Studiul electrochimic al unor benzodiazepine utilizând senzori electrochimici pe bază de carbon modificați cu liganzi anionici și polioxometalați… [310334]

Universitatea de medicină și farmacie

“iuliu hațieganu” cluj-napoca

Facultatea de farmacie

Teză DE doctorat

Studiul electrochimic al unor benzodiazepine utilizând senzori electrochimici pe bază de carbon modificați cu liganzi anionici și polioxometalați

Coordonatori științifici:

Prof. univ. dr. Robert Săndulescu

Doctorand: [anonimizat]

2007

CUPRINS

PARTEA I. Introducere

Dezvoltarea vertiginoasă a terapeuticii precum și înregistrarea unor accidente au adus în prim plan preocupările profesionale asupra controlului medicamentelor.

[anonimizat] a identității și controlului substanțelor.

[anonimizat], [anonimizat].

Ulterior s-a [anonimizat], [anonimizat]-chimic, iar pentru unele substanțe și controlul biologic și microbiologic.

[anonimizat], prezintă o serie de caracteristici dintre care amintim faptul că în majoritatea cazurilor analiza se execută pe probe mici și de cele mai multe ori asupra unor amestecuri complexe. [anonimizat].

Orice control în principiu presupune trei probe: identitatea, [anonimizat].

[anonimizat], [anonimizat].

[anonimizat], [anonimizat].

[anonimizat].

Probele de puritate constituie de asemenea o probă de mare importanță în analiza farmaceutică. Prezența impurităților este practic inevitabilă. [anonimizat], dar pot apărea impurități și datorită contaminării ulterioare accidentale sau intenționate.

O substanță, [anonimizat]. [anonimizat] o anumită limită pot să apară accidente dintre cele mai neplăcute. Diferitele farmacopei prevăd gradul de impuritate pentru substanțele întrebuințate în mod curent. Cercetarea impurităților în ultimul timp se face în comparație cu etaloanele de impurități și aceasta tocmai datorită faptului că orice substanță are un anumit grad de impurificare permis.

Cercetarea purității substanțelor este completă prin proba determinării cantitative.

Pentru analiza cantitativă a [anonimizat] a [anonimizat]-chimice. Este necesar uneori ca alături de dozarea principiului activ să se determine și alți compuși din produsul de analizat; importantă este însă alegerea metodei celei mai sensibile și pe cât se poate mai expeditive.

Metodele electroanalitice se bazează pe monitorizarea și măsurarea variației conductivității soluțiilor de substanțe chimice în general și în soluții de substanțe medicamentoase, pe măsurarea modificării echilibrului ionic și pe măsurarea oricărui transfer de electroni care are legătură cu concentrația unei substanțe analizate. Aceste modificări sunt detectate cu ajutorul unor senzori, adică electrozi de diverse specii care sunt utilizabili numai în anumite tehnici analitice, având o construcție specială pentru fiecare tip de proces. Monitorizarea modificărilor menționate are loc în soluții, iar interfața electrod-soluție funcționează ca un senzor ce traduce modificările care se petrec în soluție printr-un semnal analitic, care este amplificat și înregistrat.

Deși utilizarea metodelor electroanalitice a cunoscut un regres în a doua jumătate a secolului trecut datorită dezvoltării rapide a metodelor spectrale și magnetice, acestea cunosc în ultimul deceniu un reviriment deosebit, ce constă în progresele realizate în domeniul microelectronicii, ceea ce a condus la dezvoltarea extraordinară a senzorilor electrochimici prin diversificarea și dezvoltarea acestora. Datorită acestor progrese, metodele electroanalitice au devenit competitive cu alte metode de analiză ca urmare a conceperii și realizării unui număr impresionant de sisteme de electrozi, ca și a ultramicroelectrozilor utilizați în metodele potențiometrice și voltametrice.

Dintre metodele cele mai performante se numără voltametria cu unde pătrate, rapidă, sensibilă și adesea selectivă, polarografia puls diferențial și altele, care datorită marii lor sensibilități și selectivități sunt utilizate la determinări din matrici complexe. La acestea se adaugă stripping voltametria cu redizolvare anodică și stripping voltametria catodică puls-diferențială adsorbtivă, care are o sensibilitate de până la 10-11 M, ceea ce îi conferă un câmp larg de aplicare la determinarea urmelor de substanțe medicamentoase, metaboliți, toxice, etc.

Trebuie subliniat faptul că multe substanțe medicamentoase, deci farmacologic active, se pot determina prin metode electroanalitice, atât în medii apoase cât și în medii neapoase (protice și aprotice), la nivelul de concentrație 10-6 – 10-8 M sau chiar mai mică, cu o exactitate și precizie mare, furnizând rezultate de încredere, ceea ce este un deziderat major în etapa actuală de analiză și control. De altfel micreoelectrozii sunt preferați adesea pentru determinări de analiți din matrici organice restrictive, deoarece au căderi ohmice mici.

Metodele electroanalitice sunt mult utilizate și în analizele de laborator clinic, pentru determinarea de analiți medicamentoși și metaboliți, precum și a unor ioni ai metalelor grele și a unor compuși organici toxici, cum sunt în special drogurile. Aceste analize se fac pe volume mici de probe biologice de sânge, ser, urină sau în extracte de țesuturi și organe.

În evoluția metodelor electroanalitice un rol important l-au avut apariția electrozilor modificați și confecționarea de membrane electroactive din polimeri poroși sau din pastă de carbon ca atare sau modificată cu componente anorganice sau organice cum sunt eterii coroană, enzimele, etc., care le conferă o mare sensibilitate și selectivitate, iar în cazul biosenzorilor se poate vorbi și de o înaltă specificitate, știut fiind faptul că enzimele catalizează o singură reacție. De altfel, electrozii modificați sunt valoroși în special în cazul în care ei funcționează ca și catalizatori redox, în reacții electrochimice în care nu pot fi utilizați electrozi obișnuiți (convenționali).

Creșterea selectivității senzorilor electrochimici se poate obține prin utilizarea unor electrozi acoperiți, cum sunt de exemplu, electrozi acoperiți cu lipide care “colectează” medicamentele hidrofobe, excluzându-le pe cele hidrofile, polare, interferente. În astfel de cazuri, are loc atât separarea speciilor “colectate” cât și îmbogățirea lor, deci preconcentrarea lor până la nivelul de concentrație detectabilă și dozabilă. Pe de altă parte, în funcție de natura interferenței electrod-soluție, de natura substanțelor analizate și de potențialul aplicat, este posibilă eliberarea compusului imobilizat pe electrod în vederea determinării lui cantitative. Totodată este posibilă și eliberarea graduală a substanței imobilizate pe electrod ceea ce asigură controlul eliberării medicamentelor, cu aplicații în studiile de biodisponibilitate.

La avantajele sensibilității, selectivității, specifității și aplicabilității lor în medii acide, bazice, neutre, apoase și neapoase, inclusiv aprotice, se adaugă și marele avantaj al costurilor mici ale aparatelor electroanalitice, comparativ cu cele cromatografice, spectrofotometrice, electroforetice.

Deci, metodele electroanalitice constituie o alternativă concurentă, atât în analizele de rutină cât și în analizele mai deosebite, în analiza și controlul medicamentelor.

O privire critică asupra metodelor instrumentale utilizate pentru separarea, detecția și determinarea cantitativă a substanțelor farmaceutice permite constatarea că metodele electroanalitice sunt folosite în analiza și controlul de calitate într-o măsură mai mică decât metodele cromatografice sau spectrofotometrice. Acest lucru este un paradox dacă se ține seama de performanțele deosbite ale metodelor electroanalitice, de rapiditatea lor și de costurile mai mici ale acestor metode. La acestea se adaugă și capacitatea acestor metode de analiză de a rezolva exact și precis numeroase probleme farmaceutice, tocmai datorită sensibilității lor mari (vezi figura 1)

În urma examinării figurii de mai sus se observă că metodele electroanalitice se pot utiliza în cercetarea și rezolvarea unui mare număr de probleme referitoare la puritatea, identificarea și determinarea cantitativă a produselor farmaceutice de sinteză și a produșilor de degradare a substanțelor medicamentoase. De asemenea, aceste metode electroanalitice se utilizează frecvent la determinarea pKa a medicamentelor, la caracterizarea lor, a stabilității lor termice, a izomerilor optici, a mărimii particulelor și a formelor cristaline ale acestora. Aceste metode sunt utilizate în studiile de solubilitate a medicamentelor în apă și dependența acestei însușiri de pH-ul soluțiilor, în domeniul de pH = 1 – 8 la 37°C, care este considerat domeniul fiziologic de pH (ținând cont de pH-ul sucului gastric și cel din intestinul subțire).

O cerință importantă a analizei și controlului farmaceutic este aceea de a fi aplicabile la determinări ale medicamentelor și metaboliților lor în fluidele biologice, după administrarea unor doze reduse de medicamente, cu o sensibilitate mare, până la limita de detecție de 50-100 ng/mL de urină sau ser. Ori, voltametria cuplată cu cromatografia lichidă sau pe strat subțire are o astfel de sensibilitate și specificitate, comparabile cu cele ale cromatografiei gaz-lichid cu detectori cu captură de electroni, mas-spectrometrici sau cu ionizare în flacără. Pe de altă parte, tehnicile voltametrice sunt deosebit de utile pentru determinarea metaboliților polari care nu se pot derivatiza ușor pentru determinări gaz-cromatografice [1].

Se cunosc mai multe metode de optimizare a determinării cantitative, care se vor urmării în continuare :

Scăderea limitei de cuantificare prin alegerea metodei raportată la substanța medicamentoasă;

Asigurarea exactității și preciziei (repetabilitate, reproductibilitate, robustețe);

Calcularea corectă a rezultatelor analitice precum și evaluarea statistică a erorilor prin aplicarea analizelor statistice și a algoritmilor corespunzători, dar și a testelor de liniaritate, concordanță, etc;

Validarea metodelor de analiză în conformitate cu normele actuale în vigoare.

În concluzie, problemele legate de asigurarea calității medicamentelor se rezolvă prin utilizarea unor procedee optimizate de detecție și dozare.

PARTEA II. Stadiul actual al cunoașterii

II. 1. Considerații teoretice asupra derivaților de benzo-(f)1,4 diazepină

II. 1. 1. Noțiuni generale

În arsenalul terapeutic din ultimii ani, un loc însemnat îl ocupă medicamentele psihotrope, clasă din care fac parte substanțe cu compoziții și structuri diferite, dar care au caracteristici farmacodinamice comune, reflectate în influența selectivă a funcțiilor psihice.

Amploarea utilizării lor în terapeutică în zilele noastre nu este depășită decât de antibiotice.

Documente vechi, ilustrații și reprezentări antropomorfice, atestă folosirea de către popoarele antice și medievale orientale și occidentale a multor tipuri de medicamente psihotrope sub formă de băuturi, inhalații, extracte, pilule, etc.

Dezvoltarea cercetărilor farmacognostice, metodele noi de extracție, izolare, identificare și dozare a dus la o creștere considerabilă a numărului substanțelor cu acțiune psihotropă.

Terminologia întrebuințată pentru aceste medicamente este deosebit de variată.

Sintetizarea de către Sternbach [2] în anul 1959 a clordiazepoxidului și apoi introducerea sa în terapeutică printr-o serie de lucrări ale lui Randll, [3] a marcat apariția unei noi clase de medicamente cu acțiune depresivă asupra sistemului nervos central (SNC), întrebuințate ca agenți farmacoterapeutici și psihoterapeutici. Ele au la bază un sistem triciclic ce conține o structură benzodiazepinică. Spre deosebire de medicamentele tranchilizante care pot avea structuri foarte variate, dar care au în comun acțiunea farmacodinamică asemănătoare, benzodiazepinele nu corespund unor proprietăți farmacodinamice bine definite. Structura benzodiazepinică poate fi întâlnită la diferite clase de medicamente cum sunt: hipoglicemiante orale, hipotensoare, antiepileptice, tranchilizante antidepresive sau stimulatori ai SNC.

Gruparea acestor produși într-o clasă aparte este justificată pe de o parte datorită asemănărilor chimice, care le conferă o oarecare analogie a metodelor de preparare și a proprietăților analitice, iar pe de altă parte datorită proprietăților neurotrope a majorității dintre ele.

Benzodiazepinele au un larg spectru psihofarmacologic, având o mare eficacitate ca relaxanți musculari centrali în tratamentul stărilor medii de anxietate, ca antiepileptice sau ca anestezice, în funcție de structură, doză, cale de administrare sau interval de timp de la o administrare la alta.

II. 1. 2. Structura chimică

Structura chimică generală a derivaților de benzo-(f)-1,4 diazepină este reprezentată în figura 2:

Prin substituția celor șapte radicali cu diferite grupări au fost obținuți o serie de compuși medicamentoși, cei mai importanți fiind prezentați în tabelul 1:

Tabel 1. Benzodiazepinele cele mai importante

După cum se poate observa, aceste substanțe sunt derivați de benzo-(f)-1,4 diazepină care posedă în comun o dublă legătură în poziția 4-5 din heterociclu în timp ce radicalii ceilalți sunt diferiți.

II. 1. 3. Caracteristici fizico-chimice

Proprietățile fizice și chimice ale benzodiazepinelor sunt determinate pe de o parte de prezența heterociclului diazepinic, iar pe de altă parte, de grupările funcționale grefate pe heterociclul respectiv.

Astfel, benzodiazepinele prezintă un caracter slab bazic care poate fi pus în evidență prin formarea clorhidratului de benzodiazepină în urma reacției dintre benzodiazepină și acid clorhidric conform reacției:

Bzd + HCl → BzdH+Cl-

Constantele de bazicitate [4] pentru câteva benzodiazepine sunt prezentate în tabelul următor:

Se remarcă din tabelul 2 caracterul bazic mai puternic al clonazepamului lorazepamului și flunitrazepamului comparativ cu celelate benzodiazepine, caracterul bazic cel mai slab revenindu-i diazepamului.

Benzodiazepinele sunt în general solubile în solvenți organici ca etil eter, acetat de etil, cloroform și metanol, dar sunt insolubile în apă. [5]

Principalele tehnici prin care pot fi identificate și dozate benzodiazepinele sunt:

Testele de culoare

Metode cromatografice (TLC, GC și HPLC)

Metode spectrofotometrice (UV-VIS, IR)

Dintre numeroasele tipuri de benzodiazepine existente s-au realizat studii experimentale pe diazepam, flunitrazepam și bromazepam și în consecință referirile următoare vor fi efectuate numai asupra acestora.

Structurile chimice și principalele prevederi ale monografiilor oficiale pentru cele trei benzodiazepine [6, 7, 8, 9] sunt prezentate în continuare:

1. Diazepamul trebuie să conțină cel puțin 98,5% și cel mult 101,1% C16H13ClN2O raportat la substanța uscată.

Descriere: diazepamul se prezintă sub forma unei pulberi cristaline albe sau alb-gălbuie, fără miros sau aproape fără miros, cu gust amar.

Solubilitate: diazepamul este ușor solubil în acetonă, cloroform și benzen, solubil în acid acetic anhidru și alcool, greu solubil în eter, practic insolubil în apă.

Punct de topire: diazepamul se topește la 130 – 134 °C.

Diazepamul dă cu ușurință reacții de culoare datorită sensibilității mari față de reactivii de culoare. Colorațiile sunt însoțite uneori de o intensă fluorescență.

Reactivii utilizați în acest sens ar fi [10]:

reactivul Forest (amestec FeCl3, HClO4 și HNO3);

dicromat de potasiu în mediu de acid azotic;

permanganat de potasiu în mediu de acid azotic;

azotit de sodiu în mediu de acid percloric;

azotat de sodiu în mediu de acid sulfuric.

Diazepamul se poate identifica astfel: peste 10 mg diazepam se adaugă 3 mL acid sulfuric 0,1 M și se încălzește la fierbere timp de 3 min; soluția prezintă o fluorescență galben-verzuie.

O altă reacție de identificare a diazepamului constă în dizolvarea a 100 mg diazepam în 5 mL acid sulfuric 100g/L când se formează un precipitat galben-portocaliu.

Conform Farmacopeei Române, ed. X (FR X), spectrul în ultraviolet al soluției de diazepam 0,001% în acid clorhidric 0,02 mol/L prezintă trei maxime la: 358 nm, 284 nm și la 240 nm (figura 3).

Dozarea diazepamului se face conform FR X astfel: 250 mg diazepam se dizolvă în 15 mL acid acetic anhidru și se titrează cu acid percloric 0,1 mol/L în acid acetic anhidru folosind ca și indicator cristal violet în acid acetic anhidru până la colorație verde; 1 mL acid percloric 0,1 mol/L în acid acetic anhidru corespunde la 28,47 mg C16H13ClN2O.

2. Flunitrazepamul trebuie să conțină cel puțin 98,5% și cel mult 101,1% C16H12FN3O3 raportat la substanța uscată.

Descriere: flunitrazepamul se prezintă sub forma unei pulberi cristaline albe, fără miros.

Solubilitate: flunitrazepamul este ușor solubil în alcool și eter, solubil în acetonă, greu solubil în eter, practic insolubil în apă și hexan.

Punct de topire: flunitrazepamul se topește la 168 – 172 °C.

Flunitrazepamul dă cu ușurință reacții de culoare datorită sensibilității mari față de reactivii de culoare. Colorațiile sunt însoțite uneori de o intensă fluorescență.

Flunitrazepamul se poate identifica astfel: se dizolvă 10 mg flunitrazepam în 2 mL metanol și se încălzește dacă este necesar. Se adaugă 0,05 mL soluție diluată de NaOH obținându-se o soluție de culoare galbenă.

Conform Farmacopeei Europene, ediția a V-a, spectrul în ultraviolet al soluției de flunitrazepam 0,001% în metanol prezintă trei maxime la: 317 nm, 255 nm și la 223 nm (figura 4).

Dozarea flunitrazepamului se face conform Farmacopeei Europene ediția a V-a astfel: se dizolvă 250 mg flunitrazepam în 20 mL acid acetic anhidru peste care se adaugă 50 mL anhidridă acetică. Această soluție se titrează cu acid percloric 0,1M în acid acetic anhidru, determinarea punctului de echivalență efectuându-se potențiometric cu un electrod combinat pentru mediu neapos.

1 mL acid percloric 0,1 mol/L în acid acetic anhidru corespunde la 31,33 mg C16H12FN3O3.

3. Bromazepamul trebuie să conțină cel puțin 99,0% și cel mult 101,0% C14H10BrN3O raportat la substanța uscată.

Descriere: bromazepamul se prezintă sub forma unei pulberi cristaline albe sau alb-gălbuie, fără miros.

Solubilitate: bromazepamul este ușor solubil în alcool, acid acetic glacial, cloroform și clorură de metilen și insolubil în apă, eter, hexan, etc.

Punct de topire: bromazepamul se topește la 242 – 250 °C cu descompunere.

Bromazepamul dă cu ușurință reacții de culoare datorită sensibilității mari față de reactivii de culoare (ex: sarea Mohr când se formează o soluție de culoare violetă)

Conform Farmacopeei Europene, ediția a V-a, spectrul în ultraviolet al soluției de bromazepam 0,005% în metanol prezintă un maxim de absorbție la 233 nm (figura 5).

Dozarea bromazepamului se face conform Farmacopeei Europene, ediția a V-a astfel: se dizolvă 250 mg bromazepam în 20 mL acid acetic anhidru peste care se adaugă 50 mL anhidridă acetică. Această soluție se titrează cu acid percloric 0,1M în acid acetic anhidru, determinarea punctului de echivalență efectuându-se potențiometric cu un electrod combinat pentru mediu neapos.

1 mL acid percloric 0,1 mol/L în acid acetic anhidru corespunde la 31,62 mg C14H10BrN3O.

II. 2. Metode electroanalitice

Metodele electroanalitice cunosc în ultima perioadă o aplicabilitate din ce în ce mai mare, datorită mai ales progreselor microelectronicii care permit obținerea unor senzori electrochimici selectivi și sensibili, pentru analiza calitativă și cantitativă a unor substanțe medicamentoase. Un alt avantaj al acestor metode îl constitue costul foarte redus al aparaturii folosite în comparație cu alte metode ca HPLC, GC-SM, etc.

Tehnicile electroanalitice se bazează pe monitorizarea la interfața electrod-soluție a oricărei modificări a echilibrului ionic, a oricărui transfer de electroni în relație cu concentrația analitului. Metoda care se bazează pe observarea modificării echilibrului ionic se numește potențiometrie și este o metodă statică prin care se măsoară diferența de potențial la curent zero. Pe de altă parte, metoda care se bazează pe monitorizarea unui flux de electroni printr-un electrod care este supus unei perturbări a potențialului său, se numește voltametrie [11].

Câteva dintre avantajele acestor metode electroanalitice sunt:

Sensibilitate mare;

Îmbogățirea analitului “in situ” ( metoda stripping);

Posibilitatea de modificare a suprafeței sensibile;

Domeniu microanalitic de analiză;

Nu deranjează turbiditatea;

Posibilități largi de alegere a electrozilor și a modului de detecție;

Automatizare totală;

Costuri relativ scăzute.

II. 2. 1. Titrarea potențiometrică

Titrarea potențiometrică are marele avantaj de a permite stabilirea punctului de echivalență cu precizie mai mare decât titrarea volumetrică (clasică) care se bazează pe indicarea chimică a punctului de echivalență. În plus indicarea potențiometrică a puctului de echivalență se poate aplica chiar și la soluții tulburi sau colorate, la care indicarea chimică nu se poate aplica deloc. De remarcat că punctul final în titrarea potențiometrică coincide de regulă cu punctul de echivalență.

În titrarea potențiometrică se urmărește variația potențialului soluției de analizat cu ajutorul unor electrozi, produs de o reacție chimică oarecare, din care se poate calcula concentrația analitului.

Ca și electrozi utilizați în titrarea potențiometrică avem un electrod indicator, potrivit și un electrod de referință. Într-o titrare potențiometrică se urmărește modificarea diferenței de potențial în funcție de volumul de titrant adăugat.

Pentru măsurătorile de potențial se utilizează pH-metre sau titrimetre care pot să fie automate sau nu și care pot să determine direct concentrația substanțelor analizate.

Un montaj potențiometric este format dintr-o celulă de titrare în care sunt introduși cei doi electrozi care se unesc prin intermediul aparatului care măsoară diferența de potențial (figura 6).

Uneori, montajul potențiometric mai poate conține o pompă peristaltică care dozează volumul de titrant adăugat.

Electrozi de referință: sunt electrozi al căror potențial este cunoscut, constant și independent de concentrația analitului în soluție. Acești electrozi sunt utilizați la determinarea potențialului electrozilor indicatori. Dintre electrozii de referință cei mai folosiți amintim:

Electrodul de calomel saturat

Electrodul de Ag/AgCl

Electrodul saturat de calomel (ESC) (figura 7) format din mercur metalic și calomel, Hg/Hg2Cl2 (sat.), KCl (cM). Reacția la electrod este următoarea:

Hg2Cl2(s) +2e- ↔ 2Hg0(l) + 2Cl-

Acest electrod nu poate fi utilizat la determinări în care se produc mari variații de temperatură.

Electrodul de argint/clorură de argint (figura 7) are un fir de argint introdus într-o soluție saturată de KCl care conține și 1-2 picături de AgNO3 de concentrație 1M.

Reacția la electrod este:

AgCl(s) + e- ↔ Ag0(s) + Cl-

Ca și electrozi indicatori se folosesc în special electrozi ion selectivi (EIS), pentru determinarea ionilor de hidrogen, respectiv pH-ului și a ionilor metalici sau chiar a unor anioni organici, inclusiv substanțe medicamentoase. De asemenea, în prezent se mai folosesc electrozi membrană și în special electrozi membrană modificată care se pot utiliza la determinarea unor molecule medicamentoase dar și a altor tipuri de molecule. Deși electrozii ion selectivi și în general specii chimice selective prezintă o mare selectivitate, fiabilitatea lor are uneori de suferit datorită matricelor complexe în care se află analiții.

Electrozii membrană ion-selectivi sunt foarte numeroși fiind frecvent utilizați la determinarea cantitativă a numeroase molecule de substanțe medicamentoase.

În general obținerea și utilizarea membranelor electroactive selective, componente ale senzorilor electrochimici nu este un scop în sine, deoarece membranele sunt supuse continuu unui proces de optimizare prin încorporarea unor componente chimice care au rolul de a le mări specificitatea, selectivitatea, sensibilitatea și în general fiabilitatea, ceea ce se traduce prin răspunsuri cât mai rapide și prin semnale cât mai sensibile și mai reproductibile, deci de mai mare încredere.

În ultima perioadă electrozii cu membrană modificată datorită performanțelor deosebite au cunoscut o bună dezvoltare concretizată prin aplicații în analiza chimică în general și în analiza și controlul medicamentelor în special. De regulă membranele se obțin din polimeri precum PVC sau teflon și mai rar din alți polimeri.

De asemenea în ultimele decenii, un mare interes prezintă membranele din pastă de carbon modificată. Pasta de carbon se obține din pulbere de carbon (grafit) de mare puritate, încorporată în ulei de parafină solidă sau parafină solidă topită în prealabil, în nujol, cauciuc siliconic, etc.

Se cunosc mai multe procedee de modificare a suprafeței membranei [1]:

depunera unui film de mercur sau aur, pe electrozi de grafit sau grafit vitros;

încorporarea în membrana electrodului pastă de carbon a unor componenți precum: catalizatori sintetici, compuși organo-metalici, unii oxizi metalici, săruri metalice conductoare;

agenți complexanți chelatanți sau a unor complecși chelați utilizați la determinarea urmelor unor metale grele;

îmbrăcarea membranei cu unii polimeri ca: polipirolii, politiofenul, poliacrilamida, etc;

pentru electrozii pe bază de pastă de carbon se pot utiliza ca modificatori: lipide, surfactanți (tensioactive sau detergenți), agenți chelatanți sau complecși chelați ai acestora cu ionii metalelor grele care trebuie să fie dozate, polioxometalați sau cu perechi de ioni ai acestora cu baze organice medicamentoase; complecși de asociație ionică ai bazelor organice medicamentoase cu sare Reinecke, tetrafenilborat, hexacianoferat(II), tetraiodobismutat (III), enzime și mediatori enzimatici;

încorporarea unor cationi hidrofobi cum sunt cationii sărurilor cuaternare de amoniu sau sărurile complexe de substituție ale unor metale tranziționale, dizolvate într-un solvent organic potrivit, în membrane PVC sau filtre Millipore, pentru determinarea anionilor.

Electrozii pastă de carbon sunt folosiți cu succes atât în analiza voltametrică cât și în analiza potențiometrică. Conform recomandărilor IUPAC electrozii pastă de carbon fac parte din categoria electrozilor modificați chimic (EMC). Avantajul utilizării lor în potențiometrie constă în faptul că electrodul pastă de carbon este mai ușor de preparat și prezintă o rezistență ohmică mai mică, ceea ce înseamnă că valoarea intensității curenților de fond este redusă.

Un electrod chimic modificat poate fi definit ca reprezentând o modificare rațională intenționată a structurii moleculare a suprafeței electrozilor convenționali în scopul utilizării lor în cadrul unor aplicații specifice [12 – 20].

Electrodul chimic modificat (EMC) se bazează pe fixarea unui centru redox pe suprafața electrodului; acesta funcționează ca un mediator pentru transferul rapid de electroni spre molecula de substrat, fiind oxidat sau redus lent (sau deloc în unele cazuri) la suprafața unui electrod convențional.

În principiu, mediatorul poate fi considerat că funcționează ca un transportor de electroni între electrod și compusul de analizat. Necesitatea unei astfel de medieri apare ori de câte ori viteza directă a transferului de electroni este mică, atunci când la nivelul unui electrod convențional este necesară aplicarea unui suprapotențial pentru a face ca reacția redox să aibă loc cu o viteză apreciabilă [21 – 25]. Prin utilizarea unui EMC oxidarea sau reducerea compusului de analizat se produce la valoarea potențialului redox al mediatorului.

În concluzie, prin fixarea (incorporarea) intenționată a unui mediator adecvat pe suprafața electrozilor convenționali (într-o pastă de carbon), aceștia pot căpăta noi proprietăți, cum ar fi: mărirea sensibilității și a selectivității, eliminarea fenomenelor de adsorbție, precum și obținerea unor caracteristici optice speciale.

Un electrod chimic modificat ideal pentru aplicații analitice, ceea ce presupune funcționarea continuă și de durată în sisteme în flux, trebuie să prezinte următoarele caracteristici:

o bună stabilitate mecanică și chimică, atât a electrodului de bază cât și a speciei chimice modificatoare, precum și a legăturii dintre electrod și acesta din urmă;

reproductibilitatea pe o anumită perioadă și stabilitate în timp a activității speciei chimice modificatoare față de compusul de analizat;

flexibilitate în capacitatea de legare a speciei chimice modificatoare;

un domeniu larg de linearitate a răspunsului analitic;

curenți de bază mici și stabili pe domeniul de potențial utilizat;

compatibilitatea cu o gamă largă de solvenți apoși și organici.

În ultima perioadă au fost folosite diferite procese de imobilizare a unor compuși chimici pe electrozi de diferite tipuri (în ceea ce privește materialul și construcția acestora), dar majoritatea proceselor au avut la bază următoarele tehnici:

Adsorbția directă a modificatorului pe suprafața electrodului;

Legarea covalentă a modificatorului la un centru specific al suprafeței;

Acoperirea fizică a suprafeței cu un polimer conținând modificatorul;

Amestecarea modificatorului cu o matrice conductivă (pastă conductivă).

Dintre cele patru metode de fabricare prezentate, ultimele două par să constituie variantele cele mai bune de obținere a unui electrod ideal.

Folosirea EMC în dozarea substanțelor medicamentoase se bucură de un success considerabil. Prin modificarea chimică a suprafeței electrozilor a fost posibilă obținerea unei varietăți de electrozi chimic modificați prin intermediul cărora pot fi determinați un număr mare de compuși chimici. Datorită selectivității și sensibilității mărite, electrozii chimic modificați sunt ideali pentru electroanalize. Electrozii modificați chimic și-au găsit largi aplicații în: electroanaliză, preconcentrare, permeabilitate selectivă și recunoaștere specifică, calea fiind încă deschisă și spre alte aplicații [26- 31]

Construcția, caracterizarea și aplicațiile electrozilor modificați chimic posedând suprafețe funcționalizate specifice, reprezintă un nou domeniu de cercetare electrochimică, care în principiu poate deschide o serie de posibilități analitice unice în domeniul electrochimiei [32 – 37].

Preocuparea noastră referitor la electrozii modificați chimic a constat în posibilitatea realizării acestora având la bază complecși de asociație ionică a benzodiazepinelor în vederea determinării benzodiazepinelor din soluții cât mai diluate.

Electrozii pastă de carbon pot fi modificați într-un mod avantajos (asemănător electrozilor solizi), cu scopul îmbunătățirii selectivității și sensibilității lor [38 ], prin procedee diferite de cele aplicate electrozilor solizi [39], datorită structurii caracteristice a pastei de carbon.

În general modificarea chimică a electrozilor are ca scop posibilitatea desfășurării unor reacții chimice pe suprafața electrodului (ex: preconcentrarea reactanților prin adăugarea liganzilor, enzimelor) sau asigurarea transferului electronilor.

Varianta electrodului pastă de carbon oferă numeroase avantaje pentru cercetarea electrochimică a speciilor anorganice și organice și este ușor de preparat și este ieftin. Acest tip de electrod prezintă performanțe ridicate față de alte tipuri de electrozi solizi ca de exemplu:

zgomot de fond scăzut într-un domeniu larg de potențial;

risc scăzut de degradare ireversibilă a suprafeței;

permite modificarea suprafeței electrodice prin diverse tehnici;

permite modificarea pastei prin incorporarea unor modificatori.

Pe lângă aceste avantaje, electrozii pastă de carbon prezintă și câteva dezavantaje, dar care sunt nesemnificative în comparație cu avantajele enumerate mai sus. Dintre acestea amintim:

instabilitatea în solvenți hidro-organici;

variabilitatea compoziției pastei;

viteza lentă a transferului de electroni și refacerea manuală a suprafeței electroactive care constituie o sursă a erorilor aleatoare.

Titrarea potențiometrică este mai exactă decât potențiometria directă, datorită incertitudinilor implicate în măsurătorile de potențial. În soluțiile diluate, citirile potențialului sunt dificile în preajma punctului de echivalență deoarece soluția este foarte puțin echilibrată.

Pe de altă parte, trebuie să se reprezinte grafic numai potențialul din preajma punctului de echivalență și în această zonă să se adauge cantități cât mai mici de soluție titrantă (între 0,05 și 0,1 mL). Volumul de titrant corespunzător echivalenței se obține prin interpolarea potențialului (E) pe abscisă (pe care sunt reprezentate volumele).

De remarcat că în titrarea acido-bazică se produce la echivalență un salt mare de potențial (sau pH); această modificare a potențialului (pH-ului) poate fi urmărită cu un electrod de sticlă, iar prin reprezentarea grafică a forței electromotoare (pH-ului) față de volumul de titrant (bază sau acid) se obține curba de titrare (figura 8).

Punctul de echivalență se găsește în zona cea mai abruptă a curbei de titrare și corespunde punctului de inflexiune. Pentru titrarea multor acizi slabi cu baze slabe în apă se poate utiliza un electrod indicator de sticlă și un electrod de referință de calomel saturat, iar pentru titrări în mediu neapos se utilizează un electrod de referință SCE de tip manșon, cu joncțiune de fibră, pentru a micșora rezistența celulei. În cazul solvenților cu constantă dielectrică scăzută este convenabil ca electrod de referință să fie folosit electrodul de argint (Ag/AgCl).

Așa cum se observă din reprezentarea grafică a variației potențialului în funcție de volumul de titrant adăugat, panta curbei de titrare este maximă la punctul de echivalență, iar viteza de schimbare a potențialului, odată cu adăugarea titrantului este de asemenea maximă la punctul de echivalență. Cu toate acestea este dificilă determinarea volumului de echivalență din curba sigmoidală, dar dacă se reprezintă grafic prima derivată a potențialului/volum, ΔE/ΔV, în funcție de volum se obține o curbă al cărei pic corespunde punctului de echivalență (figura 9).

Pentru stabilirea volumului de titrant la echivalență cu și mai mare precizie se reprezintă derivata a doua a potențialului care este în fond viteza de schimbare a potențialului Δ2E în funcție de variația volumului de titrant corespunzător, Δ2V [11]; această a doua derivată se exprimă prin raportul Δ2E/ ΔV2 (figura 10).

De remarcat că utilizarea derivatelor poate fi însoțită de creșterea zgomotului de fond.

Cunoscând volumul de titrant la echivalență, Vechiv., și titrul acestei soluții (sau factorul), se poate calcula cantitatea de analit din proba analizată.

II. 2. 2. Voltametrie

Voltametria este o metodă electroanalitică dintre cele mai exacte și mai sensibile, în care analitul este oxidat sau redus la un electrod potrivit, iar cantitatea de electricitate (de curent) implicată în electroliză se corelează cu cantitatea de analit. De remarcat că electroliza poate fi completă ca și în electrogravimetrie și în coulometrie care sunt potrivite pentru cantități de analit mai mari, de ex. de ordinul mmoli (uneori se pot determina și cantități mai mici) [1, 40, 41].

Voltametria se utilizează pentru:

Determinarea cantitativă a compușilor organici și anorganici în soluții apoase și neapoase;

Determinări cinetice;

Determinarea suprafețelor de adsorbție la suprafață;

Determinarea transferului electronului și mecanismul reacțiilor;

Determinarea proprietăților termodinamice a speciilor de solvat;

Studii fundamentale a proceselor de oxidare și reducere în diverse medii;

Determinarea combinațiilor complexe și a valorii de coordinare.

