STUDIUL ANTIBIOREZISTENȚEI LA TULPINILE DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA DE ORIGINE UMANĂ ȘI ANIMALĂ [301676]
STUDIUL ANTIBIOREZISTENȚEI LA TULPINILE DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA DE ORIGINE UMANĂ ȘI ANIMALĂ
STUDY ON ANTIBIOTIC RESISTANCE OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA STRAINS OF HUMAN AND ANIMAL ORIGIN
6.1.TESTAREA SENSIBILITĂȚII LA ANTIBIOTICE A [anonimizat], [anonimizat] “în vitro” prin testul nimit antibiogramă.
Pentru ca rezultatul antibiogramei să fie concludent se impune respectarea unor standarde internaționale. [anonimizat]: cel european EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing și cel american CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute).
Scopul esențial al antibiogramei este de a [anonimizat]: supravegherea epidemiologică a [anonimizat] a [anonimizat], prin punerea în evidență a rezistenței naturale.
6.1.1. Material si metodă
Au fost luate în studiu tulpini de Pseudomonas aeruginosa izolate în perioada 2013-2015. Au fost testate tulpinile cu semnificație clinică.
Tulpinile izolate au fost testate și confirmate conform protocolului de diagnostic bacteriologic.
Lotul de studiu a inclus 125 de tulpini Pseudomonas aeruginosa de origine umană și 57 [anonimizat]-duplicat.
Antibiograma se poate executa prin 2 categorii de tehnici: tehnici difuzimetrice și tehnici bazate pe diluții. [anonimizat] s-a realizat prin metoda difuzimetrică Interpretarea rezultatelor am efectuat-o pe baza normelor CLSI 2015 (Clinical Laboratory and Standard Institute).
[anonimizat]: [anonimizat]; [anonimizat]; creșterea bacteriană este inhibată în zona în care realizează concentrații mai mari decât CMI (Codiță, 2009a).
Materiale folosite:
tulpina de testat în cultură pură;
[anonimizat] (Oxoid, Marea Britanie);
discuri impregnate cu antibiotice (Oxoid, Marea Britanie);
ser fiziologic steril;
tampoane sterile;
densitometru .
Protocol de lucru:
s-a [anonimizat], conform indicațiilor producătorului și s-a turnat câte 25 ml în plăci Petri cu diametrul de 90 mm, astfel încât grosimea mediului să fie de 4 mm;
în 2 ml de ser fiziologic, s-a pregătit o suspensie bacteriană cu turbiditatea 0,5 McFarland din cultură de 24 h a [anonimizat] 1-2 x 108 CFU/ ml, [anonimizat]. 6.1 Pregătirea suspensiei bacteriene pentru testarea sensibilității la antibiotice
Fig. 6.1 [anonimizat] (uscate în prealabil la termostat 5-10 minute) [anonimizat], astfel încât să se disperseze pe întreaga suprafață pentru a obține o creștere confluentă;
microcomprimatele s-[anonimizat] Britanie (fig.6.2);
Fig. 6.2 Dispunerea microcomprimatelor pe mediu de cultură
Fig. 6.2. The layout of the microdisks on culture medium
incubarea plăcilor la 37℃,timp de 20-24h;
diametrele zonelor de inhibiție din jurul discurilor s-a măsurat în mm, apoi s-a interpretat categoria de sensibilitate (sensibil, rezistent, intermediar) conform standardelor CLSI, 2015, (fig.6.3)
Fig. 6.3 Interpretarea rezultatelor la 24 h de la incubare (original)
Fig. 6.3 Interpretation of the results after 24 hours of incubation (original)
Rezultate si discuții
Toate izolatele au fost împărțite în grupe de analiză pentru a se putea urmări unde este rezistența mai des întâlnită, astfel lotul de 125 probe de origine umană a fost împărțit în 7 grupe (H1-H7)și cele de origine animală în 4 (A1-A4) grupe.
Testările s-au realizat pe 13 antibiotice din grupa quinolonele: ciprofloxacin (5 µg) , grupa betalactamine: imipenem(10 µg), meropenem, (10µg), piperacilin + tazobactam (10 µg), ceftazidime (30 µg), cefepim (30 µg), aztreonam (30 µg), piperacilin (10 µg), tazobactam (10 µg), grupa aminoglicozide: amikacina (30 µg), gentamcina (10 µg), tobramicina (10µg) și polimxine: polimixina B( 10 µg).
S-au izolat 19 tulpini de Pseudomonas aeruginosa din aspirate bronșice de la pacienți umani, majoritatea cu patologie respiratorie (tabelul 6.1).
Prelevarea sputei se efectuează din expectorația de dimineață, cand pacientului i se face de obicei „toaleta bronhiilor. În prealabil bolnavul va efectua o gargară cu ser fiziologic steril. (Richard B.T., 2003)
Produsul a fost prelevat într-un recipient steril, cu gât larg, prevăzut cu capac. În infectiile acute este suficient să se recolteze un volum de 1-2 ml secretie purulentă. (Buiuc D., 1999)
Creșterea rezistenței la antibiotice la bacteriile non-fermentative este tot mai des raportată si sunt în pericol eficacitatea antibioticelor utilizate ca ultimă instanță in terapie.
La tulpinile de P. aeruginosa, achiziția de mecanisme de rezistență la aceste molecule de antibiotice devine tot mai frecventă, ce duce la formarea de tulpini MDR și PDR.
Ultimii ani au arătat că cea mai mare parte a mecanismelor de rezistență la antibioticele cu spectru larg la Enterobacteriacee pot fi identificate la ora actuală și la P. aeruginosa. Acumularea de mecanisme de rezistență independente (de exemplu, la β-lactame și aminoglicozide) se observă zilnic la nivel mondial; și deși unele bacterii sunt slab patogene comparativ cu P. aeruginosa, ele pot juca un rol important în răspândirea genelor de rezistență la antibioticele cu spectru larg, conditiile de călătorie și de transfer internațional dintre pacienții spitalizați îmbunătățește în continuare această răspândire.
Tabelul 6.1
H-1 Tulpini de P. aeruginosa de origine umană izolate din aspirate bronșice
Table 6.1
H-1 P. aeruginosa strains of human origin isolated from bronchial aspirates
Toate tulpinile au fost testate față de cele 13 antibiotice care sunt uzual recomandate în patologia infecțioasă produsă de Pseudomonas aeruginosa (tabelul 6.2.)
Din analiza de ansamblu a tabelului 6.2, reiese faptul că sensibilitatea tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa de origine umană din grupul H1, variază de la un izolat la altul.
Testările au evidențiat o rezistență relativ redusă (fig 6.4). Se observă faptul că,5,27% dintre tulpini sunt simultan rezistente la toate cele 13 tulpini testate, 5,27% tulpini sunt rezistente la 10 antibiotice, 15,78% sunt rezistente la 4 antibiotice, 10,52% tulpini sunt rezistente la 3 antibiotice, 26,31% dintre tulpini sunt rezistente la două antibiotice, 21,05% sunt rezistente la un singur antibiotic. Un aspect pozitiv este faptul că 15,768% din tulpinile testate nu manifestau rezistență față de antibioticele testate.
Tabelul 6.2
Rezultatele la antibiogramă pe tulpinile umane de P. aeruginosa obținute din aspirate bronșice (H-1)
Table 6.2
The results of the antibiotic on the human strains of P. aeruginosa obtained from bronchial aspirates (H-1)
Legendă:S – sensibil, R – rezistent, I – intermediar
Antibiotice testate: IPM – imipenem, MEM – meropenem, TZP – piperacilin + tazobactam, CAZ – , FEP – cefepim, CIP – ciprofloxacin, AK – amikacin, GN – gentamicin, TOB – tobramicin, ATM – aztreonam, PB – polimixin B, PIP – piperacilin TAZ – tazobactam
Fig. 6.4 Incidența rezistenței microbiene a tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa din H-1
Fig. 6.4 The incidence of microbial resistance of Pseudomonas aeruginosa strains of H-1
Aspiratele bronșice provin în mare parte din Bronhopneumonii și FC (Fibroză chistică) spre deosebire de pneumonie, bronhopneumonia necesita un tratament diferit, dar și atenție medicală diferită. Severitatea ambelor patologii de fond depinde de tipul de bacterie ce cauzează infecția, în aceeași măsură contează starea generală de sănatate a persoanei afectate.
Bronhopneumonia afectează preponderent copii mici, persoanele imunosupresate și cele vârstnice. (Buiuc D., 2010)
Fibroza chistică este o boală genetică gravă, ce afectează în special plămânii, asftel copii diagnosticați cu FC sunt predispuși infecțiilor pulmonare recidivante. (Poonja A. și colab., 2017)
Analiza sensibilității tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa din grup H1, raportată la grupe de antibiotice este prezentată în fig.6.5.
Fig. 6.5 Reprezentarea grafică a sensibilității bacteriene față de antibiotice la grupul H-1
Fig. 6.5 Graphical representation of bacterial susceptibility to antibiotics ,. group H-1
Tulpinile de Pseudomonas aeruginosa provenite din aspiratele bronșice au prezentat o înaltă sensibilitate la CIP, AK și rezistență la IMP și MEM, fapt îngrijorător deoarece carbapenemele sunt antibioticele betalactame cu spectru ultralarg (antibiotic total) (Năstasă V., 2005) față de gamă largă de bacterii.
Antibioticele betalactamice au fost utilizate tot mai frecvent datorită eficienței terapeutice. În timp, aceste acțiuni au dus, în mod inevitabil, la selectarea unor tulpini rezistente, capabile să producă enzime care să scindeze legătura betalactamică.
Amoniglicozidele nu sunt foarte eficiente în infecțiile sistemice dar au o foarte bună acțiune bactericidă asupra bacteriilor Gram negative. Întrucât sunt moderat nefrotoxice și neurotoxice, și pentru că că bacteriile crează foarte repede rezistență față de aminoglicoizide, administrarea lor se face cu precauție (Nastasă V., 2005).
Monoterapia cu fluoroquinolone trebuie rezervată doar pentru infecțiile comunitare, datorită riscului emergenței rezistenței
Pentru infecții severe este indicată terapia combinată, cel mai adesea administrându-se o betalactamină antipseudomonas (ceftazidim, cefepim, piperacilină + tazobactam) și un aminoglicozid.
Pseudomonas aeruginosa este un agent patogen oportunist care colonizează orofaringele, fiind unul din patogenii izolați din probele de spută de la pacienți cu afecțiuni respiratorii făcând posibilă contaminarea conținutului gastric (Bynum L.J. și colab., 1976). Aderența bacteriilor la epiteliul căilor respiratorii este primul pas al infecțiilor bronhopulmonare ce favorizează ulterior colonizarea tubului digestiv.
Aspiratele gastrice pot distinge diferite boli pulmonare legate de produsul aspirat. Conținutele acide pot agrava infecția bacteriană printr-un mecanism care implică adeziunea celulei bacteriene la epiteliul căilor respiratorii. (Augustine SM și colab., 1991)
Aspiratele gastrice prelevate de la pacienți umani (H-2), cu diferite patologii de fond, au reprezentat o altă categorie de afecțiuni produse de Pseudomonas aeruginosa (tabelul 6.3.)
Tabelul 6.3
H – 2 Tulpini de P. aeruginosa de origine umană izolate din aspirate gastrice
Table 6.3
H – 2 P. aeruginosa strains of human origin isolated from gastric aspirates
Tabelul . 6.4
Rezultatele obținute la antibiogramă pe tulpinile de P. aeruginosa de origine umană izolate din aspiratele gastrice (H-2)
Table 6.4
The results obtained from the antibiotic of P. aeruginosa strains of human origin isolated from gastric aspirates (H-2)
Din analiza de ansamblu a tabelului 6.4, reiese faptul că, tulpinile de Pseudomonas aeruginosa de origine umană izolate de la grupul H-2, au o sensibilitate foarte bună față de antibioticele testate (fig 6.6).
Testările au evidențiat o rezistență redusă ceea ce determină reușita terapeutică. Se observă faptul că, 6,66% dintre tulpini sunt simultan rezistente la 11, 8, 7, 3, 2, 1 dintre antibioticele testate. De remarcat incidența ridicată de 60% de tulpinile sensibile simultan la toate cele 13 antibiotice testate.
Analiza comparată a sensibilității tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa din grup H-2,evaluată în funcție de grupa de antibiotice, este prezentată în fig.6.7.
Fig. 6.7 Reprezentarea grafică a sensibilității bacteriene față de antibiotice la grupul H-2
Fig. 6.7 Graphical representation of bacterial susceptibility to antibiotics group H-2
Toate tulpinile de Pseudomonas aeruginosa izolate din aspiratele gastrice ale pacienților umani (H-2), au prezentat sesibilitate PB.
Din cele 15 tulpini izolate, 4 tulpini au manifestat rezistență la IPM, TZP, GN, 3 tulpini au manifestat rezistență la MEM, CAZ, FEP, CIP, 2 tulpini au manifestat rezistență la AK, TOB, ATM și câte o tulpină rezistentă la PIP si TAZ.. Nu s-a izolat nicio tulpină multirezistentă față de antibioticele testate.
Testarea microbiologică a lichidului pleural, de la pacienți umani (H-3) cu diverse patologii de fond (osteoartrită, encefalipatii, stenoză posttraumatică, enterocolită, etc), a permis izolarea unor tulpini de Pseudomonas aeruginosa (tabelul 6.5.)
În mod normal, la nivelul cavității pleurale există doar o cantitate mică de lichid (0,1-0,2 ml/kg), care îndeplinește două funcții importante: asigură alunecarea ușoară a foițelor pleurale în cursul mișcărilor respiratorii, scăzând semnificativ forța de frecare; permite păstrarea plămânilor „lipiți” de peretele toracic, realizând o expansiune optimă a țesutului pulmonar (Nistor N., 2016).
Investigațiile microbiologice ale prelevatelor a permis izolarea a 12 tulpini de Pseudomonas aeruginosa. Pentru stabilirea protocolului terapeutic, toate tulpinile au fost testate față de cele 13 antibiotice: ciprofloxacin, imipenem, meropenem, piperacilin + tazobactam, ceftazidime, cefepim, aztreonam, piperacilin, tazobactam,amikacina, gentamcina, tobramicina și polimixina B (tabelul 6.6).
Tabelul 6.5
Tulpini de P. aeruginosa de origine umană izolate din lichidul pleural H – 3
Table 6.5
P. aeruginosa strains of human origin isolated from pleural fluid H-3
Testarea sensibilității la antibiotice similar tutror grupelor testate s-a efectuat prin metoda disc difuziei Kirby Bauer pe mediul Mueller Hinton folosind microcomprimate Oxoid UK, interpretarea rezultatelor a fost realizată în concordanță cu ghidul CLSI 2015. Densitatea inoculului pentru antibiogramă, de 0,5 MacFarland, a fost determinată cu ajutorul densitometrului. Tulpinile de referință față de care s-a testat comparativ sensibilitatea la antibiotice Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, furnizate de firma Oxoid UK (Thermo Fisher Scientific).
Tabelul 6.6
Rezultatele obținute la antibiograma realizată pe tulpinile de P. aeruginosa de origine umană din lichidul pleural ,H-3
Table 6.6
The results obtained from the antibiotic strains of P. aeruginosa in the pleural fluid of human origin, H-3
Rezultatele antibiogramelor au arătat faptul că, tulpinile de Pseudomonas aeruginosa de origine umană izolate de la grupul H-3, au o sensibilitate foarte bună față de antibioticele testate.
