STUDII PRIVIND PROPRIETĂȚILE UNUI PRODUS COSMETIC PE BAZĂ DE OXID DE ZINC NANOSTRUCTURAT [309996]

LUCRARE DE

Student: [anonimizat]-Alexandra Spirescu

2016

STUDII PRIVIND PROPRIETĂȚILE UNUI PRODUS COSMETIC PE BAZĂ DE OXID DE ZINC NANOSTRUCTURAT

Cuprins

I. Partea de Literatură 6

1. Introducere 7

2. De ce cremă cu protecție solară? 8

2.1. Principiile protecției UV cu filtre anorganice 12

2.2. [anonimizat] 14

2.3. Testarea cremelor cu protectie solara 15

2.3. Oxidul de zinc 16

2.3.1. Metode de obținere a nanoparticulelor de oxid de zinc 16

2.3.1.1. Metode de sinteză a sistemelor nanostructurate 16

2.3.1.2. Sol-gel 17

2.3.1.3. [anonimizat] 19

2.3.1.4. Metoda hidrotermala 20

2.3.2. Oxidul de zinc ca filtru UV 22

2.3. Alte ingrediente ale produsului final 23

II. Contributii personale 24

1. Materiale si metode 25

1.1.Materiale 25

1.2. Prepararea nanopulberii de ZnO 25

1.3.Prepararea cremei cu protectie solara 26

2. Metode de caracterizare 27

2.1. XRD 27

2.2. SEM 27

2.3. TEM 27

2.4. IR 27

2.5. Potential ZETA 28

2.6. Analiza termogravimetrica 28

2.7. UV 28

2.8. Evaluarea in vivo a biodistributiei 28

2.9. Evaluarea in vitro a [anonimizat] 34

2.10. Evaluarea factorului de protectie solara a [anonimizat], Vol 76, No 117 June 17, 2011 21CFR Parts 201 and 310 (Labelling and Effectiveness Testing; [anonimizat]-Counter Human Use; Final Rules) 35

2.11. Evaluarea lungimii de unda critice a unui produs cu fotoprotectie conform metodei ISO 24443 (2012) „Determinarea fotoprotectiei UVA in vitro pentru un produs cu protectie solara” 43

3. Rezultate și discuții 48

3.1. XRD 48

3.2. SEM 49

3.3. TEM 51

3.4. IR 52

3.4. Potential ZETA 53

3.6. ATG/DSC 54

3.7.Absorbanță UV 58

3.8. Biodistribuția in vivo 59

Creier 59

Ficat 59

Inimă (miocard) 60

Pancreas 60

Plămân 60

Rinichi 61

Splină 61

3.9. Profilul antimicrobian 62

3.10. Evaluarea factorului de protectie solara a [anonimizat], Vol 76, No 117 June 17, 2011 21CFR Parts 201 and 310 (Labelling and Effectiveness Testing; [anonimizat]-Counter Human Use; Final Rules) 63

3.11. Evaluarea lungimii de unda critice a unui produs cu fotoprotectie conform metodei ISO 24443 (2012) „Determinarea fotoprotectiei UVA in vitro pentru un produs cu protectie solara” 67

4. Concluzii 72

Bibliografie 74

I. [anonimizat] 90% din cancerele de piele nemelanomatoase si aproximativ 86% din melanoame sunt asociate cu expunerea la radiatii UV solare.

Astazi, un cancer din trei este cancer din piele. [anonimizat] 2 si 3 milioane de cancere de piele (de tip carcinom) si 130,000 de melanoame. Incidenta cancerului de piele a crescut considerabil de-a lungul ultimului deceniu. [anonimizat] “plaja”, e cauza principala a acestei cresteri. [anonimizat], va inrautati aceasta tendinta (World Health Organisation 2007). [anonimizat] a herpesului labial []. Lotiunile cu protectie solara protejeaza ADNul impotriva deteriorarii induse de diferitele tipuri de radiatii UV si reduce dezvoltarea diversilor indici melanomici []. Astfel, utilizarea regulata a lotiunilor cu protectie solara este esentiala in preventia cancerului de piele.

Produsele destinate protectiei solare au protejat inca de mult timp impotriva eritemului indus de lumina solara, cu un nivel de performanta indicat de Factorul de Protectie Solara (Sun Protection Factor – SPF). Din moment ce parametrul SPF este influentat in principal de lungimile de unda UVB, totodata, nu este neaparat un indicator suficient pentru protectia oferita de un produs sunscreen pentru expunerea UVA.

In ani recenti, efectele distructive ale radiatiilor UVA de la soare au fost mai clar stabilite. Cu aceasta intelegere, s-a evidentiat nevoia aparitiei mai multor produse ce pfera protectie eficienta si pe intreg spectrul UVA.

Lucrarea de fata si-a propus atat descrierea modului de obtinere al unui produs cu protectie solara ce protejeaza atat impotriva UVB, cat si UVA, cat si testarea produsului in vederea stabilirii protectiei efective impotriva UVB si UVA. Decizia a fost de a realiza o crema cu protectie solara folosind oxidul de zinc care e un filtru UV deosebit de eficient, cu multiple aplicații în medicină și stomatologie.

De ce cremă cu protecție solară?

Pielea este cel mai mare organ al organismului uman, localizat pe întreaga suprafață a corpului și se alfă în contact direct constant (continuu) cu mediul exterior. Aceasta protejează celulele și țesuturile organismului de o varietate de riscuri mecanice, chimice, termice, optice, etc. Grosimea pielii depinde de regiunea corpului și variază de la 1.5 până la 4 mm []. Straturile pielii sunt epiderma, derma și un strat de grăsime subcutanată (hipoderma). Partea cea mai de sus a epidermei, deseori considerată un strat separat, este cunoscută pentru celulele moarte fara nuclei și se mai numește stratul cornos. Datele despre grosimea stratului cornos difera în diferite surse: 6-40 μm în regiuni precum abdomenul, antebrațul flexor, coapse și spate []; totuși, pe palme și tălpi, stratul este de 5-10 ori mai gros din cauza utilizării intensive a mainilor și picioarelor.

Fig. 1Straturile epidermei [].

Fig.2.Epiderma vizibilă, evidențiind stratul cornos, care la rândul lui conține trei straturi: bazal, spinos și granulos. Stratul cornos consta în aproximativ 15 straturi de corneocite. Tipul celular principalal în epiderma viabilă este keratinocitul. Căile de penetreare cutanată includ rutele paracelulară (a), transcelulară (b), care include transportul de-a lungul foliculilor piloși (c1), porilor sudoripari (c2) si glandelor sebacee (c3) [].

Influența radiațiilor solare asupra pielii prezintă numeroase avantaje:

Întărește sistemul imunitar;

Ameliorează mișcările în articulațiile tumefiate;

Atenuează parezele faciale;

Organismul uman produce vitamina D sub acțiunea ultravioletelor de tip UVB.

Vitamina D este o grupă de vitamine secosteroide liposolubile, cele două forme relevante fiziologice majore fiind vitamina D2 (ergocalciferol) și vitamina D3 (colecalciferol). Fără un indice, vitamina D se referă la D2, D3 sau ambele. Vitamina D3 este produsă în pielea vertebratelor după expunerea la lumina ultravioletă B, din sursele solare sau artificiale și apare în mod natural într-o gamă mică de alimente.

Vitamina D este dusă de fluxul sanguin până la ficat unde se transformă în prohormon de calciu. Circulând prin corp, calcidiolul se poate transforma în calcitriol, o formă biologică activă a vitaminei D, fie în rinichi, fie de monocitele-macrofage în sistemul imunitar. Când este sintetizată de o monocită-macrofagă, calcitriolul acționează la nivel local ca și o citozină, apărând organismul împotriva organismelor microbiene.

Când este sintetizată în rinichi, calcitriolul circulă ca și hormon, reglementând printre altele, concentrația de calciu și fosfat în sânge, promovând mineralizarea sănătoasă, creșterea și remodelarea osoasă și prevenind tetania hipocalcemică. Insuficiența de vitamina D poate duce la oase subțiri, fragile sau deformate, în timp ce suficiența previne rahitismul la copii, osteomalacia la adulți și, împreună cu calciul, ajută la protejarea oamenilor în vârstă care au osteoporoză. Vitamina D modulează de asemenea funcțiile neuromusculare, reduce inflamațiile și influențează acțiunea a mai multor gene care reglementează proliferarea, diferențierea și apoptoza celulelor.

Vitamina D3 este produsă în piele atunci când 7-dehidrocolesterolul reacționează cu lumina ultravioletă UVB la lungimi de unde între 270-300 nm, cu sinteza de vârf care apare între 295-297 nm. Aceste lungimi de undă sunt prezente în lumina soarelui atunci când indicele luminii UV este mai mare decât 3. La această altitudine solară de zi cu zi în timpul anotimpurilor primăvara și vara, în regiunile temperate și rareori la cercurile arctice, vitamina D3 este produsă în piele. În funcție de intensitatea razelor UVB și de timpul de expunere, echilibrul din piele se poate forma și astfel, vitamina D degenerează la fel de repede precum generează.

Pericolele și dezavantajele expunerii prelungite la soare nu aduc niciun beneficiu, ci reprezintă un risc de apariție a unor probleme grave de sănătate:

Riduri fine și îmbătrânire prematură: razele UV ale soarelui penetrează în profunzime epiderma și ajung până la moleculele de colagen pe care le descompun, formând ridurile. O data distrusă, molecula de colagen nu se mai poate regenera, iar pielea își pierde din fermitate și elasticitate.

Arsurile solare sunt datorate expunerii îndelungate la UV. Simptomele apar, de regulă, la câteva ore de la expunere, iar pielea se înroșește. Arsurile solare repetate pot afecta pielea permanent și pot declanșa apariția cancerului de piele.

Cancerul de piele se datorează unei expuneri neprotejate la soare, care e principala cauză a melanomului, unul dintre cele mai întâlnite și cele mai grave tipuri de cancer. Acesta apare sub forma unei pete maronii la nivelul pielii, are contur neregulat și o forma asimetrică. Culoarea poate fi maronie, roșiatică sau gri.

Fig. 3. Cancerul de piele și probabilitatea de manifestare a bolii.

Crema cu protecție solară este un preparat, de multe ori sub formă de cremă sau loțiune, folosit pentru a proteja pielea de razele UV nocive ale soarelui.

Radiația ultravioletă face parte din spectrul solar și acoperă intervalul dintre 100 si 400 nm și, de obicei, este împărțit în 3 subintervale: UVC (100-280 nm), UVB (280-315 nm) și UVA (315-400 nm). Radiația UVC este complet absorbită de stratul de ozon atmosferic localizat la o înălțime de 18-40 km deasupra nivelului mării. UVB și UVA penetrează atmosfera și afectează oamenii. Fracția UVB e responsabilă pentru arsuri solare si crește riscul de carcinom de celule bazale și scuamoase prin modificarea directă a ADN-ului (prin fotonii cu energie înaltă UVB) []. Fracția UVA produce bronzul, îmbătrânirea pielii și provoaca melanom malign prin modificarea indirecta a ADN-ului (prin generarea de radicali liberi care atacă ADN-ul) [4]. Bronzul moderat poate preveni arsurile solare, datorită producției crescute de melanină, care e un protector UV natural.

De când prima crema cu protecție solară comercială a fost introdusă in 1928, utilizarea produselor cu protecție solară ca parte integrală a strategiei de fotoprotecție s-a extins global. Doi factori trebuie luați în considerare pentru a produce crema ideală cu protecție solară []. Aceasta ar trebui să ofere protecție uniformă de-a lungul întregului interval UVB, dar și pe întregul interval UVA, această proprietate numindu-se “homeostazie spectrală”, care asigură că spectrul natural al soarelui este atenuat uniform. O cremă cu protecție solară ideală ar trebui, de asemenea, să aiba un profil senzorial și tactil plăcut, care să crească satisfacția utilizatorului.

2.1. Principiile protecției UV cu filtre anorganice

Oxizii micronizați anorganici folosiți în produsele cu protecție solară (TiO2 și ZnO) atenuează radiația UV prin absorbție în principal și prin împrăștiere []. În funcție de dimensiunea particulei, aceste materiale sunt semiconductoare care absorb fotonii la diferite lungimi de undă. Cu cât sunt mai mici particulele, cu atât este mai scurt picul de absorbție din spectru.

Avantajele oferite de produsele cu protecție solară bazate pe compuși anorganici cuprind absența iritării și sensibilizării pielii, inerția ingredientelor, penetrare prin piele limitată și un spectru larg de protecție. Opacitatea naturală a acestor compuși micronizați este eliminată fără să se reducă eficacitatea de a bloca UV, utilizând nanoparticule de ZnO sau TiO2. Pentru că raportul aria suprafeței/volum crește pe măsură ce diametrul particulelor scade, nanoparticulele, adică nanoobiectele cu toate cele 3 dimensiuni în nanoscală [], devin mai reactive decât materialul bulk. De aceea, siguranța produselor cosmetice care conțin nanoparticule, în particular produsele cu protecție solară, a fost frecvent discutată. Produsele cu protecție solară sunt destinate protecției UV, iar introducerea nanoparticulelor în aceste produse nu trebuie sa cauzeze mai multe probleme decât expunerea la soare în sine.

Materialele nanometrice folosite in cosmetica difera mult fata de materialele nano folosite in industrie, atat ca forma, cat si ca structura moleculara, modul lor de utilizare si maniera de interactiune cu mediul. In esenta, materialele nano din cosmetica sunt nanoemulsiile si nanopigmentii.

