Studiul Bioinformatic Asupra Caveolinelor Umane

Agronomie

Studiul Bioinformatic Asupra Caveolinelor Umane

Byadmin ianuarie 1, 2024

Bibliografie

http://www.marcoregalia.com/STUFF/UDISTRITAL/Bioinformatica/Actividades/Libro%20Clases/Libro%20Bioinformatica.pdf

(Morange, Michel. A History of [NUME_REDACTAT] . Cambridge, MA: [NUME_REDACTAT] Press. 1998.)

Nenițescu C.D Tratat elementar de chimie organică vol II [NUME_REDACTAT] , București 195

A. Lehninger, Biochimie vol I-II, [NUME_REDACTAT], București 1987-1992

([NUME_REDACTAT] de [NUME_REDACTAT], A. Izvoran, Ed. Universtății de Vest, 2012)

http://www.medclub.org.md/load/biochimia/595-biochimia-structura-proteinelor-usmf

(http://www.bioquimicaqui11601.ucv.cl/unidades/proteinas/ptnas4fid.html)

http://www.medclub.org.md/load/biochimia/595-biochimia-structura-proteinelor-usmf

http://www.nlm.nih.gov/cgi/mesh/2011/MB_cgi?mode=&term=SIGNAL+TRANSDUCTION

http://www.nature.com/scitable/topicpage/how-viruses-hijack-endocytic-machinery-14364991

Anderson RG (1998). "The caveolae membrane system". Annu. Rev. Biochem. 67: 199–225. doi:10.1146/annurev.biochem.67.1.199. PMID 9759488.

http://www.nature.com/nrm/journal/v14/n2/box/nrm3512_BX1.html

Sáinz-Jaspeado M, Martin-Liberal J, Lagares-Tena L, Mateo-Lozano S, Garcia del Muro X, Tirado OM. Caveolin-1 in sarcomas: friend or foe? Oncotarget. 2011. 2(4):305-12.

Caveolina-1 en la progresión metastásica del Sarcoma de Ewing , Programa de Doctorado en Biomedicina, Doctorando: Laura María [NUME_REDACTAT], Universidad de [NUME_REDACTAT] biology of caveolae: lessons from caveolin knockout mice and implications for human disease. Hnasko R, Lisanti MP. [NUME_REDACTAT] 2003;3(8):445-64.

http://www.uniprot.org/

http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do

http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/

http://web.expasy.org/protparam/

http://web.expasy.org/protscale/

http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/

http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html

http://www.enzim.hu/hmmtop/

http://geno3d-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/geno3d_automat.pl?page=/GENO3D/geno3d_home.html

http://string-db.org/

Studiul bioinformatic asupra caveolinelor umane

Lucrare de [NUME_REDACTAT]

Ce este bioinformatica?

Bioinformatica este o știința în plină expansiune în zilele noastre având un succes global datorită tehnologiei, care s-a dezvoltat foarte mult și a permis uniunea informatici cu alte științe precum biologia și genetica.

Bioinformatica presupune folosirea tehnicilor computaționale, matematice si statistice pentru analiza, interpretarea și generarea de date cu caracter biologic

Sevențierea genomurilor necesită obținerea unor concluzii din lectura milioanelor de perechi de baze,de a ști ce codifica, cum se relaționează și regulează expresia diferiților produși genici, pe langă dezvăluirea funcțiilor unor proteine necunoscute și generarea modelelor care sa permită studiul mutațiilor punctuale. Rapiditatea si eficacitatea cu care s-a ajuns la aceste concluzii se datoreaza dezvoltării Bionformaticii.

Aproape toate realizările care se fac în ziua de azi in bioinformatică , se bazează mai mult sau mai puțin pe folosirea informațiilor magazinate în baze de date biologice sau bioinformatice.

O bază de date biologică este de fapt un depozit de informație derivată din datele obținute din experimentele biologice. O bază de date bioinformatică este un depozit de date cu informații biologice și cu programe bionformatice. [1]

1. Proteine- generalitați despre organizarea structurală

Noțiuni generale despre proteine și importanța lor în lumea vie

Proteinele sunt substanțe organice macromoleculare alcătuite din lanțuri simple sau complexe de aminoacizi. Proteinele determină forma și strucutura celulelor și dirijează aproape toate procesele vitale. Funcțiile proteinelor sunt specifice și permit menținerea integrității celulelor, apararea împotriva agenților externi, repararea leziunilor, dar si controlarea și regularea anumitor alte funcții.

Fiecare proteină prezintă o secvență unică de aminoacizi, succesiunea AA din lanțul polipeptidic determinându-se genetic.[1]

Dat fiind faptul că proteinele sunt macromoleculele biologice participante în toate procesele fiziologice din lumea vie, oameni de știință interesați de domeniul științelor vieții și ale pământului și-au îndreptat în permanentă atenția asupra studiului structurii, propietăților și funcțiilor acestora.[5]

1.1.1Etimologie și scurt istoric

Prima menționare a cuvântului proteină a fost făcută de către [NUME_REDACTAT], descoperitorul acestora, în scrisoarea să către [NUME_REDACTAT] Mulder din 10 iulie 1838, scrisoare în care menționează:

"The name protein that I propose for the organic oxide of fibrin and albumin, I wanted to derive from [the Greek word] πρωτειος, because it appears to be the primitive or principal substance of animal nutrition".[2]

(Numele de proteină pe care îl propun pentru denumirea compusului organic rezultat prin oxidarea fibrinei sau albuminei, l-am derivat din grecescul πρωτειος (proteios) deoarece pare a fi substanță primitivă sau principala din nutriția animalelor).

James B. Sumner, în anul 1926 afirmă că enzimele pot fi izolate și cristalizate acesta reprezentând un alt moment foarte important în dezvoltarea cunoștiințelor despre proteine.

