modelul mozaicului fluid propus de Singer și Nicholson în care componentele
membranare erau distribuite aleator, în anii 70' Stier & Sackmann au dovedit existența unor
microdomenii membranare, explicâ nd modul în care celula, prin intermediul plasmalemei,
comunică cu exteriorul. Membrana celulară este un “mozaic” de microdomenii funcționale,
între care se remarcă plutele lipidice și un subset al acestora ce poartă denumirea de caveolele,
structuri impli cate în semnalizarea și homeostazia celulară. Plutele lipidice sunt domenii
dinamice de dimenisuni mici, heterogene, bogate în steroli și sfingolipide și pot interacționa
cu proteine. Caveolele sunt structuri colesterol -dependente, intens studiate în ultim ii ani, însă
rolul precis pe care îl au, mai ales în semnalizarea celulară, nu este cunoscut pe deplin.
Caveolele, abundente în țesuturile mamiferelor, formează microdomenii membranare
remarcabile ca stabilitate implicate în procesul de endocitoza și exoc itoza. În ultimii ani,
studiul acestor structuri a luat amploare și percepția despre importanț a lor în economia celulei
s-a modificat. Parton și colaboratorii definesc caveolele c a “senzori ai membranei plasmatice
care pot răspunde la stresul celular și modelează interacțiunea cu mediul extern”. Importanț a
caveolelor ca și structură membranară reiese din rolurile de protecție, de organizare și de
senzor celular, descoperite datorită bolilor apărute ca rezultat al modificării expresiei proteice:
distrofii musculare și procese tumorale.
3.1. Introducere în biologia caveolelor
Caveolele, descrise pentru prima dată de G.E. Palade în 1953, au fost identificate prin
microscopie electronic ă, fiind prezentate ca invaginări ale membranei plasmatice cu forma
literei Ω și diametru de 60 -80 nm. Caveolina -1, proteina principala ce formează aceste
structuri, a fost identificată 40 de ani mai târziu (Kurzchalia și colab., 1992, Rothberg și
colab., 1992), urmată de caveolina -2 (Scherer și colab., 1996) și caveolina -3, proteină cu
distribuție predominant musculară (Way și Parton, 1995). O nouă famile de proteine alcătuită
din 4 proteine numite cavine a fost descoperit că se asocia ză și stabiliz ează structura caveolar ă

26
(Bastiani și colab., 2009, McMahon și colab., 2009). Caveolele au fost identificate pentru
prima dată în celulele endoteliale ale capilarelor (“Fine structures of blood capillaries”, 1953)
urmând că apoi să fie descrise la nivelul multor celule și țesuturi.
Până în prezent, majoritatea cercetărilor au studiat prezența caveolinelor la mamifere,
însă aceste proteine se regăsesc inclusiv la Xenopus laevis, Fugu rubripes și Caenorhabditis
elegans. Caveolele sunt prezente în majoritatea celulel or, existând și excepții precum
eritrocite, trombocite, limfocite (Fra și colab., 1995). Densitatea caveolelor diferă în funcție
de țesuturi, cel mai mare nivel de caveolina -1 regăsindu -se în adipocite, celulele endoteliale,
fibroblaste și pneumocite de ti p I. Suprafața membranară este crescută cu ajutorul acestor
structuri, peste 50% din suprafață endoteliul și mai mult de 20% din suprafață adipocitara este
acoperită de caveole (Sheldon și colab., 1962). La nivelul țesutului nervos au fost descrise
caveole în astrocite25, dar nu în neuroni62-63, caveolinele fiind implica te în procese de
diferențiere astrocit ară93 și transcitoz ă8 atât în perioada embrionară cât și postnatal7.
Mutațiile în genele familiei caveolinelor sunt corelate cu o varietate de boli din
patologia umană: distrofii musculare, boli cardiace și neoplazii. În cazul anumitor cancere de
sân, expresia caveolinei -1 este scăzută existând mutații sporadice ale genei , pe când în
progresia cancerului prostatic caveolina -1 stimulează supraviețuirea și creșterea tumorală . Au
fost descrise multiple mutații la nivelul genei caveolinei -3 fiind asociate cu distrofii și boli
musculare51.
3.2. Structura caveolelor
La nivelul cel ulelor eucariote există trei proteine descrise că și componente ale
caveolelor: caveolina -1 (Cav -1), caveolina -2 (Cav -2) și caveolina 3 (Cav -3). Mai mult, atât
caveolina -1 cât și caveolina -2 prezintă izoforme: Cav -1α și Cav -1β respectiv Cav -2α, Cav -2β
și Cav-2γ a căror semnificație funcțională nu este pe deplin cunoscută. Deși aceste proteine
sunt diferite, caveolina -1 este în proporție de 38% identică cu caveolina -2 și în proporție de
65% cu caveolina -3, fiind conservate de -a lungul evoluției. Motivul FEDV IAEP este o
secvență de 8 aminoacizi identică la toate cele 3 proteine fiind considerată “secvența de
semnătură a caveolinei”. Expresia genelor diferă între cele 3 tipuri de proteine, cav-1 și cav-2
apar în marea majoritatea a celulelor diferențiate iar cav-3 în mușchii scheletici și miocard51.
Ca și prototip al familiei proteinelor caveolare, caveolina -1 are o greutate moleculară
de 22 kDa fiind suficientă și necesară pentru a forma caveole, prin oligomerizarea în medie a
140-150 de molecule cav -1 alături de colesterol și sfingolipide. Din punct de vedere
structural, este o proteină transmembranara cu o dispoziție aparte, atât capătul N -terminal cât
și cel C -terminal se găsesc intracitoplasmatic. Prezintă zone care interacționează cu

27
componente celulare: C -MAD (aa. 135 -150) și N -MAD (aa. 82 -101) importante pentru
atașarea de membranară, porțiunea transmembranara (aa. 102 -134) care se înseră în bistratul
lipidic, domeniul responsabil de oligomerizare (aa. 61 -101) prin care interacționează cu alte
molecule ca v-1, domeniul de ancorare “scaffold” (aa. 82 -101) care recunoaște o porțiune
hidrofobă prezentă în structura a multor pro teine implicate în semnalizare (figura 1.6.)51-53.

roșu Porțiune transmembranară (aa.
102-134)
albastru C-MAD (aa. 135 -150)
galben N-MAD sau domeniul scaffold
(aa. 82 -101)
verde Reziduri de palmitolare (aa. 133,
143, 156)
roz Domeniul de oligomerizare (aa.
61-101)

Figura 1.6 . – Structura caveolinei -1
(adaptat după Lisanti si colab., APS Journals, 2004)

Domeniul de oligomerizare mediază formarea de homo -oligomeri din 14 -16 molecule
de caveolina -1 (figura 1.7.) , care apoi se asociază și formează complexe caveolare cu masă
molecu lară de 400 kDa (Monier și colab., 1995; Kurzchalia și colab., 1992). Caveolina -2, spre
deosebire de celelalte două proteine din aceeași familie, nu poate forma caveole, necesitând
prezența caveolinei -1 pentru a forma complexe hetero -oligomerice încă de la nivelul
reticulului endoplasmatic. Domeniul “scaffold” funcționează asemeni unui receptor ce
recunoaște o regiune din structura anumitor proteine numită domeniul de legare caveolara
(CBM – caveolin binding motif) cu rol dublu, acționează ca și ancorare pen tru proteine și
reglează prin inhibare sau stimulare activitatea de semnalizare celulară a acestor proteine.
Caveolina -1 este palmitolata la nivelul a trei reziduri de cisteină (aa. 131, 143 și 156),
fiind necesare pentru interacțiunea cu colesterolul din membrana celulară. Dacă în structura
unei caveole se estimează că există 140 -150 de molecule de caveolina, cantitatea de colesterol
este de 100 de ori mai mare, aproximativ 20.000 molecule, scăderea nivelului colesterolului
ducând la modificări importante în structura finală. Astfel, caveolele sunt structuri specializate
ce conțin domenii sfingolipidic -colesterol distincte stabilizate prin proteine ce aparțin familiei
caveolinelor.

28
Identificarea unei noi familii de proteine citoplasmatice ce cooperează cu caveolinele
în formarea și funcția caveolei a îmbogățit înțelegerea asupra acestei structuri încă puțin
cunoscute. Cavina -1 identificată prima dată ca și PTRF (Vinten și colab., 2001), cavina -2
cunoscută sub numele de SDPR (serum deprivation response prote in) descrisă în 1993 de
Gustincich și Scheinder, cavina -3 sau SBRC ce funcționează ca și adaptor pentru PKC (Izumi
și colab., 1997) și cavina -4 identificată prima dată în mușchi (Ogata și colab., 2008) sunt cele
care alcătuiesc familia cavinelor. Odată aju nse la nivel plasmalemal, oligomeri de caveolina
sunt stabilizați prin complexul cavinelor, format prin homo – și hetero -oligomerizarea celor 4
proteine cavinelor. Nu se cunoaște mecanismul exact prin care cele două familii de proteine se
asamblează pentru a forma caveole însă disocierea legăturilor cav -1-cavina -1 duce la
aplatizarea caveolara și eliberarea în citoplasmă a cavinelor , ca răspuns la stress ul celular52.

Figura 1.7. – Oligomerizarea caveolinei -1
(adaptat după Lisanti si colab., Pharmacological Reviews, 2002)

Studiul formării și traficului caveolar este crucial pentru înțelegerea rolului familiei
caveolinelor. Sinteza acestor proteine începe la nivelul reticulului endoplasmatic unde se
găsesc ca proteine membr anare, urmând apoi prima etapă de oligomerizare. Oligomeri de
mici dimensiuni sunt apoi transferați la nivelul aparatului Golgi, etap ă prezentă în multe
celule. De -a lungul căi de sinteză, caveolinele se asociază cu plutele lipidice și se organizează
în oligomeri caracteristici. Dacă caveolina suferă mutații, aceasta se acumulează în aparatul
Golgi și nu este transportată eficient către membrană, lucru evident în diverse patologii. Se
pare că aceste mutații proteice sunt mai dăunătoare prin blocarea la nivel golgian decât prin
lipsa totală a structurii finale. Explicația este că proteinele exocitate prin calea caveolara, pot
însă să urmez e și alte căi, în absența totală a caveolinelor. Însă în cazul caveolinei mutante,
aceasta va bloca aparatul Golgi împiedicând, din punct de vedere fizic, excreția proteinelor .

29
3.3. Rolurile caveolelor
3.3.1. Caveolele și transportul celular
Ultrastructur a și dispoziția caveolelor sugerează implicarea în procesele de transport
celular prin transcitoza și endocitoza (figura 1.8.) . Datorită abundenței caveolelor în teritoriul
vascular, procesele de transport au fost studiate intens la nivel endotelial. Impor tanța și rolul
caveolinelor au fost investigate prin compararea animalelor sănătoase cu cele modificate
genetic. Luând drept exemplu albumina, caveolele sunt responsabile, cel puțin parțial, de
transportul transcelular al acestei proteine, însă în mod surp rinzător nivelul albuminei este
unul normal la șoarecii K.O. pentru caveolina -1. Mecanismul compensator în organismelele
în care s -a dovedit absența totală a caveolelor este acela de creștere a permeabilității vasculare
pentru albumină, în acest caz, prin mărirea joncțiunilor intercelulare fiind un proces mediat de
creșterea oxidului nitric51-53.
Pentru a pătrunde intracelular diverși agenți patogeni sunt necesare rearanjamente ale
membranei celulare, prin intermediul modificărilor citoscheletale care sunt legate de
implicarea caveolinei -1. Alături de endocitoza mediată de vezicule acoperite cu clatrina,
transportul caveolar internalizează o serie de macromolecule și agenți patogeni dintre care cel
mai bine descris este virusul simian 40 (SV -40). Astfel, fo losind această cale de transport,
evita degradarea lizozomal ă. Virusurile, bacteriile și toxinele de dimensiuni mari sunt
internalizate în zone bogate în caveole, printr -o cale non -clatrina dependentă de colesterol,
existând o directă corelație între down -reglarea expresiei caveolinelor și procesul de
pătrundere intracelulară a agenților patogeni61-67.
3.3.2. Caveolele și homeostazia colesterolului
Relația dintre colesterol și caveolin ă este complexă și cu multe implicații în fiziologia
celulară. Rothberg și colaboratorii (1993) au demonstrat pentru prima dată importantă
colesterolului pentru stabilizarea structurii caveolare, care prin legarea de agenți cu afinitate
pentru colesterol, filipin ă sau nistatin ă, au dus la aplatizare și dezasamblarea oligomeril or
formați din caveoline și cavine. Expresia caveolinei -1 și distribuția celulară este în strânsă
relație cu nivelul de colesterol prin modularea transcrierii în zona promoter a caveolinei -1 dar
și prin stabilizarea proteinei. De ce există diferențe tisula re între densitatea caveolelor? Din
perspectiva legăturii strânse caveoline -colesterol, acestea funcționează ca "rezervor" de
sfingolipide și colesterol, furnizându -le la nevoie plutelor lipidice. Se poate spune că celulele
de origine animală nu folosesc d oar picăturile lipidice pentru a depozita lipide ci și caveole61.
Caveolele sunt abundente la nivelul țesutului adipos fiind implicate în reglarea

30
componentelor lipidice membranare. Caveolina -1 interacționează cu colesterolul, acizii grași
și picăturile l ipidice (depozite intracitoplasmatice de acizi grași și trigliceride) în culturi
celulare dar și in vitro . Studiul celulelor cu expresie scăzută sau mutantă a caveolinei -1 a
demonstrat că absența proteinei scade sinteza de colesterol și crește cantitatea d e acizi grași
esterificați. Modele murine trangenice cav -1-/- au țesutul adipos puțin reprezentat fiind
rezistenți la obezitatea indusă prin dietă hiperglucidică. La polul opus, creșterea nivelului cav –
1 stimulează intrarea acizilor grași în celulă și tra nsportul colesterolului (figura 1.8.) . Acest
proces este important in vivo pentru că regenerarea hepatică cu implicații în supraviețuirea
șoarecilor după hepatectomie necesită caveolina -151-53.
3.3.3. Semnalizarea celulară și caveolele
Caveolele au multiple roluri la nivel celular descrise mai sus, însă modularea
semnalizării celulare este una dintre cele importante (figura 1.8.) . Lisanti și colaboratorii au
indentificat în microdomeniilor caveolare purificate biochimic o varietate de molecule de
semnalizare precum tirozin kinaza Src -like sau proteine G heterotrimerice53. Astfel, caveolele
acționează ca și domenii de ancorare pentru numeroși receptori de suprafață, care după
activare sunt recrutați către aceste structuri facilitând astfel un răspuns specific și rapid. A fost
propusă “ipoteza semnalizării caveolare” în care proteina are un rol dual de reglator al
traducerii semnalului dar și de proteină de ancorare, concen trând receptori la acest nivel :
receptorul pentru bradikinină B2, factorul de cre ștere epidermala (EGF), factorul de creștere
derivat din plachete (PDGF), dar și eNOS, MAP -kinazele, Src -kinazele, h -RAS, protei nele G,
protein kinaza C (PKC)67-68.
Esențial în înțelegerea implicării caveolelor în semnalizare este interacțiunea dintre
domeniul bine conservat al caveolinei (aa. 82 -101) numit domeniul “scaffold" și regiunile de
legarea a caveolinei de la nivelul proteinelor implicate în semnalizare, descrise mai sus.
Dintre cele 3 isoforme, cav -1 și cav -3 sunt cele mai asemănătoare existând însă o diferența
importantă între cele două: fosforilarea cav -1 la nivelul Tyr -14. La nivel endotelial,
fosforilarea duce la modificarea domeniului NH2 și astfel recrutează proteine de semnalizare
că răspuns la stresul osmotic și mecanic (shear stress). I mportan ța caveolinei -2 în semnalizare
nu este suficient definită, regiunea CSD fiind mult mai diferită. Caveolina -1 are un efect
inhibitor asupra majorității proteinelor de semnalizare cu care interacționează, însă
suprinzător, în cazul receptorului insuli nic are un efect stimulator . În privința caveolinei -3,
această modulează receptori și molecule de semnalizare având c a particularitate complexul
distrofine -glicoproteine. Interacțiunea dintre caveolina -1 și eNOS este bine cunoscută și
caracterizată. În co ndițiile unei celule nestimulate, cele două sunt asociate la nivel caveolar,

31
împiedicând legarea calmodulinei și generarea oxidului nitric. Creșterea expresiei caveolinei –
1 inhibă activitatea eNOS fără să crească formarea de caveole, mecanismul propus fiin d de
eliberare a caveolinei -1 în anumite condiții și la anumiți stimuli celulari.
Apariția ipotezei semnalizării caveolare descrisă mai sus sugerează că absența
caveolelor ar duce la o distribuție aleatorie și dezordonată a proteinelor de se mnalizare. Mai
mult, dacă aceptăm această ipoteză , cum reușesc alte celule cărora caveolina -1 le lipsește fie
în mod natural (limfocitele) fie prin modificări de inginerie genetică (șoarecii cav -1 -/-) să
regleze semnalizarea celulară? Deși studiile pe animale tra nsgeni ce au demonstrat importanța
caveolelor, aceste modele sunt viabile și fertile, prin urmare sunt necesare mai multe date care
să susțină ipoteza caveolinei -1 ca și signalosom64-65.
3.3.4. Alte funcții ale caveolelor
Caveolina -1 are rol antiproliferativ acț ionând ca și supresor tumoral (Lisanti și colab,
1995; Engelman și colab., 1997) atât în culturi celulare cât și la animalele de laborator.
Proteinele localizate și inhibate de cav -1 dintre care reamintesc EGFR, Her2/Neu,
componente din cascada Ras/p42/44 MAP kinaza sunt extrem de importante și implicate în
semnalizarea pro -proliferativă și anti -apoptotica (Zundel și colab., 2000; Yamamoto și colab.,
1999). Mai mult, genele Cav -1 și Cav -2 se află pe cromozomul 7 în apropierea unei regiuni
(7q31.1) care sufe ră dele ții ducând la apariția multor cancere de origine epitelială: cancer de
sân, colorectal, prostatic și ovarian (Kerr și colab., 1996). A fost observată scăderea și chiar
absența caveolelor în cancere de origine epitelială, transcripția caveolinelor fiind downreglata,
astfel caveolina -1 poate să fie un factor important în diagnostic ul și tratamentul neoplaziilor.
Folosind modele animale transgenice și celule cav -1 -/-, s-a studiat rolul în
mecanosensibilitate, mai ales în celulele endoteliale și musculare. Celulele musculare netede
în condiții de întinder i ciclice își redistribuie rapid caveolina -1 către zonele de contact
intercelular , activând PI3K -AKT, MAPK, ERK și kinaza Src67. Acest răspuns este inhibat în
cazul scăder ii tranzitorii a caveoli nei-1 în mușchiul neted K.O. pentru cav -1. La nivel
endotelial, stressul cronic sau “shear stress” activează calea ERK dependentă de caveole, cu
dezasamblarea structurilor ce duce la aplatizarea membranei ca răspuns la creșterea tensiunii
superficiale, urm ând ca în cazul dispariției stimulului acestea să se reorganizeze membanar
(Sens și Turner, 2012).
Densitatea caveolar ă scade în liniile celulare imortalizate, fiind absente în celulele
aflate în suspensie. Atunci când celulele își pierd adeziunea de subst rat, endocitoza mediată de
caveole joacă un rol important. În primul rând, detașarea fibroblastelor declanșează
internalizarea GM1 prin endocitoza dependen tă de caveolin ă ce este fosforilată la nivelul Tyr –

32
14. Conluzion ând, există studii care arată pute rnică legătură între endocitoza mediată de
caveole și reglarea adeziunii celulare, însă rămâne neclar cum se corelează această informație
cu aparenta dezvoltare normală a șoarecilor transgenici cav -1 -/-, cărora le lipsesc în totalitate
aceste structuri caveo lare.

Figura 1.8. – Principalele roluri ale caveolelor
(adaptat după Razani și colab., Elsevier, 2001)
3.4. Caveolina -1 la nivel cerebral
3.4.1. Rolul caveolinei -1 în neurogenez ă
Plecând de la celulele precursoare nervoase care apar în girul dentat și în zona
subventriculara, a fost studiată caveolina -1 în relație cu procesul de dezvoltare neuronală.
Șoarecii cav -1 K.O. prezintă o creștere în numărul de noi neurobla ști formați, prin comparație
cu șoarecii wild -type de aceeași vârstă. Însă in vitro bloca rea caveolinei -1 duce la
diferențierea oligodendrogliilor din celulele nervoase precursoare (Head și colab., 2010). La
polul opus, creșterea nivelului caveolinei -1 stimulează diferențierea astrogliilor (Refolo și
colab., 2000). Caveolina -1 mediază semnaliz area receptorului glucocorticoid și influențează
diferențierea celulelor precursoare neuronale fie prin reglarea ciclului celular fie prin migrarea
către poziția lor fin ală la nivelul cortexului cerebral (Dislich și Lichtenthaler, 2012).
3.4.2. Rolul caveo linei-1 în îmbătrânirea neuronală
Implicarea caveolinelor în îmbătrânirea celular ă se studiază de mai bine de 10 ani (Cho
și colab., 2005). Din ce în ce mai multe studii arată importanța caveolinei -1 în reglarea
anumitor procese biologice precum creșterea , migrarea celulor, controlul nivelul

33
antioxidanților mitocondriali dar și senescența celulară (Baker și Tuan, 2013). Celulele și
țesuturile mature exprimă un nivel crescut al caveolinei , ce crește odată cu vârstă. Mai mult,
supraexpresia caveolinei -1 în vitro duce la îmbătrânire prematură. Pe de altă parte, există
studii care arată că pierderea expresiei caveolinei -1 favorizează apariția neurodegener ării
precoce în creierul de șoarece. Suprinzător, modele animale cav -1 K.O. au arătat o scurtare a
duratei de viață, din cauza funcției caveolinei -1 ca supresor tumoral, aceștia dezvoltând mult
mai rapid tumori (Muller și colab., 2003). Cho și colaboratorii au propus că și explicație "Gate
theory of aging" unde caveolina -1 acțione ază c a și paznic în modularea căilor de semnalizare,
jucând un rol principal în determinarea fenotipului senescent .
Compoziția membranei celulare se modifică odată cu îmbătrânirea, expresia și
distribuția caveolinelor este modificată. Țesuturile prezintă variații în ceea ce privește
îmbătrânirea fiziologică: miocardul are un nivel crescut de caveoliă a-1 în fracțiunile
membranare, spre deosebire de mușchiul neted, care nu își modifică expresia în caveolin ă-1
sau cavine (Lowalekar și colab., 2012); celulele endoteliale prezintă un nivel crescut de
caveolin ă-1 (Ratajczak și colab., 2003).
Creierul prezintă anumite particularități în ceea ce privește îmbătrânirea celulară și
expresia proteinelor caveolare. Caveolina -1 este prezentă în neuroni, mai ales neuroni i
piramidali ai cortexului motor, dar și în cortexul parietal, stratum oriens și stratum radiatum
din hipocamp, având o expresie scăzută față de endoteliu sau fibroblaste (Kang și colab.,
2006). Celulele gliale exprimă caveolina -1 însă la microscop ie elect ronic ă caveolele nu au
putut fi identificate, excepția fiind astrocitele. Supraexpresia caveolinei -1 la nivel neuronal
duce la scăderea ramificațiilor neuronale însă creștereaa grosimii ramificațiilor (Gaudreault și
colab., 2005). Șoarecii sănătoși cu vârs te peste 18 luni au o expresie crescută a caveolinei -1 la
nivel hipocamp ic, similară cu cea a pacienților cu boală Alzheimer (Gaudreault și colab.,
2004). Cerebel ul însă nu prezintă modificări la pacienții cu patologie neurodegenerativă dar
nici în condiți i de îmbătrânire fiziologic ă. Dacă la nivelul hipocampului se downregleaz ă
caveolin a-1 are loc o reducere a plasticității sinaptice. Din această perspectivă, creșterea
expresiei caveolinei -1 poate fi interepretat ă ca un mecanism compensator prin care
organ ismul încearcă să recupereze funcțiile pierdute (Liu și colab., 2013). Din perspectiva
transmiterii sinaptice la nivelul neuronilor glutaminergici, caveolina -1 interacționează și cu
receptorii glutaminergici astfel tratamentul cu glutamat, kainat sau AMPA duce la creșterea
expresiei caveolinei -1, sugerând astfel că activarea acestor receptori reglează expresia
neuronală a proteinei (Head și colab., 2007).

