Studiul de fa ță s-a axat pe dezvoltarea unui biomaterial bazat pe hidroxiapatita substituita [600955]

1 Universitatea „POLITEHNICA” Bucure ști
Facultatea de Inginerie Medicală
SUBSTANTE SI MATERIALE IN SISTEME BIOCOMPATIBILE

Material e hidroxiapatitic e dopat e cu
Silice si Magneziu

Masterand: [anonimizat]. Kamaran KANABI

Conducător științific:
Prof. Dr.Ing. Stefan ia STOLERIU

Bucuresti, 2017

2 Rezumat

Studiul de fa ță s-a axat pe dezvoltarea unui biomaterial bazat pe hidroxiapatita substituita
cu silice, si a magneziului pentru imbunatatirea osteointegrarii , si a rezistentei mecanice.
In urma experimentelor reali zate cu diferite cantitati de silice, s -a observant diferenta in
ceea ce priveste porozitatea si structura materialului obtinut prin metoda simpla, cea de
precipitare, unde am amestecat materiile prime in apa distilata sub agitare , dupa care l -am
precipit at cu ajutorul solutiei ammoniac, solutie cu care am ridicat pH -ul la 11 , dupa care am
spalat material precipitate cu apa distilata pentru a readuce pH -ul la valoare neutra.
Pentru a controla morfologia si dimensiunea porilor din material, procesul de s interizare
s-a realizat la trei temperatur i, la 650°C, 750°C respectiv 1100°C. Si s -a observat cu ajutorul
Microscopie electronică de baleiaj (SEM) faptul ca probele sinterizate la 750°C prezinta o
porozitate mai ridicata , insa nu are o structura bine sin terizata datorita temperaturi mici. in
schimb, probele sinterizate la temperatura ridicata de 1100°C am observat structura bine
sinterizata , consolidarea, densificarea si aglutinarea cristalelor aciculare.
Cu ajutorul spectroscopiei FT -IR , am determina t legaturile caracteristice pentru proba
noastra prin vibratia compusilor la lungimi de unda specifice HA, din spectrele FT -IR sa putut
identifica benzile largi specifice pentru gruparile OH
Iar prin analiza TEM (Microscopie electronica de transmisie) , s -a putut demonstra ca
particulele aciculare au diametre de cca. 10 nm si lungimi de pana la 50 nm. De unde putem trage
concluzia ca pulberile noastre sunt la scala nanometrica, iar proba noastra este formata din
nanopulberi.
Ultimul test pe care am supus probele noastra a fost testari in vitro, pentru a vedea daca
proba noastra dauneaza viabilitatea celulara, unde probele noastre au fost incubate in mediu de
cultura , unde am constatat ca dupa o perioada de incubare , viabilitatea celulara nu a scazut ci d in
contra acesta a crescut, ceea ce demonstreaza ca proba nu este toxica asupra celulelor , si poate
avea o compatibilitate biologica ridicata , acest lucru ne asigura faptul ca dupa implantarea HA
putem avea o biocompatibilitate fata de tesutul uman si nu vor avea loc reactii alergice sau efecte
adverse contra materialului obtinut dupa implanarea acesteia in organism .

3 Summary

This study focused on the development of a biomaterial based on hydroxyapatite doped
with Silica and Magnezium . to improve osseo integration and mechanical strenght.
In the following experiments conducted with different amounts of Si , we notice the
difference in terms of porosity and structure of the material obtained by a simple method that we
chosed, wich is by precipitation, whe re we mixed the raw materials in distilled water while
stirring, then we precipitated solution using ammoniac, that made de pH value 11, then I washed
precipitated material with distilled water to restore a neutral pH value.
In order to control the morphol ogy and size of the pores in the material, the sintering
process was performed at three different temperatures, 650°C, 750 ° C respectively 1100 ° C.
Andit was observed using scanning electron microscopy (SEM) that samples that was sintered
at 750°C shows a higher porosity, but has a good sintered structure due to low temperatures.
Instead, the samples sintered at high temperature of 1100°C, we observed good sintered structure,
consolidation, densification and agglutination of acicular crystals.
With th e help of FT -IR spectroscopy, we determined the bonds through the vibration
characteristic of our tested compounds to specific wavelengths that is specified to HA, FT -IR
spectra could identify specific OH bonds.
And by electron transmiting microscope (TE M), we could demonstrate that acilar
particles have diameters of approx. 10 nm and lengths up to 50 nm. Where we conclude that our
powders are nanoscale and our sample consists of nanopowders.
The last test we put our samples to evidence was in vitro tes ting, to see if our samples
harms cell viability, where our samples were incubated in culture , where we found that after a
period of incubation, cell viability did not decrease but on the contrary, it increased! which shows
that the our sample is not toxi c to the cells, and can have a high biological compatibility,this
insures us that after the implantation of the HA that we created we can have a high expectasion
reffering to biocombability with human tissue and it will not appear alergic reactions or
side-effect against the material that we obtained after its implantet into a human organism.

Cuprins

1. Introducere ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 1
2. Hidroxiapatita ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………………. 2
2.1. Generalitati ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………. 2
2.1.1. Aplicații ale hidroxiapatitei ………………………….. ………………………….. ………………………. 3
2.1.2 Hidroxiapatita de origine naturală ………………………….. ………………………….. ………………. 4
2.1.3 Hidroxiapatita de origine sintetică ………………………….. ………………………….. ………………. 5
2.2 Caracteristicile structurale ale hidroxiapatitei ………………………….. ………………………….. …….. 6
2.2.1 Compoziție hidroxiapatitei ………………………….. ………………………….. ………………………… 8
2.2.2 Cristalinitatea Hidroxiapatitei ………………………….. ………………………….. …………………….. 9
2.3. Metode de obținere a hidroxiapatitei ………………………….. ………………………….. ……………. 10
3. Imbunata tirea proprietatilor a hidroxiapatitei prin dopare ………………………….. ……………………. 13
3.1. Generalitati ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………….. 13
3.2 Influenta dopantilor ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 14
3.2.1 Substituț ia hidroxiapatitei cu silice ………………………….. ………………………….. ……………. 14
3.2.2 Doparea hidroxiapatitei cu magneziu ………………………….. ………………………….. ………… 16
4. Partea experimentală ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………… 19
4.1 Fluxul tehnologic consi derat ………………………….. ………………………….. ………………………….. 20
4.2. Rezultate experimentale și discuții ………………………….. ………………………….. …………………. 21
4.2.1. Caracterizarea pulberii de hidroxiapatită pură și substituită ………………………….. ……… 21
4.2.1.1. Analiza termică diferențială (ATD) ………………………….. ………………………….. ……. 21
4.1.1.2. Difracția de Raze X ………………………….. ………………………….. ………………………….. 23
4.1.1.3. Microscopie electronică de transmisie ………………………….. ………………………….. … 24
4.1.1.4. Spectrometrie FT -IR ………………………….. ………………………….. ………………………… 25
4.1.2.1. Obținerea și caracterizarea corpurilor ceramice poroase ………………………….. ……. 26
4.1.2.2. Difracția de Raze X ………………………….. ………………………….. ………………………….. 26
4.1.2.3. Microscopie electronică de baleiaj ………………………….. ………………………….. ……… 28
4.1.2.5. Proprietăți ceramice ………………………….. ………………………….. …………………………. 32
4.1.2.6. Testări în vitro ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 33
5. Concluzii ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …. 37

1 1. Introducere

Din cele mai vechi timpuri a existat si va exista un interes major pentru repararea si
inlocuirea organelor si a părților din organismul uman care au prezentat probleme și acest e tehnci
a fost realizat e folosind diverse material e, mai mult sau mai pu țin potrivite datorita evolutiei si a
tehnici existente in medicina existente la perioada respectivă.
Datorită faptulu ca știința a evoluat și aparatur a din zilele noastre in lumea medicală se
află într -o perioadă de tranzi ție de la vindecarea organelor existente pana la înlocuirea acestora
parti ale organismului uman, cu materiale sintetice si organice obținute în laboratoare le
performante din toate tarile . Substitu ția osoasă se afla pe locul 2 ca și procedură de înlocuire a
țesutul ui osos, pe locul întâi find desigur transfuzia de sânge. Mai mult de 2.2 milioane de
refaceri si reconstruc ții osoase sunt efetuate în fiecare an la scară mondială pentru repara rea
defecte lor osoase în medicina ortopedica , neurochirurgie și în cea de medi cina dentară. De și
există mai mai multe posibilită ți pentru reconstructia si repararea defectelor osoase cum ar fi
scaffoldul (țesut osos ob ținut din centura iliaca a pacientului) . alograftul ( țesut osos uman de la alt
individ), xenograftul ( țesut osos pro venit de la animale) și substitu ții sintetici, fiecare prezintă și
anumite dezavantaje la randul lor ca și riscurile de contaminare bacteriologica sau cantitatea
limitată (insuficienta) existentă. Aceste incoveniente si lipsuri se pot inlocui utilizând com puși
obținuți în condi ții reproductibile într -un laborator de ceretare eliminând astfel totodata riscul de
contaminare bacteriologica dar și limitarea cantitativă. Țesutul osos este sintetizat de fel si în
principal din materiale de natura bioactive și destul de rezistente cu structură similară cu structura
osului natural care este un material compozit cu proprietă ți bune de autoreparare.
Clasa b ioceramicele este o clasă de materiale care trebuie sa îndepline asca condi țiile
necesare substitu țiilor osoase, acestea fiind neaparat și biocompatibile și cu o mare rezisten ță
mecanică , similară cu cea a osul ui uman . Materialele bioceramice sunt împărti țe în două mari
categorii în func ție de reactivitatea lor în mediul biologic dar si fiziologic .
Doparea hidroxiap atitei este de asemenea studiat foarte intens în ultimii ani în vederea
îmbunătă țirii proprietă ților acestora dar o cantitate mare din materialele folosite sunt cauza
apararii altor dezavantaje cum ar fi proprietă ți mecanice mai slabe sau efecte adverse di n punct de
vedere citotoxic. Spre deosebire de alte materiale de substitutie studiate magneziul a atras
interesul comunită ții de cercetare în ultim ani din cauza ridicari a rezistentei mecanice fără a
afecta in mod negativ biocompatibilitatea acestora.