Structura primară a unei proteine, insulina a fost determinata de către [NUME_REDACTAT] în anul 1955, iar în 1958 [NUME_REDACTAT] și respective [NUME_REDACTAT] Kendrew reușesc prin difracție de raze x , să determine primele structuri spațiale ale mioglobinei și hemoglobinei. Aceste două evenimente a fost cruciale în evoluția cunoașterii asupra proteinelor.

1.1.2 Tipuri de proteine

În funcție de compoziția lor chimică ele pot fi clasificate în:

Holoproteine cu următoarele clase de proteine :

-Proteine globulare sunt de regulă substanțe solubile în apă sau în soluții saline: protaminele, histonele, prolaminele, gluteinele, globulinele, albuminele.

-Proteinele fibrilare (scleroproteinele) caracteristice regnului animal, cu rol de susținere, protecție și rezistență mecanică: colagenul, cheratină și elastina.

Heteroproteinele sunt proteine complexe care sunt alcătuite din o parte proteică și o parte prostetica; în funcție de această grupare se pot clasifică în :[3] [4]

[NUME_REDACTAT]

[NUME_REDACTAT] mai pot fi clasificate și în funcție de localizarea în organismul viu, astfel avem :

proteinele interne, localizate în interiorul celulelor

proteinele externe, aflate în mediu extracelular

proteinele de membrane, fiind cele care se găsesc în interiorul dublului strat lipidic al membranelor celulare , la diferite adâncimi, respective cele care străbat în întregime membrană , numite proteine transmembranare

Toate rolurile necesare bunei funcționarii a organismelor vii, sunt îndeplinite de proteine:

• elemente structurale în compoziția celulelor și a țesuturilor

• sunt catalizatori ai reacțiilor chimice și biochimice din organism

• asigura transportul și depozitarea unor molecule

• participa la transmiterea semnalelor și la reglarea proceselor hormonale din organism.

• participa deasemenea în contracția musculară

• ajută în dezvoltarea celulelor și diferențierea lor

Studiile experimentale și computaționale asupra proteinelor au că obiect de studiu, în primul rând prezicerea structurii spațiale pornind de la secvență de aminoacizi, prelucrarea și extragerea informațiilor folositoare din aceste date structurale cu scopul de a înțelege relația structura/ funcție biologică, sinteză unor noi medicamente, caracterizarea interacțiunilor proteine-proteine și proteine-liganzi.[5]

Niveluri structurale ale proteinelor

Proteinele prezintă în mod usual trei tipuri de structuri spațiale,al 4- lea nivel structural fiind caracteristic doar unor proteine.Toate aceste patru nivele structurale alcătuiesc edificiul proteic. Lanțurile peptidice sunt formate de grupările carboxil și aminice a aminoacizilor; fiecare proteină prezintă două forme, numite forme de rezonanță:

• una dată de dublă legături ; această asigura rigiditatea și nu permite rotația în jurul axei sale;

• a 2- a formă de rezonanță este dată de unghiul diedru φ(planul atomilor C'-N-Cα-C'), ψ (planul atomilor N-Cα-C'-N), ω (planul atomilor Cα-C'-N-Cα), unghiurile φ și ψ pot avea diferite valori fiind responsabile de gradul de libertate a proteinelor, controlând structura tridimensională a lanțului proteic.

Structura substanțelor proteice, datorită dinamicitatii structurii sale, este încă insuficient cunoscută deoarece ele sunt supuse în continuu unor procese de sinteză și de degradare. [3] [4]

Structura primară

Structura primară este dată de aminoacizii care intră în lanțul proteic prin formarea legăturilor peptidice. Aminoacidul este unitatea structurală a proteinei și este format dintr-un atom de carbon central ( carbonul alfa ) de care se leagă gruparea amino (NH3+ ), gruparea carboxil ( -) și gruparea laterală.

Fig.1.1 Scheletul unui aminoacid.

(http://www.steroids.us/amino-acids.php)

În proteinele naturale legătura peptidică se stabilește între gruparea carboxilica de la C1 și gruparea aminică de la C2, astfel încăt lanțul peptidic va fi format dintr-o succesiune de unități CO-NH-CH.

Legătură peptidica -CO-NH- se găsește în același plan, iar carbonul -CH- se poate roti, astfel putănd să apară în planuri diferite. Depinzând de compoziția lanțului lateral, R, se pot diferenția 20 de aminoacizi, pe care îi vom prezența în următorul tabel, Tabel 1.1, împreună cu abrevierile lor în coduri de o litera, respectiv 3 litere și abundență acestora.

Tabel 1.1 Lista aminoacizilor naturali [3] [4]

Înlănțuirea aminoacizilor legați între ei prin legături peptidice( -CO-NH-) va da rezultat structurei primare a proteinelor. Gruparea amino se va localiza în așa numitul capăt N-terminal, iar gruparea carboxil în capătul C-terminal.

Fig. 1.2 Structura primară a unei proteine [5]

Fig.1.3 Reprezentare grafică a legăturii peptidice[6]

Structura secundară

In 1951 Pauling y Corey au propus existența unei structuri secundare diferite, cea a foi beta . La fel că și cea a elicei-alfa se formează datorită exitenței legăturilor numite punți de hidrogen ale scheletului peptidic. Este structura tridimensională a regiunilor locale ale unei proteine.

