Studiul disfuncției vasculare într-un model animal experimental de ateroscleroză Coordonatori științifici: INTRODUCERE Bolile cardiovasculare (BCV)… [303960]

[anonimizat]:

INTRODUCERE

Bolile cardiovasculare (BCV) [anonimizat] 17 milioane de decese anual (31%), în special în țările slab dezvoltate. Termenul definește totalitatea afecțiunilor/bolilor care afectează inima și vasele de sănge, o mare parte fiind atribuite aterosclerozei.

Ateroscleroza este o [anonimizat], [anonimizat], cu etiologie multifactorială și asimptomatică în stadiile inițiale. Ateroscleroza se instalează datorită acumularii de lipide și celule inflamatorii în spațiul subendotelial de la nivelul peretelui vascular (intima), determinând formarea leziunii/[anonimizat]. [anonimizat], cu distrugeri severe și ireversibile la nivelul organelor afectate.

[anonimizat] o barieră selectivă cu o serie de funcții cu rol major în asigurarea stabilității hemostatice adecvate și a tonusului vascular prin menținerea echilibrului dintre vasodilatație și vasoconstricție. [anonimizat]/[anonimizat].

[anonimizat]-un model experimental “in vivo” cu boală cardiovasculară aterosclerotică. [anonimizat]: (1) Realizarea și caracterizarea modelului animal cu boală cardiovasculară aterosclerotică; (2) Evaluarea disfuncției vasculare și explorarea mecanismelor implicate; investigarea markerilor inflamatori specifici și a căii de semnalizare Ang II; TGF-β1/Smad2,3; TAK1 [anonimizat]2, NF-kB, AP-1S3 cu afectarea ulterioară a expresiei miR21/miR192/miR200/miR29.

Rezultatele acestui studiu vor constitui baza unei abordări terapeutice mai eficiente a disfuncțiilor vasculare în ateroscleroză și boli cardiovasculare.

[anonimizat] – [anonimizat]-vascular.

[anonimizat], alcătuit din inimă (cord), [anonimizat], se formează atât în stadiile timpurii în cadrul procesului de embriogeneză (vasculogeneză) cât și în cursul vieții postnatale (prin procesul de angiogeneză), având origine mezodermică. [anonimizat]: transportă oxigenul și nutrienții necesari activității metabolice a țesuturilor și elimină produșii în exes. [anonimizat] o [anonimizat] o rețea care facilitează buna funcționare a acestora. Vasculatura este împărțită în sistemul vascular sanguin care transportă sângele și sistemul vascular limfatic care transportă limfa. Morfogeneza vaselor de sânge este adaptată nevoilor țesutului din care fac parte, astfel că fiecare tip de vas prezintă o ierarhie și structură distinctă: ARTERE ELASTICE – ARTERE MUSCULARE – ARTERIOLE – METAARTERIOLE – CAPILARE – VENULE POSTCAPILARE – VENULE COLECTOARE – VENULE MUSCULARE – VENE (Pittman, 2011).

În urma activității inimii, sângele este distribuit în întregul organism prin intermediul celor două circuite vasculare distincte. Astfel, circulația este împărțită în:

(1) Circulația sistemică (sau circulația mare), care asigură necesarul de nutrienți tuturor celulelor, începe din ventriculul stâng cu artera aorta și se distribuie într-o rețea complexă catre organe și țesuturi – microvasculatură – venele cave (inferioară și superioară) ajungând în atriul drept. Acest circuit este mai lung și cuprinde vene mult mai numeroase decât arterele situate atât profund cât și superficial. La nivelul capilarelor, care sunt cele mai mici vase de sânge, are loc schimbul dintre oxigen și dioxid de carbon, dar și de nutrienți sau produși rezultați în urma metabolismului. De regulă arterele mari sunt localizate profund, protejate de țesuturile care le înconjoară, fiind însoțite de o singură vena profundă, spre deosebire de arterele micii și mijlocii care sunt însoțite de doua vene situate profund. Venele superficiale au localizare la nivel subcutanat, predominant în regiunea membrelor și capului și se pot observa prin transparența tegumentului (Marcu-Lapadat, 2005; Pittman, 2011).

(2) Circulația pulmonară (sau circulația mica), care asigură transportul sângelui neoxigenat la plămâni, începe din ventriculul drept prin trunchiul arterei pulmonare – plămâni – cele 4 vene pulmonare – atriul stâng. Este un circuit scurt, care asigură oxigenarea sângelui prin intermediul funcției plămânului; alveolele pulmonare prezintă cea mai bogată rețea de capilare, iar la nivelul membranei alveolo-capilare are loc schimbul de gaze respiratorii (Marcu-Lapadat, 2005).

1.2. Vasculatura

Sistemul vascular (sistemul venos și sistemul arterial) este alcătuit din totalitalea vaselor de sânge care formează un sistem închis prin care sângele circulă în tot organismul întorcându-se mereu la inimă. Vasele de sânge sunt descrise ca fiind organe tubulare care prezintă la interior lumen (cavitate prin care circulă sângele) și un perete format din trei tunici concentrice. În funcție de morfologia și funcția acestora, vasele prezintă următoarea clasificare: de conducere – artere elastice, de distribuție și menținere a fluxului sanguin prin vasoconstricție/vasorelaxare – artere musculare, de reglare a presiunii sanguine (tensiunii arteriale) – arteriole și metaarteriole (menținerea presiunii scăzute în capilare, conțin sfincterul precapilar), de asigurare a schimburilor de gaze respiratorii și nutrienți – capilare, venule postcapilare (drenează sângele), de întoarcere – venule, vene (Taylor și Burdoni, 2019).

În structura vaselor de sânge sunt prezente trei tipuri de țesuturi, care intră în alcătuirea celor trei tunici care formează peretele vascular. De la interior la exterior se observă: țesut epitelial vascular reprezentat de endoteliu care reprezintă o barieră selectivă formată din celule endoteliale specializate așezate pe o membrane bazală (50-100nm), țesut muscular format din celule musculare netede distribuite în straturi concentrice la nivelul mediei, absente la nivelul capilarelor și la nivelul venulelor postcapilare, cu ajutorul lor vasul de sânge prezintă funcțiile de relaxare și contracție prin care se reglează presiunea fluxului sanguin și țesut conjunctiv format din fibre de colagen de tip I și III, fibre de elastină distribuite în lame elastice paralele între straturile musculare, preponderent la nivelul arterelor elastice, proteoglicani și hialuronat care determină permeabilitatea vasului de sânge (Tucker și Mahajan, 2020).

1.2.1. Structura histologică a peretelui vascular

Peretele vascular, cu excepția capilarelor, prezintă 3 straturi concentrice numite tunici care delimitează lumenul vascular (Figura 1):

Tunica internă – INTIMA este reprezentată de endoteliul vascular dispus pe o membrană bazală, se continuă la stratul intern (endocard, care căptușește cavitatea cordului) format din țesut conjunctiv lax, fibre de colagen I și III, de reticulină, elastină, cu lamina elastică internă care la nivelul vaselor mari este fenestrată pentru a putea permite trecerea substanțelor nutritive în toată grosimea peretelui. De asemenea, intima de la nivelul venelor, prezintă valvule venoase care ajută la circulatia sângelui către inimă, în sens opus gravitației. În particular, arterele mari prezintă adiacent un spațiu subendotelial.

Tunica medie – MEDIA sau stratul muscular este alcătuit din celule musculare netede cu dstribuție concentrică sau longitudinală, care determină vasoconstricție sau vasorelaxare în funcție de necesitățile organismului, din fibre conjunctive elastice, fibre de colagen I, III, V, proteoglicani, laminină, fibronectină, și lamina elastică externă. În funcție de tipul vasului de sânge, în arterele de tip elastic predomină fibrele elastice, iar în arterele mijlocii și mici predomina fibrele musculare netede. Venele prezintă o tunică medie mult mai subțire în comparație cu arterele.

Tunica externă – ADVENTICEA este formată din țesut conjunctiv, fibre de colagen I și III, fibre elastice, fibroblaste, celule musculare netede rare, si țesut adipos perivascular. Adventicea are rol protector fiind mai groasă la nivelul venelor și mai subtire în artere. La nivelul ei sunt prezente fibre nervoase, vase limfatice și vase de sânge proprii (vasa vasorum) care asigură hrănirea peretelui vascular.

Arterele mari sau elastice sunt vase de conducere care asigură deplasarea sângelui în intreg organismul. Din această categorie fac parte aorta toracică, arterele carotide, artera pulmonară, trunchiul brahiocefalic, artera iliacă comună. Ele au tunica internă bine dezvoltată, groasă, endoteliu crenelat, spațiu subendotelial, tunica medie alcătuită din 60 de lame elastice la adult (concentrice separate de celule musculare netede), fibre de colagen, adventicea bogată în fibre de colagen, fibroblate, celule dendritice, terminații nervoase, vasa vasorum. Atât lamina elastică internă cât și cea externă sunt slab observabile (Figura 2) (Tucker și Mahajan, 2020).

Capilarele sunt cele mai mici vase de sânge, cu diametru cuprins între 4 -10 μm, formând cel mai important teritoriu vascular la nivelul căruia are loc schimbul de gaze respiratorii și substanțe nutritive dintre sânge și lichidul interstițial. Sunt alcătuite dintr-un perete subțire format exclusiv din tunica internă (endoteliu situat pe o membrană bazală și pericite), sunt prezente la nivelul tuturor tipurilor de țesuturi, iar în funcție de activitatea și nevoile metabolice, circulația din capilare este crescută sau redusă. Rețeaua este dispusă între ultimele ramificații ale arteriolelor denumite metaarteriole și venule, iar prin intermediul sfincterului precapilar format din musculatură netedă are loc reglarea fluxului sanguin și menținerea unei presiuni scăzute în interiorul capilarelor. Capilarele reprezintă cel mai important sector funcțional al sistemului cardio-vascular datorită funcției peretelui vascular, care acționează ca o barieră semipermeabilă pentru transportul moleculelor (Godwin și colab, 2020).

În funcție de histologia endoteliului, capilarele se clasifică în:

(1) Capilarele de tip continuu prezintă celule endoteliale strâns unite între ele, interconectate prin joncțiuni intercelulare, situate pe o membrană bazală continuă și subțire încunjurată de pericite. Prezintă rar canale intercelulare pentru asigurarea permeabilității dar si vezicule de pinocitoză numeroase. Se găsesc la nivelul encefalului formând bariera hemato-encefalică, dar și la nivelul plămânului, cordului, tegumentului și mușchiului.

(2) Capilarele fenestrate prezintă un endoteliu cu fenestre (diametru 60-80 nm) sau pori de filtrare care asigură o permeabilitate crescută față de capilarele continue, sunt rar înconjurate de pericite, membrana bazală este continuă și groasă la nivelul glomerulului renal. Se găsesc la nivelul glandelor endocrine, tractului gastro-intestinal și la nivelul rinichilor.

(3) Capilarele sinusoide prezintă un endoteliu și o membrană bazală disontinuă. Celulele endoteliale sunt fuziforme, lumenul are contur neregulat si spații mari între celule (0,5-2 µm), care permit trecerea unor molecule de dimensiuni mari (proteine, hematii), și nu sunt înconjurate de pericite. Se găsesc la nivelul ficatului unde sunt înconjurate de celule specializate –macrofage Kupffer, splină, măduvă osoasă hematogenă.

Pericitele sunt celule mioide localizate în jurul capilarelor și al venulelor postcapilare, au funcție contractilă datorită rețelei de actină și miozină, fiind controlate de sinteza oxidului nitric produs de celula endotelială. Ele comunică cu celulele endoteliale prin intermediul joncțiunilor gap, emit prelungiri citoplasmatice ramificate, reglează fluxul sanguin și împreună cu acestea sintetizează membrana bazală și factorii de creștere. Pericitele sunt considerate celule mezenchimale nediferențiate deoarece în anumite condiții se pot diferenția în adipocite, fibroblaste, condrocite sau chiar în celule endoteliale (Taylor și Bordoni, 2019).

1.3. Endoteliul vascular

1.3.1. Celula endotelială: definiție și compoziție

Celula endotelială este o celulă cu formă alungită, poligonală, cu lungimea de 30-50 µm și grosimea de 0,1-10 µm, dispusă pe axul longitudinal al vasului de sânge pentru a reduce forța de frecare la contactul cu fluxul sanguin. Nucleul este central, alungit, citoplasma conține microfilamente necesare pentru contracție, filamente intermediare de vinculină (proteină prezentă în structura citoscheletului fiind implicată în interacțiile celulă-celulă sau celulă-matrix extracelular prin legarea moleculelor de integrină la actină (adeziune focală)), reticul endoplasmatic rugos (RER), reticul endoplasmatic neted (REN), aparat Golgi, mitocontrii, vezicule plasmalemale, corpii Weibel-Palade (granule electronodense de depozitare prezente la nivelul arterelor, venelor, capilarelor cu excepția vaselor limfatice cu funcția de a stoca două molecule principale: factorul von Willebrand (vWF) și P-selectină cu rol în inflamație și hemostază).