Pe lângă aceste utilizări, voltametria se mai poate aplica la:

Determinarea cantitativă a compușilor farmaceutici;

Determinarea concentrației ionior metalici din apă la concentrații de ordinul ppm;

Determinarea potențialelor redox;

Detecția analiților eluați din HPLC și FIA;

Determinarea numărului de electroni transferați în reacțiile redox;

Studiul cinetic al unor reacții chimice.

Caracteristicile voltametriei:

Specific: Speciile care prezintă interes trebuie să fie dizolvate într-un solvent corespunzător pentru a fi reduse sau oxidate în domeniul de potențial aplicat electrodului.

Cantitativ: Este nevoie ca și cantitățile de substanță analizată să depindă de tehnica folosită. De exemplu, voltametria ciclică generală poate determina concentrații de analit de 10-3-10-5 M, pe când voltametria stripping anodică determină ionii metalici cu rezultate bune la concentrații de 10-12 M. De asemenea analiza se poate face la volume de ordinul µL cu o celulă și un microelectrod special.

Preparare: Gradul de pregătire depinde de probă și de tehnica folosită. De exemplu pentru determinarea Pb(II) și Cd(II) din apa de mare cu un microelectrod prin voltametrie stripping anodică cu undă pătrată nu este necesară o pregătire prealabilă. În schimb, determinarea efedrinei din plasma sanguină cu un electrod de carbon vitros prin voltametrie puls diferențială, necesită ca proba să fie în prealabil tratată cu o soluție tampon și separată.

Timpul de analiză : odată ce proba este pregătită, timpul de analiză variază de la câteva secunde necesare obținerii unei voltamograme simple până la câteva minute pentru o voltamogramă ciclică sau aproximativ 30 de minute (sau chiar mai mult) pentru determinarea unui analit de concentrație foarte mică prin ASV (depinde de viteza de baleiaj a potențialului, dar și de mărimea domeniului de potențial ales).

Limitele voltametriei :

Generale :

Analiții trebuie să fie oxidabili sau reductibili în domeniul de potențial în care solventul și electrodul sunt inerți din punct de vedere electrochimic;

Furnizează foarte puțin sau deloc informații despre identitatea speciei;

Proba trebuie să fie obligatoriu dizolvată într-un solvent adecvat.

Precizie (acuratețe) : Precizia metodelor voltametrice variază odată cu tehnica de la 1 la 10%.

Sensibilitatea și limita de detecție : limita de detecție variază odată cu tehnica de la ppm la ppt.

Combinația cu alte metode de analiză și control:

Metode spectroscopice

Cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC).

II. 2. 2. 1. Noțiuni generale

Din punct de vedere istoric voltametria s-a dezvoltat în urma descoperirii polarografiei de către chimistul ceh Jaroslav Heyrovsky, descoperire pentru care a primit premiul Nobel la chimie în anul 1959. Impunerea metodelor voltametice în analiza curentă a fost destul de dificilă, dar prin anii 1960-1970 s-a avansat destul de repede în acest domeniu prin apariția instrumentației și a metodologiei corespunzătoare care au condus la o sensibilitate crescută a metodelor analitice. Această dezvoltare a coincis cu scăderea prețului amplificatoarelor operaționale urmată de o dezvoltarea rapidă a instrumentației necesare.

Caracteristica comună a tuturor tehnicilor voltametrice este aceea că implică aplicarea unui potențial la un electrod și monitorizarea curentului rezultat (i) care străbate celula electrochimică. În multe cazuri potențialul aplicat este variabil și curentul este monitorizat într-o anumită perioadă de timp (t). Astfel toate tehnicile voltametrice descrise sunt funcție de potențial (E), intensitate (i) și timp (t). Metodele voltametrice sunt considerate tehnici active (spre deosebire de tehnicile pasive, ca de exemplu – potențiometria), deoarece potențialul “forțează“ o modificare a concentrației unei specii active la suprafața electrodului prin oxidare sau reducere electrochimică.

Avantajele analitice ale diverselor tehnici voltametrice includ sensibilitatea excelentă pentru un domeniu foarte mare de concentrație (10-12 – 10-1 mol/L) a speciilor organice sau anorganice, permite folosirea a numeroși solvenți și electroliți, interval de temperatură mare al determinărilor, timpul de analiză scurt, determinarea simultană a câtorva analiți, capacitatea de determinare cinetică și a parametrilor mecanismului de reacție.

Analiștii chimiști folosesc tehnicile voltametrice în general pentru determinările cantitative a diverselor substanțe anorganice și organice. Chimiștii anorganicieni, fizicienii și biologii folosesc în mare măsură tehnicile voltametrice pentru o varietate de scopuri, incluzând studiile fundamentale de oxidare și reducere a proceselor în diferite medii, procesele de adsorbție la suprafață, transferul electronilor și mecanismul reacțiilor, cinetica procesului de transfer al electronilor și transport, și proprietățile termodinamice ale speciei solvatate. Metodele voltametrice sunt de asemenea aplicate la dozarea substanțelor medicamentoase, iar când sunt cuplate cu un HPLC, se pot analiza efectiv amestecuri complexe [42].

În voltametrie efectele aplicate potențialelor și comportarea curentului redox sunt descrise cu ajutorul unor legi. Potențialul aplicat care controlează concentrația speciei redox prin suprafața electrodului (și ) și ritmul reacției (k0) a fost descris cu ajutorul ecuației Nernst sau Butler-Volmer. În cazul unde difuzia este controlată în parte, curentul rezultat din procesul redox (cunoscut sub numele de curent faradaic) este dependent de suprafața de separație dintre electrod și soluție și este descris de legea Fick. Interacțiunea între aceste procese este responsabilă pentru caracteristicile observate la voltamogramele diferitelor tehnici.

Se știe că potențialul la care se oxidează sau reduce un anumit analit depinde de substanța ca atare (de natura ei), dar prin alegerea judicioasă a potențialului de electroliză se poate obține o selectivitate corespunzătoare bună. Este important faptul că de obicei, în voltametrie este necesară separarea prealabilă a analitului. În prezent tehnicile voltametrice utilizează microelectrozi pentru microelectroliză; potențialul este scanat, iar soluția diluată a anlitului produce un curent limitativ la un potențial dat în domeniul de microamperi sau chiar mai puțin care este proporțional cu concentrația analitului.

Prin urmare, voltametria este în esență o microelectroliză pe un microelectrod de lucru, de ex. fir de platină; potențialul este scanat lent la un microelectrod de lucru iar la un anumit potențial analitul se reduce sau se oxidează, curentul care rezultă este înregistrat ca o funcție a potențialului aplicat rezultând o voltamogramă. Pe de altă parte trebuie subliniat că înregistrarea curentului are loc numai dacă este prezentă o specie electroactivă reductibilă sau oxidabilă, iar potențialul aplicat devine suficient de negativ sau de pozitiv, pentru ca specia electroactivă să poată fi electrolizată; se știe că prin convenție un curent catodic este pozitiv, deci reducător, iar un curent anodic este negativ, deci oxidant.

În soluție diluată curentul atinge o valoare limitativă, datorită faptului că analitul poate să difuzeze la electrod pentru a fi electrolizat cu o anumită viteză dependentă de concentrația sa; în general curentul limitativ este proporțional cu concentrația, iar electrodul limitează curentul la câțiva μA sau chiar mai puțin, de aceea în multe aplicații, concentrația substanței de analizat în soluție rămâne fundamental neschimbată după înregistrarea voltamogramei.

Pentru o reacție electrochimică redox ca, Ox. + ne- ↔ Red., forța electromotoare se poate scrie conform ecuației Nernst :

, unde

R – constanta gazelor perfecte (8,3144 J.mol-1.K-1);

T – temperatura absolută (K);

n – numărul de electroni transferați;

F – constanta Faraday (96,485C/echiv.);

E0 – potențialul standard de reducere pentru cuplul redox.

În cele din urmă în majoritatea cazurilor fluxul curentului depinde de materialul electrodului precum și de suprafața acestuia. Când o specie nouă, Ox. sau Red., este obținută la suprafață, concentrația ei crește într-o anumită zonă care conduce la difuzia acestei specii către volumul de soluție. De asemenea, când Ox. sau Red. este distrusă, concentrația scade fiind promovată difuzia de material nou din soluție. Rezultatul gradientului de concentrație și transportul masei este descris de legea Fick, în care fluxul de materie (Ф) este direct proporțional cu gradientul concentrației :

Ф = -AD0 (δc0/δx), unde

D0 – coeficientul de difuzie al formei Ox.;

x – distanta de la suprafața electrodului.

O ecuație analoagă se poate scrie pentru Red.

Fluxul de Ox. sau Red. la suprafața electrodului controlează viteza de reacție și implicit fluxul de curent faradaic din interiorul celulei. Curentul este o măsură cantitativă de determinare a speciei care se oxidează sau se reduce la suprafața electrodului. Valoarea reală a acestui curent este influențată de mulți factori adiționali, dintre care cei mai importanți sunt :

concentrația speciei redox;

dimensiunea și forma electrodului;

materialul electrodului;

rezistența electrică asoluției;

volumul celulei;

numărul electronilor transferați în timpul procesului redox.

În plus pentru difuzie, transportul de masă se poate de asemenea realiza prin migrație sau convecție. Migrația reprezintă mișcarea ionilor încărcați electric în prezența câmpului electric. În voltametrie, folosirea unui suport electrolitic concentrat elimină efectul migrării. Convecția reprezintă mișcarea speciei electroactive prin gradienții de densitate prezenți în soluție, agitând soluția, sau rotind electrodul.

Voltametria se efectuează într-o celulă care include un microelectrod de lucru, un electrod auxiliar și un electrod de referință (de obicei un SCE); pentru controlul potențialului se utilizează un potențiostat, curentul electrodului de lucru se înregistrează ca o funcție a potențialului său măsurat față de un electrod de referință; voltajul este aplicat între electrodul de lucru și cel auxiliar. În voltametrie se măsoară curentul între doi electrozi care sunt supuși la variații periodice de potențial. Curenții sunt măsurați la un electrod indicator polarizat în raport cu un electrod de referință nepolarizat. În acest fel curba curent-tensiune nu este stânjenită de o rezistență apreciabilă a soluției, care creează o cădere de tensiune iR între electrodul de lucru și cel auxiliar, în solvenți neapoși.

II. 2. 2. 2. Aparatura voltametrică

Componentele de bază ale unui sistem electroanalitic modern pentru voltametrie sunt: un potențiostat, un computer și o celulă electrochimică.

Potențiostatul: Sarcina potențiostatului este de a măsura potențialul și de a monitoriza căderile de curent la potențiostat. Cele mai folosite potențiostate din zilele noastre sunt cele care au asamblate circuite integrate operaționale, amplificatoare și de asemenea module digitale cele mai moderne.

Cele mai multe tehnici voltametrice sunt dinamice. Controlul exact și flexibil al potențialului aplicat este o funcție critică a potențiostatului. Potențiostatele analogice efectuează un baleiaj liniar al potențialului după o ordine prestabilită de la o valoare la alta. În continuare au apărut și s-au dezvoltat potențiostatele digitale în care scanarea liniară a potențialului se face cu pași mici analog cu varianta potențialului analogic. Nu în mod surprinzător invenția digitală adresată potențialului a deschis drumul puls voltametriei care s-a impus datorită timpului mic de analiză și sensibilității sporite. În figura 11 este prezentat schematic un sistem voltametric:

Electrozii și celula voltametrică: O celulă electrochimică clasică conține proba dizolvată într-un solvent, un electrolit ionic și doi sau trei electrozi (după caz). Se folosesc celule electrochimice de diferite dimensiuni, forme, confecționate din diverse materiale. Tipul de celulă folosit într-o determinare voltametrică depinde de probă, tehnica folosită și de datele analitice care urmează a fi obținute. Materialul celulei electrochimice (sticlă, teflon, polietilenă) se alege astfel încât interacțiile sale cu probă să fie nule sau minime (figura 12).

Celula electrochimică folosită în voltametrie are trei electrozi:

Electrod de lucru;

Electrod de referință;

Electrod auxiliar.

Electrodul de referință: Electrodul de referință ar trebui să furnizeze o jumătate de reacție reversibilă cu comportare Nernst-iană constantă în timp. Cei mai utilizați electrozi de referință pentru soluțiile apoase sunt:

Electrodul de calomel

Electrodul de argint

Acești electrozi se găsesc sub o varietate de dimensiuni și forme.

Electrodul auxiliar: În majoritatea tehnicilor voltametrice la suprafața acestui electrod se produc schimbările de concentrație a Red. sau Ox. Cel mai adesea electrodul auxiliar constă dintr-un fir de Pt, sau Au și uneori chiar grafitul a fost utilizat.

Electrodul de lucru: Electrodul de lucru se prezintă sub forma unor variate forme geometrice fiind confecționat din diverse materiale, începând de la micile picături de mercur până la discurile plate de platină. Mercurul este frecvent utilizat datorită domeniului larg de potențial negativ și suprafața lui este permanent regenerată prin crearea unei picături noi. Mulți ioni metalici pot fi reduși pe picătura sau filmul de mercur.

Alte materiale folosite sunt aurul, platina și carbonul vitros.

Întrucât potențialul este mărit dincolo de potențialul de descompunere, curentul va crește liniar conform legii lui Ohm:

i = = kE

Pe măsură ce electroliza se desfășoară, numărul ionilor din vecinătatea electrodului scade prin reducere ceea ce creează un gradient de concentrație între suprafața electrodului și volumul soluției. Atâta vreme cât potențialul aplicat este mic, ionii din masa de soluție pot difuza suficient de rapid spre suprafața electrodului. Dar cum potențialul este mare, curentul crează un gradient de concentrație. Deci ionii trebuie să difuzeze cu o viteză mai rapidă în scopul menținerii intensității curentului. Gradientul de concentrație și implicit viteza de difuzie este proporțională cu concentrația. Dacă soluția este diluată se va atinge (eventual) un potențial la care viteza de difuzie atinge un maxim și toți ionii sunt reduși cu atât mai rapid cu cât ei pot difuza spre suprafața electrodului. Deci, o valoare limitativă a curentului (il) este atinsă iar creșterea ulterioară a potențialului nu va determina creșterea intensității curentului.

În figura 13 sunt prezentate câteva tipuri de curbe voltametrice:

Dacă soluția este agitată (sau electrodul este rotativ) se obține o curbă în formă de “S”, în fapt curentul limitativ rămâne constant îndată ce el este stabilit; aceasta deoarece stratul de difuzie sau grosimea gradientul de concentrație pe care analitul trebuie să-l difuzeze, rămâne mic și constant, întrucât analitul este adus continuu aproape de suprafața electrodului prin transfer de masă prin agitare.

Dacă electrodul este fix (neagitat), iar soluția este liniștită, stratul difuziei se va extinde cu timpul în soluție, ceea ce va determina o scădere exponențială a curentului limitativ, înregistrându-se o undă cu pic; de aceea voltajul se scanează folosind microelectrozi staționari.

Reducerea sau oxidarea pas cu pas a analitului sau a amestecului celor două substanțe electroactive în soluție neagitată.

Cu toate că potențialul de descompunere necesar pentru a iniția electroliza variază ușor cu concentrația, potențialul la care curentul limitativ este independent de concentrație se numește potențial de semiundă și se notează cu E1/2; acesta este o constantă și este legat de potențialul standard sau formal al cuplului redox. În acest fel voltametria servește ca mijloc calitativ de identificare a speciilor reductibile (oxidante) și oxidabile (reducătoare).

În concluzie, potențialul la care analitul este electrolizat, este o măsură calitativă, deci un parametru de identificare al acestuia.

Înălțimea undelor este proporțională cu concentrațiile relative ale celor doi ioni. Pentru o bună rezoluție diferența dintre două unde voltametrice trebuie să fie de cel puțin 0,2 V între valorile potențialelor, iar dacă valorile E1/2 sunt egale se obține singura undă compusă cu aceeași înălțime, care este suma undelor individuale.

De remarcat că în cazul reducerii prealabile (sau oxidării) prin scanare anodică a unui component principal existent în concentrație mai mare decât analitul ce urmează a fi dozat, unda componentului principal maschează undele ce urmează (succesive) și ele nu pot atinge curentul limitativ; de aceea în astfel de cazuri majoritatea substanțelor interferente trebuie să fie îndepărtate înaintea efectuării analizei, dacă se poate printr-un proces de preelectroliză la un macroelectrod utilizând un montaj ca cel prezentat anterior la un potențial corespunzând curentului limită care trebuie să fie insuficient pentru a electroliza substanța de analizat.

II. 2. 2. 3. Voltametria cu baleiaj liniar și voltametria ciclică

Comportamentul electrochimic al unui sistem poate fi studiat prin aplicarea unui potențial asupra sistemului și înregistrarea curbei curent-potențial. Drept urmare s-a dezvoltat o metodă, care aplică electrodului un potențial variabil în timp și înregistrează intensitatea curentului ce traversează interfața studiată, numită voltametrie cu baleiaj. Tipul baleiajului utilizat, corespunde în general unei funcții lineare de timp, iar vitezele de baleiaj sunt cuprinse în intervalul 0,04-1000 mV/s și metoda se numește voltametrie cu baleiaj liniar.

Voltametria cu baleiaj liniar (figura 14) implică monitorizarea curentului în funcție de potențialul aplicat când acesta variază regulat și este aplicat unui electrod de lucru.

Potențialul limită ce poate fi aplicat depinde de electrodul de referință, tipul electrodului indicator și solventul în care se efectuează analiza.

Când potențialul este scanat în direcție catodică, reducerea începe înainte de a ajunge la valoarea potențialulului electrodului care se modifică până când valoarea lui Red. este formată în acord cu ecuația Nernst.

Picul de curent pentru un sistem reversibil este [43]:

, unde:

Ip – intensitatea curentului, A;

v – viteza de scanare, V/s.

Poziția picului potențialului este:

Dacă potențialul se balează ciclic între două valori (inițială – numit potențial de start și finală – numit potențial de întoarcere) cu viteză constantă, înregistrându-se intensitatea curentului ce traversează interfața studiată, metoda se numește voltametrie ciclică.

Deci, voltametria ciclică este o metodă care urmărește răspunsul de curent pe care îl dă electrodul de lucru, aflat în soluție neagitată și a cărui potențial este modificat ciclic între două valori (înregistrându-se astfel curba curent-potențial atât pentru procesul de reducere cât și pentru procesul de oxidare).

Speciile electroactive reacționează la suprafața electrodului de lucru. Pot fi folosiți o seamă de electrozi, dintre care amintim electrodul de platină sau electrodul de carbon vitros într-o soluție apoasă. Electrozii cu film de mercur nu sunt utilizați prea mult datorită faptului că mercurul se oxidează foarte ușor ceea ce reprezintă un dezavantaj major în voltametrie. În plus suprafața filmului de mercur observată cu ajutorul unui microscop electronic, nu este uniformă, ea prezentându-se sub forma unor picături foarte mici așa cum se observă în figura 15:

Ca și electrod de referință cei mai utilizați electrozi sunt electrodul saturat de calomel și electrodul de argint. Electrodul fir de platină este cel mai utilizat electrod auxiliar.

Electrodul auxiliar produce suficient curent pentru electroliză. Un experiment de voltametrie ciclică presupune o soluție liberă de oxigen dacă potențialul coboară sub potențialul de reducere al oxigenului. Aceasta se realizează prin barbotarea unui gaz inert în interiorul soluției cu câteva minute înainte de efectuarea analizei. Uneori, este de asemenea necesar să se regleze temperatura celulei electrochimice prin circulația unui flux de apă prin cămașa exterioară celulei în care se află soluția de analizat.

Electrodul de lucru este cuplat cu un electrod de referință față de care se măsoară potențialul. Tehnica de lucru constă în variația în timp a potențialului de electrod prin aplicarea unui impuls triunghiular de tensiune de la un generator de impulsuri, prin intermediul unui potențiostat. Creșterea potențialului se face cu viteză constantă până la o anumită valoare, iar apoi direcția sa de creștere se inversează (figura 16).

Așa cum se observă din figura de mai sus este posibil ca variația potențialului între valorile extreme ale acestuia să se facă în mai mult de un ciclu (două sau mai multe cicluri). Acest lucru este util atunci când se aplică acest procedeu de voltametrie ciclică pentru a determina prezența speciilor chimice în reacții ireversibile [44, 45].

În timpul ciclului de creștere și descreștere a potențialului se măsoară curentul corespunzător, care se trasează în funcție de potențialul aplicat, obținându-se așa numita voltamogramă ciclică, figura 17:

Voltamograma prezintă vârfuri, maxime, corespunzătoare proceselor de reducere sau oxidare, care au loc la anumite valori ale potențialelor.

Dacă un potențial se aplică la suprafața electrodului pentru a face sarcina electrodului să fie negativă, atunci orice specie oxidată de interes (A) poate fi redusă pentru a forma (A-) dacă aceasta intră în contact cu suprafața electrodului. Întotdeauna va fi o concentrație ridicată a speciei reduse în vecinătatea suprafeței electrodului. Odată cu scurgerea timpului, concentrația speciei reduse de pe suprafața electrodului crește. În figura de anterioară se observă 7 paliere care au următoarele semnificații:

concentrația speciei A este maximă datorită faptului că tensiunea nu este suficient de negativă pentru a se produce reacția de reducere, deci produsul A- are concentrație 0.

pe acest palier reducerea are loc deoarece tensiunea este suficient de negativă pentru a produce reducerea speciei A la A-; de reținut este faptul că, concentrația speciei A descrește în vecinătatea suprafeței electrodului deoarece A se transformă în A-; produsul de reacție A- este generat la suprafața electrodului și concentrația sa este mică pe măsură ce distanța față de electrod crește.

specia A descrește în concentrație către suprafața electrodului, de aceea procesul de reducere necesită difuzia lui A din masa de soluție către suprafața electrodului.

specia A este deja consumată în vecinătatea suprafeței electrodului, zona lipsită de A crește în grosime cât timp potențialul electrodului este suficient de negativ pentru a converti A la A-.

în acest punct nu mai este curent anodic, tensiunea nu este suficient de mare pentru a cauza oxidarea speciei A-; curentul catodic provine de la difuzia lui A către electrodul din masa de soluție și reducerea sa.

concentrația speciei A crește la suprafața electrodului și apoi descrește din nou înainte de a ajunge înapoi la valoarea sa maximă din masa de soluție; reacția de oxidare convertește pe A- înapoi la A, deoarece conversia lui A- la A abia a început, doar o porțiune din zona sărăcită în A își mărește concentrația.

este porțiunea pe care concentrațiile speciilor A și A- încep să revină la valorile inițiale, acest fapt se petrece deoarece moleculele de produs sunt convertite înapoi în molecule de reactant la potențiale pozitive mult mai mari decât potențialele inițiale pentru aceasată reacție.

În vederea obținerii unei voltamograme se efectuează un baleiaj catodic al potențialului, măsurat față de un electrod de referință adecvat în soluție neagitată, iar apoi unul anodic. Intensitatea de curent se determină față de o linie mediană orizontală. Curbele obținute prezintă zone crescătoare, explicabile prin creșterea exponențială a curentului cu potențialul de electrod și zone descrescătoare, cauzate de epuizarea speciei reactive de la electrod și îngroșării stratului de difuzie.

Cei mai importanți parametrii în voltametria ciclică sunt picurile potențialelor (Epc, Epa) respectiv picurile de curent (ipc, ipa). Procesul de transfer al electronilor se poate compara cu orice alt proces (ca difuzia), reacția fiind reversibilă electrochimic iar rezoluția picurilor este:

ΔEp = │Epa – Epc│ = 2,303.RT/nF

Astfel, pentru o reacție redox reversibilă la 25°C, cu un transfer de n electroni, ΔEp ar trebui să fie 0,0592/n V sau aproximativ 60 mV pentru un electron transferat. În practică această valoare este greu de atins din cauza unor factori ce implică rezistența electrică a celulei.

Potențialul de reducere formal (E0) pentru un cuplu reversibil este:

Pentru o reacție reversibilă concentrația analitului are legătură cu intensitatea curentului și se exprimă prin expresia Randels-Sevick:

ip = 2,686.105.n3/2.Ac0.D1/2.v1/2, unde,

Ip – intensitatea curentului, A;

A – aria electrodului, cm2;

D – coeficientul de difuzie, cm2/s;

c0 – concentrația, mol/L;

v- viteza de scanare, V/s.

Când concentrația substanței de analizat este mică, un parametru foarte important de luat în considerare este contribuția curentului de fond. Acest curent de fond este compus dintr-un curent faradaic provocat de impuritățile din soluție și un curent non faradaic. Acesta din urmă nu poate fi eliminat din experiment și rezultă din curentul stabilit între electrolit și electrod. Curentul faradaic produs de impuritățile din soluție este ilustrat calitativ în figura 18 pentru o viteză de scanare de 0,1V/s, unde se poate remarca absența vârfului picului.

În concluzie, voltametria ciclică (dar și celelate tipuri de voltametrii) se desfășoară în soluții neagitate care asigură o bună desfășurare a fenomenului de difuzie.

II. 2. 2. 3. Metode voltametrice puls-diferenȚiale

În vederea creșterii sensibilității și a vitezei de lucru, de-a lungul timpului au fost încercate câteva forme de modulare a potențialului.

Undele voltametrice cu formă pulsată sunt preferate tehnicilor cu baleiere liniară deoarece îmbunătățesc deosebirile față de curenții de fond mai ales față de dublul strat de sarcină.

Wang și Dewald [46] au determinat rapid prin voltametrie puls diferențială acetaminofenul, dopamina, acidul cafeic, clorpromazina, precum și unele metale (cupru, plumb și cadmiu) cu o baleiere a potențialului de 0,1 V/s.

În continuare în figura 19 sunt prezentate trei dintre aceste tehnici și anume: voltametria puls normală (A), voltametria puls diferențială (B) și voltametria cu unde pătrate (square-wave voltammetry) (C):

Voltametria puls-normală (NPV)

Această tehnică folosește o serie de pulsuri de tensiune crescătoare ca amplitudine [47 – 55]. Curentul se măsoară la sfârșitul fiecărui impuls. Această metodă folosește în general ca și electrod DME sau electrozi solizi. Potențialul măsurat are valoarea pentru potențialul inițial Ei. Durata pulsului, τ, este de 1-100 msec. iar durata între pulsuri este de 0,1-5,0 sec. Voltamograma reprezintă variația curentului în funcție de pulsurile de tensiune aplicate (figura 20)

Creșterea obișnuită a potențialului (ΔE) este de 2 mV. Curentul limită faradaic se poate calcula cu ecuația Cottrell:

, unde:

(τ – τ’) – timpul după puls;

aria electrodului.

Polarografia puls-normală se utilizează cu succes în analizele in vivo cu electrozi solizi.

Voltametria puls-diferențială (DPV)

Această tehnică este comparabilă cu voltametria puls-normală în care potențialul este de asemenea scanat cu o serie de pulsuri. Totuși se deosebește de NPV prin faptul că pulsul de potențial este fix, de amploare mică (de la 10 la 100 mV) și este suprapus cu o modificare lentă a potențialului. Curentul se măsoară de două ori pentru fiecare puls de tensiune aplicat și anume o dată înaintea aplicării pulsului și a doua oară la sfârșitul pulsului. Acest tip de măsurători ține seama de curentul nonfaradaic. Diferența dintre valorile curentului între cele două măsurători per impuls este determinată de baza potențialului (figura 21).

Expresia picului curentului este [55]:

, unde .

Expresia picului potențialului este:

Această metodă se poate utiliza cu succes la determinarea urmelor de metale dar și a unor amestecuri complexe de metale [56 – 60].

Analiza stripping voltametrică

Metodele electroanalitice clasice permit determinarea compușilor organici și anorganici până la concentrații de 10-4 – 10-5 M. Așa numitele metode stripping permit extinderea limitelor de detecție până la ppm și chiar ppb.

Termenul electrochimic de analiza stripping este un procedeu ce presupune o concentrare urmată de determinarea pe un electrod de lucru direct sau indirect prin diverse tehnici de analiză [61, 62].

Analizele stripping sunt tehnici electrochimice extrem de sensibile pentru determinarea urmelor de metale. Sensibilitatea remarcabilă este atribuită combinării unei etape efective de preconcentrare cu procedee avansate de măsurare, care generează un raport favorabil semnal/fond.

Prin preconcentrarea metalelor la electrod cu un factor de 100-1000, limitele de detecție coboară cu 2-3 ordine de mărime în comparație cu determinările voltametrice, în fază de soluție.

În principal, analizele stripping cuprind două etape. Prima, etapa de depunere, implică depunerea electrochimică a unei cantități mici de ioni metalici din soluție pe Hg, în scopul preconcentrării metalelor după care urmează etapa stripping (etapa de determinare) care implică dizolvarea (striparea) depozitului.

Etapa crucială în experimentele stripping este preconcentrarea, în care are loc acumularea analiților pe electrodul de mercur (picătură de mercur) sau alți electrozi, în concentrații de până la 1000 ori mai mari decât concentrația în volumul soluției.

Condițiile de preconcentrare și durata acestui proces determină atingerea unor limite de detecție apreciabile. Etapa următoare este urmărirea răspunsului electrochimic al speciilor preconcentrate, în timpul procesului invers de oxidare anodică.

Există un număr mare de metode stripping care diferă prin metoda de acumulare (depunere electrochimică sau prin electrosorbție) dar și prin metoda de determinare (voltametrică sau potențiometrică).

Astfel o combinație chimică se poate acumula efectiv, putându-se determina cu o limită de sensibilitate foarte mică în analiza de urme. O metodă stripping originală constă în electrodepunerea catodică a metalului sub formă de amalgam pe o picătură de mercur suspendată (electrod indicator) urmată de determinarea voltametrică anodică a metalului acumulat prin scanarea potențialului [63].

Se cunosc numeroase metode de analiza stripping prin diferite metode de acumulare și analiză. Termenul de anodic stripping voltammetry (ASV) a fost utilizat prima dată pentru acumularea catodică a metalului sub formă de amalgam urmată de determinarea anodică.

Determinarea directă a ionului metalic prin reducere catodică a adsorbției complexului s-a efectuat cel mai frecvent prin voltametrie stripping catodică care în general se numește adsorbtive cathodic stipping voltammetry (AdCSV). Determinarea directă a substanțelor organice se efectuează frecvent prin voltametrie stipping adsorbtivă [64] sau voltametrie stripping catodică [65].

Posibilitatea utilizării acestor metode devine din ce în ce mai importantă deoarece acestea prezintă avantajul unui preț de cost mult mai redus decât al altor metode, de ex. al metodelor de emisie în plasmă cuplată inductiv.

Voltametria cu redizolvare anodică (voltametria stripping –AdSV)

Voltametria stripping anodică este metoda cea mai utilizată din categoria metodelor stripping. Această tehnică este o metodă de depunere pe un electrod picătură de mercur suspendată (diferența față de polarografie), etapă care este urmată de redizolvarea metalului redus la catod prin oxidare anodică.

În acest caz, metalele sunt preconcentrate prin electrodepunere pe electrod de Hg, de volum mic (un film subțire de Hg sau picătură suspendată de Hg). Preconcentrarea se face prin depunere catodică, la potențial și timp controlat. Potențialul de depunere este, de obicei, cu 0,3-0,5V mai negativ decât E0 al ionului metalic cel mai dificil de redus. Ionii metalici ajung la electrodul de Hg prin difuzie și convecție, unde sunt reduși și concentrați sub formă de amalgam:

Mn+ + ne- + Hg = M(Hg)

Măsurătorile se efectuează cu ajutorul electrodului de mercur, fie Hanging Mercury Drop Electrode (HMDE), fie Thin Mercury Film Electrode (TMFE); uneori se utilizează și electrodul de argint.

Există avantaje și dezavantaje în ceea ce privește alegerea unui anumit electrod de lucru. TMFE este mai stabil decât HMDE, ceea ce permite realizarea etapei de preconcentrare într-un regim mai intens de agitare, favorizând astfel procesul. Astfel se poate lucra cu timpi de preconcentrare, mai mici. În ceea ce privește reproductibilitatea, se știe că suprafața picăturii de mercur, mai ales în condițiile unei creșteri controlate, este deosebit de reproductibilă, în timp ce proprietățile filmului de mercur depind mult inclusiv de natura suportului (carbon, platină, etc).

Pentru determinarea mercurului sau a altor metale cu potențiale de oxidare mai pozitive (Au, Ag) s-au utilizat electrozi solizi, ca de exemplu carbonul vitros. Interacțiunile dintre suprafața electrodică și electrolitul cu compoziție complexă au dus, de multe ori la apariția unor picuri stripping suplimentare, care influențează rezultatele determinărilor. Toate aceste inconveniente se minimizează prin prepararea corespunzătoare a suprafeței electrodice și prin optimizarea potențialului de depunere.

În cazul AdSV trebuie ținut cont de următoarele inconveniente:

Suprapunerea vârfurilor cauzată de apropierea potențialelor de oxidare (ex. Pb, Ti, Cd)

Prezența unor compuși tensioactivi care se absorb pe Hg și inhibă depunerea metalului

Cunoașterea acestor dezavantaje duce la prevenirea lor prin acordarea unei atenții mărite etapelor importante (selectarea potențialului de depunere sau a alegerii judicioase a electrolitului).

Creșterea sensibilității poate fi realizată prin realizarea tehnicilor cu doi electrozi de lucru cum ar fi AdSV prin însumare și AdSV prin diferență.

Din punct de vedere practic, voltametria cu redizolvare anodică se desfășoară urmând mai multe etape, astfel:

Se realizează un montaj potrivit, cu o celulă de cca 100 mL din cuarț topit pentru a preveni pierderile de metale grele prin adsorbție pe sticlă sau prin schimb ionic cu acesta sau contaminarea probei cu metale din sticlă

Se introduce soluția de analizat, după îndepărtarea aerului (O2) cu un curent de azot și toată determinarea se efectuează în atmosferă de azot

Se introduc electrozii indicator (picătură de mercur suspendată sau carbon vitros acoperit cu un film de mercur), de referință SCE și un electrod de contact din cuarț care are la capătul ce se introduce în soluție wolfram; se mai introduce un agitator magnetic

Se aduce electrodul picătură de mercur suspendată la un potențial constant, se agită soluția cu o viteză constantă și se execută electroliza într-un interval de timp de 1-30 min când o fracțiune din cantitatea de ion metalic se depune pe electrod, formând cu acesta un amalgam:

Mn+ + ne- M0(Hg) faza de electroliză

În această fază se realizează o preconcentrare de zeci, sute sau chiar mii de ori a ionului metalic existent, fie și în ultraurme, în proba anlizată

Se oprește agitația și se micșorează progresiv diferența de potențial între electrodul de mercur și cel de referință, când are loc redizolvarea metalului depus pe elctrodul picătură de mercur:

M0(Hg) – ne- Mn+ + Hg

Pentru a obține rezultate reproductibile și cantitative este necesară atât stăpânirea și controlul riguros al parametrilor electrochimici, cât și agitarea soluției probei, dezaerarea, mărimea electrodului de lucru (indicator) și durata electrolizei, deci a timpului de depunere a metalului prin reducere catodică.

Voltametria cu redizolvare anodică este sensibilă în domeniul 0,1 – 0,01 ppb atunci când se lucrează cu electrod de grafit cu film de mercur.

Voltametria cu dizolvare anodică se poate utiliza la preconcentrarea ultraurmelor de metale grele cu o sensibilitate de 10-8 – 10-10 M, chiar din matrici complexe, erorile fiind mici în comparație cu alte metode, care sunt contaminate. Viteza de scanare se poate regla la 16,25; 33,41; 50 mV/s, perioada maximă de scanare este de 60 s, ceea ce face posibilă o scanare maximă de 3 V într-o mișcare continuă. Celula de determinare se termostatează prin imersare într-o baie de apă la 30±0,1°C. Un alt factor important pentru obținerea unor rezultate reproductibile și de încredere este puritatea mercurului din electrodul indicator, care este un mercur tridistilat, filtrat de două ori, tratat timp de 24 ore cu NaOH 10% și spălat cu HNO3 10% alte 10 ore. Apoi se adaugă din nou acid azotic 10% pentru 24 ore, după care se clătește bine cu apă pură de gradul 2, se filtrează de 2 ori pe hârtie de filtru foarte curată pentru îndepărtarea apei. Dezaerarea trebuie să se facă pentru toate probele timp de cel puțin 20 minute cu azot pur [1].

