Studii Privind Reactia Morfogenetica a Unor Explante de Calendula Officinalis Si Analiza Fitochimica a Unor Regeneranti

CUPRINS

1. Introducere

2. Cultivarea in vitro a plantelor

2.1.Tehnologia de cultivare in vitro

2.1.1. Mediul de cultură

2.1.2. Materialul biologic

2.1.3. Inocularea și incubarea

2.1.4. Acomodarea vitroplantelor ex vitro

2.2. Reacția morfogenetică

2.2.1. Calusogeneză

2.2.2. Organogeneza

2.2.2.1. Caulogeneză

2.2.2.2. Rizogeneză

2.2.3. Embriogeneza somatică

3. Tehnici utilizate în analiza fitochimică

4. Calendula officinalis-plantă de interes economic

4.1. Încadrare sistematică

4.2. Importanță economică

4.3. Scopul cercetărilor

5. Material și metodă de cercetare

5.1. Cultura in vitro

5.2. Reacție morfogenetică

5.3. Analiză fitochimică

6. Rezultate și discuții

7. [NUME_REDACTAT]

INTRODUCERE

Istoria civilizației umane este strâns legată de dezvoltarea tehnicii și a științei, de succesul pe care omul îl deține în competiția sa cu natura. Culturile in vitro de celule și țesuturi au apărut și ele ca dovadă a inteligenței omului și a încercării acestuia să aducă fenomene noi în biologie, atât de necesare în lumea vie.

Cultivarea in vitro a unor celule și țesuturi vegetale reprezintă o ramură a științelor biologice care își are bazele la începutul sec.XX. Evoluția acesteia în timp a decurs foarte rapid, astfel încât, în ultimii ani, se vorbește de un ansamblu de metode și tehnici in vitro grupate sub numele de biotehnologii vegetale.

În prezent se desfășoară o revoluție biotehnologică ce se materializează printr-un mare volum de aplicații practice ale culturilor in vitro în domenii precum: științe agricole, biologice, medicale, în farmacologie și industria alimentară, în industria cosmetică, a coloranților naturali și a substanțelor bioactive.

Cercetările în domeniul biotehnologiei se axează pe rezolvarea unor probleme de importanță majoră ale omenirii precum: malnutriția, criza energetică, reciclarea materiei organice, valorificarea și conservarea resurselor genetice, valorificarea terenurilor degradate, reducerea poluării mediului înconjurător.

După al doilea război mondial, culturile in vitro s-au dezvoltat rapid datorită multiplelor domenii de aplicabilitate: înmulțirea industrială a plantelor, genetică, ameliorarea plantelor, inginerie genetică, conservarea resurselor genetice, producția industrial de substanțe utile. Deasemenea se mai adaugă și rolul pe care culturile in vitro îl au în dezvoltarea unor studii de anatomie și fiziologie vegetală, fitopatologie, etc.

Stadiul atins în present în domeniul culturilor in vitro deschide ample perspective în ceea ce privește manipularea materialului genetic și dirijarea proceselor de înmulțire, creștere și dezvoltare a plantelor pentru a obține noi forme productive.

În prezent biotehnologiile reprezintă o achiziție cu valoare fundamentală și aplicativă a științei contemporane. Biotehnologiile moderne au apărut odată cu dezvoltarea cunoștințelor de biologie în diverse domenii ca: biochimie, microbiologie, inginerie genetică, genetică moleculară sau biochimie celulară putându-se astfel manipula artificial informațiile genetice a organismelor vii.

În domeniul agriculturii, prin utilizarea metodelor in vitro, au fost obținute la un număr mare de specii, plante libere de viroze, somaclone valoroase, multiplicarea genotipurilor rare, plante haploide, toate acestea contribuind la scurtarea procesului de ameliorare pentru rezistența la factori de stres sau la îmbunătățirea unor caractere calitative.

Astfel, biotehnologia se ocupă cu studierea oricărei tehnici care utilizează organisme vii sau părți ale acestora, pentru a se obține sau modifica produse, pentru a se dezvolta microorganisme cu îmbunătățiri specifice, pentru a se ameliora caracterele unor animale sau plante. Plantele obținute prin tehnicile biotehnologiei vegetale sunt superioare calitativ celor obținute pe căi tradiționale de înmulțire sexuată, ele permițând țărilor cu tradiție în ameliorare și în cultivarea plantelor să comercializeze cantități foarte mari de legume, fructe, flori ori biomasă vegetală prin clonarea într-un interval scurt de timp a acestora cu ajutorul vitropracticilor.

Biotehnologiile pot fi clasificate în funcție de nivelul de cunoaștere implicat, de gradul lor de dificultate și de ansamblul mijloacelor tehnice necesare pentru valorificarea lor, în trei categorii:

a) tehnologii convenționale utilizate pentru creșterea productivității în agricultură, producerea de biomasă, protein, substanțe utile și energie;

b) biotehnologii ce utilizează microorganismele, culturile de țesuturi animale și vegetale, hibridarea somatic în producerea de genotipuri noi, de substanțe și servicii;

c) biotehnologii care utilizează tehnologia AND-recombinat, transgeneza și clonarea la organismele vii pentru a obține organisme noi, substanțe și servicii necesare omului.

Randamentul în micropropagarea plantelor de interes economic este ridicat odată cu descoperirea fitohormonilor precum și a variațiilor regulatorilor de creștere care sunt utilizați cu succes în tehnicile de cultivare in vitro.

Studii ce au fost realizate pe parcursul secolului trecut contribuie la înțelegerea unor aspecte privind creșterea, regenerarea, organogeneza și morfogeneza, embriogeneza somatică, compoziția mediilor de cultură, condițiile de dezvoltare a vitroplantelor atât din camera de creștere cât și din recipientul de cultură. Însă, există și numeroase necunoscute cu privire la efectele pe care le produc unii factori implicați în morfogeneza celulară și moleculară sau referitoare la transmiterea și exprimarea informației genetice dobândite din exteriorul genomului propriu, prin mijloace tehnice de inginerie genetică.

Așadar se poate afirma faptul că această gamă a speciilor de plante cultivate in vitro crește zi de zi iar valorificarea acestora prin intermediul tehnicilor de vitrocultură se află în continuă extindere.

Istoria biotehnologiei vegetale

Tabelul 1.1 Scurt istoric al biotehnologiilor vegetale

Capitolul 2

CULTURA IN VITRO LA PLANTE

2.1. Tehnologia de cultivare

2.1.1. Mediul de cultură

Termenul in vitro își are originea în limba latină și înseamnă cu aproximație viață în recipient de sticlă. Acest termen a fost introdus din necesitatea definirii tehnicilor privind cultura de organe, țesuturi și celule vegetale pe medii de viață artificial, ce permit păstrarea lor în viață și înafara organismului. Botanistul german Haberlandt a fost considerat inițiatorul culturii in vitro la plante, în anul 1902. Acesta a intuit capacitatea de regenerare a celulelor plantelor superioare și astfel a cultivat pe mediu artificial celule izolate din frunze.

Explantele de natură vegetală cum sunt țesuturi, organe, celule pot fi cultivate și menținute în viață pe medii artificiale într-un ambient steril numit mediul in vitro. Deci, cultura in vitro se realizează în condiții controlate, în absența microorganismelor, la parametri optimi fizici, chimici și hormonali.

Creșterea explantelor poate fi de asemenea dirijată (pentru generare de calusuri, de protoplaști, de plantule noi pornind de la o singură celulă) prin intervenții în compoziția mediului de cultură și prin reglarea condițiilor din mediu cum ar fi temperatura și lumina.

Mediul de cultură reprezintă suportul fizic și chimic ce este necesar pentru creșterea și dezvoltarea explantelor in vitro.

Dea lungul timpului au fost efectuate numeroase cercetări, ceea ce a permis formularea, de către diferiți cercetători, a mai multe rețete de medii folosite pentru diferite tipuri de culturi in vitro la o gamă largă de specii vegetale.

Momentul de impas în acest domeniu l-a reprezentat anul 1962, când cercetătorii T. Murashige și F. Skoog au dat spre publicare rețeta de mediu ce le poartă numele, inițial realizată pentru culturi de țesuturi de tutun. Mediul a fost apoi folosit cu succes la numeroase specii de plante, astăzi fiind cel mai folosit, alături de varianta elaborată de Linsmaier&Skoog (LS, 1965). Diferența dintre cele două medii constă în nefolosirea acidului nicotinic, piridoxinei, glicinei și creșterea concentrației de tiamină la 0,4 mg/l, în cazul variantei modificate (LS).