Factorul von Willebrand este esențial în coagularea sângelui, leagă factoul de coagulare VIII în momentul lezării vasului semnalizând aderarea plachetară și formarea ulterioară a cheagului.

P-selectina are rol în adeziunea plachetelor și a leucocitelor și mediază transportul lor (extravazarea/diapedeză) în locul infecției/inflamației prin fuziune cu membrana endoteliului.

În condiții normale, endoteliul intact exprimă nivele scăzute ale moleculelor de adeziune ICAM-1, VCAM-1, E-selectine, P-selectine, iar în momentul activării lui exprimarea acestor molecule crește, facilitand aderarea celulelor circulante cu restrictionarea ulterioara a fluxului sanguin si initierea formarii complexelor de coagulare (Alberts și colab, 2002).

Membrana celulelor endoteliale prezintă microdomenii bogate în colesterol și sfingolipide tapetate pe fața lor citoplasmatică cu proteina denumita caveolină-1. Caveolele sunt implicate în transportul moleculelor prin procesul denumit transcitoză (transportul moleculei de pe fața apicală pe cea abluminală) (Simionescu și Simionescu, 1985). Endocitoza reprezintă o altă modalitate de transport prin intermediul veziculelor plasmalemale “coated pits” mediată de clatrină.

Celulele endoteliale sunt celule aplatizate, polarizate, dispuse în monostrat, care căptușesc interiorul vasului de sânge fiind ancorate la o grosime de 80 nm în lamina bazală, formând tunica internă sau intima întregii vasculaturi. În funcție de diametrul vasului, celulele endoteliale variază ca număr și arhitectura și prezintă heterogenitate funcțională și specificitate de țesut. Desi au origine embrionară comună, celulele endoteliale nu trebuie privite ca un țesut omogen, ele reprezinta populații de celule care au în comun o serie de funcții adaptate pentru regiunea tisulară in care sunt localizate. Mecanismele epigenetice acționează asupra morfologiei, funcției și expresiei proteice la nivelul celulelor endoteliale. Ele formează un sistem care este adaptat susținerii nevoilor metabolice ale țesuturilor și prezintă capacitatea de a secreta anumiți factori fără de care remodelarea și repararea vasculară nu ar fi posibile (Félétou, 2011) (Krüger-Genge și colab, 2019).

Celulele endotaliale prezintă trei suprafețe de contact: coezivă, adezivă și luminală. Partea coezivă ajută conectarea lor prin jonctiuni intercelulare strânse-ocluzive (tight), partea adezivă permite aderarea la lamina bazală prin intermediul joncțiunilor de adeziune, iar partea luminală prezintă proteine de legare specifice care controlează traficul celulelor sanguine. Cele mai numeroase sunt joncțiunile gap, care asigură comunicarea endoteliului cu celelalte straturi adiacente, fiind formate din două hemicanale numite conexoni care delimitează pasajul de trecere a moleculelor. Cele mai întâlnite conexine de la nivelul conexonilor sunt Cx43, Cx40, Cx37 (Favero și colab, 2014).

Partea luminală a celulelor endoteliale intră în contact direct cu celulele circulante, iar suprafața bazolaterală este separată de țesuturile din jur de o glicoproteină membranară. Celulele endoteliale prezintă situsuri de legare pentru glicocalix format din glicoproteine și proteoglicani. Glococalixul este o rețea complexă de natură polizaharidică de macromolecule care formează un multistrat pentru a reduce contactul direct cu componentele celulare sanguine. Compoziția și distribuța glicocalixului variază în funcție de forțele care acționează asupra vasului (stimuli mecanici, pH), ceea ce duce la pierderea și resinteza lui. Sinteza este un proces complex în care sunt implicate mai multe căi enzimatice, iar prin intermediul domeniului său intracelular poate acționa ca transductor pentru celulele endoteliale pentru a semnala un eventual stres mecanic sau leziune. Orice modificare la nivelul conformației are implicare directă în reglarea tonusului vascular și eliberarea oxidului nitric (Mazurek și colab, 2017).

Deși în alcătuirea vasculaturii intră diferite tipuri celulare, endoteliul vascular reprezintă cea mai importantă sursă de producere a metaloproteinazelor matriceale (MMPs) în cadrul procesului de angiogeneză sau de vindecare a leziunilor. Funcția acestor proteine depinde de expresia și activitatea lor, determinate de condiții fiziologice sau patologice, de stres mecanic și hemodinamic. În condiții fiziologice, celulele endoteliale produc nivele reduse de MMP-1 și MMP-2, însă sub acțiunea factorilor proangiogenici și a mediatorilor proinflamatori expresia lor crește, activând și MMP-urile latente. MMP-2 face parte din grupul 2 de proteaze zinc- dependente fiind denumite si colagenaze de tip IV după specificitatea de substrat. Un astfel de factor este VEGF- Vascular Endothelial Growth Factor (factor de creștere endotelial vascular), care crește activitatea MMP-2 și reduce activitatea inhibitorilor de metaloproteinaze TIMP1 si TIMP2. De asemenea, expunerea la factori proinflamatori precum interleukine, prezența de LDL oxidat în spațiul subendotelial determină activarea proMMP-2. Expunerea la TGF-β1 -Transforming Growth Factor (factor de creștere transformant), induce supraexprimarea metaloproteinazelor în celulele musculare netede determinând modularea lor spre fenotipul contractil. Aceste efect este antagonist celui produs de către PDGF – Platelet-Derived Growth Factor (factor de creștere plachetar) care determină ca celulele musculare să adopte un fenotip proliferativ. În cazuri patologice, eliberarea speciilor reactive de oxigen (ROS) crește activitatea celulelor și controlează proliferarea fibroblastelor și sinteza de colagen (Chelladurai și colab, 2012).

1.3.2. Funcțiile endoteliului vascular

Endoteliul vascular este descris ca un organ dinamic care tapetează întregul sistem vascular de la nivelul inimii până la nivelul capilarelor, prezentând funcții speciale (secretoare, de sinteză, metabolice și imunologice) esențiale pentru biologia vasculară. Deoarece se află localizat pe partea luminală a vasului de sânge și intră în contact cu celulele sanguine, joacă un rol esențial în controlul fluidității sângelui, în permeabilitatea vasculară, agregarea plachetară, controlul trecerii leucocitelor în țesuturi și în menținearea tonusului vascular. De asemenea, este implicat în medierea răspunsurilor hemostatice, inflamatorii, de angiogeneză, reparare si remodelare vasculară. Pentru a putea îndeplini toate aceste roluri, endoteliul răspunde continuu la stimulii mecanici și biochimici prin intermediul receptorilor pentru factorii de creștere, prin sinteza și eliberarea lipoproteinlipazelor (LPL – necesare în metabolismul trigliceridelor), a factorilor plachetari și hormonilor (care produc schimbări în expresia proteinelor via ARNm), prin proliferarea celulară/creșterea celulară și eliberarea mediatorilor vasoactivi și a factorilor inflamatori (Pearson, 2000) (Krüger-Genge și colab, 2019).

Datorită heterogenității sale, endoteliul asigură funcția de barieră cu permeabiliate selectivă care realizează schimburi bidirecționale de O2, CO2, glucoză, apă, electroliți și molecule de diferite dimensiuni (hormoni, proteine). Această funcție este determinată de jocțiunile intercelulare care stau la baza acestei selectivități și care controlează modul în care endoteliul este organizat și adaptat unei anumite regiuni tisulare. De exemplu, joncțiunile stânse asigură o permeabilitate redusă la nivelul barierei hemato-encefalice, rezistență la presiunea mare din interiorul arterelor, o rată de filtrare, absorbție si secreție crescută la nivelul glomerulului renal, și de asemenea asigura transferul liber al lipoproteinelor din fluxul sanguin în hepatocite (structura discontinuă a endoteliului specifică capilarelor sinusoide).

Endoteliul vascular raspunde la stimuli externi (hipoxie, stres mecanic) prin eliberarea de substanțelor vasoactive (Favero și colab, 2014). S-a observat ca anumite condiții patologice, precum ateroscleroza sau inflamația cronică, sunt asociate în prima etapă cu modificarea structurii joncțiunilor și ulterior cu activarea endoteliului (Kerr și colab, 2011).

Pentru menținerea tonusului vascular este necesară sinteza și eliberarea atat a factorilor de relaxare (oxidul nitric (NO), metaboliții acidului arahidonic, prostacicline (PGI2), factori de hiperpolarizare derivați de la endoteliu (EDHF)), cat și a factorilor de contracție (Tromboxan A2 (TXA2), Endoteline (ET-1), Angiotensină II (Ang II), Prostaglandina H2 (PGH2)).

În condiții fiziologice, endoteliul are funcție antitrombotică, de menținere a fluidității sângelui și a echilibrului hemostatic. Acest lucru se realizează prin secreția factorilor anticoagulanți (trombomodulină, heparan) si antitrombogeni (prostaciclina (PGI2)) și a activatorului tisular al plasminogenului (TPA) care reglează fibrinoliza. Celulele endoteliale exprimă pe suprafața lor receptorul pentru trombină care transformă acest factor procoagulant într-o enzimă anticoagulantă. Trombina legată de trombomodulină activează proteina C, care prin asociere cu proteina S, inactivează factorii Va și VIIIa oprind cascada de coagulare. Acest fenotip anticoagulativ este caracterizat și de nivele scăzute de PAI (inhibitor al activatorulului de plasminogen), specii reactive de oxigen, acid uric, P-selectine, factori von Willebrand (Rajendran și colab, 2013). Activatorul tisular al plasminogenului (t-PA) și inhibitorul activatorulului de plasminogen (PAI-1) sunt markeri fibrinolitici sintetizați în celulele endoteliale, iar în momentul în care endoteliul este activat în urma lezării, apare un dezechilibru al nivelului lor de expresie generând formarea unei suprafețe procoagulante. Orice leziune care conduce la infamație și la activarea endoteliului, are ca urmări dezechilibre între sistemele pro- și anticoagulante având ca rezultat formarea cheagului de sânge și producerea trombozei (Felmeden și Lip, 2014).

1.3.2.1. Factorii de relaxare și contracție

Fosfolipidele din structura membranei celulare eliberează acidul arahidonic prin intermediul fosfolipazelor. Acidul arahidonic este metabolizat de către ciclooxigenaze (COX), lipooxigenaze (LO) și citocromul P450 monooxigenaze (CTP). Enzimele COX metabolizează acidul arahidonic în intermediari de endoperoxid, care sunt apoi convertiți într-o serie de eicosanoizi (de exemplu, prostaciclină PGI2, Tromboxan A2) prin acțiunile diferitelor sintaze cu rol în reglarea funcției vasculare. Cele doua izoforme COX-1 și COX-2 sunt prezente la nivelul endoteliului; COX-1 are acțiune vasoprotectivă, iar COX-2 este exprimat când endoteliul este expus citokinelor proinflamatorii (Kerr și colab, 2011).

Acidul arahidonic este convertit în prostaglandina H2 (PHG2), care apoi este sintetizat în Prostaciclina (PGI2), care se leagă de receptorii prostaciclinei (IP) cu localizare atât la nivelul plachetelor sanguine dar și pe celulele musculare netede. Activarea acestor receptori conduce la inhibarea agregării plachetare și activează calea cAMP (adenozin monofosfat ciclic), care la rândul său activează protein kinaza A prin care se induce relaxarea fibrelor musculare, efect similar cu cel produs de NO (Figura 3A). De asemenea, PGI2 inhibă agregarea leucocitelor, limitează proliferarea celulelor musculare și contracarează efectul produs de factorii de creștere (Sandoo și colab, 2010).

Tromboxan A2 (TXA2) rezultă pe aceeași cale de sinteză dar spre deosebire de PGI2, acesta determină agregarea plachetară și vasoconstricție. Acțiunile sale sunt mediate de receptorii tromboxan-prostanoid (TP), receptori cuplați cu proteina G, localizați la nivelul trombocitelor generând aderarea plachetară, dar și pe celulele musculare netede unde determină creșterea nivelului de Ca2+ intracelular rezultând contracția musculară (Figura 3B). Acest factor acționează într-o manieră paracrină activând trombocitele adiacente pentru a genera mai mult TXA2 și amplifica acțiunea altor agoniști trombocitari mai puternici. COX-2 este izoforma inductibilă care se găsește în condiții normale la o mică parte din plachetele circulante, prezentând o expresie ridicată în trombocitele nou formate (regenerare plachetară), dar și la nivelul monocitelor implicate în inflamație. De asemenea, COX-2 crește expresia moleculelor de adeziune și are efecte asupra proliferării și hipertrofiei celulare (Smyth, 2010).