În funcție de tipul electrodului folosit pentru “depunere” și tehnica folosită, avem diferite limite de detecție pentru metodele stripping (tabelul 3):

Analog cu cele descries anterior se poate efectua și în cazul benzodiazepinelor.

Voltametria stripping puls-diferențială adsorbtivă

Această tehnică se aseamănă cu voltametria puls diferențială cu redizolavare anodică, dar se deosebește de aceasta prin aceea că ionul metalic analizat nu se concentrează pe electrodul picătură de mercur suspendată prin reducerea catodică, ci prin adsorbție sub forma unui complex chelat oarecare.

Multe specii organice (ca de exemplu: hemul, clorpromazina, codeina, cocaina) au putut fi determinate în concentrații micromolare și nanomolare utilizând AdSV; de asemenea au fost dozate chiar și specii anorganice.

PARTEA III: Contribuții proprii la studiul electrochimic al unor benzodiazepine folosind electrozi benzodiazepinici selectivi

Realizarea unor electrozi noi care să fie sensibili și selectivi, care să aibă un timp de răspuns cât mai mic ne permite să se poată detecta în anumite condiții experimentale numai o anumită benzodiazepină dintr-un amestec de mai multe benzodiazepine cu o limită de detecție cât mai mică. Totuși, se poate face abstracție în cazul unei selectivități mai puțin bune prin cuplarea metodei de detecție electrochimică cu o metodă de separare a componenților din amestec (de ex: cromatografie de lichide de înaltă performanță care folosește un detector electrochimic, LC-EC, electroforeza capilară și chiar in vivo). [66, 67, 68]

Lipsa de selectivitate a acestor electrozi față de unii compuși înrudiți chimic se compensează prin separarea lor prealabilă folosind alte metode, de exempul cromatografice.

Se cunosc mai multe metode de elaborare a unor electrozi selectivi pentru diferite benzodiazepine prin incorporarea unor modificatori în pasta de carbon preparată în diferite proporții din pudră de carbon și ulei de parafină, parafină solidă, dioctil ftalat (DOP), o-nitrofenil octileter (o-NPOE), etc. [69 – 73 ]. O altă metodă de a obține electrozi selectivi este aceea de a îngloba într-o membrană cu PVC anumiți compuși de asociație ionică obținuți din benzodiazepine și tetrafenilborat de sodiu (TPB), sare Reinecke (Rn) [74], heteropoliacizi (HP), tetraiodomercuriat de potasiu, tetraiodobismutat de potasiu, etc. Acești electrozi se folosesc în analize clasice cum ar fi cele potențiometrice sau voltametrice. În cazul analizei stripping potențiometrice sau voltametrice adsorbtive se folosesc electrozi pastă de carbon în care este incorporat un modificator adsorbtiv (diferite tipuri de argile: caolin, montmorilonită, bentonită, sepiolit, zeolit, etc) [75, 76] sau pastă de carbon acoperită cu un film subțire de mercur sau bismut.

Metodele electrochimice care utilizează electrozi membrană specii chimice selectivi pentru determinarea unor substanțe medicamentoase, sunt frecvent folosite la determinarea cantitativă a acestora [1]. Aceasta se datorează sensibilității crescute a acestora precum și selectivității lor mari pentru speciile analitice în raport cu speciile străine.

Dintre metodele electroanalitice folosite, potențiometria, dar în special voltametria cu baleiaj liniar (LSV), voltametria ciclică (CV), alături de metodele stripping adsorbtive, unde putem aminti atât potențiometria cât și voltametria, prezintă avantaje deosebite și performanțe analitice remarcabile cu limite de detecție din soluții de concentrații 10-6 – 10-10 mol/L.

În acest context se înscrie și preocuparea noastră în vederea realizări unor electrozi ion selectivi pentru diferite benzodiazepine.

În prima etapă, pornind de la studiile efectuate de A. Salem ș.a. [69] care au construit un electrod ion selectiv având incorporat în membrana selectivă un complex de asociație ionică, mai exact o pereche de ioni [diazepam]+.[tetrafenil borat]- folosind ca matrice policlorura de vinil și poliuretan, s-a încercat construirea unui electrod diazepam selectiv membrană PVC necesar dozării diazepamului.prin titrare potențiometrică unde s-a măsurat diferența de potențial între un electrodul respectiv și un electrod de referință, în condițiile unui curent nul.

În cadrul dozărilor potențiometrice s-au utilizat doi electrozi indicatori: electrod membrană PVC ion selectiv și electrod pastă de carbon modificat ion selectiv între care s-a efectuat o comparație din punct de vedere al performanțelor.

S-a ales varianta utilizării electrozilor cu membrană modificată deoarece aceștia conferă metodelor electroanalitice următoarele avantaje:

Specificitate;

Selectivitate;

Sensibilitate, care poate ajunge ușor la 10-10 mol/L;

Permit preconcentrarea analiților prin analize stripping voltametrice sau potențiometrice;

Analiza se poate efectua în medii acide, neutre sau bazice și apoase sau neapoase;

Simplitatea și rapiditatea se concretizează prin evitarea etapei de pretratare și pregătire;

Răspuns analitic rapid;

Cost relativ mic.

În cazul nostru, s-au preparat următorii electrozi:

Electrod diazepam selectiv membrană PVC

Electrod pastă de carbon diazepam selectiv

Electrod pastă de carbon flunitrazepam selectiv

Electrod pastă de carbon bromazepam selectiv

Electrod pastă de carbon nemodificat și modificat cu caolin

Utilizând acești electrozi s-au efectuat studii privind optimizarea lor în vederea analizei calitative și cantitative a diazepamului. Totodată s-au întreprins studii referitoare la stabilirea condițiilor optime de analiză, stabilirea stoechiometriilor reacțiilor chimice, validarea metodelor electrochimce elaborate, stabilirea domeniilor de liniaritate răspuns-concentrație și a sensibilității detecției în comparație cu alte metode.

III. 1. Electrod ion selectiv membrană PVC modificată

Electrozii membrană policlorură de vinil (PVC) sunt electrozii ion selectivi cel mai frecvent folosiți în determinările potențiometrice [77]. Electrodul membrană PVC este constituit dintr-un corp electrodic pe care se fixează membrana polimerică prin lipire sau prin atașare la corpul electrodului cu ajutorul unui manșon de cauciuc. Prin intermediul soluției interne se asigură contactul electric între membrana sensibilă a electrodului și referința internă de Ag/AgCl, KCl sat. (figura 22).

Componenta cea mai importantă a unui electrod membrană ion selectiv este membrana ion selectivă care conține următoarele componente:

polimerul sau suportul membranei;

plastifiantul, care este un solvent organic ce înglobează ionoforul și care „leagă” componenții membranei;

ionoforul, care este ligandul sau agentul de complexare ce leagă selectiv analitul.

1. Polimerul cel mai utilizat este policlorura de vinil (PVC) care este folosită la prepararea membranei ion-selective. Pe lângă acesta mai pot fi folosiți și alți polimeri ca: polistiren, polvinilpirolidină, etc.

2. Plastifiantul este un solvent organic cu rolul de a determina o „înmuiere”, o plastifiere a PVC-ului, altfel acesta nu s-ar preta pentru membrane ion-selective. Pe de altă parte rolul său este de a dizolva și repartiza uniform ionoforul. Cel mai adesea se folosesc ca și plastifianți dioctilftalat (DOP), dibutilftalat (DBP) și orto-nitrofeniloctil eter (o-NPOE).

3. Ionoforul este molecula care determină selectivitatea membranei. În majoritatea cazurilor de preparare a unei membrane ion selective ionoforul se adaugă într-o proporție de aproximativ 1% (m/m) raportat la membrană sau 10-2 M dacă se raportează la plastifiant, proporția acestor componente din structura membranei fiind importantă pentru optimizarea performanțelor electrodului.

Electrozii fără plastifiant prezintă câteva avantaje importante față de electrozii ce conțin plastifiant. Astfel, există unele situații nedorite când plastifiantul este extras din membrană în soluția de analizat, ceea ce poate avea următoarele consecințe:

electrodul respectiv nu poate fi folosit la analiza „in vivo”, plastifiantul ajungând în lichidele biologice unde poate determina apariția unor reacții adverse grave.

prin pierderea plastifiantului din membrană, se schimbă compoziția membranei care are ca rezultat instabilitatea electrodului în timp.

Construcția unui astfel de electrod cu matrice PVC de tip membrană selectivă cu cation de diazepam utilizat la determinarea potențiometrică a diazepamului se bazează pe asocierea cationului de diazepam cu anionul sării Reinecke. Caracterizarea electrodului s-a efectuat conform recomandărilor IUPAC, acesta fiind utilizat la detecția și determinarea cantitativă a diazepamului.

III. 1. 1. Prepararea complexului de asociație ionică a diazepamului

Se cântăresc la balanța analitică 100 mg diazepam care se dizolvă în volumul minim de soluție HCl 0,1N într-un flacon conic, după care se adaugă 80-100 mL apă bidistilată. Peste acestă soluție se adaugă picătură cu picătură sub agitare continuă soluție apoasă de sare Reinecke (Rn) 1% în mic exces (sau acid fosfowolframic, respectiv acid fosfomolibdenic). Precipitatul format se lasă 30-40 min la rece (gheață) după care se filtrează prin creuzet filtrant G4. Precipitatul se spală cu 2-3 mL soluție apoasă de sare Reinecke 0,1% și cu 2-3 mL apă bidistilată după care se usucă în etuvă la 80°C până la greutate constantă [78].

Reacțiile care are loc sunt următoarele:

C16H13ClN2O.HCl + NH4[Cr(NCS)4(NH3)2]→

clorhidrat de diazepam reineckat de amoniu

→[C16H13ClN2OH] + [Cr(NH3)2(NCS)4]- + NH4Cl

reineckat de diazepam (Dz-Rn)

3C16H13ClN2O.HCl + H3[P(W3O10)4] → (C16H13ClN2OH)+3 [P(W3O10)4]- + 3HCl

fosfowolframat de diazepam (Dz-W)

3C16H13ClN2O.HCl + H3[P(Mo3O10)4] → (C16H13ClN2OH)+3 [P(Mo3O10)4]- + 3HCl

fosfomolibdat de diazepam (Dz-Mo)

Cei trei complecși de asociație ionică preparați mai sus, au fost folosiți la prepararea pastei de carbon modificate diazepam selective, iar pentru prepararea membranei PVC-diazepam selective s-a folosit numai reineckatul de diazepam.

III. 1. 2. Determinarea punctelor de topire și a solubilității complecșilor cu diazepam

În prealabil s-au determinat punctele de topire ale complecșilor și s-au efectuat testele de solubilitate ale acestora (tabelul 4). Punctul de topire a fost determinat prin introducerea unei cantități mici de substanță într-o capilară care la rândul ei s-a introdus în orificiul unei plite electrice a unui aparat Boetius.

Solubilitatea complecșilor în diferiți solvenți a fost determinată prin dizolvarea a 5 mg substanță în 2-3 mL solvent și observarea gradului de solubilitate.

– = greu solubil; + = puțin solubil; ++ = solubil; +++ = foarte solubil

III. 1. 3. Titrarea potențiometrică a diazepamului folosind electrod ion selectiv membrană PVC modificată

Pentru prepararea membranei electrodului ion selectiv de diazepam s-au întrebuințat următoarele substanțe de puritate analitică:

Policlorură de vinil (PVC) – Merck, Germania;

Dioctilftalat (DOF) – Merck, Germania;

Diazepam – Labormed Pharma, București, România;

Reineckat de diazepam – preparat în laborator din Diazepam (LaborMed Pharma, București) și sare Reinecke (Rearal, Budapesta, Ungaria)

Tetrahidrofuran (THF) – Merck, Germania.

Construcția electrodului

În scopul preparării membranei s-au dizolvat 190 mg PVC în 0,35 mL dioctilftalat, folosit ca și plastifiant, (s-a încercat și cu dibutilftalat, dar rezultatele au fost inferioare cazului în care s-a folosit dioctilftalat), în care s-au incorporat 10 mg combinație complexă dizolvată în 5 mL tetrahidrofuran. Compoziția a fost lăsată în repaus 24 h la temperatura camerei pentru evaporarea tetrahidrofuranului. Membrana de PVC astfel obținută a fost folosită la construirea EIS având ca și electrod intern electrodul de Ag/AgCl. Soluția de umplere a corpului electrodului a fost obținută prin amestecarea unei soluții de KCl 10-1N și soluție diazepam 10-2N în raport volumetric de 1:1.

Înainte de utilizare, electrodul a fost condiționat 2 ore într-o soluție de diazepam 10-3N. Electrodul se păstreză în aer atunci când nu se folosește.

În cazul deteriorării membranei, aceasta se înlocuiește relativ ușor cu o membrană nouă. Se recomandă să se folosescă membrana proaspăt preparată pentru a asigura reproductibilitatea determinărilor.

Metoda potențiometrică de dozare a diazepamului a fost validată prin următorii parametrii: liniaritate, acuratețe, precizie (repetabilitate și reproductibilitate), limită de detecție și cuantificare, robustețe [79, 80].

Liniaritate

Liniaritatea rezultatelor analitice a fost evaluată prin calcularea dreptei de regresie și calcularea coeficientului de corelație.

Utilizând electrodul ion selectiv s-a măsurat potențialul unui set de 7 soluții de diazepam cu concentrații cuprinse între 10-2M și 10-8M folosind ca și electrod de referință electrodul Ag/AgCl și un pH-metru Methrom pentru celula potențiometrică simbolizată astfel:

Ag/AgCl, KNO3 //DzH+Cl-, KNO3//EIS

Măsurătorile au fost repetate de 3 ori pe același set de soluții, valorile medii regăsindu-se în tabelul 6:

Valorile înregistrate ale potențialului exprimate în mV, pentru domeniul liniar de concentrații, au fost supuse prelucrării statistice prin metoda celor mai mici pătrate, obținându-se ecuația dreptei de regresie: y = -36,5x +180 (figura 23) și coeficientul de corelație egal cu 0,9906 ceea ce confirmă liniaritatea bună potențial-concentrație pentru domeniul de concentrație 10-2 – 10-6 M.

Potențialul standard al electrodului s-a calculat folosind relația:

E = E0 + S.log[Dz.HCl] = 182,26 mV

2. Acuratețea (exactitatea)

Exactitatea exprimă concordanța dintre valoarea adevărată și rezultatul analitic obținut în urma măsurătorilor. Evaluarea exactității se face prin calcularea procentului de regăsire (cantitatea de substanță cunoscută adăugată în proba de analizat).

Exactitatea metodei s-a determinat prin titrarea potențiometrică astfel: s-a preparat o soluție stoc de diazepam 10-2N din care s-au luat cote părți (10, 12, 16, 20 respectiv 22 mL) și 10 mL tampon acetat (pH =4,65) care s-au introdus în celula de titrare. Ca reactiv titrant s-a folosit soluție de reineckat de amoniu 10-2M. S-a folosit cuplul de electrozi EIS – Ag/AgCl, KCl sat., în tabelul 7 fiind prezentate variațiile potențialului în funcție de volumul de titrant adăugat graficele respective (figura 24) pentru o determinare.

S-au efectuat câte 3 determinări pentru fiecare volum de soluție, valorile medii obținute pentru fiecare caz în parte regăsindu-se în tabelul 8:

Regăsirea medie este 99,11%, iar deviația relativă standard (RSD) în acest caz este de 0,284%, ceea ce înseamnă că metoda de dozare este exactă.

3. Repetabilitatea

Repetabilitatea – exprimă fidelitatea în condiții identice de obținere a rezultatelor analitice de către același analist, cu același echipament tehnic, în intervale de timp scurte, cu aceeași reactivi. Rezultatele se exprimă prin abaterea standard a repetabilității și prin coeficientul de variație a repetabilității (abaterea relativă standard). Cu cât abaterea standard este mai mică cu atât rezultatele analitice sunt mai apropiate de media aritmetică iar precizia e mai mare.

Aceasta fost determinată prin dozarea a 3 soluții probă de clorhidrat de diazepam 10-2 M în aceeași zi. S-au efectat trei măsurători s-a calculat abaterea standard (SD) și abaterea standard relativă (RSD) (tabelul 9).

4. Reproductibilitatea

Reproductibilitatea – exprimă fidelitatea în condiții experimentale efectuate în zile diferite. Rezultatele sunt exprimate prin abaterea standard a reproductibilității și prin coeficientul de variație a reproductibilității (abaterea relativă standard). Analog, cu cât abaterea standard este mai mică cu atât rezultatele analitice sunt mai apropiate de media aritmetică iar precizia e mai mare.

Reproductibilitatea fost determinată prin analiza a 3 soluții probă de clorhidrat de diazepam 10-2 M în trei zile consecutive. S-au efectat trei măsurători, media lor regăsindu-se în tabelul 9. S-a calculat abaterea standard (SD) și abaterea standard relativă (RSD).

5. Limita de detecție și limita de cuantificare

Limita de cuantificare este de aproximativ 3x mai mare decât limita de detecție și reprezintă cantiatea minimă de analit care se poate doza dintr-un amestec în condițiile experimentale descrise, cu o fidelitate și o exactitate definită.

Prin metoda grafică s-a stabilit concentrația minimă detectabilă ca fiind 0,285 μg/mL, iar limita de cuantificare 0,863 μg/mL.

6. Optimizarea metodei

Pentru a optimiza metoda de dozare a diazepamului folosind electrodul diazepam selectiv au fost urmărite:

influența pH-ului: determinarea intervalului optim de pH în care electrodul diazepam selectiv are un răspuns optim s-a realizat prin monitorizarea potențialului odată cu modificarea valorii pH-ului pentru o soluție de clorhidrat de diazepam 10-4M prin adăugarea în porțiuni a unei soluții de NaOH 0,1 N.

Din figura 25 se poate constata că acest electrod poate fi utilizat în domeniul de pH = 2,8 – 5,4, ceea ce este în concordanță cu afirmațiile referitoare la abaterile de la liniaritate a electrodului în soluții puternic acide sau în soluții alcaline. La valori mai mari ale pH-ului, potențialul se modifică mult, ca urmare a pierderii progresive de sarcină pozitivă odată cu creșterea pH-ului.

timpul de răspuns: a variat între 30 – 60s pentru soluții de diazepam concentrate (10-2M) respectiv pentru soluții diluate (10-6 M)

selectivitatea electrodului: pentru aceasta au fost preparate soluții de diazepam (i) și ion secundar (j) (interferent) de concentrații identice (10-3 mol/L). La alegerea interferenților s-a ținut cont ca aceștia să se găsescă în lichidele biologice, să prezinte structuri asemănătoare cu diazepamul sau să constituie excipienți care se găsesc în comprimatele de diazepam.

Coeficientul de selectivitate, , s-a calculat prin metoda Srinivisan și Rechnitz [81]:

, unde

– potențialul unei soluții de interferent;

– potențialul unei soluții de diazepam protonat;

S – panta dreptei de calibrare/decada de concentrație;

[DzH+] – concentrația soluției de diazepam protonat;

[J+]- concentrația soluției de interferent (Na+, K+, etc).

Determinările coeficientului de selectivitate au fost efectuate atât în soluție de DzH+Cl- și soluție de interferent luate separat Kij (1) cât și în amestec de soluții DzH+Cl-interferent Kij (2).

Selectivitatea electrodului este bună în prezența unor cationi comuni a căror interferență este neglijabilă așa cum rezultă din tabelul 8, în care sunt prezentați coeficienții de selectivitate potențiometrică a electrodului studiat.

Au fost realizate câteva măsurători și pentru soluții de interferenți mai concentrate de 10 ori decât soluția de diazepam, dar electrodul prezintă o oarecare interferență în acest caz.

Determinarea diazepamului din forme farmaceutice

Electrodul ion selectiv a fost utilizat la determinarea cantitativă a diazepamului din forme farmaceutice prin titrare potențiometrică. S-a lucrat cu comprimate de Diazepam conținând 10 mg substanță activă/cpr. (Terapia, Cluj-Napoca, România) care conțin pe lângă diazepam, lactoză, stearat de magneziu, dioxid de siliciu coloidal și celuloză microcristalină.

S-a determinat masa medie a unui comprimat de 200,73 mg, prin cântărirea a 30 comprimate care s-au triturat și din care s-au cântărit la balanța analitică 5,714 g pulbere ce a fost adusă cantitativ într-un flacon Erlenmeyer peste care s-a adăugat aproximativ 40-50 mL cloroform, s-a agitat 10-15 minute pentru dizolvarea diazepamului și s-a filtrat. Filtratul obținut s-a încălzit la 45°C până la completa evaporare a cloroformului iar reziduul s-a dizolvat în 40-50 mL soluție tampon acetat (pH = 4,6) (s-a adăugat acid acetic glacial până la dizolvarea completă a diazepamului), după care s-a adus cantitativ într-un balon cotat de 100 mL. Volume diferite din soluția astfel obținută s-au titrat cu soluție apoasă de sare Reinecke 10-2M folosind cuplul de electrozi Ag/AgCl-EIS.

S-au efectuat câte 6 titrări pentru volume de 10, 12, 16, 18, 20 și 22 mL soluție diazepam 10-2 M luată în lucru, în tabelul 11 fiind trecute cantitățile de diazepam luate în lucru și cele găsite, dar și calculul statistic aferent acestor dozări.

Deviația relativă standard (RSD) în acest caz este de 0,41%, valoare subunitară, ceea ce înseamnă că electrodul diazepam selectiv este corespunzător dozării diazepamului. Regăsirea medie obținută (99,08%) corespunde la 9,908 mg/cp diazepam, ceea ce indică că produsul analizat a corespuns prevederilor FR X referitoare la conținutul în substanță activă (9 – 11 mg/cp).

Concluzii

A fost construit și caracterizat un electrod cu matrice PVC dopată cu reineckat de diazepam cu ajutorul căruia s-a determinat cantitativ diazepamul din comprimate prin titrare potențiometrică, metodă ce a fost validată.

Metoda de titrare potențiometrică a diazepamului cu electrod diazepam-selectiv este simplă, rapidă, timpul de răspuns al electrodului este scurt, ea fiind relativ puțin costisitoare. Electrodul se prepară și se întreține ușor.

III. 2. Electrod pastă de carbon modificat diazepam selectiv

Electrozii pastă de carbon diazepam selectivi confecționați au fost modificați cu următorii complecși de asociație ionică: reineckat de diazepam, fosfomolibdat de diazepam și fosfowolframat de diazepam, complecși a căror preparare a fost descrisă anterior.

Prepararea pastei de carbon modificată diazepam selectivă

Pentru prepararea electrodului pastă de carbon modificat s-au folosit următorii reactivi de puritate analitică:

Pudră de grafit fină, extrapură – Merck

Lianți: – Parafină lichidă – Merck

– Parafină solidă – Merck

– Dioctilftalat (DOP) – Fluka

Reineckat de diazepam – preparat în laborator din Diazepam (LaborMed Pharma, București) și sare Reinecke (Rearal, Budapesta, Ungaria).

Fosfomolibdat de diazepam – preparat în laborator din Diazepam (LaborMed Pharma, București) și acid fosfomolibdenic (Peking’s Reagent, China).

Fosfowolframat de diazepam– preparat în laborator din Diazepam (LaborMed Pharma, București) și acid fosfowolframic (Peking’s Reagent, China).

Prepararea pastei de carbon s-a efectuat astfel: 40 mg pudră de carbon și 15 mg complex anionic s-au triturat bine într-un mojar de sticlă timp de 10 minute după care s-au adăugat 20 μL lichid liant (dioctilftalat, parafină lichidă sau solidă topită la 68-74°C) și s-a amestecat din nou până s-a obținut o pastă omogenă. Electrodul pastă de carbon modificat a fost preparat prin încorporarea în pastă a modificatorului (complexului anionic).

Liantul utilizat la încorporarea grafitului în vederea obținerii pastei de carbon trebuie să fie electroinactiv, inert chimic, nemiscibil cu soluțiile de analiți, nevolatil și lipsit de impurități electroactive.

Confecționarea electrodului pastă de carbon modificat diazepam selectiv

O parte din pasta astfel preparată a fost introdusă și presată într-un tub de PVC cu diametrul de 3 mm unde se realizează un contact electric prin intermediul unui fir de cupru aurit (figura 26).

Excesul de pastă de carbon se îndepărtează prin curățare pe o hârtie luciosă, iar pentru netezirea suprafeței electrodului, pasta de carbon a fost polizată prin frecarea electrodului sub forma numărului 8 pe o hârtie lucioasă fără asperități până la obținerea unei suprafețe cu aspect lucios. Suprafața electrodului pastă de carbon modificată are o arie de 7 mm2 (determinată geometric) și poate fi utilizată pentru 6-8 analize, după care în vederea continuării analizelor este necesară refacerea suprafeței electroactive prin presarea în tub a unei compoziții proaspete de pastă de carbon modificată urmată de aceiași operație pentru obținerea suprafeței lucioase (figura 27).

Soluția stoc de diazepam de concentrație 10-1 M se prepară într-un flacon volumetric de 25 mL prin dizolvarea a 0,71175 g diazepam în 10 mL soluție HCl 10-1 M peste care se adaugă picătură cu picătură soluție de HCl 2M până la dizolvarea completă a diazepamului; pH-ul se ajustează la 2,7 (se măsoară cu un electrod combinat de pH conectat la un multimetru pH/mV, Chemcadet) cu soluție de NaOH 0,1 N și se completează la semn cu soluție de HCl 10-1 M. Dizolvarea diazepamului se efectuează în baia cu ultrasunete. Din această soluție se prepară o serie de diluții de concentrații 10-3 și 10-4 M necesare analizelor ulterioare.

Măsurarea diferenței de potențial a unor soluții cu electrodul pastă de carbon modificat diazepam selectiv cu reineckat de diazepam

În continuare:

S-au stabilit condițiile optime de lucru (soluție electrolit, pH, etc)

S-a caracterizat electrodul pastă de carbon modificat cu reineckat de diazepam și s-a compart cu electrodul diazepam selectiv membrană PVC

Aceste obiective s-au realizat prin adăugarea unor volume cunoscute de soluție de diazepam de diferite concentrații molare la un volum de 5 mL de soluție electrolit, obținându-se soluții de diferite concentrații. Aparatura folosită:

pH-meter OP 208/1 Radelkis, Ungaria;

agitator magnetic;

minielectrod de referință – de argint cu dublă joncțiune, Naposenz, Cluj-Napoca;

minielectrod pastă de carbon modificat, Naposenz, Cluj-Napoca.

Agitarea soluției s-a efectuat permanent cu ajutorul unui agitator magnetic.

Mod de lucru: înainte de măsurarea potențialului s-a spălat electrodul pastă de carbon în vederea hidratării pastei de carbon modificate, după care s-a verificat stabilitatea acestuia din punct de vedere al potențialului măsurat în 3 soluții diferite:

soluție de diazepam 10-3 M în HCl 10-1M și NaOH 10-1M, pH = 2,7;

azotat de poatsiu 10-1 M, pH = 6,6;

tampon acetat, pH = 4,6,

prin scoaterea și reintroducerea electrozilor în soluție până în momentul stabilizării potențialului (tabelul 12) realizându-se astfel condiționarea electrodului.

Potențialul s-a citit atunci când , adică potențialul variază cu mai puțin de 0,6 mV/min.

Valoarea potențialului soluției de acid clorhidric 10-1M cu hidroxid de sodiu 10-1M fără diazepam, la pH = 2,7 este de -66 mV, diferită față de valorea potențialului soluției cu diazepam ceea ce înseamnă că diazepamul modifică valoarea potențialului.

Din tabelul 12 se observă o stabilitate mai bună a electrodului indicator în soluția de diazepam (la ultimele 3 citiri potențialul este aproape constant), urmată de tamponul acetat și în final azotatul de potasiu.

În continuarea studiului, prin titrare potențiometrică directă s-a trasat dreapta de etalonare a electrodului pastă de carbon modificat diazepam-selectiv în diverse soluții de electroliți și la pH-uri diferite.

Soluție de KNO3 10-1M: 0,2525 g KNO3 se aduc cantitativ într-un flacon volumetric de 25 mL, se adaugă apă bidistilată, se dizolvă și se completează la semn cu același solvent.

Tampon acetat pH = 4,6: 1,3600g acetat de sodiu se dizolvă în 10 mL apă bidistilată proaspăt fiartă și răcită se adaugă 0,5945 mL acid acetic glacial și se completează cu același solvent la semn într-un flacon volumetric de 25 mL.

Tampon Britton-Robinson: se prepară separat soluție de CH3COOH 0,04 M (0,06 g acid acetic glacial la b.c. de 25 mL), H3PO4 0,04M (0,098 g acid fosforic la b. c. de 25 mL) și soluție H3BO3 0,04 M (0,05981 g acid boric la b.c. de 25 mL) și se amestecă în părți egale. La 10 mL din acest amestec se adaugă sub agitare continuă soluție de NaOH 0,2 N până se obține pH-ul dorit, măsurat cu un pH-metru prin intermediul unui electrod combinat de pH.

Concret, dintr-o soluție de diazepam 10-1 M s-au preparat soluții de diazepam de concentrații 10-3 M și 10-4 M prin diluarea soluției mai concentrate cu amestec de soluție HCl 10-1 M și NaOH 10-1M în așa fel încât valoarea pH-ului soluției final să fie 2,7.

După un protocol stabilit, la un volum de 5 mL soluție de electrolit (pentru electrolitul Britton-Robinson s-au efectuat două măsurători), s-au adăugat volume bine determinate de soluție de diazepam de concentrații diferite (10-1 M, 10-3 M respectiv 10-4 M), valorile măsurate pentru variația de potențial a celulei de măsurare regăsindu-se în tabelul 13, iar dreptele de etalonare sunt prezentate în figurile 28, 29, 30 și 31.

Domeniul de concentrație al soluției de diazepam pentru analiza acestuia a fost cuprins între 2,2.10-2 M și 2,0.10-7 M .

În figurile 28, 29 și 30 se reprezintă grafic ΔEMF (diferența dintre potențialul soluției electrolit și potențialul soluției rezultate în urma adăugării de diazepam) și logaritmul concentrației soluției rezultate cu semn schimbat, iar în figura 31 este reprezentată variația potențialului în funcție de volumul de diazepam adăugat tamponului Britton-Robinson.

Caracteristicile funcționale pentru electrodul pastă de carbon modificat diazepam selectiv în care s-a incorporat reineckat de diazepam sunt prezentate în tabelul 14 în cele trei medii de reacție folosite (pentru tamponul Britton-Robinson s-au făcut 2 măsurători a căror valori sunt aproximativ egale).

Se observă din tabel că atunci când se lucrează la pH = 4,4 – 4,6, în tampon Britton-Robinson, respectiv tampon acetat valoarea coeficientului de corelație este superioară comparativ cu celălat mediu de reacție. De aceea, în continuare se va avea în vedere caracterizarea electrodului pastă de carbon modificat sub aspectul limitei de detecție, influenței pH-ului, și elaborarea unei metode de determinare cantitativă a diazepamului folosind ca și electrolit suport tampon acetat (pH = 4,6) deoarece valoarea coeficentului de corelație este puțin mai mare decât în cazul tamponului Britton-Robinson.

Timpul de răspuns variază de la 1 la 3 minute, dar poate să fie și mai scurt dacă electrodul este condiționat (menținut) în soluție de electrolit aproximativ 3 ore înainte de utilizare.

III. 2. 1. Titrarea potențiometrică a diazepamului folosind un electrod pastă de carbon modificat diazepam selectiv

III. 2. 1. 1. Electrod pastă de carbon modificat diazepam selectiv cu reineckat de diazepam

Titrarea potențiometrică a diazepamului s-a efectuat folosind 3 tipuri de soluție de titrant (sare Reinecke, acid fosfomolibdenic și acid fosfowolframic) cu ajutorul electrozilor pastă de carbon modificați cu complecșii anionici ai diazepamului cu sare Reinecke, acid fosfomolibdenic respectiv acid fosfowolframic [82].

Pentru titrarea dizepamului cu soluție de sare Reinecke s-a măsurat variația potențialului ca rezultat al adausului unei soluții de reactiv care se combină într-un raport stoechiometric cunoscut cu ionul de interes (diazepamul) astfel încât să conducă la valori similare ale activității sau concentrației cu cele ale standardului. Variația concentrației analitului este rezultatul unei reacții chimice cu o soluție titrantă. Se reprezintă în acest caz variația potențialului în funcție de volumul de titrant adăugat. Concret s-a luat un volum de 5 mL soluție diazepam 2.10-3 M (dizolvat în tampon acetat, pH = 4,6) (0,5694 mg/mL diazepam teoretic) care s-a titrat cu o soluție apoasă de sare Reinecke 10-2 M (3,5444 mg/mL sare Reinecke).

Variația potențialului soluției analizate s-a făcut în raport cu potențialul unui electrod de referință de Ag/AgCl – KCl saturat. S-au folosit doi electrozi indicatori pastă de carbon modificată diazepam selectiv, în care pasta de carbon conține aceeași componenți dar diferă modul de preparare descris în continuare:

E1 reprezintă potențialul măsurat cu un electrod pastă carbon modificat preparat astfel: 40 mg pudră de carbon și 15 mg reineckat de diazepam s-au triturat timp de 10 minute după care s-au adăugat 20 μL dioctilftalat și s-a triturat din nou până s-a obținut o pastă omogenă. (electrod 1)

E2 reprezintă potențialul măsurat cu un electrod pastă carbon modificat (preparat astfel: 40 mg pudră de carbon și 10 mg reineckat de diazepam s-au triturat timp de 10 minute după care s-a adăugat 1 mL tetrahidrofuran (THF) în scopul omogenizării amestecului și s-a continuat triturarea timp de încă 2-3 minute, după care s-a lăsat în reapaus. După evaporarea completă a solventului s-au adăugat 20 μL dioctilftalat și s-a amestecat din nou până s-a obținut o pastă omogenă. (electrod 2)

Rezultatele obținute pentru un set de măsurători se regăsesc în tabelul 15 de unde se pot remarca valorile potențialului foarte mari pentru electrodul 2 în comparație cu electrodul 1 (aproape de trei ori mai mare), fapt care probabil se datorează influenței urmelor de tetrahidrofuran care nu s-a evaporat complet din pasta de carbon. Aceasta nu influențează însă în mare măsură răspunsul electrodului utilizat la titrarea potențiometrică.

Curbele titrării potențiometrice, curbele derivatelor I și curbele Lorentz sunt prezentate în figurile 32 și 33 [1]:

În cazul în care s-a folosit electrodul 1, s-a reprezentat grafic derivata I și curba Lorentz obținându-se două volume diferite de echivalență care diferă cu 0,70%, valoarea cea mai exactă fiind dată de curba Lorentz, adică Vechiv. = 0,996 mL, ceea ce corespunde la o cantitate de diazepam de 2,835 mg, adică o regăsire de 99.57%. Pentru electrodul 2, analog, se trasează cele două curbe din care se determină volumul de echivalență, valoarea cea mai precisă a acestuia fiind dată de curba Lorentz, adică Vechiv. = 0,965 mL. La acest volum de sare Reinecke folosit până la echivalență s-a găsit o cantitate de diazepam de 2,747 mg, adică o regăsire de 96,5%. Aceste rezultatele preliminare ne sugerează utilizarea electrodului 1 în măsurătorile ulterioare.

1. Liniaritate

Soluția stoc de clorhidrat de diazepam de concentrație 10-1 M se prepară într-un flacon volumetric de 25 mL prin dizolvarea a 0,71175 g diazepam în 10 mL soluție HCl 10-1 M peste care se adaugă picătură cu picătură soluție de HCl 2M până la dizolvarea completă a diazepamului, completându-se la semn cu soluție de HCl 10-1 M. Din această soluție se prepară soluții de diazepam mai diluate de concentrații 10-2 …. 10-7 M [83].