Nanopigmentii, precum dioxidul de titan (TiO2) si oxidul de zinc (ZnO) sunt minerale deja prezente in mediul inconjurator. Sunt folositi in produse cu protectie solara pentru capacitatea lor de a reflecta si imprastia lumina UV, astfel protejand pielea umana impotriva efectelor adverse ale radiatiilor UV, incluzand cancer []. In lotiunile pentru protectie solara, nano TiO2 este prezent in clustere mari a caror marime este mult mai mare decat 100 nm, pentru a asigura protectie optima a pielii.

SPF si UVA-PF

Factorul de Protecție Solară (Sun Protection Factor – SPF) reprezintă un factor de timp care întârzie apariția arsurilor de soare în condiții standard: în soare care emite raze UVB și UVA, la o cantitate de produs fotoprotector pe piele de 2 mg/cm². SPF reprezintă, deci, cantitatea de radiație pe care pielea o poate primi până când începe să se înroșească, atunci când se folosește o crema cu protecție, față de situația în care pielea nu este protejată. Astfel, dacă în mod normal, fără protecție, pielea începe să se înroșească, spre exemplu, după 2 minute de stat la soare, prin aplicarea unei creme cu SPF 15, durata expunerii la soare se prelungește de 15 ori mai mult, adică o jumatate de oră, iar prin aplicarea unei creme cu SPF 30, timpul maxim de expunere devine o oră. SPF-ul este un indicator specific fiecărei persoane și e influențat de o serie de factori precum sursa de lumină (spectru, intensitate), cantitatea aplicată, reactia pielii, etc. Întrucat SPF masoară timpul necesar pana la înroșirea/arderea pielii, a afirma că un produs are un SPF 15 este echivalent cu a spune ca acel produs asigură protecție UVB cu un timp de multiplicare de 15 față de timpul normal de înroșire a pielii.

Simpla menționare a factorului SPF pe un produs nu înseamnă că acesta protejează și de radiația UVA. Protecția UVA, de obicei, este specificată pe eticheta produsului. Însă, dacă filtrul UV este anorganic – cum este cazul oxidului de zinc, ambele radiatii UV (UVA și UVB) vor fi blocate.

Pentru a afla care este procentul de protecție pe care îl oferă un produs, se folosește următoarea formulă de calcul: 100 – (1/numărul SPF)*100.În urma acestei formule rezultă următoarele valori:

SPF 15 –93.3%;

SPF 30 – 96.6%;

SPF 50 – 98%.

Fig. 6.Procentul de protecție oferită de produs cu SPF 15, SPF 30 și fără SPF [].

UVA-PF se refera la factorii de protectie impotriva radiatiilor UVA (UVA protection factors). Un substitul pentru UVA-PF este si PPD (persistent pigment darkening). In loc de a masura eritemul sau inrosirea pielii, metoda PPD foloseste radiatia UVA pentru a induce o inchidere la culoare sau bronzare a pielii. Teoretic, un produs cu protectie solara cu o valoare PPD de 10 ar trebui sa ii permita unei persoane de 10 ori mai multa expunere la UVA, decat fara protectie.

Metoda PPD este o metoda de testare in vivo, precum metoda SPF. In plus, Colipa (acum Cosmetics Europe) a introdus o metoda care poate masura in vitro si ofera paritate alaturi de metoda PPD.

2.3. Testarea cremelor cu protectie solara

In 2003, asociatii din industria cosmeticelor din Europa, Japonia si Africa de Sud au dezvoltat impreuna si au adoptat prima metoda de test internationala SPF. Au fost insotiti si de asociatii din USA pentru versiunea actualizata din 2006. Dezvoltarea metodei de testare SPF a fost insotita de imbunatatirile din cunoasterea stiintifica. De asemenea, a fost acceptat faptul ca metoda SPF masoara protectia impotriva radiatiilor UVB. Aceasta metoda a devenit baza pentru standardul ISO 24444 acceptat global in 2010.

De-a lungul timpului, au aparut diverse standarde ce sunt urmarite in testarea produselor cu protectie solara: Standard EN ISO 24444:2010 Cosmetics ‐ Sun protection test methods ‐ In vivo determination of the sun protection factor (SPF), AS/NZS 2604 Sunscreen Standard, FDA Federal Register, Rules and Regulation, Vol 76, No 117 June 17, 2011 21CFR Parts 201 and 310 (Labelling and Effectiveness Testing; Sunscreen Drug Products for Over-the-Counter Human Use; Final Rules), Colipa Standard, ISO 24442:2011 – In vivo determination of sunscreen UVA protection, etc. Pentru fiecare test, protocolul urmareste un anumit standard sau o combinatie intre mai multe standarde si descrie toate procesele ce trebuiesc respectate in vederea atingerii obiectivului final – aflarea valorii SPF/UVA-PF, in vivo. De asemenea, exista si metode in vitro care pot determina SPF/UVA-PF prim metode de laborator.

Protocoalele care au ca obiectiv stabilirea valorii lungimii de unda critice pentru un produs cosmetic urmaresc majoritatea metoda ISO 24443:2012. Lungimea de unda critica identifica o cantitate de protectie UVA oferita de un produs cu protectie solara si, de asemenea, ofera o modalitate de a defini reala protectie pe spectru larg (“broad spectrum”). Asadar, masuratorile pentru lungimea de unda critica sunt intradevar benefice pentru consumatorul in cautarea unui produs cu protectie solara care ofera o protectie maxima.

Doua dintre metodele amintite mai sus vor fi discutate pe larg, in sectiunea de Contributii personale, si anume: FDA Federal Register, Rules and Regulation, Vol 76, No 117 June 17, 2011 21CFR Parts 201 and 310 (Labelling and Effectiveness Testing; Sunscreen Drug Products for Over-the-Counter Human Use; Final Rules) si Evaluarea lungimii de unda critice a unui produs cu fotoprotectie conform metodei ISO 24443 (2012) „Determinarea fotoprotectiei UVA in vitro pentru un produs cu protectie solara”.

2.3. Oxidul de zinc

2.3.1. Metode de obținere a nanoparticulelor de oxid de zinc

2.3.1.1. Metode de sinteză a sistemelor nanostructurate

Căutarea de ceramici nanostructurate care a rezultat în obținerea de materiale de înaltă performanța a condus la dezvoltarea câtorva metode chimice la nivel de laborator. Printre aceste metode chimice de sinteză se numără metoda sol-gel [], piroliza spray [], reacția de combustie lichidă [], sinteza hidrotermală [], spray drying [] și metoda Pechini [], subliniind metoda reacției de combustie, care utilizează reacțiile redox dintre produșii de descompunere ai nitratului și un combustibil, precum urea. O metodă alternativă este procesul solochimic, o metodă sol-gel care produce pulberi nanometrice, utilizat inițial pentru a produce ZnO [], unde o soluție inițială care conține un complex de zinc este descompusă pentru a forma pulberea de oxid de zinc. Un alt nume pentru această metodă este metoda solochimica în două etape (two stage solochemical method – TSSC). Metoda aceasta poate fi obținută și pentru a produce alți oxizi precum NiO și Mn2O3. Amestecul unui compus chimic pur (care conține complexul de zinc) într-un al doilea compus produce formarea de pulbere nanometrică.

Cercetările în domeniu au arătat că metoda de sinteză cât și formele nanoparticulelor obținute stabilesc domeniul de aplicabilitate a acestora. Pentru un control mai bun al dimensiunilor și al distribuțiilor acestora, forma și gradul de aglomerare a cristalitelor nanometrice, metodele de sinteză pe cale umedă sunt net superioare comparativ cu cele fizice. Printre cele mai utilizate tehnici de sinteză bazate pe reacții în mediu apos pentru prepararea particulelor oxid de zinc nanocristalin, se numara tehnica sol-gel, metoda hidrotermală și coprecipitarea.

2.3.1.2. Sol-gel

Metoda sol-gel este în prezent cea mai investigată metodă chimică de sinteză, deoarece ea poate fi aplicată unei game extrem de largi de compoziții de materiale, oferind posibilitatea de a controla forma, dimensiunile și distribuția dimensiunilor particulelor. Prin acestă metodă pot fi obținute și fibre sau filme.

În principiu, metoda sol gel constă în formarea unui sol coloidal concentrat de oxizi sau hidroxizi metalici și convertirea acestuia la un gel semirigid prin una sau mai multe căi. Solul (definit ca o dispersie de particule solide într-un mediu lichid în care cel puțin una dintre dimensiunile particulelor este cuprinsă între 1 nm și 1 μm) trebuie întai stabilizat pentru a împiedica sedimentarea dispersantului și după aceea procesat la faza de gel. Gelul format este apoi uscat și prelucrat ca un material ceramic. S-au dezvoltat două direcții de abordare a tehnicilor sol-gel, funcție de natura formatorilor de geluri:

tehnici sol-gel folosind ca precursori soluții apoase ale sărurilor metalice;

tehnici sol-gel avand soluția precursoare formată din alcoxizi.

Faza de formare a solului este deosebit de importantă, este o fază strict controlată de puritatea precursorilor, de gradul de solubilizare a acestora în soluție, de valoarea pH -ului și temperatură, pentru că toți acești factori influențează realizarea unei vascozități optime a solului, de care va depinde realizarea microsferelor. La pH-uri puternic acide sau puternic bazice, hidroxizii precipitați sau oxizii dispersați în soluție, adsorb superficial ionii hidroxil sau oxidril din soluție. Prezența sarcinilor superficiale conduce la apariția de soli, particule coloidale stabile, datorită echilibrului dintre forțele de repulsie dintre particulele incărcate și forțele de atracție, care tind să reducă suprafața liberă a sistemului prin aglomerare.

Pentru a controla morfologia pulberilor, suspensiile coloidale sunt destabilizate cu obținerea de geluri (rețele anorganice polimerice continue, semirigide) ca rezultat al legării particulelor formate prin nucleație hidrolitică (pentru diametre ale particulelor < 3 nm se formează geluri polimerice, iar pentru diametre > 3 nm, geluri coloidale). Punctul critic unde apare rețeaua infinită tridimensională este numit "punct de gelifiere". În acest punct vascozitatea η→∞ și modulul elastic E devine măsurabil.

Formarea gelurilor se realizează prin îndepărtarea apei, cel mai adesea termic. Un alt procedeu este extracția apei cu un solvent organic nemiscibil (alcooli, esteri, cetone, eteri). Procesul de stabilizare a solilor și de gelificare poate fi controlat prin prezența unor adaosuri cu proprietăți superficiale sau catalitice. Suspensiile coloidale pot fi stabilizate prin adaosul unor surfactanți care produc o stabilizare sterică. Se utilizează surfactanți solubili in apă, cu formula generală RX.

Dimpotrivă, unii catalizatori pot produce gelifierea controlată a solilor stabilizați prin descompunerea agentului de hidroliza la un pH constant (prin tamponare), corespunzător punctului de sarcină zero (p.s.z.). Față de tehnologia sol-gel din alcoxizi, frecvent citată in ultima vreme in literatură, aceste procedee au avantajul utilizării unor materii prime mai ieftine și accesibile.

Procedeele sol-gel ale compușilor organometalici au la bază hidroliza controlată a precursorilor, cu formarea în prima etapă a suspensiilor coloidale (soli) din care se formează ulterior gelul. Spre deosebire de procesele hidrolitice de precipitare și sol-gel coloidal, unde formarea fazei noi are loc printr-un proces de nucleație neomogenă, în cazul hidrolizei compușilor organo-metalici viteza de nucleație poate fi mai ușor controlată, iar faza solidă se formează printr-un mecanism de nucleație omogenă.

Dintre compușii organometalici utilizați pentru sinteza nanopulberilor cel mai adesea in literatura de specialitate sunt menționati alcoxizii metalici. Alcoxizii formează ușor alcoxizi dubli sau heterometalici prin simplă amestecare, chiar și în cazul metalelor cu electronegativitate comparabilă, prin reacții de coordinare, auto-coordinare sau coordinare transvarsală.

Combinații heterometalice pot fi obținute și prin condensarea termică a alcoxizilor și acetaților, de obicei în soluții de alcool sau în hexan, rezultând o structură polimerizată. Destabilizarea (gelarea, adică formarea unui solid coloidal conținând componentul fluid dispersat într-o rețea tridimensională) poate fi obținută prin diluarea cu apă sau hidroliză catalizată de acizi sau baze.

Dacă este utilizat un exces de apă, gelul, numit și gel coloidal sau aquagel, este format dintr-o rețea continuă de agregate de particule. Dacă apa este adăugată incet și în cantități mici, particulele de sol cresc în dimensiuni printr-o reacție de condensare-polimerizare. Se obține un gel polimeric sau alcogel.

Procesul de gelificare influențează structura și volumul porilor produselor obținute, depinzând de mai mulți factori, cum sunt: pH-ul, raportul apă/alcoxid, natura chimică a alcoxidului.

Îndepărtarea mediului de dispersie este o etapă importantă. Dacă indepărtarea are loc rapid, de exemplu prin trecerea picăturilor fine de gel printr-o coloană ce conține alcool, se obține o pulbere.

Datorită prețului ridicat al alcoxizilor sau al altor materii prime organometalice (acetați, oxalați, citrați) utilizate în sinteză, procedeul solgel este aplicat îndeosebi pentru obținerea de fibre, nanotuburi și filme subțiri. Pentru obținerea pulberilor nanodimensionale se utilizează metoda hidrolizei rapide.

