. Stresul Oxidativ In Psoriazis

INTRODUCERE

O ipoteză controversată a ultimelor decenii a fost legată de implicarea radicalilor liberi (RL) în medicină. Studiile efectuate, care au necesitat o strânsă colaborare interdisciplinară, au adus, în cele din urmă, câteva certitudini. Radicalii liberi există în organismul uman ca intermediari în procese de oxido-reducere, având roluri multiple, demonstrate deja: funcționale, de comunicare intercelulară, distructive, citolitice.

Se încearcă obținerea unei imagini cât mai clare în ceea ce privește rolul exercitat de RL în organism, atât în condiții normale, homeostazice, cât și în condiții patologice. Există o serie de date interesante privitoare la implicarea lor în deteriorarea membranelor celulare, creșterea permeabilității celulare, cardiopatia ischemică, ciroză, cancerogeneză, procesele de îmbătrânire, etc.

Practic, în majoritatea domeniilor și specialităților medicale, studiul radicalilor liberi ridică probleme și începe să explice o serie de procese care erau neelucidate. Se pare, totuși, că medicina se află încă la început de drum. Biologicul, deși sperie prin complexitate, inspiră și uimește prin geniul arhitectural al structurilor, prin menținerea echilibrului vital. Lucrarea de față se dorește un mic pas, revelator, pentru o lume nu doar aridă, ce parcă se încăpățânează să-și dezlege misterul.

Psoriazisul este o boală dermatologică, care în ciuda eforturilor depuse, nu a putut fi pe deplin înțeleasă și tratată. Nu se cunoaște mecanismul etiopatogenic, fiziopatologia acestei boli. Tratamentul actual ameliorează simptomatologia, dar nu poate preveni și trata definitiv.

Problematica RL a deschis o nouă perspectivă în activitatea de cercetare a psoriazisului. În această lucrare vor fi sintetizate câteva din datele rezultate ale studiilor efectuate pe plan mondial în ultimii ani, cu precădere anii 1997-1998, referitoare la implicarea RL în patogenia psoriazisului, la care vom adăuga concluziile unui studiu de laborator efectuat pe un lot de 10 bolnavi psoriazici, la care am determinat: concentrația glutationului (GSH) sangvin, concentrația sangvină a malon dialdehidei (MDA) și activitatea enzimatică a superoxid dismutazei eritrocitare (SOD) și a ceruloplasminei.

CAPITOLUL I

PARTEA GENERALĂ

RADICALII LIBERI ȘI PSORIAZISUL

A. RADICALII LIBERI (RL)

1. Definiție, rol, structură, proprietăți.

Radicalii liberi pot fi definiți ca molecule sau fragmente moleculare ce conțin un electron impar. Se știe că moleculele organice posedă un număr par de electroni, fiecare orbital al moleculei fiind ocupat de doi electroni cu momentul lor magnetic și cu spinii opuși. În acest sens, RL au următoarele proprietăți:

a) conțin unul sau mai mulți electroni impari;

b) pot fi neutri sau încărcați electric pozitiv () sau negativ (-);

c) posedă o foarte mare reactivitate chimică, dependentă de concentrație și de temperatură. Viteza de reacție este atât de mare, încât, în multe cazuri, constanta de viteză atinge limita existentă în procesele de difuzie, 109 M-1 x s-1. În general, RL cu o structură simplă (CH3, C6H5) au o viață extrem de scurtă, pe când cei cu o structură mai complexă (trifenilmetil) au o stabilitate ceva mai mare;

d) din punct de vedere al încărcării electrice, cităm câteva exemple:

1 Clorpromazina (CPZ) OH –-> CPZ OH-

Astfel, observăm formarea unui radical încărcat electric pozitiv și o grupare oxidril.

2 Oxigenul poate capta în anumite condiții un electron formându-se radicalul anionic superoxid, O2 -:

O2 e- –-> O2 –

3 Tetraclorura de carbon poate capta un electron rezultând radicalul triclormetil, CCl3:

CCl4 e – –-> CCl3 Cl-

Prin folosirea unor condiții speciale (temperatură joasă, medii vâscoase, condiții de cristalizare), RL pot fi izolați sau măsurați. Pentru a sugera dificultățile în studierea RL prezentăm comparativ marea reactivitate reprezentată prin constantele de viteză:

Tabelul nr.1. Exemple de reactivitate a RL

Mult timp existența radicalilor liberi nu a fost acceptată sau rămăseseră doar la statutul de curiozitate chimică. Pasul hotărâtor în înțelegerea și acceptarea acestor interesante entități biochimice l-a avut binecunoscutul biochimist Michaelis care în 1939 a demonstrat existența RL ca intermediari în reacțiile enzimatice, de oxido-reducere.

Deși unele aspecte s-au mai clarificat, unele ipoteze devenind certitudini, RL stârnesc încă vii controverse. Se admite existența lor variabilă, de la miimi de secundă la minute, ca intermediari în reacțiile de oxido-reducere.

Importanța RL poate fi înțeleasă numai prin cunoașterea rolului lor. Ori, ținând seama de necesitatea menținerii unei stabilități chimice relative, RL apar în anumite reacții de oxido-reducere în care au loc modificări structurale mari, de pe urma cărora substanța respectivă își schimbă adesea funcția biologică (devine mai hidrosolubilă sau intervine în alt lanț de reacții metabolice). Prin formarea RL, intermediari, au loc modificări structurale rapide, schimbări funcționale, permițând implicarea în reacții multiple. Pe cale evolutivă, natura a selecționat și înglobat în componența organismelor, reacții generatoare de RL, cu roluri multiple: funcționale, de comunicare intercelulară sau distructive, citolitice. Din multitudinea reacțiilor în care se formează RL s-au evidențiat următoarele căi:

A. Homoliza substanțelor de substrat:

a) termică

A-B –-> A B

b) homoliza cuplată – la concentrații mici (10-4 – 10-6 M), peroxizii (ROOH), în prezența acizilor sau a compușilor cu duble legături se descompun eliberând radicalii peroxi, ROO:

-HCCH-R ROOH –-> -CH-CH2-R ROO

Un astfel de mecanism funcționează în biosinteza PG.

c) transferul de electroni: în reacțiile redox sunt cele mai răspândite surse de formare ale RL, în special ai oxigenului.

În acest sens, cel mai cunoscut este ciclul de reacții Haber-Weiss:

H2O2 Fe2 –-> OH OH – Fe3

H2O2 Fe3 –-> H HO2 Fe2

B. Fotoliza și radioliza

Prin absorbția luminii sau a radiațiilor ionizante se produc mari cantități de RL. Acțiunea acestor agenți depinde de cantitatea (doza) și timpul expunerii. Dacă acțiunea luminii se produce în special asupra unor substanțe cu acțiune favorabilă absorbției fotonilor, cum sunt fotosensibilizatorii, radiațiile ionizante pot acționa direct asupra oricăror molecule din structura organismelor, producând RL prin deteriorarea lor.

Radiațiile ionizante produc RL și după încetarea expunerii prin efect indirect, datorită radiolizei apei. Cum apa formează peste 70% din compoziția viețuitoarelor, importanța acestui fenomen este mare. Radioliza apei se poate rezuma prin ecuația de mai jos:

H2O –-> (H2O, e- ) H3O , H, OH, e-aq, H2O2, H2, unde

e-aq reprezintă electronul hidratat

C. Reacții enzimatice

În general, reacțiile enzimatice redox implică mecanisme cu transfer mixt de 1-2 electroni. RL apar din moleculele substratului sub forma:

acceptor de electroni, AH2 AH –-> A (oxidare)

donori de electroni, A AH –->AH2 (reducere)

La echilibru, viteza producerii RL va egala pe cea a inhibării formării lor prin disproporționare. Deci la echilibru:

2AH –-> A AH2

Prin combinarea studiilor de spectofotometrie cu cele prin rezonanța electronică de spin (RES) se poate diferenția legarea RL de enzimă, perioadă ce durează aproximativ 10-10s.

D. Metabolizarea unor compuși organici

Prin metabolizare, o serie de hidrocarburi cancerigene, pătrunse în organism ca poluanți, produc RL. Acestea pot fi: benzopiren, benzantracen, metilcolantren, nitrochinoline, etc.

E. Radicali liberi existenți în natură

Azotul și mai ales oxigenul formează destul de ușor RL specifici, care la rândul lor generează alți RL prin reacții cu alți compuși. NO și NO2 pot fi socotiți RL liberi stabili, în concentrații relativ mici (0,2ppm NO2 în smog).

Oxigenul formează RL specifici într-o gamă largă de medii așa cum vom vedea mai departe.

2. Tipuri de RL.

Dintre tipurile de RL amintim: radicalii liberi de O2 (care vor fi prezentați pe larg la subpunctul 3), flavin semichinonele, chinonele și semichinonele, compușii aromatici, acizii nucleici, radicalul thiil, monoxidul de azot (NO).

a) Flavin semichinonele (FlSQ)

Flavin semichinonele reprezintă o grupă de substanțe din amrea clasă a semichinonelor (SQ), RL intermediari între formele oxidate și reduse ale chinonelor. Procesele de oxido-reducere în organism sunt principalele furnizoare directe de energie pentru procesele vitale, în aceste reacții oxidantul acceptă electroni fiind redus iar reducătorul îi donează oxidându-se:

Figura nr.2 Schema transportului de e- într-o reacție obișnuită donor-acceptor.

Aceste reacții redox sunt catalizate enzimatic. Flavin enzimele sunt transportori de e- în cursul lanțului respirator.

Figura nr.3 Flavin enzime, flavin metalo-enzime (exemple)

Activitatea flavinenzimelor (FE) constă în transportul unuia sau a mai multor electroni în cadrul unui ciclu de reacții, cuprinzând faza intermediară de radical semichinonic.

FLAVINCHINONĂ SEMICHINONĂ FLAVINE REDUSE

280, 370, 450nm max 280, 370, 490, 280,370nm

590nm

Figura nr.4 Formulele RL semichinonici cu maxime de absorbție caracteristice

În unele situații cele trei faze pot fi suficient de stabile pentu a fi caracterizate prin semnale RES (pentru SQ) și prin spectre de absorbție separate. Viața radicalilor SQ poate fi prelungită prin interacțiune cu unele grupări ale enzimei, ale substratului sau un ion metalic. RLSQ pot produce reacții de disproporționare de tipul:

Flox H Flred H3 2FlH2

b) Chinonele și semichinonele

Chinonele sunt foarte răspândite în natură, în diferite stări redox, participând în procesele de transport electronic, cum sunt respirația mitocondrială și fotosinteza. Au mai fost detectate chinone printre poluanții atmosferici, fumul de țiagară și medicamente.

Semichinonele se caracterizează printr-o relativă stabilitate față de oxigen, datorită conjugării electronice între diferite stări limită posibile. Capul de serie al chinonelor este constituit de perechea o-benzochinonă și hidrochinonă.

Figura nr.5 Perechea benzo și hidrochinonă

Medicamentele citostatice antrachinonice (tip adriamicină) acționează in vivo prin producerea de SQ și O2 – urmată de legarea de ADN. Aceste medicamente fac parte din clasa semichinonelor.

Figura nr.6 RL obținuți din reacțiile fenildiaminei: p-fenildiamina sub acțiunea apei de brom sau a ceruloplasminei (A), formula posibilă a RL rezultat (B).

c) Compușii aromatici

O serie de compuși aromatici cum sunt: acidul p-amino-benzoic, anilină și derivați (alchilamino-anilină), aminopirină, amine terțiare aromatice, pot ajunge în organism drept componente ale poluării chimice, vor fi metabolizate fie pe calea citocromului P450 din microzomii hepatici cât și prin peroxidare.

d) Radicali proveniți de la acizii nucleici (AN)

Modificările macromoleculelor de AN rezultă în urma absorbției energiei radiante în fracțiuni de secundă, rezultând excitări și ionizări. Dacă moleculele excitate pierd energia absorbită tot în fracțiuni de secundă, ionizările sau scindările produc RL cu viață ceva mai lungă. RL ai AN rezultă deci prin impactul energiei absorbite (prin expunerea la radiații ionizante sau UV) și care determină ruperea unor legături chimice, deteriorări ale unor componente.