În vederea stabilirii caracteristicilor electrodului pastă de carbon modificat diazepam selectiv cu reineckat de diazepam, s-au măsurat potențialele unor soluții de diazepam având concentrația cuprinsă între 10-2 M și 10-7 M. Măsurătorile au fost repetate de 3 ori iar media lor este prezentată în tabelul 16 și reprezentarea grafică în figura 34:

Se observă că domeniul liniar corespunde intervalului de concentrație 10-2 – 10-5 M, iar ecuația dreptei de regresie: y = 224,98 – 19,83 x, are un coeficient de corelație 0,9980 pe domeniul liniar. Potențialul standard condițional al electrodului este 224,54 mV.

Acuratețea (exactitatea)

Exactitatea metodei s-a determinat prin titrare potențiometrică astfel: s-a luat un volum de 5 mL soluție diazepam 2.10-3 M (dizolvat în tampon acetat, pH = 4,6) (0,5694 mg/mL diazepam teoretic) care s-a titrat cu o soluție apoasă de sare Reinecke 10-2 M (3,5444 mg/mL sare Reinecke).

Variația potențialului soluției analizate s-a făcut în raport cu potențialul unui electrod de referință de Ag/AgCl – KCl saturat. Curba titrării potențiometrice, derivata I și curba Lorentz sunt prezentate în figura 35:

S-au efectuat câte 3 determinări a 6 dozări pentru 5, 6, 7, 8, 9 și 10 mL soluție diazepam 2.10-3 M dizolvată în tampon acetat (pH = 4,6) luată în lucru, care s-au titrat cu o soluție de sare Reinecke 10-2M. În tabelul 17 sunt prezentate cantitățile medii de diazepam găsite pentru fiecare dozare în parte precum și calculul statistic corespunzător.

Regăsirea medie este 99,41%, iar deviația relativă standard (RSD) în acest caz este de 0,283%, ceea ce înseamnă că metoda de dozare este exactă.

Repetabilitatea

A fost determinată prin dozarea a 3 soluții probă de clorhidrat de diazepam 10-2 M în aceeași zi. S-au efectuat trei măsurători, s-a calculat abaterea standard (SD) și abaterea standard relativă (RSD).

Reproductibilitatea

A fost determinată prin analiza a 3 soluții probă de clorhidrat de diazepam 10-2 M în trei zile consecutive. S-au efectuat trei măsurători, media lor se regăsește în tabelul 18. S-a calculat abaterea standard (SD) și abaterea standard relativă (RSD).

Limita de detecție și limita de cuantificare

Prin metoda grafică s-a determinat limita de detecție de 1,79 μg/L, iar limita de cuantificare este de 5,37 μg/L.

Optimizarea metodei

Pentru optimizarea metodei de dozare a diazepamului folosind electrodul diazepam selectiv au fost urmărite:

influența pH-ului: Electrodul pastă de carbon modificat a fost introdus alături de electrodul de referință într-o soluție de acid acetic cu pH = 2,35, căreia i s-a ajustat pH-ul în sens crescător cu soluție de NaOH 10-1 M, până la 12. Palierul orizontal a fost obținut pe intervalul de pH = 4,6 – 6,2, după care urmează o scădere lentă a potențialului până în jurul valorii de pH = 9,35, urmată de o scădere accentuată a potențialului.

timpul de răspuns: al electrodului este în jur de 20 s

selectivitatea electrodului: pentru aceasta au fost preparate soluții de diazepam (i) și ion secundar (j) (interferent) de concentrații identice (10-3 mol/L). La alegerea interferenților s-a ținut cont ca aceștia să se găsescă în lichidele biologice, să prezinte structuri asemănătoare cu diazepamul sau să constituie excipienți care se găsesc în comprimatele de diazepam.

Determinările coeficientului de selectivitate au fost efectuate atât în soluție de DzH+Cl- și soluție de interferent luate separat Kij (1) cât și în amestec de soluții DzH+Cl-interferent Kij (2).

Selectivitatea electrodului este bună în prezența unor cationi comuni a căror interferență este neglijabilă. Valori superioare ale selectivității se obțin pentru soluții separate în comparație cu amestecul de soluție de diazepam și interferent. Au fost efectuate măsurători și pentru soluții de interferenți mai concentrate de 10 ori decât soluția de diazepam, dar electrodul prezintă o anumită interferență în acest caz.

Determinarea diazepamului din forme farmaceutice

Rezultatele bune obținute au permis aplicarea acestei metode la dozarea diazepamului din forme farmaceutice.

În acest sens s-au cântărit la balanța analitică 20 comprimate de Diazepam 10 mg/cpr. substanță activă (Terapia, Cluj-Napoca), s-a determinat masa medie a unui comprimat de 200,73 mg. S-au luat apoi 3 comprimate care s-au triturat până s-a obținut o pulbere omogenă din care s-au cântărit la balanța analitică 571,0 mg pulbere care s-au adus cantiativ într-un flacon Erelenmeyer peste care s-a adăugat aproximativ 10-15 mL cloroform și s-a agitat 10-15 minute în vederea dizolvării diazepamului, după care s-a filtrat. Filtratul obținut s-a încălzit la 45°C până la completa evaporare a cloroformului, iar reziduul s-a dizolvat în 4-5 mL soluție HCl 10-1 N într-un balon cotat de 10 mL și s-a completat la semn cu aceeași soluție. Volume diferite din soluția astfel obținută s-au titrat cu soluție de sare Reinecke 10-2 M.

S-au efectuat câte 6 titrări pentru volume de 1, 2, 3, 4, 5 și 6 mL soluție diazepam 10-2 M luată în lucru adăugate peste 5 ml tampon acetat (pH = 4,6) în tabelul 20 fiind trecute cantitățile de diazepam luate în lucru și cele găsite, dar și calculul statistic aferent acestor dozări.

Valoarea subunitară a RSD indică exactitatea metodei folosind acest electrod care poate fi utilizat cu succes la dozare diazepamului atât ca substanță medicamentoasă cât și din forme framaceutice.

Comparând rezultatele obținute la dozarea diazepamului cu cei doi electrozi ion selectivi (membrană PVC și pastă de carbon) modificat cu reineckat de diazepam se pot remarca rezultatele superioare obținute cu electrodul pastă de carbon, de aceea în continuare s-a abordat numai studiul potențiometric al benzodiazepinelor folosind electrozi pastă de carbon modificați. Mergând mai departe cu această comparție performanțele acestor electrozi sun net superioare unui electrod simplu pentru mediu neapos [84].

III. 2. 1. 2. Electrod pastă de carbon modificat diazepam selectiv cu fosfowolframat de diazepam

În cazul titrării dizepamului din probe multiple cu conținut diferit cu soluție de acid fosfowolframic [85] s-a măsurat variația potențialului ca rezultat al adausului soluției de acid fosfowolframic care se combină în raport stoechiometric de 1:3 cu diazepamul. Se reprezintă grafic variația potențialului în funcție de volumul de titrant adăugat.

În vederea stabilirii caracteristicilor electrodului pastă de carbon modificat diazepam selectiv cu fosfowolframat de diazepam, am măsurat potențialele unor soluții de diazepam având concentrația cuprinsă între 10-2 M si 10-7 M.

1. Liniaritate

Soluția stoc de clorhidrat de diazepam de concentrație 10-1 M se prepară într-un flacon volumetric de 25 mL prin dizolvarea a 0,71175 g diazepam în 10 mL soluție HCl 10-1 M peste care se adaugă picătură cu picătură soluție de HCl 2M până la dizolvarea completă a diazepamului, completându-se la semn cu soluție de HCl 10-1 M. Din această soluție se prepară soluții de diazepam mai diluate de concentrații 10-2 …. 10-7 M cărora li s-a deteminat potențialul în vederea stabilirii caracteristicilor electrodului pasta de carbon modificat diazepam selectiv cu fosfowolframat de diazepam. Măsurătorile au fost repetate de 3 ori iar media lor este prezentată în tabelul 21.

Domeniul liniar corespunde intervalului de concentrație 2,00.10-3 – 1,94.10-6 M, iar ecuația dreptei de regresie: y = 733,48 – 107,85 x, are un coeficient de corelație 0,9968 corespunzător domeniului liniar. Potențialul standard condițional al electrodului este 582,24 mV.

Acuratețea (exactitatea)

În cazul titrării dizepamului din probe multiple cu conținut diferit cu soluție de acid fosfowolframic s-a măsurat variația potențialului ca rezultat al adausului soluției de acid fosfowolframic care se combină în raport stoechiometric de 1:3 cu diazepamul. Se reprezintă grafic variația potențialului în funcție de volumul de titrant adăugat.

Titrarea potențiometrică a unei soluții de diazepam 10–3 M s-a efectuat cu o soluție de acid fosfowolframic de concentrație 10–3 M, preparată prin dizolvarea a 0,0313 g H3[PW12O40].14H2O în apă bidistilată la balon cotat de 10 mL.

S-au luat volume multiple de 3 mL, 4,5 mL, 6 mL, 7,5 mL, 9 mL, respectiv 10,5 mL soluție diazepam 10-3 M (0,2847 mg/mL diazepam care s-au titrat cu o soluție apoasă de acid fosfowolframic 10-3 M (3,132 mg /mL acid fosfowolframic). Rezultatele obținute pentru două seturi de măsurători se regăsesc în tabelul 22 iar în figura 38 sunt prezentate curbele titrării potențiometrice, derivatele I și curbele Lorentz corespunzătoare.

Reprezentarea grafică a valorilor din tabelul anterior este prezentată în figura următoare alături de derivata I a curbei titrării potențiometrice obținute și curba Lorentz care indică cu o exactitate apreciabilă valoarea volumului de echivalență.

S-au efectuat câte 3 determinări a 6 dozări pentru 3 mL, 4,5 mL, 6 mL, 7,5 mL, 9mL respectiv 10,5 mL soluție diazepam 10-3 M luată în lucru. În tabelul 23 sunt prezentate cantitățile de diazepam luate în lucru, cele găsite pentru fiecare dozare în parte precum și calculul statistic corespunzător .

Regăsirea medie este 99,30%, iar deviația relativă standard (RSD) în acest caz este de 0,36%, ceea ce înseamnă că metoda de dozare este exactă.

Repetabilitatea

A fost determinată prin dozarea a 3 soluții probă de clorhidrat de diazepam 10-3 M în aceeași zi. S-au efectuat trei măsurători, s-a calculat abaterea standard (SD) și abaterea standard relativă (RSD).

Reproductibilitatea

A fost determinată prin analiza a 3 soluții probă de clorhidrat de diazepam 10-3 M în trei zile consecutive. S-au efectuat trei măsurători, media lor se regăsește în tabelul 24. S-a calculat abaterea standard (SD) și abaterea standard relativă (RSD).

Limita de detecție și limita de cuantificare

Prin metoda grafică s-a determinat limita de detecție de 0,22 μg/L, iar limita de cuantificare este de 0,72 μg/L.

Optimizarea metodei

În vederea optimizării metodei de dozare a diazepamului folosind electrodul diazepam selectiv au fost urmărite:

influența pH-ului: Electrodul pastă de carbon modificat a fost introdus alături de electrodul de referință într-o soluție de acid acetic cu pH = 2,35, căreia i s-a ajustat pH-ul în sens crescător cu soluție de NaOH 10-1 M, până la 12. În figura 39 se prezintă variația potențialului în funcție de pH.

Se observă din figură că potențialul are valoare constantă pe palierul orizontal îngust care este cuprins între 4,4 – 6,3 valoare de pH. Palierul orizontal poate fi considerat până în jurul valorii de pH = 9,0, dar are totuși o pantă lentă de descreștere a potențialului înregistrat.

timpul de răspuns: al electrodului este de aproximativ 30 s

selectivitatea electrodului: pentru aceasta au fost preparate soluții de diazepam (i) și ion secundar (j) (interferent) de concentrații identice (10-3 mol/L). La alegerea interferenților s-a ținut cont ca aceștia să se găsescă în lichidele biologice, să prezinte structuri asemănătoare cu diazepamul sau să constituie excipienți care se găsesc în comprimatele de diazepam.

Determinările coeficientului de selectivitate au fost efectuate atât în soluție de DzH+Cl- și soluție de interferent luate separat Kij (1) cât și în amestec de soluții DzH+Cl-interferent Kij (2).

Selectivitatea electrodului este bună în prezența unor cationi comuni a căror interferență este neglijabilă. Valori superioare ale selectivității se obțin pentru soluții separate în comparație cu amestecul de soluție de diazepam și interferent. Au fost efectuate măsurători și pentru soluții de interferenți mai concentrate de 10 ori decât soluția de diazepam, dar electrodul prezintă interferențe în acest caz.

Determinarea diazepamului din forme farmaceutice

Rezultatele bune obținute au permis aplicarea acestei metode la dozarea diazepamului din forme farmaceutice.

Analog s-au cântărit la balanța analitică 20 comprimate de Diazepam 10 mg/cpr. substanță activă (Terapia, Cluj-Napoca) și s-a determinat masa medie a unui comprimat de 200,73 mg. S-au luat apoi 3 comprimate care s-au triturat până s-a obținut o pulbere omogenă din care s-au cântărit la balanța analitică 571,0 mg pulbere care s-au adus cantiativ într-un flacon Erelenmeyer peste care s-a adăugat aproximativ 10-15 mL cloroform și s-a agitat 10-15 minute în vederea dizolvării diazepamului, după care s-a filtrat. Filtratul obținut s-a încălzit la 45°C până la completa evaporare a cloroformului, iar reziduul s-a dizolvat în 4-5 mL soluție tampon acetat (pH = 4,6) (s-a adaugat acid acetic glacial până la dizolvarea completă a diazepamului), după care s-a adus cantitativ într-un balon cotat de 10 mL și s-a completat la semn cu aceeași soluție. Volume diferite din soluția astfel obținută s-au titrat cu soluție de acid fosfowolframic 10-2 M. S-au efectuat câte 6 titrări pentru volume de 1, 2, 3, 4, 5 și 6 mL soluție diazepam 10-2 M luată în lucru, în tabelul 26 fiind trecute cantitățile de diazepam luate în lucru și cele găsite, dar și calculul statistic aferent acestor dozări.

Valoarea subunitară a RSD indică exactitatea metodei folosind acest electrod la dozarea diazepamului, iar regăsirea medie obținută (99,09%) corespunde unei valori de 9,909 mg/cp diazepam, indicând faptul că comprimatele de Diazepam sunt conforme cu prevederile FR X referitoare la conținutul de substanță activă (9 – 11 mg/cp).

Concluzii

A fost construit și caracterizat un pastă de carbon modificat cu fosfowolframat de diazepam care s-a utilizat la determinarea cantitativă a diazepamului din comprimate prin titrare potențiometrică, metodă ce a fost validată din punct de vederea a liniarității, exactității și a fidelității (reproductibilității și repetabilității).

III. 2. 1. 3. Electrod pastă de carbon modificat diazepam selectiv cu fosfomolibdat de diazepam

În cazul titrării dizepamului din probe multiple cu conținut diferit cu soluție de acid fosfomolibdenic s-a măsurat variația potențialului ca rezultat al adausului soluției de acid fosfomolibdenic care se combină cu diazepamul în raport stoechiometric de 1:3. Se reprezintă grafic variația potențialului în funcție de volumul de titrant adăugat.

În vederea stabilirii caracteristicilor electrodului pastă de carbon modificat diazepam selectiv cu fosfomolibdatat de diazepam, s-au măsurat potențialele unor soluții de diazepam având concentrația cuprinsă între 10-2 M și 10-7 M.

Rezultate și discuții

1. Liniaritate

Soluția stoc de clorhidrat de diazepam de concentrație 10-1 M se prepară într-un flacon volumetric de 25 mL prin dizolvarea a 0,71175 g diazepam în 10 mL soluție HCl 10-1 M peste care se adaugă picătură cu picătură soluție de HCl 2M până la dizolvarea completă a diazepamului, completându-se la semn cu soluție de HCl 10-1 M. Din această soluție se prepară soluții de diazepam mai diluate de concentrații 10-2 …. 10-7 M cărora li s-a deteminat potențialul în vederea stabilirii caracteristicilor electrodului pasta de carbon modificat diazepam selectiv cu fosfomolibdat de diazepam. Măsurătorile au fost repetate de 3 ori iar media lor este prezentată în tabelul 27.

Se observă că domeniul liniar este pe domeniul de concentrație 2,51.10-3 – 1,69.10-6 M, iar ecuația dreptei de regresie: y = 407,45 – 34,04 x, are un coeficient de corelație 0,9968. Potențialul standard condițional al electrodului este 403,02 mV.

Acuratețea (exactitatea)

În cazul titrării dizepamului cu soluție de acid fosfomolibdenic s-a măsurat variația potențialului față de electrodul de referință Ag/AgCl, KCl sat. ca rezultat al adausului soluției de acid fosfomolibdenic care se combină în raport stoechiometric de 1:3 cu diazepamul.

Practic, titrarea potențiometrică a soluției de diazepam 10-3 M s-a făcut cu o soluție de acid fosfomolibdenic de concentrație 10–3 M, preparată prin dizolvarea a 0,2077 g acid fosfomolibdenic în apă bidistilată la balon cotat de 100 mL.

Exactitatea metodei s-a determinat prin titrare potențiometrică astfel: s-au luat volume multiple de 3 mL, 4,5 mL, 6 mL, 7,5 mL, 9 mL, respectiv 10,5 mL soluție diazepam 10-3 M (0,2847 mg/mL diazepam) care s-au titrat cu o soluție apoasă de acid fosfomolibdenic 10-3 M (2,077 mg /mL acid fosfomolibdenic). Rezultatele obținute pentru două seturi de măsurători se regăsesc în tabelul 28 iar în figura 41 sunt prezentate curbele titrării potențiometrice, derivatele I și curbele Lorentz corespunzătoare.

S-au efectuat câte 3 determinări a 6 dozări pentru 3 mL, 4,5 mL, 6 mL, 7,5 mL, 9mL și 10,5 mL soluție diazepam 10-3 M luată în lucru care s-a titrat cu soluție de acid fosfomolibdenic 10-3 M. În tabelul 29 sunt prezentate cantitățile medii de diazepam luate în lucru și cele găsite pentru fiecare dozare în parte precum și calculul statistic corespunzător.

Regăsirea medie este 99,35%, iar deviația relativă standard (RSD) în acest caz este de 0,33%, ceea ce înseamnă că metoda de dozare este exactă.

Repetabilitatea

A fost determinată prin dozarea a 3 soluții probă de clorhidrat de diazepam 10-3 M în aceeași zi. S-au efectuat trei măsurători, s-a calculat abaterea standard (SD) și abaterea standard relativă (RSD).

Reproductibilitatea

A fost determinată prin analiza a 3 soluții probă de clorhidrat de diazepam 10-3 M în trei zile consecutive. S-au efectuat trei măsurători, media lor se regăsește în tabelul 30. S-a calculat abaterea standard (SD) și abaterea standard relativă (RSD).

Limita de detecție și limita de cuantificare

Prin metoda grafică s-a determinat limita de detecție de 0,35 μg/L, iar limita de cuantificare este de 1,18 μg/L.

Optimizarea metodei

Pentru a optimiza metoda de dozare a diazepamului folosind electrodul diazepam selectiv au fost urmărite:

influența pH-ului: Electrodul pastă de carbon modificat a fost introdus alături de electrodul de referință într-o soluție de acid acetic cu pH = 2,35, căreia i s-a ajustat pH-ul în sens crescător cu soluție de NaOH 10-1 M, până la 12. Reprezentarea grafică a variației potențialului în funcție de pH se regăsește în figura 42.

Se observă din figură că potențialul are valoare constantă pe palierul orizontal îngust care este cuprins între 4,2 – 6,3 valoare de pH, palier care poate fi prelungit până la 9,5 dacă luăm în considerare panta lentă de scădere a potențialului.

timpul de răspuns: al electrodului este de aproximativ 30 s

selectivitatea electrodului: analog au fost preparate soluții de diazepam (i) și ion secundar (j) (interferent) de concentrații identice (10-3 mol/L). La alegerea interferenților s-a ținut cont ca aceștia să se găsescă în lichidele biologice, să prezinte structuri asemănătoare cu diazepamul sau să constituie excipienți care se găsesc în comprimatele de diazepam.

Determinările coeficientului de selectivitate au fost efectuate atât în soluție de DzH+Cl- și soluție de interferent luate separat Kij (1) cât și în amestec de soluții DzH+Cl-interferent Kij (2).

Selectivitatea electrodului este bună în prezența unor cationi comuni a căror interferență este neglijabilă. Valori superioare ale selectivității se obțin pentru soluții separate în comparație cu amestecul de soluție de diazepam și interferent.

Au fost efectuate măsurători și pentru soluții de interferenți mai concentrate de 10 ori decât soluția de diazepam, dar electrodul prezintă o anumită interferență în acest caz.

Determinarea diazepamului din forme farmaceutice

Analog s-au cântărit la balanța analitică 20 comprimate de Diazepam 10 mg/cpr. substanță activă (Terapia, Cluj-Napoca), s-a determinat masa medie a unui comprimat de 200,73 mg. S-au luat apoi comprimatele care s-au triturat până s-a obținut o pulbere omogenă din care s-au cântărit la balanța analitică 571,0 mg pulbere care s-au adus cantiativ într-un flacon Erelenmeyer peste care s-a adăugat aproximativ 10-15 mL cloroform și s-a agitat 10-15 minute în vederea dizolvării diazepamului, după care s-a filtrat. Filtratul obținut s-a încălzit la 45°C până la completa evaporare a cloroformului, iar reziduul s-a dizolvat în 4-5 mL soluție tampon acetat (pH = 4,6) (s-a adaugat acid acetic glacial până la dizolvarea completă a diazepamului), după care s-a adus cantitativ într-un balon cotat de 10 mL și s-a completat la semn cu aceeași soluție. Volume diferite din soluția astfel obținută s-au titrat cu soluție de acid fosfomolibdenic 10-2 M.

S-au efectuat câte 6 titrări pentru volume de 1, 2, 3, 4, 5 și 6 mL soluție diazepam 10-2 M luată în lucru, în tabelul 32 fiind trecute cantitățile de diazepam luate în lucru și cele găsite, dar și calculul statistic aferent acestor dozări.

Valoarea subunitară a RSD indică exactitatea metodei folosind acest electrod ceea ce îl recomandă la utilizarea sa în cazul dozării diazepamului, iar regăsirea medie obținută (98,68%) corespunde unei valori de 9,868 mg/cp diazepam, indicând faptul că comprimatele de Diazepam sunt conforme cu prevederile FR X referitoare la conținutul de substanță activă (9 – 11 mg/cp).

Concluzii

S-a construit și caracterizat un pastă de carbon modificat cu fosfomolibdat de diazepam care s-a utilizat la determinarea cantitativă a diazepamului din comprimate prin titrare potențiometrică, metodă ce a fost validată.

Referitor la electrodul pastă de carbon modificat, printr-un calcul simplu se poate determina compoziția procentuală a modificatorului în pasta de carbon care este de aproximativ 15%. S-au mai încercat și alte concentrații de modificator (5%, 10% și 20%), dar cu rezultate mai slabe în ceea ce privește performanțele electrodului pastă de carbon modificat care nu poate oferi un potențial stabil în timp.

Un alt studiu care s-a mai realizat pentru pasta de carbon a constat în schimbarea liantului (dioctilftalat, ulei de silicon și parafină solidă), dar rezultatele cele mai bune s-au obținut cu dioctilftalat ca și liant lichid.

III. 3. Electrod pastă de carbon modificat flunitrazepam selectiv

Prepararea complexului de asociație ionică

Se cântăresc la balanța analitică 100 mg flunitrazepam care se dizolvă în volumul minim de soluție HCl 0,1N într-un flacon conic, după care se adaugă 80-100 mL apă bidistilată. Peste acest conținut se adaugă picătură cu picătură sub agitare continuă soluție apoasă de sare Reinecke (RN) 1% în mic exces (sau acid fosfowolframic, respectiv acid fosfomolibdenic). Precipitatul format se lasă 30-40 min la rece (gheață) după care se filtrează prin creuzet filtrant G4. Precipitatul se spală cu 2-3 mL soluție apoasă de sare Reinecke 0,1% (respectiv acid fosfowolframic sau acid fosfomolibdenic) și cu 2-3 mL apă bidistilată după care se usucă în etuvă la 60°C până la greutate constantă.

Reacțiile care are loc sunt următoarele:

C16H12FN3O3.HCl + NH4[Cr(NCS)4(NH3)2]→

clorhidrat de flunitrazepam reineckat de amoniu

→[ C16H12FN3O3H] + [Cr(NH3)2(NCS)4]- + NH4Cl

reineckat de flunitrazepam (Fz-Rn)

3 C16H12FN3O3.HCl + H3[P(W3O10)4] → (C16H12FN3O3H)+3 [P(W3O10)4]- + 3HCl

fosfowolframat de flunitrazepam (Fz-W)

3 C16H12FN3O3.HCl + H3[P(Mo3O10)4] → (C16H12FN3O3H)+3 [P(W3O10)4]- + 3HCl

fosfomolibdat de flunitrazepam (Fz-Mo)

Determinarea punctelor de topire și a solubilității complecșilor cu flunitrazepam

În prealabil s-au determinat punctele de topire ale complecșilor (tabelul 33) și s-au efectuat testele de solubilitate ale acestora (tabelul 34) conform protocolului descris anterior:

– = greu solubil; + = puțin solubil; ++ = solubil; +++ = foarte solubil

Complecșii obținuți sunt stabili, de culori diferite, cu puncte de topire mai mari de 200° C.

III. 3. 1. Titrarea potențiometrică a flunitrazepamului folosind electrod pastă de carbon modificat flunitrazepam selectiv

Prepararea pastei de carbon

Prepararea propriu zisă a pastei de carbon se realizează astfel: 40 mg pudră de carbon de înaltă puritate se triturează timp de 10 minute cu 10,58 mg (15%) complexul de asociație ionică (Fz-Rn, Fz-W, Fz-Mo). Se adaugă 20 µg (o picătură) liant dioctilftalat (DOP) și se triturează în continuare încă 5 minute. Pasta astfel preparată se introduce în electrod.

Pentru prepararea electrodului pastă de carbon modificată s-a folosit:

Pudră de grafit fină, extrapură – Merck

Dioctilftalat (DOP) – Fluka

Flunitrazepam – Labormed Pharma, București, România

Reineckat de flunitrazepam – preparat în laborator din Flunitrazepam (LaborMed Pharma, București) și sare Reinecke (Rearal, Budapesta, Ungaria)

Fosfowolframat de flunitrazepam – preparat în laborator din Flunitrazepam (LaborMed Pharma, București) și acid fosfowolframic (Peking’s Reagent, Peking, China)

Fosfomolibdat de flunitrazepam – preparat în laborator din Flunitrazepam (LaborMed Pharma, București) și acid fosfomolibdenic (Peking’s Reagent, Peking, China)

III. 3. 1. 1. Electrod pastă de carbon modificat flunitrazepam selectiv cu reineckat de flunitrazepam

1. Liniaritate

Pentru determinarea potențialului se prepară soluții de concentrații diferite:10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 M, astfel: într-un balon cotat de 5 mL se dizolvă 0,01566 g flunitrazepam în HCl 0,1N și HCl 10% și se completează cu apă bidistilată la 5 mL.

Un mL din acestă soluție se aduce într-un balon cotat de 10 mL și se completează cu apă până la semn obținându-se astfel o soluție de 10-3 M. În continuare se recurge la diluarea soluțiilor urmând aceeași modalitate ca și mai sus. Măsurătorile au fost repetate de 3 ori iar media lor este prezentată în tabelul 35.

Din figura 43 se observă că domeniul liniar este pe intervalul de concentrație 10-2 – 10-6 M, iar ecuația dreptei de regresie: y = 360,02 – 22,98 x, are un coeficient de corelație 0,9925 pe domeniul liniar. Potențialul standard condițional al electrodului este 324,91 mV.

Acuratețea (exactitatea)

Exactitatea metodei s-a determinat prin titrare potențiometrică astfel: s-a luat un volum de 9 mL soluție flunitrazepam 10-3 M (dizolvat în HCl 0,1 N) (0,3133 mg/mL flunitrazepam teoretic) care s-a titrat cu o soluție apoasă de sare Reinecke 10-2 M (3,5444 mg/mL sare Reinecke)

Variația potențialului soluției analizate s-a făcut în raport cu potențialul unui electrod de referință de Ag/AgCl – KCl saturat. Rezultatele obținute pentru un set de măsurători se regăsesc în tabelul 36, iar curba titrării potențiometrice, derivata I și curba Lorentz sunt prezentate în figura 44:

Reprezentarea grafică a variației potentialului în funcție de volumul de titrant adăugat se regăsește în figura următoare de unde se poate remarca faptul că în acest caz volumul de echivalență este de 0,886 mL.

S-au efectuat câte 3 determinări a 6 dozări pentru 5, 6, 7, 8, 9 și 10 mL soluție flunitrazepam 10-3 M dizolvată în HCl 0,1M luată în lucru, care s-au titrat cu o soluție de sare Reinecke 10-2M. În tabelul 37 sunt prezentate cantitățile medii de flunitrazepam găsite pentru fiecare dozare în parte precum și calculul statistic corespunzător.

Regăsirea medie este 98,58%, iar deviația relativă standard (RSD) în acest caz este de 1,136%, ceea ce înseamnă că metoda de dozare este exactă.

Repetabilitatea

A fost determinată prin dozarea a 3 soluții probă de flunitrazepam 10-2 M în aceeași zi. S-au efectuat trei măsurători, s-a calculat abaterea standard (SD) și abaterea standard relativă (RSD).

Reproductibilitatea

A fost determinată prin analiza a 3 soluții probă de flunitrazepam 10-2 M în trei zile consecutive. S-au efectuat trei măsurători, media lor se regăsește în tabelul 38. S-a calculat abaterea standard (SD) și abaterea standard relativă (RSD).

Limita de detecție și limita de cuantificare

Prin metoda grafică s-a determinat limita de detecție pentru flunitrazepam de 0,23 μg/L, iar limita de cuantificare este de 0,70 μg/L.

Optimizarea metodei

Pentru a optimiza metoda de dozare a flunitrazepamului folosind electrodul pastă de carbon flunitrazepam selectiv au fost urmărite:

influența pH-ului: electrodul pastă de carbon modificat a fost introdus alături de electrodul de referință într-o soluție de acid clorhidric 10-1 M, căreia i s-a ajustat pH-ul în sens crescător cu soluție de NaOH 10-1 M, până la 12. Reprezentarea grafică a variației potențialului în funcție de pH se regăsește în figura 45. Palierul orizontal a fost obținut pe intervalul de pH = 4,6 – 6,7

timpul de răspuns: al electrodului este în jur de 20 s

selectivitatea electrodului: pentru aceasta au fost preparate soluții de flunitrazepam (i) și ion secundar (j) (interferent) de concentrații identice (10-3 mol/L). La alegerea interferenților s-a ținut cont ca aceștia să se găsescă în lichidele biologice, să prezinte structuri asemănătoare cu flunitrazepamul sau să constituie excipienți care se găsesc în comprimatele de flunitrazepam.

Determinările coeficientului de selectivitate au fost efectuate atât în soluție de flunitrazepam și soluție de interferent luate separat Kij (1) cât și în amestec de soluții flunitrazepam-interferent Kij (2).

Selectivitatea electrodului este bună în prezența unor cationi comuni a căror interferență este neglijabilă. Valori superioare ale selectivității se obțin pentru varianta cu soluții separate comparativ cu amestecul de soluție de flunitrazepam și interferent. Au fost efectuate măsurători și pentru soluții de interferenți mai concentrate de 10 ori decât soluția de flunitrazepam, dar electrodul prezintă interferențe în acest caz.

Determinarea flunitrazepamului din forme farmaceutice

Rezultatele bune obținute au permis aplicarea acestei metode la dozarea flunitrazepamului din forme farmaceutice (Fluninoc, 1mg/cp.).

În acest sens s-au cântărit la balanța analitică 20 comprimate de Fluninoc 1 mg/cpr. substanță activă (Hexal Pharma) determinându-se masa medie a unui comprimat de 146,50 mg după care se triturează până se obține pulbere omogenă din care se cântărește la balanța analitică 454,15 mg pulbere care s-au adus cantiativ într-un flacon Erelenmeyer peste care s-a adăugat aproximativ 10-15 mL eter și s-a agitat 10-15 minute în vederea dizolvării flunitrazepamului, după care s-a filtrat. Filtratul obținut s-a lăsat în repaus până la completa evaporare a solventului, iar reziduul s-a dizolvat în 4-5 mL soluție HCl 10-1 N într-un balon cotat de 10 mL și s-a completat la semn cu aceeași soluție. Volume diferite din soluția astfel obținută (concentrația soluției este 10-3M) s-au titrat cu soluție de sare Reinecke 10-2 M.

S-au efectuat câte 6 titrări pentru volume de 1, 2, 3, 4, 5 și 6 mL soluție flunitrazepam 10-3 M luată în lucru, în tabelul 40 fiind trecute cantitățile de flunitrazepam luate în lucru și cele găsite, dar și calculul statistic aferent acestor dozări.

Se obține o valoare supraunitară a RSD, dar mai mică decât 2 ceea ce indică valabilitatea acestei metode. Regăsirea medie obținută (100,27%) corespunde unei valori de 1,0027 mg/cp flunitrazepam, indicând faptul că comprimatele de Fluninoc sunt conforme cu prevederile FR X referitoare la conținutul de substanță activă (0,9 – 1,1 mg/cp).

III. 3. 1. 2. Electrod pastă de carbon modificat flunitrazepam selectiv cu fosfowolframat de flunitrazepam

Prepararea propriu-zisă a complexului de asociație ionică precum și confecționarea electrodului au fost descrise anterior.

1. Liniaritate

Pentru determinarea potențialului se prepară soluții de concentrații diferite:10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 M, astfel: într-un balon cotat de 5 mL se dizolvă 0,01566 g flunitrazepam în HCl 0,1N și HCl 10% și se completează cu apa bidistilată la 5 mL.

Un mL din acestă soluție se aduce într-un balon cotat de 10 mL și se completează cu apă până la semn obținandu-se astfel o soluție de 10-3 M. În continuare se recurge la diluarea soluțiilor urmând aceeași modalitate ca și mai sus. Măsurătorile au fost repetate de 3 ori iar media lor este prezentată în tabelul 41.

Se observă că domeniul liniar corespunde intervalului de concentrație 10-2 – 10-7 M, iar ecuația dreptei de regresie: y = 347,80 – 31,52 x, are un coeficient de corelație 0,9955 pe domeniul liniar de concentrație. Potențialul standard condițional al electrodului este 300,11 mV.

Acuratețea (exactitatea)

Exactitatea metodei s-a determinat prin titrare potențiometrică astfel: s-a luat un volum de 9 mL soluție flunitrazepam 10-3 M (dizolvat în HCl 0,1 N) (0,3133 mg/mL flunitrazepam teoretic) care s-a titrat cu o soluție apoasă de acid fosfowolframic 10-2 M (28,8 mg/mL acid fosfowolframic).

Variația potențialului soluției analizate s-a făcut în raport cu potențialul unui electrod de referință de Ag/AgCl – KCl saturat. Rezultatele obținute pentru un set de măsurători se regăsesc în tabelul 42, iar curba titrării potențiometrice, derivata I și curba Lorentz sunt prezentate în figura 47:

Reprezentarea grafică a variației potențialului în funcție de volumul de titrant adăugat se regăsește în figura următoare de unde se poate remarca că în acest caz volumul de echivalență este de 1,13 mL.

S-au efectuat câte 3 determinări a 6 dozări pentru 5, 6, 7, 8, 9 și 10 mL soluție flunitrazepam 10-3 M dizolvată în HCl 0,1M luată în lucru, care s-au titrat cu o soluție de acid fosfowolframic 10-2M. În tabelul 43 sunt prezentate cantitățile medii de flunitrazepam găsite pentru fiecare dozare în parte dar și calculul statistic corespunzător.

