Studiul computațional aplicat compușilor naturali cu schelet flavonoidic [309773]

UNIVERSITATEA POLITEHNICA TIMIȘOARA

FACULTATEA DE CHIMIE INDUSTRIALĂ ȘI INGINERIA MEDIULUI

LUCRARE DE DISERTAȚIE

Coordonator științific:

Dr.Chim. Alina Bora

Conf.Dr. Mihai Medeleanu

Candidat: [anonimizat]-Andreea Paul

Timișoara

2020

[anonimizat], flori, semințe și boabe. Modificările chimice ale acestor compuși naturali sunt asociate cu activități biologice diverse și beneficii multiple aduse în tratamentul cancerului, a bolilor de inimă, a [anonimizat]. [anonimizat].

[anonimizat] 17 flavonoide naturale diferite structural. Reactivitatea și profilul chimic au fost cercetate prin calculul unor descriptori globali (de ex., [anonimizat]) [anonimizat] (Austin model 1, AM1) și calcule chimice cuantice la nivel de teorie DFT (modulul Jaguar). Unul (hesperetina, 13) [anonimizat] (OSIRIS) a fost utilizat mai departe ca șablon (query) în studiul de similaritate 3D aplicat la 400 de compuși naturali conținuți de baza de date SPECS pentru identificarea de flavonoide noi naturale cu profil farmacologic îmbunătățit. 16 compuși din cei 400 ai bazei de date SPECS au fost identificați prin studile de similaritate 3D bazate pe formă. În studiile viitoare acești 16 compuși vor fi trecuți prin aceleași filtre ca cele pentru molecula șablon selectată (hesperetin, 13), pentru a [anonimizat].

ABSTRACT

Flavonoids form a [anonimizat], fruits, flowers, seeds, and grains. [anonimizat]-related, [anonimizat]. [anonimizat].

[anonimizat] a set of 17 different natural flavonoids. The reactivity and chemical profiles were investigated by computing global descriptors (e.g. [anonimizat], and all descriptors derived from these energies) [anonimizat] (Austin model 1, AM1) and quantum chemical calculations at DFT level of theory using Jaguar module. One (hesperetin, 13) [anonimizat] (OSIRIS) was further used as query in 3D shape-based matching against the 400 natural compounds of SPECS database to identify new natural flavonoids with enhanced pharmacological profile. 16 SPECS compounds were identified by 3D similarity searches and in future studies, will be passed through the same filters as those for the selected query in order to find the best compound(s) from electronic, ADME and secundary effects profiles point of view.

Introducere

1.Definiție și răspândire în natură

Flavonoidele sunt o clasă importantă de compuși naturali. Ele fac parte din categoria metaboliților secundari ai plantelor, având o structura de tip polifenolic și se găsesc în abundență în fructe, legume și în anumite bauturi. [1]

În natură, compușii flavonoidici sunt extrași din plante și îndeplinesc numeroase roluri în metabolismul acestora. În angiosperme sunt sintetizați doar în anumite locuri din plantă și sunt responsabili de culoarea și aroma florilor, iar în fructe de atragerea polinatorilor și în consecință ajută la răspandirea și germinarea semințelor. [2] Flavonoidele protejează plantele de stresul biotic și abiotic, acționează ca un filtru unic al radiaților UV, funcționează ca și molecule de tip semnal, compuși alopatici, agenți de detoxifiere și compuși implicați în apărarea antimicrobiotică. [1] Flavonoidele mai îndeplinesc roluri în rezistența la frig și secetă a plantelor, dar și a aclimatizării acestora la schimbările de temperatură din mediu. [3] De asemenea, flavonoidele se găsesc din abundență în alimente și băuturi de origine vegetală precum fructele, legumele, ceaiul, cacao și vinul purtând numele de flavonoizi alimentari. [1]

2. Structura flavonoizilor

Din punct de vedere chimic, flavonoidele au ca structură de bază un schelet de cincisprezece unități de carbon format din două inele benzenice A și B, legate între ele prin intermediul unui inel heterociclic de tip piranoză, C (Figura 1). [4]

Figura 1. Structura generală a flavonoizilor [4]

3. Clasificare

Flavonoidele pot fi divizate în mai multe subgrupe în funcție de carbonul din inelul C de care este atașat inelul B, de gradul de oxidare și respectiv de nesaturare a inelului C. Flavonoidele în care inelul B este legat în poziția 3 sunt numite isoflavone. Cele în care inelul B este legat în poziția 4 sunt numite neoflavonoide, iar cele în care inelul B este legat în poziția 2 pot fi subdivizate în subgrupuri diferite în funcție de caracteristicile structurale ale inelului C. [1]

3.1 Flavonele

Flavonele sunt larg raspândite în frunze, flori, fructe sub forma de glicozidă. Ridichea, patrunjelul, ardeii roșii, mușețelul, menta și ginkgo biloba sunt sursele principale de flavone. Astfel luteolina, apigenina și tangeritina aparțin acestei subclase (Figura 2). [1] Coaja citricelor este bogată în flavone polimetoxilate precum tageretina, nobiletina și sinensetina. [5] Flavonele au o legatură dublă între pozițiile 2 și 3 și o grupare de tip cetonă în poziția 4 a inelului C. Majoritatea au o grupare hidroxil în poziția 5 a inelului A, pe când hidroxilarea în alte poziții, în principal la poziția 7 de pe inelul A sau 3’ și 4’ de pe inelul B poate să varieze în funcție de clasificarea taxonomică a respectivei legume sau fruct. [1]

Figura 2. Strucura chimică a flavonelor apigenina, luteolina și tangeritina

3.2 Flavonolii

Flavonolii reprezintă cea mai comună și cea mai variată subgrupă a flavonoidelor fiind considerate “cărămizi” ale proantocianinelor. Cei mai studiați flavonoli sunt quercitina, kaempferolul, miricetina și fisetinul (Figura 3). Flavonolii sunt distincți de flavanoli (cu „a”) cum ar fi catechinul, o altă clasă de flavonoizi. Surse bogate de flavonoli sunt varza furajeră, ceapa, salata, roșiile, merele, strugurii și zmeura. Pe lângă fructe și legume, ceaiul și vinul roșu sunt și ele surse de flavonoli. O alimentație bogată în flavonoli este asociată cu numeroase beneficii pentru sănătate precum un potențial antioxidant mărit și un risc redus de boli vasculare. [1]

Flavonolii au o grupare hidroxil în poziția 3 a inelului C, care poate fi și glicozilat. Flavonolii au modele foarte variate de metoxilare și hidroxilare, diversitatea lor provinind tocmai din pozițiile diferite ale grupărilor -OH sau –OCH3 pe inele A și B. De exemplu quercitina se găsește în cantități apreciabile în numeroase plante utilizate ca alimente, cum ar fi ceapa roșie, varză furajeră, mărar, etc. [6]

Figura 3. Strucura chimică a flavonolilor kaempferolul, quercitina, miricetina și fisetina

3.3 Flavanone

Flavanonele sunt în general întalnite în citrice precum portocale, lămâi și struguri. Dintre acestea se remarcă hesperitina, naringenina și eriodyctiolul (Figura 4). Flavononele au numeroase beneficii pentru sănătate datorită proprietăților lor de neutralizare a radicalilor liberi. Acești compuși sunt responsabili de gustul amărui ai sucului și cojii de citrice. Flavanonele prezintă numeroase efecte farmacologice asupra organismului, precum efect antioxidant, antiinflamator, de reducere a concentrației de lipide în sânge și sunt agenți de reducere a colestrolului. [1]

Flavanonele mai sunt numite și dihidroflavone au inelul C saturat, deci spre deosebire de flavone legătura dublă dintre pozițiile 2 și 3 este saturată, acesta fiind singura deosebire dintre cele două subclase. În ultimii douăzeci de ani numărul flavononelor identificate a crescut simțitor. [6]

Figura 4. Strucura chimică a flavanonelor naringenina, hesperitina, și eriodictiolul

3.4. Isoflavonoidele

Isoflavonoidele au o răspândire limitată în lumea vegetală și se găsesc cu preponderență în planta de soia și alte plante leguminoase. Există și studii care raportează prezența acestora în anumiți microbi. [7] De asemenea ei joacă un rol important ca precursori în formarea phytoalexinelor în timpul interacțiunii plantă-microb. [8], [9]

Potențialul utilizării în medicină a isoflavonoidelor este imens. Genisteina și daidzeina (Figura 5) sunt considerate fitoestrogeni. Ei pot induce diferite modificări hormonale și metabolice și datorită acestui lucru pot influența căile de acțiune ale unor boli. [10]

Figura 5. Strucura chimică a isoflavonoidelor genisteina și daidzeina

3.5 Neoflavonoide

Neoflavonoidele sunt o clasă a compușilor fenolici. Ca și particularitate structurală se remarcă faptul că inelul B nu este atașat de inelul C în poziția 2 ci în poziția 4 (Figura 6). [11]

Figura 6. Strucura de bază a neoflavonoidelor

3.6 Catechine

Catechinele, numite și flavanoli, flavanololi, flavan-3-oli sau dihidroflavonoli sunt flavanone cu o grupare hidroxi în poziția 3. Nu prezintă legătură dublă între carbonii 2 și 3 ai inelului C (Figura 7). Sunt un grup diversificat care se găsesc în abundență în banane, mere, coacăze, piersici și pere. [1]

Figura 7. Structura chimică a catechinei

3.7 Antocianii

Antocianii sunt compuși de natură pigmentară, responsabili de culoarea plantelor, florilor și fructelor. Ei apar în general în straturile exterioare de celule al diferitelor fructe precum murele, afinele, strugurii roșii și albi, coacăze negre și roșii, căpșuni și zmeură. [1] Culoarea antocianilor este dependentă de pH și de metilarea sau acilarea grupărilor hidroxi de pe inelele A și B. [6] Sunt compuși foarte stabili și cu numeroase beneficii pentru sănătate cea ce ii face mult utilizați în industria alimentară. [12] Cei mai studiați antociani sunt cianidina, delphinidina, malvidina, pelargonidina și peonidina. (Figura 8) [1]

Figura 8. Structura chimică pelargonidina, delphinidina, cianidina, malvidina și peonidina