Există două varietăți:

1. Foi cu pliere antiparalelă, unde direcția lanțurilor polipeptidice este opusă.

2. Foi cu pliere paralelă, en care direcția lanțurilor polipeptidice este aceiași

Pentru a se putea formă legăturile prin punți de hidrogen, unghiurile de rotație variază puțin încomparație cu un lanț extins, asta dându-i aspectul de foie împăturită,ondulată b. [7]

De asemenea, proteinele mai prezintă și unele regiuni locale nestructurate (coil) dar foarte importante pentru stabilitatea proteinei și în interacțiunile pe care această le dezvoltă.[5]

Fig. 1.4. Elemente de structura a proteinelor: elice alfa si foi beta. [3] [4] [7]

Fig.1.5. Foi beta cu pliere paralelă si antiparalelă [3] [4] [7]

Stuctură terțiară

Structura terțiară este definită ca fiind forma structurală rezultată din superspiralizarea a două sau mai multe catene polipeptidice ce conțin fragmente α-helicoidale și β-pliate într-o arhitectură spațială complexă sub formă de ghem sau globulă. Menținerea și stabilizarea structurii terțiare se realizează prin forțele de atracție ce apar între radicalii aminoacizilor componenți care se pot orienta în așa fel încât să ajungă în poziții favorabile formării diferitelor tipuri de legături. Dintre acestea, cele mai importante sunt următoarele: interacțiuni electrostatice, punți de sulf, interacțiuni hridrofobe, interacțiuni de tipul forțelor Van der Waals.[5],[7]

Fig1.6. Structura terțiara a moleculei proteice[7]

Structura cuaternară

Această reprezintă nivelul de organizare cel mai înalt al proteinelor și este rezultatul interacțiunilor dintre catenele polipeptidice independente, fiecare cu structura să primară, secundară și terțiară caracteristică. Interacțiunile care mențin această structura sunt: legăturile de hidrogen, punți de sulf și interacțiunile electrostatice. Acest tip de structura nu se întâlnește la toate proteinele. El este caracteristic, în principal, proteinelor globulare a căror masă moleculară este mai mare de 50.000 Da și sunt proteine oligomere.[7]

Fig.1.7. Structura cuaternară a proteinelor [7]

Fig.1.8 Gradele de organizare ale moleculei proteice [8]

1.2 Introducere despre caveole și caveoline

1.2.1 [NUME_REDACTAT] celulară a caveolei este un domeniu de cercetare biomedicală de mare interes . Caveolele sunt cunoscute în primul rând pentru capacitatea lor de a transporta molecule prin celulele endoteliale, dar tehnicile celulare moderne au extins dramatic cunoștiințele anterioare despre caveole. Ele formează un compartiment unic endocitic si exocitic la suprafața aproximativ tuturor celulelor și sunt capabile de a importa molecule și de a le livra la locații specifice din interiorul celulei, de a exporta molecule in spațiu extracelular, și de compartimenta o varietate de activități de semnalizare. Semnalul de transductie este transferul intracelular de informații (activare / inhibare biologică), printr-o cale de semnal. În fiecare sistem de transducție a semnalului, o activare / inhibare a semnalului de la o moleculă activă biologic (hormon, neurotransmițător) este mediată prin cuplarea unui receptor / enzimă a unui al doilea sistem mesager sau la un canal de ioni. Transducția semnalului joacă un rol important în activarea funcțiilor celulare, diferențierea celulară și proliferarea celulară. [9] [10] [11]

Fig.1.2.1 Reprezentare schematică a caveolei [10]

Ele nu sunt pur și simplu un dispozitiv endocitic cu o formă membranară peculiară, mai mult de atât constituie un întreg sistem membranar cu multiple funcții esențiale pentru celulă.

Încercarea de a înțelege întreaga gamă de funcții de caveolei provoacă instinctele și cunoștințele de bază despre celula ale tuturor cercetătorilor.[ 11]

[NUME_REDACTAT] sunt proteine integrale din membrana plasmatică prezente în structurile celulare numite caveole. Aceste structuri sunt invaginații ale membranei plasmatice măsurând de la 50 la 100 nanometri în diametru,descrise pentru prima dată de către [NUME_REDACTAT]. Caveolinele se exprimă în majoritatea tipurilor celulare, dar mai ales în celulele endoteliale ( suprafață endoteliilor), în adipocite (celule grase) și miocite (celule musculare).

Caveolinele formează în membrană celulară grupuri sau oligomeri.Uniunea între o caveolina și altă se realizează prin domeniul oligomerizarii, uniunea cu membrană se face prin intermediul unui domeniu transmembrană și această uniune se reforțeaza cu conjugarea cu acidul palmitic legat la membrană.

Extremele amino și carboxil terminale se orientează spre citoplasmă celulară, după cum se poate observa în următoarea figură.

Fig1.2.2 Organizarea și uniunea caveolelor la membrana celulară [12]

Se deosebesc trei membrii:

• Caveolina-1: simbol CAV-1: prezenta în multe tipuri celulare,este necesară pentru formarea caveolelor, interacționează cu colesterolul membranelor celulare și a fost asociată cu mai multe funcții celulare, precum endocitoza, metabolismul colesterolului, suprimarea tumorilor, semnalizare celulară etc. Este membrul cel mai studiat din această familia.Posedă două izoforme.

• Caveolina-2: simbol CAV-2: deasemenea este prezenta în caveole, dar are nevoie de prezența caveolinei 1 pentru a se exprimă în membrană, altfel este reținută de aparatul Golgi și posterior degradată. Nu se cunosc funcțiile sale, dar poate fi importantă en dezvoltarea pulmonară. Posedă 3 izoforme.

• Caveolina-3: simbol CAV-3: se exprimă doar în țesutul muscular scheletic și cardiac, unde este este esențial pentru formarea caveolelor și în dispunera corectă a citoscheletului.

Genele CAV1 y CAV2 se localizează foarte aproape in regiunea cromozomică 7q31.1, în timp ce CAV3 se localizează in regiunea cromozomică 3p25 (Tabel 1.2.1) [Williams y Lisanti, 2004].

Tabel 1.2.1 Organizarea genomică a caveolinelor umane[Williams y Lisanti, 2004].

1.2.3 Caveolina 1

S-au identificat două izoforme: alfa, cea mai studiată și beta, care se produce prin traducerea unui codon de inițiere intern, fapt pentru care îi lipsesc primi 31 de aminoacizi. [Scherer y cols., 1995].

Proteina poseda un domeniu N- terminal citosolic( 101 aminoacizi), un domeniu transmembranar de 33 de aminoacizi și un domeniu C- terminal de 44 de aminoacizi, deasemenea citosolic.Monomerii caveolinei 1 formeaza complexe oligomerice de 14-16 molecule.În aceasta oligomerizare intervine un domeniu ce cuprinde aminoacizi de la 61 la 101 in extremul N- terminal. [Sargiacomo y cols., 1995].

