Studiul Corelatiilor Genotip Fenotip In Hepatopatia din Mucoviscidoza (fibroza Chistica)

Diverse2

Studiul Corelatiilor Genotip Fenotip In Hepatopatia din Mucoviscidoza (fibroza Chistica)

Byadmin ianuarie 1, 2024

LUCRARE DE LICENȚĂ

„Studiul corelațiilor genotip- fenotip în hepatopatia din mucoviscidoză (fibroza chistică)”

CUPRINS

PARTEA GENERALA

Introducere

Definiție

Istoric

Epidemiologie

Incidența clinică

Sex ratio

Speranța de viață

Epidemiologia genei CFTR

Genetica

Generalități

Localizarea CFTR

Structura CFTR

Clase de mutații

Mutațiile CFTR?

Mecanismele bolii – fiziopatologie și patogenie

Tractul gastro-intestinal

Implicarea hepato-biliară

Patogeneza afectării hepatice din mucoviscidoză

Mecanisme iplicate

Factorii obstructivi

Cascada fibrinogenezei

Factorii distructivi

Diagnostic

Diagnostic prenatal

Diagnostic postnatal

PARTEA SPECIALA

Obiectivele studiului

Materiale și metode

Rezultate si discuții

Date epidemiologice

Prevalența

Incidența

Distribuția cazurilor în funcție de sex

Distribuția pe grupe de vârstă

Factori de risc

Ileusul meconial

Statusul nutrițional

Elemente teguentare specifice afectării hepatice

Evaluarea clinică a hepatomegaliei și splenomegaliei

Insuficiența pancreatică

Mutații genetice

Explorări paraclinice

Ecografia abdominală

Biopsia hepatică

Concluzii

PARTEA GENERALĂ

1.INTRODUCERE

1.1.Definiție

Mucoviscidoza(fibroza chistică) este cea mai frecventă boală monogenică a rasei caucaziene, potențial letală, cu transmitere recesiv autosomală, manifestată printr-un polimorfism clinic marcat asociat unor mutații la nivelul genei CFTR(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator).

Clasic, mucoviscidoza e definită(genotipic) prin existența a două alele defective la nivelul CFTR caracterizându-se printr-o multitudine de trăsături clinice(fenotip), asociate cu creșterea valorilor concentrației Cl- în sudoare. Întrunirea acestor condiții are loc în cazurile tipice de mucoviscidoză. (Figura 1).1

Deși o valoare mai mare sau egală cu 60 mmol/l a testului sudorii este considerată a fi diagnostică pentru mucoviscidoză, concentrațiile Cl- în sudoare înregistreaza valori mai scăzute la pacienții cu forme atipice (aproximativ 60-90 mmol/l); mai mult, rezultatele se situează uneori la valori “borderline”(40-50 mmol/l) sau chiar în limite normale(<40 mmo/l) în cazurile atipice. 2

Pacienții cu mucoviscidoză atipică au cel puțin o copie a unei gene mutante ce conferă funcționarea parțială a proteinei CFTR; aceste cazuri nu asociază semne și simptome de maldigestie, deoarece funcția pancreatică este prezervată partial1 (Fig.1)

Figura 1. Mucoviscidoza –manifestări tipice și atipice, dupa Knowles MR, Durie PR.

Manifestările tipice sunt reprezentate în partea stângă, iar cele atipice în partea dreaptă. Pacienții “atipici” au un status nutrițional mai bun și o mai bună speranță de viață. Deși afectarea pulmonară se manifestă variabil, la acești pacienți se înregistrează un debut tardiv sau o progresie mai lentă a bolii pulmonare. Funcția glandelor sudoripare evidențiată prin modificări ale testului sudorii este alterată, dar nu într-o măsură atât de mare ca și în cazurile tipice de mucoviscidoză. Pancreatitele sunt frecvente în cazurile atipice. Totuși, sinuzitele cronice, azoospermia obstructivă apar la ambele grupe de pacienți. În baza celor enunțate putem concluziona că mutațiile CFTR, probabil asociate cu alți factori, genetici sau ambientali, pot conferi predispoziție pentru apația sinuzitei, pacreatitei sau absenței congenitale a vaselor deferente în populația generală.

Unele mutații CFTR, însoțite de prezența unei funcții reziduale a proteinei CFTR, au fost asociate cu afectare “mono-organică”, de exemplu debutul tardiv al afectării pulmonare, absența congenitală a vaselor deferente sau pancreatitele idiopatice. 3,4,5 citat de1 Pentru a face față provocării ridicate de cazurile atipice de mucoviscidoză, a fost inițiată o declarație de consens, ce definește mucoviscidoza ca și prezența unui sindrom clinic “coerent” plus, fie dovada unei disfunctii CFTR(valori anormale ale testului sudorii sau diferența de potential nasal), fie confirmarea a două mutații cauzatoare de boală în gena CFTR. 6

Declarația de consens privind diagnosticul mucoviscidozei6, dupa Rosenstein BJ, Cutting GR. The diagnosis of cystic fibrosis: a consensus statement: Cystic Fibrosis Foundation Consensus Panel. J Pediatr 1998;132:589-595:

Testul sudorii pozitiv

Una sau mai multe trăsături clinice caracteristice

-boală cronică sino-pulmonară

-modificări gastrointestinale sau de nutriție

-sindrom de pierdere de sare

-bărbati-azoospermie obstructivă

Sau:

-istoric de mucoviscidoză la rude

-test screening pozitiv la nou-născut

-alterarea transportului ionic la nivelul epiteliului nazal

Pacienții la care se descoperă o singură mutație CFTR, și la care se inregistrează funcție reziduală a proteinei, dar nu întrunesc criteriile de diagnostic, sunt considerați a avea boală CFTR-asociata -“variant cystic fibrosis”.7

1.2. Istoric

Considerații asupra manifestărilor bolii s-au făcut de către Landsteiner în 1905 care face legătura între ileusul meconial și afectarea pancreasului.8

Ulterior în 1936 Fanconi și colaboratorii au descris fibroza chistică congenitală de pancreas asociată cu bronșiectazii, considerând că este vorba de un sindrom aparte cu evoluție fatală.8

In 1938 , Dorothy Andersen și scoala sa aduce recunoașterea unanimă a “fibrozei chistice de pancreas” ca boală distinctă .9

Considerații fiziopatologice sunt remarcate pentru prima dată de către Farber care evidențiază afectarea glandelor exocrine tradusă prin deficitul de clearance al mucusului, enunțând pentru prima dată termenul de mucoviscidoză. În aceeași perioadă, boala este denumită ca și “Dysporia entero-bronho-pancreatica congenital familaries” de către Glanzmann10.

În 1949, Lowe și al. au postulat că mucoviscidoza ar fi cauzată de un defect al unei singure gene (și deci al unei singure proteine), bazându-se pe pattern-ul recesiv autozomal de transmitere a bolii.11 , 12

Cunoașterea mecanismului molecular a fost baza multor încercări de a identifica proteina cauzativă. Nivelele mari de sare în sudoarea pacienților cu mucoviscidoză sugerează anomalii în transportul electroliților la nivelul glandelor sudoripare, Quinton stabilind că la acești pacienți sunt impermeabile canalele de ‘sudoare’13 citat de 12

Studiul epiteliului nazal și a membranei celulelor epiteliale de la nivelul căilor aeriene a demonstrat existența unui defect al canalelor de clor. Aceste descoperiri, confirmate de mai multe laboratoare, au dus la ipoteza că tocmai acest canal clor defectiv situat la nivelul apical al membranei epiteliilor respiratorii sau a glandelor ar putea sta la baza modificărilor întălnite în mucoviscidoză. 12

Odată cu demonstrarea anomaliilor electrolitice din sudoarea copiilor cu mucoviscidoză, Di Sant’Agnese și colaboratorii descoperă în 1953 și testul diagnostic patognomonic formelor tipice de boală.14

La scurt timp dupa descoperirea tulburării de permeabilitate a canalului de clor, Collins, Riordan, Tsui, și colaboratorii au identificat gena responsabilă pentru aceste modificări. Independent și fără a cunoaște structura proteinei, au numit-o gena CFTR(Cystic Fibrosis Transmembranar Conductance Regulator) 8,12

Anul 1989 a fost marcat de descoperirea genei, a locusului specific la nivelul brațului lung al cromozomului 7 și a proteinei determinate de aceasta.

Odata cu aceste descoperiri s-au făcut progrese importante în ceea ce privește cunoașterea bolii și implicit managementul său.

O consecință importantă a fost ameliorarea prognosticului, creșterea speranței de viață și a calității vieții. La descoperirea bolii, majoritatea pacienților decedau la vârsta de sugar. Începând cu anii 60, media de supraviețuire a crescut de la 3-5 ani la 25-30 pentru mai mult de 50% din bolnavi, având în vedere depistarea precoce și tratamentul corect, în ciuda progresiei bolii pulmonare.15

Se consideră că speranța de viață la cei născuți în anii 90 va fi de 40 ani.21

Aceasta va fi posibilă datorită achizițiilor în cunoașterea bolii și prin construirea unui sistem complex de tratament și îngrijire a pacienților cu mucoviscidoză.

2.EPIDEMIOLOGIE

2.1.Incidența clinică

Clasic, incidența fibrozei chistice în populația caucaziană este în medie de 1:2 000 – 1:2 500 de nou-născuți.8

Screeningul neonatal precum și lărgirea posibilităților de diagnostic(testarea genetică) au modificat substanțial datele epidemiologice.

Astfel, un studiu efectuat în UK arată o incidență de 1:2 300 față de 1:1 600 estimată inițial.16

În țara noastră s-a efectuat, în Clinica II Pediatrie Timișoara, un studiu pilot de screening neonatal prin test meconial, ce a stabilit o incideță de 1:2 054 – cifră apropiată de media europeană17.

În funcție de distribuția geografică, datele raportate au fost diferite.

Tabel 1- Incidenta mucoviscidozei – după Popa și colaboratorii – “Fibroza Chistica (Mucoviscidoza)”8

Screeningul neonatal precum și lărgirea posibilităților de diagnostic(testarea genetică) au modificat substanțial datele epidemiologice. Astfel, un studiu efectuat în UK arată o incidență de 1:2 300 față de 1: 1 600 estimață inițial.8

Odată cu imbunătățirea supraviețuirii la pacienții cu mucoviscidoză, spectrul clinic al acestei complexe boli continuă să evolueze.

