Studiul de față s-a efectuat pentru evaluarea in vitro a activității antimicrobiene a ceaiului verde si negru cu consorțiul de tip Kombucha. [310564]

CUPRINS

REZUMAT

Studiul de față s-a efectuat pentru evaluarea in vitro a activității antimicrobiene a ceaiului verde si negru cu consorțiul de tip Kombucha.

Activitatea antimicrobiană a fost testată față de cinci specii bacteriene potențial patogene ([anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], Staphylococcus aureus) și patru specii fungice de interes veterinar (Candida albicans, C. parapsilosis, [anonimizat]).

Pentru evaluarea activității antimicrobiene s-a utilizat metoda antibiogramei cu măsurarea zonelor de inhibiție.

[anonimizat] C. parapsilosis.

Scopul final este proiectarea unui nou produs antimicrobian pentru uz veterinar.

[anonimizat], [anonimizat], gastroenterita acută sau sindromul intestinului iritabil. [anonimizat], conferă numeroase beneficii pentru sănătate (FAO / OMS, 2001). [anonimizat] (LAB) [anonimizat] a [anonimizat]. [anonimizat], si aplicatii practice ale Kombucha de uz uman si veterinary.

Capitolul I al acestei lucrări este dedicat studiului bibliografic. În acest capitol a fost făcută o inventariere a [anonimizat] o descriere a principalelor bacterii si drojdii ce alcătuiesc acest consorțiu. Tot aici s-a realizat o descriere a proprietăților antibacteriene si antifungice a consoțiului de tip Kombucha și o caracterizare a microorganismelor potențial patogene asupra cărora s-a testat activitatea antagonistă a acestui consoțiu.

Capitolul II este destinat materialelor și metodelor folosite în această lucrare. [anonimizat] a ceaiului cu consorțiul de tip Kombucha asupra microorganismelor potențial patogene.

[anonimizat]. [anonimizat].

Capitolul I – STUDIU BIBLIOGRAFIC

. Scurt istoric despre Kombucha

Kombucha sau denumita popular ʺelixirul tinerețiiʺ este o băutura populară printre băuturile tradiționale fermentate în întreaga lume. Ea a [anonimizat] (Manchiuria) și mai târziu s-a răspândit în Rusia și restul lumii. Prima utilizare înregistrată de

Kombucha provine din China în 221 î.Hr. și a fost consumată acolo timp de 2000 de ani.

A [anonimizat].

[anonimizat] a tratat familia împăratului Inyko cu ceaiul fermentat.

Rusia are o tradiție îndelungată folosind o băutură de vindecare numită "Tea Kvass", realizată din "ciupercă japoneză". Din Rusia s-a răspândit în Prusia, Polonia, Germania și Danemarca, dar se pare că în timpul celui de-al Doilea Război Mondial această tradiție s-a pierdut. După război, dr. Rudolph Skelnar a creat un interes nou față de Kombucha în Germania când a folosit-o la el în practica pentru a trata pacienții cu cancer, tulburări metabolice, hipertensiune arterială și diabet.

Kombucha este de asemenea denumită frecvent în literatură "ciuperca de ceai " datorită aspectului ei de film subțire deasupra ceaiului în cazul în care masa celulelor de bacterii și drojdie s-au atașat, deși nu există defapt nici o ciupercă implicată în fermentație. (Benk, 1988, Reiss, 1987, 1994, Steinkraus et al., 1996; Liu et al., 1996; Sievers et al., 1995).

Kombucha este o băutură de sănătate, vie, făcută prin fermentarea ceaiului cu zahăr împreună cu cultura Kombucha. Rezultatul poate avea gust asemanator cu cidrul strălucitor de mere și șampanie, în funcție de ce ceaiul folosit.

Mulți oameni din întreaga lume au băut ceai fermentat timp de multe sute de ani, numindu-l prin nume diferite și lăudând beneficiile sale probiotice, precum și aroma sa revigorantă.

Această băutură se pare că exercită o serie de efecte medicinale, de exemplu, împotriva bolilor metabolice, artritei, psoriazisului, constipație, indigestie și hipertensiune, dar nu există încă dovezi științifice solide disponibile pentru eficacitatea sa.

1.2. Ce este Kombucha?

Kombucha este un consoțiu de microorganisme simbiotice intre bacterii (Acetobacter xylinum, Acetobacter xilinoide, Bacterium gluconicum) și tulpini de drojdii (Schizosaccharomyces pombe, Saccharomycodes Ludwigii, Saccharomyces cerevisiae ) cultivate în ceai cu zahăr. (Cvetkovic et al., 2008)

Pentru a pregăti kombucha, frunzele de ceai negru se varsă în apă clocotită, se adaugă cantități suficiente de zahăr (zaharoză) și amestecul este răcit în încăpere la temperatura camerei, apoi, un biofilm "mamă" este introdus în ceai; Acest biofilm este uneori numita cultura simbiotica de bacterii si drojdii, si este compusa din acetic bacterii producătoare de acid, drojdii de fermentare cu etanol și un peliculă de celuloză groasă. Biofilmul plutește la interfața lichid-aer și crește pe verticală, creșterea biomasei cu bandă de celuloză pe măsură ce fermentația se maturizează. După câteva zile de incubare la temperatura camerei, ceaiul devine un dulce și acru, în mod natural, din cauza activităților microbiene. (Malbasa et al., 2006)

Cultura este plasată atât în ceai negru sau verde îndulcit și transformă ceaiul dulce într-un ceai plin de vitamine, minerale, enzime și acizi. Pe măsură ce cultura Kombucha digeră zahărul produce o gamă de acizi organici cum ar fi acidul glucuronic, acidul gluconic, acidul lactic, acidul acetic, acidul butiric, acidul malic și acidul usnic, vitamine, în special vitaminele B și vitamina C, precum și aminoacizi și enzime. Deasemenea toate microorganismele sunt probiotice.

Cultura Kombucha arată ca o clătită de culoare albă. Este adesea numit "scoby", ce reprezintă cultura simbiotică a bacteriilor și drojdiilor. Simbioza înseamnă că bacteriile și drojdiile trăiesc împreună o comunitate complexă, care se susține reciproc, sprijinind și depinzând una de cealaltă. Scoby este uneori numită ciupercă, pentru că seamănă cu corpul neted și gros al unei ciuperci. Bacteriile specifice și tulpinile de drojdie din Kombucha sunt ceea ce o face să se comporte așa cum o face provocând acidularea și aroma ceaiului îndulcit.

Ceaiurile negre și verzi sunt cele obișnuite și cele mai bune substraturi cunoscute pentru prepararea băuturilor Kombucha. (Battikh et al., 2012)

Fig.1.1. Kombucha

(sursa: http://fsi.colostate.edu/kombucha/ )

1.3. Principalele bacterii prezente in consorțiul de tip Kombucha

Principalele bacterii care alcătuiesc consorțiul microbian de tip Kombucha sunt bacteriile acetice ca de exemplu Acetobacter xylinum, Acetobacter pasteurianus, o cantitate considerabilă de bacterii producătoare de acid lactic (LAB), cum ar fi: Lacobacillus și Lactococcus și alte specii/genuri de bacterii cum ar fi: Bacterium gluconicum, Propionibacterium, Bifidobacterium (Marsh et al., 2013).

Fig.1.3.Celule de drojdii si bacterii observate cu obicetivul 400X (Sursa: https://en.wikipedia.org/wiki/Kombucha#/media/File:Kombuchacultsm.jpg)

În continuare sunt prezentate principalele genuri bacteriene detectate în consorțiu Kombucha.

1.3.1. Genul Gluconacetobacter

Bacteriile dominante din consorțiul de Kombucha aparțin genului Gluconacetobacter care, în trecut erau cunoscute sub denumirea de Acetobacter (tabel 1.3.1.) identificat ca fiind cel mai mare gen bacterian prezent atât în ​​biofilm, cât și în suspensia crudă de tip Kombucha (~ 50%) (Chakravorty et al., 2016). Conform studiilor realizate de Marsh (2014) genul major de bacterii prezent a fost Gluconacetobacter, prezente până la > 85% în majoritatea probelor.

Tabel 1.3.1. Principalele specii de bacterii din consorțiul de Kombucha din genul Gluconacetobacter

Genul Acetobacter cuprinde o serie de specii de bacterii producatoare de acid acetic.

Bacteriile acidului acetic se caracterizează prin capacitatea de a transforma etanolul în acid acetic în prezența oxigenului. Bacteriile din genul Acetobacter au fost izolate din procesele de fermentare industrială a oțetului și sunt frecvent utilizate ca culturi de fermentare inițială. Una dintre cele mai importante specii ale genului este Acetobacter xylinum, o bacterie în formă de tijă, gram-negativă, flagelată mobilă, ce se găsește în perechi sau formând lanțuri scurte. Este o bacterie aerobă obligatorie care metabolizează în principal glucoza pe care o folosește în sinteza celulozei.

Fig.1.3.1. Matricea plutitoare sau scooby-ul de la suprafața ceaiului

( Sursa: http://www.thekitchn.com/how-to-make-kombucha-tea-at-home-cooking-lessons-from-the-kitchn-173858 )

Acetobacter xylinum (Gluconacetobacter xylinus) formează în cea mai mare parte matricea plutitoare sau scooby-ul de la suprafața ceaiului, ce permite celulelor să se ridice la suprafața unde oxigenul este abundent. Este un mezofil nepatogen identificat de A.J Brown în 1886 datorită capacității sale de a produce celuloză. În natură, A. xylinum se găsește în sol și se găsește în mod frecvent la fructele putrede căzute (Skinner și Cannon, 2000). Având abilitatea excepțională de a produce celuloză, Acetobacter xylinum constituie un candidat important pentru obținerea polimerului de celuloză de tip microbian. Celuloza acrilică este un material interesant pentru utilizarea ca pansament pentru răni, deoarece asigură un mediu umed și are ca rezultat o vindecare mai bună a rănilor. Un tip de peliculă uscată de celuloză bacteriană a fost dezvoltată și caracterizată ca un potențial pansament antibacterial funcțional pentru răni pentru tratamentul traumatismelor acute. În ceea ce privește efectul antimicrobian, a fost obținută o activitate antimicrobiană stabilă și prelungită timp de cel puțin 24 ore, în special împotriva Staphylococcus aureus și Bacillus subtilis, bacterii Gram pozitive care s-au găsit pe rana contaminată. (Bin Weia et al., 2011).