2 2. Hidroxiapatita
2.1. Generalitati
Apatita reprezinta un nume general pentru defini tia unui grup mare de ceramic i, un
material cu proprietă ți diferite in ceea ce priveste legaurile chimice, dar au o structură cristalină
asemănătoare; iar hidroxiapatita face parte din acest grup.
Hidroxiapatita al carei formule chimice este : Ca10(PO4)6(OH) 2 este constituentul
mineral principal al dintiilor și al oaselor din organismul uman . Hidroxiapatita sintetica a fost si
este utilizat în foarte multe aplica ții clinice si ortopedice cum ar fi un material de umplutură
pentru o trauma ce a rezultat defecte osoase, sau distan țiere osoasa si plăci, dar si os înlocuitor ,
sau un strat de os.
Acesta fiind unul din materialele importante cele mai des folosite în ultimele deceni i
pentru reconstructia unei lipsuri sau unei traume suferite ducand la lipsa acesteia, dar și înlocuirea
de a țesuturi osoase, dator ată asemănării prompte cu structura anorganică a osului uman . Aceasta
bioceramică prezinta proprietă ți destul bune de biocom patibilitate biologica în organismul uman
și este utiliz ată in special pentru implanturile de oase și dinți [20], [21].
Fosfa ții de calciu sunt folosite de către corpul omenesc pentru construi rea materialul u
osos, iar în cercetările cu aplica ții medicale s e folosesc de ani de zile pentru a produce
biomateriale necesare repara țiilor osoase. Se cunoa ște foarte bine că biomaterialele de fosfa ți de
calciu ghidează sinteza osoasă și formează o legătură foarte strânsă cu noul os, fiind de aceea prin
defini ție ost eoconductive. În afara faptului ca au proprietă ților osteoconductive, s -a dovedit
stiintific faptul că aceste biomateriale ceramice (doar cele care posedă anumite caracteristici
fizico -chimice) induc formarea tesutului osos în situri neosoase și din aceast a pricina sunt
considerate ca fiind osteoconductive .
Materialele ceramice de bază folosite ca materiale pentru substitu ție osoasă sunt:
Hidroxiapatita (HAp), cu formula Ca 10(PO4)6(OH) 2;
Hidroxiapatita deficientă în calciu (CDHA) cu formula
Ca10-x(PO4)6-x(HPO 4)x(OH) 2-x, 0≤x≤1;
Fosfa ți de calciu: fosfat tricalcic (TCP, prezent în formele cristalografice α și β), fosfat
dicalcic (DCP), pirofosfatul de calciu.

3 Mineralul osos natural, descris ca hidroxiapatită initial , este compus din nanocristale sau,
mai exact nanodiscuri. In prezent este acceptat faptul că apatita osoasă poate fi descrisă mai bine
drept carbonathidroxiapatită (CHA), și aproximată prin formula (Ca, Mg, Na) 10(PO4,
CO3)6(OH) 2. Materialele ceramice bioactive si biocompatibile au fost larg folosit e ca substitute
osoase. Dintre aceste bioceramici, o aten ție particulară a fost acordată HAp datorită bioactivită ții
acesteia foarte bune .

Hidroxiapatita (HAp) este similară chimic cu partea minerală a țesuturilor dure ale
mamiferelor și are formula chimi că ideală Ca 10(PO4)6(OH) 2.
Are tendin ță mare de a forma compu și nonstoichiometrici, prin:
substitu ții cu diferi ți anioni și cationi;
apari ția unor defecte în re țea.
Este cel mai pu țin solubilă dintre fosfa ții de calciu și se descompune termic la temperatu ri
cuprinse între 800 – 1200°C, în func ție de modul de ob ținere. Pentru condi ții speciale de sinteză
poate fi stabilă până la temperaturi de 1500°C.
Este osteoconductivă, permi țând cre șterea osului în interiorul implantului și în consecin ță
osteointegrare.
În formă densificată nu are proprietă ți mecanice suficient de bune [2] pentru a putea fi
folosită în aplica ții care presupun eforturi mecanice importante.

2.1.1. Aplica ții ale hidroxiapatitei

Folosirea hidroxiapatitei pentru implanturi dentare sau de o s conduce din nou la aplica ții de
obținere a pulberii de ”trifosfat de calciu” pentru refacerea mai rapidă a portiunilor osoase din
1920. Al ți cercetatori stintifici depilda au încercat de atunci utilizarea fosfat ului de calciu , dar nu
au reu șit să obtina o refacere mai rapidă a oaselor si a țesutului osos. În 1961, Driskell la Battelle
Memorial Institute a realizat un implant cu o structura pe bază de fosfat de calciu și materiale de
umplere pentru defecte osoase .
Tehnicile de acoperire al materialulu hidroxiapatit ic au fost folosite intai pentru ceramicile pe
bază de alumină folosite în implanturi dentare și metale (o țel inoxiadabil, aliaje Co -Cr, aliaje de

4 Ti și Ta) pentru proteze osoase. Mai târziu, au fost ob ținute implaturile ortopedice prin
introduc erea materialelor într -o solu ție de hidroxiapatită și încălzire la temperatură ridicată și prin
pulverizare de plasmă. Tabelul 3 rezumă istoria recentă a ob ținerii hidroxiapatitei precum și
aplica țiile în implanturi [7].

Tabelul 1 Istoria recentă a prepar ării hidroxiapatitei și aplicațiile acesteia pentru implanturi [7]
cercetatori stintifici Rezultate
1920 FH Albee & HF Morrison Trifosfat de calciu ca stimul pentru osteogeneză
1934 KO Haldeman & JO Moore Fosfat de calciu pentru vindecarea fracturilor
1952 RD Ray & AA Ward Fosfat tricalcic în înlocuiri osoase
1961 TD Driskell Fosfat de calciu pentru implanturi structurale și
implanturi de umplere a golurilor, acoperiri pe
alumină și implanturi metalice
1971 -2 Getter și col. Β-TCP pentru material de gr efare sub formă de
bloc poros și acoperiri pe implanturi dentare
1972 Aoki și col. Sinteza și sinterizarea HAp
1973 Hubbard, Hirthe, & Mueller Predominant HAp și β-TCP
1975 Chiroff și col., Roy &
Linnehan Jarcho și col. Bloc de HAp de înaltă densitate s interizată
1976 -198
0 Ducheyne, Hench, & Kagan
Cook și col. Acoperiri ale implanturilor prin pulverizare in
plasmă cu Hap.

Problem a principala întâlnită la aplicarea hidroxiapatitei este reprezentata de catre
proprietă țile mecanice destul de scazute și din acest a motiv este necesară implantarea unor
dispozitive de tipul acoperirilor. Metoda cea mai utilizată pentru acoperirea suprafe ței
implanturilor este pulverizarea unui flux de plasmă. Legătura dintre hidroxiapatită și substrat este
extrem de importan tă în orice acoperire. În plus, cristalinitatea hidroxiapatitei după acoperire
poate conduce la determinarea raportului de dizolvare: cu cât cristalinitatea este mai mare cu atât
viteza de dizolvarea HAp este mai mică. Cristalinitatea poate fi compromisă d atorită
temperaturilor înalte folosite la metoda pulverizării fluxului de plasmă, conducând la ob ținerea de
fosfat de calciu amorf după pulverizare.

2.1.2 Hidroxiapatita de origine naturală
Hidroxiapatita poate avea ca si proveni enta din corali sau chiar si os bovin și are o
structura similară cu osul cortical și spongios.

5 Hidroxiapatita care provine din coral este un material bioinert în ciuda originii biologice și
stimulează cre șterea osului în contact direct cu suprafa ța. Dimensiunea și configurarea porilor
creează un mediu ideal pentru întrepătrunderea dintre material și țesutul osos înconjurător.
Osteoblastele sunt identificate ini țial direct pe suprafa ța implantului în timpul
osteoconduc ției [31].
Proprietă țile mecanice ale hidroxiapatitei din cora l sunt scăzute, ceea ce face ca materialul să
fie casant și este necesară fixarea cu plăcu țe sau șuruburi pentru a evita încărcarea ciclică.
Acestea au fost folosite cu succes la reconstruc ția unor defecte de metafiză și în artroplastii de
revizie sau ca m aterial de umplere pentru donatorii de os din centura iliaca.
Rata de probleme de infec ție, probleme de interac țiune cu țesutul moale, nesudare sau sudare
întârziată, sudare gre șită sau de probleme mecanice este similară cu cea a autograftului. În plus,
acest material de coral are o rată de refracturare mai mare decât osul provenit de la acela și
pacient. Acest material este utilizat în general ca și implant osteoconductiv [ 37].