Lipoxigenazele sunt enzime care deoxigenează acizii grași polisaturați cu acțiune asupra acidului arahidonic rezultând forme stero specifice – HPETE. Celula endotelială exprimă trei izoforme (5-LO, 12-LO și 15-LO). 5-LO este implicat în sinteza leucotrienelor iar produșii rezultați din activitatea 12-LO și 15-LO (lipoxina A4/B4) sunt vasoactivi producând vasorelaxare și inhibă activitatea chemotaxică a neutrofilelor (Kerr și colab, 2011). Astfel, în menținerea homeostaziei la nivelul vasului de sânge este nevoie de un echilibru menținut între activitățile acestor doi factori.

Endotelinele (ET) fac parte dintr-o familie de peptide cu 21 aminoacizi, fiind exprimate în trei izoforme (ET-1, ET-2, ET-3). ET sunt sintetizate din Big ET-1 în endotelină 1 prin acțiunea enzimei de conversie a endotelinei (ECE) . Celulele endoteliale produc și eliberează numai ET-1. Endotelina ET-2 este produsă în rinichi și intestin, în timp ce ET-3 este produsă la nivelul creierului, tractului gastro-intestinal și la nivelul plămânilor. ET-1 este un factor vasoconstrictor puternic care induce vasoconstricție îndelungată, având efect asemănător cu cel produs de către AngII (Titus și Marappa-Ganeshan, 2019).

Mecanismul care determină contracția constă în activarea fosfolipazei C, care la rândul său determină formarea de IP3 (inozitol trifosfat) și DAG (diacilglicerol) care crește cantitatea de Ca2+ ce intră în celulă prin activarea protein kinazei C. Receptorii pentru ET-1 au fost identificați atat la nivelul celulelor musculare netede (ETA si ET-B2), cât și la nivelul celulelor endoteliale (ET-B1). În momentul legarii ET-1 la receptorii ETA si ET-B2, canalele de Ca2+ se deschid permițând un influx de calciu extracelular care induce o vasoconstricție (Figura 3B). În sens opus, activarea receptorului ET-B1 de către ET-1 determină vasodilatație produsă de sinteza NO și PGI2. Reglarea producției de ET-1 este stimulată de factorii inflamatori (interleukine și TNF-a) și de stresul mecanic care acționează asupra endoteliului. Pe lângă efectele sale vasoactive, ET-1 are efect mitogenic și proinflamator determinând proliferarea celulelor musculare netede datorită legării la receptorii ETA și activării factorilor de creștere, cum ar fi PDGF. În consecința, ET-1 induce îngroșarea perelelui arterial în cazul aterosclerozei. În plus, legarea ET-1 la receptorii ETA determină și activarea macrofagelor, crește interacțiunea neutrofilelor cu peretele vascular și controlează expresia enzimelor implicate în degradarea matriceală cu rol în remodelarea vasculară (Sandoo și colab, 2010).

S-a constatat că blocarea ambilor receptori duce la un efect de vasodilatație mai amplu, astfel că cei prezenți în celulele musculare ETB exercită un efect aditiv asupra endoteliului lezat. Nivelele crescute de ET-1 s-au înregistrat în hipertensiunea arterială, dislipidemie, ateroscleroză și alte patologii asociate, iar studiile realizate pe hamsteri cu ateroscleroză indusă au aratat că prin inhibarea receptorilor, în special ETA, se poate reduce leziunea din peretele vascular (Kowala și colab, 1995).

Factorul de hiperpolarizare derivat de la endoteliu (EDHF) este o substanță vasodilatatoare care produce hiperpolarizare la nivelul celulei musculare netede, fiind eliberat de către celulele endoteliale activate de factori vasodilalatori precum bradichinina (BK), acetilcolina (Ach). S-a observat ca acest proces este independent de eliberarea NO și PGI2, deoarece în momentul când ele sunt inhibate hiperpolarizarea încă se produce. EDHF este considerat al treilea factor de hiperpolarizare derivat de la endoteliu. Mecanismul prin care se produce hiperpolarizarea are la bază activarea receptorilor de pe suprafața endoteliului care reduc influxul de Ca+2 prin închiderea canalelor voltaj-dependente și în același timp se produce un eflux de K+ prin canalele de potasiu. Ca urmare, se modifică potențialul de membrană, se reduce cantitatea de Ca2+ eliberată astfel că celula se relaxează (Figura 3A). Comunicarea dintre cele două celule (celula endotelială și celula musculară netedă), ce implică EDHF are loc prin cuplarea electrică directă prin intermediul joncțiunilor mioepiteliale. Caracterizarea funcțională a EDHF depinde de regiunea vasculară unde a fost secretat prin implicarea mai multor molecule precum EET care sunt produse prin metabolizarea acidului arahidonic, peptidul natriuretic de tip C, care determină eliberare de K+ cu relaxarea musculaturii (Gao și colab, 2011).

Oxidul nitric (NO) este un factor vasodilatator dependent și produs de endoteliu cu proprietăți vasoprotective, care exercită efect opus celui produs de către Ang II sau endotelină. În anul 1980, Furchgott și Zawadzki au descris pentru prima data această moleculă ca având rol în menținerea tonusului vascular bazal al celulelor prin vasorelaxare, dar și prin faptul că inhibă aderarea și agregarea plachetară, infiltrarea leucocitelor și proliferarea celulelor musculare nedete. De asemenea, NO previne modificările oxidative ale lipoproteinelor de densitate joasă (LDL colesterol) care reprezintă mecanismul major în procesul aterosclerotic. LDL-ul oxidat induce sinteza de caveolină-1 care reduce formarea de NO prin inactivarea enzimei eNOS. S-a demonstrat ca, NO inhibă expresia moleculelor de adeziune celulară VCAM-1 si ICAM-1, modulează răspunsul inflamator prin inhibarea factorului de transcripție NK-kB și controlează formarea cheaguluide sânge. Stresul oxidativ prin eliberarea radicalilor liberi precum anionul superoxid joacă un rol important și perturbă activitatea NO. Superoxid dismutaza (SOD) este o enzimă care asigură biodisponibilitatea NO. Acest lucru se realizează prin legarea enzimei la superoxidul format în urma stresului oxidativ și înlăturerea lui din celulă, menținând un nivel optim de NO (Davington și Ganz, 2004).

Celulele endoteliale produc NO din aminoacidul precursor L-arginină pe cale enzimatică cu L-citrulină ca produs secundar sub acțiunea unei enzime denumită sintetaza oxidului nitric, izoforma eNOS, localizată la nivelul unor invaginări ale membranei – microdomenii membranare denumite caveole. Există trei izoforme ale acestei enzime, dar eNOS este responsabilă de producerea oxidului nitric la nivelul vasculaturii. Caveolina-1 este o proteină care tapetează caveolele fiind legată de calmodulină inactivând activitatea eNOS. Pentru activare este necesară o creștere a nivelului intracelular de Ca+2 eliberat din reticulul endoplasmic până la epuizarea depozitelor, după care se transmite un mesaj receptorilor membranari pentru a deschide canalele de Ca2+ pentru un influx suplimentar din spațiul extracelular. Acest lucru determină într-o primă etapă legarea acestuia de calmodulină prin detașarea de caveolina-1 și apoi prin modificări structurale induce sinteza de NO (Desjardins și Balligand, 2006).

În producerea de NO intervin și substanțe agoniste precum bradichinina, acetilcolina sau modificări în fluxul sanguin și cofactori precum NADPH. Odată generat, NO difuzează rapid prin membrana celulei endoteliale în țesutul muscular adiacent activând guanilat-ciclaza (GC) responsabilă de conversia lui GTP în cGMP (Figura 3A). Acest complex determină defosforilarea lanțului ușor al miozinei cu producerea vasorelaxării. În cazul în care nivelul de calciu scade, sunt activate alte mecanisme care mențin producția de NO stabilă precum fosforilarea eNOS de către serin-treonin protein kinazele A, B sau de cGMP. Stresul de forfecare produs de creșterea fluxul sanguin asigură sinteza continuă de NO prin inițierea fosforilării eNOS, dar acționează și asupra canalelor speciale de Ca2+ activate de K+ de pe suprafața celulei care determină o eliberare de potasiu concomitent cu un influx de Ca2+. Acest fenomen durează doar pe perioada în care endoteliul este supus acestui stres. S-a observat că cGMP intervine în reducerea eliberării Ca2+ de la nivelul reticului sarcoplasmic care ajută la restabilirea depozitelor de calciu cu reducerea contracției în celula musculară netedă (Gimbrone și Guillermo, 2016). Distibuția asimetrică a dimetilargininei (ADMA), care este o proteină ce conține resturi de arginină metilată, prezintă un efect antagonist asupra endoteliului, inhibând sinteza de NO. Nivelele crescute de ADMA au fost asociate cu disfuncția endotelială la pacienții cu boli cardiovasculare, în special cu ateroscleroză. NO interacționează si cu eritrocitele facilitând transportul oxigenului la țesuturi. Biodisponibilitatea NO este redusă de următorii factori: expresia redusă a enzimei eNOS sau a cofactorilor implicați, stresul oxidativ care degradează NO si creșterea expresiei enzimei de conversie a angiotensinei (ACE) (Favero și colab, 2014).

ATEROSCLEROZA

2.1. Ateroscleroza: definiție

Ateroscleroza este o boală inflamatorie cronică, fibroproliferativă ale arterelor mari și medii, fiind considerată principala cauza a bolilor cardiovasculare, cu o rată de mortalitate foarte ridicată în țările dezvolate. Este o boală vasculară progresivă, complexă, cu o componentă autoimună, care nu este doar o consecință degenerativă, inevitabilă îmbătrânirii, ci mai degrabă o condiție inflamatorie, care poate fi transformată într-un eveniment clinic acut, prin ruptura plăcii de aterom, formarea cheagului și prin instalarea trombozei. Se caracterizează prin acumularea de lipide, în special cristale de colesterol în intima vasculară, infiltrarea macrofagelor, proliferarea celulelor musculare netede, acumularea componentelor țesutului conjunctiv care prin acțiunea fibroblastelor și prin calcifiere determină rigidizarea arterelor, obturarea fluxului sanguin și formarea trombusului. Cu toate că factorii de risc predispun la inițierea și dezvoltarea aterosclerozei, din cauza diferențelor în dinamica fluxului sanguin, există regiuni ale sistemului vascular care sunt afectate în mod preferențial pentru formarea leziunilor. În stadiile inițiale ale bolii, dezvoltarea leziunilor are loc pe partea abluminală a vasului după care este afectat și lumenul (Singh și colab, 2002).

Striurile de grăsime sau plăcile ateromatoase nu sunt semnificative din punct de vedere clinic, dar sunt considerate precursorii leziunilor avansate, caracterizate prin acumularea de resturi celulare ale miezului necrotic, bogate în lipide și SMC-uri. Astfel de leziuni pot fi întălnite la nivelul aortei în prima decadă a vieții, în arterele coronare din a doua decadă și în arterele cerebrale în a treia sau a patra decadă (Lusis, 2000).

2.2. Factori de risc

Ateroscleroza este o boală cu etiologie multifactorială care implică interacțiunea dintre factorii cu componentă genetică și cei de mediu dar și complexitatea ce rezultă în urma acțiunii lor. Incidența este crescută la barbații de peste 45 de ani, însă, în ultimii ani, s-a observat o creștere și la femei ca urmare a obiceiurilor alimentare nesănătoase, a fumatului și a unui stil de viață stresant. Boala este mai frecventă la rasa albă comparativ cu persoanele de culoare. Cei mai frecvenți și cunoscuți factori de risc sunt: hipercolesterolemia, dislipidemia, hipertensiunea arterială, diabetul, hiperglicemia, fumatul, vâsta înaintată, obezitatea, stilul de viață sedentar, stresul oxidativ. Disfuncția endotelială și speciile reactive de oxigen sunt considerați cei mai predominanți factori implicați în toate căile care duc la dezvoltarea ateroscerozei, însă au apărut și alti factori responsabili de instalarea patologiei precum hiperhomocisteinemia, infecțiile bacteriene și virale sau bolile autoimune cum este lupusul eritematos sistemic. Expunerea cronică la acești factori de risc depășesc mecanismele de apărare ale endoteliului vascular, compromit integritatea acestuia, declanșând inițierea în cele din urmă a disfuncției vasculare. Este bine cunoscut faptul că disfuncția endotelială reprezintă legătura directă dintre expunerea la factorii de risc și dezvolatrea bolii aterosclerotice. Hiperlipidemia și hiperglicemia sunt corelate cu o creștere oxidativă în țesut, care afectează mecanismele antioxidante și nivelul lipoproteinelor (Sitia și colab, 2010).

Hipercolesterolemia.