În prezent, Acetobacter xylium considerată cea mai bine studiată și cea mai eficientă producătoare de celuloză bacteriană din Kombucha (Mikkelsen et al., 2009; Strap et al., 2011).

Abd El-Salam (2012) a demonstrat că apariția peliculei groase de celuloză de la suprafața ceaiului de Kombucha este intensificată de asocierea dintre bacterii și drojdii. Grosimea si apariția peliculei poate fi influențată de temperatura și cantitatea de zahăr utilizat în prepararea ceaiului.

1.3.2. Genurile Lacobacillus și Lactococcus

Bacteriile acidului lactic (LAB) sunt o serie de bacterii care prezintă caracteristici metabolice și fiziologice comune. Aceste bacterii, de obicei găsite în plantele de descompunere și în produsele lactate, produc acid lactic ca principalul produs finit metabolic al fermentației de carbohidrați.

Genul Lactobacillus este alcătuit din bacterii Gram-pozitive, facultative anaerobe sau microaerofile, în formă de bacil (Makarova et al., 2006). Ele reprezintă o parte majoră a grupului de bacterii producătoare de acid lactic, transformând zaharurile în acid lactic. La om, acestea constituie o componentă semnificativă a microbiotei. Multe specii de lactobacili funcționează folosind metabolismul homofermentativ producând numai acid lactic din zaharuri, iar alte specii utilizează metabolismul heterofermentativ și pot produce fie alcool, fie acid lactic din zaharuri.

Speciile Lactobacillus produc peroxid de hidrogen care inhibă creșterea și virulența agentului fungic patogen Candida albicans in vitro și in vivo (Wang, et al. 2015). În urma terapiei cu antibiotice, anumite specii de Candida pot suprima regenerarea speciilor de Lactobacillus în locurile în care coabitează, cum ar fi în tractul gastro-intestinal. Speciile de Lactobacillus administrate ca un singur agent probiotic nu au nici un beneficiu la persoanele cu sindromul intestinului iritabil sau boala Crohn (Ghouri, et al., 2014). Când se administrează în combinație cu alte probiotice, poate ajuta persoanele cu sindrom de intestin iritabil. Lactobacilii s-au dovedit recent că pot contracara efectul secundar al expunerii pe termen lung la antibiotice la începutul vieții la șoareci (Leclercq, et al., 2017).  În ceaiurile fermentate de tip Kombucha se găsește o populație proeminentă de Lactobacillus (până la 30%).

Din ceaiurile fermentate, Kombucha a conținut cele mai mari proporții de Firmicutes de la 5.6% până la 10,5% în extractul din ziua 3 și respectiv ziua 10. Afirmațiile asociate Firmicutes au fost predominant atribuite genului Lactobacillus, care a fost detectat în toate produsele fermentate de tip Kombucha (Marsh et al. 2014). Studiile au indicat faptul că rolul acestor microorganisme ar putea fi creșterea speciilor de acid acetic. În acest sens s-a demonstrat că Lactobacillus crește semnificativ producția de celuloză de către Gluconacetobacter (Seto et al., 2006) și, chiar mai relevant, s-a dovedit că LAB susține creșterea bacteriilor din genul Gluconacetobacter în Kombucha (Yang e al., 2010). Din acest gen cele mai multe specii identificate au corespuns unei comunități care a fost 99% identică cu Lactobacillus kefiranofaciens ( Marsh et al., 2014).

Lactococcus este un alt gen de bacterii lactice care anterior au fost incluse în genul Grupul Streptococcus N1. Ele sunt cunoscute ca homofermentoare, ceea ce înseamnă că acestea produc un singur produs, acid lactic, în acest caz, ca fiind produsul principal sau singur al fermentației glucozei. Caracterul lor homofermentativ poate fi modificat prin ajustarea condițiilor de mediu cum ar fi pH-ul, concentrația de glucoză și limitarea nutrienților. Acestea sunt cocci gram-pozitivi, catalază-negativi, nemotați care se găsesc singuri, în perechi sau în lanțuri. Genul conține tulpini cunoscute că cresc la sau sub 7˚ (Schleifer et al., 1985).

În consorțiul de tip Kombucha, abundența de bacterii din genul Lactococcus a variat, dar a fost în general mai mică, reprezentând în mod constant <2% din citirile tuturor fermentelor și peliculelor (Marsh et al., 2014).

1.3.3. Alte specii de bacterii din consorțiul de Kombucha

În continuare sunt prezentate principalele alte genuri sau specii detectate în consorțiu Kombucha (tabel 1.3.2.).

Tabel 1.3.2. Principalele specii/genuri bacteriene din consorțiul Kombucha

Bifidobacterium este un gen de bacterii anaerobe, gram-pozitive, fară motilitate, adesea ramificate. Ei sunt locuitori omniprezenți ai tractului gastrointestinal, (Schell et al., 2002) și gurii (B. dentium) a mamiferelor, inclusiv a oamenilor. Bifidobacteriile sunt unul dintre genurile majore de bacterii care alcătuiesc flora de colon la mamifere. Unele bifidobacterii sunt folosite ca probiotice. Genul Bifidobacterium posedă o cale unică de fosfocetolază de fructoză-6-fosfat utilizată pentru fermentarea carbohidraților. O mare cercetare metabolică asupra bifidobacteriilor s-a concentrat asupra metabolismului oligozaharidelor, deoarece acesti carbohidrați sunt disponibili în habitatele lor cu conținut limitat de nutrienți (Mayo et al., 2010).

Leuconostoc este un gen de bacterii Gram-pozitive, plasate în familia Leuconostocaceae (Björkroth și Holzapfel., 2006). Ele sunt în general coci ovoizi care formează adesea lanțuri. Leuconostoc spp. sunt rezistente intrinsec la vancomicină și sunt catalază-negative. Toate speciile din acest gen sunt heterofermentative și sunt capabile să producă dextran din sucroză. Leuconostoc este, de asemenea, parte din coloniile simbiotice ale bacteriilor și drojdiei sau SCOBY implicate în fermentarea chefirului, o băutură cu lapte fermentat (Farnworth și Edward , 2005), dar si în SCOBY-ul implicat in fermentarea ceaiului de tip Kombucha.

Propionibacterium este un gen gram-pozitiv, anaerob, în ​​formă de bară, cunoscut pentru metabolismul lui unic. Bacteriile de acest gen sunt capabile să sintetizeze acidul propionic prin utilizarea enzimelor neobișnuite de transcarboxilază (Cheung, et al., 1975). Membrii săi sunt în primul rând paraziți facultativi și comensali ai oamenilor și altor animale, care trăiesc în și în jurul glandelor sudoripare, glandelor sebacee și a altor zone ale pielii. Membrii din genul Propionibacterium sunt utilizați pe scară largă în producția de vitaminele B12, compuși tetrapirol și acid propionic, precum și în industria probioticelor și a brânzeturilor (Kiatpapan și Murooka, 2002).

1.4. Principalele drojdii prezente in consorțiul de tip Kombucha

Principalele genuri de drojdii ce alcătuiesc și predomină în consorțiul de tip Kombucha sunt: Schizosaccharomyces, (Mayser et al., 1995; Marsh et al., 2014 Saccharomycodes, Saccharomyces, Brettanomyces, Candida (Chakravorty et al., 2016 ), Lachancea (Chakravorty et al., 2016), Zygosaccharomyces (Dufresne și Farnworth, 2000), Torulaspora, Pichia (Marsh et al., 2014). În comparație cu bacteriile, populația de drojdii din acest consorțiu este mult mai variată. ( Marsh et al., 2014)

1.4.1. Genul Saccharomyces

Genul Saccharomyces include multe specii de drojdii. Termenul Saccharomyces provine din greaca și înseamnă ciupercă de zahăr. Mulți membrii ai acestui gen sunt considerați foarte importanți în producția de alimente. Este cunoscută sub numele de drojdie de bere sau drojdie de brutărie. Sunt ciuperci unicelulare și saprofite. Un exemplu este Saccharomyces cerevisiae, care se folosește la fabricarea vinului, a pâinii, a berii și a sănătății umane și animale.

În consorțiul de tip Kombucha au fost izolate S. cerevisiae și S. bisporus (Markov et al., 2001, Chakravorty et al., 2016; Șafak et al., 2002).

Saccharomyces cerevisiae este o specie de drojdie. Aceasta a fost instrumentar pentru vinificație, coacere și băuturi din timpuri străvechi. Se crede că a fost izolată inițial din pielea strugurilor, se poate vedea drojdia ca o componentă a filmului alb subțire pe pielea unor fructe de culoare închisă, cum ar fi prunele, există printre cerurile cuticulei. Tulpinile naturale ale drojdiei au fost găsite pe suprafețele plantelor, ale tracturilor gastrointestinale și ale suprafețelor corpului insectelor și animalelor cu sânge cald, solurilor din toate regiunile lumii și chiar și în mediile acvatice.( Martini, 1993) Este unul dintre cele mai intens studiate organisme de model eucariote în biologie moleculară și celulară, la fel ca Escherichia coli ca bacterie model. Microorganismul se află în spatele celui mai frecvent tip de fermentație.

Celulele S. cerevisiae sunt rotunde, ovoide, cu diametrul de 5-10 μm. Se reproduce printr-un proces de divizare cunoscut sub numele de înmugurire. (Feldmann și Horst, 2010). Poate exista în două forme diferite: haploid sau diploid. Acesta se găsește de obicei în forma diploidă. (Landry, et al., 2006) Forma diploidă are formă elipsoidă cu un diametru de 5-6 um, în timp ce forma haploidă este mai sferică cu un diametru de 4 um. În faza exponențială, celulele haploide reproduc mai mult decât celulele diploide. Celulele haploid și diploid se pot reproduce asexuat într-un proces numit înmugurire, în care celula fiică iese din celulele părinte. Mugurii celulelor haploide sunt adiacente unul altuia, în timp ce mugurii celulelor diploide sunt localizați în poli opuși. (Sherman, 2002)

Toate tulpinile de S. cerevisiae pot crește aerobic pe glucoză, maltoză și trehaloză și nu cresc pe lactoză și celobioză. Totuși, creșterea pe alte zaharuri este variabilă. Galactoza și fructoza se dovedesc a fi două dintre cele mai bune zaharuri fermentante. Capacitatea drojdiilor de a utiliza diferite zaharuri poate fi diferită în funcție de gradul de creștere a acestora prin aerobioză sau anaerobioză. Unele tulpini nu pot crește anaerob în zaharoză și trehaloză.