2.3.1.3. Metoda co-precipitării

Metoda coprecipitării este deseori folosită pentru prepararea catalizatorilor metal/suport, în care conținutul de metal activ este mult mai mare decât la cei preparați prin impregnare, este precipitarea concomitentă a ionilor metalului activ cu cei ai metalului suport sub formă de combinații greu solubile. Prin această metodă se prepara catalizatori de cupru, fier, cobalt si nichel. Soluția apoasă a amestecului de săruri (azotați, cloruri, acetați –se evita sulfații) se coprecipită cu carbonat de sodiu, sau hidroxid de sodiu. Prin această metodă, componenții precipită în mod practic total, astfel că raportul între componenți luat inițial în soluția apoasă inițiala rămâne neschimbat.

Coprecipitarea este o metodă simplă și ieftină de obținere a unor cantități mari de nanopulberi de ZnO. Analizele de difracție de raze X ale nanopulberilor obținute in literatură au pus în evidență structura de tip wurtzit a ZnO. Analizele SEM ale nanopulberilor au evidențiat formarea de particule cu dimensiuni mai mici de 100 nm.

Această metodă oferă o serie de avantaje: necesită manipulare minimă, aparatură simplă, materii prime ieftine, temperatură de sinteză scăzută, controlul ușor al dimensiunii și compoziției particulelor, precum și omogenitate chimică excelentă a produsului final.

Așadar, coprecipitarea este metoda adecvată pentru sinteza oxidului de zinc la temperatura mică și cu grad de puritate înalt. Principalul dezavantaj al coprecipitării îl reprezintă faptul că procesul este limitat la soluțiile cationilor cu produși de solubilitate similari. Materiile prime utilizate în mod frecvent sunt hidroxizii, carbonații, sulfații și oxalații. Este cunoscut faptul că în solide morfologia și microstructura particulelor depind atât de natura precursorului cât și de parametrii experimentali ai întregului proces [].

Metoda de sinteză are loc în două etape: obținerea precursorului prin metoda de coprecipitare și respectiv formarea nanopulberilor de ZnO prin descompunere termică.

Coprecipitarea, metoda de sinteză propusă pentru obținerea nanopulberilor de ZnO este o metodă economică deoarece este simplă, iar reactivii chimici utilizați sunt ieftini și netoxici. Așadar, obținerea nanopulberilor de ZnO prin metoda de coprecipitare este indicată pentru sinteza la scară industrială a acestora. Nanopulberi de calitate superioară pot fi obținute relativ ușor prin metoda de coprecipitare. Condițiile optime de sinteză sunt temperatura de calcinare de 400 °C și timp de calcinare de 4h. În comparație cu metoda sol-gel, în procesul de coprecipitare se utilizează materii prime ieftine și nu este necesară apelarea la solvenți organici. De aceea, metoda de coprecipitare reprezintă o alternativă excelentă pentru realizarea la scară industrială a nanopulberilor.

2.3.1.4. Metoda hidrotermala

Metoda hidrotermală este o metodă de creștere de materiale cristalizate din soluții apoase de săruri, la temperaturi între 100 si 200 o C și presiuni de 1 si 5 atm superioare presiunii atmosferice utilizând o autoclavă (Fig. 8 a). Funcție de valorile temperaturii și presiunii, în raport cu valorile corespunzătoare punctului critic al apei care este mediu de reacție (Tc = 647,4 K si Pc = 22,11 MPa), metodele hidrotermale se pot desfășura:

în condiții subcritice (373 – 473 K si 1-2 MPa), metoda convențională,

în condiții supracritice (673 – 773 K si 30 – 40 MPa).

Creșterea temperaturii determină creșterea vitezei de hidroliză și a celei de condensare și deshidratare a produșilor de hidroliză, cu generarea structurii cristaline a oxidului. La valori ale temperaturii și presiunii situate deasupra punctului critic, apa își modifică proprietățile (densitate, vâscozitate) cu implicații majore asupra mecanismului și implicit asupra proprietăților produsului de sinteză. Controlând atmosfera de reacție prin valorile temperaturii și ale presiunii din sistem se pot controla simultan dimensiunea, forma și cristalinitatea particulelor obtinute.

Avantajele metodei:

-poate crește nanofire de ZnO la temperaturi (70–90 0C ) și presiune atmosferică scăzute peste suprafețe mari;

– permite utilizarea substraturilor multicristaline și chiar amorfe;

-versatilitate și simplitatea metodei;

-se pot obține nanofire de ZnO perfect aliniate;

– este o metoda nepoluanta

Dezavantaje:

– timpul necesar pentru sinteza de nanofire se întinde de la cateva ore la zile.

2.3.2. Oxidul de zinc ca filtru UV

Toate produsele de protectie solara folosesc ceea ce se numeste filtru UV, sau ingredientele speciale care ecraneaza pielea impotriva soarelui. Aceste filtre pot fi chimice sau fizice. In timp ce exista numeroase tipuri de filtre chimice, doar doua filtre fizice sunt cunoscute: oxidul de zinc si dioxidul de titan.

Cu toate că atât oxidul de zinc cât și dioxidul de titan funcționează prin blocarea fizică și reflexia radiațiilor UV, oxidul de zinc are un efect de albire mai slab și oferă protecție superioară împotriva radiațiilor UVA față de dioxidul de titan. De fapt, oxidul de zinc reprezintă filtrul UV cu cel mai larg spectru posibil, protejând de la începutul spectrului pentru UVB (290-320 nm) până la sfârșitul spectrului pentru UVA (320-400 nm). Un alt avantaj al oxidului de zinc ca filtru UV folosit în produsele pentru protecție solară este capacitatea de a calma pielea iritată, fiind un ingredient obișnuit în creme pentru iritații, arsuri solare etc. Niciun alt tip de filtru UV nu are această proprietate.

Filtrele UV chimice sunt caracterizate prin instabilitate. În timp, reacția care se desfășoară când radiația UV atinge filtrul chimic de pe piele produce degradarea filtrului și distrugerea lui, în final, devenind nefolositor. Acest fenomen nu apare în cazul filtrelor fizice. Particulele de oxid de zinc își păstrează proprietățile de protecție atâta timp cât filtrul există pe piele și nu se degradează sau nu devine instabil.

Nanoparticulele de ZnO adăugate ca filtru UV în produsele de protecție solară oferă avantaje produsului: crema (loțiunea, spray-ul) antisolară este transparentă și nu mai apare efectul de albire al pielii. Cremele sau loțiunile utilizate pentru protecția solară pe bază de particule anorganice prezintă un aspect neplacut datorită culorii albe. Această culoare se obține datorită dimensiunilor de peste 200 nm ale particulelor anorganice care împrăștie radiația luminoasă la o lungime de undă de două ori mai mare decât dimensiunea particulei.

Dacă dimensiunea particulelor este redusă, sub 200 de nm, atunci cremele sau loțiunile cu ingrediente active anorganice nu mai reflectă radiația luminoasă la o lungime de undă ce poate fi detectată de ochiul uman. De exemplu, nanostructurile de TiO2 cu dimensiunea de 100 nm vor fi invizibile pentru ochiul uman.

Avantajele folosirii ca ingredient activ in produsul cu protecție solara ale ZnO fata de TiO2 sunt urmatoarele. În primul rând, ZnO ofera o protecție mult mai importanta împotriva UVA, radație ale carei efecte asupra organismului uman includ melanomul malign. În al doilea rand, ZnO nu produce același nivel de albire al țesutului cutanat, precum TiO2, fiind mai transparent.

Fig. 9. Avatajele ZnO fata de TiO2.

Conform Opiniei despre oxidul de zinc (in forma nanometrica) a Comitetului Științific pentru Siguranța Consumatorului (SCCS) [], nu există dovezi pentru a evidenția faptul că nanoparticulele de ZnO penetrează pielea. SCCS a conclus că folosirea nanoparticulelor de ZnO de anumite caracteristici, la o concentrație de până la 25%, ca filtru UV în produse cu protecție solară este fără risc de efecte adverse la oameni dupa aplicare dermala.

Alte ingrediente ale produsului final

Celelalte ingrediente care sunt folosite în sinteza cremei cu protecție solara sunt:

Ceară de albine de uz cosmetic

Unt de shea

Ulei de cocos

Limonen (ZnO + limonen)

II. Contributii personale

1. Materiale si metode

1.1.Materiale

Ceara de albine a fost achiziționată de la SC NATURA MONDE, România, sub forma de ceara de albine purificată, pastile 25 g.

Untul de shea a fost, de asemenea, achiziționat de la Carrefour România. Untul se prezintă sub forma de Unt de shea bio pentru uz cosmetic, 100g. Untul este produs de Sunlit Romania.

Uleiul de cocos a fost achiziționat de la producatori locali, prezentându-se ca Ulei de cocos bio, de puritate înaltă.

Limonenul cu care au fost funționalizate nanoparticulele de oxid de zinc a fost procurat tot de la producatori locali.

Reactivii folosiți pentru obținerea nanopulberii de oxid de zinc (azotat de zinc – Zn(NO3)2·6H2O; hidroxid de sodiu – NaOH) au fost achiziționați de la Sigma-Aldrich.

1.2. Prepararea nanopulberii de ZnO

Pentru obținerea a 5 g oxid de zinc nefunctionalizat (ZnO) prin metoda sol-gel, am respectat următoarele etape:

am pus sub agitare magnetică 9 g azotat de zinc (Zn(NO3)2·6H2O) în 100 mL alcool metilic;

am pus sub agitare magnetică 9 g hidroxid de sodiu (NaOH) în 100 mL apă deionizată;

soluția de hidroxid este adăugată treptat peste soluția de azotat de zinc prin picurare și astfel se obține oxid de zinc;

mai departe, oxidul de zinc obținut a fost supus etapelor de spălare, centrifugare și uscare.

Pentru a doua variantă experimentală (5 g ZnO funcționalizat cu limonen – substanță fitochimică ZnO@Lim), s-au urmărit următoarele etape:

am pus sub agitare magnetică 9 g azotat de zinc (Zn(NO3)2·6H2O) în 100 mL alcool metilic;

am pus sub agitare magnetică 9 g hidroxid de sodiu (NaOH) în 100 mL apă deionizată, peste care am adăugat 200 mL limonen;

soluția de hidroxid + limonen este adăugată prin picurare peste soluția de azotat, formându-se oxid de zinc funționalizat cu substanță fitochimică (limonen);

materialul obținut a fost mai departe spălat, centrifugat si apoi uscat.

Pulberile obținute au fost caracterizate prin XRD, SEM, TEM, EDAX, IR, TGA și potențial ZETA. De asemenea, probele de oxid de zinc simplu si de oxid de zinc funționalizat au fost supuse și unor analize biologice precum studii de biocompatibilitate și activitate antimicrobiana.

Fig. 10.Fluxul de operatiipentru obținereaZnO si ZnO@Lim.

1.3.Prepararea cremei cu protectie solara

Probele de crema se realizează în dublu exemplar. În cate două pahare Berzelius s-au adăugat 0.8 g ceară de albine cu uz cosmetic, care se lasă la topit pe baie de apă până când întreaga cantitate de ceară devine lichidă. Pasul urmator este adăugarea untului de shea, tot pentru topire. Se adaugă 3.2 g de unt de shea în același pahar Berzelius. După topirea untului de shea, amestecul se omogenizează și apoi se adaugă 3.2 g de ulei de cocos.

După ce ingredientele adăugate sunt omogenizate, peste amestec se adaugă pulberea de oxid de zinc simplă (în primul pahar – 1.6 g oxid de zinc), iar în celalalt pahar Berzelius se adaugă nanopulberea de oxid funcționalizată cu limonen (1.6 g oxid de zinc funționalizat cu limonen). Amestecurile sunt omogenizate și se lasă pana cand ajung la temperatura camerei. Ulterior, crema cu protectie solara a fost caracterizata din punct de vedere fizico chimic.

2. Metode de caracterizare

2.1. XRD

Pentru evaluarea cristalinității prin difracție de raze X a probelor obținute, s-a utilizat un echipament de tip difractometru Shimadzu XRD 6000. Scanarea s-a efectuat la temperatura camerei, cu o radiație de Cu Kα =1.056 Å (15 mA și 30kV), într-un unghi Bragg 2θ = 10- 80.

2.2. SEM

Pentru efectuarea analizei de microscopie electronică de baleiaj, s-a utilizat un echipament de tip microscop electronic FEI echipat cu EDX, având un fascicul de electroni secundari cu energii de 30 keV. Probele au fost pregătite prin plasarea pe o bandă de carbon atașată de un suport metalic.

2.3. TEM

Pentru efectuarea analizei de microscopie electronică prin transmisie, s-a utilizat un echipament de tip Tecnai ™ G2 F30 S-TWIN HR-TEM (FEI Company, Hillsboro, OR, USA) echipat cu SEAD (selected area electron diffraction). Pregătirea probelor a constat în dispersarea pulberilor în etanol, urmată de sonicare, timp de 15 minute, după care s-au realizat diluții successive ale suspensiilor pentru obținerea unei concentrații mici din probele de analizat. Următorul pas a constat în plasarea suspensiilor pe o grilă de carbon-cupru, ce a fost răcită, în vederea efectuării analizei. Microscopul a fost setat în modul transmisie la 300 kV, cu punct de rezoluție de 2Å și rezoluția liniei de 1Å.