34
3.5. Corelații între caveolina -1 și boala Alzheimer
Creșterea nivelului caveolinei -1 se corelează cu inducerea senescenței celulare fiind
una din modificările ce apar în procesul de îmbă trânire la nivel cerebral. Deși caveolina -1 a
fost pusă în legătură până acum cu senescența , ultimele studii sugerea ză o s trânsă legătură
între cav -1 și capacitatea de a exercita un rol de neuroprotecție. Mai mult, șoarecii transgenici
pentru gena caveolinei -1 au la nivelul creierului modificări asemănătoare celor care apar în
boala Alzheimer. Deasemenea, la modelele cav -1 K. O. există un deficit al plasticității
sinaptice, cu scăderea reactivității post -leziune, prin urmare propun caveolina -1 ca factor de
neuroprotecție. Din această perpsectiv ă, creșterea caveolinei -1 în creierul bătrân este o măsură
de prot ecție, un mecanism compensator ș i nu o măsură directă a procesului în sine41-45.
Proteina precursoare a amiloidului (APP) este o proteină membranară care poate fi
metabolizată pe două cai: o cale fiziologică, ce generează fragmente neurotrofice solubile, și o
cale patolog ică, ce generează peptide β -amiloid ce agregă la nivel extracelular, formând
plăcile senile din boala Alzheimer. Regiunile membranare bogate în colesterol, cum sunt
caveolele, favorizează metabolizarea APP prin calea patologică cu generarea de β -amiloid.
Modelul murin cav -1 -/- exprimă caracteristici ale bolii Alzheimer cu un nivel ridicat de β –
amiloid și proteine tau hiperfosforilate la nivelul hipocampului, modificări ce vrebrovasculare
și de astroglioă având un debut precoce.
Neurodegenerarea este un pro ces multifactorial, alterările patologice pot fi prezente
fără să existe însă o manifestare clinică, de aici și dificultatea înțelegerii fiziopatologiei
neurologice. Deși există numeroase modele animale bine definite pentru studiul bolilor
neurodegenerativ e, necesitatea dezvoltării altora a dus la apariția șoarecilor caveolin -1
knockout. Astfel, aceștia sunt primul model non -mutațional care datorită disfuncțiilor
endoteliale pot fi studiați în legătură cu demența vasculară dar mai ales cu boala Alzheimer
prin depozitel e cerebrale specifice. Date recente legate de proteina precursoare a amiloidului
și modificările expresiei la acești șoareci, aduce argumente în favoarea acestui model
multifactorial pentru demența Alzheimer.
3.6. Interacțiunea dintre APP și caveolina -1
În cazul studiilor privind senescența, atât în culturile de fibroblaste cât și în țesuturile
șoarecilor bătrâni (creier și splină), se observă creșterea expresiei proteinelor din familia
caveolinelor (Part și colab., 2000; Wheaton și colab., 2 001). Prin studii de microscopie
electronică, protein a precursoare a amiloidului este exprimată cu precădere în fracțiuni
membranare, mai ales în zonele bogate în colesterol unde se localizează peptidul Aβ (Lee și
colab., 1998; Simons și colab., 1998). Se cunoaște că metabolizarea are loc la nivelul plutelor

35
lipidice care influențează producția peptidului neurotoxic. Într -un studiu din 20061, expresia
caveolinei -1 crește odată cu vârstă în neuronii din creierul șoarecilor bătrâni, fiind co –
localizată la niv el caveolar împreună cu APP. Asocierea APP cu caveolina -1 are loc la nivelul
porțiunii C -terminale intracitoplasmatice, o regiune alcătuită din 20 de aminoacizi. Mai mult,
creșterea caveolinei -1 duce la activarea procesul de clivaj enizmativ al β -secretaze i. Ikesu și
colaboratorii arată că in vivo caveolele și interacțiunea directă cu caveolina -1 joacă un rol
important în procesul de clivare a APP mediat de α -secretaz ă la nivelul suprafeței celulare. De
asemenea, caveolina -3 reglează direct procesarea APP p rin creșterea activității secretazei în
astrocite (Nishiyama și colab., 1999).
Dezvoltarea bolii Alzheimer este complexă cu un proces biologic de neurodegenerare
ce nu poate fi explicat printr -un model liniar de acumulare a petidului Aβ. Din punct de
vedere al argumentelor cu substrat genetic, alterarea expresiei genice pentru APP, PS1 și PS2
duc la apariția formei familiale a BA cu debut precoce. Formele sporadice apar clinic după 65
de ani, peste 12 gene sunt considerate a fi factori de risc, cel mai importantă fiind APOE care
transport ă Aβ. Se încearcă susținerea ipotezei amilodogenice însă au fost descoperite persoane
care deși prezintă la examinarea PET amiloid la nivel cerebral nu dezvoltă niciodată demență
(25-30%). În ceea ce privește modele mur ine, s -a observat că dezvoltă depozite încă de la 4
luni cu o performanță scăzută la testul Morris, însă fără modificările cognitive care pot fi
corelate cu BA. Imunizarea activă sau pasiv ă împotriva Aβ îmbunătățește com portamentul
șoarecilor, acest lucru nefiind observat însă studiile clinice umane, deși plăcile de amiloid
dispar într -o proporție mare. Deoarece demența Alzheimer evoluează cu o pierdere progresivă
a integrității rețelei neuronale, o scădere graduală a densității sinaptice, cu atrofie până l a
pierdere difuză nervoasă, există argumente pentru alte teorii: tauopatie, o deficiență a
autofagiei și de pierdere a funcției lizozomale, alterarea homeostaziei Ca2+ cu activitate
excitotoxică și chiar cu alterarea controlului ciclului celular , toate contribuind în cele din
urmă la ev enimentul central: neuroinflamaț ia.

36

CAPITOLUL IV

4.1. Premise și ipoteze de lucru
Neurodegenerarea este un termen definit ca "pierdere neuronală" fiind însoțită de
manifestări clinice precum tulburare cognitiv ă și a afectului. Însă, variabilitate leziunilor
histopatologice la pacienții diagnosticați cu demență a dus la aprofundarea mecanismelor
moleculare de apariție a apoptozei neuronale. Granița între îmbătrânirea fiziologică a
creierului și procesele neurod egenerative este dificil de delimitat din perspectivă cognitivă.
Existența noțiunii de “rezervă cognitivă” c e presupune abilitatea pacienț ilor de a
contrabalansa pierderea neuronală prin folosirea unor achiziții cognitive preexistente sau a
unor abordări diferite, face dificil diagnosticul precoce al demenței. Aceste tulburări cognitive
sunt o cauză de morbi -mortalitate importantă, cu incidenț ă și prevalenț ă crescute odată cu
îmbătrânirea populației . Una din cele mai frecvente este boala Alzheimer sporadic ă, existând
un interes mărit în cercetarea fundamentală cu scop ul edificării etiologiei bolii. Mi-am propus
pe parcursul acestei lucrări să abordez mecanismele molecular implicate în neurodegenerare
din perspectiva teoriei căii amiloidului în cadrul unui m odel murin transgenic non -mutațional
pentru boala Alzheimer. Premisele de la care am pornit în elaborarea ipotezelor și a designului
experimentelor sunt:
1. Expresia caveolinei -1 influențează procesul de neurodegenare și de
îmbătrânire celulară . Nivelul caveo linei-1 crește odată cu îmbătrânirea celulară, existând
studii ce raportează această modificare de expresie atât în culturile de fibroblaste cât și la
analiza țesutului cerebral. În hipocampul șoarecilor sănătoși se păstrează creșt erea expresiei
caveolinei -1 cu vârsta (20 luni vs. 4 luni), modificări ce se mențin și în creierul prelevat post –
mortem ( Gaudreault și colab., 2004 ; Kang și colab., 2006). Studiile in vitro privind
manipularea genică a caveolinei -1 au arătat că supraexpresia proteinei induce un fenotip
asociat cu senescență precoce. În mod surprizător, scăderea expresiei caveolinei -1 accelerează
procesul de neurodegenerare ducând la scăderea densității sinapselor, îmbătrânire prematură
neuronală dar și susceptibilitate crescută la leziuni ischemice post -reperfuzie (Head & Patel,
2010).
2. Teoria amiloidogenică a bolii Alzheimer are în c entru clivarea proteinei
precursoare a amiloidului, cu APP având rol neurotrofic și neuroprotector. APP are un rol
cheie în stabilirea și păstrarea arhitecturii neuronale. Încă din stadiul embrionar, sAPPα și

37
full-length APP contribuie la proliferarea, dif erențierea și migrarea celulelor stem neuronale
până la formarea de sinapse în sistemul nervos central și periferic. Expresia APP este crescută
în timpul diferențierii neuronale dar și post -leziuni neuronale cu scop reparator (Zheng și
Koo, 2006). Din punc t de vedere genetic, alterarea genelor pentru APP, PS1 și PS2 duc la
forma familială a BA cu debut precoce. Formele sporadice apar cu debut clinic după 65 de
ani, peste 12 gene fiind considerate a fi factori d e risc, cea mai importantă APOE . Având în
veder e că APP este o proteina implicata în răspunsul celulelor în condiții de stress, în
contextul bolii Alzheimer este posibil ca cel puțin unul din mecanismele fiziologice să fie
alterat ducând la neurodegenerare precoce.
Ipotezele de la care am plecat în efe ctuarea experimentelor sunt:
1. Existen ța unei corela ții directe între caveolina -1 și proteina precursoare a
amiloidului .
2. Șoarecii knockout pentru cav eolina -1 sunt un model non -mutaț ional util pentru
studiul bolilor neurodegenerative cum este boala Alzheimer .
4.2. Obiective
Plecând de la premisele de mai sus mi -am stabilit urmă toarele obiective:
1. Investigarea modific ărilor nivelului proteinei precursoare a amilodului în șoarecii
knockout la caveolina -1, ca posibil model non -mutațional de neurodegenerare .
2. Core larea modific ărilor la nivel proteic cu cele de expresie genică .
3. Investigarea modifică rilor de fosforilare a APP în șoarecii knockout la cav -1,
pentru a stabili o eventuală corelație cu pierderea efectului inhibitor al caveolinei pe multiple
căi de semnali zare.
4.3. Materiale și metode
4.3.1. Animale de laborator
Au fost folosite dou ă loturi de șoareci achizi țonate din laboratoarele Jackson: șoareci
C57BL/6 și șoarecii Cav1tm1Mls/J (cav-1 -/-). Tulpina Black 6 est e cea mai folosit ă în
cercetare în momentul de față , fiind primul animal de laborator al c ărui genom a fost
secven țiat î n totalitate. Șoarecii din acest lot au o durat ă lungă de via ță cu o susceptibilitate
scăzută la dezvoltarea multor tumori, însă pot exprima multiple muta ții in func ție de stimulii
la care sunt supu și. Aceste modele animale pot dezvolta în timp obezitate indusa prin diet ă,
diabet zaharat de tip 2 ș i ateroscleroz ă, patologii dependente de vâ rstă dar prezint ă hipoacuzie
cu debut rapid. Ș oarecii K .O. pentru cav -1 sunt homozigo ți pentru gena mutant ă a cav -1 ce

38
conține muta ții țintite la nivelul exonilor 1 ș i 2, inserat ă apoi în blastocist de șoarece
C57BL/6. Lotul de șoareci modifica ți genetic exprim ă hiperproliferare vascular ă, cu alterarea
metabolismului lipidic cu valori ridicate ale trigliceridelor și acizilor grași în sânge. Șoarecii
tineri (3 -6 luni) knockout pentru gena cav -1 exprim ă modific ări specifice bolii Alzheimer, cu
depozite crescute de β -amiloid ș i protein ă tau. Av ând în vedere modul în care au fost obț inuți
șoarecii transgenici, drept control am utilizat lotul C57BL/6. Animalele au fost crescute într –
un ciclu zi -noapte de 12 ore, în condiții de mediu controlate, sacrificate la v ârste diferite ( 6
luni, 12 luni, 13 luni, 1 an ș i 11 luni) conform normelor de etică ale manipulării animalelor de
laborator ale Universității de Medicină Generală și Farmacie „Carol Davila‟ București.
4.3.2. Lizatul de proteine
Am utilizat un omogenizator Potter -Elvehjem, format din piston de teflon și eprubetă
din sticlă între care există un spaț iu foarte mic (~0,2mm), pentru ț esuturile recoltate de la cele
două loturi de șoareci (creier, cerebel, hipocamp, ț esut muscular). De aici încolo se lucrează
pe gheață, suspensia se transfer ă într-un eppendorf și se centrifughează 5 minute la 3000 rpm,
se aruncă supernatantul, iar peste pelletul rezultat se adaugă 250 µL Buffer urmat de
resuspensie. Am folosit mai multe tipuri de Buffer pentru a ob ține o extracț ie mai bun ă, în
funcție de proteina pe care vrem să o eviden țiem la Western blot. Peste s uspensia de celule în
Buffer se adaugă 10% inhibitori de proteaze. Se resuspendă bine și se adaugă 10% în volum
Triton X (20%) și 10% volum NP40 (20%), se vortexează și se lasă 15 minute pe gheață. Se
centrifughează 10 minute la 11000 rpm și se colecteaz ă supernatantul pentru dozarea de
proteine.
4.3.3. Determinarea concentrației de proteine
Am realizat determinarea concentrației de proteine în probel e folosite ulterior la
Western B lot prin utilizarea metodei colorimetrice folosind reactivul PierceTM 660nm Protein
Assay. Se folose ște o placu ță cu godeuri în care se pun 10 µL de lizat proteic peste care se
adaug ă 150 µL din solu ție, urmat de 10 minute incubat la temperatur a camerei pe agitator.
Rezultatul este o solu ție de culoare albastr ă a că rei intensitate depinde de concentraț ia de
proteine, cuantificat ă apoi prin citire la spectofotometru. Rezultatele citirii la 650 nm sunt
comparate cu o curb ă standard de dilu ții ale unei solu ții de albumină serică bovin ă 2mg/ml
(dilu țiile sunt de 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ș i un blanc de 0 mg/ml ).
Valorile cititite sunt apoi calculate pe baza unei ecua ții de ordinul I, ob ținută prin
extrapolarea graficului curbei standard.

39
4.3.4. Western Blot (WB)
Lizatele de proteine obț inute prin metodele de mai sus au fost supuse mai multor
situa ții: 1) denaturate cu ajutorul unui tampon de încărcare denumit Laemmli ce con ține 60
mM Tris -Cl pH 6.8, 2% SDS, 10% glicerol, 5% β -mercaptoetanol, 0.01% albastru de
bromofenol urmat de fierbere timp de 10 minute; 2) condi ții de non -denaturare prin folosirea
unui tampon de încărcare Laemmli fă ră β-mercaptoetanol și fără fierberea probelor. Am
încărcat cantit ăți egale de proteină conținută în 20 μl/godeu, diferen ța între volumul de lizat ce
conține cantitatea dorit ă de protein ă și volumul de încărcat se completeaz ă cu soluț ie tampon
Laemmli 2X. Probele din prima situa ție sunt fierte la 100 °C timp de 10 minute pentru
denaturare, apoi urmeaz ă încărcarea godeurilor și a standardului de masă . Gelurile au fost
turnate la o concentra ție de 10% si 7,5% acrilamid ă pentru caveolina -1 și respectiv pentru
proteina precursoare a amiloidului (tabel II și tabel III) , urmat ă de migrarea la 0.02 A/ gel
timp de 2h in medie.
Concentraț ie gel 7,5% 10%
H2O 4,8 ml 2,2 ml
Tampon de migrare 2,5 ml 2,5 ml
Acrilamid ă 30% 2,4 ml 5 ml
0,1 M EDTA 100 μl 100μl
10% SDS 100 μl 100μl
TEMED 0.075% 7.5 μl 7.5μl
10% amonium persulfat 100 μl 100μl
Tabel II – Obținerea gelurilor de acrilamid ă pentru migrarea proteinelor

Soluț ie Volum
H2O 3.8 ml
Tampon de încărcare 1.67 ml
30% acrilamidă 1 ml
0.1M EDTA 67μl
10% SDS 67μl
TEMED 0,075% 6,7μl
10% amonium persulfat 67μl
Tabel III – Obținerea gelului de încărcare a proteinelor pentru Western Blot

Tampo nul pentru gelul de migrare conț ine 1.5M Tris -HCl la ph 8.8 iar cel pentru gelul
de încărcare 0.5 M Tris-HCl la ph 6.8. Electroforeza și separarea proteinelor s -a realizat în
tampon de migrare ( Tris 0,05M 6,06 g , Glicin ă 0,384M 28,8 g, SDS 0,1% 1g sau 5 ml din
solutie SDS 20%), folosind sistemul de electroforeză de la BioRad Mini Protein (figura 1.9.) .

40
Transferul s -a realizat timp de 1h la 100 V pe membrane de nitroceluloză și PVDF,
care sunt blocate în albumină serică bovină (BSA) 5% în TBS timp de 1h la temperatura
camerei pe agitator. Am incubat cu anticorpul prim ar (Anti proteină precursoare a amiloidului
în concentrație de 1:20.000 , Anti protein ă precursoare a amiloidului fosforilat ă în concentrație
de 1:1.000 , Anti β-tubulina în concentrație de 1:1.000 , Anti Caveolin ă-1 în concentrație de
1:1.000 , Anti GAPDH 1:1.000 ) peste noapte, la 4°C, iar a doua zi se spală de trei ori câte 10
minute cu TBS +TWEEN 0,1 % și o dată cu TBS simplu 10 min. Am incubat cu anticorpul
secundar în TBS +TWEEN 0,1% timp de 1 oră (capră anti iepure sau capră anti șoarece
ambele în concentrație de 1:2.000 ). Am spălat membranele de trei ori a câte 10 minute cu
TBS +TWEEN 0,1% și o dată cu TBS simplu 10 min, apoi am incubat 5 minute în soluție de
chemiluminiscență (Thermo si Licor) urmată de scanarea intensit ății benzilor folosind C –
DiGit.

Figura 1.9. – Sistem de electroforeză pentru Western Blot

4.3.5. Electroforeză nativă (EN)
Proba obțin ută din țesut ul cerebelos provenit de la animale de laborator (șoareci de
laborator tulpina C57Bl /6 și tulpina Cav1tm1Mls/J) a fost supus protocolului de EN . Peletul
celular se resuspendă în tamponul de se parare a fracțiunilor celulare, 250mM sucroză , prin
ultracentrifugare. Soluția resuspendată este supusă unor centrifugări repetate la viteze din ce
în ce mai mari: 700 G pentru separarea fracțiunii nucleare, 10.000 G pentru îndepărtarea
componentelor citosolice, iar supernatantul rezultat se centrifug hează 100.000 G la 4°C
pentru peletarea membranelor celulare. Complexele proteice se extrag din membrane folosind
un tampon ce conține imidazol 50mM, NaCl 50 mM, acid 6 -aminohexanoic 2mM, triton X –
1000 1%, la care se adaugă 1% cocktail de inhibitori de pro teaze. Proba astfel obținută se va
separa în complexe proteice mari prin migrare pe gel de poliacrilamidă, c onform tabelul IV de
mai jos:

41
Soluție Volum
Tampon de gel
(imidazol 25 mM, acid 6 -aminohexanoic 0,5 M) 7,5 ml
Acrilamidă concentrație 37,5:1 2,5 ml
TEMED 0.075% 7,5 μL
10% a monium persulfat 100μL
Tabel IV – Gel electroforeză nativă

Separarea electroforetică se realizează pe gheață, la 10 mA/gel, constant, timp de 2 -4
ore, într -un tampon de migrare format din 50mM tricină și 7,5 mM imidazol, ajustat la pH 8-
10 cu granule de NaOH (0,8 g pentru 0,1 unități de pH). După migrare , gelul se pune la
transfer în tampon c u rețeta de mai sus, pe membrană de PVDF sau nitroceluloză, la 100 mA
constant, timp de 20 -22 ore, pe gheață.
Mem brana de transfer se blochează timp de 30 de minute – 1 oră în soluție de blocare
(5% soluție de albumină serică bovină), apoi se incubează cu anticorpul primar anti proteină
precursoare a amiloidului porțiunea C-terminal în concentrație de 1:20.000 si anticorpul
primar anti caveolin ă-1 în concentrație de 1:1.000 . Incubarea cu anticorpul primar durează
minim 12 ore și este urmată de 4 spălari consecutive a câte 10 minute în TBS -Tween 20,
concetrație 0,1%, iar ultima în TBS simplu. Urmează o oră de incubare în anticorp secundar
cuplat cu HRP anti iepure în concentrație 1:2.000 și relevare cu soluție ECL prin scanare cu
scannerul cDigit.
4.3.6. Densitometria optică și analiza statistică
Analiza semicantitativă a WB a fost realizată utilizând softul QuantityOne (BioRad).
Rezultatele citirii densității optice (OD) reprezintă media a trei experimente. Pentru analiza
statistică am utilizat softul SPSS, iar ca test de varianță, de obicei am ales LSD, cu p
semnificativ statistic la valori mai mici de 0,05. Atât testul de varianță cat și valoarea p se
regăsesc în tabelele statistice importate din SPSS și prezentate în text, după graficului
corespunzător.
4.3.7. Extracție de ARNmesager
Protocolul este optimizat conform specificațiilor kitului de extracție ARN . Am lucrat
în mediu fără RNaze – în hota cu flux laminar, cu mănuși chirurgicale și după curățarea
prealabilă a suprafețelor cu NaOH 0,5M și alcool etilic 70%. Soluțiile (altele decât cele din
kit) au fost pregătite cu apa DEPC 0,1%, iar timpul de izolare a ARN -ului a fost cât mai scurt
posibil. Am prelevat steril țesutul, am sp ălat rapid în PBS rece și am adăugat 5 -10 mg de
țesut în 300 µl soluție de liză, omogenizând rapid. Etapele constau în precipitarea proteinelor

42
și ADN -ului folosind soluți a oferită în kit, omogenizare și centrifugare la 13 .000-16.000 G
timp de 3 minute. Proteinele și ADN -ul vor forma un pelet alb, aderent. Se pipetază
supernatantul într -un eppendorf de 1,5 ml care conține 300 µl isopropanolol 100% și se
omogenizează întorcâ nd tubul cu susul în jos de 25 -30 de ori până la amestecare completă.
Urmează o nouă centrifugare la 13 .000-16.000 G timp de 3 minute. ARN -ul va sedimenta ca
un pelet translucent. Se elimină supernatantul și se usucă tubul pe hârtie de filtru curată, se
adaugă 300 µl etanol 70% și se întoarce tubul de câteva ori pentru a spăla peletul și se
centrifughează la 13 .000-16.000 G timp de 1 minut, eliminând apoi etanolul. După ce se
usucă la aer 10 -15 minute, se poate păstra la -80°C până la utilizare, când va tre bui rehidratat,
sau se va hidrata prin adăugarea a 50 µl soluție de hidratare, pe gheață, timp de 30 minute.
Înainte de utilizare se vortexează și puls -spin.
4.3.8. Dozarea ARN
Pentru dozarea ARN -ului am folosit sistemul Qubit 2.0 de la Invitrogen și kitul de
dozarea ARN BR kit. Sistemul folose ște o metodă fluorimetrică de dozare, raportată la o
soluție standard furnizată cu kitul de măsurare. Pe scurt, după calibrarea aparatului, se
pregăte ște solu ția de lucru cu 198 μl tampon si 2μl reactiv fluoresce nt. Din solu ția de lucru se
iau 199 μl în care se adaugă 1μl solutie de ARN. Această mixtură se pune în cititor și aparatul
va calcula concentra ția în μg/ml.
4.3.9 . Reverse Transcriptase Polimerase Chain Reaction (RT -PCR)
RT-PCRa fost efectuat imediat după extragerea ARN -ului, pentru a sc ădea riscul de
contaminare cu RNAze și pierderea de material. Am folosit pentru experiment un cycler
preîncălzit la 65 °C și am combinat următoarele într -un tub de 0,2 ml:
a. până la 5 µg de ARN (x µl ARN)
b. primeri (50ng/ µl random hexamers sau 50µM oligo (dT)20) – 1 µl
c. tampon de spiralizare – 1 µl
d. apă RNA/DNA free – până la 8µl
Apoi am incubat proba în cycler la 65 °C 5 minute, apoi imediat pus pe gheață cel
puțin 1 minut. După colectarea conținutul tubului prin cen trifugare scurtă, în tubul ținut pe
gheață, am ad ăugat următoarele :
a. 2x first strand reaction mix – 10µl
b. SuperScript™ III/RNaseOUT™ Enzyme Mix 2 μl

43
Am vortexat scurt și centrifugat 1 minut la viteză mare, apoi 5 –10 minute la 25°C,
urmat de 50 min la 50°C. Am terminat reacția la 85°C pentru 5 minute, apoi am lăsat la răcit
pe gheață. cDNA obținut l -am păstrat la -20°C până la utilizare.
Volumul care con ține 1 µg ARN se combin ă cu 6µL tampon de eliminare a ADN -ului
genomic și apoi se adaugă apă până la un volum final de 14µl. Amestecul astfel obținut se
incubează la 37°C 5 minute, apoi reacția se oprește prin incubare pe gheață cel puțin 1 minut.
Se adaugă 6 µl de amestec prestabilit de reacție pentru un volum final de 20 µl și se incubează
la 42°C 15 minute, apoi se oprește reacția prin încălzire la 95°C timp de 5 minute.

4.3.10. Q-RT PCR (semicantitativ)
S-a făcut qRT pornind de la ADNul complementar (AD Nc) obținut prin metoda
descrisă mai sus din ARN -ul extras din creier de șoarece control și K.O. pentru cav -1,
utilizând iCycler setat pentru următoarele cicluri :
Ciclul 1:( 1X) pas 1: 95.0șC timp de 05:00 minute ;
Ciclul 2:(35X) pas 1: 95.0șC, 30 sec, pas 2: 53.0șC, 30 sec, pas 3: 72.0șC, 30 sec.
Ciclul 3:( 1X) pas 1: 72.0șC, 05:00 minut e ;
Ciclul 4:( 1X) pas 1: 4.0șC 30:00 minute.
Primerii folosiți au fost:
APP mouse fwd TGG -AAT -CTC -TGG – AAC -AGG -AA
APP mouse reverse: ATG -CTT -TAG -GGT -GTG -CTG -T
În fiecare godeu d in placuț a pentru control S18 s -au combinat următoarele, pentru un
volum to tal de 20 μL:
– 1 μL ADNc;
– 1uL primer mix de S18;
– 10μL Sybr Green qPCR master mix;
– 8μL apă RNA, DNA pură.
În fiecare godeu din placu ța pentru expresia APP s -au combinat urmatoarele, la un
volum total de 20 μL:
– 1μL ADNc;
– 0,75 μl primer Forward APP;
– 0,75 μl primer Reverse APP;
– 10μl Sybr Green qPCR master mix;
– 7,5μl apă RNA, DNA pură.