Fig.1.4. Saccharomyces cerevisiae, imagine SEM

(Sursa: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/9/95/Saccharomyces_cerevisiae_SEM.jpg )

Saccharomyces cerevisiae nu este în mod normal considerat a fi un agent patogen și este folosit ca probiotic in tratarea diareei infecțioase. Multe proteine ​​importante în biologia umană au fost descoperite pentru prima dată prin studierea omologilor lor în drojdie. Aceste proteine ​​includ proteine ​​de ciclu celular, proteine ​​de semnalizare și enzime de procesare a proteinelor. S. cerevisiae este în prezent singura celulă de drojdie cunoscută că are corpuri Berkeley prezente, care sunt implicate în anumite căi secretorii. Anticorpii împotriva S. cerevisiae se găsesc la 60-70% dintre pacienții cu boală Crohn și la 10-15% dintre pacienții cu colită ulcerativă. (Walker et al., 2004).

1.4.2. Genul Schizosaccharomyces

Din consoțiul de tip Kombucha s-au izolat doua specii ale genului Schizosaccharomyces, aceastea fiind S. pombe și S. bisporus (Marsh et al., 2013; Teoh et al., 2004; Jayabalan et al., 2008). Populațiile de drojdii din consorțiul de tip Kombucha a fost dominată de Zygosaccharomyces până la 95% în băutura fermentată

Schizosaccharomyces pombe, denumită și "drojdie de fisiune", este o specie de drojdie folosită în berii tradiționale și ca organism model în biologie moleculară și celulară. Este un eucariot unicelular, al cărei celule este în formă de tijă. Celulele de obicei măsoară 3 până la 4 micrometri în diametru și 7 până la 14 microni în lungime. (Wilhelm; et al., 2008). Drojdia de fisiune S. pombe aparține diviziei Ascomycota, care reprezintă cel mai mare și mai divers grup de ciuperci. Ascomycetele se găsesc frecvent în exsudatele de copaci, pe rădăcinile plantelor și în solul înconjurător, pe fructele coapte și în putrefacție și în asociere cu insectele vectori care le transportă între substraturi. Multe dintre aceste asociații sunt simbiotice sau saprofite, deși numeroasele ascomycete reprezintă patogeni importanți din plante care țintesc specii de plante, inclusiv culturi comerciale. Dintre genurile de drojdie ascomycite, drojdia Schizosaccharomyces este unică datorită depunerii de a- (1,3) -glucan sau pseudonigeran în peretele celular în plus față de beta-glucanii cunoscuți mai bine și lipsa virtuală de chitină. . S. Pombe suferă fermentație aerobă în prezența excesului de zahăr. (Lin; et al., 2011) S. Pombe poate degrada acidul malic L, unul dintre acizii organici dominanți în vin.

Fig.1.4.2. Schizosaccharomyces pombe

(Sursa: https://en.wikipedia.org/wiki/Schizosaccharomyces_pombe#/media/File:Fission_yeast.jpg)

1.4.3. Genul Dekkera

Genul Dekkera sau cunoscută și sub numele de Brettanomyces este un gen de drojdii care nu formează spori în familia Saccharomycetaceae. Morfologia celulară a drojdiei poate varia de la celule ovoidte până la lungi. Drojdia este acidogenă și, atunci când este cultivată pe medii bogate în glucoză, în condiții aerobe, produce cantități mari de acid acetic. Brettanomyces este important atât pentru industria berii, cât și pentru sectorul vitivinicol datorită compușilor senzoriali pe care îi produce.

Tabel 1.4.1. Principalele specii de bacterii din consorțiul de Kombucha din genul Brettanomyces

Brettanomyces bruxellensis este o drojdie ce formează colonii vizibile din punct de vedere macroscopic ce arată albicioase și prezintă un aspect în formă de cupolă, în funcție de vârstă și dimensiune (Yakobson, 2010).

Fig. 1.4.3. B. bruxellensis

(Sursa:http://wineserver.ucdavis.edu/industry/enology/winemicro/wineyeast/dekkera_bruxellensis.html )

1.4.4. Genul Zygosaccharomyces

Din genul Zygosaccharomyces, în consorțiul de tip Kombucha, au fost identificate doua specii și anume Zygosaccharomyces bailii și Zygosaccharomyces bisporus (Marsh et al., 2013).

Zygosaccharomyces bailii este o specie din genul Zygosaccharomyces. Celulele vegetative Z. bailii sunt, de obicei, elipsoide, fără motilitate și reproduse asexual prin înmugurire multilaterală (Boekhout și Phaff, 2003 și Sutton, 1999). Din specia Zygosaccharomyces, Z. bailii posedă caracteristicile de rezistență foarte pronunțate și diversificate, permițându-i să supraviețuiască și să se prolifereze în condiții de stres mari. S-a descoperit că Z. bailii preferă medii ecologice caracterizate prin condiții osmotice ridicate. Cele mai des întâlnite habitate naturale sunt fructele uscate sau fermentate, exudații de copaci (în podgorii și livezi) și în diferite stadii de rafinare a zahărului și de producere a siropului (Erickson, et al., 1999). În plus, rareori se întâlnește Z. bailii ca agent major de distrugere a alimentelor neprelucrate. De obicei, drojdia devine importantă numai în produsele prelucrate atunci când concurența cu bacteriile și mucegaiurile este redusă prin factori intrinseci cum ar fi pH-ul, activitatea apei (aw), conservanții etc (Davenport, 1985).

O caracteristică remarcabilă a Z. bailii este rezistența sa excepțională la conservanții slabi ai acidului utilizat în mod obișnuit în alimente și băuturi, cum ar fi acetic, lactic, propionic, benzoic, acizi sorbici și dioxid de sulf. Spre deosebire de majoritatea altor drojdii, Z. bailii metabolizează fructoza mai rapid decât glucoza și crește mult mai rapid în alimentele care conțin fructoză ≥ 1% . În plus, s-a observat că fermentația alcoolică în condiții aerobe (efectul Crabtree) în Z. bailii este influențată de sursa de carbon, adică etanolul este produs la o viteză mai mare și cu un randament mai mare pe fructoză decât pe glucoză. ( Merico, et al. 2003).

Fig. 1.4.4. Celulele Z. bailii în mediu Sabouraud (100x)

( Sursa: https://en.wikipedia.org/wiki/Zygosaccharomyces_bailii#/media/File:Zygosaccharomyces_bailii_cells.jpg )

1.4.5. Genul Candida

În consorțiul de tip Kombucha au fost găsite mai multe specii ale genului Candida, aceaseta fiind nepatogene.

Tabel 1.4.2. Principalele specii de drojdii din consorțiul de Kombucha din genul Candia

Chakravorty (2015) a studiat structura și dinamica comunității microbiene împreună cu proprietățile biochimice ale ceaiului Kombucha la diferite momente timp de 21 de zile de fermentație. În timpul fermentării comunitatea drojdii a biofilmului nu a arătat o variație în timp prea mare și a fost dominată de Candida sp. (73.5-83%). Supa însă a arătat o schimbare semnificantă în dominanță din Candida sp. la Lachancea sp. În a 7-a zi de fermentație. Acesta este primul raport prezentând Candida ca gen de drojdie cu cea mai mare influență în timpul fermentației Kombucha. Specia dominantă în biofilm a fost C. Stellimalicola.

1.4.6. Alte specii de drojdii prezente in consorțiul de tip Kombucha

În continuare sunt prezentate principalele alte genuri sau specii detectate în consorțiu Kombucha. ( tabelul 1.4.3.)

Tab. 1.4.3. Alte specii de drojdii prezente in consorțiul de tip Kombucha

1.5. Activitatea antimicrobiană a speciilor microbiene detectate în consorțiul de tip Kombucha

Eficacitatea antimicrobiană a ceaiului original Kombucha a fost testată împotriva mai multor bacterii și drojdii patogene sau potențial patogene.

Kombucha s-a dovedit a exercită o activitate antimicrobiană împotriva Helicobacter pylori, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Agrobacterium tumefaciens (Greenwalt et al.., 1998; Steinkraus et al, 1996), Bacillus cereus (Greenwalt et al., 1998), Shigella sonnei, Salmonella enteritidis și Escherichia coli (Greenwalt et al., 1998; Sreeramulu et al., 2001; Steinkraus, 1996).

Activitatea antimicrobiană a ceaiului de tip Kombucha a fost investigată împotriva unui număr de mare de microorganisme patogene. Staphylococcus aureus, Shigella sonnei, Escherichia coli, Aeromonas hydrophila, Yersinia enterolitica, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Staphylococcus epidermis, Campylobacter jejuni, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Bacillus cereus, Helicobacter s-au dovedit a fi sensibile la Kombucha. In conformitate cu literatura de specialitate despre Kombucha, acidul acetic este considerat a fi responsabil pentru efectul inhibitor asupra unui număr mare de microorganisme testate. (Sreeramulu, et al., 2000)

Băutura de ceai fermentată are efect antimicrobian împotriva unui spectru larg de organisme inclusiv unele ciuperci fitopatogene ( Fusarium oxysporum, Alternaria solani, Aspergillus niger, Penicillium). ( Shehata și Lila 2005)

Dufresne și Farnworth (2000) au demonstrat că ceaiurile verzi sunt antibacteriene și au activitate împotriva bacteriilor gram-pozitive și gram-negative. Extracte de ceai inhibă agenții patogeni enterici cum ar fi Staphylococcus aureus, S. epidermis, Plesiomonas shigelloides (Toda et al., 1989), Salmonella typhi, S. tiphimurium, S. enteritidis, Shigella exneri, S. disenteriae și Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus.

Un alt studiu a raportat activitatea ceaiului de tip Kombucha asupra Helicobacter pylori, Escherichia coli, Staphylococcus aureus și Agrobacterium tumefaciens legate în principal de acidul acetic produs in timpul fermentației. (Steinkraus et al., 1996). Un studiu privind activitatea antimicrobiană a anumitor acizi organici indicată că acidul acetic poate inhiba creșterea fungilor. Extracte de ceai verde si negru utilizate în aceeași concentrație nu au prezentat niciun efect. (Dufresne și Farnworth, 2000).