Fig….Diverse localizări ale caveolinei 1 înăuntrul celulei [13]

Fig..Reprezentare schematică a organizării structurale ale caveolinei 1. Se arată modificările postranscripționale, domeniile N și C- terminal, domeniul transmembranar ( cu roșu), precum si CSD sau Caveolin- [NUME_REDACTAT]. [14]

CAV1 suferă diferite modificări postranscripționale, cum sunt palmitolizarea [Dietzen y cols., 1995] și fosforilarea. Prezintă două reziduri principale în urma forforilării, tirozina 14 (Tyr14), fundamentală în activitatea sa [Li y cols., 1996], și serina 80, implicată în oligomerizare și foarte importantă in asocierea sa cu membrana. [Schlegel y cols., 2001] (Fig de mai sus).

CAV1 este singurul membru al familiei care este imprescindibil in formarea caveolelor, fiindcă suprimirea expresiei sale duce la pierderea caveolelor in țesuturi. [Drab y cols., 2001, Razani y cols., 2001].

1.2.4 CAV1 și progresia tumorilor

Capacitatea caveolinei 1 de a regula diferite rute se semnalizare intracelulară are o importantă implicare în diversele procese celulare, atât fiziologice cât și patologice, inclusă fiind și geneza tumorilor. De-a lungul ultimelor decenii s-au realizat foarte multe studii despre rolul CAV1 ăn inițierea și progresia tumorală. De fapt , atît pierderea cât si expresia în exces a caveolinei 1 în celulele tumorale au fost relaționate cu dezvoltarea tumorală și cu progresia metastazică.

Pe baza expresiei reduse în diferite tipuri de tumori, cum ar fi ovarian, de colon, plămân și sân, CAV1 a fost propus ca un supresor tumoral [Quest și colab, 2008 20.; Sotgia colab., 2012].

În cancerul de sân a fost demonstrat efectul inhibitor asupra creșterii tumorii primare și asupra dezvoltării metastazelelor cerebrale și pulmonare [Chiu et al, 2011.; Williams și colab., 2004]

Contrariu, nivelele ridicate de CAV1 au fost asociate cu creșterea progresia tumorii și potențialul metastazic în cancerul de prostata, esofag și de vezică urinară [Burgermeister, 2008]. În cazul cancerului de prostată, expresia crescută a CAV1 în celulele umane,este asociată cu o mai mare agresivitate și potențial metastazic[1999 Thompson et al.] și cu proliferarea celulelor androgen-dependente [Bryant et al., 2011].

Mai mult decât atât, s-au realizat diferite studii pentru a evalua validitatea sa ca un biomarker, dacă ar putea fi detectat în serul sanguin în forma sa secretată [Corn și Thompson, 2010].

Expresia CAV1 a fost asociată cu prognosticul în diferite tipuri tumoare [Sotgia et al., 2012]. În celulele carcinomului renal, niveluri ridicate de expresie ale CAV1 sunt semnificativ asociate cu stadii avansate și metastaza nodulului limfatic [Horiguchi și colab, 2004.; Waalkes colab., 2011], precum și

cu o rata de supraviețuire scazută. [Phuoc et al., 2007].

Fig..Modelul structurii și al funcției caveolinei 1 in progresia tumorala.Depinzănd cu ce proteină interacționeaza prin intermediul CSD, va avea efecte pro-tumorale (roșu) sau anti-tumorale [14]

În oameni, mutațiile congenite ale genelor care codifică caveolinele sunt extrem de rare. Până în ziua de azi, s-a descris doar cazul unei femei din Brazilia căreia îi lipsea proteină caveolina-1, ce a produs lipodistrofia congenitală Berardinelli-Seip, un sindrom rar ce se caracterizeză prin lipsa țesutului adipos, rezistență la insulină, dislipidemie și hipertrofie musculară.[15 ]

Utilizarea metodelor boinformaticii structurale permite identificarea caracteristicilor structurale comune pentru toți membrii familiei caveolinelor și implicit prezicerea unor proprietăți și/sau funcții ale CAV-2 și CAV-3 prin transferarea informațiilor cunoscute și dovedite pentru CAV-1. Informațiile transferate trebuie verificate mai întâi experimental pentru a putea fi validate.

2. Instrumente bioinformatice utilizate în analiza structurală a proteinelor

2.1 Baze de date despre proteine

UniProtKB

UniProt (UniProtKB) este hub-ul central pentru colectarea de informații funcționale despre proteine, cu adnotări precise, coerente și bogate. Pe lângă captarea datelor de bază obligatorie pentru fiecare intrare UniProtKB (în principal, secvența de aminoacizi, proteine nume sau descriere, date și informații taxonomice citare), cât mai multe informații de adnotare posibile sunt adăugate. Aceasta include ontologii acceptate pe scarăbiologica largă, clasificări și referințe încrucișate, și indicii clare cu privire la calitatea de adnotare sub forma de dovezi de atribuire a datelor experimentale și de calcul.

Referință: UniProt Consortiul, Viitoare îmbunătațiri la the [NUME_REDACTAT] Resource, [NUME_REDACTAT] Research 39 (Database issue): D214–D219.

Fig.2.1 Pagina web de acces a bazei de date UniProt

PDB

[NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] (PPB) este depozitul unic la nivel mondial de informații cu privire la structurile 3D de molecule biologice mari, inclusiv proteine si acizi nucleici. Acestea sunt moleculele viații, care se găsesc în toate organismele, inclusiv bacterii, drojdie, plante, alte animale, și la om. Înțelegerea structurii unei molecule ajuta în înțelegerea funcțiilor.. Aceste cunoștințe pot fi folosite pentru a ajuta deduce rolul unei structuri în domeniul bolilor si sănătății umane, precum și în dezvoltarea medicamentelor. Structurile din arhiva cuprind de la proteine mici și bucăți de ADN-ului la complexe moleculare, cum ar fi ribozomul.