44

4.4. Rezultate
4.4.1 Analiza nivelului caveolinei -1 și a proteinei precursoare a amiloidului în
creierul șoarecilor C57Bl/6J
În sistemul control, expresia proteică a caveoline i-1 crește semnificativ cu vârsta, față
de cea a proteinei precursoare a amiloidului (APP) a cărei schimbare este modestă .
Am testat în Laboratorul de Medicină Celulară și Moleculară al Institutului Național de
Patologie V. Babeș , creierul recoltat de la cele două tulpini de șoarecii cu vârste diferite. Determinarea
concentrației de proteine din p robele obținute a fost efectuată conform protocolului de la capitolul
“Materiale și metode”. Tabelul V prezintă valorile curbei standard, care au dus la generarea formulei
de calcul a concentrației de prote ine (figura 1.10. ) care a fost aplicat valorilor spectofotometrice
generate de probe (tabelul VI ).
Tabel V – Valori
spectofotometrice ale curbei
standard
Concentrație
BSA (mg/ml)
Media DO

2 0,244
1 0,151
0,5 0,109
0,25 0,091
0,125 0,080
0 0,067

Figura 1.10. – Curbă standard de BSA
y = 0.0875x + 0.0675
R² = 0.9989
00.050.10.150.20.250.3
0 0.5 1 1.5 2 2.5Series1
Linear (Series1)
Concentrația BSADensitatea optică

45
Media DO
probe diluate
de 10 x Concentrația
proteică diluată de
10 x Concentrația
proteică reală
Volumul necesar
pentru în cărcarea a
20 ug
Cerebel
control 0,102 0,39 3,99 5,00
Cerebel
knock out 0,109 0,48 4,81 4,15
Parietal
control 0,087 0,22 2,22 8,97
Parietal
knock out 0,090 0,26 2,61 7,64
Tabel VI – Determinarea concentrațiilor proteice din lizatul de cerebel și parietal
Pentru confirmarea asocierii caveolinei -1 cu procesul de imbătrânire raportat în literatură am
analizat pentru î nceput expre sia cav -1 în creierul murin al ș oarecilor C57BL/6J. Deoarece
doresc să folosesc șoarecii ca și control în experimentele viitoare, am testat expresia și variația
cu vârsta a APP prin tehnica Western Blot (figura 1.11.) .

Figur a 1.11. – Testarea expresiei cav -1 și APP în creierul șoarecilor C57Bl/6
Western Blot pentru cav -1 și APP pe lizate de cortex cerebral (20 µg/godeu) obținut de
la șoareci C57Bl/6 de 6 luni respectiv 20 de luni, controlul încărcării probelor a fost
facut cu β -actină. Am constatat creșterea expresiei cav -1 cât și a APP odată cu vârsta în
creierul șoarecilor sănă toși.

Nivelul de caveolină -1 este crescut în cortexul șoarecilor C57Bl/6 de 20 luni față de
cel al șoarecilor C57Bl/ 6 de 6 luni, rezultatele sunt în acord cu ceea ce se regăseș te în
literatura de specialitate (CAV -1 în figura 1.11.) . Am evaluat modificarea expresiei proteinei
la acest tip de șoarece deoarece aces ta este cel recomandat de crescător ș i contribuie cu 75%
la fundalul genetic al animalului de laborator ce va fi studiat de mine, knockout pentru cav -1.
Aceast ă tulpin ă va fi folosită ca și control în urmatoarele experimente.
Nivelul proteinei precursoare a amiloidului cre ște odat ă cu îmbătrânirea la șoarecii
C57Bl/6, proteina av ând o expresie mai mare în creierul șoarecilor de 20 de luni prin
compara ție cu cei de 6 lu ni (APP în figura 1.11.) . Șoarecii s ănătoși de 6 luni exprim ă APP în
lizatul cerebral, însă la cei de 20 luni se observ ă o cre ștere a expresiei acestei proteine, fiind
corelat ă cu procesul de î mbătrânire neuronală ș i depunere extraneuronal ă a peptidului Aβ.
APP CAV -1

46
4.4.2 Analiza modific ărilor de nivel al proteinei precursoare a amiloidului în
creierul ș oarecilor transgenici Cav1tm1Mls/J, comparativ cu tulpina C57Bl/6
Deoarece șoarecele cav -1 -/- are un fundal genetic mixt, controlul C57Bl/6
recomandat de cresc ător și folo sit de mine î n toate experimentele contribuie cu 75% la
fundalul genetic. Întâ i am verificat absen ța expresiei cav -1 în creierul ș oarecilor transgenici,
controlul încărcării probelor a fost făcut î n paralel cu β -actin ă (figura 1.12.) .

Figur a 1.12. – Testarea absen ței cav -1 în creierul ș oarecilor trangenici cav -1 -/-
Western Blot pentru cav -1 pe lizat de c ortex cerebral (20 µg/godeu) obținut de la șoareci
C57Bl/6 ș i Cav1tm1Ml s/J, controlul î ncărcării probelor a fost f ăcut cu β -actin ă. Am
demonstrat absen ța expresiei cav -1 în creierul șoarecii transgenici.

Următorul pas a fost testarea expresiei proteinei precursoare a amiloidului în creierul
șoarecilor K.O. comparativ cu cei aleși ca și control. Folosind protocolul de Western Blot
descris în ”Materiale și metode” am obținut:

Figur a 1.13. – Evaluarea expresiei APP în creierul șoarecilor transgenici cav -1 -/-
Western Blot pentru APP pe lizat de c ortex cerebral (20 µg/godeu) obț inut de la șoareci
C57Bl/6 si Cav 1tm1Mls/J, controlul î ncărcării probelor a fost f ăcut cu β -actin ă. Am
constatat scăd erea expresiei APP în creierul ș oarecilor transgenici prin compara ție cu
șoarecii control de aceea și vârstă.

Nivelul proteinei precursoare a amiloidului este scăzut în cortexul șoarecii knockout
pentru caveolina -1 față de controlul de aceeași vârstă cu specimenul studiat (figura 1.13.). Am

47
folosit anticorpi anti APP ce recunosc domeniul C -terminal al proteinei, fiind identificată la o
greutate de aproximativ 100 kDa. Pasul următor a constat în studiul distribuției modificării de
expresie a APP în mod diferențiat pe arii corticale.
4.4.3 Analiza modific ărilor cantitative ale proteinei precursoare a amiloidului,
diferen țiat pe zone corticale, la șoarecii Cav1tm1Mls/J și tulpina control
Trecând de la testarea expresiei de la nivelul întregului creier unde se observ ă o
scădere a expresiei proteinei precursoare a amiloidului, în grupul knockout la nivelul
cerebelului se p ăstreaz ă aceea și scădere prin comparație cu cerebelul ș oarecilor C57Bl/6 de
aceea și vârstă (1 an și 3 luni). Acest ă scădere este p ăstrată atât la masculi c ât și la femele, prin
comparație cu controlul de aceeaș i vârstă și sex. În literatura de specialitate, la nivelul
cerebelului nu a fost raportat ă modificarea expresiei caveolinei -1 cu v ârsta, iar în ceea ce
prive ște expresia APP nu exist ă date concludente.

Figura 1.1 2.– Evaluarea expresiei APP în cerebelul șoarecilor transgenici cav -1 -/-
Western Blot pentru APP și GAPDH pe lizate de cortex cerebelos ob ținut de la șoarecii
cav-1 -/- și șoarecii C57Bl/6 (20µg/godeu). Am constat sc ăderea expresiei APP la șoarecii
K.O. indiferent de sex. Pentru analiza statistic ă s-a folosit testul ANOVA, cu corec ție
Bonferroni, iar semnifica ția statistic ă (*) a fost atins ă pentru p < 0.05.

Pentru a evalua gradul scăderii expresiei APP în cerebelul șoarecilor cav -1 -/- am
efectuat densitometria optică a Western Blot-ului din figura 1.12. , urmată de analiza statistică
(Bonferroni test of variance, *p< 0,05), care a arătat o scădere semnificativ statistică a
nivelului de proteină precursoare a amiloidului în cerebelul șoarecilor masculi K.O. cât și a
femelelor K. O. pentru caveolina -1 față de controlul de aceeași vârstă.

48

Figur a 1.1 3. – Evaluarea expresiei APP în lobul parietal al șoarecilor transgenici cav -1-/-
Western Blot pentru APP (prima banda) și GAPDH (a doua banda) pe lizate de lob
parietal obținute de la șoarecii cav -1 -/- și șoarecii C57Bl/6 (20µg/godeu). Am constat
scăderea expresiei APP la ș oarecii K.O. odata cu v ârsta. Pentru analiza statistic ă s-a
folosit testul ANOVA, cu corecț ie Bonferroni, însă semnifica ția statistic ă nu este atins ă.

În ceea ce prive ște varia ția expresiei APP cu vâ rsta la nivelul lobului parietal, în lotul
șoarecilor transgenici pen tru gena caveolinei -1 se evidenț iaza sc ăderea nivelul de APP ce se
menține la cei de 12 luni c ât și la cei de 23 luni. Pentru a evalua gradul sc ăderii expresiei APP
în lobul parietal al ș oarecilor cav -1-/- am efectuat densitometria opt ica a Western Blot -ului
din figura 1.13. , urmată de analiza statistic ă (Bonferroni test of variance,*p < 0,05), însă în
aceast ă regiune nu am o bținut o diferen ță semnificativ ă statistic între ș oarecii K.O. și control
de aceea și vârstă.

Figur a 1.14. – Evaluarea expresiei APP
în cerebel și lobul parietal în cortexul
șoarecilor transgenici cav-1 -/- și control
Western Blot pentru APP și GAPDH pe
lizate de cerebel și lob parietal obținute
de la șoarecii cav -1 -/- și șoarecii
C57Bl/6 (20µg /godeu). Am constat
scăderea expresiei APP la șoarecii K.O.
la nivelul ambelor zone corticale
studiate , semnificația statistică fiind
atinsă pentru cerebel .

49
4.4.4. Testarea asocierii dintre caveolina -1 și APP prin electroforeză nativă
Pentru a vedea da că această modificare de expresie necesită o asociere fizică între cele
două proteine am efectuat electroforez a nativă conform protocolului prezentat la „ Materiale și
Metode ” prin care am păstrat legăturile care se realizează in vivo între proteine le partenere.

Figura 1.17. – Evaluarea expresiei APP C-terminal în cerebel și a cav -1 în cerebel
șoarecilor transgenici cav-1 -/- și control
Electroforeză nativa pentru APP C-terminal în lizatul de cerebel și a caveolinei -1 în
fracția membranară din cerebelul obținut de la șoarecii cav -1 -/- și șoarecii C57Bl/6
(2µg/godeu). Am confirmat absența cav -1 din membrană la șoarecii knockout și am
obținut benzi pentru APP și cav -1 în cerebelul șoarecilor control cu greutăți moleculare
ce variază între aproximativ 1000 kDa și 700 kDa .
Am constatat că profilul obținut la electroforeză nativă pentru cele două proteine nu
este decât parțial superpozabil, deci legătura dintre ele ar putea fi mai degrabă una
funcțională. Având în vedere descrierea caveolinei -1 drept inhibitor al mai multor căi de
semnalizare, prevenind activarea diverselor kinaze implicate, am testat mai departe efectul
knockout -ului de caveolină -1 asupra fosforilării APP.

4.4.5.Testarea fosforil ării proteine i precursoare a amiloidului la ș oarecii control
C57Bl/6J versus șoarecii transgenici Cav1tm1Mls/J
Având în vedere c ă am ob ținut modific ări în expresia proteinei semnificativ e statistic
la nivelul cerebelului, am co ntinuat experimentele pe această zona din cortex. Știind că APP
este o protein ă transmembranar ă ce con ține 8 situsuri de fosforilare la cap ătul C -terminal, am
studiat forma fosforilat ă de la nivelul treoninei 743/668 neuron specific ă care afectează
procesarea enzimatic ă. Pentru testarea expresiei formei fosforilate am adaptat un protocol de
electroforeză care presupune migrarea probelor în condiții reducătoare și non -reducătoare, cea
din urmă păstrând legăturile disulfidice din cadrul APP. Condițiile reducătoare presupun

50
lizatul de cerebe l de la șoarecii control și adăugarea β-mercaptoetanol ului urmată de fierbere
timp de 10 minute , pe când la proba în condiții non -reducătoare se adaugă soluție Laemmli
fără β-mercaptoetanol ș nu este urmat de fierbere.

Figur a 1.18. – Evaluarea expresiei formei fosforilate a APP în cerebelul șoarecilor
control
Western Blot pentru forma fosforilat ă a APP (Thr -743) din lizat de cerebel al șoarecilor
C57Bl/6 ș i lizat de leucocite umane, utilizând condiț ii de reducere pentru prepararea
probelo r dar și condiț ii non -reductive. Am constatat prezenț a mai multo r benzi pentru
forma fosforilată cu GM diferite. Abreviere: GM – greutatea moleculara, (1) – probă
lizat cerebel condi ții reduc ătoare, (2) – prob ă lizat cerebel condi ții non -reductoare, (3) –
prob ă lizat leucocite condiții reducă toare, (4) – prob ă lizat leucocite non-reduc ător.

Se observă în fig ura 1.18. că în condi țiile probei 2 exist ă mai multe benzi cu greutate
molecular ă ce variaz ă între 100 kDa și 50 kD a, acestea fiind diferite față de rezultatul obț inut
în condi ții reduc ătoare. Astfel, pă strarea leg ăturilor S -S duce la identificarea mai multor
fragmente fosforilate a proteinei precursoare a amiloidului, care nu se reg ăsesc în condi țiile
non-reduc ătoare la blotarea pentru por țiunea C -terminală a APP. Studiind modificările de
fosforilare de la nivel cerebelos am putea explica expresia scăzută a APP la șoarecii K.O. ce
prezintă modificări cerebrale regăsite în boala Alzheimer.
Am dorit să testez persistența modificării de expresie la șoareci K.O. cav -1 -/- în
condiții non -reducătoare non -denaturante. Astfel, lizatul din cerebel recoltat de la șoarecii
control și transgenici cu soluția Laemmli 2X fără β-mercaptoetanol și fără fierbere, urmând ca
migrarea să fie pe un gel fără SDS, co ndițiile fiiind identice cu experimentele efectuate mai
sus.

51

Figur a 1.19. – Evaluarea expresiei formei fosforilate a APP în cerebelul ș oarecilor
trangenici pentru cav -1 -/- versus tulpina control
Western Blot pentru APP fosforilat (Thr -743/668) din lizatul de cerebel al șoarecilor
Cav1tm1Mls/J și C57Bl/6 , în condi ții non -reductoare ș i non -denaturante. Am constatat
prezenta mai multor benzi cu greutăț i moleculare variate.

Se observ ă în figura 1.19. că rezultatele ob ținute se mențin și în condi ții non –
denaturante, ap ărând mai multe benzi la blotarea pentru forma fosforilat ă a APP Thr -743/668.
Cu greut ăți moleculare între 40 kDa și >250 kDa se observă în cerebelul celor dou ă loturi de
șoareci forme fosforilate a fragmentelor APP cu posibilitatea formă rii unor agregate din
fragmentele APP care s ă explice existen ța benzilor la greut ăți moleculare de peste 100 kDa.
4.4.6. Evaluarea expresiei genice a proteinei precursoare a amiloidului pr in PCR
cantitativ
Pentru a vedea dacă modificarea expresiei proteinei se coreleaz ă cu inhibarea
transcrierii genice, am făcut determina t cantitativ ARNm a APP -ului din creierul șoarecilor
cav-1 K.O. . Am extras ARN -ul creierul șoarecilor cav -1 K.O. conform protocolului prezentat
în subcapitolul ”Materiale ș i metode”, iar pentru control am folosit cortex de șoarece C57/Bl6
de aceeași vârstă și sex cu animalul K.O. . ARN -ul extras a fost transformat în cDNA prin
revers -transcripție la 50° Celsius, apoi supus am plificării prin PCR. Pentru controlul intern am
folosit S18 rARN deoarece prezint ă mai pu țină variabilitate a expresiei fa ță de β-actin ă și
GAPDH, iar controlul negativ a fost reprezentat de probe la care nu am adăugat
reverstranscriptaza în amestecul de RT-PCR.

52

Tabel VII – Citirea valorilor prag a fluorescen ței pentru SYBR Green 490

”Ct” (cycle threshold) reprezintă numărul de cicluri de amplificare necesare
semnalului fluorescent pentru a depăși semnalul de fond (tabelul VII) . Cu cât secvența de
amplificat este mai puțină cantitativ, cu atât semnalul va apărea mai târziu, iar pragul va fi mai
mare. Din tabelul precedent se observă c ă media numărului de cicluri neceare pentru APP din
cortexul șoarecilor cav -1 -/- să atingă pragul este cu aproximati v 1,5 cicluri mai mic decât a
controlului recomandat de crescător. Toate probele luate în lucru au avut un semnal puternic,
indicator al prezenței unei cantități suficiente de material genetic.
Pe baza înregistrării semnalului fluorescent, softul folosit a generat un grafic (figura
1.20.) în care fiecare godeu este prezentat ca o situație individuală, iar evoluția fluorescenței
fiecărei situații este reprezentată printr -o curbă de anumită culoare, culoare pe care o regăsim
în tabelul VII.

Figura 1.20. – Înregistrarea fluorescenț ei qRT -PCR pentru APP din cortexul șoarecilor
cav-1 -/-

53
Pentru a mă asigura de corectitudinea rezultatelor am efectuat o ”curbă de topire”, care
măsoară temperatura de degradare a secvențelor de ADN dublu catenar rezultate în urma
PCR -ului. Energia necesară ruperii legăturilor de hidrogen dintre cele două catene
complementare este dependentă de lungimea catenei, motiv pentru care, dacă în proba mea ar
exista contaminari (catene de altă lungime decât cea dorită sau chiar exces d e primeri
dimerizați) aceștia ar apărea pe curba de topire ca vârfuri la alt e temperaturi decât cea a
situaț iilor mele.

Figura 1.21. – Curba de topire pentru qRT -PCR APP din cortexul șoarecilor cav -1 -/-

Din figura 1.21. se obsevă două vârfuri, unul mai amplu, la 87°C, al secvenței de APP
și unul mai mic, la 85,5°C, al subunității ribozomale S18. Aspectul graficului curbei de topire
confirmă reușita experimentului.
Pentru cuantificarea ARNm al APP pe baza datelor de qRT -PCR am folosit formula :
𝑁𝑢𝑚 ă𝑟 𝑐𝑜𝑝𝑖𝑖 𝐴𝑃𝑃 𝑐𝑎𝑣 1 𝐾.𝑂.
𝑁𝑢𝑚 ă𝑟 𝑐𝑜𝑝𝑖𝑖 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 =2−∆∆𝐶𝑇
∆∆𝐶𝑇=∆𝐶𝑡 𝐴𝑃𝑃 𝑐𝑎𝑣 −1 𝐾.𝑂.−∆𝐶𝑡 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙
unde ΔCt reprezintă normalizarea la controlul endogen de S18, adica:
𝐶𝑡 𝐴𝑃𝑃 𝑐𝑎𝑣1 𝐾.𝑂/𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 –𝐶𝑡 𝑆18

Deci, raportul este 2 -(26.4 -28,4) -(27.8 -27,15)= 2 1,35=2,54, ceea ce presupune o
upregulare a traducerii genice. Cum însă WB arată o scădere a expresiei proteice, este foarte
posibilă existența unei interferențe ARN, pos ibil prin specii de microARN, care exercită un
control posttranscripțional al expresiei APP în creierul șoarecilor cav -1 -/-.

54

4.5. D iscuții

Cele mai frecvente patologii neurodegenerative sunt demența vasculară, boala
Alzheimer și boala Parkinson, fiecare având propriul mecanism molecular de apariție.
Demența este o patologie multifactorială, cercetările din domeniul biologiei moleculare au
demonstrat că mecanismele se suprapun, având următoarele consecințe: 1) recunoaș terea
necesității unui diagnostic mai exact și prin urmare a identificării unor biomarkeri specifici și
sensibili; 2) noi modele animale de boală au fost dezvoltate. Modelele animale dețin un rol
important în elucidarea mecanismelor de apariție a bolii deo arece permit analiza căilor și
proteinelor care aparent nu au legătură cu modificarea genetică imprimată organismului.
Modelele murine neurodegenerative includ animale transgenice pentru proteina precursoare a
amiloidului, proteina tau, presenilina, dar și injectare de neurotoxine în corpul striat sau
ligaturarea carotidelor în cazul demenței vasculare.
Conceptul de îmbătrânire a creierului –“brain aging” – se referă la o performanță
cognitivă cu deteriorare progresivă. Metodele de imagistică (tomografie computerizată,
rezonanță magnetică și PET cu fluordeoxiglucoza) au demonstrat că atrofia cerebrală apare
odată cu înaintarea în vârstă în creierul sănătos, fără semne de d emență. Studiul modelelor
animale a arătat că odată cu îmbătrânirea apare în mod normal o diminuare a numărului de
neuroni alături de scăderea volumului substanței cenușii. Studii ulterioare au contrazis
rezultatele inițiale, susținând conservarea numărulu i de neuroni în pofida subțierii cortexului
cerebral. Modificările apar în s ubstanța cenușie cât și în substanță albă, pierderea fiind mai
degrabă funcțională cu modificarea circuitelor neuronale decât că scăderea numărului absolut
de celule nervoase. Numă rul de neuroni este păstrat inclusiv în zonele susceptibile la demență,
precum lobul frontal sau medio -temporal, unde subțierea scoarței cerebrale nu este un
indicator definitor de boală. Îmbătrânirea este caracterizată de neurogeneza scăzută, cu
alterarea semnalizării neurotrofinei și dezechilbrul factorilor de semnalizare neuronală. În
creierul îmbătrânit, macromoleculele sunt oxidate și nu mai pot fi degradate de aparatul
lizozomal astfel se produce o cantitate mai mare de enzime lizozomale ce nu mai pot digera
materialul celular, un bun exemplu fiind lipofuscina4. O dată cu îmbătrânirea și cu
neurodegenerarea, creierul prezintă un nivel crescut al mai multor proteine dar și enzime,
neuronii având un număr mai mare de endosomi și fagozomi6-8. Multiple stu dii subliniază
importanța homeostaziei proteice, sugerând că pierderea acestui echilibru duce la îmbătrânire
și inclusiv la procese neurodegenerative. Nu se cunoaște încă relevanț a acestor depozite

55
proteice anormale, neputând fi corelate modificările morfo logice cu semnele clinice, deoarece
sunt foarte puțini cei peste 80 de ani fără anomalii cerebrale.