Pentru a se asigura toate aceste condiții de creștere și dezvoltare a explantelor, este nevoie de un laborator destinat culturilor in vitro, care să prezinte dotările necesare acestui tip de cercetări. În funcție de obiectivul urmărit trebuie aleasă compoziția mediului de cultură, momentul inoculării explantelor, materialul biologic și tipul de explant cât și condițiile de cultivare ori intervalul dintre pasaje.

2.1.1.1. Compoziția mediului de cultură

Compoziția mediului de cultură reprezintă un element decisive pentru succesul operației de cultivare in vitro a explantelor vegetale. Astfel un mediu de cultură trebuie să îndeplinescă anumite cerințe, precum:

Să corespundă cerințelor nutritive și hormonale ale specie cultivate pentru faza în care se găsește (stabilizare, proliferare, calogeneză, înrădăcinare, etc.);

Să asigure condiții optime de creștere și dezvoltare în ceea ce privește pH-ul, umiditatea, presiunea osmotică;

Să fie echilibrat din punct de vedere ionic;

Să nu conțină ioni sau substanțe toxice;

Să fie ușor de preparat și reproductibil;

Să fie stabil după autoclavare (să-și mențină compoziția și caracteristicile fizico-chimice neschimbate);

Să fie ieftin și să conțină cât mai puțini constituienți naturali costisitori și neomogeni;

Dacă este posibil, să poată fi reciclat.

Prin efectuarea cercetărilor asupra cenușei de plante, asupra compoziției sevei din vasele lemnoase și liberiene și altele s-au eliberat medii de cultură cu compoziții bine definite care de regulă poartă numele celor care le-au creat: Heller (1953), Nitsch și Nitsch (1956), White (1963), Murashige – Skoog (1962), Gamborg, Miller și Ojima(B5; 1965), (după GHIORGHIȚĂ și NICUȚĂ, 2005).

Mediile folosite în cultura in vito a explantelor vegetale au o compoziție complexă, fiind alcătuite dintr-un număr mare de elemente de natură diversă și cu rol diferit. Acești constituenți pot fi grupați astfel:

Constituenți cu rol nutritiv: elemente minerale: macro și microelemente și elemente organice: zaharuri (ca sursă de carbon), aminoacizi (ca sursă de azot organic) și vitamine.

Constituenți cu rol hormonal fitoregulator al creșterii și dezvoltării explantelor in vitro: auxine, citochinine, gibereline și alte substanțe cu rol stimulator sau inhibitor: acid abscisic, etilenă, colchicină, paclobutrazol, etc.

Constituenți cu rol în stabilizarea mediului de cultură: apă, agenți de solidificare, stabilizatori osmotici și de pH, antioxidanți și substanțe absorbante.

Substanțele minerale ce intră în componența mediilor de cultură sunt reprezentate de săruri ce conțin cele opt macroelemente fundamentale: azot (N), fosfor (P), potasiu (K), calciu (Ca), magneziu (Mg), natriu (Na), clor (Cl) și sulf (S) precum și un mare număr de microelemente: fier (Fe), mangan (Mn), zinc (Zn), aluminiu (Al), bor (B), iod (I) și nichel (Ni).

Cantitatea macroelementelor din mediul de cultură variază de la o formulă de mediu la alta și se administrează în cantități de milimoli, în timp ce microelementele sunt prezente în mediul de cultură în cantități de ordinul micromolilor.

Dintre macroelemente un rol deosebit îl au K și Ca care sunt implicate în schimbul ionic, în funcționarea celulei, în gradul de fluiditate al citoplasmei, în permeabilitatea membranei celulare.

Rolul fiecărui element mineral este influențat de forma chimică în care el se află în mediu și concentrația lui, de natura explantului, de tipul culturii primare sau subculturii. De regulă, la inițierea unui ciclu experimental este indicată efectuarea de tatonări pentru testarea reacției țesuturilor luate în studiu pe diferite medii de cultură. De obicei, fenomenele de carență nutrițională se observă după a doua sau a treia pasare a inoculilor pe un același tip de mediu de cultură.

Azotul are un rol fiziologic extreme de important, fiind de nelipsit în metabolismul proteic și glucidic.Lipsa sau carența acestui element determină acumularea antocianilor în vacuole și moartea rapidă a celulelor.

Fosforul are și el un rol important în metabolismul general al explantelor prin formarea compușilor nucleotizicu valoare energetic ridicată (ADP și ATP), ce realizează captarea, păstrarea și eliberarea energiei chimice și care sunt determinanți în biosinteza acizilor nucleici (Neamțiu și colab., 1989).

Potasiul are și el un rol deosebit de important în reglarea permeabilității membrane celulare și a vâscozității protoplasmei. Acesta este foarte active în cadrul schimburilor de ioni la nivelul membranelor celulare și este preferat în cantități mai mari de către explantele tinere, la nivelul cărora determină activarea diviziunii celulare.

Calciul este prezent la majoritatea mediilor de cultură sub formă de clorură de calciu sau azotat de calciu.Acest element are deasemenea un rol important în reglarea permeabilității membranelor la nivel cellular, dar este cunoscut și rolul său antitoxic. Carențele calciului determină necrozarea apexurilor la lăstarii cultivați in vitro și lipsa lui duce la moartea celulelor.

Magneziul este un macroelement important ce intră în compoziția clorofilei iar carența sa determină importante perturbări în funcționarea frunzei, pentru ca în final să ducă la moartea explantului. [NUME_REDACTAT]-Mg este una foarte strânsă, cele două elemente putându-se substitui în unele reacții metabolice.

Sulful intră în compoziția multor aminoacizi esențiali prezența lui fiind nelipsită din mediile de cultură, intrând în componența ionului de sulfat.

Spre exemplu, dacă în mediul de cultură se omite azotul, sulful sau fosforul celulele de morcov mor după aproximativ două luni, cercetările arătând că prin omiterea sau carența în azot se provoacă o acumulare de antociani în vacuolele celulare ale inoculilor, treptat apărând perturbații ale metabolismului proteic și glucidic apoi celule mor. Lipsa de sulf în culturile de morcov sau viță-de-vie determină apariția clorozelor iar excesul de sulf și fosfor cauzează necroze și provoacă moartea țesuturilor după aproximativ 2 sau 3 pasaje.

Microelementele exercită roluri fiziologice și metabolice diferite de cele îndeplinite de către macroelemente. În 1953, Heller a dovedit faptul că omiterea totală a microelementelor din mediul de cultură conduce la micșorarea cu 40% a creșterii celulelor începând cu primul pasaj și cauzează moartea acestora la sfârșitul celui de-al treilea pasaj. Amestecul de microelemente indicat de Heller este cel mai utilizat în culturile de țesuturi.

Dintre microelemente un rol important il are fierul în creștera explantelor vegetale fiind implicat în activarea peroxidazei și citocrom-ozidazei, în sinteza ARN-ului și a proteinelor. Forma cea mai accesibilă de Fe este chelatul ( FeSO4 7H2 EDTA). Pentru a facilita operația de preparare a mediului de cultură se utilizează soluții stoc de macro- și microelemente, ce se păstrează în sticle de culoare închisă, la frigider. În acest mod poate fi păstrată și soluția de Fe, care va fi preparată din Na2EDTA (37,3 mg/l) și FeSO4˚7H2O (27,8 mg/l).

Manganul participă la o serie de activități enzimatice dar are și rol în sinteza proteică.

Zincul este implicat în sinteza auxinei, a ARN- polimerazei și a unor dehidrogenaze. Lipsa acestui element determină dereglări în sinteza triprofanului (precursor al auxinei endogene), îngălbenirea și necroza țesuturilor tinere.

Aluminiul este folosit doar în anumite medii de cultură (Heller) în mici cantități cu rol de catalizator al unor recții biochimice.

Borul este un alt element ce intră în alcătuirea mediului de cultură sub formă de acid boric, și are rol la reglarea proceselor de diviziune celulară și creștere. O carență de brom se manifestă prin brunificarea și necrozarea țesuturilor.

Compuși organici

Plantele au nevoi de substanțe organice pentru dezvoltarea lor astfel că în urma unor cercetări s-au stabilit compușii necesari a fi prezenți în compoziția mediului de cultură. Aceste substanțe sunt reprezentate de: o sursă de carbon organic, o sursă de azot, vitamine, fitohormoni și alți compuși cu rol în creșterea, multiplicarea și morfogeneza explantelor sau inoculilor cultivați in vitro.