Studii longitudinale întinse precum și existența registrelor de pacienți în Canada, Statele Unite [United States CF Foundation National Patient Registry (CFF NPR), Epidemiology Study în Cystic Fibrosis (ESCF)], și Europa [European Epidemiologic Registry of Cystic Fibrosis (ERCF), United Kingdom CF Database] permit continua reevaluare a spectrului bolii și a complicațiilor.15

Existența acestor registre cu pacienți plasează fibroza chistică în fruntea epidemiologiei bolilor genetice permițând o evaluare extinsă a istoriei naturale a bolii.

2.2. Sex ratio

Raportul între sexe privind incidența mucoviscidozei pare să fie în favoarea sexului masculin.8,15

Date comparative provenind din UK au relevat variații între 104,8-106,1 în favoarea băieților raportat la 100 fete, în perioada 1968-1988.8

2.3. Speranța de viață

Îmbunătățirile aduse în ingrijirea pacienților cu mucoviscidoză au ameliorat rata de supraviețuire până după 30 ani. 18

Îmbunătățirea ratei de supraviețuire la pacienții cu mucoviscidoză în ultimele decade a fost demonstrată în SUA, Canada și Europa. Recent, Kulich și colaboratorii au evaluat tendința la supraviețuire pe etape de vârstă , raportând o îmbunătățire a speranței de viață limitată la pacienții între 2-15 ani.15

Între 1985-1999, rata mortalității a fost de 61% la cei între 2-5 ani, 70% (60-88%) pentru pacienții cu vârstă între 6-10 ani și 45%(32-66%) pentru cei 11-15 ani. Rata mortalității s-a redus nesemnificativ la cei peste 15 ani.15

S-a înregistrat o rată a mortalității mai redusă la sexul masculin comparativ cu cel feminin la pacienții cu vârstă cuprinsă între 2-20 ani.15 Se pare că la această creștere a speranței de viață au contribuit mai mulți factori ca: îmbunătățirea statusului nutrițional și introducerea de noi terapii.

Mulți cercetători au încercat să constituie scale de parametri utile pentru estimarea speranței de viață(utile mai ales pentru încadrarea pacienților pe liste de transplant). Liou și colaboratorii19 utilizând US CFF NPR(registrul Statelor Unite ale Americii), au dezvoltat și validat un model de prognostic pe 5 ani, urmărind 9 parametri ce includ caracteristici demografice și clinice, încercând să identifice pacienții cu cel mai mare beneficiu în urma transplantului pulmonar.15 Mayer-Hamblett și colab20 au inițiat un alt model utilizând US CFF NPR, comparându-l ulterior cu potențialul prognostic al scaderii FEV1 cu mai puțin de 30% din valoarea predictivă fără a exista diferențe semnificative. Ambele studii au demonstrat că e mai ușor de prezis cine va trăi peste 2 ani, decât cine va muri în 2 ani. Folosirea ca unic criteriu a scăderii FEV1 este eronată, fiind de dorit luarea în calcul a unui model complex care să includă obligatoriu îmbunătățirea statusului nutrițional și introducerea de noi terapii.

Mulți cercetători au încercat să constituie scale de parametri utile pentru estimarea speranței de viață(utile mai ales pentru încadrarea pacienților pe liste de transplant). Liou și colaboratorii19 utilizând US CFF NPR(registrul Statelor Unite ale Americii), au dezvoltat și validat un model de prognostic pe 5 ani, urmărind 9 parametri ce includ caracteristici demografice și clinice, încercând să identifice pacienții cu cel mai mare beneficiu în urma transplantului pulmonar.15 Mayer-Hamblett și colab20 au inițiat un alt model utilizând US CFF NPR, comparându-l ulterior cu potențialul prognostic al scaderii FEV1 cu mai puțin de 30% din valoarea predictivă fără a exista diferențe semnificative. Ambele studii au demonstrat că e mai ușor de prezis cine va trăi peste 2 ani, decât cine va muri în 2 ani. Folosirea ca unic criteriu a scăderii FEV1 este eronată, fiind de dorit luarea în calcul a unui model complex care să includă obligatoriu factori clinici predictivi. 15

Alți factori de care depinde evoluția bolii sunt: statusul socioeconomic, factori de mediu, genetici și infecțioși. Există o corelație de directă proporționalitate între starea socioeconomică și funcția pulmonară. Nu s-au demonstrat diferențe semnificative între cei cu sau fără acces la terapii noi(tobramicina inhalatorie și dezoxiribonucleaza). Este clar rolul factorilor poluanți în declanșarea exacerbărilor afectării pulmonare.15

Impactul genotipului sau fenotipului asupra speranței de viață a fost evaluat de McKone și colab.15 Renunțând la clasificarea pacienților ca și genotip ΔF508 homozigot sau heterozigot, a luat în considerare clasificarea genotipică pe clase de mutații. Au demonstrat asocierea unei mortalități crescute la clasele I, II și III de mutații, în timp ce pacienții cu genotip aparținând claselor IV și V au cea mai redusă rată a mortalității.15

Caracteristicile clinice diferă în funcție de clasele de mutații, astfel pacienții din clasele IV și V au o valoare mai bună a FEV1% prognosticat, status nutrițional mai bun, o rată redusă de colonizare cu Pseudomonas, insuficiență pancreatică, de aici corelațiile cu rata supraviețuirii.

Un alt studiu ce a folosit datele din CFF NPR efectuat de Lai et al21 a arătat că există o bună corelare între starea la debut și evoluția bolii; pacienții care au o formă completă de boală au o speranță de viață mai scăzută, funcția pulmonară deteriorată semnificativ și o rată crescută de infecție cu Pseudomonas aeruginosa15 .

Studiile epidemiologice continuă să aducă informații noi atât pacienților cât și cercetătorilor, alimentând noi ipoteze patogenice.

Tot studiile epidemiologice aduc în discuție probleme ce devin din ce în ce mai importante odată cu creșterea ratei de supraviețuire, cum ar fi afectarea hepato-biliară, sarcina și riscul de cancer digestiv la adulții cu mucoviscidoză.

2.4. Epidemiologia genei CFTR

CFMDB Statistics: se cunosc până în prezent 1900 mutații în baza de date a „Cystic Fibrosis Consortium.”22 și încontinuu se descoperă noi mutații.

Deși nu este cunoscută harta genetică a epidemiologiei genei, există câteva principii care stau la baza studiilor epidemiologice genetice:

-frecvența genei defective pentru rasa caucaziană este de 1:50,

-frecvența heterozigoților de 1:25.

-numărul diferitelor tipuri de alele este mai mare de 1 300, mutația cea mai frecventă este deleția F508

Un studiu amplu european, pe termen lung, a fost lansat pentru a determina distribuția mutațiilor CFTR, cu scopul de a furniza indicații pentru screeningul de rutină, prin eforturile cumulate a 82 de centre europene.24 Macek și colaboratorii au prezentat rezultatele acestui studiu, după analizarea a 15 606 de pacienti(31 212 cromozomi), compilând și concluziile altor 102 studii originale europene. Structura genei a fost analizată în proportie de 73%, fiind descoperite 729 mutații.

Unele alele au apărut o singură dată, iar dintre celelalte, cele mai frecvente 20 au apărut în urmatoarele procente: F508del(63,45%), G542 X(2,73%), N1303(2,22%), W1282(1,60%), G551 D(1,25%), 1717-G>A(0,94%), R553X(0,79%), 621+1 G>T(0,59%), 3849+10 kb C>T(0,57%) etc. 24

S-au înregistrat diferențe marcate regionale și etnice a mutațiilor particulare în populațiile studiate; mai mult, statisticile au arătat corelații pozitive între frecvența deleției F508 și incidența mucoviscidozei.

3.GENETICA

3.1.Generalități

Cercetările efectuate la început s-au izbit de problema neidentificării proteinei defective; au fost suspectați a fi “patogeni” mai multi factori, cum ar fi: factorul diskinetic ciliar- depistat în serul bolnavilor, factorul inhibitor al Na din saliva pacienților cu mucoviscidoză, chiar existența unui antigen al mucoviscidozei codat de o genă localizată pe cromozomul 1.8,25

După descrierea proprietăților electrice ale epiteliului respirator în mucoviscidoză, asociat cu alterarea transportului transepitelial al Na și Cl(Knowles), observarea impermeabilității glandelor sudoripare (Quinton)8,12, s-a suspectat că mecanismul patogenic implică modul de circulație al ionilor de Na și Cl . Studiile ulteriore au demonstrat că proteina defectivă este responsabilă de alterarea canalelor de clor la nivelul membranei celulare. 8,12

Primul pas în localizarea defectului primar în mucoviscidoză l-a constituit identificarea cromozomului purtător al genei. Studii de screening au demonstrat apropierea genei mucoviscidozei de de alți markeri: Δ7 S15 și MET oncogena și Δ7S8 și COL1 A2, dovedindu-se că MET oncogena și Δ7S8 flancau gena mucoviscidozei, distanța fiind de aproximativ 1 500 kilobaze.26

Pasul următor a constat în identificarea locusului genei; s-a încercat aceasta prin utilizarea metodei RFLP, dar acest lucru nu a reușit, având în vedere că gena avea un singur locus iar distanța dintre markerii utilizați era foarte mare.8,27

La începutul anului 1989, Lap Che Tsui și Riordan pun la punct tehnica clonării cu ajutorul cromozomului “walking and jumping”, reușind să cloneze gena mucoviscidozei. S-a stabilit astfel că locusul genei este la nivelul brațului lung al cromozomului 7, între benzile 22 și 31.8,12

S-a concluzionat că gena mucoviscidozei este o gena mare, cu lungime de peste 250 kilobaze, ce conține 27 exoni(zone de codificare) despărțiți de introni(zone necodante) și un ARN mesager de aproximativ 6,5 kilobaze 28.

3.2. Localizarea CFTR

CFTR a fost identificată în marea majoritate a membranelor celulelor epiteliale având diferite poziții, de unde reglează transportul clorurilor.

La nivelul aparatului respirator, proteina patologică a fost evidențiată în celulele epiteliului de suprafață, a epiteliului ciliat și a ductelor seroase a glandelor submucoase.12,18

În pancreas a fost depistată la nivelul epiteliilor ce delimiteaza ductele intercelulare, în ficat – în epiteliile ductelor biliare.8,19

În glandele sudoripare a fost izolată la nivelul membranelor ductelor de reabsorbție și mai puțin în ductele secretorii. 12

La nivelul intestinului subțire și gros, proteina a fost identificată la nivelul criptelor și în special la baza acestora.