Figura 1.22. – Îmbătrânirea fiziologică vs. patologică (adaptat după Tony Wyss -Coray ,
Ageing, neurodegeneration and brain rejuvenation , Nature, 2016 )

Deși creierul are un înveliș protector, bariera hematoencefalica, există argumente că
factori ai senescenței neuronale traversează barier a și influențează negativ neurogeneza.
Senescența neuronală depinde de echilibrul între tipurile celular e ce se găsesc în sistemul
nervos, a celulelor cu abilitatea de a cataliza speciile reactive de oxigen (SRO), de a proteja de
stimulii citotoxici sau de a limita reacțiile inflamatorii care în aceste condiții sunt mult
diminuată. Prin urmare, înțelegerea procesului de îmbătrânire de la nivelul creierului și
diferențierea de procesul patologic de neurodegenerare este o sarcină mai dificilă prin
comparație cu alte sisteme și organe, datorită mecanismelor complexe de reglare, semnalizare
și interacțiune celul ară.
Cunosc ând importan ța caveolelor în transportul celular și semnalizare dar și
interac țiunea cu proteina precursoare a amiloidului ce a fost prezentat ă în partea generală a
acestei lucr ări, voi prezenta pe scurt modifică rile ce apar la animalele modificate genetic încă
din faza embrionar ă și care nu mai produc caveolina -1, caveolina -2 sau caveolina -3.
a) Fenotipul ș oarecilor knockout pentru caveolina -1 ( Drab și colab., 2001; Razani
și colab., 2002)
După identificarea ca v-1 ca principal ă componentă a caveolaelor, un model animal a
fost dezvoltat pentru studierea func ției in vivo . Surprinză tor, șoarecii cav -1 K.O. au fost
viabili dar au dezvoltat anormalit ăți vasculare, de aș teptat av ând în vedere larga distribu ție în
celulele endoteliale. În țesuturile prelevate de la șoarecii cav -1 -/- este certificat ă absen ța

56
caveolelor din endoteliu, adipocite dar și epiteliu, cu reducerea dramatic ă a nivelului
caveolinei -2 datorită destabiliz ării și lizei pro teice, fiind prin urmare cav-1 și cav -2 deficiente.
La nivel pulmonar prezint ă hiperproliferarea epiteliului cu defecte în sistemul vascular și un
raspuns exagerat la stimuli prin activarea cascadei oxidului nitric al ături de modific ări în
homeostazia lipidic ă, cu un nivel crescut de trigliceride. Procesele celulare sunt afecta te cu o
multiplicarea mai rapidă a fibroblastelor c ât și defecte în endocitoza av ând loc o sc ădere a
transportului albuminei.
Deși viabili, șoarecii cav -1 K.O. au o greutat e semnificativ mai mic ă prin compara ție
cu wild -type, fiind rezisten ți la obezitatea indus ă prin dieta hipercaloric ă. Șoarecii transgenici
au o mas ă cerebral ă diminuat ă, dezvolt ă fenotipuri neurologice cu afectare motorie și de
comportament, cu sl ăbiciune muscular ă și au activitate fizic ă redusă, dar și anormalit ăți
digestive f ără să existe o afectare nervoas ă. Aceste modific ări ar putea fi corelate cu pierderea
sinaptic ă, mecanismul fiind la nivelul pl ăcii neu romotorii. Dar, fiind o proteină membran ară,
caveolina -1 poate fi responsabil ă de slaba mielinizare a celulelor gliale ce se înfășoară in jurul
axonilor.
b) Fenotipul șoarecilor knockout pentru caveolina -2 (Razani ș i colab., 2002)
În țesuturile acestor modele murinice, expresia caveolinei -1 este u șor sc ăzută fără să
fie absente caveolele. Exist ă modific ări histologice la nivel pulmonar identice cu cele ale
șoarecilor K.O. pentru cav -1, demonstr ând rolul important al cav -2 independent de prezen ța
sau interac țiunea cu cav -1. În rest, vasoreglarea și transportul lipide lor sunt nealterate.
c) Fenotipul ș oarecilor knockout pentru caveolina -3 (Galbiati și colab., 2001;
Hagiwara ș i colab., 2000)
În țesuturile musculare și la nivel cardiac, se pierd caveolele mai ales în celulele care
exprimă predominat cav -3. Modific ări histologice ale muș chilor prezint ă un fenotip
asemă nător distrofiei muscular e a centurilor din patologia uman ă (Minnetti și colab., 1998).
Am ales pentru studiu modelul trangenic pentru caveolina -1 deoarece acesta prezint ă la
nivel cerebral modific ări impo rtante care m ă intereseaza pentru studiul că ii amiloidogenice a
bolii Alzheimer. Astfel, pri n obținerea unui lizat tisular ș i extrac ție de ARNm, am studiat
expresia APP în creierul acestor șoareci comparativ cu șoarecii control de aceeași vârstă și
sex, re comandați de crescător C57BL/6 .
Argumentele în plus pentru studiul acestor animale sunt raport ările din literatur ă care
susțin existen ța unei interac țiuni semnificative între caveolina -1 si APP, interac țiune posibil
modificat ă în boala Alzheimer. Aș a cum am prezentat în partea general ă, apar modific ări de
expresie a caveolinei -1 cu v ârsta, în țesuturile senescente dar ș i în cortexul cerebral, în
hipocamp și cerebel prin compara ție cu animalul t ânăr (Kang ș i colab., 2006). În boala

57
Alzheimer se p ăstrează aceea și creștere semnificativ ă a expresiei caveolinei -1, atât la nivel de
ARNm c ât și ca protein ă finală (Gaudreault și colab., 2004). Evidenț ierea co -localiz ării
membranare a peptidului Aβ și a caveolinei -1, a dus la teoria prin care metabolizarea APP
este influen țată de interac țiunea cu caveolele, APP fiind o protein ă transmembranara cu
modific ări de expresie în func ție de compoziț ia plutelor lipidice. În experimentele mele, am
studiat aceast ă tulpin ă de șoareci transgenici deoarece prezint ă de la v ârsta de 3 -6 luni
modific ări specifice bolii Alzheimer (depozite de β -amiloid și protein ă tau), ace știa put ând fi
utiliza ți în viitor ca și model pentru bolile neurodegenerative, cum este boala Alzheimer.
Head și colaboratorii au publicat în 2010 un studiu în care au propus aceast ă tulpin ă de
șoarece trangenic pentru caveolina -1 drept model de neurodegenerare accelerata. Folosind
metode utilizate în studiul biologiei moleculare, au comparat creierul dar și hipocampul
animalelor de vâ rste diferite. Ace știa a u descoperit modific ările prezentate mai sus și au
încercat s ă găseasc ă o legătura între caveolina -1 și produc ția crescut ă de peptid A β. Astfel au
generat o cultur ă neuronal ă din creierul șoarecilor cav -1 -/- și au reexprimat gena caveolinei,
în acest sistem fiind observat ă apoi scăderea producț iei de peptid a miloidogenic.
Modelul ales de mine a produs rezultate interesante, confirmâ nd ipoteza unei
interrela ții între cele dou ă protein e. Scăderea expresiei de APP obț inută în urma electroforezei
a fost ve rificată la nivel de ARNm, unde surprinzător, am constatat o creștere a transcriptului
ARNm de aproape 3x față de control. Diferența de expresie între ARNm și proteina codificată
de acesta presupune existența unui control posttranscripțional exercitat de m icroARNuri.
Din literatur ă, câteva mecanisme p ot fi evidenț iate prin care expresia sau procesarea
proteinei precursoare a amiloidului poate fi modificat ă de catre caveolina -1:
1. Caveolina -1 prezint ă domeniul " scaffolding" (DSC) care poate să
interac ționeze cu alte proteine membranare, inclusiv cu proteina precursoare a
amiloidului, facilit ând astfel proteoliza proteinei;
2. APP este exprimat în mod preferenț ial în domeniile bogate în
colesterol, aș a cum sunt caveolele, iar procesul amiloidogenic este favorizat de
către hipercolesterolemie. Dispari ția caveolelor la modelele K.O. pentru cav -1
redirec ționeaz ă APP că tre plutele lipidice, duc ând astfel la cre șterea extracelulara a
depozitelor de beta -amiloid. A stfel, ambele enzime implicate î n procesul
amiloidogenic sunt localizate la nivelul plutelor l ipidice: BACE se gă sește în
domenii membranare non -caveolare ș i gama -secretaza la nivelul zonelor
membranare detergent -rezistente;
3. Supraexpresia cav -1 în celulele ce exprim ă BACE rezult ă în scăderea
produc ție de peptid amiloid suger ând un rol protectiv al caveolinei -1;

58
4. Caveolele și cav -1 ac ționeaz ă ca noduri de semnalizare, regl ând
activitatea kinazelor. În schimb, APP -ul are 8 situri de fosfo rilare la nivelul
domeniului C -terminal, ce pot fi potenți al modificate de exp resia cav -1.
Fosforilarea la Thr 743/668 este esenț ială pentru legarea cu Fe65 ce conduce la
translocarea nuclear ă, urmat ă de activarea GSK3β și fosforilarea proteinei tau;
5. Pierderea cav -1 poate altera fosfori larea altor proteine implicate î n
traficul APP: Mint1/X11alfa este unul din cei 4 adaptori de trafic neuronal ce
interac ționeaza cu APP. Fosforilarea Mint1 de că tre tirozina Src regleaz ă destina ția
APP, restric ționând distribu ția către ramifica țiile terminale neuronale.
Deși aparent rezultatele în urma qRT-PCR obținute de mine sunt în contradicție cu cele
raportate de Head, diferenț a poate rezulta din controalele folosite de fiecare dintre noi. În
articol nu este precizată tulpina de șoarece cav -1 -/-, daca este de proveniență proprie sau
achiziționată. Laboratorul Jackson, de unde au fost achiziți onati ș oarecii K.O., au dou ă
tulpini disponibile: B6.Cg -Cav1tm1Mls/J și STOCK Cav1tm1Mls/J, care diferă ca origine.
Datorită provenien ței embrionare diferite, controalele recomandate pentru aceste tulpini
diferă. O altă precizare important ă este că studiul precizat mai sus se concentreaz ă asupra
hipocampului, cea mai vulnerabil ă regiune a emisferelor cerebrale în patologia de tip
Alzheimer ș i zona în care apar primele modific ări. Studiul meu a implicat pentru început lizat
de creier și apoi, av ând î n vedere faptul c ă zonele cerebrale r ăspund diferit în condiții
patologice, pe cerebel ș i lob parietal, lipsind însă din experiment hipocampul.
După cum am menționat în capitolul ”Rezultate”, expresia APP este mai accentuat ă în
cerebel față de lobul parietal, însă se men ține în ambele zone sc ăderea expresiei proteice. Într-
un studiu publicat de Wagner și colaboratorii în aprilie 2017 este studiat ă implicarea
cerebelului, anume a neuronilor granulari din stratul profund, în circuitele motiva ționale ce
privesc r ăspunsul învățat la recompensa, sublinind astfel și func ția non -motorie a creierului
mic. Varietatea activit ăților asociate cu cerebelul se întinde de la sarcini precum aten ție,
limbaj, memorie de procesare și pe termen lung, învățare, durere dar și adic ție, p ână la
descrierea circuitului cortico -cerebelos, contur ând func țiile superioare cu implica ții în
comportament și care pot fi afectate în cadrul bolilor neurodegenerative. Date mai vechi
relatează prezența depunerilor de amiloid în cortexul cerebelos al pacienți lor cu BA , ca plăci
difuze în stratul molecular, uneori însoțite de amiloidoză vasculară88. Deoarece aceste
depozite nu au fost viz ibile cu colorațiile uzuale folosite pentru evidențierea plăcilor de
amiloid, este posibil ca natura fragmentelor proteice din compoziția lor să fie diferită de cea
din neocortex. Date recente d in studii clinice ale încărcării cu amiloid a creierului pacie nților
cu tulburare cognitivă ușoară și demență, obținute prin studii imagistice de PET – amiloid,

59
arată că normalizarea citirilor datelor imagistice la background -ul de încărcare cerebelos nu
duce la o bună separare a grupurilor de pacienți de cel de contr ol sau a grupurilor de pacienți
între ei, sugerând că și cerebelul prezintă încărcare amiloidică ( “Regionally specific SUVR
values in earlystage AD patients screened with amyloid PET ”, David Scott Joyce Suhy,
Mehul Sampat, Ping Chiao, Jeff Sevigny și Grego ry Klein ).
Diferențele observate în gradul de scădere a expresiei proteinei precursoare a
amiloidului între diversele zone ale cortexului ar fi interesant de aprofundat, deoarece zona în
care modificarea a fost mai pregnantă (cerebelul), prezintă depuneri difuze de amiloid spre
deosebire de zonele vulnerabile în boala Alzheimer. Ș tiind c ă APP este precursorul acestor
depuneri, sc ăderea expresiei î n ambele zone, dar mai ales în cerebel, ar putea s ă fie explicat ă
de rolul neur oprotectiv pe care caveolina -1 îl are, absen ța acestei proteine duc ând la un deficit
de plasticitate sinaptic ă cu accelerarea neurodegener ării. Creș terea expresiei proteinei
precursoare a amiloidului cu vâ rsta la șoarecii s ănătoși așa cum reiese din rezultatele ob ținute
în capitolul 4, ar putea s ă fie un mecanism compensator și nu o m ăsură direct ă a îmbătrâniri
cerebrale, corelaț ie ce poate fi f ăcută și în cazul bolii Alzheimer14-16. Mai mult, rolul APP în
cerebelul matur nu este foarte bine elucidat. Un studiu recent, care a urmărit distr ibuția
celulelor stem mesenchimale injectate la șoareci tineri vs . șoareci vârstnici, a demonstrat că,
spre deosebire de organismul tânar, unde distribuția este difuză, în majoritatea organelor, în
organismele vârstnice distribuția e ste preferențială în ne ocortex. Mai mult, la șoarecii
transgenici APP/PS1, aceste celule sunt atrase în cerebel25.
Interesant de remarcat este că, deși scăderea expresiei de APP se menține la nivelul
tuturor ariilor investigate, comparativ cu controlul de aceeași vârstă si sex, există diferențe
între zonele de cortex ale aceluiași specimen , atat cei transgenici cat si cei folosiți ca și
control . Cortexul cerebelos, care nu dezvoltă modificări de boala Alzheimer, prezintă un grad
de scădere a expresiei proteice accentuat fa ță de cortexul parietal. Nu se cunoa ște impactul
acestei modific ări deoarece exist ă puține studii la nivelul cerebelului asupra expresiei
proteinei precursoare a amiloidului.
Această scădere a expresiei de APP, preferențial în anumite zone, are potențial de
exploatare mare pentru ramura aplicativă a cercetării, mai ales din perspectiv ă terapeutic ă.
Tulbură rile cognitive nu beneficiază până la ora actuală de o terapie curativă ci doar de una
simptomatică, utilizată doar pentru încetinirea evoluției bolii. Rezultatele prezentate de mine
pun premisele identificării unui mecanism ce poate explica rolul și acțiunea fiziologic ă a APP
dar și modific ările patologice a că ii de generare a peptidului Aβ.
Alterarea structurală a barierei hematoencefalice este deja bine documentată în diverse
patologii nervoase centrale degenerative sau inflamatorii, endoteliul capilar fiind implicat în

60
transportul transe pitelial prin endocitoza mediată de receptor și endocitoza prin caveole. Peste
50 % din suprafa ța endoteliu lui capilar este alcăt uit din caveole, aceste animale trangenice se
caracterizează funcțional prin preluare și transcitoză deficitare. În plus, acești șoareci se
caracterizează prin nive l anormal de citokine proinflamatorii (TNFα, IL -6) și homeostazie
anormală a oxidului nitric care participă la realizarea unui model complex de alterare a
barierei hematoencefalice. Astfel nu se poate stabili cu exactitate importanta pierderii
caveolinei -1 la nivel cerebral în cadrul acestui lot de șoareci, deoarece exist ă o unitate
neurovascular ă ce nu poate fi divizat ă fiziopatologic iar rezultate le obținute în urma
experimentelor nu pot fi translatate intregral in vivo .
Studiul fosforil ării de la nivelul Thr-743/668 neuron specifice a APP este util deoarece
influen țează expresia proteinei prin activarea cliv ării enzimatice a proteinei. Astfel am pus în
eviden ță APP fosforilat dar și fragmente fosforilate care în condi țiile explicate mai sus se pare
că formeaz ă agregate cu greut ăți moleculare mari la care poate s ă participe caveolina -1 ca
proteina membranar ă din cadrul zonelor bogate în colesterol. SDS a fost exclus din protocolul
de electroforeză deoarece exist ă studii care sus țin că acesta induce dimeriza rea și homo –
oligomerizarea in vitro . Kinazele implicate în fosforilarea APP sunt variate și au fost detaliate
în partea generală a acestei lucr ări, o parte important ă interac ționeaz ă cu regiunea scaffold a
caveolinei -1, influențâ nd fosforilarea cu efecte asupra c ăii secretazelor.
Terapiile etiopatogenice sunt încă în curs de testare, dar în principal se încadrează în
trei direcții majore: imunizare anti -amiloid, inhibitori ai secretazelor din calea de metabolizare
și antiagregante amiloidice. Luarea în cal cul a caveolinei -1 ca țintă terapeutică trebuie să țină
cont de distribuția ubiquitară a acestei proteine și posibilele efecte adverse provocate de
supresia sau blocarea ei. Până în acest punct al lucr ării mele experimentele efectuate au dus la
sublinierea unei corela ții între caveolina -1 și proteina precursoare a amiloidului, la nivelul
cerebelului și lobului parietal. Astfel acest model murinic de studiu poa te fi folosit ca model
non-mutaț ional de studiu al bolii Alzheimer, pentru înțelegerea patologiei n eurodegenerative.
Însă teoria amiloidogenica de producere a bolii Alzheimer care pozi ționeaza celula nervoas ă
în centru și acumularea liniara a peptidului A β nu ofer ă o explica ție pentru observa țiile clinice
contradictorii printre care absen ța manifest ărilor de demen ță în BA sporadic ă în ciuda
existen ței depozitelor cu 10 -20 ani înainte de primele simptome. Strooper și Karran au
publicat un articol în 2016 în care critica teoria amiloidogenic ă și prin urmare, în ciuda
progreselor în cercetare, absen ța unui tratament etiopatogenetic eficace. Astfel, ace știa propun
un mecanism numit “cellular pha se theory ” cu bucle de feedback ș i feedforward între
astrocite, microglii și celulele endoteliale care duc în timp la incapacitatea de compensare a
modific ărilor neuro vasculare cu un proces ireversibil și continuu de neurodegenerare.

61

Concluzii și direcții viitoare

Rezultatele obținute prin experimentele efe ctuate în cadrul tezei de licență confirmă
ipotezele inițiale de lucru și anume existența unei corela ții direct e între caveolina -1 și proteina
precursoare a amiloidului. Mai mult, șoarecii knockout pentru caveolina -1 sunt un model non –
muta țional util pentru studiul bolilor neurodegenerative cum este boala Alzheimer.
În concluzie am demonstrat:
• Metode precum Wester n Blot și qRT -PCR ef ectuate pe lizat din creier de
șoarece au ară tat c ă expresia APP este influen țată de componen ta principala a
caveolelor, cav -1. Aceste rezultate confirm ă raportă rile anterioare ale echipei de
cercetare din cadrul laboratorului de biologie moleculara al Institutului de Patologie
Victor Babe ș.
• Modificarea expresiei APP este diferit ă în func ție de zona din cortex studiat ă,
am obț inut o sc ădere semnificativ ă statistic la nivelul cereb elui atunci câ nd am
comparat cu șoarecii control de aceea ți vârstă ș i sex. La nivelul lobului parietal
scăderea proteic ă este observat ă însă la analiza densitometric ă cu p având o valoare
peste 0 ,05. Deoarece APP es te o proteină cu rol imp ortant î n patogeneza bolii
Alzheimer, posibilita tea modulării expresiei prin acț iune la nivelul caveolinei -1
constituie o opțiune terapeutică interesantă.
• Am dezvoltat un protocol pentru eviden țierea formei fosforilate a proteinelor,
cu pa și simpli dar mod ificați a e lectroforezei clasice alături de un protocol de
electroforeză nativă pe ntru testarea asocierii fizice î ntre cele doua proteine studiate .
Astfel am identificat fragmente de APP fosforilate at ât în creierul șoarecilor control
bătrâni dar și K.O. pentru cav eolina -1, cre ând premisele pentru aprofundarea acestor
mecanisme pe c ăi de semnalizare.
• Studiul biologiei amiloidului poate beneficia de alte modele animale cu
proteine umane mutante a șa cum este cazul caveolinei -1, șoarecele cav-1 K.O. este
prim ul model non -mutaț ional de boala Alzheimer dezvoltat de c ătre laboratoarele
Jackson și studiat intesiv p ână acum pentru patologii cardiovasculare și respiratorii.
• Dezvoltarea bolii Alzheimer este complex ă cu un proces biologic de
neurodegenerare ce nu poat e fi explicat printr -un model liniar de acumulare a petidului
Aβ. Pocesul de neurodegenerare este multifactorial, iar studiul strict al teoriei

62
amiloidogenice și modific ările ce apar în cadrul unor tulpini animale nu pot fi
extrapolate c ătre situa țiile întâlnite în practica de zi cu zi.

Direcțiile viitoare de urmat, plecând de la rezultatele me le, se încadrează în trei
direcț ii principale:
1. Analiza separat ă a neuronilor, astrocitelor ș i celulelor endoteliale din
perspectiva expresiei proteice si al ARNm a APP -ului, caveolinei -1 și asocierii dintre
ele. Se cunoaște deja faptul că APP este exprimat la nivelul neuronilor și la nivelul
astrocitelor, dar sub formă de izoforme diferite. Caveolina -1 este descrisă la nivel
endotelial și există câteva studii de i munofluorescență care o descriu la nivel neuronal.
Aceste studii trebuie confirmate prin qPCR, și WB pe populații celulare izolate, fie în
linii celulare, fie în celule izolate prin sortare din țesut.
2. Evaluarea expresiei și activării celor trei enzime resp onsabile de clivarea APP
la șoarecii K.O. Această direcție oferă răspunsuri legate de mecanismul apariției
modificării de expresie proteică raportate de mine. Dacă această modificare este
rezultatul unei catabolizări cre scute, atunci se poate observa o act ivare enzimatică sau
o creștere a expresiei enzimelor implicate în ciclul catabolic al APP. În funcție de care
dintre enzime sunt activate, se pot face corelații mai departe cu patologia BA.
3. Analiza speciilor fosforilate și a kinazelor implicate în fosforila re care
interac ționeaza cu domeniul scaffold al caveolinei -1. În măsura în care se poate
preveni fosforilarea APP care să ducă la metabolizarea patologică a proteinei, noi
molecule mici terapeutice ar putea fi inhibiori de kinaze, deja testați pen tru alte
patologii.

Mechanisms of Ageing and Development 146 –148 (2015) 81 –87

Contents lists available at ScienceDirec t

Mechanisms of Ageing and Development

j o u r n a l h o m e p a g e : w w w . e l s e v i e r . c o m / l o c a t e / m e c h a g e d e v

Could caveolae be acting as warnings of mitochondrial ageing?

Laura Caravia a , Maria Dudau a , Mihaela Gherghiceanu b , Cristiana Tanase b
, Ana -Maria Enciu a,b,∗
a Department of Cellular, Molecular Biology and Histology, “Carol Davila” University of Medicine and Pharmacy, 8 Eroilor Sanita ri, 050474 Bucharest 5,
Romania
b “Victor Babes¸ ” National Institute of Pathology, 99 –101 Spl. Independentei, 050096 Bucharest 5 , Romania

a r t i c l e i n f o a b s t r a c t

Article history:
Received 18 February 2015
Received in revised form 9 April 2015
Accepted 28 April 2015
Available online 7 May 2015

Keywords:
Ageing
Cellular senescence
Oxidative stress
Mitohormesis
Caveolae
Caveolins
Ageing is a cellular process with many facets, some of which are currently undergoing a paradigm change. It is the
case of “mitochondrial theory of ageing”, which, interestingly, has been found lately t o cross paths with another
ageing dysfunctional process – intracellular signalling – in an unexpected point (or place) – caveolae. The latter
represent membrane microdomains altered in senescent cells, scaffolded by proteins modified (posttranslational or
as expression) with ageing. An important determinant of these alterations is oxidative stress, through increased
production of reactive oxygen species that originate at mitochondrial site. Spanning from physical contact points,
to shared structural protein s and similar function domains, caveolae and mitochondria might have more in
common than originally thought. By reviewing recent data on oxidative stress impact on caveolae and caveolins,
as well as possible interac -tions between caveolae and mitochondria, we propose a hypothesis for senescence –
related involvement of caveolins.
© 2015 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved.

Contents

1. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
2. Spatial and biochemical relationship s between caveolae and mitochondria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
3. Mitochondria as a source of oxidative stress and a central player in cellular senescence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
4. Relationship between oxidative stress and caveolae scaffolding proteins, caveolins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
4.1. Caveolin -1 as target of oxidative stress . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
4.2. Caveolin -1 as trigger of oxidative stress . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
4.3. Caveolins 2 and 3 are also involved in mitochondria -caveolae cooperation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
5. Caveolae involvement in stress -induced senescence – guardians of mitochondrial dysfunction? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
6. Conclusions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
Conflict of interest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
Acknowledgment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

Abbreviations: ERK, extracellular signal -regulated kinases; FAK, focal adhesion
kinase; Nrf2, nuclear erythroid 2 p45 -related factor -2; Shp -2, SH2 domain -containing
phosphatase -2; CSK, c -Src tyrosine kinase; HO -1, hemeoxigenase 1; HIF1, hypoxia
induced factor 1; SHP -2, Src homology 2 domai n-containing protein tyro -sine
phosphatase 2; PP2A, protein phosphatase 2A. ∗ Corresponding author at: Department of Cellular, Molecular Biology and Histol -ogy,
“Carol Davila” University of Medicine and Pharmacy, 8 Eroilor Sanitari, 050474
Bucharest 5, Romania. Tel.: +40 745 187787.
E-mail address: ana.enciu@umf.ro (A.-M. Enciu).

http://dx.doi.org/10.1016/j.mad.2015.04.00 3 0047 -6374/©
2015 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved.

1. Introduction

Cellular ageing is a process of many facets, some yet unknown,
others that are just being unravelled, while some are well -known, but
that are currently found under re -evaluation. Such a change of
paradigm emerges in “mitochondrial theory of ageing” ( Shokolenko et
al., 2014 ), one of the h allmarks of ageing. Other milestones in ageing
include changes in DNA repair and DNA damage response, shortening
of telomeres ( Cherif et al., 2003 ), changes in gene expression through
epigenetic and posttranslational mechanisms, loss of protein
homeostasis , desensitization to mitogens ( Park et al.,

82 L. Caravia et al. / Mechanisms of Ageing and Development 146 –148 (2015) 81 –87

Fig. 1. Transmission electron microscopy of vascular smooth muscle cell from a brain
arteriole (6 month -old CD -1mouse). Caveolae (*) establish contacts (arrow heads) with
mitochondria (M).

2000 ), altered nutrient signalling, stem cell pool depletion and pre –
mature cellular senescence ( Harries, 2014 ).
Two of these main axes – mitochondrial dysfunction and altered
intracellular communication – have been found lately to cross each
other in an unexpected point (or place) – caveolae. These mem -brane
microdomains with special biochemical composition own their
particular architecture to scaffolding proteins (caveolins – 1, -2 and 3
and their regulatory proteins, cavins 1 –4) (reviewed in ( Chidlow and
Sessa, 2010; Hansen and Nichols, 2010 )). More than just scaffolds,
caveolins bind to and inhibit signalling enzymes (heterotrimeric G
proteins ( Song et al., 1996 ), members of Ras superfamily, such as H –
Ras ( Song et al., 1996 ), RhoC ( Lin et al., 2005 ); members of Src
tyrosin kinases ( Li et al., 1996 ), eNOS signalling ( Bucci et al., 2000 )).
One exception from the rule “ca ve-olae = signalling suppressors” is
insulin signalling ( Karlsson et al., 2004 ), repeatedly reported to be
dependant of correct localization of insulin receptor and glucose
transporter 4 to caveolae ( Cohen et al., 2003; Fagerholm et al., 2009;
Sekimoto et al., 2012 ). On an interesting note, insulin resistance was
related quite recently, not only to caveolae biology alteration, but also
to mitochondrial dys -function ( Raza et al., 2015; Crescenzo et al.,
2014 ).
Independently, oxidative stress ( Toussaint et a l., 2000 ) and cav -1
overexpression ( Volonte et al., 2002 ) were both shown to induce
premature senescence in cell lines and were repeatedly reported to be
increased in aged animal models (reviewed in ( Liu and Xu, 2011; Zou
et al., 2011 )). More and more data relate cav -1 to oxidative stress and
because inside the cell, oxidative stress and mitochondria are
intimately related, in this review we shall attempt to outline connections
between two major ageing process determinants.