2.1.3 Hidroxiapatita de origine sintetică
Este de obicei preparată in într-un laborator, iar cea mai des folosita metoda este cea de
precipitare apoasă și este după care acesta fiind sinterizat e la temperaturi mai mari de 1000°C.
Aceasta poate fi fabricată sub formă densă sau macroporoasă în func ție de aplica ție. Tensile
stength a hidroxiapatitei dense variază între 79 și 106 MPa și pentru cea poroasă este 42 MPa, cea
a osului cortical fiind între 69 și 110 Mpa [ 27]. Hidroxiapatita sintetică se poate utiliza sub formă
de blocuri sau granule și utilizând tehnica „plasma spray” (pulv erizare prin plasmă) poate fi
folosită pentru acoperirea diferitelor implanturi dentare sau ortopedice.

Fig. 1. Hidroxiapatita: SEM x200 și SEM x350

6
Avantajele hidroxiapatitei sintetice constau în faptul că se elimină riscurile de contaminare
care exi stau la materialele preluate din corpul uman sau animal și se poate produce în cantitate
nelimitată. De asemenea, datorită faptului că este produsă într -un laborator, condi țiile
experimentale pot fi controlate astfel încât să se ob țină forma și proprietă țile dorite.
Hidroxiapatita a fost studiată clinic și experimental sub formă densă, poroasă și granulară,
rezultatele indicând că structura formei poroase permite cre șterea țesutului fibrovascular în
interiorul structurii, ceea ce produce o stabilitate și rezisten ță la micromi șcare in vivo [ 23], [38].
Comparativ, structura densă este mai pu țin stabilă și nu există cre ștere de țesut în interiorul
materialului pentru a ancora implantul (Holmes et al, 1987). În plus, forma implanturilor din
material poros sau de ns este mai dificil de realizat cu mare precizie și este nevoie de graft osos în
jurul piesei pentru a promova vindecarea și stabilitatea, când nu există interfa ță osoasă [ 39].
Hidroxiapatita granulară este utilizată pentru fuziune spinala , tratamentul c histurilor osoase
și în chirurgia maxilofacială pentru refacerea țesutului osos. Avantajul utilizării acestui material
este dat de faptul că paote fi fabricat în diferite dimensiuni și forme și poate fi întrebuin țat și în
cazul cavită ților de formă neregul ată. Amestecarea granulelor de hidroxiapatită cu sânge
permite ob ținerea unei paste care se poate modela u șor în forma dorită. De asemenea, granulele
de 1-2 mm permit o întrepătrundere osoasă mai bună în compara ție cu cele de dimensiuni mai
mici. Acest as pect se poate datora volumului liber între granulele adiacente care este mai mare și
permite transportul nutrien ților către țesutul care se dezvoltă [ 40], [41].

2.2 Caracteristicile structurale ale hidroxiapatitei

Structura HAp apar ține de cea a sistemu lui hexagonal având o grupare spacer de tip
P63/m. Dispunerea generală a HAp este caracterizată printr -o axă c perpendiculară pe 3 axe a
echivalentem, cu un unghi de 120o între ele. Celula unitate, cea mai mică unitate structurală și
totodată o reprezentar e completă a cristalului de HAp, prezintă grupări de Ca2+, PO 42- și OH-
împachetate împreună într -o dispunere hexagonală după cum se poate observa în figura 3.

7
Dispunerea atomilor de calciu în HAp, Ca 10(PO 4)6(OH) 2.

Conform pozi ției în celula unitate, ze ce atomi de Ca pot fi diviza ți în două clase: Ca 1 și Ca 2.
Astfel, patru atomi de calciu ocupă pozi țiile Ca 1 care sunt localizate în locurile octaedrice ale
matricii hexagonale iar restul de șase atomi ce ocupă pozi țiile Ca 2 sunt localiza ți în col țurile
coloanei hexagonale și înconjoară ionii OH-. Totu și, cei șase atomi de Ca 2 nu fac parte din acela și
plan, ace știa fiind dispu și în două serii de câte 3 în pozi ții triunghiulare la z=0,25 și z=0,75. Ionii
OH- sunt localiza ți în centrul axului median al hexagoa nelor. Similar atomilor Ca 2, cele șase
grupări fosfatice (PO 4) prezintă o aranjare elicoidală pentru o valoare z cuprinsă între 0,25 și 0,75
și sunt dispuse deasemenea sub forma a două triunghiuri. Grupările PO 4 formează cadrul
(scheletul) re țelei structur ale care asigură stabilitatea structurală a HAp. [3]
În figura 4 este reprezentată structura cristalină a hidroxiapatitei.

Figura 2. Structura cristalină a hidroxiapatitei ob ținute în SBF la 37°C

8 În stare pură este monoclinică, având grupul spa țial P2 1/b. La 250°C trece în simetrie
hexagonală, cu grupul spa țial P6 3/m și parametrii celulei elementare a = 9,4125 nm și b = 6,8765
nm. Această structură cristalină este stabilizată la temperatura camerei în prezen ța impurită ților.
Cationii de calciu se găsesc în două tipuri de simetrii, care se intercalează:
Ca (I): pe baza celulei elementare și la ½ din înăl țimea laturii;
Ca (II): la ¼ și ¾ din înăl țimea laturii celulei elementare.
Cationii de calciu se leagă de anionii de oxigen, satisfăcând astfel cea de -a doua sarcină
rămasă liberă a acestora. Grupările tetraedrice OH- se găsesc în straturi la ¼ și ¾ din înăl țimea
laturii celulei elementare. Dacă se analizează structura de -a lungul axei c, se observă că grupările
fosfat formează coloane, legate unele de cel elalte și o structură de tip fagure de albină 1, care
conferă stabilitate compusului.

2.2.1 Compozi ție hidroxiapatitei

Există două surse de apatită: una biologică și cealaltă din depuneri minerale, asemănător
rocilor fosfatice sau fosforit, o roca sedim entară in care componenta minerală esen țială este
fluoroapatita carbonată. Compozi țiile chimice ale smal țului, dentinei și osului sunt prezentate în
tabelul 1.
Tabel 2. Compoziția apatitei în corpul uman a smalțului, dentine și oaselor [5]
Compozi ție Smalț Dentină Os
Calciu Ca2+ 36,5 35,1 34,8
Fosfor P 17,7 16,9 15,2
Ca/P 1,63 1,61 1,71
Sodiu Na+ 0,5 0,6 0,9
Magneziu Mg2+ 0,44 1,23 0,72
Potasiu K+ 0,88 0,05 0,03
Carbonat CO 32- 3,5 5,6 7,4
Florură F- 0,01 0,06 0,03
Clorură Cl- 0,30 0,01 0,13
Pirofosfat P 3O74- 0,022 0,10 0,07
Total anorganic 97,0 70,0 65,0
Total organic 1,5 20,0 25,0
Apă absorbită 1,5 10,0 10,0
Urme de Sr2+, Pb2+, Zn2+, Cu2+, Fe2+ etc.

9
2.2.2 Cristalinitatea Hidroxiapatitei
Hidroxiapatita are o structură cristalină cu simetr ie hexagonală cu grupul spa țial P63/m și
parametrii celulei a = 9.418 Å, c = 6.881 Å, b = 120° și densitate d=3.156 g/cm3, unitatea
celulară fiind orientată de -a lungul axei c justificând orientarea preferen țială care creează un
aspect acicular [ 32]. Struc tura apatitica este contruită dintr -un schelet hexagonal de ioni
ortofosfa ți PO4 3 – care creează două tunele libere pentru a șezarea ionilor de calciu. Cei 6 cationi
Ca 2+ vor forma un tunel principal în care sunt prezente grupările hidroxil. Aceste tunele conferă
hidroxiaptitei proprietatea de a accepta schimburi ionice [ 33], [34]. Existen ța tunelelor în care se
află ionii de OH dau apatitei anumite proprietă ți apropiate de ale zeolitului. Din acest motiv
apatitele prezintă proprietă ți de schimbări ionice ( OH – fluor – clor etc.).
Aceste tunele pot acomoda și molecule mici ca și H2O sau glicina [ 35]. Această abilitate
de substitu ție, prin înlocuirea golurilor din structură, permite hidroxiapatitei nestoechiometrice să
existe în domediul dintre fosfatul apat itic octocalcic și hidroxiapatita stoechiometrică.
Nonstoechiometria are următoarele consecin țe:
– Prezen ța golurilor în loca țiile cationice și OH;
– Un con ținut de OH mai scăzut decât două grupări pe circuit;
– Cu cât se îndepartează mai tare de hidr oxiapatita stoichiometrică starea de cristalinitate
scade;
– Cu cât se îndepărtează mai tare de hidroxiapatita stechiometrica cre ște solubilitatea.

Fig.3. Structura cristalografică a HA

10 Hidroxiapatita con ține 39.84 % calciu în masă și 18.52 % fosfor. Raportul atomic Ca/P a
hidroxiapatitei stoechiometrice este de 1.67 [9]. Stoechiometria hidroxiapatitei este extrem de
importantă deoarece și cea mai mică abatere de la această propor ție poate favoriza apari ția de
TCP după tratamentul termic.
Spre deoseb ire de celelalte materiale din familia fosfa ților de calciu, hidroxiapatita este
stabilă în condi țiile fiziologice și este termodinamic stabilă la pH -ul fiziologic având un rol activ
în remodelarea osoasă prin formarea de legături chimice puternice cu osul înconjurator [ 36]. De și
inițial acest material implantat are proprietă ți mecanice mai scăzute ca osul, s -a demonstrat după
un experiment in vivo timp de 6 luni, că după această perioadă, datorită legăturilor produse,
rezisten ța mecanică poate fi superioar ă celei a osului pacientului [ 30].
Hidroxiapatita care este produsă prin precipita ție rapidă nu va fi stoechiometrica deoarece are
nevoie de o perioadă de maturare în mediul apos unde are loc un fenomen de suprafa ță care cre ște
stoechiometria și descre ște solubilitatea.