Radicalul OH, provenit de la radioliza apei, care are o reactivitate foarte mare, atacă molecula de ADN, organismul neposedând sisteme de protecție biochimică. Studiile RES au arătat că ADN poate fi protejat, cel puțin in vitro, prin prezența unor compuși tiolici (cisteamina), pentru care speciile reactive rezultate din radioliza apei au mai multă afinitate. Studiile efectuate stau la baza concepțiilor privind radioprotecția și radiosensibilitatea chimică.

e) Radicalul thiil (RS)

Existența acestui radical a fost formulată la început teoretic, mult timp acesta nefiind identificat nici spectofotometric și nici ca semnal RES.

Prin studii RES s-a observat că natura compușilor tiolici simpli (cisteamina, cisteina, glutatia lor variabilă, de la miimi de secundă la minute, ca intermediari în reacțiile de oxido-reducere.

Importanța RL poate fi înțeleasă numai prin cunoașterea rolului lor. Ori, ținând seama de necesitatea menținerii unei stabilități chimice relative, RL apar în anumite reacții de oxido-reducere în care au loc modificări structurale mari, de pe urma cărora substanța respectivă își schimbă adesea funcția biologică (devine mai hidrosolubilă sau intervine în alt lanț de reacții metabolice). Prin formarea RL, intermediari, au loc modificări structurale rapide, schimbări funcționale, permițând implicarea în reacții multiple. Pe cale evolutivă, natura a selecționat și înglobat în componența organismelor, reacții generatoare de RL, cu roluri multiple: funcționale, de comunicare intercelulară sau distructive, citolitice. Din multitudinea reacțiilor în care se formează RL s-au evidențiat următoarele căi:

A. Homoliza substanțelor de substrat:

a) termică

A-B –-> A B

b) homoliza cuplată – la concentrații mici (10-4 – 10-6 M), peroxizii (ROOH), în prezența acizilor sau a compușilor cu duble legături se descompun eliberând radicalii peroxi, ROO:

-HCCH-R ROOH –-> -CH-CH2-R ROO

Un astfel de mecanism funcționează în biosinteza PG.

c) transferul de electroni: în reacțiile redox sunt cele mai răspândite surse de formare ale RL, în special ai oxigenului.

În acest sens, cel mai cunoscut este ciclul de reacții Haber-Weiss:

H2O2 Fe2 –-> OH OH – Fe3

H2O2 Fe3 –-> H HO2 Fe2

B. Fotoliza și radioliza

Prin absorbția luminii sau a radiațiilor ionizante se produc mari cantități de RL. Acțiunea acestor agenți depinde de cantitatea (doza) și timpul expunerii. Dacă acțiunea luminii se produce în special asupra unor substanțe cu acțiune favorabilă absorbției fotonilor, cum sunt fotosensibilizatorii, radiațiile ionizante pot acționa direct asupra oricăror molecule din structura organismelor, producând RL prin deteriorarea lor.

Radiațiile ionizante produc RL și după încetarea expunerii prin efect indirect, datorită radiolizei apei. Cum apa formează peste 70% din compoziția viețuitoarelor, importanța acestui fenomen este mare. Radioliza apei se poate rezuma prin ecuația de mai jos:

H2O –-> (H2O, e- ) H3O , H, OH, e-aq, H2O2, H2, unde

e-aq reprezintă electronul hidratat

C. Reacții enzimatice

În general, reacțiile enzimatice redox implică mecanisme cu transfer mixt de 1-2 electroni. RL apar din moleculele substratului sub forma:

acceptor de electroni, AH2 AH –-> A (oxidare)

donori de electroni, A AH –->AH2 (reducere)

La echilibru, viteza producerii RL va egala pe cea a inhibării formării lor prin disproporționare. Deci la echilibru:

2AH –-> A AH2

Prin combinarea studiilor de spectofotometrie cu cele prin rezonanța electronică de spin (RES) se poate diferenția legarea RL de enzimă, perioadă ce durează aproximativ 10-10s.

D. Metabolizarea unor compuși organici

Prin metabolizare, o serie de hidrocarburi cancerigene, pătrunse în organism ca poluanți, produc RL. Acestea pot fi: benzopiren, benzantracen, metilcolantren, nitrochinoline, etc.

E. Radicali liberi existenți în natură

Azotul și mai ales oxigenul formează destul de ușor RL specifici, care la rândul lor generează alți RL prin reacții cu alți compuși. NO și NO2 pot fi socotiți RL liberi stabili, în concentrații relativ mici (0,2ppm NO2 în smog).

Oxigenul formează RL specifici într-o gamă largă de medii așa cum vom vedea mai departe.

2. Tipuri de RL.

Dintre tipurile de RL amintim: radicalii liberi de O2 (care vor fi prezentați pe larg la subpunctul 3), flavin semichinonele, chinonele și semichinonele, compușii aromatici, acizii nucleici, radicalul thiil, monoxidul de azot (NO).

a) Flavin semichinonele (FlSQ)

Flavin semichinonele reprezintă o grupă de substanțe din amrea clasă a semichinonelor (SQ), RL intermediari între formele oxidate și reduse ale chinonelor. Procesele de oxido-reducere în organism sunt principalele furnizoare directe de energie pentru procesele vitale, în aceste reacții oxidantul acceptă electroni fiind redus iar reducătorul îi donează oxidându-se:

Figura nr.2 Schema transportului de e- într-o reacție obișnuită donor-acceptor.

Aceste reacții redox sunt catalizate enzimatic. Flavin enzimele sunt transportori de e- în cursul lanțului respirator.

Figura nr.3 Flavin enzime, flavin metalo-enzime (exemple)

Activitatea flavinenzimelor (FE) constă în transportul unuia sau a mai multor electroni în cadrul unui ciclu de reacții, cuprinzând faza intermediară de radical semichinonic.

FLAVINCHINONĂ SEMICHINONĂ FLAVINE REDUSE

280, 370, 450nm max 280, 370, 490, 280,370nm

590nm

Figura nr.4 Formulele RL semichinonici cu maxime de absorbție caracteristice

În unele situații cele trei faze pot fi suficient de stabile pentu a fi caracterizate prin semnale RES (pentru SQ) și prin spectre de absorbție separate. Viața radicalilor SQ poate fi prelungită prin interacțiune cu unele grupări ale enzimei, ale substratului sau un ion metalic. RLSQ pot produce reacții de disproporționare de tipul:

Flox H Flred H3 2FlH2

b) Chinonele și semichinonele

Chinonele sunt foarte răspândite în natură, în diferite stări redox, participând în procesele de transport electronic, cum sunt respirația mitocondrială și fotosinteza. Au mai fost detectate chinone printre poluanții atmosferici, fumul de țiagară și medicamente.

Semichinonele se caracterizează printr-o relativă stabilitate față de oxigen, datorită conjugării electronice între diferite stări limită posibile. Capul de serie al chinonelor este constituit de perechea o-benzochinonă și hidrochinonă.

Figura nr.5 Perechea benzo și hidrochinonă

Medicamentele citostatice antrachinonice (tip adriamicină) acționează in vivo prin producerea de SQ și O2 – urmată de legarea de ADN. Aceste medicamente fac parte din clasa semichinonelor.

Figura nr.6 RL obținuți din reacțiile fenildiaminei: p-fenildiamina sub acțiunea apei de brom sau a ceruloplasminei (A), formula posibilă a RL rezultat (B).

c) Compușii aromatici

O serie de compuși aromatici cum sunt: acidul p-amino-benzoic, anilină și derivați (alchilamino-anilină), aminopirină, amine terțiare aromatice, pot ajunge în organism drept componente ale poluării chimice, vor fi metabolizate fie pe calea citocromului P450 din microzomii hepatici cât și prin peroxidare.

d) Radicali proveniți de la acizii nucleici (AN)

Modificările macromoleculelor de AN rezultă în urma absorbției energiei radiante în fracțiuni de secundă, rezultând excitări și ionizări. Dacă moleculele excitate pierd energia absorbită tot în fracțiuni de secundă, ionizările sau scindările produc RL cu viață ceva mai lungă. RL ai AN rezultă deci prin impactul energiei absorbite (prin expunerea la radiații ionizante sau UV) și care determină ruperea unor legături chimice, deteriorări ale unor componente.

Radicalul OH, provenit de la radioliza apei, care are o reactivitate foarte mare, atacă molecula de ADN, organismul neposedând sisteme de protecție biochimică. Studiile RES au arătat că ADN poate fi protejat, cel puțin in vitro, prin prezența unor compuși tiolici (cisteamina), pentru care speciile reactive rezultate din radioliza apei au mai multă afinitate. Studiile efectuate stau la baza concepțiilor privind radioprotecția și radiosensibilitatea chimică.

e) Radicalul thiil (RS)

Existența acestui radical a fost formulată la început teoretic, mult timp acesta nefiind identificat nici spectofotometric și nici ca semnal RES.

Prin studii RES s-a observat că natura compușilor tiolici simpli (cisteamina, cisteina, glutation) influențează mult semnalele RES ale proteinelor și AN iradiați oferind chiar protecție acestora. Compuții tiolici menționați stau la baza radioprotecției. S-a demonstrat, atât prin studii RES, cât și chimice, radiosensibilitatea deosebită a grupărilor sulfhidril (SH) față de RL rezultați din acțiunea directă sau indirectă a radiațiilor asupra organismelor. Ulterior s-a mai demonstrat că grupările SH ale proteinelor sau comnpușilor tiolici (R-SH) sunt de asemenea ținta oricăror RL, proveniți și din reacții chimice. Are loc un transfer de energie, cu caracter oxidativ:

R-SH X –-> R-S XH

Prezența compușilor tiolici (cisteină, glutation) va oferi protecție și în cazuri de producere de RL pe cale chimică, cum sunt intoxicațiile paraquat, CCl4.

f) Monoxidul de azot (NO)

NO este primul gaz și cea mai mică moleculă recunoscută ca efectuor biologic în celulele mamiferelor. Molecula posedă un electron extern necuplat care o face să devină un RL foarte puternic. Timpul de viață, foarte scurt, de ordinul secundelor, face punerea sa în evidență foarte dificilă. Dozarea nitriților, metaboliții stabili ai NO, rămâne metoda biochimică cea mai utilizată pentru punerea în evidență a sintezei sale.

La ora actuală se cunosc multiple roluri ale NO. Acesta este implicat în relaxarea fibrelor musculare netede de la nivelul bronhiilor, citotoxicitatea antiparazitară, antibacteriană și antivirală a macrofagelor, neurotransmițător, vasodilatator (EDRF).

Proprietățile sale au fost deja atestate în terapia patologiei obstructive pulmonare (sindromul de detresă respiratorie la adult). Participarea NO este suspectată în vasoplegia din șocul septic, iar inhibitorii de NO-sintetază (NOS) sunt deja testați în această patologie. NO este produs de NO-sintetază pornind de la un acid aminat, L-Arg. Distingem:

– o parte de NOS constitutiv (NOSC), în principal endotelial și neuronal;

– o altă parte NOS inductibil (NOSI), exprimat în numeroase tipuri celulare după activarea prin stimuli inflamatori și imunologici (LPS, IFN-, TNF-, IL-1). Ea conduce la eliberarea unor cantități destul de importante de NO. Numeroase celule îl pot exprima: macrofage, polimorfonucleare neutrofile, eozinofile, celule epiteliale ale bronhiilor, ale retinei pigmentare, ale tubilor renali, hepatocite, celulele beta ale insulelor Langerhans, endoteliu, endocard, condrocite, osteoclaste, celule uterine, fibroblaste, neuroni, astrocite, celule mezangiale.

Gena NOSC endotelială umană a fost clonată pe cromozomul 7, cea a NOSC neuronală pe cromozomii 12 și 17. Gena NOSI a fost izolată pe cromozomul 17 și pentru moment pare să constituie singura membră a acestei familii.

NO reprezintă un factor esențial al activării celulare. Mecanismul și modul de implicare a acestui radical în psoriazis îl vom prezenta în capitolul II. În acest capitol la punctul 5 vom arăta modul în care NO contribuie alături de speciile reactive ale oxigenului la alterarea structurii ADN-ului.

