Studii Privind Aeromicrobiota din Spatiile Educationale

STUDII PRIVIND AEROMICROBIOTA DIN SPAȚIILE EDUCAȚIONALE

Prin prezenta declar că Lucrarea de licență cu titlul “ Studii privind aeromicrobiota din spațiile educaționale” este scrisă de mine și nu a mai fost prezentată niciodată la o altă facultate sau instituție de învățământ superior din țară sau străinătate. De asemenea, declar că toate sursele utilizate, inclusiv cele de pe Internet, sunt indicate în lucrare, cu respectarea regulilor de evitare a plagiatului:

toate fragmentele de text reproduse exact, chiar și în traducere proprie din altă limbă, sunt scrise între ghilimele și dețin referința precisă a sursei;

reformularea în cuvinte proprii a textelor scrise de către alți autori deține referința precisă;

rezumarea ideilor altor autori deține referința precisă la textul original.

Pitești,

Absolvent

INTRODUCERE

Microorganismele constituie o lume în care se reflectă diversitatea în ceea ce privește forma, structura, caracterele de cultură, coloniale, morfologice, caracterele biochimice, antigenice, de patogenitate, rezistența la agenți fizici și chimici ale acestora.

În natură, microorganismele se caracterizează printr-o largă raspândire, ca rezultat al adaptării în procesul evoluției. Le găsim pretutindeni: în aer, în sol, în apa dulce și sărată (excepție fac apele care provin din izvoare foarte adânci, care, la sursă, sunt pure din punct de vedere bacteriologic), în alimente, pe suprafețe animate și neanimate, în substanțele organice în curs de descompunere, în organismele animale, vegetale, chiar și în deșeurile radioactive.

Rezervorul natural al bacteriilor este solul, unde acestea sunt prezente într-o concentrație de107 – 109/g. În apa de izvor, concentrația de celule este de 10/cm3, în apele fecalo-menajere, ajunge până la 102/cm3, în timp ce în apele mărilor și oceanelor, numărul microorganismelor este mai mare. 43

În aer, microorganismele există temporar, ele fiind transportate la distanțe foarte mari prin intermediul curenților de aer și a insectelor, iar prin sedimentare și precipitații, ele ajung în sol și în ape. Din sol, bacteriile ajung pe suprafața plantelor, a legumelor și fructelor. 43

Pe lângă acestea, microorganismele sunt prezente chiar și în locuri puțin accesibile vieții, cum sunt fundurile oceanelor, deșerturile, apele termale, vârfurile muntoase, minele, izvoarele sulfuroase, mările arctice, ghețari, rocile subterane. Prezența lor în aceste locuri se datorează capacității extraordinare de adaptare de care dispun, fiind capabile să metabolizeze azotul molecular, sulful, bioxidul de carbon, hidrocarburile, acizii și să supraviețuiască în condiții de temperatură, salinitate, presiune hidrostatică, inaccesibile altor organisme.

Recent, au fost izolate 68 de tulpini asociate cu licheni din diferite habitate din regiunea arctică și din Antarctica care, pornind de la analiza secvențială a ARNr 16S, au fost grupate în philumurile Actinobacteria, Bacteroidetes, Deinococcus – Thermus și Firmicutes, respectiv în clasele Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria și Gammaproteobacteria. Analiza filogenetică a arătat ca aproximativ 21% dintre acestea reprezintă specii potențial noi, întrucât similitudinea dintre tulpinile izolate și cele cunoscute este cuprinsă între 93,7 și 100%. Așadar, lichenii reprezintă micromedii stabile pentru bacterii și sunt, totodată, o sursă ce furnizează noi tulpini bacteriene care pot fi folosite în aplicații biotehnologice. 47

Răspândirea microorganismelor în medii foarte diferite se datorează, pe de-o parte, unor caracteristici comune, cum sunt următoarele: dimensiuni foarte mici, organizare unicelulară, capacitatea excepțională de multiplicare, abundența populațiilor. Pe de altă parte, foarte multe specii de bacterii dispun de adaptări structurale și fiziologice, cum sunt: spori de rezistență, mecansime de dispersie a formelor de rezistență, organite de locomoție, fenomene de fototaxie și chimiotaxie (permit microorganismelor să răspundă rapid la variațiile condițiilor ambiante), viabilitatea formelor vegetative, eliberarea de toxine (Zarnea, 1970).

Conform studiilor sale, profesorul de inginerie a mediului de la Universitatea Yale, Jordan Peccia, susține: „Trăim într-o supă de microbi. Și un ingredient foarte important din ea sunt chiar microorganismele noastre, pe care le noi purtăm”. Conform studiilor sale, o persoană poartă cu sine aproximativ 37 de milioane de bacterii (URL 1). De exemplu, numai în gura unui om se află aproximativ 40000 de bacterii (URL 2).

Deci, microorganismele sunt prezente oriunde există condiții de viață corespunzătoare supraviețuirii acestora, chiar și la un nivel minim (suport nutritiv, temperatură, umiditate, nivel de oxigen, pH) și oriunde este posibilă supraviețuirea îndelungată a formelor de rezistență în condiții nefavorabile, iar curenții de aer, curenții marini, precum și animalele migratoare sunt cei trei factori principali care contribuie la răspândirea microorganismelor în natură. Așadar, în ceea ce privește numărul, lumea microorganismelor reflectă cea mai mare diversitate a vieții pe Pământ.

I. CONSIDERAȚII TEORETICE

I.1. MICROORGANISME DIN MEDIUL NATURAL

În natură, condițiile care permit multiplicarea unei anumite specii de microorgansime pot varia, în sensul că acestea pot apărea și dispărea ciclic, cu sau fără regularitate. Astfel se explică de ce microorgansimele nu trăiesc în mod curent la altitudini foarte ridicate, la adâncimi prea mari în sol.

De asemenea, este dificil de delimitat habitatul microorganismelor (excepție făcând microorgansimele care trăiesc fixate permanent pe anumite substaturi), deoarece acestea pot fi prezente în regiuni foarte diferite de locurile în care ele trăiesc de fapt. Acest fenomen se datorează, pe de-o parte, faptului că multe microorgansime beneficiază de organite de mișcare (cili, flageli), cu ajutorul cărora se pot deplasa activ și, pe de altă parte, curenților de aer, curenților marini, care contribuie la deplasarea microorgansimelor libere. Ca urmare, într-o anumită regiune, pot exista microorgansimele autohtone, caracteristice acelui loc, dar și microorganisme alohtone, introduse în mod accidental în regiunea respectivă. 5

În natură, bacteriile sunt cele care realizează treapta mineralizării materiei organice animale și vegetale, întrucât intervin în transformarea materiei organice, contribuind astfel la realizarea circuitului natural al principalelor elemente biogene (C, N, P, S), făcându-le disponibile pentru reintegrarea lor în circuitul vieții. În acest sens, aserțiunea lui Pasteur conform căreia „rolul unor ființe infinit de mici este infinit de mare” este grăitoare (Mihăescu, 2000).

Bacteriile fixatoare de azot din sol (genul Rhizobium) sunt deosebit de importante în ceea ce privește fertilitatea și productivitatea sistemelor agricole, în timp ce alte bacterii din sol realizază procesul denitrificării, prin reducerea nitraților, diminuând în acest fel fertilitatea. 15

De asemenea, bacteriile sunt folosite și în industria alimentară, în diverse tehnologii: bacteriile lactice sunt folosite la fabricarea produselor lactate acide, a brânzeturilor, la conservarea legumelor, la fermentarea măslinelor, bacteriile propionice sunt folosite la prepararea brânzeturilor de tip schwaitzer, iar bacteriile acetice intervin în fabricarea oțetului. Diversele biotehnologii utilizează culturile selecționate de bacterii cu scopul obținerii de produse cu valoare economică, precum: enzime, aminoacizi, acid lactic, acid acetic, hormoni, îngrășăminte, antibiotice, vitamine, metan, dar și a băuturilor acidulate, întrucât acidul citric și aspartamul sunt obținuți pe cale microbiologică. 43

În ceea ce privește microorganismele care populează organismele vii, poat fi amintite microbiota normală din tractul digestiv al animalelor care contribuie la metabolizarea alimentelor, precum și microbiota ruminală care participă la transformarea substratului vegetal în masă celulară și fără de care producția ierbivorelor ar fi imposibilă. 16

Pe lângă aceste microorganisme benefice, există o serie de microorganisme cu rol negativ: unele bacterii reprezintă agenți de alterare a alimentelor, altele contaminează alimentele și produc toxine, iar prin consumul acestor alimente se produc îmbolnăviri grave ale celor care le consumă. Pe lângă acestea, există și bacterii patogene care parazitează organismele vii, cauzatoare de procese patologice, de la infecții locale până la septicemii. Acestea se caracterizează prin proprietăți care le permit pătrunderea în interiorul macroorganismului, adaptarea și multiplicarea, slăbirea capacității acestuia de a se apăra, de exemplu, prin elaborarea de toxine, dar și utilizarea țesuturilor gazdei ca suport nutritiv.16, 43, 44

Așadar, microorganismele pot fi benefice, însă ne pot afecta grav sănătatea. De aceea, nu trebuie să exagerăm în încercarea de a ne feri de ele, dar nici să fim prea apropiați. Trebuie să respectam limitele care sunt impuse de existența acestora ca verigă a lanțului trofic.

I.2. AEROMICROBIOTA

În general, aerul nu oferă bacteriilor condiții de creștere și de multiplicare, ci numai condiții de supraviețuire temporară, atât în formă vegetativă, dar mai ales ca spori. De aceea, în aer nu se găsesc microorganisme a căror mediu specific de viață să fie acesta. Microorganismele prezente în aer sunt reprezentate de bacterii și spori bacterieni, drojdii, spori de mucegaiuri, alge, protozoare.

Microorganismele ajung în aer odată cu particulele de praf sau cu picăturile foarte mici de apă, sunt dispersate în atmosferă, sunt vehiculate de curenți si astfel ajung să fie inhalate de către om. Ele provin din surse precum: apa, solul, depozitele de materie organică moartă (animală sau vegetală) și pot exista în aer sub formă de celule dispersate sau grupate în grămezi, formând un fel de „plute” aeriene menținute în stare de plutire datorită curenților de aer (Gregory, citat de Zarnea, 1970).

Cu toate acestea, multe microorganisme sunt distruse relativ rapid în atmosferă, sub acțiunea razelor solare și datorită uscăciunii, sporii fiind cei care rezistă un timp îndelungat. Supraviețuirea microorganismelor din aer este influențată de condițiile climatice și meteorologice. Astfel, persistența acestora în atmosferă este favorizată de condițiile de ceață, de umiditate și de cerul acoperit. De aceea, ele rezistă mai mult timp în încăperi și, mai ales, în acelea neînsorite. 1,43

În anul 2007, a fost realizat un studiu privind aeromicrobiota din două laboratoare de microbiologie din orașul nigerian Samaru-Zaria: primul se numește Jama’a (LBJ) și este situat în incinta unui spital de pe strada Sarkin-Pawa, iar cel de-al doilea (LBA) se află în campusul principal al Ahmadu Bello University. LBJ are o suprafață de 7,3 m2, este situat la parterul spitalului și, în interior, nu există surse potențiale de microorganisme, cu excepția unui coș de gunoi. Intrarea este asigurată de o ușă frecvent deschisă și o fereastră mare. LBA are o suprafață de 13,75 m2, iar comunicarea cu exteriorul se face printr-o ușă și o fereastră. Există, de asemenea, aer-condiționat și gresie.