Velicanski (2007) a studiat activitatea antimicrobiană a ceaiului de tip Kombucha asupra mai multor microorganisme patogene. Microorganisme de testare au fost bacterii gram negative: Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Escherichia coli, Erwinia carotovora, bacterii gram pozitive: Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Sarcina lutea, drojdii: Saccharomyces cerevisiae, Candida pseudotropicalis (izolat clinic), Rhodotorula sp. (izolat natural) și mucegaiuri: Penicillium aurantiogriseum (izolat natural), Aspergillus niger (izolat natural) și Aspergillus flavus (izolat natural). Kombucha, soluție de acid acetic și ceaiul încălzit de Kombucha are cea mai expresivă activitate antimicrobiană. Activitatea lor este similară împotriva tuturor bacteriilor, cu excepția Staphylococcus aureus. Neutralizat Kombucha (pH = 7) are efect bactericid față de Bacillus cereus și Erwinia carotovora, în timp ce împotriva Salmonella enteritidis și Proteus mirabilis are numai activitate bacteriostatică. Nici unul dintre eșantioane nu are activitate antimicrobiană împotriva Sarcina lutea. Probele nu sunt inhibitoare față de drojdii (Saccharomyces cerevisiae, Candida pseudotropicalis, Rhodotorula sp.) și mucegaiuri (Aspergillus niger și Aspergillus flavus), cu excepția Penicillium aurantiogriseum, unde s-a obținut activitatea antagonistă limită. Ceaiul nefermentat nu prezintă nicio activitate antimicrobiană împotriva microorganismelor de testare.

1.6. Aplicații practice ale produselor de tip Kombucha

Consorțiul de microorganisme dintre bacterii si tulpini de drojdii numit Kombucha conține o bacterie denumită Acetobacer xylinium care produce prin fermentare celuloza ce apare la suprafata ceaiului. Aceasta prezintă carateristici unice prin proprietățile sale și structura moleculară(Jaybalan et al., 2014). În Filipine, o celuloza asemanatoare celei produse de A. xylinium este consumata ca o delicatesa culinara. Ea apare la sucurile de fructe prin fermentarea A.xylinium-ului cu tulpini de drojdie. În Brazilia culturiile naturale de A. xilinyum produc o celuloză folosită la tratarea leziunilor cutanate și ale arsurilor(Blanc, 1996). Mai mult, celuloza rezultată din fermentarea produselor pe baza de Kombucha poate fi folosită si la preparea de chimicale pe baza de celuloză precum carboximetilceluloza sau fermentarea acesteia poate produce bioethanol. (Jaybalan et al., 2014)

Această băutură se pare că exercită o serie de efecte medicinale, de exemplu, împotriva bolilor metabolice, artritei, psoriazisului, constipație, indigestie și hipertensiune, dar nu există încă dovezi științifice solide disponibile pentru eficacitatea sa (O'Neill, 1994; Jacobs, 1995). În virtutea numeroaselor aspecte de promovare a sănătății raportate și în condiții de siguranță prepararea acestei băuturi la domiciliu, a câștigat popularitate ca și alte băuturi tradiționale.

Alte experimente au arătat că băutura Kombucha reglează flora intestinală, întărește celulele, armonizează metabolismul, acționează ca un antibiotic natural și ajută la menținerea pH-ului (Velicanski et al., 2007). Mai mult decât atât, consumată în mod regulat, ceaiul Kombucha contribuie în mod semnificativ la inhibarea creșterii în greutate și la alungirea vieții (Hartmann et al., 2000). De asemenea oțetul Kombucha se poate folosi in alimentație.

De asemenea, Murugesan (2005), Razmovski și Sciban (2008) au descoperit eficiența folosirii biomasei de ceai uscat in eliminarea poluanților metalici din apa uzată. Principala proprietate fiind abilitatea de absorbție a acestora.

Lovita et al., a demonstrat că suplimentarea cu 25% Kombucha a scăzut în mod semnificativ grăsimea și colesterolul din carnea de rață (p <0,05). Concluzia este că adăugarea ceaiului Kombucha fermentat până la 25% poate reduce nivelurile de grăsimi și colesterol din carnea produsă de păsările de curte.

De aseamenea Lintner (2006) a studiat folosirea Kombuchei și a substanțelor asemanatoare, fie independent sau in compusi pentru tratarea epidermei, în special pentru prevenirea semneleor endogene sau exogene ale îmbătrânirii.

1.7. Prezența pe piață a produselor probiotice

Probioticele sunt microorganisme prietenoase (cum ar fi bacteriile și drojdiile) care reechilibrează microflora digestivă, îmbunătățesc absorbția nutrienților, contracarează invazia bacteriană patogenă a intestinului, modulează răspunsul imun și previne sau reduce riscul tulburărilor gastrointestinale cum ar fi diareea și boala intestinului iritabil.

1.7.1. Prezența pe piață a produselor probiotice de uz uman

În ultimii ani, medicii tind să recomande administrarea de probiotice pentru profilaxia diareei asociate cu antibiotice și diareei asociate cu Clostridium difficile la pacienții tratați cu antibiotice cu spectru larg și pentru prevenirea bolilor digestive.

Consumatorii optează în special pentru produse lactate și non-lactate, băuturi, pentru a lua bacteriile benefice. Iaurturile probiotice (cu diferite culturi probiotice, cum ar fi Lactobacillus, Bifidobacterium) sunt cele mai frecvent preferate de către consummator.

1.7.2. Prezența pe piață a produselor probiotice de uz veterinary

În tractul gastrointestinal al câinilor și pisicilor se găsesc populații de bacterii probiotice predominante, de exemplu Lactobacillus acidophillus și Enterococcus faecium.

1.8. Bacterii și fungi potențial patogene

1.8.1 Genul Bacillus

Genul Bacillus cuprinde specii patogene și saprofite. Cele mai reprezentative bacterii patogene ale acestui gen sunt Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis.

Bacillus cereus este o bacterie Gram-pozitivă, mobile, aerobă sau facultative anaerobă, formatoare de spori, care este ecologic larg distribuită. Este asociat în principal cu intoxicația alimentară, dar este raportat din ce în ce mai des ca a fiind o cauză a infecțiilor non-gastrointestinale și potențial letale. B. cereus este responsabil pentru o minoritate de boli alimentare (2-5%), provocând greață, vărsături și diaree severe. Infecțiile provocate de Bacillus apar datorită supraviețuirii endosporelor bacteriene atunci când alimentele sunt gătite necorespunzător. (Turnbull PCB, 1996).

Producerea de exoenzime responsabile de degradarea țesuturilor este intim asociată cu patogenitatea B. cereus, fie intestinală sau non-intestinală. Printre aceste toxine secretate, o toxină care induce starea de vomă, sunt trei fosfolipaze distincte, patru hemolizine și protease. B. cereus are un obstacol major în evaluarea lui atunci când este izolat dintr-o probă clinică în laborator și acesta este faptul că este caracterizat sa ca și contaminant nesemnificativ.

B. cereus concurează cu alte microorganisme, cum ar fi Salmonella și Campylobacter în intestin, astfel încât prezența sa reduce numărul acestor microorganisme. La animalele de hrană cum ar fi puii, iepurii și porcii, unele tulpini inofensive ale B. cereus sunt utilizate ca aditivi pentru hrănirea animalelor pentru a reduce Salmonella în intestine și cec. Acest lucru îmbunătățește creșterea animalelor, precum și siguranța alimentară pentru oamenii care își mănâncă carnea. (Vilà, Fontgibell, et al., 2009)

Bacillus pumilus este o bacterie în formă de tijă, formatoare de spori, aeroba si Gram-pozitivă. Structura celulară a lui B. pumilus este similară cu alte specii de Bacillus cum ar fi B. subtilis, B. megaterium și B. cereus.

Infecțiile umane cu Bacillus pumilus sunt rare deoarece unele dintre ele colonizează în zona rădăcinii unor plante, iar majoritatea se gasesc in soluri.

Bacillus megaterium este o bacterie formatoare de spori Gram-pozitivă, în principal aerobă, care se găsește în habitate foarte diverse. Cu o lungime a celulei de până la 4 μm și un diametru de 1,5 μm, B. megaterium se numără printre cele mai mari bacterii cunoscute. Celulele apar adesea în perechi și lanțuri, unde celulele sunt legate între ele de polizaharide pe pereții celulari.

Bacillus licheniformis este o bacterie Gram-pozitivă, mezofilă, frecvent găsită în sol. Se găsește pe penele de păsări, în special pe piept și în spate, și cel mai adesea în păsările care locuiesc la sol (precum vrabii) și speciile acvatice (ca rațe).

1.8.2. Genul Staphylococcus

Din familia Micrococcaceae, face parte genul Staphylococcus. Staphylococcus aureus este una dintre cele mai importante specii ale genului cu importanță medical. Este un germen Gram-pozitiv, coc, sferic, imobil, aerob (însă poate rezista și în condiții de anaerobioză), în general neîncapsulat, nesporulant, dispus în grămezi, saprofit sau pathogen.

Cea mai frecventă cauză a infecțiilor stafilococice este produsă de S. aureus. Acesta este responsabil pentru diferite boli, inclusiv: boli invazive (infecții ale plagilor, bacteriemie cu complicații metastatice, osteomielită), infecții ușoare ale pielii (foliculite, impetigo etc) și toxina mediată boli (sindromul de șoc toxic sau TSS, sindromul pielii scalate, intoxicație alimentară). Infecții superficiale comune includ impetigo, foliculită, furuncule, celulită. Tulpinile patogene provoacă adesea infecțiile prin producerea de factori de virulență, cum ar fi toxinele proteice puternice, și expresia unei proteine ​​de suprafață celulară care se leagă și inactivează anticorpii.

S. aureus este o cauză principală ale infecțiilor cutanate în întreaga lume industrializată. Infecția este, în general, asociată cu rupturi ale pielii sau ale membranelor mucoaselor datorate intervențiilor chirurgicale, leziunilor sau utilizării dispozitivelor intravasculare, cum ar fi catetere, mașini de hemodializă sau medicamente injectate. Odată ce bacteriile au intrat în sânge, pot infecta diferite organe, provocând endocardită infecțioasă, artrită septică și osteomielită. (Rasmussen et al., 2011) Această boală este deosebit de răspândită și severă la cei foarte tineri și foarte bătrâni. Fără tratamentul cu antibiotice, bacteremia lui S. aureus are o rată a mortalității de aproximativ 80%. (Tong et al., 2015).  În cazul tratamentului cu antibiotice, ratele de mortalitate variază de la 15% la 50% în funcție de vârsta și starea de sănătate a pacientului, precum și de rezistența la antibiotice a tulpinii de S. aureus.