Modularea farmacologică a NOSI se realizează cu anumiți derivați de acid retinoic (formulele izomere cis și trans), al căror efect antiinflamator rămâne pentru moment prost înțeles. Acești derivați retinoici inhibă foarte puternic eliberarea de NO și TNF de către keratinocit. Acest efect inhibitor se regăsește atât la nivelul ARN-ului mesager cât și la nivelul activității enzimatice

IL-10, citokină cunoscută pentru proprietățile sale antiinflamatorii, inhibă puternic inducerea NOSI în keratinocit în keratinocitele activate. Această proprietate poate să explice parțial efectul imunomodulator observat după iradierea UV a epidermului, astfel am putea spune actualmente că el este legat în parte de sinteza de IL-10 de către keratinocit. Există o buclă de reglare, keratinocitul fiind capabil să producă derivați inflamatori și în același timp o citokină cu rolul de a limita efectele excedentare ale acestei sinteze. De asemeni, ciclosporina, pare capabilă să moduleze expresia NOSI în keratinocit (rezultate nepublicate).

Rezultatele studiilor efectuate plasează NO ca fiind un veritabil mesager secund implicat în sinteza de citokine proinflamatorii.

3. Radicalii liberi ai oxigenului

3.1. Caracteristici fundamentale ale oxigenului. Corelații structură-proprietăți.

Conținutul în oxigen al organismului uman (greutate umedă), este de 65%. Conținutul în oxigen al aerului inhalat este de 21%. Aceste date sunt convingătoare pentru a înțelege importanța rolului pe care acest element îl are pentru menținerea vieții. Ideea de bază este aceea că celulele generează energie aerobic, reducând oxigenul molecular (O2) la apă (H2O). O2 poate fi utilizat pentru numeroase procese catabolice și anabolice permițând degajarea unei cantități mai mari de energie decât ar fi posibil în absența sa.

Oxigenul are o structură electronică deosebită în stare fundamentală, având pe ultimul strat doi electroni neparticipanți, fiecare localizat pe câte un orbital n*. Acești doi electroni au același număr cuantic de spin, astfel că, dacă O2-ul încearcă să oxideze un compus, acceptând doi electroni, aceștia trebuie să fie cu numărul de spin paralel, pentru a putea ocupa spațiile libere din orbitalii n*. Se știe că într-un orbital atomic, o pereche de electroni au spini antiparaleli (1/2 și –1/2). Această particularitate impune o restricție asupra oxidărilor, determinând ori o reactivitate foarte mică ori una foarte mare, în funcție de natura donorului de electroni.

Structura electronică a O2-ului explică de ce acest element, deși poate fi socotit un diradical liber (datorită prezenței a doi electroni impari), are o reactivitate mică. Pentru ca un donor de electroni (reducător) să fie oxidat, trebuie să aibă loc o inversie de spin, fapt posibil ori prin reacția O2 cu metale tranziționale, paramagnetice (Cu, Fe, Mn) sau prin reducerea univalentă, prin două etape a câte unui electron. Toate oxidările din natură se bazează pe aceste două căi, chiar dacă formele pot apărea variate. Metalele tranziționale formează centrii activi ai unor enzime redox, iar oxigenazele sunt capabile de a cataliza reduceri de câte un electron.

Creșterea reactivității O2 pe măsura activării sale se datorează creșterii distanței dintre atomii de oxigen, de la 1,12Å la O2, la 1,33 Å pentru O2 – și 1,49 Å în cazul O22 – (peroxid). În același sens scade și energia de legătură O-O în ordinea menționată 118> 64 > 51kcal/mol.

Oxigenul a apărut târziu în atmosferă, ca rezultat al acțiunii combinate a reacțiilor fotochimice, erupțiilor vulcanice și apariției apei la nivelul crustei Pământului (3 miliarde ani). Formele primitive de viață, unicelulare aveau un caracter predominant anaerob sau au căpătat capacitatea fotosintetică. Creșterea concentrației de O2 din atmosferă a obligat algele fotosintetice să se adapteze caracteristicilor paradoxale ale acestui element. Majoritatea sistemelor antioxidante, protectoare, enzimatice și neezimatice, provin de la acest nivel celular și se păstrează intact și astăzi.

Puseul respirator este procesul prin care fagocitele (granulocite PMN, monocitele, macrofagele) generează în cascadă pe cale enzimatică și neenzimatică specii reactive de oxigen excitate sau cu structură de radical, cum ar fi superoxid anionul, singlet oxigenul, radicalul hidroxil, etc. Fagocitele dezvoltă puseul respirator ca urmare a stimulării lor la nivelul unor receptori de suprafață, cum ar fi receptorii pentru fragmentul FC al IgG, pentru anumite componente ale complementului, pentru peptide chemotactice, pentru lectine, etc. Activitatea oxidativă este asociată în general fagocitozei. Speciile reactive de oxigen reacționează intra și extracelular cu diverse structuri biologice pe care le alterează în lanț prin reacții de oxido-reducere, generând astfel așa-numitul stress oxidativ. Stresul oxidativ (SO) este un mecanism eficient de lezare nespecifică a patogenilor, fiind în același timp nociv și pentru organismul gazdă. În consecință, pentru menținerea homeostaziei organismului, puseul respirator este riguros reglat, atât la nivelul proceselor de generare a speciilor reactive de oxigen, cât și la nivelul acțiunilor toxice ale acestora asupra structurilor biologice. Ieșirea stressului oxidativ de sub control conduce la o serie de manifestări patologice, asociate în general cu inflamații cronice și cu leziuni persistente. Din aceste considerente, studiul SO prezintă o remarcabilă importanță teoretică și practică pentru elucidarea etiologiei și manifestărilor clinice în diverse patologii, ca și pentru instituirea unor linii terapeutice eficiente.

a) oxigenul molecular (O2)

b) superoxid anionul (O2 -)

c) Anionul peroxid ()

d) Singlet oxigenul (1O2)

Figura nr.7 Distribuția electronilor pe orbitali moleculari de tip 2y și în cazul oxigenului molecular, superoxid anionului, a anionului peroxid și a singlet oxigenului.

OA-orbitali atomici; OM-orbitali moleculari

3.2. Oxigenul singlet

Există două stadii cunoscute de oxigen singlet, provenite din oxigenul molecular, transformat în trepte excitate. Una din aceste forme se află la 23 kcal peste nivelul stării fundamentale a oxigenului și este notat cu 1g, iar celălalt este cu aproximativ 37 kcal peste nivelul stării fundamentale și este numit 1g. Ultimul are un timp de viață foarte scurt, astfel că acțiunile sale sunt atribuite oxigenului singlet 1g, care are o stabilitate mai mare. 1O2 intervine în fenomenul de chemiluminescență, emisia având două maxime. Acest tip de oxigen a fost detectat spectroscopic prin iluminarea flavinelor, porfirinelor, clorofilei sau a cloroplastelor, retinei și cristalinului din ochiul mamiferelor.

1O2 apare prin iluminarea unor structuri sensibile la fotosensibilizare, procese redox, descompunere sau radioliză. Producerea de 1O2 constituie baza pentru multe procese biologice adverse cauzate de lumină numite efecte fotodinamice.

Singlet oxigenul este atât de agresiv deoarece el nu conține doi electroni cu spini paraleli ca și în starea fundamentală, deoarece excitarea provoacă ridicare unuia din electronii necuplați pe un orbital superior și inversarea spinului său. 1O2 este astfel nestânjenit de restricția de spin și este mai activ ca oxidant decât corespondentul său din starea fundamentală. El, spre exemplu, va ataca cu rapiditate legătura dublă a lipidelor nesaturate, colesterol, olefine, compuși organici cu S sau N.

Triptofanul este principalul aminoacid care reacționează rapid cu 1O2 și principalele efecte ale fotosensibilizării sau ale fotodinamicii include această reacție.

Fototerapia include 1O2 ca mecanism de acțiune în tratamentul psoriazisului cu psoralen.

3.3. Superoxid anionul (O2 -) și radicalul hidroxil (HO)

Formarea superoxid anionului constituie prima etapă a activării O2 și are loc în organism în condițiile activității metabolice normale. Deși reducerea univalentă către O2 – este favorizată de structura electronică fundamentală a O2, aceasta este redusă de enzime specializate. Astfel, cea mai mare parte a reducerii O2 în celulele respiratorii este realizată de citocrom c oxidază, care conține 4 electroni, grupări prostetice, doi atomi de cupru (II) și două molecule de ferihem. Această enzimă realizează reducerea tetravalentă a O2 la două molecule de apă fără obținerea de intermediari. Astfel reducerea O2 la O2 – este astfel redusă la minim, dar nu poate fi evitată total.

Există enzime precum xantin-oxidaza, aldehid-oxidaza, dehidrorotic-dehidrogeneza care convertesc o fracțiune mare a O2 la O2 – . Există, de asemeni, enzime membranare (NADPH) care convertesc O2 la O2 – . Aceste enzime sunt abundente în celulele fagocite precum: macrogfage, PMN-N, euzinofile. În final, unii electroni aflați la nivelul părții interne a membranei mitocondriale, sunt cedați, cu formare consecutivă de O2 -. Dată fiind cantitatea mare de O2 consumată de celulele aerobe, se produce o cantitate substanțială de superoxid.

Există numeroase alte componente care cresc producția de O2 – prin acceptarea de e-, de la numeroase reductaze și apoi trec acești electroni oxigenului. Aceste componente includ chinone, aril nitro componente, printre altele, iar acestea exercită o toxicitate clară dependentă de O2, deoarece deviază fluxul e- de la calea productivă către creșterea producției de O2 -. O2 – se poate comporta atât ca reducător cât și ca oxidant. O2 – suferă o reacție de dismutație în care superoxidul se comportă atât ca reducător cât și ca oxidant:

O2 – O2 – 2H –->H2O2 O2.

La pH neutru această reacție spontană de dismutație este foarte rapidă (K2 1 x 105 M-1 x s-1). O2 – oxidează multe componente biologice importante incluzând: catecolamine, tetrahidropterine, leucoflavine, sulfiți (NADPH-catalizatori ai oxidărilor intramembranare cu O2 -). O2 – reduce citocromul c, tetranitrometanul, nitrobluetetrazoliul. Ultimele reduceri sunt larg utilizate pentru a analiza producția de O2 – și activitatea superoxid dismutazei (SOD).

Abilitatea O2 – de a se comporta ca oxidant este crescută semnificativ prin asocierea cu centre cationice. Astfel protonarea la HO2 care survine la un pK de aproximativ 4,9 permite oxidarea acizilor grași polinesaturați cu o rată constantă de aproximativ 1 x 103 M-1 x s-1. Un alt exemplu al efectului liganzilor cationici este dovedită de vanadat. O2 – nu oxidează NAD(P)H cu o rată apreciabilă dar peroxovanadatul produs în asociere cu V o face. Această reacție inițiază formarea de RL în lanț în care O2 – introdus în sistem poate oxida multe molecule NAD(P)H iar vanadatul se comportă ca un catalizator al acestei reacții. Acest proces este baza pentru frecventele reacții de oxidare NAD(P)H-dependente, constatate în membranele biologice, vanadat stimulate.

Reacția Haber-Weiss in vivo a stârnit vii controverse. Importanța acestei reacții constă în posibilitatea apariției radicalului HO pentru care organismele vii nu posedă sisteme de apărare. Reacțiile sunt următoarele, ținând cont de prezența sărurilor de Fe:

O2 – H2O2 –-> O2 OH- OH

Fe2 H2O2 –-> Fe3 OH- OH

OH H2O2 –-> H2O O2 – H

Fe2 OH –-> Fe3 OH

Reacțiile de mai sus sunt inhibate de scavengeri specifici pentru OH cum sunt: manitolul, formiatul, tioureea și agenți chelatori ca desferioxamina, bathofenantrolina și DETAPAC. În schimb chelatori precum: EDTA, ATP și acidul picolinic (metabolit al triptofanului) stimulează această reacție.