3.3. Structura și funcția CFTR

CFTR conține 1 480 aminoacizi, cu o masa moleculară de aproximativ 170 000, conține 2 jumătăți simetrice, fiecare reprezentând un domeniu separat; este o glicoproteină membranară ce poate fi fosforilată prin intermediul unei proteine AMPc dependente.8,20 Activarea ei este reglată prin fosforilare, cu ajutorul protein-kinazei A.

Proteina CFTR conține 2 domenii ATP-hidrofobe (denumite NBD-nucleotide-binding domains) și 12 membrane -helix (Figura 2).

Figura 2. Structura CFTR.

Proteina conține cinci regiuni:

– două zone (MSD-membrane-spanning domain) situate strict al nivel membranar, fiecare formată din 6 regiuni transmembranare, hidrofobe, capabile să lege structurile lipidice, care conțin 234 aminoacizi

– două zone de legătură (NBD sau NBF) care interacționează cu moleculele de ATP; fiecare domeniu fiind constituit din aproximativ 150 AA; mutația F508 este situată la acest nivel

– o zonă de reglare(R-domain) care conține situsuri de fosforilare și separă cele două zone simetrice; acest domeniu este codat de exonul 13 și conține situsurile de fosforilare ale PKA(protein kinaza) și PKC.

Bear și colaboratorii au sintetizat și purificat proteina CFTR, demonstrând funcția de canal ionic reglat de către AMPc26.

Numeroase cercetări au demonstrat rolul de canal de Cl al CFTR, cât și faptul că e reglat de protein kinaza A, AMPc dependent.1,8,12,21

FTR i s-au mai atribuit și alte funcții, cum ar fi în transportul transepitelial al Na27,28; reglator al canalului de Cl calciu-dependent, al canalelor de K; poate avea un rol important în exocitoza și în formarea unor molecule complexe la nivelul membranei plasmatice.

Reglarea CFTR se realizează prin: fosforilarea proteinelor de la nivelul domeniului de reglare și intervenția nucleotidelor intracelulare de la nivelul NBD.

Controlul activității CFTR depinde de echilibrul funcțional dintre activitatea kinazelor și fosfatazelor. Se pare că domeniul R intervine prin păstrarea închisă a canalelor de clor; fosforilarea sau deleția unei părți a domeniului de reglare conduce la deschiderea canalului.1,12

Absența CFTR influențează și expresia altor produse ale genei, inclusiv proteine cu rol în răspunsul inflamator, procese de maturare, transport ionic și al celulelor semnalizatoare.

Este posibil ca aceste proteine să fie factorii ce modifică fenotipul; astfel se pot explica diferențele semnificative privind starea clinică la pacienții cu aceeași mutație. 12,22

3.4. Clase de mutații

Gena CFTR numără aproximativ 180 000 perechi de baze, pe brațul lung al cromozomului 7.12

Cele peste 1 900 de mutații pot fi clasificate pe baza mecanismului prin care produc boala în 6 clase de mutații.(Figura 3).

Figura 3. Clase de mutații CFTR

Clasele de mutații CFTR apar datorită: defect în sinteza proteinei (class I); maturare incompletă sau degradare prematură (clasa II); tulburări de reglare a proteinei (clasa III); alterarea conducerii(defect conducere) al canalului de clor (clasa IV); reducerea sintezei CFTR (clasaV); turnover accelerat la suprafața celulelor (clasa VI).29

Clasa V de mutații se datorează prin reducerea numărului de transcrieri ale CFTR iar clasa VI include mutații exprimate patogenic prin deficitul de stabilitate al CFTR la suprafața celulelor.12

Cea mai comună mutație, F508 este categorisită ca și mutație de clasa II, G542X(extem de frecventa la evreii Ashkenazi) e o mutație de clasa I; mutația A455E exprimată prin prezervarea unei activități parțiale a canalului de clor, se asociază cu afectare pulmonară mai ușoară.12,29 Clasa V este specifică mutațiilor ce se exprimă fenotipic extrem de “blând”, de exemplu mutația R117 H-asociată cu absența canalelor deferente. Deși F508 este cea mai frecventă mutație, există diferențe între nordul Europei(87-90%) și Sud(27-30%), sugerând că frecvența relativă este variabilă datorită heterogenității populaționale.12

Cunoașterea consecințelor celulare ale defectelor CFTR sugerează rolul posibil al unor terapii – temă extrem de incitantă pentru cercetători și care deschide posibilități promițătoare.

Un screening randomizat, efectuat cu peste un milion de compuși medicamentoși, a arătat că unii compuși pot corecta anomaliile F508 prin restaurarea proteinei mutante în poziția ei normală – la suprafața celulei(restabilind astfel parțial funcția de canal de clor).12

De exemplu s-a demonstrat că un compus netoxic, curcuminul, principalul constituent al unei specii de plante “tumeric”, are capacitatea de a corecta defectul F508 , în vitro, prelungind peroada de viață la soarecii homozigoți F508 .30,31

Cercetări recente demonstrează că și sildenafilul are un rol pozitiv în corectarea mutației F508-CFTR , rezultat încurajator privind încercarile viitoare cu sildenafil sau alți compuși inhibitori de PDE5 la pacienții cu mucoviscidoză.32

Exista produși activi ribozomal, printre care și gentamicina, care au capacitatea de a supresa stop-codonul ce blochează prematur formarea CFTR în clasa I de mutații, corectând stop-codonul la subiecții umani.22

Cercetări aprofundate cu programe de screening special concepute pentru identificarea compușilor medicamentoși capabili să activeze funcția reziduală a CFTR la nivelul claselor II și IV de mutații sunt în derulare și cu rezultate promițătoare dar nu definitive.12

3.5. Mutațiile CFTR

Sunt înregistrate un numar de 1900 mutații în baza de date a Cystic Fibrosis Consortium.23

Mutațiile pot fi clasificate în funcție de modul de producere(tabel 2) și în funcție de regiunea în care apar.

Tabel 2- Mutații în funcție de tip22.

În țara noastră studiile genetice au început în 1990, fiind rezultatul cooperării dintre Clinica II Pediatrie și Unitatea Genetică a Spitalului Regal pentru Copii – Hospital – din . 5

Din anul 2002 s-a demarat testarea genetică cu kitul Elucigene 29 și în cadrul Disciplinei de Biochimie al Universitatii de Medicină și Farmacie Timișoara.

Rezultatele au arătat că frecvența mutației F 508(50,58%) este similară cu cea din țările învecinate(cu populație caucaziană majoritară) iar complexitatea mutațiilor genetice detectate accentuează caracterul heterogen al populației din România. 22,24

Având în vedere că formele atipice de mucoviscidoză au fost asociate cu mutații ce reduc(nu elimină) funcția proteinei CFTR, Gromann și colaboratorii au efectuat un studiu cu scopul de a verifica dacă alterarea funcției CFTR este responsabilă pentru manifestările clinice din cadrul fenotipului de mucoviscidoză variată(forme cu manifestări clinice specifice mucoviscidozei dar care nu întrunesc criteriile de diagnostic25 și la care testul sudorii are valori ale NaCl>40 mmol/l). Studiul efectuat pe un lot de 74 pacienți a relevat 29 pacienți cu 2 mutații specifice mucoviscidozei, 15 pacienți cu o mutație, iar la 30 pacienți nu a fost detectată nici o mutație(deși s-a efectuat analiza genetică extinsă) 26 Concluzia studiului a fost că alți factori decât mutațiile la nivelul CFTR pot produce fenotipuri clinice cvasiidentice cu formele atipice de mucoviscidoză cauzate de o disfuncție CFTR. 7

Este posibil ca, la pacienții cu tablou clinic caracteristic mucoviscidozei la care s-a identificat prin screeningul genotipului o mutație CFTR, extinderea testării genetice să determine fie existența unei noi mutații cauzatoare de boală, fie o alelă polimorfică27. Totuși, identificarea celei de a doua mutații sau a polimorfismului la acești pacienți 28 nu stabilește definitiv baza moleculară a sindromului lor clinic("variant cystic fibrosis"), reflectând influențe de mediu sau alți factori genetici decât mutații în CFTR.1,29

4. MECANISMELE BOLII – FIZIOPATOLOGIE și PATOGENIE

Cercetările aprofundate privind înțelegerea substratului genetic, a mecanismelor moleculare și a fiziopatologiei prezintă rezultate încurajatoare și ridică perspective pline de speranță privind dezvoltarea unor tehnici de terapie în viitor. 2

4.1 Tractul gastro-intestinal

La nivelul tractului digestiv, în mod fiziologic, există o serie de procese de absorbție și secreție, cu particularități legate de diferite segmente.5

Pancreas

În mucoviscidoză, studiile efectuate după stimularea cu colecistokinină au arătat că acinii pancreatici secretă un volum redus de enzime, fluide, ioni(Na, Cl, K, HCO3- ). S-a remarcat că secreția pancreatică este mai bogat proteică, fapt explicat parțial prin scăderea secreției fluide pancreatice(concentrație).12

O altă ipoteză fiziopatogenică este obstruarea ductelor pancreatice prin același mecanism descris la nivelul glandelor sudoripare, care duce în timp la distrucția celulelor acinare și la fibroza cicatriceală cu distrucția ulterioară a insulelor Langerhans.30

Acumularea secrețiilor pancreatice(care conțin enzime pancreatice) poate declanșa, la cazurile cu suficiență pancreatică, pancreatite recurente – care pot fi încadrate ca și semne sau ca și complicații ale bolii.

Aceste mecanisme fiziopatologice se concretizează în apariția diabetului zaharat non autoimun în cazul afectării pancreasului endocrin sau în insuficiența pancreatică, în cazul afectării pancreasului exocrin.1,12

Stagnarea mucusului precum și solidificarea secrețiilor la nivelul ductelor pancreatice duc la fibroză cronică cu vacuolizarea secundară a pancreasului, ce se concretizează prin pusee de pancreatită, de mult ori greșit încadrate ca și pancreatită idiopatică sau alcoolică.31

Prin aceleași mecanime se explică modificările produse în mucoviscidoză la nivelul intestinului, ficatului și a altor organe afectate.1

4.2 Implicarea hepatobiliară

La nivel hepatic, s-a demonstrat că CFTR se exprimă numai la nivelul celulelor epiteliului ductelor intra- și extra- hepatice și a veziculei biliare.6 Obstrucția ductelor biliare intrahepatice urmate de lezarea colangiocitelor duc la dezvoltarea cirozei biliare focale – patognomonică bolii, extinderea fibrozei inițial focale duce la ciroza biliară focală care ulterior se poate extinde realizând ciroza biliară multilobulară.12

Aproape 10% din pacientii cu mucoviscidoză se nasc cu ileus meconial (meconium ileus) o condiție fatală în cazul în care nu este tratată.