3.8 Chalcone

Chalconele sunt caracterizate de lipsa de lipsa inelului C a scheletului de bază flavonoidic. De aceea se mai numesc și flavonoide cu catenă ‚deschisă’. Ele sunt prezente în numeroase alimente precum roșiile, perele, căpșuniile și anumite cereale. Ca și exemple se remarcă phloridzinina, arbutina, phloretina și chalconaringenina (Figura 9). [1]

Figura 9. Structura chimică pentru phloretina, chalconaringenina, arbutina și phloridzinina

4. Activitate biologică

4.1 Activitatea antioxidantă

Antioxidanții sunt compuși care protejează celulele împotriva efectului oxidativ al speciilor de oxigen reactive. Stresul oxidativ poate să ducă la deteriorare celulară care este asociată cu diferite probleme de sănătate precum diabet, cancer, boli neurovegetative și îmbătrânire. Antioxidanții interferează cu sistemele producătoare de radicali liberi și îmbunătățesc efectele antioxidanțiilor indigeni, protejând celulele. [1]

Flavonoidele posedă numeroase proprietăți biochimice, dar activitatea antioxidantă este cea mai studiată dintre acestea. Ea depinde de aranjamentul grupărilor funcționale în jurul scheletului de bază. Configurația, substituția și numărul grupărilor hidroxil influențează substanțial diferite mecanisme ale activității antioxidante precum captarea de radicali liberi și capacitatea de chelare ion-metal. [4]

Cea mai importantă este configurația grupărilor hidroxil de pe inelul B în interacțiunea cu radicalii liberi deoarece poate dona hidrogeni și electroni radicalilor de tip hidroxil, peroxil și peroxinitrit, stabilizându-i. [13]

Mecanismele activității antioxidante pot să includă fie supresia formării de radicali liberi prin inhibarea activității enzimelor inplicate în formarea acestora, fie prin captarea radicalilor liberi, fie prin îmbunătățirea și protecția mecanismelor antioxidante existente deja în organism. [4]

Acțiunea flavonoidelor implică majoriatatea mecanismelor menționate mai sus. Unele dintre efectele mediate de flavonoide pot fi rezultatul unei combinări a captării de radicali liberi și a interacțiunii cu funcțiile unor enzime. Flavonoidele inhibă enzimele implicate în generarea de radicali liberi precum monooxigenaza microzomală, succinoxidaza mitocondrială, oxidaza NADH, glutation S-trasferaza, etc. [14]

Peroxidarea lipidelor este o consecință des întălnită a stresului oxidativ. Ionii liberi metalici sporesc formarea radicalilor liberi prin reducerea hidroxidului care rezultă în formarea unui radical hidroxil extrem de reactiv. Datorită potențialului lor redox mai scăzut sunt capabile din punct de vedere termodinamic să reducă radicali liberi puternic oxidanți precum superoxidul, peroxidul, alcoxilul și hidroxilul prin donare de hidrogen. [15],[16] Datorită capacității lor de a chelata ioni, flavonoidele inhibă generarea de radicali liberi. Metalele se leagă în anumite poziții de pe inelele structurii flavonoidelor. [17]

Compușii care au o legătură nesaturată între poziția 2 și 3 în conjugare cu o funcțiune 4-oxo sunt antioxidanți mult mai potenți decât omologii lor cărora le lipsește această configurație. Conjugarea dintre inele A și B permite formarea unui efect de rezonanță a nucleului aromatic care la rândul său duce la formarea unui radical flavonoidic stabil. [18]

Heterociclul flavonoidic contribuie la activitatea antioxidantă prin capacitatea de conjugare dintre inele aromatice și o grupare 3-OH liberă. Îndepărtarea acestei grupări anulează coplanaritatea și conjugarea ceea ce duce la compromiterea capacității de captare. [19]

4.2 Activitatea hepatoprotectivă

Numeroase flavonoide precum catechina, apigenina, quercitina, naringenina și rutina prezintă activități hepatoprotectoare. [20]

Numeroase boli cronice, precum diabetul pot duce manifestări clinice la nivelul ficatului. Un studiu efectuat pe șoareci de laborator a dus la concluzia că administrarea de antociani a dus la combaterea acestor manifestări prin reducerea nivelului de radicali liberi hepatici. [21]

Silimarina este un complex de natura flavonoidică având trei componente structurale numite silibinină, silidianină și silicristină și este extras din semințele și fructul armurariului, Silybum marianum. Silimarina stimulează activitatea enzimatică a ARN-polimerazei 1, o enzimă implicată în biosinteza ARN și a proteinelor. Aceasta are ca rezultat o sinteză de ADN sporită cea ce duce la o proliferare celulară mărită. Efectul acesteia este o regenerare hepatică rapidă dacă țesutul hepatic este distrus. [22] Dintre proprietățile farmacologice ale silimarinei se numără reglarea permeabilității și integrității membranei celulare, inhibiția leukotrienei, captarea de radicali liberi, scăderea protein-kinazelor și înbunătățirea producerii de colagen. [23] Silimarina are aplicații concrete în tratamentul cirozei, accidentelor vasculare și hepatitei toxice induse de diferite toxine precum acetaminofenul și toxinele din ciuperci. [24]

Activitățile hepatoprotective a flavonoidelor au fost observate și în culturile celulare de hepatocite neonatale ale șobolanilor distruse de tetraclorura de carbon care au fost tratate cu flavonoide izolate din Laggera alata. Flavonoidele în concentrație 1–100 𝜇g/mL au înbunătățit viabilitatea celulelor și au redus pierderea celulară de aspartat aminotransferază (AST) și alanin aminotransferază (ALT) cauzată de tetraclorura de carbon. [25]

Similar, într-un experimet in vivo flavonoidele administrate în doze orale de 50, 100, și 200mg/kg au redus simțitor nivele de AST, ALT, cantitate totală de proteină și albumină în ser și de hidroxiprolină și acid sialic în ficat. Examinările histopatologice au arătat îmbunătățiri în ficatul deteriorat după tratamentul cu flavonoide. [25]

Diferite investigații clinice au arătat eficacitatea și siguranța în folosire a flavonoidelor în tratamentul disfuncțiilor hepato-biliare și a problemelor digestive cum ar fi senzația de plin, pierderea apetitului, greață și durere abdominală. Flavonoidele izolate din Equisetum arvense înpreună cu hirsutina și avicularina izolate din alte surse asigură protecție înpotriva hepatotoxicității induse chimic. [26],[27]

4.3 Activitatea antibacterială

Flavonoidele sunt cunoscute ca fiind sintetizate de plante ca răspuns la o infecție microbiană. Astfel extractele din plante bogate în flavonoide posedă o activitate antibacterială pronunțată. Dintre flavonoidele cu activitate antibacterială se numără apigenina, galanginina, flavonele, isoflavonele și chalconele. [4]

Majoritatea flavonoidelor antibacteriale pot avea ținte celulare multiple, mai degrabă decât un anumit situs de acțiune. Una dintre acțiunile lor moleculare este să formeze complexi cu proteinele prin legături nonspecifice precum legăturile de hidrogen, legăturile covalente sau efecte hidrofobice. Astfel modul lor de acțiune antimicrobială este înrudit cu capacitatea lor de inactivare a enzimelor și a proteinelor transportoare. Flavonoidele lipofilice pot de asemenea să distrugă membranele celulare. [4]

Catechinele au fost cercetate intens datorită proprietăților antibacteriale. Acești compuși prezintă activitate antibacterială in vitro împotriva Vibrio cholerae, Streptococcus mutans, Shigella, și alte bacterii. Catechinele inactivează toxina din V. cholerae și inhibă glucosyl transferazele bacteriene izolate in S. mutans. [28], [29]

Robinetina, miricetina și epigallocatechina inhibă sinteza ADN-ului Proteus Vulgaris. Mecanismul sugerat este că inelul B al flavonoidelor poate intercala sau forma legături de hidrogen cu bazele acizilor nucleici și astfel duc la inhibiția sintezei de ADN și ARN în bacterie. [30]

Naringenina și sophoraflavanona G au o activitate antibacterială intensă împotriva lui Staphylococcus aureus și altor streptococi, care sunt rezistenți la meticilină. Aceste efect apare datorită capacității celor două flavonoide de a altera fluiditatea membranei în regiunile hidrofilice și hidrofobice. Corelarea dintre activitatea antibacterială și interferența cu membranele susține teoria că flavonoidele au acest efect asupra bacteriilor datorită capacității lor de a reduce fluiditatea membranei celulare bacteriene. [31]

În cadrul unui studiu a activității antibacteriene a două flavonoide, licochalconele A și C, izolate din rădăcina a Glycyrrhiza inflata, s-a obseravat efectul acestora asupra S. aureus și Micrococcus luteus. S-a ajuns la concluzia că licochalcona A inhibă încorporarea de precursori radioactivi în macromolecule, precum ADN, ARN și proteine. Activitatea aceasta este similară cu modul de acțiune a antibioticelor care inhibă respirația celulară. După mai multe studii ulterioare a fost sugerat că, situsul de inhibiție a acestor flavonoide se află între CoQ și citocromul C al lanțului transportor de electroni al celulei bacteriene. [32]

4.4 Activitatea antiinflamatoare

Inflamația este un proces bilogic normal care apare ca răspuns la rănirea unui țesut, în cazul infecției cu un agent patogen microbial sau a unei iritări chimice. Inflamația este inițiată de migrarea celulelor imunitare din vasele de sânge și eliberarea mediatorilor la locul infecției. Acest proces este urmat de recrutarea celulelor inflamatoare și eliberarea de radicali liberi și citocine proinflamatorii pentru eliminarea patogenilor străini și repararea țesutului rănit. În general, o inflamație obișnuită este rapidă și nu prezintă extindere, dar o abatere de la aceste reguli poate cauza diferite boli cronice. [4]

Sistemul imunitar poate fi modificat de dietă, ageți farmacologici, poluanți din mediu și chimicale care apar în alimente. Diferite flavonoide pot afecta pozitiv diferite funcții ale sistemului imunitar și a celulelor inflamatoare. Dintre acestea se numără hesperidina, apigenina, luteolina și quercitina care posedă efect antiinflamator și analgezic. [4]

Flavonoidele pot afecta în special funcțiile anumitor enzime implicate în generarea proceselor inflamatorii, în special tirozină și serin-theronină protein kinazele. Inhibiția kinazelor apare datorită legării competitive a flavonoidelor cu ATP-ul pe situsurile catalitice a enzimelor. Aceste enzime acționează în procese de traducere de semnale și activări celulare care implică celule ale sistemului imunitar. [33] Flavonoidele sunt capabile să inhibe expresia nitric-oxid sintazei, a ciclooxigenazei și a lipooxigenazei care sunt responsabile de producerea unei mari cantități de oxid nitric, prostanoide, leukotriene și alți mediatori ai procesului inflamator precum citokinele, chemokinele sau moleculele de adeziune. [34]