Radicalul OH este cea mai puternică specia a O2 alături de 1O2. Cel mai simplu mod de formare este prin scindarea oxidativă sau homolitică a HO-OH, sub influența căldurii sau radiațiilor UV și ionizante. În organism, căile cele mai probabile, provin din reacțiile de interconversie ale O2 – și H2O2 mai ales în prezența ionilor metalici. În condiții de laborator, scavengeri specifici sunt manitolul, formiatul și tioureea. Antioxidanții naturali pentru acest radical sunt metalothioneinele, proteine care pot lega puternic o gamă largă de ioni metalici printre care și Fe, evitându-se reacția Haber-Weiss.

3.4. Peroxidul de hidrogen (H2O2)

Ionul peroxid se formează prin adiția unui al doilea electron la superoxid, o primă etapă fiind apariția O22-, care nu are caracter de RL. H2O2 este produs direct de o serie de oxidaze. Este de asemenea produs prin dismutația O2 – . Odată produs, H2O2 trebuie văzut ca fiind extrem de periculos, deoarece, molecula sa, de dimensiuni mici și greutate moleculară mică, îi permite să difuzeze pe distanță considerabilă și să traverseze membranele biologice iar aici poate fi redus univalent la OH- și HO. Această reducere a H2O2 poate fi cauzată de reducerea cationilor metalici precum Fe (II) sau Cu (I), iar dacă aceste metale aparțin ADN-ului sau membranelor celulare, atunci HO va fi generat în vecinătatea acestora și OH va reacționa cu precădere cu aceste ținte critice.

Dintre speciile reactive ale O2, H2O2 este cel mai stabil și mai ușor de măsurat, astfel că prezența acestui peroxid este demonstrată demult. H2O2 pare a fi arma citolitică universală în lumea celulară și pluricelulară.

3.5. Peroxizii

Reprezintă cele mai stabile specii active ale O2, fiind veriga finală a activării oxigenului. Formarea peroxizilor cuprinde următoarele etape: inițiere, propagare, descompunere. Pot fi produși direct prin intermediul OH dar și din oxigenul singlet 1O2, dovedit experimental prin adiție la duble legături ale acizilor grași, la acizi grași, polinesaturați, olefine, compuși aromatici ca triptofan. Caracteristica de bază a peroxidării o constituie producerea unor reacții în lanț, în cursul cărora pot apare un amestec foarte complex de peroxizi (hidroperoxizi, endoperoxizi) și de produși de descompunere (aldehide, cetone). Inițiatorii procesului de peroxidare sunt RL de tipul R, ROO sau OH acumulați în cantități suficiente. Factorul de amplificare îl constituie activarea oxigenului. Procesul de peroxidare este dependent de creșterea concentrației substanțelor pro-oxidante (substanțe pentru care RL au o mare afinitate) de tipul: lipoxigenazei, PG-sintetazei, compușilor heminici, ionilor metalici, Fe, Co, etc.

Acțiunea RL asupra pro-oxidanților este contracarată de antioxidanți naturali precum: glutation-peroxidaza, vitamina E (tocoferol), compușii heminici, chelatorii de Fe (desferoxiamină), ascorbat, albumină, acid uric.

Concluzionând, determinarea peroxizilor și a produșilor de descompunere constituie mărturia impactului RL și a activării O2 asupra organismului. Majoritatea lucrărilor experimentale au fost efectuate pe microzomi, determinându-se concentrația de MDA (malonil dialdehida, produs final al peroxidării lipidice), rezultată prin incubarea suspensiei cu diferite sisteme pro-oxidante (NADPH, ascorbat, Fe3 ADP, Fe3 NADPH).

4. Surse naturale de radicali liberi

RL apar într-o serie de procese naturale precum: respirația mitocondrială, fagocitoză, sinteza H2O2 la nivelul peroxizomilor (corpusculi aparținând citoplasmei hepatocitare), sinteza PG și LC, peroxidarea lipidelor polinesaturate, îndeplinirea rolului de mesageri chimici.

Respirația mitocondrială. În celulele eucariote, aerobe, actul final al respirației constă în reducerea O2 cu 4 e- proveniți din reacțiile metabolice și transportați prin lanțul respirator. Clasic, se considera că această reacție nu produce RL. În 1973 au fost efectuate niște studii care au făcut senzație: s-a demonstrat producerea în cursul respirației mitocondriale a unei cantități însemnate de O2 – , H2O2. Producerea superoxidului în cursul respirației mitocondriale pare să constituie un mecanism de autoreglare. O2 – rezultă, în parte, din auto-oxidarea NADH-dehidrogenazei:

2 O2 – 2H H2O2 O2 (1)

SOD se găsește în matricea mitocondrială. NADH dehidrogenaza și SOD formează un cuplu de reglare și conservare a energiei în prezența oxigenului. H2O2 rezultat la reacția (1) va fi neutralizat de activitatea GSH-peroxidazei:

2GSH H2O2 H2O GSSG

Fagocitoza. Reprezintă cel mai cunoscut proces metabolic furnizor de RL în organism ce are loc la nivelul PMN și macrofagelor din țesuturi. Rolul RL, în special al O2-lui este esențial în fagocitoză și constă în uciderea sau labilizarea structurală a agentului patogen. Cea mai mare cantitate de RL de O2 se produce în etapa activării NADPH-oxidazei prin fosforilare, permițând un flux crescut de electroni către O2 prin intermediul altor transportori precum flavoprotein-dehidrogenaza (citocrom B reductaza) și citocrom b. Secvența reacțiilor începe în membrană, apoi trece în citoplasmă producând în final o cantitate mare de O2 – ce difuzează atât în citoplasmă dar și în afara celulei. Au loc reacțiile:

glucoză NADP NADPH (SMF – șuntul pentozo fosfat)

O2 NADPH NADP O2 –

O2 – H2O2

H2O2 Cl- OCl- 1O2

OCl- 1O2 aminoacizi acizi grași–-> cloramine, peroxizi, aldehide

Activarea reacțiilor biochimice menționate asigură furnizarea de substraturi pentru procesele biologice principale: modificări morfologice și uciderea agentului patogen.

5. Efectele biologice ale speciilor reactive de oxigen

Generarea in vivo a RL de O2 de către fagocite este un proces complex, riguros reglat, esențial pentru apărarea gazdei față de patogeni, care poate deveni toxic pentru organismul gazdă în condițiile manifestării unor deficiențe la nivelul puseului respirator.

Speciile toxice de O2 își exercită efectele distructive asupra patogenilor și celulelor “bystander” ale organismului gazdă în principal prin peroxidare lipidică. Oxidarea acizilor grași, cu precădere acizii grași nesaturați, este o reacție în lanț, caracterizată prin etapa de inițiere (reacția 1), propagare (reacțiile 2,3) și întrerupere (reacțiile 4, 5, 6):

RH X –->R XH (1)

R O2 –->ROO (2)

ROO RH –-> R ROOH (3)

R R –-> R-R (4)

ROO ROO –-> produși stabili (5)

ROO R –-> ROOR (6)

Lanțul de reacții este inițiat de radicalul X generat printr-o reacție redox. Acest radical extrage mai mult sau mai puțin selectiv un atom de hidrogen legat la carbon, generând un radical lipidic R, sau se adiționează la o dublă legătură. Reacția de propagare este etapa de generare a produșilor majori de oxidare, de tipul peroxiradicalilor ROO și de regenerare a radicalilor R. Odată pornită reacția în lanț, ea evoluează ciclic de mai multe ori, producând masiv peroxizi lipidici. Lanțul se întrerupe prin reacții de anihilare de tip radical-radical, care evoluează într-un mod favorabil suprapunerii orbitalilor radicalici. Un mecanism alternativ de întrerupere a lanțului de reacție este asociat antioxidanților AH conform reacțiilor:

ROO AH –-> ROOH A (7)

A A –-> 2A (8)

Produșii finali ai reacțiilor de peroxidare lipidică fac parte din clasa aldehidelor, a alcanilor, a acizilor grași, epoxi și hidroxi acizi. Dintre aceștia, compușii cei mai toxici sunt aldehidele care pot difuza de la locul generării, acumulându-se în zone bine definite unde pot bloca enzime cu grupări sulfhidril esențiale. Concentrația aldehidelor în organism este riguros controlată de către aldehid-dehidrogenază care, în condiții aerobe metabolizează și îndepărtează acești produși toxici.

Ca urmare a peroxidării lipidice în lanț compoziția de acizi grași nesaturați și de hidroxilipide din membranele biologice se modifică dramatic, ceea ce induce scăderea fluidității membranare și creșterea permeabilității lor. Aceste evenimente afectează esențial funcționalitatea celulelor și procesele de transport prin membrană. De exemplu, creșterea fluidității membranare inhibă chemotaxia, ceea ce determină sechestrarea leucocitelor la locul inflamației.

RL modulează activitatea unor enzime celulare prin oxidarea grupărilor esențiale de la nivelul centrului catalitic. Astfel, sistemul MPO inactivează 1- antitripsina (inhibitor plasmatic de serin-proteaze care controlează proteoliza tisulară) prin oxidarea unor reziduuri de metionină. Disproporționarea funcțională a cuplului enzimă proteolitică-inhibitor conduce la degradarea elastolitică a țesuturilor. RL de O2 pot activa enzimele latente ale PMN, cum ar fi colagenaze și gelatinaze, metaloproteinele cu rol important în distrucția tisulară. În virtutea celor prezentate mai sus, se constată că radicali toxici de O2 exercită efecte distructive directe sau indirecte asupra țesuturilor, fie prin acțiune oxidantă directă asupra acestora, fie prin modularea activității unor enzime implicate în distrugerea sau protecția țesuturilor.

Un alt mecanism de atac asupra țesuturilor îl constituie oxidarea lizinei din lanțurile laterale ale elastinei, ceea ce determină asocierea covalentă a lanțurilor de elastină și colagen cu formare de fibre insolubile. În același mod se realizează și legarea covalentă a complexelor imune între ele și la macromolecule structurale de tipul colagenului.

RL pot ataca chiar și neutrofilul. Ei afectează integritatea membranelor lizozomale, inducând astfel eliberarea enzimelor lizozomale, cu toate consecințele de distrugere tisulară generate de acestea. În același timp RL protejează neutrofilul de acțiunea devastatoare a enzimelor lizozomale prin inactivarea intra și extracelulară a acestora. RL de O2 controlează și reglează negativ procesele inflamatorii prin inactivarea unor inductori ai acestora, cum ar fi metaboliții acidului arahidonic, chemoatractanții solubili, enzimele lizozomale, factorii bacterieni, etc.

6. Antioxidanți

6.1. Ce este un antioxidant ?

Apariția RL în organism poate deveni la un moment dat distrugătoare pentru organism. Acest fapt a dus la adaptarea organismului prin apariția a ceea ce poartă numele de “sisteme antioxidante”, acestea constituind substanțe capabile să elimine sau să neutralizeze RL.

Antioxidanții sunt de două feluri: enzimatici (SOD, catalază, glutation, peroxidază) și neenzimatici–naturali (vitaminele C și E) și sintetici (butilhidroxitoluen).

Sistemele AO naturale sunt concentrate mai ales împotriva primului radical O2 – și pe ultimii (peroxizi), lăsând astfel descoperit radicalul hidroxil, OH. Pentru a mării eficiența, pentru aceeași specie de RL, acționează atât AO enzimatici, cât și neenzimatici, localizați în medii diferite (membrane, citoplasmă, lichide extracelulare).

6.2. Antioxidanți naturali enzimatici

6.2.1. Superoxid dismutaza (SOD)

Reprezintă primul AO enzimatic. Reacția catalizată de SOD:

2O2 – 2H O2 H2O2

Rolul SOD este deci de a descompune rapid ionul superoxid, dismutarea ionului O2 – la H2O2 este adesea numită apărare primară. Superoxid dismutazele sunt clasificate în trei clase distincte, în funcție de ionul metalic conținut: Cu/Zn SOD, Mn SOD și Fe SOD. Deși o parte a activității SOD se desfășoară extracelular, cea mai mare parte a activității are loc intracelular, împărțită între compartimentele mitocondrial (Mn SOD) și citosolic (Cu/Zn SOD). Activitatea SOD variază de la țesut la țesut. Cele mai crescute niveluri s-au constat la organe precum: ficat, glandele suprarenale, rinichi, splină. Activitatea SOD este reglată prin biosinteză care este sensibilă la concentrația de O2. Inducerea sintezei de SOD survine și prin stimularea de către alți compuși chimici, precum paraquatul, cunoscut ca fiind generator de O2 – .