Hipercolesterolemia crește producția de radicali liberi în vasele de sânge și scade sinteza și eliberarea substanțelor vasodilatatoare derivate din endoteliu. De asemenea, neutralizează efectul oxidului nitric, după eliberarea sa din celulele endoteliale. Hipercolesterolemia familială este o boală ereditară în care sunt moștenite genele defectoase pentru formarea receptorilor LDL de pe suprafața celulelor. Ficatul nu este capabil să absoarbă LDL în absența acestor receptori iar fără revenirea naturală a colesterolului la nivel hepatic, sinteza de colesterol în celulelor hepatice este activată. În consecință, transferul hepatic al VLDL în plasmă va fi crescut. Unele studii au observat că un nivel crescut de colesterol în timpul sarcinii induce formarea plăcilor de aterom la nivelul fătului. Colesterolul, trigliceridele și lipoproteinele (HDL și LDL) sunt implicate în patogeneza bolilor cardiovasculare, în special în ateroscleroză. Atât concentrațiile reduse de HDL cât și valorile crescute de colesterol LDL, s-au dovedit a fi responsabile pentru inițierea leziunilor aterosclerotice. HDL – lipoproteină de înaltă densitate sintetizată în ficat și în intestinul subțire, este un element cheie în ateroscleroză datorită rolului său în transportul invers al colesterolului. Efectele protectoare ale HDL sunt mediate de receptorii HDL de pe suprafață celulară. Neutralizează activitatea proaterogenică a LDL-ului prin preluarea colesterolului de la nivelul intimei vasculare și eliberarea acestuia în ficat, cu excreția ulterioară în vezica biliară. Poate funcționa ca acceptor, transportor și inactivator al lipidelor oxidate. În alcătuirea sa, intră apolipoproteina A-1 (ApoA) care inhibă fibrinoliza și activează lecitin colesterol acetil transferaza – LCAT, o enzimă care esterifică colesterolul liber din plasmă. Apolipoproteina B (ApoB) este responsabilă de formarea LDL-ului – lipoproteină de joasă densitate și transportă colesterolul în diverse regiuni tisulare. Nivelele crescute ale lipoproteinelor plasmatice LDL și VLDL (chilomicroni) sunt legate de procesul de aterogeneză fiind considerați markeri plasmatici indicatori al aterosclerozei. Esterii colesterolului se găsesc în interiorul ateromului și în matricea extracelulară și pot induce activarea fibroblastelor pentru producerea de colagen (Sitia și colab, 2010).

Hiperlipidemia definește nivele crescute de lipide în circulație, care pot predispune la disfuncție endotelială prin mecanisme precum reglarea NADPH oxidazei, creșterea stresului oxidativ cu eliberare de O2- , nivele crescute de ADMA și oxidarea LDL-ului (Hadi și colab, 2005).

Hipertensiunea arterială.

Hipertensiunea arterială este un factor de risc în bolile cardiovasculare și AVC. Afectează endoteliului prin creșterea presiunii hemodinamice, determinând creștea permeabilității peretelui vascular pentru lipoproteine. Concentrația crescută de angiotensină II stimulează creșterea SMC, crește inflamația și în cele din urmă accelerează oxidarea LDL. În cazul pacienților care suferă de hipertensiune, s-a observat defecte în mecanismul de producerea a oxidului nitric care ar putea să determine rezistență vasculară crescută în condiții normale sau ca răspunsul vaselor de sânge la substanțe vasodilatatoare să fie afectat (Hadi și colab, 2005).

Disfuncția endotelială

Mecanismele de bază implicate în procesul de aterogeneză indică faptul că modificările ce au loc asupra funcțiilor fiziologice endoteliale, cunoscute sub denumirea de disfuncție endotelială (DE) reprezintă o etapă timpurie dar absolut necesară în devolatrea aterosclerozei. DE reprezintă răspunsul la factorii de risc cardiovascular, fiind implicată în inițierea bolii dar și în progresia plăcii ateromatose și în apariția complicațiilor aterosclerotice. Are rol în formarea leziunilor prin promovarea mecanismeor precoce și tardive ale ateroclerozei precum creșterea expresiei moleculelor de adeziune, a permeabilității celulare, a sintezei de chemokine și citokine proinflamtorii, aderența leucocitelor, activarea plachetelor sanguine, proliferarea și migrarea celulelor musculare netede vasculare și a ratei de oxidare a lipidelor LDL. Disfuncția endotelială se caracterizează printr-un dezechilibru între scăderea sintezei și reducerea biodisponibilității substanțelor vasoactive derivate din endoteliu cu efect dilatator, în special a oxidului nitric și a creșterii vasoreactivității prin factorii vasoconstrictori precum Ang II și ET-1. Acest dezechilibru are ca rezultat activarea endotelială care este caracterizată printr-o stare proinflamatorie, procoagulantă și proliferativă care favorizează toate etapele aterogenezei (Matsuzawa și Lerman, 2014).

Sistemul renină-angiotensină-aldosteron

Sistemul renină-angiotensină-aldosteron (SRAA) prezintă un rol sistemic în reglarea presiunii și a volumului sanguin și în menținerea homeostaziei sodiului (Na+) și potasiului (K+). De asemenea, activitatea sa crescută, este un factor major pentru numeroase stări patologice datorită faptului că Ang II crește aldosteronul și tensiunea arterială contribuind atfel la dezvolatarea leziunilor la nivelul organelor precum: rinichi, inimă, vase de sânge.

Renina este o enzimă proteolitică sintetizată inițial în formă inactivă –prorenină de către aparatul juxtaglomerular din rinichi în momentul în care presiunea și volumul sanguin scad, cu eliberarea ei în sânge. În circulație, mecanismele proteolitice clivează prorenina în renină activă. Celulele juxtaglomerulare sunt baroreceptori intrarenali care detectează schimbări de presiune sanguină iar celulele maculei densa sunt chemoreceptori care detectează schimbări de presiune osmotică și care împreună formează aparatul juxtaglomerular. Angiotensinogenul este secretat de ficat și este singurul substrat pentru renină care prin clivare determină formarea angiotensinei I. Ang I este transformată rapid în angiotensină II de către enzina de conversie a angiotensinei. ACE este o dicarboxipeptidază, expresia ei fiind crescută pe suprafața celulelor endoteliale de la nivelul plămânului și de la nivelul rinichilor (tubul proximal). Are rol în reglarea hemostaziei fluidelor și electroliților, degradează bradikinina în fragmente inactive, reducând nivelul seric al substanțelor cu acțiune vasodilatatoare (Sparks și colab, 2014). Acțiunea angiotensinei II este mediată de receptorii de suprafață ai celulelor care aparțin familiei de receptori transmembranari, fiind împărțiți în două clase majore: AT1 și AT2. AT1 este exprimat în toate țesuturile vasculare iar prin cuplarea la Ang II determină vasoconstricție puternică. Stimularea lor în celulele musculare netede inițiază o cascadă de semnalizare care determină creșterea Ca2+ intracelular și modificarea citoscheletului. AT2 stimulează bradikinina, NO și cGMP având rol protectiv promovând scăderea natriurezei și a tensiunii arteriale. Ang II acționează și asupra glandei corticosuprarenale determinând eliberarea de aldosteron, care induce retenția de NaCl și apă, cu creșterea volumului sanguin (Figura 4) (Yim și Yoo, 2008).

Efectele aterogene ale angiotensinei II

Angiotensina II joacă un rol esențial în inițierea procesului inflamator la nivelul vasului de sânge dar are rol și în remodelarea vasculară. Inflamația duce la disfuncția endoteliului care oferă un mediu proinflamator, facilitând recrutarea și migrarea celulelor inflamatorii în spațiul subendotelial, stimulează proliferarea celulelor musculare netede, procese care promovează dezvoltarea bolilor cardiovasculare și a leziunilor tisulare. Este bine cunoscută legătura dintre hipertensiunea arterială și ateroscleroză, care este mediată prin efectul vasoconstrictor al angiotensinei II. Ang II are răspuns proinflamator la nivelul arterelor, reglând expresia citokinelor și chemokinelor. În celulele musulare netede induce activarea transcripțională a lui NF-κB și expresia lui IL-6, MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), TNFα în monocite și determină creșterea expresiei VCAM-1 și ICAM-1. Induce leziuni la nivelul celulelor endoteliale datorită faptului că inhibă regenerarea vasculară și are acțiune activă asupra caii de semnalizare intracelulară MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) care mediază proliferarea și apoptoza celulară și prin urmare disfuncția vasculară (Figura 8B). Ang II este un prooxidant puternic deoarece induce producerea de anioni superoxid și activează semnalizarea prooxidantă NADH / NADPH. Stresul oxidativ mediat de angiotensina II reduce nivelul de oxid nitric și activează genele sensibile redox în special citokine, molecule de adeziune și metaloproteinaze matriceale (Figura 5). De asemenea, determină ruperea plăcilor de aterom și instalarea trombozei iar remodelarea vasculară este mediată prin expresia factorilor de creștere ai fibroblaștilor – bFBS (Basic Fibroblast Growth Factor), al factorului de creștere transformant – TGF-β1 (Transforming Growth Factor-β1) și al factorului de creștere insulinic- IGF (Insulin Growth Factor). Remodelarea se datorează creșterii migrației celulelor vasculare și a modificării compoziției matricei extracelulare. Mai mult, modificările în structura și funcția vaselor de sânge – prezența unui lumen și a unui diametru extern semnificativ redus, scăderea nivelului de substanțe vasodilatatoare s-au putut observa mai întâi la nivelul arteriolelor de rezintență și apoi la nivelul arterelor mari precum artera carotidă sau aortă toracică, la pacienții cu hipertensiune arterială (Pacurari și colab, 2014).

Stresul oxidativ

Stresul oxidativ este mecanismul celular care stă la baza disfunției endoteliale și a aterogenezei, fiind asociat cu toți factorii de risc cardiovasculari. Speciile reactive de oxigen (ROS) constituie un grup mic de molecule reactive care joacă un rol important în reglarea numeroaselor procese biologice precum: răspunsul inflamator, apoptoză, creștere celulară, tonus vascular afectat, oxidarea moleculelor de LDL colesterol. Sursele de ROS sunt: NADPH oxidaza – (NOX2) cel mai important sistem care generează ROS în sistemul cardiovascular, xantin oxidaza- este prezent în plasmă și la nivelule celulelor endoteliale generând anioni superoxid (O2-) și peroxid de hidrogen (H2O2), ion hidroxil (HO-), COX și mitocondria care este implicată în fosforilarea oxidativă și care în condiții patologice poate reprezenta o sursă de specii reactive de oxigen. Ele induc efecte nocive precum proliferarea crescută a celulelor musculare netede, care duc la îngroșarea peretelui vascular, apoptoza celulelor endoteliale, creșterea expresia metaloproteinazelor matriceale, toate acestea fiind implicate în formarea plăcii aterosclerotice (Kattoor și colab, 2017). Determină o rată crescută de producție a substanțelor oxidante și un nivel scăzut în activitatea antioxidantă a SOD, vitaminei C și E. Enzima SOD reglează nivelul de O2- eliberat, însă o sinteză crescută, depășește mecanismul de apărare, lăsând o interacție liberă cu alte molecule, în special cu NO pentru care are afinitate ridicată. O2- este implicat direct în disfuncția vasculară prin producerea peroxinitritului (ONOO-). Sunt specii de azot reactive, foarte dăunătoare pentru celule având efecte asupra ADN-ului, lipidelor și proteinelor. Are acțiune citotoxică asupra eNOS, alterându-i funcția (Figura 6) (Strijdom și colab, 2012).

Markeri inflamatori implicați în disfuncția endotelială

Factorul de necroză tumorală – TNF (Tumor Necrosis Factor alpha) este o citokină proinflamatorie care reglează expresia multor gene implicate în inflamație, stres oxidativ și în căi de semnalizare antiapoptotice. Semnalizarea aberantă a lui TNF duce la dezvoltarea bolilor cardiovasculare, afectând vasorelaxarea mediată de oxidul nitric prin producția de radicali superoxid în arterele coronare sau în artera carotidă. S-a obersevat ca pacienții care au prezentat un nivel ridicat de TNF au un risc crescut de a dezvolta ateroscleroză asociată cu un proces inflamator cronic și cu inducerea hiperplaziei intimei vasculare. În celulele endoteliale, TNF induce expresia interleukinei-6 (IL-6), a proteinei chemoatractante de monocite-1 (MCP-1) și a moleculelor de adeziune celulară. Inflamația mediată de TNF joacă un rol important în remodelarea vasculară. Celulele musculare netede din structura arterelor răspund la TNF cu o proliferare celulară crescută, în timp ce inhibarea TNF circulant împiedică remodelarea mediei după lezare.

NF-κB este un factor proinflamator în aval de TNF, care joacă un rol esențial în reglarea expresiei mediatorilor inflamatori vasculari: interleukina-1 beta (IL-1β), interleukina-6 (IL-6), TNF și MCP-1 în celulele endoteliale. Activarea NF-κB induce proliferarea celulelor musculare netede și mediază hiperplazia intimei după leziunea vasculară (Rai și colab, 2019).