Flavonoidele inhibă de asemenea fosfodiesterazele implicate în activarea celulară. Mult din efectul antiinflamator al flavonoidelor se bazează pe biosinteza de citokine care mediază adeziunea leucocitelor circulate de locul leziunii. Multe flavonoide sunt inhibitori potenți ai producției de prostaglandine, care sunt molecule semnal proinflamatorii. [35]

Câteva flavonoide inhibă adeziunea, agregarea și secreția de trombocite la o concentrație de 1-10 mM. [36]

4.5 Activitatea anticancerigenă

Factorii dietetici joacă un rol important în prevenția cancerului. Fructele și legumele care conțin flavonoide sunt considerante ca fiind agenți chemopreventivi ai cancerului. Consumarea de ceapă și mere, două surse majore de quercitină este invers asociată cu incidente de apariție a cancerului de prostată, plămâni, stomac și sân. De asemenea băutorii moderați de vin posedă un risc mai scăzut de a dezvolta cancer de plămâni, esofag, stomac și colon. [4]

Diferite mecanisme moleculare au fost propuse pentru explicarea efectului flavonoidelor asupra inițierii și propagării stagiilor carcinogenicității incluzând influențele lor asupra activităților hormonale. Dintre aceste se numără scăderea cantității proteinei mutante p53, oprirea diviziunii celulare necontrolate, inhibiția tirozin kinazei, inhibiția proteinelor de șoc termic, capacitatea de a lega receptorii estrogenici și inhibiția expresiei moleculelor Ras. [37]

Mutațiile proteinei p53 sunt dintre cele mai cunoscute anomalii genetice în cancerele umane. Inhibarea expresiei acestei proteine poate să ducă la oprirea dezvoltării celulelor canceroase. S-a constatat că flavonoidele reduc capacitatea de expresie a acesteia până la nivele aproape nedetectabile în celulele canceroase ale cancerului de sân. [38]

Proteinele de șoc termic permit o supraviețuire mai bună a celulelor canceroase atunci când organismul este supus diferitelor tipuri de stres. S-a constatat că flavonoidele inhibă producția acestor proteine în mai multe tipuri de celule maligne precum cele ale cancerului de sân, leucemie și cancerului de colon. [38]

Quercitina (Qu) este cunoscută ca având efect inhibitoriu asupra diviziunii celulare necontrolate în celulele limfoide. Ele acționează in vitro asupra celulelor canceroase de mai multe feluri precum cele implicate în leucemie, cancerul de colon, cancerul de sân, cancerul gastric, cancerul dermic și cancerul ovarian. [38]

Tirozin kinazele sunt un tip de proteine localizate fie în interiorul celulei, fie în apropierea membranei celulare. Ele sunt responsabile de transducția semnalelor factorului de creștere către nucleu. Această proprietate a lor este implicată în oncogeneză datorită abilității de a trece peste mecanismele obișnuite de reglare a creșterii celulare. Medicamente care inhibă activitatea tirozin kinazei sunt considerate ca și posibili agenți antitumorali care acționează fără efectele secundare citotoxice ale chemoterapiei convenționale. Quercitina a fost primul compus inhibitor de tirozin kinază testat pe celule umane. [39]

Într-un studiu efectuat cu scopul determinării efectului genisteinei, daidzeinei și biochaninei A în carcinogeneza glandelor mamare, s-a constatat capacitatea genisteinei de a suprima dezvoltatea cancerului mamar indus chimic fără alte efecte secundare. Administrarea neonatală de genisteină a avut un efect protector înpotriva dezvoltării ulterioare a cancerului glandelor mamare la șobolanii. [40]

4.6 Activitatea antivirală

Compușii naturali sunt o sursă importantă de noi descoperiri și înbunătățiri de noi medicamente antivirale datorită largii lor răspândiri și a lipsei lor de efecte secundare nedorite. Flavonoidele prezente în natură cu activitate antivirală au fost studiate intensiv încă din anii 1940. Cele mai multe studii de acest gen se bazează pe inhibiția enzimelor implicate în ciclul de viată al virusurilor. [4]

Căutarea unui tratament eficace pentru virusul imunodeficienței umane (HIV) este o problemă modernă presantă. Un studiu a demosntrat că flavanolii sunt mult mai eficace decât flavonele și flavanonele în inhibiția selectivă a virusului HIV-1 și HIV-2, precum și în cea infecțiilor inumodeficinete similare. Baicalina, o flavonoidă izolată din Scutellaria baicalensis inhibă infectarea și replicarea cu HIV-1. Baicaleina și alte flavonoide precum robustaflavona și hinokiflavona inhibă de asemenea revers transcriptaza tulpinii HIV-1. Catechinele inhibă ADN polimerezele lui HIV-1 și gardenina A demetilată și robinerina inhibă proteinazele lui HIV-1. [41]

Diferite combinații de flavone și flavonoli au capacitatea de a crea un efect sinergic. Kaempferolul și luteolina au efecte sinergice înpotriva virusului herpes simplex (HSV). Sinergismul apare și intre flavonoide și alți agenți antivirali. Quercitina potențează efectele 5-etil-2-dioxiuridinei și a aciclovirului împotriva HSV-ului. Flavonolii sunt mult mai activi decât flavonele împotriva virusului herpes simplex de tipul 1 și ordinea crescătoare a eficienței este galangina, kaempferolul și quericitina. [41]

Astfel flavonoidele au efecte pozitive în numeroase infecții virale. Quercitina acționează împotriva virusului turbării, virusului herpes, virusului polimelitei, virusului mengo și virusului Auzesky. Rutina acționează împotriva virusului influenzei și parainflunenzei și împotriva virusului cartofului. Apigenina luptă împotriva virusului HIV, herpes simplex și Auzesky. [4]

4.7 Rolul flavonoidelor în plante

Flavonoidele au numeroase funcții în plante, dar de departe cel mai important este cel de reducere a stresului oxidativ. Biosinteza flavonoidelor în plante este întotdeauna mărită în cazul apariției stresului oxidativ. Ele au capacitatea să absoarbă energia solară cu cea mai mare energie și anume radiația ultravioletă, să inhibe generarea de radicali liberi și să le micșoreze efectul odată formați. Măsura abilității antioxidante și a capacității de absorție a radiației ultraviolete depinde de natura substituenților aflați pe inele. Flavonoidele dihidroxi substituite pe inelul B au o capacitate antioxidantă mai mare, în timp ce cele monohidroxi substituite au o capacitate mai mare de absorție a ultravioletelor. [42]

5. Utilizările flavonoidelor

5.1 În medicină

Multe dintre flavonoide și derivații lor, naturali sau sintetici, pot fi utilizați în industria medicamentoasă pentru numeroase boli, datorită proprietăților lor antioxidante, antivirale și antibacterine. [43]

Semințele armurariului Silybum marianum, care sunt extrem de bogate în flavonoide active au fost utilizate în afecțiunile ficatului de un timp îndelungat. Forma glicozidică a chalconelor și a flavonelor sunt responsabile de activitatea antihepatotoxică a extractelor de Butea. În urma unor studii mai recente s-a demonstrat că flavonoidele, mai ales quercitina, pot fi utilizate în tratatmentul virusului HIV și a mai multor tipuri de cancere. [44]

Flavonoidele și derivații lor pot fi utilizați ca agenți înpotriva virusurilor care atacă plantele precum virusul X al cartofului și virusul mosaic al tutunului. Ca și agenți antibacterieni pot acționa ca analogi ai antibioticelor pentru bacterii care au dezvoltat rezistență la ele. Ca și agenți antifungici pot fi utilizați ca și potențiali biocizi. Derivații alchili ai flavonoidelor acționează împotriva mai multor specii de fungi distrugători de lemn și a bacteriilor Gram pozitive și negative. [43], [45]

5.2 În alimentație

Flavonoidele sunt responsabile de numeroase calități organoleptice ale unor alimente foarte des consumate de oameni. Aroma caracteristică fructelor speciei Citrus este dată de prezența flavonoidelor ca și îndulcitori. Mai mult, flavonoidele sunt responsabile de gustul caracteristic al multor băuturi frecvent utilizate în alimentația umană precum vinul, berea sau ceaiul. Flavonoidele din struguri au o influență imensă asupra calității vinului. Două mari grupe de flavonoide sunt parte inerentă a vinurilor și anume antocianii și proantocianidinele. Antocianii sunt responsabili de culoarea vinului, în timp ce proantocianidinele îi dau anstringență. [46]

Mierea este un produs natural foarte cunoscut datorită numeroaselor sale calități, atât ca aliment cât și ca medicament. Din punct de vedere chimic este o soluție extrem de concentrată a unui amestec complex de zaharuri. Pe lângă aceste zaharuri conține o gamă largă de compuși în cantitate mai redusă, dintre care procentul cel mai mare este de polifenoli, clasă din care fac parte și flavonoidele. Cele mai întâlnite flavonoide în miere sunt quercitina, kaempferolul și myricetina, dar compoziția variază în funcție de proveniența polenului utilizat la producerea ei. Datorită compoziției bogate în polifenoili, mierea are un caracter antioxidant pronunțat ceea ce o face utilă în tratarea a numeroase boli și în menținerea unei stări de sănătate bune. Datorită gustului dulce, aromei și culorii mierea este utilizată ca înlocuitor al zahărului, conservant natural și ingredient în alimentație. [47]

5.3 În industria pigmenților naturali

Flavonoidele constituie una dintre cele mai mari clase de pigmenți naturali. În zilele noastre, datorită dezvoltării ingineriei genetice este posibilă modificarea căii biosintetice de obținere a flavonoidelor pentru a obține compuși noi, cu culori diferite. Acest lucru este foarte util în special în obținerea unor sortimente noi de flori, cu culori care nu există în natură. [46]

Pigmenții naturali care conțin flavonoide sunt utilizați frecvent ca și pigmenți mordant, cu excepția catechinelor care pot fi utilizate ca și pigmenți direcți. Mordanții sunt o categorie de substanțe utilizate în combinație cu alte pigmenți pentru a-i fixa pe fibre. Un mordant frecvent utilizat împreună cu flavonoidele este sarea de aluminiu solubilă. Culoarea verde este de obicei creată dintr-o combinație de indigo și pigment flavonoidic. [43]