Investigațiile au fost făcute atât într-o perioadă de 8 săptămâni a sezonului uscat (ianuarie – martie), cât și într-o perioadă de 8 săptămâni a sezonului umed (iulie – septembrie), temperatura fiind cuprinsă între 28 – 34°C în primul caz, respectiv între 32 – 41°C în celălalt caz. 51

Tabelul I.1. Aeromicrobiota din LBJ și LBA în sezonul uscat și sezonul umed (× 103 UFC/ml) (după Shiaka și Yakubu, 2013)

Rezultatele probelor colectate au arătat că numărul de bacterii a variat de la 0,03 × 103 UFC/ml la 1,8 × 103 UFC/ml, în sezonul uscat, în timp ce numărul de bacterii din probele colectate în sezonul umed a variat între 0,01 × 103 UFC/ml și 8,00 × 103 UFC/ml. În ambele cazuri, cea mai mare concentrație de bacterii a fost conținută de probele colectate de la LBJ: 1,80 × 103 UFC/ml în probele colectate în a treia săptămână a sezonului uscat, respectiv 8,00 × 103 UFC/ml în probele colectate în săptămâna a șaptea a sezonului umed, iar bacteriile izolate au aparținut predominant genurilor Staphylococcus, Micrococcus, Bacillus, urmate de genurile Proteus, Streptococcus, Pseudomonas și Klebsiella (Klebsiella și Proteus nu au fost găsite în probele colectate din LBA). 51

Aeromicrobiota normală este lipsită de bacterii patogene și este formată din organisme diverse: coci și bacili cromogeni, spori de ciuperci și spori de bacili aerobi, care traversează mările și oceanele, circulând vertical și orizontal cu ajutorul curenților de aer, iar numărul acestora variază în funcție de condițiile meteorologice care permit menținerea în aer timp mai scurt sau mai îndelungat. Numărul microorganismelor este mai mare în apropierea solului și mai mic la altitudine, în zonele polare, de deasupra zăpezilor și mărilor, pădurilor și livezilor. 43

În aerul de deasupra așezărilor omenești și, mai ales, în aerul din încăperi, acestei aeromicrobiote i se adaugă microorganismele de proveniență umană și animală, care sunt eliminate prin respirație și dejecții uscate și care pot fi patogene. Așadar, numărul microorganismelor din aer variază în funcție de distribuția și activitățile oamenilor: în regiunile cu o densitate și mobilitate mare a populației, calitatea aerului este mai scăzută și numărul miroorganismelor patogene este mai mare comparativ cu aerul de deasupra terenurilor nepopulate sau slab populate, în care predomină flora saprofită. 1, 23

Aerul inhalat de către oameni este conține microorganisme care formează așa-numiții bioaerosoli. Aceștia sunt definiți ca fiind o suspensie coloidă formată din picături de lichid, particule de materie solidă din aer, la care se adaugă virusuri, spori de fungi și conidii, endospori bacterieni, polen, fragmente de țesuturi vegetale (Karwowska, citat de Shiaka și Yakubu, 2013). Aerosolii infecțioși tind să aibă dimensiuni extrem de mici (< 5 μm) și, prin urmare, pot rămâne în fluxul de aer perioade lungi de timp, ceea ce crește pericolul de infestare, mai ales în încăperile mici (Brachman, citat de Shiaka și Yakubu, 2013) .

Un studiu vizând aeromicrbiota din căminele studențești și din cantine a fost realizat de cercetătorii chinezi Huo și Guo de la Shanxi Agriculture University în anul 2009. Rezultatele obținute au arătat că la etajele inferioare ale căminelor, concentrația de bacterii din aer este mai mare comparativ cu etajele superioare, indiferent dacă sunt sau nu prezenți oameni (evident, prezența oamenilor este corelată cu creșterea numărului de bacterii). Explicația constă în faptul că la etajele inferioare, supraviețuirea bacteriilor este favorizată, pe de-o parte, de mediul mai întunecat și mai umed comparativ cu etajele superioare și, pe de altă parte, numărului mare de activități care se desfăsoară la etajele inferioare, facilitând răspândirea bacteriilor. 23

Cercetătorul american, Jordan Peccia, profesor la Universitatea Yale susține că: ”Praful de pe podea este sursa principală pentru bacteriile pe care le respirăm, iar noi, oamenii, suntem responsabili pentru trezirea lor la viață.” Studiul său este primul care cuantifică modul în care prezența umană afectează nivelul de bacterii dintr-o încăpere (url1).

Același cercetător a realizat, în 2012, împreună cu echipa sa, un studiu interesant cu scopul de a analiza particulele de praf de pe podeaua unei săli de la universitate. În acest sens, ușile și ferestrele au fost ținute permanent închise pe tot parcursul studiului care a durat 8 zile: timp de 4 zile sala a fost în permanență ocupată, iar 4 zile sala a complet liberă. Rezultatele obținute i-au făcut pe cercetătorii americani să asocieze prezența umană cu un nivel considerabil crescut de microorgansime de diferite tipuri, demonstrându-se astfel că un procent de 18% din totalul emisiilor de bacterii din acea încăpere provenea de la oameni. Referitor la prezența microorganismelor din încăperi, tot Peccia este cel care susține că numărul microorganismelor este mai mare acolo unde există covoare, fapt care l-a determinat să afirme: „Oamenii capătă bolile infecțioase în interior, nu pe-afară. Cercul devine vicios, dat fiind că, mai ales, dacă ne simțim prost, tindem să petrecem și mai mult timp în interior decât în afara pereților, iar aici stau bacteriile cu noi” (URL1).

Petrecem circa 85 – 90% din viață în încăperi, acolo unde aerul este de 5 ori mai încărcat cu bacterii comparativ cu cel din afara încăperii. Din fericire, doar 0,1% dintre acestea sunt infecțioase. 22

Tabelul I.2. Variația numărului de bacterii în aerul din încăperi (×103 UFC/m3) (după Huo și Guo, 2009) 25

Microorganismele patogene care ajung în aer pot genera o serie de infecții respiratorii, boli aerogene: bacterioze (difterie, scarlatină, tuberculoză, pneumonie, tuse convulsivă, psitacoză-ornitoză), viroze (gripă, guturai, variolă, varicelă, rujeolă, oreion), micoze pulmonare, cât și infecții cutanate (produse, în special, de ciuperci actinomicete), înfecția plăgilor cu stafilococi, colibacili. 1

Studiul aeromicrobiotei este deosebit de important atât în ceea ce privește industria alimentară, întrucât microorganismele prezente în aer pot influența calitatea produselor alimentare sau, mai mult, pot produce contaminarea acestora cu floră patogenă, cât și în laboratoarele în care se manipulează material infecțios, deoarece riscul infestării este foarte ridicat, având în vedere că zilnic respirăm 20000 L de aer.

I.2.4. GENUL STAPHYLOCOCCUS

I.2.4.1. Taxonomie și habitat

Din punct de vedere filogenetic, stafilococii sunt apropiați de streptococi, enterococi, lactobacili și Genul Bacillus, motiv pentru care Genul Staphylococcus a fost scos din fosta Familie Micrococacceae. Între genurile Staphylococcus și Micrococcus există diferențe majore în ceea ce privește conținutul bazelor ADN, compoziția peretelui celular, spectrul de sensibilitate la antibiotice. De aceea, conform cu Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, vol. 3, ediția a II-a din 2009, Genul Staphylococcus care cuprinde peste 38 de specii, dintre care 18 au putut fi izolate de la om, este încadrat taxonomic în Familia VII. Staphylococcaceae, Ordinul I. Bacillales, Clasa I. Bacilli din Philumul XIII. Firmicutes al Domeniului Bacteria. (Buiuc și Neguț, 2009), 41

Stafilococii sunt larg răspândiți în mediul ambiant (apă ,sol, praful și aerul din încăperi, suprafețele meselor și podelelor, pe îmbrăcăminte, pe alimente), fiind frecvent întîlniți ca saprofiți pe piele, pe mucoasele căilor respiratorii. Colonizează, de asemenea, vestibulul nazal, vaginul, colonul de unde se poate răspândi pe zonele tegumentare cu umiditate ridicată (axile, plici). De exemplu, S. aureus se găsește frecvent în vestibulul nazal și atunci când este eliminat în mediul extern se înmulțește, mai ales, în alimente, iar acestea devin surse de contaminare. 2, 4

Rezervorul natural este reprezentat de mamiferele și păsările care contaminează mediul. Se consideră că circa 20 – 40% dintre adulții sănătoși sunt purtători de S. aureus, iar procentul ajunge până la 40 – 90% în mediul de spital. 41

Cu toate acestea, stafilococii nu au numai un rol negativ. De exemplu, S. xylosus poate oferi o soluție pentru colorarea produselor din carne, fără adaos de nitriți sau nitrați, care sunt dăunători pentru sănătate. Nitratul este utilizat la scară largă pentru a forma nitrozil-mioglobina, pigmentul care dă culoarea roz caracteristică pentru carnea conservată. Acest pigment poate fi produs prin fermentația S. xylosus, care convertește met-mioglobina în nitrozil-mioglobină, după incubarea la 37°C timp de 12 ore, într-un mediu M17 suplimentat cu bulion, met–mioglobină și ulei de parafină. 31

I.2.4.2. Caractere de cultură, coloniale și morfologice

Sunt coci Gram – pozitivi, sferici, cu diametrul 0,5 – 1,5 μm, care datorită planurilor neregulate de diviziune, se grupează sub forma unor grămezi cu număr variabil de coci (staphylos = strugure). Stafilococii sunt nesporulați, imobili, neciliați, nefimbriați, iar unele specii formează microcapsulă.

Stafilococii sunt nepretențioși din punct de vedere metabolic, putând crește ușor pe medii nutritive simple, precum bulionul simplu și geloza simplă, incubate 18-24 de ore la o temparatură de 36 – 37°C și un pH optim de 7,5, în condiții de aerobioză sau anaerobioză și mult mai bine pe mediile compuse, în condiții de aerobioză, dar sunt și specii facultativ anaerobe. De exemplu, S. sacharolyticus și S. aureus subsp. anerobius cresc mai repede și mai abundent în anaerobioză. De asemenea, pot fi folosite medii selective și neselective precum : agar-sânge, agar Vogel-Johnson, agar Baird-Parker, bulion thioglicolat.

Tulpinile proaspăt izolate din infecții netratate, cultivate pe mediu solid, dau după 24 ore colonii de tip „S” (smooth). Acestea sunt rotunde (cu diametrul de 2 – 3 mm), cremoase, opace, cu marginile perfecte, suprafața netedă, bombată și lucioasă, iar dacă sunt ținute încă 24 de ore la temperatura camerei, se va observa și pigmentarea: S. aureus dă colonii aurii, S. epidermidis (S. albus) dă colonii alb-porțelanii, iar S. saprophyticus dă colonii galben-citrin. Stafilococii tulbură mediul lichid uniform, cu depozit granular în partea inferioară a tubului însămânțat, iar pigmentul nu se observă. 1, 2, 4, 41

I.2.4.3. Caractere biochimice

Speciile de Staphylococcus sunt capabile să lichefieze gelatina și au acțiune coagulantă asupra laptelui. În mod obișnuit, stafilococii patogeni sunt gelatinolitici, iar cei nepatogeni sunt negelatinolitici. S. aureus reduce nitrații, nu hidrolizează amidonul, fermentează cu producere de acid lactoza, maltoza, manita, zaharoza, dar nu acidifică arabinoza, dextrina, inulina, rafinoza și inozita, iar în cazul S. epidermidis, aceste caractere sunt variabile. 8, 4, 41

I.2.4.4. Rezistența la agenți fizici și chimici

Deși sunt nesporogene, speciile de Staphylococcus, sunt foarte rezistente în mediul extern, fiind capabile să supraviețuiască luni de zile la adăpost de lumina directă solară și la temperatura camerei, în produsele patologice uscate (puroi, spută), în praful din perdele, covoare, perne, saltele. În condiții de umiditate, supraviețuiesc și chiar se înmulțesc, de exemplu, pe obiectele folosite pentru curățenie: perii, bureți, mături. La lumină solară, stafilococii rezistă doar câteva zile. Majoritatea mor în aproximativ 30 de minute la 50°C, iar prin fierbere mor instantaneu.