Testările au evidențiat o rezistență relativ redusă față de antibioticele testate. Se observă faptul că,8,33% dintre tulpini sunt simultan rezistente la 9 antibiotice, 8,33% tulpini rezistente simultan la 3 antibiotice,33,33% tulpini rezistente doar la 2 antibiotice și 25% dintre tulpini au manifestat rezistență la un singur antibiotic. Deasemenea, 16,66% din cele 12 tulpini testate au fost sensibile la cele 13 antibiotice testate ( fig.6.8).
Fig. 6.8 Incidența rezistenței microbiene a tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa din grupul H-3
Fig. 6.8 The incidence of microbial resistance strains of Pseudomonas aeruginosa in group H-3
Analiza comparată a sensibilității tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa din grup H-3, în funcție de grupa de antibiotice, este prezentată în figura 6.9.
Fig. 6.9 Reprezentarea grafică a sensibilității bacteriene față de antibiotice la grupul H-3
Fig. 6.9 Graphical representation of bacterial susceptibility to antibiotics group H-3
Toate tulpinile de Pseudomonas aeruginosa provenite din lichide pleurale ale pacienților umani (H-3), au fost sensibile la PB și ATM.
Din cele 12 tulpini testate, 8 tulpini au fost rezistente la MEM, 5 tulpini au fost rezistente la IPM și GN, 3 tulpini rezistente la TOB, 2 tulpini rezistente la TZP, FEP, CIP, AK și cîte o tulpină rezistentă la PIP, TAZ.
Au fost realizate investigații microbiologice pe spute prelevate de la pacienți umani (H-4) spitalizați în spații clinice specializate. În urma testărilor s-au izolat 13 tulpini de Pseudomonas aeruginosa (tabelul 6.7)
Cei mai mulți patogeni pulmonari își au originea în flora orofa-ringiană. Aspirarea acestor agenți patogeni este cel mai frecvent mecanism de producere a pneumoniei.
Frecvența colonizării mucoasei orofaringelui cu bacili aerobi gram-negativi, nu este obișnuită la subiecții sănătoși (< 2%), crește în cursul spitalizării, odată cu înrăutățirea stării generale, în legătură cu afecțiuni subiacente, poate fi consecința unei activități proteolitice salivare crescute, care distruge fibronectina, o glicoproteină ce tapetează suprafața mucoasei. Fibronectina este receptorul pentru flora normală gram-pozitivă din orofaringe. Pierderea fibronectinei expune receptorii de pe suprafața celulelor epiteliale la bacilii aerobi gram-negativi. Sursa bacililor aerobi gram-negativi poate să fie atât stomacul pacientului, care poate fi colonizat cu aceste microorganisme, ca urmare a unui pH gastric crescut (prin atrofia gastrică sau ca urmare a utilizării unor blocante H-2 sau antiacide), cât și aparatura respiratorie sau mâinile contaminate ale infirmierelor, sau apa și alimentele contaminate. Sondele nazo-gastrice pot facilita transferul bacteriilor gastrice spre faringe.
Tabelul 6.7
Tulpini de P. aeruginosa de origine umană izolate din probele de spută H – 4
Table 6.7
P. aeruginosa strains of human origin isolated from sputum samples H-4
Toate tulpinile de Pseudomonas aeruginosa au fost testate în vederea determinării sensibilității la cele 13 antibiotice recomandate în infecții produse cu bacilul pioceanic (tabelul 6.8.).
Rezultatele antibiogramelor au arătat faptul că, tulpinile de Pseudomonas aeruginosa de origine umană izolate de la grupul H-4, au o sensibilitate redusă față de antibioticele testate.
Tabelul 6.8
Rezultatele obținute la antibiograma realizată pe tulpinile de P. aeruginosa de origine umană din probele de spută, H-4
Table 6.8
The results obtained from the antibiotic strains of P. aeruginosa from sputum samples of human origin, H-4
Testările au evidențiat o rezistență relativ redusă față de antibioticele testate (fig.6.10).
Fig. 6.10 Incidența rezistenței microbiene a tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa din grupul H-4
Fig. 6.10 The incidence of microbial resistance strains of Pseudomonas aeruginosa in group H-4
Se observă faptul că, 7,69% dintre tulpini sunt simultan rezistente față de 11 antibiotice, 23,07% tulpini sunt rezistente simultan față de 10 antibiotice,15,34% tulpini sunt rezistente la 9 antibiotice, 15,34% tulpini sunt rezistente la 2 antibiotice și 7,69% dintre tulpini au manifestat rezistență la un singur antibiotic. Deasemenea, 30,76% din cele 13 tulpini testate au fost sensibile la cele 13 antibiotice testate
Analiza comparată a sensibilității tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa din grup H-4, în funcție de grupa de antibiotice, este prezentată în fig.6.11.
Pacienților cu stare generală alterată infectați cu P. aeruginosa, este prudent să se utilizeze combinația β -lactam/aminoglicozide pentru obținerea efectului bactericid. Combinarea beta-lactamilor și a aminoglicozidelor cu o fluorochinolonă nu pare să aducă o creștere a activității bactericide, deja rapidă în cazul fluorochinolonei singure; totuși, combinațiile pot lărgi spectrul și probabil împiedică dezvoltarea rezistenței. Fluorochinolonele în asociere fie cu un β-lactamic, fie cu un aminoglicozid pot fi folosite în instituțiile unde este de așteptat ca infecția cu un agent nosocomial să fie rezistent la fluorochinolonă sau capătă frecvent rezistență în timpul tratamentului, precum P. aeruginosa.
Fig. 6.11 Reprezentarea grafică a sensibilității bacteriene față de antibiotice la grupul H-4
Fig. 6.11 Graphical representation of bacterial susceptibility to antibiotics group H-4
Toate tulpinile de Pseudomonas aeruginosa provenite din sputa pacienților umani (H-4), au fost sensibile la PB.
Din cele 13 tulpini testate, 8 tulpini au fost rezistente la IPM, MEM, 7 tulpini au fost rezistente la GN, 5 tulpini rezistente la FEP,CIP, EK, TOB, 4 tulpini rezistente la TZP, CAZ, 3 tulpini au fost rezistente la ATM și câte o tulpină rezistentă la PIP și TAZ.
Au fost prelevate probe de urină de la pacienți umani (H-5) cu diferite patologii (insuficiență renală, stenoză uretrală, insuficiență renală, sindrom abdominal dureros, sindrom subocluziv), (tabelul 6.9). În urma investigațiilor microbiologice au fost izolate 15 tulpini de Pseudomonas aeruginosa.
ITU (infecții ale tractului urinar) constituie dupã infecțiile cãilor respiratorii și cele digestive, cea de-a treia entitate ca frecvență a localizării infecțiilor la copil, incidența fiind apreciată a fi cu o pondere la fetițe (Rushton H.G. și colab., 1997). Conform diverselor concepții, ITU nu constituie o boală unitară, ci un grup de boli având în comun prezența bacteriilor semnificative precum Pseudomonas aeruginosa, dar cu o etiologie și patogenie diferită (Karlowsky J.A. și colab., 2002)
Tabelul 6.9.
Tulpini de P. aeruginosa de origine umană izolate din probele de urină H-5
Table 6.9
P. aeruginosa strains of human origin isolated from urine samples H-5
Toate tulpinile de Pseudomonas aeruginosa au fost testate în vederea determinării sensibilității, la cele 13 antibiotice recomandate în terapia antiinfecțioasă (tabelul 6.10.).
Rezultatele antibiogramelor au arătat faptul că, tulpinile de Pseudomonas aeruginosa de origine umană izolate de la grupul H-5, au o sensibilitate heterogenă față de antibioticele testate (fig.6.12).
Tabelul 6.10
Rezultatele obținute la antibiogramă pe tulpinile de P. aeruginosa de origine umană din probele de urină H-5
Table 6.10
The results obtained from the antibiotic strains of P. aeruginosa in samples of human urine H-5
Se observă faptul că din cele 15 tulpini de Pseudomonas aeruginosa izolate, 20% dintre tulpini sunt simultan rezistente față de 11 antibiotice, 13,33% tulpini sunt rezistente simultan față de 10 antibiotice, 33,33% dintre tulpini au manifestat rezistență la un singur antibiotic. De asemenea, 33,33% dintre tulpinile testate au manifestat sensibilitate la cele 13 antibiotice testate (fig.6.12).
Fig.6.12 Incidența rezistenței microbiene a tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa din grupul H-5
Fig.6.12 incidence of microbial resistance strains of Pseudomonas aeruginosa in group H-5
Analiza comparată a sensibilității tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa din grup H-5, în funcție de grupa de antibiotice, este prezentată în fig.6.13.
Fig. 6.13 Reprezentarea grafică a sensibilității bacteriene față de antibiotice la grupul H-5
Fig. 6.13 Graphical representation of bacterial susceptibility to antibiotics group H-5
Din cele 15 tulpini testate, 6 tulpini au fost rezistente la MEM, FEP, AK, 5 tulpini au fost rezistente la CIP, IPM, GN, TOB, 4 tulpini au fost rezistente la PIP, TAZ, TZP, CAZ și câte o tulpină rezistentă la ATM și PB.
Au fost prelevate secreții otice de la pacienții umani (H-6), care aveau patologii diferite (otită, insuficiență respiratorie, bronsită,sinuzită, rinită, urticarii, obstrucții nazale), (tabelul 6.9).
În urma investigațiilor microbiologice au fost izolate 25 tulpini de Pseudomonas aeruginosa.
Factorii favorizanți implicați în apariția otitelor sunt: rinitele alergice, adenoidită acută sau cronică (polipii), rinofaringitele acute sau cronice, sinuzitele acute/cronice, deviații de sept, boli infecto-contagioase, folosirea în exces a bețișoarelor igienice otice.
Otita externă, prezintă particularități proprii infecției tegumentului. Cel mai frecvent este cauzată de pseudomonade, mai ales de Pseudomonas aeruginosa dar și alte bacterii aerobe, în condiții favorizante, cum ar fi pătrunderea apei în conductul auditiv extern.
Tabelul 6.11
Tulpini de P. aeruginosa de origine umană izolate din secrețiile otice H – 6
Table 6.11
P. aeruginosa strains of human origin isolated from ear secretions H-6
Toate tulpinile de Pseudomonas aeruginosa izolate din secreții otice, au fost testate prin tehnica antibiogramei, pentru determinarea sensibilității față de cele 13 antibiotice recomandate în terapia antiinfecțioasă (tabelul 6.12).
Rezultatele antibiogramelor au arătat faptul că, tulpinile de Pseudomonas aeruginosa de origine umană izolate de la grupul H-6, au o sensibilitate variabilă față de antibioticele testate dar favorabilă actului terapeutic (fig.6.14).
Tabelul 6.12
Rezultatele obținute la antibiogramă pe tulpinile de P. aeruginosa de origine umană din secrețiile otice H-6
Tabelul 6.12
The results obtained from the antibiotic of P. aeruginosa strains of human secretions ear H-6
Se observă faptul că din cele 25 tulpini de Pseudomonas aeruginosa izolate din secreții otice de la pacienții umani (H-6), 4% dintre tulpini sunt simultan rezistente față de 10 antibiotice și respectiv 8 antibiotice, 20% tulpini sunt rezistente simultan față de 3 antibiotice, 16% tulpini au fost rezistente la 2 antibiotice și 8% dintre tulpini au manifestat rezistență la un singur antibiotic. De asemenea, 48% dintre tulpinile testate au manifestat sensibilitate simultană la toate cele 13 antibiotice testate (fig.6.12).
Fig.6.14 Incidența rezistenței microbiene a tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa din grupul H-6
Fig.6.14 Incidence of microbial resistance strains of Pseudomonas aeruginosa in group H-6
Analiza comparată a sensibilității tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa din grup H-5, în funcție de grupa de antibiotice, este prezentată în fig.6.15.
Fig. 6.15 Reprezentarea grafică a sensibilității bacteriene față de antibiotice la grupul H-6
Fig. 6.15 Graphical representation of bacterial susceptibility to antibiotics group H-6
Din cele 25 tulpini testate, 7 tulpini au fost rezistente la MEM, 6 tulpini au fost rezistente la IPM, TZP, 5 tulpini au fost rezistente la CAZ, 4 tulpini au fost rezistente la FEP, 2 tulpini au fost rezistente la AK, GN și câte o tulpină rezistentă la ATM, PB, PIP, TAZ, TOB, CIP.
Au fost prelevate și investigate microbiologic diferite colecții purulente provenite de la pacienți umani (H-7) spitalizați cu diferite afecțiuni (plăgi, chisturi,atrezie esofagiană, pneumotorax, etc), (tabelul 6.13).
În anii 1850, Ignaz Semmelweis a dedus prima legătură între transferul agenților patogeni de la perosnalul medical la pacienți. Semmelweis a observat o doferență între numărul cazurilor de febră puerperală din secțiile de materitate. Incidența febrei puerperale era mai mare în sectoarele unde își desfășurau activitatea studenții în medicină comparativ cu sectoarele unde lucrau moașele și s-a gândit că ar fi fost o legătură cu participarea studenților la necropsii. După introducerea spălării mâinilor la terminarea procedurilor postmortem și înaintea reluării activității la sala de naștere. Ratele infecțiilor și a mortalității consecutive s-au redus semnificativ (Wilson J., 2007).
Folosirea echipamentului de protecție de către personalul medical este o măsură esențială pentru protejarea sănătății și siguranței pacienților dar și a personalului medical. Trebuie folosite toate măsurile de siguranță când urmează a fi manipulate prelevate purulente/lichide corporale contaminate în vederea examinării bacteriologice (mănuși sterile de unică folosință, șorț și protecție pentru ochi).
Este dovedit că mediul spitalicesc se poate contamina cu microorganisme responsabile de infecții asociate îngrijirilor medicale. Prin urmare, transmiterea microorganismelor din mediul de spital la pacienți poate apare prin contact nemijlocit cu echipamentele contaminate sau indirect ca rezultat al atingerii mâinilor. (Denton M. și colab., 2004)
Pseudomonas aeruginosa poate infecta orice parte a corpului, inclusiv ficatul, creierul, oasele, sinusurile, de aceea din recoltarea colecțiilor purulente localizate/sau nu, putem oricând izola un piocianic, indiferent de patologiile de fond ale pacienților, favorizarea infectării rămânând la pacienții imunodeprimați.
În urma analizelor de laborator, s-au izolat și identificat 26 tulpini de Pseudomonas aeruginosa din colecții purulente postoperatorii.
Tabelul 6.13
Tulpini de P. aeruginosa de origine umană izolate din colecții purulente postoperatorii H-7
Table 6.13
P. aeruginosa strains of human origin isolated from postoperative purulent collections H-7
Toate tulpinile de Pseudomonas aeruginosa izolate din colecții purulente, au fost testate prin tehnica antibiogramei, pentru determinarea sensibilității față de cele 13 antibiotice recomandate în terapia antiinfecțioasă (tabelul 6.14).
Rezultatele antibiogramelor au arătat faptul că, tulpinile de Pseudomonas aeruginosa de origine umană izolate de la grupul H-7, au o sensibilitate relativ redusă față de antibioticele testate.