Sursa de carbon

Carbohidrații (zaharuri) sunt utilizați în mediul de cultură ca sursă de carbon și energie, cunoscut fiind faptul că explantele cultivate in vitro au preponderant o nutriție heterotrofă. Astfel prin hidrolizarea carbohidraților celulele vegetale își procură cantitatea de energie necesară desfășurării proceselor vitale.

Din categoria zaharurilor cel mai mult utilizată este zaharoza, în concentrație de 2-3%, această concentrație variind în funcție de natura explantului și de specie. În unele experimente, mai ales la speciile lemnoase a fost folosită și glucoza, în concentrație de 3%. Sursa de carbon organic poate fi reprezentată uneori și de alcooli (în special glicerol) sau de acizi organic, ce au o valoare energetică scăzută. În unele experimente se mai utilizează ca sursă glucidică maltoza, fructoza, rafinoza, uneori chiar polizaharide ca pectina, amidon, dextrina în stare coloidală solubilă.

Glicerolul este și el eficient în mediul de cultură, fiind utilizat ca substart pentru numeroase specii de plante; acesta are rol energetic dar determină o creștere a biomasei mult mai mică decât cea indusă de glucide. Se recomandată și adăugarea de minoinozitol în cantitatea de 100mg/l ceea ce determină stimularea creșterii celulare.

Acești carbohidrați au un rol important și în echilibrarea presiunii osmotice a mediului de cultură. Astfel creșterea concentrației de zaharoză peste anumite limite are drept efect o creștere a presiunii osmotic precum și plasmolizarea celulelor explantelor.

Surse de azot organic

Ca și plantele superioare, țesuturile cultivate in vitro sunt autotrofe față de azot, acest element fiind preluat din substanțele organice. S-a constatat că pentru optimizarea creșterii și multiplicării celulelor vegetale este indicată adăugarea în mediul de cultură a surselor de azot organic, aminoacizi sau uree în anumite concentrații.

Aminoacizii sunt folosiți în compoziția mediului de cultură și ca surse suplimentare de azot organic, însă s-a demonstrat că aceștia au rol și în unele procese inductive.

Din această categorie glicina este cel mai frecvent utilizată. Încă din anul 1939 cercetătorul White a demonstrat că glicina are rol în creșterea rădăcinilor la tomate (Cachiță, 1987). Un alt cercetător, Gautheret, în anul 1959 a subliniat faptul că aminoacizii au rol în formarea calusului.

Dozele de utilizare a aminoacizilor variază de la 2mg/l la glicină, la 10mg/l la L-arginină și cisteină și până la 100mg/l la asparagină și L-tirozină.

[NUME_REDACTAT] mediul nutritiv s-a dovedit a fi utilă și folosirea vitaminelor, acestea fiind implicate în creșterea și multiplicarea optimă a culturii. Dintre vitamine un rol important în mediile de cultură îl au: tiamina (vitamina B1) care asigură creșterea celulelor țesuturilor cultivate, astfel crește biomasa celulară și tisulară, piridoxina (vitamina B6) care este precursorul unor enzime, fiind astfel una dintre vitaminele indispensabile și acidul pantotenic (vitamina PP) implicat în ameliorarea creșterii.

Pe lângă aceste vitamine se mai utilizează și altele ca: biotina (vitamina H) ce stimulează proliferarea celulelor, acidul folic care stimulează creșterea țesuturilor tumorale menținute la lumină, acidul ascorbic (vitamina C) în concentrații de 1- 50 mg/l este utilizat ca antioxidant al produșilor melaminici care au o acțiune dăunătoare în mediul de cultură, aceștia fiind secretați de unele explante, riboflavina (vitamina B2) și acidul pantotenic (vitamina B5) sunt puțin recomandate în rețetele de medii.

În funcție de natura țesutului cultivat variază și cantitatea de vitamine necesară în mediu. Vitaminele se prepară de asemenea în soluții stoc ce se păstrează în recipiente mici de plastic la congelator.

Regulatori de creștere

Regulatorii de creștere sau fitohormonii au un rol important în creșterea, dezvoltarea și multiplicarea țesuturilor vegetale. Ca și la animale hormonii sunt transportați în unele țesuturi acolo unde își exercită efectul, fiecare dintre acești hormoni avâd influență asupra unei game largi de procese spre deosebire de hormonii animali care prezintă specificitate.

Datorită faptului că explantele cultivate in vitro nu sunt capabile să secrete fitohormoni sau îi secretă într-o cantitate insuficientă, este necesară adăugarea în compoziția mediului de cultură a regulatorilor de creștere. În funcție de scopul urmărit se aleg tipurile de fitohormoni și concentrația optimă determinându-se astfel sensul de evoluție a explantului respectiv.

Până în prezent se cunosc cinci clase de fitohormoni: auxinele, citokininele, giberelinele, acidul abscisic și etilena, dintre acestea frecvent sunt utilizate auxinele și citokininele având efect asupra proceselor de creștere, dediferențiere și diferențiere, iar giberelinele, acidul abscisic și etilena sunt utilizate mai rar deoarece au efect asupra fitoinoculilor fiind de mai mică importanță.

[NUME_REDACTAT] sunt, în marea lor majoritate, compuși naturali sintetizați de către plante și acumulați în diferite organe, în concentrații reduse. Acestea sunt prezente mai ales în mugurii terminali, frunze foarte tinere și vârfuri de lăstari. Din locul biogenezei acestea circulă polarizat în plantă spre celulele tinere acolo unde își exercită rolul. Acțiunea auxinelor este una deosebit de complexă:

Intervin în procesele de diviziune și elongație a celulelor, în concentrații mici stimulând diviziunea celulară, iar în concentrații mari, alungirea;

Modifică permeabilitatea membranelor celulare, modificându-le totodată și alte caracteristici fizice și chimice;

Influențează pozitiv sinteza proteică prin stimularea sintezei ARN-ului ribozomal;

Controlează procesele de dominanță apicală, determinând inhibarea activității mugurilor axilari;

Stimulează procesele de calusare și ulterior determină formarea rădăcinilor;

În doze ridicate determină apariția de hipertrofii (simple deformări) sau hiperplastii (tumori).

Din categoria auxinelor cele mai utilizate în cultivarea in vitro sunt acidul 3-indolilacetic (AIA) care se oxidează la lumină și nu este stabil termic, acidul 3-indolilbutilic (AIB), acidul 1-naftilacetic (ANA) ce este stabil și eficient de aceea este deseori utilizat, acidul 2- naftoxiacetic (ANOA), acidul 2,4- diclorfenoxiacetic (2,4 –D) cu rol important în formarea rizogenezei și a calusului, acidul p- clorfenoxiacetic care are rol asematător cu 2,4- D fiind mai puțin toxic. Majoritatea auxinelor sunt insolubile în apă, dizolvarea lor realizându-se în alcool, acetonă sau eter (Ghiorgiță și Nicuță, 2005).

Stabilitatea auxinelor variază destul de mult; astfel că AIA și o parte importantă din restul auxinelor sunt fotolabile, pe când ANA și 2,4 D sunt mai stabile.

[NUME_REDACTAT] sunt sintetizate la nivelul rădăcinilor, meristemelor și embrionilor, prin intermediul vaselor lemnoase ajungând în tot corpul plantei. Aceste substanțe sunt deosebit de active, cu rol fitoregulator al proceselor de creștere și dezvoltare a plantelor.

Prima citokinină care a fost descoperită (Skoog, 1956) a fost izolată din spermă de heringi și denumită kinetină. Aproximativ în aceeași perioadă s-a descoperit și rolul stimulator pe care îl are laptele de cocos asupra formării de noi plantule in vitro. După cercetări amănunțite s-a constatat că acest lucru s-a datorat faptului că laptele de cocos era bogat în citokinine naturale.

Citokininele au efecte multiple asupra explantelor cultivate in vitro precum:

Stimulează diviziunea celulară;

Au rol esențial în formarea și creșterea lăstarilor;

Prezintă rol important în procesele de regenerare adventivă a lăstarilor (organogeneză directă);

Formarea rădăcinilor este în general inhibată de acțiunea citokininelor;

Stimulează formarea lăstarilor axilari și creșterea ratei de multiplicare;

Întârzie procesele de senescență și determină creșterea conținutului de clorofilă în explante.

Acțiunea citokininelor este corelată cu cantitatea de auxine prezente în mediul de cultură. Așadar raportul auxine-citokinine este esențial în determinarea și reglarea unor procese vitale de creștere și dezvoltare a explantelor.

Aportul exogen de citokinine poate fi îmbunătățit prin introducerea în mediul de cultură a unor extracte organice (drojdie de bere, germeni de porumb, lapte de nucă de cocos) (Ghiorgiță și Nicuță, 2005).