Proteina C reactivă (CRP) este un marker inflamator, reactant de fază acută fiind implicat în patologia bolilor vasculare. Este produs în principal la nivelul ficatului dar și la nivelul celulelor endoteliale și în celulele musculare netede. CRP are efecte proinflamatorii și protrombotice, inhibă diferențierea celulelor endoteliale progenitoare și reglează receptorul AT1. Activează cascada de semnalizare pe calea clasică a complementului iar nivelele circulante sunt corelate cu citokine inflamatorii, molecule de adeziune celulară, markeri de activarea plachetară și aderare limfocitară. Promovează direct procesele aterosclerotice și inflamația în celulele endoteliale prin reglarea negativă a sintezei de eNOS care reduce cantitatea de NO eliberat. De asemenea, inhibă angiogeneza și induce apoptoza.

Interleukina-6 (IL-6) este o citokină pleiotropă care reglează multe funcții, inclusiv proliferarea și apoptoza celulară. IL-6 joacă un rol important în inflamație și modulează dezvoltarea mai multor afecțiuni cardiovasculare, mai ales în hipertensiune și ateroscleroză. Niveluri ridicate de IL-6 au fost observate în circulație la pacienții hipertensivi. IL-6 modulează, de asemenea, reactivitatea vasculară determinând o contractilitate crescută a vaselor de sânge, mediază dezvoltarea bolii ocluzive vasculare și este un predictor al morții subite cardiovasculare. Efectele IL-6 asupra sistemului vascular sunt mediate prin semnalizarea NF-κB, care joacă un rol cheie în remodelarea vasculară. Inhibarea NF-κB prin blocarea IκBNS, o proteină nucleară de reglare IκB a NF-κB, reduce hiperplazia la nivelul intimei după vătămarea peretelui vascular prin producția IL-6 mediată de NF-κB.

După lezarea endoteliului, se generează o cascadă de semnalizare intracelulară care determină expresia crescută a moleculelor de adeziune celulară precum ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1) sau a celor de adeziune vasculară VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1). VCAM-1 este o proteină exprimată pe suprafața celulelor endoteliale activate, fiind considerată o manifestare timpurie a ateroclerozei indusă de colesterol dar și de formarea plăcilor de aterom. Este considerat marker pentru activarea endotelială (Felmeden și Lip, 2014). Ambele recrutează monocitele (celule inflamatorii) din fluxul sanguin, participând la internalizrea lor în peretele vascular, perpetuând astfel eliberarea de mai multe citokine și chemokine la locul leziunii, culminând cu dezvoltarea bolii vasculare, cum ar fi ateroscleroza. Expresia lor este modulată de Ang II dar și de stresul oxidativ (Pacurari și colab, 2014).

E-selectina este o moleculă de adeziune specifică de pe suprafața endoteliului care leagă leucocitele circulante. Are rol în medierea interacțiunii dintre trombocite, leucocite și celula endotelială. Expresia este redusă în condiții fiziologice și crește în momentul activării endoteliale, nivele ridicate fiind observate la persoanele care suferă de ateroscleroză, hipertensiune arterială și boli ischemice. Acțiunea E-selectinei este independentă de cea a factorului vWF (Felmeden și Lip, 2014).

MECANISM ATEROSCLEROZĂ

Aterogeneza este un proces lent, multistadial care implică evenimente succesive (I-VI) ce conduc la instalarea bolii în etapele inițiale, până la o patologie complexă caracterizată prin ruperea ateromului și tromboză. Toate acestea reprezintă fundamentul BCV.

Activarea endoteliului și inițierea leziunii

Într-o primă etapă are loc activarea celulelor endoteliale drept urmarea a acumulării în spațiul subendotelial, a lipoproteinelor modificate, în special LDL. Acest proces are loc datorită capacității LDL-ului de a adera la componentele matricei extreacelulare (ApoB din structura lor prezintă afinitate crescută pentru proteoglicani). În condiții normale, există un echilibru între concentrația LDL-ului plasmatic și a celui intracelular din peretele vasului. Când această concentrație crește, lipidele se acumulează în intima vasculară (locul preferat pentru formarea leziunii), ajungând la acest nivel prin transcitoză dependentă de receptorii pentru LDL de la nivelul caveolelor. Transportul moleculelor se datorează unei permeabilității crescute a endoteliului, care iși pierde integritatea prin lezarea glicocalixului și prin slăbirea interacțiunilor dintre joncțiunile ocluzive. La acest nivel are loc oxidarea LDL-ului în oxLDL datorită expunerii la substanțe oxidante având acțiune proinflamatorie. Oxidarea lipoproteinelor LDL la oxLDL indică primul pas al instalării aterosclerozei (Figura 7) (Rafieian-Kopaei și colab, 2014).

Disfuncția celulelor endoteliale și formarea celulelor spumoase

După activarea celulelor endoteliale, acestea exprimă molecule de adeziune celulară VCAM-1, ICAM-1, MCP-1, M-CSF (macrophage colony-stimulating factor), E-selectine, P-selectine pentru recrutarea celulelor imune: monocitele circulante care prin diapedeză ajung în spațiul subendotelial și se diferențiază în macrofage. Prin intermediul speciilor reactive de oxigen are loc și mai tare modificarea oxLDL pentru a fi recunoscute de către macrofage (Figura 7). Acestea prezintă pe suprafața lor receptori scavanger de tipul SR-A și CD36 prin intermediul cărora înglobează lipidele oxidate, luând naștere celulele spumoase. Moleculele de adeziune eliberează factori chemoatractanți care stimulează răspunsul imun adaptativ prin activarea limfocitelor T și a limfocitelor B pentru producerea de anticorpi. În această etapă se formează și striurile lipidice datorită formării celulelor spumoase “foam cells” (Singh și colab, 2002). Macrofagele sunt componente ale imunității înnăscute, implicate în fagocitoza și eliminarea debriurilor celulare, a corpilor străini sau a moleculelor alterate. Se disting două fenotipuri majore: M1 care secretă factori proinflamatori și M2 care secretă factori anti-inflamatori. Limfocitele T se diferențiază spre două direcții: Th1 care stimulează tranformarea spre tipul M1 al macrofagelor care eliberează citokine pentru recrutarea de limfocite în situsurile inflamate promovând lezarea țesutului susținând procesul inflamator sau Th2 care stimulează transformarea spre tipul M2 al macrofagelor care eliberează citokine antiinflamatorii și induce regenerarea țesutului (Orekhov și colab, 2019).

Procesul inflamator

Inflamația are un rol esențial în patogeneza aterosclerozei. Boala este însoțită de fibroza excesivă a intimei, formarea plăcilor ateromatose, proliferarea celulelor musculare netede și migrarea celulelor sistemului imunitar precum monocitele, limfocite T iar împreună cu trombocitele sunt eliberate ca răspuns la inflamație. OxLDL este considerat un stimul proinflamator care susține procesul inflamator cronic. În condiții patologice speciale, cum ar fi hipercolesterolemia severă, concentrația de peroxinitrit produs de stresul oxidativ crește iar leziunile vasculare și inițierea patologiei sunt intensificate. (Rafieian-Kopaei și colab, 2014). În condiții fiziologice, endoteliul vascular reglează procesul inflamator, inclusiv expresia moleculelor de adeziune prin eliberarea NO, astfel că o stare inflamatorie susținută duce la disfuncția endotelială. Există o relație strânsă între stresul oxidativ și inflamație deoarece eliberarea radicalilor liberi amplifică căile de semnalizare care induc procesul inflamator și acesta la rândul lui, eliberează tot mai mult O2-. Este de multe ori asociată cu supraexpresia citokinelor proinflamatorii cum ar fi TNFα, IL-1 care acționează pe celulele endoteliale sau pe macrofage, determinându-le să exprime molecule de adeziune, rezultând starea de activare endotelială. Stimulii persisteți ai răspunsului inflamator cronic activează macrofagele și limfocitele, determinând eliberarea factorilor de creștere și a citokinelor care intesifică sinteza de colagen cu instalarea ulterioară a fibrozei (Strijom și colab, 2012) (Libby, 2012).

Oxidarea lipidelor

În spațiul subendotelial, absorbția oxLDL de către macrofagele derivate din monocite reduce migrația lor și duce la formarea celulelor spumoase, reprezentând semnul distinctiv al leziunii aterosclerotice. LDL este format în stadiile inițiale ale aterosclerozei, pe când oxidarea și transformarea lui în oxLDL are loc mai târziu în etapele următoare. oxLDL induce o stare de vasoconstricție prin reducerea formării de substanțe vasoactive derivate de la endoteliu: NO, PGI2 și îmbunătățind sinteaza de ET-1. De asemenea facilitează tromboza, aderarea plachetară, activarea protein kinazelor și a factorului NF-kB. OxLDL are efect chemoatractant pentru monocite și pentru celulele T. Mai mult, monocitele sau macrofagele prezintă epitopi antigenici pentru oxLDL, care sunt histocompatibile cu limfocitele B, inducând formarea de anticorpi pentru oxLDL și determinând o reacție imună față de oxLDL acumulat. Celulele endoteliale mediază absorbția oxLDL printr-un receptor comun cu cel care determină fagocitoza celulelor îmbătrănite și apoptotice. Expresia receptorului pentru oxLDL în celulele endoteliale este indusă de TNF-α, ET-1, stresul mecanic, TGF-β și angiotensina II, care accelerează formarea celulelor spumose (Singh și colab, 2002).

Formarea plăcii fibro-lipidice

Citokinele și factorii de creștere secretați de către macrofage și limfocite T au rol în proliferarea celulelor musculare netede din media către intima. Ajunse la acest nivel, își schimbă profilul contractil către unul secretor, contribuind la formarea capului fibros. Secretă cantități mari de colagen și componente matriceale. La nivelul plăcii fibro-lipidice se găsesc și mastocite, celule dendritice, neutrofile care eliberează specii reactive de oxigen. CD40 este exprimat pe suprafața macrofagelor, SMC, EC, iar prin cuplarea sa cu CD40 ligand, contribuie la dezvoltarea leziunilor avansate prin producerea de citokine, proteaze matriceale și molecule de adeziune (Figura 7) (Lusis, 2000).

Formarea miezului necrotic și instalarea trombozei

O parte din celulele spumoase suferă apoptoză eliberându-și conținutul bogat în lipide și debriuri celulare. Macrofagele pot elibera și substanțe citotoxice cum ar fi TNFα, factori tisulari de coagulare și radicali liberi. Acțiunea lor lezează și mai tare endoteliul, determină acumularea excesivă de oxLDL, ceea ce duce în final la schimbări metabolice. Se formează cristale de colesterol, miezul devine necrotic, pericitele-like secretă un scaffold matriceal care suferă un proces de calcifiere activ la nivelul ateromului, iar de la nivelul adventicei se formează neovascularizația care agravează și mai mult leziunea. Toate aceste procese duc la formarea plăcii instabile. Prin secreția de proteaze are loc ruperea capului fibros care duce la tromboză iar cheagul de sânge format poate provoca infarct sau AVC (Figura 7) (Azis și Yadav, 2016).

Calea de semnalizare AngII; TGF-β1/Smad2/3; TAK1

TGF-β1 (transforming growth factor-beta 1) este o citokină multifuncțională care reglează o varietate de funcții celulare precum: proliferarea și migrarea SMC-urilor, sinteza matricei extracelulare, apoptoza, vindecarea leziunilor, calcifierea și modularea răspunsului imun, toate fiind etape majore ale procesului aterosclerotic. Proliferarea și migrarea excesivă a celulelor musculare netede și sinteza matricei extracelulare sunt evenimente cheie prezente în momentul lezării peretelui vascular. Este răspunsul patologic la expunerea cronică la factorii care determină îngustarea lumenului vascular și rigidizarea vasului. TGF-β1 favorizează recrutarea și infiltrarea celulelor inflamatorii, activând transformarea procolagenezei în colagenază, indicând rolul său în degradarea matricei extracelulare și instabilitatea plăcii. TGFβ-1, receptorii și proteinele implicate în calea de semnalizare sunt importante în menținerea homeostaziei vasculare. Orice perturbare a semnalizării conduce la instalarea BCV asociată cu inducerea fibrozei, remodelării și schimbării fenotipului celulelor vasculare (Low și colab, 2019). Semnalizarea TGF-β1 în macrofage, în celulele musculare netede vasculare și în limfocitele T este considerată ca având efect ateroprotector, întrucât s-a constatat că este asociată cu o scădere a inflamației și a formarea plăcii aterosclerotice. În schimb, TGF-β1 în endoteliul vaselor mari promovează apoptoza și crește permeabilitatea prin calea MAPK – p38. Mai mult decât atât, TGF-β induce expresia receptorului pentru oxLDL la nivelul celulelor endoteliale- OLR1, PAI-1 și MCP-1, toate având efecte proaterogenice. (Boon și colab, 2006).