1.8.3. Genul Pseudomonas

Familia Pseudomonadaceae cuprinde genul Pseudomonas. Cuprinde specii patogene pentru om, animale și plante ce trăiesc liber in mediu. Una dintre cele mai importante specii ale genului pentru patologia umana este Pseudomonas aeruginosa.

Pseudomonas aeruginosa numit si bacilul piocianic este un bacil mobil, Gram-negativ. Este un anaerob facultativ, deoarece este bine adaptat să se prolifereze în condiții de epuizare parțială sau totală a oxigenului. Se găsește în sol, apă, flora pielii și cele mai multe medii create de om în întreaga lume. Un patogen oportunist, nosocomial al indivizilor imunosupresați, P. aeruginosa infectează în mod obișnuit căile respiratorii, tractul urinar, arsurile și rănile și cauzează, de asemenea, alte infecții ale sângelui.

1.8.4. Genul Enterobacteriaceae

O serie de specii patogene cuprinde și genul Enterobacteriaceae . Dintre care cele mai des întâlnite sunt Escherichia coli și Salmonella typhimurium. Aceste bacterii sunt bacilli Gram-negativi, oxido-negativi, scurți, mobili, nesporulate, întâlnite in tractul digestiv al animalelor, păsărilor și omului. Sunt specii rezistente în mediul extern, ce pot rezista până la 5-6 luni in apele poluate cu materii fecale. Tot mai multe tulpini au ajuns să fie rezistente la antibiotice, fapt pentru care aceastea au devenit o problema pentru sănătatea umana si animal.

Genul Escherichia, se găsește frecvent în intestinul organismelor cu sânge cald (endoterme). (Singleton P, 1999) Cele mai multe tulpini de E. coli sunt inofensive, dar unele serotipuri pot provoca intoxicații alimentare grave. (Vogt, Dippold, 2005) Tulpinile inofensive fac parte din flora normală a intestinului și preven colonizarea intestinului cu bacterii patogene. (Hudault, et al. 2001) E. coli este expulzată în mediul înconjurător în materiile fecale. Bacteria crește masiv în materie fecală proaspătă în condiții aerobe timp de 3 zile, dar numărul acesteia scade încet după aceea. (Russell, Jarvis, 2001) Tulpinile virulente pot provoca gastroenterită, infecții ale tractului urinar, meningită neonatală, colită hemoragică și boala Crohn. Semnele și simptomele frecvente includ crampe abdominale severe, diaree, colită hemoragică, vărsături și, uneori, febră. În cazuri mai rare, tulpinile virulente sunt, de asemenea, responsabile pentru necroza intestinală (moartea țesutului) și perforația, fără a progresa la sindrom hemolitic-uremic, peritonită, mastită, septicemie și pneumonie gram-negativă. Copiii foarte mici sunt mai susceptibili să dezvolte boli grave, cum ar fi sindromul hemolitic uremic, cu toate acestea, indivizii sănătoși de toate vârstele sunt expuși riscului pentru consecințele grave care pot apărea ca rezultat al infectării cu E. Coli.

Salmonella typhimurium este o bacterie patogenă, răspunzătoare de majoritatea toxi-infecțiilor alimentare. Omul este contaminat prin ingerarea acesteia din apă sau mâncare infectată. Această bacterie intestinală cauzează boli infecțioase cum ar fi paratifosul și febra tifoidă. Este Gram-negativă, predominant găsită în lumenul intestinal, iar toxicitatea sa se datorează unei membrane exterioare constând în mare parte din lipopolizaharide (LPS), care protejează bacteriile din mediu. Tuin et al. (2006) au arătat că LPS este format dintr-un O-antigen, lipidul A și un miez polizaharid, care se conectează la membrana exterioară. Lipidul A este alcătuit din două glucosamine fosforilate care sunt atașate de acizi grași. Toxicitatea bacteriană este determinată de aceste grupări fosfat. Enzima care elimină în mod specific aceste grupări fosfat, în încercarea de a se proteja de acești agenți patogeni este transportată de animale. S. typhimurium provoacă la șoareci simptome asemănătoare cu febra tifoidă la om. Studierea acestor bacterii la șoareci ar putea duce în cele din urmă la un vaccine antitifoidal (Miao et al., 1995).

1.8.5. Genul Candida

Cel mai important gen dintre fungii patogeni este genul Candida fiind responsabil de infecțiile fungice la om (Manolakaki et al., 2010). Multe specii sunt comensale inofensive și simbiotice în diferite gazde, inclusiv la om. Totuși, atunci când barierele mucoasei sunt întrerupte sau sistemul imunitar este compromis, ele pot invada și cauza boală (Kourkoumpetis et al, 2011). Candida albicans este cea mai des întâlnită specie și poate provoca infecții (candidoză sau aftere) la om și la alte animale. În vinificație, unele specii de Candida pot strica vinurile. Multe specii se găsesc în flora intestinală, incluzând C. albicans în gazdele de mamifere, în timp ce altele trăiesc simbiotic în gazdele de insecte ( Spanakis, et al, 2010). Infecțiile sistemice ale fluxului sanguin și ale organelor majore (candidemia sau candidoza invazivă), în special la pacienții imunocompromiși, afectează peste 90.000 de oameni pe an în S.U.A ( Enfert și Hube, 2007).

Antibioticele promovează infecțiile cu fungi, incluzând supraaglomerarea gastrointestinală a Candidei și penetrarea mucoasei gastrointestinale (Kennedy, et al., 1987). În timp ce femeile sunt mai susceptibile la infecții cu drojdie genitală, bărbații pot fi, de asemenea, infectați. Anumiți factori, cum ar fi utilizarea prelungită a antibioticelor, cresc riscul atât pentru bărbați, cât și pentru femei.

Candida albicans este un tip de drojdie care este utilizat în mod obișnuit ca organism de model pentru biologie. Este în general menționată ca o ciupercă dimorfică, deoarece crește atât ca drojdie, cât și ca celule filamentoase. Este un membru obișnuit al florei intestinale umane (Odds, 1988). Este detectabil în tractul gastrointestinal și în gură în 40-60% dintre adulții sănătoși ( Kerawala, et al., 2010). Este, de obicei, un organism comensal, dar poate deveni patogen la indivizii imunocompromiși în diferite condiții (Erdogan și Rao, 2015). Este una dintre puținele specii din genul Candida care provoacă candidoza la om. Suprafața fungului are ca rezultat candidoza. C. albicans, împreună cu C. tropicalis, C. parapsilosis și C. glabrata, este responsabil pentru 50-90% din toate cazurile de candidoză la om (Pfaller și Diekema, 2007). O rată a mortalității până la 40% a fost găsită atunci când pacienții au candidoză sistemică. Persoanele cu risc sporit sunt pacienți care au suferit recent o intervenție chirurgicală, un transplant sau sunt în unitățile de terapie intensivă (Brosnahan și Mandy, 2013). Infecțiile cu Candida albicans sunt sursa principală de infecții fungice la pacienții bolnavi critic (Sydnor, Emily, 2011). Acești pacienți dezvoltă predominant candidoză orofaringiană sau candidoză, care poate duce la malnutriție și poate interfera cu absorbția medicamentelor. Metodele de transmitere includ mamă la sugari prin naștere, infecții de la om la om, care apar cel mai frecvent în spitalele în care pacienții cu imunitate scăzută achiziționează drojdia de la personalul medical și au o rată de incidență de 40%. Părți ale corpului care sunt frecvent infectate includ pielea, organele genitale, gâtul, gura și sângele.

Candida parapsilosis este o altă specie fungică care provoacă infecții ale plăgilor și țesuturilor la pacienții cu imunitate compromisă. Aceasta a fost izolată din surse cum ar fi animale domestice, insecte sau sol. Candida parapsilosis nu este un agent patogen uman obligatoriu, dar este de asemenea și un comensal normal al omului și este una dintre cele mai frecvente ciuperci izolate de pe mâini. Există mai mulți factori de risc care pot ajuta colonizarea acestui fung la gazda umană. Persoanele imunitatea compromisă și pacienții care au suferit intervenții chirurgicale ale tractului gastro-intestinal, prezintă un risc crescut de infecție cu Candida parapsilosis. În prezent, nu există un consens privind tratamentul candidozei invazive provocată de acest fung, deși abordarea terapeutică include în mod obișnuit extracția oricărui corp străin detașabil și administrarea unui antifungic sistemic. Din punct de vedere istoric, amfotericina B a fost cea mai frecvent antifungic utilizat. Fluconazolul este o alternativă administrată frecvent la Amfotericin B ( Trofa, David; et al., 2008).

Pichia guilliermondii este o specie de drojdii din genul Pichia, a căror formă asexuată sau anamorfă este cunoscută sub numele de Candida guilliermondii. Candida guilliermondii a fost izolată de numeroase infecții umane, majoritatea de origine cutanată, numai de la pacienți imunodeprimați. C. Guilliermondii a fost, de asemenea, izolat din pielea normală și din apa de mare, fecalele animalelor, piele, pește și bere.

Candida krusei este un agent patogen nosocomial care apare în primul rând la pacienții cu iminutate scăzută și cei cu tumori maligne hematologice. Are rezistență naturală la fluconazol, un agent antifungic standard. Cel mai frecvent se întâlnește la pacienții care au prezentat anterior o expunere la fluconazol, declanșând dezbateri și dovezi contradictorii cu privire la faptul dacă fluconazolul trebuie utilizat profilactic. Mortalitatea datorată fungemiei C. krusei este mult mai mare decât cea mai frecventă C. albicans. Alte specii de Candida care se potrivesc de asemenea acestui profil sunt C. parapsilosis, C. glabrata, C. tropicalis, C. guillermondii și C. rugosa ( Mastromarino, Paola; et al., 2013).

CAPITOLUL II – PARTE EXPERIMENTALĂ

2.1. Materiale și metode

2.1.1. Materiale necesare pregatirii Ceaiului Kombucha

Materiale utilizate: fierbător de apă, borcane sterilizate, tifon, sfoară, pipetă, vârfuri sterilizate, balanță electronică și lingură.