2. Spatial and biochemical relat ionships between caveolae
and mitochondria

Spatial relationship between mitochondria and caveolae has long
been highlighted by confocal microscopy ( Shiroto et al., 2014 ) and
electron microscopy, showing close apposition between the two
structures ( Fig. 1 ).
In terms of biochemical structure, mitochondria and caveo -lae
seem to share structural proteins, which could be explained by lateral
diffusion through physical contact points. For exam -ple, cav1
immunoblotting and immunogold electron microscopy

Fig. 2. Relationship between mitochondrial ageing and cav1 overexpression. Acti –
vation of cav1 gene expression by increased ROS production leads in turn to several
caveolin -related events leading to cellular senescence.

demonstrated its coloca lization with mitochondrial membranes in liver
and lung ( Li et al., 2001 ). Certain mitochondrial proteins were, in turn,
identified in purified caveolae through proteomic analysis ( McMahon et
al., 2006 ). According to Chatenay -Rivauday et al., ATP synthase beta
subunit was purified from endothe -lial caveolae ( Chatenay -Rivauday et
al., 2004 ) and more recently, Kim et al. reported many mitochondrial
oxidative phosphorylation complexes to be located in cell membrane
lipid rafts ( Kim et al., 2010 ).

Functional studies to investigate relationships between cav1
expression and oxidative stress were also performed, by either
knocking out the protein in cell cultures ( Pavlides et al., 2010 ) and
laboratory animals ( Shiroto et al., 2014 ) or overexpressing it in differe nt
experimental models ( Fridolfsson et al., 2012; Asterholm et al., 2012 ).
The outcome of these interventions varies, as indicated in Table 1 and
discussed in detail later on.
Cooperation between caveolin and mitochondria seems to be a
mechanism to enhanc e stress resistance and was proposed to be
coordinated by signalling through receptors coupled with trimeric G
inhibitory proteins ( Wang et al., 2014 ). Surpassing the mitohormetic
level of ROS production was reported to acti -vate cav1 promoter (
Bartholomew and Galbiati, 2010 ), leading to overexpressed proteins
levels. In turn, increased cav1 will trig -ger “warnings” related to cellular
senescence, as illustrated in Fig. 2

ROS – reactive oxygen species, Nrf2 – nuclear factor (erythroid –
derived 2) -like 2; sirt1 –sirtuin1; TrxR1 – thioredoxin reductase 1
In the following sections of the article, we shall attempt to elab –
orate on this diagram, providing some insights on mitochondrial ROS
production, ROS relationship with caveolae and caveolin1 and how this
relationship may lead to cellular senescence.

3. Mitochondria as a source of oxidative stress and a
central player in cellular senescence

Mitochondria are in the centre of “mitochondrial theory of age -ing”,
proposed by Harman ( Harman, 1972 ), according to which reactive
oxygen species (ROS) produced in these organelles are responsible
for oxidative stress and premature ageing. Soon afterwards, positive
correlation between ROS production and mito -chondrial DNA
mutagenesis were rep orted ( Wei et al., 1998 ), although there are
convincing reports that senescence induced by point mutations can
also be ROS independent ( Trifunovic et al., 2005 ). An impressive
amount of data accumulated on increased

L. Caravia et al. / Mechanisms of Ageing and Development 146 –148 (2015) 81 –87 83

Table 1
Dual relationship between caveolin -1 and oxidative stress.
Cav-1 alteration Effect Mechanism Refs

Cav-1 driven oxidative stress Phosphorylation at Tyr 14 Oxidant -induced vascular (Jo et al., 2014 )
hyper permeability
Cav1 knockdown Increase in mitochondrial ROS (Shiroto et al., 2014 )
production
Cell death when associated HIF-1 stabilization and the (Pavlides et al., 2010 )
with mitochondrial (complex I) upregulation of MCT4
and glycolysis inhibitors
Oxidative stress, when (Volonte and Galbiati, 2009a )
associated with mitochondrial
defect
Mitochondrial dysfunction in Nitric oxide (NO) (Martinez -Outschoorn et al.,
cancer associated fibroblasts over-production 2010a )
Increased superoxide release in Cav-1/STAT3/NF – B axis is (Yuan et al., 2011 )
the lung, liver, and kidney responsible for a dysregulated
cytokine response
Protects against Enhanced induction of HO -1 (Jin et al., 2008 )
hyperoxia -induced lung injury through a p38 MAPK -mediated
involving in part the pathway
modulation of the HO -1-cav-1
interaction
Both cav -1 and adiponectin Drastic increase of oxidative Cav-1 and adiponectin (Cai et al., 2014 )
knockout stress and resultant nitrative signaling cross talk
stress
Overexpression of cav1 Activation of p53 and Direct binding of Nrf2, a (Volonte et al., 2013 )
upregulation of p21Waf1/Cip1 transcription factor that
and induction of cellular mediates cytoprotective
senescence responses against stress,
limiting movement to the
nucleus
Binding Mdm2 and subsequent (Volonte and Galbiati, 2009b )
prevention of
Mdm2 -dependent degradation
of p53 inhibition of TrxR1
through direct interaction
Sequestration of PP2A -C into (Zou et al., 2011 )
caveolar membranes,
activation of ATM, followed by
phosphorylation and activation
of p53
Oxidative stress effect on cav -1 Activation of two GC -rich
promoter elements of
caveolin -1 gene promoter
Loss of expression of
membrane -bound scaffolding
protein, caveolin -1 (Cav -1), in
cancer -associated fibroblasts
Increase in total caveolin -1
protein levels
Tyrosine 14 phosphorylation
Inhibiton of caveolin -1
palmitoylation and trafficking
in endothelial cells
p38 MAPK -Sp1-dependent and ( Zou et al., 2011 ),
NF- B-dependent pathway (Bartholomew and Galbiati,
2010; Dasari et al., 2006 )
Autophagy oxidative stress (Martinez -Outschoorn et al.,
mediated induction of HIF1 – 2010a ),
and NF B -activation (Martinez -Outschoorn et al.,
2010b )
(Tian et al., 2010 )
c-Abl not c -Src dependant (Sanguinetti and Mastick,
2003 )
Fyn-dependant (Sanguinetti et al., 2003 )
(Parat et al., 2002 )

mitochondrial damage and decrease in respiratory metabolism during
ageing, in yeast ( Barros et al., 2010; Deryabina et al., 2014; Sousa
and Soares, 2014 ) and mammalians ( Edgar et al., 2009; Vermulst et
al., 2008; Esposito et al., 1999; Mansouri et al., 2006 ), including
human ( Ghosh et al., 2011; Daniele et al., 2014 ). Later on, it was
proposed that mitochondrial derived ROS could exert effects from
transiently cytoprotective to beneficial to organismal -level longevity,
named the “mitohormesis theory” ( Tapia, 2006 ). In general terms,
“hormesis” can be defined as a “biphasic or non -linear response to
potentially harmful substances” ( Ristow and Schmeisser, 2014 ),
substances that, although are (highly) toxic at elevated concentrations,
may exert a cytoprotective effect in low doses.

Mitochondrial ROS were proposed to mediate hormetic longevity
signals that activate conserved mitochondria -to-nucleus pathways,
which regulate ageing through epigenetic changes in
gene expression ( Schroeder et al., 2013 ). Other signalling events
seem to converge towards an anti -ageing mitohormetic mecha -nism,
such as insulin -signalling inhibition ( Zarse et al., 2012 ).
Life extension in Caenorhabditis elegans following hormetic
stressors treatment led to exciting new ideas on how to slow down
ageing and control the evolution of age -related human pathologies. In
nematodes, mitochondrial -related hormetic oxidative stress was
reported to rescue the sensory deficits in old animals ( Maglioni et al.,
2014 ). A desiderate regarding mitochondria involvement in
senescence is the preservation of oxidative potential without the
detrimental increase i n ROS production. Such effect was shown to be
induced by caloric restriction ( Martin -Montalvo and de Cabo, 2013 ), but
is also one of the aims of genetically engineered mito -chondria ( Tang,
2014 ). Whether mitochondria reprogramming (be it metabolic or
genet ic) will impact on caveolin biology, it is a ques -tion that remains to
be answered.

84 L. Caravia et al. / Mechanisms of Ageing and Development 146 –148 (2015) 81 –87

4. Relationship between oxidative stress and caveolae
scaffolding proteins, caveolins

In order to prevent deleterious effects, mammalian cells com -bat
oxidative stress and ROS overproduction through detoxifying
enzymes, such as superoxide dismutases and catalase, found either in
cytoplasm, or c onfined in specialized compartments, such as
mitochondria and peroxisomes. Recently, caveolae were reported to
be influenced as number, morphology and location by the oxida -tive
status of the cell. Volonte and Galbiati reported, for example, that the
numbe r of caveolae is dramatically increased in cells sub -jected to
oxidative stress ( Volonte and Galbiati, 2011 ). This finding was not
always correlated with reports on expression of caveolae scaffolding
proteins (caveolins and cavins). For example, in immor -talized mouse,
fibroblasts gene transcription of cav1 is increased under oxidative
stress ( Bartholomew and Galbiati, 2010 ), whereas in tumour
associated fibroblasts, cav1 was found downregulated ( Martinez –
Outschoorn et al., 2010a ). In turn, alterations of cav 1 levels were
reported to impact cellular ROS levels and mitochon -drial function.
Controversies still exists, though, as some of reported results are
contradictory, probably depending on cell type and experimental
procedures ( Table 1 ). Through the next sections, we shall detail on
some of these original results, regarding the dual relationship between
caveolins and oxidative stress.

4.1. Caveolin -1 as target of oxidative stress

Recent data indicated that cav -1, like (so many) other pro -teins, is
also prone to oxidative stress related modifications, in both expression
and activation status. Oxidative stress induces prema -ture senescence
and increases endogenous caveolin -1 expression in fibroblasts
(Volonte et al., 2002 ), cartil age ( Dai et al., 2006 ) and endothelial cells
(Powter et al., 2014 ). Some data also report associated increased
protein expression of PTRF/cavin -1 (Volonte and Galbiati, 2011 ), and
cavin -2 (Powter et al., 2014 ), caveolins -scaffolding proteins that are
also responsible for cav -1 cellular availability.

Bartholomew and collaborators identified an oxidant -responsive
cav-1 promoter sequence, proposing that “cav -1 appears to play a
major role in the signalling events linking oxida -tive stress to cellular
senescen ce” ( Bartholomew and Galbiati, 2010 ).

Exogenous oxidative stress up -regulated cav -1 protein expres -sion
via p38 -mediated SP1 activation of cav -1 promoter ( Dasari et al.,
2006 ), inducing premature senescence in normal cells. Pre-viously
demonstrated cav -1 functions in tumour migration and invasiveness
(Williams Lee and Cheung et al., 2015; Williams et al., 2005; Trimmer
et al., 2013; Tse et al., 2012 ) were recently demon -strated to be
associated with ROS overproduction ( Luanpitpon g et al., 2010 ).
Phosphorylation of cav -1 at tyr14 (found in a sequence specific only
for cav -1, out of all members of its family) was shown to be induced by
oxidative stress ( Chen et al., 2005 ).
The downstream effect of cav1 upregulation may vary according to
target cells, as there are notable differences between caveo -lae
density, caveolin isoform expression, raft/caveolar localisation of
signalling molecules and their targets between different adult tissues
(Harvey and Cala ghan, 2012 ). In the central nervous system, for
example, cav1 biology could impact on ageing -related cognitive
impairment, as it is expressed in hippocampal neurons, involved in
learning and memory ( Bu et al., 2003 ), but not in motor or asso -ciation
neuron s. Here, it was proposed as a positive regulator in SHP -2/ERK
signalling pathways in response to H2O2 ( Yun et al., 2011 ). Recently,
caveolae were also proposed as cell membrane redox centres –
specialized electron transfer zones usually associ -ated with li pid rafts.
Plasma membrane redox centres are known to play important
antioxidant and survival roles in cerebellar granular
neurons ( Samhan -Arias et al., 2012 ), mainly via NADH activity, with a
ratio between NADH: NADPH of nearly 10:1 ( Samhan -Arias et al. ,
2009 ). A NADH dependant enzyme – cytochrome b(5) reductase has
recently been shown to cluster within caveolins -rich membrane
microdomains, where it can form complexes with caveolins 1 , 1 and 2
(Samhan -Arias et al., 2012 ).

4.2. Caveolin -1 as trigger of oxidative stress

Recently, cav -1 was related to aggravated oxidative stress, mostly
by preventing protective mechanisms to occur. For exam -ple, a cav -1
interaction partner is thioredoxin reductase 1 (TrxR1)
– an important antioxidant enzyme that controls cellular redox
homeostasis. When cav1 is overexpressed, TrxR activity is inhibited
(Volonte and Galbiati, 2009b ).
Another important mediator of oxidative stress responses in the cell
is the nuclear erythroid 2 related factor -2 (Nrf2). In basal co nditions,
Nrf2 co -localizes with caveolin -1 in caveolar mem -branes in human
and mouse fibroblasts. After oxidative stress, caveolin -1 limits the
movement of Nrf2 from caveolar mem -branes to the nucleus, thus
linking free radicals to the activation of the p 53/senescence pathway
(Volonte et al., 2013 ). Interest -ingly, Nrf2 mediated transcriptional
control has been related to mitochondrial biogenesis ( Piantadosi et al.,
2008; Athale et al., 2012 )

4.3. Caveolins 2 and 3 are also involved in mitochondria -caveolae
cooperation

Given the increased amount of evidence of cav -1 involvement in
oxidative stress, other members of caveolin family were also
investigated in similar or related experimental conditions.
Human cav -1 and cav -3 share the most sequence homol -ogy
(85%), whereas cav -2 is only 58% similar to cav -1 (Razani et al.,
2002 ). Cav 2 has two phosphorylation sites in its Nter -minal domain
(Y19 and S23) ( Abel et al., 2012 ) and cav 3 was shown to be post –
translationally modified on its N ter minus, but by small ubiquitin -like
modifier (SUMO) proteins ( Fuhs and Insel, 2011 ).

Cav-3 is muscle specific and most data have been collected from
adult and neonates cardiomyocites. In cardiac muscle, caveolae and
subsarcolemmal mitochondria show close apposition in elec -tron
microscopy, with cav -3 and cytochrome c co -localizing along the
sarcolemmal membrane ( Fridolfsson et al., 2012 ). The authors
reported that after ischemic preconditionning, cav -3 seemed to be
transferred into mitochondrial matrix and mitochondrial inner
membrane ( Fridolfsson et al., 2012 ).
Functional studies regarding O3 -induced oxidative stress showed
increased levels of cav -3, but decreased cav1 levels in rat myocardium
(Sethi et al., 2012 ), possibly as a counterbalance mea -sure to wards
cell homeostasis.
As for cav2, it has been recently reported to be able of homo –
oligomerization in the absence of cav1, forming choles -terol
independent membrane microdomains. These microdomains seem to
be responsible for regulating activation of in sulin recep -tor signalling
(Kwon et al., 2013 ), effect also reported for cav1. In light of recent data
regarding cooperation between insulin sig -nalling and mitochondrial
function (reviewed in ( Cheng et al., 2010; Rieusset, 2015 )), caveolae
and caveolins c ould emerge as “fine -tuning” mechanisms of
mitochondria activity.

5. Caveolae involvement in stress -induced senescence –
guardians of mitochondrial dysfunction?

Stress -induced premature senescence is a forcefully induced
ageing process, driven by oncogen e activation, DNA damage and

L. Caravia et al. / Mechanisms of Ageing and Development 146 –148 (2015) 81 –87 85

various stressors ( Zou et al., 2011 ), as opposed to “replicative
senescence”, normally achieved by somatic cells through telom -eres
shortening. Caveolins have been studied in relationship with cellular
senescence for more than ten years, with caveolin -1 (cav -1) proposed
as prime candidate as determinant of the ageing process ( Cho and
Park, 2 005). Currently, cav1 is acknowledged as regulator of many
cellular processes such as growth, control of mitochon -drial antioxidant
levels, migration and senescence ( Baker and Tuan, 2013 ). The
observation that caveolae are altered in senescent cells is mor e than
one decade old and was associated with increased cellular level of
caveolins ( Wheaton et al., 2001 ). In vitro data con -firmed that
overexpression of cav -1 induced an early senescence in different cell
types ( Volonte et al., 2002; Dai et al., 2006; C ho et al., 2004 ). Different
tissues age differently in terms of cavolae and caveolins: cardiac
muscle maintains the same levels of total cav -1 and 3, but the levels of
cav-1 alpha and -3 are increased with ageing in the fractions of
membrane forming caveol ae (Ratajczak et al., 2003 ); aged smooth
muscle has decreased number of cave -olae, reduced levels of cav -2
and 3, but non -altered levels of cav -1 and cavin -1(Lowalekar et al.,
2012 ); aged endothelial cells have increased levels of total cav -1
(Yoon et al., 2010 ). There are also differences between ontogenetic
stages, as, for example, neona -tal myocardial cells do not replicate
sarcolemmal organization and caveolae physiology of adult cells
(Harvey and Calaghan, 2012 ).
The mechanism that connects caveolins and senescence was
recently indicated as activation of Mdm -p53-p21 axis ( Bartholomew et
al., 2009 ), as demonstrated on signalling alter -ation in normal/
forcefully induced ageing cells ( Favetta et al., 2004; Castro et al.,
2004 ). This mechanism is driven by ROS overproduc -tion at
mitochondrial site.
Conversely, absence of cav1 in cells experimentally pro -grammed
towards mitochondrial dysfunction and oxidative stress was correlated
with increased tumour activity in xenograft animal models ( Balliet et
al., 2011 ). Thus, caveolae could act as putative “sensors” of
mitochondrial activity, acting towards the induction of senescent
phenotype whenever required.

6. Conclusions

An overwhelming amount of data from fundamental research in
stress -induced senescence generated new and exciting progress in
areas thought to be well characterized and understood, such as
caveolin biology. Studies regarding oxidative stress effect on caveolae
and caveolins, corroborated with microscopy data show -ing contact
points between mitochondria and caveolae induced the idea of
cooperation between the two cell structures. The identification of
oxidative -stress response elements in the pro -moter of cav1, emerging
data showing that insulin signalling effect could be a balance between
caveolin -dependant activation and mitochondria -induced insulin
sensitivity, further promoted the idea of caveolae as “sensors”
evaluating mitochondrial activity sta -tus. As caveolins involvement in
the inducement of senescence is alre ady well documented, could this
inducement not be considered a signal of mitochondrial ageing?

Conflict of interest

There is no conflict of interests to declare.

Acknowledgment

The authors would like to thank Dr. Dragos¸ Cret¸ oiu for his tech –
nical assistance on image editing and Irina Radu certified translator in
Medicine – Pharmacy, certificate credentials: series E number 0048,
for professional linguistic assistance. This work was partially
supported by UMF Carol Davila “Young Researchers” Grant , con -tract
no. 28494/30.10.2012 and Sectorial Operational Programme Human
Resources Development (SOPHRD), financed by the Euro -pean Social
Fund and the Romanian Government under the contract number
POSDRU/159/1.5/S/141531.

References

Abel, B., Willoughb y, C., Jang, S., et al., 2012. N -terminal tyrosine phosphorylation of
caveolin -2 negates anti -proliferative effect of transforming growth factor beta in
endothelial cells. FEBS Lett. 586 (September (19)), 3317 –3323, http:/ /
dx.doi.org/10.1016/j.febslet.2012.07.00 8, S0014 -5793(12)00576 -5 [pii].
Asterholm, I.W., Mundy, D.I., Weng, J., et al., 2012. Altered mitochondrial function
and metabolic inflexibility associated with loss of caveolin -1. Cell Metab. 15
(February (2)), 171 –185, http://dx.doi. org/10.1016/j.cmet.2012.01.00 4, S1550 –
4131(12)00008 -3 [pii].
Athale, J., Ulrich, A., MacGarvey, N.C., et al., 2012. Nrf2 promotes alveolar
mitochondrial biogenesis and resolution of lung injury in Staphylococcus
aureus pneumonia in mice. Free Radical Biol . Med. 53 (October (8)), 1584 –
1594, http://dx.doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2012.08.00 9, S0891 –
5849(12)00498 -4 [pii].
Baker, N., Tuan, R.S., 2013. The less -often -traveled surface of stem ce lls: caveolin -1
and caveolae in stem cells, tissue repair and regeneration. Stem Cell Res. Ther. 4
(July (4)), 90, http://dx.doi.org/10.1186/scrt27 6, scrt276 [pii].
Balliet, R.M., Capparelli, C., Guido, C., et a l., 2011. Mitochondrial oxidative stress in
cancer -associated fibroblasts drives lactate production, promoting breast cancer
tumor growth: understanding the aging and cancer connection. Cell Cycle 10
(December (23)), 4065 –4073, 18254 [pii].
Barros, M.H., da Cunha, F.M., Oliveira, G.A., et al., 2010. Yeast as a model to study
mitochondrial mechanisms in ageing. Mech. Ageing. Dev. 131 (July –August (7 –
8)), 494 –502, http://dx.doi.org/10.1016/j.mad.2010.04.0 08, S0047 –
6374(10)00090 -4 [pii].
Bartholomew, J.N., Galbiati, F., 2010. Mapping of oxidative stress response elements
of the caveolin -1 promoter. Methods Mol. Biol. 594, 409 –423, http:/ /
dx.doi.org/10.1007/97 8-1-60761 -411- 1 29
Bartholomew, J.N., Volonte, D., Galbiati, F., 2009. Caveolin -1 regulates the
antagonistic pleiotropic properties of cellular senescence through a novel
Mdm2/p53 -mediated pathway. Cancer Res. 69 (April (7)), 2878 –2886, http:/ /
dx.doi.org/10.11 58/000 8- 5472.CA N-08- 2857, 0008 -5472.CAN -08-2857 [pii].
Bu, J., Bruckner, S.R., Sengoku, T., et al., 2003. Glutamate regulates caveolin
expression in rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Res. 72 (April (2)),
185–190, http://dx.doi.org/10.1002/jnr.1055 6
Bucci, M., Gratton, J.P., Rudic, R.D., et al., 2000. In vivo delivery of the caveolin -1
scaffolding domain inhibits nitric oxide synthesis and reduces inflammation. Nat.
Med. 6 (December (12)), 1362 –1367, http://dx.doi.org/10 .1038/8217 6
Cai, L., Yi, F., Dai, Z., et al., 2014. Loss of caveolin -1 and adiponectin induces severe
inflammatory lung injury following LPS challenge through excessive
oxidative/nitrative stress. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 306 (March (6)),
L566–L573, http://dx.doi.org/10.1152/ajplung.00182.201 3, ajplung.00182.2013
[pii].
Castro, M.E., del Valle Guijarro, M., Moneo, V., et al., 2004. Cellular senescence
induced by p53 -ras cooperation is independent of p21waf1 in murine embryo
fibroblasts. J. Cell. Biochem. 92 (June (3)), 514 –524, http://dx.doi.org/10.1002 /
jcb.2007 9
Chatenay -Rivauday, C., Cakar, Z.P., Jeno, P., et al., 2004. Caveolae:
biochemical analysis. Mol. Biol. Rep. 31 (June (2)), 67 –84.
Chen, D.B., Li, S.M., Qian, X.X., et al ., 2005. Tyrosine phosphorylation of caveolin 1 by
oxidative stress is reversible and dependent on the c -src tyrosine kinase but not
mitogen -activated protein kinase pathways in placental artery endothelial cells.
Biol. Reprod. 73 (October (4)), 761 –772, http://dx.doi.org/10.1095 /
biolreprod.105.04088 1, biolreprod.105.040881 [pii].
Cheng, Z., Tseng, Y., White, M.F., 2010. Insulin signaling me ets mitochondria in
metabolism. Trends Endocrinol. Metab. 21 (October (10)), 589 –598, http://dx .
doi.org/10.1016/j.tem.2010.06.00 5, S1043 -2760(10)00 099-8 [pii].
Cherif, H., Tarry, J.L., Ozanne, S.E., et al., 2003. Ageing and telomeres: a study into
organ – and gender -specific telomere shortening. Nucleic Acids Res. 31 (March
(5)), 1576 –1583.
Chidlow Jr, J.H., Sess a, W.C., 2010. Caveolae, caveolins, and cavins: complex control
of cellular signalling and inflammation. Cardiovasc. Res. 86 (May (2)), 219 –225,
http://dx.doi.org/10.1093/cvr/cvq07 5, cvq075 [pii].
Cho, K.A., Park, S.C., 2005. Caveolin -1 as a prime modulator of aging: a new
modality for phenotypic restoration? Mech. Ageing Dev. 126 (January (1)),
105–110, http://dx.doi.org/10.1016/j.mad.2004.09.02 9, S0047 –
6374(04)00231 -3 [pii].
Cho, K.A., Ryu, S.J., Oh, Y.S., et al., 2004. Morphological adjustment of senescent
cells by modulating caveolin -1 status. J. Biol. Chem. 279 (October (40)), 42270 –
42278, http://dx.doi.org/10.1074/jbc.M40235220 0, M402352200 [pii].
Cohen, A.W., Combs, T.P., Scherer, P.E., et al., 2003. Role of caveolin and caveolae
in insulin signaling and diabetes. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 285
(December (6)), E1151 –E1160, http://dx.doi.org/10.1152/ajpendo.00324.200 3,
285/6/E1151 [pii].
Crescenzo, R., Bianco, F., Mazzoli, A., et al., 2014. Mitochondrial efficiency and
insulin resistance. Front Physiol. 5, 512, http://dx.doi.org/10.3389/fphys.2014 .
0051 2