Regăsirea medie este 99,26%, iar deviația relativă standard (RSD) în acest caz este de 0,15%, ceea ce înseamnă că metoda de dozare este exactă.

Repetabilitatea

A fost determinată prin dozarea a 3 soluții probă de flunitrazepam 10-2 M în aceeași zi. S-au efectuat trei măsurători, s-a calculat abaterea standard (SD) și abaterea standard relativă (RSD).

Reproductibilitatea

A fost determinată prin analiza a 3 soluții probă de flunitrazepam 10-2 M în trei zile consecutive. S-au efectuat trei măsurători, media lor se regăsește în tabelul 44. S-a calculat abaterea standard (SD) și abaterea standard relativă (RSD).

Limita de detecție și limita de cuantificare

Prin metoda grafică s-a determinat limita de detecție de 0,15 μg/L, iar limita de cuantificare este de 0,46 μg/L pentru flunitrazepam.

Optimizarea metodei

În vederea optimizării metodei de dozare a flunitrazepamului folosind electrodul pastă de carbon flunitrazepam selectiv au fost urmărite:

influența pH-ului: electrodul pastă de carbon modificat a fost introdus alături de electrodul de referință într-o soluție de acid clorhidric 10-1 M, căreia i s-a ajustat pH-ul în sens crescător cu soluție de NaOH 10-1 M, până la 12. Reprezentarea grafică a variației potențialului în funcție de pH se regăsește în figura 48. Palierul orizontal a fost obținut pe intervalul de pH = 4,4 – 6,3

timpul de răspuns: al electrodului este în jur de 20 s

selectivitatea electrodului: pentru aceasta au fost preparate soluții de flunitrazepam (i) și ion secundar (j) (interferent) de concentrații identice (10-3 mol/L). La alegerea interferenților s-a ținut cont ca aceștia să se găsescă în lichidele biologice, să prezinte structuri asemănătoare cu flunitrazepamului sau să constituie excipienți care se găsesc în comprimatele de flunitrazepam.

Determinările coeficientului de selectivitate au fost efectuate atât în soluție de flunitrazepam și soluție de interferent luate separat Kij (1) cât și în amestec de soluții flunitrazepam-interferent Kij (2).

Selectivitatea electrodului este bună în prezența unor cationi comuni a căror interferență este neglijabilă. Valori superioare ale selectivității se obțin pentru soluții separate în comparație cu amestecul de soluție de flunitrazepam și interferent. Au fost efectuate măsurători și pentru soluții de interferenți mai concentrate de 10 ori decât soluția de flunitrazepam, dar electrodul prezintă o anumită interferență în acest caz.

Determinarea flunitrazepamului din forme farmaceutice

Rezultatele bune obținute au permis aplicarea acestei metode la dozarea flunitrazepamului din forme farmaceutice (Fluninoc, 1mg/cp.).

În acest sens s-au cântărit la balanța analitică 20 comprimate de Fluninoc 1 mg/cpr. substanță activă (Hexal Pharma) determinându-se masa medie a unui comprimat de 146,50 mg după care se triturează până se obține pulbere omogenă din care se cântărește la balanța analitică 454,15 mg pulbere care s-au adus cantiativ într-un flacon Erelenmeyer peste care s-a adăugat aproximativ 10-15 mL eter și s-a agitat 10-15 minute în vederea dizolvării flunitrazepamului, după care s-a filtrat. Filtratul obținut s-a lăsat în repaus până la completa evaporare a solventului, iar reziduul s-a dizolvat în 4-5 mL soluție HCl 10-1 N într-un balon cotat de 10 mL și s-a completat la semn cu aceeași soluție. Volume diferite din soluția astfel obținută (concentrația soluției este 10-3M) s-au titrat cu soluție de acid fosfowolframic 10-2 M.

S-au efectuat câte 6 titrări pentru volume de 1, 2, 3, 4, 5 și 6 mL soluție flunitrazepam 10-3 M luată în lucru, în tabelul 46 fiind trecute cantitățile de flunitrazepam luate în lucru și cele găsite, dar și calculul statistic pentru aceste dozări.

La fel ca și pentru ceilalți electrozi studiați până acum, se obține o valoare subunitară a RSD, ceea ce indică valabilitatea metodei de dozare. În plus, regăsirea medie obținută (99,44%) corespunde unei valori de 0,9944 mg/cp flunitrazepam, indicând faptul că comprimatele de Fluninoc sunt conforme cu prevederile FR X referitoare la conținutul de substanță activă (0,9 – 1,1 mg/cp).

III. 3. 1. 3. Electrod pastă de carbon modificat flunitrazepam selectiv cu fosfomolibdat de flunitrazepam

Prepararea propriu-zisă a complexului de asociație ionică precum și confecționarea electrodului au fost descrise anterior.

1. Liniaritate

Pentru determinarea potențialului se prepară soluții de concentrații diferite:10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 M, astfel: într-un balon cotat de 5 mL se dizolvă 0,01566 g flunitrazepam în HCl 0,1N și HCl 10% și se completează cu apa bidistilată la 5 mL.

Un mL din acestă soluție se aduce într-un balon cotat de 10 mL și se completează cu apă până la semn obținandu-se astfel o soluție de 10-3 M. În continuare se recurge la diluarea soluțiilor urmând aceeași modalitate ca și mai sus. Măsurătorile au fost repetate de 3 ori iar media lor este prezentată în tabelul 47.

Domeniul liniar corespunde intervalulului de concentrație 10-2 – 10-6 M, iar ecuația dreptei de regresie: y = 366,86 – 26,07 x, are un coeficient de corelație 0,9925. Potențialul standard condițional al electrodului este 332,79 mV.

Acuratețea (exactitatea)

Exactitatea metodei s-a determinat prin titrare potențiometrică astfel: s-a luat un volum de 10 mL soluție flunitrazepam 10-3 M (dizolvat în HCl 0,1 N) (0,3133 mg/mL flunitrazepam teoretic) care s-a titrat cu o soluție apoasă de acid fosfomolibdenic 10-2 M (28,8 mg/mL acid fosfomolibdenic).

Variația potențialului soluției analizate s-a făcut în raport cu potențialul unui electrod de referință de Ag/AgCl – KCl saturat. Rezultatele obținute pentru un set de măsurători se regăsesc în tabelul 48, iar curba titrării potențiometrice, derivata I și curba Lorentz sunt prezentate în figura 50:

Reprezentarea grafică a variației potențialului în funcție de volumul de titrant adăugat se regăsește în figura următoare de unde se poate remarca că în acest caz volumul de echivalență este de 0,30 mL.

S-au efectuat câte 3 determinări a 6 dozări pentru 5, 6, 7, 8, 9 și 10 mL soluție flunitrazepam 10-3 M dizolvată în HCl 0,1M luată în lucru, care s-au titrat cu o soluție de acid fosfomolibdenic 10-2M. În tabelul 49 sunt prezentate cantitățile medii de flunitrazepam găsite pentru fiecare dozare în parte precum și calculul statistic corespunzător.

Regăsirea medie este 99,52%, iar deviația relativă standard (RSD) în acest caz este de 0,46%, ceea ce înseamnă că metoda de dozare este exactă.

Repetabilitatea

A fost determinată prin dozarea a 3 soluții probă de flunitrazepam 10-2 M în aceeași zi. S-au efectuat trei măsurători, s-a calculat abaterea standard (SD) și abaterea standard relativă (RSD).

Reproductibilitatea

A fost determinată prin analiza a 3 soluții probă de flunitrazzepam 10-2 M în trei zile consecutive. S-au efectuat trei măsurători, media lor se regăsește în tabelul 50. S-a calculat abaterea standard (SD) și abaterea standard relativă (RSD).

Limita de detecție și limita de cuantificare

Prin metoda grafică s-a determinat limita de detecție de 0,23 μg/L, iar limita de cuantificare este de 0,70 μg/L.

Optimizarea metodei

Pentru optimizarea metodei de dozare a flunitrazepamului folosind electrodul pastă de carbon flunitrazepam selectiv au fost urmărite:

influența pH-ului: electrodul pastă de carbon modificat a fost introdus alături de electrodul de referință într-o soluție de acid clorhidric 10-1 M, căreia i s-a ajustat pH-ul în sens crescător cu soluție de NaOH 10-1 M, până la 12. Reprezentarea grafică a variației potențialului în funcție de pH se regăsește în figura 51. Palierul orizontal a fost obținut pe intervalul de pH = 4,1 – 6,7

timpul de răspuns: al electrodului este în jur de 20 s

selectivitatea electrodului: pentru aceasta au fost preparate soluții de flunitrazepam (i) și ion secundar (j) (interferent) de concentrații identice (10-3 mol/L). La alegerea interferenților s-a ținut cont ca aceștia să se găsescă în lichidele biologice, să prezinte structuri asemănătoare cu flunitrazepamul sau să constituie excipienți care se găsesc în comprimatele de flunitrazepam.

Determinările coeficientului de selectivitate au fost efectuate atât în soluție de flunitrazepam și soluție de interferent luate separat Kij (1) cât și în amestec de soluții flunitrazepam-interferent Kij (2).

Selectivitatea electrodului este bună în prezența unor cationi comuni a căror interferență este neglijabilă. Valori superioare ale selectivității se obțin pentru soluții separate în comparație cu amestecul de soluție de flunitrazepam și interferent. Au fost efectuate măsurători și pentru soluții de interferenți mai concentrate de 10 ori decât soluția de flunitrazepam, dar electrodul prezintă o anumită interferență în acest caz.

Determinarea flunitrazepamului din forme farmaceutice

Rezultatele bune obținute au permis aplicarea acestei metode la dozarea flunitrazepamului din forme farmaceutice (Fluninoc, 1mg/cp.).

În acest sens s-au cântărit la balanța analitică 20 comprimate de Fluninoc 1 mg/cpr. substanță activă (Hexal Pharma) determinându-se masa medie a unui comprimat de 146,50 mg. după care se triturează până se obține pulbere omogenă din care se cântărește la balanța analitică 454,15 mg pulbere care se aduce cantiativ într-un flacon Erelenmeyer adăugând-se aproximativ 10-15 mL eter și agitând-se 10-15 minute în vederea dizolvării flunitrazepamului, după care s-a filtrat. Filtratul obținut s-a lăsat în repaus până la completa evaporare a solventului, iar reziduul s-a dizolvat în 4-5 mL soluție HCl 10-1 N într-un balon cotat de 10 mL și s-a completat la semn cu aceeași soluție. Volume diferite din soluția astfel obținută (concentrația soluției este 10-3M) s-au titrat cu soluție deacid fosfomolibdenic 10-2 M.

S-au efectuat câte 6 titrări pentru volume de 1, 2, 3, 4, 5 și 6 mL soluție flunitrazepam 10-3 M luată în lucru, în tabelul 52 fiind trecute cantitățile de flunitrazepam luate în lucru și cele găsite, dar și calculul statistic aferent acestor dozări.

Analog cu ceilalți electrozi studiați până acum, se obține o valoare subunitară a RSD, deci metoda de dozare este valabilă și poate fi folosită cu succes la dozarea flunitrazepamului atât ca substanță medicamentoasă cât și din forme farmaceutice. Regăsirea medie obținută (99,18%) corespunde unei valori de 0,9918 mg/cp flunitrazepam, indicând faptul că comprimatele de Fluninoc sunt conforme cu prevederile FR X referitoare la conținutul de substanță activă (0,9 – 1,1 mg/cp).

Concluzii

Au fost preparați trei electrozi pastă de carbon modificați selectiv cu : reineckat de flunitrazepam, fosfowolframat de flunitrazepam și fosfomolibdat de flunitrazepam, cu ajutorul cărora s-a determinat cantitativ flunitrazepamul din Fluninoc 1 mg/cp. prin titrare potențiometrică, după ce în prealabil au fost stabilite pentru fiecare electrod în parte domeniul de liniaritate, exactitatea metodei aplicate, repetabilitatea și reproductibilitatea, limita de detecție și cuantificare.

III. 4. Electrod pastă de carbon modificat bromazepam selectiv

Prepararea complexului de asociație ionică

Se cântăresc la balanța analitică 100 mg bromazepam care se dizolvă în volumul minim de soluție HCl 0,1N într-un flacon conic, după care se adaugă 80-100 mL apă bidistilată. Peste acest conținut se adaugă picătură cu picătură sub agitare continuă soluție apoasă de sare Reinecke (Rn) 1% în mic exces (sau acid fosfowolframic, respectiv acid fosfomolibdenic). Precipitatul format se lasă 30-40 min la rece (gheață) după care se filtrează prin creuzet filtrant G4. Precipitatul se spală cu 2-3 mL soluție apoasă de sare Reinecke 0,1% (respectiv acid fosfowolframic sau acid fosfomolibdenic) și cu 2-3 mL apă bidistilată după care se usucă în etuvă la 70°C până la greutate constantă.

Reacțiile care are loc sunt următoarele:

C14H10BrN3O.HCl + NH4[Cr(NCS)4(NH3)2]→

clorhidrat de bromazepam reineckat de amoniu

→[ C14H10BrN3OH] + [Cr(NH3)2(NCS)4]- + NH4Cl

reineckat de bromazepam (Bz-Rn)

3 C14H10BrN3O.HCl + H3[P(W3O10)4] → (C14H10BrN3O H)+3 [P(W3O10)4]- + 3HCl

fosfowolframat de bromazepam (Bz-W)

3 C14H10BrN3O.HCl + H3[P(Mo3O10)4] → (C14H10BrN3O H)+3 [P(W3O10)4]- + 3HCl

fosfomolibdat de bromazepam (Bz-Mo)

Determinarea punctelor de topire și a solubilității complecșilor cu bromazepam

În prealabil s-au determinat punctele de topire ale complecșilor (cu aparatul Boetius prin introducerea complecșilor în capilară) (tabelul 53) și s-au efectuat testele de solubilitate ale acestora (tabelul 54) conform modului de lucru descris anterior.

– = greu solubil; + = puțin solubil; ++ = solubil; +++ = foarte solubil

Complecșii obținuți ai bromazepamului au puncte de topire mai mici de 200° C (cu excepția fosfowolframatului de bromazepam care se descompune la peste 150° C), sunt stabili insolubili în benzen.

III. 4. 1. Titrarea potențiometrică a bromazepamului folosind electrod pastă de carbon modificat bromazepam selectiv

Prepararea pastei de carbon: prepararea propriu zisă a pastei de carbon se realizează astfel: 40 mg pudră de carbon de înaltă puritate se triturează timp de 10 minute cu 10,58 mg (15%) complex de asociație ionică (Bz-RN, Bz-W, Bz-Mo). Se adaugă 20 µL (o picătură) liant dioctilftalat (DOP) și se triturează în continuare încă 5 minute. Pasta astfel preparată se introduce în locașul electrodului.

Pentru prepararea electrodului pastă de carbon modificată s-a folosit:

Pudră de grafit fină, extrapură – Merck

Dioctilftalat (DOP) – Fluka

Bromazepam, Labormed Pharma, București, România

Reineckat de bromazepam – preparat în laborator din Bromazepam (LaborMed Pharma, București) și sare Reinecke (Rearal, Budapesta, Ungaria)

Fosfowolframat de bromazepam – preparat în laborator din Bromazepam (LaborMed Pharma, București) și acid fosfowolframic (Peking’s Reagent, Peking, China)

Fosfomolibdat de bromazepam – preparat în laborator din Bromazepam (LaborMed Pharma, București) și acid fosfomolibdenic (Peking’s Reagent, Peking, China)

III. 4. 1. 1. Electrod pastă de carbon modificat bromazepam selectiv cu reineckat de bromazepam

1. Liniaritate

Pentru determinarea potențialului se prepară soluții de concentrații diferite:10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 M, astfel: într-un balon cotat de 5 mL se dizolvă 0,01581 g bromazepam în HCl 0,1N și HCl 10% și se completează cu apa bidistilată la 5 mL, obținându-se soluția de bromazepam 10-2 M.

Un mL din acestă soluție se aduce într-un balon cotat de 10 mL și se completează cu apă bidistilată până la semn obținându-se astfel o soluție de 10-3 M. În continuare se recurge la diluarea soluțiilor urmând aceeași modalitate ca și mai sus. Măsurătorile au fost repetate de 3 ori iar media lor este prezentată în tabelul 55.

Domeniul liniar este pe intervalul de concentrație 1,58.10-3 – 4,46.10-7 M, iar ecuația dreptei de regresie: y = 221,51 – 8,11 x, are un coeficient de corelație 0,9946. Potențialul standard condițional al electrodului este 226,58 mV.

Acuratețea (exactitatea)

Practic, am efectuat 3 determinări a câte 6 titrări potențiometrice pe volume diferite de soluție de bromazepam 10-3 M (5, 7, 9, 11, 13 si 15 mL) obținându-se rezultate diferite (tabelul 57).

De exemplu, pentru un volum de 7 mL soluție bromazepam 10-3 M (dizolvat în HCl 0,1 N) (2,213.10-3 g bromazepam teoretic) care s-a titrat cu o soluție apoasă de sare Reinecke 10-2 M (3,5444.10-3 g/mL sare Reinecke), măsurarea diferenței de potențial s-a realizat cu electrodul pastă de carbon ion selectiv în care complexul Bz-Rn se află în procent de 15% față de un electrod de referință Ag/AgCl-KCl saturat, rezultatele obținute regăsindu-se în tabelul 56.

Reprezentarea grafică a variaței potentialului în funcție de volumul de titrant adăugat se prezintă în figura următoare de unde se poate remarca că în acest caz volumul de echivalență este de 0,672 mL.

Regăsirea medie este 99,72%, iar deviația relativă standard (RSD) în acest caz este de 0,22%, ceea ce înseamnă că metoda de dozare este exactă.

Repetabilitatea

A fost determinată prin dozarea a 3 soluții probă de bromazepam 10-2 M în aceeași zi. S-au efectuat trei măsurători, s-a calculat abaterea standard (SD) și abaterea standard relativă (RSD).

Reproductibilitatea

A fost determinată prin analiza a 3 soluții probă de bromazepam 10-2 M în trei zile consecutive. S-au efectuat trei măsurători, media lor se regăsește în tabelul 58. S-a calculat abaterea standard (SD) și abaterea standard relativă (RSD).

Limita de detecție și limita de cuantificare

Prin metoda grafică s-a determinat limita de detecție de 0,0197 μg/L, iar limita de cuantificare este de 0,0593 μg/L.

Optimizarea metodei

În vederea optimizării metodei de dozare a bromazepamului folosind electrodul pastă de carbon bromazepam selectiv au fost urmărite:

influența pH-ului: electrodul pastă de carbon modificat a fost introdus alături de electrodul de referință într-o soluție de acid clorhidric 10-1 M, căreia i s-a ajustat pH-ul în sens crescător cu soluție de NaOH 10-1 M, până la 12. Reprezentarea grafică a variației potențialului în funcție de pH se regăsește în figura 54. Palierul orizontal a fost obținut pe intervalul de pH = 3,9 – 6,4.

timpul de răspuns: al electrodului este în jur de 25 s

selectivitatea electrodului: pentru aceasta au fost preparate soluții de bromazepam (i) și ion secundar (j) (interferent) de concentrații identice (10-3 mol/L). La alegerea interferenților s-a ținut cont ca aceștia să se găsescă în lichidele biologice, să prezinte structuri asemănătoare cu bromazepam sau să constituie excipienți care se găsesc în comprimatele de bromazepam.

Determinările coeficientului de selectivitate au fost efectuate atât în soluție de bromazepam și soluție de interferent luate separat Kij (1) cât și în amestec de soluții bromazepam-interferent Kij (2).

Selectivitatea electrodului este relativ bună în prezența unor cationi comuni a căror interferență este neglijabilă. Valori superioare ale selectivității se obțin pentru soluții separate în comparație cu amestecul de soluție de bromazepam și interferent. Au fost efectuate măsurători și pentru soluții de interferenți mai concentrate de 10 ori decât soluția de bromazepam, dar electrodul prezintă o anumită interferență în acest caz.

Determinarea bromazepamului din forme farmaceutice

Rezultatele bune obținute au permis aplicarea acestei metode la dozarea bromazepamului din forme farmaceutice (Calmepam, 3mg/cp.).

În acest sens s-au cântărit la balanța analitică 20 comprimate de Calmepam 3 mg determinându-se masa medie a unui comprimat de 229,67 mg. după care se triturează până se obține pulbere omogenă din care se cântărește la balanța analitică 245,03 mg care se dizolvă în alcool și se filtrează. Filtratul obținut s-a încălzit la 50°C până la completa evaporare a solventului, iar reziduul s-a dizolvat în 4-5 mL soluție HCl 10-1 N, s-a adus cantitativ într-un balon cotat de 10 mL și s-a completat la semn cu aceeași soluție. Volume diferite din soluția astfel obținută (concentrația soluției este 10-3M) s-au titrat cu soluție de sare Reinecke 10-3 M în tampot acetat (pH = 4,6).

S-au efectuat câte 6 titrări pentru volume de 1, 2, 3, 4, 5 și 6 mL soluție bromazepam 10-3 M luată în lucru, adăugat peste 5 mL tampon acetat, în tabelul 60 fiind trecute cantitățile de bromazepam luate în lucru și cele găsite, dar și calculul statistic aferent acestor dozări.

Analog cu ceilalți electrozi studiați până acum, se obține o valoare subunitară a RSD, deci metoda de dozare este valabilă. Regăsirea medie obținută (99,72%) corespunde unei valori de 2,9916 mg/cp bromazepam, indicând faptul că comprimatele de Calmepam sunt conforme cu prevederile FR X referitoare la conținutul de substanță activă (2,7 – 3,3 mg/cp).

III. 4. 1. 2. Electrod pastă de carbon modificat bromazepam selectiv cu fosfowolframat de bromazepam

Prepararea propriu-zisă a complexului de asociație ionică precum și confecționarea electrodului au fost descrise anterior.

1. Liniaritate

Pentru determinarea potențialului se prepară soluții de concentrații diferite:10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 M, astfel: într-un balon cotat de 5 mL se dizolvă 0,01581 g bromazepam în HCl 0,1N și HCl 10% și se completează cu apa bidistilată la 5 mL.

Un mL din acestă soluție se aduce într-un balon cotat de 10 mL și se completează cu apă până la semn obținandu-se astfel o soluție de 10-3 M. În continuare se recurge la diluarea soluțiilor urmând aceeași modalitate ca și mai sus. Măsurătorile au fost repetate de 3 ori iar media lor este prezentată în tabelul 61.

Domeniul liniar corespunde intervalului de concentrație 1,00.10-2 – 8,91.10-7 M, iar ecuația dreptei de regresie: y = 528,58 + 3,30 x, are un coeficient de corelație 0,9954. Potențialul standard condițional al electrodului este 532,57 mV.

Acuratețea (exactitatea)

Exactitatea metodei s-a determinat prin titrare potențiometrică astfel: s-au luat volume diferite de solutie de bromazepam 10-3 M dizolvat în HCl 0,1 N (0,3162 mg/mL bromazepam teoretic) (5, 6, 7, 8, 9 si 10 mL care s-au titrat cu o soluție apoasă de acid fosfowolframic 10-3 M (2,88 mg/mL acid fosfowolframic) (tabelul 63). Pentru fiecare volum în parte s-au efectuat câte 3 determinări.

Măsurarea diferenței de potential s-a realizat cu electrodul pastă de carbon ion selectiv în care complexul fosfowolframat de bromazepam se afla în procent de 15% în raport cu potențialul unui electrod de referință de Ag/AgCl – KCl saturat.

În tabelul 62 sunt redate valorile potențialului pentru titrarea potențiometrică a 5 mL soluție bromazepam 10-3 M cu o soluție apoasă de acid fosfowolframic 10-3 M, iar reprezentarea grafică a curbei titrării potențiometrice, derivatei I și a curbei Lorentz se regăsesc în figura 56:

Din grafic se poate remarca că în acest caz volumul de echivalență este de 1,66 mL.

Regăsirea medie este98,34%, iar deviația relativă standard (RSD) în acest caz este de 0,47%, ceea ce înseamnă că metoda de dozare este exactă.

Repetabilitatea

A fost determinată prin dozarea a 3 soluții probă de bromazepam 10-2 M în aceeași zi. S-au efectuat trei măsurători, s-a calculat abaterea standard (SD) și abaterea standard relativă (RSD).

Reproductibilitatea

A fost determinată prin analiza a 3 soluții probă de bromazepam 10-2 M în trei zile consecutive. S-au efectuat trei măsurători, media lor se regăsește în tabelul 64. S-a calculat abaterea standard (SD) și abaterea standard relativă (RSD).

Limita de detecție și limita de cuantificare

Prin metoda grafică s-a determinat limita de detecție de 0,18 μg/L, iar limita de cuantificare este de 0,54 μg/L.

Optimizarea metodei

Pentru optimizarea metodei de dozare a bromazepamului folosind electrodul pastă de carbon bromazepam selectiv au fost urmărite:

influența pH-ului: electrodul pastă de carbon modificat a fost introdus alături de electrodul de referință într-o soluție de acid clorhidric 10-1 M, căreia i s-a ajustat pH-ul în sens crescător cu soluție de NaOH 10-1 M, până la 12. Reprezentarea grafică a variației potențialului în funcție de pH se regăsește în figura 57. Palierul orizontal a fost obținut pe intervalul de pH = 4,1 – 6,7

timpul de răspuns: al electrodului este în jur de 30 s

selectivitatea electrodului: pentru aceasta au fost preparate soluții de bromazepam (i) și ion secundar (j) (interferent) de concentrații identice (10-3 mol/L). La alegerea interferenților s-a ținut cont ca aceștia să se găsescă în lichidele biologice, să prezinte structuri asemănătoare cu bromazepamul sau să constituie excipienți care se găsesc în comprimatele de bromazepam.

Determinările coeficientului de selectivitate au fost efectuate atât în soluție de bromazepam și soluție de interferent luate separat Kij (1) cât și în amestec de soluții bromazepam-interferent Kij (2).

Selectivitatea electrodului este foarte bună în prezența unor cationi comuni a căror interferență este neglijabilă. Valori superioare ale selectivității se obțin pentru soluții separate în comparație cu amestecul de soluție de bromazepam și interferent. Au fost efectuate măsurători și pentru soluții de interferenți mai concentrate de 10 ori decât soluția de bromazepam, unde s-au obținut rezultate relati bune.

Determinarea bromazepamului din forme farmaceutice

Bromazepamul a fost dozat din comprimate de Calmepam 3 mg, metoda de preparere a soluției fiind descrisă anterior.

Volume diferite din soluția astfel obținută (concentrația soluției este 10-3M) s-au titrat cu soluție de acid fosfowolframic 10-3 M în tampot acetat (pH = 4,6).

S-au efectuat câte 6 titrări pentru volume de 1, 2, 3, 4, 5 și 6 mL soluție bromazepam 10-3 M luată în lucru, adusă peste 5 mL tampon acetat, în tabelul 66 fiind trecute cantitățile de bromazepam luate în lucru și cele găsite, dar și calculul statistic aferent acestor dozări.

Analog cu ceilalți electrozi studiați până acum, se obține o valoare subunitară a RSD, deci metoda de dozare este valabilă și poate fi folosită la dozarea bromazepamului atât ca substanță medicamentoasă cât și din forme farmaceutice. Regăsirea medie obținută (99,57%) corespunde unei valori de 2,9871 mg/cp bromazepam, ceea ce indică faptul că comprimatele de Calmepam sunt conforme cu prevederile FR X referitoare la conținutul de substanță activă (2,7 – 3,3 mg/cp).

III. 4. 1. 3. Electrod pastă de carbon modificat bromazepam selectiv cu fosfomolibdat de bromazepam

Prepararea propriu-zisă a complexului de asociație ionică precum și confecționarea electrodului au fost descrise anterior.

1. Liniaritate

Pentru determinarea potențialului se prepară soluții de concentrații diferite: 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 M, astfel: într-un balon cotat de 5 mL se dizolvă 0,01581 g bromazepam în HCl 0,1N și HCl 10% și se completează cu apa bidistilată la 5 mL.

Un mL din acestă soluție se aduce într-un balon cotat de 10 mL și se completează cu apă până la semn obținându-se astfel o soluție de 10-3 M. În continuare se recurge la diluarea soluțiilor urmând aceeași modalitate ca și mai sus. Măsurătorile au fost repetate de 3 ori iar media lor este prezentată în tabelul 67.

Domeniul liniar de concentrație este 1,09.10-3 – 7,76.10-7 M, iar ecuația dreptei de regresie: y = 368,84 – 36,12 x, are un coeficient de corelație 0,9970. Potențialul standard condițional al electrodului este 368,84 mV.

Acuratețea (exactitatea)

Exactitatea metodei s-a determinat prin titrare potențiometrică astfel: s-au luat volume diferite de solutie de bromazepam 10-3 M dizolvat în HCl 0,1 N (0,3162 mg/mL bromazepam teoretic) (5, 6, 7, 8, 9 si 10 mL care s-au titrat cu o soluție apoasă de acid fosfowolframic 10-3 M (1,82 mg/mL acid fosfomolibdenic). Pentru fiecare volum în parte s-au efectuat câte 3 determinări.

Măsurarea diferenței de potential s-a realizat cu electrodul pastă de carbon ion selectiv (în care complexul fosfomolibdat de bromazepam se află în procent de 15%), în raport cu potențialul unui electrod de referință de Ag/AgCl – KCl saturat.

În tabelul 68 sunt redate valorile potențialului pentru titrarea potențiometrică a 5 mL soluție bromazepam 10-3 M cu o soluție apoasă de acid fosfomolibdenic 10-3 M, iar reprezentarea grafică a curbei titrării potențiometrice, derivatei I și a curbei Lorentz se regăsesc în figura 59:

În tabelul 69 sunt prezentate cantitățile de bromazepam găsite pentru cele 18 determinări efectuate, precum și regăsirile corespunzătoare.

Regăsirea medie este 98,64%, iar deviația relativă standard (RSD) în acest caz este de 0,23%, ceea ce înseamnă că metoda de dozare este exactă.

Repetabilitatea

A fost determinată prin dozarea a 3 soluții probă de bromazepam 10-2 M în aceeași zi. S-au efectuat trei măsurători, s-a calculat abaterea standard (SD) și abaterea standard relativă (RSD).

Reproductibilitatea

A fost determinată prin analiza a 3 soluții probă de bromazepam 10-2 M în trei zile consecutive. S-au efectuat trei măsurători, media lor se regăsește în tabelul 70. S-a calculat abaterea standard (SD) și abaterea standard relativă (RSD).

Limita de detecție și limita de cuantificare

Prin metoda grafică s-a determinat limita de detecție de 0,13 μg/L, iar limita de cuantificare este de 0,41 μg/L.

Optimizarea metodei

Pentru optimizarea metodei de dozare a bromazepamului folosind electrodul pastă de carbon bromazepam selectiv au fost urmărite:

influența pH-ului: electrodul pastă de carbon modificat a fost introdus alături de electrodul de referință într-o soluție de acid clorhidric 10-1 M, căreia i s-a ajustat pH-ul în sens crescător cu soluție de NaOH 10-1 M, până la 12. Reprezentarea grafică a variației potențialului în funcție de pH se regăsește în figura 60. Palierul orizontal a fost obținut pe intervalul de pH = 4,3 – 6,8

timpul de răspuns: al electrodului este în jur de 30 s

selectivitatea electrodului: pentru aceasta au fost preparate soluții de bromazepam (i) și ion secundar (j) (interferent) de concentrații identice (10-3 mol/L). La alegerea interferenților s-a ținut cont ca aceștia să se găsescă în lichidele biologice, să prezinte structuri asemănătoare cu bromazepamul sau să constituie excipienți care se găsesc în comprimatele de bromazepam.

Determinările coeficientului de selectivitate au fost efectuate atât în soluție de bromazepam și soluție de interferent luate separat Kij (1) cât și în amestec de soluții bromazepam-interferent Kij (2).

Selectivitatea electrodului este bună în prezența unor cationi comuni a căror interferență este neglijabilă. Valori superioare ale selectivități, dar nu cu diferențe foarte mari, se obțin pentru soluții separate în comparație cu amestecul de soluție de bromazepam și interferent. Au fost efectuate măsurători și pentru soluții de interferenți mai concentrate de 10 ori decât soluția de bromazepam, dar electrodul prezintă interferențe în acest caz.

Determinarea bromazepamului din forme farmaceutice

Calmepam 3 mg a fost forma farmaceutică din care s-a dozat bromazepamul. În acest sens au fost preparați 10 mL soluție bromazepam de concentrație 10-3 M prin cântărirea cantității corespunzătoare de pulbere, după modul descris anterior.

Volume diferite din soluția astfel obținută (concentrația soluției este 10-3M) s-au titrat cu soluție de acid fosfomolibdenic 10-3 M în tampot acetat (pH = 4,6).

S-au efectuat câte 6 titrări pentru volume de 1, 2, 3, 4, 5 și 6 mL soluție bromazepam 10-3 M luată în lucru, adusă peste 5 mL tampon acetat (pH = 4,6), în tabelul 72 fiind trecute cantitățile de bromazepam luate în lucru și cele găsite, dar și calculul statistic aferent acestor dozări.

Analog cu ceilalți electrozi studiați până acum, se obține o valoare subunitară a RSD, deci metoda de dozare este valabilă și poate fi utilizată cu succes la dozarea bromazepamului. Regăsirea medie obținută (99,91%) corespunde unei valori de 2,9973 mg/cp bromazepam, indicând faptul că comprimatele de Calmepam sunt conforme cu prevederile FR X referitoare la conținutul de substanță activă (2,7 – 3,3 mg/cp).

Concluzii

Au fost preparați trei electrozi pastă de carbon modifiicați selectiv cu : reineckat de bromazepam, fosfowolframat de bromazepam și fosfomolibdat de bromazepam, cu ajutorul cărora s-a determinat cantitativ bromazepamul din Calmepam 3 mg/cp. prin titrare potențiometrică, după ce în prealabil au fost stabilite pentru fiecare electrod în parte domeniul de liniaritate, exactitatea metodei aplicate, repetabilitatea și reproductibilitatea, limita de detecție și cuantificare. Toate comprimatele de Calmepam luate în lucru au corespuns cu prevederile FR X din punct de vedere al substanței active.

Așa cum reiese din tabelele prezentate anterior la dozarea diazepamului, flunitrazepamului și bromazepamului din comprimatele de Diazepam (10mg/cp.), Fluninoc (1 mg/cp.) respectiv Calmepam (3 mg/cp.) aceste metode de dozare folosind electrozi pastă de carbon modificați selectiv se pretează foarte bine la determinarea benzodiazepinelor prin titrare potențiometrică, ceea ce este dovedit de valorile foarte bune ale regăsirilor procentuale, valori mici – subunitare ale RSD% și de evaluarea statistică a rezultatelor analitice.

III. 5. Studii voltametrice preliminare asupra diazepamului

În tehnicile voltametrice se utilizează 3 electrozi și anume:

electrod indicator

electrod de referință

electrod auxiliar

Acești electrozi sunt conectați la un potențiostat care controlează potențialul de lucru și în același timp măsoară curentul rezultat.

În primele studii voltametrice efectuate s-a realizat stabilirea condițiilor experimentale de analiză voltametrică folosind următorii electrozi indicatori:

electrod de carbon vitros

electrod de platină

electrod de aur

Ca și electrod de referință s-a folosit electrodul de Ag/AgCl, KCl sat. cu dublă joncțiune, iar un fir de platină a constituit electrodul auxiliar sau contraelectrodul.

În vederea efectuării analizei voltametrice preliminare, dintre numeroasele metode voltametrice disponibile s-au ales două metode frecvent utilizate și anume voltametria cu baleiaj liniar (LSV) și voltametria ciclică (CV). În cazul LSV se execută un baleiaj liniar al potențialului la electrodul indicator (de lucru), în sens anodic sau catodic într-un singur sens, iar în cazul CV baleiajul liniar se execută în ambele sensuri.