Cele mai utilizate citokinine în culturile in vitro sunt reprezentate de: kinetina (K sau Kin), zeatina (Z), benzilaminopurina (BAP) sau benziladenina (BA), izopentiladenina (2IP). Citokininele ca și auxinele nu sunt solubile în apă pentru a se obține soluții stoc ele se diluează în hidroxid de sodiu diluat sau acid clorhidric.

În anul 1957, Skoog și Miller ( după Ghiorghiță și Nicuță, 2005) au fondat conceptul de control fitohormonal al organogenezei ca urmare a observării efectului fiziologic combinat al auxinelor și citokininelor.

Reacția fitoinoculilor este diferită în funcție de balanța hormonală din mediul nutritiv a celor două tipuri principale de fitohormoni, astfel: dacă în mediul nutritiv există o concentrație crescută de auxină alături de o citokinină favorizează procesul de rizogeneză, dacă în mediu concentrația de citokinine este mai ridicată decât cea de auxine este stimulată formarea de mugurași și tulpinițe, o cantitate egală dar ridicată atât de auxine cât și de citokinine induce formarea de calus și proliferarea acestuia dar și organogeneză.

Reacția morfologică a fitoinoculilor reprezintă rezultatul interacțiunii dintre balanța hormonală și conținutul hormonal endogen, natura explantului, tipul de explant cultivat, starea fiziologică e explantului etc.

[NUME_REDACTAT] sunt fitohormoni ce au acțiune diferită comparativ cu auxinele și citokininele. Acești fitohormoni au fost identificați pentru prima dată în mediul de cultură al ciupercii Gibberella fujikuroi, fiind eliberate de miceliul acesteia. Acest tip de hormoni circulă în plantă prin vasele liberiene iar sinteza în plante a acestora se realizează în frunzele foarte tinere, în mugurii activi, în embrioni și extremitățile rădăcinilor.

Dintre gibereline cea mai activă substanță este acidul giberelic (GA3) fiind cel mai frecvent utilizat în culturile in vitro. Sunt utilizate doar în mediile în care explantul posedă meristeme în structura sa, giberelinele inhibând dediferențierea celulară. Prin autoclavare, 90% din activitatea biologică a GA3 se pierde, și din acest motiv este nevoie ca sterilizarea acestuia să se facă prin filtrare.

Rolul fiziologic pe care îl îndeplinesc giberelinele nu este cunoscut în totalitate, însă se știe că acestea au următoarele efecte:

Stimularea alungirii lăstarilor, fiind recomandate în acest sens după stabilizarea culturii de meristeme pentru formarea noilor lăstari;

Înlăturarea dormansului la semințe și embrioni și stimularea germinării;

Reglarea formării auxinelor endogene;

Controlul proceselor de formare a florilor dar și a fructelor partenocarpice, etc;

Inhibarea formării lăstarilor și rădăcinilor adventive.

Acidul abcistic (ABA) este destul de rar utilizat, acesta fiind cunoscut ca inhibitor al creșterii și dezvoltării plantelor, utilizarea lui făcându-se pentru a stimula intrarea în repaus a plantelor.

Folosirea acestuia în culturile in vitro este limitată datorită efectelor sale negative.Totuși există și situații în care, utilizat în concentrații reduse, acidul abcistic poate regla creșterea și dezvoltarea explantelor în primele faze ale embriogenezei somatice.

Etilena are acțiune asupra auxinelor endogene și exogene intensificându-le activitatea, poate declanșa fenomenul de hiperhidrie (formă de neoplazie apărută la vitroplante). Forma comercială a acestui fitohormon este Ethrel sau Ethefon prin descompunerea acestuia obținându-se etilena (gaz) și acidul fosforic.

Adăugarea acesteia în mediul de cultură, dacă este nevoie, se face prin filtare la rece în concentrații de cca 1- 0,1 mg/l.

Efectele etilenei în cele mai multe cazuri sunt negative: determină oprirea creșterii explantelor, induce fenomenul de senescență și determină căderea frunzelor, determină inhibarea procesului de embriogeneză somatică.

[NUME_REDACTAT] obicei, mediile nutritive utilizate pentru tehnologia de cultivare in vitro sunt solide. Pentru a obține această consistență a mediului, se adaugă în compoziția acestuia agent gelifiant. Cel mai folosit agent de gelificare este agar-agarul un polizaharid extras din algele roșii ale genului Gelidium.

Acesta se prezintă sub forma unei pulbere de culoare galben murdar ce se topește în apă la o temperatură apropiată de 100̊ C și prin răcire sub 40̊ C se formează un gel transparent, mai mult sau mai puțin solid în funcție de marcă, concentrație, pH și puritate. Soluția de agar se poate turna sau pipeta dar dacă aceasta se gelifică trebuie reîncălzită la baie-marină sau microunde pentru a se lichefia din nou.

Cantitatea de agar necesară în soluția nutritivă diferă în funcție de natura culturilor și de tipul inoculilor, aceasta variind între 0,6 – 1% ( Ghiorghiță și Nicuță, 2005). Se mai pot utiliza pe lângă agar și alți agenți gelifianți precum: silicagelul, biogelurile sau geluri de poliacrilamidă și acestea având rezultate foarte bune.

[NUME_REDACTAT] constituie cel mai important component al materiei vii. Prin pierderea apei din țesuturi fie prin osmoză fie prin uscăciune se produce mai întâi pierderea turgescenței celulare apoi deshidratarea țesuturilor, fenomen ce împiedică funcționarea optimă a celulelor, de aceea și explantarea și inocularea se realizează repede.

Pierderea apei în mediul in vitro este datorată fie umidității scăzute din camera de creștere fie obturării defectuoase a flacoanelor de cultură, toate acestea ducând la deshidratarea mediului și a țesutului. Astfel, mediul pierde apă iar gelul cu agar își micșorează volumul și crapă. De aceea transferarea inoculilor trebuie realizată pe mediul proaspăt iar umiditatea din camera de creștere trebuie să fie de aproximativ 80%.

Pentru prepararea mediilor de cultură se folosește apă bidistilată sau deionizată, apa de robinet conținând diferiți compuși anorganici (ioni grei și săruri), organici (detergenți, rezidii, clorderivate) sau particule în suspensie nu poate fi utilizată în acest scop. Apa bidistilată se obține cu ajutorul bidistilatoarelor, iar prin trecerea apei distilate prin coloane de rășini schimbătoare de ioni se realizeză apa deionizantă.

Un avantaj al apei distilate este acela că ea poate fi păstrată în urma preparării în vase închise de sticlă sau material plastic.

2.1.1.2. Prepararea mediului de cultură

După ce se adaugă în mediul nutritiv zaharoza și hormonii, înainte de sterilizare, se stabilește pH-ul ce trebuie să fie cuprins între 5,5 și 5,8 unități (Ghiorghiță și Nicuță, 2005) în funcție de tipul de explant, de specie și de cultură.

Sterilizarea reprezintă ultima etapă în prepararea mediilor de cultură. Aceasta se realizează prin autoclavare la o temperatură de 120̊ C și presiune de 1 atm, timp de 20- 30 minute. În ceea ce privește sterilizarea substanțelor termolabile, cum sunt vitaminele sau unii hormoni, aceasta se realizează prin filtrare, după care vor fi adăugate în mediul ce a fost autoclavat și răcit (la 45̊ – 50̊ C).

Vasele de cultură pot fi reprezentate de vase Erlenmayer, eprubete, cutii Petri, vase speciale. Acestea sunt acoperite cu folie de staniol sau dop de vată și sunt sterilizate la etuvă, la o temperatură de 160º C timp de 1 -2 ore. În laboratoare mari se utilizează vase de plastic, de unică folosință, sterile.

Inocularea se realizează după răcirea mediului nutritiv. Atât supraautoclavarea cât si subautoclavarea sunt nefavorabile mediului de cultură. Supraautoclavarea determină alterarea calității mediului datorită deteriorării echilibrului ionic din acesta și datorită afectării calității agarului iar subautoclavarea induce dezvoltarea coloniilor de microorganisme ceea ce face mediile inutilizabile.

Pentru sterilizare se mai pot utiliza și oale de fiert sub presiune, tip kukta, durata sterilizării în oala de fiert fiind de 15 – 25 minute din momentul declanșării emiterii de vapori.

Mediile de cultură lichide se pot steriliza și la rece prin filtrare, utilizând filtre Milipor sau nuci filtrante. Acestea vor fi sterilizate la autoclav, înfășurate în folie de aluminiu și se vor păstra la 4 – 10º C.