Substrat: Formosa Oolong (Fig. 2.1A); ceai Earl Grey Jasmine „Twings” (Fig.2.1.B); ceai verde „Celmar” (Fig.2.1C); ceai Chimion „ProNatura” (Figura 2.1E ); ceai English Breakfast „365”; ceai de Roiniță „Stefmar”; ceai verde „Parapharm”; ceai Rosehip „Sir Edward Tea”; comprimate Grapefruit Seeds „ProNatura” (Fig.2.1F)

În plus a mai fost utilizat zahăr commercial Coronița (Fig.2.1D)

A BC

D E F

Figura 2.1.1 Substraturi utilizate în acest studiu

(Sursa: (A) http://www.ctscorner.ro/images/categories/categorie%20ceai%20oolong.jpg

(B) http://www.emag.ro/supermarket/ceai-earl-grey-si-iasomie-25-plicuri-25x2g-twinings-93083/pd/DFTP1BBBM/#supermarket-delivery

(C) http://fl12.shopmania.org/files/p/ro/t/064/ceai-verde-celmar-20dz~157312064.jpg

(D) https://www.cora.ro/coronita-zahar-1kg-P-2116810

(E) http://www.pronaturastore.ro/ceai-chimion-x-20-de-doze

(F) http://www.pronaturastore.ro/grapefruit-seeds-x-150-comprimate?search=grapefruit )

Material biologic: 2 tipuri de cultură Kombucha: cultură Kombucha de laborator (K1) și o cultură Kombucha (K), procurată de la compania Laboratoarele Medica, Otopeni. Culturile Kombucha au fost menținute inițial în condiții optime de dezvoltare: la temperatura de 25±3℃, ferită de acțiunea directă a razelor solare, acoperită cu tifon pentru a permite circularea aerului dar și prevenirea contaminărilor.

2.1.2 Pregătirea substratului

Inițial au fost propuse mai multe variante de lucru, constând în testarea a 11 substraturi

Tab.2.1.1. Probe de ceai cu consorțiul Kombucha luate în analiză

Au fost pregătite 3 borcane de 1500 mL, în prealabil sterilizate prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute. Pentru fiecare substrat s-a fiert 1000 ml de apă, iar apoi apa a fost introdusă într-un borcan sterilizat.

Pentru obținerea extractului crud de Kombucha au fost testate 7 substraturi în experimente independente:

6 g ceai English Breakfast „365” + 90 g zahăr;

9 g ceai de Roiniță „Stefmar” + 180 g zahăr;

8 g ceai de Roiniță „Stefmar” + 4 g ceai verde Parapharm + 180 g zahăr;

4 g ceai Farmosa Oolang + 90 g zahăr;

5 g ceai Farmosa Oolang + 5,58 g comprimate Grapefruit Seeds „Pronatura” + 90 g zahăr;

6 g ceai English Breakfast „365” + 4 g ceai Rosehip „Sir Edward Tea” + 90 g zahăr;

6 g ceai Earl Grey jasmine „Twings” +1,5 g ceai Chimion „Pronatura” + 90 g zahăr.

Apa fierbinte a fost infuzată cu unul din substraturile prezentate mai sus. În plus, s-a dizolvat zahărul în ceaiul infuzat. La 15 minute de la infuzare, a fost îndepărtat substratul, iar ceaiul îndulcit a fost lăsat să se răcească până la o temperatură de aproximativ 25℃.

2.1.3. Inocularea cu Kombucha

Odată atinsă această temperatură, s-a realizat inocularea ceaiului cu consorțiu Kombucha (procurată de la compania Laboratoarele Medica, Otopeni), în preajma becului de gaz. Utilizând pipeta și vârfuri sterilizate, au fost adăugați 100 ml de cultură Kombucha, iar circa 30 g de celuloză bacteriană au fost preluate în condiții aseptice din membrana formată la suprafața culturii anterioare, fără a permite ca membrana să ia contact cu obiecte metalice.

În momentul în care primul preparat a fost pregătit pentru procesul de fermentație, gura borcanului a fost acoperită cu tifon pentru a împiedica accesul Drosophilei Melanogaster, dar și al altor posibili contaminanți și în același timp pentru a permite schimbul de gaze și apoi tifonul a fost prins bine cu o sfoară.

Perioada de fermentație a fost de 17 zile la temperatura camerei, ferită de acțiunea directă a razelor solare.

Ceaiurile cu cultura de Kombucha au fost notate in funcție de ceaiul, tipul de Kombucha și apa folosită conform tabelurilor 2.1.1. și 2.1.3.

2.1.4. Microorganisme testate

Nouă tulpini bacteriene potențial patogene și patru tulpini fungice au fost utilizate în acest studiu (tabelul 2.1.2).

Tabelul 2.1.2. Caracterizarea microorganismelor testate

Pentru testarea activității antimicrobiene a ceaiului de tip Kombucha față de aceste tulpini s-au preparat culturi proaspete prin inoculare pe medii lichide, sterile. Inocularea s-a realizat în baloane Erlenmayer, conținând 10 ml mediu; temperatura de 37˚C pentru tulpinile bacteriene și 30˚C pentru fungi; timpul de incubare în vederea dezvoltării a fost de 24-48 ore.

2.1.5. Medii de cultură

Pentru determinarea activității antimicrobiene a ceaiurilor de tip Kombucha luate în analiză, mediile de cultură utilizate sunt prezentate mai jos:

Mediile au fost cântarite, dizolvate in apă distilată și sterilizate in autoclav la temperatura de 121°C, timp de 20 minute. După sterilizare, mediile de cultură au fost repartizate în plăci Petri (aproximativ 6-8 ml/placă) in mediu steril din hota cu flux laminar.

2.1.6. Determinarea activității antimicrobiene a extractului crud de tip Kombucha

Metoda utilizată a fost metoda antibiogramei (rondelelor). Experimentele realizate au cuprins mai multe etape:

însămanțarea microorganismului față de care se testează activitatea antimicrobiană pe medii de cultură adecvate prin metoda etalarii prin inundare, sterile, respectiv 1 ml suspensie repartizate în plăci Petri;

centrifugarea extractelor crude de tip Kombucha

filtrarea extractelor prin filtre milipore sterile, pentru îndepărtarea eventualei contaminări microbiene a acestora;

depunerea rondelelor pe plăcile cu microorganismele însămânțate

impregnarea rondelelor cu 10µl extractul filtrat ;

incubarea la temperatură optimă de dezvoltare a microorganismelor luate în lucru (28˚C pentru drojdii și mucegaiuri, 37˚C pentru bacterii), timp de 24-48 ore;

toate experimentele au fost efectuate în duplicat.

Activitatea antimicrobiană a fost evaluată în funcție de apariția sau nu a haloului în jurul rondelei impregnate cu extract, prin măsurarea dimensiunii acesteia, pe două axe, raportându-se media acestora.

Fig. 2.1.4 Aspecte din perioada testării în laborator a activității antimicrobiene

2.1.7. Liofilizarea extractelor de tip Kombucha

Un alt experiment a constat în liofilizarea a trei extracte de tip Kombucha în vederea concentrării acestora pentru a crește activitatea antimicrobiană ( Tab. 2.1.3)

Tab.2.1.3. Extract crud de tip Kombucha luate în analiză

* cultură Kombucha, procurată de la compania Laboratoarele Medica, Otopeni

**cultură Kombucha de laborator

Conservarea de lungă durată prin liofilizare reprezintă o metodă larg răspândită în practica microbiologică.

Liofilizarea este un proces de desicație sub vid, dar la temperatură scăzută și se realizează într-un aparat special numit liofilizator.

Aparat de liofilizare utilizat: Liofilizator Labconco (freeze dryer) de capacitate 6 l. Presiunea de 0,04 mbar; temperatura între – 60 și – 700C, timp de 6 ore.

Varianta de liofilizare a extractului crud de tip Kombucha:

s-au centrifugat 5 ml din fiecare cultură de ceai;

biomasa rezultată , s-a transferat steril în fiole de sterilizare de 100 ml și s-au introdus în aparatul de liofilizare;

s-au ținut in liofilizator la temperatură între – 60 și – 700C, timp de 6 ore;

După liofilizare s-au resuspendat in 0,5 ml apă distilată;

Activitatea antimicrobiană extractelor de tip Kombucha înainte și după liofilizare a fost evaluată după metoda descrisă mai sus.

Fig. 2.1.5 Aspecte din perioada testării în laborator a activității antimicrobiene

CAPITOLUL III – REZULTATE ȘI DISCUȚIE

Experimentele efectuate au avut ca scop determinarea activității antagoniste a consorțiului de tip Kombucha în vederea obținerii unui produs de uz veterinar.

3.1 Determinarea activității antimicrobiene a ceaiului cu Kombucha asupra bacteriilor Gram pozitive si Gram negative

Pentru evaluarea activității antimicrobiene a ceaiului cu consorțiul microbian Kombucha au fost utilizate cinci tulpini Gram pozitive (Bacillus spp. si S. auresus) (tabelul 3.1.1).

În vederea determinării activității antimicrobiene asupra bacteriilor Gram-negative au fost utilizate 3 tulpini potențial patogene: Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa și Escherichia coli (tabelul 3.1.1).

Tabelul 3.1.1 Evaluarea activității antimicrobiene a ceaiului cu consortiul microbian Kombucha asupra bacteriilor Gram- pozitive si Gram-negative

Legendă: – = lipsa haloului; activitate inhibitoare inexistenă;

+ = activitate inhibitoare intre 1-3 mm;

++ = activitate inhibitoare > 3 mm

+++ = activitate inhibitoare > 6 mm

Pentru obținerea unor rezultate cât mai bune, fiecare proba a fost lucrată in duplicat. In paralel s-a folosit ca martor negativ ceai simplu negru si verde fara consorțiul de tip Kombucha.

Probele de ceai au fost in numar de 7 si denumite astfel: V1, V3, V4, KO, KO1, KN, KN1.

a b

Fig. 3.1.1 Evaluarea activității antimicrobiene asupra Bacillus cereus ;

a b

Fig 3.1.2 Evaluarea activității antimicrobiene asupra Bacillus licheniformis ;

a b

Fig 3.1.3 Evaluarea activității antimicrobiene asupra Bacillus pumilus ;

a b

Fig. 3.1.4 Evaluarea activității antimicrobiene asupra Bacillus megaterium ;

a b

Fig 3.1.5 Evaluarea activității antimicrobiene asupra E.coli ;

a b

Fig 3.1.6 Evaluarea activității antimicrobiene asupra S. tiphymurium ;

a b

Fig. 3.1.7 Evaluarea activității antimicrobiene asupra Pseudomonas aeruginosa

Conform tabelului 3.1.1 s-a observat că proba V4 a manifestat activitate inhibitorie asupra tuturor tulpinilor bacteriene. S-a observat apariția în cazul acestei probe a unor halouri clare, de dimensiuni medii.