86 L. Caravia et al. / Mechanisms of Ageing and Development 146 –148 (2015) 81 –87

Dai, S.M., Shan, Z.Z., Nakamura, H., et al., 2006. Catabolic stress induces features of
chondrocyte senescence through overexpression of caveolin 1: possible
involvement of caveolin 1 -induced down -regulation of articular chondrocytes in the
pathogenesis of osteoarthritis. Arthritis Rheum. 54 (March (3)), 818 –831,
http://dx.doi.org/10.1002/art.2163 9
Daniele, G., Eldor, R., Merovci, A., et al., 2014. Chronic reduction of plasma free fatty
acid improves mitochondrial function and whole -body insulin sensitivity in obese
and type 2 diabetic individuals. Diabetes 63 (August (8)), 2812 –2820,
http://dx.doi.org/10.2337/db1 3- 1130, db13 -1130 [pii].
Dasari, A., Bartholomew, J.N., Volonte, D., et al., 2006. Oxidative stress induces
premature senescence by stimulating caveolin -1 gene transcription through p38
mitogen -activated protein kinase/Sp1 -mediated activatio n of two GC -rich promoter
elements. Cancer Res. 66 (November (22)), 10805 –10814, http://dx .
doi.org/10.1158/000 8- 5472.CA N-06- 1236, 14.66/22/10805 [pii].
Deryabina, Y., Isakova, E., Sekova, V., et al., 2014. Inhibition of free radical
scavenging enzymes a ffects mitochondrial membrane permeability transition
during growth and aging of yeast cells. J. Bioenerg. Biomembr., http://dx.doi .
org/10.1007/s10 863-014-9582 – 8
Edgar, D., Shabalina, I., Camara, Y., et al., 2009. Random point mutations with major
effects on protein -coding genes are the driving force behind premature aging in
mtDNA mutator mice. Cell Metab. 10 (August (2)), 131 –138, http://dx .
doi.org/10.1016/j.cmet.2009.06.01 0, S1550 -4131(09)00191 -0 [pii].
Esposito, L.A., Melov, S., Panov, A., et al., 1999. Mitochondrial disease in mouse
results in increased oxidative stress. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (April (9)),
4820 –4825.
Fagerholm, S., Ortegren, U., Karlsson, M. , et al., 2009. Rapid insulin -dependent
endocytosis of the insulin receptor by caveolae in primary adipocytes. PLoS
One 4 (6), e5985, http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.000598 5
Favetta, L.A., Ro bert, C., King, W.A., et al., 2004. Expression profiles of p53 and
p66shc during oxidative stress -induced senescence in fetal bovine fibroblasts.
Exp. Cell Res. 299 (September (1)), 36 –48, http://dx.d oi.org/10.1016/j.yexcr .
2004.05.00 9, S0014482704002897 [pii].
Fridolfsson, H.N., Kawaraguchi, Y., Ali, S.S., et al., 2012. Mitochondria -localized
caveolin in adaptation to cellular stress and injury. FASEB J. 26 (November 11),
4637 –4649, http://dx.doi.org/10.1096/fj.1 2- 21579 8, fj.12 -215798 [pii].
Fuhs, S.R., Insel, P.A., 2011. Caveolin -3 undergoes SUMOylation by the SUMO E3
ligase PIASy: sumoylation affects G -protein -coupled receptor desensitization. J.
Biol. Chem. 286 (April (17)), 14830 –14841, http://dx.doi.org/1 0.1074/jbc .
M110.21427 0, M110.214270 [pii].
Ghosh, S., Lertwattanarak, R., Lefort, N., et al., 2011. Reduction in reactive oxygen
species production by mitochondria from elderly subjects with normal and
impaired glucose tolerance. Diabetes 60 (August (8)), 2051 –2060, http://dx .
doi.org/10.2337/db1 1- 0121, db11 -0121 [pii].
Hansen, C.G., Nichols, B.J., 2010. Exploring the caves: cavins, caveolins and
caveolae. Trends in Cell Biol. 20 (April (4)), 177 –186, http://dx.doi.org/10.1016 /
j.tcb.2010.01.00 5, S0962 -8924(10)00016 -4 [pii].
Harman, D., 1972. The biologic c lock: the mitochondria? J. Am. Geriatr. Soc. 20
(April (4)), 145 –147.
Harries, L.W., 2014. MicroRNAs as mediators of the ageing process. Genes (Basel) 5
(3), 656 –670, http://dx.doi.org/10.3390/genes503065 6, genes5030656 [pii].
Harvey, R.D., Calaghan, S.C., 2012. Caveolae create local signalling domains through
their distinct protein content, lipid profile and morphology. J. Mol. Cell Cardiol. 52
(Febuary (2)), 366 –375, http://dx.doi.org/10.1016/j.yjmcc.2011.07.00 7, S0022 –
2828(11) 271 -9 [pii].
Jin, Y., Kim, H.P., Chi, M., et al., 2008. Deletion of caveolin -1 protects against oxidative
lung injury via up -regulation of heme oxygenase -1. Am. J. Respir. Cel l Mol. Biol. 39
(August (2)), 171 –179, http://dx.doi.org/10.1165/rcmb.200 7- 0323O C, 2007 –
0323OC [pii].
Jo, A., Park, H., Lee, S.H., et al., 2014. SHP -2 binds to caveolin -1 and regulates Src
activity via competitive inhibition of CSK in response to H2O2 in astrocytes.
PLoS One 9 (3), e91582, http://dx. doi.org/10.1371/journal.pone.009158 2,
PONE -D-13-40082 [pii].
Karlsson, M., Thorn, H., Danielsson, A., et al., 2004. Colocalization of insulin
receptor and insulin receptor substrate -1 to caveolae in primary human
adipocytes. Cholesterol depletion blocks i nsulin signalling for metabolic and
mitogenic control. Eur. J. Biochem. 271 (June (12)), 2471 –2479, http://dx.doi .
org/10.1111/j . 1432 – 1033.2004.04177. x, EJB4177 [pii].
Kim, B.W., Lee, C.S., Yi, J.S., et al., 2010. Lipid raft proteome reveals that oxidative
phosphorylation system is associated with the plasma membrane. Expert Rev.
Proteomics 7 (December (6)), 849 –866, http://d x.doi.org/10.1586/epr.10.8 7
Kwon, H., Lee, J., Jeong, K., et al., 2013. A novel actin cytoskeleton -dependent
noncaveolar microdomain composed of homo -oligomeric caveolin -2 for activation
of insulin signaling. Biochim. Biophys. Acta. 1833 (10), 2176 –2189,
http://dx.doi.org/10.1016/j.bbamcr.2013.05.00 3, S0167 -4889(13)00182 -1 [pii].
Li, S., Couet, J., Lisanti, M.P., 1996. Src tyrosine kinases, Galpha subunits, and H -Ras
share a common membrane -anchored scaffolding protein, caveolin. Caveolin
binding negatively regulates the auto -activation of Src tyrosine kinases. J. Biol.
Chem. 271 (November (46)), 29182 –29190.
Li, W.P., Liu, P., Pilcher, B.K., et al., 2001. Cell -specific targeting of caveolin -1 to
caveolae, secretory vesicles, cytoplasm or mitochondria. J. Cell Sci. 114 (April
(Pt 7)), 1397 –1408.
Lin, M., DiVito, M.M., Merajver, S.D., et al., 2005. Regulation of pancreatic cancer cell
migration and invasion by RhoC GTPase and caveolin -1. Mol. Cancer 4 (1),
http://dx.doi.org/10.1186/147 6-4598 -4- 21, 21.1476 -4598 -4-21 [pii].
Liu, D., Xu, Y., 2011. p53, oxidative stress, and aging. Antioxid. Redox Signaling 15
(September (6)), 1669 –1678, http://dx.doi.org/10.1089/ars.2010.364 4
Lowalekar, S.K., Cristofaro, V., Radisavljevic, Z.M., et al., 2012. Loss of bladder
smooth muscle caveolae in the aging bladder. Neurourol. Urodyn. 31 (April
(4)), 586 –592, http://dx.doi.org/10.1002/nau.2121 7
Luanpitpong, S., Talbott, S.J., Rojanasakul, Y., et al., 2010. Regulation of lung cancer
cell migration and invasion by reactive oxygen species and caveolin -1. J. Biol.
Chem. 285 (December (50)), 38832 –38840, http://dx.doi.org/10.1074/jbc .
M110.12495 8, M110.124958 [pii].
Maglioni, S., Schiavi, A., Runci, A., et al., 2014. Mitochondrial stress extends lifespan in
C. elegans through neuronal hormesis. Exp. Gerontol. 56 (August (89 –98)),
http://dx.doi.org/10.1016/j.exger.2014.03.02 6, S0531 -5565(14)00117 -X [pii].
Mansouri, A., Muller, F.L., Liu, Y., et al., 2006. Alterations in mitochondrial function,
hydrogen peroxide release and oxidative damage in mouse hind -limb skeletal
muscle during aging. Mech. Ageing Dev. 127 (3), 298 –306, http://dx.doi.org/10 .
1016/j.mad.2005.11.00 4, S0047 -6374(05)00301 -5 [pii].
Martin -Montalvo, A., de Cabo, R., 2013. Mitochondrial metabolic reprogramming
induced by calorie restriction. Antioxid. Redox Signaling 19 (July (3)), 310 –320,
http://dx.doi.org/10.1089/ars.2012.486 6
Martinez -Outschoorn, U.E., Balliet, R.M., Rivadeneira, D.B., et al., 2010a. Oxidative
stress in cancer associated fibroblasts drives tumor -stroma co -evolution: A new
paradigm for understanding tumor metabolism, the field effect and genomic
instability in cancer cells. Cell Cycle 9 (August (16)), 3256 –3276,
http://dx.doi.org/10.4161/cc.9.16.1255 3, 12553 [pii].
Martinez -Outschoorn, U.E., Trimmer, C., Li n, Z., et al., 2010b. Autophagy in cancer
associated fibroblasts promotes tumor cell survival: Role of hypoxia, HIF1
induction and NFkappaB activation in the tumor stromal microenvironment. Cell
Cycle 9 (September (17)), 3515 –3533, 12928 [pii].
McMahon, K .A., Zhu, M., Kwon, S.W., et al., 2006. Detergent -free caveolae
proteome suggests an interaction with ER and mitochondria. Proteomics 6
(January (1)), 143 –152, http://dx.doi.org/10.1002/pmic.20050020 8
Parat, M.O., Stachowicz, R.Z., Fox, P.L., 2002. Oxidative stress inhibits caveolin -1
palmitoylation and trafficking in endothelial cells. Biochem J. 361 (February (Pt 3)),
681–688.
Park, W.Y., Park, J.S., Cho, K.A., et al., 2000. Up -regulation of caveolin at tenuates
epidermal growth factor signaling in senescent cells. J. Biol. Chem. 275 (July (27)),
20847 –20852, http://dx.doi.org/10.1074/jbc.M90816219 9, M908162199 [pii].
Pavlides, S., Tsirigos, A., Vera, I., et al., 2010. Loss of stromal caveolin -1 leads to
oxidative stress, mimics hypoxia and drives inflammation in the tumor
microenvironment, conferring the reverse Warburg effect: a transcriptional
informatics analysis wi th validation. Cell Cycle 9 (June (11)), 2201 -19.2540 [pii].
Piantadosi, C.A., Carraway, M.S., Babiker, A., et al., 2008. Heme oxygenase -1
regulates c ardiac mitochondrial biogenesis via Nrf2 -mediated transcriptional
control of nuclear respiratory factor -1. Circ. Res. 103 (November (11)), 1232 –
1240, http://dx.doi.org/10.1161/01.RES.0000338597 .71702.a d,
01.RES.0000338597.71702.ad [pii].
Powter, E.E., Coleman, P.R., Tran, M.H., et al., 2014. Caveolae control the anti –
inflammatory phenotype of senescent endothelial cells. Aging Cell, http:/ /
dx.doi.org/10.1111/acel.1227 0
Ratajczak, P., Damy, T., Heymes, C., et al., 2003. Caveolin -1 and -3 dissociations
from caveolae to cytosol in the heart during aging and after myocardial
infarction in rat. Cardiovasc Res. 57 (Febuary (2)), 358 –369,
S0008636302006600 [pii].
Raza, H., John, A., Howarth, F.C., 2015. Increased oxidative stress and mitochondrial
dysfunction in zucker diabetic rat liver and brain. Cell Physiol. Biochem. 35 (3),
1241 –1251, http://dx.doi.org/10.1159/00037394 7, 000373947 [pii].
Razani, B., Woodman, S.E., Lisanti, M.P., 2002. Caveolae from cell biology to animal
physiology. Pharmacol. Rev. 54 (September (3)), 431 –467.
Rieusset, J., 2015. Contribution of mitochondria and endoplasmic reticulum
dysfunction in insulin resistance: Distinct or interrelated roles? Diabetes
Metab., http://dx.doi.org/10.1016/j.diabet.2015.02. 006, S1262 –
3636(15)00030 -0 [pii].
Ristow, M., Schmeisser, K., 2014. Mitohormesis promoting health and lifespan by
increased levels of reactive oxygen species (ROS). Dose Response 12 (May (2)),
288–341, http://dx.doi.org/10.2203/dos e- response.1 3- 035.Risto w, drp-12-288
[pii].
Samhan -Arias, A.K., Garcia -Bereguiain, M.A. , Martin -Romero, F.J., et al., 2009.
Clustering of plasma membrane -bound cytochrome b5 reductase within ‘lipid raft’
microdomains of the neuronal plasma membrane. Mol. Cell Neurosci. 40 (January
(1)), 14 –26, http://dx.doi.org/10.1016/j.mcn.2008.08.01 3, S1044 -7431(08)00240 –
6 [pii].
Samhan -Arias, A.K., Marques -da-Silva, D., Yanamala, N., et al., 2012. Stimulation and
clustering of cytochrome b5 reductase in caveolin -rich lipid microdomains is an
early eve nt in oxidative stress -mediated apoptosis of cerebellar granule neurons. J.
Proteomics. 75 (June (10)), 2934 –2949, http://dx.doi.org/10.1016/j .
jprot.2011.12.00 7, S1874 -3919(11) 688 -9 [pii].
Sanguinetti, A.R., Mastick, C.C., 2003. c -Abl is required for oxidative stress -induced
phosphorylation of caveolin -1 on tyrosine 14. Cell. Signalling 15 (3), 289 –298,
S0898656802000906 [pii].
Sanguinetti, A.R., Cao, H., Corley Mastick, C., 2003. Fyn is required for oxidative –
and hyperosmotic -stress -induced tyrosine phosphorylation of caveolin -1.
Biochem. J. 376 (November (Pt 1)), 159 –168, http://dx.doi.org/10.1 042/
BJ2003033 6, BJ20030336 [pii].
Schroeder, E.A., Raimundo, N., Shadel, G.S., 2013. Epigenetic silencing mediates
mitochondria stress -induced longevity. Cell Metab. 17 (June (6)), 954 –964,
http://dx.doi.org/10.1016/j.cmet.2013.04.00 3, S1550 -4131(13)00145 -9 [pii].

L. Caravia et al. / Mechanisms of Ageing and Development 146 –148 (2015) 81 –87 87

Sekimoto, J., Kabayama, K., Gohara, K., et al., 2012. Dissociation of the insulin
receptor from caveolae during TNFalpha -induced insulin resistance and its
recovery by D -PDMP. FEBS Lett. 586 (January (2)), 191 –195, http://dx.doi.org /
10.1016/j.febslet.2011.12.01 9, S0014 -5793(11)00891 -X. [pii].
Sethi, R., Manchanda, S., Perepu, R.S., et al., 2012. Differential expression of
caveolin -1 and cave olin-3: potential marker for cardiac toxicity subsequent to
chronic ozone inhalation. Mol. Cell Biochem. 369 (October (1 –2)), 9 –15, http:/ /
dx.doi.o rg/10.1007/s1101 0-012-1363 – 2
Shiroto, T., Romero, N., Sugiyama, T., et al., 2014. Caveolin -1 is a critical
determinant of autophagy, metabolic switching, and oxidative stress in
vascular endothelium. P LoS One 9 (2), e87871, http://dx.doi.org/10.1371 /
journal.pone.008787 1, PONE -D-13-47024 [pii].
Shokolenko, I.N., Wilson, G.L., WAlexeyev, M.F., 2014. Aging: mitochondrial DNA
perspective, critical analysis and an update. World J. Exp. Med. 4 (November
(4)), 46 –57.
Song, K.S., Li, S., Okamoto, T., et al., 1996. Co -purification and direct interaction of
Ras with caveolin, an integral membrane protein of caveolae microdomains.
Detergent -free purification of caveolae microdomains. J. Biol. Chem. 271 (April
(16)), 9690 –9697.
Sousa, C.A., Soares, E.V., 2014. Mitochondria are the main source and one of the
targets of Pb (lead) -induced oxidative st ress in the yeast Saccharomyces
cerevisiae. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98 (June (11)), 5153 –5160, http://dx .
doi.org/10.1007/s0025 3-014-5631 – 9
Tang, B.L., 2014. Synthetic mitochondria as therapeutics against systemic aging: a
hypothesis. Cell Biol. Int., http://dx.doi.org/10.1002/cbin.1036 2
Tapia, P.C., 2006. Sublethal mitochondrial stress with an attendant stoichiometric
augmentation of reactive oxygen species may precipitate many of the beneficial
alterations in cellular physiology produced by caloric restriction, intermittent
fasting, exercise an d dietary phytonutrients: mitohormesis for health and vitality.
Med. Hypotheses 66 (4), 832 –843, http://dx.doi.org/10 .
1016/j.mehy.2005.09.00 9, S0306-9877(05)00467 -6 [pii].
Tian, J., Hou, Y., Lu, Q., et al., 2010. A novel role for caveolin -1 in regulating
endothelial nitric oxide synthase activation in response to H2O2 and shear
stress. Free Radical Biol. Med. 49 (2), 159 –170, http://dx.doi.org/10.1016/j .
freeradbiomed.2010.03.02 3, S0891 -5849(10)00199 -1 [pii].
Toussaint, O., Medrano, E.E., von Zglinicki, T., 2000. Cellular and molecular
mechanisms of stress -induced premature senescence (SIPS) of human diploid
fibroblasts and melanocytes. Exp. Gerontol. 35 (8), 927 –945, http://dx.doi.org /
10.1016/S053 1- 5565(00)0018 0- 7
Trifunovic, A., Ha nsson, A., Wredenberg, A., et al., 2005. Somatic mtDNA mutations
cause aging phenotypes without affecting reactive oxygen species production.
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (50), 17993 –17998, http:// dx.doi.org/10.1073 /
pnas.050888610 2, 0508886102 [pii].
Trimmer, C., Bonuccelli, G., Katiyar, S., et al., 2013. Cav1 suppresses tumor growth
and metastasis in a murine model of cutaneous SCC through modul ation of
MAPK/AP -1 activation. Am. J. Pathol. 182 (March (3)), 992 –1004, http://dx.doi .
org/10.1016/j.ajpath.2012.11.00 8, S0002 -9440(12)00867 -X [pii].
Tse, E.Y., Ko, F.C., Tung, E.K., et al., 2012. Caveolin -1 overexpression is
associated with hepatocellular carcinoma tumourigenesis and metastasis. J.
Pathol. 226 (March (4)), 645 –653, http://dx.doi.org/10.1002/path.395 7
Vermulst, M., Wanagat, J., Kujoth, G.C., et al., 2008. DNA deletions and clonal
mutations drive premature aging in mitochondrial mutator mice. Nat. Genet. 40
(April (4)), 392 –394, http://dx.doi.org/10.1038/ng.9 5, ng.95 [pii].
Volonte, D., Galbiati, F., 2009a. Caveolin -1, cellular senescence and pulmonary
emphysema. Aging (Albany N. Y.) 1 (September (9)), 831 –835.
Volonte, D., Galbiati, F., 2009b. Inhibition of thioredoxin redu ctase 1 by caveolin 1
promotes stress -induced premature senescence. EMBO Rep. 10 (December
(12)), 1334 –1340, http://dx.doi.org/10.1038/embor.2009.21 5, embor2009215 [pii].
Volonte, D., Galbiati, F., 2011. Polymerase I and transcript release factor
(PTRF)/cavin -1 is a novel regulator of stress -induced premature senescence. J.
Biol. Chem. 286 (August (33)), 28657 –28661, http://dx.doi.org/10.1074/jbc .
C111.23511 9, C111.235119 [pii].
Volonte, D., Zhang, K., Lisanti, M.P., et al., 2002. Expression of caveolin -1 induces
premature cellular senescence in primary cultures of murine fibroblasts. Mol. Biol.
Cell 1 3 (July (7)), 2502 –2517, http://dx.doi.org/10.1091/mbc.0 1-11- 0529
Volonte, D., Liu, Z., Musille, P.M., et al., 2013. Inhibition of nuclear factor -erythro id 2-
related factor (Nrf2) by caveolin -1 promotes stress -induced premature
senescence. Mol. Biol. Cell 24 (June (12)), 1852 –1862, http://dx.doi.org/10 .
1091/mbc.E1 2-09- 0666, mbc.E12 -09-0666 [pii].
Wang, J., Schilling, J.M., Niesman, I.R., et al., 2014. Cardioprotective trafficking of
caveolin to mitochondria is Gi -protein dependent. Anesthesiology 121 ( September
(3)), 538 –548, http://dx.doi.org/10.1097/ALN.000000000000029 5
Wei, Y.H., Lu, C.Y., Lee, H.C., et al., 1998. Oxidative damage and mutation to
mitochondrial DNA and age -dependent decline of mitochondrial respiratory
function. Ann. N. Y. Acad. Sci. 854 (November 20), 155 –170.
Wheaton, K., Sampsel, K., Boisvert, F.M., et al., 2001. Loss of functional caveolae
during senescence of human fibroblasts. J. Cell Physiol. 187 (May (2)), 226 –
235, http://dx.doi.org/10.1002/jcp.107 1, 10.1002/jcp.1071 [pii].
Williams Lee, T.M.H., Cheung, M.W., et al., 2015. Combined loss of INK4a and
caveolin -1 synergistically enhances cell proliferation and oncogene -induced
tumorigenesis: role of INK4a/CAV -1 in mammary epithelial cell hyperplasia. J.
Biol. Chem. 279 (June (23)), 24745 –24756, http://dx.doi.org/10.1074/jbc .
M402 06420 0, M402064200 [pii].
Williams, T.M., Hassan, G.S., Li, J., et al., 2005. Caveolin -1 promotes tumor
progression in an autochthonous mouse model of prostate cancer: genetic ablation
of Cav -1 delays advanced prostate tumor development in tramp mice. J. Biol.
Chem. 280 (July (26)), 25134 –25145, http://dx.doi.org/10.1074/jbc . M50118620 0,
M501186200 [pii].
Yoon, H.J., Cho, S.W., Ahn, B.W., et al., 2010. Alterations in the activity and
expression of endothelial NO synthase in aged human endothelial cells. Mech.
Ageing Dev. 131 (February (2)), 119 –123, http://dx.doi.org/10.1016/j.mad .
2009.12.01 0, S0047 -6374(10)00005 -9 [pii].
Yuan, K., Huang, C., Fox, J., et al., 2011. Elevated inflammatory response in caveolin –
1-deficient mice with Pseudomonas aeruginosa infection is mediated by STAT3
protein and nuc lear factor kappaB (NF -kappaB). J. Biol. Chem. 286 (June (24)),
21814 –21825, http://dx.doi.org/10.1074/jbc.M111.23762 8, M111.237628 [pii].
Yun, J.H., Park, S.J., Jo, A., et al., 2011. Caveolin -1 is invol ved in reactive oxygen
species -induced SHP -2 activation in astrocytes. Exp. Mol. Med. 43 (December
(12)), 660 –668, http://dx.doi.org/10.3858/emm.2011.43.12.07 5,
emm.2010.43.075 [pii].
Zarse, K., Schme isser, S., Groth, M., et al., 2012. Impaired insulin/IGF1 signaling
extends life span by promoting mitochondrial L -proline catabolism to induce a
transient ROS signal. Cell Metab. 15 (April (4)), 451 –465, http://dx.doi.org/10 .
1016/j.cmet.2012.02.01 3, S1550 -4131(12)00094 -0 [pii].
Zou, H., Stoppani, E., Volonte, D., et al., 2011. Caveolin -1, cellular senescence and
age-related diseases. Mech. Ageing Dev. 132 (November –December (11 –12)),
533–542, http://dx.doi.org/10.1016/j.mad.2011.11.00 1, S0047 -6374(11)00167 -9
[pii].