2.4. IR

Analiza IR a fost realizată cu ajutorul unui microscop Nicolet iN10 MX FT-IR, cu detector MCT, răcit cu N2 lichid. Colectarea spectrelor s-a făcut în modul de reflexive la o rezoluție de 4 cm-1, pentru fiecare spectru fiind realizate câte 32 de scanări, care au fost mai apoi suprapuse și convertite pentru aflarea maximului de absorbanță utilizând soft-ul OminoPicta (Thermo Scientific). Pentru fiecare probă au fost analizate câte 250 de spectre.

2.5. Potential ZETA

Potentialul zeta a fost masurat utilizand ecuatia Helmholtz–Smoluchowsky, cu un aparat Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd.,United Kingdom).Înainte de măsurătorile pentru potențialul zeta, tuturor probelor li s-a adăugat soluție 0.9% NaCl, pentru a corecta conductivitatea dispersiilor apoase de nanoparticule de oxid de zinc la o valoare de aproximativ 50 lS/cm. Toate măsurătorile au fost realizate la o temperatură de 25 °C, în triplicat și s-a notat valoarea medie.

2.6. Analiza termogravimetrica

Analiza termică a nanostructurilor de oxid de zinc a fost realizată pentru a investiga schimbarile în starea de cristalit a probelor. Analizele TG/DSC pentru nanoparticulele de oxid de zinc, atât simple cât și funcționalizate, și ale celorlalte ingrediente folosite pentru realizarea cremei au fost efectuate utilizând aparatul Netzsch STA 449C Jupiter (TG-DSC). Analizele s-au realizat în creuzet din alumina (Al2O3), între temperatura camerei și 900 °C. Viteza de încălzire a fost de 10K/min. Analiza a fost realizată în atmosferă dinamică, 20mL/min aer uscat.

2.7. UV

Aparatul folosit este Able Jasco V560, cu accesoriu pentru măsurarea reflexiei difuze a probelor solide. Spectrele au fost înregistrate în domeniul 200-900 nm cu o viteză de scanare de 200 nm/min.

2.8. Evaluarea in vivo a biodistributiei

Cercetările histologice s-au efectuat în cadrul Centrului pentru Studii de Morfologie Microscopică și Imunologie, Universitatea de Medicină și Farmacie din Craiova.

I. Tehnica histologică de includere în parafină

Pentru cercetările histologice, fragmentele de organe interne (creier, ficat, plămân, rinichi, splină), recoltate corespunzător și fixate în formol tamponat (pH 7.2–7.4), au fost prelucrate pentru includere în parafină.

Tehnica histologică de includere în parafină prezintă următoarele etape:

1. Deshidratarea;

2. Clarificarea;

3. Parafinarea;

4. Includerea propriu-zisă;

5. Secționarea blocului de parafină;

6. Lipirea secțiunilor microscopice pe lame și uscarea lor.

I. 1. Deshidratarea

Înainte de prelucrare, fragmentele de organe fixate în formol se spală sub jet de apă, cca. 2–4 ore. Deshidratarea probelor este obligatorie, deoarece apa nu este miscibilă cu mediul de includere (parafina). Reactivul folosit de obicei pentru deshidratare este etanolul. Este necesară trecerea succesivă a probelor histologice prin mai multe băi de etanol de concentrații diferite, aranjate în ordine crescătoare. Durata deshidratării este diferită, în funcție de mărimea piesei și de natura fixatorului. O deshidratare incompletă are drept consecință o impregnare insuficientă cu parafină, la rândul ei provocând deficiențe la secționare. Dimpotrivă, prelungirea deshidratării peste timpul necesar poate duce la întărirea exagerată a pieselor și astfel secționarea lor va deveni dificilă.

Pentru deshidratare, probele histologice au fost trecute succesiv printr-o baterie de flacoane care conțineau etanol de diferite concentrații: 750, 900, 960 (două băi), etanol absolut (trei băi). Pentru a preveni evaporarea și hidratarea reactivilor, deshidratarea se face în vase speciale închise etanș, cu o capacitate suficient de mare pentru a permite ca volumul de deshidratant să fie de 10–20 ori mai mare decât volumul probelor. La trecerea dintr-un flacon în altul, fragmentele de organe sunt zvântate ușor pe o hârtie de filtru, pentru a nu impurifica băile următoare.

Etanol 750 75 min.

Etanol 900 75 min.

Etanol 960 (I) 75 min.

Etanol 960 (II) 75 min.

Etanol absolut (I) 75 min.

Etanol absolut (II) 75 min.

Etanol absolut (III) 75 min.

I. 2. Clarificarea

Pentru faptul că deshidratarea s-a realizat cu un reactiv nemiscibil cu parafina (etanolul), se impune eliminarea completă a acestuia din probele de analizat. Prin urmare, etanolul a fost îndepărtat cu ajutorul unui reactiv volatil, miscibil cu parafina, o hidrocarbură aromatică – xilenul –, care se elimină rapid atunci când probele histologice se află în termostat la impregnare. În această etapă, unele fragmente de țesuturi sau organe devin translucide („clarificate”).

Clarificarea s-a realizat la temperatura camerei, în flacoane de sticlă înguste și înalte, prevăzute cu dop rodat sau cu un capac etanș. Cantitatea de reactiv pentru clarificare (xilen) dintr-o baie a fost de cca. 20 de ori mai mare decât volumul probelor de analizat, care se lasă libere pe fundul flacoanelor. Durata clarificării variază în funcție de natura țesuturilor și de grosimea fragmentelor de țesuturi sau organe. Pentru unele țesuturi durata este ușor de apreciat, deoarece pe măsură ce sunt impregnate cu xilen piesele devin transparente. Din acest moment este suficientă încă o baie de 15 min. cu xilen proaspăt, după care piesele pot fi trecute în parafină. Durata clarificării trebuie corect apreciată, deoarece depășirea limitei optime duce întotdeauna la întărirea pieselor, care devin greu sau imposibil de secționat.

Xilen (I) 60 min.

Xilen (II) 60 min.

I. 3. Parafinarea

Etapa de parafinare urmează deshidratării și clarificării. Pătrunderea probelor, până în cele mai mici interstiții, cu parafină topită și solidificarea lor în bloc, prin răcire, s-a efectuat cu scopul obținerii unei consistențe omogene, fără de care nu este posibilă realizarea unor secțiuni plane și subțiri. Operația decurge la cald, la termostat, la o temperatură care depășește cu 2–30C punctul de topire al parafinei (560C). Pentru băile de parafină au fost alese recipiente scunde, cu un diametru mare, din sticlă, fără capac. Durata menținerii pieselor în băile de parafină variază în funcție de dimensiunile pieselor, de consistența lor, precum și de natura clarificatorului întrebuințat (pentru clarificatori mai volatili durata este mai scurtă).

S-au utilizat trei băi de parafină, timpul de menținere a probelor fiind diferit:

Parafină (I) overnight

Parafină (II) 60 min.

Parafină (III) 60 min.

Pentru utilizare, parafina a fost topită în etuvă, la 60–700C. Pentru mărirea elasticității s-a adăugat ceară de albine, în proporție de 5–10%. După omogenizare, amestecul a fost filtrat prin hârtie de filtru, cu o pâlnie obișnuită, în etuvă, la 60–700C. Trecerea pieselor dintr-o baie în alta s-a efectuat rapid, pentru a evita solidificarea parafinei.

I. 4. Includerea propriu-zisă

În această etapă, probele histologice, bine îmbibate cu parafină topită, au fost înglobate în blocuri de parafină solidificate, de consistență omogenă. Ca formă pentru turnarea blocurilor, s-au folosit mici matrițe de plastic. Se toarnă puțină parafină topită în matriță și cu o pensă încălzită la flacără se scoate piesa din ultima baie de parafină din termostat și se scufundă în parafina din formă. Piesa trebuie orientată cu fața care trebuie secționată în jos, spre tăvița matriței. Se umple matrița cu parafină. Piesa se lasă până când parafina din formă se solidifică perfect. Includerea în parafină s-a realizat cu ajutorul unei stații de tip SLEE (SLEE Medical GmbH, Mainz, Germania), compusă din dispenser automat de parafină, cu plită încălzită (SLEE MPS/P1) și cu plită răcită (SLEE MPS/C).

Stație SLEE (MPS/P1, MPS/C), de includere în parafină a probelor histologice.

I. 5. Secționarea blocului de parafină

Secționarea blocurilor de parafină s-a realizat cu un microtom motorizat de tip MICROM HM355s (MICROM International GmbH, Walldorf, Germania). Pentru secționare, blocurile s-au montat cu fața unde se găsește proba spre cuțitul microtomului, iar cu partea opusă au fost prinse de port-obiect. Primele mișcări de secționare s-au efectuat cu microtomul reglat la o grosime de 20–25 μm. Secțiunile de la început s-au realizat doar prin parafină. Astfel, s-a verificat dacă panglica de secțiuni se formează corect. Când operația este efectuată corect, secțiunile succesive aderă una de alta, formând o bandă rectilinie. Dacă totul decurge normal și s-a pătruns suficient în piesă, se trece la grosimea de 5 μm, pentru realizarea de colorații histologice uzuale (Hematoxilină–Eozină). Prima secțiune subțire este susținută atent cu o pensulă, astfel încât panglica ce se constituie treptat să fie ușor tracționată. Capătul panglicii se prinde cu ajutorul unei pensule uscate, se ridică de pe cuțitul microtomului și se așează cu fața lucioasă (fața dinspre cuțit) pe o placă neîncălzită, pentru ca în acest fel secțiunile microscopice să poată fi lipite pe lame de sticlă.

Microtom motorizat MICROM HM355s.

I. 6. Lipirea secțiunilor microscopice pe lame și uscarea lor

Lamele de sticlă trebuie să fie perfect curate și degresate. Etalarea secțiunilor microscopice s-a realizat într-un cristalizor cu apă distilată încălzită la cca. 400C. Cele mai bune secțiuni au fost detașate cu bisturiul și apoi transferate cu fața lucioasă în jos, în cristalizor. Sub acțiunea căldurii, secțiunile s-au destins singure și apoi au fost culese una câte una pe lamele port-obiect. Lamele s-au introdus în cristalizor, plasate oblic sub secțiuni, după care s-au ridicat încet. Lamele scoase din apă s-au tamponat ușor cu hârtie de filtru și apoi s-au așezat pe un stativ, lăsând să se scurgă apa. După un timp scurt de contact cu aerul, stativul cu lame a fost introdus la termostat, unde a fost lăsat timp de 12–24 de ore. Lamele scoase din termostat sunt perfect uscate, iar secțiunile microscopice bine întinse și aderente.

II. Tehnica histologică de colorare cu Hematoxilină–Eozină

Tehnica uzuală de colorare cu Hematoxilină–Eozină (HE) cuprinde următoarele etape:

II. 1. Deparafinare, prin trecerea lamelor microscopice prin două băi succesive de xilen:

Xilen (I) 15 min.

Xilen (II) 15 min.

II. 2. Hidratare, prin trecerea succesivă a secțiunilor microscopice prin soluții de etanol de concentrații descrescătoare:

Etanol absolut (I) 5 min.

Etanol absolut (II) 5 min.

Etanol 960 5 min.

Etanol 900 5 min.

Etanol 750 5 min.

II. 3. Spălare cu apă de robinet.

II. 4. Colorarea nucleilor cu Hematoxilină Mayer, timp de 10–15 min.

II. 5. Spălare cu apă de robinet.

II. 6. Diferențiere în etanol clorhidric, timp de 2–3 s. Etanolul clorhidric a fost preparat după următoarea formulă:

Etanol 960 100 ml

Acid clorhidric conc. 5 picături

II. 7. Spălare cu apă de robinet.

II. 8. Virare în soluție de carbonat de litiu, timp de 3–5 s.

II. 9. Spălare cu apă de robinet.

II. 10. Colorarea secțiunilor cu Eozină, timp de 3–5 s.

Eozină etanolică 3 g

Eozină apoasă 3 g

Orange G 0.6 g

Etanol 700 350 mg

Acid acetic glacial 5 ml

Soluție saturată de carbonat de litiu 65 ml

II. 11. Spălare cu apă de robinet

II. 12. Spălare în etanol 700 până când reactivul nu se mai colorează, iar secțiunile de pe lamele microscopice capătă o culoare violet.

II. 13. Deshidratare în etanol 960: două băi succesive, a câte 5 min.

II. 14. Deshidratare în etanol absolut: trei băi succesive, a câte 5 min.

II. 15. Clarificare în xilen: trei băi succesive, a câte 5 min.

II. 16. Montare. Secțiunile microscopice au fost montate pe lame cu balsam de Canada și au fost păstrate la termostat, la o temperatură de 370C, aprox. 24 de ore.

Prin tehnica uzuală cu Hematoxilină–Eozină (HE), nucleii celulelor se colorează în albastru-violet (în funcție de conținutul de cromatină), citoplasma celulelor apare colorată în roz, fibrele de colagen se colorează în roz palid, iar fibrele elastice și de reticulină nu se evidențiază.

III. Fotografierea secțiunilor microscopice

Fotografiile secțiunilor colorate cu Hematoxilină–Eozină au fost obținute la un microscop binocular de tip Nikon Eclipse 55i (Nikon Instruments, Apidrag, România), folosind obiectivele ×10, ×20, ×40 sau ×100.