Proba KN1 nu a manifestat activitate antimicrobiană asupra bacteriilor Gram-negative si Gram-pozitive, cu excepția unei activități de mici dimensiuni asupra Bacillus licheniformis. Din tabel 3.1.1 s-a putut observa faptul că proba V1 are activitate antagonistă asupra tuturor bacteriilor Gram-pozitive, dar nu și asupra celor Gram-negative.

De asemenea proba KO prezintă activitate inhibitorie asupra tuturor speciilor testate cu excepția Bacillus pumilus si Escherichia coli.

Tot din tabelul 3.1.1 s-a observat că specia de Bacillus licheniformis este inhibat de toate probele de tip Kombucha, cea mai mare zonă de inhibiție având-o proba KN.

Staphylococcus aureus bacterie Gram pozitivă prezinta rezistență asupra tuturor probelor de ceai filtrat de tip Kombucha, la fel si Pseudomonas aeruginosa bacterie Gram negativă.

Toate probele au fost lucrate în duplicat.

Martorul negativ din ceai simplu negru și verde nu are activitate antagonistă asupra nici unui microorganism testat.

3.2 Determinarea activității antimicrobiene a ceaiului filtrat asupra fungilor

Pentru această categorie, în vederea determinării activității antimicrobiene asupra fungilor s-au teastat trei tulpini de Candida spp.

Cele 7 probe de ceai filtrate si denumite astefel: V1, V3, V4, KO, KO1, KN, KN1 au fost testate asupra C. albicans, C. parapsilosis si C.guillermondi conform tabelului 3.2.1.

Tabelul 3.2.1 Evaluarea activității antimicrobiene a ceaiului cu consortiul microbian Kombucha asupra fungilor

Determinarea zonei de inhibitie

Legendă: – = lipsa haloului; activitate inhibitoare inexistenă;

+ = activitate inhibitoare;

Conform rezultatelor prezentate în tabelul 3.2.1 s-a observat că față de speciile de fungi patogene testate, filtratele de ceai Kombucha nu au o activitate antifungică.

Fig 3.2.1 Evaluarea activității antimicrobiene asupra C. albicans

3.3 Determinarea activității antimicrobiene a ceaiului liofilizat asupra bacteriilor Gram-pozitive si Gram-negative

Pentru evaluarea activității antimicrobiene a ceaiului liofilizat cu consorțiul microbian Kombucha au fost utilizate 3 tulpini Gram-pozitive si 3 tulpini Gram-negative. (tabelul 3.2.1).

Au fost liofilizate 3 probe de ceai, numite KMN(Ni), KI, KMV(Vi), iar testarea s-a facut atât asupra liofilizatelor resupendate in apă distilată cât și asupra filtratelor inițiale înainte de liofilizare pentru a se observa în ce formă a ceaiului cu Kombucha activitatea antimicrobiana este mai mare.

Tabelul 3.3.1 Evaluarea activității antimicrobiene a ceaiului liofilizat cu consorțiul microbian Kombucha asupra bacteriilor Gram pozitive si Gram-negative

Legendă: – = lipsa haloului; activitate inhibitoare inexistenă;

+ = activitate inhibitoare intre 1-3 mm;

++ = activitate inhibitoare > 3 mm

+++ = activitate inhibitoare > 6 mm

L1 = Liofilizat KMN

F1 = Filtrat KMN

L2 = Liofilizat KI

F2 = Filtrat KI

L 3 = Liofilizat KMV

F 3= Filtrat KMV

Fig 3.3.1 Evaluarea activității antimicrobiene asupra a. Bacillus megaterium, b.Bacillus pumilus, c. Enterococcus faecalis, d. E. coli, e. S. tiphymurium, f. P. aerugionasa.

Toate probele au fost facute in duplicat pentru un rezultat cât mai clar.

Din tabelul 3.2.1 se poate observa ca toate probele liofilizate de ceai și resupendate în apă distilată au activitate antibacteriană semnificativă asupra tuturor tulpinilor bacteriene, atât cele Gram-pozitive, cât și cele Gram-negative. Cea mai puternică activitate antibacteriană au manifestat-o față de bacteriile Gram-negative.

Probele liofilizate L2 și L3 au cea mai puternică activitate antagonistă asupra tuturor microorganismelor patogene testate.

Din aceste rezultate reiese faptul că liofilizarea probelor de ceai ofera o activitate inhibitorie mult mai ridicată decât cea a ceaiului simplu filtrat.

3.4 Determinarea activității antimicrobiene a ceaiului liofilizat asupra fungilor

Pentru evaluarea activității antimicrobiene a ceaiului liofilizat cu consorțiul microbian Kombucha asupra fungilor au fost utilizate 4 tulpini de tulpini de Candida sp, conform tabelului 3.4.1.

Conform rezultatelor prezentate în tabelul 3.4.1 se poate observa că liofilizatul ceaiului nu are activitate antifungică asupra speciilor de Candida spp. cu excepția C. parapsilosis unde prezinta o activitate foarte mică, spre deosebire de cea antibacteriană.

Tabelul 3.4.1 Evaluarea activității antimicrobiene a ceaiului liofilizat cu consortiul microbian Kombucha asupra

Legendă: – = lipsa haloului; activitate inhibitoare inexistenă;

+ = activitate inhibitoare;

a b

Fig 3.4.1 Evaluarea activității antimicrobiene asupra a. C.krusei, b. C. parapsilosis.

CONCLUZII ȘI PERSPECTIVE

Ceaiurile cu consorțiul de tip Kombucha liofilizate au activitate antibacteriană mai ridicata decat ceaiurile normale

Activitatea antibacteriană a fost mai ridicată când s-a folosit ceai verde ca mediu de creștere a consorțiului

Asupra speciilor de Candida nu s-a observat acitivitate antifungică, cu excepția unei activități antifungice sclabă asupra C. parapsilosis

Cercetări ulterioare pot duce la obținerea unui preparat nou antibacterian

BIBLIOGRAFIE

Björkroth, J., and W. Holzapfel. 2006. Genera Leuconostoc, Oenococcus and Weissella, p.267 -319. In M. Dworkin (ed.), The prokaryotes: a handbook on the biology of bacteria: Firmicutes, Cyanobacteria, vol. 4, 3rd ed. Springer-Verlag, New York, NY.

Boekhout, T. and Phaff, H.J., 2003. Yeast biodiversity. In: In: Boekhout, T. and Robert, V. (Eds), Yeasts in food – Beneficial and detrimental aspects. Woodhead Publishing Ltd. and CRC Press, Hamburg, pp. 1-38.

Brosnahan, Mandy (July 22, 2013). "Candida Albicans". MicrobeWiki. Kenyon College.

Calderone A, Clancy CJ, eds. (2012). Candida and Candidiasis (2nd ed.). ASM Press. ISBN 978-1-55581-539-4.

Chakravorty, S., Bhattacharya, S., Chatzinotas, A., Chakraborty, W., Bhattacharya, D., Gachhui, R. (2016). Kombucha tea fermentation: Microbial and biochemical dynamics, International Journal of Food Microbiology ,220 63-72 ;

Chen, C., Liu, B.Y., (2000). Changes in major components of tea fungus metabolites during prolonged fermentation, J. Appl. Microbiol. 89, 834-839 ;

Cheung, Y.F., Fung, C., and Walsh, C. "Stereochemistry of propionyl-coenzyme A and pyruvate carboxylations catalyzed by transcarboxylase." 1975. Biochemistry 14(13), pg 2981

Cleenwerck I; Vandemeulebroecke D; Janssens D; Swings J (2002). "Re-examination of the genus Acetobacter, with descriptions of Acetobacter cerevisiae sp. nov. and Acetobacter malorum sp. nov.". International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 52: 1551–1558

Dufresne, C.; Farnworth, E. (2000). "Tea, Kombucha, and health: a review". Food Research International. 33 (6): 409–421.

Enfert C, Hube B (editors) (2007). Candida: Comparative and Functional Genomics. Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-13-4.

Erdogan A, Rao SS (April 2015). "Small intestinal fungal overgrowth". Curr Gastroenterol Rep. 17 (4): 16.

Erickson, J.P., McKenna, D.N., 1999. Zygosaccharomyces. In: Robinson, R.K., Batt, C.A., Patel, P.D. (Eds.), Encyclopedia of Food Microbiology, vol. 3. Academic Press, London, pp. 2359-2365

Farnworth, Edward R (4 April 2005). "Kefir-a complex probiotic" (PDF). Food Science and Technology Bulletin: Functional Foods. 2 (1): 1–17.

Ford, Alexander C; Quigley, Eamonn M M; Lacy, Brian E; Lembo, Anthony J; Saito, Yuri A; Schiller, Lawrence R; Soffer, Edy E; Spiegel, Brennan M R; Moayyedi, Paul (2014). "Efficacy of Prebiotics, Probiotics, and Synbiotics in Irritable Bowel Syndrome and Chronic Idiopathic Constipation: Systematic Review and Meta-analysis". The American Journal of Gastroenterology. 109 (10):1547–1561.

Ghouri YA, Richards DM, Rahimi EF, Krill JT, Jelinek KA, DuPont AW (Dec 9, 2014). "Systematic review of randomized controlled trials of probiotics, prebiotics, and synbiotics in inflammatory bowel disease". Clin Exp Gastroenterol (Review). 7: 473–87.

Greenwalt, C. J., Ledford, R. A., & Steinkraus, K. H. (1998). Determination and characterization of the antimicrobial activity of the fermented tea kombucha. LWT – Food Science and Technology, 31, 291-296.

Hartmann, A. M., Burleson, L. E., Holmes, A. K., & Geist, C. R. (2000). Effects of chronic kombucha ingestion on open-field behaviors, longevity, appetitive behaviors, and organs in C57-BL/6 mice: a pilot study. Nutrition, 16, 755-761.

Houda Battikh, Amina Bakhrouf , Emna Ammarb, (2012). Antimicrobial effect of Kombucha analogues, LWT – Food Science and Technology 47 (2012) 71-77

Hudault S, Guignot J, Servin AL (Jul 2001). "Escherichia coli strains colonising the gastrointestinal tract protect germfree mice against Salmonella typhimurium infection". Gut. 49 (1):4755.