2.1.2. Materialul biologic

Materialul vegetal folosit pentru inițierea culturilor in vitro reprezintă un fragment de plantă prelevat de la o așa numită ,,plantă mamă,, și denumit explant.

În momentul inițierii culturii in vitro, în ceea ce privește materialul vegetal este necesar să se țină cont de proveniența acestuia (specie, genotip, varietate, regim ecologic), de originea și natura țesuturilor recoltate, de vârsta plantelor sau a organelor donatoare de explant, cât și de pregătirea prealabilă a explantelor (se pot aplica, dacă este cazul, anumite pretratamente nutriționale, hormonale sau termice) și de starea fiziologică a plantelor donatoare.

Alegerea materialului biologic reprezintă un prim factor important pentru inducerea reacției morfogenetice dorite a explantului, aceasta fiind dependentă de interacțiunea cumulată și a altor factori ce stau la baza tehnologiei de cultivare in vitro (mediul de cultură, tipul și concentrația fitohormonilor, condițiile de cultivare). Se cunoaște faptul că explante de același tip dar recoltate de la soiuri diferite (în aceeași perioadă de vegetație) se pot comporta diferit pe aceeași variantă de mediu și în condiții identice de creștere.

În anul 1990 cercetătorul Raicu a clasificat explantele în două mari categorii:

Explante ce conțin celule nediferențiate (apex, muguri, noduri sau meristeme);

Explante provenite din țesuturi diferențiate, ale căror celule sunt specializate.

După ce au fost inoculate pe mediul nutritiv explantele urmează calea morfogenetică dată de interacțiunea tuturor factorilor endogeni și exogeni.

2.1.2.1. Sterilizarea explantelor

Pentru eliminarea bacteriilor, ciupercilor sau a altor microorganisme este necesară sterilizarea materialului vegetal. Acest proces trebuie să fie complet și să nu afecteze integritatea țesuturilor și a celulelor vegetale.

Dacă aseptizarea nu este eficientă apar infecții în mediu de cultură cu mucegaiuri și bacterii determinând astfel distrugerea calității mediului și deprecierea explantelor inoculate. De regulă infecțiile apar după 7-10 zile, dar există și contaminări interne care nu se manifestă de-a lungul mai multor subculturi.

Metoda sterilizării trebuie adaptată în funcție de tipul materialului biologic utilizat, de calitatea acestuia precum și de intensitatea de acțiune a substanței sterilizante. Astfel procesul de sterilizare cuprinde trei etape standard și anume:

Spălarea cu apă curentă sau imersarea în alcool etilic 70% cca 1 minut;

Imersia într-o soluție sterilizantă (pentru un timp diferit, în funcție de factorii menționați anterior);

Spălări cu apă distilată sterilă în mod repetat.

Se cunosc diverse tipuri de agenți sterilizanți, a căror timp de acțiune și utilizare diferă în funcție de tipul de fitoinocul și de specia utilizată. Spre exemplu hipocloritul de calciu într-o concentrație de 9 – 10%, într-un timp de 5- 30 minute realizează o sterilizare foarte eficientă iar apa oxigenată de concentrație 10 – 12% timp de 5 – 15 minute determină o sterilizare bună.

2.1.3. Inocularea și incubarea explantelor

După ce a fost realizată sterilizarea este recomandată inocularea rapidă a explantelor pe mediile nutritive, pentru a fi evitată degradarea acestora. Această etapă se realizează la nișa cu aer steril, astfel evitându-se infectarea culturilor. Procedeul de inoculare este unul simplu, mai ales atunci când se folosește mediu nutritiv solid. Astfel acesta constă în plasarea explantelor în vasele de cultură, pe mediile nutritive. Pentru aceasta se folosesc pense sterile, care după fiecare operație de inoculare a unui vas, se sterilizează prin imersarea acesteia în alcool și flambare la un bec de gaz.

Atunci când se realizează plasarea fragmentelor vegetale pe mediul de cultură trebuie să se țină cont de fenomenul de polaritate, deoarece fiecare fragment are o porțiune bazală (“radiculară”) ce tinde să formeze calus sau rădăcini, și o porțiune superioară (“foliară”) la nivelul căreia apar mugurași (Gautheret, 1959).

Densitatea explantelor în fiecare vas se stabilește în funcție de tipul de fitoinocul utilizat. Astfel în fiecare vas inoculat densitatea fitoinoculilor nu trebuie să fie foarte mare, pentru a exista o bună aprovizionare cu substanțe nutritive a acestora.

După ce se inoculează cu material vegetal, pentru a evita contaminarea culturilor, fiecare vas, cât și folia acestuia, se flambează la becul de gaz. Următoarea etapă este reprezentată de trecerea flacoanelor în camera de creștere, unde sunt menținute într-un regim climatizat programat. Odată cu această etapă începe perioada de incubare ce variază în funcție de tipul culturii, de specie și de tipul de explant utilizat.

Creșterea și dezvoltarea explantelor inoculate depinde foarte mult și de condițiile de lumină și de temperatură existente în camera de creștere, și nu doar de substratul nutritiv. Se cunoaște faptul că cerințele celulelor inoculate nu sunt identice, astfel că primele procese regenerative încep să fie observate după 1-2 săptămâni de la inoculare (în cazul speciilor ierboase) iar la speciile de natură lemnoasă reacția devine evidentă după 40-60 zile sau mai puțin în funcție de specie, deoarece procesele regenerative sunt mai lente.

Pe toată durata perioadei de cultivare in vitro, în funcție de ceea ce se dorește să se obțină, se pot realiza culturi secundare prin transferul fitoinoculilor pe aceeași variantă nutritivă sau pe alte variante noi.

Condiții de cultivare in vitro la diferite specii

În vederea unei bune dezvoltări a plantelor care apar în urma incubării explantelor sau a inoculilor, aceștia trebuiesc crescuți în camere sau incinte climatizate, cu umiditate, temperatură și iluminare condiționate.

Temperatura optimă pentru cultivarea explantelor in vitro este de 25º C±2. Dacă este nevoie de un regim de temperatură se utilizează incubatoare, dulapuri sau incinte climatizate, cu lumină fluorescentă cu regim programat. Pe rafturi flacoanele vor fi dispuse la o distanță convenabilă de sursa de lumină, pentru a se preîntâmpina supraîncălzirea recipientelor și pentru a se putea asigura un regim termic corespunzător creșterii inoculilor.

Fotoperioada. Se obișnuiește utilizarea a 16 ore de lumină și 8 ore de întuneric spre o creștere și incubare optimă a culturilor in vitro.

Umiditatea din camera de creștere trebuie să fie peste 50% pentru a preîntâmpina deshidratarea mediilor. Această nu trebuie să fie nici prea ridicată deoarece favorizează dezvoltare mucegaiurilor.

Schimbul de gaze este realizat pasiv (prin difuziune) sau activ (prin agitare). În cazul mediilor de cultură lichide este utilizată agitarea prin mișcări rotative sau prin barbotarea acestora cu aer steril sau oxigen.

Intensitatea luminoasă. Diferă în funcție de scopul urmărit și de tipul de inoculi. Cel mai frecvent utilizată este lumina fluorescentă, difuză, cu o intensitate de 1 Klux, dar uneori, într- o anumită etapă de dezvoltare a culturilor este recomandată iluminarea de 2-10 Klucși. Unii cercetători folosesc lumina florescentă pentru a favoriza creșterea anumitor tipuri de inoculi și a organogenezei.

2.1.4. Acomodarea vitroplantelor ex vitro

Scopul principal al tehnologiei de cultivare in vitro este reprezentat de obținerea de neoplantule. Neoplantulele astfel obținute trebuie acomodate la mediul septic înainte de transplantarea lor în câmp.

Acomodarea poate fi realizată prin mai multe metode, dintre care: trecerea lor în ghivece cu sol steril sau alte amestecuri de înrădăcinare și meținerea acestora în incinte cu umiditate ridicată, cu scopul de a împiedica transpirația abundentă sau sistemul hidroponic (regeneranții sunt cultivați în vase de sticlă sau plastic, pline cu apă, a căror umiditate se menține fie prin acoperirea cu vase asemănătoare, fie prin introducerea lor în incinte special amenajate).

Umiditatea aerului se reduce treptat prin expunerea regeneranților la mediul obișnuit, astfel încât după o perioadă de 10 – 14 zile ei vor fi complet acomodați și vor putea fi transferați în ghivece cu sol în amestec cu perlit ori turbă, câmp sau sere.