Open Access
Austin Alzheimer’s and Parkinson’s Disease

Mini Review
Arguments for Caveolin -1 Knockout Mice as
an Alzheimer’s Disease Model

Dudau M1, Frumosu M1, Codrici E2, Tanase
C2,3 and Ana -Maria E1,2*
1”Carol Davila” University of Medicine and
Pharmacy, Romania
2”Victor Babeș” National Institute of Pathology, Romania
3Department of Medicine, “Titu Maiorescu”
University, Romania
*Corresponding author: Ana-Maria E, Carol Davila
“University of Medicine and Pharmacy, 8 E roilor
Sanitari, 050474 Bucharest 5, Romania
Received: March 18, 2016; Accepted: June 02,
2016; Published: June 04, 2016
Abstract
Neurodegenerative diseases, such as Alzheimer’s Disease, are now
acknowledged to be multifactorial pathologies, explaining the failure to come up with
specific targeted treatments. New pathogenic links should be addressed in order to
integrate the molecular interactions into a comprehensive mechanism. Caveolin -1 is
a scaffolding membrane protein of caveolae – membra ne microdomains involved in
cell signaling, senescence and cell growth. Increased caveolin -1 expression was
related to inducement of senescence and was also reported in the aged brain.
However, cav -1 KO mice express AD – like alterations in hippocampus and
neurologic abnormalities and incongruent reports in AD patients or AD models in
this review we present the involvement of caveolin -1 in aging, with emphasis on
aging brain and propose several mechanisms of interaction between caveolin -1 and
amyloid precurs or protein, the main pathogenic link of Alzheimer’s disease. Also, in
view of reports of synaptic plasticity deficits upon Cav -1 KO and its involvement in
post-injury reactive neuronal plasticity, we propose Cav -1 to be neuroprotective and
increased as a c ompensatory mechanism, rather than a direct measurement of
aging process.
Keywords: Amyloid precursor protein; Caveolin -1; Alzheimer’s disease;
Cav-1 knockout mouse; Aging brain

Introduction
“Neurodegeneration” is a term which can be translated into “loss of
neurons” accompanied by clinical features related to cognition and
affect. However, high variability in terms of histopathologic changes
found in patients with the same clinical diagnostic led to a thorough
investigati on of molecular causes. The limit between “normal” aging
and neurodegeneration was even more so difficult delineate from the
perspective of “cognition reserve” – the ability of some subjects to
counteract neuronal or synaptic loss by “using pre -existing co gnitive
processing approaches or by enlisting compensatory approaches” [1].
The most frequent causes of neurodegeneration are vascular dementia,
Alzheimer’s and Parkinson’s diseases, each with its own molecular
hallmarks. Alzheimer’s disease diagnostic cri teria include extraneuronal
amyloid plaques and intraneuronal hyperphosphorylated tau tangles, but
other molecular factors may contribute [2]. Parkinsons’s disease is
characterized by progressive loss of dopaminergic neurons, with yet
unknown, but apparent ly multifactorial molecular basis [3]. Vascular
dementia is also a multifactorial entity [4]. However, molecular research
results reported a considerable overlapping between these entities, with
two important consequences: 1) the need for a more accurate d iagnostic,
which led to search of new biomarkers; 2) new disease models emerged.
Animal models still hold an important role for mechanism elucidation,
as they allow assessment of apparently non -related effects of the
molecular defect imposed on the animal. Classical

neurodegeneration mouse models include, among others,
transgenic animals for mutated amyloid precursor protein, mutated
tau protein, mutated presenilin enzyme, injection of neurotoxins in
the corpus striatum, ligation of carotid arteries. Caveolin -1
is a membrane protein responsible for scaffolding a membrane
microdomain called “caveola” (pl. caveolae). Caveolae are
considered signaling nodes and caveolin -1 over expression was
related to cellular aging [5]. Caveolin -1 knockout mouse is a well
established model for endothelial dysfunction [6]. In this review we
will present this animal as a potential AD – like disease model, with
arguments related to stem cells, amyloid precursor protein and
metabolic and signaling particularities in neurons .
The concept of brain aging
“Brain aging” concept referred at the beginning to a
progressively deteriorating performance. Studies on aged animals [7]
from more than three decades ago reported neuronal loss with aging,
along with a decreased volume of gr ay matter. Later reports
challenged previous data, showing preserved neuronal number,
despite cortex thinning in human brain [8], and were soon followed
by confirming studies on animals [9 -12]. Modern imagistic methods,
from computer tomography analysis in the early 80’s [13] to MRI
and fluorodeoxigluocose PET analyses [14,15], demonstrated that
brain atrophy does occur with age, in healthy, non -demented elderly.
The modifications affect both grey and white matter, but the loss is
rather functional than cel lular, more like defective circuitry, rather
than neuronal loss. Cell preservation in aging was reported even in
areas susceptible to dementia, such as frontal and medial temporal
cortex, in which thinning is not always indicative of disease. Rather,
instead of neuronal loss, a 3D
neuronal network loosening would account for frontal and temporal
neocortical thinning [16]. A decrease in dendritic branching in animal
[17] and human prefrontal cortex [18 -20] supports this hypothesis.
Surprisingly, hippocampal neurons, related to

Austin Alzheimers J Parkinsons Dis – Volume 3 Issue 1 – 2016
Submit your Manuscript | www.austinpublishinggroup.com
Ana-Maria et al. © All rights are reserved

Citation: Dudau M, Frumosu M, Codrici E, Tanase C and Ana -Maria E. Arguments for Caveolin -1 Knockout
Mice as an Alzheimer’s Disease Model. Austin Alzheimers J Parkinsons Dis . 2016; 3(1): 1028.

Ana-Maria E Austin Publishing Group

neurogenesis and learning, do not alter their dendritic length, nor
reduce their spine density in aged humans [21] or rats [22]. MRI
data showed that white matter reduction is also constant in the aged
human brain, possibly as an indicator of a defective m yelination,
strongly correlated hypertension and stroke [23]. However, is still
under debate whether the presence of white matter lacunae yielded
is significantly related to cognitive impairment [24]. Aging is
characterized by a reduced neurogenesis, due t o altered neurotrophin
signaling,
Activation of senescence programmers within the niche,
imbalanced growth factor signaling. Although brain resides in a
protected environment, isolate by the blood -brain barrier, there are
evidence of blood -born aging factors to cross the blood brain barrier
to negatively influence the neurogenesis [25]. Brain aging is also a
“decrease in homeostatic reserve” [26] which affects, at different
rates, different cell types that share a homeostatic balance. Cellular
abilitie s to limit and buffer Reactive Oxygen Species (ROS), to
sustain a protective response to cytotoxic stimuli, or to limit vicious
circles such as inflammatory environments are diminished. DNA
damage (some ROS -related), mitochondrial aging and decreased
ATP r eserves [27] and affected cellular calcium removal systems
[28] add to neuronal vulnerability. Thus, understanding the aging
process of nervous tissue is a more challenging task due to a more
complex regulation, signaling and intercellular interactions [4] .
Caveolin -1 in aging brain
Caveolins 1, 2 and 3, the scaffolding proteins of caveolae, have been
related to cellular senescence for more than ten years [29], changes in
their expression were interpreted either as determinants, either as
effectors of the aging process. Main function of caveolin -1 has been as
proposed to be of signaling node, therefore cav -1, its family members
(caveolins 2 and 3) and associated proteins (cavins) would select which
signals are to be transmitted into cells. New data reveale d that cav -1 is
involved in the regulation of many cellular processes relevant to cell
biology such as growth, migration, control of mitochondrial antioxidant
levels and senescence [30]. Senescent cells express increased levels of
caveolins [31] and in vitro over expression of cav -1 induced an early
senescence in different cell types [32 -34]. Contradictory, cav -1 KO
animal models showed reduced lifespan [35], paradox that was
attributed to cav -1 function as tumor suppressor [36,37]. Cho et al.
proposed t he “Gate theory of aging”, when “gatekeeper molecules at the
membrane level would play the prime role in determining the senescent
phenotype”; caveolae and caveolins are suitable for this role due to their
regulation of cell signaling, calcium storage and quantization of cross –
talk between signaling cascades [29]. Plasma membrane composition
also changes with age, including the cholesterol composition. Such
changes could influence the expression and distribution of caveolins in
caveolae. Different tissues a ge differently in terms of caveolins
expression: cardiac muscle shows increased cav -1 in the fractions of
membrane forming caveolae [38], unlike smooth muscle, which does
not change levels of cav -1 and cavin -1 [39]; aged endothelial cells
increase their le vels of cav -1 [40]. Brain and nervous tissue have their
own particularities in term of aging and caveolin content. Aged mice
increase their cav -1 expression in the hippocampus, similar to cav -1
expression in hippocampal tissue in patients with Alzheimer’s disease
[41]. Cerebellum does not change expression of cav -1 with
age or pathology. Down regulation of hippocampal caveolin -1 was
related to reduce synaptic plasticity in aging and its increased expression
could be interpreted as a compensatory mechanis m [42]. Cav -1 is
expressed in neurons, mostly in pyramidal neurons of the frontal motor
cortex, but also in parietal cortices, CA1 layer, stratum oriens and
stratum radiatum of hippocampus [43]. The protein is also present in
glial cells, although no caveo lae have been identified in either cell type.
Over expressing cav -1 in neurons led to a decrease in primary neurite
outgrowth and branching, but an increase in neurite density [44]. In
glutamatergic neurons, cav -1 interacts with glutamate receptors.
Treatm ent with glutamate, kainate and AMPA increased the expression
of caveolin -1, suggesting that “activation of ionotropic receptors
regulates neuronal expression of caveolin” [45].
Caveolin -1 knockout mouse model
After identification of caveolin -1 as the prime component of
[46], a knockout mouse model was generated for the study of the
protein function in vivo . Surprisingly, cav -1KO mice were viable
but showed evidence of hyperproliferative and vascular
abnormaliti es, consistent with the wide distribution of caveolae in
endothelial cells throughout the body. First roles attributed to cav -1
were stabilization of caveolin -2 to caveolae, mediator for caveolar
endocytosis of specific ligands, negative regulator of cell
proliferation and eNOS activity inhibition in endothelial cells [47].
Although viable, aged cav -1-deficient mice display significantly
lower body weights and were resistant to diet – induced obesity, as
compared with wild -type controls mice, even on a high fat diet.
Serum profiles of these animals showed normal insulin, glucose, and
cholesterol levels, but severely elevated triglyceride and free fatty
acid levels, especially in the post -prandial state [6]. They have,
however drastically reduced insulin rece ptor protein levels (>90%),
without any changes in insulin receptor mRNA levels [48]. This
mouse model is also characterized by alterations in other signaling
pathways than nitric oxide and insulin, such as Extracellular -Signal
Regulated Kinase (ERK), calc ium signaling [45], modified balance
of pro -and anti – inflammatory cytokines [49]. Cav -1 KO mice have
reduced brain weight and develop a number of neurological
phenotypes, with motor and behavioral abnormalities, including
muscle weakness, clasping, reduce d activity, abnormal spinning and
gait abnormalities, without neuronal loss [50]. This finding could be
related to previously report synaptic loss, sharing the same
mechanisms at neuronal plate. Also, as a membrane protein, cav -1
loss could count for less myelinization, which is basically a glial cell
membrane enwrapping around the axons.
Cav-1 and neurogenesis
An interesting approach regarding cav -1 involvement in nervous
tissue homeostasis was reported starting from Neuronal Precursor
Cells (NPC) from d entate gyrus and subventricular zone. Cav -1 KO
mice showed increased number of newly formed neuroblasts than
wild type of matching age, while in vitro knockdown of Cav -1
promoted oligodendroglial differentiation of NPCs via β – catenin
expression [51]. In t urn, cav -1 promoted differentiation of NPCs
towards astroglial line [52]. Another cav -1 related way to modulate
NPC proliferation was recently reported by Samarasinghe et al. A
non-transcriptional glucocorticoid signaling pathway that operates
via lipid -raft associated glucocorticoid receptors requires cav -1 to

Submit your Manuscript | www.austinpublishinggroup.com Austin Alzheimers J Parkinsons Dis 3(1): id1028 (2016)
– Page

Ana-Maria E Austin Publishing Group

alter NPCs proliferative capacity [53]. Cav -1 mediated signaling via
GR could impact on development of NPCs by “regulating the
degradation of cell cycle regulators or migration of differentiated
cells derived from NPSCs to their final position in the cortex” [53].
Caveolin -1 in neurodegeneration and Alzheimer’s disease
Although most data reported until several years back associated
increased cav -1 with ageing, more and more results stated a
neuroprotective role of cav -1. Starting with the cav -1 KO phenotype, to
reports of synaptic plasticity deficits upon cav -1 KO [42] and
involvement in post -injury reactive neuronal plasticity [44], cav -1 seems
to be ne uroprotective. From this perspective, the increase of cav -1 in
brain of aged animals or brains of AD patients could be interpreted as a
compensatory mechanism and not a direct measurement of aging
process. Caveolin -1 and amyloid precursor protein – putativ e
mechanisms of cooperation APP is a transmembrane protein, which can
be metabolized in two ways: a physiologic one, generating soluble
neurotrophic fragments and a pathologic one, generating insoluble
amyloid beta peptides (Aβ) that aggregate in the extra cellular matrix,
forming senile plaques in the AD brain. Membrane regions of high
cholesterol content, such as caveolae, favor the pathologic pathway and
generation of Aβ. It has been demonstrated that APP localizes
preferentially in cholesterol rich – memb rane microdomains [43]. Cav -1
KO mouse model exhibits AD characteristics, such as elevated Aβ
deposition in the hippocampus, cerebrovascular changes and increased
astrogliosis, with early onset [54].
From literature data, several mechanisms can be put for th,
through which amyloid precursor protein expression or processing
can be modified by cav -1:
1- Cav-1 presents a Cav Scaffolding Domain (CSD), which can
interact with other membrane proteins, including APP, thus
facilitating its proteolysis [41].
2- APP is preferentially expressed in cholesterol –rich domains,
such as caveolae [43] and its amyloidogenic processing is favored
by hypercholesterolemia [55]. Disruption of caveolae by cav -1 KO
may redirect APP traffic towards lipid rafts (also cholesterol
enriched) leading to increased extracellular Aβ peptides deposition.
Furthermore, both enzymes involved in amyloidogenic processing
are located in lipid
rafts: β secretase compartmentalizes in non -caveolar lipid rafts
[56] and γ secretase in detergent -resistant membranes [57].
3- Over -expressed cav -1 in β -secretase expressing cells resulted in
decreased Aβ production, suggesting a protective role by cav -1 [54].
4- Caveolae and cav -1 act as signaling nodes, regulating activation
of various kinases. In tur n, APP has eight phosphorylation sites in the
Cterminal domain, potentially affected by the modification of cav -1
expression. Phospho -Thr668 is essential for its binding to Fe65 and its
nuclear translocation possibly followed by induction of glycogen
synth ase kinase 3β and tau phosphorylation [58].
5- Loss of cav -1 may alter phosphorylation of other proteins
involved in APP trafficking: Mint1/X11α is one of four neuronal
trafficking adaptors that interact with APP. Srcrelated tyrosine
phosphorylation of Mi nt1 regulates the destination of APP,
restricting its distribution to distal neurites [59].
Conclusion
Neurodegeneration is a multifactorial process, not necessarily
related to a pathological process. Conversely, pathological
alterations may be present, without any clinical signs. Although
there are numerous and well characterized animal models to study
the most frequent neurodegenerative diseases, other models may
unravel new pathogenic links. Caveolin -1 knockout mouse is
emerging as a novel, non -mutational model, which, due to is
endothelial dysfunctions, could be related to vascular dementia.
However, rec ent data regarding amyloid precursor protein
processing in these mice, may argue also in favor of Alzheimer
disease model, providing a multifactorial dementia model.
Acknowledgment
This work was supported by a grant of the Romanian National
Authority for Scientific Research and Innovation CNCS –
UEFISCDI, project number PN -II-RU-TE 2014 -4-1534.
References
1. Stern Y. Cognitive reserve in ageing and Alzheimer’s disease. Lancet
Neurol . 2012; 11: 1006 -1012 .

2. KA J. Alzheimer’s Disease: Current Clinical and Neuropathologic Diagnostic
Criteria. Austin Alzheimer’s and Parkinson disease. 2014; 1.

3. Robinson PA. Understanding the molecular basis of Parkinson’s disease ,
identification of biomarkers and routes to therapy. Expert Rev Proteomics .
2010; 7: 565 -578.

4. Enciu AM, Constantinescu SN, Popescu LM, MureÅŸanu DF, Popescu BO .
Neurobiol ogy of vascular dementia. J Aging Res. 2011; 2011: 401604 .

5. Caravia L, Dudau M, Gherghiceanu M, Tanase C, Enciu AM. Could
caveola e be acting as warnings of mitochondrial ageing? Mech Ageing Dev.
2015; 146 – 148: 81 -7.

6. Razani B, Combs TP, Wang XB, Frank PG, Park DS, Russell RG, et al .
Caveolin -1-deficient mice are lean, resistant to diet -induced obesity, an d
show hypertriglyceridemia with adipocyte abnormalities. The Journal o f
biological chemistry. 2002; 277: 8635 -8647 .

7. Sturrock RR. A quantitative lifespan study of changes in cell number, cel l
division and cell death in various regions of the mouse forebrain.
Neuropatho l Appl Neurobiol. 1979; 5: 433 -456.

8. Terry RD, DeTeresa R, Hansen LA. Neocortical cell counts in normal
huma n adult aging. Ann Ne urol. 1987; 21: 530 -539.

9. Vincent SL, Peters A, Tigges J. Effects of aging on the neurons within area
17 of rhesus monkey cerebral cortex. Anat Rec. 1989; 223: 329 -341.

10. Merrill DA, Roberts JA, Tuszynski MH. Conservation of neuron number an d
size in entorhinal cortex layers II, III, and V/VI of aged primates. J Com p
Neurol. 2000; 422: 396 -401.

11. Peters A, Leahu D, Moss MB, McNally KJ. The effects of aging on area 4 6
of the frontal cortex of the rhesus monkey. Cereb Cortex. 1994; 4: 621 -635.

12. Gazzaley AH, Thakker MM, Hof PR, Morrison JH. Preserved number o f
entorhinal cortex layer II neurons in aged macaque monkeys. Neurobio l
Aging. 1997; 18: 549 -553.

13. Soininen H, Puranen M, Riekkinen PJ. Computed tomography findings i n
senile dementia and normal aging. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 1982; 45 :
50-54.

14. Scahill RI, Frost C, Jenkins R, Whitwell JL, R ossor MN, Fox NC. A
longitudina l study of brain volume changes in normal aging using serial
registere d magnetic resonance imaging. Arc h Neurol. 2003; 60: 989 -994.

15. Mungas D, Harvey D, Reed BR, Jagust WJ, DeCarli C, Beckett L, et al .
Longitudinal volumetric MRI change and rate of cognitive decline.
Neurology . 2005; 65: 565 -571.

Ana-Maria E Austin Publishing Group

16. Freeman SH, Kandel R, Cruz L, Rozkalne A, Newell K, Frosch MP, et al .
Preservation of neuronal number despite age -related cortical brain atrophy i n
elderly subjects without Alzheimer disease. J Neuropathol Exp Neurol. 2008 ;
67: 1205 -1212 .

17. Grill JD, Riddle DR. Age -related and laminar -specific dendritic changes in
the medial frontal cortex of the rat. Brain Res. 2002; 937: 8 -21.

18. de Brabander JM, Kramers RJ, Uylings HB. Layer -specific dendriti c
regression of pyramidal cells with ageing in the human prefrontal cortex. Eu r
J Neurosci. 1998; 10: 1261 -1269 .

19. Uylings HB, de Braban der JM. Neuronal changes in normal human aging
and Alzheimer’s disease. Brain Cogn. 2002; 49: 268 -276.

20. Dickstein DL, Kabaso D, Roche r AB, Luebke JI, Wearne SL, Hof PR. Change s in
the structural complexity of the aged brain. Aging Cell. 2007; 6: 275 -284.

21. Burke SN, Barnes CA. Neural plasticity in the ageing brain. Nat Rev
Neurosci . 2006; 7: 30 -40.

22. Rapp PR, Gallagher M. Preserved neuron number in the hippocampus o f
aged rats with spatial learning deficits. Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93 :
9926 -9930 .

23. Kennedy KM, Raz N. Pattern of normal age -related regional differences i n
white matter microstructure is modifie d by vascular risk. Brain Res. 2009 ;
1297: 41 -56.

24. Kramer JH, Mungas D, Reed BR, Wetzel ME, Burnett MM, Miller BL, et al .
Longitudinal MRI and cognitive change in healthy elderly. Neuropsychology .
2007; 21: 412 -418.

25. Enciu AM. Stem cells in neurodegenerative diseases. Tanase C, Neagu M,
editors. In: Stem Cells between Regeneration and Tumorigenesis: Bentham
Publishing.

26. Toescu EC. Normal brain ageing: models and mechanisms. Philos Trans R
Soc Lond B Biol Sci. 2005; 360: 2347 -2354 .
27. Brunk UT, Terman A. The mitochondrial -lysosomal axis theory o f aging:
accumulation of damaged mitochondria as a result of imperfec t
autophagocytosis. Eur J Biochem. 2002; 269: 1996 -2002 .
28. Toescu EC, Verkhratsky A. Parameters of calcium homeostasis in norma l
neuronal ageing. J Anat. 2000; 197 Pt 4: 563 -569.

29. Cho KA, Park SC. Caveolin -1 as a prime modulator of aging: a new
modalit y for phenotypic re storation? Mech Ageing Dev. 2005; 126: 105 -110.

30. Baker N, Tuan RS. The less -often -traveled surface of stem cells: caveolin -1
and cave olae in stem cells, tissue repair and regeneration. Stem Cell Re s
Ther. 2013; 4: 90 .

31. Wheaton K, Sampsel K, Boisvert FM, Davy A, Robbins S, Riabowol K .
Loss of functional caveolae during senescence of human fibroblasts. J Cel l
Physiol. 2001; 187: 226 -235.

32. Volonte D, Zhang K, Lisanti MP, Galbiati F. Expression of caveolin -1 induce s
premature cellular senescence in primary cultures of murine fibroblasts .
Molecular biology of the cell. 2002; 13: 2502 -2517 .

33. Cho K A, Ryu SJ, Oh YS, Park JH, Lee JW, Kim HP, et al. Morphologica l
adjustment of senescent cells by modulating caveolin -1 status. J Biol Chem .
2004; 279: 42270 -42278 .

34. Dai SM, Shan ZZ, Nakamura H, Masuko -Hongo K, Kato T, Nishioka K, e t
al. Catabolic stress induces features of chondrocyte senescence throug h
overexpression of caveolin -1: possible involvement of caveolin 1 -induce d
down -regulation of articular chondrocytes in the pathogenesis of
osteoarthritis . Arthritis Rheum. 2006; 54: 818 -831.

35. Park DS, Cohen AW, Frank PG, Razani B, Lee H, Williams TM, et al .
Caveolin -1 null ( -/-) mice show dramatic reductions in life span.
Biochemistry . 2003; 42: 15124 -15131 .

36. Williams TM, Cheung MW, Park DS, Razani B, Cohen AW, Muller WJ, e t
al. Loss of caveolin -1 gene expre ssion accelerates the development o f
dysplastic mammary lesions in tumor -prone transgenic mice. Molecula r
biology of the cell. 2003; 14: 1027 -1042 .
37. Capozza F, Williams TM, Schubert W, McClain S, Bouzahzah B, Sotgia F ,
et al. Absence of caveolin -1 sensitizes mouse skin to carcinogen -induce d
epidermal hyperplasia and tumor formation. The American journal o f
pathology. 2003; 162: 2029 -2039 .

38. Ratajczak P, Damy T, Heymes C, Oliviéro P, Marotte F, Robidel E, et al .
Caveolin -1 and -3 dissociations from caveolae to cytosol in the heart durin g
aging and after myocardial infarction in rat. Cardiovasc Res. 2003; 57: 358 –
369.

39. Lowalekar SK, Cristofaro V, Radisavljevic ZM, Yalla SV, Sullivan MP. Los s
of bladder smooth muscle caveolae in the aging bladder. Neurourol Urod yn.
2012; 31: 586 -592.

40. Yoon HJ, Cho SW, Ahn BW, Yang SY. Alterations in the activity an d
expression of endothelial NO synthase in aged human endothelial cells .
Mech Ageing Dev. 2010; 131: 119 -123.

41. Gaudreault SB, Dea D, Poirier J. Increased caveolin -1 expression i n
Alzheimer’s disease brain. Neurobiol Aging. 2004; 25: 753 -759.

42. Liu Y, Liang Z, Liu J, Zou W, Li X, Wang Y, et al. Downregulation of caveolin -1
contributes to the synaptic plasticity deficit in the hippocampus of aged rats .
Neural Regen Res. 2013; 8: 2725 -2733 .

43. Kang MJ, Chung YH, Hwang CI, Murata M, Fujimoto T, Mook -Jung IH, e t
al. Caveolin -1 upregulation in senescent neurons alters amyloid precurso r
protein processing. Experimental & molecular medicine. 2006; 38: 126 -133.

44. Gaudreault SB, Blain JF, Gratton JP, Poirier J. A role for caveolin -1 in post –
injury reactive neuronal plasticity. Journal of neurochemistry. 2005; 92: 831 –
839.

45. Head BP, Insel PA. Do caveolins regulate cells by actions outside o f
caveolae? Trends Cell Biol. 2007; 17: 51 -57.

46. Rothberg KG, Heuser JE, Donzell WC, Ying YS, Glenney JR, Anderson
RG. Caveolin, a protei n component of caveolae membrane coats. Cell.
1992; 68 : 673-682.

47. Razani B, Engelman JA, Wang XB, Schubert W, Zhang XL, Marks CB, et
al. Caveolin -1 null mice are viable but show evidence of hyperproliferative
and vascular abnormalities. J Biol Chem. 2001; 276: 38121 -38138 .

48. Cohen AW, Razani B, Wang XB, Combs TP, Williams TM, Scherer PE, e t al.
Caveolin -1-deficient mice show insulin resistance and defective insuli n receptor
protein expression in adipose tissue. American journal of physiolog y
Cell physiology. 2003; 285: C222 -235.

49. Codrici EPID, Mihai S, Enciu AM, Albulescu R, Tanase C, Hinescu ME.
Cytokines, chemokines and growth factors profile in caveolin -1 transgenic
mice. 40th Congress of the Federation -of-European -Biochemical -Societies
(FEBS) – The Biochemical Basis of Life; Berlin, GERMANY: FEBS
JOURNAL. 2015; 186.

50. Trushina E, Du Charme J, Parisi J, McMurray CT. N eurological abnormalitie s in
caveolin -1 knock out mice. Behav Brain Res. 2006; 172: 24 -32.

51. Head BP, Peart JN, Panneerselvam M, Yokoy ama T, Pearn ML, Niesma n
IR, et al. Loss of caveolin -1 accelerates neurodegeneration and aging. PLo S
One. 2010; 5: e15697 .

52. Refolo LM, Malester B, LaFrancois J, Bryant -Thomas T, Wang R, Tint GS,
et al. Hypercholesterolemia accelerates the Alzheimer’s amyloid patholog y
in a transgenic mouse model. Neurobiol Dis. 2000; 7: 321 -331.

53. Dislich B, Lichtenthaler SF. The Membrane -Bound Aspartyl Protease
BACE1 : Molecular and Functional Properties in Alzheimer’s Disease and
Beyond . Front Physiol. 2012; 3: 8 .

54. Hur JY, Welander H, Behbahani H, Aoki M, Frånberg J, Winblad B, et al .
Active gamma -secretase is localized to detergent -resistant membranes i n
human brain. FEBS J. 2008; 275: 1174 -1187 .

55. Chang KA, Kim HS, Ha TY, Ha JW, Shin KY, Jeong YH, et al.
Phosphorylatio n of Amyloid Precursor Protein (APP) at Thr668 regulates
the nuclea r translocation of the APP intracellular domain and induces
neurodegeneration . Molecular and cellular biology. 2006; 26: 4327 -4338 .