Afectarea hepatobiliară asociată mucoviscidozei este singura maladie hepatică „moștenită” în care leziunea se situează exclusiv la nivelul colangiocitelor și nu la nivelul hepatocitelor.25

4.3 Patogeneza afectării hepatice din mucoviscidoză

Patogeneza este multifactorială, cu contribuții variabile de la determinanți de mediu până la cei genetici. Hepatopatia asociată mucoviscidozei este în prezent clasificată printre colangiopatiile genetice. 12,33

Pe perioada secreției biliare ficatul normal funcționează ca și o glandă exocrină.

Conține structuri distincte acinare și ductulare alcătuite din hepatocite și respectiv celulele ductelor biliare 34. Celulele epiteliale sau colangiocitele sunt responsabile de reglarea rapidă a volumului bilei, fluidității și alcalinității acesteia ca răspuns la mai mulți hormoni și mediatori paracrini , similar cu rolul celulelor ductale privind secreția exocrină în alte țesuturi. Funcționarea corectă a CFTR este necesară în mai multe etape ale secreției biliare. 35

4.3.1 Mecanismele implicate

Factorii care contribuie la o vâscozitate anormală, la un flux scăzut, și o creștere a concentrației componentelor bilei sunt transportul deficitar de clor, reabsorbția de sodiu și diluția bilei în ductele biliare intrahepatice, secreția alterată de mucină și alte proteine protective din glandele submucoase sau cantități crescute de acizi biliari glicin conjugați.Compoziția biliară alterată sau fluxul biliar scăzut cauzează obstrucția ductelor biliare mici , fenomen urmat de depunerea colagenului periportal.36

Contribuția apoptozei celulelor epiteliului de la nivelul ductelor biliare sau a hepatocitelor la leziunile hepatice din mucoviscidoză nu a fost determinată, deși a fost suspectată în alte afecțiuni biliare. 37

La o minoritate din pacienți, mai ales la copii, boala hepatică poate progresa rapid și reprezintă principala problemă clinică.12

Deși ipotezele menționate oferă o posibilă bază etiologică pentru hepatopatia cronică din mucoviscidoză, ele eșuează în a explica absența implicării hepatice în majoritatea pacienților sau spectrul larg al severității la cei la care hepatopatia există.38

Speculația cum că în timp, marea majoritate a pacienților cu mucoviscidoză vor dezvolta boala hepatică nu a fost demonstrată, iar încercarea de a corela genotipul CFTR cu dezvoltarea unei afectări hepatice a fost fără success.38Această variabilitate și severitatea afectării hepatice sugerează ca există și alți factori ce modifică genele sau factori de mediu care determină dacă implicarea hepatobiliară va avea semnificație clinică într-un anume caz dat.39

Dacă până nu demult se considera că doar genotipul poate influența apariția hepatopatiei din mucoviscidoză, studii recente sugerează acțiunea suplimentară unor factori genetici și de mediu , favorizanți sau declanșatori.40

Pornind de la faptul că nu s-a putut demonstra asocierea certă a vreunei mutații genetice cu prezența hepatopatiei și luându-se în considerare fenotipul extrem de variabil corespunzător unui genotip identic, s-au ridicat mai multe semne de întrebare referitoare la potențiale influențe.

Astfel, factori ca statusul nutrițional, deficitul de antioxidanți, tratamentul medicamentos și potențialul efect hepatotoxic al acestuia pot agrava deficitul secretor inițial , cu afectarea ulterioară a ductelor biliare și a hepatocitului , jucând un rol important în patogeneza hepatopatiei 41 . Printre factorii favorizanți se numără și infecția cu virusuri cu tropism hepatic, chirurgia abdominală și nutriția parenterală totală. Existența unor discordanțe privitoare la expresia clinică a hepatopatiei, la pacienți cu mucoviscidoză ce au genotip identic și care trăiesc în condiții similare de mediu, a dus la suspiciunea că există alți factori genetici, exceptând gena mucoviscidozei , care pot modula expresia clinică și gravitatea bolii.

4.3.2.Factorii obstructivi

În sistemul hepatobiliar,CFTR este exprimată exclusiv în membrana apicală a colangiocitelor și celulelor epiteliale ale vezicii biliare, și nu în hepatocite. La acest nivel,CFTR reglează conținutul fluid și electrolitic al bilei.12,42

Absența sau disfuncția acesteia în mucoviscidoză este considerată pasul central în secvența patogenetică a bolii hepatice asociate mucoviscidozei , motiv pentru care reprezintă primul exemplu de hepatopatie moștenită, rezultând din alterarea funcției secretorii a epiteliului biliar și din colestaza ductală.

Modificările ultrastructurale ale colangiocitelor (cu forme neregulate,necroze,si depuneri periductulare de colagen) au fost sistematic documentate la pacienții cu mucoviscidoză, sugerând că leziunile de la nivelul ductului biliar reprezintă într-adevăr evenimentul primar în dezvoltarea fibrozei periportale.14

Modificările legate de CFTR în ceea ce privește secreția de mucină, contribuie de asemenea la creșterea vâscozității bilei la pacienții cu mucoviscidoză ducând la formarea de dopuri cu material eozinofilic la nivelul ductelor biliare, ceea ce se întâlnește printre primele modificări histologice prezente la sugarii și copiii cu mucoviscidoză.6,43

Acest proces poate crește susceptibilitatea epiteliului biliar de a fi afectat de compușii citotoxici excretați în bilă și lezat de patogeni . Acumularea intrahepatică de acizi biliari pot produce leziuni biliare cu rol în întreținerea și agravarea leziunilor hepatice.

Retenția de acizi biliari endogeni hidrofobi poate fi responsabilă de leziuni hepatice secundare, cu eliberarea de citokine proinflamatorii, produși de oxidare, precum și de activarea fibrocitelor hepatice cu sinteză de colagen44.

4.3.3 Cascada fibrogenezei

Alterarea compoziției bilei și reducerea secreției biliare , cu obstrucția secundară a ductelor biliare duce la formarea și depozitare de colagen prin mai multe mecanisme12

-hepatocitele lezate de acizii biliari hidrofili eliberează citokine proinflamatorii și produși oxidativi care recrutează și activează celulele hepatice stelate pentru producerea de colagen

-celulele epiteliale intraductale, prin același mecanism, stimulează hepatocitele stelate, cu aceeași consecință

-inflamația stimulează recrutarea altor celule, ca neutrofile, macrofage, limfocite, ce generează citokine cu rol stimulator al celulelor stelate și producere de colagen.

Acest proces are caracter de localizare focală hepatică, nu este generalizat, probabil datorită conexiunilor interductale care permit o drenare corespunzătoare a bilei în anumite arii hepatice.

Pe măsură ce procesul de fibroză avansează, se dezvoltă fibroză sub formă de punți în ciroza multilobulară, numită astfel deoarece se formează noduli mari, regenerativi ca și rezultat al procesului inițial focal.

Aceasta progresie de la colestază (flux biliar scazut) până la ciroza biliară focală și ciroza multilobulară durează ani până la decenii și ar trebui considerată ca un proces continuu.44

4.3.4. Factorii distructivi

Un studiu care a vizat explicarea substratului patogenic al leziunilor din hepatopatia asociată mucoviscidozei, efectuat în microscopie electronică, a arătat existența unor leziuni cu pattern destructiv alductelor biliare și nu obstructiv.45 Aceasta observație a dus la teoria existenței unei toxine biliare, neconfirmată însă.14

Modificările compoziției secreției biliare și acidității acesteia, au fost și ele sugerate ca și posibile cauze.6,14

Desi studiile nu au arătat diferențe semnificative în profilul seric al acizilor biliari al pacienților cu hepatopatie și nici la cei fără hepatopatie, e posibil ca metodele utilizate să nu reflecte cu acuratețe expunerea hepatocitelor la potențiali acizi biliari hepatotoxici.14

Secreția de săruri biliare rămîne normală, desi excreția biliară este în cantitate mai redusă la cei cu mucoviscidoză.

Asocierea unui grad de obstrucție ductală parțială sau totală, ar favoriza expunerea hepatocitului la concentrații înalte de acizi biliari lipolitici cu potențial toxic, fie primar (acid chenodezoxicolic) fie secundar (acid deoxicolic și acid litocolic)14

S-a speculat ca CFTR are rol de reglare în schimbul Cl/HCO3, care realizează alcalinizarea bilei, importantă pentru funcționarea calitativă a acesteia.

În mucoviscidoză există modificări și la nivelul secreției de mucină deoarece se secretă o glucoproteină anormală, care, asociată cu creșterea nivelelor de condroidin sulfat din bilă, duce la o creștere a vâscozității secreției biliare.

Secreția de clor AMPc stimulată are ca rezultat un potențial negativ intraluminal, și un gradient osmotic ce atrage Na în lumen, iar apa prin canale selective pentru apă, rezultând o secreție biliară saracă în apă.

Toate aceste modificări ale compoziției biliare normale produc secreție modificată și întârziată.

5.DIAGNOSTIC

5.1. Diagnosticul prenatal

Diagnosticul genetic prenatal- în multe cazuri o necesitate, se poate realiza în prezent , dupa recoltarea din vilozitatile coriale , de obicei intre saptamana 11-12 de viata intrauterina.8

Se pune problema, pe plan international a efectuarii diagnosticului genetic preimplant în cazurile cuplurilor ce recurg la fertilizarea în vitro, dar studiile sunt inca la inceput. 48

5.2. Diagnosticul postnatal

Polimorfismul clinic este impresionant, mucoviscidoza putandu-se manifesta printr-o multitudine de simptome și semne-tabel 5.

Tabel 3- Manifestari clinice specifice mucoviscidozei6

Pentru a face față provocării ridicate de cazurile atipice de mucoviscidoză, a fost inițiată o declarație de consens, ce definește mucoviscidoza ca și prezența unui sindrom clinic “coerent” plus, fie dovada unei disfunctii CFTR(valori anormale ale testului sudorii sau diferența de potential nasal), fie confirmarea a două mutații cauzatoare de boală în gena CFTR. 6

Declarația de consens privind diagnosticul mucoviscidozei6, dupa Rosenstein BJ, Cutting GR. The diagnosis of cystic fibrosis: a consensus statement: Cystic Fibrosis Foundation Consensus Panel. J Pediatr 1998;132:589-595:

Testul sudorii pozitiv

Una sau mai multe trasaturi clinice caracteristice

-boala cronica sino-pulmonara

-modificari gastrointestinale sau de nutritie

-sindrom de pierdere de sare

-barbati-azoospermie obstructiva

Sau:

-istoric de mucoviscidoza la rude

-test screening pozitiv la nou-nascut

-alterarea transportului ionic la nivelul epiteliului nasal

Pacientii la care se descopera o singura mutație CFTR, și la care se inregistreaza funcție reziduala a proteinei , dar nu intrunesc criteriile de diagnostic, sunt considerati a avea boala CFTR-asociata -“variant cystic fibrosis”.