Procesul de acomodare a neoplantulelor la mediul septic este dificil pentru plante întrucât el presupune o adaptare morfo-fiziologică a regeneranților la un nou mod de viață și trebuie tratate cu mare atenție deoarece pierderile de material biologic trebuie să fie cât mai mici.

Deasemenea o atenție deosebită trebuie acordată și transplantării regeneranților în câmp. Acest aspect presupune coordonarea a două procese reprezentate de: producerea de regeneranți sincronizată cu perioada optimă de transfer a plantelor în câmp, pentru a se evita astfel noi pierderi de material vegetal obținut in vitro.

2.2. Reacția morfogenetică

Morfogeneza reprezintă diferențierea histolitică a celulelor. Astfel evoluția celulelor în cadrul acestui proces este diferită, fapt datorat capacității lor organogenetice sau embriogenetice.

La nivelul celulelor vegetale cultivate in vitro fenomenele de morfogeneză se află sub controlul diverșilor factori interni și externi. Astfel prin interacțiunea acestora celulele explantelor suferă transformări, ale căror rezultat este reprezentat de apariția unui calus (calusogeneză sau calogeneză), generarea de organe- rădăcinițe și/sau tulpinițe (rizogeneză și caulogeneză),fenomen ce poartă numele de organogeneză. De asemenea, sub influența celor două categorii de factori, are lor și transformarea celulelor somatice în embrioni, a căror evoluție este asemănătoare cu cea a embrionilor zigotici, iar pentru ca derivă din celule ale corpului poartă numele de embrioni somatici. Acest fenomen de apariție a embrionilor somatici din celulele explantelor cultivate in vitro se numește embriogeneză somatică.

Factorii ce sunt implicați în determinarea reacției morfogenetice a explantelor cultivate in vitro sunt multipli, și pot fi grupați în două categorii:

a) factori interni

Conținutul endogen în regulatori de creștere;

Starea de dezvoltare a materialului donor;

Natura și vârsta țesuturilor din care sunt recoltate explantele;

Competența morfogenetică a explantelor cultivate, etc.

b) factori externi

Tipul și concentrația fitohormonilor introduși în mediul nutritiv;

Compoziția mediului de cultură în săruri minerale și compuși organici;

Raportul și concentrația dintre diferiți constituienți ai mediului nutritiv (compuși organici, hormoni de creștere);

Factori fizici (temperatura, lumina, la care sunt incubate culturile in vitro).

2.2.1. Generarea calusului în culturile in vitro (calusogeneza)

Calusul reprezintă o formațiune tisulară ce are rol în cicatrizarea rănilor care apar în mod natural la plante.Acest calus este constituit dintr-o masă informă de celule de natură parenchimatică, cu structură histologică uniformă. Atunci când calusul este tânăr celulele lui sunt nediferențiate și se divid activ.

În cazul culturii in vitro acest calus poate să fie generat din diferite tipuri de explante (muguri, internodii, fragmente de frunze, semințe imature, rădăcini, etc.). Astfel, fiind inoculate pe diverse variante hormonale de mediu, apare o dediferențiere a celulelor respectivelor țesuturi, celule ce devin nespecializate, care încep să se dividă activ și să dea naștere calusului.

Inducerea calusului , viteza de creștere, culoarea și aspectul lui sunt influențate de mai mulți factori ca: tipul și concentrația fitohormonilor din mediul nutritiv, condițiile de incubare a culturilor. S-a constatat faptul că cele mai bune rezultate în inducerea și proliferarea calusului s-au obținut pe mediile care conțin 2,4-D (Cachiță, Cosma, 1987).

Creșterea calusului in vitro este nedefinită deoarece acesta poate fi separat în fragmente mai mici care apoi pot fi cultivate pe medii nutritive proaspete. Pentru a fi păstrată viabilitatea celulelor calusale, este indicat ca repicarea acestuia să fie făcută la 2-6 săptămâni (ținând cont de natura țesuturilor de origine, de condițiile de cultivare precum și de viteza de proliferare a celulelor). Dacă această operațiune nu se face în perioada indicată are loc o îmbătrânire a culturii.

După trecerea unei perioade de timp în masa celulelor nediferențiate a calusului este posibilă apariția unei citodiferențieri spontane ce presupune prezența unor centri meristematici. Astfel morfologia calusului poate fi schimbată prin apariția organelor (rădăcini și/sau tulpini) sau a embrionilor ce dau naștere la plantule. Există, însă, multe cazuri în care calusul rămâne nediferențiat din punct de vedere celular, acesta proliferând fără a se metamorfoza.

Calusul poate fi clasificat, în funcție de mai multe criterii, astfel:

a) după aspect:

Compact sau dur (celulele sunt strâns conectate între ele);

Lax sau friabil (celulele pot fi separate cu ușurință, fie în fragmente granulate de diferite mărimi- calus grunjos, fie în formațiuni tisulare fine- calus spumos).

b) după originea lui:

Primar (obținut din inoculul inițial și conținând o populație de aproximativ 50.000 de celule);

Secundar (provine din calusul primar, care după ce a fost cultivat o perioadă pe mediul de inducere a fost transferat pe un mediu proaspăt de cultură).

c) după răspunsul dat în cultură:

Regenerativ sau embriogen (dă naștere la noi plante, fiind dens, cu zone compacte, cu celule nediferențiate, capabile de a genera embrioni);

Neregenerativ sau neembriogen (generează rădăcini, rar mugurași și niciodată plante).

Sub raportul generării calusului în lumea plantelor există o mare variabilitate.În general formarea calusului este strâns legată de prezența auxinelor în mediul nutritiv, însă, există specii care produc calus chiar și pe mediul lipsit de fitohormoni (MS).

Mediile de cultură care sunt optime pentru obținerea de calus regenerativ sunt cele sărace în azot, cu un pH de 5,5 (Badea și Săndulescu, 2001).

Capacitatea calusului de a regenera plante se poate menține o perioadă îndelungată la unele specii, dacă repicarea acestuia este făcută în condiții optime. Capacitatea embriogenă a calusului depinde de genotip, de tipul și de concentrația fitohormonilor din mediul de cultură, de condițiile de cultivare.

Calusul se poate utiliza și pentru a studia reacția celulei vegetale la acțiunea unor substanțe sau la diferite condiții de cultivare. Astfel pot fi realizate experiențe de fiziologie vegetală pe calus, pentru a clarifica aspecte legate de creștere, respirație, morfogeneză, testarea variabilității celulare, cercetări de enzimologie, etc.

2.2.2. Organogeneza in vitro

Organogeneza este, în culturile in vitro, este un proces complex care presupune generarea de rădăcini (rizogeneză) și/sau tulpini (caulogeneză). Organogeneza și direcția dezvoltării acesteia este influențată de factori ca: conținutul endogen de fitohormoni din explante, aportul exogen de hormoni, regimul de iluminare a plantelor, temperatura din camer ade creștere.

Formarea de tulpini și/sau rădăcini poate avea loc direct din celulele explantului (organogeneză directă) dar și din masa de calus care poate lua naștere prin dediferențierea celulelor explantului (organogeneză indirectă).

2.2.2.1. Caulogeneza

2.2.2.1. [NUME_REDACTAT] reprezintă fenomenul de formare, creștere și dezvoltare a tulpinilor. În cadrul culturilor in vitro acest fenomen presupune apariția și dezvoltarea lăstarilor terminali, axilari, adventivi sau neoformați pe un calus. Lăstarii care au provenit din calus sunt considerați un tip particular de lăstari adventivi și au primit denumirea de “lăstari de neoformare” (Margara, 1982). Lăstarii neoformați pot apărea direct pe explantul inițial (caulogeneză directă) sau, la nivelul calusului dezvoltat din explantul inițial (caulogeneză indirectă).

Neoformarea mugurașilor din calus este esențială atunci când se urmărește multiplicarea unei plante sau a unui genotip. Procesul este stimulat în primul rând de prezența citokininelor în mediul de cultură. Acest fenomen este, însă, indus și prin asocierea citokininelor cu auxinele, aceasta dacă se respectă un anumit raport auxine/citokinine.Inducerea caulogenezei indirecte este influențată și de factori precum: specia, genotipul, proveniența și natura explantului.

Explantele răspund diferit în condiții identice de cultivare, fapt pentru care, se încearcă întotdeauna echilibrarea conținutului endogen de fitohormoni. Uneori se poate declanșa caulogeneza reducându-se concentrația de auxine, alteori a fost posibilă formarea de mugurași prin adăugarea în mediul nutritive a unor compuși fenolici, ce par să reducă nivelul de auxine, prin stimularea activității IAA- oxidazei, (Lee și Skoog, 1965- la tutun).