PPB a fost stabilit în 1971, la [NUME_REDACTAT] Laboratory, sub conducerea lui [NUME_REDACTAT] și conținea inițial 7 structuri., Personalul RCSB PDB sunt situate la Rutgers, Universitatea de Stat din [NUME_REDACTAT] si de la Universitatea din California, [NUME_REDACTAT].

Ca de marți 08 aprilie 2014 la 17 PDT există 99293 [NUME_REDACTAT]: [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] Helen M. BermanHYPERLINK "http://nar.oxfordjournals.org/content/28/1/235.abstract"1,2 ;John WestbrookHYPERLINK "http://nar.oxfordjournals.org/content/28/1/235.abstract"1,2, ; [NUME_REDACTAT]; [NUME_REDACTAT]; [NUME_REDACTAT] ResearchVolume 28 , Issue 1 Pp. 235-242.

Fig.2.2 Pagina web de acces a bazei de date PDB

2.2 Instrumente care permit analiza si compararea secventelor proteinelor

BLAST

[NUME_REDACTAT] Alignment (BLAST) găsește regiuni de similitudine la nivel local între secvențe. Programul compară nucleotide sau secvențe de proteine la bazele de date de secvență și calculează semnificația statistică a asemănărilor. BLAST poate fi utilizat pentru a deduce relații funcționale și evolutive între secvențele precum și pentru a ajuta la identificarea membrilor unei familii de gene.

Fig 2.3 Pagina web de acces al bazei de date BLAST

CLUSTALW 2

Clustalw2 este un program care are ca scop general alinierea secvențelor de proteine și de ADN. Se încearcă cea mai bună potrivire a liniilor, pentru a calcula secvențele selectate, astfel încât identitatea, asemănările și deosebirile pot fi ușor observate (Larkin M.A., și col. 2007). Alinierea poate fi redată alb-negru sau color, în funcție de opțiunea utilizatorului.

Fig. 2.4 Pagina web de acces a programului ClustalW2

2.3 Programe care permit prezicerea propietatilor fizico-chimice globale si distributia acestora

in lungul lantului proteic

PROTPARAM

ProtParam is a tool which allows the computation of various physical and chemical parameters for a given protein stored in Swiss-Prot or TrEMBL or for a user entered sequence.

The computed parameters include the molecular weight, theoretical pI, amino acid composition, atomic composition, extinction coefficient, estimated half-life, instability index, aliphatic index and grand average of hydropathicity (GRAVY).

Fig 2.4 Pagina web de acces ai bazei de date PROTPARAM

PROSCALE

ProtScale allows you to compute and represent the profile produced by any amino acid scale on a selected protein.

An amino acid scale is defined by a numerical value assigned to each type of amino acid. The most frequently used scales are the hydrophobicity or hydrophilicity scales and the secondary structure conformational parameters scales, but many other scales exist which are based on different chemical and physical properties of the amino acids.

This program provides 57 predefined scales entered from the literature.

Fig. 2.5 Pagina web de acces al bazei de date PROTSCALE

Programe care permit prezicerea elementelor de structura secundara ale proteinelor

JPRED

Jpred is a [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] server and has been in operation since approximately 1998. Jpred incorporates the Jnet algorithm in order to make more accurate predictions. In addition to protein secondary structure Jpred also makes predictions on [NUME_REDACTAT] and Coiled-coil regions (Lupas method).

Fig. 2.6 Pagina web de acces al bazei de date Jpred

PSIPRED

PSIPRED is a simple and accurate secondary structure prediction method, incorporating two feed-forward neural networks which perform an analysis on output obtained from PSI-BLAST ([NUME_REDACTAT] Iterated – BLAST). Using a very stringent cross validation method to evaluate the method's performance, PSIPRED 3.2 achieves an average Q3 score of 81.6. PSIPRED 2.0 achieved an average Q3 score of 80.6% across all 40 submitted target domains with no obvious sequence similarity to structures present in PDB, which ranked PSIPRED top out of 20 evaluated methods (an earlier version of PSIPRED was also ranked top in CASP3 held in 1998)

Fig. 2.7 Pagina web de acces al bazei de date PSIPRED

Prezicerea topologiei si modelului structural omolog pentru proteine

HMMTOP

HMMTOP is an automatic server for predicting transmembrane helices and topology of proteins, developed by G.E. Tusnády, at the Institute of Enzymology.
The method used by this prediction server is described in "G.E Tusnády and I. Simon (1998) [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] Composition of [NUME_REDACTAT] Proteins: Applications to [NUME_REDACTAT]." J. Mol. Biol. 283, 489-506 (JMB) (Medline) (PDF).
The new features of HMMTOP 2.0 version is described in "G.E Tusnády and I. Simon (2001) The HMMTOP transmembrane topology prediction server" Bioinformatics 17, 849-850 (Bioinformatics) (Medline)/

REFERENCES

G.E. Tusnady and I. Simon (1998); [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] Composition of [NUME_REDACTAT] Proteins: Applications to topology prediction J. Mol. Biol. 283, 489-506

http://www.enzim.hu/hmmtop/doc/program.html for more information

COPYRIGHT Gabor E. Tusnady, 2000

Fig. 2.8 Pagina de acces al banci de date HMMTOP

TMpred

Prediction of [NUME_REDACTAT] and [NUME_REDACTAT] TMpred program makes a prediction of membrane-spanning regions and their orientation.

The algorithm is based on the statistical analysis of TMbase, a database of naturally occurring transmembrane proteins. The prediction is made using a combination of several weight-matrices for scoring.

Fig. 2.9 Pagina web de acces a bazei de date TMpred

GENO3D

Geno3D (http://geno3d-pbil.ibcp.fr) is an automatic web server for protein molecular modelling. Starting with a query protein sequence, the server performs the homology modelling in six successive steps: (i) identify homologous proteins with known 3D structures by using PSI-BLAST; (ii) provide the user all potential templates through a very convenient user interface for target selection; (iii) perform the alignment of both query and subject sequences; (iv) extract geometrical restraints (dihedral angles and distances) for corresponding atoms between the query and the template; (v) perform the 3D construction of the protein by using a distance geometry approach and (vi) finally send the results by e-mail to the user.