În cazul voltametriei cu baleiaj liniar, potențialul electrodului indicator variază cu viteză constantă într-un anumit interval de potențial și se măsoară curentul rezultat [38].

Pentru a induce un curent care să treacă prin celula electrochimică, și pentru ca reacția electrochimică să poată avea loc este necesar ca diferența de potențial să depășească potențialul de curent zero cu cel puțin valoarea supratensiunii celulei, care reprezintă suma supratensiunilor celor doi electrozi (Eind. și Eref.) și supratensiunea ohmică (IR) datorată trecerii curentului prin electrolit:

Eaplicat = Eind. + Eref. + IR

Căderea ohmică de potențial este una dintre problemele critice cauzate în voltametrie de caracteristicile de mediu care intervin în fenomenele de transport de reactant, în special de conductivitatea (rezistența) soluției și de vâscozitatea soluției.

Căderea ohmică de potențial, iR, poate induce efecte înșelătoare în experimentele electrochimice, de exemplu în voltametria ciclică poate determina deplasări ale potențialului de pic și scăderi ale valorilor intensităților curenților de pic [86]. În tehnicile impulsionale se modifică valoarea potențialului aplicat și distorsionează forma semnalului de răspuns (intensitatea curentului).

Voltametria ciclică este una dintre cele mai importante și utilizate tehnici electroanalitice, fiind foarte mult utilizată în studierea proceselor redox și pentru înțelegerea reacțiilor intermediare, deoarece observarea simultană a undei de reducere și a celei de oxidare ne oferă posibilitatea urmăririi proceselor care se desfășoară la suprafața electrozilor. În schimb, voltametria ciclică este mai puțin utilizată pentru determinări cantitative.

Diazepamul (dar și celelate benzodiazepine ca: flunitrazepam, bromazepam, medazepam, nitrazepam, etc) se pretează la analize voltametrice deoarece gruparea –CR=N- din nucleul benzodiazepinic este redusă la –CHR-NH- prin acceptarea a doi electroni (e-) și implicit a doi protoni (H+), conform reacției:

Electrodul indicator folosit a fost electrodul de carbon vitros (glassy carbon electrode – GCE) care are o bună stabilitate mecanică, permițând realizarea anumitor modificări la suprafață prin depunerea unor filme metalice (mercur, bismut, rodiu, iridiu, etc) foarte subțiri. Un alt avantaj al electrodului de carbon vitros este conductivitatea electrică foarte bună, adică o rezistență foarte mică cuprinsă între 3,7.10-3 – 4,5.10-3 Ω.cm în funcție de temperatura de preparare (1000-3000°C).

Structura carbonului vitros conține suprafețe de grafit dispuse conform complexului topologic din figura 61:

Dintre numeroase avantaje pe care le are electrodul de carbon vitros, trebuie reamintit faptul că el este:

inert;

robust;

are activitate electrocatalitică înaltă.

Dar, electrodul de carbon vitros (și nu numai el) are dezavantajul că prezintă așa-numitul efect de memorie care necesită reînoirea suprafaței electroactive după fiecare utilizare. Această reînnoire se poate realiza în două moduri:

prin șlefuire mecanică pe pâslă-fetru

prin regenerare electrochimică sau chimică

Pe lângă acest electrod s-a mai utilizat în studiul voltametric electrozi indicatori de palatină și aur.

III. 5. 1. Aparatura utilizată în studiile voltametrice

Metodele voltametrice au fost efectuate cu ajutorul a două sisteme electrochimice:

Un sistem electrochimic modular (Autolab, Eco Chemie, Olanda) echipat cu un potentiostat PSTAT30 controlat de softul GPES 4.9 (Eco Chemie).

Combina electrochimică TRACELAB 50 utilizind software-ul TRACE MASTER 5 de la RADIOMETER ANALYTICAL. Analizorul polarografic este un analizor controlat de un microprocesor utilizat atât pentru tehnici de analiză polarografice cât și voltametrice. POL150 lucrează la o frecvență de pâna la 200 Hz. Combina permite toate tehnicile de măsură polarografice cât și diferențial pulse. Soft-ul aferent controlează toți parametrii de proces și poate recunoaște o serie de maxime polarografice sau poate fi calibrat pentru recunoașterea maximelor de interes.

Aparatura cu care s-a efectuat voltametria puls diferențială a constat dintr-un Analizor polarografic POL150 prevăzut cu un Stand polarografic MDE 150 (figura 62).

Pentru primul sistem electrochimic soluția de analizat a fost introdusă într-o celulă electrochimică standard de 15 mL echipată cu trei electrozi :

electrod de lucru:

carbon vitros – Metrohm, Germania,

electrod de Pt – BAS Inc. (Bioanalytical Systems, USA),

electrod de Au – BAS Inc. (Bioanalytical Systems, USA).

electrod de referință: Ag/AgCl, KCl sat., dublă joncțiune – Naposenz, Cluj-Napoca, România

contraelectrod: fir de Pt – Naposenz, Cluj-Napoca, România.

Valoarea pH-ului soluțiilor electrolit suport a fost determinată cu un electrod combinat de sticlă conectat la pH-metru Chemcadet.

Suprafața electrodului de carbon vitros s-a curățat prin șlefuire manuală folosind suspensie de diamant cu granulație foarte fină (diametrul particulelor de 0,1 µm), urmată de spălare cu apă bidistilată și sonicare în metanol timp de 5 minute atât la început cât și între fiecare etapă a detereminării.

Deoarece prin reducere baleiajul potențialului se face în sens catodic, este necesar ca în prealabil să se efectueze deoxigenarea soluției prin barbotare de azot pur timp de 5-10 minute.

III. 5 .2. Influența pH-ului asupra răspunsului voltametric

În vederea stabilirii condițiilor optime de detecție și determinare cantitativă a diazepamului au fost efectuate voltamogramele unei soluții de diazepam în diferite soluții de electrolit suport (tampon KCl/HCl, tampon acetat, Britton-Robinson) la diferite pH-uri ale acestora.

Prepararea soluțiilor

Electrolit suport.

Tampon KCl/HCl se prepară din soluție de HCl 0,1 M și KCl 0,1 M astfel (tabelul 73):

Tampon acetat 0,01M: pentru pH = 4,6 și 5 se prepară conform Farmacopeei Române, ediția a X-a.

Tampon Britton-Robinson 0,04 M: se prepară separat soluții de CH3-COOH 0,04 M, H3PO4 0,04 M și H3BO3 0,04 M și se amestecă în părți egale. La un volum de 50 mL soluție astfel preparată se adaugă un anumit volum de NaOH 0,2 N sub agitare continuă până se obține pH = 3 măsurat de pH-metrul Chemcadet prin intermediul electrodului combinat de sticlă. Analog se prepară și celelalte soluții de tampon Britton-Robinson de pH = 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 6; 7; 8 și 9.

Soluții stoc

Soluție stoc de diazepam 10-3 M în metanol: se cântăresc 0,02847 g diazepam care se aduc cantitativ într-un flacon volumetric de 10 mL peste care se adaugă metanol, se dizolvă și se completează la semn. Din acestă soluție care are concentrația de 10-2 M se ia 1 mL care se introduce într-un alt flacon volumetric de 10 mL aducându-se la semn cu metanol.

Soluție stoc de diazepam 10-3 M în acid clorhidric: se cântăresc 0,02847 g diazepam care se aduc cantitativ într-un flacon volumetric de 10 mL peste care se adaugă HCl 10-1M, se dizolvă și se completează la semn. Din acestă soluție care are concentrația de 10-2 M se ia 1 mL care se introduce într-un alt flacon volumetric de 10 mL aducându-se la semn cu acid HCl 5.10-3 M.

Pentru realizarea acestui studiu s-au ales 6 viteze diferite de scanare (25; 50; 75; 100; 150 și 200 mV/s) a soluției blanc, dar și pentru soluție de diazepam 1.10-3 M dizolvat în soluție de HCl 5.10-3 M respectiv în metanol. Concret s-a început cu citirea blancului (soluție tampon 5 mL) la diferite viteze de baleiaj, după care la această soluție blanc s-au adaugat 500 μL soluție acidă respectiv metanolică de diazepam 10-3 M, rezultând o soluție de diazepam finală de concentrație 9,09.10-5 M).

Domeniul de baleiaj al potențialului s-a ales între 0,0V …. -1,5V pentru analizele preliminare, urmând ca acesta să se restrângă pentru dozarea diazepamului.

În figurile 63, 64, 65 și 66 sunt prezentate voltamogramele ciclice și liniare folosind ca și suport electrolit tamponul acetat (pH = 5,0 și 4,6) și tamponul Britton-Robinson (pH = 9,0; 6,0 și 3,0). Alături de fiecare serie de voltamograme (conțin voltamogramele pentru soluția blanc, soluția de diazepam dizolvat în acid clorhidric și soluția de diazepam dizolvat în metanol) este prezentat un tabel în care se află valorile de potențial la care apare picul de reducere catodică a diazepamului.

În figura 63 a sunt prezentate voltamogramele ciclice la diferite viteze de scanare pentru electrolitul tampon acetat (pH = 5,0) numai în sens catodic pe intervalul 0,2 … -1,6 V de unde se remarcă absența picurilor. În schimb în figurile 63 b și 63 c (unde s-a adăugat soluție de diazepam), se observă apariția unor picuri de reducere care se deplasează spre valori negative odată cu creșterea vitezei de scanare pentru cele două soluții de diazepam dizolvat în acid clorhidric respectiv metanol.

Din tabelul 74 se observă că valoarea potențialului de reducere a diazepamului cea mai mică se obține pentru o viteză de scanare de 25 mV/s, aceste fiind comparabile atât pentru diazepam dizolvat în acid clorhidric cât și în metanol.

Analog, în figura 64 a sunt prezentate voltamogramele ciclice la diferite viteze de scanare pentru electrolitul tampon acetat (pH = 4,6) numai în sens catodic pe intervalul 0,2 … -1,6 V de unde se remarcă absența picurilor. În schimb în figurile 64 b și 64 c (unde s-a adăugat soluție de diazepam), se observă apariția unor picuri de reducere (mai puțin evidențiate în cazul soluției de diazepam dizolvat în metanol) care se deplasează spre valori negative odată cu creșterea vitezei de scanare.

Din tabelul 75 se observă că cea mai mică valoare a potențialului de reducere pentru diazepam se obține pentru o viteză de scanare de 25 mV/s, cu mențiunea că în cazul diazepamului dizolvat în acid clorhidric potențialul este inferior față de diazepam dizolvat în metanol.

În figura 65 a sunt prezentate voltamogramele cu baleiaj liniar în sens catodic pe intervalul 0,2 … -1,6 V la diferite viteze de scanare pentru electrolitul tampon acetat (pH = 5,0) unde se remarcă absența picurilor. În schimb în figurile 65 b și 65 c (unde s-a adăugat soluție de diazepam), se observă apariția unor picuri de reducere care se deplasează spre valori negative odată cu creșterea vitezei de scanare.

Din tabelul 76 se observă că cea mai mică valoare a potențialului de reducere pentru diazepam se obține la o viteză de scanare de 25 mV/s, cu mențiunea că în cazul diazepamului dizolvat în acid clorhidric potențialul este inferior față de diazepam dizolvat în metanol.

În figura 66 a sunt prezentate voltamogramele cu baleiaj liniar în sens catodic pe intervalul 0,2 … -1,6 V la diferite viteze de scanare pentru electrolitul tampon acetat (pH = 4,6) unde se remarcă absența picurilor. În schimb în figurile 66 b și 66 c (unde s-a adăugat soluție de diazepam), se observă apariția unor picuri de reducere care se deplasează spre valori negative odată cu creșterea vitezei de scanare.

Din tabelul 77 se observă că cea mai mică valoare a potențialului de reducere pentru diazepam se obține la o viteză de scanare de 25 mV/s, cu mențiunea că în cazul diazepamului dizolvat în acid clorhidric potențialul este inferior față de diazepam dizolvat în metanol.

În concluzie, în urma studierii acestor voltamograme, picul cu potențialul de reducere cel mai mic, în valoare absolută, se obține în mediu de tampon acetat (pH = 4,6) la o viteză de scanare de 25 mV/s.

De asemenea s-a efectuat același studiu pentru cele două soluții de diazepam dizolvat în solvenți diferiți prin voltametrie puls diferențială, în figura 67 fiind prezentate voltamogramele puls diferențiale pentru o soluție de diazepam de concentrație 9,09.10-5 M în soluție de acid clorhidric 5.10-3M, respectiv metanol. Voltamogramele sunt înregistrate în soluție de electrolit tampon acetat la două valori de pH diferite.

Voltametria puls diferențială s-a efectuat cu:

timp de modulare: 0,04 s;

interval de timp: 0,5 s;

pasul potențialului: 0,01005 V, sau viteza de baleiaj: 20 mV/s;

potențial de așteptare: 0,5 V.

Studiind voltamogramele înregistrate mai sus pentru o soluție de diazepam în tampon acetat la două valori de pH și anume 4,6 respectiv 5, se observă că valoarea mai mică a potențialului de reducrere a diazepamului se obține atunci când se folosește electrolit suport de tampon acetat la pH = 4,6 intensitatea curentului fiind aproximativ egală în ambele cazuri pentru diazepamul dizolvat în acid clorhidric.

Studiul voltametriei ciclice a soluției de diazepam a continuat cu folosirea tamponului Britton-Robinson 0,04 M ca și electrolit suport la trei valori de pH (3, 6, 9).

În acest sens se folosește ca și electrolit, tampon Britton-Robinson căreia i se ajustează pH-ul cu soluție de NaOH 0,1N. Voltamogramele cu baleiaj ciclic și liniar înregistrate la diferite pH-uri sunt prezentate în figurile 68-73:

În figura 68 a sunt prezentate voltamogramele ciclice la diferite viteze de scanare pentru electrolitul Britton-Robinson (pH = 9,0) unde se remarcă absența picurilor, care nu apar nici la adăugarea soluției de diazepam (figurile 68 b și 68 c), deci în acest caz picurile sunt nedefinite (tabelul 78). Absența picurilor se poate datora valorii de pH prea mare la care se efectuează înregistrarea voltamogramelor.

În figura 69 a sunt prezentate voltamogramele ciclice la diferite viteze de scanare pentru electrolitul Britton-Robinson (pH = 6,0) unde se remarcă absența picurilor, care apar odată cu adăugarea soluției de diazepam (figurile 69 b și 69 c). Valoarea potențialului acestor picuri se deplasează spre valori negative odată cu creșterea vitezei de scanare (tabelul 79), existând diferențe neseminificative pentru diazepamul dizolvat în ce doi solvenți.

Analog, în figura 70 a sunt prezentate voltamogramele ciclice la diferite viteze de scanare pentru electrolitul Britton-Robinson (pH = 3,0) unde se remarcă absența picurilor, care apar odată cu adăugarea soluției de diazepam (figurile 70 b și 70 c). Ca și în cazul anterior, valoarea potențialului acestor picuri se deplasează spre valori negative odată cu creșterea vitezei de scanare (tabelul 80), existând diferențe neseminificative pentru diazepamul dizolvat în ce doi solvenți.

În figura 71 a sunt prezentate voltamogramele cu baleiaj liniar la diferite viteze de scanare pentru electrolitul Britton-Robinson (pH = 9,0) unde se remarcă absența picurilor, care se menține și după adăugarea soluției de diazepam (figurile 71 b și 71 c). Analog cu voltametria ciclică, picurile nu sunt definite (tabelul 81) în cazul folosirii electrolitului Britton-Robinson (pH = 9,0). Absența picurilor se poate datora valorii pH-ului prea mare la care se efectuează înregistrarea voltamogramelor.

În figura 72 a sunt prezentate voltamogramele cu baleiaj liniar la diferite viteze de scanare pentru electrolitul Britton-Robinson (pH = 6,0) unde se remarcă absența picurilor, care devin foarte evidente odată cu adăugarea soluției de diazepam (figurile 72 b și 72 c). Valoarea potențialului acestor picuri se deplasează spre valori negative odată cu creșterea vitezei de scanare (tabelul 82), valori mai mici ale acestuia (în valoare absolută) obținându-se pentru soluția de diazepam în acid clorhidric.

În figura 73 a sunt prezentate voltamogramele cu baleiaj liniar în sens catodic pe intervalul 0,0 … -1,0 V la diferite viteze de scanare pentru electrolitul tampon Britton-Robinson (pH = 3,0) unde se remarcă absența picurilor. În schimb în figurile 73 b și 73 c (unde s-a adăugat soluție de diazepam), se observă apariția unor picuri de reducere care se deplasează spre valori negative odată cu creșterea vitezei de scanare.

Din tabelul 83 se observă că cea mai mică valoare a potențialului de reducere pentru diazepam se obține la o viteză de scanare de 25 mV/s, cu mențiunea că nu există diferențe semnificative între valorile potențialelor pentru diazepam dizolvat în acid clorhidric și metanol.

În concluzie, din analiza voltamogramelor, care au o alură identică pentru fiecare caz în parte (ciclică și liniară), se observă că valoarea cea mai mică a potențialului de reducere a diazepamului este obținută în tampon Britton-Robinson 0,04 M la pH = 3, (Ered = -852,3 mV) iar din punctul de vedere al vitezei de baleiaj este mai convenabilă viteza de 25 mV/s. Acestă remarcă este confirmată de valorile tabelul 83 unde E25mV/s = -852,3 mV și E200mV/s = -902,8 mV, iar diferența celor două potențiale constituie un câștig energetic de 50,5 mV în favoarea procesului de reducere.

De altfel, în literatura de specialitate se arată că prin metode polarografice, soluția metanolică de diazepam în electrolit Britton-Robinson (pH = 2,8) prezintă un pic de reducere la -780 mV [88].

De remarcat este faptul că la pH = 9, picurile voltametrice nu sunt definite, ceea ce înseamnă că la această valoare a pH-ului nu se pot face determinări, deci se poate spune că picurile de reducere prezintă o tendință de nedefinire odată cu creșterea valorică a pH-ului.

O analiză mai precisă a influenței pH-ului asupra optimizării analizei voltametrice a diazepamului a fost realizată la mai multe valori ale pH-ului pentru o soluție de diazepam dizolvat în metanol. Practic s-au adăugat 500 µL soluție metanolică de diazepam în 5 mL soluție de electrolit. În figurile 74 (a – l) se prezintă voltamogramele liniare, înregistrate cu un electrod de carbon vitros față de electrodul de Ag/AgCl, KCl sat., folosind ca și contraelectrod un fir de platină, în ordinea crescătoare a pH-ului (la 4 viteze de baleiaj diferite), începând cu 1,1 (asigurat de o soluție de KCl/HCl) și terminând cu pH = 8 (asigurat de o soluție tampon Britton-Robinson). Valoarea pH-ului a fost măsurată cu un electrod combinat de pH, conectat la un pH-metru Chemcadet.

În tabelul 84 se găsesc valorile potențialelor din voltamogramele de mai sus la care apare picul de reducere a diazepamului:

Așa cum se observă din tabel valoarea cea mai mică a potențialului de reducere a diazepamului se obține atunci când se folosește electrolit suport cu pH = 1,5 iar viteza de scanare este de 25 mV/s, picul de reducere fiind bine evidențiat.

Un alt studiu efectuat a constat în folosirea electrozilor de platină și de aur ca electrod indicator, dar s-a constatat că nu este posibilă determinarea diazepamului folosind acești electrozi, picurile de reducere a diazepamului nefiind definite în nici unul din cazuri.

Pentru verificarea existenței unor fenomene de adsorbție a diazepamului la suprafața electrodului de carbon vitros s-a efectuat scanarea liniară în sens catodic a unei soluții de diazepam de concentrație 2,75.10-4 M (electrolit suport: tampon Britton-Robinson, pH = 2,8) la diferite viteze de baleiaj a potențialului (figura 75).

În continuare s-a reprezentat variația intensității curentului în funcție de rădăcina pătrată a vitezei de baleiaj pe domeniul 9 – 225 mV/s (figura 76):

Datorită faptului că toate punctele se află pe o dreaptă înseamnă că nu există fenomene de adsorbție a analitului la suprafața electrodului pe acest domeniu al vitezei de baleiaj.

Panta dreptei reprezintă coeficientul de difuziune al diazepamului la suprafața electrodului de carbon vitros, adică 1,11 x 10-6 cm2/s.

III. 6. Dozarea diazepamului prin metode voltametrice

III. 6. 1. Voltametrie cu baleiaj liniar utilizând electrodul de carbon vitros

Pentru determinarea cantitativă a diazepamului s-au preparat soluții stoc de diazepam de concentrație 10-2 M, în metanol din care prin diluții corespunzătoare s-au preparat soluții de concentrație 10-3 și 10-4 M necesare protocolului de analiză.

Conform acestui protocol se adaugă peste 5 mL soluție de electrolit, tampon Britton-Robinson (B-R) 0,04 M (pH = 2,8), volume cunoscute din soluțiile de diazepm preparate anterior, obținându-se astfel soluții de diferite concentrații cărora li se înregistrează voltamograma cu baleiaj liniar.

Se folosește ca și electrod indicator electrodul de carbon vitros. Mai trebuie menționat că inițial a fost efectuată o deoxigenare prin barbotare de N2 pur timp de 10 min., iar după fiecare adăugare de soluție de diazepam, se efectuează agitări și deoxigenări intermediare timp de 30 secunde.

Viteza de scanare optimă a fost de 25 mV/s, iar voltamogramele cu baleiaj liniar a soluțiilor respective sunt prezentate în figura 77, în tabelul 85 fiind trecute numai valorile care au putut fi citite.

Astfel, picul de reducere de la –0,83 V crește liniar cu concentrația de diazepam adăugată. Reprezentând grafic logaritmul zecimal cu semn schimbat al concentrației de diazepam în funcție de intensitatea curentului, se observă că domeniul liniar este cuprins între 1,62.10-4 și 2,54.10-5 M (figura 78).

Intervalul liniar este foarte restrâns, dar există posibilitatea ca acesta să fie mărit prin folosirea altor tehnici voltametrice sau a unui electrod pastă de carbon nemodificat sau modificat cu diferite argile în locul electrodului de carbon vitros folosit până acum.

Electrod carbon vitros cu film metalic de mercur

Compușii organici sau anorganici care se pot reduce pot fi dozați prin metode electrochimice, folosind o serie de senzori electrochimici.

Dintre acești senzori, electrodul de carbon vitros (sau electrodul pastă de carbon) pe care se află depus un strat de mercur are avantajul de a prezenta un zgomot de fond redus și de a poseda un suprapotențial de hidrogen ridicat, ceea ce se traduce prin lărgirea domeniului de investigare a analiților. Dezavantajul utilizării electrodului cu film de mercur constă în reproducerea dificilă a suprafeței de mercur și a toxicității acestuia care nu îi permite a fi utilizat în sistemele de analize în flux.

Prepararea filmului de mercur pe electrodul de carbon vitros

Depunerea filmului de mercur se realizează după o prealabilă curățare a electrodului de carbon vitros prin polizare manuală utilizând o suspensie de diamant cu granulație de 0,1 µm, urmată de spălare și introducere în metanol pentru ultrasonare (acest ciclu de operații se repetă de 3 ori).

Pe suprafața curată a electrodului de carbon vitros, mercurul se depune prin electroliză la -1,0 V față de Ag/AgCl, KCl sat. timp de 300 s, după o prealabilă dezaerare cu azot pur timp de 10 minute, dar sub agitare permanentă, dintr-o soluție care conține 10-3 mol/L Hg(NO3)2, 10-1 mol/L KNO3 și 10-2 mol/L HNO3.

Eliminarea sau reînoirea filmului de mercur se face pe cale electrochimică, aplicând un potențial de +0,3 V față de Ag/AgCl, KCl sat. timp de 60 s, după care se poate aplica imediat un nou strat de film metalic.

Pentru verificarea existenței unor fenomene de adsorbție a diazepamului la suprafața filmului de mercur depus pe un electrod de carbon vitros s-a efectuat scanarea liniară în sens catodic a unei soluții de diazepam de concentrație 3,77.10-5 M (electrolit suport: tampon Britton-Robinson, pH = 2,8) la diferite viteze de baleiaj a potențialului (figura 79).

Variația intensității curentului în funcție de rădăcina pătrată a vitezei de baleiaj pe domeniul 9 – 225 mV/s (figura 80) se produce liniar, ceea ce înseamnă că nu există fenomene de adsorbție pe acest domeniu al vitezei de baleiaj.

Panta dreptei reprezintă coeficientul de difuziune al diazepamului la suprafața filmului de mercur depus pe electrodul de carbon vitros, adică 0,946 x 10-6 cm2/s.

III. 6. 2. Voltametrie puls diferențială utilizând electrod de carbon vitros

O metodă cu sensibilitate superioară de dozare a diazepamului este voltametria puls diferențială, prin care diferența de potențial se aplică sub formă de pulsații.

Folosind această metodă, s-au efectuat studii de optimizare a metodei în tampon Britton-Robinson (pH = 2,8), utilizând doi electrozi indicatori:

electrodul de carbon vitros (GC);

electrodul de carbon vitros cu film de mercur (Hg-GC);

Potențialul a fost măsurat față de Ag/AgCl, iar domeniul de potențial utilizat este -0,5 V …. -1,5V. Sistemul de măsurare a fost același, adică sistemul electrochimic Autolab cu soft-ul corespunzător, cei trei electrozi și celula voltametrică standard de 15 mL.

Înainte de scanare, în soluție se barbotează azot pur timp de 10 min pentru dezaerare și 30 s după adăugarea fiecărei probe. În timpul scanării se menține o pătură de azot deasupra soluției care are rolul de a împiedica redizolvarea oxigenului din atmosferă.

În urma optimizării curentului de reducere a diazepamului prin voltametrie puls difernțială, s-a ajuns la concluzia că se pot obține rezultate bune atunci când se lucrează cu o viteză de scanare de 10,05 mV, rezultată dintr-un timp de modulare de 40 ms la o amplitudine de modulare de 100 mV într-un interval de 0,5 s cu un pas al potențialului de 5,1 mV.

În urma acestor studii preliminare s-a încercat trasarea curbelor de calibrare pentru fiecare electrod prin metoda adaosului standard, adică s-au adăugat volume de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 și 15 µL, soluție de diazepam 10-3 M în HCl 10-3 M, în 5 mL soluție electrolit tampon Britton-Robinson (pH = 2,8).

Voltamogramele puls diferențiale pentru o serie de soluții de diazepam de concentrație crescătoare, utilizând cei doi electrozi, sunt prezentate în figurile 81 și 82:

Din figurile de mai sus se poate remarca că, între curenții de reducere în cazul celor doi electrozi, pentru aceeași concentrație de diazepam nu sunt diferențe semnificative, ceea ce poate însemna o otrăvire prematură a filmului de mercur.

S-au efectuat 3 serii de măsurători pentru pentru fiecare electrod indicator folosit în parte, mediile intensităților curentului de reducere fiind prezentate în tabelul următor.

Se observă din tabelul 86, că în cazul folosirii electrodului de carbon vitros cu film de mercur, intensitatea curentului de reducere crește cu o medie de 122,83% față situația în care se utilizează electrodul de carbon vitros fără depunere de film metalic.

Dreptele de calibrare (pe domeniul liniar: 2,53.10-5 –- 3,98.10-6 M) obținute prin reprezentarea grafică a intensității curentului de reducere în funcție de concentrația soluției de diazepam, sunt prezentate în figurile 83 și 84:

Din cele două drepte de calibrare de mai sus, se observă coeficientul de corelație superior al electrodului HgGC, pantele dreptelor și cele două ordonate la origine au același ordin de mărime, fiind aproape egale.

Totuși, trebuie precizat că în cazul utilizării electrodului HgGC, intensitatea picului de reducere este superioară cazului în care se folosește GCE.

Dezavantajul electrodului de carbon vitros cu film de mercur apare datorită imposibilității de repetare a analizelor succesive pe același electrod care își modifică suprafața după fiecare analiză, iar reînoirea filmului metalic, necesită o perioadă de timp (curățare electrochimică, curățare mecanică, ultrasonicare, depunere de film și spălarea electrodului), de care nu întotdeauna beneficiază analistul. În acest context, este mai avantajos să fie folosit electrodul de carbon vitros, unde nu este nevoie de etape intermediare de pretratament sau condiționare, cu atât mai mult cu cât nu există o diferență semnificativă între erorile procentuale relative a pantelor curbelor de calibrare pentru cele două situații.

III. 6. 3. Validarea metodei de dozare a diazepamului prin voltametrie puls diferențială cu electrod de carbon vitros

Metodologia de validare are scopul de a demonstra că o metodă de analiză corespunde utilizării pentru care a fost elaborată [89, 90, 91].

Așa cum reiese din studiile anterioare electrodul de carbon vitros este electrodul cel mai potrivit pentru analiza voltametrică a diazepamului. În acest context s-a încercat validarea metodei de dozare a diazepamului (liniaritate, exactitate, limită de detecție și cuantificare), substanță farmaceutică, prin voltametrie puls diferențială, utilizând electrodul respectiv. Procedeul de dozare este analog cu cel descris anterior, adică, s-a folosit metoda adaosului standard, adăugând trei serii de volume: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 și 150 µL, soluție de diazepam 10-3 M în HCl 10-3 M, în 5 mL soluție electrolit tampon Britton-Robinson (pH = 2,8).

În continuare se calculează parametrii de liniaritate și testele de omogenitate ale varianțelor pentru 3 serii independente la fiecare din cele 5 nivele de concentrație alese în așa fel încât să avem: 60%, 80%, 100%, 120% și 140%. Concentrația de 100% s-a ales la mijlocul domeniului liniar adică pentru o soluție de diazepam 1,40.10-5 M, iar celelate concentrații sunt: 8,43.10-6 M (60%), 1,12.10-5 M (80%), 1,68.10-5 M (120%) și 5,60.10-5 M (140%).

Soluțiile respective conțin:

S-au efectuat trei serii independente de concentrații a unor soluții de diazepam, datele înregistrate fiind prezentate în tabelul 88:

Testul de omogenitate a varianțelor (Testul Cochran) s-a aplicat varianțelor lui Yij pentru a verifica omogenitatea varianțelor constitutive ale erorii experimentale.

Se observă că ccalculat < cteoretic, ceea ce înseamnă că ansamblul varianțelor diferitelor grupuri j pot fi considerate omogene cu riscul 0,05%.

Test de existență a unei pante semnificative (Testul Fisher) constă în compararea variațiilor datorate regresiei și erorilor experimentale de ajustare.

Deoarece valoarea lui Fcalculat este semnificativă, se poate trage concluzia că există o pantă cu dependență lineară de pragul de probabilitate considerat (0,05).

Testul de validitate a dreptei de regresie (Fisher) permite să se compare erorile de ajustare () și experimentale ().

Se observă că valoarea lui Fcalculat nu este semnificativă, deci se poate considera că ajustarea este validă, la pragul de probabilitate considerat (0,05).

Testul de comparare a ordonatei la origine cu zero permite să verifice dacă ordonata la origine nu este semnificativ diferită de zero.

Se observă că valoarea lui tcalculat este mai mică decât t(0,05; 13), deci se poate considera că ordonata la origine nu este semnificativ diferită de zero, cu probabilitatea: p = 1- 0,05 = 0,95.

Exactitate

Testul de omogenitate a varianțelor (Testul Cochran)

Test de validitate a mediilor

Intervalul de încredere al mediei regăsite:

Calculul limitei de detecție (LD) și cuantificare (LQ)

Limita de detecție poate fi estimată plecând de la valorile deviației standard și pantei; analog se calculează limita de cuantificare:

LD = și LQ =

Limita de cuantificare este de aproximativ 3x mai mare decât limita de detecție și reprezintă cantiatea minimă de analit care dintr-o substanță care se poate doza în condițiile experimentale descrise, cu o fidelitate și o exactitate definită.

Dozarea diazepamului din forme farmaceutice prin voltametrie puls diferențială cu electrod de carbon vitros

Pentru pregătirea probei de analiză, se cântăresc 30 comprimate Diazepam (10mg/cp.) și se calculează masa medie a unui comprimat (). Apoi se omogenizează tabletele prin triturare și se cântărește o probă de 58,09 mg pulbere care să corespundă la o soluție de cca.10-3 M obținută prin dizolvarea pulberii într-un flacon volumetric de 10 mL. Dozarea efectivă s-a realizat prin metoda adaosului standard adăugând 0,50 mL (0,52, 0,54, 0,56 și 0,58 mL) soluție mai sus preparată peste 10 mL soluție electrolit urmată de adăugarea de cinci ori a câte 0,5 mL soluție diazepam 10-3 M (284,7 μg/mL) cu înregistrarea voltamogramelor stripping adsorbtive corespunzătoare (figura 85). Pentru fiecare volum de soluție de diazepam formă farmaceutică operația a fost repetată de încă două ori iar în tabelul 89 se regăsesc valorile medii ale intensităților curentului.

Această operație s-a efectuat de câte trei ori pentru fiecare concentrație în parte, rezultatele obținute fiind redate mai jos:

a Media a trei determinări

Se remarcă din tabelul de mai sus rezultatele bune obținute la dozarea diazepamului din comprimate de Diazepam și anume valorile regăsirii medii fiind în apropiere de 100% precum și valoare mică a deviației relative standard care oferă o informație netă asupra calității rezultatelor analitice.

III. 6. 4. Dozarea diazepamului prin voltametrie puls diferențială cu electrod pastă de carbon modificat

Un alt electrod folosit la dozarea diazepamului a fost electrodul pastă de carbon modificat cu CAOLIN (argilă cu formula Al(OH)4(SiO5) de culoare albă sau ușor colorată de impurități, insolubilă în apă, alcătuită din caolinit, întrebuințată în industria ceramicii, a hârtiei, a sticlei, în medicină etc.), care a fost preparat prin amestecarea a 40 mg pudră carbon, 15 mg caolin și 20 μL dioctilftalat (DOP). Modul de preparare fost descrisă anterior la metodele de dozare potențiometrică.

Pentru determinarea cantitativă a diazepamului s-au preparat soluții stoc de diazepam de concentrație 10-3 M din care prin diluție corespunzătoare s-a preparat soluția de concentrație 10-4 M necesară protocolului de analiză.

Conform protocolului de analiză se adaugă peste 10 mL soluție de electrolit, tampon Britton-Robinson (B-R) 0,04 M (pH = 2,8), volume cunoscute din soluțiile de diazepam preparate anterior, obținându-se astfel soluții de diferite concentrații (vezi tabelul 90) cărora li se înregistrează voltamograma puls diferențială.

Mai trebuie menționat că inițial a fost efectuată o deoxigenare prin barbotare de N2 pur timp de 5 min., iar după fiecare adăugare de soluție de diazepam, se efectuează agitări și deoxigenări intermediare timp de 10 secunde.

Viteza de scanare optimă a fost de 25 mV/s, iar voltamogramele puls diferențiale a soluțiilor respective sunt prezentate în figura 86, în tabelul 90 fiind trecute numai valorile care au putut fi citite.

Operațiile de scanare voltametrică au fost repetate de 3 ori, valorile concentrațiilor soluțiilor obținute precum și intensitățile medii ale curenților corespunzători sunt prezentate în tabelul următor:

Astfel, picul de reducere care variază de la -0,91 V până la -0,98V, crește liniar cu concentrația soluției de diazepam. Reprezentând grafic logaritmul zecimal cu semn schimbat al concentrației soluției de diazepam în funcție de intensitatea curentului luată în valoare absolută, se observă că domeniul liniar este cuprins între 6,48.10-5 și 9,99.10-8 M (figura 87).