Mulți pigmenți prezenți în plante au natură glicozidică. Procesul de vopsire este urmat de ruperea legăturii glicozidice și formarea de legături noi între fibră și pigment, obținându-se astfel o colorație insolubilă în apă, dar care poate fi spălată. Cele mai frecvente flavonoide apărute în pigmenții de culoare galbenă sunt quercitina, kaempferolul și isorhamnetina sub forma lor glicozidică. Taninurile sunt utilizate ca pretratament al fibrelor și pentru obținerea culorilor închise, maro spre negru. [48]

Materiale și metode

6. Instrumente computaționale

Modelarea moleculară ca și metodă de abordare a proiectării compușilor medicamentoși are o amploare tot mai mare și este tot mai răspândită în zilele noastre. Procedeul tradițional de proiectare folosit la introducerea unor compuși noi cu profil chimic îmbunătățit a fost considerat mult prea lent și costisitor. Ca să compenseze aceste dezavantaje, metodele chimiei computaționale sunt considerate unele dintre cele mai folositoare instrumente menite să îmbunătățească acest domeniu, să economisească timp valoros și să reducă costurile și resursele utilizate. De asemenea aceste studii computaționale pot susține cercetarea și dezvoltarea domeniului de studiu al flavonoidelor prin obținerea unor informații noi asupra interacțiunilor intermoleculare și a structurii lor moleculare prin investigarea relațiilor structură-activitate. Scopul acestora este de a deschide noi direcții de cercetare sau a de a găsi funcțiuni noi flavonoidice cu aplicații terapeutice diferite. [49,50]

7. Detalii computaționale

Influența substiuienților asupra centrului flavonoidic și relațiile dintre structură, stabilitate și reactivitate a 17 compuși flavonoidici naturali (Figura 10) au fost studiate utilizând metode computaționale. Aceste structuri au fost construite și preoptimizate cu metoda MM+ (molecular mechanic force field) și metoda semi-empirică AM1 (Austin Model 1) utilizând programul HyperChem. [51] Optimizarea geometrică s-a realizat utilizând algoritmul Polak-Ribere cu convergența SCF setată la 0.0001 kcal/mol și gradientul RMS setat la 0.001 kcal/mol.

Proprietatea numită căldură de formare (ΔHfθ) [53] calculată cu HyperChem a fost utilizată mai departe în studiul stabilității compușilor. Aceste metode ușurează optimizarea completă cu metode mai dezvoltate precum DFT (hybrid density functional theory = teoria funcționalei de densitate) combinată cu funcția de schimb-corelare sau pe scurt funcționala B3LYP (Becke, three-parameter, Lee-Yang-Parr) și utilizând diferite baze de orbital atomici, pentru acest caz, setul de baze 6-31G(d,p). Structurile 3D ale celor 17 flavonoide preluate din baza de compuși cu activități biologice determinate, PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), au fost convertite în formatul *mae (care este acceptat de modulul Jaguar [52]) pentru a putea fi optimizate complet și a se calcula proprietățile electronice a compușilor titulari. Minumul real al compușilor a fost confimat prin prezența frecvențelor pozitive.

Proprietățile electronice de tipul energilor HOMO și LUMO [54], a potențialului electrostatic (ESP) [57,58] și indicilor Fukui au fost obținuțe utilizând modulul Jaguar al pachetului Schrödinger. [52] Au fost calulați parametrii suplimentari precum intervalul de energie (ΔE), [54,59] potențialul de ionizare (I), afinitatea pentru electroni (A), tăria (η), [60,61,62] slăbiciunea (S), [63] potențialul chimic (µ), [62,64] electronegativitatea (χ), [65] și electrofilicitatea (ω), [63], parametri considerați indicatori relevanți ai reactivității și stabilității chimice a compușilor. Acești parametri au fost derivați din energiile HOMO și LUMO. Analiza acestor proprietăți calculate furnizează informații adiționale despre activitatea analoglor flavonoidici.

8. Parametrii electronici

Căldura de formare (ΔHfθ) este energia eliberată sau absorbită sub formă de căldură când un mol de compus este format prin combinarea elementelor sale aflate în condiții standard (T=298.15K și p=1atm). Entalpia de formare este un indicator important al stabilității termodinamice sau a instabilității compusului. Compușii cu valori mari, negative ale entalpiei sunt extremi de stabili, iar cei cu valori ușor negative sau pozitive sunt relativ instabili și pot reacționa sau se pot descompune spontan în elemente. [51]

Orbitalii energetici HOMO și LUMO. Cel mai înalt orbital molecular ocupat (HOMO) și cel mai jos orbital molecular neocupat (LUMO), care mai poartă denumirea și de orbitali de frontieră, joacă un rol important în reactivitatea chimică a unei molecule. Localizarea HOMO și LUMO pe o moleculă indică susceptibilitatea situsului la un atac electrofilic sau nucleofilic. Capacitatea donoare sau afinitatea pentru electroni a unei molecule pot fi determinate cu ajutorul valoriilor HOMO și LUMO. O valoare HOMO mare corespunde unei capacități de donare de electroni mare și prin urmare molecula este supusă susceptibilități la atac electrofil. Energia LUMO este asociată cu afinitatea pentru electroni și descrie susceptibilitatea unei molecule față de un atac nucleofil. [53,54]

Intervalul de energie HOMO-LUMO (ΔE) calculat ca și diferența de energie a orbitalilor HOMO și LUMO este o valoare importantă în stabilitate și reactivitate chimică. O valoare a ΔE mare reprezintă o stabilitate mărită și o reactivitate mai mică, în timp ce o valoare ΔE mică reprezintă o stabilitate mai scăzută, dar o reactivitate moleculară mai mare. [54,59] Potrivit teoremei Koompnas [65] EHOMO aproximează potențialul de ionizare (IP), în timp de afinitatea pentru electroni (EA) este aproximată de ELUMO. Potențialul de ionizare și afinitatea pentru electroni [64] poate estima predispoziți unui sistem de a dona sau a accepta electroni. (Ecuațiile 1-2)

Tăria globală (η) corespunde intervalului dintre orbitalii ocupați și neocupați și permite înțelegerea reactivității chimice a unei molecule. Din punct de vedere fizic corespunde rezistenței moleculei față de deformăriile moleculare. Valoriile sunt întotdeauna pozitive. Cu toate acestea, cu cât valoarea este mai mică cu atât crește reactivitatea moleculei. Inversa tăriei este definită ca și slăbiciunea (S). (Ecuațiile 3-4)

Potențialul chimic (μ) măsoară tendința unei particule de a difuza. Poate fi pozitivă, apropiată de zero sau foarte negativă. Conceptual, în timp ce un potențial puternic negativ se referă la a se comporta ca un donor de electroni, o valoare pozitivă corespunde unui comportament de tip acceptor de electroni. (Ecuația 5)

Electronegativitatea (χ), valoarea cu minus a potențialului chimic (-(μ)), descrie tendința unui atom de a atrage electroni sau densități electronice înspre el. (Ecuația 6)

Indexul electrofilic (ω) măsoară predilecția unei molecule de a accepta electroni. Cu cât valoriile acesteia sunt mai mari cu atât reactivitatea chimică este mai mare. (Ecuațiile 6-7)

Indicii atomici Fukui (sau indicii de reactivitate) și potențialul electrostatic (ESP) sunt considerate de asemenea instrumente adecvate pentru interpretarea, predicția și îmbunătățirea comportamentului reactiv a unei molecule.

Indicii Fukui descriu tendința unei molecule de a accepta sau a pierde un electron. Pe scurt, indicii de reactivitate arată care din atomii unei molecule sunt cei mai susceptibili să întreprindă un atac nucleofilic sau electrofilic. Indicii Fukui conțin două subscripte:

N(f_NN) sau S(F_SS) care corespund densității de electroni, respectiv densității de spin. O valoare pozitivă mare pentru (f_NN) a HOMO indică atomul care este cel mai reactiv în filfața unui atac electrofilic (agent nucleofilic) și o valoare pozitivă mare pentru (f_NN) a LUMO indică atomul care este cel mai reactiv în fața unui atac nucleofilic (agent electrofilic).

Potențialul electrostatic (ESP) reprezintă diferența în sarcina electrică dintre două puncte și ajută la identificarea zonelor de potențial local negativ sau pozitiv dintr-o moleculă. Speciile încărcate pozitiv (electrofile) tind să fie atrase în regiunile moleculelor corespunzătoare celor mai negative valori ale ESP, în timp ce speciile încărcate negativ (nucleofile) tind să fie atrase în zonele moleculelor cu valori pozitive ale ESP.

Cea mai ușoară metodă de a evalua orbitalii HOMO și LUMO, distribuția de sarcină și profilele ESP este să fie reprezentate ca o hartă de potențial electrostatic. Pentru interpretarea datelor sunt folosite culorile și anume: roșul reprezintă valorile joase ale ESP, în timp ce albastru pe cele înalte ale ESP.

Indicii prezentați mai sus sunt calculați conform următoarelor ecuații:

S = 1/η (4)

9. ADME și profilul de risc al toxicității

ADME-ul (Adbsorție, Distribuție, Metabolism, Excreție) și procesele de toxicologice joacă un rol cheie în definirea eficacității terapeutice a unui posibil medicament. Profilele metabolice ale compușilor pot furniza informație importantă la un nivel preselectiv, pot economisi timp și pot reduce semnificativ costurile dezvoltării unui compus nou. Proprietățile ADME a medicamentelor și a posibilelor medicamente pot fi modificate prin transformări chimice care presupun introducerea de noi fragmente chimice în compușii biologic activi (în cazul proiectării de promedicamente) sau introducerea unor legături chimice labile în compușii biologic activi. Ținta acestor modificări chimice este de modificare a solubilității apoase, permeabilității și a capacității de metabolizare a compușilor biologic activi. În urma acestor schimbări se obține o entitate chimică nouă cu proprietăți ADME/Tox îmbunătățite.[66] Datorită diversități structurale mari ale flavonoidelor, studiul metabolismului și a biodisponibilității acestor compuși este extrem de important în definirea profilului lor metabolic și toxicologic.