Tabel 6.14
Rezultatele obținute la antibiogramă pe tulpinile de P. aeruginosa de origine umană din colecții purulente postoperatorii H-7
Table 6.14
The results obtained from the antibiotic of P. aeruginosa strains of human origin of postoperative purulent collections H-7
Se observă faptul că din cele 26 tulpini de Pseudomonas aeruginosa izolate din colecții purulente provenite de la pacienții umani (H-7), 3,84% dintre tulpini au fost rezistente la 13 antibiotice, 3,84% dintre tulpini au fost rezistente la 12 antibiotice, 7,69% tulpini au fost rezistente la 11 antibiotice, 11,53% tulpini au fost rezistente la 10 antibiotice, 7,69% tulpini au fost rezistente la 9 antibiotice, 3,84% dintre tulpini au fost rezistente la 8 antibiotice respectiv 7 antibiotice, 11,53% au fost rezistente la 3 antibiotice, 3,84% au fost rezistente la 2 antibiotice și tot 3,84% au fos rezistente doar la un antibiotic. De asemenea, 38,46% dintre tulpinile testate au manifestat sensibilitate microbiană la toate cele 13 antibiotice testate (fig.6.16).
Fig.6.16 Incidența rezistenței microbiene a tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa din grupul H-7
Fig.6.16 Incidence of microbial resistance strains of Pseudomonas aeruginosa in group H-7
Analiza comparată a sensibilității tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa din grup H-7, în funcție de grupa de antibiotice, este prezentată în fig.6.17
Fig. 6.17 Reprezentarea grafică a sensibilității bacteriene față de antibiotice la grupul H-7
Fig. 6.17 Graphical representation of bacterial susceptibility to antibiotics group H-7
Din cele 26 tulpini de Pseudomonas aeruginosa testate, 14 tulpini au fost rezistente la FEP, 13 tulpini au fost rezistente la MEM, 12 tulpini au fost rezistente la CAZ,IPM, 11 tulpini au fost rezistente la GN, TZP, 10 tulpini au fost rezistente la CIP, TOB, 8 tulpini au fost rezistente la AK, ATM, 4 tulpini au fost rezistente la PIP, TAZ și 3 tulpini au fost rezistente la PB.
Testarea tulpinilor de origine animală (A1-A4)
Potrivit prezentului studiu rezistența la antibiotice este destu de mare, fapt îngrijorător atât pentru oameni cât și pentru animale. Lupta împotriva rezistenței la antibiotice trebuie să înceapă din crescătoriile de animale. Trebuie să fie interzisă utilizarea în scop preventiv a antibioticelor, să se limiteze tratamentele în masă la cazuri strict delimitate, să se interzică în medicina veterinară folosirea antibioticelor extrem de importante și de rezervă în medicina umană și să fie stopate vânzările pe internet de antibiotice, prin aplicarea acestor măsuri, s-ar reduce fenomenul de rezistență bacteriană în medicina umană cât și veterinară.
Toate tulpinile de Pseudomonas aeruginosa izolate din secreții otice, provenite de la diferite specii de animale (câine,pisică, iepure), au fost testate pentru determinarea sensibilității față de același panel de antibiotice uzilizate în testarea tulpinilor de origine umane (tabelul 6.15).
Tabelul 6.15
Rezultatele obținute la antibiogramă pe tulpinile de P. aeruginosa de origine animală izolate din otite, A – 1
Table 6.15
The results obtained from the antibiotic of P. aeruginosa strains isolated from animal otitis A – 1
Din cele 17 tulpini de Pseudomonas aeruginosa izolate din secrețiile otice provenite de la animale (A-1), 11,76% dintre tulpini au fost rezistente la 13 antibiotice, 11,76% dintre tulpini au fost rezistente la 12 antibiotice, 17,64% tulpini au fost rezistente la 11 antibiotice, 11,76% tulpini au fost rezistente la 10 antibiotice, 11,76% tulpini au fost rezistente la 9 antibiotice, 17,64% dintre tulpini au fost rezistente la 8 antibiotice, 11,76% tulpini au fost rezistente la 7 antibiotice și 5,88% au fost rezistente la 2 antibiotice (fig.6.18). Nu s-a identificat nici-o tulpină de Pseudomonas aeruginosa cu sensibilitate totală la antibioticele luate în testare.
Fig.6.18 Incidența rezistenței microbiene a tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa din grupul A-2
engleza
Analiza comparată a sensibilității tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa din grup A-1, în funcție de grupa de antibiotice, este prezentată în fig.6.19. Toate cele 17 tulpini testate au fost rezistente la PIP și TAZ, 16 tulpini au fost rezistente la TZP,CAZ,FEP, 15 tulpini au fost rezistente la CIP, 12 tulpini au fost rezistente la MEM, 11 tulpini au fost rezistente la PB, 10 tulpini au fost rezistente la ATM, 9 tulpini au fost rezistente la GN și IPM, 7 tulpini au fost rezistente la TOB și 6 tulpini au fost rezistente la AK.
Fig. 6.19 Reprezentarea grafică a sensibilității bacteriene față de antibiotice,. la grupul A-1
engleza
Au fost prelevate și testate microbiologic colecții purulente provenite de la câini cu abcese perianale. Au fost izolate 25 de tulpini de Pseudomonas aeruginosa cărora le-a fost testată sensibilitatea față de antibiotice ( tabelul 6.16).
Tabelul 6.16
Rezultatele obținute la antibiogramă pe tulpinile de P. aeruginosa de origine animală izolate din abcese perianale
Table 6.16
The results obtained from the antibiotic of P. aeruginosa strains isolated from animal perianal abscess
Din cele 25 tulpini de Pseudomonas aeruginosa izolate din colecțiile purulente, provenite de la animale cu abcese perianale (A-2), 36% dintre tulpini au fost rezistente la cele 13 antibiotice testate, 12% dintre tulpini au fost rezistente la 12 antibiotice, 24% tulpini au fost rezistente la 11 antibiotice, 8% tulpini au fost rezistente la 10 antibiotice, 8% tulpini au fost rezistente la 9 antibiotice, 8% dintre tulpini au fost rezistente la 8 antibiotice și 4% tulpini au fost rezistente la 5 antibiotice (fig.6.20). Din analiza acestor rezultate se observă faptul că, nici-o tulpină de Pseudomonas aeruginosa nu a manifestat sensibilitate 100% la antibioticele testate.
Fig.6.20 Incidența rezistenței microbiene a tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa din grupul A-2
engleza
Analiza comparată a sensibilității tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa din grup A-2, în funcție de grupa de antibiotice, este prezentată în fig.6.21. Toate cele 25 tulpini testate au fost rezistente la TZP, CAZ, PIP și TAZ., 24 tulpini au fost rezistente la PB,FEP, 21 tulpini au fost rezistente la MEM, 20 tulpini au fost rezistente la CIP, 19 tulpini au fost rezistente la ATM, 17 tulpini au fost rezistente la IPM și AK și 14 tulpini au fost rezistente la TOB.
Fig. 6.21 Reprezentarea grafică a sensibilității bacteriene față de antibiotice la grupul A-2
Investigațiile microbiologice, realizate pe hemoculturi prelevate de la diferite animale cu suspiciune de septicemie, au permis izolarea a 8 tulpini de Pseudomonas aeruginosa (tabelul 6.17).
Tabelul 6.17
Rezultatele obținute la antibiogramă pe tulpinile de P. aeruginosa de origine animală izolate din septicemii, A – 3
Table 6.17
The results obtained from the antibiotic of P. aeruginosa strains isolated from animal sepsis, A – 3
La majoritatea antibioticelor, tulpinile testate au prezentat o sensibilitate redusă, fenomenul de rezistență fiind dominant și inductibil.
Din cele 8 tulpini de Pseudomonas aeruginosa izolate din hemoculturi, provenite de la animale cu septicemie (A-3), 25% dintre tulpini au fost rezistente la 12 antibiotice, 25% dintre tulpini au fost rezistente la 11 antibiotice, 25% tulpini au fost rezistente la 10 antibiotice, 12,5% tulpini au fost rezistente la 9 antibiotice și 12,5% tulpini au fost rezistente la 8 antibiotice (fig.6.22).
Fig. 6.22 Incidența rezistenței microbiene a tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa din grupul A-3
engleza
Analiza comparată a sensibilității tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa din grup A-3, în funcție de grupa de antibiotice, este prezentată în fig.6.23. Toate cele 8 tulpini testate au fost rezistente la TZP, PIP,FEP,CAZ și TZP, 7 tulpini au fost rezistente la PB și ATM, 6 tulpini au fost rezistente la MEM, 5 tulpini au fost rezistente la CIP și IPM, 3 tulpini au fost rezistente la TOB și 2 tulpini au fost rezistente la AK.
Fig. 6.23 Reprezentarea grafică a sensibilității bacteriene față de antibiotice, la grupul A-3
engleza
În grupa A-4 au fost încadrate tulpinile de Pseudomonas aeruginosa izolate din secreții conjunctivale, provenite de la câini, pisici și iepuri (tabelul 6.18).
Tabelul 6.18
Rezultatele obținute la antibiogramă pe tulpinile de P. aeruginosa de origine animală izolate din conjunctivite, A – 4
Table 6.18
The results obtained from the antibiotic of P. aeruginosa strains isolated from animal conjunctivitis, A – 4
Majoritatea tulpinilor testate au prezentat rezistență multiplă față de majoritatea antibioticelor testate.
Din cele 7 tulpini de Pseudomonas aeruginosa izolate din secreții conjunctivale, provenite de la diferite specii de animale (A-4), 71,42% dintre tulpini au fost rezistente la toate antibioticele testate, 14,28% dintre tulpini au fost rezistente la 12 antibiotice și 14,28% tulpini au fost rezistente la 9 antibiotice, (fig.6.22).
Fig. 6.24 Incidența rezistenței microbiene a tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa din grupul A-4
Analiza comparată a sensibilității tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa din grup A-3, în funcție de grupa de antibiotice, este prezentată în fig.6.25.
Fig. 6.25 Reprezentarea grafică a sensibilității bacteriene față de antibiotice,. la grupul A-4
Toate cele 7 tulpini testate au fost rezistente la TZP,CAZ, FEP,CIP,GN, PB, PIP, TAZ și 6 tulpini au fost rezistente la TOB și ATM.
6.1.3. Concluzii parțiale
Toate tulpinile au fost testate față de cele 13 antibiotice care sunt uzual recomandate în patologia infecțioasă produsă de Pseudomonas aeruginosa.
Din cele 19 tulpini de Pseudomonas aeruginosa izolate din aspirate bronșice de la pacienți umani (H-1), 5,27% dintre tulpini au fost simultan rezistente la toate cele 13 tulpini testate, 5,27% tulpini au fost rezistente la 10 antibiotice, 15,78% au fost rezistente la 4 antibiotice, 10,52% tulpini au fost rezistente la 3 antibiotice, 26,31% dintre tulpini au fost rezistente la două antibiotice, 21,05% au fost rezistente la un singur antibiotic. Un aspect pozitiv este faptul că 15,78% din tulpinile testate au manifestat sensibilitate față de toate antibioticele testate
Din cele 19 tulpini testate la grupul H-1, 13 tulpini au fost rezistente la IPM, 10 tulpini au fost rezistente la MEM, 7 tulpini rezistente la FEP, 6 tulpini rezistente la CAZ, 5 tulpini au fost rezistente la GN, 4 tulpini au fost rezistente la TZP si ATM, 3 tulpini la TAZ, PIP, PB, TOB și 2 tulpini rezistente la CIP.
. Din cele 15 tulpini de Pseudomonas aeruginosa izolate din aspirate gastrice (H-2), 6,66% sunt simultan rezistente la 11, 8, 7, 3, 2, 1 dintre antibioticele testate. 60% de tulpinile testate manifestă sensibilitate simultană la toate cele 13 antibiotice testate.
Din cele 15 tulpini izolate, din grupa H-2, 4 tulpini au manifestat rezistență la IPM, TZP, GN, 3 tulpini au manifestat rezistență la MEM, CAZ, FEP, CIP, 2 tulpini au manifestat rezistență la AK, TOB, ATM și câte o tulpină rezistentă la PIP si TAZ. Nu s-a izolat nicio tulpină multirezistentă față de antibioticele testate.
Din cele 12 tulpini de Pseudomonas aeruginosa izolate din lichide pleurale (H-3), 8,33% dintre tulpini sunt simultan rezistente la 9 antibiotice, 8,33% tulpini rezistente simultan la 3 antibiotice,33,33% tulpini rezistente doar la 2 antibiotice și 25% dintre tulpini au manifestat rezistență la un singur antibiotic. Deasemenea, 16,66% din cele 12 tulpini testate au fost sensibile la cele 13 antibiotice testate.
Din cele 12 tulpini testate la grupa H-3, 8 tulpini au fost rezistente la MEM, 5 tulpini au fost rezistente la IPM și GN, 3 tulpini rezistente la TOB, 2 tulpini rezistente la TZP, FEP, CIP, AK și cîte o tulpină rezistentă la PIP, TAZ
Din cele 12 tulpini de Pseudomonas aeruginosa izolate din spută (H-4), 7,69% dintre tulpini sunt simultan rezistente față de 11 antibiotice, 23,07% tulpini sunt rezistente simultan față de 10 antibiotice,15,34% tulpini sunt rezistente la 9 antibiotice, 15,34% tulpini sunt rezistente la 2 antibiotice și 7,69% dintre tulpini au manifestat rezistență la un singur antibiotic.
Din cele 12 tulpini testate la grupa H-4, 8 tulpini au fost rezistente la IPM, MEM, 7 tulpini au fost rezistente la GN, 5 tulpini rezistente la FEP,CIP, EK, TOB, 4 tulpini rezistente la TZP, CAZ, 3 tulpini au fost rezistente la ATM și câte o tulpină rezistentă la PIP și TAZ.
Din cele 15 tulpini de Pseudomonas aeruginosa izolate din spută (H-5), 20% dintre tulpini sunt simultan rezistente față de 11 antibiotice, 13,33% tulpini sunt rezistente simultan față de 10 antibiotice, 33,33% dintre tulpini au manifestat rezistență la un singur antibiotic.
Din cele 12 tulpini testate la grupa H-5, 6 tulpini au fost rezistente la MEM, FEP, AK, 5 tulpini au fost rezistente la CIP, IPM, GN, TOB, 4 tulpini au fost rezistente la PIP, TAZ, TZP, CAZ și câte o tulpină rezistentă la ATM și PB.
Din cele 25 tulpini de Pseudomonas aeruginosa izolate din secreții otice de la pacienții umani (H-6), 4% dintre tulpini sunt simultan rezistente față de 10 antibiotice și respectiv 8 antibiotice, 20% tulpini sunt rezistente simultan față de 3 antibiotice, 16% tulpini au fost rezistente la 2 antibiotice și 8% dintre tulpini au manifestat rezistență la un singur antibiotic.
Din cele 12 tulpini testate la grupa H-6, 7 tulpini au fost rezistente la MEM, 6 tulpini au fost rezistente la IPM, TZP, 5 tulpini au fost rezistente la CAZ, 4 tulpini au fost rezistente la FEP, 2 tulpini au fost rezistente la AK, GN și câte o tulpină rezistentă la ATM, PB, PIP, TAZ, TOB, CIP.