Ținând cont de efectele O2 – și implicațiile lui în fagocitoză rezultă că SOD este principalul agent antiinflamator natural. S-au comercializat medicamente conținând SOD purificat: Orgotein (SUA), Peroxinorm (Germania), Epurox (România). A fost utilizat în terapia următoarelor boli: artrită reumatoidă, boli autoimune, intoxicații cu ierbicidul paraquat, ischemii cerebrale, Parkinson, boala Alzheimer. Rezultate deosebite s-au obținut în tratamentul artritei, ulcerului gastric, diabetului indus chimic.

6.2.2. Catalaza (CT)

Această enzimă este prezentă în toate celulele aerobe fiind localizată mai ales în mitocondrii și peroxizomi. Rolul său este de a descompune H2O2 la H2O, împărțind această funcție cu GSH-Px (glutation peroxidaza).

Catalaza descompune H2O2 extraordinar de eficient (k108 M-1 x s-1) acționând fie catalazic:

H2O2 H2O2 –-> O2 2H2O

ori peroxidazic:

H2O2 R-CH2-OH 2H2O R-COH.

La descompunerea în prezența unor concentrații mici de H2O2 acționează peroxidazele. La niveluri ridicate ale concentrației H2O2 acționează CT.

6.2.3. Glutation peroxidaza (GSH-Px)

GSH-Px catalizează reacția:

R-OOH 2GSH –-> R-OH GSSG, unde R-OOH pot fi H2O2 și orice tip de peroxizi organici (ai purinelor), AGPN-acizi grași polinesaturați, steroizi, în schimb specificitatea GSH este foarte mare. Activitatea ei se completează cu cea a CT, GSH-Px acționând la concentrații mici de H2O2 (>10-6 M) și la cele fiziologice de GSH (10-4-10-3 M).

Intracelular, GSH-Px este cuplată cu CT în mitocondrii și peroxizomi, pe când în citoplasmă GSH-Px este cuplată cu SOD. Prin cuplajul a două enzime și a unor AO neenzimatici se asigură protecția structurilor subcelulare, dar și reglarea activării O2 evitându-se formarea radicalului OH. Localizarea GSH-Px în membranele mitocondriale pare să asigure protecția față de acțiunea pro-oxidantă a GSH. GSH, la fel ca și ascorbatul, la concentrații mici, în mod paradoxal, deși este reducător, determină producerea de O2 – și peroxizi urmată de umflarea mitocondriilor și eliberarea GSH peroxidazei din membrane. Principalul tip de GSH-Px conține 4 atomi de Se pentru cele 4 unități polipeptidice.

GSH-Px intervine ca regulator în biosinteza PG prin inhibarea lipoxigenazei care catalizează producerea de HPETE, HETE și THETE, ultimul având rol chemotactic. În acest fel intră în competiție cu lipoxigenazele care acționează în pozițiile 5 sau 12 ale acizilor eicosatetraenoici, precursori în biosinteza LC. Același rol regulator al GSH-Px poate fi observat și la nivelul intermediarului 15-HPETE, etapă importantă în evoluția biosintezei de prostacicline și tromboxani. Importanța regulatoare în biosinteza PG este atât de mare încât, în deficit de Se apar leziuni ale endoteliului vascular, tulburări în agregarea trombocitelor, dereglarea biosintezei prostaciclinelor.

6.2.4. Glutation transferaza (GSH-T)

Pe lângă GSH, peroxidaza ce nu conține Se și care posedă și activitate transferazică, s-a mai izolat și studiat o grupă de enzime denumite GSH-S-transferaze care catalizează conjugarea GSH cu o mare varietate de compuși organici electrofili, inițiind formarea acizilor mercapturici, o formă importantă a detoxifierii în organism. GSH-S-transferaza se mai numește și ligandină, se găsește în ficat și asigură supraviețuirea organismului în condițiile poluării chimice.

Aldehidele reprezintă compușii finali ai evoluției RL și peroxizilor în organism. Acești compuși, foarte reactivi, sunt descompuși de aldehid oxido-reductază sau GSH-S-transferază, conform reacției:

GSH R-CH CH-CORR-CH (SG)-CH2-COR.

6.3. Antioxidanți neenzimatici

6.3.1. Glutationul

Este principalul AO neenzimatic, reprezentat de tripeptidul L–glutamil-cisteinil-glicocoli, care asigură forma de transport a grupărilor sulfhidril (SH) libere.

GSH este caracterizat prin gruparea reactivă tiol și capătul său, -glutamil, care îl face rezistent la atacul peptidazelor. Versatilitatea sa derivă din proprietățile chimice care îi permit să fie substrat nucleofil cât și un reducător efectiv, interacționând cu numeroase componente, electrofile sau cu compuși oxidanți precum H2O2, O2 – și OH. Ca reducător efectiv, GSH joacă un rol important în procesele de detoxifiere, acesta incluzând neutralizarea proceselor de distrucție peroxidică.

Includerea grupării “-SH” în centrul activ al multor enzime, în vecinătatea acestuia sau ca reziduu al cisteinei, în structura tridimensională proteică, conferă acesteia o poziție unică în reacțiile biochimice. În acest sens, nu este de mirare că RL, prin reactivitatea lor mare vor ataca grupările -SH libere din vecinătatea lor. Spre deosebire de grupările tiol aparținând altor enzime, care sunt protejate oarecum de lanțul polipeptidic, cele care fac parte din structura GSH sau a cisteinei (tiolii cu masă moleculară mică) vor constitui prima țintă a RL. Așa încât, prin modificarea reacției de bază a glutationului:

2GSH 2R –-> GSSG 2RH,

RL vor acționa direct sau indirect asupra multor procese metabolice.

6.3.2. Viatmina E (-tocorefolul)

Vitamina E este principalul AO neenzimatic liposolubil, al cărui rol de bază este păstrarea integrității membranelor. În contact cu RL, vitamina E este rapid oxidată într-un RL (vit. E-oxigen) conform reacțiilor produse în membrane:

vit. E-OH ROO –->vit.E-O ROOH

cromanoxil

6.3.3. Vitamina C-acidul ascorbic (AA)

În contrast cu vitamina E, vitamina C este hidrofilă, deci își exercită rolul în mediu hidratat. Rolul său AO este indicat de acțiunea de înlăturare a RL. Ca agent reducător și AO, AA reacționează direct cu O2 – cu OH și alți variați hidroperoxizi lipidici. În plus, AA poate reface proprietățile AO ale vitaminei E oxidate, sugerând faptul că una din funcțiile majore ale vitaminei C este de a recicla radicalul vitaminei E, cromanoxil. Comparând cu alți AO hidrosolubili vitamina C asigură cea mai bună protecție în fața peroxidării lipidice. AA poate servi și ca pro-oxidant, în prezența metalelor tranziționale Fe3 și Cu2 generând cofactori ai RL de O2 activați în timpul promovării procesului de peroxidare lipidică. În studiile efectuate s-a demonstrat că activitatea pro-oxidantă a AA rezidă din capacitatea de a reduce Fe3 la Fe2, iar Fe2 este recunoscut ca un radical inductor foarte potent. Într-un alt studiu s-a dovedit că modificările oxidative ale ADN-ului, au fost substanțial mărite de prezența ascorbatului. Complexitatea rolului dual exercitat de AA devine evidentă atunci când sunt prezenți și alți antioxidanți, precum vitamina E. De exemplu peroxidarea lipidică în microzomi este crescută de AA la animalele cu deficit de vitamina E și este scăzută de AA la cele cu valori normale ale vitaminei E. Deoarece pK-ul AA este 4,25, în condiții fiziologice de pH, anionul ascorbat, AH-, reprezintă forma dominantă. Forma oxidată a ascorbatului (AH—), acidul dehidroascorbic (DHA) – prin oxidarea reversibilă cu formarea unui radical intermediar, ascorbil (A-), sugerează că DHA poate avea roluri anti sau pro-oxidante, ca și a AA însuși.

6.3.4. Vitamina A (carotinoizii)

Carotinoizii protejează lipidele de peroxidare, eliminând RL și speciile reactive de O2. -carotenii joacă un eficient rol AO prin inhibarea peroxidării lipidice indusă de sistemul xantin-oxidazei.

Aranjamentul structural al -carotenilor cu lanțul lor lung de duble legături conjugate, sugerează excelentul rol de scavengeri ai RL. -carotenii la fel ca și vitamina C, pot avea și rol pro-oxidant. La o presiune parțială a O2-ului sub 150 Torri, -carotenii exercită o excelentă activitate de scavengeri. La o presiune mai mare a O2 –ului capătă capacitate auto catalitică cu efecte pro-oxidante cu pierderea consecutivă a proprietăților antioxidante.

6.3.5. Alți antioxidanți

Alți antioxidanți sunt: Se, acidul uric, bilirubina, metalotioneinele, albuminele, aminoacizi precum histidina, taurina, polifenoli, fenoli, flavonoizi, propolisul.

B. PSORIAZISUL

1. Introducere. Definiție. Istoric

Psoriazisul este o boală cutanată, cronică, determinată genetic, în care procesele inflamatorii și proliferative evoluează concomitent, caracterizata prin leziuni eritemato sau papulo-scuamoase care prezintă o deosebit de mare variabilitate în durată, extindere și aspectul morfologic al leziunilor.

Leziunile cutanate sunt caracteristice, astfel încât diagnosticul clinic este ușor de făcut, cu toate că există o mare variabilitate de forme clinice. Între acestea amintim pe cele foliculare, guttate inelare, circinate, girate, numulare, inversate, eritrodermice, serpiginoase, pustuloase, eczematoase, etc. Zonele de elecție implicate sunt coatele, genunchii și ariile retroauriculare pentru psoriazisul în plăci, în timp ce, cel guttat, implică mai ales trunchiul și extremitățile proximale, iar cel eritrodermic implică întreg corpul. Poate exista și o fază asociată, pustuloasă, ce poate complica un psoriazis stabil, în plăci (psoriazis cu pustulizare), poate apare generalizat (tip von Zumbusch) sau palmoplantar (tip Barber).

Principalele leziuni sunt de tip eritemato-scuamos ceea ce arată faptul că sunt implicate atât vascularizația cutanată cât și epidermul (scuama în cantitate mare). Plăcile sunt în general simetrice și pot fi însoțite de o senzație de arsură și prurit în puseele acute de psoriazis, dar cel mai frecvent leziunile sunt asimptomatice.

Aspectul clinic pare să depindă de așa numita "presiune eruptivă" care reprezintă culminarea factorilor de exacerbare, perpetuare și mentinere a afecțiunii. Întrucât aceasta este variabilă, un individ se poate prezenta la medic numai cu câteva plăci mici, localizate, stabile sau la polul opus, se poate prezenta cu inflamație generalizată a pielii, cu dezvoltarea de pustule. În afară de implicarea cutanată, singura manifestare necutanată recunoscută a bolii reprezintă artropatia psoriazică.

Leziunile cutanate de psoriazis apar de obicei pentru prima dată între 20 și 50 de ani (cu medie la debut 28 de ani), însă leziunile inițiale pot apare chiar și la vârsta de 1 an sau la polul opus, la peste 80 de ani. Indiferent de momentul debutului afecțiunii, pacientul va duce o luptă permanentă pentru a face să dispară leziunile eritemato-scuamoase care constituie o sursă de anxietate și de jenă permanentă.