Un studiu efectuat de o echipă de cercetători de la Universiti Teknologi MARA din Malaezia a demosntrat în 2012 că S. aureus este sensibil la radiațiile electromagnetice emise de telefoanele mobile. Aceștia au arătat că în primele 15 minute de convorbire a existat o scădere ușoară a numărului de UFC (Unități Formatoare de Colonii) din ureche, iar după o expunere prelungită, numărul de UCF a fost mult redus, însă atunci când telefonul se află în modul de așteptare, numărul de S. aureus nu este afectat. Această reducere a numărului de bacterii a fost pusă pe seama creșterii bruște a temperaturii care alterează viabilitatea celulelor, întrucât temperatura din zona urechii poate crește chiar cu 3°C după o oră de convorbire la telefonul mobil. 29

Stafilococii sunt sensibili la detergenți, la fenol 2% (mor în 10 minute), la clor și cloramine, la iod și iodofori, la coloranți (violet de gențiana). De asemenea, ei mor în aproximativ 30 de minute în alcool de 60%. 8, 1, 2, 41

De asemenea, a fost demonstrată acțiunea bacteriostatică a nanoparticulelor de ZnO de 33 nm (eficiența crește direct proporțional cu scăderea dimensiunii particulelor) asupra S. epidermidis. 30

I.2.4.5. Caractere antigenice și de patogenitate

Stafilococii sunt foarte complecși și variabili din punct de vedere antigenic, fiind identificate antigene care variază de la o specie la alta și chiar de la o tulpină la alta în cadrul speciei, prin urmare, și patogenitatea este variabilă. Factorii de patogenitate ai stafilococilor sunt repezentați de virulență și toxigeneză. Pe de-o parte, virulența este realizată prin factori corpusculari (anumite antigene somatice) și factori enzimatici (anumite antigene solubile) și, pe de altă parte, toxigeneza este realizată prin hemolizine, enterotoxine, toxina epiermolitică, leucocidina, toxina sindromului de șoc toxic. 41

Antigenele somatice (legate de structura celulei) sunt reprezentate de capsulă (alcătuită din acid glucozaminuronic la S. aureus), cu rol antifagocitar, antigenele polizaharidice care derivă din acizii teichoici: polizaharidul A, prezent la S. aureus și polizaharidul B, prezenta la S. apidermidis, proteina A (proteina Cowan), cu acțiune antifagocitară, factorul de agregare (clumping factors), care transformă fibrinogenul în fibrină insolubilă și adezinele (proteine de suprafață specifice), cu rol de invazie a țesuturilor.

Antigenele solubile, difuzabile (extracelulare) sunt reprezentate de β-lactamaza (penicilinaza), catalaza, coagulaza liberă, care contribuie la localizarea și persistența infecției, hidrolaze (fibrinolizina sau stafilokinaza, cu acțiune opusă coagulazei, nucleaza, hialuronidaza sau invazina, care facilitează diseminarea infecției), lipaze, care determină adcese (furuncule și carbuncule), hemolizine (alfa, beta, gamma, delta), extotoxine pirogene (enteotoxinele A, B, C1, C2, C3, D, E și TSST-1 (Toxina șocului toxic), leucocidina, exfoliatina (toxina epidermolitică) care este cauza „sindromului pielii opărite”. 41

I.2.1 GENUL BACILLUS

I.2.1.1. Taxonomie și habitat

Conform cu Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, vol. 3, ediția a II-a din 2009, Genul Bacillus este încadrat taxonomic în Familia I. Bacillaceae, Ordinul I. Bacillales, Clasa I. Bacilli din Philumul XIII. Firmicutes, aparținând Domeniului Bacteria și cuprinde peste 40 specii, în mare parte, nepatogene și saprofite. 4, 41

Pornind de la analiza secvențială a ARNr 16S, clasicul gen Bacillus a fost divizat în 11 grupe, cu rang de gen, dintre care numai Bacillus, Paenibacillus și Brevibacillus au interes medical. De asemenea, B. anthracis, B. cereus și B. thuringiensis reprezintă patotipuri de B. cereus, însă didactic li se acordă rangul de specii. 4

În ceea ce privește habitatul, principalul rezervor al speciilor din genul Bacillus este solul, dar se pot găsi, de asemenea, în praf, în apa mării, în apele dulci și termale, în produsele alimentare și medicamentoase, pe plante (B. thuringiensis), în materiile organice aflate în descompunere (B. megatherium), în materiile fecale (B. polymyxa), în nămoluri (B. coagulans), în fân (B. subtilis), pe tegument, pe penele păsărilor (B. licheniformis), în produsele de proveniență animală (B. anthracis), în timp ce multe specii de Bacillus sunt regăsite în microbiota indigenă, rezidentă sau flotantă a colonului.

Larga răspândire a speciilor de Bacillus se datorează sporilor care le oferă o rezistență deosebită față de factorii de mediu. Sporii acestor bacterii sunt răspândiți oriunde este praf și întuneric, putând rezista ani de zile atât timp cât se află la adăpost de uscăciune și de razele ultraviolete. 2, 4, 8

Pentru a „conserva” ADN-ul în condiții de stres, unele bacterii au o capacitate crescută de a lega și internaliza ADN exogen, ceea ce duce la mărirea șanselor de supraviețuire a celulei respective. De exemplu, în cazul bacteriei B. subtilis, trecerea în stare de competență (caracteristică procesului de transformare genetică) se datorează activării unei secvențe de reacții chimice care duce la creșterea nivelui secvenței reglatoare proteice ComK din celulă. Aceasta are un rol cheie, deoarece activează sute de gene, ceea ce conduce la trecerea în starea de competență. (Dandach și Khammash, 2011) 26

Prezența în aer a speciilor din genul Bacillus (de exemplu B. cereus, B. megatherium, B. subtilis, B. circulans, B.pumilus, B. anthracis) se datorează rezistenței endosporilor care pot fi izolați ocazional din medii ambientale, acestea reprezentând doar căi de transmitere. 4

I.2.1.2. Caractere de cultură, coloniale și morfologice

Speciile genului Bacillus au forma caracteristică de bastonașe lungi (3 – 5 μm lungime și 1 – 1,2 μm grosime), drepte, izolate sau dispuse în lanțuri, cu sau fără capsulă și cele mai multe celule sunt mobile, prin prezența flagelilor peritrichi (B. anthracis este imobil). 41

Bacilii care endosporulează aerob pot fi diferențiați în două grupe. În prima grupă sunt încadrați bacilii Gram-pozitivi la care sporul este elipsoid sau cilindric, dispus central sau subterminal și care nu deformează sporangiul. La rândul său, această grupă cuprinde două subgrupe: pe de-o parte, subgrupa bacililor mari care au diametrul mai mare de 1 μm, lungimea de 3 – 8 μm și care sunt frecvent așezați în lanțuri și prezintă adesea globule cistoplasmatice de β-hidroxibutirat (B. anthracis, B.megatherium, B. cereus, B. thuringiensis), pe de altă parte, subgrupa bacililor mici care au diametrul sub 1 μm, lungimea de 1 – 3 μm, sunt dispuși izolat sau în lanțuri scurte și nu prezintă globule citoplasmatice (B. subtilis, B. licheniformis, B. pumilus, B. macerans). Cea de-a doua grupă cuprinde bacilii Gram-variabili care formează spori sferici ce deformează sporangioforul (B. sphaericus). 4

Pentru izolarea speciilor de bacili Gam-pozitivi care endosporulează aerob, mediile de bază folosite sunt agarul-sânge sau agarul nutritiv. Obținerea culturilor pure se poate realiza cu ajutorul mediilor selective, cum este, de exemplu, mediul PLET (Polimixină B-lizozim-EDTA-acetat de taliu) folosit pentru izolarea B. anthracis. După 24 – 48 de ore se dezvoltă colonii mici, netede, în timp ce creșterea altor specii de Bacillus (de exemplu, B. cereus) este inhibată. 3, 4

Coloniile variază în ceea ce privește aspectul și mărimea coloniilor în raport cu specia, condițiile de incubație, vârsta și densitatea coloniilor, calitățile mediului de cultură, proporția celulelor sporulate (care poate determina un amestec de colonii mai mult sau mai puțin opace). De exemplu, pe geloză simplă și geloză-sânge, coloniile formate de B. anthracis (după incubare timp de 24 de ore la 35 – 37°C) sunt mari, cu diametrul de 3 – 5 mm, alb-cenușii, turtite, rugoase, cu aspect de sticlă pisată, nehemolitice sau slab hemolitice și cu marginea cu aspect de „cap de meduză”, iar B. cereus formează colonii care se aseamănă cu cele de B. anthracis, deosebindu-se totuși de acestea prin faptul că primele sunt mai mari și pot produce un pigment roz-brun sau galben-verde fluorescent. Asemănătoare cu coloniile de B. cereus sunt coloniile de B. thuringiensis. De asemenea, coloniile de B. subtilis sunt mari, rotunde sau neregulate, uneori zbârcite, opace, cu suprafața lipsită de strălucire și colorate în crem sau brun, coloniile de B. licheniformis sunt opace, mate până la rugoase, aderente la mediu, iar coloniile de B. circulans pot fi mobile. 3, 4

I.2.1.3. Caractere biochimice

Acest gen cuprinde bacili Gram pozitivi, în culturi tinere, uneori Gram-variabili sau Gram-negativi, în culturile bătrâne, aerobi, facultativ anaerobi. Sunt catalazo-pozitivi, indol-negativi, nu produc urează, reudc nitrații, hidrolizează cazeina și fermenteză unele zaharuri: glucoza, fructoza, maltoza, zaharoza, lichefiază gelatina. De asemenea, asimilează citratul, descompun tirozina, produc lecitinază și cresc pe medii cu 7% NaCl.

În ciuda numeroaselor progrese în tehnologia biomedicală, detectarea rapidă și identificarea endosporilor rămâne o provocare. Straturile endosporilor oferă bogate informații despre speciile bacteriene. De exemplu, datorită afinității unei proteine conținute de endosporii de B. thuringiensis și de cei de B. atrophaeus pentru ThT (tioflavina T), aceștia emit fluorescență atunci când sunt colorați cu această substanță. Deosebirea este aceea că endosporii primei specii se colorează mai rapid comparativ cu cea de-a doua. (Upadhyayula și colab., 2012) 23

I.2.1.4. Rezistența la agenți fizici și chimici

Atât în cazul bacteriilor sporulate, cât și în cazul celor nesporogene, formele vegetative au aceeași rezistență față de factorii fizici și chimici, fiind distruse după aproximativ 30 de minute la 60°C.

Sporii bacteriilor sporulate sunt însă foarte rezsitenți la acțiunea acizilor, dezinfectantelor, radiațiilor și variațiilor de temperatură, B. stearothermophilus fiind bacteria cu cel mai rezistent spor. În cazul B. anthracis, la uscăciune și feriți de razele ultraviolete, aceștia rămân viabili în sol timp de 30 – 40 de ani. Sporii rezistă 10 minute la 140°C și până la 10 ani la – 5°C. Lumina solară directă distruge atât fomele vegetative (în 6 – 15 ore), cât și sporii (în 3 – 4 zile) (Duca și colab., 1979), 3, 41.

Formele vegetative sunt distruse rapid de substanțele dezinfectante în concentrații uzuale, însă sporii prezintă rezistență deosebită. Aceștia sunt sensibili la agenți oxidanți: peroxid de hidrogen 3%, permanganat de potasiu 4%, iar în frotiurile fixate și colorate, nu își pierd viabilitatea. Sărarea cărnii nu distruge sporii. 41

I.2.1.5. Caractere antigenice și de patogenitate

Dintre speciile de Bacillus, B. anthracis și B. cereus sunt speciile cu importanță medicală majoră. B. anthracis produce boala numită antrax, care se transmite de la animale la om, afectând mai ales măcelarii și lucrătorii în industria textilă, iar B. cereus este cauza unor toxiinfecții alimentare. Inhalarea sporilor de B. anthracis produce antrax pulmonar. Aceștia vegetează în țesuturile umane, ganglionii limfatici și secretă un grup de toxine care induc edem, leziuni tisulare și hemoragie.

B. anthracis prezintă structuri antigenice diverse: antigenul capsular polipeptidic sau antigenul K care este o haptenă, formată din acid D-glutamic, a cărui sinteză este codificată de plasmida pXO2, prezentă la toate tulpinile virulente, antigenul somatic polizaharidic alcătuit din galactoză, xiloză, riboză și acid uronic din peretele celular și toxina bacilului cărbunos sau exotoxina cărbunoasă, a cărei sinteză este codificată de plasmida pXO1. Toxina este constituită din 3 fracțiuni antigenice: factorul edematogen (FE, factorul I), antigenul protector (AP, factorul II) și factorul letal (FL, factorul II). Aceste componente, luate separat, sunt slab toxice, însă acționând împreună, dau un grad ridicat de toxicitate. (Irving și colab., 2009), 4 , 41

Patogenitatea B. anthracis se manifestă prin virulență și toxinogeneză. În virulență intervin capsula, care are rol antifagocitar (prezintă rezistență la hidroliza produsă de enzimele proteolitice ale celulei gazdă) și factorii enzimatici eliberați cum sunt lecitinaza, hemolizina. În ceea ce privește toxinogeneza, un rol important în patogenitate în fazele avansate și terminale ale bolii îl are exotoxina cărbunoasă, o proteină simplă, termolabilă care poate fi detectată în colecția lichidiană edematoasă a pacienților cu antrax.