Din cele 26 tulpini de Pseudomonas aeruginosa izolate din colecții purulente (H-7), 3,84% dintre tulpini au fost rezistente la 13 antibiotice, 3,84% dintre tulpini au fost rezistente la 12 antibiotice, 7,69% tulpini au fost rezistente la 11 antibiotice, 11,53% tulpini au fost rezistente la 10 antibiotice, 7,69% tulpini au fost rezistente la 9 antibiotice, 3,84% dintre tulpini au fost rezistente la 8 antibiotice respectiv 7 antibiotice, 11,53% au fost rezistente la 3 antibiotice, 3,84% au fost rezistente la 2 antibiotice și tot 3,84% au fos rezistente doar la un antibiotic.
Din cele 26 tulpini testate la grupa H-7, 14 tulpini au fost rezistente la FEP, 13 tulpini au fost rezistente la MEM, 12 tulpini au fost rezistente la CAZ,IPM, 11 tulpini au fost rezistente la GN, TZP, 10 tulpini au fost rezistente la CIP, TOB, 8 tulpini au fost rezistente la AK, ATM, 4 tulpini au fost rezistente la PIP, TAZ și 3 tulpini au fost rezistente la PB.
Din cele 17 tulpini de Pseudomonas aeruginosa izolate din secreții orice provenite de la animale (A-1), 11,76% dintre tulpini au fost rezistente la 13 antibiotice, 11,76% dintre tulpini au fost rezistente la 12 antibiotice, 17,64% tulpini au fost rezistente la 11 antibiotice, 11,76% tulpini au fost rezistente la 10 antibiotice, 11,76% tulpini au fost rezistente la 9 antibiotice, 17,64% dintre tulpini au fost rezistente la 8 antibiotice, 11,76% tulpini au fost rezistente la 7 antibiotice și 5,88% au fost rezistente la 2 antibiotice.
Din cele 26 tulpini testate la grupa A-1, 16 tulpini au fost rezistente la TZP,CAZ,FEP, 15 tulpini au fost rezistente la CIP, 12 tulpini au fost rezistente la MEM, 11 tulpini au fost rezistente la PB, 10 tulpini au fost rezistente la ATM, 9 tulpini au fost rezistente la GN și IPM, 7 tulpini au fost rezistente la TOB, 6 tulpini au fost rezistente la AK. Toate cele 17 tulpini testate au fost rezistente la PIP și TAZ
Din cele 25 tulpini de Pseudomonas aeruginosa izolate din colecții purulente provenite de la animale (A-2), 36% dintre tulpini au fost rezistente la cele 13 antibiotice testate, 12% dintre tulpini au fost rezistente la 12 antibiotice, 24% tulpini au fost rezistente la 11 antibiotice, 8% tulpini au fost rezistente la 10 antibiotice, 8% tulpini au fost rezistente la 9 antibiotice, 8% dintre tulpini au fost rezistente la 8 antibiotice și 4% tulpini au fost rezistente la 5 antibiotice.
Din cele 25 tulpini testate la grupa A-2, 24 tulpini au fost rezistente la PB,FEP, 21 tulpini au fost rezistente la MEM, 20 tulpini au fost rezistente la CIP, 19 tulpini au fost rezistente la ATM, 17 tulpini au fost rezistente la IPM, AK și 14 tulpini au fost rezistente la K. Toate tulpinile au fost rezistente la TZP, CAZ, PIP și TAZ.
Din cele 8 tulpini de Pseudomonas aeruginosa izolate din colecții purulente provenite de la animale (A-3), 25% dintre tulpini au fost rezistente la 12 antibiotice, 25% dintre tulpini au fost rezistente la 11 antibiotice, 25% tulpini au fost rezistente la 10 antibiotice, 12,5% tulpini au fost rezistente la 9 antibiotice și 12,5% tulpini au fost rezistente la 8 antibiotice.
Din cele 8 tulpini testate la grupa A-3, 7 tulpini au fost rezistente la PB și ATM, 6 tulpini au fost rezistente la MEM, 5 tulpini au fost rezistente la CIP și IPM, 3 tulpini au fost rezistente la TOB și 2 tulpini au fost rezistente la AK. Toate cele 8 tulpini testate au fost rezistente la TZP, PIP,FEP,CAZ și TZP
Din cele 7 tulpini de Pseudomonas aeruginosa izolate din colecții purulente provenite de la animale (A-4), 71,42% dintre tulpini au fost rezistente la toate antibioticele testate, 14,28% dintre tulpini au fost rezistente la 12 antibiotice și 14,28% tulpini au fost rezistente la 9 antibiotice.
Din cele 7 tulpini testate la grupa (A-4), 6 tulpini au fost rezistente la TOB și ATM. Toate cele 7 tulpini testate au fost rezistente la TZP,CAZ, FEP,CIP,GN, PB, PIP, TAM.
TESTAREA SENSIBILITĂȚII LA ANTIBIOTICE A TULPINILOR DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA PRODUCĂTOARE DE ESBL ȘI MBL
Material și metodă
Scopul acestui studiu a constat în stabilirea prevalenței și a sensibilității la unele antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa ESBL și MBL.
Lotul de studiu a fost constituit din 125 tulpini de Pseudomonas aeruginosa de origine umană și 57 tulpini de origine animală izolate din urină, spută, secreții traheale, plăgi și hemoculturi.
Investigațiile microbiologice au realizate în laboratorul de specialitate dintr-un spital din Iași și în laboratorul de Microbiologie al FMV Iași.
6.2.1.1.Identificarea tulpinilor producătoare de ESBL
Identificarea fenotipică a tulpinilor producătoare de ESBL s-a realizat prin metoda difuzimetrică.
ESBL (Extended Spectrum Beta Lactamase = Beta Lactamaze cu Spectru Larg) sunt sintetizate de majoritatea enterobacteriilor. Prezența lor este detectată cel mai adesea prin tehnica antibiogramei. Detecția tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa producătoare de ESBL se bazează pe testul de sinergie (dop de șampanie) realizat între un disc de cefalosporină din generația a-III-a și/sau monobactam și un disc de amoxicilină+ acid clavulanic.
Secreția de ESBL va fi suspectată mai întâi de micșorarea diametrelor de inhibiție la cefalosporinele de generația a-III-a-: cefotaxim(CTX)˂ 27mm; ceftazidim (CAZ)˂ 22 mm; monobactami- aztreonam (ATM)˂ 27mm. O tulpină de referință trebuie testată în aceleași condiții, în scopul verificării validității discurilor de antibiotice. Prezența betalactamazelor indică faptul că tulpina este rezistentă la toate β-lactamicele, cu excepția imipenemului și a cefamicinei (Mihăescu Gr., 2007)
Brilliance ESBL Agar
Brilliance ESBL Agar sunt plăci cu mediu cromogen de screening pentru tulpinile care produc beta – lactamase cu spectru extins.
Mediul prevede identificarea prezumtivă ESBL de Enterobacteriaceae direct din probele clinice.
Timpul pentru identificarea prezumtivă a ESBL intr-un lot de testat este de 24 de ore,ceea ce constituie un avantaj. Este o metodă convenabilă și ușor de utilizat care poate face o diferențiere clară între tulpinile de E. coli, P. aeruginosa și KESC (Klebsiella-Enterobacter-Serratia-Citrobacter), inoculate direct din proba recoltată sau din suspensia bacteriană .
Este un mediu selectiv în care este inclus Cefpodoxime, un marker bine cunoscut pentru producția de ESBL, fiind prezentă o rezistență mediată, inhibând majoritatea tulpinilor non-ESBL Enterobacteriaceae. Are o incidență redusă a rezultatelor fals-pozitive comparativ cu testele fenotipice tradiționale care se utilizează în laboratoare în scop de cercetare, reducând ulterioarele teste de confirmare a tulpinilor ESBL. Identificarea prezumtivă și precoce a ESBL permite un tratament adecvat pacientilor precum și procedurile de control al infecțiilor depistate în mediul spitalicesc.
Pseudomonas aeruginosa ar trebui să fie suspectată pe baza unor colonii de răspândite neregulat, pigmentate în mod natural și cu un caracter de oxidază pozitiv.
În studiul nostru, în scopul cercetării coloniile oxidază pozitiv au fost izolate și identificate, pentru a se evalua dacă tulpinile de Pseudomonas aeruginosa se dezvoltă pe acest mediu cromogen specific Enterobacteriaceaelor.
În general, aspectul și culoarea diferitelor colonii de bacterii nonfermentative observate la bacteriile oxidază pozitiv este de brun roșcat, majoritatea tulpinilor de P. aeruginosa din studiul nostru a prezentat aceast aspect la 24 h de la inoculare, reflectând astfel prezența legată de piocianină/pigmentare. (fig.6.26) (Te-Din Huang și colab., 2010)
Brilliance ESBL agar-agar s-a dovedit a fi util pentru detectarea tulpinilor ESBL produse de P.aeruginosa, obtinandu-se un rezultat în 24 de ore, poate fi o metodă de screening ce permite excluderea rapidă a pacienților care nu transportă bacterii producătoare de ESBL.
Fig. 6.26 Cultură de Pseudomonas aeruginosa pe mediu Brilliance ESBL Agar la 24 h de la incubare
Fig. 6.26 Culture of Pseudomonas aeruginosa Brilliance ESBL agar medium at 24 hours of incubation
Testul de sinergie între două comprimate pentru detectarea ESBL
Pe o placă cu mediu Mueller-Hinton am inoculat tulpina de testat (cultură de 24h, însămânțată pe placă prin tehnica tamponului), am aplicat un disc cu amoxicilină+acid clavulanic în mijlocul plăcii, de o parte și de alta a discului cu AMC, la o distanță de 20 – 25 de mm am aplicat un disc cu ceftazidim și de cealaltă parte un disc cu cefotaxim. Păcile au fost incubate peste noapte la 37 0C. Producerea de ESBL este confirmată dacă diametrul zonei de inhibiție a cefalosporinelor este extins spre zona clavulanatului ( Ffig.6.27).
Fig. 6.27 Testul de sinergie între două comprimate pentru detectarea ESBL
Fig. 6.27 Synergy between the two tablets test for detecting ESBL
Metoda discurilor
Această metodă presupune folosirea unor discuri de cefalosporine simple și a unor discuri de cefalosporine potențate cu acid clavulanic. Pentru interpretare se compară diferența dintre diametrele zonelor de inhibiție. Creșterea diametrului de inhibiție de >5 mm în prezența clavulanatului indică producția de ESBL (fig. 6.28) Aceste teste sunt ieftine și nu necesită o spațiere exactă a discurilor.
Fig. 6.28 Metoda discurilor cu cefalosporine simple și
potențate cu acid clavulanic
Fig 6.28 Cephalosporins simple method discs and
enhanced with clavulanic acid
6.2.1.2.Identificarea tulpinilor producătoare de MBL
Metalo-betalactamazele reprezintă beta-lactamazele din clasa B, care au 4 atomi de zinc (Ambler R.,1980). Emergența MBL accentuează nevoia controlului riguros al prescrierii carbapenemelor, în timp ce creșterea rezistenței la cefalosporine și fluorochinolone impune utilizarea carbapenemelor.
Pe o placă cu agar MH se inoculează suspensie din cultură de 24 h, se face diluție 0,5 MF, apoi la o distanță convenabilă (15 mm – 20 mm) se vor aplica microdiscurile de testat, fiind o metodă prin antibiogramă difuzimetrică.
Cu ajutorul acestor metode se testează tulpinile care prezintă rezistență la carbapeneme (fig.29).
Fig. 6.29 Tulpină de P. aeruginosa cu rezistență la carbapeneme.
Fig. 6.29 Strain of P. aeruginosa resistance to carbapenems
Metalo-β-lactamazele constitue o amenințare clinică serioasă, deoarece: compromit eficiența carbapenemelor, antibiotice cu spectru larg, folosite de obicei ca ultimă resursă terapeutică, ele sunt rezistente la acțiunea inhibitorilor de β-lactamază, sunt codificate de un aparat genetic foarte mobil, de aceea o identificare timpurie a bacteriilor care produc acest tip de enzime este vitală, pentru identificarea și determinarea fenotipică a izolatelor potențial producătoare de MBL se folosesc în special teste rapide, medii de cultură cromogene, benzile Etest MBL, dar și metode bazate pe antibiograma difuzimetrică.
Brilliance CRE AGAR
CRE Agar (depistarea precoce a enterobacteriaceelor rezistente la carbapeneme) presupune o identificarea cromogenică prezumtivă a tulpinilor izolate rezistente la carbapeneme, direct din prelevatele clinice, timpul necesar de testare fiind de 18 ore.
Brilliance CRE Agar ajută la detectarea pacienților colonizați-CRE. Mediul conține o cantitate de carbapeneme la un nivel modificat ce este recomandat atât de EUCAST cât și de CLSI, asigurând rezultate fiabile, în urma testării lui pe o largă varietate de organisme rezistente la carbapeneme, inclusiv New Delhi Mettalo β-lactamază -1 (NDM-1).
Plăcile sunt incubate la 37 ° C și asigură o sensibilitate și specificitate ridicată cu rezultate disponibile în doar 18-24 de ore (fig.6.30).
Fig.6.30 Brilliance Agar CRE inoculat direct cu probă de urină
Fig. 6.30 Brilliance CRE Agar inoculated directly with the urine sample
Brilliance Agar CRE poate fi inoculat direct din tampoane rectale de screening, probe de fecale sau dintr-o colonie izolată preparată sub formă de suspensie lichidă, 0,5 McFarland turbiditate.
Mediul trebuie lăsat să se încălzească la temperatura camerei înainte de inoculare. Se incubează timp de 18-24 ore la 37 ° C, plăcile negative trebuie re-incubate timp de încă 24 de ore, coloniile roz pal sunt prezumtiv pozitive pentru rezistența la carbapeneme, coloniile cafenii cu un halogen maro prin reacția triptofan dezaminazei (TDA) sunt considerate rezistente la carbapeneme și pot produce enzime de tip MBL.
Rezultatele noastre indică faptul că Brilliance CRE Agar permite creșterea și dezvoltarea tulpinilor rezistente la carbapeneme, cu limite de detecție scăzute și poate reprezenta un mediu util de screening pentru bacteriile non-fermentative G – rezistente la carbapeneme.
Metoda discului combinat Imipenem – EDTA pentru metalo-β-lactamaze (MBL)
Metalo-β-lactamazele, având Zn2+ în centrul active, sunt inhibate de chelatorii de metale precum acidul etilendiamintetraacetic (EDTA) (Yong și col., 2002).S-au testat doar tulpinile rezistente la imipenem.
Materiale folosite:
Tulpinile de testat în cultură pură;
Plăci cu agar Mueller-Hinton (Oxoid, Marea Britanie)
Discuri cu imipenem de 10 µg (Oxoid, Marea Britanie)
Pulbere de EDTA;
Ser fiziologic steril;
Tampoane de recoltare sterile;
Standard de 0,5 McFarland.
Protocol de lucru:
S-a preparat o soluție de EDTA dizolvând 186,1 g de EDTA în 1000 ml de apă distilată, s-a ajustat pH la 8 cu NaOH și s-a sterilizat-o la autoclave la 121℃, 15 minute;
Tulpina de testat s-a însămânțat pe agar Mueller-Hinton, utlizand aceeași tehnica pentru antibiograma difuzimetrică;
S-a plasat la distanță convenabilă 2 discuri de imipenem 10 µg, peste unul din ele s-a adăugat 5 µl din soluția de EDTA;
După incubarea peste 37℃ s-a măsurat și comparat diametrele zonelor de inhibiție apărute în jurul celor 2 discuri. Criteriile de pozitivitate au fost următoarele: creșterea diametrului zonei de inhibiție în prezența EDTA cu cel puțin 5 mm ( fig.6.31.)