În timpuri străvechi, oamenii considerau psoriazisul ca pe o formă de lepră. Termenul biblic "lepra" includea și ceeea ce acum se numește psoriazis. Primele descrieri ce par să vorbească despre psoriazis apar în Corpus Hipocraticum, lucrare editată în Alexandria la 100 de ani după moartea lui Hipocrate. Autorul utiliza termeni ca "psora" și "lepra" pentru afecțiuni ce pot fi recunoscute ca psoriazis. Mai târziu, Celsius a descris între circa 40 de dermatoze, o formă de impetigo ce a fost interpretată de R.Willan ca fiind psoriazis. Acesta din urmă separă două boli ca entități psoriaziforme, o "lepră Graecorum" discoidă și o "psora leprosa" policiclică, confluentă, pe care mai târziu a numit-o "psoriazis" (în anul 1808). Așadar, confuzia între lepră și psoriazis a durat mai mult de 19 secole. Abia în anul 1841 cuvântul "lepra" a fost eliminat din definirea psoriazisului, grație dermatologului vienez Ferdinand von Hebra. Acesta a arătat ca "lepra graecorum" și "psora leprosa", ale lui R.Willan, sunt una și aceeași afecțiune ce a cauzat atâta confuzie, datorită diferențelor de mărime, în creșterea și involuția leziunilor. Patogenia bolii rămâne încă neexplicată. Astăzi, după multe decade de eforturi clinice și de laborator se arată că această boală, specifică, nu este precipitată de o singură cauză, ci de un mecanism complex de factori care interacționează. Epidemiologia este una din științele medicale utilizate în investigarea enigmei psoriazisului. Ea diferă de alte discipline medicale prin aceea că pacienții sunt studiați în mediul lor natural, ca membrii ai unei comunități, în strânsă legătură atât cu susceptibilitatea lor determinată genetic, cât și cu influența mediului ecologic și a celui artificial în care trăiesc.

2. Etiologie și patogeneză

2.1. Modul de moștenire.

Faptul că psoriazisul poate fi moștenit a devenit o certitudine, datorită unor multitudini de studii efectuate, cum ar fi cele familiale, cele făcute pe gemeni, cele care studiază antigenele HLA, etc. Ele sugerează că psoriazisul este fie o mutație spontană frecventă, fie că transmisibilitatea sa genetică nu este înțeleasă. Cea mai aproape de adevăr pare a fi originea multifactorială, în care atât componentele genetice cât și cele de mediu, joacă un rol în debutul și evoluția psoriazisului.

Traupe și colaboratorii (1992) au propus un mecanism genetic, cunoscut sub denumirea de "imprinting genetic", pentru a explica de ce copiii par să aibă psoriazis mai frecvent dacă tatăl este afectat, decât atunci când este afectată mama. Implicarea "imprimării genomice" apare acum clara și în diabetul insulinodependent precum și în sindroamele Prader-Willi și Angleman.

Studiile epidemiologice și clinice arată că vârsta de debut a psoriazisului este situată între 15 și 30 de ani, 75-90% din persoanele prezentând debutul afecțiunii sub 40 de ani. Pe baza vârstei de debut există două tipuri de psoriazis nepustulos: tipul I (<40 ani), cel mai frecvent întâlnit, și tipul II (>40 ani). Incidența este de 1-2%.

2.2. Imunogenetica

Dintre markerii genetici ai bolii, cei mai importanți sunt antigenele HLA; s-a observat că pacienții cu psoriazis au o predominanță mai mare a clasei I definită serologic HLA-B13, B17, B39, B57, Cw6, Cw7, precum și antigenele clasei II HLA-DR4 și DR7. Dintre aceștia, riscul cel mai mare, îl prezintă asocierea cu Cw6. S-a descris o formă familială de boală (tipul I) în care antigenul HLA-Cw6 este constant prezent și o altă formă, sporadică, în care antigenul HLA-Cw6 este rar întâlnit.

2.3. Factori de provoacare și exacerbare

Cauza psoriazisului nu este cunoscută. La pacienții cu predispoziție genetică, factorii de mediu pot avea rol declanșator sau agravant al bolii. Cei mai importanți dintre aceștia sunt:

1 Traumatismele constituie unul dintre cei mai cunoscuți factori trigger în declanșarea leziunilor psoriazice. Între acestea, un rol deosebit revine unor factori traumatici locali, cum ar fi: injurii fizice, chimice, electrice, chirurgicale, infecțioase, inflamatorii. Fenomenul Koebner reprezintă apariția leziunilor psoriazice la locul injuriei. Acesta apare la 7-14 zile de la injurie, incidența sa variind între 38-76% la pacienții cu psoriazis. Dacă la un pacient fenomenul apare într-un loc, el va apare în toate locurile traumatizate. Reacția este mai frecvent întâlnită în psoriazisul activ, sever întins, constituind un marker pentru un subgrup de pacienți ce au tendința la un debut precoce și recăderi rapide după diverse forme de tratament. Se pare că nu există vreo regiune cutanată mai susceptibilă decât alta pentru apariția fenomenului.

Fenomenul Koebner descrie o reacție a pielii în care eflorescența psoriazică apare în aria pielii lezate la un individ cu genotip psoriazic. După lezarea aseptică a pielii normale numărul celulelor Langerhans (celulă epidermică, macrofagică, LC) din epiderm crește dramatic. Descoperirea că LC se acumuleaza în aria traumatizată nu este surprinzătoare, de vreme ce LC sunt specializate în prezentarea de antigen. Într-un articol, intitulat "Immunology today" (1997), autoarea, Vera B. Morhenn, arată că LC poate provoca vindecarea psoriazisului via producție de NO și EGF (Epidermal Growth Factor), sugerând că aceste două substanțe reglează refacerea normală a pielii, această reglare, normală, fiind legată de o coordonarea precisă a sintezei celor două substanțe. Din contră, dereglarea acestei coordonări poate genera psoriazisul. LC activate pot sintetiza NO sub acțiunea NO-sintetazei din L-Arg. NO stimulează GC (guanilat-ciclaza), enzimă pe care o găsim în multe tipuri de celule, incluzând keratinocitul (KC), promovând sinteza de GMPc, considerat a fi un potențial mitogen pentru keratinocit. Prin contrast inhibitorii calmodulinei, cofactori ai NOS, s-a arătat că inhibă proliferarea KC. În leziune, NO cauzează dilatația vaselor de sânge, inhibă agregarea plachetară și scade recrutarea celulelor T, acestea reprezentând caracteritici ale plăcilor psoriazice.

Membranele macrofagice conțin P2, purinoreceptori, care reglează producția de NOi. Acești receptori pot de asemeni mobiliza Ca2 , important ion în reglarea creșterii și diferențierii KC.

Este știut faptul că mecanismul de bază al fenotipului anormal din leziunile psoriazice este hiperproliferarea keratinocitară. S-a presupus ipoteza ca în KC din peretele epidermic să existe unități proliferatoare, compromițând LC localizată în preajma păturii celulare bazale, proliferatoare, și că KC stem stau în centrul acestor unități. În piele, LC sunt înconjurate de 20 de KC. Astfel că, activarea unui LC s-ar putea produce prin acțiunea mai multor KC. KC sintetizează NOS, în care este reglată intracelular de Ca2. KC este de origine ectodermală și, în comun cu celulele nervoase, posedă un receptor NMDA (N-metil-D-aspartat) pe suprafața lor. Activarea NMDA de către glutamat poate crește concentrația intracelulară a Ca2 . KC conține NOSi care poate fi activat de către IFN și IGFI (Insulin like Growth Factor I). Comparativ cu NOSc, NOSi sintetizează o cantitate mai mare de NO, pentru o perioadă mai mare de timp. Este posibil ca LC, secretoare de NO, să activeze KC, și apoi ,aceste KC pot menține și crește producția de NO din aria lezată. KC activate și proliferânde exprimă 1-integrine. S-a demonstrat prin intermediul modelelor transgenice că epidermul conținând KC cu 1-integrine constitutive suprabazale exprimate, constituie un fenotip tipic psoriazic. Astfel în pielea umană expresia 1-integrinelor în KC poate menține eflorescența psoriazică.

După lezarea pielii, este de primă importanță ca reepitelizarea suprafeței denudate să se realizeze. Macrofagele activate pot produce EGF, un stimulator potent al mitozelor KC. KC poate de asemenei sintetiza liganzi pentru receptorii EGF, precum TGF- (Transforming Growth Factor) și amphyregulin. Prinderea receptorilor EGF-like de receptorii EGF de pe suprafața KC declanșează proliferarea KC printr-un mecanism care are la bază forforilarea tirozinei. Prinderea ligandului determină internalizarea și distrucția complexului receptor-ligand,iar celula devine insensibilă la activarea mai departe la EGF. La indivizii psoriazici, KC suprabazale, proliferatoare ,continuă să exprime receptori la EGF și se pare că stimularea la EGF a KC nu este inhibată adecvat. La indivizii normali, efectele NO și EGF sunt mutual antagoniste; astfel acumularea de NO inhibă acțiunea de EGF și în schimb EGF supresează producția de NO din KC. Acest antagonism duce la întreruperea proliferarii leziunii. În contrast, în pielea psoriazică, KC nu sintetizează suficient NO pentru a inhiba proliferarea mediată de EGF a KC, cu rezultatul că celula continuă să se dezvolte. Aceasta ar trebui să ducă la o rată constantă scăzută a regenerării epidermice și poate explica prevalența genelor psoriazice în populația generală. În alternativă și mult mai verosimil în viziunea recentelor descoperiri, LC psoriazice ar sintetiza constant nivele scăzute de NO, ducând la mitoze ale KC învecinate, prin generare de GMPc . Aceasta duce la dezvoltarea de plăci scuamoase.

Un studiu efectuat în Turcia (1997), privind relația existentă între producția de NO și psoriazis a avut ca obiectiv măsurarea metaboliților radicalilor NO, nitrit și nitrat, în plasmă sau ser (sunt cel mai ades utilizați ca markeri ai producției de NO. S-a utilizat un lot de 17 pacienți cuprinzând 11 bărbați (18-63 ani) și 6 femei (21-55 de ani), diagnosticați cu psoriazis. Au fost evaluați în timpul perioadei acute și în perioada de remisiune. Probele de sânge recoltate au fost ținute la 70C. Nivelurile nitraților au fost măsurate după conversia enzimatică cu NO-reductază:

NO NITRAT

Nivelul de nitrat în perioada activă a fost găsit mărit față de perioada inactivă a bolii. Multe alte studii arată că nivelurile de NO ridicate se corelează cu procesul inflamator, creșterea producției de NO poate avea o funcție biologică relevantă pentru patogenia psoriazisului. NO produs poate fi considerat un factor predictiv pentru psoriazis.

2 Infecțiile constituie un trigger pentru debutul sau exacerbarea psoriazisului. Copiii prezintă debutul psoriazisului după infecții recunoscute clinic, mai ales infecții ale tractului respirator superior. La circa 54% din copii, exacerbările unui psoriazis preexistent apar la aproximativ 2-3 săptămâni după o infecție streptococică (faringo-amigdaliană). La persoanele în vârstă, cu constipație rebelă, psoriazisul cronic, în plăci, poate fi menținut de o floră intestinală (candida, enterococ, Escherichia Coli, etc.

Grupul streptococilor și enterotoxina stafilococică B poate induce NO cel puțin în macrofage și, posibil în LC. Aceasta poate explica frecventa declanșare a psoriazisului după infecții streptococice. Mai mult, IFN în prezența unor LPS (lipopolizaharide), IL-1 sau TNF- poate deasemeni induce sinteza NO în LC. În final, macrofagele sintetizatoare de NO își autoinhibă producția. Astfel, feed-back-ul pozitiv și negativ pentru sintezele NO pare să existe în pielea indivizilor normali cât și în pielea indivizilor psoriazici; una sau alta din revenirile de feed-back prezintă probabil o deficiență.

3 Factori psihogenici. Studiile clinice susțin ideea că psoriazisul se exacerbează după stress psihic, în 30-40% din cazuri. La copii, acest procent poate ajunge la 90%, este posibil ca stress-ul psihic să declanșeze un puseu de psoriazis printr-o evidentă afectare a sistemului imun celular al individului sau poate și printr-o capacitate redusă de a urma un tratament corect.

4 Consumul de alcool prezintă efecte adverse nete în psoriazis. Această afirmație se bazează pe observațiile efectuate pe alcoolicii care au psoriazis. Ei vor prezenta rush-uri acute ale bolii atunci când vor începe să consume băuturi tari. Totuși se pare că alcoolul nu exacerbează direct afecțiunea, ținând cont de diferențele mari în consumul său între cele două sexe. Este posibil ca un consum excesiv de alcool să ducă la o reducere a complianței terapeutice și de asemenea să constituie un simptom de stress cauzat de boala severă cutanată.