Dintre citokinine cea mai frecvent utilizată în inducerea caulogenezei este kinetina.Pe langă aceasta se mai utilizează BA (benziladenină), unele substanțe din clasa auxinelor (IAA- acid indolilacetic, NAA- acid naftilacetic, IBA- acid indolilbutiric). Giberelinele influențează formarea lăstarilor. În general, însă, acestea inhibă inducerea caulogenezei, dar uneori facilitează creșterea ulterioară a meristemelor (Margara, 1969).

În ceea ce privește inducerea caulogenezei din calus rezultate pozitive se obțin prin repicarea și subcultivarea succesivă a acestuia, inițial pe mediu bogat în 2,4-D (10-7M sau 10-6M) dar și în prezența unei auxine ce are efect redus dar care este folosită în concentrație mare (NAA sau IBA, 10-6-10-5M) sau combinată cu o citokinină în concentrație medie. Dacă este cultivat pe un mediu nutritiv cu aport scăzut de auxină dar cu concentrație mare de citokinină, calusul poate genera muguri de lăstari (Anghel et al., 1985).

Factorii externi (temperatura, lumina, compoziția mediului nutritiv) influențează și ei caulogeneza. Acțiunea acestora depinde în mare măsură de tipul inoculilor și de etapele parcurse anterior. Temperatura optimă pentru desfășurarea procesului de caulogeneză este de 25˚C.

Inducerea mugurilor, de cele mai multe ori, necesită un anumit tip de explant. Astfel explantele prelevate din embrioni, din plantule sau din inflorescențe au cea mai bună reacție în generarea de lăstari. Reacția variază, însă, și în funcție de specie, fapt pentru care este destul de dificil de stabilit organele cele mai potrivite pentru a fi donatori de explante.

Numeroase experimente de micropropagare ce au fost realizate pe specii de plante medicinale și aromatice au indicat faptul că inducerea neoformării de mugurași, intensitatea fenomenului, aspectul lăstarilor precum și capacitatea de supraviețuire a acestora, depind de o gamă mare de factori: specia luată în studiu, genotipul, stadiul de dezvoltare al plantelor donor, tipul explantului inoculate dar și de tipul și concentrația regulatorilor de creștere din mediu (Ghiorghiță și Onisei, 1990).

2.2.2.2. Rizogeneza in vitro

Rizogeneza este un fenomen de organogeneză des întâlnit în multiplicarea vegetativă, inclusiv în culturile in vitro. Apariția acestui fenomen depinde de factori precum: originea explantului, natura și mărimea explantului, starea fiziologică a celulelor din explant.Fitohormonii, în special auxinele endogene și exogene, au un rol foarte important în exprimarea rizogenezei.

Regimul de lumină este un alt factor ce are efect cert asupra procesului de rizogeneză: intensitatea slabă a luminii sau expunerea pentru un timp scurt la lumină stimulează procesul de rizogeneză. Astfel temperatura optimă desfășurării acestui fenomen este indictă în jurul valorii de 26˚C.

Deseori, când este vorba de cotiledoane, noduri, vârfuri de lăstari, formarea rădăcinilor este localizată polar. Astfel acestea se formează la polul radicular al explantului, pe când generarea mugurilor este localizată la polul foliar.

Fenomenul de apariție a rădăcinilor din calus sau din alte explante poate fi speculat în practică atunci când sinteza unor principii active din plante este specifică rădăcinilor. Există, insă, și cazuri în care explantele nu au capacitate rizogenetică, dar o dobândesc în mod secundar în urma microcultivării sau sub influența interacțiunii unor factori.

Efectul cel mai mare asupra formării și dezvoltării rădăcinilor îl au fitohormonii din categoria auxinelor. [NUME_REDACTAT] și Gautheret în anul 1963 au menționat ca fiind necesar în mediul de cultură prezența acidului naftilacetic (NAA) ca factor ce declanșează rizogeneza. Totuși, cercetările arată că cel mai eficient fitohormon pentru generarea rădăcinilor este acidul 3-indolilacetic (IAA), acesta fiind o auxină nativă care se acumulează în concentrații importante chiar la locul de formare și, mai apoi, circulă către zona de inițiere a meristemelor care vor genera rădăcini.

A fost semnalat în literatură că efectul auxinei este important numai la prima introducere a acesteia în substratul nutritiv. Dacă din cadrul rădăcinilor neoformate este prelevat un butaș și retratat cu auxină, procesul rizogenetic nu mai are loc. Din această constatare apare și supoziția că există un factor rizogen în celulele din zona de formare a rădăcinilor, factor ce este epuizat sau inactivat în cadrul primului tratament.

Cu toate că se cunosc multe aspecte legate de formarea rădăcinilor in vitro, încă nu se cunoaște în detaliu care sunt mecanismele intime ale acestui proces de rizogeneză. O dovadă în plus a celor afirmate este și faptul că la unele specii apariția rădăcinilor poate fi indusă prin cultivarea explantelor și pe medii ce nu au regulatori de creștere, fapt ce denotă că nivelul fitohormonilor endogeni de la nivelul explantelor este suficient pentru ca procesul de rizogeneză să fie declanșat.

2.2.3. Embriogeneza somatică

În mod normal termenul de embriogeneză face referire la dezvoltarea embrionului din celula ou, fenomen ce apare atât la animale cât și la plante. În cazul culturilor in vitro oricare celulă vegetală vie își poate exprima totipotența, generând un embrion, care, putând să apară din orice celulă somatică, poartă numele de embrion somatic. Formarea acestor embrioni este datorată diviziunii repetate a celulelor somatice, ce se organizează morfostructural după tipicul embrionului zigotic (Ghiorghiță și Nicuță, 2005).

Apariția embrionilor somatici poate avea loc direct din explant, derivând direct din țesuturile inoculate in vitro (embriogeneza directă) sau, din calusurile formate pe explantul inițial ori în culturi celulare (embriogeneză indirectă). Diferența care apare între cele două tipuri de embriogeneză este următoarea: embriogeneza directă apare din celule pro-embriogenice determinate, în timp ce, embriogeneza indirectă necesită dediferențierea celulelor cu funcții specializate, proliferarea calusului și inducerea celulelor embriogene.

Cachiță și Cosma (1987) au realizat o clasificare a embrionilor în două tipuri:

1. Embrioni zigotici- apar din zigot prin fertilizarea ovulului;

2. Embrioni ne-zigotici- embrioni generați in vivo sau formați in vitro din alte celule decât zigotul. Aceștia se împart la rândul lor astfel:

Embrioni somatici- cei care derivă din celule ale sporofitului. Din această categorie făcând parte și embrionii adventivi, care au luat naștere direct din alți embrioni, organe sau celule;

Embrioni partenogenetici, sunt cei apăruți din ovule nefertilizate;

Embrioni ginogenetici, care derivă din celule ale gametofitului femel.

Atât în cultura de calus cât și în cea de celule, studiile anatomice și histologice

Capitolul 3

TEHNICI UTILIZATE ÎN ANALIZA FITOCHIMICĂ

Capitolul 4

CALENDULA OFFICINALIS – PLANTĂ DE INTERES ECONOMIC

4.1. Încadrare sistematică

4.2. Importanță economică

4.3. Scopul cercetărilor

[NUME_REDACTAT] officinalis este cunoscută, încă din Antichitate, ca plantă cu un conținut ridicat de compuși bioactivi, ce prezintă o importanță economică mare, fiind utilizată în industria farmaceutică și cosmetică, și mai rar în cea alimentară. De aceea, cercetările noastre s-au axat atât pe evidențierea reacției morfogenetice a explantelor de apex, nod și frunze, pe mai multe variante nutritive în scopul identificării formulelor hormonale ce generează cel mai bun randament în obținerea de lăstari sau calus, cât și pe analiza fitochimică a unor regeneranți obținuți in vitro. Utilizarea acestor formule identificate de noi, pot conduce la obținerea unei mari producții de material vegetal care să poată fi supus extracțiilor biochimice, obținându-se în acest fel compuși bioactivi în cantitate ridicată. De asemenea, din calus, prin specularea variabilității somaclonale, se pot obține genotipuri valoroase în ceea ce privește conținutul în anumite principii active. Aceste genotipuri ar putea fi multiplicate utilizând mediile nutritive care permit acest lucru.