Fig.6.31 Metoda discului combinat Imipenem – EDTA pentru screening MBL
Fig. 6.31 Combined disc method imipenem – EDTA screening for MBL
Această metodă se mai poate realiza și cu ajutorul discului de IMP + EDTA ea presupune compararea diametrelor zonelor de inhibiție date de discul simplu de IMP și de cel care conține un inhibitor MBL respectiv EDTA (fig.6.32)
Fig.6.32 Cultură de P. aeruginosa testată cu discul simplu de IMP și de cel care conține un inhibitor MBL respectiv EDTA
Fig. 6.32 Culture of P. aeruginosa tested IMP and simple disc containing an inhibitor of the MBL that EDTA
E-test MBL
Etest-MBL constă din benzi de plastic sau hârtie impregnate cu un gradient de concentrații de imipenem la un capăt și imipenem+EDTA la celălalt (fig.6.33). Testul se bazează pe inhibiția MBL de către chelatorul de zinc EDTA. Testul este considerat pozitiv dacă raportul dintre imipenem si imipenem + EDTA este ≥ 5 (Walsh și col., 2002)
Fig. 6.33 E-test MBL
Fig. 6.33 E-test MBL
6.2.2. Rezultate și discuții
Utilizarea mediului de cultură Briliance ESBL a permis creșterea și multiplicarea a 68% din tulpinile de Pseudomonas aeruginosa de origine umană și 100% tulpinile de origine animală.
În urma testului de sinergie între două comprimate pentru detectarea ESBL lotul de tulpini testat nu a prezentat zone de inhibiție sugestive/relevante pentru identificarea tulpinilor de ESBL, respectiv creșterea zonei de inhibiție în jurul antibioticului potențat cu inhibitor β-lactamază.
Prin metoda discurilor combinate (Oxoid/Becton Dickinson – "Combination Discs" și Mast "MAST DD") s-a evidențiat o creștere a diametrului de inhibiție cu>5 mm în prezența clavulanatului, ceea ce indică prezența de ESBL.
Metoda discului combinat imipenem-EDTA pentru depistarea metalo-β-lactamazelor, aplicată doar pe tulpinile care au fost rezistente la imipenem ( 52 tulpini de origine umană și 37 de origine animală) a surprins prin faptul că toate aceste tulpini elaborează enzime metalo-betalactamaze.
Pentru susținerea rezultatului, aceleași tulpini de Pseudomonas aeruginosa, au fost testate și cu E-test MBL. Rezultatele au confirmat faptul că cele 89 tulpini de Pseudomonas aeruginosa, testate pentru metalo-betalactamaze, au fost pozitive la acest test
Carbapenemele (imipenem, meropenem, ertapenem și doripenem) sunt antibiotice de neprețuit în tratamentul infecțiilor cu bacterii gram-negative multi-rezistente. Apariția și difuzarea de bacterii rezistente la carbapeneme reprezintă o amenințare considerabilă pentru ingrijirea pacienților, depistarea precoce a tulpinilor de P. aeruginosa rezistente la carbapeneme, va permite punerea în aplicare mai rapid a unor strategii adecvate pentru tratarea pacienților și a limita răspândirea acestor agenți patogeni.
6.2.3. Concluzii parțiale
Testului de sinergie între două comprimate este o metodă ieftină, dar interpretarea este dificilă.
Brilliance Agar CRE permite o depistare precoce a tulpinilor de P. aeruginosa rezistente la carbapeneme ce pot produce enzime de tip MBL, de aceea poate fi folosită ca și metodă rapidă de identificare a tulpinilor producătoare de MBL
Pentru identificarea tulpinilor producătoare de MBL cu ajutorul metodei discurilor combinate s-a folosit 2 tipuri de testare cu același principiu, respectiv folosirea chelatorul de zinc EDTA pentru inhibiția MBL, recomandăm folosirea variantei 2 deoarece dicurile se pot achiziționa impregnate deja cu EDTA ceea ce rezultă o scurtare a timpului de execuție și eliminarea unor posibile erori de concentrație a EDTA -ului, o concentrație mai mare de EDTA poate duce la rezultate fals pozitive.
Pentru a se verifica acuratețea mediului cromogen CRE s-a facut testarea tulpinilor în paralel cu celelalte metode pentru a se urmări specificitatea testelor și pentru a verifica prezența unor posibile erori, în studiul nostru tulpinile inoculate pe acest mediu care au fost pozitive au răspuns tot pozitiv și la celelalte testări
Rezultatele noastre indică faptul că Brilliance CRE Agar permite creșterea și dezvoltarea tulpinilor rezistente la carbapeneme, cu limite de detecție scăzute și poate reprezenta un mediu util de screening pentru bacteriile non-fermentative G – rezistente la carbapeneme.
7. SUPRAVEGHEREA EPIDEMIOLOGICĂ A TULPINILOR DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA
EPIDEMIOLOGICAL SURVEILLANCE METHODS PSEUDOMONAS AERUGINOSA INFECTION
Supravegherea epidemiologică este o activitate sistematică, de continuă colectare, analiză, prelucrare și interpretare a datelor necesare pentru identificarea și cunoașterea frecvenței infecțiilor nosocomiale precum și pentru determinarea factorilor de risc. Toate datele obținute se utilizează pentru elaborarea, planificarea și implementarea acțiunilor de prevenire a transmiterii microorganismelor multidrogrezistente.
Tipizarea prin diferite metode se practică la toate grupările sau speciile de interes epidemiologic major. Cele mai utilizate metode de tipizare sunt: tipizarea serologică, tipizarea biochimică (biotiparea), tipizarea cu bacteriofagi (lizotiparea), tipizarea cu antibiotice (antibiotiparea).
Antibiotiparea este o metodă sensibilă bazată pe stabilirea filiațiunii tulpinilor microbiene testate dintr-un focar (areal). Metodele moleculare sunt utilizate tot mai frecvent în supravegherea epidemiologică, bazându-se pe tipizarea plasmidică, tipizarea ribotipului, detectarea tipului de PFGE (pulsed field gel electrophoresis= electroforeză în camp pulsatil).
7.1. ANTIBIOTIPAREA TULPINILOR DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA DE ORIGINE UMANĂ ȘI ANIMALĂ
Toate izolatele au fost testate pentru a se stabili sensibilitate antimicrobiană cu ajutorul metodei Kirby-Bauer pe Mueller-Hinton agar, rezultatele au fost interpretate conform Institutului de Standarde Clinice și de Laborator 2015 (CLSI).
Antibiotiparea izolatelor s-a realizat cu programul UPGMA/ Quantity One Software (Bio – Rad Laboratories, SUA), lotul studiat a fost împărțit 2 grupuri, primul cuprinzând 125 tulpini de origine umană și 57 tulpini de origine animală. Conform acestor rezultate; 57 de tulpini de origine animală izolate au fost colectate în 4 grupe principale (A1-A4) pe bază de 70% similitudini. Pe de altă parte, 125 izolatele umane au fost colectate în 7 grupe principale (H1-H7) la 70% similitudine.
7.1.1. Material și metodă
UPGMA – Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean (construcție filogenetică) această comandă este utilizată pentru a construi un copac UPGMA. Această metodă de luare a arborelui presupune că rata de evoluție a rămas constantă de-a lungul istoriei evolutive a taxonilor incluși. Prin urmare, ea produce un copac cu rădăcini. Se utilizează acest program pentru a se crea dendrograme de la (a) seturi de variabile, (b) matricea de similaritate sau (c) matricea de distanță.
Software-ul calculează matricea de similaritate (numai pentru opțiunea a), se transformă în similaritate și distanțele.
Coeficienții de similitudine se fac prin grupare folosind metoda neponderată, formând pereche de grup cu ajutorul mediei aritmetice (UPGMA).
Pentru opțiunile (b) și (c) construcția de dendrograme cu similitudine trebuie să fie implementate matricele de similaritate sau distanța de matrice.
Este cel mai simplu algoritm de construcție a unui arbore filogenetic, fiind similar algoritmilor aglomerativi de clustering, calculează distanțele dintre clustere folosind media distanțelor
O colecție de 125 izolate de P. aeruginosa au fost recoltate de la pacientii internați într-un spitalul clinic din și 57 de izolate de origine animala în Laboratorul de Microbiologie al FMV Iasi pe parcursul anilor 2013 – 2015.
Toate tulpinile au fost izolate din procese patologice și doar acestea au fost incluse în studiu. Identificarea și confirmarea bacteriană a fost efectuată prin teste biochimice standard folosindu-se RapID NF Plus (Oxoid) si API 20 NE. Identificarea s-a bazat și pe morfologia coloniilor, colorația Gram, producția de pigment și creșterea la 42ᵒC. Izolatele identificate ca fiind rezistente la carbapeneme au fost investigate in conformitate cu obiectivele studiului.
7.1.2. Rezultate și discuții
Antibiotiparea grupului de tulpini de origine umană
Puterea discriminatorie (D) este probabilitatea medie ca sistemul de tastare va atribui un tip diferit de cele două tulpini care nu au legătură în eșantion aleatoriu din populația microbiană a unui anumit taxon.
Acest program a fost creat pentru a ajuta la calcularea acestui parametru.
Acolo unde D este indicele de discriminare, N este numarul de tulpini testate, S este numărul de diferite tipuri și xj – numărul de tulpini care aparțin tipului jth, presupunând că tulpinile vor fi clasificate în categorii care se exclud reciproc.
Astfel, o valoare de 1.0 a D-ului ar indica faptul ca o metoda de tipizare a fost capabilă să distingă fiecare membru al populației tulpinilor dintre toți membrii ai acelei populații.
Pe de alta parte, un indice de 0.0 ar indica faptul că toți membrii populației au fost identici. Un indice de 0.5 ar însemna că în cazul în care o tulpină a fost aleasă la întamplare dintr-o populație de tulpini, atunci ar trebui să existe o probabilitate de 50% ca următoarea tulpină aleasă randomizat să fie imposibil de distins față de prima. (Hunter P. 1990)
Tabelul 7.1
Factorul de discriminare pentru loturile de origine umană
Table 7.1
Discrimination factor for lots of human origin
H – 1
Fig. 7.1 Antibiotiparea grupului H – 1 de P. aeruginosa de origine umană
Fig. 7.1 Antibiotyping Group H – 1 P. aeruginosa of human origin
Grupul 1 de origine umană este alcătuit din 19 tulpini de P. aeruginosa izolate din aspirate bronșice. În urma introducerii rezultatelor la antibiogramă în softul UPGMA pentru a se efectua antibiotiparea sau tipizarea tulpinilor pentru a se verifica existența unui tipar și existența similitudinii din acel tipar a rezultat dendograma din fig. NR, de unde rezultă ca acest grup este format din 12 tipuri de profile, punându-se în evidență 2 clustere și 4 profile de tip unic.
Primul cluster este alcătuit din H1 – AD1 și H1 – AD2, respectiv tulpinile 96 și 78, ambele tulpini au fost izolate de la pacienți cu o patologie a aparatului respirator, având în istoricul medicației administrarea pe o perioadă lungă de timp ( peste 21 de zile ) a antibioticelor. Gradul de similitudine în acest cluster este de 0,80, evidențiind o asociere înaltă a profilurilor identificate la antibiogramă. Al 2 lea cluster, cel ce predomină grupul, este format din 6 tipuri de profile, cu variații ale coeficientului de similitudine, de la 0,75 la 0,92. Similar primului cluster pacienții au în istoric administrarea antibioticelor ca și terapie.
H – 2
Fig.7.2 Antibiotiparea grupului H – 2 de P. aeruginosa de origine umană
Fig. 7.2 Antibiotyping Group H – 2 P. aeruginosa of human origin
Tulpinile analizate provin din aspirate gastrice, ele au fost supuse testării aceluiaș panel de antibiotice, respectiv: IPM, MEM, TZP, CAZ, FEP, CIP, AK, GN, TOB, ATM, PB, PIP și TAZ. Acest grup este alcătuit din 10 tipuri de profile din care 3 sunt de tip unic. În interiorul dendogramei se poate observa existența unui singur cluster ce cuprinde 7 tipuri de profile cu grade diferite de similitudine, de la 0,72 la 0,85. Gradul de similitudine a clusterului este de 0,72, depășind astfel pragul de 0,70, această valoare indică faptul că metoda de tipizare a fost capabilă să distingă fiecare tulpină din acest cluster.
H – 3
Fig. 7.3 Antibiotiparea grupului H – 3 de P. aeruginosa de origine umană
Fig. 7.3 Antibiotyping Group H – 3 P. aeruginosa of human origin
Izolatele analizate provin din lichide peritoneale. Acest grup cuprinde un singur cluster cu 5 tipuri de profile și 3 de tip unic. Clusterul are 0,74 gradul de similitudine, în interiorul lui ajungându-se și până la 0,83 la tulpinile H4 – AD1 și H4 – AD2, ambele izolate prezentând rezistență la MEM, patologiile de fond și istoricul antibioterapiei ale pacienților sunt diferite.
H – 4
Fig. 7.4 Antibiotiparea grupului H – 4 de P. aeruginosa de origine umană
Fig. 7.4 Antibiotyping Group H – 4 P. aeruginosa of human origin
Grupul 4 este format din tulpini ce provin din probe de spută. Dendograma pune în evidență 2 clustere cu 13 tipuri de profile, din care 3 sunt de tip unic.
Primul cluster are grad de similitudine de 0,74, este format din 3 tipuri de profile, cu grade de similitudine de la 0,74 la 0,79, respectiv la tulpinile 47 și 36, ambele prezentând rezistență înaltă la cele 13 antibiotice testate, fiind sensibile doar la 4 antibiotice.
Cel de-al 2 lea cluster are ca și coeficient de similitudine 0,71, similar primului cluster întâlnim valori diferite ale similitudinii între profile, de la 0,71 la 0,90, valoarea maximă fiind la H4 – AE5 și H4 – AE 6, aceste tulpini având același profil de sensibilitate la antibioticele testate.
H – 5
Fig. 7.5 Antibiotiparea grupului H – 5 de P. aeruginosa de origine umană
Fig. 7.5 Antibiotyping Group H – 5 P. aeruginosa of human origin
Grupul 5 cuprinde izolate de P. aeruginosa recoltate din probe de urină. Dendograma evidențiază 2 clustere, 15 tipuri de profile din care 2 sunt de tip unic.
Primul cluster este format din 4 tipuri de profile, H5 – AB3 și H5 – AB4, respectiv tulpinile 106 și 104 au un coeficient de similitudine de 0,98, în urma testării la antibiotice profilul de rezistență și de sensibilitate al acestor tulpini este identic.
Al 2 lea cluster are grad de similitudine de 0,77, cuprinde 10 tipuri de profile din care H5 – AC9 și H5 – AC10 au 0,98 coeficient de similitudine, fapt explicat prin identitatea de 100 % al rezultatelor la testarea panelului de antibiotice.