5 Regiunile anatomice. Anumite regiuni anatomice sunt mai susceptibile de a dezvolta psoriazis decât altele. Astfel, cel mai frecvent afectate sunt scalpul, coatele și genunchi. Motivele sunt necunoscute, dar probabil frecarea și scărpinarea continuă constituie un factor favorizant posibil. De altfel ratele de proliferare a epidermului coatelor și genunchilor, comparativ cu pielea adiacentă sunt mai mari. În mod similar, rata de proliferare a epidermului interfolicular a scalpului, este mărită de circa 3 ori față de restul pielii. S-a considerat, de altfel că psoriazisul ar fi o boală în care inhibitorii proliferării epidermice sunt deficienți. De aceea, zonele cu niveluri crescute, inerent, ale proliferării epidermice, ar fi supuse mai mult exprimării bolii

6 Factori endocrini. O serie întreagă de raportări arată vârfuri de incidență a psoriazisului la pubertate și la menopauză. La gravide psoriazisul rămâne neafectat în 40% din cazuri, se îmbunătățește în 40% din cazuri, și se înrăutățește la numai 15% dintre acestea. În contrast, în primele trei luni postpartum, circa 30% rămân neschimbate, 10% se îmbunătățesc și 50% se deteriorează. Psoriazisul pustulos generalizat poate fi provocat de sarcină, se poate exacerba premenstrual și poate fi provocat de dozele mari în terapia estrogenică. Relația dintre psoriazis și diabet zaharat este evidentă: circa 8-9% din cei cu psoriazis prezintă această afecțiune.

7 Factori metabolici. Hipocalcemia (de exemplu după paratiroidectomie accidentală) și dializă pot precipita psoriazisul.

8 Lumina solară este în general benefică la pacienții cu psoriazis. Totuși, o proporție mică de pacienți suferă din cauza luminii solare puternice, ei agravându-și psoriazisul (acționează ca și un fenomen Koebner). Prevalența fotosensibilității în psoriazis este apreciată aproximativ circa 5,5%, procent mult mai mic decât cel găsit în studiile anterioare. Circa 40% din pacienții fotosensibili prezintă o anamneză de erupție polimorfă la lumină, cu exacerbare secundară a psoriazisului.

9 Medicamentele. Recunoscute sunt administrarea de litiu, agenți blocanți -adrenergici și antimalarice ca și întreruperea bruscă a corticosteroizilor administrați sistemic. Oprirea bruscă a acestora din urmă, ca și a steroizilor topici potenți (clobetazol prorionat) este asociată în mod particular cu psoriazis pustulos generalizat. Raportări izolate arată exacerbări psoriazice datorate clonidinei, iodurii de potasiu, amiodaronei, digoxinului, trazodonului (antidepresiv), gemfibrozilului (hipolipemiant), penicilinei și terfenadinei. O posibilă exacerbare a leziunilor cutanate apare la cei cu artropatie, care folosesc AINS, în special indometacin. Psoriazisul ar mai putea fi precipitat de fenilbutazonă, diclofenac, ibuprofen. Se pare totuși că AINS nu prezintă efect advers direct asupra psoriazisului.

10 SIDA. Asocierea dintre psoriazisul sever și infecția HIV apare din ce în ce mai pregnantă în ultimul timp. Într-un studiu efectuat pe 13 pacienți cu HIV și psoriazis, urmăriți pe o perioadă de 2,5 ani, psoriazisul a evoluat sever sau a apărut de novo în formă explozivă, ca rezutat al infecției HIV dezvoltate. Prognosticul AIDS la pacienți cu psoriazis este prost, 9 din cei 13 pacienți urmăriți decedând în cei 2,5 ani de studiu.

O declanșare a eflorescenței psoriazice survine devreme la bolnavii sidatici. În plus, este știut că LC exprimă CD4, care este un ligand al HIV, și că HIV-ul poate infecta LC. Mai mult, gp120 a HIV-ului este știut că stimulează producția macrofagică de NO. Astfel, este posibil ca infecția LC în infecția cu HIV să ducă la activarea LC în epiderm , rezultind eliberarea de citokine și alți mediatori (NO și EGF) din aceste celule. Aceste substanțe vor iniția mai departe procesul patogenic din psoriazis.

Mecanismul agravării psoriazisului la acești pacienți nu este cert. Cunoștințele noastre că psoriazisul poate fi agravat de SIDA (boală în care celula T-helper este ținta majoră) și evidența că psoriazisul poate fi mult îmbunătățit de ciclosporină (care inhibă funcția celulară T-helper) creează un paradox ce rămâne a fi explicat.

2.4. Aspecte clinice

2.4.1.Simptomatologie.

Leziunile de psoriazis vulgar pot afecta pielea glabră, pielea păroasă a scalpului, fanerele și uneori mucoasele.

I. Psoriazisul vulgar

a) psoriazisul pielii glabre;

Leziunile au următoarele caracteristici:

– sunt eritematoase. Eritemul este produs de vascularizația și de fluxul crescut la nivel subepidermic. Aceasta poate fi obiectivată prin gratarea metodică a scuamelor: la desprinderea ultimului strat se produce o mică hemoragie punctiformă, datorită deschiderii mănunchiului de capilare din vârful papilelor dermice (semnul Auspitz sau "roua sângerândă");

– sunt acoperite de scuame sidefii , groase, lamelare, ușor detașabile. Acestea sunt rezultatulul hiperproliferării epidermului și a keratinizării sale incomplete. Gratarea scuamelor produce dâre albicioase, pulverulente datorită pătrunderii aerului între straturile scuamelor (semnul spermanțetului);

– sunt foarte bine delimitate și supradenivelate, expresie a hipertrofiei papilelor dermice și a epidermului.

Forme clinice ale psoriazisului pielii glabre.

– psoriazis eruptiv;

– psoriazis stabil, cronic (rupioid, elefantin, ostreaceu);

– psoriazis instabil.

b) psoriazisul scalpului

Poate îmbrăca aspect de plăci eritemato-scuamoase, circumscrise sau poate fi difuz, cu afectarea întregii calote. Părul este indemn macroscopic, microscopic se constată anomalii ale tijei firului de păr. Leziunile sunt de obicei net limitate la interlinia păroasă.

c) psoriazisul unghiilor

Însoțește de regulă psoriazisul artropatic. Leziunile constau în hipercheratoză subunghială, depresiuni punctiforme ale lamei unghiale, onicoliză, colorație gălbuie a lamei unchiale, șanț transversal (linia Beau).

d) psoriazisul mucoaselor

Afectarea mucoasă este mai rară, se manifestă prin leziuni ale glandului sau ale cavității bucale.

II. Psoriazisul eritrodermic.

Este definit ca psoriazisul care afectează tegumentele în totalitatea lor. Bolnavul este febril cu stare generală alterată, tegumentele sunt în totalitate eritematoase, scuamoase, infiltrate și uneori exudative. Asociat apar modificări unghiale severe și alopecie difuză. Pacienții pot prezenta limfadenopatie dermopatică și prurit intens. Evoluția este prelungită cu recăderi frecvente.

III. Psoriazisul pustulos.

Apar pustule macroscopice, substratul lor histopatologic fiind acumulările de netrofile în epiderm (pustula spongiformă Kogoj).

2.4.2. Clasificarea formelor clinice de psoriazis

I. Psoriazis vulgar

II. Psoriazis eritrodermic

III. Psoriazis pustulos

a) forme localizate:

– cronic palmoplantar (Barber)

– acut palmoplantar

– acrodermatitis continua (Hallopeau)

b) forme generalizate:

– acut (von Zumbusch)

– de sarcină (Hebra)

– circinat și inelar (Bloch-Lapiére)

IV. Psoriazis artropatic

2.5. Patogenia psoriazisului

Cercetarea în domeniul geneticii moleculare arată că această afecțiune este în continuare dificil de studiat și din cauza faptului că moștenirea poate fi multifactorială în unele familii, în timp ce în altele este aparent nemoștenită.

Trăsăturile patologice principale ale leziunilor psoriazice includ proliferarea anarhică a pielii, dilatația vasculară superficială ca și infiltrarea leziunilor cu PMN neutrofile, limfocite și monocite, macrofage. Există un consens în acceptarea faptului că fenomenele inflamatorii preced proliferarea epidemică. Pielea aparent normală a celor cu psoriazis conține un număr relativ crescut de limfocite T față de pielea indivizilor normali. Alte studii sugerează degranularea mastocitelor asociată cu edem și separarea celulelor endoteliale ca fiind evenimentele primare, cel puțin în psoriazisul guttat acut. Ulterior au fost observate infiltrate cu macrofage, aceste celule fiind văzute apoi și în pătura keratinocitară bazală. Se eliberează numeroase substanțe biologic active. Studiile efectuate pot identifica noi ținte pentru tratamentul medicamentos, ținând cont de rolul exercitat de aceste substanțe eliberate

1 Membrana celulară în psoriazis, în special membrana keratinocitară, are un rol patogenic important. Aceste celule sunt în mod particular active în schimburile de semnale intercelulare, secretând și răspunzând la o serie de factori. Importanța membranei celulare în transducerea semnalului a dat naștere la o serie de ipoteze legate de membrană, privind etiologia psoriazisului. Ele includ atât ipoteze bazate pe receptorii citokinelor, anomalii în mecanismul însuși de transducere a semnalului, defecte în structura sau chimia membranei ca și în prezentarea antigenelor. S-a constatat o scădere a numărului de desmozomi, precum și apariția unui număr crescut de microvili pe keratinocitele psoriazice. Mai importante par modificările ultrastructurale ale desmozomilor. Ei par a fi asociați cu filamente intermediare, fapt ce poate fi legat de modificările cunoscute ale keratinei în psoriazis. În această afecțiune există defecte de glicozilare a suprafeței celulare.

2 Rolul EGF (și a altor factori de creștere) în psoriazias.

EGF și TGF se leagă de același receptor membranar. Ei afectează keratinocitele în cultură mai ales prin creșterea ratei de migrare a lor (deci stimulează indirect creșterea). Prin creșterea ratei de migrare, EGF crește numărul de celule în diviziune, ceea ce la rândul ei, mărește rata de creștere, timpul de viață în cultură și abilitatea de a iniția noi colonii. Alți factori peptidici care au rol în proliferarea keratinocitară sunt: TGF, insulina, IGF I și II, IL1, IL6, PDGF, FGF-a, FGF-b (stimulatori) și TGF1, TGF2, IFN, IFN1, IFN2, IFN și TNF (inhibitori). Legendă: PDGF Plateled Derived Growth Factor; TGF Transforming Growth Factor; FGF Fibroblast Growth Factor

3 Eicosanoizii. Acidul arahidonic (AA) derivă din surse dietetice dar poate fi produs și prin desaturarea acidului linoleic. În psoriazis s-a observat scăderea metaboliților acidului linoleic: EPA (acid eicosapentoic) și GLA (acidul -linoleic), arătând apariția unor dezordini în metabolismul acizilor grași, legate probabil de un blocaj la nivelul metabolizării acizilor grași esențiali. De aceea se recomandă în dietă un supliment de uleiuri cum sunt uleiul de pește (peștele prin prăjire pierde acizii grași esențiali), uleiul din semințele de in și alte uleiuri naturale extrase din plante precum Borago officinalis (limba mielului) sau Primula officinalis (ciuboțica cucului). Aceste ultime două uleiuri conțin o concentrație ridicată de acid -linoleic (GLA).

Pielea nu poate sintetiza local AA, dar el provine din surse endogene cum ar fi ficatul. El este depozitat în membrana celulară sub forma de fosfolipide. Eliberarea (sau dezesterificarea sa) constituie o etapă limitativă pentru degradarea sa oxidativă ulterioară. Această etapă este catalizată de PLA2 și PLC. În cazul PLA2 se eliberează direct AA, dar în cazul PLC se vor produce din fosfoinozitol, DAG (diacil glicerol) și IP3 (inozitol trifosfat), după care DAG se degradează în glicerol și acizi grași liberi, inclusiv AA. Odată eliberat din fosfolipide, AA suferă transformări enzimatice prin diferite căi.