2.3. Metode de ob ținere a hidroxiapatitei

Reac ții în fază solidă
Reac ții de co -precipitare*
Procese sol -gel
Reac ții hidrotermale
Piroliza unui sol

Reactii de Co -Precipitare
Se utilizeaza ca materii prime compusi de calciu s i fosfor: NH 4H2PO 4, (NH 4)2HPO 4,
H3PO 4; CaCl 2, (CH 3COO) 2Ca, Ca(OH) 2, Ca(NO 3)2, CaSO 4 · 2H2O. Se foloseste NH 4OH pentru
reglarea pH -ului la valori pentru care hidroxiapatita este stabila.
Cristalinitatea HAp creste cu temperatura d e reactie:
< 80°C: caracter slab cristalin;
80 – 100°C: HAp cristalina

11 Gradul de deficienta al structurii este influentat de pH -ul mediului de reactie: scade pe
masura ce creste pH -ul.
Precipita rea poate fi ob ținută prin reac țiile următoare:

sau prin adăugare picătură cu picătură de acid fosforic la o solu ție saturată de hidroxid de calciu,
Ca(OH) 2:

Hidroxiapatita ceramică poate fi deasemenea preparată prin sinte rizarea produselor de
hidroliza dihidrat fosfatului dicalcic (DCPD, CaHPO 42H2O), fosfat dicalcic anhidru (DCPA,
CaHPO 4), sau fosfat octacalcic [OCP, Ca 10H2(PO 4)65H2O] în solu ții bazice sau de CaCO 3 în
soluții fosfatice [4]:

La alegerea metodei de ob ținere, precum și atunci când sunt stabilite materiile prime și
parametrii de procesare, trebuie ținut cont nu numai de compozi ția ce se dore ște a fi ob ținută, dar
și de proprietă țile vizate, în conformitate cu aplica țiile specifice:
Proprietă țile (bio)chimice și fizice ale hidroxiapatitei sunt similare cu cele ale oaselor și
ale din ților. Structurile lor moleculare sunt de asemenea similare, de și natura exactă a
compozitului (mineralele și proteinele ) și interac țiile lor nu sunt total cunoscute.

Tabel 3: Modulul elastic al hidroxiapatitei
Metode de testare Materialul Modulul de elasticitate (GPa)
Tehnici de interferen ță
ultrasonică Hidroxiapatita (minerală) 144
Hidroxiapatita (sintetic) 117
Denti nă 21
Smal ț 74
Tehnici distructive Os cortical uman 24,6 – 35

12 Tehnici a frecven ței
rezonan ței Hidroxiapatita (sintetic) 39,4 – 63
Os cortical canin 12 – 14,6

13
3. Imbunatatirea proprietatilor a hidroxiapatitei prin dopare
3.1. Generalitati

Hidroxi apatita de și prezintă o biocompatibilitate ridicată, poate fi substan țial îmbunătă țit
prin modificarea compozi ției chimice și a structurii morfologice. Aceste modificări sunt
favorizate de capacitatea hidroxiapatitei de a accepta cu u șurință în structura s a numero și ioni
substituen ți atât pentru ionii de Ca2+ cât și pentru cei de PO 43- odată cu compozi ția chimică
modificându -se și structura morfologică. Analizele chimice și structurale au arătat că partea
anorganică a osului nu corespunde formulei stoechiom etrice a hidroxiapatitei.
Practic partea anorganică aflată în țesuturile osoase reprezintă un amestec de compu și
anorganici pe bază de hidroxiapatită în care ionii de Ca2+ și PO 43- sunt par țial substitui ți cu diferi ți
alți ioni (anioni și cationi). Ionii substituen ți trebuie să fie la rândul lor biocompatibili cu
organismul astfel încât resorb ția lor să nu provoace reac ții nedorite și fenomene de respingere.
Mai mult, prezen ța unor ioni străini în structura hidroxiapatitei conferă acesteia o abilitate spor ită
la stimularea și creșterea țesutului osos.
Deși prezen ța ionilor substituen ți în structura hidroxiapatitei este în propor ție mică, ei
conferă acesteia proprietă ți biologice și fizice specifice, astfel că rolul lor este important și
determinant în chim ia osului. Din cele prezentate rezultă că prezen ța ionilor substituen ți în
structura hidroxiapatitei este obligatorie pentru ca biocompozitele în compozi ția cărora aceasta
intră să aibă biostructura și biochimia osului natural. Totodată, prin intermediul l or se asigură o
viteză mai mare de regenerare a țesutului osos și parametri fizico -chimici cât mai apropia ți
comparativ de cei din osul natural. Cei mai importan ți ioni substituen ți ai hidroxiapatitei din
materialele cu aplica ții biomedicale sunt cei de Mg2+ și de Zn2+ pentru ionii de Ca2+ precum și cei
de CO 32- și SiO 44- pentru ionii de PO 43-. În ceea ce prive ște ionii de Mg2+, ace știa joacă un rol
important prin natura transformărilor pe care le produc în matricea osoasă. Lipsa magneziului în
os afectează în mod negativ procesele fiziologice din metabolismul osos ducând astfel la o
fragilitate ridicată a oaselor [8]

14 3.2 Influenta dopantilor

Hidroxiapatita poate fi multisubstituită cu specii de ioni compatibili, care pot fi folosi ți
pentru prepararea os ului artificial și în reconstruc ția țesuturilor osoase. Ionilor substituen ți
prezen ți într -o cantitate mică în hidroxiapatită le pot fi atribuite anumite proprietă ți biologice și
fizice specifice și joacă un rol important în biochimia osului și a din ților. Siliciul este unul dintre
elementele esen țiale prezente în procesele biologice. Importan ța acestuia în formarea osului a fost
dovedită științific. Substituirea ionilor de fosfat cu ionii de silicat în structura hidroxiapatitei
crește activitatea celulelo r osoase în raport cu hidroxiapatita fiziologică. Rezultă astfel o
remodelare rapidă a țesutului osos ce a fost observată la suprafa ța implanturilor de hidroxiapatită
substituită cu ioni de silicat (Si -HAP). Procentul de siliciu prezent în hidroxiapatita b iologică
variază între limitele 0,2% și 0,8%. Prezen ța siliciului în HAP favorizează adeziunea celulară și
dezvoltarea păr ții organice din os, a colagenului. Procentul molar al ionilor de silicat în raport cu
ionii de fosfat din hidroxiapatită este de pref erat a fi cuprins între 0,1% până la 2,5%.
Literatura de specialitate indică faptul că o proprietate determinantă a biocompozitelor
este, alături de cristalinitate, porozitatea și suprafa ța specifică. Hidroxiapatite cu porozitate și
suprafa ță specifică controlate se pot ob ține dacă în structura acestora se introduc ioni de SiO 44-
sub diferite forme de exemplu sub formă de TEOS sau Na 2SiO 3. Ace ști ioni prin procesul de
policondensare crează grupări siloxan –Si-O-Si- și silanol Si -OH care depin d de raportul
HAP:SiO 2, temperatură, condi ții hidrodinamice și viteza de adăugare a componen ților reactan ți.

3.2.1 Substitu ția hidroxiapatitei cu silice

Si prezent în hidroxiapatită sub forma ionilor de SiO 44- joacă un rol esen țial în procesele
biologice determinând structura chimică a osului. Substituirea ionilor de PO 43- din hidroxiapatită
cu ionii de SiO 44- crește activitatea celulelor osteoblaste în raport cu hidroxiapatita pură. Această
creștere a activită ții osteoblastelor conduce la o remodelare ma i rapidă a țesutului osos,
reducându -se astfel timpul de regenerare al acestuia. Prezen ța siliciului în hidroxiapatită
intensifică și alte fenomene biologice cum sunt adeziunea celulară și dezvoltarea mai rapidă a
matricei organice (a colagenului) din țesutul osos.
Cu toate că există mai multe procedee de sinteză a hidroxiapatitei, încă nu s -a reu șit
fabricarea unui produs care să îndeplinească la un nivel satisfăcător toate condi țiile de calitate

15 care se impun biocompozitelor folosite în implanturi și rec onstruc ții osoase: scara nano a
particulelor, cristalinitate ridicată, bună biocompatibilitate cu țesutul osos natural și viteză mare
de resorb ție. Procedeele existent de fabricare nu elimină apari ția fazelor secundare formate din α
și β fosfat tricalcic C a3(PO 4)2 și a silicocarnotitului (Ca 10(PO 4)4(SiO 4)2), faze ce afectează negativ
proprietă țile biologice.[9 -12]
Hidroxiapatita poate fi multisubstituită cu specii de ioni compatibili, ce pot fi folosi ți pentru
prepararea osului artificial și în reconstruc ția țesuturilor osoase. Ionilor substituen ți prezen ți într -o
cantitate mică în hidroxiapatită le pot fi atribuite anumite proprietă ți biologice și fizice specifice
și joacă un rol important în biochimia osului și a din ților. Siliciul este unul dintre element ele
esențiale prezente în procesele biologice. Importan ța acestuia în formarea osului a fost dovedită
științific. Substituirea ionilor de fosfat cu ionii de silicat în structura hidroxiapatitei cre ște
activitatea celulelor osoase în raport cu hidroxiapati ta fiziologică. Rezultă astfel o remodelare
rapidă a țesutului osos ce a fost observată la suprafa ța implanturilor de hidroxiapatită substituită
cu ioni de silicat (Si -HAP). Procentul de siliciu prezent în hidroxiapatita biologică variază între
limitele 0, 2% și 0,8%. Prezen ța siliciului în HAP favorizează adeziunea celulară și dezvoltarea
părții organice din os, a colagenului. Procentul molar al ionilor de silicat în raport cu ionii de
fosfat din hidroxiapatită este de preferat a fi cuprins între 0,1% până la 2,5%. Literatura de
specialitate indică faptul că o proprietate determinantă a biocompozitelor este, alături de
cristalinitate, porozitatea și suprafa ța specifică. Hidroxiapatite cu porozitate și suprafa ță specifică
controlate se pot ob ține dacă în stru ctura acestora se introduc ioni de SiO 44- sub diferite forme de
exemplu sub formă de TEOS sau Na 2SiO 3. Ace ști ioni prin procesul de policondensare cre ează
grupări siloxan –Si-O-Si- și silanol Si -OH (figura 5) care depind de raportul HAP:SiO 2,
temperatură, condi ții hidrodinamice și viteza de adăugare a componen ților reactan ți.