Geno3d: [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] of Protein [URL]

C. Combet, M. Jambon, G. Deleage and C. Geourjon

(2002) Bioinformatics 18 : 213-214

Fig. 2.10 Pagina web de acces a bazei de date Geno3D

Prezicerea interactiunilor functionale ale caveolinelor

STRING

STRING is a database of known and predicted protein interactions.
The interactions include direct (physical) and indirect (functional) associations; they are derived from four sources:

STRING quantitatively integrates interaction data from these sources for a large number of organisms, and transfers information between these organisms where applicable. The database currently covers 5'214'234 proteins from 1133 organisms.

STRING references: Franceschini et al. 2013 / 2011 / 2009 / 2007 / 2005 / 2003 / Snel et al. 2000.

Fig. 2.11 Pagina web de acces al bazei de date STRING

3.Studiul bioinformatic asupra caveolinei umane

3.1 Analiza secventelor caveolinelor umane

Pentru caveolinele umane am identificat codurile de acces in banca de date UniProt astfel:

CAV 1 – Q03135

Cav 2 – P51636

CAV 3 – P56539

Pe baza acestor coduri am accesat informațiile despre proteine in banca de date UniProt și am extras secvențele acestora.

Secvențele în format FASTA pentru caveolinele umane sunt urmatoarele:

CAV 1 :

>sp|Q03135|CAV1_HUMAN Caveolin-1 OS=Homo sapiens GN=CAV1 PE=1 SV=4

MSGGKYVDSEGHLYTVPIREQGNIYKPNNKAMADELSEKQVYDAHTKEIDLVNRDPKHLN

DDVVKIDFEDVIAEPEGTHSFDGIWKASFTTFTVTKYWFYRLLSALFGIPMALIWGIYFA

ILSFLHIWAVVPCIKSFLIEIQCISRVYSIYVHTVCDPLFEAVGKIFSNVRINLQKEI

CAV 2 :

>sp|P51636|CAV2_HUMAN Caveolin-2 OS=Homo sapiens GN=CAV2 PE=1 SV=2

MGLETEKADVQLFMDDDSYSHHSGLEYADPEKFADSDQDRDPHRLNSHLKLGFEDVIAEP

VTTHSFDKVWICSHALFEISKYVMYKFLTVFLAIPLAFIAGILFATLSCLHIWILMPFVK

TCLMVLPSVQTIWKSVTDVIIAPLCTSVGRCFSSVSLQLSQD

CAV 3:

>sp|P56539|CAV3_HUMAN Caveolin-3 OS=Homo sapiens GN=CAV3 PE=1 SV=1

MMAEEHTDLEAQIVKDIHCKEIDLVNRDPKNINEDIVKVDFEDVIAEPVGTYSFDGVWKV

SYTTFTVSKYWCYRLLSTLLGVPLALLWGFLFACISFCHIWAVVPCIKSYLIEIQCISHI

YSLCIRTFCNPLFAALGQVCSSIKVVLRKEV

Analizăm ce alte secvențe sunt similare cu secvența caveolinei 1 utilizând programul BLAST.

Figura ne prezintă o parte a rezultatului obținut prin rularea programului BLAST.

[NUME_REDACTAT] rezultatului obținut prin rularea programului BLAST pentru caveolina 1

Acest rezultat ne arată ca există o similaritate secvențială înaltă pentru caveolinele 1 ale vertebratelor (până la 100%). Cea mai joasă similaritate secvențială este de 35% pentru caveolina umană1 comparat cu caveolina de la specia Danio rerio (peștele zebră).

Alinierea multiplă a secvențelor celor 3 caveoline umane a fost efectuată cu programul CLUSTALW și rezultatul obținut este prezentat în figura …. Respectiv in tabelul 3.1..

CLUSTAL 2.1 multiple sequence alignment

sp|Q03135|CAV1_HUMAN -MSGGKYVDSEGHLYTVPIREQGNIYKPNNKAMADELSEKQVYDAHTKEIDLVNRDPKHL 59

sp|P56539|CAV3_HUMAN -MMAEEHTD–––––––––LEAQIVKDIHCKEIDLVNRDPKNI 32

sp|P51636|CAV2_HUMAN MGLETEKADVQLFMD–––––DDSYSHHSGLEYADPEKFADSDQDRDPHRL 45

: .* . * . . :***:.:

sp|Q03135|CAV1_HUMAN NDDVVKIDFEDVIAEPEGTHSFDGIWKASFTTFTVTKYWFYRLLSALFGIPMALIWGIYF 119

sp|P56539|CAV3_HUMAN NEDIVKVDFEDVIAEPVGTYSFDGVWKVSYTTFTVSKYWCYRLLSTLLGVPLALLWGFLF 92

sp|P51636|CAV2_HUMAN NS-HLKLGFEDVIAEPVTTHSFDKVWICSHALFEISKYVMYKFLTVFLAIPLAFIAGILF 104

*. :*:.******** *:*** :* *.: * ::** *::*:.::.:*:*:: *: *

sp|Q03135|CAV1_HUMAN AILSFLHIWAVVPCIKSFLIEIQCISRVYSIYVHTVCDPLFEAVGKIFSNVRINLQKEI 178

sp|P56539|CAV3_HUMAN ACISFCHIWAVVPCIKSYLIEIQCISHIYSLCIRTFCNPLFAALGQVCSSIKVVLRKEV 151

sp|P51636|CAV2_HUMAN ATLSCLHIWILMPFVKTCLMVLPSVQTIWKSVTDVIIAPLCTSVGRCFSSVSLQLSQD- 162

* :* *** ::* :*: *: : .:. ::. .. ** ::*: *.: : * ::

Fig. 3 Alinierea multiplă a secvențelor caveolinelor umane:

* – arată aminoacizi 100% conservați pe aceiași poziție în toate secvențele.