Achiziția și prelucrarea imaginilor s-a realizat prin cuplarea microscopului cu o cameră video de înaltă definiție Nikon DS–Fi1 (Nikon Instruments, Apidrag, România), prin intermediul pachetului de programe Image-Pro Plus ver. 6.0 (MediaCybernetics, Marlow, Buckinghamshire, Marea Britanie).

Microscop binocular Nikon Eclipse 55i, cuplat cu o cameră video de înaltă definiție Nikon DS–Fi1, pentru studii de microscopie optică.

Pentru analiza histologică s-au folosit câte doi șoricei per probă.

Șoriceii au fost inoculați intraperitoneal, în zona inghinală, cu 200 μL din fiecare dispersie de nanostructuri funcționalizate polar, 1 mg/mL, realizată în apă ultrapură (ser fiziologic), din fiecare material, sterilizată prin iradiere cu UV timp de 30 de minute.

La două intervale, de șapte și respectiv de 14 zile de la administrarea nanostructurilor, animalele au fost eutanasiate, după anestezie generală cu eter etilic, în scopul recoltării organelor vitale: creier, ficat, inimă (miocard), pancreas, plămân, rinichi, splină. După recoltare, fragmentele de organe au fost spălate în TFS (tampon fosfat salin), pentru îndepărtarea sângelui, și apoi conservate în formaldehidă 10%, la temperatura camerei, timp de 72 de ore.

2.9. Evaluarea in vitro a profilului anti-microbian

Tulpinile bacteriene de referințã S. aureus si E. coli (ATCC, US) au fost folosite în studiul actual. Testarea din punct de vedere cantitativ ale ZnO și ZnO@Lim pentru determinarea concentrației minime de inhibare (CMI) s-a efectuat prin tehnica de microdiluției în mediu lichid (supa Mueller Hinton – Mueller Hinton broth) folosind o placã cu 96 de godeuri. Microdiluții seriale duble (twofold serial microdillutions) au fost realizate în 200 µL mediu. Diluțiile au variat în funcție de materialul testat și de tulpina bacterianã, în concordanțã cu recomandarile CLSI. În același timp, godeurile au fost însãmânțate cu 50 µL din fiecare suspensie cu tulpini bacteriene, ajustate la 0,5 din densitatea MacFarland (0,5 MacFarland density) (1-3x108CFU/mL). Probe de control pozitiv și negative au fost folosite. Dupã incubarea la 37oC pentru 24 ore, rezultatele au fost verificate macroscopic pentru creștere bacterianã, CMI corespunzând godeului in care mediul ramane limpede, așadar fãrã creștere microbianã vizibilã.

2.10. Evaluarea factorului de protectie solara a produsului cosmetic in vivo conform FDA Federal Register, Rules and Regulation, Vol 76, No 117 June 17, 2011 21CFR Parts 201 and 310 (Labelling and Effectiveness Testing; Sunscreen Drug Products for Over-the-Counter Human Use; Final Rules)

I. Introducere

Acest tip de studiu isi propune sa determine factorul de protectie solara (Sun Protection Factor – SPF) al produsului “SOL0991S” dupa aplicare standardizata pe spatele subiectului, urmata de expunere la UV dupa conditii stabilite de sponsor in acord cu FDA Federal Register, Rules and Regulation, Vol 76, No 117 June 17, 2011 21CFR Parts 201 and 310 (Labelling and Effectiveness Testing; Sunscreen Drug Products for Over-the-Counter Human Use; Final Rules).

Studiul este executat pe un produs cosmetic a carui siguranta a fost asigurata de un toxicolog, cu scopul de a determina SPF al produsului care va fi utilizat de un numar generos de consumatori sub conditii de uz normale si predictibile.

Acest protocol standard contine informatii generale si necesitatile de respectat atunci cand acest tip de studiu clinic este efectuat. Informatii aditionale legate de studiu sau produsele investigate vor fi oferite de Sponsor inainte de inceperea studiului intr-un e-mail/document.

II. Obiectivele studiului

Evaluarea Factorului de Protectie solara a unui produs cosmetic, aplicat in cantitate standardizata pe zone definite, pe spatele subiectului adult sanatos, in acord cu FDA Monograph Volume 76, No 117 21CFR Parts 201 and 310 (Labelling and Effectiveness Testing; Sunscreen Drug Products for over-the- Counter Human Use; Final Rules).

III. Metoda

Plan experimental

Acest studiu este considerat un studiu comparativ, randomizat, cu un produs de referinta.

Instrumentatie

Cuantificarea SPF este facuta utilizand un simulator solar UV.

Sursa UV:

Lampa Xenon: Solar Light tip Multiport 601-300W,

Filtru WG320 (1.2 mm)

Spectru:

290 – 400 nm. (Spectrul de iradiere si conformitatea cu necesarul %RCEE sunt prezentate in raportul de calibrare al sursei UV folosite).

Sursa de lumina (simulatorul solar):

Simulatorul solar folosit pentru determinarea SPF-ului pentru un produs medicament cu protectie solara este fistrat astfel incat produce un spectru emis continuu de la 290 la 400 nm similar cu lumina naturala de la soare la nivelul marii, la un unghi al zenitului de 10° cu o limita de 1500 W/cm2 per iradianta totala pentru toate lungimile de unda intre 250 si 1400 nm; are mai putin de 0.1% din totalul de energie de output alcauit din lungimi de unda non-solare, mai scurte decat 290 nm. In plus, simulatorul solar nu are fluctuatii care depind de timp semnificative (maxim 20%) in radiatiile emise dupa un timp corespunzator de incalzire si demonstreaza o buna uniformitate a facicolului (pana in 10%) in planul de expunere. Doza livrata la situl de expunere se incadreaza in 10% din doza asteptata.

Pentru a asigura faptul ca simulatorul solar livreaza spectrul corespunzator de radiatie UV, spectrul de emisie al lui este calibrat cel putin anual cu un sistem spectroradiometric adecvat, exact calibrat. Mai mult, intensitatea radiatiei simulatorului solar este monitorizata zilnic cu un radiometru in banda larga cu un raspuns cantarit pentru a se potrivi cu spectrul de actiune eritematos in ISO 17166 CIE S007/E numit „Erythemal reference action spectrum and standard erythema dose” (radiometrul este el insusi calibrat anual utilizand comparatii cu spectroradiometrul).

In plus, simulatorul solar este recalibrat daca se produce orice schimbare a lampii sau a componentelor optice (i.e. filtre, oglinzi, lentile, dispozitive colimatoare, etc).

Elimiarea IR si a radiatiei vizibile:

Filtru UG11 (1 mm).

Suprafata radiata:

Cel putin 5 orificii (diametru de 8 mm – suprafata 0.5 cm2) separate de o distanta de 10 mm.

Puterea lampii:

300 W

Sistemul destinat determinarii dozei minime eritemale (minimal erythemal dose – MED):

Fluxul UV al fiecarei fibre optice este determinat de un operator in acord cu SPF-ul asteptat al produselor. Din moment ce sistemul este utilizat cu un flux constant, toate fibrele sunt deschise in acelasi timp.

CR400 Minolta Chromameter®: pentru masuratori colorimetrice ale pielii.

Sistem daylight:

Raspunsul eritemal al fiecarui site este evaluat folosind iluminare fluorescenta care provine de la o sursa ce emite cel putin 500 lux.

Principiu

Doza minima eritemala (MED) pe pielea umana este definita ca cea mai mica doza de radiatie UV care produce eritem al pielii perceptibil care nu este ambiguu, cu margini definite, aparand pe majoritatea campului expus la UV, la 16-24 de ore de la expunerea UV.

Doza DEM pentru piele neprotejata (MEDu) este determinata pe un site de test care nu are produs cu protectie solara aplicat. Med pentru pielea protejata (MEDp) este determinat pe un site ce are produs aplicat.

MEDp este determinat pentru valoarea SPF standard (ssMEDp). De asemenea, MEDp este determinat si pentru produsul de investigat (tpMEDp).

Expunerea UV pentru MED

Pentru fiecare subliect, MEDu, ssMEDp si tpMEDp sunt determinate prin administrarea unei serii de cate 5 doze UV crescatoare pe site-ul de test corespunzator. Doza din mijloc in fiecare dintre aceste serii (i.e. a treia doza) ar trebui sa fie egala cu doza initiala MEDu inmultita cu valoarea SPF asteptata. De retinut este faptul ca SPF asteptat este 1 si 16.3 pentru MEDu si respectriv pentru ssMEDp.

Dozele UV ramase din serii depind de valoarea SPF asteptata a produselor de investigat.

Pentru produsele cu un SPF asteptat mai mic decat 8 si pentru zona neprotejata, dozele UV care vor fi administrate sunt crescute cu un procent de 25% cu fiecare doza succesiva, de ex. 0.64X, 0.80X, 1.00X, 1.25X si 1.56X, unde X reprezinta valoarea SPF asteptata.

Pentru produsele cu un SPF asteptat intre 8 si 15, dozele UV care vor fi administrate sunt crescute cu 20% cu fiecare doza succesiva, de ex. 0.69X, 0.83X, 1.00X, 1.20X si 1.44X, unde X reprezinta valoarea SPF asteptata.

Pentru produsele cu un SPF asteptat mai mare de 15 si pentru produsul de referinta, dozele UV care vor fi administrate sunt crescute cu 15% cu fiecare doza succesiva, de ex. 0.76X, 0.87X, 1.00X, 1.15X si 1.32X, unde X reprezinta valoarea SPF asteptata.

Factorul de protectie solara individual (SPFi) este egal cu raportul dintre doza minica eritemala obtinuta pentru produsul de investigat (MEDp) si doza minima eritemala obtinuta pentru zona netratata, fara protectie (MEDu):

, [MED]=J/m2

Determinarea parametrului ITA°

Masurarea unghiului tipologic individual (Individual Typological Angle – ITA°) a fost adoptata pentru a stabili intensitatea pigmentarii subiectilor inainte de a fi supusi testelor pentru protectie solara. Subiectii inclusi au avut ITA° mai mare decat 28°. Masuratorile colorimetrice ale pielii au fost realizate folosind un colorimetru de tip CR400 Minolta Chromameter®, care prezinta o apertura de 8 mm. Cromametrul converteste culorile percepute de ochiul uman in semnal digital, constand in 3 parametri:

L* = pentru claritate (de la intunecat la palid)

a* = spectrul de la verde la rosu

b* = spectrul de la albastru la galben

Dupa etapa de calibrare, masuratorile au fost efectuate direct pe piele, folosind o sursa de lumina pulsata de Xenon si un sistem dublu de fascicole destinate sa masoare lumina transmisa si sa corecteze orice deviatii mici.

Cei mai caracteristici parametri pentru pigmentare sunt culoarea galbena (b*) si luminanta (L*). Ambii parametri sunt exploatati pentru calcularea ITA° care defineste gradului de pigmentare al pielii unui subiect, dupa urmatoarea formula:

Valoarea ITA° a fiecarui subiect a fost determinata pe spate. Cel putin 3 masuratori ale pielii au fost efectuate in sistemul L*a*b* (CIE lab 1975 system), pe fiecare zona definita folosind un colorimetru de tip CR400 Minolta Chromameter® calibrat in prealabil. Valorile medii L* si b* au fost folosite pentru calculul ITA°. Datele au fost inregistrate in CRF-ul fiecarui subiect. Subiectii au fost rugati sa stea asezati pe un pat, in pozitie intinsa (cu fata in jos), cu bratele pe langa corp, fara sa se miste.

Selectarea subiectilor

Criterii de includere

Subiecti sanatosi,

Subiecti care si-au oferit consimtamantul in scris, informat,

Sex: masculi si femele,

Subiecti cu varsta intre 18 si 60 de ani,

Subiecti care accepta merioada de imobilizare,

Subiecti cu fototip de la I la III, nebronzati,

Colorimetria pe spate: ITA°>28°.

Criterii de non-includere

Subiecti care si-au aplicat produse cosmetice pe zonele de studiu,

Subiecti sub tratament medical incompatibil cu studiul,

Subiecti cu patologii dermatologice,

Femei insarcinate sau care alapteaza sau femei care planuiesc o sarcina in timpul studiului,

Subiecti care iau medicamente anti-inflamatoare,

Subiecti cu alergii cunoscute la soare,

Subiecti cu pistrui, tatuaje, nevi sau care prezinta afectare solara pe zonele de studiu,

Subiecti obisnuiti cu solar,

Subiecti ce participa in orice alt studiu clinic.

Diagrama de flux al studiului

Organizarea studiului

Ziua 1

Subiectul ajunge la centru. Acesta nu a aplicat pe piele niciun produs cosmetic incepand cu seara trecuta.

Explicarea studiului pentru subiect.

Subiectul citeste si semneaza fisa de consimtamant in dublu exemplar.

Colectarea fisei de consimtamant de la subiect.

Verificarea criteriilor de includere / non-includere de catre un tehnician.

Masuratori colorimetrice pe zonele de studiu si calculul parametrului ITA°.

Determinarea zonelor de studiu pe spatele subiectului: o zona neprotejata, o zona protejata cu un produs de referinta si zone protejate cu produsele investigationale.

Aplicare standardizata de 2 mg/cm2 a produsului de investigat si a produsului de referinta pe zonele definite, conform listei de randomizare.

Dupa 15-30 de minute dupa fiecare aplicare de produs, expunere UV cu simulatorul solar.

Evaluarea raspunsului imediat.