În acest context, profilul ADME și toxicologic ale flavonoidelor studiate au fost aproximate utilizând modulul QikProp ale pachetului Schrodinger. QikProp aproximează o gamă largă de proprietăți farmaceutice precum masa moleculară (MW); coeficientul de partiție octanol/apă, logP, (QPlogPo/w); solubilitatea în apă, logS, (QPlogS); valoarea IC50 pentru blocarea canalelor HERG K+ (QPlogHERG); permeabilitatea aparentă a celulei Caco-2 (QPPCaco); coeficientul de partiție creier/sânge (QPlogBB); permeabilitatea celulară (QPMDCK); procentul absorției pe cale orală în organismal uman (%HOA); aria suprafeței polare (PSA). [67] În plus, a fost aplicată Regula celor cinci a lui Lipinski (Lipinski’s rule of five; LRo5) care presupune că un compus este mai probabil să fie permeabil prin membrană și ușor absorbit de către corp dacă indeplinește următoarele criterii: masa moleculară <500, lipofilicitate (logP) <5, legături de hidrogen donoare (HBD) <5 și acceptoare (HBA) <10. Suprafață polară topologică (TPSA<130Å2) este un alt indicator de biodisponibilitate a medicamentului. Moleculele care încalcă mai mult de un criteriu pot prezenta probleme de biodisponibilitate. [68-71]

Profilul de risc a toxicității. Recent au fost dezvoltate mai multe abordări pentru a evalua posibilele proprietăți medicamentoase ale compușilor bioactivi. Acestea se bazează pe descriptori topologici, amprente ale structurii moleculare și alte proprietăți precum masa moleculară, solubiliatea în apă și cLogP (coeficient de partiție). [72]

În acest scop, programul OSIRIS Property Explorer [72] disponibil fără licență academică, a fost folosit pentru a estima riscurile efectelor secundare, dar și a proprietăților de tip medicament ale flavonoidelor studiate. Programul Osiris utilizează o bază de date a medicamentelor comercializate și a compușilor comerciali (Fluka) pentru a analiza frecvența aparițiilor fiecărui fragment în structura individuală a compusului. Programul estimeză riscurile unor efecte secundare, precum risc mutagen, tumoral, irritant sau reproducător, dar și prezența unor caracteristici relevante din punct de vedere medical și anume: cLogP, LogS (solubilitate), MW și asemănarea cu alte medicamente. Mai mult, un scor final al capacității compusului de a funcționa ca medicament s-a estimat combinând rezultatele parametrilor cLogP, LogS, MW, riscurile de toxicitate și asemănărea cu alte medicamente. Scorul de medicament este o măsură a potențialului unui compus de a îndeplini criteriile necesare a unui candidat pentru funcția de medicament. [73]

10. Căutarea unor similarități bazate pe formă în baza de date chimice SPECS

Metodele bazate pe structură (necesită cunoașterea structurii 3D a țintei) și cele bazate pe ligand (necesită cunoașterea liganzilor activi) au fost aplicate cu success în bazele de date publice mari care descriu compuși chimici precum SPECS [74], PubChem [75], DrugBank [76] etc. pentru identificarea unor inhibitori specifici, noi cu profile farmacologice îmbunătățite. Aceste baze de date conțin o variatate mare de molecule pentru dezvoltarea de librării noi și ușor de optimizat pentru a selecta compuși noi, promițători. Relațiile cantitative structură-activitate (QSAR), modelare farmacoforă, căutările de similaritate sau substructuri și potrivire a formei tridimensionale sunt doar unele dintre stategiile care au fost utilizate la obținerea unor schelete moleculare noi și promițătoare. [77]

Procedeul ROCS, al pachetului OpenEye (Rapid Overlay of Chemical Structure = Suprapunere rapidă a structurii chimice) [78] a fost suprapus peste datele a 400 de compuși naturali selectați din biblioteca SPECS (cu un conținut de aproximativ 200000 de compuși) pentru a identifica flavonoide noi cu profil îmbunătățit. Baza de date SPECS a fost pregătită în prealabil pentru acest proces folosind modulul LigPrep [79] al pachetului Schrödinger care generează stările de ionizare și tautomerii la pH=7.2±0.2 și modulul OMEGA [80],[81],[82] al pachetului OpenEye pentru a genera conformațiile 3D. ROCS este o unealtă de screening foarte eficace care poate identifica rapid schelete moleculare noi și interesante, utilizând compararea bazată pe formă. Aplicația ROCS se bazează pe ideea că moleculele au formă similară dacă volumele lor se suprapun bine, și orice nepotrivire de volum este o posibilă nesimilaritate. Aceasta permite înțelegerea diversității scheletelor și detecția elementelor comune de legare. [83,84,85,86] Compușii din baza de date SPECS au fost clasificați în funcție de asemănarea lor ca formă cu compusul de referință, care poartă denumirea de query. Similaritatea a fost evaluată în funcție de indexul de similaritate ShapeTanimoto (ST) a cărui valoare limită impusă a fost ST>0.8.

Rezultate și discuții

11.Schema generală de lucru

Succesiunea etapelor (Figura 10) utilizate în acest proiect include:

Selectarea setului de date a flavonoizilor naturali pe baza criteriilor stabilite

Optimizarea structurilor geometrice utilizând metodele semiempirice (MM+ și AM1) și cuantice DFT

Calcularea parametriilor electronici

Predicția profilului ADME

Predicția profilului de risc al toxicității

Căutarea unor similariăți 3D posibile în baza de date SPECS cu scopul identificării unor schelete flavonoidice noi cu profiluri îmbunătățite

Figura 10. Schema generală a etapelor de lucru

12. Structurile chimice ale setului de derivați flavonoidici

Structurile 3D a 17 compuși flavonoidici naturali descărcate din baza de date PubChem [75] (Figura 11) au fost selectate luând în considerare două criterii:

diversitatea structurii chimice

influența probabilă a unor substituienți asupra activității biologice

Cei 17 derivați flavonoidici fac parte din următoarele subgrupe:

flavone – 6 ( luteolina, apigenina, flavona, 7,8-dihidroxiflavona, vitexina, nobiletina)

flavonoli – 8 (quercetina, kaempferolul, miricetina, fisetina, galangina, morina, laricitrina, robinetina)

flavanone – 2 (hesperetina, naringenina)

isoflavonoizi – 1 (genisteina)

Reprezentarea grafică a celor 17 structuri chimice a fost realizată cu versiunea demo online a MarvinJS de la ChemAxon (https://marvinjs-demo.chemaxon.com/latest/demo.html).

Quercitină, 1 Kaempferol, 2

Miricetină, 3

Apigenină, 4 Luteolină, 5

Naringenină, 6 Genisteină, 7

Morină, 8 Laricitrină, 9

Robinetină, 10

Fisetină, 11 Flavonă, 12

Hesperitină, 13 Galangină, 14

Vitexină, 15 7,8-Dihidroxiflavonă, 16

Nobiletină, 17

Figura 11. Scheletul de bază flavonoidic și structurile celor 17 derivați naturali flavonoidici

13. Analiza și interpretarea rezultatelor

Diferențele principale dintre caracteristicile structurale și electronice a flavonoidelor au fost studiate pentru a putea înțelege comportamenul lor chimic și pentru a obține o perspectivă nouă din punct de vedere molecular care poate duce la descoperirea unor agenți terapeutici noi cu profile biologice și farmacologice îmbunătățite. Prin urmare caracteristicile electronice ale celor 17 compuși obținute prin metodele semiempirice AM1 și DFT au fost comparate între ele și analizate în conjuncție cu profilele ADME și de risc al toxicității prezise. Studiile precedente [87] au semnalat niște caracteristici structurale importante pentru structura de bază a unei flavonoide antioxidante, de aceea un număr mai mare de flavone și flavonoli au fost incluși în acest studiu alături de alte grupuri de flavonoide.

13.1 Analiza paremetrilor electronici și structurali

Influența căldurii de formare. Flavona (12) este singurul compus din serie cu o valoarea pozitivă a caldurii de formare, cea ce sugerează o stabilitate redusă a compusului care ar putea reacționa rapid sau s-ar putea descompune spontan. În acest caz, instabilitatea compusului poate fi asociată cu o reactivitate mărită, după cum rezultă din energia LUMO. Potrivit calculelor AM1, se estimează că vitexina (15) și flavona (12) sunt cel mai stabil (ΔHf⁰= -366.743kcal/mol), respectiv cel mai instabil (ΔHf⁰= 6.405kcal/mol) dintre compuși din punctul de vedere al căldurii de formare. Instabilitatea relativă a flavonei poate fi asociată cu absența grupărilor -OH. Prezența unui număr mare de grupări -OH într-o moleculă este corelată direct cu stabilitatea moleculei (Tabelul 1 și 2). Spre exemplu, această teorie este confirmată de cel mai stabil dintre compuși, vitexina (15) care conține 7 grupări hidroxil. Pe baza observațiilor de mai sus stabilitatea compușilor scade după cum urmează : 15>3>9>1>8>10>17>13>5>2>11>6>4>14>7>16>12.

Influența LUMO. Potrivit teoriei lui Koopman [65], valoarea energiei LUMO este asociată cu afinitatea electronică și prin urmare este o măsură a electrofilicității unei molecule. Moleculele cu energii LUMO joase acceptă mult mai ușor electroni decât molecule cu energii LUMO mai înalte. Prin urmare compusul 12 prezintă cea mai joasă valoare a energiei LUMO, cea ce îl face cel mai electrophilic din setul de compuși studiați și prin urmare cel mai susceptibil unor atacuri nucleofile. Capacitate redusă a flavonei (12) de a dona electroni este ilustrată și de valorile cele mai scăzute ale energiei HOMO. Reactivitatea mărită este susținută și de electronegativitate și valorile potențialelor chimice care descriu tendința de a atrage electroni, respectiv tendința electronilor de a evada. Valorle crescute ale electronegativități (χ) și scăzute ale potentialului chimic (µ) indică flavona (12) ca cel mai reactiv compus din această serie. Mai mult, comportamenul puternic electrofil este de asemenea susținut de cea mai mare valoare de electrofilicitate (ω) (Tabelul 1). Alte flavonoide cu comportament asemănător sunt flavonolul 14 și flavonele 4, 5 și 15.