Jayabalan, R., Marimuthu, S., Swaminathan, K. (2007). Changes in content of organic acids and tea polyphenols during kombucha tea fermentation. Food Chem., 102(1): 392–398;

Jayabalan, R., Marimuthu, S., Thangaraj, P., Sathishkumar, M., Binupriya, R.A., Swaminathan, K., And Yun, E.S. (2008). Preservation of Kombucha Teas-Effect of Temperature on Tea Components and Free Radical Scavenging Properties, J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 9064–9071 ;

Jayabalan, R., Radomir, Malbaša, V., Lončar, S.V., Vitas, S.J., Sathishkumar, M. (2014). A Review on Kombucha Tea—Microbiology, Composition, Fermentation, Beneficial Effects, Toxicity, and Tea Fungus, Volume 13,Issue 4, Pages 538-550 ;

Kerawala C, Newlands C, eds. (2010). Oral and maxillofacial surgery. Oxford: Oxford University Press. pp. 446, 447. ISBN 978-0-19-920483-0

Kiatpapan P., Murooka Y. Genetic manipulation system in propionibacteria. Journal of Bioscience and Bioengineering. 93 (1) (pp 1-8), 2002

Kourkoumpetis, Themistoklis K., et al. "The effect of cumulative length of hospital stay on the antifungal resistance of Candida strains isolated from critically ill surgical patients." Mycopathologia 171.2 (2011): 85-91

Kumamoto CA (2002). "Candida biofilms". Current Opinion in Microbiology. 5 (6): 608–11.

Landry, C.R., Townsend, J.P., Hartl, D.L. and Cavalieri, D. "Ecological and evolutionary genomics of Saccharomyces cerevisiae". Molecular Ecology. 2006. Volume 15. p. 575–591.

Lin; et al. (2011). "The evolution of aerobic fermentation in Schizosaccharomyces pombe was associated with regulatory reprogramming but not nucleosome reorganization". Mol Biol Evol. 28 (4): 1407–13

Lovita Adriani, Heni Siti Mainah, Nova Marbun; „The effect of suplementation fermented kombucha tea on fat and cholesterol levels of duck meat”. Lucrări Științifice – vol. 55, Seria Zootehnie

Makarova, K.; Slesarev, A.; Wolf, Y.; Sorokin, A.; Mirkin, B.; Koonin, E.; Pavlov, A.; Pavlova, N.; et al. (October 2006). "Comparative genomics of the lactic acid bacteria". Proc Natl Acad Sci USA. 103 (42):156116.

Manolakaki, D.; Velmahos, G.; Kourkoumpetis, T.; Chang, Y.; Alam, H. B.; De Moya, M. M.; Mylonakis, E. (2010). "Candida infection and colonization among trauma patients". Virulence. 1 (5): 367–375.

Markov, S., Cvetković, D., Bukvić, B. (2006). Use of tea fungus isolate as starter culture for obtaining of Kombucha, Annals Of The Faculty Of Engineering Hunedoara 2006, Tome IV, Fascicole 3, (ISSN 1584 – 2673);

Marsh, J.A., O`Sullivan, O., Hill, C., Ross, R.P., Cotter, P.D. (2013). Sequence-based analysis of the bacterial and fungal compositions of multiple kombucha tea (tea fungus) samples, Food Microbiology 38 171-178

Martini, A. "Origin and Domestication of the Wine Yeast Saccharomyces cerevisiae". Journal of Wine Research. 1993. Volume 4. p. 165-176

Mastromarino, Paola; Vitali, Beatrice; Mosca, Luciana (2013). "Bacterial vaginosis: a review on clinical trials with probiotics" (PDF). New Microbiologica. 36: 229–238.

Mayo, Baltasar; van Sinderen, Douwe, eds. (2010). Bifidobacteria: Genomics and Molecular Aspects. Caister Academic Press.

Merico, A., Capitanio, D., Vigentini, I., Ranzi, B.M., Compagno, C., 2003. Aerobic sugar metabolism in the spoilage yeast Zygosaccharomyces bailii. FEMS Yeast Research 4, 277-283.

Murugesan GS, Sathishkumar M, Swaminathan K., 2005. Supplementation of waste tea fungal biomass as a dietary ingredient for broiler chicks. Biores Technol 96:1743-8

Nguyen NH, Suh SO, Blackwell M (2007). "Five novel Candida species in insect-associatedyeast clades isolated from Neuroptera and other insects". Mycologia. 99 (6):842858.

Odds, F.C. (1988). Candida and Candidosis: A Review and Bibliography (2nd ed.). London ; Philadelphia: Bailliere Tindall. ISBN 978-0702012655.

Rasmussen RV; Fowler VG; Skov R; Bruun NE (January 2011). "Future challenges and treatment of Staphylococcus aureus bacteremia with emphasis on MRSA". Future Microbiology. 6 (1):4356.

Russell JB, Jarvis GN (2001). "Practical mechanisms for interrupting the oral-fecal lifecycle of Escherichia coli". Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 3 (2): 265–72.

Singleton P (1999). Bacteria in Biology, Biotechnology and Medicine (5th ed.). Wiley. pp. 444–454. ISBN 0-471-98880-4.

Schell, Mark A.; Karmirantzou, Maria; Snel, Berend; Vilanova, David; Berger, Bernard; Pessi, Gabriella; Zwahlen, Marie-Camille; Desiere, Frank; et al. (2002). "The genome sequence of Bifidobacterium longum reflects its adaptation to the human gastrointestinal tract". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22): 14422–7.

Seto, A., Saito, Y., Matsushige, M., Kobayashi, H., Sasaki, Y., Tonouchi, N., Tsuchida, T.,Yoshinaga, F., Ueda, K., Beppu, T., 2006. Effective cellulose production by a coculture of Gluconacetobacter xylinus and Lactobacillus mali. Appl. Microbiol. Biotechnol. 73, 915-921.

Schleifer KH, Kraus J, Dvorak C, Kilpper-Balz R, Collins MD, Fischer W (1985). "Transfer of Streptococcus lactis and related streptococci to the genus Lactococcus gen. nov". Syst. Appl. Microbiol. 6: 183–195.

Sherman, F. "Getting Started with Yeast". Methods Enzymology. 2002. Volume 350. p. 3-41

Sreeramulu, G., Zhu, Y., & Knol, W. (2000). Kombucha fermentation and its antimicrobial activity. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48(6), 2589e2594

Spanakis, Elias K., et al. "Statin Therapy and Decreased Incidence of Positive Candida Cultures Among Patients With Type 2 Diabetes Mellitus Undergoing Gastrointestinal Surgery." Mayo Clinic Proceedings. Vol. 85. No. 12. Elsevier, 2010.

Steinkraus, K. H. (1996). Handbook of Indigenous fermented foods (2nd ed.). New York: Marcel Dekker

Suh SO, Nguyen NH, Blackwell M (2008). "Yeasts isolated from plant-associated beetles and other insects: seven novel Candida species near Candida albicans". FEMS Yeast Res. 8 (1): 88–102.

Sutton, B.C., 1999. Overview of classification of the fungi. In: Robinson, R.K., Batt, C.A., Patel, P.D. (Eds.), Encyclopedia of Food Microbiology, vol. 2. Academic Press, London, pp. 860-871.

Sydnor, Emily (24 January 2011). "Hospital Epidemiology and Infection Control in Acute-Care Settings". Clinical Microbiology Reviews. 24 (1): 141–173.

Thomas, D.S., Davenport, R.R., 1985. Zygosaccharomyces bailii – a profile of characteristics and spoilage activities. Food Microbiology 2, 157-169.

Tong SY; Davis JS; Eichenberger E; Holland TL; Fowler VG (July 2015). "Staphylococcus aureus infections: epidemiology, pathophysiology, clinical manifestations, and management". Clinical Microbiology Reviews. 28 (3): 603–661.

Trofa, David; Gácser, Attila; Nosanchuk, Joshua D. (2008-10-01). "Candida parapsilosis, an emerging fungal pathogen". Clinical Microbiology Reviews. 21 (4): 606–625.

Trovatti, E., Serafim, L.S., Freire, C.S.R., Silvestre, A.J.D., Neto, C.P (2011) Gluconacetobacter sacchari: an efficient bacterial cellulose cell-factory, Carbohydr. Polym. 86, 1417-1420 ;

Velićanski, S.A., Cvetković, D., Markov, L.S., Tumbas and Savatovic, S.M. (2007). Antimicrobial and Antioxidant Activity of Lemon Balm Kombucha. Original scientific paper, APTEFF, 38, 1-190 (2007)

Velićanski, S.A., Cvetković, D., Markov, L.S., Tumbas, T.V., Šaponjac, and Vulić, J.J. (2014). Antioxidant and Antibacterial Activity of the Beverage Obtained by Fermentation of Sweetened Lemon Balm (Melissa officinalis L.) Tea with Symbiotic Consortium of Bacteria and Yeasts. Food Technol Biotechnol.2014 Dec ; 52(4): 420-429;

Vilà, B.; Fontgibell, A.; Badiola, I.; Esteve-Garcia, E.; et al. (2009). "Reduction of Salmonella enterica var. Enteritidis colonization and invasion by Bacillus cereus var. toyoi inclusion in poultry feeds". Poultry Science. HighWire Press. 88 (55): 975–9.

Vogt RL, Dippold L (2005). "Escherichia coli O157:H7 outbreak associated with consumption of ground beef, June-July 2002". Public Health Reports. 120 (2): 174–8.

Zaragoza, O., and Gancedo, J.M. "Pseudohyphal growth is induced in Saccharomyces cerevisiae by a combination of stress and cAMP signalling". Antonie van Leeuwenhoek. 2000. Volume 78. 187-194

Walker LJ, Aldhous MC, Drummond HE, Smith BR, Nimmo ER, Arnott ID, Satsangi J (2004). "Anti-Saccharomyces cerevisiae antibodies (ASCA) in Crohn's disease are associated with disease severity but not NOD2/CARD15 mutations". Clin. Exp. Immunol. 135 (3): 490–6.

Wang ZK, Yang YS, Stefka AT, Sun G, Peng LH (April 2014). "Review article: fungal microbiota and digestive diseases". Aliment. Pharmacol. Ther. 39 (8): 751–766.

Yang, Z., Zhou, F., Ji, B., Li, B., Luo, Y., Yang, L., Li, T., 2010. Symbiosis between microorganismsnfrom kombucha and kefir: potential significance to the enhancement of kombucha function. Appl. Biochem. Biotechnol. 160, 446-455.