Ziua 2

Subiectul de intoarce la centrul de testare.

Aclimatizare la temperatura camerei (cel putin 15 minute).

La 16-24 de ore de la expunere, citire a raspunsului eritemal MEDu, MEDp (atat pentru produsele investigationale cat si pentru cel de referinta) sub un sistem daylight care asigura o iluminare a mesei de lucru uniforma, efectuata de catre un tehnician care nu a fost implicat in aplicarea produselor. Subiectul are aceeasi pozitie ca in timpul iradierii.

Intre ziua 1 si ziua 2, daca orice reactie de intoleranta a fost observata de catre subiect, acesta trebuie sa fi anuntat investigatorul si sa fi stabilit o intalnire cu acesta pentru o examinare. Dermatologul va urmari evolutia reactiei zilnic, pana la regresia totala a leziunii. Orice intoleranta a fost fotografiata si transmisa sponsorului.

Numarul de subiecti

Un panel de test include suficienti subiecti pentru a produce un minim de 10 rezultate valide. Cel mult 3 subiecti pot fi respinsi din panel. Daca mai de 3 subiecti au fost respinsi, sponsorul a fost contactat si masuri corespunzatoare au fost luate conform indicatiilor acestuia.

Produsul investigational

Referinta produsului: formula N° SOL0991S

Aspectul produslui: crema alba.

Certificat de conformitate: un certificat de conformitate (certificat de siguranta) a fost semnat de un evaluator si trimis de catre sponsor inainte de inceperea studiului.

Dozaj: cantitate standard – 2 mg/cm2 ± 2.5% folosind o balanta cu precizie electronica, conform “FDA Federal Register, Rules and Regulation, Vol 76, No 117 June 17, 2011 21CFR Parts 201 and 310 (Labelling and Effectiveness Testing; Sunscreen Drug Products for Over-the-Counter Human Use; Final Rules)”.

SPF asteptat: Conform sponsorului, valoarea SPF asteptata a produsului a fost 15-20.

Aplicare si metode: Site-ul de aplicare: pe spate.

Pozitia: intinsa.

Metoda de aplicare: Studiul s-a realizat intr-un laborator ventilat, in care temperatura a fost intre 18°C si 26°C, cu lumina suficienta. Zonele de 40 cm2 (8*5 cm) au fost definite cu o carioca pe spatele subiectului. Distanta minina intre 2 zone a fost de 1 cm. Produsul a fost aplicat de un tehnician pe spatele fiecarui subiect cu un fingercot. Cantitatea aplicata a fost de 2 mg/cm2 ± 2.5%. Suprafata de aplicare a fost de 40 cm2, astfel cantitatea depusa a fost intre 78.0 si 82.0 mg.

Calcularea SPF si statistica

Parametri statistici pentru calcularea SPF sunt descrisi dupa cum urmeaza:

Calcularea SPF pentru fiecare subiect (SPFi)

Calcularea SPF mediu

Calculul deviatiei standard (s) pentru SPFi mediu

Calculul erorii standard (SE)

Obtinerea valorii t din tabelul de distributie student corespunzator punctului superior de procent 5% cu n-1 grade de libertate.

Determinarea SPF eticheta care este egal cu cel mai mare numar intreg mai mic decat:

Numarul minim de valori SPFi valide a fost 10 si numarul maxim de valori SPFi valide a fost 13.

Rezultatele au fost validate daca valoarea SPF a referintei FDA P2 a fost tinuta in intervalul 16.3 ± 3.43 (12.87 si 19.73).

Evaluarea MED

MED a fost evaluat vizual. Subiectul a fost asezat in pozitie intinsa pentru evaluarea MED (aceeasi pozitie ca in timpul expunerii). Evaluarea vizuala a fost efectuata intr-un laborator cu iluminare uniforma si suficienta deasupra mesei de lucru (cel putin 500 lux), ce provide de la un sistem daylight. Acuitatea vizuala a observatorului a fost testata in prealabil, o data pe an. Raspunsurile eritemale au fost observata intr-o maniera „blind”.

Sistemul daylight folosit (Atlas TLL1200) permite comparatii cromatice reproductibile la orice timp si in orice anotimp, independent de influentele mediului. Evaluarea a fost facuta vizual si distanta dintre ochii observatorului si zona de examinat a fost de aproximativ 50 cm.

2.11. Evaluarea lungimii de unda critice a unui produs cu fotoprotectie conform metodei ISO 24443 (2012) „Determinarea fotoprotectiei UVA in vitro pentru un produs cu protectie solara”

I. Introducere

Studiul isi propune sa determine lungimea de unda critica „λc” a unui produs cosmetic cu formula „SOL0991S”, dupa aplicare standardizata pe placute de PMMA (single side, roughened polymethylmethacrylate (PMMA) PlexiglasTM plates), urmata de expunere la UVA in conditii planificate de sponsor si in acord cu Recomandarile ISO 24443:2012 „Determinarea fotoprotectiei UVA in vitro pentru un produs cu protectie solara”. Studiul este efectuat pe produse cosmetice cu tinta de a confirma valoarea lungimii de unda critice „λc”.

Acest protocol standard contine informatii generale si necesitatile de respectat atunci cand acest tip de studiu clinic este efectuat. Informatii aditionale legate de studiu sau produsele investigate vor fi oferite de Sponsor inainte de inceperea studiului intr-un e-mail/document.

II. Obiectivul studiului

Evaluarea lungimii de unda critice „λc” pentru un produs cosmetic, aplicat in cantitate standardizatape zone definite, pe placute de PMMA (single side, roughened polymethylmethacrylate (PMMA) PlexiglasTM plate), urmat de expunere la UVA sub conditii planificate de sponsor si in acord cu Recomandarile ISO 24443:2012 „Determinarea fotoprotectiei UVA in vitro pentru un produs cu protectie solara”.

III. Metoda

Plan experimental

Studiul este considerat ca fiind un studiu comparativ, cu un produs de referinta.

Instrumentatie

Cuantificarea Factorului de Protectie UVA este realizata prin utilizarea unui simulator UV.

Suportul de aplicatie

Suportul de aplicatie utilizat sunt substraturi de 5x5cm2 de polimetilmetacrilat (PMMA), cu o suprafață aspră, obținut prin utilizarea unei tehnici de turnare. Rugozitatea medie este de 5 µm. Referință și furnizor: PMMA WW5, Schonberg SARL, Hamburg-Schnelsen, Germania.

Sursa UV – SUNTEST CPS+

Lampa Xenon,

Filtru optic „coated quartz filter segment”,

Oglinda UV si oglinda lumina,

Masa pentru probe,

Senzor pentru masurarea si controlul black standard temperature (BST).

Spectru

290 nm pana la 400 nm.

Spectrofotometru UV-2000S Analizor Transmitanta

Intervalul de lungimi de undă pentru spectrofotometrul UV se întinde de lungimea de undă primară de 290 până la 400 nm. Pasul de incrementatie este de 1 nm.

Sistemul optic de intrare pentru spectrofotometrul UV trebuie să fie proiectat pentru o iluminare difuză și/sau o colectare difuză a iradiantei transmise prin substratul PMMA, atat cu si fara stratul uniform de protectie solara de pe suprafata sa. Mărimea diametrului orificiului de intrare al sondei spectrofotomettrice trebuie să fie mai mică decât dimensiunea spotului luminos ce trebuie să fie măsurat la nivelul probei. Suprafața fiecărui site de citire trebuie să fie de cel puțin 0.5 cm2, în scopul de a reduce variabilitatea dintre citiri și pentru a compensa lipsa de uniformitate în stratul de produs. Lungimea de undă a spectrofotometrului trebuie să aibă o precizie de 1 nm, in urma verificarii cu ajutorul unui filtru dopat cu holmium.

Capacitatea spectrofotometrului de a măsura factorii de transmisie sau de protecție cu precizie este limitată de sensibilitatea instrumentului. Intervalul dinamic minim necesar este de cel puțin 2.2 unități de absorbție.

Absorbția maximă măsurată trebuie să fie în intervalul dinamic al dispozitivului.

Gama dinamică și linearitatea se verifică cel puțin o dată pe lună. Lampa care este utilizată ca sursă în măsurarea transmitanței și iradianța trebuie să fie suficient de scăzute astfel încât fotostabilitatea produsului nu este modificata în mod nejustificat. Doza UV livrata în timpul unui ciclu de măsurare nu trebuie să depășească 0.2 J/cm2.

Suprafata radiata

Mărimea substratului trebuie aleasă astfel încât zona de aplicare nu este mai mică de 16 cm2 și se prefera forma pătrată.

Fiecare probă de produs cu protecție solară care trebuie testata se eșalonează pe cel puțin patru plăci din PMMA. Fiecare placă trebuie să fie măsurată la un număr de diferite site-uri.

Monitorizarea sursei de expunere UV

Emisia sursei de expunere UV utilizată pentru expunere se verifică pentru respectarea limitelor de acceptare acordate de un expert calificat în mod corespunzător (cel puțin) la fiecare 18 luni, sau după 3000 de ore timp de funcționare a lămpii. Inspecția trebuie să fie efectuată cu un spectroradiometru care a fost calibrat față de o lampă standard, care poate fi urmărită comparativ cu un standard de calibrare internațional sau național. În plus față de inspecția spectroradiometrica, intensitatea sursei de expunere UV utilizată pentru expunere trebuie să fie verificată înainte de fiecare utilizare. Aceasta se poate face folosind fie un spectroradiometru sau un radiometru cu sensibilitate in UVA, calibrate pentru aceeasi sursă de expunere utilizate pentru etapa de expunere din procedurii, aplicând coeficientul de calibrare.

Puterea lampii

1.5 kW.

Sistemul menit sa determine Factorul de Protectie UVA

Intensitatea UVA este determinata de catre operator prin masurarea cu radiometru in interiorul SUNTEST CPS +.

Proba standard

Pentru a confirma faptul ca valorile UVA-PF sunt masurate in acord cu „Measurement Standards for UVA Protection”, media valorii UVA-PF pentru produsul standard S2 trebuie sa fie 12.7 (deviatie standard ±2).

Determinarea lungimii de unda critice

Valoarea lungimea de unda critice λc pentru produsul testat este definita precum lungimea de unda la care suprafata de sub sprectrul de absorbtie pentru produsul iradiat de la 290 nm la λc este 90% din totalul spectrului de absorbtie de la 290 nm la 400 nm si este calculata dupa ecuatia de mai jos:

Valoarea finala a lungimii de unda critice este media valorilor obtinute pentru fiecare repetare.

Aspecte operationale

Validarea instrumentului

Validarea instrumentului a fost realizata pentru a asigura functionarea buna a instrumentului (acuratetea lungimilor de unda determinate, raspunsul liniar al detectorului, intervalul dinamic, etc). Validarea instrumentului a fost realizata: cel putin de doua ori pe luna, oricand acuratetea instrumentului a fost indoielnica, atunci cand un alt utilizator opereaza echipamentul.

Prepararea probelor

Metoda ISO 24443:2012 necesita cel putin 4 placute cu probe in analiza fotoprotectiei si cel putin 3 scanari in diferite locuri pe placuta.

Masuratori spectrofotometrice pre-expunere UV

Acestea au fost stabilite la 290 si 400 nm. Proba blank de transmitanta a fost verificata pe o placuta PMMA WW5 cu glicerina (lot 069-2013-CP228/CP229) . Dupa fiecare repetare, s-a efectuat o serie de 5 masuratori.

Expunerea UV a probelor

Probele au fost expuse la UV dupa ce au fost tinute cel putin 30 de minute in intuneric si la o temperatura apropiata de cea din timpul expunerii UV, pentru a facilita formarea unui film subtire stabil de produs pe placute. Doza Dx de expunere UV primita de fiecare proba a fost proportionala cu factorul de protectie UVA-PF static determinat in vitro. Probele au fost mentinute la temperaturi intre 25°C si 35°C cu ajutorul unui sistem de aer conditionat. Temperaturi inregistrate in Suntest sunt prezentate la sectiunea de rezultate.

Masuratori spectrofotometrice post-expunere UV

Aceste masuratori au fost efectuate sub aceleasi conditii ca cele stabilite pentru pre-expunere UV.

Produsul investigational

Referinta: formula N° SOL0991S.

Aspectul produsului: Crema alba.

Dozaj

Cantitatea standard: 1.3 mg/cm2, masurat cu o balanta de precizie electronica. Cantitatea a fost definita de metodele ISO 24443:2012 „Determinarea fotoprotectiei UVA in vitro pentru un produs cu protectie solara”.

Referinta SPF

Ca cerinta a sponsorului, produsul a fost testat pe baza masuratorii SPF. Conform acestuia, valoarea SPF aleasa pentru calcul a fost 16.3.

Aplicare si metoda

Suportul pentru aplicare: Placute PMMA WW5 (single side, roughened polymethylmethacrylate (PMMA PlexiglasTM plate), lot 069-2013-CP228/CP229).

Metoda de aplicare: Studiu s-a desfasurat intr-un laborator ventilat cu o temperatura intre 22°C si 25°C, iar umiditatea a fost intre 40-50%. Suprafata de aplicare a fost 25 cm2. Produsul a fost aplicat de catre un tehnician pe fiecare placuta cu varful degetului „presaturat” pentru a raspandi produsul cat mai uniform posibil. Placutele preparate au fost puse intr-un zona intunecata (s-a folosit o etuva HEATING OVEN ED23), intr-un interval de temperatura de 25-35 °C. Temperatura din sursa UV a fost intre 25-35 °C. Aceste placute tratate au stat in etuva cel putin 30 de minute. Cantitatea aplicata a fost de 1.3 mg/cm2. Suprafara de aplicare a fost 25 cm2, deci cantitatea toatala depusa a fost intre 31.5 mg si 33.5 mg.