În ceea ce privește sporii, antigenele conținute de aceștia diferă de cele ale celulei vegetative și permit diferențierea speciilor. De exemplu, antigenul H lipsește la B. anthracis, însă are rol important în stabilirea serotipurilor de B. thuringiensis. 3

I.2.3. GENUL PSEUDOMONAS

I.2.3.1. Taxonomie și habitat

Taxonomia pseudomonadelor a fost remaniată de nenumărate ori, multe specii ale genului Pseudomonas fiind reclasificate în alte genuri. Astfel, după criteriul omologiei ARNr, în genul Pseudomonas au râmas doar speciile: Ps. aeruginosa (bacilul piocianic), Ps. putida, Ps. fluorescens (specii fluorescente), Ps. alcaligenes, Ps.pseudoalcaligenes, Ps. mendocina, Ps. stutzeri (specii non-fluorescente). Conform cu Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, vol. 2, ediția a II-a din 2005, Genul Pseudomonas aparține Familiei I. Pseudomonadaceae din Ordinul IX. Pseudomonadales, Clasa III. Gammaproteobacteria, Philumul XIV. Proteobactria, Domeniul Bacteria. 4

Speciile acestui gen sunt foarte răspândite în natură (sol, aer, ape naturale stătătoare sau de scurgere). Specia tip a genului, Ps. aeruginosa, este unul dintre agenții de putrefacție a materiei organice și se izolează frecvent de pe mucoase, tegument (mai ales, în regiunea axilară și perineală), din tubul digestiv, dar poate fi găsit și în spitale (instalații sanitare, alimente, instrumente medicale, tolete, imncubatoare, termometre, flori). Contaminează cosmeticele, alimentele, medicamentele chiar dacă acestea sunt stocate la frigider. În cazul infecțiilor cu Ps. alcaligenes se estimează că mortalitatea este de 13,5%, chiar și în cazul administrării de antibiotice. 3, 41

I.2.3.2. Caractere de cultură, coloniale și morfologice

Pseudomonadele sunt bacili fini (1,5 – 3 μm lungime și 0,5 – 0,8 μm grosime), drepți sau ușor curbați, cu lungimi variabile (1,5 – 3 μm la formele filamentoase), cel mai adesea izolați, dar pot fi așezați în perechi și, uneori în lanțuri scurte. Majoritatea sunt mobili prin prezența a 1 – 3 cili dispuși polar, sunt nesporulați și nu prezintă capsulă, dar au fost izolate și tulpini cu capsulă polizaharidică, din infecții grave.

În culturile tinere, se prezintă sub formă filamentoasă, în culturile vechi și pe medii antiseptice prezintă forme de involuție (filamente ondulate, lanțuri scurte de coci), în timp ce formele bătrâne se prezintă granulate. 1,2,3

Speciile de Pseudomonas se cultivă cu ușurință pe medii lichide simple (bulion nutritiv) și pe medii solide (agar nutritiv, agar-sânge, agar-ciocolat, agar Mac Conkey, agar Istrate-Meitert) în condiții de aerobioză, la o temperatură optimă de 37°C și un pH optim de 7,6.

Pe geloză simplă, Ps. aeruginosa, formează 5 tipuri de colonii: colonii de tip 1 care sunt mari (2 – 3 mm diametru), rotunde, strălucitoare, ușor convexe și cu o consistență untoasă, colonii de tip 2, mici și convexe, colonii de tip 3, convexe și rugoase, colonii mucoide care sunt inițial convexe, unele cu consistență apoasă, altele cu consistență gumoasă și colonii pitice, izolate de la bolnavii de fibroză chistică pulmonară. Pe agar-sânge, colorează mediul în brun, iar pe mediile agar Mac Conkey și agar Istrate-Meitert, coloniile sunt mici și aderente la mediu. Cultivat în bulion, tulbură mediul și formează peliculă la suprafață. După 24 de ore, apare pigmentația albastră-verde fluorescentă (datorită picocianinei și fluoresceinei) și apare un miros caracteristic de flori de tei. Pigmentația se accentuează prin agitarea mediului, dar nu apare în aerobioză.3, 1, 2, 41

I.2.3.3. Caractere biochimice

Speciile de Pseudomonas sunt Gram – negative, oxidazo-pozitive, reduc nitrații în nitriți, amoniac sau chiar N liber, fermentează glucoza, dar nu fermentează lactoza. De asemena, unele specii produc pigmenți fluorescenți. De exemplu, 91% din tulpinile de Ps. fluorescens și 82% din cele de Ps. putida produs pioverdină, în timp ce tulpinile de Ps. aeruginosa produc în proporție de aproximativ 80% piocianină, 70% pioverdină și sub 1% produc piomelanină. 4

În anul 2010, doi cercetători din India au efectuat un studiu asupra unor pești ornamentali din specia Pseudotropheus lombardoi, prin care au demonstrat că tulpina Ps. aeruginosa MICC 741, pe de-o parte, influențează pigmentarea și, pe de altă parte, constituie o barieră împotriva proliferării patogenilor. Peștii supuși experimentului au fost hrăniți cu diferite concentrații de Ps. aeruginosa, iar concentația maximă de 103 UFC/ml a determinat creșterea cu aproximativ 400% a cantității de pigment carotenoid. Acesta nu a fost singurul efect al administrării de Ps. aeruginosa, întrucât s-au mai observat sporirea semnificativă a ritmului de creștere, precum și sporirea rezistenței la patogeni (Vibrio parahaemolyticus și Bacillus cereus). 50

Un studiu publicat în 2014 a arătat că unele specii de Pseudomonas, precum: Ps. alcaligenes, Ps. putida, Ps. fluorescens produc enzime capabile să degradeze cafeina. Această proprietate are importanță, întrucât cafeina din produsele reziduale poate avea efecte nocive asupra mediului, incluzând inhibarea germinării semințelor plantelor și toxicitate pentru plante și insecte. Cafeaua este un produs agricol intens cultivat la nivel mondial (8,1 tone în 2012) și numai 18% din fruct este folosit, restul de 82% reprezentând deșeuri. 48

De asemenea, s-a demosntrat că Ps. putida se află printre microorgansimele capabile să degradeze nicotina conținută de tutun. Acesta este capabil să utilizeze nicotina ca unică sursă de carbon, și astfel o poate degrada din frunzele de tutun, fără a afecta însă aroma și gustul tutunului. Un studiu din 2011 efectuat în acest sens au arătat că rata de degradare a nicotinei este influențată direct proproțional de rata de creștere a culturii de Ps. putida. Așadar, aceasta ar putea constitui o strategie puternică pentru reducerea bolilor cauzate de fumat. 39

Multe studii efectuate au arătat că anumite specii de Pseudomonas, atunci când se află în faza staționară de creștere, pot fi folosite eficient pentru tratarea efluenților insustriali care conțin metale grele. Valorificarea potențialului acestor specii de a acționa asupra metalelor grele poate constitui o soluție la problemele actuale legate de poluarea mediului înconjurător, având în vedere că multe industrii, printre care industria auto și industria textilă, folosesc metale grele în diferite concentrații. Acestea nu se degradează în timp, ci se acumulează în natură, sunt toxice și au potențial cancerigen. Una dintre speciile care pot fi folosite în acest scop este Ps. alcaligenes care oferă posibilitatea de a îndepărta ionii de Sr(II) și Pb(II) din soluții apoase. Capacitatea maximă de absorbție pentru ionii de Sr(II) este de 67,35 mg/g, iar pentru ionii de Pb (II) este de 65,42 mg/g. În primul caz, experimentele au fost realizate la 28°C și un pH de 5 iar în cel de-al doilea caz, temperatura a fost de 27°C și pH-ul de 6.32 și 33

O altă specie care poate fi folosită pentru absorbția metalelor grele este Ps. fluorescens, care acționează asupra ionilor de Pb(II), Sr(II), Co(II) și Cd(II). Rezultatele studiilor efectuate în acest sens au arătat o capacitate maximă de absorbție de 80 mg/g (27°C, pH=7), 80,06 mg/g (27°C, pH=7), 65,42 mg/g, respectiv 85,30 mg/g (25±2°C, pH=5). 34 35 36

I.2.3.4. Rezistența la agenți fizici și chimici

Ps. aeruginosa, specia cea mai frecvent implicată în etiologia multiplelor afecțiuni umane este o bacterie cu o rezistentă crescută la ultraviolete, umiditatea fiind factorul care favorizează dezvoltarea și persistența acesteia. Ps. aeruginosa rezistă câteva săptămâni în materialul infecțios uscat, dar este sensibil la căldură (moare în 5 – 15 minute la 60°C), la dezinfectante și antiseptice uzuale. De exemplu este distrus, în special, de detergenții cationici, de fenol 2% și de formol, dar este rezistent la alcool. 8, 1, 2, 3

Un studiu recent a arătat că Ps. aeruginosa este sensibil la NTBC (2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl) benzoyl]-1,3-cyclohexanedione), care acționează în sensul inhibării sintezei de piomelanină, un pigment cu proprietăți antioxidante care contribuie la persistența bacteriei în infecțiile cronice și la creșterea rezistenței la stres oxidativ. Ca atare, NTBC are potențialul de a acționa ca factor anti-virulență în tratarea infecțiilor cauzate de Ps. aeruginosa. 50

I.2.3.5. Caractere antigenice și de patogenitate

Ps. aeruginosa posedă antigenul somatic „O”, termostabil, de natură lipopolizaharidică, și care este localizat în peretele celular și antigenul „H”, termolabil, de natură proteică, izolat din flageli și fimbrii. Factorul de adeziune este reprezentat de slime, o substanță mucoidă extrasă din coloniile mucoide ale tulpinilor implicate în infecții cronice ale tractului respirator.

Fcatorii de virulență sunt reprezentați de capsulă, cu rol antifagocitar și de adezină, de pili (fimbrii) care asigură aderarea la celulele epiteliale, de exopolizaharidele (alginatul) care sunt responsabile de dezvoltarea coloniilor mucoide în culturi provenite de la pacienții cu fibroză chistică, precum și de enzimele extracelulare care produc lezarea celulară (lecitinaza C, fosfataza, lipaza, colagenaza, elastaza, proteaza, fosfolipaza C și glicolipidul)

În toxinogeneză sunt implicate antigenul „O” care determină sindromul septic (febră, șoc, oligurie, leucopenie și leucocitoză), exotoxina A care inhibă sinteza proteică și exotoxina S, de asemenea, inhibitoare a sintezei proteice. 1, 2, 3, 21,

I.2.2. GENUL LEGIONELLA

I.2.2.1. Taxonomie și habitat

Conform cu Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, vol. 2, ediția a II-a din 2005, Genul Legionella aparține Familiei I. Legionellaceae din Ordinul VI. Legionelalles, Clasa III. Gammaproteobacteria, Philum XIV. Proteobacteria, Domeniul Bacteria și cuprinde, în prezent, cel puțin 48 de specii și 70 de serogrupe. Dintre acestea, 14 specii au fost izolate de la om și din mediul ambiant, 7 numai de la bolnavi, iar restul numai din mediul extern. Cea mai importantă este L. pneumophila, serogrupul I care este responsabilă de peste 90% din cazurile de legioneloză, urmată de L. micdadei (5%). (Buiuc și Neguț, 2009), 41

Habitatul natural principal al legionelelor este reprezentat de sursele și rezervoarele naturale sau artificiale de apă, unde stabilesc relații complexe cu microbiocenozele proprii acestor biotopuri: cianobacterii, protozoare, flavobacterii, alge verzi. Legionelele supraviețuiesc și în amibe, răspândindu-se astfel în natură prin intermediul chisturilor de amibe. Ele au fost izolate din apa turnurilor de răcire, din condensatoarele de evaporare și rezervoarele de apă ale instalațiilor de climatizare a aerului, din noroi, nămol, apă de ploaie, din lacuri dulci, chiar și din apele din rețelelor de instalații domestice, cu temperatura sub 55°C, iar principala cale de infectare este reprezentată de inhalarea aerosolilor. Nu au fost izolate niciodată din pământ uscat și din apa de mare.