În primele etape ale remodelării vasculare, TGF-β este eliberat din plachete și activat din depozitele matriceale, stimulează chemotaxia celulelor care intervin în repararea leziunilor, modulează răspunsul imun și inflamația și induce producerea de elemente matriceale. În etapele ulterioare, oprește instalarea fibrozei prin declanșarea apoptozei și prin efectul său antiproliferativ. În cazul leziunilor avansate, TGF-β este implicat în procesul de calcifiere care produce rigidizarea arterelor, având un nivel plasmatic foarte crescut. În urma studiilor de imunolocalizare a leziunilor aterosclerotice, s-a observat rolul lui TGF-β în procesul de patogeneză prin prezența nivelurilor ridicate de TGF-β1 și TGF-β3 la nivelul SMC-urilor și a celulelor spumoase din striurile de grăsime, fiind pozitive și pentru pSmad2 indicând activarea căii de semnalizare. Este implicat în mai multe căi de semanlizare intracelulare precum: calea canonică SMAD dependentă, calea MAPK kinazică, calea Rho, iar orice dereglare poate afecta regenerarea tisulară (Toma și McCaffrey, 2012). TGF-β1 face parte din superfamilia de citokine, fiind una din cele trei izoforme localizată la nivelul intimei vasculare. Multifuncționalitatea acestei proteine, este atribuită interacțiunii dintre receptorii de tip I și tip II care activează căile de semnalizare și propagă semnalul.

Receptorii căii de semnalizare TGF-β1

Acțiunile lui TGF-β1 sunt mediate prin interacțiunile dintre receptorii transmembranari serin/treonin kinazici de tip I (TβRI) și a celor de tip II (TβRII), activând căile de semnalizare intracelulară. În absența unui ligand, aceștia se găsesc în formă homodimerică la suprafața membranei celulare, iar în momentul cuplării cu un ligand, TGF-β1 se leagă la TβRII iar TβRI la rândul său, se leagă de TβRII cu formarea complexelor heterotetramerice. TβRII are activitate kinazică, iar în momentul cuplării cu ligangul suferă un proces de fosforilare a resturilor de serină/treonină ale domeniului GS citoplasmatic care activează TβRI (Figura 8). Acest fenomen este urmat de activarea mai multor molecule de semnalizare intracelulară care intervin în medierea diferitelor funcții biologice ale lui TGF-β1 (Kim și Choi, 2012).

Calea de semnalizare TGF-β1/ Smad 2/3

Proteinele Smad sunt mediatorii intracelulari ai căii de semnalizare canonică ce implică activarea lui TGF-β1. După legarea ligandului și fosforilarea domeniului GS a receptorului TβRI, are loc recrutarea și activarea receptorilor pentru Smad denumiți R-Smads (receptor-regulated Smads), iar complexul nou format este mediat de către proteine auxiliare precum SARA (Smad anchor for receptor activation). După fosforilare, Smad 2/3 disociază rapid de receptor și interacționează cu proteina Smad 4 cu rol de co-factor, ceea ce duce la translocarea noului complex la nivelul nucleului și la inițierea activității transcripționale. Smad 6 și Smad 7 sunt sunt proteine inhibitorii denumite și (I-Smads) care blochează semnalizarea Smad -TGF-β1 împiedicând legarea lor la receptori sau între ele (Figura 8) (Low și colab, 2019).

Calea de semnalizare TGF-β1/ TAK1

TGF-β1 este implicat și în căi de semnalizare necanonice, Smad independente precum: calea Rho GTP-ază, calea PI3K (fosfatidilinozitol-3-kinază), calea ERK, calea JNK și calea p38 MAPK. S-a demonstrat că activează kinaza I (TAK1) care este o moleculă principală situată în amonte, implicată în calea de semnalizare care induce sinteza de colagen tip I, tip IV și fibronectină prin activarea cascadelor de semnalizare MAPK kinazice (MKK3-p38) și respectiv MKK4-JNK. TAK1 este un membru al familiei MAP3K fiind o serin/treonin kinază activată prin cuplarea ligandului la TGF-β1 sau de diverși stimuli cum ar fi factorii de stres externi, citokinele proinflamatorii, TNF, interleukina 1 sau lipopolizaharide. După activare el transduce semnale în mai multe cascade de semnalizare: MKK4-JNK care activează factorul de transcripție c-Jun, MKK3 -p38 care activează factorul de transcripție ATF2 (Activating Transcription Factor 2), 1 AP-1 (Activator Protein 1) și NF-kB (Figura 8). Pentru activare este necesară stabilirea unui complex cu o proteină de legare numită TAB1, care în funcție de specificitatea tipului celular ajută la propagarea semnalului în aval deoarece induce autofosforilarea lui TAK1. În comparație cu calea Smad 2/3 care necesită fosforilarea și activitatea kinazică a receptorului TβRI, care este apoi eliberat din complexul format pentru a interacționa cu co-factorul Smad4 pentru a transmite semnalele, activarea lui TAK1 este independentă de activitatea kinazică a receptorului. În absența stimulării lui TGF-β1, TAK1 se asociază cu receptorul de tip I (TβRI) prin formarea complexelor cu TAB2 și TRAF6 (Choi și colab, 2012).

CONTRIBUȚII ORIGINALE

Bolile cardiovasculare (BCV) reprezintă principala cauză de mortalitate la nivel mondial, în special în tările slab dezvolate. Majoritatea afecțiunilor care intră sub termenul de BCV sunt atribuite aterosclerozei. Este caracterizată ca fiind o boală inflamatorie cronică, datorită acumulării de lipide la nivelul peretelui vascular determinând disfuncție endotelială, împreună cu o activare intensă a sistemului imun, ca răspuns la hiperlipidemie .

MATERIALE ȘI METODE

În cadrul acestui studiu, scopul principal a fost analiza disfuncției vasculare în contextul bolii aterosclerotice. Astfel, s-a realizat un model experimental animal – hamsterul sirian (Golden Syrian). Se cunoaște faptul că acest rozător este utilizat ca model experimental de ateroscleroză indusă încă de la începutul anilor 1980, deoarece prezintă o serie de avantaje: o rată scăzută de sinteză a colesterolului endogen, secreția de apolipoproteină B-100 de către ficat și o asimilație completă de LDL-colesterol via receptorului implicat în calea de semnalizare. De asemenea, morfologia celulelor spumoase formate sau a leziunilor de la nivelul aortei toracice au fost foarte similare cu cele prezente la om (Dillard și colab, 2010).

Generarea lotului animal experimental cu boală aterosclerotică indusă

Pentru generarea lotului experimental “in vivo” care să reproducă cât mai fidel modificările fiziopatologice de la om, animalele au fost împărțite în două grupe: un grup control – (C) și un grup hiperlipidemic-hipertensiv – (HH). Grupul C a cuprins 5 animale (n=5) sănătoase care în decursul experimetului au primit o dietă standard; grupul HH a cuprins 7 animale (n=7) care în decursul experimentului au primit o hrană îmbogățită. Dieta este una combinată, fiind suplimentată cu 3% colesterol și 15% unt pentru a induce hiperlipidemia și gavaj zilnic cu 8% NaCl pentru a induce hipertensiunea arterială (Figura 9).

Figura 9. Realizarea modelului animal experimental cu boală aterosclerotică.

La începutul studiului s-au ales animalele care vor participa în experiment, fiind selectați doar hamsterii masculi, cu vârsta cuprinsă între 3-4 luni. Se cunoaște faptul că pentru mai bune rezultate, animalele trebuie să îndeplinească acest criteriu de sex și vârstă. Animalele au fost distribuite în cuști separate, li s-au atribuit un număr (la nivelul urechii) și au fost ținute la post cu 24h înainte de prelevarea de sânge din plexul retroorbital. Acest procedeu a fost repetat în fiecare lună, timp de 4 luni (16 săptămâni), pentru a monitoriza valorile parametrilor biochimici din plasmă. Recoltarea de sânge a fost făcută sub anestezic (IzofluranVet) cu cântărirea în prealabil al animalelor. În acest fel, s-a urmărit fluctuația greutății pe perioada experimentului dar și valorile plasmatice care confirmă instalarea patologiei. Sângele a fost recoltat pe anticoagulant, în vacutainere cu EDTA, centrifugat la (4șC, 10 minute, 2500g) pentru a obține plasma. La sfârșitul celor 4 luni de experiment animalele au fost sacrificate (pentru anesteziere s-a folosit un amestec de 80mg ketamină, 10mg xilazină, 2mg acepromazină/ kg corp și ser fiziologic) în vederea prelevării organelor de interes: aortă toracică, artere carotide și ventricul stâng. Vasele de sânge care au fost prelevate pentru analiza lor la miograf nu au fost spălate în prealabil cu PBS cu Ca2+ pentru a evita lezarea endoteliului.

Valorile parametrilor biochimici din plasmă au fost determinate cu ajutorul kiturilor speciale pentru (glicemie, trigliceride, colesterol total, colesteol LDL, colesterol HDL) de la Dialab, iar valorile au fost citite la spectrofotometru (Tecan Infinite M200 PRO).

Tehnica de imunohistochimie

3.2.1. Pentru investigarea markerilor inflamatorii specifici (COL1A, -SMA, Cx43, VCAM-1, MMP-2, macrofage – CD68+, limfocite T- CD3e+, macrofage tip-1 M1 MHC-II+), care joacă un rol important în cazul disfuncției vasculare, s-a utilizat tehnica de imunohistochimie prin imunofluorescență. Reprezintă o tehnică indirectă de marcare cu fluorocromi, o metodă cantitativă prin care se observă modificările proteinelor de interes. Cu ajutorul acestei metode se poate observa și structura histologică a țesutului.

După prelevarea organelor de interes – aortă toracică și artere carotide, țesutul este imersat în soluție de crioprotecție de PFA 2% în tampon fosfat 0,1M și lăsat la 4șC peste noapte. Probele se spală cu tampon fosfat și sunt supuse unor băi consecutive de glicerol de concentrații diferite (5% -15 minute, 10% – 1h la 4șC, 20% – peste noapte la 4șC, 50% -1h la 4șC). Probele sunt păstrate la congelator (-20șC) până în momentul procesării lor. Pentru realizarea secțiunilor histologice, probele se decongelează (aclimatizarea de la -20șC la 4șC), spălări succesive cu soluție de sucroză 3% în tampon fosfat (6x15minute), imersare 30 minute în OCT. După cele 30 minute, probele sunt scoase din OCT (Optimum Cutting Temperature), scufundate 30-45 secunde (în funcție de duritatea țesutului analizat) în azot lichid (-160șC) și introduse în criotom, unde se vor monta pe suportul de tăiat. După cele 5 minute de aclimatizare cu temperatura din interiorul criotomului, piesa de țesut se va monta pe moldul respectiv și tăierea se va face la o temperatură de -25șC.

În vederea analizei, se vot tăia secțiuni de 5µm grosime, care se montează pe lame de sticlă speciale SUPERFROST sau SUPERFROST PLUS (lame tratate cu Poly-L-Lysine pentru o aderare mai bună a sectiunii pe suport) vor fi incubate 30 minute la 37 șC după care sunt depozitate la 4 șC până în momentul utilizării.

Detecția prin marcare cu fluorocromi presupune utilizarea unui anticorp (Ac) primar monoclonal, nemarcat, care recunoaște antigenul (Ag) tisular corespunzător identificat prin incubarea ulterioră a secțiunilor cu un anticorp secundar policlonal, marcat, obținut prin imunizarea altei specii cu imunoglobulina G (IgG) a speciei care a furnizat anticorpul primar. Anticorpul secundar este biotinilat si se cuplează cu streptavidina/ FITC ( izotiocianat de fluoresceină) datorita afinității foarte mari. Streptavidina este un agent de developare derivat din bacteria Streptoccocus avidini care nu prezintă sarcini electrice și resturi glucidice.

Astfel pentru realizarea preparatelor, au fost urmate următoarele etape esențiale: dezghețare secțiuni la temperatura camerei, fixare cu acetonă/matanol rece (-20 șC) în funcție de localizarea proteinelor de interes (proteine citoplasmatice/membranare), stingere fluorescență cu NaBH4 1 mg/ml – 1h la4 șC, permeabilizare cu 0,2% Triton cu 0.05% Tween 20 30 minute la RT, încercuirea secțiunilor pe lamă cu creion lipidic, blocarea situsurilor nespecifice cu ser de capră 10% (Invitrogen) 10 minute la RT– situsurile care recunosc domeniile Fc sunt acoperite de imunoglobulinele serului normal și nu mai sunt disponibile atașării anticorpului primar, incubare Anticorp primar pentru COL1A (1:250, Santa Cruz Biotechnology), -SMA (1:200, Cell Signaling Technology), Cx43 (1:200, Thermo Fisher Scientific), MMP-2 (1:200, Santa Cruz Biotechnology), VCAM-1 (1:200, Santa Cruz Biotechnology), CD3e+ (1:200, ThermoFisher Scientific), CD68+ (1:200, Santa Cruz Biotechnology), MHC II HLA-DR (1:250, Thermo Fisher Scientific) diluat în soluție de PBS cu 1% BSA peste noapte, spălare, incubare anticorp secundar marcat (Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG (H+L) 1:1000/ Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H+L) 1:500 – fluorescență roșie, Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) 1:500 – fluorescență verde), spălare, adăugare soluție DAPI pentru marcarea nucleilor, spălare, adăugare soluție de montare PROLONG, lăsat să polimerizeze la temperatura camerei iar la final, vizualizare la microscopul de fluorescență Zeiss, obiectiv 20X. Cuantificarea imaginilor s-a realizat cu ajutorul programului ImageJ.