Placuta a fost examinata pentru a se asigura ca nu exista materiale straine;

Placuta a fost plasata pe balanta electronica cu suprafata rugoasa in sus;

Tehnicianul a notat citirea si a tarat balanta;

Produsul a fost aplicat uniformintr-o serie de picaturi de-a lungul placutei cu o spatula pana cand a fost indicata cantitatea optima (31.5-33.5 mg);

Cantitatea a fost notata in CRF.

Placuta cu proba a fost ridicata de pe balanta analitica;

Folosind varful degetului „presaturat”, produsul a fost distribuit prin miscari circulare cu o presiune minima pana cand acesta a fost intins uniform in cel mai scurt timp posibil (20-30 de secunde), urmat de miscari orizontale si verticale fara a aplica presiune.

Placuta a fost plasata pe balanta analitica si a doua masuratoare a fost notata in CRF.

Criterii de respingere a datelor

Datele obtinute in studiu sunt respinse in urmatoarele circumstante:

Scanarea inregistrata pre-iradiere a probei esueaza (curba si datele nu sunt acceptabile (C: nu este in intervalul [0.8-1.6]).

Scanarea inregistrata post-iradiere a probei esueaza (curba si datele nu sunt acceptabile (C: nu este in intervalul [0.8-1.6]).

3. Rezultate și discuții

3.1. XRD

În figura 11, sunt prezentate difractogramele înregistrate pentru pulberile de ZnO si ZnO@Lim.Utilizand aceasta analiză s-a studiat cristalinitatea pulberilor sintetizate. S-a observat că interferențele de difracție ale pulberilor obținute corespund interferențelor de difracție ale oxidului de zinc.

Fig. 11. Difractograma de raze X înregistrată pentru pulberea de ZnO si ZnO@Lim

3.2. SEM

În figura 12 sunt prezentate imagini SEM înregistrate pentru pulberile de ZnO simplu si pentru pulberea de ZnO funcționalizată cu agentul terapeutic natural (limonen). Astfel, s-a studiat morfologia celor doua materiale. Se observă că diametrul particulelor nu depășește 30 nm, că particulele au morfologie neregulata, dar asemănătoare cu cea a particulelor clasice și, în mod evident, că nanoparticulele de oxid de zinc se aglomerează puternic. Agregarea nanoparticulelor sau formarea unor particule își au originea în energia de suprafață foarte ridicată a nanoparticulelor de oxid de zinc [].

Fig. 12. Micrografii SEM ale nanoparticulelor de oxid de zinc (A) si de oxid de zinc funcționalizat cu limonen (B).

Fig. 13. Spectru EDAX pentru pulberea de ZnO funcționalizată cu agent terapeutic natural (limonen).

Figura 13 prezintă spectrul EDAX pentru pulberea de oxid de zinc funcționalizat cu limonen. Analiza elementală identifică elementele prezente în materialul obținut. Pentru proba de oxid funcționalizat, elementele existente provin de la oxidul de zinc, iar carbonul provine de la agentul terapeutic natural.

3.3. TEM

Fig. 14. Micrografii TEM (A, B), HRTEM (C) și imagine SAED (D) ale nanoparticulelor de zinc sintetizate.

Figura 14 prezintă imaginile TEM corespunzătoare nanoparticulelor de oxid de zinc sintetizat la temperatura camerei. Particulele sunt aglomerate (soft agglomerates – particulele sunt unite între ele prin legaturi van der Waals), se prezintă sub formă poliedrală, sunt neregulate. Se observă și câteva particule sferice. Gradul de cristalinitate este ridicat, nu se observă impurități. Figura 14Dprezinta difractia de electroni pe arie selectata. Aceasta analiza ofera informatii despre puritatea din punct de vedere cristalin al probei analizate. Se observa ca planele de cristalinitate identificate/masurate corespund oxidului de zinc (hexagonal).

3.4. IR

În figura 15 sunt prezentate harta în infraroșu și imaginea în vizibil pentru oxidul de zinc funcționalizat cu limonen. Analizand imagninea in infrarosu se observa ca intensitatea distributiei culorilor variaza odata cu cantitatea de material scanata. Din aceste considerente se poate afirma că proba analizata este omogena din punct de vedere al distributiei grupei functionale monitorizate pe intreaga suprafata scanata. Banda de absorbtie monitorizata a fost 2920 cm-1 si corespunde legaturii C-H caracteristica fazei organice.

Figura 16 prezinta spectrele IR înregistrate pentru limonen si pentru nanoparticulele de zinc functionalizate cu limonen. Se observă că benzile de absorbtie caracteristice limonenului sunt prezente în spectrele de infraroșu ale pulberii obtinute. Se pot identifica benzile de absorbtie caracteristice legaturii C-H, de intindere (2920 cm-1 si de deformatie 1438 cm-1.

Fig. 15. Cartografiere în infraroșu (A) și imagine în vizibil (B) pentru ZnO@LIM.

Fig. 16. Spectru FT-IR pentru pulberea ZnO@LIM.

3.4. Potential ZETA

Fig. 17. Potențial ZETA pentru ZnO.

Fig. 18.Potențial ZETA pentru ZnO@LIM.

Potențialul ZETA oferă informații despre sarcinile de suprafață ale particulelor obținute.Pulberea de ZnO nefunctionalizata prezinta o sarcina de suprafata de +8.01 mV, ceea ce o face un candidat bun pentru aplicatiile anti-microbiene, deoarece un material cu sarcina pozitiva va interactiona eficient cu peretele celular bacterian cu sarcina negativa si va impiedica multiplicarea celulara. Recent, datele de literatura prezinta o noua ipoteza prin care se afirma ca materialele cu sarcina de suprafata negativa ar prezenta o activitate antimicrobiana mult mai pronuntata decat cele cu sarcina pozitiva. Acest lucru este discutat pe larg in cadrul interpretarii analizelor antimicrobiene. In cazul pulberii de ZnO@Lim, sarcina de suprafata este pozivita, avand valoarea de -19.5 mV.

3.6. ATG/DSC

Materiile prime utilizate pentru prepararea cremelor, cat si produseleSolange si Solange L au fost caracterizate utilizand analiza termogravimetrica si termo-diferentiala.

Fig. 19. Pierderile de masă înregistrate pe derivatograma ZnO.

Într-o primă etapă, până în 100oC, sunt eliminate moleculele de apă adsorbite pe suprafața nanoparticulelor. Procesul este însoțit de un efect endoterm pe curba DSC. Până la 250oC urmează alte două efecte endoterme, cu o intensitate mai mică, corespunzatoare eliminării grupărilor HO- și moleculelor de H2O legate mai puternic de suprafața nanoparticulelor. În continuare, are loc o oxidare (un efect ușor exoterm pe curba DSC) a resturilor organice existente în compoziția ZnO din faza de sinteză.

Fig. 20. Pierderile de masă înregistrate pentru ZnO@LIM.

Spre deosebire de proba ZnO, în acest caz se observă apariția unui efect exoterm între 250-350oC, corespunzător oxidării părții organice depuse pe ZnO. Diferența de 2.3% în cazul masei reziduale reprezintă cantitatea de limonen legată de ZnO.

Fig. 21. Pierderile de masă pentru unt de shea.

Analiza termică a untului de shea indică o serie de procese fizice și chimice. La 40oC are loc topirea substanței, fapt indicat de peak-ul endoterm de pe curba DSC, peak care nu este însoțit de vreo modificare de masă. Începând cu 300oC, untul de shea începe să sufere o serie de transformări (procese de oxidare degradativă), pierderea de masă până în 480oC fiind de aproape 90%. Procesele de oxidare sunt însoțite pe curba DSC de o serie de peak-uri exoterme, suprapuse, indicand faptul că substanța organică participă în mai multe tipuri de reacții paralele sau suprapuse. În ultima etapă, 480-620oC, are loc arderea masei carbonice rămase în urma oxidărilor anterioare. Această ardere a C este însoțită de un efect puternic exotem pe curba DSC.

Fig. 22. Pierderile de masă înregistrate pentru ulei de cocos.

În cazul uleiului de cocos, procesele chimice care însoțesc descompunerea acestuia sunt asemănătoare cu cele observate anterior pentru untul de shea. Întrucât uleiul este deja lichid la temperatura camerei, lipsește peak-ul corespunzător procesului fizic de topire (care apare la 40oC in cazul untului de shea). Uleiul este stabil până la aproximativ 300oC când încep degradările oxidative, însoțite de efecte exoterme pe curba DSC. În intervalul 400-580oC are loc arderea masei carbonice rezultate în urma degradărilor anterioare.

Fig. 23. Pierderile de masă înregistrate pentru ceara de albine.

Ceara de albine suferă procesul de topire la 64oC, fapt indicat de peak-ul endoterm de pe curba DSC, care nu este însoțit de pierderi de masă. Începând cu 200oC, are loc oxidarea degradativă a componentelor organice, iar de la 400oC are loc oxidarea masei carbonice. Toate procesele sunt însoțite de efecte exoterme pe curba DSC.

Fig. 24. Pierderile de masă înregistrate pentru crema care conține ZnO.

Solange se topește la temperatura de 38.5oC și este stabilă până la aproximativ 300oC, când începe să se degradeze. Procesele de degradare oxidativă sunt cele corespunzătoare componentelor organice folosite. Masa reziduală de 10% reprezintă cantitatea de ZnO introdusă în cremă.

Fig. 25. Pierderile de masă înregistrate pentru crema care conține ZnO@LIM.

Solange L se topește la temperatura de 34oC și este stabilă până la aproximativ 300oC când începe să se degradeze. Procesele de degradare oxidativă sunt cele corespunzătoare componentelor organice folosite. Masa reziduală de 10% reprezintă cantitatea de ZnO introdusă în cremă.

3.7.Absorbanță UV

Fig. 26. Măsurători de absorbanță pentru Solange si Solange L.

Figura 26 prezintă măsurătorile de absorbanță monocromatică ca funcție de lungimea de undă în spectrul UV pentru nanoparticulele de ZnO. Creșterea bruscă în absorbanță sub 380 nm este tipică pentru oxidul de zinc. Pe măsură ce dimensiunea nanoparticulelor scade, și valorile absorbanței în UV scad. În literatură [] s-a observat că dimensiunea optimă la care absorbanța are valori ideale pentru aplicații ale nanopulberii de ZnO ca filtru UV este de aproximativ 35 nm. Deci, dimensiunea nanoparticulelor are o influență importantă asupra valorilor absorbanței în UV.

Fig. 27. Spectrul radiației UV (UVC, UVB și UVA).

Din analiza de absorbanță UV se observă că nanoparticulele de oxid de zinc absorb radiația întregului spectru UV, începând de la 200 nm pana la 400 nm. Astfel, putem considera că nanopulberea de ZnO realizată este un filtru UV eficient, absorbind radiație din tot spectrul UV (figura 27). Pentru aplicațiile din cosmetica, este important ca filtrul UV să acopere întreg spectrul UV. Pentru că ZnO este un filtru anorganic, acesta prezintă un mod diferit de absorbție in UV față de filtrele chimice, care absorb de regulă doar UVA. Așadar, ZnO absoarbe în mod constant prin întreaga gama UV până la ~380 nm.

3.8. Biodistribuția in vivo

Creier

La nivel cerebral, pentru proba ZnO, la 7/14 zile nu s-au evidențiat nanoparticule.

Fig. 28. Secțiune transversală prin creierul de șoarece tratat cu nanoparticule ZnO. Probă recoltată la 7 (a)/14 (b) zile. Nanoparticule absente. Aspecte normale.
Colorație Hematoxilină–Eozină (HE): ×400.

Ficat

La nivel hepatic, la 7/14 zile, pentru proba ZnO nu s-au evidențiat nanoparticule.

Fig. 29. Secțiune transversală prin ficatul de șoarece tratat cu nanoparticule ZnO. Probă recoltată la 7 (a)/14 (b) zile. Nanoparticule absente. Aspecte normale.
Colorație HE: ×200.

Inimă (miocard)

La nivelul miocardului, pentru proba ZnO, la 7/14 zile nanoparticulele au fost absente.

Fig. 30. Secțiune transversală prin miocardul de șoarece tratat cu nanoparticule ZnO. Probă recoltată la 7 (a)/14 (b) zile. Nanoparticule absente. Aspecte normale.
Colorație HE: ×400.

Pancreas

La nivel pancreatic, pentru proba ZnO, la 7/14 zile nu s-au evidențiat nanoparticule.

Fig. 31. Secțiune transversală prin pancreasul de șoarece tratat cu nanoparticule ZnO. Probă recoltată la 7 (a)/14 (b)zile. Nanoparticule absente. Aspecte normale.
Colorație HE: ×400.

Plămân

La nivel pulmonar, pentru proba ZnO, la 7/14 zile nanoparticulele au fost absente.

Fig. 32. Secțiune transversală prin plămânul de șoarece tratat cu nanoparticule ZnO. Probă recoltată la 7 (a)/14 (b) zile. Nanoparticule absente. Aspecte normale.
Colorație HE: ×400.