O data cu cresterea sperantei de viata a devenit evident ca afectarea hepato-biliara din mucoviscidoza este o complicatie frecventa și de temut.

Afectarea hepato-biliara asociata mucoviscidozei este considerata în prezent ca fiind singura maladie hepatica “mostenita” în care deficitul primar afecteaza mai degraba colangiocitele decat hepatocitele.24,43

Obstructia ductelor intrabiliare intrahepatice urmata de injuria colangiocitelor duce la instalarea cirozei biliare focale, leziune patognomonica mucoviscidozei și care poate fi documentata la 25-30% din pacienti.25 Extinderea fibrozei initial focale la nivelul lobulilor poate duce la ciroza biliara multilobulara.; insuficienta hepatica se dezvolta lent, de temut și instalata rapid în evolutie este hipertensiunea portala, cu dezvoltarea varicelor esofagiene, ascitei sau a hipersplenismului

La nivelul veziculei biliare cu o frecventa de 1-10% se intalneste litiaza biliara și colecistita, în procent mai mare(30%) este microvezicula biliara.15,25

PARTEA SPECIALĂ

1. MOTIVATIA STUDIULUI

2. MATERIALE SI METODE

3. REZULTATE ȘI DISCUȚII

3.1 Date de epidemiologie

Pacienții cuprinși în studiu au fost în număr de 158 copii cu mucoviscidoză, cu vârsta cuprinsa între 2 luni-18 ani, din care 85 băieți și 73 fete.

Studiul s-a desfășurat în Clinica II Pediatrie Timișoara și la nivelul Centrului Național de Mucoviscidoză Timișoara din cadrul Spitalului Județean de Urgență Timișoara, în timpul din analiza retrospectiva a perioadei 2002-2007.

3.1.1. Prevalența

Din totalul de 158 de copii urmăriți în perioada 2002-2007, au fost diagnosticați cu afectare hepatobiliară 62 de copii(tabel.nr.13), însumând o prevalență de 39,24% din numărul total de cazuri43(fig.nr.4).

Fig.nr.4 Prevalența afectării hepatobiliare la pacienții cu mucoviscidoză

Grupul inițial luat în studiu a inclus 127 de copii, cu vârsta mai mare de doi ani, vârsta medie la diagnostic 10,74±5,9 din care 48 copii fiind deja diagnosticați cu afectare hepatobiliară, prevalența inițială fiind de 37,8%43.

Studiile efectuate până în prezent arată prevalențe diferite 51,55 ale hepatopatiei, de la 25% până la 41% în funcție de entitățile patologice luate în studiu și metodele folosite.46,47

La sfârșitul studiului prevalența hepatopatiei înregistrată în grupul nostru a fost de 32,27% comparabilă cu rezultatele altor studii. În ceea ce privește asocierea unei afecțiuni biliare la acești pacienți, prevalența a fost de 37%( cuprinzând și pacienții cu patologie mixtă) 43.

3.1.2. Incidența

În ceea ce privește incidența hepatopatiei la grupul nostru a fost în medie de 2,25% raportată la lotul inițial de pacienți cu mucoviscidoză.

Privind rata de decese, au fost înregistrate 5 decese(3,1% din numărul total al pacienților), toate având ca și cauză insuficiența pulmonară, la pacienți cu afectare pulmonară severa; vârsta medie a celor decedați a fost 12.2 ani 43 .Nu s-a înregistrat niciun deces de cauză hepatică la pacienții din grupul nostru de studiu.

Tabel.nr.4Tabel sinoptic al copiilor cu afectare hepatică

Dintre aceștia, 51 au fost diagnosticați cu hepatopatie asociată mucoviscidozei, 11 au prezentat afectare biliară, existând un număr de 12 pacienți ce au avut atât afectare biliară cât și hepatică (fig.nr. 4).

S-a constat că, la lotul nostru de studiu cu afectare hepatobiliară, ponderea cea mai importantă o reprezintă hepatopatia asociată mucoviscidozei, exprimată fiind la un procent important de 71% (51 pacienți, din care 12 au asociat și afecțiuni ale vezicii biliare) din totalul pacienților cu afectare hepatobiliară. (fig.nr 5)

Fig nr.5.Spectrul manifestărilor hepatobiliare

Din cei 51 pacienți cu hepatopatie 4 au asociat și litiază biliară și 8 microveziculă, astfel încât procentele exprimate în fig. nr.5, reprezintă numărul de expresii clinice, și nu numărul de cazuri.

3.1.3. Distribuția cazurilor în funcție de sex

În ceea ce privește afectarea hepatică din mucoviscidoză, datele din literatură subliniază o mai mare frecvență a hepatopatiei la sexul masculin 48,49, comparativ cu cel feminin, considerându-se chiar că sexul masculin este factor de risc pentru apariția hepatopatiei.

În aceasta idee am evaluat distribuția pe sexe a cazurilor cu hepatopatie la grupul nostru de studiu43 ( Fig. nr.6).

Fig.nr.6 Distribuția hepatopatiei în funcție de sex

Nu a fost confirmată o prevalență semnificativă statistic a patologiei la cei de sex masculin la grupul nostru de pacienți.

Pentru a stabili dacă există o asociere între sex și prezența hepatopatiei am aplicat testul de independenta χ2 cu corecție Yates, obținând valoarea p=0.274, ceea ce atestă independența genului masculin sau feminin de existența hepatopatiei.

Asfel, în grupul copiilor cu afectare hepatobiliară nu există diferențe importante în ceea ce privește distribuția hepatopatiei pe sexe.

Nu s-a constat o frecvență mai mare a hepatopatiei la sexul masculin comparativ cu sexul feminin, diferența fiind nesemnificativă statistic43.

Raportul băieți/fete a fost subunitar, avand o valoare de 0,76; odd ratio fiind în favoarea sexului feminin , riscul relativ F/M=1,31/1.

Astfel riscul relativ ca un băiat să dezvolte hepatopatie a fost mai mic la grupul nostru de studiu de 0,76/1, fiind surclasat de riscul mai mare al sexului feminin43.

Deși în grupul total al pacienților cu mucoviscidoză există o ușoară predominență a sexului masculin 84 băieți și 74 fete, aceasta predominență dispare la grupul pacienților cu hepatopatie.(fig.nr.7 )

Fig.nr.7 Sex ratio în grupul pacienților cu hepatopatie comparativ

cu cei fără afectare hepatică

Majoritatea studiilor susțin o predominență a sexului masculin la pacienții cu hepatopatie48,49.

Astfel, un studiu de tip cohortă condus de școala italiană24( Colombo și colaboratorii) a inclus 183 copii diagnosticați cu hepatopatie la vârsta medie de 7.5 ani, interval [3 luni-18 ani], arată prevalența crescută a hepatopatiei la sexul masculin.

Un studiu tip cohortă-prospectiv48, condus de colectivul Lindblad și Strandvik ce a evaluat 124 de pacienți pe o perioada de 9,1 ani a publicat un raport F/M de 1,2.

Date similare cu ale noastre au fost raportate și de Ling și Paton care arată49 că din 124 copii cu vârsta de medie 5.4 ani 61 au fost băieți și 63 fete.

Discordanța cu datele unor studii care raportează prevalența sexului masculin la pacienții cu hepatopatie ar putea fi explicată prin diferență de vârstă dintre loturile comparate. Se consideră că estrogenii și receptorii acestora ar avea un rol protectiv modulator pentru dezvoltarea fibrozei hepatice, de aici incidența mai scăzută a bolii la sexul feminin.50

Majoritatea studiilor au urmărit pacienți cu vârste mai mari (comparativ cu grupul nostru de studiu la care vârsta medie este 10.98 ani) , cu status hormonal mai dezvoltat și la care efectul estrogenic protectiv a fost mai pregnant.12

Predominența hepatopatiei la sexul feminin în grupul nostru, în ciuda efectului presupusului efect protectiv al estrogenilor poate fi explicat prin ipoteza unei secreții mai reduse de estrogeni în aceasta populație feminină, aflate ca și vârstă medie în perioada prepubertară și la care malnutriția calorică sau deficitul ponderal este cvasiprezent. 43

3.1.4. Distribuția pe grupe de vârstă

1.3.1. Hepatopatia

susține, într-un studiu publicat recent, că hepatopatia ar fi mai frecvent întâlnită la pacienții diagnosticați la o vârstă mai mare12.

Ipoteza este susținută de faptul că întârzâierea diagnosticului de mucoviscidoză se asociază cu malabsorbție și deficit ponderal, lipsa terapiei specifice cu AUDC(acid ursodeoxicolic) accentuând o evoluție mediocră.

Vârsta medie a pacienților noștri cu afectare hepatobiliară la ultima evaluare a fost 10.98 ani +/-6.545 DS 43.

Pacienții cu hepatopatie din grupul luat în considerare au fost diagnosticați cu mucoviscidoză la o vârsta medie de 5.47± 2.34 DS , iar hepatopatia a fost diagnosticată după aproximativ 2 ani, în medie( vârsta medie la diagnosticul hepatopatiei = 7.41± 4.2 DS).

Vârsta medie de diagnostic este scăzută comparativ cu lotul pacienților cu mucoviscidoză din care s-a extras grupul nostru, însă pacienții cu hepatopatie au fost evaluați prospectiv, ceea ce explică diferența de vârsta. 43

Grupul de pacienți a inclus inițial numai copii, cu vârsta 18 ani ulterior , pe perioada studiului aceștia au depășit vârsta de 18 ani dar au fost urmăriți în continuare în Centrul Național de Mucoviscidoză Timișoara.

În acest sens, am considerat imperativă evaluarea distribuției cazurilor în funcție de grupa de vârstă.(fig.nr.8)

Fig.nr.8 Distribuția cazurilor de hepatopatie în funcție de vârstă

Se constată că un număr important de cazuri cu hepatopatie acoperă segmentul de vârstă 7-14 ani, dar comparativ cu lotul pacienților fără hepatopatie(fig.nr.8 ), proporția este de 21,79%(17 copii cu hepatopatie la 61 copii fără hepatopatie), mai mică decât la cei peste 18 ani, la care raportul este de 33,33%.