Influența HOMO. Structura moleculară a flavonoidelor selectate a fost de asemenea studiată din prisma energiei orbitalului de frontieră HOMO. O valoare mare a energiei HOMO corespunde unei molecule cu comportament puternic nucleofil, în timp ce o valoare scăzută a energiei HOMO arată o capacite redusă a moleculei de a dona electroni și prin urmare molecula este ușor susceptibilă unui atac electrofil. Flavona 17, nobiletina, are cea mai mare valoare a energiei HOMO (-5.888eV), cea ce sugerează o puternică abilitate de a dona electroni și prin urmare molecula are o disponibilitate crecută de a reacționa cu o moleculă electrofilă. Pentru compusul 17, orbitalul HOMO este localizat în jurul inelelor A și C, cu atomii C3, C5 și C8 ca cele mai nucleofilice situsuri după cum rezultă din graficele indicilor Fukui și ESP (Figura 12 și 13). Flavona 16, care este următoarea cea mai nucleofilă moleculă din setul ales, are de asemenea o distribuție a orbitalilor HOMO în jurul inelelor A și C, dar situsurile ei cu caracter puternic nucleofil sunt reprezentate de atomii C5, C7 și C8, datorită influenței substituenților. Compusul 13 o altă moleculă puternic nucleofilă, nu conține o legătură dublă între C2 și C3, prin urmare întreaga delocalizarea a electronilor este întreruptă.

În general, HOMO este localizat în jurul legăturii duble dintre C2 și C3, cea ce îi dă o acestei legături o importanță deosebită în compușii din categoria flavonoidelor. Analizând Figura 12, se poate concluziona că orbitalii de frontieră HOMO la 10 din 17 cazuri sunt distribuiți în principal pe inelele A și C, în timp de orbitalii de frontieră LUMO sunt poziționați pentru toți compușii peste gruparea de tip cetonă din poziția 4 a inelului C și peste inelul B. Toate aceste observații sunt susținute de graficele care descriu orbitalii HOMO și LUMO, ESP și indicii Fukui pentru toți cei 17 compuși. (Figura 12 și 13)

Tabel 1. Caracteristicile electronice calculate pentru cei 17 derivați flavonoidici

Figura 12. Orbitalii tridimensionali HOMO și LUMO (A), profilurile potențialului electrostatic (B) și distribuția de sarcină (C) a celor 17 structuri optimizate geometric

Intervalul de energie. Un alt parametru important în activitatea flavonoidică este intervalul de energie (ΔE). O valoare mai mică a ΔE corespunde unei capacități antioxidante mari și unui sistem foarte reactiv. Valorile acestui parametru pentru quercitină și cei 16 analogi ai ei sunt cuprinse între 3.951eV și 4.942eV. Analiza valoriilor lui ΔE (Tabel 1) indică că, kaempferolul (2), miricetina (3), laricitrina (9) și galangina (14) au cele mai scăzute valori ceea ce corespunde unor sisteme puternic reactive și cu o capacitate antioxidantă mare. De asemenea aceste valori joase sugerează că în orice proces de excitare aceste patru flavonoide au nevoie de energie mai puțină decât celelalte 13.

Potențialul electrostatic. Toate cele 17 grafice ale potențialului electrostatic (Figura 12) arată o regiune de potențial electrostatic (nuanța roșie) lângă atomii de oxigen ai inelelor A, B și C cu o regiune electronegativă suplimentară alocată grupării carbonil din poziția -4- de substituție a inelului C, însemnând că aceste regiuni sunt susceptibile unui atac electrofilic. De asemenea este sugerat că gruparea polară hidroxil, și în special carbonilul de pe inelul C, joacă un rol important în activitatea flavonoidică.

Indicii Fukui. Graficele indicilor Fukui (Figura 13) caracterizează reactivitatea locală, evidențiind situsurile atomice disponibile unui atac electrofilic și/sau nucleofilic. Doar valorile semnificative ale indicilor Fukui care corespund celor mai înalte picuri au fost analizate și reprezentate grafic (Figura 13). Situsurile atomice cele mai susceptibile unui atac nucleofil sunt C2, C3, O4, O2 (3 cazuri), O3 (3 cazuri), O6 (1 caz) și C4’ după cum rezultă din valorie LUMO Fukui (Figura 13) care corespund legăturilor C=O, C-OH (poziția -3- de subtituție), C-OH (poziția -5- de susbstituție), legătura C=C din inelul C și pozițiilor meta sau para din inelul B. Prezența unor susbstituenti pe inelele A și C influențează întreaga delocalizarea electronică, dar cele mai electrofilice situsuri rămân aceleași. Când inelul B este susbstituit în poziția para de o grupare OH cel mai electrofilic situs al inelului B este C2 (poziția orto). În legătură cu valorile HOMO Fukui, situsurile atomice cele mai susceptibile unui atac electrofil sunt C2, C3, C5, C7, C8, O2 and C4', O4’ care corespund fie legăturilor C=O and C=C din inelul C, fie atomilor de carbon din poziții de substituție importante precum 5,7 și 8 de pe inelul A și poziția para a inelului B. În anumite cazuri aceeași atomi au valorii mari și pentru ambii indici Fukui LUMO și HOMO, cea ce sugerează că acești atomi au situsuri atomice echivalente și pentru atacuri nucleofilice și pentru atacuri electrofilice.

În concluzie, aceste proprietăți electronice subliniază că distribuția și numărul grupărilor hidroxil, precum și legătura dublă dintre atomii C2 și C3 și gruparea carbonil de pe scheletul flavonoidic sunt caracteristici importante pentru activitatea biologică a flavonoizilor.

Figura 13. Graficele Fukui pentru toți cei 17 flavonoizi naturali care sublinează atomii semnificativi din moleculă (fiecărui atom de pe axa X îi coresponde o valoare de pe axa Y; atomii cu valori semnificative (HOMO și LUMO) corespund celor mai înalte vârfuri (pick))

13.2 Caracterizarea farmacologică

Cu excepția unui singur compus, toți compușii selectați se supun regulii de cinci a lui Lipinsky (Tabelul 2) care evaluează asemănarea cu un medicament a unui compus care prezintă o anumită activtate biologică și farmacologică. Ca o extensie a acestei reguli, valoarea ariei suprafeței polare totale (TPSA) mai mare de 130Å2 a permis separarea compușilor care sunt activi oral de cei care nu sunt. Mai mult, TPSA, masa moleculară, și implicit absorbabilitatea scăzută (se absorb greu în organism), crește odată cu creșterea numărului atomilor de azot, oxigen și a grupărilor hidroxil. Compușii care se supun acestei reguli sau care nu încalcă mai mult de o excepție de la regula menționată mai sus sunt cel mai probabil medicamente posibile cu administrare orală. Compusul 15, vitexina, face excepție de la două caracteristici Lipinsky, excepții susținute de conținutul a mai mult de 5 donori de legături de hidrogen și mai mult de 10 acceptori de legături de hidrogen. De asemenea, numărul mare de grupări hidroxil (7) și de atomi de oxigen (10), îl fac un compus greu absorbabil. Mai mult valorile calculate pentru absorția distribuția, metabolismul și excreția compusului în organimul uman au arătat că, compusul 15 are permeabilitate celulară și membranară scăzută (valorile pentru QPPCaco, QPPMDCK, și QPlogBB sub 25) și o absorție orală scăzută (valoare %HOA mică și o valoare TPSA mare) (Tabel 3). Excepțiile de la regula de cinci și profilul farmacologic slab par a fi rezultatul prezenței fracțiunii de glucozidă din moleculă.

Tabel 2. Regula de 5 a lui Lipinsky (LRo5)*

*MW<500: masa moleculară; HBD<5: numărul donorilor de legături de hidrogen; HBA<10: numărul acceptorilor de

legături de hidrogen; logP<5: coeficientul de partiție octanol-apă; LV: încălcări ale reguli de 5 a lui Lipinsky;

TPSA>130Å2: aria suprafeței polare totale;

*culoarea roze și cifrele îngroșate indică compușii cu profil farmacologic precar

Aceeași permeabilitate celulară slabă a fost observată și pentru compușii 1, 3, 5, 8, 9, 10. Compusul 4, apigenina, care este identic cu compusul 15 fără inelul de glucozidă are toți parametrii calculați care descriu profilul său farmacologic între limitele tolerate. Celelalte flavone din setul selectat au un profil farmacologic bun (compușii 2, 5, 6) spre excelent (compușii 4, 7, 13, 14, și 16), în timp șapte din opt flavonoli prezintă o permeabilitate celulară slabă.

Rezultatele OSIRIS (Tabelul 4) indică că analogii 5, 6 și 13 nu prezintă potențial de risc mutagenic, tumorigenic, iritant sau reproducător efectiv. Aceeași compuși au cele mai mari valori ale asemănării cu un medicament (drug-likeness) și ale scorului de medicament (drug score). Potrivit observațiilor lui Rietjens et al. [88], 14 din cei 17 compuși flavonoidici naturali conțin caracteristici structurale esențiale în dezvoltarea unui efect mutagenic nedorit.

Aceste caracteristici sunt:

o structură de tip inel flavonoidic cu o grupare hidroxil liberă în poziția 3

o legătură dublă între pozițiile 2 și 3

o grupare cetonică în poziția 4 care îi permite protonului grupării din poziția 3 să tautomerizeze la o fracțiune 3-ceto

Din aceste 14 flavonoide, doi compuși, quercetina (1) și nobiletina (17) prezintă și un risc crescut tumorigenic. Genisteina (7) este singura care prezintă trei din cele patru efecte secundare nedorite precum mutagenicitatea, tumorigenicitatea și iritabilitatea. Conform analizei ADME și a rezultatelor riscului de toxicitate (determinate cu OSIRIS) compușii 5, 6 și 13 sunt considerați a fi cei mai buni din punct de vedere farmacologic.

Tabel 3. Parametrii ADME calculați

QPPCaco: permeabilitatea celulară Caco-2 aparentă preconizată în nm/sec (interval acceptat: <25 scăzută, >500 bună); QPlogBB: coeficientul de partiție creier/sânge preconizat (interval acceptat: -3.0 până la 1.2); QPMDCK: permeabilitatea celulară preconizată (interval acceptat: <25 scăzută, >500 bună); QPlogKp: permeabilitatea cutanată preconizată, log Kp, (interval acceptat -8.0 to -1.0); QPlogS: solubilitatea apoasă preconizată, logS; S în mol/dm-3 (interval acceptat -6.5 to 0.5), QPlogHERG: valoarea IC50 preconizată pentru blocarea canalelor HERG K+, (interval acceptat: sub -5); %HOA: absorția pe cale orală umană preconizată pe o scală de la 0 la 100%, (interval acceptat: <25% scăzută, >80% înaltă).