De exemplu, folosind 45 de probe colectate din 7 spitale din Iran, o echipă de cercetători de la „Tehran University of Medical Sciences” au arătat, în anul 2014, folosind tehnica PCR (Polymerase Chain Reaction), că dușurile erau cele mai contaminate cu L. pneumophila (58,3% din probele colectate au fost pozitive), urmate de robinetele de apă caldă și rezervoarele de apă caldă (25% din probe au fost pozitive în amele cazuri), în timp ce numai 9% din probele colectate din apa rece de la robinet au fost pozitive. 49

De asemenea, au fost izolate și de la bolnavi, deși omul nu reprezintă o gazdă naturală, deoarece legionelele nu fac parte din flora saprofită umană, ci au apărut ca urmare a suprapunerii și unificării nișelor umane și bacteriene. 3, 4

I.2.2.2. Caractere de cultură, coloniale și morfologice

Acest gen cuprinde bacili, mici, subțiri (cu lungimea de 1,5 – 5 μm și grosimea de 0,3 – 0,9 μm), palid colorați, cu marginile ascuțite. Sunt polimorfi, dar în culturi mai vechi apar sub forme filamentoase care pot ajunge până la 50 μm. Sunt nesporulați, nu au capsulă, prezintă pili și sunt mobili prin unul sau mai mulți flageli subpolari. În compoziția chimică a peretelui celular predomină acizii grași cu lanțuri ramificate (6 – 80%). 3,4

Speciile de Legionella sunt aerobe și creșterea lor este stimulată de concentrațiile de 2,5 – 5% CO2 (L. gormanii este singura specie carboxifilă) și pH-ul de 6.9. Legionelele nu se dezvoltă pe mediile de cultură convenționale, ci numai pe medii suplimentate cu L-cisteină, săruri de fier, diverși aminoacizi și factori de creștere. Mediul de selecție utilizat pentru obținerea culturii pure de B. anthracis este agarul BCYE α (Buffered Charcoal Yeast Extract α-Cetoglutarat). 4

Coloniile apar lent, la 35 – 37°C, după 3 – 5 zile de la inoculare. Coloniile sunt inițial punctiforme, observabile numai la stereomicroscop, iar după o săptămână ating 3 – 4 mm, fiind vizibile cu ochiul liber. Acestea au marginile convexe, sunt rotunde, gri-verzui și au aspect lucios-sticlos. Culturile vechi capătă aspect alb-cenușiu și se disociază în colonii mari și colonii mici. 3, 4

I.2.2.3. Caractere biochimice

Speciile de Legionella sunt Gram-negative, catalazo-pozitive și oxidazo-negative sau slab pozitive, descompun hipuratul sodic, produc β-lactamază, sunt inactive asupra carbohidraților și nu reduc nitrații. De asemenea, legionelele digeră gelatina, utilizează amidonul, dar nu descompun ureea și nu folosesc hidrocarbonatele cu producere de gaz.

I.2.2.4. Rezistența la agenți fizici și chimci

Speciile de Legionella pot supraviețui până la un an în apa de la robinet la 4°C și până la 130 de zile în apa distilată, la un pH de 4,2, iar în aerosoli mor cu atât mai rapid cu cât scade umiditatea.

În ceea ce privește factorii chimici, legionelele sunt sensibile la dezinfectanții pe bază de clor (hipoclorit de calciu), la formol, fenol, precum și compușii cuaternari de amoniu, iar protozoarele ciliate și rizopode le ingeră, fără a le distruge, protejându-le astfel de uscăciune. 3, 41

I.2.2.5. Caractere antigenice și de patogenitate

Există atât antigene comune genului, cât și antigene specifice de specie sau de serogrup, aceasta fiind explicația diferențierii legionelelor în serotipuri. Pe lângă acestea, au fost ientificate și fracțiuni antigenice comune cu alte specii bacteriene (mai ales Gram-negative).

L. pneumophila prezintă următoarele antigene: lipopolizaharidul (LPS), bogat în acizi grași și care are o acțiune similară cu andotoxina bacteriilor Gram negative, proteina majoră a membranei externe (MOMP – major outer membran protein) și antigenul flagelar „H”. 41

Legionelele sunt bacterii facultativ intracelulare, iar tulpinile de L. pneumophila sunt patogene prin: glicocalix, flageli, cu rol în aderența la celulele pulmonare, endotoxina lipopolizaharidică, exotoxine și proteaze.

La om, infecțiile cu L. pneumophila se manifestă în principal sub două forme: „boala legionarilor” sau „pneumonia de Pittsburg” (pneumonia atipică cu o gamă largă de manifestări clinice) și „febra de Pontiac” (nepneumonică, pseudogripală). 3, 12

II. PARTE EXPERIMENTALĂ

II.1. SCOPUL ȘI OBIECTIVELE CERCETĂRII

Scopul prezentei lucrări este studiul aeromicrobiotei din spații educaționale ale Facultății de Științe din cadrul Universității din Pitești, având ca obiective:

– determinarea numărui total de germeni mezofili (NTG);

– determinarea numărului de germeni hemolitici (NG);

– determinarea prezenței coliformilor și a Escherichia coli;

– determinarea prezenței Proteus;

Pentru realizarea obiectivelor propuse, au fost alese șase săli din care au fost preluate probe de aer prin metoda sedimentării, folosind plăci Petri cu geloză simplă și geloză – sânge. Acestea au fost incubate 24 de ore la 37°C (plăcile cu geloză simplă au fost ținut eîncă 24 de ore la temperatura camerei), după care s-a procedat la numărarea și descrierea coloniilor apărute pe suprafața acestora.

Numărul coloniilor apărute a fost folosit pentru a determina numărul toal de germeni mezofili (NTG) și numărul total de germeni hemolitici (NG), permițând astfel a face o comparație cu limita maximă admisă.

NTG (microorganismele care se dezvoltă la temperatura de incubare de 37°C) permite aprecierea gradului de conatminare a aerului cu microbiotă de origine animală sau umană, în majoritate saprofită) și oferă informații privind condițiile sanitare din încăpere, precum ventilația, aglomerația starea de curățeni, condiții care intervin în transmiterea infecțiilor pe cale aerului. Deși este indicatorul cel mai frecvent utilizat, prezintă totuși dezavantajul că, la temperatura de 37° C se pot dezvolta și germeni psihrofili,nu numai mezofili.

NG este un indicator care permite aprecierea gradului de contaminare al aerului cu microbiotă de origine nazo – faringiană și bucală. Indicatorul are importanță întrucât cele mai multe infecții respiratorii sunt provocate de picăturile de secreție nazo – faringiană și salivară eliminate de persoanele purtătoare sau bolnave prin strănut, vorbit, tuse. Prin urmare, prezența acestora în aerul dintr-o încăpere are semnificație epidemiologică fiind un semnal al prezenței unei persoane bolnave sau purtătoare de streptococi. Recomnadrile

Pornind de la coloniile descrise, au fost obținute culturi pure care au fost descrise, iar tulpinile bacteriene izolate au fost supuse mai multor tehnici pentru: – studiul caracterelor morfologice și tinctoriale: colorația Gram;

– studiul carecterelor biochimice: reacția catalazei, studiul metabolizării citratului, studiul metabolizătii glucidelor, reacția catalazei.

Astfel, s-a putut concluziona dacă în probele de aer prelevate sunt prezenți coliformi (Escherichia coli) și Proteus sp., și indica potențiale genuri bacteriene cărora pot aparține tulpinile izolate și supuse analizei.

Prezența în aer a coliformilor, grup care aparține Familiei Enterobacteriaceae și din care fac parte Escherichia coli, Proteus sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp., Salmonella sp. indică un grad alarmant de insalubrizare al încăperii, aceștia fiind de origine intestinală umană și animală.

În final, pe baza rezultatelor obținute s-a putut aprecia dacă și în ce măsură aeromicrobiota din încăperile vizate poate prezenta un risc pentru sănătatea umană.

II.2. MATERIAL ȘI METODE

II.2.1. PROBELE INVESTIGATE

Studiul a fost realizat în șase încăperi din incinta Facultății de Științe (două laboratoare, două amfiteatre, o sală de curs și secretariat), din cadrul Universității din Pitești.

Pentru realizarea studiului, probele de aer au fost prelevate prin metoda sedimentării pe geloză simplă și geloză – sânge în două variante de lucru:

– un prim set de probe au fost prelevate în data de 18 noiembrie 2014 din trei săli: secretariat S102, amfiteatru S103 și laborator S128;

– un al doilea set de probe au fost prelevate în data de 5 mai 2015 din alte trei săli: sală de curs S101, laborator S106 și amfiteatru S109.

Pentru fiecare încăpere aleasă pentru realizarea studiului, au fost măsurate temperatura aerului (°C), umiditatea atmosferică (%) la momentul prelevării probelor de aer, precum și volumul de aer, exprimat în m3 de aer, valorile acestora fiind prezentate în tabelul II.1.

Tabelul II.1. Valorile temperaturii, umidității și volumului de aer pentru sălile din care au fost prelevate probe de aer

Temperatura și umiditatea aerului au fost determinate cu ajutorul unui higro – termometru electronic, iar volumul de aer al sălilor a fost calculat după formula:

V = L x l x h, în care

V = volumul de aer al încăperii (m3 aer);

L = lungimea încăperii (m);

l = lățimea încăperii (m);

h = înălțimea încăperii (m).

II.2.2. METODE UTILIZATE

II.2.2.1. Recoltarea probelor

Probele de aer au fost prelevate utilizând metoda sedimentării (Koch). Metoda este avantajoasă deoarece datorită simplității sale și a faptului că se realizează într-un timp scurt, fiind des utilizată în practică, dar prezintă dezavantajul că prin folosirea acesteia se pot determina numai germenii sedimentați în unitatea de timp și nu permite însămânțarea nucleilor de picătură.

Etapele specifice ale acestei metode sunt:

– recoltarea germenilor din aer;

– incubarea în condiții corespunzătoare;

– citirea și interpretarea rezultatelor.

Metoda sedimentării constă în expunerea de plăci Petri cu mediu nutritiv solid (geloză simplă și/sau geloză – sânge în încăperea în care se urmărește analiza aeromicrobiotei. Numărul plăcilor, precum și timpul de expunere depind de gradul de contaminare bănuit al aerului. Astfel, se recomandă folosirea unui anumit număr de plăci per încăpere în funcție de volumul de aer al acesteia, mai exact o placă Petri la fiecare 10 m3 aer, timpul de expunere putând fi cuprins între 5 și 60 de minute. După expirarea timpului de expunere, se închid plăcile Petri și se termostatează la 37°C pentru 24 de ore (în cazul plăcilor cu geloză simplă), respectiv 48 de ore (în cazul plăcilor cu geloză – sânge), se numără coloniile crescute și se fac însămânțări pe medii selective.

Pentru prelevarea primului set de probe, în fiecare din cele trei încăperi, au fost expuse câte 4 plăci Petri:  două cu geloză simplă (pentru determinarea numărului total de germeni mezofili) și două cu geloză – sânge (pentru determinarea numărului de germeni hemolitici), timpul de expunere fiind de 15, respectiv 30 de minute pentru fiecare tip de mediu nutritiv.

În același mod s-a procedat și pentru prelevarea celui de-al doilea set de probe, cu deosebirea că nu s-au mai folosit plăci cu geloză – sânge. Plăcile Petri au fost așezate la o înălțime de 60 – 100 cm de la pardoseală, iar după expirarea timpului de expunere, plăcile Petri au fost închise și au fost introduse în termostat, la 37°C, timp de 24 de ore, plăcile cu geloză simplă fiind expuse încă 24 de ore la temperatura camerei. După 24, respectiv 48 de ore, s-a procedat la numărarea coloniilor apărute geloză – sânge, respectiv geloză simplă.

O altă metodă utilizată în practică pentru prelevarea probelor de aer este metoda apirației care necesită următoarele dispozitive:

– un aspirator electric sau hidraulic pentru aspirarea probelor de aer;

– un dispozitiv pentru măsurarea volumului de aer aspirat;

– un filtru lichid sau solid pentru reținerea germenilor din proba de aer (URL. http://www.scribd.com/doc/46554413/Aeromicroflora#scribd ).