Fig.nr. 9 Distribuție comparativă pe grupe de vârstă a pacienților

Hepatopatia asociată mucoviscidozei s-a manifestat clinic cel mai frecvent după o perioadă medie de 10 ani de evoluție a bolii.

Pentru vârsta copiilor cu hepatopatie asociată mucoviscidozei a fost calculată o medie de 10.98/-7.11 ani, fapt care confirmă ipoteza unui “interval liber” de timp în evoluția bolii până la apariția hepatopatiei; distribuția pe vârstă a pacienților cu hepatopatie fiind ilustrată în figura nr.9

Majoritatea cazurilor se întâlnesc la pacienții cu vârsta mai mare de 10 ani, 34 copii(69%)(fig.nr.10).

Fig.nr. 10. Distribuția cazurilor de hepatopatie

2.Factori de risc

2.1. Ileus meconial

Istoricul de ileus meconial sau echivalențe de ileus meconial (sindromul de obstrucție intestinală distală) a fost prezent la 8 pacienți din cei 51 cu hepatopatie, comparativ cu 17 pacienți din cei fără hepatopatie(134 pacienți cu mucoviscidoză).

Prezența în procent de 15,8% a istoricului de ileus meconial la grupul de studiu cu hepatopatie nu are o semnificație statistică privind asocierea afectării hepatice cu istoricul de ileus meconial sau sindromul de obstrucție distală. 43

Din totalul de 25 copii cu istoric de ileus sau echivalențe doar 6 au dezvoltat hepatopatie pe parcursul a 5 ani de studiu, riscul relativ ca un pacient cu ileus meconial să dezvolte hepatopatie este ușor subunitar RR=0,98.

Deși valoarea riscului relativ este subunitară , exprimând lipsa semnificației statistice, apropierea marcată de valoarea unitară semnificativă statistic, astfel încât putem lua în considerare acest factor ca și potențial factor de risc.

Istoricul de ileus meconial ca și factor de risc pentru apariția hepatopatiei este controversat de rezultatele altor studii12, în timp ce altele susțin interrelația strânsă între cele două, cu un risc de 4 ori mai mare de a dezvolta boala la pacienții cu istoric de ileus meconial sau echivalențe. 43

Din cele 25 cazuri cu istoric de ileus meconial 2 pacienți au prezentat ca și complicație peritonită meconială.

2.2. Statusul nutrițional

Patogeneza malnutriției la pacienții cu mucoviscidoză și afectare hepatică este multifactorială12 și implică un consum energetic de repaus crescut, malabsorbție (datorită efectului combinat al colestazei și insuficienței pancreatice), un aport insuficient și un metabolism alterat al nutrienților.

Se consideră că statusul nutrițional este un factor ce influențează severitatea hepatopatiei, în contextul asocierii hepatosteatozei și a agravării funcției pulmonare.39

La începutul studiului, din cei 48 de copii doar 6 au prezentat status nutrițional satisfăcător, la restul cazurilor însumând un procent de 87,5%, s-au înregistrat deficite ponderale de diferite grade(fig.nr.11).

Fig.nr. 11 Exprimarea deficitului ponderal la pacienții cu hepatopatie

Majoritatea pacienților(39 copii reprezentând 76%) au asociat un deficit poderal mediu, între 10-25%; doar 7,8%(4 copii) au avut deficit ponderal marcat, deși toți pacienții cu insuficiență pancreatică au primit terapie de substituție enzimatică.

Explicația este complexă; majoritatea pacienților cu hepatopatie prezintă și insuficiență pancreatică cu posibilă malabsorbție lipidică secundară , un număr mare de cazuri au prezentat și afectare pulmonară ce necesită un consum crescut de energie43

3. Elemente tegumentare specifice afectării hepatice

Am urmărit prezența icterului, a circulației colaterale, a rubeozei palmare, steluțelor vasculare.

La 3 pacienți care au prezentat ca și complicație ciroza hepatică cu hipertensiune portală s-a remarcat circulație colaterală abdominală cu aspect de „cap de meduză”(fig.nr.12).

Fig. nr.12 Circulație colaterală la un caz complicat cu HTP

F.L, sex F, 7 ani

Nu a fost depistat la grupul nostru de studiu, pe perioada de 5 ani de monitorizare niciun pacient cu icter, eritroză palmară sau spider naevi.

4. Evaluarea clinică a hepatomegaliei și splenomegaliei

Accentul s-a pus pe depistarea semnelor clinice specifice pentru afectarea hepatică: hepatomegalia și splenomegalia.

Pentru a elimina rezultatele false am evaluat gradul hepatomegaliei în afara episoadelor de acutizare pulmonară și cu verificarea masurătorilor prin ultrasonografie. Odată cu apariția cirozei, hepatomegalia poate dispare, se constată scăderea dimensiunilor ficatului în stadii avansate ale bolii.

Dacă splenomegalia este prezentă, este o problemă de timp pentru ca semnele de hipertensiune portală să se manifeste.

Fig.nr.13 Hepatosplenomegalie Fig.nr.14 .Spleno-hepatomegalie

si circulatie colaterala (K.S, 17 ani, sex M, homozigot F508 )

(F.L, 7 ani, sex F, homozigot F508)

Hepatomegalia a fost depistată la 22 de pacienți (43,13%) , din care 6(11,76%) au prezentat și splenomegalie.(fig.nr.15)

Într-un procent de 15,68 % a fost documentată prezența splenomegaliei, doar 2 cazuri cu ciroză hepatică, s-a înregistrat prezența singulară a splenomegaliei. Cele două cazuri, cunoscute cu ciroză hepatică au avut anterior ultimei evaluări inclusiv hepatomegalie, remiterea acesteia s-a datorat probabil progresiei hepatopatiei spre ciroză.

Fig.nr.15. Distribuția semnelor clinice la grupul de studiu

Procentul mai mare al pacienților cu hepatomegalie și splenomegalie întâlnit la grupul nostru este explicabil prin prisma faptului că cele două semne clinice au fost considerate componente diagnostice importante, unii pacienții fiind practic diagnosticați în baza prezenței acestora.

5. Insuficienta pancreatică

Evaluarea funcției exocrine pancreatice a constat în evidențierea anamnestică a steatoreei, demonstrarea deficiului seric în amilaze și lipaze, confirmată fiind de remiterea steatoreei și ameliorarea statusului nutrițional după începerea tratamentului enzimatic substitutiv.

Începînd cu analizele retrospective și continuând cu studiile prospective, toti autorii subliniază asocierea extrem de strânsă între hepatopatie și insuficiența pancreatică, unele studii raportînd o perfectă corelare, de 100%48,49.

Insuficiența pancreatică a fost prezentă în 96% din cazuri(49 din 51 pacienții cu hepatopatie) la grupul nostru de studiu(fig.nr.16) , procent extrem de apropiat de cele comunicate în literatura de specialitate.

Fig.nr.16.Distribuția pacienților cu hepatopatie în funcție de statusul pancreatic

Legendă: IP-insuficiență pancreatică, SP-suficiență pancreatică

Certificată fiind de către toate studiile asocierea insuficienței pancreatice la cei cu hepatopatie se consideră a fi factor de risc pentru apariția acesteia43.

La pacienții noștri am calculat riscul relativ , care a avut o valoare de 1.25, supraunitară, statistic semnificativă(p=0.003).

Riscul relativ ca un pacient cu insuficiență pancreatică să dezvolte hepatopatie este de 1.25, iar pentru populația din care s-a extras acest lot riscul aparține intervalului (0.75, 1.72) cu un nivel de încredere de 95%, fapt care certifică rolul de factor de risc al insuficienței pancreatice43.

6.Mutațiile genetice

Multiple studii au urmărit ideea unei potențiale corelații genotip /fenotip în hepatopatia din mucoviscidoză , și, desi unele studii12,48,49 au reclamat existența unei corelații cu genotipul sever, studii ulterioare mai ample au infirmat această ipoteză.

Nu a fost confirmată nici o corelație între prezența hepatopatiei și o anumită mutație sau genotip.24, 43

Pacienții purtători de mutații asociate cu un genotip sever, prezintă însă un risc crescut pentru a dezvolta hepatopatie severă .24

Analiza genetică a mutațiilor majore prezente în această populație nu a oferit dovezi ale existenței unui marker genetic specific pentru dezvoltarea bolii hepatice la pacienții cu mucoviscidoză. 43

Mutațiile așa-numite „severe” nu sunt factori determinanți pentru dezvoltarea hepatopatiei, dar pot fi considerate ca și factori favorizanți privind apariția bolii hepatice.

Se suspectează existența mai mulor factori de risc sau favorizanți, asociați genului sau din grupul „modificatorilor” genetici. 43,48

Majoritatea studiilor 48,49 au constat o mai mare frecvență a hepatopatiei la purtătorii unui genotip „sever”, dar nu s-a constat asocierea certă a unei mutații cu hepatopatia din mucoviscidoză.

Rezultatele testelor genetice din baza de date ale Centrului Național de Mucoviscidoză Timișoara, au relevat prezența a 22 genotipuri F508 (43%), 8 genotipuri F508/non F508, 5 F508/x, genotip heterozigot compus pentru alte mutații și 8 pacienți cu genotip neidentificat(fig.nr.38) 43.

S-a constat o frecvență crescută a genotipului homozigot F508, înregistrat la 43% din pacienții cu hepatopatie.(fig.nr.17) 43

Fig nr.17.Distributia genotipurilor la pacienții cu hepatopatie

Este interesantă distribuția genotipurilor, de alfel destul de heterogenă și faptul că, după „concentrarea” unui procent de 43% de pacienți homozigoți pentru F508, restul genotipurilor apar la doar câte un pacient, ceea ce este un argument pentru ipoteza existenței altor factori determinanți pentru dezvoltarea hepatopatiei43.

Se constată și un procent redus de pacienți cu genotipuri necunoscute 15%, (rezultat derivat cel mai probabil din selecția inițială a pacienților, predominant forme tipice), care vine în sprijinul afirmațiilor privitoare la inexistența unei asocieri specifice a unei anumite mutații cu hepatopatia.

Unele studii de specialitate „reclamă” asocierea hepatopatiei la cei cu genotip „sever”, deși nu există evidențe clare privind această interrelație.24,48

Am investigat această relație cu genotipul la pacienții cu hepatopatie luați în studiu, realizînd o clasificare a genotipului după expresia fenotipică existența în baza de date a mutațiilor genei mucoviscidozei; a fost considerat sever un genotip alcătuit din două mutații severe( de clasa I, II sau III).