Tabel 4. Profilul de risc a toxicității și asemănarea cu un medicament a celor 17 flavonoide calculate cu OSIRIS Property Explorer*

*cercurile de culoare roșie indică prezența unor proprietăți cu riscuri mari de apariție a unor efecte secundare nedorite precum mutagenicitatea, tumorigenicitatea, etc. în timp ce cercurile de culoare verde indică un comportament asemănător unui medicament

13.3 Căutarea de similarități 3D

Analiza proprietăților electronice în conjuncție cu profilul ADME și profilul riscului de toxicitate indică hesperetina (13) ca fiind cel mai bun din punct de vedere a proprietăților fizicochimice și farmacologice. Prin urmare, hesperitina (13) a fost folosită în continuare ca și șablon de căutare (query) pentru studiile de similaritate bazate pe formă în baza de date de compuși naturali SPECS pentru a identifica flavonoide noi cu profil farmacologic îmbunătățit. Din cei 400 de compuși ai bazei SPECS, ROCS a selectat doar 16 compuși unici care satisfac valoarea limită impusă a pragului ShapeTanimoto (ST>0.8). Codurile SPECS a compușilor selectați și structurile lor chimice sunt prezentate în Figura 14.

Figura 14. Strucutrile chimice și codurile compușilor selectați din baza SPECS

Concluzii

Aspectele structurale și profilurile farmaceutice a unui set de 17 flavonoizi au fost studiate prin calcule semi-empirice și cuantice la un nivel de teorie DFT pentru a putea înțelege cele mai importante caracteristici care influențează activitatea flavonoidică. Influența susbstituenților pe inelele A, B și C a fost explicată prin proprietăți electronice și aspecte farmacocinetice. Flavonoidele care prezintă un comportament electrofil sunt cele mai susceptibile unui atac nucleofil la situsurile atomice C2, C4, O2 și C4' care corespund legăturilor C=O și C=C ale inelului C și pozițiilor para și orto din inelul B. Situsurile atomice susceptibile unui atac electrofilic sunt distribuite fie pe inelul A, fie pe inelul B, în funcție de delocalizarea electronică.

Analiza proprietăților electronice combinate cu profilul ADME și profilul de riscului de toxicitate indică compusul numit hesperitină (13) ca fiind cel mai bun din punct de vedere fizicochimic și farmacologic. Căutarile de similaritate 3D cu ROCS au dus la obținerea a 16 compuși similari ca formă cu hesperitina, folosită ca query, aceștia având un posibil profil îmbunătățit din punct de vedere farmacologic și fiziochimic. Compușii rezultați din studiul de similaritate 3D vor fi supuși, în studii viitoare, aceluiași protocol de evaluare aplicat celor 17 flavonoizi de start în vederea selectării celor mai buni compuși conform celor 3 aspecte: proprietăți electronice, profil ADME și profil de toxicitate.

Proprietățile electronice, profilul ADME și profilul de risc al toxicității calculate cu metodele teoretice pot să contribuie la o înțelegere cât mai bună a structurilor flavonoidice în vederea utilizării acestora la scară largă în domeniile chimiei, biologiei și industriei alimentare. Prin urmare sunt necesare studii viitoare pentru ca utilitatea flavonoizilor în dietă să poată fi îmbunătățită pentru a putea asigura oamenilor o sănătate mai bună.

Software-uri utilizate

ChemDraw Ultra 12.0 – https://chemdraw-pro.software.informer.com/12.0/

MarvinJS, ChemAxon – https://marvinjs-demo.chemaxon.com/latest/demo.html

HyperChem 7.0 – http://www.hyper.com/Products/tabid/354/Default.aspx

Maestro, Schrodinger – http://www.schrodinger.com

LigPrep v.3.1, Schrodinger – http://www.schrodinger.com

Jaguar v.10.5, Schrodinger – http://www.schrodinger.com

QikProp v.5.2, Schrodinger – http://www.schrodinger.com

OMEGA, OpenEye – www.eyesopen.com

Filter, OpenEye – www.eyesopen.com

ROCS v. 3.2.1.4, OpenEye – www.eyesopen.com

OSIRIS Property Explorer – http://www.organic-chemistry.org/prog/peo/

Baze de date

PubChem – https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/

SPECS, Natural Product Library – https://www.specs.net/

Sumarul lucrării

42 pagini

88 note bibliografice

14 figuri

4 tabele

11 programe utilizate

2 baze de date de compuși cu activitate biologică disponibile fără licență academică

Bibliografie

[1] Panche, A. N., A. D. Diwan, and S. R. Chandra. "Flavonoids: an overview." Journal of nutritional science 5 (2016).

[2] Griesbach, R. J. "Biochemistry and genetics of flower color." Plant Breed Rev 25 (2005): 89-114.

[3] Samanta, Amalesh, Gouranga Das, and Sanjoy Kumar Das. "Roles of flavonoids in plants." carbon 100.6 (2011).

[4] Kumar, Shashank, and Abhay K. Pandey. "Chemistry and biological activities of flavonoids: an overview." The Scientific World Journal 2013 (2013).

[5] Manach, Claudine, et al. "Polyphenols: food sources and bioavailability." The American journal of clinical nutrition 79.5 (2004): 727-747

[6] Iwashina, Tsukasa. "Flavonoid properties of five families newly incorporated into the order Caryophyllales." Bull Natl Mus Nat Sci 39 (2013): 25-51.

[7] Matthies, Anastasia, et al. "Conversion of daidzein and genistein by an anaerobic bacterium newly isolated from the mouse intestine." Appl. Environ. Microbiol. 74.15 (2008): 4847-4852.

[8] Aoki, Toshio, Tomoyoshi Akashi, and Shin-ichi Ayabe. "Flavonoids of leguminous plants: structure, biological activity, and biosynthesis." Journal of Plant Research 113.4 (2000): 475.

[9] Dixon, Richard A., and Daneel Ferreira. "Genistein." Phytochemistry 60.3 (2002): 205-211.

[10] Szkudelska, Katarzyna, and Leszek Nogowski. "Genistein—a dietary compound inducing hormonal and metabolic changes." The Journal of steroid biochemistry and molecular biology 105.1-5 (2007): 37-45.

[11] Ollis, W. D. "The neoflavanoids, a new class of natural products." Experientia 22.12 (1966): 777-783.

[12] Giusti, M. Monica, and Ronald E. Wrolstad. "Acylated anthocyanins from edible sources and their applications in food systems." Biochemical engineering journal 14.3 (2003): 217-225

[13] Cao, Guohua, Emin Sofic, and Ronald L. Prior. "Antioxidant and prooxidant behavior of flavonoids: structure-activity relationships." Free Radical Biology and Medicine 22.5 (1997): 749-760.

[14] BROWN, E. Jonathan, et al. "Structural dependence of flavonoid interactions with Cu2+ ions: implications for their antioxidant properties." Biochemical Journal 330.3 (1998): 1173-1178.

[15] Kumar, Shashank, Amita Mishra, and Abhay K. Pandey. "Antioxidant mediated protective effect of Parthenium hysterophorus against oxidative damage using in vitro models." BMC complementary and alternative medicine 13.1 (2013): 120.

[16] Kumar, S., and A. K. Pandey. "Antioxidant, lipo-protective and antibacterial activities of phytoconstituents present in Solanum xanthocarpum root." International Review of Biophysical Chemistry 3.3 (2012): 42-47.

[17] Mishra, Amita, et al. "Bauhinia variegata leaf extracts exhibit considerable antibacterial, antioxidant, and anticancer activities." BioMed Research International 2013 (2013).

[18] Rice-Evans, Catherine A., Nicholas J. Miller, and George Paganga. "Structure-antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids." Free radical biology and medicine 20.7 (1996): 933-956.

[19] Bors, Wolf, et al. "[36] Flavonoids as antioxidants: Determination of radical-scavenging efficiencies." Methods in enzymology. Vol. 186. Academic Press, 1990. 343-355.

[20] Tapas, Ahmad R., D. M. Sakarkar, and R. B. Kakde. "Flavonoids as nutraceuticals: a review." Tropical Journal of Pharmaceutical Research 7.3 (2008): 1089-1099.

[21] Zhu, Wei, et al. "The anthocyanin cyanidin-3-O-β-glucoside, a flavonoid, increases hepatic glutathione synthesis and protects hepatocytes against reactive oxygen species during hyperglycemia: Involvement of a cAMP–PKA-dependent signaling pathway." Free Radical Biology and Medicine 52.2 (2012): 314-327.

[22] Sonnenbichler, Johann and Isolde Zetl. “Biochemical effects of the flavonolignane silibinin on RNA, protein and DNA synthesis in rat livers.” Progress in clinical and biological research 213 (1986): 319-31 .

[23] He, Quanren, Jiyoung Kim, and Raghubir P. Sharma. "Silymarin protects against liver damage in BALB/c mice exposed to fumonisin B1 despite increasing accumulation of free sphingoid bases." Toxicological Sciences 80.2 (2004): 335-342.

[24] Saller, Reinhard, Remy Meier, and Reto Brignoli. "The use of silymarin in the treatment of liver diseases." Drugs 61.14 (2001): 2035-2063.

[25] Wu, Yihang, et al. "Hepatoprotective effect of total flavonoids from Laggera alata against carbon tetrachloride-induced injury in primary cultured neonatal rat hepatocytes and in rats with hepatic damage." Journal of Biomedical Science 13.4 (2006): 569-578.

[26] Spencer, Jeremy PE, David Vauzour, and Catarina Rendeiro. "Flavonoids and cognition: the molecular mechanisms underlying their behavioural effects." Archives of biochemistry and biophysics 492.1-2 (2009): 1-9.

[27] Kim, Sang Min, et al. "Hepatoprotective effect of flavonoid glycosides from Lespedeza cuneata against oxidative stress induced by tert‐butyl hyperoxide." Phytotherapy Research 25.7 (2011): 1011-1017.

[28] Borris, Robert P. "Natural products research: perspectives from a major pharmaceutical company." Journal of ethnopharmacology 51.1-3 (1996): 29-38.

[29] Nakahara, K. O. I. C. H. I., et al. "Inhibitory effect of oolong tea polyphenols on glycosyltransferases of mutans Streptococci." Appl. Environ. Microbiol. 59.4 (1993): 968-973.