Rinichi

La nivel renal, pentru proba ZnO, recoltată la 7/14 zile, nu s-au evidențiat nanoparticule.

Fig. 33. Secțiune transversală prin rinichiul de șoarece tratat cu nanoparticule ZnO. Probă recoltată la 7 (a)/14 (b) zile. Nanoparticule absente. Aspecte normale.
Colorație HE: ×400.

Splină

În splină, pentru proba ZnO, la 7zile, nanoparticulele s-au evidențiat doar în pulpa roșie. În pulpa albă, nanoparticulele au fost absente. Totuși, se observă hipertrofia pulpei albe, datorită faptului că nanoparticulele au stimulat formarea macrofagelor cu nucleu multilobular. În pulpa roșie, nanoparticulele s-au evidențiat la nivelul celulelor sistemului macrofagic, atât în cordoanele Billroth, cât și în capilarele sinusoide. Nanoparticulele au apărut ca structuri granulare, aglomerate, sferice, de dimensiuni variabile. Densitatea nanoparticulelor a variat de la o celulă la alta, unele celule prezentând o cantitate mai mare de nanoparticule endocitate. La 14 zile, nanoparticulele s-au evidențiat doar în pulpa roșie, în concentrație mai mare decât în proba recoltată la șapte zile.

Fig. 34. Secțiune transversală prin splina de șoarece tratat cu nanoparticule ZnO. Probă recoltată la 7 (a)/14 (b) zile. Nanoparticule prezente doar în pulpa roșie.
Colorație HE: ×400.

Fig. 35. Secțiune transversală prin splina de șoarece tratat cu nanoparticule ZnO. Probă recoltată la 7 (a)/14 (b) zile. Nanoparticule prezente doar în pulpa roșie.
Colorație HE: (g–n) ×1000.

3.9. Profilul antimicrobian

Rezultatele testului de evaluare a profilului antimicrobian sunt prezentate în figurile 36 și 37. Rezultatele prezentate sunt raportate la concentrația minimă inhibitorie a antibioticelor de uz general susceptibile la S. aureus și E. coli. Eficiența nanoparticulelor de ZnO@Lim este de 25 de ori mai bună decât a antibioticului carbencilină și de 12 ori mai bună decât a kanamicinei sau amicacinei în cazul tulpinii de S. aureus. În cazul tulpinii de E. coli, concentrația minimă inhibitorie e îmbunătățită de 12 ori. În cazul ZnO nefuncționalizat, concentrația minimă inhibitorie se afla în jurul valorii de 250 μg/mL.

Fig. 36. Analiza profilului antimicrobian în raport cu antibiotice de uz general susceptibilie la tulpinile de S. aureus

Fig. 37. Analiza profilului antimicrobian în raport cu antibiotice de uz general susceptibilie la tulpinile de E. coli

Evaluarea factorului de protectie solara a produsului cosmetic in vivo conform FDA Federal Register, Rules and Regulation, Vol 76, No 117 June 17, 2011 21CFR Parts 201 and 310 (Labelling and Effectiveness Testing; Sunscreen Drug Products for Over-the-Counter Human Use; Final Rules)

Follow-up

Numarul de subiecti inclusi: 10.

Numarul de subiecti care au terminat studiul: 10.

Numarul de subiecti inclusi in analiza: 10.

Caracteristicile subiectilor

Rezultate

Tabelul de mai jos arata valorile MED (in unitati MED) obtinute cu si fara produs si cu produsul de referinta P2 pe 10 subiecti.

Produs SOL0991S

Valoarea SPF a formulei SOL0991S a fost 16.3.

Conform FDA final rules, valorea SPF de pe eticheta este egala cu cel mai mare numar intreg care e mai mic decat SPF-ul produsului.

SPF produs = SPF mediu – (t * SEM)

Referinta P2

Valoarea SPF a preparatului standard a fost 16.3.

Acceptat daca valoarea SPF a fost mentinuta intre 12.87 si 19.73 (16.3 ±3.43).

Testul este valid intrucat valoarea SPF a referintei P2 a fost mentinuta in intervalul acceptat 12.87 si 19.73.

Aceste rezultate, pentru un test efectuat pe 10 subiecti, sunt de incredere.

Concluzii

Scopul studiului a fost sa determine, pe subiecti, factorul de protectie solara a unui produs cosmetic, aplicat in cantitate standardizata pe zone definite, pe spatele adultilor sanatosi, urmat de expunere la UV conform FDA Federal Register, Rules and Regulation, Vol 76, No 117 June 17, 2011 21CFR Parts 201 and 310 (Labelling and Effectiveness Testing; Sunscreen Drug Products for Over-the-Counter Human Use; Final Rules).

Rezultate

Produsul, formula SOL0991S, a avut valoarea SPF de 16.3.

Evaluarea lungimii de unda critice a unui produs cu fotoprotectie conform metodei ISO 24443 (2012) „Determinarea fotoprotectiei UVA in vitro pentru un produs cu protectie solara”

Tabelul de mai jos arata rezultatele obtinute pentru cele 4 placute.

Produs SOL0991S

Datele pentru fiecare placuta vor fi prezentate in continuare. Spectrele de absorbtie individuale si spectrul de absorbtie UV mediu sunt prezentate, de asemenea, mai departe.

Fig. 38. Datele obtinute pentru fiecare placuta.

Fig. 39. mAF mediu ajustat (5 scanari) pentru placuta nr 1.

Fig. 40. mAF mediu ajustat (5 scanari) pentru placuta nr 2.

Fig. 41. mAF mediu ajustat (5 scanari) pentru placuta nr 3.

Fig. 42. mAF mediu ajustat (5 scanari) pentru placuta nr 4.

Fig. 43. mAF mediu ajustat (4 placute, 20 de scanari).

Fig. 44. Exemplu care aproximeaza curbele de absorbanta pentru o crema cu protectie UVB (2-EHMC, 5%), o crema cu protectie UVA (TDSA, 5%) si un filtru cu spectru larg, precum o crema bazata pe oxid de zinc (20%).

Forma absorbantei rezultante reprezinta eficienta cu care un produs destinat fotoprotectiei blocheaza un anumit interval de lungimi de unda din spectrul UV. Curba de absorbanta UV demonstreaza amplitudinea si latimea protectiei oferite (de la 290 nm la 400 nm), de-a lungul spectrului UV.

Amplitudinea curbei de absorbanta reflecta gradul de protectie. Cu cat este mai mare aplitudinea curbei, cu atat este mai mare absorbanta, si cu atat este mai mare protectie oferita la acea lungime de unda. In cazul produsului SOL0991S, amplitudinea este maxima la lungimea de unda 310 nm, aceasta amplitudine fiind corelata cu valoarea SPF.

Cu cat este mai mare suprafata de sub curba in latime, cu atat este mai mare protectia oferita de produs pe acel interval de lungimi de unda.

Determinarea lungimii de unda critice nu promoveaza falsa idee ca UVB si UVA sunt doua entitati separate, ci mai degraba ca ele sunt o parte din spectrul electromagnetic continuu. Lungimea de unda critica pentru un produs cu protectie UVB este mai mica decat pentru un produs ce protejeaza UVA si UVB. O lungime de unda critica mai mare asigura mai multa protectie UV, in special o protectie impotriva lungimilor de unda UVA mai mari. Calculul lungimii de unda critice ofera o medota convenabila si reproductibila pentru a evalua protectia UV pe intreg spectrul ultraviolet. Atunci cand aceasta metoda este combinata cu o testare SPF in vivo, lungimea de unda critica ofera o modalitate usoara si explicita pentru a comunica fotoprotectia de spectru larg consumatorului final al produsului.

Fig. 45. Comparatie intre lungimile de unda critice pentru fotoprotectie UVB si fotoprotectie UVA.

O lungime de unda critica > 370 nm pare a fi minimul pe care un produs cu protectie pe spectru larg trebuie sa il indeplineasca pentru a fi catalogat drept produs „broad spectrum”.

Produsul SOL0991S are o lungime de unda critica λc = 378 nm. Deci, produsul SOL0991S se poate incadra in produsele de fotoprotectie „broad spectrum”.

4. Concluzii

Principalul element de noutate al studiului reprezintă crearea unei creme cu protecție solară “bio”, produs de obicei dificil de găsit pe piață. Metoda de a obține filtrul UV, oxidul de zinc, este o metodă chimică sol-gel care permite obținerea unei pulberi pure, fără a fi nevoie de calcinare, la dimensiuni optime pentru aplicația aleasă. Astfel, nanoparticulele de oxid de zinc au avut dimensiunea de 25-35 nm, cum este prevăzut în industria cosmetică ca fiind optim. O cantitate de nanoparticule a fost funcționalizată cu limonen, o substanța fitochimica, pentru a observa schimbarile olfactive și de absorbție UV produse cremei finale.

În alegerea metodei de obținere a nanopulberii de oxid de zinc s-a ținut cont de ușurința metodei, de cantitatea de pulbere produsă, de operațiile ulterioare necesare. Din punct de vedere al structurii cristaline, materialul rezultat prezintă o structură hexagonală tipică oxidului de zinc, cu o orientare preferențială (002) și lipsită de faze secundare detectabile prin XRD. Oxidul de zinc a fost supus unei serii de analize (XRD, SEM, TEM, EDAX, IR, TGA, potențial ZETA, evaluarea in vivo a biodistribuției, profil antimicrobian, test SPF in vivo si evaluarea lungimii de unda critice) și s-a observat că acesta este optim pentru aplicația aleasă in industria cosmetică.

În urma analizelor de XRD, SEM, TEM, EDAX s-a observat că nanoparticulele de oxid de zinc sunt de formă negerulată si sferică, puritatea pulberii este înaltă si adecvată aplicațiilor în cosmetică, gradul de cristalinitate al nanoparticulelor este ridicat, nanoparticulele sunt aglomerate, formând agregate. Proba analizată prin IR este omogena din punct de vedere al distribuției grupei funcționale monitorizate pe întreaga suprafață scanată. Potențialul ZETA oferă informații despre sarcinile de suprafață ale particulelor obținute. Pulberea de ZnO nefunctionalizata prezinta o sarcina de suprafata de +8.01 mV, ceea ce o face un candidat bun pentru aplicatiile anti-microbiene, deoarece un material cu sarcina pozitiva va interactiona eficient cu peretele celular bacterian cu sarcina negativa si va impiedica multiplicarea celulara.

În cazul biodistribuției, la nivel cerebral, pentru proba ZnO, la 7/14 zile nu s-au evidențiat nanoparticule. La nivel hepatic, la 7/14 zile nu s-au evidențiat nanoparticule. La nivelul miocardului, la 7/14 zile nanoparticulele au fost absente. La nivel pancreatic, la 7/14 zile nu s-au evidențiat, de asemenea, nanoparticule. La nivel pulmonar, la 7/14 zile nanoparticulele au fost absente. La nivel renal, pentru proba recoltată la 7/14 zile, nu s-au evidențiat nanoparticule. În splină, pentru proba ZnO, la 7 zile, nanoparticulele s-au evidențiat doar în pulpa roșie. În pulpa albă, nanoparticulele au fost absente. Totuși, se observă hipertrofia pulpei albe, datorată faptului că nanoparticulele au stimulat formarea macrofagelor cu nucleu multilobular. În pulpa roșie, nanoparticulele s-au evidențiat la nivelul celulelor sistemului macrofagic, atât în cordoanele Billroth, cât și în capilarele sinusoide. Nanoparticulele au apărut ca structuri granulare, aglomerate, sferice, de dimensiuni variabile. Densitatea nanoparticulelor a variat de la o celulă la alta, unele celule prezentând o cantitate mai mare de nanoparticule endocitate.

Cremele Solange și Solange L au fost realizate din ingrediente simple (ceară de albine, unt de shea, ulei de cocos și nanoparticule de oxid de zinc simple si funcționalizate cu limonen). După realizare, acestora li s-a măsurat absorbția UV, cea mai importantă caracteristică a produselor cu protecție solară și s-a constatat ca acestea poseda o foarte bună acoperire a întregului spectru UV, oxidul de zinc fiind un filtru anorganic care absoarbe în mod constant prin întreaga gamă UV până la ~380 nm.

Materiile prime utilizate pentru prepararea cremelor, cât și produsele Solange și Solange L au fost caracterizate utilizând analiza termogravimetrică și termo-diferențială. Solange se topește la temperatura de 38.5 °C și este stabilă până la aproximativ 300 °C, când începe să se degradeze. Solange L se topește la temperatura de 34 °C și este stabilă, la fel ca și prima cremă, până la aproximativ 300 °C când începe să se degradeze. Procesele de degradare oxidativă sunt cele corespunzătoare componentelor organice folosite.

In urma testarii in vivo SPF, s-a determinat o valoare SPF de 16.3. Valoarea lungimii de unda critice pentru produsul creat a fost λc = 378 nm. Acest fapt inseamna ca produsul obtinut ofera protectie pe intreg spectrul ultraviolet (290 nm – 380 nm). Prin faptul ca toate aparatele si dispozitivele folosite in aceste evaluari sunt calibrate, pot concluziona ca rezultatele sunt de incredere.

În concluzie, produsele realizate în laborator și-au atins scopul, de a fi creme cu protecție solară "eco-friendly" și "bio", având un SPF 16.3. Prin toate analizele și testele efectuate pentru oxidul de zinc și pentru produsul final s-au observat caracteristicile filtrului UV și ale cremelor propriu-zise.

Bibliografie