Figura 4. Structuri macromoleculare și tridimensionale ale SiO 2 hidratat

16
Pe lângă faptul că prin policondensare, SiO 2 creează o structură poroasă, adsorb ția sa la
suprafa ța partic ulelor de fosfa ți de calciu împiedică cre șterea cristalitelor, având astfel și rol de
inhibitor al cre șterii acestora. Din acest punct de vedere, siliciul se comportă ca o impuritate
adsorbită pe suprafată, adsorb ția lui blocând cre șterea cristalitelor.
Un alt parametru care joacă un rol esen țial în procesul de cristalizare este temperatura.
Procesul de cristalizare este un proces deosebit de complex fiind rezultatul raportului în care se
găsesc cele două procese elementare: nuclea ția (formarea germenilor) și procesul de cre ștere a
germenilor. Ambele procese elementare sunt puternic influen țate de temperatură.[9]

3.2.2 Doparea hidroxiapatitei cu magneziu

Doparea hidroxiapatitei cu magneziu , măre ște semnificativ rata de cre ștere osoasă [ 15] și
abilitatea de a crea legături bune cu osul [ 44]. Mecanismul exact nu este cunoscut dar există
studii care arată că doparea hidroiapatitei cu magneziul intăre ște oasele la oameni și animale
[16] și că deficien ța în acest element poate cauza osteoporoză la oameni si a nimale. Acesta este
un element întâlnit în mod normal în structura osului și procentul este de 0,44 -1,23 % în func ție
de tipul de țesut osos, smal țul dentar con ține 0,44 %, dentină 1,23 % și osul 0,72 % magneziu
[17].
Adiția de magneziu în straturile de acoperire cu HA folosite în cazul implanturilor din
aliaje de titan cre ște în mod sim țitor legăturile osoase la șase săptămâni după implantare .
Rezisten ța la alunecare a interfe ței în cazul implanturilor acoperite cu Mg -HA a fost de 3,54 ±
1,41 MPa, comp arativ cu 1,97 ± 1,17 MPa în cazul acoperirilor cu HA simpla [ 44].
Încorporarea de magneziu poate afecta de asemenea cristalinitatea acoperirilor cu HA și
poate avea un rol important în adeziunea celulară , Molecule ca și intregrina și fibronectina
intera cționează cu acesta favorizând ata șamentul celular și proliferarea celulară crescând
bioactivitatea implanturilor de titan acoperite cu Mg -HA [ 44]. Asadar prezena acesei Mg
creste rezistenta mecanica semnificativ coparativ cu HA nedopată [ 10].
Serre et al. a descoperit că adaosul de 20 wt% de Mg reduce osteoconductivitatea
ceramicii apatitice fa ță de celulele „osteoblast -like”, indicând că o cantitate prea mare de dopant
poate fi defavorabilă materialului final, de și în cantită ți mici are efecte dorite [ 17].

17 De asemenea, conform Webster at al. doparea cu magneziu cre ște adeziunea
osteoblastelor.stabilizează faza β -TCP în timpul tratamentului termic și tind să stabilizeze HA cu
o singură fază în prezen ța ionilor de CO3 chiar și la 1300°C [ 18].
Magneziul e ste unul dintre cei mai importan ți ioni bivalen ți care ajută la men ținerea
sănătă ții din ților și stimulează transformarea osului imatur (amorf) într -un os matur și cristalin
[48].
Acesta este de asemenea cunoscut pentru prevenirea fracturilor osoase dator ită cre șterii
elasticită ții oaselor.
Ca și rezultat al studiului realizat asupra principalilor dopan ți utiliza ți în cazul
hidroxiapatitei, acest element reiese că aduce cele mai multe avantaje. În primul rând acesta
stabilizează descompunerea HA la tempera turi de sinterizare mai ridicate, ceea ce va permite
densificarea ceramicii la temperaturi superioare și implicit proprietă ți mecanice mai bune [ 19].
De asemenea, s -a observat că proprietă țile biologice sunt similare cu cele ale
hidroxiaptitei și chiar su perioare în unele studii, cu condi ția să nu se utilizeze o cantitate prea
mare de dopant.
În cazul bioceramicilor bifazice HA/βTCP, acesta previne tranzi ția βTCP -αTCP până la
temperaturi mai ridicate.
Un aspect importart de men ționat este faptul că o cant itate prea mare de Mg va reduce
osteoconductivitatea și solubilitatea va cre ște, rezultând că este important de determinat cantitatea
de Mg optimă pentru fiecare aplica ție [17].
În majoritatea studiilor realizate pentru Mg -HA, apare βTCP ca și fază secunda ră,
deoarece temperatura de tranzi ție a HA în TCP scade cu cre șterea con ținutului de Mg, astfel
0,25Mg -HA este stabilă până la 840°C, 0,5 Mg -HA până la 760°C și 1,0 Mg -HA până la 660°C
comparat cu HA care este stabilă până la 960°C [ 18], [20].

18 Tabel 4: Proprietăți comparate ale HA, osului și MgHA 1%

Conținutul mai ridicat de MgO împiedică cre șterea grăun ților de HA/TCP și scade
sinterabilitatea, rezultând că optim ar fi o cantitate de 1 wt% Mg. De asemenea, Mg -HA are o
bună biocompatibilitate fără cito toxicitate [ 64].
Concluzie a literaturii studiate putem spune că Mg2+ este recomandat din mai multe
motive ca și dopant pentru hidroxiapatită, iar aceastea sunt:
✓ Îmbunătă țește proprietă țile mecanice ale HA;
✓ Mg2+ stabilizează faza β -TCP crescând tempera tura de tranzi ție a α -TCP până
la 1600°C;
✓ Biocompatibilitate fără citotoxicitate și bune proprietă ți de biodegradare;
Magneziul este în strânsă legătură cu mineralizarea țesuturilor calcificate stimulând direct
proliferarea osteoblastelor. Riscurile care p ot apărea la utilizarea Mg pentru doparea HA sunt
următoarele:
· O cantitate prea mare de Mg poate scădea gradul de cristalinitate, cristalitele devenind
mai mici și neregulate, formând aglomerate datorită dimensiunii;
· Cre șterea cantită ții de Mg poate in duce apari ția TCP la temperaturi mai scăzute;
· Un con ținut crescut de MgO inhibă cre șterea grăun ților de HA/TCP și scade
sinterabilitatea.

19 4. Partea experimentală

Experimentele realizate au avut drept obiectiv sinteza și caracterizarea hidroxiapatitei cu și
fără substituire cu silice și cu silice și magneziu.
Hidroxiapatita a fost substituită în mai multe propor ții:
➢ Hidroxiapatită substituită cu 0,5% grav. Si O2
➢ Hidroxiapatită substituită cu 1% grav. Si O2
➢ Hidroxiapatită substituită cu 1,5% grav. Si O2
➢ Hidroxiapatită substituită cu 0,5% grav. Mg2+ și 1% grav. Si O2
Sinteza prin ruta coprecipitării a hidroxiapatitei
Pentru sinteza hidroxiapatitei substituite s -a folosit o ruta de sinteza simpla – ruta
coprecipitării. Ca materii prime au fost folosite Ca(NO 3)∙4H2O, orto -H3PO 4 (85%), TEOS,
Mg(NO 3)∙6H 2O și H 2O. În figura 1 se prezintă fluxul tehnologic de ob ținere a hidroxiapatitei
substituite prin coprecipitare.
✓ Pentru ob ținerea precipitatelor, pH -ul solu ției ob ținute s -a ajustat la pH bazic (pH=11).
✓ După ob ținerea precipitatelor, acestea au fost filtrate și spălate succesiv cu apă distilată
până la pH=7. Aceste precipitate spălate au uscate în aer timp de 24 h. Pulberea uscată a fost
caracterizată cu ajutorul analizei termice diferen țiale (ATD), analiză care s -a făcut pentru a alege
cât mai bine temperatura de calcinare.
✓ Amestecurile au fost calcinate la 300°C timp de 2h. Pulberile calcinate au fost apoi
caracterizate cu ajutorul XRD și TEM, după care acestea au fost măcinate cu ajutorul unui mojar
de agat, apoi s-a realizat o omogenizare uscată cu glucoză și o fasonare uniaxială cu o presiune de
60 MPa.
✓ Pastilele ob ținute au fost supuse unor tratamente de sinterizare la 650°C, 750°C, 1100°C
✓ Probele sinterizate au fost caracterizare cu ajutorul difrac ției de raz e X (XRD) pentru a
se urmării gradul de cristalinitate, imagistica SEM pentru a se observa morfologia probelor,
Spectroscopia FTIR și Proliferarea Celulară – MTT assay.