[30] Mori, Akihisa, et al. "Antibacterial activity and mode of action of plant flavonoids against Proteus vulgaris and Staphylococcus aureus." Phytochemistry 26.8 (1987): 2231-2234.

[31] Tsuchiya, H., and M. Iinuma. "Reduction of membrane fluidity by antibacterial sophoraflavanone G isolated from Sophora exigua." Phytomedicine 7.2 (2000): 161-165.

[32] Haraguchi, Hiroyuki, et al. "Mode of antibacterial action of retrochalcones from Glycyrrhiza inflata." Phytochemistry 48.1 (1998): 125-129.

[33] Nishizuka, Yasutomi. "The molecular heterogeneity of protein kinase C and its implications for cellular regulation." Nature 334.6184 (1988): 661.

[34] Tunon, M. J., et al. "Potential of flavonoids as anti-inflammatory agents: modulation of pro-inflammatory gene expression and signal transduction pathways." Current drug metabolism 10.3 (2009): 256-271.

[35] Manthey, John A. "Biological properties of flavonoids pertaining to inflammation." Microcirculation 7.sup1 (2000): S29-S34.

[36] Beretz, Alain, and Jean-Pierre Cazenave. "The effect of flavonoids on blood-vessel wall interactions." Progress in clinical and biological research 280 (1988): 187-200.

[37] Duthie, Garry G., Susan J. Duthie, and Janet AM Kyle. "Plant polyphenols in cancer and heart disease: implications as nutritional antioxidants." Nutrition research reviews 13.1 (2000): 79-106.

[38] Davis, W., et al. "Antioxidants and cancer III: quercetin." Altern Med Rev 5.3 (2000): 196-208.

[39] Ferry, David R., et al. "Phase I clinical trial of the flavonoid quercetin: pharmacokinetics and evidence for in vivo tyrosine kinase inhibition." Clinical cancer research 2.4 (1996): 659-668.

[40] Barnes, Stephen. "Effect of genistein on in vitro and in vivo models of cancer." The Journal of nutrition 125.suppl_3 (1995): 777S-783S.

[41] Cushnie, TP Tim, and Andrew J. Lamb. "Antimicrobial activity of flavonoids." International journal of antimicrobial agents 26.5 (2005): 343-356.

[42] Agati, Giovanni, et al. "Flavonoids as antioxidants in plants: location and functional significance." Plant science 196 (2012): 67-76.

[43] Brodowska, Katarzyna Małgorzata. "Natural flavonoids: classification, potential role, and application of flavonoid analogues." European Journal of Biological Research 7.2 (2017): 108-123.

[44] Nijveldt, Robert J., et al. "Flavonoids: a review of probable mechanisms of action and potential applications." The American journal of clinical nutrition 74.4 (2001): 418-425.

[45] Bae, Eun-Ah, et al. "In vitro inhibitory effect of some flavonoids on rotavirus infectivity." Biological and Pharmaceutical Bulletin 23.9 (2000): 1122-1124.

[46] Bohm, Bruce A. Introduction to flavonoids. Harwood Academic Publishers, 1998.

[47] Pyrzynska, Krystyna, and Magdalena Biesaga. "Analysis of phenolic acids and flavonoids in honey." TrAC Trends in Analytical Chemistry 28.7 (2009): 893-902.

[48] Sequin-Frey, Margareta. "The chemistry of plant and animal dyes." Journal of chemical education 58.4 (1981): 301.

[49] Antonczak, Serge. "Electronic description of four flavonoids revisited by DFT method." Journal of Molecular Structure: THEOCHEM 856.1-3 (2008): 38-45.

[50] Lameira, J., et al. "A density functional study of flavonoid compounds with anti-HIV activity." European journal of medicinal chemistry 41.5 (2006): 616-623.

[51] Hyperchem, version 7.52, 2005, Hypercube, Inc., Gainesville, FL, USA.

[52] Jaguar, version 10.5, 2019, Schrödinger, LLC, New York

[53] Clare, Brian W. "Charge transfer complexes and frontier orbital energies in QSAR: a congeneric series of electron acceptors." Journal of Molecular Structure: Theochem 337.2 (1995): 139-150.

[54] I. Fleming, "Molecular Orbitals and Organic Chemical Reactions", 1st edition, I. Fleming (Ed.), John Wiley & Sons, New York, 2010, p.526

[55] Murray, J. S., F. Abu-Awwad, and P. Politzer. "Characterization of aromatic hydrocarbons by means of average local ionization energies on their molecular surfaces." Journal of Molecular Structure: THEOCHEM 501 (2000): 241-250

[56] Contreras, Renato R., et al. "A direct evaluation of regional Fukui functions in molecules." Chemical physics letters 304.5-6 (1999): 405-413.

[57] Spackman, Mark A., and Robert F. Stewart. "Ectrostatic Potentials in Crystals." Chemical Applications of Atomic and Molecular Electrostatic Potentials. Springer, Boston, MA, 1981. 407-426.

[58] Sjoberg, Per, et al. "Average local ionization energies on the molecular surfaces of aromatic systems as guides to chemical reactivity." Canadian Journal of Chemistry 68.8 (1990): 1440-1443.

[59] Zhou, Zhongxiang, and Robert G. Parr. "Activation hardness: new index for describing the orientation of electrophilic aromatic substitution." Journal of the American Chemical Society 112.15 (1990): 5720-5724.

[60] Ayers, Paul W., and Robert G. Parr. "Variational principles for describing chemical reactions: the Fukui function and chemical hardness revisited." Journal of the American Chemical Society 122.9 (2000): 2010-2018.

[61]. Pearson, Ralph G. "Recent advances in the concept of hard and soft acids and bases." Journal of Chemical Education 64.7 (1987): 561.

[62]. Pearson, Ralph G. "The electronic chemical potential and chemical hardness." Journal of Molecular Structure: THEOCHEM 255 (1992): 261-270.

[62] Chattaraj, Pratim Kumar, Buddhadev Maiti, and Utpal Sarkar. "Philicity: a unified treatment of chemical reactivity and selectivity." The Journal of Physical Chemistry A 107.25 (2003): 4973-4975.

[63] Pearson, Ralph G. "Chemical hardness and density functional theory." Journal of Chemical Sciences 117.5 (2005): 369-377.

[64] Parr, Robert G., et al. "Electronegativity: the density functional viewpoint." The Journal of Chemical Physics 68.8 (1978): 3801-3807.

[65] T. A Koopmans, Physica, 1933, 1, 104-113.

[66] Pajouhesh, Hassan, and George R. Lenz. "Medicinal chemical properties of successful central nervous system drugs." NeuroRx 2.4 (2005): 541-553.

[67] Schrödinger Release 2017-4: QikProp, version 5.2, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2017

[68]. Lipinski, Christopher A., et al. "Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings." Advanced drug delivery reviews 23.1-3 (1997): 3-25.

[69]. Lipinski, Christopher A. "Drug-like properties and the causes of poor solubility and poor permeability." Journal of pharmacological and toxicological methods 44.1 (2000): 235-249.

[70] Filter, 2016, OpenEye Scientific Software, Santa Fe, NM, USA.

[71]. Freitas, Matheus P. "MIA-QSAR modelling of anti-HIV-1 activities of some 2-amino-6-arylsulfonylbenzonitriles and their thio and sulfinyl congeners." Organic & biomolecular chemistry 4.6 (2006): 1154-1159.

[72] Tetko, Igor V. "Computing chemistry on the web." Drug discovery today 10.22 (2005): 1497-1499

[73] Organic Chemistry Portal.; 2002-2020. Available at http://www.organic-chemistry.org/prog/peo/. Accesat în Martie 2020.

[74] SPECS (Delft, The Netherlands), Natural Product Library, www.specs.net , accesat în Aprilie 2020

[75] Wang, Yanli, et al. "PubChem: a public information system for analyzing bioactivities of small molecules." Nucleic acids research 37.suppl_2 (2009): W623-W633.

[76] Wishart, David S., et al. "DrugBank: a knowledgebase for drugs, drug actions and drug targets." Nucleic acids research 36.suppl_1 (2008): D901-D906.

[77] Danishuddin, Mohd, and Asad U. Khan. "Virtual screening strategies: a state of art to combat with multiple drug resistance strains." MOJ Proteomics Bioinform 2.2 (2015): 00042.

[78] ROCS, v.3.2.1.4, OpenEye Scientific Software, 2013, Santa Fe NM, http://www.eyesopen.com

[79] Schrödinger Release 2016–1: LigPrep, v.3.1 (2016) Schrödinger, LLC, New York, NY

[80] OMEGA, v.2.5.1.4, OpenEye Scientific Software, Santa Fe, NM, http://www.eyesopen.com

[81] Hawkins, P.C.D., Skillman, A.G., Warren, G.L., Ellingson, B.A., Stahl, M. T. Conformer Generation with OMEGA: Algorithm and Validation Using High Quality Structures from the Protein Databank and Cambridge Structural Database. Journal of Chemical Information and Modeling, 50.4 (2010): 572–584.

[82] Hawkins, P.C.D., Nicholls, A. Conformer Generation with OMEGA: Learning from the Data Set and the Analysis of Failures. Journal of Chemical Information and Modeling, 52 (2012): 2919-2936.

[83] Hawkins, Paul CD, A. Geoffrey Skillman, and Anthony Nicholls. "Comparison of shape-matching and docking as virtual screening tools." Journal of medicinal chemistry 50.1 (2007): 74-82.

[84] Rush, Thomas S., et al. "A shape-based 3-D scaffold hopping method and its application to a bacterial protein− protein interaction." Journal of medicinal chemistry 48.5 (2005): 1489-1495.

[85] Tuccinardi, Tiziano, et al. "Multitemplate alignment method for the development of a reliable 3D-QSAR model for the analysis of MMP3 inhibitors." Journal of chemical information and modeling 49.7 (2009): 1715-1724.

[86] Sutherland, Jeffrey J., et al. "Lessons in molecular recognition. 2. Assessing and improving cross-docking accuracy." Journal of chemical information and modeling 47.6 (2007): 2293-2302.

[87] Mendes, Anna PS, et al. "The basic antioxidant structure for flavonoid derivatives." Journal of molecular modeling 18.9 (2012): 4073-4080.

[88] Rietjens, Ivonne MCM, et al. "Flavonoids and alkenylbenzenes: mechanisms of mutagenic action and carcinogenic risk." Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis 574.1-2 (2005): 124-138.