Capitolul 5

MATERIAL ȘI METODĂ DE CERCETARE

Pentru a atinge obiectivele propuse în prezenta lucrare am recurs la inițierea culturii in vitro la specia Calendula officinalis. În acest sens am utilizat material semincer, obținut de la ………

Semințele au fost sterilizate la nișa de aer cu flux laminar, prin imersare în soluție de cloramină T 5% timp de 20 minute. Pentru îndepărtarea soluției sterilizante materialul vegetal a fost clătit de 3 ori cu apă distilată sterilă.

Vasele utilizate pentru cultură au fost reprezentate de flacoane Erlenmayer de tip B care au fost sterilizate în autoclav la o temperatură de 220° C timp de 180 de minute.

Semințele sterilizate au fost apoi inoculate în mai multe vase ce conțineau ca mediu nutritiv, mediul de bază MS (Murashige-Skoog), lipsit de fitohormoni. Vasele astfel inoculate au fost transferate în camera de creștere Sanyo în condiții controlate de temperatură (23°C) și lumină (2500 Lx) și o fotoperioadă de 16 ore (16 ore lumină și 8 ore întuneric).

Neoplantulele obținute in vitro au fost utilizate ca sursă de explante (noduri de lăstari, apexuri, fragmente foliare) pentru evidențierea reacției morfogenetice a speciei Calendula officinalis.

Pentru a testa reacția morfogenetică a diferitelor tipuri de explante am preparat mai multe variante nutritive ale mediului de bază Murashige-Skoog (1962), suplimentat cu diferite concentrații și combinații de fitohormoni, (tabelul …). Sursa de carbon a fost reprezentată de zaharoză, iar ca agent gelifiant am utilizat agar – agarul.

Culturile au fost urmărite periodic, iar observațiile privind reacția morfogenetică au fost notate într-un caiet al laboratorului. La unele variante nutritive am calculat randamentul de producere a lăstarilor. Au fost realizate și fotografii ale diverselor stadii de cultură, cu ajutorul unui aparat foto digital FujiFilm.

În următorul tabel sunt prezentate doar variantele hormonale unde au fost evidențiate diverse reacții morfogenetice la gălbenele.

Tabelul – Variantele hormonale pe care au reacționat unele explante prelevate de la Calendula officinalis

Materialul vegetal obținut in vitro de pe unele variante hormonale (MS-proba martor, A2, BB1, BB2, BA1, BA2, B2, B1) a fost supus apoi unor extracții biochimice pentru a face o comparație între vitroplantele obținute pe mediul MS fără hormoni și vitroplantele obținute pe mediile suplimentate cu diferite formule hormonale, în ceea ce privește conținutul în compuși bioactivi. Regeneranții utilizați în acest scop au avut aceeași vârstă (2 luni de cultură in vitro).

Pentru realizarea extractelor s-au parcurs, pentru fiecare mediu de cultură luat în studiu, mai multe etape: s-au extras regeneranții de pe mediul de cultură, s-au spălat sub jet de apă rece, cu mare grijă, apoi a avut loc uscarea lor prin tamponare cu hârtie, pentru a îndepărta restul de apă rămas în urma spălării. A urmat apoi analizarea acestora care a presupus măsurarea și cântărirea întregii vitroplante, măsurarea rădăcinii, tulpinii, frunzelor și cântărirea fiecărei părți (după ce au fost separate). Materialul astfel pregătit a fost depozitat la -20˚C, în congelator, pentru realizarea ulterioară a extactelor.

Din partea vegetală a vitroplantelor s-au realizat extracte alcoolice folosind un raport total între probă și solvent de 1:20 g/ml, realizat în două etape, astfel: în prima etapă s-a utilizat un raport de 1:15 g/ml probele stând în acest solvent aproximativ 23ore și 30 minute. Acestea au fost puse la ora 15 și timp de 3ore au fost agitate din 30 în 30 de minute; au stat apoi în repaus peste noapte iar dimineața au fost din nou agitate tot 3ore din 30 în 30 de minute, după care au fost filtrate. În cea dea doua etapă s-a folosit cantitatea de solvent rămasă, adică 1:5 g/ml, cu care s-a clătit proba după filtrare.

Extractele astfel obținute au fost analizate cu ajutorul cromatografiei în strat subțire. Aceasta este o metodă de separare și purificare a compușilor organici, simplu de realizat, ce presupune existența a două faze: faza staționară, reprezentată de plăcuța cromatografică, care poate fi din silice depusă pe un strat subțire de aluminiu sau sticlă (noi am folosit aluminiul) și faza mobilă care include solventul de polaritate diferită, la care aderă compușii existenți în extract.

Am realizat două plăcuțe cromatografice pe care am spotat material biologic obținut de pe mediile nutritive. Pe prima plăcuță s-a spotat din material corespunzător mediilor MS (I), A2 (II), B1 (III), B2 (IV), câte 3 capilare. Pe plăcuța a doua a fost spotat material de pe mediile BB1 (1), BB2 (2), BA1 (3), BA2 (4).

Capitolul 6

REZULTATE ȘI DISCUȚII

Inițierea culturii in vitro la Calendula officinalis nu a ridicat probleme în ceea ce privește infestarea culturilor, datorită faptului că explantele utilizate (apexuri, noduri de lăstari, fragmente foliare), au fost prelevate din neoplantule obținute in vitro.

Reacția fitoinoculilor a fost testată pe numeroase variante nutritive, reprezentate de diferite concentrații de fitohormoni sau combinații de regulatori de creștere.

6.1. Reacția morfogenetică a explantelor de Calendula officinalis

Observațiile realizate de noi au evidențiat o reacție diversă a explantelor inoculate pe variantele testate. Această reacție morfogenetică a explantelor a depins de interacțiunea dintre genotip, mediul de cultură (în special formula hormonală) și condițiile de cultivare.

[NUME_REDACTAT] morfogenetică a specie Calendula officinalis

6.2. Analiza fitochimică a unor regeneranți obținuți in vitro

Plăcuțele cromatografice realizate au fost revelate atât cu ochiul liber cât și în UV. În urma analizei plăcuțelor cu ochiul liber am constatat prezența unor compuși diferiți, aceștia putând fi identificați prin culoare diferită (în cazul nostru galben, verde, vernil) a căror intensitate a fost diferită la probele testate, comparativ cu martorul.

Plăcuțele au fost citite și la UV, deoarece există clase de compuși ce nu se observă cu ochiul liber.

[NUME_REDACTAT] anormală a unor lăstari

[NUME_REDACTAT]

Capitolul 7

CONCLUZII

Pe majoritatea variantelor nutritive din explante de apex și nod au rezultat noi lăstari cu o rată de multiplicare de cca. 1-2 lăstari/explantă.

Cele mai bune variante în privința caulogenezei au fost BA1, BA2, KA1, BB1.

La mediul MSIII prezența acidului giberelic a favorizat creșterea în dimensiuni a lăstarilor și frunzelor.

S-au observat de asemenea că pe unele vase de cultură apar lăstari cu aspect anormal.

Calusul s-a format atât la baza lăstarilor, fenomen observat pe mediul BA1, cât și la nivelul frunzelor care veneau în contact cu mediul nutritiv.

Rezultate foarte bune pentru formarea rădăcinilor s-au observat pe mediul BB1.

BIBLIOGRAFIE

BREZEANU A., DORINA CACHIȚĂ-COSMA, BAVARU A., 2000, Actualități și prespective în biotehnologia vegetală, Ed. [NUME_REDACTAT] press, Constanța;

DORINA CACHIȚĂ-COSMA., ARDELEANU A., 2009, Tratat de biotehnologie vegetală VOL.2, Ed.Dacia, Cluj-Napoca;

DORINA CACHIȚĂ-COSMA, 1987, Metode in vitro la plantele de cultură, Ed. Ceres, București;

ELENA MARCELA BADEA, DANIELA SĂNDULESCU, 2001, Biotehnologii vegetale, Fundația BIOTECH, București;

GHEORGHIȚĂ G., NICUȚĂ DANIELA., 2005, Biotehnologiile azi, Ed.Junimea, Iași;

MILIAN GURĂU, 2007, Botanică sistematică, Ed. [NUME_REDACTAT], Bacău;

PÂRVU C., 1991, Mica enciclopedie UNIVERSUL PLANTELOR, Ed.Enciclopedică;

PETRUS A., 2009, Lucrări practice de biotehnologie generală, Oradea;

RACZ G., LAZA A., COICIU E., 1986, Plante medicinale și aromatice, Ed.Ceres.

VERZEA M., FLORENTINA RĂDUCANU, 2007, Genetica și ameliorarea plantelor, AN. I.N.C.D.A. Fundulea, Vol LXXV, [NUME_REDACTAT].