H – 6
Fig. 7.6 Antibiotiparea grupului H – 6 de P. aeruginosa de origine umană
Fig. 7.6 Antibiotyping Group H – 6 P. aeruginosa of human origin
Grupul 6 este alcătuit din izolate de P. aeruginosa izolate din secreții auriculare. Dendograma evidențiază 25 tipuri de profile împărțite în 2 clustere și 2 profile de de tip unic.
Primul cluster are 0,94 coeficientul de similitudine, cuprinde 3 tipuri de profile, H6 – AC2 și H6 – AC3 depășește coeficientul de 0,94, aceste tulpini sunt rezistente la TZP, CAZ și FEP. Al 2 lea cluster are 0,75 coeficientul de similitudine, este alcătuit din 20 de tipuri de profile, valorile coeficientului de similitudine variază de la 0,75 la 0,98, depășind cu mult pragul de 0,70.
H – 7
Fig. 7.7 Antibiotiparea grupului H – 7 de P. aeruginosa de origine umană
Fig. 7.7 Antibiotyping Group H – 7 P. aeruginosa of human origin
Ultimul grup de origine umană supus analizei cu ajutorul softului UPGMA este format din tulpini de P. aeruginosa izolate din secrețiile purulente post – operatorii.
În dendogramă se poate observa însumarea a 26 de tipuri de profile reprezentate prin 4 clustere și 2 profile de tip unic.
Primul cluster este format din 4 tipuri de profile diferite, având 0,78 coeficientul de similitudine, în interiorul clusterului H7 – AB3 reprezentat de tulpina 125 și H7 – AB4 reprezentat de tulpina 111 au peste 0,90 gradul de similitudine. Tulpinile prezintă același profil de rezistență la panelul de antibiotice testat.
Cel de-al 2 lea cluster are 0,75 coeficient de similitudine, dar ca și în primul cluster întâlnim grade diferite de similitudine în interiorul lui, de până la 0,97, între H7 – AD4 și H7 – AD5, acestea fiind tulpinile 54 și 41, profilele lor fiind de 100 % identice în urma testării a celor 13 antibiotice, patologiile de fond și istoricul administrării de antibiotice fiind diferite, doar unui singur pacient i s-a mai administrat antibiotice.
Al 3 lea cluster din acest grup este format din 3 profile diferite având grad de similitudine de 0,81, tulpinile prezintă diferențe minore la testarea antibioticelor. Ultimul cluster are 0,82 coeficient de similitudine, fiind format din 12 tipuri de profile cu diferite grade de similitudine, de la 0,82 și până la 0,98. Toate tipurile de profile sunt reprezentate de tulpini cu sensibilitate la toate cele 13 antibiotice testate.
Antibiotiparea tulpinilor de origine animală
Tabelul 7.2
Factorul de discriminare pentru loturile de origine animală
Table 7.2
Discrimination factor for lots of animal origin
A – 1
Fig. 7.8 Antibiotiparea grupului A – 1 de P. aeruginosa de origine animală
Fig. 7.8 Antibiotyping Group A – 1 P. aeruginosa of animal origin
Lotul de 57 de tulpini de P. aeruginosa de origine animală a fost împărțit în 4 grupuri de analiză, împărțirea a fost efectuată în baza provenienței izolatului, astfel primul grup de tulpini este izolat din secețiile otice ale animalelor de companie.
În urma analizei au rezultat 17 tipuri de profile formând 2 clustere și un profil de tip unic.
Primul cluster este format din 6 tipuri de profile cu diferite coeficiente de similitudine, de la 0,81 și până la 0,96, ultima valoare fiind atribuită profilelor A1 – B5 și A1 – B6, fiind vorba de tulpinile 134 și 133, ele prezintă cel mai înalt grad de similitudine din acest cluster cât și din grupul total de analiză.
Al 2 lea cluster este alcătuit din 9 tipuri de profile și în acest cluster coeficientele de similitudine variază de la 0,72 pănă la 0,92, această similitudine o întâlnim la profilurile A1 – C7 și A1 – C8.
A – 2
Fig. 7.9 Antibiotiparea grupului A – 2 de P. aeruginosa de origine animală
Fig. 7.9 Antibiotyping Group A – 2 P. aeruginosa of animal origin
Grupul 2 supus antibiotipării este format din tulpini de P. aeruginosa de origine animală izolate din abcesele perianale de la animalele de companie.
Dendograma pune în evidență 23 tipuri de profile, din care unul singur este de tip unic, profilele sunt împarțite în 2 clustere.
Primul cluster este alcătuit din 2 profile ce au coeficient de înrudire de 0,84.
Cel de-al 2 lea cluster este format din 19 tipuri de profile, în interiorul clusterului întâlnim profile cu coeficient de similitudine de aproape 100 %, respectiv profilele A2 – AC13 și A2 – AC14 cu un coeficient de similitudine de 0,99.
A – 3
Fig. 7.10 Antibiotiparea grupului A – 3 de P. aeruginosa de origine animală
Fig. 7.10 Antibiotyping Group A – 3 P. aeruginosa of animal origin
Acest grup este alcătuit din tulpini de P. aeruginosa izolate de la animalele de companie ce prezentau sepricemie. În dendogramă sunt evidențiate 8 tipuri care care formează 2 clustere.
Primul cluster este format din 2 tipuri de profile cu un coeficient de similitudine de 0,77 și cel de-al 2 lea cluster este format din 6 tipuri de profile având coeficient de similitudine de 0,71, profilul cu coeficientul cel mai mare de similitudine l-a prezentat grupul de profile A3 – AB4 cu profilul A3 – AB5 și A3 – AB6 el fiind de 0,84.
A – 4
Fig. 7.11 Antibiotiparea grupului A – 4 de P. aeruginosa de origine animală
Fig. 7.11 Antibiotyping Group A – 4 P. aeruginosa of animal origin
Ultimul grup supus tipizării pe baza rezultatelor la antibiotice este format din tulpini de P. aeruginosa de origine animală zolate din secreții oculare.
Dendograma este formată din 7 tipuri de profile, din care doar unul este de tip unic și un cluster alcătuit din 3 tipuri de profile, având grad de similitudine de 0,92, în interiorul clusterului valoarea coeficientului ajunge la 0,99 la profilele A4 – AB2 și A4 – AB3.
7.1.3. Concluzii parțiale
Antibiotiparea este o metodă prin care se identifică un tipar dintr-un lot total analizat, cu ajutorul lui se poate urmări într-un circuit închis proveniența tulpinilor izolate (ferme, spitale etc).
Analiza în acest studiu s-a realizat cu ajutorul rezultatelor la antibiogramă, datele au fost înregistrate în soft – ul (UPGMA).
Tot lotul de tulpini a fost testat cu aceleași antibiotice.
Este important ca antibioticele să fie identice, dacă se schimbă un singur antibiotic la o tulpină apar erori de similitudine.
Valorile fixe sunt antibioticele și cele variabile fiind rezultatele analizei.
Această metodă este economă și necesită doar achiția soft – ului.
Antibiotiparea poate fi utilizată ca metodă de supraveghere epidemiologică.
7.2. ANALIZA GENETICĂ A TULPINILOR DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA DE ORIGINE UMANĂ ȘI ANIMALĂ PRIN RAPD
Pentru testarea genetică a tuturor izolatelor de Pseudomonas aeruginosa, identificate în studiul nostru, s-a folosit metoda RAPD, prin care se poate pune în evidență înrudirea genetică.
7.2.1. Material și metodă
Efectuarea RAPD – ului a fost de a investiga variația genotipică a tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa izolate de la om și de la animale utilizând metoda aleatorie de ADN polimorfic Amplified (RAPD).
Tehnica RAPD – PCR (Random Amplified Polymorphic DNA) a fost descoperită de Williams și colaboratorii în anul 1990. Metoda este rapidă, relativ economă și bine adaptată pentru obținerea unei amprente genetice neradioactive (Welsh și Mcclelland, 1990). Tehnica RAPD se bazează pe determinarea polimorfismului la nivel alelic, în ceea ce privește producerea unor produși de amplificare sau lipsa lor, în urma utilizării unui primer oligonucleotidic, arbitrar, într-o poziție care să-i permită realizarea amplificării (Carșai și colab., 2009).
Progresele în domeniul tehnicilor de biologie moleculară au furnizat o adevarata baza pentru descoperirea practica a unui număr nelimitat de markeri a ADN-ului. Utilitatea markerilor de ADN bază este în general determinat de tehnologia utilizată pentru a dezvălui polimorfismul bazat pe ADN. În prezent, restricția polimorfismul lungimii fragmentelor (RFLP) a fost alegerea pentru multe specii de a măsura diversitatea genetica și a construi o harta genetica care pune in evidenta legatura dintre ele, un test RFLP detectează polimorfismul ADN prin digestie cu enzime de restricție.
Reacțiile RAPD sunt reacțiile PCR, dar utilizează un singur primer, care s-ar putea atașa în mod aleatoriu în mai multe secvențe de ADN în genomul bacterian și a crea modele de electroforeză repetitive, care este utilizat pentru diferențierea genotipică. Dacă o mutație a avut loc în ADN-ul șablon care a fost anterior complementar primerului, un produs PCR nu va fi produs, rezultând într-un alt model de segmente de ADN amplificate pe gel. Cealaltă diferență între această metodă și PCR este utilizarea a două temperaturi diferite de tratament termic.
Se foloseste un singur primer M13 (5’-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3’) respectându-se literatura de specialitate Coban și colab., 2009 și Gulhan și colab., 2015.
Similaritatea benzilor RAPD au fost determinate în baza Dice similarity coefficient. Pentru a crea dendogramele și a se evidenția înrudirea genetică dintre tulpinile de Pseudomonas aeruginosa izolate de la oameni și cu cele de la animale, am folosit programul “Unweighted Pair Group Method cu Arithmetic Averages (UPGMA)” Quantitiy One & Software.
Etape de lucru RAPD:
Extragerea ADN – ului
Determinarea cantității de ADN
Reacția PCR (se folosește un singur primer)
Amplificarea ADN – ului
Separarea segmentelor de ADN în gelul de electroforeză
Vizualizarea segmentelor de ADN folosind bromura de etidium în transiluminatorul UV
Fiecare gel de electoforeză va fi analizat urmărind prezența sau absența polimorfismului de fragmente de ADN, datorită naturii RAPD, doar așa se va putea evalua fiecare gel. Se vor analiza și lua în considerare doar profilele de benzi clare, altfel coeficientul de înrudire/similitudine va fi greu de stabilit.
Similitudinea/înrudirea din matricea de ADN va fi analizată prin metoda aritmetică UPGMA folosind SAHN (Sequential, agglomerative, hierarchical and nonoverlapping), module de clustere.
Metodele de grupare combinaționale ale lui Sahn pot fi împărțite în mod logic în două clase. Metodele d-Sahn caută distanțe minime și maxime dintre clustere verificând aomogenitatea. Metodele lui Sahn clustering sunt compatibile cu binecunoscuta formula a lui Lance & Williams (1966).
Rezultate și discuții
RAPD -ul este o tehnică de biologie moleculară ce are la bazată PCR -ul. În ultimul deceniu analiza RAPD fost una dintre tehnicile moleculare cel mai frecvent utilizate pentru a dezvolta markeri ADN. RAPD este o modificare a PCR – ului, în care un singur primer este capabil să se alipească la mai multe locatii din întreagul genom ce poate produce un spectru de produse de amplificare, care sunt caracteristice unui șablon de ADN.
În studiul de față, am găsit tehnica RAPD-PCR fiind un instrument util pentru studierea variației genetice a tulpinilor P. aeruginosa. Acesta metodă are un cost redus, este rapidă, fiind o metodă genotipică cu o putere de discriminare ridicată. Rezultatele pot ajuta la aflarea originii infecției cauzate de acest organism pentru a se realiza un control al bacteriilor împiedicându-le astfel să colonizarea și transmiterea lor.
Ințelegerea distribuției agentului patogen și înrudirea este esențială pentru determinarea epidemiologiei infecțiilor nosocomiale și sprijinirea în proiectarea metodelor raționale de control al agentului patogen. PCR-genotipare moleculară a P. aeruginosa este de o importanță majoră în elucidarea rutelor de transport, care în comparație cu metodele de fenotipare sunt mai puțin afectați de factorii de mediu. În general, metodele moleculare detin o putere mai mare de discriminare și de reproductibilitate decât testele fenotipice, datorită capacității lor de a detecta diferențele minore ale genomului pentru unele specii.
Tulpinile analizate cu tehnica RAPD prezintă un grad ridicat de înrudire genetică, ceea ce poate concluziona că tulpinile provin din același mediu și informatia genetică se transimite de la o tulpina la altă.
Genotiparea grupului de tulpini de origine umană
Fig. 7.12 Vizualizarea benzilor de ADN din grupul 1 de origine umană
Fig. 7.12 Viewing Group 1 DNA bands of human origin
Fig. 7.13 Genotiparea grupului H – 1 de P. aeruginosa de origine umană
Fig 7.13 Genotyping Group H – 1 P. aeruginosa of human origin
Profilul molecular de înrudire genetică a primului grup analizat este format din 16 tipuri de profile, notate în ordin cronologic și alfabetic, primul profil identificat fiind H1 – RA, H fiind litera grupului total de origine umană (H – human), a 2 a literă reprezentând prescurtarea metodei moleculare RAPD (R) și ultima literă fiind atribuită primului profil, următoarele profile fiind notate cu B, C șamd.
Numerotarea cronologică este însușită în interiorul profilelor, determinând de câte ori a fost identificat respectivul profil. Grupul 1 este alcătuit din 3 clustere, fiecare cluster având coeficient diferit de înrudire genetică, cel mai mare grad este atribuit primului cluster, H1 – RD1, H1 – RD2 și H1 – RD3, respectiv tulpinile 115, 78 și 53, înrudirea profilelor din interiorul lui fiind de 80% – 85 %.
Relaționarea între tulpinile 115 și 53 a fost identificată și la antibiotipare, cele două tulpini aparținând aceluiași cluster. Tulpinile din acest cluster au fost izolate din aspirate bronșice, pacienții având în comun patologiile de fond, respectiv Fibroză chistică. Profilele de rezistență și de sensibilitate la panelul de antibiotice testat sunt total diferite.
Al 2 lea cluster are coeficient de similitudine de 71%, H1 – RG1 și H1 – RG2, reprezentat de tulpinile 59 și 52, similar primului cluster cele două tulpini la antibiotipare au făcut parte din același cluster, putem concluziona astfel că metoda de antibiotipare poate fi o medodă eficientă pentru supraveghere epidemiologică. Ultimul cluster are un grad de întrudire genetică de la 75% la 84%, acest cluster predomină în grupul analizat.
H – 2
Fig. 7.14Vizualizarea benzilor de ADN din grupul 2 de origine umană
Fig. 7.14 Viewing Group 2 DNA bands of human origin
Fig. 7.15 Genotiparea grupului H – 2 de P. aeruginosa de origine umană
Fig 7.15 Genotyping Group H – 2 P. aeruginosa of human origin
Grupul 2 este format din tulpini de P. aeruginosa izolate din aspirate gastrice. În urma RAPD – ului s-a identificat în interiorul lui 14 tipuri de profile genetice din care 4 sunt de tip unic.
Profilele au fost împarțite în două clustere cu coeficient de înrudire de până la 85%. Primul cluster cuprinde 3 tipuri de profile cu grad de înrudire genetic de 84%.