56. Dunning CJ, Black HL, Andrews KL, Davenport EC, Conboy M, Chawla S, e t

Submit your Manuscript | www.austinpublishinggroup.com Austin Alzheimers J Parkinsons Dis 3(1): id1028 (2016) –
Page – 04

Ana-Maria E Austin Publishing Group

al. Multisite tyrosine phosphorylation of the N -terminus of Mint1/X11alpha b y
Src kinase regulates the trafficking of amyloid precursor protein. Journal o f
neurochemistry. 2016; 137: 518 -527.
57. Li Y, Luo J, Lau WM, Zheng G, Fu S, Wang TT, et al. Caveolin -1 pla ys a
crucial role in inhibiting neuronal differentiation of neural stem/progenitor
cells via VEGF signaling -dependent pathway. PloS one. 2011; 6: e22901.

58. Li Y, Lau WM, So KF, Tong Y, Shen J. Caveolin -1 promote astroglia l
differentiation of neural stem/progenitor cells through modulating Notch1 /
NICD and Hes1 expressions. Biochemical and biophysical researc h
communications. 2011; 407: 517 -524.
59. Samarasinghe RA, Di M aio R, Volonte D, Galbiati F, Lewis M, Romero G , et al.
Nongenomic glucocorticoid receptor action regulates gap junctio n intercellular
communication and neural progenitor cell proliferation . Proceedings of the
National Academy of Sciences. 2011; 108: 16657 -16662 .

75

Anexa 2. Participări la congrese cu prezentări orale și premii obținute

76
Anexa 3. Lista figurilor

Figura 1.1.- Progresia leziunilor neuronale și gliale în cadrul bolii Alzheimer (BA) ……………. 7
Figura 1.2. – Ipoteza cascadei amiloidului la nive lul sistemului nervos central ……………………. 9
Figura 1.3. – Structura proteinelor din familia APP ………………………….. ………………………….. . 14
Figura 1.4. – Căile de metabolizare a APP ………………………….. ………………………….. …………… 18
Figura 1.5. – Formarea homodimerilor APP prin cis -dimerizare și trans -dimerizare ………….. 22
Figura 1.6. – Structura caveolinei -1 ………………………….. ………………………….. …………………….. 27
Figura 1.7. – Oligomerizarea caveolinei -1 ………………………….. ………………………….. ……………. 28
Figura 1.8. – Principalele roluri ale caveolelor ………………………….. ………………………….. …….. 32
Figura 1.9. – Sistem de electroforeză pentru Western Blot ………………………….. ………………… 40
Figura 1.10. – Curbă standard de BSA ………………………….. ………………………….. ………………… 44
Figura 1.11. – Testarea expresiei cav -1 și APP în creierul șoarecilor C57Bl/6 ………………….. 45
Figura 1.12. – Testarea absenței cav -1 în creierul șoarecilor trangenici cav -1 -/- ……………….. 46
Figura 1.13. – Evaluarea expresiei APP în creierul șoarecilor transgenici cav -1 -/- …………….. 46
Figura 1.14. – Evaluarea expresiei APP în cer ebelul șoarecilor transgenici cav -1 -/- ………….. 47
Figura 1.15. – Evaluarea expresiei APP în lobul parietal al șoarecilor transgenici cav -1-/- …. 48
Figura 1.16. – Evaluarea expresiei APP în cerebel și lobul parietal în cortexul șoarecilor
transgenici cav-1 -/- și cont rol ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 48
Figura 1.17. – Evaluarea expresiei APP C-terminal în cerebel și a cav -1 în cerebel șoarecilor
transgenici cav-1 -/- și control ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 49
Figura 1.18. – Evaluarea expresiei formei fosforilate a APP în cerebelul șoarecilor control .. 50
Figura 1.19. – Evaluarea expresiei formei fosforilate a APP în cerebelul șoarecilor trangenici
pentru cav -1 -/- versus tulpina control ………………………….. ………………………….. …………………. 51
Figura 1.20. – Înregistrarea fluorescenței qRT -PCR pentru APP din cortexul șoarecilor cav -1 –
/- ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 52
Figura 1.21. – Curba de topire pentru qRT -PCR APP din cortexul șoarecilor cav -1 -/- ……….. 53
Figura 1.22. – Îmbătrânirea fiziologică vs. patologică ………………………….. ……………………….. 55

77
Anexa 4. Lista tabelelor

Tabel I – Funcțiile domeniului intracitoplasmatic și al formei solubile a APP …………………… 15
Tabel II – Obținerea gelurilor de acrilamidă pentru migrarea proteinelor ………………………….. 39
Tabel III – Obținerea gelului de încărca re a proteinelor pentru Western Blot ……………………. 39
Tabel IV – Gel electroforeză nativă ………………………….. ………………………….. ……………………. 41
Tabel V – Valori spectofotometrice ale curbei standard ………………………….. …………………….. 44
Tabel VI – Determinarea concentrațiilor proteice din lizatul de cerebel și parietal …………….. 45
Tabel VII – Citirea valorilor prag a fluorescenței pentru SYBR Green 490 ……………………….. 52

78

Anexa 5. Lista abrevierilor

Aβ – amiloid beta
ADN – acid dezoxiribonucleic
AICD – domeniul intracelular al
amiloidului
ApoE – apolipoptroteina E
APP – amyloid precursor protein (proteina
precursoare a amiloidului)
ARN – acid ribonucleic
BA – Boala Alzheimer
BACE – betasecretaza (β -site APP –
cleaving enzyme)
BDNF – factorul neurotrofic cerebral
BHE – bariera hematoencefalică
Cav -1 -/- – knockout de caveolină
Cav1 – caveolina 1
CTF – fragment carboxi -terminal
DO – densitate optică
EGF – factorul de creștere epidermală
eNOS – NO sintaza endotelială
GSK -3β – kinaza glicogen sintetazei 3 β
K.O. – knockout

LCR – lichid cefalorahidian
LTP – potențare de lungă durată
MAPK – fosfokinaze activate de mitogeni
miARN – microARN
NGF – factorul de creștere neuronală
NT – neurotrofină
PCR – polimerase chain reaction
PET – tomografie cu emisie de pozitroni
PKA – protein kinaza A
PKC – protein kinaza C
PS – presenilina
qPCR – PCR cantitativ
RT- PCR – revers transcripti e
TNF -α – factorul de necroză tumorală
SDS – sodiu dodecil sulfat
SNC – sistem nervos central
WB – western b lot

79

1-93
BIBLIOGRAFIE

1. Ahn JH, So SP, Kim NY, Kim HJ, Yoon SY, Kim DH. c -Jun N -terminal Kinase
(JNK) induces phosphorylation of amyloid precursor protein (APP) at Thr668, in okadaic
acid-induced neurodegeneration. BMB Rep. Jul 2016;49(7):376 -381.
2. Badaut J, Ajao DO, Sorensen D W, Fukuda AM, Pellerin L. Caveolin expression
changes in the neurovascular unit after juvenile traumatic brain injury: signs of blood -brain
barrier healing? Neuroscience. Jan 29 2015;285:215 -226.
3. Barage SH, Sonawane KD. Amyloid cascade hypothesis: Patho genesis and therapeutic
strategies in Alzheimer's disease. Neuropeptides. Aug 2015;52:1 -18.
4. Baumkotter F, Schmidt N, Vargas C, et al. Amyloid precursor protein dimerization
and synaptogenic function depend on copper binding to the growth factor -like dom ain. J
Neurosci. Aug 13 2014;34(33):11159 -11172.
5. Beel AJ, Sakakura M, Barrett PJ, Sanders CR. Direct binding of cholesterol to the
amyloid precursor protein: An important interaction in lipid -Alzheimer's disease
relationships? Biochim Biophys Acta. Aug 2010;1801(8):975 -982.
6. Benilova I, Karran E, De Strooper B. The toxic Abeta oligomer and Alzheimer's
disease: an emperor in need of clothes. Nat Neurosci. Jan 29 2012;15(3):349 -357.
7. Bento -Abreu A, Velasco A, Polo -Hernandez E, et al. Albumin endocytosi s via
megalin in astrocytes is caveola – and Dab -1 dependent and is required for the synthesis of the
neurotrophic factor oleic acid. J Neurochem. Oct 2009;111(1):49 -60.
8. Bhattacharyya R, Barren C, Kovacs DM. Palmitoylation of amyloid precursor protein
regulates amyloidogenic processing in lipid rafts. J Neurosci. Jul 03 2013;33(27):11169 –
11183.
9. Bignante EA, Heredia F, Morfini G, Lorenzo A. Amyloid beta precursor protein as a
molecular target for amyloid beta –induced neuronal degeneration in Alzheimer' s disease.
Neurobiol Aging. Nov 2013;34(11):2525 -2537.
10. Blennow K, Hampel H, Weiner M, Zetterberg H. Cerebrospinal fluid and plasma
biomarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. Mar 2010;6(3):131 -144.
11. Caravia L, Dudau M, Gherghiceanu M, Tanase C, Enciu AM. Could caveolae be
acting as warnings of mitochondrial ageing? Mech Ageing Dev. Mar 2015;146 -148:81 -87.

80
12. Chang KA, Kim HS, Ha TY, et al. Phosphorylation of amyloid precursor protein
(APP) at Thr668 regulates the nuclear translocation of the AP P intracellular domain and
induces neurodegeneration. Mol Cell Biol. Jun 2006;26(11):4327 -4338.
13. Chen Y, Tang BL. The amyloid precursor protein and postnatal
neurogenesis/neuroregeneration. Biochem Biophys Res Commun. Mar 03 2006;341(1):1 -5.
14. Cho KA, Park SC. Caveolin -1 as a prime modulator of aging: a new modality for
phenotypic restoration? Mech Ageing Dev. Jan 2005;126(1):105 -110.
15. Cho KA, Ryu SJ, Oh YS, et al. Morphological adjustment of senescent cells by
modulating caveolin -1 status. J Biol Chem. Oct 01 2004;279(40):42270 -42278.
16. Cho KA, Ryu SJ, Park JS, et al. Senescent phenotype can be reversed by reduction of
caveolin status. J Biol Chem. Jul 25 2003;278(30):27789 -27795.
17. Collingridge GL, Peineau S, Howland JG, Wang YT. Long -term depression in the
CNS. Nat Rev Neurosci. Jul 2010;11(7):459 -473.
18. Couet J, Li S, Okamoto T, Ikezu T, Lisanti MP. Identification of peptide and protein
ligands for the caveolin -scaffolding domain. Implications for the interaction of caveolin with
caveolae-associated proteins. J Biol Chem. Mar 07 1997;272(10):6525 -6533.
19. De Strooper B, Annaert W. Proteolytic processing and cell biological functions of the
amyloid precursor protein. J Cell Sci. Jun 2000;113 ( Pt 11):1857 -1870.
20. Eggert S, Midthune B , Cottrell B, Koo EH. Induced dimerization of the amyloid
precursor protein leads to decreased amyloid -beta protein production. J Biol Chem. Oct 16
2009;284(42):28943 -28952.
21. Ehehalt R, Keller P, Haass C, Thiele C, Simons K. Amyloidogenic processing of the
Alzheimer beta -amyloid precursor protein depends on lipid rafts. J Cell Biol. Jan 06
2003;160(1):113 -123.
22. Engelman JA, Chu C, Lin A, et al. Caveolin -mediated regulation of signaling along
the p42/44 MAP kinase cascade in vivo . A role for the caveol in-scaffolding domain. FEBS
Lett. May 29 1998;428(3):205 -211.
23. Engelman JA, Zhang X, Galbiati F, et al. Molecular genetics of the caveolin gene
family: implications for human cancers, diabetes, Alzheimer disease, and muscular dystrophy.
Am J Hum Genet. Dec 1998;63(6):1578 -1587.
24. Evin G, Zhu A, Holsinger RM, Masters CL, Li QX. Proteolytic processing of the
Alzheimer's disease amyloid precursor protein in brain and platelets. J Neurosci Res. Nov 01
2003;74(3):386 -392.

81
25. Fabian C, Naaldijk Y, Leovsky C , et al. Distribution pattern following systemic
mesenchymal stem cell injection depends on the age of the recipient and neuronal health.
Stem Cell Res Ther. Apr 18 2017;8(1):85.
26. Frank PG, Pavlides S, Cheung MW, Daumer K, Lisanti MP. Role of caveolin -1 in the
regulation of lipoprotein metabolism. Am J Physiol Cell Physiol. Jul 2008;295(1):C242 -248.
27. Fridolfsson HN, Roth DM, Insel PA, Patel HH. Regulation of intracellular signaling
and function by caveolin. FASEB J. Sep 2014;28(9):3823 -3831.
28. Gaudr eault SB, Blain JF, Gratton JP, Poirier J. A role for caveolin -1 in post -injury
reactive neuronal plasticity. J Neurochem. Feb 2005;92(4):831 -839.
29. Gaudreault SB, Dea D, Poirier J. Increased caveolin -1 expression in Alzheimer's
disease brain. Neurobiol Aging. Jul 2004;25(6):753 -759.
30. Goetz JG, Lajoie P, Wiseman SM, Nabi IR. Caveolin -1 in tumor progression: the
good, the bad and the ugly. Cancer Metastasis Rev. Dec 2008;27(4):715 -735.
31. Gralle M, Ferreira ST. Structure and functions of the human amyloid precursor
protein: the whole is more than the sum of its parts. Prog Neurobiol. May 2007;82(1):11 -32.
32. Haass C, Kaether C, Thinakaran G, Sisodia S. Trafficking and proteolytic processing
of APP. Cold Spring Harb Perspect Med. May 2012;2(5) :a006270.
33. Hansen CG, Nichols BJ. Exploring the caves: cavins, caveolins and caveolae. Trends
Cell Biol. Apr 2010;20(4):177 -186.
34. Hartmann T, Prinetti A. Going the wrong road: Fyn and targeting of amyloid precursor
protein to lipid rafts. J Neurochem . Sep 2011;118(5):677 -679.
35. Harvey RD, Calaghan SC. Caveolae create local signalling domains through their
distinct protein content, lipid profile and morphology. J Mol Cell Cardiol. Feb
2012;52(2):366 -375.
36. Head BP, Insel PA. Do caveolins regulate cells by actions outside of caveolae? Trends
Cell Biol. Feb 2007;17(2):51 -57.
37. Head BP, Patel HH, Insel PA. Interaction of membrane/lipid rafts with the
cytoskeleton: impact on signaling and function: membrane/li pid rafts, mediators of
cytoskeletal arrangement and cell signaling. Biochim Biophys Acta. Feb 2014;1838(2):532 –
545.
38. Head BP, Peart JN, Panneerselvam M, et al. Loss of caveolin -1 accelerates
neurodegeneration and aging. PLoS One. Dec 23 2010;5(12):e156 97.
39. Hehlgans S, Cordes N. Caveolin -1: an essential modulator of cancer cell radio -and
chemoresistance. Am J Cancer Res. 2011;1(4):521 -530.

82
40. Heidari A, Behmanesh M, Sahraian MA, et al. The human caveolin 1 gene upstream
purine complex and neurodegene ration –a common signature. J Neuroimmunol. Jul
2011;236(1 -2):106 -110.
41. Herrup K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat Neurosci. Jun
2015;18(6):794 -799.
42. Ikezu T, Trapp BD, Song KS, Schlegel A, Lisanti MP, Okamoto T. Caveolae, p lasma
membrane microdomains for alpha -secretase -mediated processing of the amyloid precursor
protein. J Biol Chem. Apr 24 1998;273(17):10485 -10495.
43. Isbert S, Wagner K, Eggert S, et al. APP dimer formation is initiated in the
endoplasmic reticulum and d iffers between APP isoforms. Cell Mol Life Sci. Apr
2012;69(8):1353 -1375.
44. Kang MJ, Chung YH, Hwang CI, et al. Caveolin -1 upregulation in senescent neurons
alters amyloid precursor protein processing. Exp Mol Med. Apr 30 2006;38(2):126 -133.
45. Kapoor A , Hsu WM, Wang BJ, et al. Caveolin -1 regulates gamma -secretase -mediated
AbetaPP processing by modulating spatial distribution of gamma -secretase in membrane. J
Alzheimers Dis. 2010;22(2):423 -442.
46. Khalifa NB, Van Hees J, Tasiaux B, et al. What is the ro le of amyloid precursor
protein dimerization? Cell Adh Migr. Apr-Jun 2010;4(2):268 -272.
47. Kogel D, Deller T, Behl C. Roles of amyloid precursor protein family members in
neuroprotection, stress signaling and aging. Exp Brain Res. Apr 2012;217(3 -4):471 -479.
48. Kovtun O, Tillu VA, Ariotti N, Parton RG, Collins BM. Cavin family proteins and the
assembly of caveolae. J Cell Sci. Apr 01 2015;128(7):1269 -1278.
49. Landis DM, Reese TS. Membrane structure in mammalian astrocytes: a review of
freeze -fracture stud ies on adult, developing, reactive and cultured astrocytes. J Exp Biol. Dec
1981;95:35 -48.
50. Li QX, Fuller SJ, Beyreuther K, Masters CL. The amyloid precursor protein of
Alzheimer disease in human brain and blood. J Leukoc Biol. Oct 1999;66(4):567 -574.
51. Lisanti MP, Scherer PE, Tang Z, Sargiacomo M. Caveolae, caveolin and caveolin -rich
membrane domains: a signalling hypothesis. Trends Cell Biol. Jul 1994;4(7):231 -235.
52. Lisanti MP, Scherer PE, Vidugiriene J, et al. Characterization of caveolin -rich
membrane domains isolated from an endothelial -rich source: implications for human disease.
J Cell Biol. Jul 1994;126(1):111 -126.
53. Lisanti MP, Tang ZL, Sargiacomo M. Caveolin forms a hetero -oligomeric protein
complex that interacts with an apical GPI -linke d protein: implications for the biogenesis of
caveolae. J Cell Biol. Nov 1993;123(3):595 -604.

83
54. Liu P, Rudick M, Anderson RG. Multiple functions of caveolin -1. J Biol Chem. Nov
01 2002;277(44):41295 -41298.
55. MacLeod R, Hillert EK, Cameron RT, Baillie G S. The role and therapeutic targeting
of alpha -, beta – and gamma -secretase in Alzheimer's disease. Future Sci OA. Nov
2015;1(3):FSO11.
56. Marksteiner J, Humpel C. Beta -amyloid expression, release and extracellular
deposition in aged rat brain slices. Mol Psychiatry. Oct 2008;13(10):939 -952.
57. Marquer C, Devauges V, Cossec JC, et al. Local cholesterol increase triggers amyloid
precursor protein -Bace1 clustering in lipid rafts and rapid endocytosis. FASEB J. Apr
2011;25(4):1295 -1305.
58. Masters CL, Bateman R, Blennow K, Rowe CC, Sperling RA, Cummings JL.
Alzheimer's disease. Nat Rev Dis Primers. Oct 15 2015;1:15056.
59. Mercier I, Jasmin JF, Pavlides S, et al. Clinical and translational implications of the
caveolin gene family: lessons from mouse models and human genetic disorders. Lab Invest.
Jun 2009;89(6):614 -623.
60. Nishiyama K, Trapp BD, Ikezu T, et al. Caveolin -3 upregulation activates beta –
secretase -mediated cleavage of the amyloid precursor protein in Alzheimer's disease. J
Neurosci. Aug 01 1999;19(15):6538 -6548.
61. Okamoto T, Schlegel A, Scherer PE, Lisanti MP. Caveolins, a family of scaffolding
proteins for org anizing "preassembled signaling complexes" at the plasma membrane. J Biol
Chem. Mar 06 1998;273(10):5419 -5422.
62. Parton RG, del Pozo MA. Caveolae as plasma membrane sensors, protectors and
organizers. Nat Rev Mol Cell Biol. Feb 2013;14(2):98 -112.
63. Parton RG, Simons K. The multiple faces of caveolae. Nat Rev Mol Cell Biol. Mar
2007;8(3):185 -194.
64. Quest AF, Gutierrez -Pajares JL, Torres VA. Caveolin -1: an ambiguous partner in cell
signalling and cancer. J Cell Mol Med. Aug 2008;12(4):1130 -1150.
65. Quest AF, Lobos -Gonzalez L, Nunez S, et al. The caveolin -1 connection to cell death
and survival. Curr Mol Med. Feb 2013;13(2):266 -281.
66. Razani B, Lisanti MP. Caveolin -deficient mice: insights into caveolar function human
disease. J Clin Invest. Dec 2001;1 08(11):1553 -1561.
67. Razani B, Lisanti MP. Caveolins and caveolae: molecular and functional relationships.
Exp Cell Res. Nov 15 2001;271(1):36 -44.
68. Razani B, Schlegel A, Liu J, Lisanti MP. Caveolin -1, a putative tumour suppressor
gene. Biochem Soc Tran s. Aug 2001;29(Pt 4):494 -499.

84
69. Reinhard C, Hebert SS, De Strooper B. The amyloid -beta precursor protein:
integrating structure with biological function. EMBO J. Dec 07 2005;24(23):3996 -4006.
70. Scheuermann S, Hambsch B, Hesse L, et al. Homodimerization of amyloid precursor
protein and its implication in the amyloidogenic pathway of Alzheimer's disease. J Biol
Chem. Sep 07 2001;276(36):33923 -33929.
71. Schilling JM, Patel HH. Non -canonical roles for caveolin in regulation of membrane
repair and mitochond ria: implications for stress adaptation with age. J Physiol. Aug 15
2016;594(16):4581 -4589.
72. Schlegel A, Volonte D, Engelman JA, et al. Crowded little caves: structure and
function of caveolae. Cell Signal. Jul 1998;10(7):457 -463.
73. Sebastiao AM, Coli no-Oliveira M, Assaife -Lopes N, Dias RB, Ribeiro JA. Lipid rafts,
synaptic transmission and plasticity: impact in age -related neurodegenerative diseases.
Neuropharmacology. Jan 2013;64:97 -107.
74. Stary CM, Tsutsumi YM, Patel PM, Head BP, Patel HH, Roth DM . Caveolins:
targeting pro -survival signaling in the heart and brain. Front Physiol. 2012;3:393.
75. Stern Y. Cognitive reserve in ageing and Alzheimer's disease. Lancet Neurol. Nov
2012;11(11):1006 -1012.
76. Suzuki T, Nakaya T. Regulation of amyloid beta -protein precursor by phosphorylation
and protein interactions. J Biol Chem. Oct 31 2008;283(44):29633 -29637.
77. Tacutu R, Budovsky A, Yanai H, Fraifeld VE. Molecular links between cellular
senescence, longevity and age -related diseases – a systems biology perspective. Aging (Albany
NY). Dec 2011;3(12):1178 -1191.
78. Thinakaran G, Koo EH. Amyloid precursor protein trafficking, processing, and
function. J Biol Chem. Oct 31 2008;283(44):29615 -29619.
79. Trushina E, Du Charme J, Parisi J, McMurray CT. Neurolog ical abnormalities in
caveolin -1 knock out mice. Behav Brain Res. Sep 15 2006;172(1):24 -32.
80. van Helmond ZK, Miners JS, Bednall E, et al. Caveolin -1 and -2 and their relationship
to cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease. Neuropathol Appl Ne urobiol. Jun
2007;33(3):317 -327.
81. Volonte D, Zhang K, Lisanti MP, Galbiati F. Expression of caveolin -1 induces
premature cellular senescence in primary cultures of murine fibroblasts. Mol Biol Cell. Jul
2002;13(7):2502 -2517.
82. Wagner MJ, Kim TH, Savall J, Schnitzer MJ, Luo L. Cerebellar granule cells encode
the expectation of reward. Nature. Apr 06 2017;544(7648):96 -100.

85
83. Westmark CJ. What's hAPPening at synapses? The role of amyloid beta -protein
precursor and beta -amyloid in neurological disorders. Mol Psychiatry. Apr 2013;18(4):425 –
434.
84. Wheaton K, Sampsel K, Boisvert FM, Davy A, Robbins S, Riabowol K. Loss of
functional caveolae during senescence of human fibroblasts. J Cell Physiol. May
2001;187(2):226 -235.
85. Williams TM, Lisanti MP. The caveolin proteins. Genome Biol. 2004;5(3):214.
86. Williams TM, Lisanti MP. The Caveolin genes: from cell biology to medicine. Ann
Med. 2004;36(8):584 -595.
87. Wyss -Coray T. Ageing, neurodegeneration and brain rejuvenation. Nature. Nov 10
2016;539(7628):180 -186.
88. Yamaguchi H, Hirai S, Morimatsu M, Shoji M, Nakazato Y. Diffuse type of senile
plaques in the cerebellum of Alzheimer -type dementia demonstrated by beta protein
immunostain. Acta Neuropathol. 1989;77(3):314 -319.
89. Yao B, Christian KM, He C, Jin P, Ming GL, Song H. Epigenetic mechanisms in
neurogenesis. Nat Rev Neurosci. Sep 2016;17(9):537 -549.
90. Zhang T, Yao Y, Wang J, et al. Haploinsufficiency of Klippel -Trenaunay syndrome
gene Aggf1 inhibits developmental and pa thological angiogenesis by inactivating PI3K and
AKT and disrupts vascular integrity by activating VE -cadherin. Hum Mol Genet. Dec 01
2016;25(23):5094 -5110.
91. Zhao YL, Song JN, Zhang M. Role of caveolin -1 in the biology of the blood -brain
barrier. Rev Ne urosci. 2014;25(2):247 -254.
92. Zou H, Stoppani E, Volonte D, Galbiati F. Caveolin -1, cellular senescence and age –
related diseases. Mech Ageing Dev. Nov-Dec 2011;132(11 -12):533 -542.
93. Zschocke J, Bayatti N, Behl C. Caveolin and GLT -1 gene expression is r eciprocally
regulated in primary astrocytes: association of GLT -1 with non -caveolar lipid rafts. Glia. Jan
15 2005;49(2):275 -287.