20 4.1 Fluxul tehnologic considerat

21 4.2. Rezultate experimentale și discu ții
4.2.1. Caracterizarea pulberii de hidroxiapatită pură și substituită
4.2.1.1. Analiza termică diferen țială (ATD)
Pentru stabilirea temperaturii de calcinate, pe probele uscate s -a efectuat in prealabil analize
termice complexe (figura 2).
Din acestea rezultă că, o dată cu cre șterea temperaturii se înregistrează efecte endotermice
însoțite de pierderi de masă datorate pierderii apei și descompunerii carbonatului de calciu, cu
formarea oxizilor corespunzători care conferă caracter bazic suspensiilor apoase ale
biocera micilor de hidroxiapatită. Analiza derivatogramelor indică următoarele intervale de
temperatură:
• 20°C -150°C – un slab efect endotermic aferent pierderii apei legate fizic
• 150°C -300°C – un efect endotermic puternic aferent deshidratării fosfa ților de calci u
hidrata ți, înso țit de o pierdere de masa mare.
• 300°C -1000°C – pierderile de masă sunt atribuite descompunerii micilor cantită ți de
carbonat de calciu format.
De asemenea pierderile de masă în procente sunt prezentate în tabelul 1.

22
a)

b)
Figura 4. Analize termice complexe: curbele ATD (a) si TG (b)

23 Tabelul 1. Pierderea de masă pe intervale de temperatură
Cod probă Pierderea de masă (%) pe intervale de temperatură
30°-100°C 100° -300°C 300° -1000°C
HAp 2,48 % 32,64% 3,91%
HAp 0,5% grav. Si O2 2,69% 30,25% 4,17%
HAp 1% grav. Si O2 3,63% 13,24% 4,12%
HAp 1,5% grav. Si O2 3,21% 9% 5,05%

4.1.1.2. Difrac ția de Raze X
Prin difractometria de raze X se poate determina gradul de cristalinitate al pulberilor și
mărimea cristalitelor din structura particulelo r.
Difrac ția de raze X pentru probele calcinate la 300°C, cu palier de 2 ore, permite observarea
interferen țelor de difrac ție caracteristice hidroxiapatitei, conform fi șei ASTM ata șate.
10 20 30 40 50 60 
TCP


HAp
















Hap 0,5% wt. Mg-1% wt. Si
Hap 1,5% wt. Si
Hap 1% wt. Si
2Hap nesubs .Hap O,5% wt. Si

Fig. 5 Difractogramele pulberilor calcinate la 300°C

24 Din figura 5 se poate observa și că nu există diferen țe între proba de HAP pur și celelalte
probe. Și deci, introducerea de ioni substituen ți în sistemul hidroxiapatitei nu produce schimbări
în structura acesteia interferen țele de difrac ție cores punzătoare ionilor de SiO 44- datorită
concentra ției scăzute în care ace știa au fost introdu și în structura hidroxiapatitei nu sunt
eviden țiate în aceste difractograme.
De asemenea se poate observa o u șoară descompunere a probelor disubstituite de
hidroxiap atită în trifosfat de calciu. Acest lucru se datorează substitu ției care destabilizează
structura hidroxiapatitei.
4.1.1.3. Microscopie electronică de transmisie
Prin imagistica TEM se pot determina atât morfologia particulelor de HAp cât și mărimea
acesto ra.

Figura 6. Imagini TEM, SAED și EDAX pentru HAp nedopată

25 Din imaginile TEM ale probei de HAp nedopată (figura 6) se observă particule aciculare
mici cu diametre de cca. 10 nm și lungimi de până la 50 nm. Nu se observă modificări
morfologice prin su bstitu ție cu siliciu și magneziu. Spectrul EDAX nu indică impurificări
accidentale ale probelor.
4.1.1.4. Spectrometrie FT -IR
Am folosit spectroscopia FTIR (FT -IR Thermo iN10 -MX) pentru a determina picurile
caracteristice pentru hidroxiapatită și interac țiunile ce au loc între compu șii existen ți în structura
acesteia. În figura 5 sunt prezentate spectrele FTIR ale probelor calcinate.
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500PO3-
4
HAp 0.5% grav.Mg – 1% grav. SiHAp 1,5% grav. SiHAp 1% grav. SiHAp 0,5% grav. Si
numar de unda (cm-1)HAp nesubs.
-Si-O-Si-
Si-OH

Fig. 7 Spectrele absorb ție FTIR ale probelor calcinate
Figura 5 prezintă benzile specifice pentru punțile de hidrogen din gruparea OH..O la 3426
cm-1 – 3438 cm-1 în toate probele de HA p studiate. În zona 3566 cm-1 apar grupările OH libere de
pe suprafa ța particulelor pentru toate probele de HAP. Benzile de la 1090 cm-1, 1030 cm-1, 960
cm-1, 600 cm-1, 562 cm-1 corespund vibra țiilor PO 43-. Spectrele FT -IR prezintă și două benzi
caracteristice: una la 980 cm-1 atribuită vibra ției Si -OH din gruparile de silanol și banda de la

26 1100 cm-1 care corespunde vibra ției –Si-O-Si- din legătura siloxan. Prezen ța lor s e datorează
introducerii în sistem a ionilor silicat, care intră în structura hidroxiapatitei și formează legături
silanolice și siloxanice.

4.1.2.1. Obținerea și caracterizarea corpurilor ceramice poroase
Pulberea omogenizată cu glucoză și fasonată uniax ial sub formă de probe cilindrice a fost
supusă tratamentului de sinterizare la 650°C, 750°C, 1100°C. Aceste temperaturi au fost alese
pentru o compara ție cât mai elocventă a proprietă ților biologice, deoarece peste 750°C
hidroxiapatita se descompune in tr ifosfat de calciu, un alt biomaterial de interes.

4.1.2.2. Difrac ția de Raze X
În figura 6 sunt prezentate difractogramele probelor sinterizate la 650°, 750° și 1100°C. În
probele sinterizate la 650°C se pot observa atât interferen țele de difrac ție core spunzătoare HAp,
cât și cele corespunzătoare fosfatului tricalci c, conform fi șelor ASTM ata șate.
În probele sinterizate la 750°C se deceleaza numai picuri specifice HAp iar în cele sinterizate
la 1100°C se poate observa completa descompunere a pulberii de HAp în fosfat tricalcic în urma
tratamentului termic. Această descompunere nu este neapărat un lucru negativ deoarece fosfatul
tricalcic (TCP) este un material bioresorbabil, ceea ce poate fi un aspect pozitiv al unui scaffold și
de asemenea se poate ob ține o compara ție între 2 biomateriale pentru care s -au folosit acelea și
materii prime și condi ții de procesare.

27 a
b
c

Figura 6. Difractogramele probele sinterizate la 650°C (a), 750°C ( b) și 1100°C ( c)

28 4.1.2.3. Microscopie electronică de baleiaj
În imaginile SEM din figurile 7 – 9 sunt prezentate probele de hidroxiapatită.
Din aceste imagini se poate observa aspectul nesinterizat al probelor sinterizate la 650°C ,
acest fapt se datorează temperaturii scăzute a tratamentului termic. Din acest motiv se tul acesta
de probe a fost foarte friabil, neputându -se determina proprietatile ceramice ale acestora.
De asemenea se poate observa cu u șurință si porozitatea ridicată si neuniformă a probelor,
acesta este datorată atât tratamentului termic care a fost făc ut la o temperatură scăzută, cât și
glucozei, care în urma tratamentului termic s -a descompus lăsând în structură o porozitate
suplimentară.
De asemenea în figura 8 a probelor sinterizate la 750°C putem observa acela și aspect
nesinterizat, alături de o por ozitate ridicată.
În figura 9 sunt prezentate imaginile SEM ale probelor sinterizate la 1100°C în acestea putem
observa porozitatea ridicată mixtă, cu pori intergranulari, cât și intragranulari, ace știa având o
distribu ție neuniformă pe suprafa ța probelor .
Porozitatea ridicată a tuturor probelor este datorată glucozei, care a fost fololosită ca agent
porogen. Temperatura de descompunere a glucozei este aproximativ 311,4°C, ceea ce o face un
veritatil agent porogen.
Rezultatele indică faptul că substitu ția hidroxiapatitei cu siliciu și cu siliciu și magneziu nu
are o influen ță semnificativă asupra morfologiei acesteia.

29
Fig. 8 Imagini SEM ale probei sinterizate la 650°C: a) hidroxiapatita nesubstituită, b) 0,5% grav.
SiO2, c) 1%grav Si O2, d) 1,5% grav. Si O2, e) 0,5% grav. Mg -1% grav. Si O2.

30
Fig. 8 Imagini SEM ale probei sinterizate la 750°C: a) hidroxiapatita nesubstituită, b) 0,5% grav.
SiO2, c) 1%grav Si O2, d) 1,5% grav. Si O2, e) 0,5% grav. Mg -1% grav. Si O2.

31
Fig. 9 Imagini SEM ale probei sinterizate la 650°C: a) hidroxiapatita nesubstituită, b) 0,5% grav.
SiO2, c) 1%grav Si O2, d) 1,5% grav. Si O2, e) 0,5% grav. Mg -1% grav. Si O2.