Cu predominanță în grup este cel de-al 2 lea cluster, cu coeficient de înrudire de 75%, clusterul este format din 7 tipuri de profile, un grad înalt de înrudire este reprezentat de perechea de profile H2 – RF6 și H2 – RF7, fiind vorba de tulpinile 23 și 12, ambilor pacienți li s-a mai administrat antibiotice, patologiile de fond sunt diferite, aproximativ similar fiind doar profilul de sensibilitate la panelul de antibiotice testat.
H – 3
Fig. 7.16 Vizualizarea benzilor de ADN din grupul 3 de origine umană
Fig. 7.16 Viewing Group 3 DNA bands of human origin
Fig. 7.17 Genotiparea grupului H – 3 de P. aeruginosa de origine umană
Fig 7.17 Genotyping Group H – 3 P. aeruginosa of human origin
Grupul 3 analizat este format din tulpini de P. aeruginosa izolate din lichide pleurale, dendograma evidențiază 2 clustere.
Primul având coeficient de similitudine de 77% și este format din 2 tipuri de profile. Al 2 lea cluster ce predomină în grup are 4 tipuri de profile, astfel grupul are 10 tipuri de profile din care 4 sunt de tip unic.
Înrudirea genetică ce depășește procentul de 90% o întâlnim între profilele H3 – RF3 și H3 – RF4, fiind reprezentate de tulpinile 90 și respectiv 87.
Tulpinile sunt izolate de la pacienți cu patologii de fond diferite, doar unul din ei are în istoric administrarea de antibiotice și totodată apartenența pacienților este diferită (urban/rural), la antibiotipare cele două tulpini au prezentat un coeficient de similitudine de 0,78, similitudine fiind acum dovedită prin înrudirea genetică de 90%
H – 4
Fig. 7.18 Vizualizarea benzilor de ADN din grupul 4 de origine umană
Fig. 7.18 Viewing Group 4 DNA bands of human origin
Fig. 7.19 Genotiparea grupului H – 4 de P. aeruginosa de origine umană
Fig 7.19 Genotyping Group H – 4 P. aeruginosa of human origin
Grupul 4 supus analizei RAPD este format din tulpini de P. aeruginosa izolate din probe de spută.
Dendograma evidențiază 3 clustere și 4 profile genetice de tip unic. Profile din primul cluster are 2 tipuri de profile genetice, coeficientul de îrudire depășește pragul stabilit de 0,70.
Cel de-a 2 lea cluster este înrudit într-un procent de 72%, fiind format din profilul H4 – RE1 și H4 – RE2, respectiv tulpinile 98 și 97, tulpinile au fost izolate de la pacienți diferiți ce au în comun patologiile de fond, Fibroză chistică și antibioterapie repetată, proveniența pacienților și rezultatele la testarea antibioticelor sunt total diferite.
Ultimul cluster este format din 4 tipuri de profile genetice, gradul lor de îrudire variază de la 71% la 76%. Toate tulpinile din acest grup provin de la pacienți cu aceeași patologie de fond, respectiv pacienți diagnosticați cu Fibroză chistică, acest lot de tulpini a fost supus și verificării producerii de biofilm, din 13 tulpini, 53,84% sunt producătoare de biofilm (7 tulpini: 36, 47, 69, 92, 98,117,119), înaintea analizei RAPD, izolatele au fost supuse la diferite analize, pentru a se verifica prin metode fenotipice dacă au puncte în comun.
H – 5
Fig. 7.20 Vizualizarea benzilor de ADN din grupul 5 de origine umană
Fig. 7.20 Viewing Group 5 DNA bands of human origin
Fig. 7.21 Genotiparea grupului H – 5 de P. aeruginosa de origine umană
Fig 7.21 Genotyping Group H – 5 P. aeruginosa of human origin
Grupul 5 este reprezentat de tulpini care au fost izolate din probe de urină, probele provin de la pacienți diferiți cu patologii de fond diferite. Prin dendogramă putem observa formarea a 3 clustere și 3 tipuri unice de profile genetice.
Primul cluster este format din 2 tipuri de profile genetice, având coeficient de îrudire de 79%.
Cel de-al 2 lea cluster, cu procentajul de îrudire superior primului, 82%, este format din 2 tipuri de profile, H5 – RE1 și H5 – RE2, fiind vorba de tulpinile 114 și 22 izolate de la pacienți cu patologii de fond diferite, având în comun mediul de proveniență, rezultatele antibiogramei și administrarea de antibiotice în trecut de lungă durată, deoarece patologiile de fond sunt cronice ce necesită administrarea lor, împiedicând astfel septicemiile.
Ultimul cluster, predominant în acest grup, este format din 7 tipuri de profile cu diferite procente de similitudine, de la 74% până la 92%. Cel mai mare procentaj de înrudire fiind la perechea de profile H5 – RF1 și H5 – RF2, reprezentate de tulpinile 51 și 32, aceste izolate provin de la pacienți diferiți cu patologii diferite.
H – 6
Fig. 7.22 Vizualizarea benzilor de ADN din grupul 6 de origine umană
Fig. 7.22 Viewing Group 6 DNA bands of human origin
Fig. 7.23 Genotiparea grupului H – 6 de P. aeruginosa de origine umană
Fig 7.23 Genotyping Group H – 6 P. aeruginosa of human origin
Penultimul grup de origine umană este format din tulpini de P. aeruginosa izolate din secreții auriculare, tulpinile sunt non-duplicat și provin de la pacienți diferiți.
Dendograma distinge 20 de tipuri de profile genetice, ce sunt divizate în 4 clustere și 2 tipuri de profile genetice de tip unic.
Primul cluster fiind reprezentat de 2 profile ce au coeficient de înrudire de 0,78. Similar primului cluster, al 2 lea și al 3 lea cluster cuprind câte 2 tipuri de profile genetice având coeficient de îrudire inferior primului, respectiv de 0,71 și 0,75, înrudirea lor fiind semnificativă deoarece depașește pragul de 0,70 stabilit prin formulă matematică.
Ultimul cluster cuprinde 12 tipuri de profile genetice, cu procentaje diferite de îrudire genetică, de la 74% până la 90%. H6 – RF11 și H6 – RF12, reprezentate de tulpinile 112 și 103, 105, 121 care au profilele genetice identice de 90%, ele au fost izolate de la pacienți diferiți, cu internați în unitate cu patologii de fond diferite, pacienții au în comun rezultatele de antibiogramă.
H – 7
Fig. 7.24 Vizualizarea benzilor de ADN din grupul 7 de origine umană
Fig. 7.24 Viewing Group 7 DNA bands of human origin
Fig. 7.25 Genotiparea grupului H – 7 de P. aeruginosa de origine umană
Fig 7.25 Genotyping Group H – 1 P. aeruginosa of human origin
Ultimul grup analizat este format din tulpini de P. aeruginosa izolate din secreții purulente postoperatorii.
Dendograma este formată din 21 tipuri de profile genetice, ele fiind împărțite în 3 clustere si 7 profile de tip unic.
Primul cluster are coeficient de îrudire de 0,71, în interiorul lui ajungându-se până la 92% înrudirea genetică. Al 2 lea cluster este alcătuit din 5 tipuri de profile, coeficientul de îrudire variază de la 0,74 pănâ la 0,90. H7 – RI1 și H7 – RI2, reprezentate de tulpinile 38 și 26 au profilul genetit îrudit în proporție de 90%, izolatele provin de la pacienți diferiți cu patologii de fond diferite.
Ultimul cluster analizat este format din 6 tipuri de profile genetite îrudite în procentaj de 73% pănâ la 93%. Profile H7 – RJ5 și H7 – RJ6, reprezentate de tulpinile 107 și 99, au coeficient de înrudire de 0,93. Izolatele provin de la pacienți care provin din același mediu social, cu aceeași vârstă, dar cu patologii de fond diferite de tip cronic, ambii pacienți având în istoricul medical administrarea antibioticelor.
Genotiparea grupului de tulpini de origine animală
A – 1
Fig. 7.26 Vizualizarea benzilor de ADN din grupul 1 de origine animală
Fig. 7.26 Viewing Group 1 DNA bands of animal origin
Fig. 7.27 Genotiparea grupului A – 1 de P. aeruginosa de origine animală
Fig 7.27 Genotyping Group H – 1 P. aeruginosa of animal origin
Lotul de tulpini de P. aeruginosa de origine animală cuprinde un număr de 57 de tulpini ce au fost împărțite în funcție de proveniența lor, astfel au fost împărțite în 4 grupe: secreții auriculare, abcese perianale, septicemii și secreții conjunctivale.
Primul grup supus analizei este format din tulpini recoltate de la animale de companie cu otită. Dendograma evidențiază 9 tipuri de profile genetice, ce sunt divizate în 2 clustere.
Primul cluster cuprinde 3 tipuri de profile cu coeficient de înrudire de 0,73. Câinii de la care s-au recoltat probele provin din același mediu, rezultatele antibiogramelor sunt diferite.
Cel de-al 2 lea cluster este format din 6 tipuri de profile, îrudirea genetică variază de la 72% până la 94%. Profilele A1 – RB5 și A1 – RB6, reprezentate de tulpinile 140 și 131 au gradul superior de înrudire genetică din tot grupul analizat, ele provin de la câini ce au în comun mediul de creștere, diferă rezultatele la antibiotice.
A – 2
Fig. 7.28 Vizualizarea benzilor de ADN din grupul 2 de origine animală
Fig. 7.28 Viewing Group 2 ADN bands of animal origin
Fig. 7.29 Genotiparea grupului A – 2 de P. aeruginosa de origine animală
Fig 7.29 Genotyping Group H – 2 P. aeruginosa of animal origin
Grupul 2 analizat este format din tulpini de P. aeruginosa izolate din abcese perianale de la animale de companie.
Dendograma este formată din 18 tipuri de profile, divizate în 3 clustere și 5 profile de tip unic.
Primul cluster este format din 2 profile cu coeficient de înrudire genetic de 0,72. Al 2 lea cluster însumează 3 tipuri de profile cu variații ale coeficientului de înrudire de la 0,71 până la 0,83.
Ultimul cluster din acest grup, predominant de altfel, cuprinde 7 tipuri de profile genetice, similar celui de-al 2 lea cluster și aici întâlnim variații ale coeficientului de înrudire, de la 0,72 până la 0,86. Tulpinile ce reprezintă profilele genetice din ultimul cluster au în comun rezultatele la antibiogramă, unde întâlnim o rezistență de aproximativ 100%.
A – 3
Fig. 7.30 Vizualizarea benzilor de ADN din grupul 3 de origine animală
Fig. 7.30 Viewing Group 3 ADN bands of animal origin
Fig. 7.31 Genotiparea grupului A – 3 de P. aeruginosa de origine animală
Fig 7.31 Genotyping Group H – 3 P. aeruginosa of animal origin
În grupul 3 analizat sunt tulpini de P. aeruginosa izolate din septicemii.
Dendograma este formată din 5 tipuri de profile genetice, evidențiind un singur cluster și un singur profil de tip unic. Clusterul are coeficient de înrudire de 0,74. În interiorul lui profilul A3 – RB3, reprezentat de tulpinile 149, 150, 151 și 156 și profilul A3 – RB4 reprezentat de tulpina 139 prezintă 88% înrudire genetică.
Tulpinile au în comun rezultatele la testarea panelului de antibiotice, același panel care a fost folosit și pentru celelalte grupe.
A – 4
Fig. 7.32 Vizualizarea benzilor de ADN din grupul 4 de origine animală
Fig. 7.32 Viewing Group 4 ADN bands of animal origin
Fig. 7.33 Genotiparea grupului A – 4 de P. aeruginosa de origine animală
Fig 7.33 Genotyping Group H – 4 P. aeruginosa of animal origin
Dendograma ultimului grup analizat este similară cu cea din grupul anterior, este evidențiat un singur cluster și un singur profil de tip unic. Clusterul este format din 3 tipuri de profile, coeficientul de înrudire ajunge până la 79%. A4 – RB2 și A4 – RB3 este reprezentat din tulpini ce provin de la specii diferite de animale (iepure, câine și pisică), contrar acestui lucru tulpinile prezintă 79% grad de înrudire, profilul de rezistență este aproximativ identic la aceste tulpini.
H – TOTAL
Fig. 7.34 Vizualizarea benzilor de ADN din grupul total
origine umană și animală
Fig. 7.34 Viewing Group 5 ADN bands of animal origin
Fig. 7.35 Genotiparea tulpinilor de P. aeruginosa reprezentative a grupelor analizate de origine umană și animală
Fig 7.35 Genotyping of P. aeruginosa representative strains groups analyzed human and animal origin
Acest grup analizat este foarte important, deoarece a fost efectuat pe tulpini de P. aeruginosa de origine umană și animală.
Din fiecare grup a fost ales câte un izolat ce a fost reprezentativ profilului respectiv.
Dendograma evidențiază un singur cluster și 6 profile de tip unic: TRA – H4 (izolate din spută), TRB – H6 (izolate din secreții otice), TRC – H3 (izolate din lichide plurale), TRD – A1 (izolate din secreții otice), TRE – H5 (izolate din probe de urină), TRF – H2 (izolate din aspirate gastrice). Clusterul este format din 5 tipuri de profile genetice, fiecare profil este reprezentat de câte un izolat din grupe diferite: TRG1 – H1 (aspirate bronșice recoltate de la oameni), TRG2 – A4 (secreții otice izolate de la animale de companie), TRG3 – A3 (septicemii de la animale), TRG4 – H7 (izolate din secrețiile purulente postoperatorii de la oameni), TRG5 – A2 (izolate din abcese perianale de origine animală).
În interiorul clusterului procentele de înrudire genetică variază de la 73% până la 91%. Profilul cu cel mai mare procentaj de înrudire, respectiv 91%, format din TRG4 – H7 și TRG5 – A2, reprezentat de tulpini izolate de la oameni din secrețiile postoperatorii și tulpini izolate din abcese perianale de la animale au 91% procentul de înrudire genetică. Tulpinile de origine animală au fost recoltate de la câinii aflați în proximitatea unității spitalicești din care au fost recoltate tulpinile din secrețiile purulente postoperatorii de origine umană.
7.2.3. Concluzii parțiale
Tulpinile de Pseudomonas aeruginosa au fost grupate în funcție pe grupe în funcție de proveniența lor: 125 tulpini de Pseudomonas aeruginosa de origine umană, reunite în 7 grupe (H1-H7), izolate din ; 57 de tulpini de Pseudomonas aeruginosa de origine animală, reunite în 4 grupe (A1- A4), izolate din: secreții auriculare, abcese perianale, septicemii și secreții conjunctivale.
Tulpinile analizate cu tehnica RAPD prezintă un grad ridicat de înrudire genetică, ceea ce poate concluziona că tulpinile provin din același mediu și informatia genetică se transimite de la o tulpina la altă.
Grupul H-1 (aspirate bronsice) a fost alcătuit din 3 clustere, fiecare cluster având coeficient diferit de înrudire genetică:
cel mai mare grad este atribuit primului cluster, H1 – RD1, H1 – RD2 și H1 – RD3, respectiv tulpinile 115, 78 și 53, înrudirea profilelor din interiorul lui fiind de 80% – 85 %.