3.2.2. Tot prin microscopia de fluorescență, am analizat nivelul de exprimare ROS citosolic (specii reactive de oxigen) prin adăugarea colorantului DHE (dihidroetidium) – 6µM peste secțiunile de țesut încercuite cu creionul lipidic pentru determinare, timp de 30 minute la temperatura camerei. În prezența superoxidului, DHE este rapid oxidat la bromură de etidiu, care se intercalează cu ADN-ul. Bromura de etidiu este excitată la o lungime de undă de 490nm, imaginile se obțin la microscopul de fluorescență, Zeiss, obiectiv 20X. Cuantificarea imaginilor s-a realizat cu ajutorul programului ImageJ.

3.3. Tehnica miografului

Disfuncția vasculară a fost analizată prin tehnica miografului (aparat care înregistrează contracțiile musculare) pentru a vedea capacitatea de contracție sau de relaxarea a vaselor de sânge. Pentru acest experiment, s-au utilizat stocuri de 1M de Ach (acetilcolină) pentru a induce relaxarea vaselor și de NA (noradrenalină) pentru a induce contracția vaselor. În vederea înregistrării activității fiziologice a fibrelor musculare, vasul de sânge a fost secționat sub microscop la o lungime de 3 mm și diametru 200µm, montat în camera miografului și imersat în tampon HEPES cu Na+ la 37șC. Vasul de sânge este etalat pe un suport numit elastomer și curățat de striurile de grăsime cu ajutorul unei forfecuțe fine. Se recomandă măsurarea pH-ului (7,2-7,4) înainte de utilizarea lui în experiment. A fost determinat și calibrat diametrul optim de funcționare și aplicată procedura standard start pentru a ne asigura că vasul nu este lezat și că raspunde la stimulare la o concentrație de NA de 28µl 3×10-7M. Pe tot parcursul experimentului s-a barbotat O2. Apoi cu ajutorul unei curbe de concentrație crescatoare de NA sau Ach s-a înregistrat în timp real răspunsul vasului de sânge. Curba de concentrații utilizată a fost următoarea: 14µl 10-8 M, 28µl 3×10-8 M, 9µl 10-7 M, 28µl 3×10-7 M, 9µl 10-6 M, 28µl 3×10-6 M, 9µl 10-5 M, 28µl 3×10-5 M, 98µl 10-4 M.

Valorile au fost citite la interval de 2 minute. Toate valorile înregistrate au fost introduse într-un sistem de calcule pentru a vedea procentul de relaxare (%) și tensiunea în fir (mN/mm) dezvoltată datorită contracției.

Tehnica Western Blott

Pentru studiul expresiei proteinelor de interes în cazul disfuncțiilor vasculare s-a utilizat metoda de imunoblotting – WESTERN BLOTT.

Western blott-ul sau electrotransferul este o metodă de analiză utilizată foarte des pentru detectarea unor cantități foarte mici dintr-o anumită proteină, obținută dintr-un lizat celular. Proba este supusă electroforezei în gel de poliacrilamidă (SDS-PAGE) pentru separarea în bandă a constituienților proteici și transferată pe un suport solid (membrană de nitroceluloză/ membrană PVDF) care este pusă în evidență cu anticorpi specifici.

3.4.1. Prepararea lizatului celular.Pentru a obține extractul proteic, peste țesut s-a adăugat tampon RIPA care este un amestec de (PMSF 10µl, cocktail de inhibitori de fosfataze B 10µl, inhibitori de proteaze 10µl la 1 ml RIPA) și biluțe de sticlă cu diametrul de 1 mm. Probele au fost omogenizate cu ajutorul aparatului MINILYS (2 minute, 5000rpm x 5 reprize) în funcție de duritatea țesutului. După procesare, tuburile sunt lăsate la frigider peste noapte, centrifugate a doua zi la 13.600rpm, 5 minute, 4șC, supernatantul transferat în tuburi noi și păstrate la -20șC până la dozarea concentrației proteice.

3.4.2. Determinarea concentrației proteice: Prin metoda Bradford (metoda se bazează pe formarea unui complex între colorantul Brilliant Blue G și proteine care determină o modificare a maximului de absorbție între 456-895nm) sau prin BCA – este o metodă de detecție colorimetrică și se bazează pe reducerea Cu2+ la Cu1+ în mediu alcalin -metoda Biuretului – însă cu o sensibilitate mai ridicată. Produsul de reacție este de culoare violet și se formează prin chelatarea a 2 molecule de BCA cu un ion de Cu. Reacția este citită la o absorbanță de 562nm cu un range de detecție între 20-2000µg/mL). În cazul ambelor metode de determinare se folosește o curbă standard de BSA.

3.4.3. Electroforeza

Electroforeza reprezintă o metodă analitică care are la bază fenomenul migrarii moleculelor încărcate electric sub acțiunea unui câmp electric extern, de la catod (-) la anod (+). Această migrare are loc în funcție de masa moleculară a particulelor și de sarcina lor electrică. Proteinele obținute din lizatul celular, pot fi separate electroforetic în funcție de dimensiunea lor și de componența gelului. Gelul de PAA realizat în prezență de SDS (dodecil sulfat de sodiu) are caracter denaturant și se găsește atât în tamponul de electroforeză cât și în gelul de poliacrilamidă, deoarece conferă proteinelor sarcină electrică netă negativă, iar interacțiunea detergentului cu proteinele, determină anularea conformației spațiale – denaturarea lor.

Gelul prezintă proprietăți optime de separare electroforetică, transparent, flexibil și stabil. Rezultă din polimerizarea acrilamidei cu bisacrilamida în prezența agentului de reticulare TEMED (N, N, N’, N’- tetrametiletilendiamină) – furnizează radicali liberi de O2 pentru inițierea polimerizării – și a catalizatorului APS (persulfat de amoniu). În funcție de concentrația și de greutatea moleculară a proteinei de interes se alege grosimea, porozitatea și concentrația gelului și se toarnă într-un sistem format din 2 geamuri de sticlă verticale separate cu un spațiator de grosime. Pentru separarea proteinelor cu masă moleculară mică, se utilizează concentrație de 10-15% și pentru cele cu masă moleculară mare o concentrație de 6-8%. Gelul final este alcatuit din două geluri: în partea superioară un gel de concentrare („Stacking gel”) unde vor fi proteinele cu masă moleculară mare și un gel de separare în partea inferioară denumit („Running gel”) unde vor fi proteinele cu masă moleculară mică. Componentele pentru geluri sunt aceleași, diferă pH-ul și concentrația. După turnarea gelurilor, se introduce pieptenul pentru a forma godeurile și se lasă la polimerizat în jur de 40 minute la temperatura camerei (se păstrează peste noapte la frigider). Voltajul la care migrează proteinele este în jur de 100V, la o temperatură de 4șC – pe gheață.

Pentru prepararea probelor se folosește un tampon de probă Sx2/Sx5 (se realizează diluția) care conține din glicerol pentru a conferi densitate probei, albastru de bromfenol pentru a urmări frontul de migrare, β-mercaptoetanol pentru ruperea punților disulfurice și migrarea proteinei în unități monomerice. Înainte de a fi încărcate probele, se denaturează la 100șC timp de 5 minute. Întotdeuna pe langă probe se încarcă și un mator de greutate moleculară pentru raportarea benzilor obținute; se încarcă minim 30µg/godeu. Tamponul pentru migrare are un pH de 8,3 și conține Trisma Base, glicină, SDS. Sistemul de geamuri se introduce în tancul de electroforeză.

Transferul proteinelor se realizează pe membrana de nitroceluloză, care acționează ca substrat solid, sub influența unui câmp electric. Se realizează sandwich-ul de blot din 2 bureți îmbibați cu tampon de transfer, membrana de nitroceluloză 0,45µm și gelul cu proteinele migrate (lăsate 20 minute în tampon înainte de transfer). Se așează toate componentele pe aparatul de transfer, se scot bulele de aer cu ajutorul unei baghete de sticlă prin rotire, se toarnă o cantitate mică de tampon de transfer și se setează amperajul în funție de aria gelului (Lxl). Tamponul de transfer este alcătuit din Tris, glicină, SDS, metanol.

După transferul proteinelor, gelul este colorat cu o soluție de Coomassie Blue 30 minute și decolorat cu o soluție de acid acetic glacial, metanol și apă distilată (3:6:1) pentru a vedea rata transferului. Foița de nitroceluloză este spălată cu apă distilată și PBS și ulterior colorată cu o soluție de Ponceau 1X pentru a vedea benzile transferate.

Marcarea cu anticorpi specifici. Înainte de marcarea cu anticorpi, membrana de nitroceluloză este imersată într-o soluție de blocare a situsurilor nespecifice (soluție de TBS cu 3% BSA, TBS cu 5% milk), apoi este incubată cu o soluție de anticorpi primari monoclonali de șoarece: β-actină (1:200, SantaCruz Biotechnology), ATF2 (1:500, ThermoFisher Scientific), SMAD2/3 (1:1000, ThermoFisher Scientific), TAK1(1:200, SantaCruz Biotechnology) policlonali de iepure pSMAD2/3 (1:1000, ThermoFisher Scientific), NF-kB p50/p65 (1:200, SantaCruz Biotechnology), AP-1S3 (1:1000 ThermoFisher Scientific) care recunosc proteina de interes, spălare pentru a îndepărta anticorpii nelegați, incubare cu soluția de anticorpi secundari – anticorpi anti-mouse (1:5000, ThermoFisher Scientific), anticorpi anti-rabbit (1:2000, ThermoFisher Scientific) – recunosc specific anticorpii primari- care sunt cuplați cu HRP (peroxidază din hrean) sau fosfatază alcalină. După incubarea membranei cu substratul cromogen 5 minute, se formează un compus insolubil, care se depunde la locul de legare al Ac, determinând apariția unor benzi asociate cu prezența proteinelor de interes. Developarea benzilor se realizează la aparatul de Chemiluminescență (ECL), iar pentru cuantificare datelor s-a utilizat programul TotalLab. Benzile asociate proteinelor de interes se raportează la banda corespunzătoare unei proteine de referință housekeeping (ex: GAPDH, β-actină) (Mahmood și Yang, 2012).

Tehnica ELISA

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) reprezintă o metodă imunoenzimatică, foarte des utilizată la ora actuală în domeniul biologiei, medicinei clinice și a biotehnologiei, care se bazează pe reacția antigen-anticorp. Cu ajutorul acestei metode se poate idetifica și aprecia cantitativ, o serie largă de molecule de interes precum anticorpi, antigene, hormoni, citokine, peptide. Prezintă o serie de avantaje foarte importante și anume siguranța crescută față de metoda radioimună, specificitate și sensibilitate crescută, ușor de realizat, rentabilă la preț (Sakamoto și colab, 2018). Există mai multe variații ale tehnicii ELISA, însă pentru studiul Ang II ți TGF-β1 s-a utilizat kituri de detecție pentru metoda indirectă „sandwich” și pentru metoda competitivă.

Principiul metodei are la bază reacția dintre antigen-anticorp. Antigenul sau anticorpul – de captură – este fixat pe un suport solid (placa de 96 godeuri este tapetată sau necesită incubare cu Anticorpul/Antigenul pentru pregătirea pentru reacție peste noapte la 4°C sau 2 ore la temperatura camerei) apoi este pusă în evidență cu orice molecula pentru care prezintă specificitate. Al doilea anticorp este cuplat cu o enzimă care degradează substratul cromogen rezultând un produs de reacție colorat care poate fi cuantificat spectrofotometric la o anumită lungime de undă. Molecula de specificitate sau anticorpul de detecție este cuplat cu biotină, având afinitate crescută pentru conjugat, sensibilitatea legării fiind amplificată de 2-5 ori. Conjugatul este reprezentat de o enzimă, de exempul HRP (peroxidază din hrean), care este cuplat cu streptavidina ce prezintă afinitate mare pentru biotină. După fiecare etapă, anticorpii necuplați se îndepărtează prin spălarea plăcii cu o soluție de tipul (WashBuffer solution).

La final, se adaugă substratul TMB (3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine) – își schimbă culoarea datorită reducerii peroxidului de hidrogen în prezența HRP- 100µl/ godeu, placa este lăsată la incubat aproximativ 30 de minute la întuneric și apoi adăugată soluția de stopare a reacției (0,2M acid sulfuric) 50µl/ godeu și citirea la spectrofotometru la o lungimea de undă sugerată de producator (450nm). În cazul ambelor kituri, s-au folosit probe standard de concentrații cunoscute plus blank, cu ajutorul cărora s-a trasat curba standard (Figura 10).

Figura 10. Schemă Tehnica ELISA „sandwich” (imagine adaptată după https://www.elisagenie.com/sandwich-elisa-protocol).