Tabel nr.5.Clasificarea genotipurilor la pacienții cu hepatopatie

Din totalul pacienților cu hepatopatie 56,87% sunt purtători ai unor genotipuri asociate cu expresie clinică severă, iar un procent important de 33,3% cu genotip fără expresie fenotipică determinată, „neclasificat”.

Procentul purtătorilor de genotip sever , deși este mai scăzut la grupul nostru comparativ cu alte studii, este important( 56,87%) și arată un risc relativ de 1.13, supraunitar, care certifică un risc mai crescut al purtătorilor de genotip sever de a dezvolta hepatopatie.

Studii efectuate la pacienți din Nordul Europei nu confirmă aceasta corelație ci susțin independența expresiei hepatice de genotip.50

La grupul nostru, distribuția pacienților cu hepatopatie în funcție de genotip arată că pacienții cu genotip sever și cei cu genotip neclasificat sunt majoritari în populația cu hepatopatie.

Nu s-a constat însă asocierea hepatopatiei cu nicio mutație specifică și nici cu un anumit genotip, concluzie în acord cu rezultatele publicate la nivel internațional.24,50

Fig.nr. 18. Distribuția pacienților în funcție de severitatea mutațiilor

Intrigant este procentul mare al pacienților cu genotip „neclasificat” , care dă naștere unor supoziții legate de asocierea cu alte mutații, mai rare, care ar avea o mai mare sensibilitate pentru dezvoltarea hepatopatiei(fig.nr.39).

Constatarea că hepatopatia apare mai frecvent la pacienți purtători ai genotipului homozigot F508 nu are un caracter de predictivitate ; s-a demonstrat că nu toți purtătorii ai acestui genotip dezvoltă hepatopatie.

Studiile efectuate pe grupe de gemeni homozogoți F508 au relevat rezultate surprinzătoare: astfel, dintr-o pereche, un geamăn a dezvoltat hepatopatie, celălalt nu, ambii fiind sub influența acelorași factori nutriționali și de mediu. 24

De aici a rezultat placa turnantă pentru discuțiile legate de interferența altor mecanisme în etiopatogeneza hepatopatiei și ipoteza „modificatorilor genetici” 43

Aceasta teorie, demonstrată în unele direcții, sugerează intervenția suplimentară a unor gene ce codifică o serie de mecanisme considerate a fi implicate în patogeneza hepatopatiei.6 Astfel, par a fi implicate gene ce codifică raspunsul imun-gena MBL, în codificarea procesului de inflamație,- gena 1 antitripsinei , în procesele de antioxidare-gena glutation transferazei- GSTP1 sau în controlul fibrogenezei-gena inhibitorului proteazei PI și TGF-ß1 3.

7. Explorări paraclinice

Având în vedere datele din literatură privind existența modificărilor oculte la nivel hepatic , fără expresie clinică și fără modificări în statusul biologic24,43, pentru evaluarea corectă a patologiei se impune utilizarea investigatiilor paraclinice.

7.1.Ecografia abdominală

Evaluarea ecografică a sistemului hepatobiliar poate realiza o distincție între diferitele pattern-uri ale bolii, cum ar fi fibroză, ciroză, hipertensiunea portală, modificările arborelui biliar și steatoză hepatică și este considerată a fi ca și cea mai potrivită metodă noninvazivă de investigație.

7.1.1.Hepatosteatoza

Cea mai frecventă modificare a fost steatoza difuză, vizualizată ca și creșterea ecogenității hepatice ( fig.nr. 19,20).

Hepatosteatoza a fost întalnită la 31 de pacienți, ceea ce reprezintă un procent de 61% raportat la pacienții cu hepatopatie, procent concordant cu datele din literatură.24

Fig.nr.19 Steatoză hepatică , DG., sex F, 7 ani

Se remarcă aspectul de parenchim cu tentă “strălucitoare”, datorat creșterii ecogenității hepatice.(fig.nr.40-43)

Deși se afirmă predilecția pentru sexul masculin și genotip sever al hepatopatiei, la cazul de față nu se confirmă, ci dimpotrivă, evoluția este foarte bună și din punct de vedere a afectării pulmonare.

Fig.nr.20 Hepatosteatoză, LC=2,6 cm, VP=0,6 cm

N.F.21 ani, sex M

Fig.nr.21. Hepatosteatoză, cu tendinta la agregare,LC=2,3 cm, VP=0,77 cm

Același caz N.F.23 ani, sex M

Se remarca plaje de steatoză localizată, cu diametru 1-2 cm,(fig.nr.20) descrise ca și arii hiperecogene cu margini hipoecogene de contrast, reprezentate de fapt de țesut hepatic strâns între aceste arii.

Structurile lobulate steatozice apar ca pseudomase,de 1-2 cm ca mărime, cauzează heterogenitate în parenchimul hepatic.81

Fig.nr.22. Aspect “granitat”, de “cer înstelat”.Microleziuni de fibroză(săgeți negre), steatoză hepatică difuză și cu formare de noduli(săgeti albe). Microveziculă biliară

Z.R, sex M, 6 ani homozigot D F508

7.1.2.Ciroza hepatică

Este exprimată ecografic prin existența unor leziuni hiperecogene mai mari de 2 mm(fig.nr.48) ce apar în evoluție, odată cu inițierea procesului de ciroză multilobulară (fig.nr.49). În stadii avansate apare ca și cordoane fibroase difuze ce modifică arhitectonic ficatul(fig.51 și fig.52) Criteriul de diagnostic pentru fibroza periportală a fost stabilit prin prezența tesutului periportal hiperecogen cu o grosime de peste 2mm.51

Aceste creșteri ale ecogenității de formă rotund-ovalară pot fi interpretate ca și steatoză localizată ( fig.47 și fig.49) sau noduli de fibroză(fig.nr.50).

Fig.nr23 Structura hepatică heterogenă, nodulara. Plaje hipoecogene alternand cu plaje hiperecogene. Fibroza hepatica. Z.R, 6 ani, sex M , genotip F508/ F508

7.1.3.Hipertensiunea portală

Un semn de hipertensiune portala este creșterea diametrului venei splenice și dilatații intrasplenice.

Fig.nr.24 Creșterea calibrului VP=1,4 cm diametru, dilatații “în ciorchine”

K.S, 17 ani,sex M, genotip F508/ F508

Fig.nr.25.Splenomegalie, același caz

F.L, 9 ani , sex F, genotip F508/ F508

Rezultatele înregistrate la începutul studiului au arătat că majoritatea pacienților 62,74% (32 pacienti) au prezentat un scor între 4-6, ceea ce semnifică hepatopatie moderată, la aceștia a fost prezentă steatoza, difuză sau localizată, fibroza moderată, hiperecogenitatea parenchimului hepatic.

La 14 pacienți (27,4%) leziunile hepatice au constat predominant în steatoza difuză, fără fibroză periportală, cu ecostructură normală hepatică, doar o ușoara creștere a ecogenității.

Un număr redus de 5 pacienți, cu ciroză hepatică multilobulară și semne de hipertensiune portală au prezentat un scor ecografic >9 (fig.nr.25 )

Încadrarea la un scor >9 semnifică modificări severe hepatice, constând în fibroză, arii hiperecogene alternând cu arii hipoecogene, noduli cirotici și modificarea nodulară a marginii hepatice43,51.

Fig.nr. 26..Repartitia formelor de gravitate în funcție de scor Wiliams

7.2.Biopsia hepatică

Este considerată fi “standardul de aur” în diagnosticul multor boli hepatice cronice, în ciuda performanțelor imagistice actuale, pînă nu demult și în hepatopatia din mucoviscidoză.

Din cauza distribuției focale a leziunilor și nu generalizate în afectarea hepatică din mucoviscidoză, există riscul obținerii unui rezultat fals negative , cu “pierderea ” diagnosticului 43

Au fost raportate cazuri de copii la care hepatopatia a fost singura manifestare a mucoviscidozei , iar diagnosticul a fost stabilit doar ca urmare a examinării histologice a fragmentului hepatic obținut prin biopsie sau autopsie. 24

Biopsia hepatică poate oferi informații importante asupra tipului de leziune predominantă (steatoza sau ciroza biliară focala), extinderii fibrozei portale, a ratei de progresie a bolii hepatice și răspunsului la tratament.

Puncția biopsie hepatică a fost efectuată la cazuri selecționate, doar atunci când s-a suspectat suprapunerea unei alte patologii cu tropism hepatic și fără expresie biologică specifică.

Pornind de la prima verigă patogenică, depunerea de mucus la nivelul ductelor biliare-staza biliară (fig.nr.27,28 ), cu distrucția ulterioară a acestora, are ca și efect aglomerarea perilezională de limfoplasmocite(fig.nr. 27).

Activarea celulelor stelate Kupffer, stimulează depunerea de colagen și inițiază procesul de fibroză periportală cu formarea leziunilor de ciroză biliară focală care poate progresa ulterior la ciroză biliară multifocală și prinderea întregului parenchim hepatic,cu leziuni de regenerare(fig.nr.30).

La pacienții cu hepatopatie pot fi întîlnite următoarele elemente de histopatologie43:

-proliferarea ductelor biliare mici , cu posibile stratificări ale epiteliului canalicular

-secreție intraductală densă, sub forma unui material eozinofil-brun dens(29)

-stază biliară ușoară spre moderată , cu spații porte moderat/mult lărgite, ușor fibrozate(fig.30)

-hepatocite cu zone de intumescență tulbure-semnificînd steatoza

Fig.nr. 27.Depunere de pigmenti biliari. Infiltrat limfoplasmocitar periportal.

Fibroză portala, HEx200

Depunerea pigmentilor biliari intraductal și extravazarea acestora în tesutul hepatic, sub forma localizată este patognomonica pentru ciroza biliară focală din mucoviscidoză.

Fig.nr28 Structura hepatică dezorganizata, depunere de pigment biliar intraductal, fibroza difuză, intensa(col HEx400)

Fig. Nr.30Infiltrat cronic inflamator periportal,

stază biliară intra și interductală

Structura hepatică dezorganizată(col HEx200)

Deși aspectul histopatologic este cel mai relevant pentru diagnosticul hepatopatiei din mucoviscidoză și acuratețea leziunilor depistate este superioară oricărei metode imagistice de evaluare a hepatopatiei, invazivitatea sa face ca mulți cercetători să o considere o metodă de linia a doua.

Aceasta în ciuda fapului că au fost raportate cazuri la care rezultatul punctatului bioptic hepatic a îndrumat către diagnosticul de mucoviscidoză, hepatopatia fiind practic prima expresie a bolii.