III. 6. 5. Validarea metodei de dozare a diazepamului prin voltametrie puls diferențială cu electrod pastă de carbon modificat

În studiile preliminare de caracterizare a electrozilor, pentru calibrare s-a utilizat metoda adaosului standard, adăugând volume crescânde (10, 30, 60, 100 μL sol 10-4 M diazepam și 0,01; 0,03; 0,06; 0,10; 0,20, 0,40, 0,70; 1,00; 1,30; 1,60; 1,90; 2,20; 2,50; 3,00; 3,50 mL sol 10-3 M diazepam) din soluția stoc în 10 mL tampon Britton-Robinson (pH = 3) cu câte trei serii în aceeași zi pentru fiecare tip de electrod.

În cazul utilizării electrodului pastă de carbon modificat, curba de calibrare, care este prezentată anterior, s-a obținut prin reprezentarea grafică a intensității curentului de reducere în funcție de concentrația diazepamului.

În continuare se calculează parametrii de liniaritate și testele de omogenitate ale varianțelor pentru 5 nivele de concentrație alese în așa fel încât să avem: 60%, 80%, 100%, 120% și 140%. Concentrația de 100% s-a ales la mijlocul domeniului liniar adică pentru o soluție de diazepam 2,96.10-6 M, iar celelate concentrații sunt: 1,77.10-6 M (60%), 2,36.10-6 M (80%), 3,22.10-6 M (120%) și 4,14.10-6 M (140%).

Soluțiile respective conțin:

S-au efectuat trei serii independente de concentrații a unor soluții de diazepam, datele înregistrate fiind prezentate în tabelul 92:

Testul de omogenitate a varianțelor (Testul Cochran) este un test folosit pentru verificarea egalității mai multor dispersii în cazul în care numărul de măsurători pentru cele k selecții este același. Testul Cochran s-a aplicat varianțelor lui Yij pentru a verifica omogenitatea varianțelor constitutive ale erorii experimentale.

Se observă că ccalculat < cteoretic, ceea ce înseamnă că ansamblul varianțelor diferitelor grupuri j pot fi considerate omogene cu riscul 0,05%.

Test de existență a unei pante semnificative (Testul Fisher) constă în compararea variațiilor datorate regresiei și erorilor experimentale de ajustare.

Deoarece valoarea lui Fcalculat este semnificativă, se poate trage concluzia că există o pantă cu dependență lineară de pragul de probabilitate considerat (0,05).

Testul de validitate a dreptei de regresie (Fisher) permite să se compare erorile de ajustare () și experimentale ().

Se observă că valoarea lui Fcalculat nu este semnificativă, deci se poate considera că ajustarea este validă, la pragul de probabilitate considerat (0,05).

Testul de comparare a ordonatei la origine cu zero permite să verifice dacă ordonata la origine nu este semnificativ diferită de zero.

Se observă că valoarea lui tcalculat este mai mică decât t(0,05; 13), deci se poate considera că ordonata la origine nu este semnificativ diferită de zero, cu probabilitatea: p = 1- 0,05 = 0,95.

Exactitate

Testul de omogenitate a varianțelor (Testul Cochran)

Test de validitate a mediilor

Intervalul de încredere al mediei regăsite:

Se obseravă valoarea foarte mare a abaterii ceea ce implică un interval de încrederea la fel de mare.

Calculul limitei de detecție (LD) și cuantificare (LQ)

Limita de detecție poate fi estimată plecând de la valorile deviației standard și pantei; analog se calculează limita de cuantificare:

LD = și LQ =

Valorile limitelor de detecție și a limitei de cuantificare sunt aberant de mari, ceea ce înseamnă că nu mai are sens să încercăm să determinăm diazepamul din comprimate, deoarece această metodă nu prezintă încredere, adică nu poate fi recomandată pentru dozarea diazepamului.

Un alt electrod folosit pentru dozarea diazepamului prin voltametrie stripping adsorbtivă a fost electrodul picătură de mercur staționară, dar rezultatele obținute nu au fost satisfăcătoare, obținându-se voltamograme cu picuri nedefinite. Acest lucru, este posibil să se datoreze lipsei adsorbției diazepamului la suprafața picăturii, ceea ce a dus la absența picurilor din voltamogramele înregistrate.

III. 7. Dozarea flunitrazepamului prin metode voltametrice

Flunitrazepamul s-a dozat prin voltametrie puls diferențială și voltametrie stripping adsorbtivă.

Electrozi utilizați au fost:

Electrod de referință: electrod de Ag/AgCl-KCl sat.

Contraelectrod: electrod fir de platină TM010

Electrod de lucru: Capilar MDE/CAP 70mm; GC; CPE; MCPE

În vederea dozării voltametrice a flunitrazepamului s-a preparat într-un flacon volumetric de 10 mL soluție de flunitrazepam 10-2M (prin cântărirea a 0,03133g flunitrazepam) din care prin diluții succesive alte soluții de concentrație mai mici.

S-au efectuat studiile de optimizare a metodei pe domeniul de potențial 0…..-1.5 V vs. Ag/AgCl în sens catodic utilizând 10 mL soluție electrolit tampon Britton-Robinson (pH = 2,8). Soluțiile au fost purjate cu azot ultrapur timp de 5 minute la prima scanare și 10 s la citirile ulterioare. În timpul scanărilor, deasupra soluției s-a menținut o pătură de azot care a avut rolul de împiedica redizolvarea oxigenului. Înălțimea picurilor obținute este parametrul cantitativ al semnalului iar poziția maximului cel calitativ. În urma modulării parametrilor de analiză s-au înregistrat voltamogramele din figura 88 (numărul lor corespunde numărului curent din tabelul 93) a căror parametri sunt redați în tabelul respectiv:

Din tabel se pot remarca următorii parametri optimi ai semnalului, în care intensitatea curentului este maximă:

durata etapei: 0,4 s

amplitudinea etapei: 10 mV

durata pulsului: 40 ms

amplitudinea pulsului: 25 mV

E inițial: 0 mV

E final: -1500 mV

Domeniul de curent: 10 nA …..100 mA

În continuare s-au determinat condițiile optime din punct de vedere al pH-ului soluției tampon Britton-Robinson cunoscându-se faptul ca flunitrazepamul (analog cu diazepamul) suferă o reacție de reducere deci domeniul de variație al tensiunii a fost unul negativ. În acest sens s-a preparat o soluție de concentrație 8,33.10-5M flunitrazepam în tampon Britton-Robinson de diferite pH-uri cărora le-a fost înregistrată voltamograma. Valorile intensității curenților obținute sunt prezentate mai jos:

Se poate remarca din grafic că intensitatea curentului electric scade odată cu creșterea pH-ului electrolitului, valoarea maximă a acesteia corespunzând unei soluții tampon Britton-Robinson cu pH = 3,0.

III. 7. 1. Dozarea flunitrazepamului prin voltametrie puls diferențială utilizând electrodul de carbon vitros, electrod pastă de carbon și electrod pastă de carbon modificat

Pentru determinarea cantitativă a flunitrazepamului s-au preparat soluții stoc de flunitrazepam de concentrație 10-3 M, în HCl 0,1N din care prin diluție corespunzătoare s-a preparat soluția de concentrație 10-4 M necesară protocolului de analiză.

Conform protocolului de analiză se adaugă peste 10 mL soluție de electrolit, tampon Britton-Robinson (B-R) 0,04 M (pH = 3,0), volume cunoscute din soluțiile de flunitrazepam preparate anterior, obținându-se astfel soluții de diferite concentrații (vezi tabelul 94) cărora li se înregistrează voltamograma puls diferențială.

Se folosește ca și electrod indicator electrodul de carbon vitros. De asemenea trebuie menționat că inițial a fost efectuată o deoxigenare prin barbotare de N2 pur timp de 5 min., iar după fiecare adăugare de soluție de flunitrazepam, se efectuează agitări și deoxigenări intermediare timp de 10 secunde.

Viteza de scanare optimă a fost de 25 mV/s, iar voltamogramele puls diferențiale a soluțiilor respective sunt prezentate în figura 89, în tabelul 94 fiind trecute numai valorile care au putut fi citite.

Operațiile de scanare voltametrică au fost repetate de 3 ori, valorile concentrațiilor soluțiilor obținute precum și intensitățile medii ale curenților corespunzători sunt prezentate în tabelul următor:

Astfel, picul de reducere care variază de la -0,40 V până la -0,44V, crește liniar cu concentrația soluției de flunitrazepam. Reprezentând grafic logaritmul zecimal cu semn schimbat al concentrației de flunitrazepam în funcție de intensitatea curentului luată în valoare absolută, se observă că domeniul liniar este cuprins între 2,57.10-4 și 5,91.10-6 M (figura 90).

Rezultatele obținute prin voltametrie puls diferențială cu electrodul de carbon vitros s-au încercat a fi îmbunătățite prin folosirea unui electrod pastă de carbon preparat din 40 mg pudră carbon și 20 μL DOP. Protocolul de analiză a fost același ca și în cazul anterior, idem pentru parametrii semnalului, iar voltamogramele sunt prezentate în figura următoare:

Numerele graficelor din figură care au fost posibil să fie interpretate corespund numărului curent din tabelul următor la diferite concentrații pentru soluția de flunitrazepam precum și intensitățile curenților corespunzători:

Domeniul liniar al concentrației de flunitrazepam este de 2,57.10-4 – 9,80.10-6 M.

Utilizând aceeași parametri s-a folsit un alt electrod pastă de carbon modificat preparat prin amestecarea a 40 mg pudră carbon cu 15 mg caolin și 20 μL DOP și urmând același protocol de analiză s-au obținut voltamograme din figura 93:

Și în acest caz au fost efectuate câte 3 măsurători, în tabelul 96 fiind exprimate mediile intensităților curenților a căror variație liniară cu concentrația se regăsește în figura 94:

Domeniul liniar al concentrației de flunitrazepam este de 9,01.10-5 – 9,99.10-8 M.

Comparând cei trei electrozi folosiți se remarcă un domeniu de liniaritate mai larg și la valori mai mici de concentrație pentru electrodul pastă de carbon modificat.

III. 7. 2. Validarea metodei de dozare a flunitrazepamului prin voltametrie puls diferențială cu electrod de carbon vitros

În studiile preliminare de caracterizare a electrozilor, pentru calibrare s-a utilizat metoda adaosului standard, adăugând volume crescânde (10, 30, 60, 100 μL sol 10-4 M flunitrazepam și 0,01; 0,03; 0,06; 0,10; 0,20; 0,40; 0,70; 1,00; 1,30; 1,60; 1,90; 2,20; 2,50; 3,00; 3,50 mL sol 10-3 M flunitrazepam) din soluția stoc în 10 mL tampon Britton-Robinson (pH = 3) cu câte trei serii în aceeași zi pentru fiecare tip de electrod.

În cazul utilizării electrodului de carbon vitros, curba de calibrare, care este prezentată anterior, s-a obținut prin reprezentarea grafică a intensității curentului de reducere în funcție de concentrația flunitrazepamului.

În continuare se calculează parametrii de liniaritate și testele de omogenitate ale varianțelor pentru 5 nivele de concentrație alese în așa fel încât să avem: 60%, 80%, 100%, 120% și 140%. Concentrația de 100% s-a ales la mijlocul domeniului liniar adică pentru o soluție de diazepam 9,04.10-5 M, iar celelate concentrații sunt: 5,42.10-5 M (60%), 7,23.10-5 M (80%), 1,08.10-4 M (120%) și 1,26.10-4 M (140%).

Soluțiile respective conțin:

S-au efectuat trei serii independente de concentrații a unor soluții de flunitrazepam, datele înregistrate fiind prezentate în tabelul 98:

Testul de omogenitate a varianțelor (Testul Cochran) s-a aplicat varianțelor lui Yij pentru a verifica omogenitatea varianțelor constitutive ale erorii experimentale.

Se observă că ccalculat < cteoretic, ceea ce înseamnă că ansamblul varianțelor diferitelor grupuri j pot fi considerate omogene cu riscul 0,05%.

Test de existență a unei pante semnificative (Testul Fisher) constă în compararea variațiilor datorate regresiei și erorilor experimentale de ajustare.

Deoarece valoarea lui Fcalculat este semnificativă, se poate trage concluzia că există o pantă cu dependență lineară de pragul de probabilitate considerat (0,05).

Testul de validitate a dreptei de regresie (Fisher) permite să se compare erorile de ajustare () și experimentale ().

Se observă că valoarea lui Fcalculat nu este semnificativă, deci se poate considera că ajustarea este validă, la pragul de probabilitate considerat (0,05).

Testul de comparare a ordonatei la origine cu zero permite să verifice dacă ordonata la origine nu este semnificativ diferită de zero.

Se observă că valoarea lui tcalculat este mai mare decât t(0,05; 13), deci se poate considera că ordonata la origine este semnificativ diferită de zero, cu probabilitatea: p = 1- 0,05 = 0,95.

Exactitate

Testul de omogenitate a varianțelor (Testul Cochran)

Test de validitate a mediilor

Intervalul de încredere al mediei regăsite:

Valoarea abaterii este relativ bună deci și intervalul de încredere este la fel.

Calculul limitei de detecție (LD) și cuantificare (LQ)

Limita de detecție poate fi estimată plecând de la valorile deviației standard și pantei; analog se calculează limita de cuantificare:

LD = și LQ =

Limita de cuantificare este de aproximativ 3x mai mare decât limita de detecție și reprezintă cantiatea minimă de analit care dintr-o substanță care se poate doza în condițiile experimentale descrise, cu o fidelitate și o exactitate definită.

Dozarea flunitrazepamului din forme farmaceutice prin voltametrie puls diferențială cu electrod de carbon vitros

Pentru pregătirea probei de analiză, 30 comprimate Fluninoc (1mg/cp.), se cântăresc și se calculează masa medie a unei tablete (). Apoi se omogenizează tabletele prin triturare și se cântărește o probă de 0,44840 g pulbere care să corespundă la o soluție de cca.10-3 M obținută prin dizolvarea pulberii într-un flacon volumetric de 10 mL. Dozarea efectivă s-a realizat prin metoda adaosului standard adăugând 0,40 mL (0,42, 0,44, 0,46 și 0,48 mL) soluție mai sus preparată peste 10 mL soluție electrolit urmată de adăugarea de cinci ori a câte 0,5 mL soluție flunitrazepam 10-3 M (313,3 μg/mL) cu înregistrarea voltamogramelor stripping adsorbtive corespunzătoare (figura 95). Pentru fiecare volum de soluție de flunitrazepam formă farmaceutică operația a fost repetată de încă două ori în așa fel încât în tabelul 99 se regăsesc valorile medii ale intensităților curentului.

Această operație s-a efectuat de câte trei ori pentru fiecare concentrație în parte, rezultatele obținute fiind redate mai jos:

a Media a trei determinări

Valoarea regăsirii medii este de 98,62% iar deviația relativă standard este 0,34% ceea ce indică exactitatea metodei prin care a fost dozat flunitrazepamul din comprimatele de Fluninoc. Mai mult, comprimatele de Fluninoc corespund cu prevederile Farmacopeei Române ediția a X-a referitoare la substanța activă din comprimat (0,9 – 1,1 mg flunitrazepam, este intervalul în care trebuie să se găsescă catitatea de flunitrazepam calculată), deoarece conțin 0,9862 mg flunitrazepam/comprimat.

III. 7. 3. Dozarea flunitrazepamului prin voltametrie stripping adsorbtivă cu electrod pastă de carbon modificat

Numită și stripping voltammetry (în engleză), este metoda bazată pe redizolvarea depozitului obținut într-o primă fază prin electroliză, dizolvare de regulă anodică (dar și catodică) și constituie un ansamblu de tehnici foarte sensibile, utilizate în special pentru determinarea urmelor de metale în mediul ambiant, datorită limitelor de detecție foarte joase și a preciziei relativ ridicate 1-2%; se desfășoară în două etape:

1. Prima etapă este depunerea. Pe un electrod menținut la un potențial controlat, constant, scufundat într-o soluție agitată, se depune prin electroliză timp de 1-30 minute o fracțiune din analitul electroactiv – de regulă un metal. Acest electrod este constituit de cele mai multe ori dintr-o picătură de mercur suspendată (electrod de mercur nepicurător) sau dintr-un electrod de cărbune vitros acoperit cu mercur. În urma electrolizei din soluția agitată se concentrează metalul de analizat, rezultat din ionul Mz+, care formează cu mercurul un amalgam, M(Hg).

2. Urmează apoi a doua etapă, redizolvarea. Se oprește agitarea și se micșorează progresiv diferența de potențial dintre electrodul de mercur și cel de referință, măsurându-se curentul. Electrodul de mercur conținând amalgamul – inițial catodul celulei – devine progresiv anod iar curentul la început crește apoi revine la zero spre sfârșit. Așadar, oxidarea metalului depus trece în soluție sub formă de cationi. Semnalul analitic îl constituie, în acest caz, suprafața curbei curent-tensiune obținute, din care se calculează, pe baza legii lui Faraday, cantitatea de metal din probă.

În ultimul timp tehnica a mai fost combinată și cu polarografia cu undă pătrată, care a asigurat o reversibilitate și mai bună a metodei. Anume, scăderea tensiunii are loc în trepte, analog cu modalitatea de creștere a tensiunii în polarografia cu undă pătrată. În mod cu totul similar are loc și măsurarea curentului.

Această metodă voltametrică adsorbtivă am adaptat-o la dozarea benzodiazepinelor.

Electrozii folosiți prin această tehnică în vederea dozării flunitrazepamului au fost electrodul pastă de carbon modificat (suprafața activă = 7 mm2) și electrodul picătură de mercur suspendată (suprafața activă = 3,3 mm2). S-a renunțat la utilizarea electrodului film de mercur ținând cont de dezavantajele pe care acesta le are în comparație cu electrodul picătură de mercur suspendată a cărui suprafață se reînnoiește după fiecare scanare voltametrică prin reînnoirea picăturii.

Parametrii semnalului au fost stabiliți la:

durata etapei: 0,4 s

amplitudinea etapei: 10 mV

durata pulsului: 40 ms

amplitudinea pulsului: 25 mV

E initial: -500 mV

E final: -750 mV

Domeniul de curent: 10 nA …..100 mA

Un factor important care influențează stripping voltametria este timpul și potențialul de acumulare a analitului la suprafața electrodului de lucru. S-a măsurat intensitatea curentului la diferiți timpi de acumulare (30, 60, 120, 180, 240, 300, 360, 420, 480, 540 și 600 s) pentru o soluție de flunitrazepam 9,09 . 10-5 M, folosind cei doi electrozi conform tabelului 100:

În figura 96 este prezentat un grafic tridimensional al influenței timpului de acumulare asupra intensității curentului pentru cei doi electrozi.

Se observă că în cazul folosirii electrodului pastă de carbon modificat timpul optim de acumulare este de 300s, iar pentru electrodul picătură de mercur staționară de 30s, ceea ce înseamnă că analitul se adsoarbe un timp mai îndelungat la suprafața electrodului pastă de carbon modificat decât la suprafața picăturii de mercur.

Celălalt parametru care poate influența voltametria stripping adsorbtivă este potențialul de acumulare, acesta fiind verificat într-o soluție de flunitrazepam de concentrație ~10-6 M obținută în soluție de electrolit tampon Britton-Robinson (pH = 3,0). Voltamogramele obținute în acest caz pentru potențial de acumulare de: -300 mV, -350 mV, -400 mV, -450 mV, -500 mV, -550 mV și 600 mV folosind HMDE sunt prezentate în tabelul următor:

Flunitrazepamul a fost acumulat în tampon Britton-Robinson (pH = 3) la un potențial de 0 V fața de un electrod Ag/AgCl la un timp de acumulare de 300 s folosind electrodul pastă de carbon modificat. Referitor la ceilalți parametri ai semnalului aceștia au fost identici ca și în cazul anterior.

1. Electrod pastă de carbon modificat

A fost preparat prin titrurarea a 40 mg pudră de carbon cu 15 mg caolin și 20 μL DOP până la obținerea unei paste consistente care a fost presată în locașul electrodului și șlefuită până se obține o suprafață lucioasă.

Protocolul de analiză a constat în adăugarea unor volume de soluție de flunitrazepam de concentrație 10-3 M și 10-4 M în celula voltametrică în care se află 10 mL tampon Britton-Robinson (pH = 3).

Potențialul de scanare s-a realizat în sens negativ pe intervalul 0…-700 mV, având potențial de acumulare la -300 mV .

S-au înregistrat voltamogramele pentru soluții cu concentrație între 9,99.10-8 M și 4,72.10-5 M flunitrazepam, voltamogramele cu pic definit putând fi citite de la concentrații mai mari de 4,98.10-7 M. În figura 97 sunt prezentate voltamogramele înregistrate iar în tabelul 102 valorile intensităților curenților și concentrațiile soluțiilor respective care sunt reprezentate grafic în figura 98:

Domeniul liniar de concentrație este 4,72.10-5 – 4,98.10-7 M flunitrazepam având coeficientul de corelație de 0,9930.

III. 7. 4. Validarea metodei de dozare a flunitrazepamului prin voltametrie stripping adsorbtivă cu electrod pastă de carbon modificat

Flunitrazepamul a fost determinat prin voltametrie catodică stripping adsorbtivă cu reducerea grupării azometin înregistrată de puls voltamogramă după acumularea analitului la potențialul maxim de adsorbție.

În reacția de adsorbție flunitrazepamul se adsoarbe fizic la suprafața electrodului prin intermediul atomului de azot dublu legat din heterociclu, conform reacției:

As ↔ Aads + ne- ↔ Dads, unde

As și Aads indică specia electroactivă în soluție, respectiv pe suprafața electrodului

Dads indica substanța redusă prin adsorbție

Această metodă voltametrică este mai sensibilă decât metoda anterioară, ca atare calibrarea prin metoda adaosului standard se realizează la concentrații mai mici adăugând volume crescânde (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 μL sol 10-4 M flunitrazepam și 10, 20, 40, 70, 100, 130, 160, 200, 250, 300, 400, 500 μL sol 10-3 M flunitrazepam) din soluția stoc în 10 mL tampon Britton-Robinson (pH = 3) cu câte trei serii în aceeași zi pentru fiecare tip de electrod. Concentrația soluțiilor obținute a variat între 4,72.10-5 M și 9,99.10-8 M.

În cazul utilizării electrodului pastă de carbon, curba de calibrare, care este prezentată anterior, s-a realizat prin reprezentarea grafică a intensității curentului de reducere în funcție de concentrația flunitrazepamului.

În continuare se calculează parametrii de liniaritate și testele de omogenitate ale varianțelor pentru 5 nivele de concentrație alese în așa fel încât să avem: 60%, 80%, 100%, 120% și 140%. Concentrația de 100% s-a ales la mijlocul domeniului liniar adică pentru o soluție de flunitrazepam 3,94.10-6 M, iar celelate concentrații sunt: 2,36.10-6 M (60%), 3,15.10-6 M (80%), 4,72.10-6 M (120%) și 5,51.10-6 M (140%).

Soluțiile respective conțin:

S-au efectuat trei serii independente de concentrații a unor soluții de flunitrazepam, datele înregistrate fiind prezentate în tabelul 104:

Testul de omogenitate a varianțelor (Testul Cochran) s-a aplicat varianțelor lui Yij pentru a verifica omogenitatea varianțelor constitutive ale erorii experimentale.

Se observă că ccalculat < cteoretic, ceea ce înseamnă că ansamblul varianțelor diferitelor grupuri j pot fi considerate omogene cu riscul 0,05%.

Test de existență a unei pante semnificative (Testul Fisher) constă în compararea variațiilor datorate regresiei și erorilor experimentale de ajustare.

Deoarece valoarea lui Fcalculat este semnificativă, se poate trage concluzia că există o pantă cu dependență lineară de pragul de probabilitate considerat (0,05).

Testul de validitate a dreptei de regresie (Fisher) permite să se compare erorile de ajustare () și experimentale ().

Se observă că valoarea lui Fcalculat nu este semnificativă, deci se poate considera că ajustarea este validă, la pragul de probabilitate considerat (0,05).

Testul de comparare a ordonatei la origine cu zero permite să verifice dacă ordonata la origine nu este semnificativ diferită de zero.

Se observă că valoarea lui tcalculat este mai mare decât t(0,05; 13), deci se poate considera că ordonata la origine este semnificativ diferită de zero, cu probabilitatea: p = 1- 0,05 = 0,95.

Exactitate

Testul de omogenitate a varianțelor (Testul Cochran)

Test de validitate a mediilor

Intervalul de încredere al mediei regăsite:

Calculul limitei de detecție (LD) și cuantificare (LQ)

Limita de detecție determinată este de 0,25 μg/mL, iar limita de cuantificare de 3 ori mai mare, adică 0,75 μg/mL.

Dozarea flunitrazepamului din forme farmaceutice prin voltametrie stripping adsorbtivă

Pentru pregătirea probei de analiză, 30 comprimate Fluninoc (1mg/cp.), se cântăresc și se calculează masa medie a unei tablete (). Apoi se omogenizează tabletele prin triturare și se cântărește o probă de 0,44840 g pulbere care să corespundă la o soluție de cca.10-3 M obținută prin dizolvarea pulberii într-un flacon volumetric de 10 mL. Dozarea efectivă s-a realizat prin metoda adaosului standard adăugând 20 μL (22, 24, 26 și 28 μL) soluție mai sus preparată peste 10 mL soluție electrolit urmată de adăugarea de cinci ori a câte 20 μL soluție flunitrazepam 10-3 M (313,3 μg/mL) cu înregistrarea voltamogramelor stripping adsorbtive corespunzătoare. Pentru fiecare volum de soluție de flunitrazepam formă farmaceutică operația a fost repetată de încă două ori în așa fel încât în tabelul următor se regăsesc valorile medii ale intensităților curentului.

Această operație s-a efectuat de câte trei ori pentru fiecare concentrație în parte, rezultatele obținute fiind redate mai jos:

a Media a trei determinări

Valoarea regăsirii medii de peste 99 % și deviația relativă stadard subunitară ne sugerează posibilitatea utilizării cu succes a acestei metode de dozare a flunitrazepamului atât ca substanță medicamentoasă cât și din diverse forme farmaceutice. În cazul nostru, comprimatele de Fluninoc corespund prevederilor FR X din punct de vedere al substanței active 0,9 – 1,1 mg/cp. flunitrazepam), obținându-se o valoarea medie de 0,9908 mg /cp. flunitrazepam.

III. 7. 5. Dozarea flunitrazepamului prin voltametrie stripping adsorbtivă cu electrod de mercur picătură staționară

Referitor la dozarea flunitrazepamului prin voltametrie stripping adsorbtivă folosind ca și electrod indicator un electrod de mercur picătură staționară (HMDE) intervalul de concentrație ales a fost: 9,99.10-8 M …… 4,72.10-5 M flunitrazepam, obținându-se un domeniu liniar de 9,99.10-8 ….. 5,00.10-9 M. Voltamogramele obținute conform protocolului de analiză sunt prezentate în figura 100, iar intensitățile curenților corespunzători maximului de pic se regăsesc în tabelul 106.

Reprezentarea grafică a concentrației în funcție de intensitățile picurilor confirmă dependența celor doi parametri pe un interval de 4,8.10-8 – 9,0.10-8 M cu un coeficient de corelație 0,9951 așa cum se poate observa din figura 101:

Domeniul liniar de concentrație cuprins pe intervalul 4,98.10-8 – 9,90.10-8 M, are coeficient de corelație 0,9951.

III. 7. 7. Validarea metodei de dozare a flunitrazepamului prin voltametrie stripping adsorbtivă cu HMDE

Această metodă voltametrică este mai sensibilă decât metoda anterioară, ca atare calibrarea prin metoda adaosului standard se realizează la concentrații mai mici adăugând volume crescânde (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 μL sol 10-4 M flunitrazepam și 10, 20, 40, 70, 100, 130, 160, 200, 250, 300, 400, 500 μL sol 10-3 M flunitrazepam) din soluția stoc în 10 mL tampon Britton-Robinson (pH = 3) cu câte trei serii în aceeași zi pentru fiecare tip de electrod. Concentrația soluțiilor obținute a variat între 4,72.10-5 M și 9,99.10-8 M.

În cazul utilizării electrodului de mercur picătură staționară curba de calibrare, care este prezentată anterior, s-a realizat prin reprezentarea grafică a intensității curentului de reducere în funcție de concentrația flunitrazepamului.

În continuare se calculează parametrii de liniaritate și testele de omogenitate ale varianțelor pentru 5 nivele de concentrație alese în așa fel încât să avem: 60%, 80%, 100%, 120% și 140%. Concentrația de 100% s-a ales la mijlocul domeniului liniar adică pentru o soluție de flunitrazepam 2,99.10-7 M, iar celelate concentrații sunt: 1,79.10-7 M (60%), 2,39.10-7 M (80%), 3,58.10-7 M (120%) și 4,18.10-7 M (140%).

Soluțiile respective conțin:

S-au efectuat trei serii independente de concentrații a unor soluții de flunitrazepam, datele înregistrate fiind prezentate în tabelul 108:

Testul de omogenitate a varianțelor (Testul Cochran) s-a aplicat varianțelor lui Yij pentru a verifica omogenitatea varianțelor constitutive ale erorii experimentale.

Se observă că ccalculat < cteoretic, ceea ce înseamnă că ansamblul varianțelor diferitelor grupuri j pot fi considerate omogene cu riscul 0,05%.

Test de existență a unei pante semnificative (Testul Fisher) constă în compararea variațiilor datorate regresiei și erorilor experimentale de ajustare.

Deoarece valoarea lui Fcalculat este semnificativă, se poate trage concluzia că există o pantă cu dependență lineară de pragul de probabilitate considerat (0,05).

Testul de validitate a dreptei de regresie (Fisher) permite să se compare erorile de ajustare () și experimentale ().

Se observă că valoarea lui Fcalculat nu este semnificativă, deci se poate considera că ajustarea este validă, la pragul de probabilitate considerat (0,05).

Testul de comparare a ordonatei la origine cu zero permite să verifice dacă ordonata la origine nu este semnificativ diferită de zero.

Se observă că valoarea lui tcalculat este mai mare decât t(0,05; 13), deci se poate considera că ordonata la origine este semnificativ diferită de zero, cu probabilitatea: p = 1- 0,05 = 0,95.

Exactitate

Testul de omogenitate a varianțelor (Testul Cochran)

Test de validitate a mediilor

Intervalul de încredere al mediei regăsite:

Calculul limitei de detecție (LD) și cuantificare (LQ)

Limita de detecție respectiv limita de cuantificare au valori de ordinul ng/mL (3,1ng/mL respectiv 9,3 ng/mL) ceea ce arată o sensibilitate superioară a electrodului picătură de mercur staționară față de ceilalți electrozi folosiți până acum.

Dozarea flunitrazepamului din forme farmaceutice prin voltametrie stripping adsorbtivă cu HMDE

Analog, pentru pregătirea probei de analiză, 30 comprimate Fluninoc (1mg/cp.), se cântăresc și se calculează masa medie a unei tablete (). Apoi se omogenizează tabletele prin triturare și se cântărește o probă de 0,44840 g pulbere care să corespundă la o soluție de cca.10-3 M obținută prin dizolvarea pulberii într-un flacon volumetric de 10 mL. Din această soluție s-a preparat într-un flacon volumetric de 10 mL soluție de concentrație 10-4M care a fost folosită în continuare.

Dozarea efectivă s-a realizat prin metoda adaosului standard adăugând 20 μL (30, 40, 50 și 60 μL) soluție mai sus preparată peste 10 mL soluție electrolit urmată de adăugarea de cinci ori a câte 20 μL soluție flunitrazepam 10-4 M (31,33 μg/mL) cu înregistrarea voltamogramelor stripping adsorbtive corespunzătoare. Această operație s-a efectuat de câte trei ori pentru fiecare concentrație în parte, rezultatele obținute fiind redate mai jos:

a Media a trei determinări

Din tabelul 109 se pot remarca valorile net superioare (din punct de vedere al valorii de regăsire medie și deviației relative standard) folosind electrodul picătură de mercur staționară comparativ cu ceilalți electrozi folosiți. Firesc, că și în acest caz comprimatele de Fluninoc corespund cu prevedrile FR X din punct de vedere al substanței active, obținându-se o valoare medie de 0,9934 mg/cp. substanță activă care se încadrează în intervalul prevăzut de FR X cu o abatere admisă de ± 10%, adică 0,9 – 1,1 mg/cp. flunitrazepam.

III. 8. Dozarea bromazepamului prin metode voltametrice

Aparatura utilizată pentru voltametria puls diferențială a fost identică cu cea folosită la dozarea flunitrazepamului, adică un Analizor polarografic POL150 prevăzut cu un Stand polarografic MDE 150.

Electrozi utilizați au fost:

Electrod de referință: electrod Ag/AgCl-KCl sat.

Contraelectrod: electrod fir de platină TM010

Electrod de lucru: Capilar MDE/CAP 70mm; GC; CPE; MCPE

În standul MDE150 presiunea azotului a fost menținută la 0,5 bar.

În vederea dozării voltametrice a bromazepamului s-a preparat într-un flacon volumetric de 25 mL soluție de bromazepam 10-3M (prin cântărirea a 0,00790g bromazepam care se dizolvă în 2 mL HCl 0,5 M și apă bidistilată) din care prin diluții succesive alte soluții de concentrație mai mică.

S-au efectuat studiile de optimizare ale metodei pe domeniul de potențial 0…..-1,5 V vs. Ag/AgCl în sens catodic utilizând 10 mL soluție electrolit tampon Britton-Robinson (pH = 2,8) asemănator cu cele efectuate la dozarea flunitrazepamului. Soluțiile au fost purjate cu azot ultrapur timp de 5 minute la prima scanare și 10 s la citirile ulterioare. În timpul scanărilor, deasupra soluției s-a menținut o pătură de azot care a avut rolul de împiedica redizolvarea oxigenului.

Parametri optimi ai semnalului, în care intensitatea curentului este maximă sunt:

durata etapei: 0,4 s

amplitudinea etapei: 10 mV

durata pulsului: 40 ms

amplitudinea pulsului: 25 mV

E initial: 0 mV

E final: -1500 mV

Domeniul de curent: 10 nA ….. 100 mA

În continuare s-au determinat condițiile optime din punct de vedere al pH-ului soluției tampon Britton-Robinson cunoscându-se faptul ca bromazepamul (analog cu diazepamul și flunitrazepamul) suferă o reacție de reducere deci domeniul de variație al potențialului a fost unul negativ. În acest sens s-a preparat o soluție de concentrație 8,33.10-5M bromazepam în tampon Britton-Robinson de diferite pH-uri cărora le-a fost înregistrată voltamograma. Valorile intensității curenților obținute sunt prezentate mai jos:

Se poate remarca că intensitatea curentului electric scade odată cu creșterea pH-ului electrolitului, valoarea maximă a acesteia corespunzând unei soluții tampon Britton-Robinson cu pH = 3,0.

III. 8. 1. Dozarea bromazepamului prin voltametrie puls diferențială utilizând electrodul de carbon vitros, electrod pastă de carbon și electrod pastă de carbon modificat

Pentru determinarea cantitativă a bromazepamului s-au preparat soluții stoc de bromazepam de concentrație 10-3 M din care prin diluție corespunzătoare s-a preparat soluția de concentrație 10-4 M necesară protocolului de analiză.

Conform protocolului de analiză se adaugă peste 10 mL soluție de electrolit, tampon Britton-Robinson (B-R) 0,04 M (pH = 3,0), volume cunoscute din soluțiile de bromazepam preparate anterior, obținându-se astfel soluții de diferite concentrații (vezi tabelul 110) cărora li se înregistrează voltamograma puls diferențială.

Se folosește ca și electrod indicator electrodul de carbon vitros. Trebuie menționat că inițial a fost efectuată o deoxigenare prin barbotare de N2 pur timp de 5 min., iar după fiecare adăugare de soluție de bromazepam, se efectuează agitări și deoxigenări intermediare timp de 10 secunde.

Viteza de scanare optimă a fost de 25 mV/s, iar voltamogramele puls diferențiale a soluțiilor respective sunt prezentate în figura 102, în tabelul 110 fiind trecute numai valorile care au putut fi citite.