Germenii pot fi recoltați prin barbotare (cu ser fiziologic steril), prin filtrare (cu un filtru de nisip steril), pot fi aspirați turbionar cu ajutorul unui cilindru căptușit îm interior cu mediu solid sau prin electroprecipitare, folosind un dispozitiv cu electrozi care sunt acoperiți cu mediu de cultură solid (URL http://www.scribd.com/doc/46554413/Aeromicroflora#scribd ). După recoltare, se realizează termostatarea la 37°C timp de 24 de ore, după care se numără coloniile, iar pentru exprimarea numărului de germeni/m3 de aer se aplică formula (URL http://www.scribd.com/doc/46554413/Aeromicroflora#scribd ):

N = n x 1000/V, unde:

N = numărul de germeni/m3 de aer,

n = numărul de coloii apărute pe suprafața mediului de cultură,

V= volumul de aer aspirat (exprimat în dm3)

II.2.2.2. Determinarea NTG și NG

După termostatarea corespunzătoare a probelor prelevate, s-a procedat la numărarea coloniilor apărute pe geloză simplă (Fig. II.1.), respectiv geloză – sânge (Fig. II.2.) utilizând numărătorul de colonii Funke Gerber.

Pentru aprecierea cantitativă a numărul de microorganisme din aerul analizat s-a utilizat formula lui Omelianski:

UFC – numărul de unități formatoare de colonii;

n – numărul de colonii rezultate prin sedimentarea celulelor pe suprafața mediului;

S – suprafața plăcii Petri (cm2) ;

K – coeficient ce depinde de timpul de expunere (min) ;

, t = timpul timp de expunere (min).

Valorile supuse analizei au constat din media aritmetică dintre numărul de UFC/m3 aer obținut pentru intervalul de 15 minute și cel obținut pentru intervalul de 30 de minute, pentru fiecare sală în parte. Valoarea la care s-a făcut raportarea în realizarea studiului a fost de 2500 UFC/m3 aer pentru NTG, respectiv de 50 UFC/m3 aer pentru NG, valorile limită recomandate de legislație pentru NTG și NG și preluate de literatura de specialitate pentru câteva tipuri de încăperi fiind prezentate în tabelul II. 2.

Tabelul II. 2. Valorile limită recomandate pentru NTG și NG (http://www.scribd.com/doc/46554413/Aeromicroflora#scribd; Diaconu D. și colab., 2012; Misca C., 2014)

În ceea ce privește NTG, valorile recomandate, comparate cu valoarea la care s-a realizat raportarea sunt mai mici în cazul încăperilor educaționale pentru copii, unitaților destinate producției de alimente și saloanelor de spital. Pentru sălile de pansamente septice, valoarea recomandată este mult mai mare comparativ cu cea recomandată pentru sălile de pansamente aseptice, în timp ce pentru sălile de operație, valoarea recomandată nu depășește 70 UFC/m3 aer. Valorile recomandate sunt mai mici în cazul încăperilor din spitale, fapt explicabil prin efectuarea de dezinfecții dese care să prevină infectarea pacienților.

Pentru NG, valoarea recomandată în cazul unităților destinate producerii de alimente este de doar 16 UFC/m3 aer, mult mai mică comparativ cu valoarea la care s-a făcut raportarea pentru realizarea acestui studiu.

II.2.2.3. Obținerea culturilor pure

Prin cultură pură se înțelege o populație omogenă de celule care aparțin aceleași tulpini bacteriene dintr-o aumită specie de microroganisme care se dezvoltă într-un mediu nutritiv lichid sau solid. Altfel spus, cultura pură reprezintă o masă de celule, rezultat al replicării unei singure celule bacteriene într-un mediu nutritiv steril (Petre, 2012).

De asemenea, cultura pură poate fi considerată și o colonie formată în urma izolării unei celule ori a unei unități formatoare de colonie, localizată pe mediu nutritiv solidificat, prin unitate formatoare de colonii (UFC) înțelegându-se totalitatea formelor vegetative ale unei bacterii care rezultă, dintr-o celulă unică în mod direct, în urma cultivării in vitro (Petre, 2012).

Obținerea unei culturi pure se realizează efectuând mai multe operații:

– obținerea de colonii izolate ale microorganismelor dintr-o populație heterogenă din punct de vedere taxonomic din proba destinată cercetării;

– cultivarea coloniei izolate dorite pe medii nutritive corespunzătoare și în condiții aseptice;

– multiplicarea repetată a coloniilor izolate care rezultă din prima inoculare, având ca rezultat purificarea culturii (Petre, 2012).

Așadar, pentru studiul unui izolat bacterian în scopul identificării sale este necesar să se folosească culturi pure. De aceea, culturile bacteriene prelevate și au fost trecute pe mediu selectiv înclinat.

Materiale necesare:

– culturi bacteriene în mediu solidificat în cutii Petri;

– tuburi cu mediu steril în coloană înclinată;

– bec de gaz;

– ansă de platină.

Tehnica de lcuru:

– se sterilizează ansa prin încălzire la roșu și se flambează portansa în porțiunea inferioară a flăcării becului de gaz;

– se deschide cutia Petri, în apropierea flăcării becului de gaz, ținând cutia în palma stângă și deschizând-o cu degetele mâinii stângi;

– se răcește bucla ansei pe partea interioară a capacului cutiei Petri;

– se preiau celulele bacteriene prin raclare fină;

– se flambează capacul cutiei Petri și se acoperă cutia;

– se deschide eprubeta conținând mediu steril dispus în coloană înclinată și se flambează gura eprubetei;

– se introduce ansa cu celulele bacteriene preluate anterior până la nivelul lichidului de condensare și se omogenizează;

– pe suprafața mediului înclinat se descrie un traseu în zig-zag cu bucla ansei;

– se flambează gura eprubetei și se închide;

– se usucă ansa în porțiunea rece a flăcării becului de gaz și se sterilizează prin încălzire la roșu, urmată de flambarea portansei în porțiunea fierbinte a flăcării becului de gaz;

– eprubetele se termostatează timp de 24 – 48 de ore la 37°C.

Culturile pure astfel obținute se pot păstra la frigider la obținute se pot păstra la frigider la 4°C, prelucrându-se ulterior.

Trecerea izolatelor bacteriene pe mediu în coloană înclinată poate fi precedat de trecerea coloniilor izolate pe geloză sectorizată în cutii Petri (Fig. II. 4.)

II.2.2.3. Studiul caracterelor coloniale și de cultură

Studiul caracterelor de cultură și coloniale reprezintă o etapă importantă pentru identificarea germenilor din probe naturale și s-a realizat prin observații ale coloniilor asupra coloniilor, respectiv culturilor obținute pe geloză simplă.

O colonie bacteriană reprezintă rezultatul procesului de multiplicare într-un spațiu limitat a unui mediu nutritiv solid a unei singure celule care aparține unei specii bacteriene.

Coloniile bacteriene izolate, obținute pe mediu solidificat repartizat în cutii Petri, după termostatare, au fost observate, înregistrându-se:

– forma coloniilor: circulară, neregulată, ovalară, concentrică, rizoidală, rizoidă, filamentoasă, rotundă cu margini crenelate, rotundă cu margini reliefate, filiformă, complexă;

– mărimea coloniilor: punctiforme (<1 mm diametru), mici (1 – 2 mm diametru), medii (2 – 4 mm diametru), mari (>4 mm diametru) (Deliu, 2015);

– localizarea coloniilor: la suprafața mediului, în profunzimea mediului;

– marginea coloniilor: întreagă, neregulată, ondulată, lobată, lânoasă, filamentoasă, ramificată, ciliată, buclată;

– profilul coloniilor: plat, convex, înalt, crateriform, umbonat;

– culoarea coloniilor: diferă în funcție de pigmentul sintetizat, eliberarea lui în mediu și de mediul de cultură (de cele mai multe ori, coloniile apar colorate în crem);

Pentru descrierea culturilor pure bacteriene s-au urmărit și notat următoarele aspecte:

– gradul de creștere al culturii: absent, sărac, moderat, abundent, excesiv;

– caracterul creșterii culturii: sub formă de colonii izolate sau confluent;

– localizarea culturii: la suprafața mediului, în profunzimea mediului;

– culoarea culturii.

II.2.2.4. Studiul caracterelor morfologice

Pentru diferențierea tulpinilor bacteriene în funcție de afinitățile tinctoriale (Gram pozitive sau Gram negative) și de forma microorganismelor (coci sau bacili) s-a utilizat colorația Gram, Christian Gram fiind cel care a pus bzele acestei metode diferențiale de colorare.

Structura peretelui celular diferă la cele două categorii de bacterii, astfel:

– peretele celular al bacteriilor Gram (+) are o grosime de 20 – 80 nm, fiind alcătuit dintr-un start unitar și omogen de peptidoglican;

– peretele celular al bacteriilor Gram (-) este mai complex constituit, fiind alcătuit dintr-un start de peptidoglican cu o grosime de 1- 3 nm care este înconjurat de o membrană externă de 7 – 8 nm (Petre, 2012).

Aceste diferențe în ceea ce privește structura peretelui celular determină o afinitate tinctorială diferită față de coloranții utilizați: violet de gențiana (colorantul primar), respectiv fuxină bazică diluată (colorantul secundar). Astfel, ultilizând această tehnică de colorare, bacteriile Gram (+) vor căpăta culoarea violet (culoarea colorantului primar), iar bacteriile Gram (-) se vor colora în roz până la roșu (culoarea colorantului secundar).

Principiul tehnicii:

În prima etapă, celulele bacteriene sunt colorate cu un colorant primar, și anume colorantul bazic violet de gențiana care, pătruns în celule, va interacționa cu componenții acizi din citoplasmă. Urmează tratamentul celulelor cu soluție de I2/KI, cunoscută sub numele de soluție Lugol. Aceasta are rol de mordant care sporește interacția dintre colorantul violet de gențiana și componentele celulare, formând un complex intracelular substrat – mordant – colorant (Deliu, 2015; Petre, 2012).

În cea de-a treia etapă, se efectuează decolorarea celulelor cu o soluție de alcool – acetonă care determină diferențierea celor două categorii de bacterii: bacteriile Gram (+) rețin colorantul primar, spre deosebire de bacteriile Gram- care pierd colorantul primar, devenind astfel incolore (Deliu, 2015; Petre, 2012).

În final, se face o recolorare cu un colorant secundar, precum safranina sau fuxina, în urma căreia se vor colora în roșu doar bacteriile Gram (-) decolorate, în timp ce bacteriile Gram (+) își vor păstra culoarea violet a colorantului primar folosit (Deliu, 2015; Petre, 2012).

Utilizarea acestei tehnici permite diferențierea celor două categorii de bacterii în funcție de structura peretelui lor celular, care determină o colorație diferită.

Materiale necesare:

– cultură pură bacterienă de 24 h;

– violet de gențiana sau cristal violet;

– soluție mordant (Lugol: iod în iodură de potasiu);

– soluție decolorantă (alcool: acetonă 3:1);

– soluție fuxină bazică diluată;

– lame degrasate;

– ansă bacteriologică;

– pipete Pasteur;

– pipete pentru coloranți;

– bac de gaz;

– cristalizor;

– suport pentru lame;

– suport pentru uscarea lamelor;

– vas cu apă de robinet;

– vas cu amestec dezinfectant;

– microscop.

Tehnica de lucru:

Obținerea frotiurilor:

– lama degresată se sterilizează prin treceri consecutive prin flacăra becului de gaz, după care se lasă în suportul pentru lame în poziție înclinată și se așteaptă răcirea acesteia;

– se recoltează o cantitate mică din cultura bacteriană pură în bucla ansei bacteriologice sterilizate la flacăra becului de gaz prin uscare în partea inferioara a flăcării, urmată de încălzirea la roșu a ansei și flambarea portansei în zona fierbinte a flăcării,

– se etalează celulele bacteriene pe lama sterilizată într-un strat subțire și uniform, prin deplasarea buclei ansei tangent cu lama și prin mișcări concentrice, ovale;

– frotiul astfel obținut se usucă la temperatura camerei sau prin termostatarea la 37°C, rezultatul fiind evaporarea lichidului și atașarea celulelor bacteriene de suprafața lamei (Deliu, 2015; Petre, 2012).