Ecocardiografie

Ecografia cardiacă este o metodă noninvazivă utilizată foarte des în diagnosticul bolilor cardiovasculare. Cu ajutorul ecocardiografiei, a fost investigată structura și funcția aortei toracice și a arterei carotide și evaluată disfuncția vasculară asociată procesului aterosclerotic. Pentru analiză, s-a utilizat sistemul de imagistică de mare rezoluție pentru animale de talie mică (Vevo2100). Înainte de procedură, blana hamsterilor de la nivelul toracelui a fost îndepărtată cu ajutorul unui aparat de tuns pentru a nu interfera cu semnalul aparatului. Animalele au fost anesteziate pe tot parcursul ecocardiografiei cu 2% izofluranVet și așezate pe o platformă încălzită pentru a le menține temperatura corpului constantă. Semnele vitale (ritm cardiac, puls) au fost monitorizate în permanență. Ecocardiografia transtoracică a constat în secțiuni parasternale pe axul lung pentru determinarea grosimii peretelui vascular și a diametrului interior înregistrat în modulul B (bidimensional). Modulul B este o metodă principală care ajută la aprecierea caracteristicilor anatomice și funcționale ale inimii și ale vaselor de sânge. Cu ajutorul modulului M s-au obținut secțiuni plane și s-a putut măsura diamentrul în sistolă și diastolă. Pentru vasele mari de sânge precum aorta toracică s-a măsurat VTI (Integrala Velocitate Timp) și VEL (Velocitatea sanguină), înregistrări obținute în modul Doppler pulsat care analizează caracteristicile hemodinamice ale fluxului sanguin. Prelucrearea imaginilor obținute de la cele două grupe experimentale: C și HH s-a realizat cu ajutorul softului VevoLab300.

REZULTATE ȘI DISCUȚII

După realizarea modelului experimental animal cu boală aterosclerotică indusă, urmărit timp de 16 săptămâni, s-a recoltat sânge periferic din plexul retroorbital, aortă toracică și arteră carotidă în vederea analizării efectelor pe care dieta administrată influențează integritatea și funcția endoteliului vascular. De asemenea am dorit să vedem dacă dieta are rezultatele dorite- de a induce ateroscleroza în modelul animal. În decursul celor 4 luni, s-a prelevat sânge periferic pentru a realiza analiza parametrilor biochimici plasmatici (glicemie, colesterol total, HDL, LDL, trigliceride) pentru a observa evoluția în timp a profilului lipidic. În urma rezultatelor obținute, s-a putut observa instalarea aterosclerozei/patologiei cu disfuncția vasculară asociată.

Cele doua grupe experimentale investigate C si HH nu prezintă variații semnificative ale greutății și glicemiei plasmatice. Modificarea profilului lipidic, în special creșterea LDL-colesterol, factor de risc corelat cu dezvoltarea aterosclerozei, este evidentă în cazul grupului HH.

Rezultate parametrii biochimici.

Figura 11 (Tabel 1). Caracteristicile clinice ale celor 2 grupe de animale experimentale: C și HH după 16 săptămani de dietă standard/dietă aterogenă.

Figura 12. Evoluția în timp de 16 săptămâni a parametrilor plasmatici/ profilului lipidic.

Este cunoscut faptul că în cazul pacienților care suferă de ateroscleroză, profilul lor lipidic este alterat prezentând creșteri semnificative ale lipidelor. Astfel, în modelul animal experimental se poate observa o creștere treptată la grupul HH a colesterolului total, colesterol LDL și a trigliceridelor până la valori extrem de ridicate comparativ cu grupul C, ceea ce indică atât instalarea bolii cât și agravarea ei, cu consecințe grave asupra vaselor de sânge și a organelor interne. Greutate animalelor scade odată cu evoluția aterosclerozei, iar glicemia inițial scade iar mai apoi, pe la sfârșitul experimentului, prezintă valori crescute. Parametrii plasmatici ai grupului control se mențin stabile pe tot parcursul celor 4 luni. În urma administrării dietei aterogene, ficatul este grav afectat având aspect galben și gras- instalarea steatozei hepatice, iar plasma are un aspect lăptos, dens, datorită acumularii unei cantități mari de lipide în circulația sanguină.

Figura 13. Aspectele morfologice și anatomice ale ficatului în cazul celor două grupe experimentale: Control (C) și Hiperlipemic-Hipertesiv (HH).

Prin tehnica ELISA s-a putut cuantifica nivelele de TGF-β1 și Ang II din plasmă care sunt corelate cu disfuncția vasculară datorită creșterii nivelelor de colagen tip I și III ce conduce la rigiditatea pereților vaselor de sânge. Acest fapt este potențat și de administrarea de NaCl care în timp produce hipertensiune arterială remodelând peretele vascular datorită hipertrofiei și hiperplaziei instalate. În cazul lotului experimental, creșterea TGF-β1, marker ce indică procesul inflamator specific aterosclerozei, este semnificativă la grupul HH comparativ cu grupul C. Ang II este un vasoconstrictor puternic care activează TGF-β1 pe calea Smad-independentă pentru a induce sinteza de fibronectină (glicoproteină care este implicată în formarea leziunii aterosclerotice).

Figura 14. Analiza cantitativă a proteinelor TGF-β 1și Angiotensină (Ang II) din plasma hamsterilor HH și C prin tehnica ELISA. (***P<0.005, Two-way ANOVA, Bonferroni post-test).

Cu ajutorul tehnicii miografului, s-a urmărit disfunția vasculară la cele 2 grupe de animale pentru a vedea capacitatea de contacție și de relaxare a vaselor, atât la nivelul arterei carotide cât și la nivelul aortei toracice. În urma graficelor realizate (Figura 15) s-a putut observa funcția normală a vasului la grupul C și disfuncția vasculară în cazul grupului HH.

La grupul HH contracția la NA (10-4M) și relaxarea la ACh (10-5M/10-6M) sunt semnificativ reduse comparativ cu grupul C, ceea ce indică instalarea disfuncției endoteliale.

Figura 15. Reprezentare grafică a valorilor obținute la contacție/relaxare la cele 2 grupe experimentale (*P<0.05, ***P<0.005, Two-way ANOVA, Bonferroni post-test).

Figura 16. Imagini reprezentative cu înregistrări obținute la miograf: contacția (10-8M ÷10-4M) și relaxarea (10-8M ÷10-4M) la nivelul aortei toracice (roșu) și a arterei carotide (mov) pentru cele 2 grupe experimentale investigate: C si HH.

Investigarea disfuncției vasculare s-a realizat si cu ajutorul tehnicilor de inumohistochimie/ imunofluorescență a markerilor inflamatorii specifici. Aceștia au fost urmăriți atât la nivelul aortei toracice cât și la nivelul arterei carotide.

Investigarea markerilor inflamatori specifici cu rol în disfuncția aortei toracice

Grupul HH a înregistrat valori semnificativ crescute la nivelul aortei toracice ale markerilor implicați în disfuncția vasculară precum VCAM-1, MMP-2 (proteine implicate în adeziune celulară/ remodelarea vasculară), macrofage (CD68+), macrofage tip-1 M1 (MHC-II+) –celule proinflamatorii – celule care susțin procesul inflamator; Cx43, COL1A, α-SMA (proteine implicate în structura peretelui vascular).

Investigarea markerilor inflamatori specifici cu rol în disfuncția arterei carotide

Grupul HH a înregistrat valori semnificativ crescute la nivelul arterei carotide ale markerilor implicați în disfuncția vasculară precum MMP-2 (proteină implicată în remodelarea vasculară), macrofage (CD68+), macrofage tip-1 M1 ( MHC-II+) –celule proinflamatorii, limfocite T (CD3e+) – celule implicate activ în inflamație; α-SMA (proteină implicată în structura peretelui vascular).

S-a analizat nivelul de exprimare ROS (specii reactive de oxigen) citosolic la sfârșitul celor 16 săptămâni de dietă. Atât la nivelul aortei toracice cât și la nivelul arterei carotide, grupul animal HH a înregistrat valori semnificativ crescute, fiind asociate cu lezarea endoteliului care conduce la activarea acestuia dar și cu o creștere a LDL-ului oxidat în intima vasculară.

Expresia proteinelor SMAD2/3, pSMAD2/3, AP-1S3, TAK1, ATF-2, NF-kB p50/p65 urmărită prin tehnica Western Blott, implicate în căile de semnalizare intracelulare. Cuantificarea s-a realizat prin raportarea valorilor la o proteină de referință – β actină. Au fost observate nivele semnificativ crescute ale factorului de transcripție AP-1S3 implicat în calea de semnalizare Ang II; TGF-β1/Smad2,3; TAK1. Expresia factorului de transcripție NF-kB are un rol esențial în eliberarea citokinelor proinflamatorii și activarea receptorilor de suprafață care contribuie la progresia leziunii aterosclerotice având funcție proaterogenică. Factorul de transcripție AP-1S3 are rol în controlul proceselor celulare precum: diferențierea, proliferarea și apoptoza dar și reglează expresia genică ca răspuns la stimuli diverși (citokine, factori de creștere, stres mecanic). Proteinele SMAD2/3 implicate în calea de semnalizare canonică prezintă o creștere ușoară în expresie dar fără semnificație statistică.

Prin intermediul tehnicii ecocardiografice, s-a investigat structura și funcția aortei toracice și a arterei carotide împreună cu evaluarea disfuncției vasculare. Înregistrările în modul B – 2D oferă informații cu privire la aspectele anatomice (grosime și diametru interior) ale vaselor de sânge. În urma analizei, grupul HH a înregistrat valori marcant crescute în ceea ce privește grosimea peretelui vascular față de grupul C, fiind asociate cu proliferarea celulelor musculare netede la nivel subendotelial și cu formarea plăcii fibro-lipidice caracteristice procesului aterosclerotic. Diametrul interior nu a prezentat modificări notabile.

(Figura 28B. Reprezentare grafică a grosimii (mm) și diametrului (mm) peretelui aortei toracice ,***P<0.005, Two-way ANOVA, Bonferroni post-test).

În urma analizării înregistrărilor în modul M (care prezintă avantajul unei rezoluții temporale mari) a diamentrului aortei toracice în sistolă și diastolă, la grupul HH s-a observat o scădere marcantă a distensibilității vasculare. Acest fapt se poate corela cu o rigidizare a peretelui vascular, proces caracteristic aterosclerozei.

(Figura 29B. Reprezentare grafică a distensibilității vasculare (mm) ,**P <0.01, Two-way ANOVA, Bonferroni post-test).

Imaginile obținute prin ecocardiografia în modulul Doppler pulsat oferă informații privind hemodinamica fluxului sanguin. Atfel că, s-a analizat velocitatea sângelui și integrala velocitate timp la nivelul aortei toracice izolată de la cele 2 grupe animale experimentale. Grupul HH a înregistrat valori crescute corelate cu o creștere a tensiunii arteriale declanșată după administrarea gavajului cu 8% NaCl.

(Figura 30B. Reprezentare grafică a Velocității (mm/s) și a Integralei velocitate timp (mm) la nivelul aortei toracice ,***P<0.005, Two-way ANOVA, Bonferroni post-test).

Înregistrările în modul B au arătat valori semnificativ crescute ale grosimii peretelui vascular de la nivelul arterei carotide însoțite și de o scădere/reducere ușoară a diametrului interior.

(Figura 31B. Reprezentare grafică a grosimii (mm) și diametrului (mm) peretelui arterei carotide ***P<0.005, Two-way ANOVA, Bonferroni post-test).

CONCLUZII

În urma rezultatelor obținute în cadrul acestei lucrări, pe modelul animal experimental cu boală aterosclerotică, putem concluziona astfel:

Dieta îmbogățită cu 15% unt, 3% colesterol și gavajul zilnic cu 8% NaCl administrată timp de 4 luni generează modelul animal cu boala cardiovasculară aterosclerotică, respectiv cu disfuncție vasculară.

Modificari semnificative au fost observate la nivelul parametrilor plasmatici (profil lipidic modificat: nivelele crescute de lipide în fluxul sanguin precum colesterol total, LDL, trigliceride sunt considerate markeri specifici care indică instalarea ateroscelrozei), precum și în ceea ce privește structura si funcția aortei toracice și a arterei carotide (contracție și relaxare diminuate, grosimea peretelui vascular crescută, diametrul intern redus, distensibilitate redusă, integrala velocitate timp crescută, velocitate crescută la grupul HH).

Disfuncția vasculară a fost asociată cu creșterea stresului oxidativ si a markerilor specifici inflamatori (nivele semnificativ crescute pentru ROS, TGF- β1, COL1A, α-SMA, Cx43, macrofage (CD68+), macrofage tip 1 proinflamator – M1 (MHC-II+), limfocite T (CD3e+), MMP-2, VCAM-1 la grupul HH).

Mecanismul responsabil: nivele semnificativ crescute ale factorului de transcripție AP-1S3 implicat în calea de semnalizare Ang II; TGF-β1/Smad2,3; TAK1.