: – arată aminoacizi diferiți pe aceiași poziție dar cu propietați fizico-chimice similare.

. – arată aminoacizi diferiți pe aceiași poziție cu propietați fizico-chimice asemănatoare.

Semnul – indică o deleție.

Tab. 3.1 Scorurile alinierii multiple a secvențelor caveolinelor umane

Se observă ca există o similaritate secvențială ușor peste medie între caveolina 1 și caveolina 3 (61,59) și o similaritate secvențială mica între caveolina1 și caveolina 2 (30,86) și respectiv între caveolina 2 și

caveolina 3 (33,77).

3.2 Prezicerea propietăților fizico-chimice ale caveolinei 1

Prezicerea propietăților fizico-chimice globale ale caveolinei 1 a fost facută cu ajutorul programului PROTPARAM, rezultatul obținut fiind prezentat în cele ce urmează.

Number of amino acids: 178

Molecular weight: 20471.6 [NUME_REDACTAT] pI: 5.64

Total number of negatively charged residues (Asp + Glu): 22

Total number of positively charged residues (Arg + Lys): 17

Instability index:

The instability index (II) is computed to be 31.54

This classifies the protein as stable.

Aliphatic index: 100.17

Grand average of hydropathicity (GRAVY): 0.064

Din aceste date se observă ca este vorba de o proteină de talie medie cu un caracter ușor hidrofob și stabila. Caracterul hidrofob prezis de programul PROTPARAM este în bună concordanță cu altele cunoscute despre caveolina 1 deoarece se știe ca o parte a ei intra în membrana celulară.

Distribuția propietăților fizico-chimice în lungul lanțului caveolinei1 a fost analizată cu programul PROTSCALE.

Acest program permite analizarea distribuției mai multor propietăți.Noi am analizat hidrofobicitatea,flexibilitatea medie și distribuția elementelor de structură secundară ( elice alfa si foi beta). Pentru hidrofobicitate programul PROTSCALE permite utilizare mai multor scale, noi am folosit scala KYTE & DOOLITTLE :

Using the scale Hphob. / Kyte HYPERLINK "http://web.expasy.org/protscale/pscale/Hphob.Doolittle.html"&HYPERLINK "http://web.expasy.org/protscale/pscale/Hphob.Doolittle.html" Doolittle, the individual values for the 20 amino acids are:

Ala: 1.800 Arg: -4.500 Asn: -3.500 Asp: -3.500 Cys: 2.500 Gln: -3.500

Glu: -3.500 Gly: -0.400 His: -3.200 Ile: 4.500 Leu: 3.800 Lys: -3.900

Met: 1.900 Phe: 2.800 Pro: -1.600 Ser: -0.800 Thr: -0.700 Trp: -0.900

Tyr: -1.300 Val: 4.200 : -3.500 : -3.500 : -0.490

Distibuția hidrofobicității după această scală este prezentată in fig ….

Fig. 3… Distribuția hidrofobicității în lungul lanțului caveolinei 1

Se observă că regiunea N-terminală a caveolinei 1 are un caracter puternic hidrofil iar regiunea C-terminală are un caracter puternic hidrofob.Cea mai hidrofobă regiune a caveolinei 1 este regiunea 100-140.

Pentru analiza distribuției flexibilității mediei în lungul lanțului caveolinei 1 am folosit scala AVERAGE FLEXIBILITY :

Using the scale Average flexibility, the individual values for the 20 amino acids are:

Ala: 0.360 Arg: 0.530 Asn: 0.460 Asp: 0.510 Cys: 0.350 Gln: 0.490

Glu: 0.500 Gly: 0.540 His: 0.320 Ile: 0.460 Leu: 0.370 Lys: 0.470

Met: 0.300 Phe: 0.310 Pro: 0.510 Ser: 0.510 Thr: 0.440 Trp: 0.310

Tyr: 0.420 Val: 0.390 : 0.485 : 0.495 : 0.428

Am obținut distribuția prezentată in Fig ….

Fig ….Distribuția flexibilității medie în lungul lanțului caveolinei 1

Se observă că regiunea N-terminală este flexibilă, regiunea de mijloc este rigidă, respectiv regiunea de capătă C-terminală are o flexibilitate medie. Această distribuție este în bună concordanță cu distribuția hidrofobicitatii și arată ac regiunea cu hidrofobicitatea cea mai mare (100-140) este și cea mai rigidă.

Prezicerea regiunilor secundare sub formă de elice a fost efectuată folosind scala Deleage & Roux:

Using the scale alpha-helix / Deleage HYPERLINK "http://web.expasy.org/protscale/pscale/alpha-helixRoux.html"&HYPERLINK "http://web.expasy.org/protscale/pscale/alpha-helixRoux.html" Roux, the individual values for the 20 amino acids are:

Ala: 1.489 Arg: 1.224 Asn: 0.772 Asp: 0.924 Cys: 0.966 Gln: 1.164

Glu: 1.504 Gly: 0.510 His: 1.003 Ile: 1.003 Leu: 1.236 Lys: 1.172

Met: 1.363 Phe: 1.195 Pro: 0.492 Ser: 0.739 Thr: 0.785 Trp: 1.090

Tyr: 0.787 Val: 0.990 : 0.848 : 1.334 : 1.020

Rezultatul obținut este prezentat in Fig……

Fig… Distribuția elementelor de structură secundară de tip elice în lungul lanțului caveolinei 1.

Se observă ca regiunile prezise ca adoptând structura de elice sunt: de la 25- 45 , 63-78, 98- 143 si 157-165.