2. Fixarea frotiurilor:

– frotiul uscat se trece de trei ori prin flacăra becului de gaz, timp de o secundă, tinând lama de una din extremități, cu mișcari lente și cu fața opusă celei pe care se găsesc celulele bacteriene, operațiune care are ca rezultat omorârea celulelor bacteriene și aderarea acestora la lamă (Deliu 2015; Petre, 2012)

Temperatura la care se face încălzirea lamei trebuie să fie suportată de dosul mâinii, deasupra degetului mare (60 – 70°C). Pe de-o parte, preparatul trebuie să fie bine uscat, în caz contrar, germenii pot fi antrenați în mediul înconjurător prin aerosolii formați de către picăturile din frotiu. Pe de altă parte, preparatul nu trebuie supraîncălzit (Deliu, 2015).

3. Colorarea frotiurilor:

– frotiul uscat și fixat se așează pe suportul de sticlă deasupra cristalizorului;

– se aplică pe frotiu soluție violet de gențiana cu o pipetă și se lasă timp de 1 – 3 minute;

– se clătește cu apă de robinet deasupra cristalizorului;

– se acoperă cu soluție Lugol, cu rol de mordant timp de 2 – 4 minute;

– se clătește cu apă de robinet deasupra cristalizorului;

– se decoloreză cu picături din amestecul alcool: acetonă 3:1 timp pe lama înclinată timp de 5-8 secunde;

– se spală abundent cu apă de robinet deasupra cristalizorului;

– se recolorează frotiul cu soluție fuxnă bazică diluata (1/10) timp de un 1 minut;

– se spală cu apă de robinet;

– frotiul se usucă în suportul pentru la temperatura camerei;

– se examinează frotiul la microscopul optic (Deliu, 2015).

Interpretarea rezultatelor:

În urma colorării cu violet de gențiana, toate celulele bacteriene vor căpăta culoarea violet. Celulele Gram (+) vor rămâne colorate în violet după decolorarea cu amestecul alcool: acetonă, dar celulele Gram (-) vor deveni incolore. În final, după recolorarea cu fuxină, celulele Gram (+) vor rămâne colorate în violet, iar cele Gram (-), vor fi colorate în roșu. Așadar, în urma efectuării colorației Gram, celulele Gram (+) vor fi colorate în violet, pe când cele Gram (-) vor apărea colorate în roșu până la roz (Deliu, 2015).

În ceea ce privește celulele eucariote, acestea se comportă ca și bacteriile Gram (-), colorându-se în roșu, excepția fiind levurile, care se vor colora în violet, ca și bacteriile Gram (+) (Deliu, 2015).

Exemple de bacterii Gram (+) sunt: Staphylococcus sp., Streptococcus sp., Bacillus sp., Corynebacterium diphteriae, Clostridium sp., Micrococcus sp., iar ca bacterii Gram (-) se pot aminti: Salmonella sp., Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa., Legionella pneumophila, Klebsiella sp., Proteus sp., Helicobacter pilorii, Borrelia sp. (Deliu, 2015).

Pe lângă diferențirea bacteriilor în Gram (+), respectiv Gram (-), colorația Gram permite și diferențierea celulelor bacteriene după formă, în coci, respectiv bacili.

II.2.2.3. Studiul caracterelor biochimice

Studiul caracterelor biochimice reprezintă o etapă importantă pentru identificarea și clasificarea microorganismelor, urmărindu-se evidențierea particularităților de metabolism și echipamentului enzimatic al microorganismului. (http://www.scribd.com/doc/197034855/Teste-Biochimice-Si-API20E#scribd URL9)

Pentru studiul caracterelor biochimice ale microorganismelor se folosesc culturi pure bacteriene, medii de diagnostic diferențiat, citirea rezultatelor făcându-se prin comparație cu un martor.

Cele 63 de tulpini bacteriene izolate din probele de aer prelevate din încăperile vizatate au fost supuse următoarelor reacții biochimice:

– realizarea testului catalazei pentru diferențierea tulpinilor catalazo – pozitive de cele catalazo – negative;

– studiul metabolizării glucidelor, utilizând mediul TSI pentru determinarea capacității microorganismelor de a fermenta glucoza, lactoza și zaharoza;

– studiul metabolizării citratului, folosind mediul citrat Simmons pentru a diferenția tulpinile care au capacitatea de a utiliza citratul de cele care nu posedă această proprietate;

– testul oxidazei pentru a diferenția tulpinile oxidazo – pozitive de cele oxidazo – negative.

II.2.2.3.1. Determinarea activității catalazice a microoroganismelor

Enzimele cunoscute sub numele de catalaze sunt substanțe antioxidante, cu rol de biocatalizatori, care au proprietate de a descompune peroxidul de hidrogen în apă și hidrogen. (URL6)

Principiul metodei:

Acțiunea catalazei poate fi evidențiată direct, fie în culturi de microorganisme strict aerobe, fie în culturi de microorganisme facultativ aerobe, această enzimă având proprietatea de a descompune peroxidul de hidrogen (H2O2), cu eliberare de oxigen. Apa oxigenată este un produs final al metabolismului aerobic al carbohidraților si este toxică pentru bacterii (URL6, URL7). În cazul bacteriilor care conțin enzima catalază, în urma contactului lor cu apa oxigenată vor rezulta bule de gaz. (TL)

Materiale necesare:

– cultură pură bacteriană;

– anse de plastic sterile;

– lame de sticlă sterile;

– soluție dezinfectantă de cloramină

Tehnica de lucru:

– pe o lama de sticlă sterilă se pun 2-3 picături de peroxide de hidrogen (apă oxigenată);

– cu ajutorul unei anse de plastic sterile se recoltează celule bacteriene din cultura pură;

– se pun în contact celulele bacteriene din bucla ansei cu picătura de apă oxigenată de pe lama de sticlă și se urmărește degajarea de bule de gaz;

– ansa de plastic folosită se pune în soluție dezinfectantă.

Interpretarea rezultatelor:

Reacția pozitivă este indicată de degajarea bulelor de gaz (efervescență), ceea ce demonstrează prezența catalazei în echipamentul enzimatic al celulelor testate (Fig. II. 4). Acestea sunt, deci, catalazo – pozitive. (TL) Lipsa efervescenței indică o reacție negativă, iar microorganismele în cauză sunt catalazo – negative.

Genuri bacteriene catalazo – pozitive sunt: Staphylococcus sp., Micrococcus sp., Bacillus sp., Aeromonas sp., Proteus sp. și Escherichia coli. Bacteriile aparținând genului Streptococcus sp. sunt catalazo – negative.

II.2.2.3.2. Studiul metabolizării glucidelor

Pentru evidențierea anumitor particularități metabolice ale unor specii date de microorganisme, se folosesc mediile diferențiale care, prin compoziția lor sunt utilizate pentru diagnosticul diferențial. În ceea ce privește metabolismul glucidelor, se pot utiliza medii diferențiale simple (pentru evidențierea unui singur caracter), cum este mediul AABTL (Bromothymol – blue Lactose Agar), utilizat pentru evidențierea bacteriilor care fermentează lactoza și medii diferențiale politrope (pentru evidențierea mai multor caractere), cum este mediul TSI (triple sugat iron; agar tripluzaharat sulfat feros), utilizat pentru evidențierea bacteriilor care fermentează lactoza și zaharoza, respectiv glucoza, dar și a acelora producătoare de hidrogen sulfurat (H2S).

Principiul metodei:

Mediul diferențial multitest TSI se dispune în tuburi, conținând o porțiune verticală de 1 – 2 cm, pentru fermentarea glucozei și o porțiune înclinată pentru fermentarea lactozei și/sau zaharozei. Mediul conține lactoză, zaharoză și o cantitate mică de glucoză, sulfat feros și indicatorul de pH roșu fenol. Datorită compoziției sale, mediul permite recunoașterea fermentării glucidelor prin virarea culorii de la roșu cărămiziu (culoarea inițială a mediului) spre galben în porțiunea corespunzătoare glucozei, respectiv lactozei și/sau zaharozei. De asemenea, mediul permite și evidențierea producerii de gaze, în special H2S care se recunoaște prin colorarea în negru a mediului. (TL)

Materiale necesare:

– cultură bacteriană pură;

– tuburi cu geloză TSI;

– ansă fir;

– bec de gaz;

– termostat.

Tehnica de lucru:

– ansa fir se sterilizează prin încălzire la roșu, urmată de flambarea portansei în porțiunea fierbinte a flăcării becului de gaz;

– se recoltează celule bacteriene din cultura pură;

– se însămânțează celulele bacteriene în tubul cu mediu TSI prin înțepare în coloana dreaptă, urmată de trasarea unui striu în zig – zag pe planul înclinat;

– se sterilizează ansa prin uscare în porțiunea rece a flăcării becului de gaz, urmată de încălzirea la roșu a ansei și flambarea portansei în porțiunea fierbinte a flăcării;

– după însămânțare, tuburile cu geloză TSI se incubează la 37°C pentru 24 h.

Interpretarea rezultatelor:

Virarea culorii de la roșu – cărămiziu la galben numai în porțiunea verticală a tubului, indică o reacție pozitivă pentru fermentarea glucozei (putându-se observa bule, dacă fermentarea a avut loc cu producere de gaz), deci bacteriile testate sunt glucozo – pozitive, lactozo și zaharozo – negative. În cazul în care virarea culorii se produce numai în porțiunea înclinată, reacția este pozitivă pentru fermentarea lactozei și/sau zaharozei, iar bacteriile testate sunt glucozo – negative, lactozo și/sau zaharozo – pozitive. Dacă se produce virarea culorii atât în porțiunea dreaptă, cât și în cea înclinată, celulele testate sunt glucozo – pozitive, lactozo și/sau zaharozo – pozitive, iar dacă virarea culorii nu se produce în niciuna din cele două porțiuni, reacția este negativă atât pentru fermentarea glucozei, cât și pentru fermentarea lactozei și/sau zaharozei, deci bacteriile supuse testului sunt glucozo, lactozo și zaharozo – negative (Fig. II. 5.)

În ceea ce privește producerea de H2S, reacția este considerată pozitivă dacă se produce înnegrirea zonei dintre porțiunile verticală și înclinată.

Bacteriile strict glucozo – pozitive pot aparține genului Pseudomonas sp., iar bacteriile strict lactozo – pozitive pot face parte din genul Bacillus sp. Genul Micrococcus sp. cuprinde bacterii care nu fermentează nici glucoza, nici lactoza, în timp ce Streptococcus sp., Staphylococcus aureus și Escherichia coli fermentează atât glucoza, cât și lactoza. Producerea de H2S indică prezența Salmonella sp., Proteus sp.

II.2.2.3.3. Evidențierea metabolizări citratului de sodiu

În scopul evidențierii metabolizării citratului de sodiu ca unică sursă de carbon, se folosește mediul diferențial simplu citrat Simmons. S. A. Koser a fost cel care a pus bazele acestei metode de diferențiere a coliformilor, cum este Enterobacter aerogenes, prezent în mod normal în sol, ape, aer, capabil să metabolizeze citratul, de Escherichia coli, indiciu al contaminării fecale și care nu poate utiliza citratul ca sursă de carbon. Mai târziu, Simmons a îmbunătățit formula mediului adăugând indicatorul de pH albastru brom – timol (BTB) (URL8).

Principiul metodei:

Mediul diferențial citrat Simmons se dispune în tuburi în coloană înclinată, având culoarea verde. Utilizarea citratului ca sursă de carbon de către bacterii are ca rezultat formarea de carbonați și bicarbonați alcalini, ceea ce duce la creșterea pH-ului. Datorită acidului citric și al indicatorului de pH din compoziția mediului, reacția pozitivă este vizibilă prin schimbarea culorii mediului de la verde la albastru (URL8).

Materiale necesare:

– cultură bacteriană pură;

– eprubete cu mediu citrat Simmons;

– ansă bacteriologică cu buclă;

– bec de gaz;

– termostat.

Tehnica de lucru:

– se sterilizează ansa prin încălzire la roșu, urmată de flambarea portansei în porțiunea fierbinte a flăcării becului de gaz;

– se recoltează celule din cultura bacteriană;

– se însămânțează celulele bacteriene în tubul cu citrat Simmons, prin trasarea unui striu în zig – zag pe suprafața mediului;

– se sterilizează ansa prin uscare în porțiunea rece a flăcării becului de gaz, urmată de încălzirea la roșu a ansei și flambarea portansei în porțiunea fierbinte a flăcării;

– după însămânțare, eprubetele cu citrat Simmons se termostatează la 37°C, iar rezultatele se citesc după 48 de ore, cu o citire intermediară la 24 de ore.