32 4.1.2.5. Proprietă ți ceramice
În tabelul 2 sunt prezentate rezultatele ob ținute pentru probele HAp, HAp -0,5% grav. Si O2,
HAP -1,5% grav. Si O2 și HAp 0,5% Mg – 1%Si O2 sinterizate la 750°C și 1100°C. Trebuie
menționat ca probele sinterizate la 650°C au fost foarte friabile, fapt ce a făcut imposibilă
determinarea proprietăților lor ceramice.
Se pot constata valorile mari de poroz itate deschisă pentru probele sinterizate la 750°C. Este
firesc ca accelerarea procesului de sinterizare (ca urmare a cre șterii temperaturii de sinterizare) să
îmbunătă țească proprietă țile mecanice.

Tabelul 2. Proprietă țile ceramice ale probelor sinteriza te
Cod proba ρaparenta
(g/cm3) ρrelativa
(%) Porozitatea
deschisa (%) Absorb ția
(%)
750°C
HAp nedop 0,89 28,17 58,82 62,15
HAp 0.5%Si O2 0,91 28,77 56,01 60,06
HAp 1%Si O2 0,94 29,94 50,47 57,03
HAp 1,5%Si O2 0,96 30,70 49,65 56,18
HAp 0,5%Mg -1%Si O2 0,91 28,98 52,05 57,75
1100°C
HAp nedop 1,60 50,76 11,23 21,56
HAp 0.5%SiO 2 1,70 54,00 9,25 18,89
HAp 1%SiO 2 1,57 50,14 12,2 23,36
HAp 1,5%SiO 2 1,67 53,11 10,54 20,66
HAp 0,5%Mg -1%SiO 2 1,51 48,28 12,61 23,42

33 4.1.2.6. Testări în vitro
Proliferarea c elulara – MTT assay (CellTiter 96® Non -Radioactive Cell Proliferation Assay,
Promega)
Pe baza acestei metode colorimetrice cantitative se permite aprecierea proliferării, viabilita ții
și citotoxicită ții celulare. Metoda se bazează pe reducerea unei săruri de tetrazoliu galbene MTT
(bromura de3 -(4,5dimetiltiazoliu) -2,5-difeniltetrazoliu) la formazan de culoare albastru -închis.
Reducerea realizată de enzime mitocondriale (în special succinat dehidrogenaza) este un indiciu
al integrită ții celulare/mitocondrial e. Formazanul insolubil în apă poate fi solubilizat cu
izopropanol, dimetilsulfoxid sau alt solvent organic. Densitatea optică (DO) a formazanului
solubilizat este evaluată spectrofotometric, ob ținându -se o func ție absorban ță-concentra ție
colorant -număr de celule active metabolic din cultura. Celulele se cultivă în plăcu țe cu 96 de
godeuri, având o densitate de însămân țare de 3000 celule /godeu în diferite condi ții
experimentale. Ulterior s -a adăugat 15 µl solu ție I și s-a incubat la 37°C timp de 4 ore. Se adaugă
soluția II și se pipetează energic pentru solubilizarea cristalelor de formazan. Se incubează 1 ora,
apoi se pipetează pentru omogenizare și se elimină bulele pentru a nu interfera cu citirea. Se
citește la spectrofotometru la 570 nm (TECAN, Männedo rf, Switzerland).
În figura 11 ne sunt prezentate rezultatele testelor în vitro după 24 ore, acestea arată o
viabilitate celulară mai ridicată pentru proba de HAp 1% grav. Si O2 sinterizată la 750°C fa ță de
celelalte probe, un alt aspect remarcat este că și proba de HAp 1% grav. sinterizată la 1100°C
prezintă o viabilitate celulară mai ridicată decât proba control. Totodată se poate observa că toate
probele care prezintă substitu ție au valori mai bune decât proba nesubstituită.
Figura 12 ne prezintă rezulta tele testelor în vitro după 48 de ore. Aici putem observa ca toate
cele 3 probe dublu substituite HAp 1% grav. Mg -1% grav. Si O2 sinterizate la 650°C, 750°C și
1100°C prezintă o viabilitate celulară mai ridicată fa ță de proba control și încă un aspect
impor tant, toate probele substituite prezintă rezultate mai bune decât proba nesubstituită.
Testul MTT arată că probele preparate nu au efect toxic asupra celulelor și prezintă o bună
biocompatibilitate cu acestea.
În completarea analizelor de viabilitate vine imaginile de fluorescen ță cu mediul de cultură
(fig. 13), acestea dovedesc încă o dată buna compatibilitate dintre celule și probele supuse
testărilor.

34

Fig. 9 Viabilitatea celulară după 24 ore

Fig. 9 Viabilitatea celulară dupa 48 ore

CellTracker ™ R ed CMTPX
CellTracker ™ Red CMTPX este un colorant fluorescent utilizat pentru monitorizarea
viabilită ții și motilita ții celulare. Colorantul fluorescent CellTracker ™ Red CMTPX a fost

35 proiectat pentru a trece liber prin membranele celulare în interiorul ce lule, unde este transformat
într-un produs de reac ție impermeabil de către celule. Colorant CellTracker ™ Red CMTPX este
reținut în celulele vii și se transmite de la o genera ție la alta către celulele fiice. Colorant
CellTracker ™ Red CMTPX este proiecta t să afi șeze fluorescen ță pentru cel pu țin 72 de ore,
având proprietă ți superioare: acesta este stabil, netoxic la concentra ții de lucru, bine păstrat în
celule, și fluorescent la pH fiziologic. Red CMTPX se adaugă peste celule la o concentra ție de 3
uM și se incubează timp de 30 de minute. Se spală celulele pentru îndepărtarea colorantului care
nu a pătruns în celule și se vizualizează la microscopul de fluorescen ță având un spectru de
emisie în ro șu (577/602 nm).

Analiza ciclului celular prin citometr ie in flux
La 48 de la cultivarea celulelor endoteliale EAhy926 acestea au fost colectate și spălate în
PBS și centrifugate la 300g, 5 minute. Sedimentul a fost resuspendat în 2 ml etanol 70% rece și
încubat timp de 30 minute. După 30 de minute celulele a u fost centrifugate si apoi spălate în 5 ml
PBS pentru îndepărtarea etanolului și centrifugate la 300g, 5 minute. Sedimentul a fost
resuspendat in 400 µl PBS peste care s -a adăugat 50 ul iodura de propidiu (400ug/ml) și s-a
incubat timp de 30 de minute la intuneric. Probele au fost apoi analizate la citometrul de flux
Gallios (Beckman -Coulter).

36

Fig. 10 Imagini de fluorescenta cu mediul de cultură după 48 de ore de incubare:
a.)HAp sinterizată la 650°C , b.)HAp -1% grav. Si O2 sinterizată la 650°C , c.)HAp-0.5% grav. Mg
-1% grav. SiO2 sinterizată la 650°C, d.) HAp -1% grav. Si O2 sinterizată la 750°C, e.) HAp -0.5%
grav. Mg -1% grav. SiO2 sinterizată la 750°C, f.) HAp -1% grav. Si O2 sinterizată la 1100°C, g.)
HAp -0.5% grav. Mg -1% grav. SiO2 sinterizată la 110 0°C

37 5. Concluzii
In urma experimentelor realizate cu diferite cantitati de siliciu, s -a observant diferenta in ceea
ce priveste porozitatea si structura materialului obtinut prin metoda simpla, cea de precipitare,
Pentru a controla morfologia si dimens iunea porilor din material, procesul de sinterizare s -a
realizat la doua temperature, la 750°C respectiv 1100°C. Si s -a observat cu ajutorul Microscopie
electronică de baleiaj (SEM) faptul ca probele sinterizate la 750°C prezinta o porozitate mai
ridicata , insa nu are o structura bine sinterizata datorita temperaturi mici. in schimb, probele
sinterizate la temperatura ridicata de 1100°C am observat structura bine sinterizata ,
consolidarea, densificarea si aglutinarea cristalelor aciculare.
Cu ajutorul s pectroscopiei FT -IR , am determinat legaturile caracteristice pentru proba
noastra prin vibratia compusilor la lungimi de unda specifice HA, din spectrele FT -IR sa putut
identifica benzile largi specifice pentru gruparile OH
Iar prin analiza TEM (Microscop ie electronica de transmisie) , s -a putut demonstra ca
particulele aciculare au diametre de cca. 10 nm si lungimi de pana la 50 nm. De unde putem trage
concluzia ca pulberile noastre sunt la scala nanometrica, iar proba noastra este formata din
nanopulber i.
Ultimul test pe care am supus probele noastra a fost testari in vitro, pentru a vedea daca
proba noastra dauneaza viabilitatea celulara, unde probele noastre au fost incubate in mediu de
cultura , am constatat ca dupa o perioada de incubare , viabilita tea celulara nu a scazut ci din
contra a crescut, ceea ce demonstreaza ca proba nu este toxica asupra celulelor si poate avea o
compatibilitate biologica ridicata , acest lucru ne asigura faptul ca dupa implantarea HA putem
avea o biocompatibilitate fata d e tesutul uman si nu vor fi reactii alergice sau efecte adverse
contra materialului obtinut.