Al 2-lea cluster are coeficient de similitudine de 71%, H1 – RG1 și H1 – RG2, reprezentat de tulpinile 59 și 52, similar primului cluster cele două tulpini la antibiotipare au făcut parte din același cluster
al 3lea cluster are un grad de întrudire genetică de la 75% la 84%, acest cluster predomină în grupul analizat.
Relaționarea între tulpinile 115 și 53 a fost identificată și la antibiotipare, cele două tulpini aparținând aceluiași cluster, ceea ce confirmă înrudirea lor genetică.
Grupul H-2 (aspirate gastrice) a inclus 14 tipuri de profile genetice din care 4 sunt de tip unic:
. Primul cluster cuprinde 3 tipuri de profile cu grad de înrudire genetic de 84%.
Cu predominanță în grup este cel de-al 2 lea cluster, cu coeficient de înrudire de 75%, clusterul fiin format din 7 tipuri de profile; un grad înalt de înrudire este reprezentat de perechea de profile H2 – RF6 și H2 – RF7, fiind vorba de tulpinile 23 și 12
Grupul H-3 (lichide pleurale) ia inclus 2 clustere:
Primul având coeficient de similitudine de 77% și este format din 2 tipuri de profile.
Al 2 lea cluster, ce predomină în grup, are 4 tipuri de profile, astfel grupul are 10 tipuri de profile din care 4 sunt de tip unic.
Îrudirea genetică ce depașește procentul de 90% o întâlnim între profilele H3 – RF3 și H3 – RF4, fiind reprezentate de tulpinile 90 și respectiv 87.
la antibiotipare cele două tulpini au prezentat un coeficient de similitudine de 0,78, similitudine fiind acum dovedită prin înrudirea genetică de 90%
Grupul H-4 (spută) a inclus 3 clustere și 4 profile genetice de tip unic:
primul cluster are 2tipuri de profile genetice, coeficientul de îrudire depășește pragul stabilit de 0,70.
Cel de-a 2 lea cluster este înrudit într-un procent de 72%, fiind format din profilul H4 – RE1 și H4 – RE2, respectiv tulpinile 98 și 97.
Ultimul cluster este format din 4 tipuri de profile genetice, gradul lor de îrudire variază de la 71% la 76%.
Toate tulpinile din acest grup provin de la pacienți cu aceeași patologie de fond, respectiv pacienți diagnosticați cu Fibroză chistică
Grupul H-5 (uroculturi) a inclus 3 clustere și 3 tipuri unice de profile genetice:
Primul cluster este format din 2 tipuri de profile genetice, având coeficient de îrudire de 79%.
Cel de-al 2 lea cluster, cu procentajul de îrudire superior primului, 82%, este format din 2 tipuri de profile, H5 – RE1 și H5 – RE2, fiind vorba de tulpinile 114 și 22 izolate de la pacienți cu patologii de fond diferite, având în comun mediul de proveniență,
Ultimul cluster, predominant în acest grup, este format din 7 tipuri de profile cu diferite procente de similitudine, de la 74% până la 92%. Cel mai mare procentaj de înrudire fiind la perechea de profile H5 – RF1 și H5 – RF2, reprezentate de tulpinile 51 și 32, aceste izolate provin de la pacienți diferiți cu patologii diferite.
Grupul H-6 (secreții auticulare) a inclus 4 clustere cu 20 de tipuri de profile genetice și 2 profile genetice unice:
Primul cluster fiind reprezentat de 2 profile ce au coeficient de înrudire de 0,78.
Similar primului cluster, al 2 lea și al 3 lea cluster cuprind câte 2 tipuri de profile genetice având coeficient de îrudire inferior primului, respectiv de 0,71 și 0,75, înrudirea lor fiind semnificativă deoarece depașește pragul de 0,70 stabilit prin formulă matematică.
al 4-lea cluster cuprinde 12 tipuri de profile genetice, cu procentaje diferite de îrudire genetică, de la 74% până la 90%. H6 – RF11 și H6 – RF12, reprezentate de tulpinile 112 și 103, 105, 121 care au profilele genetice identice de 90%, ele au fost izolate de la pacienți diferiți, cu internați în unitate cu patologii de fond diferite
Grupul H-7 (colecții prurulente postoperatorii) a inclus 3 clustere cu 21 de tipuri de profile genetice și 7 profile de tip unic:
Primul cluster are coeficient de îrudire de 0,71, în interiorul lui ajungându-se până la 92% înrudirea genetică.
Al 2 lea cluster este alcătuit din 5 tipuri de profile, coeficientul de îrudire variază de la 0,74 pănâ la 0,90. H7 – RI1 și H7 – RI2, reprezentate de tulpinile 38 și 26 au profilul genetit îrudit în proporție de 90%, izolatele provin de la pacienți diferiți cu patologii de fond diferite.
Al 3-lea cluster analizat este format din 6 tipuri de profile genetite îrudite în procentaj de 73% pănâ la 93%.
Profile H7 – RJ5 și H7 – RJ6, reprezentate de tulpinile 107 și 99, au coeficient de înrudire de 0,93.
Izolatele provin de la pacienți care provin din același mediu social, cu aceeași vârstă, dar cu patologii de fond diferite de tip cronic.
Grupul A-1 ( exudate otice) a inclus 2 clustere cu 9 tipuri de profile genetice:
Primul cluster cuprinde 3 tipuri de profile cu coeficient de înrudire de 0,73.
Cel de-al 2 lea cluster este format din 6 tipuri de profile, îrudirea genetică variază de la 72% până la 94%. Profilele A1 – RB5 și A1 – RB6, reprezentate de tulpinile 140 și 131 au gradul superior de înrudire genetică.
Grupul A-2 ( colecții purulente perianale) a inclus 3 clustere cu 18 tipuri de profile genetice și 5 profile de tip unic:
Primul cluster este format din 2 profile cu coeficient de înrudire genetic de 0,72.
Al 2 lea cluster însumează 3 tipuri de profile cu variații ale coeficientului de înrudire de la 0,71 până la 0,83.
Al 3-lea cluster din acest grup, predominant de altfel, cuprinde 7 tipuri de profile genetice, similar celui de-al 2 lea cluster și aici întâlnim variații ale coeficientului de înrudire, de la 0,72 până la 0,86.
Tulpinile ce reprezintă profilele genetice din ultimul cluster au în comun rezultatele la antibiogramă, unde întâlnim o rezistență de aproximativ 100%.
Grupul A-3 (hemoculturi) a inclus un cluster cu 5 tipuri de profile genetice și un singur profil de tip unic:
Clusterul are coeficient de înrudire de 0,74.
În interiorul lui profilul A3 – RB3, reprezentat de tulpinile 149, 150, 151 și 156 și profilul A3 – RB4 reprezentat de tulpina 139 prezintă 88% înrudire genetică.
Grupul A-4 ( secreții conjunctivale) a inclus un cluster cu 3 tipuri de profile genetice și un singur profil de tip unic:
coeficientul de înrudire ajunge până la 79%. A4 – RB2 și A4 – RB3
tulpinile prezintă 79% grad de înrudire, profilul de rezistență este aproximativ identic la aceste tulpini, care provin de la specii diferite ( iepure, pisică, și câine).
Analiza de grup, realizată pe tulpinile reprezentative fiecărui profil a evidențiat un singur cluster și 6 profile de tip unic:
Clusterul este format din 5 tipuri de profile genetice, fiecare profil este reprezentat de câte un izolat din grupe diferite: TRG1 – H1 (aspirate bronșice recoltate de la oameni), TRG2 – A4 (secreții otice izolate de la animale de companie), TRG3 – A3 (septicemii de la animale), TRG4 – H7 (izolate din secrețiile purulente postoperatorii de la oameni), TRG5 – A2 (izolate din abcese perianale de origine animală)
Cele 6 profile de tip unic sunt: TRA – H4 (izolate din spută), TRB – H6 (izolate din secreții otice), TRC – H3 (izolate din lichide plurale), TRD – A1 (izolate din secreții otice), TRE – H5 (izolate din probe de urină), TRF – H2 (izolate din aspirate gastrice).
În interiorul clusterului procentele de înrudire genetică variază de la 73% până la 91%. Profilul cu cel mai mare procentaj de înrudire, respectiv 91%, format din TRG4 – H7 și TRG5 – A2, a fost reprezentat de tulpinile izolate de la oameni din secrețiile postoperatorii și tulpini izolate din abcese perianale de la animale care au 91% procentul de înrudire genetică.
8. CONCLUZII ȘI RECOMANDĂRI
8.1. CONCLUZII FINALE
S-au izolat și confirmat molecular 182 de tulpini de Pseudomonas aeruginosa.
S-au izolat 125 (68,68%) tulpini de Pseudomonas aeruginosa de origine umană și 57 (31,32 %) tulpini de Pseudomonas aeruginosa de origine animală.
Din cele 125 tulpini de Pseudomonas aeruginosa de origine umană, 15% proveneau din aspirate bronsice, 12% din aspirate gastrice, 10% din lichide pleurale, 21% din colecții purulente post operatorii, 20% din secreții auriculare și oculare, 10% din spută, 12% din uroculturi.
Din cele 57 tulpini de Pseudomonas aeruginosa izolate de la animale, 30% proveneau din secreții otice, 44% din abcese perianale, 14% septicemii și 12% din conjunctivite.
Toate tulpinile au fost testate față de cele 13 antibiotice IPM – imipenem, MEM – meropenem, TZP – piperacilin + tazobactam, CAZ – , FEP – cefepim, CIP – ciprofloxacin, AK – amikacin, GN – gentamicin, TOB – tobramicin, ATM – aztreonam, PB – polimixin B, PIP – piperacilin TAZ – tazobactam care sunt uzual recomandate în patologia infecțioasă produsă de Pseudomonas aeruginosa.
Din cele 125 tulpini de Pseudomonas aeruginosa de origine umană, 43,2% au fost rezistente la Meropenem, 41,6% au fost rezistente șa Imipenem, 36% au fost rezistente la Cefepim, 32% au fost rezistente la Gentamicină, 28,8% au fost rezistente la Ceftazidim, 28,8% au fost la Piperacilin+tazobactam,24% au fost rezistente la Tobramicină, 23,2% au fost rezistente la Ciprofloxacin, 19,2% au fost rezistente la amikacina, 18,4% au fost rezistente la Aztreonam, 14,4% au fost rezistente la Piperacilină, 14,4% au fost la Tazobactam și 8,8% au fost rezistente la Polimixină B.
Din cele 57 tulpini de Pseudomonas aeruginosa de origine animală, 100% au fost rezistente la Tazobactam, 100% au fost rezistente la Piperacilină, 98,24% au fost rezistente la TZP, 98,24% au fost rezistente șa Ceftazidim, 96,49% au fost rezistente la Cefepim, 85,96% au fost rezistente la Polimixină B, 82,45% au fost rezistente la Ciprofloxacin, 78,94% au fost rezistente șa Meropenem, 75,43% au fost rezistente la Gentamicină, 73,68% au fost rezistente șa Aztreonam, 64,91% au fost rezistente la Imipenem, 54,38% au fost rezistente la Amikacin, 52,36% au fost rezistente la Tobramicin.
Antibiotiparea este o metodă prin care se identifică un tipar dintr-un lot total analizat, cu ajutorul lui se poate urmări într-un circuit închis proveniența tulpinilor izolate (ferme, spitale etc).
Antibiotiparea poate fi utilizată ca metodă de supraveghere epidemiologică.
Analiza genetică de grup, realizată pe baza similitudinii genetice, realizată pe tulpinile reprezentative fiecărui profil, a evidențiat un singur cluster și 6 profile de tip unic:
Clusterul este format din 5 tipuri de profile genetice, fiecare profil este reprezentat de câte un izolat din grupe diferite: TRG1 – H1 (aspirate bronșice recoltate de la oameni), TRG2 – A4 (secreții otice izolate de la animale de companie), TRG3 – A3 (septicemii de la animale), TRG4 – H7 (izolate din secrețiile purulente postoperatorii de la oameni), TRG5 – A2 (izolate din abcese perianale de origine animală)
Cele 6 profile de tip unic sunt: TRA – H4 (izolate din spută), TRB – H6 (izolate din secreții otice), TRC – H3 (izolate din lichide plurale), TRD – A1 (izolate din secreții otice), TRE – H5 (izolate din probe de urină), TRF – H2 (izolate din aspirate gastrice).
În interiorul clusterului procentele de înrudire genetică variază de la 73% până la 91%. Profilul cu cel mai mare procentaj de înrudire, respectiv 91%, format din TRG4 – H7 și TRG5 – A2,a fost reprezentat de tulpinile izolate de la oameni din secrețiile postoperatorii și tulpini izolate din abcese perianale de la animale care au 91% procentul de înrudire genetică.
8.2. RECOMANDĂRI
Recomandăm ca mediu înalt selectiv pentru izolarea tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa, mediul Pseudomonas Agar Base + supliment C-N ( Oxoid, UK). Pe acest mediu de cultură este stimulată pigmentogeneza și mirosul lor caracteristic este mai accentuat.Totodată s-a observat o scurtare a perioadei de incubare, 12 – 16 h tulpinile de Pseudomonas aeruginosa erau prezente în mediu.
Pentru identificarea biochimică recomandăm folosirea testelor RapID NF Plus de la Oxoid UK, micșorând perioada de confirmare aproximativ până la jumătate față de testele API 20 NE, singurul dezavantaj fiind costul de achiziție, prețul testelor rapide este de 3 ori mai mare față de cele obișnuite, s-a urmărit o urgentare a izolării acestor tulpini, deoarece timpul este vital într-o astfel de infecție.
Pentru prevenirea fenomenului de rezistență bacteriană în cazul infecțiilor cu pseudomonas aeruginosa atât în medicina umană cât și În cea umană recomandăm efectuarea antibiogramei și respectarea administrării antibioticelor.
evitarea administrarii antibioticelor aminopenicilinele: ampicilina, amoxicilina în infecțiile cu Pseudomonas aeruginosa întrucât este natural rezistent la o serie de
Pentru supraveghere epidemiologică recomandam folosirea antibiotipari deoarece este o metoda economa si nu necesita multe materiale pentru a fi pusa in practica.
Pentru identificarile fenotipice in special a tulpinilor producatoare de MBL recomandam folosirea imipenemului potentat cu EDTA.
Recomandam limitarea administrarii antibioticelor daca pacientii nu se afla in situatii critice in care chiar este necesara administrarea lui, efectuarea antibiogramei deoarece în cazul tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa daca nu se merge tintit cu antibiotcul se declanseaza mecanismele de aparare si transferul informatiei antibioticului, declansand astfel mecanismele de rezistenta bacteriana ce se vor transfera de la o bacterie la alta, de la un pacient la altul, supravegherea si controlul sunt singurele masuri ce pot fi luate in prevenirea acestor infectii cu pseudomonas aeruginosa, igiena riguroasa din spitalele umane si veterinare pot impiedica transferul acestor tulpini, managerul corect al deseurilor din cadrul unitatilor spitalicesti sa nu poata veni in contact cu animalele din proximitatea lor pentru a nu lua contact cu ele si sa poata prelua tulpinile bacteriene si acele animale la randul lor prin contactul cu persoanele din jur sa le poata contacta.
BIBLIOGRAFIA ????
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: STUDIUL ANTIBIOREZISTENȚEI LA TULPINILE DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA DE ORIGINE UMANĂ ȘI ANIMALĂ [301676] (ID: 301676)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.