Interpretarea rezultatelor

Virarea culorii de la verde la albastru după 24 de ore este dovada metabolizării rapide a citratului, schimbarea culorii după 48 de ore indicând metabolizarea lentă a citratului. Dacă după 48 de ore nu se produce virarea culorii de la verde la albastru, reacția este negativă, iat tulpina bacteriană testată nu folosește citratul ca unică sursă de carbon (Fig. II. 6.)

Genuri bacteriene citrat – pozitive sunt: Bacillus sp., Staphylococcus sp., Streptococcus sp., în timp ce o reacție negativă poate indica prezența Micrococcus sp., Proteus sp., Escherichia coli.

II.2.2.3.4. Reacția oxidazei

Principiul metodei:

Testul oxidazei permite diferențierea bacteriilor care prezintă enzima citocrom – oxidază de cele care nu posedă o astfel de enzimă în echipamentul lor enzimatic. Această enzimă participă la transferul de electroni de la o moleculă donatoare la oxigen. Benzile pentru testul oxidazei conțin un compus care, în prezența oxidazei determină colorarea acestora în albastru sau mov închis în aproximativ 10 – 30 de secunde (URL 10). Ca urmare, bacteriile care posedă enzima oxidază vor determina colorarea benzilor, în timp ce prin contactul cu bacterii care nu au această enzimă, benzile vor rămâne albe.

Materiale necesare:

– cultură pură bacteriană;

– benzi pentru testul oxidazei;

– apă distilată sterilă;

– ansă de plastic;

– pipetă Pasteur de plastic;

– sticlă de ceas;

– pensetă metalică;

– bec de gaz;

– soluție dezinfectantă de cloramină.

Tehnica de lucru:

– se sterilizează penseta în flacăra becului de gaz;

– se ia cu penseta o bandă pentru testul oxidazei și se așează pe sticla de ceas;

– se pipetează 2 – 3 picături de apă distilată sterilă peste bandă;

– se deschide eprubeta și se flambează gura acesteia;

-se cu ansa ed plastic se raclează o cantitate din cultura bacteriană, se flambează din nou gura eprubetei și se închide;

– celulele bacteriene se dispun pe bandă și se așteaptă 10 – 30 de secunde;

– ansa de plastic folosită se pune în soluție de cloramină.

Interpretarea rezultatelor:

Colorarea benzii în albastru sau mov închis demonstrează o reacție pozitivă, deci tulpina testată are inclusă enzima oxidază în echipamentul său enzimatic. Dacă banda rămâne necolorată, tulpina testată este oxidazo – negativă (Fig. II. 7.)

Genuri bacteriene oxidazo – pozitive: Pseudomonas sp., Aeromonas sp., Micrococcus sp., Bacillus sp.

Genuri bacteriene oxidazo – negative: Staphylococcus sp., Streptococcus sp., Proteus sp., Escherichia coli.

(http://www.microbelibrary.org/library/laboratory+test/3287-oxidase-test

II.3. REZULTATE ȘI DISCUȚII

II.3.1. DETERMINAREA NTG ȘI NG

Rezultatele obținute în urma aplicării formulei lui Omelianski în scopul aprecierii cantitative a aeromicrobiotei au relevat faptul că valoarea limită recomandată pentru NTG nu a fost depășită în cazul probelor prelevate din cele șase săli.

Valorile obținute pentru NTG și NG pentru probele variantei 1 de lucru sunt prezentate în Fig. II. 8.

În ceea ce privește NTG, rezultatele obținute în urma prelucrării probelor prelevate în luna noiembrie arată că cea mai mică încărcătură microbiană a aerului s-a înregistrat în secretariatul S102, acesta fiind urmat de amfiteatrul S103 și de laboratorul S128. Volumul sălii și spațiul în m3 alocat per persoană ar putea fi o explicație pentru aceste valori.

În ceea ce privește NG, valorile obținute în urma prelucrării probelor reflectă o încărcătură microbiană (microbiotă nazo-faringiană și bucală) care depășește ușor limita maximă admisă de literatura de specialitate în cazul laboratorului S128, valoare explicabilă prin faptul că luna noiembrie este o lună de epidemii de infecții respiratorii. În cazul amfiteatrului S103, valoarea maximă nu este depășită, iar pentru secretariatul S102, valoarea obținută a fost de 0 UFC/m3 aer.

Valorile obținute pentru probele prelevate în luna mai (Fig. II. 9.) sunt mai mari comparativ cu cele obținute pentru probele prelevate în luna noiembrie, ceea ce demonstrează corelația dintre încărcătura microbiană a aerului și creșterea temperaturii.

Pentru această variantă de lucru, cea mai mare valoare a NTG s-a înregistrat în cazul amfiteatrului S109, cauzele probabile fiind creșterea temperaturii aerului și frecventarea acestei săli de un număr mare de persoane. În ordine descrescătoare a valorilor obținute urmează laboratorul S106 și de sala de curs S101.

În niciunul din cazuri, valoarea limită nu a fost depășită, deci rezultatele obținute nu reflectă un risc pentru sănătatea umană.

III.3.2. OBȚINEREA CULTURILOR PURE

După prelevarea probelor de aer au fost selectate un număr de colonii pentru fiecare din cele șase săli (fig), și au fost trecute pe pe geloză înclinată obținându-se un total de 63 tulpini bacteriene care au fost păstrate la frigider, pentru studiile ulterioare.

III.3.3. STUDIUL CARACTERELOR COLONIALE ȘI DE CULTURĂ

În ceea ce privește aspectele coloniale, se pot aprecia următoarele:

– toate tulpinile bacteriene au prezentat colonii și culturi crescute la suprafața mediului;

– aspectul creșterii culturilor a fost identic pentru toate tulpinile supuse analizei, și anume sub formă de colonii confluente, nefiind prezente colonii izolate;

– gradul de creștere al culturilor a fost moderat pentru majoritatea tulpinilor bacteriene, în timp ce procentele de tulpini care au format culturi cu grade de creștere sărac, respectiv abundent sunt aproape egale (Fig. II. 10.)

– coloniile și a culturile bacteriene au prezentat culoarea alb și galben, fiind prezente foarte puține colonii având culoarea portocaliu (Fig. II. 11.)

– forma coloniilor a fost circulară pentru majoritatea tulpinilor bacteriene, dar au fost descrise și tulpini care au prezentat colonii de formă neregulată și chiar colonii punctiforme (fig)

– majoritatea tulpinilor analizate au prezentat colonii mici, fiind prezent un număr însemnat de tulpini care au format colonii mici și puține tulpini care au prezentat colonii de mărime medie fig

– coloniile formate de un procent mare de tulpini analizate au prezentat margine întreagă, fiind descrise și colonii având margine neregulată fig

– mai mult de jumătate din tulpinile analizate au format colonii cu profil ușor convex, iar restul tulpinilor bacteriene au prezentat colonii cu profil plat. fig

III.3.4. STUDIUL CARACTERELOR MORFOLOGICE

În urma vizualizării la microscopul optic a frotiurilor colorate utilizând tehnica Gram, s-a constat prezența exclusivă de coci Gram – pozitivi (Fig. II. 15.), nefiind identificate nici bacterii de formă bacilară, nici bacterii Gram – negative.

Cocii Gram – pozitivi pot aparține genurilor Staphylococcus sp., Streptococcus sp., Micrococcus sp., exclusă fiind prezența bacteriilor din genurile Bacillus sp., Pseudomonas sp., Legionella pneumophila. De asemenea, Absența bacteriilor Gram – negative exclude prezența Proteus sp. în probele analizate, iar faptul că nu au fost observate bacterii de formă bacilară, exclude prezența Escherichia coli.

III.3.5. STUDIUL CARACTERELOR BIOCHIMICE

III.3.5.1. Determinarea activității catalazice a microorganismelor

În urma efectuării reacției pentru determinarea prezenței bacteriiloor care conțin enzima catalază, se poate aprecia faptul că tulpinile analizate au prezentat o mare uniformitate, fiind evidențiate doar 2 tulpini catalazo – negative, în probele prelevate într-una din săli, restul tulpinilor fiind catalazo – pozitive. fig

Tulpinile catalazo – negative pot aparține genului Staphylococcus sp., Micrococcus sp., având în vedere faptul că, în urma efectuării colorației Gram au fost observate numai bacterii sub formă de coc, în timp ce tulpinile catalazo – negative pot fi o dovadă a prezenței în probele de aer a bacteriilor din genul Streptococcus sp.

III.3.5.1. Studiul metabolizării citratului

În ceea ce privește capacitatea de metabolizare a citratului, din cele 63 de tulpini analizate, 55 de tulpini citrat – pozitive, dintre care 39 au metabolizat rapid citratul (după 24 de ore de termostatare la 37°C) și 16 tulpini au metabolizat lent citratul (după 48 de ore de termostatare la 37°C) și 8 tulpini citrat – negative. Rezultatele obținute pentru fiecare sală din care s-au prelevat probe de aer în parte sunt prezentate în figura

Tulpinile bacteriene citrat – pozitive sunt pot aparține genurilor Staphylococcus sp., Streptococcus sp., în timp ce o reacție negativă poate indica prezența Micrococcus sp. Tot catalazo – negative sunt și Escherichia coli și Proteus sp., însă prezența lor se exclude deoarece colorația Gram nu a evidențiat bacterii bacilare (Escherichia coli) și bacterii Gram – negative (Proteus sp.)

III.3.5.2. Studiul metabolizătii glucidelor

Utilizând tuburi cu mediul TSI (însămânțate și incubate 24 de ore la 37° C) pentru studiul capacitații tulpinilor analizate de a metaboliza glucoza, lactoza și zaharoza, au fost obținute următoarele rezultate:

– cele mai multe tulpni analizate au fost glucozo – pozitive, lactozo și zaharozo – negative (44);

– au fost prezente 11 tulpini glucozo – pozitive, lactozo și/sau zaharozo – pozitive;

– 6 dintre tulpinile analizate au fost glucozo – negative, lactozo și zaharozo -negative;

– doar 2 tulpini au fost glucozo – negative, lactozo și zaharozo – pozitive ;

– nu au fost prezente tulpini producătoare de gaze (caracteristică pentru Proteus sp.) și H2S (caracteristică pentru Salmonella sp.)

Rezultatele pentru fiecare sală pentru care s-a relizat studiul aeromicrobiotei în ceea ce privește capacitatea tulpinilor analizate de a fermenta glucidele sunt prezentate în figura.

Rezultatele obținute pot indica prezența Streptococcus sp., Staphylococcus sp., în timp ce tulpinile care au dat rezultat negativ atât pentru fermentarea glucozei, cât și pentru fermentarea lactozei pot aparține genului Micrococcus sp. Escherichia coli fermentează atât glucoza, cât și lactoza, însă prezența acesteia este exclusă datorită rezultatelor obținute pentru reacțiile anterioare.

III.3.5.3. Reacția oxidazei

Din cele 63 de tulpini izolate, pentru 42 de tulpini s-a realizat reacția oxidazei, fiind selectate câte 7 tulpini pentru fiecare din cele 6 săli din care au fost prelevate probe de aer. Astfel, cele mai multe tulpini au dat o reacție oxidazo – pozitivă, dar au fost prezente și tulpini oxidazo – negative, rezultatele fiind prezentate în figura

Ca și în cazul reacțiilor anterioare, rezultatele obținute pentru reacția catalazei indică prezența în probele de aer a Staphylococcus sp., Streptococcus sp. (bacterii oxidazo – pozitive) și Micrococcus sp.

CONCLUZII

http://atlas.microumftgm.ro/bacteriologie/bactgen/cbio.php URL 5

URL6 https://www.bd.com/resource.aspx?IDX=19009

URL 7

http://www.bioterapi.ro/compusi_bio/index_compusi_bio_enzime_cateva_enzime_mai_importante.html

http://www.microbelibrary.org/component/resource/laboratory-test/3203-citrate-test-protocol url 8

http://www.austincc.edu/microbugz/triple_sugar_iron_agar.php