38 Bibliografie
1. Scheffler M., Colombo P. Cellular Ceramics – Structure, Manufacturing, Properties and
Applications , Wiley -VCH Verlag GmbH &Co. KGaA, Weinheim, 54 7-559, 2005
2. I.Sopyan, M.Mel, S.Ramesh, K.A.Khalid, Porous hydroxyapatite for artificial bone
applications , Science and Technology of Advanced Materials 2006;
doi:10.1016/j.stam.2006.11.017
3. D. Eichert, C. Drouet, H. Sfihia, C.Rey, C.Combes, Nanocrysta lline Apatite -Based
Biomaterials, Nova Science Publishers, Inc. 2009.
4. Curs 4 Ceramica Fosfatica, Nanomateriale FIM . pag 31 -52
5. Joon Park, Bioceramics -Properties, Characterizations and Applications, Editura Springer 2008
6. Joon Parck, Bioceramics. Pr operties, Characterization and Applications , Springer 2008.
7. I. Sopyan, M. Mel, S. Ramesh, K.A. Khalid, Porous hydroxyapatite for artificial bone
applications , Elsevier 2007.
8. Lăcrimioara -Bianca Pop, Teza doctorat: Preparare și proprietă ți fizico -chimi ce ale unor
compozite nanostructurate formate din colagen, chitosan și diverse pulberi anorganice bioactive,
pag 38, 2011
9. Sung -Baek C., Fumiaki M., Tadashi K., Kazuki N., Naohiro S., Takashi N.; Apatiteforming
ability of silicate ion dissolved from sili ca gels; Journal of Biomedical Materials Research, pg.
F375-381, 1996.
10. Karin A. H., Peter A. R., Nigel S., Thomas B.; Effect of silicon level on rate, quality and
progression of bone healing within silicate -substituted porous hydroxyapatite scaffolds;
Biomaterials, pg. 5014 –5026, 2006.
11. Yoshinobu F., Hiroshi Y., Kunio K., Tsugio S. , Akitsugu O.; Preparation of needle -like
hydroxyapatite by homogeneous precipitation under hydrothermal conditions; Journal of
Chemical Technology & Biotechnology, pg. 34 9 – 353, 2007.
12. Shigeru S., Takayuki Y., Toshihiro M., Hiromu H., John B. M.; Preparative enhancement of
the thermal stability of calcium hydroxyapatites ; Journal of Solid State Chemistry, pg. 319 -324,
1999.
13. Kasemo, B. and Lausma, J. (1988). Biomat erial and implant surface: a surface science
approach. Int. J. Oral Maxillofac Impl. 3, 247 –259
14. American Scociety for Testing and Materials, F67 -89, F136 -84, 1992 15. Comte, T. W. 1984.
Metallurgical observations of biomaterials, in Contemporary Bioma terials, Boretos, J. W. and
Eden, M., Eds, Noyes, Park Ridge, NJ 16. Wynblatt, P. (1986). Platinum Group Metals and
Alloys. In: Encyclopedia of Materials Science and Engineering, M. B. Bever, Ed. (Oxford,
Cambridge: Pergamon Press), pp. 3576 –3579
17. Smit h, W. F. (1993). Structure and Properties of Engineering Alloys, 2nd ed. (New York:
McGraw -Hill)
18. B. Basu, D.S. Katti, A. Kumar, Advanced Biomaterials, American Ceramic Society, Wiley
and Sons, Hoboken, New Jersey, 2009
19. Biomateriale si biocompatib ilitatea acestora cu organismul uman,
http://www.scribd.com/doc/41463101/Biomateriale -Si-tea-Acestora -Cu-Organismul -Uman
20. Buddy D. Ratner et al, Biomedical Engineering desk reference, Elsevier Academic Press,
2009
21. POSNER A.S. The mineral of bone. C lin. Orthop Relat Res, 1985, 200:87 -89 89. Paul W.
Brown, Brent Constantz – Hydroxyapatite and related materials, 1994, CRC Press

39 20. L.L. Hench, EC Ethridge, Biomaterials: An interfacial Approach, Academic press, New York,
1982
21. R.Z. Legeros, Apatite s in biological systems, Prog. Cryst. Growth Charact. 4, 1981, 1 -45
22. Queiroz AC, Santos JD, Monteiro FJ, Gibson IR and Knowles JC (2001) Adsorption and
release studies of sodium ampicillin from hydroxyapatite and glass -reinforced hydroxyapatite
composit es, Biomaterials 22:1393 -1400.
23. Damien E, Hing K, Saeed S and Revell PA (2003) A preliminary study on the enhancement
of the osteointegration of a novel synthetic hydroxyapatite scaffold in vivo, J. Biomed. Mater.
Res. 66A:241 -24
24. Block JE and Thor n MR (2000) Clinical indications of calcium -phosphate biomaterials and
related composites for orthopedic procedures, Calcif. Tissue Int. 66: 234 -238
25. K. De Groot, C. De Putter, P. Smith, A. Driessen, Mechanical failure of artificial teeth made
of dense calcium phosphate, Sci. Ceram. &&, 1981, 433 -437
26. J. Huaxia, P.M. Marquis, Sintering behaviour of Hydroxyapatite reinforced with 20% Al2O3,
J. Mater. Sci. 28, 1993, 1941 -1945
27. Y.M.Kong, S. Kim, H.E. Kim, Reinforcement of hydroxyapatite bioceramics by addition of
ZrO2 coated with Al2O3, J. Am. Ceram. Soc. 82, 1999, 2963 -2968
28. R. Ramachandra Rao, T.S. Kanaan, Synthesis and sintering of hydroxyapatite –zirconia
composites, Mater. Sci. Eng., C 20, 2002, 187 -193
29. Bauer TW and Muschler GF (2000) Bone graft materials. An overview of the basic science,
Clin. Ortho. 371:10 -27
30. Fleming JE Jr., Cornell CN and Muschler GF (2000) Bone cells and matrices in orthopedic
tissue engineering, Ortho. Clin. North Am. 31:357 -374.
31. OShors EC (1999) Coralli ne bone graft substitutes, Ortho. Clin. North Am. 30: 599 – 613.
32. Kay M.I, Young R.A, Posner A.S, Crystal structure of hydroxyapatite, Nature, 204,
1050 -1052, (1964)
33. Young R.A, Some aspects of crystal structural modeling of biological apatites, Col l. Intern.
CNRS, Paris, 230, 21 -39, (1975)
34. Legeros R.Z, Taheri M.H, Quirolgico G.B, Legeros J.P, Formation and stability of apatites :
effects of some cationic substituants, Intern. Cong. Phosphorus Compounds, Boston, 89 -103,
(1980)
35. Rey C, Etude des relations entre apatites et composés moléculaires, Thèse d’état, INPT,
(1984)
36. Holmes RE, Bucholz RW and Mooney V (1987) Porous hydroxyapatite as a bone graft
substitute in diaphyseal defects: A histometric study, J. Orthop. Res. 5:114 -121
37. Buc holz RW (2002) Nonallograft osteoconductive bone graft substitutes Clin. Ortho.
395:44 -52.
38. S. Kannan, S.I. Vieira, S.M. Olhero, P.M.C. Torres, S. Pina, O.A.B. da Cruz e Silva, J.M.F.
Ferreira, Synthesis, mechanical and biological characterization of io nic doped carbonated
hydroxyapatite/β -tricalcium phosphate mixtures, Acta Biomaterialia 7 (2011) 1835 –1843
39. Elsie Damien and Peter A Revell, Enhancement of the Bioactivityof Orthopaedic
Biomaterials:Role of Growth Factors, IonSubstitution and Implant, BONE GRAFTS AND
BONE SUBSTITUTES, World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd., Singapore, 2005, 481
40. Webster TJ, Ergun C, Doremus RH, Bizios R.Hydroxyl apatite with substituted magnesium,
zinc, cadmium, and yttrium II: mechanisms of osteoblast adhesion.J Biomed Mater Res 2002;
59:312 –7
41. Ito A, Ojima K, Naito H, Ichinose N, Tateishi T.Preparation, solubility, and cytocompatibility
of zinc -releasing calcium phosphate ceramics.J Biomed Mater Res 2000;50:178 –83.
42. Ito A, Kawamura H, Miyakawa S, Layroll e P, Aomori R, Tsutsumi S.Resorbab ility reduction
by the incorporation of zinc into tricalcium phosphate.Key Eng Mater 2001;192 –195: 199 –202.

40 43. Hidaka S, Okamoto Y, Abe K, Miyazaki K.Effects of indium and iron ions on in vitro
calcium phosphate and crys tallinity. J Biomed Mater Res 1996;31:11 –8.
44. Czesława Paluszkiewicz, Anna Slósarczyk, Dawid Pijocha, Maciej Sitarz, Mirosław
Bucko,Aneta Zima, Anna Chróscicka, Małgorzata Lewandowska -Szumieł, Synthesis, structural
properties and thermal stability of Mn -doped hydroxyapatite, Journal of Molecular Structure 976
(2010) 301 –309
45. Zhang XS, Revell PA, Evans P, Tanner KE and Howlett CR (1998) Magnesium -ion
implantation of HA -coated implants enhances bone ingrowth in rabbits, Transac. Soc.
Biomaterials 21: p. 187
46. Toba Y, Kajita Y, Masuyam R, Takada Y, Suzuki K and Aoe S (2000) Dietary magnesium
supplementation affects bone metabolism and dynamic strength of bone in ovariectomised rats, /.
Nutr. 130:216 -220
47. Serre CM, Papillard M, Chavassieux P, Voegel JC, Boivin G. Influence of magnesium
substitution on a collagen -apatite biomaterial on the production of a calcifying matrix by human
osteoblasts.J Biomed Mater Res 1998;42:626 –33.
48. Gibson IR, Bonfield W. Preparation and characterization of magnesium/ carbonate
cosubstituted hydroxyapatites. J Mater Sci Mater Med 2002;13:685 –93.