4.CONCLUZII

Odată cu creșterea speranței de viată la pacienții cu mucoviscidoză, afectarea hepatobiliară asociată mucoviscidozei a devenit o complicație serioasă și relativ frecventă care poate afecta durata și calitatea vieții pacienților.

Patogeneza afectării hepatobiliare este multifactorială, cu contribuții variabile, de la determinanți de mediu până la determinanți genetici.

Prevalența hepatopatiei la grupul nostru de studiu a fost de 32,27% iar afecțiunile vezicii biliare au fost evidențiate la 37% din pacienți, rezultate similare cu cele publicate până în prezent.

Hepatopatia din mucoviscidoza este mai frecventă la pacienții cu insuficiență pancreatică, purtători ai unor mutații CFTR severe, confirmând rolul de factori de risc al acestor parametri.

Nu s-au putut face corelații privind specificitatea unei anume mutații pentru această patologie, dar frecvența hepatopatiei a fost mai mare la pacienții purtători de genotip sever.

Hepatopatia se poate exprima ecografic diferit, cea mai frecventă modificare fiind hepatosteatoza, iar fibroza se întâlnește mai rar.

Rata progresiei hepatopatiei este foarte diferită ; astfel , la majoritatea pacienților, complicația progresează lent, fără a avea un impact major asupra evoluției bolii, la un număr mic de cazuri însă , hepatopatia devine principala problemă de management a bolii de fond.

Bibliografie.

Knowles MR, Durie PR. What is cystic fibrosis? N Engl J Med 2002;347:439-442

Rowe S. , Miller B.S., J. Sorscher, .- Cystic Fibrosis-N Engl.Med J 352: 1992–2001, 2005

Margaret Hodson, Duncan M.Geddes-„Cystic fibrosis”-Red Chapmann and Hall Medical

Chillon M, Casals T, Mercier B, et al. Mutations în the cystic fibrosis gene în patients with congenital absence of the vas deferens. N Engl J Med 1995;332:1475-1480.

Noone PG, Zhou Z, Silverman LM, Jowell PS, Knowles MR, Cohn JA. Cystic fibrosis gene mutations and pancreatitis risk: relation to epithelial ion transport and trypsin inhibitor gene mutations. Gastroenterology 2001;121:1310-1319.

Rosenstein BJ, Cutting GR. The diagnosis of cystic fibrosis: a consensus statement: Cystic Fibrosis Foundation Consensus Panel. J Pediatr 1998;132:589-595.

Groman JD, Meyer ME, Wilmott RW, Zeitlin PL, Cutting GR. Variant cystic fibrosis phenotypes în the absence of CFTR mutations. N Engl J Med 2002;347:401-407.

Popa I., Pop L., Popa Z.-„Fibroza chistica(Mucoviscidoza)”-Editura Viata Medicala Romaneasca, 1998

Andersen D.H.-Cystic fibrosis and it s relation to celiac disease-A.J.Dis.Child, 1938, 56, 344-399

Glanzmann E: Dysporia entero-broncho-pancreatica congenita familiaris, , Cystiche Pancreas fibrose, Eine Clinische Vorlesung, Ann.Ped.1946, 8, 648-655

Lowe CU, May CD, Reed SC. Fibrosis of the pancreas în infants and children: a statistical study of clinical and hereditary features. Am J Dis Child 1949;78:349-374

Colombo.C, Liver disease în cystic fibrosis.Current Opinion în Pulmonary Medicine:Volume 13(6)November 2007p 529-536 Quinton PM. Missing Cl conductance în cystic fibrosis. Am J Physiol 1986;251:C649-C652.

Di Sant’ Agnese P.A, Darling R.C., Rerera A, Shea E: Abnormal electrolyte composition of sweat în cystic fibrosis of the pancreas, Pediatrics, 1953, 12, 549-563

Dodge J.A., Morison S., Lewis P.A., et al: Cystic fibrosis în the United Kingdom1968-1988, incidence, population and survival. Pediatric Perinat.Epidemiology, 1993, 2, 151-156

Popa I., Nicolau S., Cristescu A., Zagorca Popa și colab:Rezultatele unui studiu studiu pilot în depistarea nou-nascutilor cu mucoviscidoza, Pediatria, 1988, 2, 151-15

Cystic Fibrosis Foundation National Patient Registry Annual Data Report 2003. : Cystic Fibrosis Foundation, 2004.

Liou TG, Adler FR, , et al.: Predictive 5-year survivorship model of cystic fibrosis. Am J Epidemiol 2001, 153:345-352.

Mayer-Hamblett N, Rosenfeld M, Emerson J, et al.: Developing cystic fibrosis lung transplant referral criteria using predictors of 2-year mortality. Am J Respir Crit Care Med 2002, 166:1550-1555.

Lai HJ, Cheng Y, Cho H, et al.: Association between initial disease presentation, lung disease outcomes, and survival în patients with cystic fibrosis. Am J Epidemiol 2004, 159:537-546.

Cystic Fibrosis Consortium.-CFMDB Statistics

I.M.Popa, L.Pop, I.Popa, G.Benga, M.Schwarz, L.Tamas-„Epidemiology of CF gene în Romania”, European Human Genetics Conference , 2005, P1024

M.Macek Jr., M.Macek Sr., A.Krebsova, H.Cuppens, E.Dequeker, J.Cassimann, „European distribution of cystic fibrosis(CFTR) gene mutation: correlation with disease incidence and application to screening”-comunication at European Human Genetics Conference 2005

C.Colombo-“Gastrointestinal Disease”-Interactive Course on Cystic Fibrosis- Courses 2004-Viena

Bear CE, Li CH, Kartner N, et al. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Cell 1992;68:809-818.

Knowles M, Gatzy J, Boucher R. Relative ion permeability of normal and cystic fibrosis nasal epithelium. J Clin Invest 1983;71:1410-1417.

Kunzelmann K, Schreiber R, Nitschke R, Mall M. Control of epithelial Na+ conductance by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Pflugers Arch 2000;440:193-201.

Zeitlin PL. Pharmacologic restoration of delta F508 CFTR-mediated chloride current. Kidney Int 2000;57:832-837.

Zeitlin P. Can curcumin cure cystic fibrosis? N Engl J Med 2004;351:606-608.

Egan ME, Pearson M, Weiner SA, et al. Curcumin, a major constituent of turmeric, corrects cystic fibrosis defects. Science 2004;304:600-602.

R L Dormer, C M Harris, Z Clark, M M C Pereira, I J M Doull, C Norez, F Becq and M A McPherson -Sildenafil (Viagra) corrects F508-CFTR location în nasal epithelial cells from patients with cystic fibrosis , Thorax 2005;60:55-59

Wyckoff TJ, Thomas B, Hassett DJ, Wozniak DJ. Static growth of mucoid Pseudomonas aeruginosa selects for non-mucoid variants that have acquired flagellum-dependent motility. Microbiology 2002;148:3423-3430.

Whiteley M, Bangera MG, Bumgarner RE, et al. Gene expression în Pseudomonas aeruginosa biofilms. Nature 2001;413:860-864.

Freedman SD, Blanco PG, Zaman MM, et al. Association of cystic fibrosis with abnormalities în fatty acid metabolism. N Engl J Med 2004;350:560-569.

Cohn JA, Friedman KJ, Noone PG, Knowles MR, Silverman LM, Jowell PS. Relation between mutations of the cystic fibrosis gene and idiopathic pancreatitis. N Engl J Med 1998;339:653-658.

Engelhardt JF, Yankaskas JR, Ernst SA, et al. Submucosal glands are the predominant site of CFTR expression în the human bronchus. Nat Genet 1992;2:240-248.

Joo NS, Irokawa T, Wu JV, Robbins RC, Whyte RI, Wine JJ. Absent secretion to vasoactive intestinal peptide în cystic fibrosis airway glands. J Biol Chem 2002;277:50710-50715.

, Saenz Y, Krouse ME, Wine JJ. Mucus secretion from single submucosal glands of pig: stimulation by carbachol and vasoactive intestinal peptide. J Biol Chem 2002;277:28167-28175.

Jayaraman S, , Reitz B, Wine JJ, Submucosal gland secretions în airways from cystic fibrosis patients have normal [Na(+)] and pH but elevated viscosity. Proc Natl Acad Sci U S A 2001;98:8119-8123.

, Song Y, Thiagarajah JR. Role of airway surface liquid and submucosal glands în cystic fibrosis lung disease. Am J Physiol Cell Physiol 2003;284:C2-C15.

Galietta LJ, Springsteel MF, Eda M, et al. Novel CFTR chloride channel activators identified by screening of combinatorial libraries based on flavone and benzoquinolizinium lead compounds. J Biol Chem 2001;276:19723-19728.

Ma T, Vetrivel L, Yang H, et al. High-affinity activators of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) chloride conductance identified by high-throughput screening. J Biol Chem 2002;277:37235-37241.

Popa I.M- Studiul implicarii hepato-biliare la copiii cu mucoviscidoza( fibroza chistica), Teza doctorat, 2007

Bernhardt SA, Spilker T, Coffey T, et al.: Burkholderia cepacia complex în cystic fibrosis: frequency of strain replacement during chronic infection. Clin Infect Dis 2003, 37:780-785.

Kerem E, Kerem B: Genotype-phenotype correlations în cystic fibrosis. Pediatr Pulmonol 1996, 22:387-395.

Cutting GR. Genetic epidemiology and genotype/phenotype correlations. NIH Consensus Development Conference on Genetic Testing for Cystic Fibrosis. April 14-16, 1997.Genetic Testing for Cystic Fibrosis. NIH Consens Statement Online 1997 Apr 14-16

Tamas Liviu-Studiul mutațiilor genetice la copiii cu mucoviscidoza în Romania, Teza de doctorat

Lamireau T, Monnereau S; Martin S; Marcotte JE; Winnock M, Alvarez F-“Epidemiology of liver disease în cystic fibrosis: a longitudinal study . J Hepatol 2004 Dec; 41(6):920-5

Wilschanski M, Rivlin M, Solomon C, Augarten A, Blau H , Clinical and Genetic Risk Factors for Cystic Fibrosis-related Liver Disease PEDIATRICS Vol. 103 No. 1 January 1999, pg. 52-57

Lindblad A, Glaumann H, Strandvick B. Natural history of. liver disease în cystic fibrosis. Hepatology 1999;30:1151-8.

Williams SGJ, Evanson JE, Barret N, Hodson ME, Boultbee JE, Wetaby D. An ultrasound scoring system for the diagnosis of liver disease în cystic fibrosis. J Hepatol 1995; 22: 513-21.