Prezicerea regiunilor secundare sub forma de foi beta a fost efectuată folosind scala Deleage & Roux:

Using the scale beta-sheet / Deleage HYPERLINK "http://web.expasy.org/protscale/pscale/beta-sheetRoux.html"&HYPERLINK "http://web.expasy.org/protscale/pscale/beta-sheetRoux.html" Roux, the individual values for the 20 amino acids are:

Ala: 0.709 Arg: 0.920 Asn: 0.604 Asp: 0.541 Cys: 1.191 Gln: 0.840

Glu: 0.567 Gly: 0.657 His: 0.863 Ile: 1.799 Leu: 1.261 Lys: 0.721

Met: 1.210 Phe: 1.393 Pro: 0.354 Ser: 0.928 Thr: 1.221 Trp: 1.306

Tyr: 1.266 Val: 1.965 : 0.573 : 0.704 : 1.016

Rezultatul obținut este prezentat in Fig……

Fig…… Distribuția elementelor de structură secundară de tip foi beta în lungul lanțului caveolinei 1.

Se observă ca regiunile prezise ca adoptănd structură de foi beta sunt : de la 10-20, 60-70, 85-103 si 110-155.

Se observă că nu există o corelare între prezicerea regiunilor acre adopta structura în elice și cele în foi beta astfel ac sutn necesare și alte preziceri pentru a deduce care regiuni ce structura adopta.

3.3 Prezicerea regiunilor de structura secundară

Am efectuat prezicerea regiunilor de structura secundară cu ajutorul programelor JPRED și respectiv PSIPRED.

Rezultatul obținut cu ajutorul porgramului JPRED este prezentat în Fig…

MSGGKYVDSEGHLYTVPIREQGNIYKPNNKAMADELSEKQVYDAHTKEIDLVNRDPKHLNDDVVKIDFEDVIAEP

––––EEEEE––––––––––––––––EE-E–EEE–

EGTHSFDGIWKASFTTFTVTKYWFYRLLSALFGIPMALIWGIYFAILSFLHIWAVVPCIKSFLIEIQCISRVYSI

––-HEHHHHEEEEEEHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHEEEEE–HHHHHHHH

YVHTVCDPLFEAVGKIFSNVRINLQKEI

HHHHHHHHHHHHHHHHH–EEEEE–-

Fig ….. Prezicerea elementelor de structură secundară a caveolinei 1 cu programul JPRED.( E- foaie beta , H- elice alfa).

Programul JPRED prezice regiuni in foaie beta: de la 12-16, 68-71, 85-87, 89-95, 125-130 si 170-175, respectiv elice alfa: 104-118, 126-134, 153- 168.

Rezultatul obținut cu PSIPRED este prezentat in fig….

Programul PSIPRED prezice regiuni în foaie beta: 14- 15, 68-72, 85-86, 88-96, 125- 130, 170-175, respectiv regiuni alfa: 41-43 97-125, 132-155 158-168.

Ambele programe prezic că cea de-a doua jumătate a caveolinei 1 adoptă structuri în elice alfa de lungime apreciabilă.Acest rezultat este de asemenea în bunî concordanță cu hidrofobicitatea acestor regiuni și cu faptul ca ele pătrund în interiorul membranei, cunoscut fiind ca proteinele transmembranare adoptă structuri în elice alfa.

Prezicerea topologiei și modelului structural omolog pentru proteine

Serverul HMMTOP prezice existența a două regiuni transmembranare pentru caveolina 1 si anume regiunile: 139-158, 165-188 după cum este ilustrat in figura ….

seq SPQCAVHMAN CAVELINSHM SAPIENSGNC AVPESVMSGG KYVDSEGHLY 50

pred OOOOOOOOOO OOOOOOOOOO OOOOOOOOOO OOOOOOOOOO OOOOOOOOOO

seq TVPIREQGNI YKPNNKAMAD ELSEKQVYDA HTKEIDLVNR DPKHLNDDVV 100

pred OOOOOOOOOO OOOOOOOOOO OOOOOOOOOO OOOOOOOOOO OOOOOOOOOO

seq KIDFEDVIAE PEGTHSFDGI WKASFTTFTV TKYWFYRLLS ALFGIPMALI 150

pred OOOOOOOOOO OOOOOOOOOO OOOooooooo ooooooooHH HHHHHHHHHH

seq WGIYFAILSF LHIWAVVPCI KSFLIEIQCI SRVYSIYVHT VCDPLFEAVG 200

pred HHHHHHHHii iiiiHHHHHH HHHHHHHHHH HHHHHHHHoo oooooooooo

seq KIFSNVRINL QKEI 214

pred oooOOOOOOO OOOO

Procedând analog se obține pentru caveolina 2 că exista o singură regiune tranmembranară și anume regiunea 119-143 ,respectiv pentru caveolina-3 două regiuni transmembranare: 120-143 si 164-183 .

Serverul TMpred prezice pentru cele trei caveoline urmatoarele regiuni transmembranare:

Caveolina 1: 140- 160 , 152- 172

Caveolina 2: 130- 151, 155- 174, 173- 196

Caveolina 3: 124- 144, 162- 184

Se observa ca cele două servere prezic aproximativ aceleași regiuni transmemmbranare.

Utilizând serverul GENO3D căutăm să găsim un model structural omolog pentru cele 3 caveoline.

Pentru caveolina 1 și caveolina 2 programul GENO3D nu indică nici un model structural.Pentru caveolina 3 programul GENO3D indică 3 modele structurale( Tabelul …..), dar acestea sunt valabile doar pentru regiunea 1-64 a caveolinei-3, ceea ce este insuficient pentru caracterizarea globală a structurii proteinei.

Tabelul ….. Modele structurale prezise de catre programul GENO3D pentru caveolina-3

Prezicerea interacțiunilor funcționale ale caveolinelor

STRING

Programul STRING conduce la partenerii de interacțiune ai caveolinelor prezentați in figurile……..

Fig… Partenerii de interacțiune ai caveolinei 1

Fig… Partenerii de interacțiune ai caveolinei 2

Fig… Partenerii de interacțiune ai caveolinei 3

Se observa ca nu exista partenerii de interacțiune comuni pentru cele 3 caveoline umane.