Operațiile de scanare voltametrică au fost repetate de 3 ori, valorile concentrațiilor soluțiilor obținute precum și intensitățile medii ale curenților corespunzători sunt prezentate în tabelul următor:

Astfel, picul de reducere care variază pe un domeniu restrâns de la -0,50 V până la -0,52V, crește liniar cu concentrația soluției de bromazepam. Reprezentând grafic logaritmul zecimal cu semn schimbat al concentrației soluției de bromazepam în funcție de intensitatea curentului luată în valoare absolută, se observă că domeniul liniar este cuprins între 2,57.10-4 și 9,80.10-6 M (figura 103).

Utilizând aceeași parametri s-a folsit un alt electrod de carbon vitros pe care s-a depus un film de mercur, obținându-se voltamogramele din figura următoare:

Și în acest caz au fost efectuate câte 3 măsurători, în tabel fiind exprimate mediile intensităților curenților.

Domeniul liniar al concentrației de bromazepam este de 2,57.10-4– 2,99.10-7 M.

Rezultatele obținute prin voltametrie puls diferențială cu electrodul de carbon vitros s-au încercat a fi îmbunătățite prin folosirea unui electrod pastă de carbon modificat preparat din 40 mg pudră carbon 15 mg caolin și 20 μL DOP. Protocolul de analiză a fost același ca și în cazul anterior, idem pentru parametrii semnalului, iar voltamogramele sunt prezentate în figura următoare:

Numerele graficelor din figură corespund numărului curent din tabelul următor la diferite concentrații pentru soluția de bromazepam precum și intensitățile curenților corespunzători:

Domeniul liniar al concentrației de bromazepam este de 2,57.10-4 – 2,96.10-6 M.

Comparând cei trei electrozi folosiți se remarcă un domeniu de liniaritate mai larg dar și la valori mai mici de concentrație pentru electrodul pastă de carbon modificat ceea ce îl recomandă ca fiind cel mai performant.

III. 8. 2. Validarea metodei de dozare a bromazepamului prin voltametrie puls diferențială cu electrod de carbon vitros

În studiile preliminare de caracterizare a electrozilor, pentru calibrare s-a utilizat metoda adaosului standard, adăugând volume crescânde (10, 30, 60, 100 μL sol 10-4 M bromazepam și 0,01; 0,03; 0,06; 0,10; 0,20; 0,40; 0,70; 1,00; 1,30; 1,60; 1,90; 2,20; 2,50; 3,00; 3,50 mL sol 10-3 M bromazepam) din soluția stoc în 10 mL tampon Britton-Robinson (pH = 3) cu câte trei serii în aceeași zi pentru fiecare tip de electrod.

În cazul utilizării electrodului de carbon vitros, curba de calibrare, care este prezentată anterior, s-a realizat prin reprezentarea grafică a intensității curentului de reducere în funcție de concentrația bromazepamului.

În continuare se calculează parametrii de liniaritate și testele de omogenitate ale varianțelor pentru 5 nivele de concentrație alese în așa fel încât să avem: 60%, 80%, 100%, 120% și 140%. Concentrația de 100% s-a ales la mijlocul domeniului liniar adică pentru o soluție de bromazepam 1,37.10-4 M, iar celelate concentrații sunt: 8,22.10-5 M (60%), 1,10.10-4 M (80%), 1,64.10-4 M (120%) și 1,91.10-4 M (140%).

Soluțiile respective conțin:

S-au efectuat trei serii independente de concentrații a unor soluții de bromazepam, datele înregistrate fiind prezentate în tabelul 114 pentru cele 5 concentrații de soluție de mai sus:

Testul de omogenitate a varianțelor (Testul Cochran) s-a aplicat varianțelor lui Yij pentru a verifica omogenitatea varianțelor constitutive ale erorii experimentale.

Se observă că ccalculat < cteoretic, ceea ce înseamnă că ansamblul varianțelor diferitelor grupuri j pot fi considerate omogene cu riscul 0,05%.

Test de existență a unei pante semnificative (Testul Fisher) constă în compararea variațiilor datorate regresiei și erorilor experimentale de ajustare.

Deoarece valoarea lui Fcalculat este semnificativă, se poate trage concluzia că există o pantă cu dependență lineară de pragul de probabilitate considerat (0,05).

Testul de validitate a dreptei de regresie (Fisher) permite să se compare erorile de ajustare () și experimentale ().

Se observă că valoarea lui Fcalculat nu este semnificativă, deci se poate considera că ajustarea este validă, la pragul de probabilitate considerat (0,05).

Testul de comparare a ordonatei la origine cu zero permite să verifice dacă ordonata la origine nu este semnificativ diferită de zero.

Se observă că valoarea lui tcalculat este mai mică decât t(0,05; 13), deci se poate considera că ordonata la origine nu este semnificativ diferită de zero, cu probabilitatea: p = 1- 0,05 = 0,95.

Exactitate

Testul de omogenitate a varianțelor (Testul Cochran)

Test de validitate a mediilor

Se observă că Fc<Ft ceea ce confirmă validitatea mediilor.

Intervalul de încredere al mediei regăsite:

În acest caz valoarea abaterii este foarte mică, implicit intervalul de încredere este foarte restrâns și este în jurul valorii de 99,50% cu o abatere foarte mică de 0,0296.

Calculul limitei de detecție (LD) și cuantificare (LQ)

Valorile limitei de detecție și cuantificare sunt bune, așa cum se observă din tabelul de mai sus bromazepamul poate fi detectat până la o concentrație de 0,121 μg/mL.

Dozarea bromazepamului din forme farmaceutice prin voltametrie puls diferențială cu electrod de carbon vitros

Analog pentru pregătirea probei de analiză, 30 comprimate Calmepam (3mg/cp.), se cântăresc și se calculează masa medie a unei tablete (). Apoi se omogenizează tabletele prin triturare și se cântărește o probă de 0,24503 g pulbere care să corespundă la o soluție de cca.10-3 M obținută prin dizolvarea pulberii în volumul minim de sol. HCl 0,5 M, într-un flacon volumetric de 10 mL (se completează la semn cu apă bidistilată). Dozarea efectivă s-a realizat prin metoda adaosului standard adăugând 0,50 mL (0,52, 0,54, 0,56 și 0,58 mL) soluție mai sus preparată peste 10 mL soluție electrolit urmată de adăugarea de cinci ori a câte 0,5 mL soluție bromazepam 10-3 M (316,2 μg/mL) cu înregistrarea voltamogramelor puls diferențiale corespunzătoare. Pentru fiecare volum de soluție de bromazepam formă farmaceutică operația a fost repetată de încă două ori în așa fel încât în tabelul următor se regăsesc valorile medii ale intensităților curentului.

Această operație s-a efectuat de câte trei ori pentru fiecare concentrație în parte, rezultatele obținute fiind redate mai jos:

a Media a trei determinări

Valorile bune obținute pentru deviația relativă standard de 0,54% alături de regăsirea medie de de 99,43% recomandă această metodă pentru dozarea bromazepamului. Regăsirea medie corespunde unei cantități medii de 2,9829 mg/cp substanță activă care este cuprinsă în intervalul de 2,7 – 3,3 mg/cp. bromazepam datorat abaterii admise de ±10%, indicând faptul că comprimatele de Calmepam corespund cu prevederile FR X referitoare la substanța activă.

III. 8. 3. Dozarea bromazepamului prin voltametrie stripping adsorbtivă cu electrod pastă de carbon modificat

Electrozii folosiți prin această tehnică în vederea dozării bromazepamului au fost electrodul pastă de carbon modificat și electrodul picătură de mercur suspendată. Parametrii semnalului au fost aceeași, adică:

durata etapei: 0,4 s

amplitudinea etapei: 10 mV

durata pulsului: 40 ms

amplitudinea pulsului: 25 mV

E initial: -500 mV

E final: -750 mV

Domeniul de curent:

Minim: 10nA

Maxim: 100mA

Un factor important care influențează stripping voltametria este timpul și potențialul de acumulare a analitului la suprafața electrodului de lucru. S-a măsurat intensitatea curentului la diferiți timpi de acumulare (30, 60, 120, 180, 240, 300, 360, 420, 480, 540 și 600 s) pentru o soluție de bromazepam 9,09.10-5 M, folosind cei doi electrozi conform tabelului 116:

Reprezntând grafic variația timpului în funcție de intensitățile curenților (graficul tridimensional din figura 109) se observă că în cazul folosirii electrodului pastă de carbon modificat timpul optim de acumulare este de 300s, iar pentru electrodul picătură de mercur staționară de 60s, ceea ce înseamnă că analitul se adsoarbe un timp mai îndelungat la suprafața electrodului pastă de carbon modificat decât la suprafața picăturii de mercur.

Celălat parametru care poate influența voltametria stripping adsorbtivă este potențialul de acumulare, acesta fiind verificat într-o soluție de bromazepam de concentrație ~10-6 M în soluție de electrolit tampon Britton-Robinson (pH = 3,0). S-au înregistrat voltamogramele pentru potențial de acumulare de: -300 mV, -350 mV, -400 mV, -450 mV și -500 mV folosind MCPE, obținându-se un pic foarte intens pentru -300 mV.

Bromazepamul a fost acumulat în tampon Britton-Robinson (pH = 3) la un potențial de 300 m V fața de un electrod Ag/AgCl la un timp de acumulare de 300 s folosind electrodul pastă de carbon modificat. Referitor la ceilalți parametri ai semnalului aceștia au fost identici ca și în cazul anterior.

Electrod pastă de carbon modificat

Electrodul pastă de carbon modificat a fost preparat prin triturarea a 40 mg pudră carbon cu 15 mg caolin și 20 μL DOP până la obținerea unei paste omogene care a fost presată în corpul electrodului.

Protocolul de analiză a constat în adăugarea unor volume de soluție de bromazepam de concentrație 10-3 M și 10-4 M în celula voltametrică în care se află 10 mL tampon Britton-Robinson (pH = 3).

Potențialul de scanare s-a realizat în sens negativ pe intervalul 0…-700 mV, având potențial de acumulare la -300 mV .

S-au înregistrat voltamogramele pentru soluții având concentrația între 9,80.10-6 M și 9,99.10-8 M bromazepam. În figura 110 sunt prezentate voltamogramele înregistrate iar în tabel valorile intensităților curenților și concentrațiile soluțiilor respective a căror dependență liniară se regăsește în graficul din figura 111:

Domeniul liniar de concentrație este 9,90.10-7 – 9,99.10-8 M bromazepam, unde există o dependență liniară între concentrația soluției de bromazepam și intensitatea picurilor curenților, fapt confirmat de valoarea coeficientului de corelație, 0,9944.

III. 8. 4. Validarea metodei de dozare a bromazepamului prin voltametrie stripping adsorbtivă cu electrod pastă de carbon modificat

Bromazepamul a fost determinat prin voltametrie catodică stripping adsorbtivă cu reducerea grupării azometin înregistrată de puls voltamogramă după acumularea analitului la potențialul maxim de adsorbție asemănător cu flunitrazepamul.

Calibrarea prin metoda adaosului standard se realizează la concentrații mai mici adăugând volume crescânde (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 μL sol 10-4 M bromazepam și 10, 20, 40, 70, 100, 130, 160, 200, 250, 300, 400, 500 μL sol 10-3 M bromazepam) din soluția stoc în 10 mL tampon Britton-Robinson (pH = 3) cu câte trei serii în aceeași zi pentru fiecare tip de electrod. Concentrația soluțiilor obținute a variat între 4,72.10-5 M și 9,99.10-8 M.

În cazul utilizării electrodului pastă de carbon modificat, curba de calibrare, care este prezentată anterior, s-a realizat prin reprezentarea grafică a intensității curentului de reducere în funcție de concentrația bromazepamului.

În continuare se calculează parametrii de liniaritate și testele de omogenitate ale varianțelor pentru 5 nivele de concentrație alese în așa fel încât să avem: 60%, 80%, 100%, 120% și 140%. Concentrația de 100% s-a ales la mijlocul domeniului liniar adică pentru o soluție de bromazepam 4,98.10-6 M, iar celelate concentrații sunt: 2,98.10-6 M (60%), 3,98.10-6 M (80%), 5,97.10-6 M (120%) și 6,97.10-6 M (140%).

Soluțiile respective conțin:

S-au efectuat trei serii independente de concentrații a unor soluții de bromazepam, datele înregistrate fiind prezentate în tabelul 120:

Testul de omogenitate a varianțelor (Testul Cochran) s-a aplicat varianțelor lui Yij pentru a verifica omogenitatea varianțelor constitutive ale erorii experimentale.

Se observă că ccalculat < cteoretic, ceea ce înseamnă că ansamblul varianțelor diferitelor grupuri j pot fi considerate omogene cu riscul 0,05%.

Test de existență a unei pante semnificative (Testul Fisher) constă în compararea variațiilor datorate regresiei și erorilor experimentale de ajustare.

Deoarece valoarea lui Fcalculat este semnificativă, se poate trage concluzia că există o pantă cu dependență lineară de pragul de probabilitate considerat (0,05).

Testul de validitate a dreptei de regresie (Fisher) permite să se compare erorile de ajustare () și experimentale ().

Se observă că valoarea lui Fcalculat nu este semnificativă, deci se poate considera că ajustarea este validă, la pragul de probabilitate considerat (0,05).

Testul de comparare a ordonatei la origine cu zero permite să verifice dacă ordonata la origine nu este semnificativ diferită de zero.

Se observă că valoarea lui tcalculat este mai mică decât t(0,05; 13), deci se poate considera că ordonata la origine nu este semnificativ diferită de zero, cu probabilitatea: p = 1- 0,05 = 0,95.

Exactitate

Testul de omogenitate a varianțelor (Testul Cochran)

Test de validitate a mediilor

Deorece Fc<Ft validitatea mediilor este confirmată.

Intervalul de încredere al mediei regăsite:

Intervalul de încredere este foarte mare datorită valorii mari a abaterii.

Calculul limitei de detecție (LD) și cuantificare (LQ)

Limita de detecție pentru broamzepam folosind această metodă este de 174,6 ng/mL iar limita de cuantificare este 529,1 ng/mL.

Dozarea bromazepamului din forme farmaceutice prin voltametrie stripping adsorbtivă cu MCPE

Pentru pregătirea probei de analiză, 30 comprimate Calmepam (3 mg/cp.), se cântăresc și se calculează masa medie a unei tablete (). Apoi se omogenizează tabletele prin triturare și se cântărește o probă de 0,24503 g pulbere care să corespundă la o soluție de cca.10-3 M obținută prin dizolvarea pulberii într-un flacon volumetric de 10 mL. Dozarea efectivă s-a realizat prin metoda adaosului standard adăugând 20 μL (22, 24, 26 și 28 μL) soluție mai sus preparată peste 10 mL soluție electrolit urmată de adăugarea de cinci ori a câte 20 μL soluție bromazepam 10-3 M (316,2 μg/mL) cu înregistrarea voltamogramelor stripping adsorbtive corespunzătoare. Pentru fiecare volum de soluție de bromazepam formă farmaceutică operația a fost repetată de încă două ori în așa fel încât în tabelul următor se regăsesc valorile medii ale intensităților curentului.

Această operație s-a efectuat de câte trei ori pentru fiecare concentrație în parte, rezultatele obținute fiind redate mai jos:

a Media a trei determinări

Regăsirea medie obținută este 101,23%, dar deviația standard de 4,32% este o valoare prea mare pentru a putea recomanda ca această metodă să poată fi utilizată la dozarea cantitativă a bromazepamului prin voltametrie stripping adsorbtivă. Cu toate acestea, valoarea regăsirii medii corespunde unei cantități de 3,0369 mg/cp. bromazepam care se încadrează în intervalul 2,7 – 3,3 mg corespunzător abaterii admise de ±10% prevăzute de FR X, ceea ce înseamnă că comprimatele de Calmepam (3 mg/cp.) corespund prevederilor FR X referitor la conținutul de substanță activă dintr-un comprimat.

S-a încercat dozarea bromazepamului prin voltametrie stripping adsorbtivă folosind electrodul de mercur picătură staționară, dar nu a fost posibil deoarece se pare că bromazepamul nu se poate adsorbi (sau reduce) la suprafață picăturii.

Concluzii

Ținând seama de datele experimentale obținute și expuse în lucrare, se pot trage următoarele concluzii generale:

Derivații de benzo-(f)-1,4-diazepină prin caracterul lor intrinsec bazic datorat atomului de azot din poziția 4, precum și de grupările grefate pe acest heterociclu, manifestă capacitatea de a forma compuși stabili cu sare Reineke, acid fosfowolframic și acid fosfomolibdenic.

Heteropoliacizii (acid fosfowolframic și acid fosfomolibdenic) și sarea Reinecke formează cu diazepamul, flunitrazepamul și bromazepamul în mediu acid, precipitate diferit colorate și microcristaline.

Ținând seama de proprietățile fizico-chimice ale noilor compuși, au fost elaborate noi metode de analiză cantitativă a diazepamului, flunitrazepamului și bromazepamului atât în stare pură, cât și din forme farmaceutice.

S-au elaborat 10 noi metode potențiometrice de determinare cantitativă a diazepamului, flunitrazepamului și bromazepamului, utilizând ca reactiv de titrare: sare Reineke, acid fosfowolframic și acid fosfomolibdenic. Pentru stabilirea volumului de echivalență (punctului de evhivalență) s-a aplicat metoda grafică folosind softul ORIGIN 7.5.

1. S-au elaborat patru noi metode potențiometrice de dozare a diazepamului, folosind un electrod membrană PVC diazepam selectiv, modificat cu reinekat de diazepam și trei electrozi pastă de carbon modificată cu reineckat de diazepam, fosfowolframat de diazepam și fosfomolibdat de diazepam. Metodele elaborate au fost validate din punct de vedere al liniarității, exactității, repetabilității și reproductibilității. De asemenea au fost determinate limitele de detecție (0,22 – 1,79 μg/mL) și cuantificare (0,72 – 5,37 μg/mL) pentru fiecare caz în parte și s-au efectuat optimizările metodelor, urmărindu-se influența pH-ului și timpul de răspuns al electrodului, dar și selectivitatea electrodului în diverse soluții de interferenți.

2. Pentru determinarea cantitativă a diazepamului s-a construit un electrod membrană PVC diazepam selectiv, care s-a comparat din punct de vedere al performanțelor cu un electrod pastă de carbon diazepam selectiv, avantajul fiind în favoarea electrodului pastă de carbon a cărui regăsire și deviație relativă standard este superioară. (regăsire 99,14% și deviație standard 0,38% pentru electrod pastă de carbon diazepam selectiv față de 99, 08% regăsire și 0,41% deviație relativă standard pentru electrodul membrană membrană PVC diazepam selectiv)

4. 3. S-au elaborat trei noi metode potențiometrice de dozare a flunitrazepamului, folosind trei electrozi pastă de carbon modificată cu reineckat de flunitrazepam, fosfowolframat de flunitrazepam și fosfomolibdat de flunitrazepam. Au fost determinate limitele de detecție (0,15 – 0,23 μg/mL) și cuantificare (0,46 – 0,70 μg/mL) pentru fiecare caz în parte și s-au optimizat metodele elaborate, urmărindu-se influența pH-ului, timpul de răspuns al electrodului și selectivitatea electrodului în diverse soluții de interferenți.

4.4. Au fost instituite trei noi metode potențiometrice de dozare a bromazepamului, folosind trei electrozi pastă de carbon modificată cu reineckat de bromazepam, fosfowolframat de bromazepam și fosfomolibdat de bromazepam. Au fost determinate limitele de detecție (0,019 – 0,180 μg/mL) și cuantificare (0,059 – 0,0,540 μg/mL) pentru fiecare caz în parte și s-au efectuat optimizările metodelor, unde s-a urmărit influența pH-ului și timpul de răspuns al electrodului, dar și selectivitatea electrodului în diverse soluții de interferenți.

5. S-au elaborat noi metode voltametrice de dozare a celor trei benzodiazepine, folosind mai multe tipuri de electrozi indicatori: electrod de carbon sticlos, electrod film de mercur, electrod pastă de carbon modificat, electrod de mercur picătură staționară. Metodele au fost validate.

5. 1. În prima fază s-au stabilit condițiile experimentale (tipul electrolitului, pH-ul electrolitului, timpul de acumulare, potențialul de acumulare, etc) de dozare a benzodiazepinelor.

5. 2. Diazepamul a fost dozat prin voltametrie puls diferențială folosind un electrod de carbon vitros, metoda de dozare voltametrică fiind validată. Din comprimatele de Diazepam (10 mg), diazepamul a fost dozat cu o regăsire de 99,18% și deviație relativă standard de 0,39%. Studiile efectuate cu alți electrozi: electrodul film de mercur, electrodul de platină, electrodul de aur și electrodul de mercur picătură staționară, nu au oferit rezultate acceptabile.

5. 3. Un alt electrod folosit la dozarea diazepamului a fost electrodul pastă de carbon modificat cu caolin. Studiile privind validarea metodei voltametrice puls diferențiale au dus la rezultate necorespunzătoare (valoarea abaterii foarte mare, limitele de detecție și implicit de cuantificare, de asemenea sunt extrem de mari).

5. 4. Flunitrazepamul a fost dozat prin metoda voltametrică puls diferențială folosind un electrod de carbon vitros, iar metoda a fost validată. Dozarea flunitrazepamului din comprimatele de Fluninoc (1 mg/cp), prin această metodă, s-a efectuat cu o regăsire de 98,62% și deviație relativă standard de 0,34%.

5.5. O metodă nouă de determinare cantitativă a flunitrazepamului a fost voltametria stripping adsorbtivă, unde s-au utilizat doi electrozi: un electrod pastă de carbon modificat cu caolin și un electrod de mercur picătură staționară. În cazul electrodului pastă de carbon modificat s-a realizat validarea metodei și dozarea flunitrazepamului din comprimatele de Fluninoc (1 mg/cp), obținându-se regăsirea de 99,08% și deviația relativă standard 0, 45%. Asemănator s-a procedat la determinarea cantitativă a flunitrazepamului prin aceeași metodă, dar cu electrod de mercur picătură staționară. După validarea metodei, determinarea flunitrazepamului din comprimatele de Fluninoc s-a efectuat cu o regăsire de 99,34% și deviație relativă standard 0,14%, ambele metode oferind performanțe comparabile.

5.6. Bromazepamul a fost dozat prin două metode voltametrice diferite, folosind doi electrozi diferiți, ambele metode fiind validate. Prima metodă a fost voltametria puls diferențială în care s-a folosit electrodul de carbon vitros inclusiv la dozarea bromazepamului din comprimatele de Calmepam (3 mg/cp.) unde regăsirea obținută este 99, 43% iar deviația relativă standard 0,54%.

5.7. A doua metodă folosită la dozarea bromazepamului a fost voltametria stripping adsorbtivă în care s-a utilizat electrodul pastă de carbon modificat cu caolin. Rezultatele obținute la determinarea bromazepamului din comprimatele de Calmepam (3 mg/cp.) au fost de 101,23 % regăsire și 4,32% deviație relativă standard. Mai trebuie menționat că s-a încercat o dozare prin aceeași metodă adsorbtivă cu electrod de mercur picătură staționară, dar nu au fost obținute rezultatele bune, se pare că bromazepamul nu s-a adsorbit la suprafața picăturii de mercur, deoarece voltamograma puls diferențială nu înregista nici un pic.

6. Dozarea substanței active din comprimatele luate în lucru (Diazepam 10 mg, Fluninoc 1 mg respectiv Calmepam 3 mg) atât prim titrare potențiometrică cât și prin diferite metode voltametrice utilizând diverși electrozi a dus la concluzia că acestea corespund prevederilor FR X din punct de vedere al substanței active încadrându-se în intervalul obținut din abaterea admisă de 10% pentru comprimate ce conțin o cantitate de substanță activă mai mică sau egală cu 10 mg.

7. În concluzie, rezultatele experimentale obținute în cadrul acestei lucrări, aduc date noi de ordin teoretic și mai ales aplicativ, în clasa substanțelor medicamentoase benzo-(f)-1,4-diazepină, aplicată pe scară largă în terapeutica actuală. Ele completează datele existente până în prezent și deschid noi direcții de cercetare în acest domeniu prin utilizarea electrozilor pastă de carbon modificați în cadrul unor detectori cuplați la diferite aparate de separare (de ex. HPLC cuplată cu un sistem de detecție electrochimic).

8. Metodele fizico-chimice instituite pentru determinarea cantitativă a diazepamului, flunitrazepamului și bromazepamului sunt suficient de exacte, ușor de executat și întrebuințează reactivi uzuali, accesibili laboratoarelor de control și analiză a medicamentelor.

9. Lucrarea este ilustrată cu 112 figuri, din care 91 în partea experimentală personală, și cu 121 tabele, din care 118 de asemenea în partea experimentală.

10. O parte din rezultatele experimentale obținute au fost comunicate (82) sau publicate (74, 78, 84) sau sunt în curs de apariție (85).

Bibliografie

M. Bojiță, L. Roman, R. Săndulescu, R. Oprean – Analiza și Controlul Medicamentelor, vol II, ed. Intelcredo, Deva, 2003;

Sternbach L. H., Reeder E., Journal of Organic Chemistry, 1960, 26, 1111;

Randall L. O. ș. a., Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 1960, 129, 163,

K. Florey, Analytical Profiles of Drug Substances, Academic Press, San Diego, CA, 1991

***** Recommanded Methods for the Detection and Assay of Barbiturates and Benzodiazepines in Biological Specimens, United Nation, New York, 1997;

***, Farmacopeea Română, ed. a X-a, Editura Medicală, București, 1998, 235;

***, U.S. Pharmacopeea, ed. a XXV-a, The United States Pharmacopeial Convention, 2002;

***, Farmacopeea Europeană, ed. a V-a, Ed. Consiliului European, Strasbourg, 2005;

***, British Pharmacopeea, 1993;

Paul Marcu, Complecși anionici ai Cr (III), Cd(II) și Bi(III) și heteropoliacizi în analiza și controlul unor medicamente benzodiazepinice, Teza Doctorat, UMF “Iuliu Hațieganu”, Cluj-Napoca, 1976;

L. Roman, R. Săndulescu – Chimie analitică – Metode de separare și analiză instrumentală, vol III, Ed. Didactică și Pedagogică R.A., București, 1999;

H. Lee, L. J. Kepley, H.G. Hong and T.E. Mallouk, Journal of the American Chemistry Society, 1988, 110, 618;

L.L. Miller and M.R. Van de Mark, Journal of the American Chemistry Society, 1978, 100, 3223;

A. Merz and A.J. Bard, Journal of the American Chemistry Society, 1978, 100, 3222;

A.N.K. Lau and L.L. Miller, Journal of the American Chemistry Society, 1983, 105, 5271;

J.M. Kalvert, R.H. Schmel, B.P. Sullivan, J.S. Facci, T.J. Meyer and R.W. Murray, Inorganic Chemistry, 1983, 22, 2151;

R.N. Dominey, N.S. Lewis, J.A. Bruce, D.C. Bookbinder and M.S. Wrighton, Journal of the American Chemistry Society, 1982, 104, 467;

K.M. Kost, D.E. Bartak, B. Kazee and T. Kuwana, Anaytical Chemistry, 1988, 60, 2379;

M. Umaňa and J. Waller, Anaytical Chemistry, 1986, 58, 2979;

N.C. Foulds and C.R. Lowe, Anaytical Chemistry, 1988, 60, 2473;

G. J. Patriarche, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 1987, 4 (6);

Metrohm, Application Bulletin, nr. 250/1e ;

H. Oelschlaeger, J. Volke, M. B. Veter &co, Archiv der Pharmazie, 1990, 7, 323;

M. Gonzales-Martin, C. Gonzales-Perez, J. Hernandez-Mendez, Anaytical Chemistry, 1986, 1,  82;

M. M. Hefnawy, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2002, 27;

C.A.H. Chambers and J.K. Lee, Journal of Electroanalytical Chemistry, 1967, 14, 309;

R.N. Adams, Anaytical Chemistry, 1976, 48, 1128A;

T. Kuwana and W.G. French, Anaytical Chemistry, 1964, 36, 241;

F.A. Schultz and T. Kuwana , Journal of Electroanalytical Chemistry, 1965, 10, 95;

D. Bauer and M.P. Gaillochct, Electrochimica Acta, 1974, 19, 597;

B.F. Walkins, R.J. Sehling, E. Karin and L.L. Miller, Journal of the American Chemistry Society, 1975, 97, 3549;.

S.V. Pralehu and R.P. Baldwin, Anaytical Chemistry, 1989, 61, 852;

S.V. Pralehu and R.P. Baldwin, Anaytical Chemistry, 1989, 61, 2258;

P. Luo, S.V. Prabhu and R.P. Baldwin, Anaytical Chemistry, 1990, 62, 752;

X. Qi and R.P. Baldwin, Electroanalysis, 1991, 3, 119;

A. Ciucu and R.P. Baldwin, Electroanalysis, 1992, 4, 515;

X. Qi and R.P. Baldwin, Electroanalysis, 1993, 5, 547;

R. Săndulescu, R. Oprean, L. Roman, Farmacia, 1997, 4, 23-34;

Khodari M., Kauffmann J. M., Patriarche G. J., Ghandour M-A., Electroanalysis, 1989, 1, 501;

P. Protti – Introduzione alle moderne tecniche di Analisi Voltammetriche e Polarografiche, Ed IV, 2001;

N. Abo El-Maali, Voltammetric analysis of drugs. Review. Bioelectrochemistry, 2004, 64, 99–107;

S. P. Kounaves – Handbook of Instrumental Techniques for Analytical Chemistry, 1999, 709 – 725;

R. S. Nicholson and I. Shain, Anaytical Chemistry, 1964, 36;

D. H. Evans, K. M. O’Connel, R. A. Peterson, M. J. Kelly, J. Chem. Ed., 1983, 60, 290;

A. J. Bard, L. R. Faulkner, Electrochemical Methods, J. Wiley and Sons, New York, 1980, 507;

D. C. Johnson, S. G. Weber, Analytica Chimica Acta, 1986, 180;

K. B. Oldham, E. P. Parry, Anaytical Chemistry, 1968, 40, 65;

J. L. Morris, L. R. Faulkner, Anaytical Chemistry, 1977, 49, 489;

K. B. Oldham, E. P. Parry, Anaytical Chemistry 1970, 42, 229;

J. H. Christie, R. A. Osteryoung, Journal of Electroanalytical Chemistry, 1974, 49, 301;

J. Pradac, J. Pradacova, Electroanalytical Chemistry, vol 11, M. Deker, 1979, 85;

K. B. Oldham, E. P. Parry, Anaytical Chemistry, 1966, 838, 67;

J. B. Flanagan, K Takahashi, F. C. Anson, Journal of Electroanalytical Chemistry, 1977, 85, 257;

H. P. Van Leeuwen, Journal of Electroanalytical Chemistry, 1982, 133, 201;

E. P. Parry R. A. Osteryoung, Anaytical Chemistry, 1965, 37, 1634;

R. L. Birke, Anaytical Chemistry, 1978, 50, 1489;

J. Galvez, Anaytical Chemistry, 1985, 57, 585;

M. H. Kim, R. L. Birke, Anaytical Chemistry, 1983, 55,522;

F. Sanz, J. Puy, F. Mas, J. Virgil, Journal of Electroanalytical Chemistry, 1985, 183, 57;

S. B. Adeloju, A. M. Bond, M. H. Briggs, Anaytical Chemistry, 1985, 57, 1386;

Vydra, F., Stulik, K., Julakova, E., Electrochemical Stripping Analysis, Halsted Press, New York, 1976;

Wang, J., Stripping Analysis, VCH Publishers, Deerfield Beach, FL, 1985;

Copeland, T.R., Skogerboe, R.K., Analytical Chemistry, 1974, 46, 1257ă;

Kalvoda, R., Analytica Chimica Acta, 1984, 162, 197;

Zanoni, M.V.B., Fogg, A.G., Analyst, 1993, 118, 1163;

R. M. Wightman, S. Hochsetler, D. Michael and E. Travis, Chemical Communication Using Microelectrodes as Secretion Probes in Biological System, Interface, Fall, 1996, 22;

T. Grygar, F. Marken, U. Scrhoder, F. Scholz, Collection Czechoslovak Chemical Communications, 2002, 67;

Klara Toth, Karel Stulik, W. Kutner, Z. Feher, E. Lindner, Pure and Applied Chemistry, 2004 , 76 (6), 1119–1138;

L. B. Pfendt, G. A. Popovic, T. Damjanovi, D. M. Sladic, Journal of the Serbian Chemical Society, 2002, 67 (3), 187–195;

A. A. Salem, B. N. Barsoum, E. L. Izake, Analytica Chimica Acta, 2003, 498, 79–91;

A. E. A. Salem, B. N. Barsoum, G. R. Saadb, E. L. Izake, Journal of Electroanalytical Chemistry, 2002, 536, 1 – 9;

I. P. Gorelov, S. S. Ryasenskii, S. V. Kartamyshev, M. V. Fedorova, Journal of Analytical Chemistry, 2005, 60 (1), 65–69. Translated from Zhurnal Analiticheskoi Khimii, 2005, 60 (1 ), 74–78;

Y. M. Issa, N. T. Abdel-Ghani, A. F. Shoukry, M. Ahmed, Analytical Sciences, 2005, 21, 1037 – 1042;

F. Bǎnicǎ, Tunde Jurca, Laura Vicaș, Ildiko Szabo, Analele Universității din Oradea, Fascicula Științe Farmaceutice, 2004, III, 28 – 32;

M. E. Lozano-Chaves, J. M. Palacios-Santander, L.M.Cubillana-Aguilera, I.Naranjo-Rodriguez, J.L.Hidalgo-Hidalgo-de-Cisneros, Sensors and Actuators B: Chemical Volume, 2006, 115 (2), 575-583;

Z. Navratilova, P. Kula, Electroanalysis, 2003, 15 (10), 837-846;

V. V.Coșofreț, R. Buck, Critical Reviews in Analytical Chemistry, 1993, 24 (1), 1-58;

F. Bănică, E. Bodoki, E. Marian, L. Vicaș, R. Săndulescu, Farmacia, 2007, 207 – 216;

***, I.C.H. Harmonised Tripartite Guideline: Validation of Analytical Methods: Methodology, I.C.H. Topic Q2B-Pharm. Ind., 1997, 59 (2), 312;

***, Guide de validation analytique, Rapport d’une comission SFSTP, S.T.P. Pharma Pratiques, 1992, 2(4), 205-226;

Srinivisan K., Rechnitz G. A. , Anaytical Chemistry, 1969, 41, 1203;

F. Bănică, E. Marian, T. Jurca, E. Bodoki, R. Sănndulescu, L. Roman, Congresul Național de Farmacie, Ed. a XIII-a, Cluj-Napoca, 2006;

F. Bănică, E. Marian, S. Lotrean, R. Săndulescu, Revista medico-chirurgicală a Societății de Medici și Naturaliști din Iași, 2007, 111 (2), 389 – 390;

F. Bǎnicǎ, S. Bungǎu, E. Marian, T. Jurca, L. Vicaș, Analele Universității din Oradea, Fascicula Științe Farmaceutice, 2003, II, 33 – 37;

F. Bănică, S. Cavalu, A. Fodor, R. Săndulescu, Analele Universității din Oradea, Fascicula Chimie, 2007, XIV in press;

A. W. Bott, O. Howell, Current Separations, 1994, 3 (3), 21;

C. M. A. Brett and A. M. O. Brett, Electrochemistry, Principles, Methods, and Aplications, Oxford University Press, New York, 1993;

***** Application Bulletin, Metrohm, 1998, 250/1e;

L. Roman, M. Bojiță, R. Săndulescu, Validarea metodelor de analiză și control – Bazele teoretice și practice, Ed. Medicală, 1998, 86 – 110;

JC Miller, JN Miller, Statistics for Analytical Chemistry, Second edition, Ellis Horwood Lim., London, 1988;

M. Bojiță, L. Roman, R. Săndulescu, R. Oprean – Analiza și Controlul Medicamentelor, vol I, Ed. Intelcredo, Deva, 2003.

.