În psoriazis AA liber este prezent în concentrații foarte mari la nivelul pielii implicate. De asemenea sunt crescute activitățile PLA2 și PLC. În placa psoriazică activitatea inhibitorie asupra PLA2 este scăzută , întrucât, lipocortina, principala enzimă ce reglează activitatea PLA2, își pierde proprietățile inhibitorii după fosforilare. Deși nivelurile unor eicosanoizi sunt crescute în țesutul implicat, existența AA liber, singurul factor limitant în cascada AA, sugerează că mecanismele de control post arahidonic operează în pielea psoriazică. În pielea afectată sunt prezente cantități crescute de eicosanoizi activi produși ai căilor 5,12 și 15 ale lipoxigenazei.

4 Tulburarea funcției PMN. PMN constituie elementele celulare cele mai reprezentative din infiltratul epidermic ce caracterizează psoriazisul. Leziunile precoce și active sunt caracterizate prin penetrarea intraepidermică a PMN ducând la apariția de microabcese Munro, iar în cazurile severe la pustulizare, sterilă, aparentă clinic.

PMN eliberate în compartimentul vascular periferic supraviețuiesc în mod normal 8 ore. Au următoarele activități funcționale: proliferare, maturare, marginație, aderență de endoteliu, dermotactism, fagociotoză, degranulare și distrugere intercelulară.

În psoriazis există o serie de anomalii legate de aceste funcții ale neutrofilului. Anomaliile nu par a fi de natură intrinsecă ci numai induse din afara lor. După extravazare au loc interferențe cu pielea prin eliberarea proteinazelor, a mediatorilor inflamației și a speciilor intermediare de oxigen. Proliferarea, maturarea și desfășurarea par să nu fie deosebit de afectate în psoriazis, în schimb numărul PMN este crescut la pacienții cu psoriazis netratat. Chemotactismul PMN spre plăcile de psoriazis pare a fi dictat de activitatea procesului inflamator: Valori scăzute la cei cu plăci cronice, stabile și valori crescute la cei cu leziuni active. Extinderea leziunilor psoiriazice nu pare a fi corelată cu chemotaxia PMN.

Procesul de atașare endotelială necesită alterarea suprafeței endoteliale ca și o alterare a suprafeței PMN înainte de atașare. Se constată că aderența PMN la cei cu psoriazis este mult crescută față de normal: dacă cei cu o boală minimă au valori aproape normale ale aderenței, cei cu o boală moderată sau extensivă, prezintă valori semnificativ crescute. PMN din sângele periferic se află în număr mult mai mare decât la persoanele sănătoase (fără creștera numărului de limfocite și de monocite).

PMN se acumulează în epiderm formând așa numitele micropustule ale lui Kogoj. Înainte de a invada epidermul, keratinocitele vor prezenta un halou perinuclear și vor forma o rețea spongiformă. Ulterior, PMN vor prezenta un aspect picnotic, fragmentat cu acumulare în stratul cornos (microabcesele Munro). Acumularea PMN în psoriazis este abundentă într-o fază precoce a bolii; în leziunea cronică se remarcă o heterogenitate topografică, cu acumulare maximă în zona de margine. Se pare că acumularea de leucocite mononucleare precede invazia de PMN în leziunea psoriazică, ceea ce arată că PMN nu este un inițiator, ci mai degrabă o interfază în patogeneza psoriazisului. Infiltrarea cu PMN nu este secundară proliferării epidermice, ea survenind chiar înaintea modificărilor epidermice vizibile. Așadar, prolferarea epidermică și keratinizarea anormală apar după inițierea inflamației.

Migrarea PMN prin piele este modulată de o varietate de terapii antipsoriazice. Astfel, corticosteroizii, antralinul, terapiile PUVA și UVB, MTX și retinoizii, au în comun inhibarea migrării PMN prin piele. Ciclosporina A este eficientă în tratamentul psoriazisului nu prin interferarea cu funcțiile PMN, ci prin modularea limfocitelor T activate.

În concluzie, putem spune că migrarea PMN spre epiderm constituie o adevărată placă turnantă în patogeneza psoriazisului. Tratamentele care modulează migrarea transdermică sau transepidermică a PMN ar putea avea implicații importante pentru psoriazis.

În ultimii ani s-a acordat o mare atenție factorilor eliberați în timpul procesului de activare a neutrofilului, în ideea că aceștia contribuie la dezvoltarea procesului inflamator și deci la generarea psoriazisului. O ipoteză recentă este aceea că RL de O2 ar putea juca un rol în injuria tisulară. Superoxidul (O2 -) este produs ca intermediar puternic reactiv printr-o reducere electronică a O2-lui molecular, printr-un sistem enzimatic de membrană ce include oxidarea cuplată a NADPH și NADP.

Neutrofilele pot genera superoxid în spațiul extracelular în timpul fagocitozei. O2 – extracelular va acționa direct asupra unor componente tisulare și indirect, prin formarea unor oxidanți potenți: H2O2, OH, oxigen singlet. Aceștia cresc distrugerea tisulară și au activitate bactericidă. O2 – poate distruge eritrocitele și generează în ser substanțe chemotactice, derivate din lipide, ceea ce va duce la atracția unor noi neutrofile în locurile inflamației. Ca o concluzie, mecanismele oxidative joacă un rol important în recrutarea de neutrofile adiționale în leziunile cutanate ca și în leziunile tisulare care pot rezulta.

În momentul activării neutrofilului, granulele lizozomale fuzionează prin fagozomi, formând fagolizomi, aceștia la rândul lor fuzionând cu suprafața celulară, eliberând conținutul lor în spațiul extracelular. Se poate spune că toate atributele funcționale ale PMN sunt denaturate în procesul psoriazic.

Aceste alterări nu sunt intrinseci, ci induse de mediu, după cum am mai spus. Ele sunt, invariabil, în direcția participării și activării crescute ale acestor celule. Blocarea funcției acestora de către anumite medicamente ar putea fi în beneficiul pacientului. Astfel, metodele cunoscute de tratament PUVA, anthralin, retinoizi și steroizi topici potenți, își exercită efectul de mediu direct pe celulele epidemice, dar și pe chemoatracția PMN.

5 Anomaliile keratinocitului psoriazic. Rolul keratinocitului în dezvoltarea psoriazisului, specificitatea anomaliilor acestuia pentru psoriazis, interacțiunile epidermului cu celulele mezenchimale, imune, inflamatorii și factorii de mediu sunt printre cele mai semnificative aspecte ale acestei boli. Se știe că în psoriazis țesutul țintă primar este epidermul. Investigațiile au demonstrat că dereglarea căilor metabolice epidermice includ producerea de factori de creștere, transducerea semnalului și activarea enzimatică. Totuși, la evoluția leziunii psoriazice contribuie foarte mult și factorii genetici, imuni, inflamatori și cei dermici.

Așadar, keratinocitul epidermic este țesutul țintă principal al evenimentelor activatoare, biochimice și moleculare ce pot fi inițiate sau reglate în epiderm, prin sistemul imun, inflamator și dermul subiacent. În prezent există metode noi de biologie moleculară ce detectează ARNm specifici, reprezentativi pentru un fenotip celular particular într-o varietate de țesuturi și celule, demonstrând expresia genică "ectopică", specifică de țesut. Expresia fenotipului psoriazic este, astfel, dictată de activarea genei aberante sau dereglate. Keratinocitul psoriazic pare să fie modulat atât de factori inhibitori, cât și stimulatori (inițiatori).

6 Celulele Langerhans. Studii imunocistochimice, cu anticorpi monoclonali, demostrează scăderea acestora de 3-5 ori în leziunile acantotice din psoriazisul cronic. Ele sunt diatribuite neregulat în epidermul lezional, apărând adesea agregate în cuiburi mici, situate cel mai frecvent în vecinătatea foliculilor piloși și deasupra papilelor dermice alungite. Ele apar mai puțin dendritice, cu excepția celor dispuse în periferia plăcilor de psoriazis (în zona de extensie a acestora). În aceste plăci a fost demonstrată, ultrastructural, apoziția celulă la celulă, între celulele Langerhans și limfocite. Aceste interacțiuni au fost observate mai ales în leziunile active netratate (în mod excepțional în regiunile de extensie). Aceste celule sunt prezentatoare de antigen.

Alte celule implicate sunt: fibroblaștii, monocitele, celulele endoteliale.

7 Mastocitele par să aibă un rol important în leziunea precoce de psoriazis. De altfel, leziunile precoce cuprind degranularea mastocitelor și alterări ("endothelial cell gaps") ale venulelor postcapilare cu hipertrofie endotelială și implicarea epidermului ce capătă zone spongiotice punctiforme. Factorii eliberați prin degranularea mastocitelor pot fi responsabili de proliferarea celulelor endoteliale microvasculare. Histamina pare a fi un factor de creștere endotelială.

8 Enzimele (sistemul protează-antiprotează). Proteazele au activitate crescută în leziunile psoriazice. Enzimele care intervin în degradarea proteinelor sunt: serin-proteazele (de prim interes în psoriazis, includ factorii de coagulare și factori ai complementului), cistein-proteinazele (necesită factori ionici metalici pentru activarea catalitică în epidermul psoriazic). Unul dintre cele mai serioase evenimente enzimatice este creșterea nivelului de plasminogen, activatorul serin-proteazelor în plăcile psoriazice.

Plasminogen-activatorul reprezintă o enzimă cu niveluri crescute în numeroase situații în care apare transformarea și activarea celulară. Și în cazul psoriazisului, activitatea bolii poate fi corelată cu creșterile în activitatea specifică a plasminogen-activatorului, constituind un bun marker al activității nucleare în această boală. Alterările metabolismului proteinazelor sunt intrinseci pielii și nu depind de factorii circulanți.

9 Nucleotizii ciclici. Un defect al cascadei AMPc poate explica trei caracteristici: proliferarea crescută a stratului bazal, creșterea conținutului de glicogen în stratul malpighian și scăderea diferențierii celulare în porțiunea externă a epidermului psoriazic. AMPc are activitate scăzută în psoriazis. Cum activitatea adenilat-ciclazei este normală, probabil că răspunsul scăzut se datorează unui defect al receptorului celular de suprafață.

Într-o serie de studii ultrastructurale s-a arătat că suprafața celulară în ansamblu are o abilitate redusă de a răspunde la stimuli externi, probabil prin reducerea marcată a glicocalixului suprafeței celulei psoriazice, în comparație cu celulele epidermice normale. Un alt defect al straturilor celulare profunde este scăderea locurilor de joncțiune prin care AMPc trece de la o celulă la alta. Acesta ar putea fi motivul pentru scăderea efectului AMPc în compartimentul epidermic proliferativ. Litiul, propranololul inhibă adenilat-ciclaza, scad AMPc și agravează psoriazisul. Inhibitorii de fosfodiesterază (enzimă care dezactivează AMPc), aplicările topice de -agoniști îmbunătățesc evoluția psoriazisului.

Așadar, psoriazisul este o boală cutanată cu un defect genetic sau dobândit de autoreglare a homeostaziei epidermice, ce duce la deficiențe ale frânării proliferării celulare la nivelul întregii suprafețe dermice.

GMPc este crescut în epidermul psoriazic. Activitatea guanilat-ciclazei este crescută de trei ori față de valorile normale în epiteliul psoriazic. GMPc se pare că are un rol mai degrabă în diferențierea celulară, decât în proliferarea celulară.

10 Interleukinele. IL1 prezintă un inters deosebit în psoriazis, datorită calității sale de a stimula producerea de citokine chemotactice și de induce moleculele de adeziune a leucocitelor la nivelul celulelor endoteliale, cum ar fi ELAM-1 (endothelial leucocyte adhesion molecule 1), VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule 1) și ICAM-1. Ele răspund parțial de infiltrația PMN în leziunile psoriazice. IL-1 poate induce, uneori, proliferarea keratinocitară directă.

În contrast cu IL-1, IL-6, mediator major al răspunsului gazdei la injurie și infecție, și IL-8, un potent chemoatractant pentru limfocitele T și neutrofile, sunt prezente în cantități mari în epidermul psoriazic.

11 Microcirculația. Ansele capilare în dermul papilar al leziunilor psoriazice devin dilatate și tortuoase înainte ca hiperplazia epidermică să fie detectată morfologic. Fluxul sangvin este crescut de două ori față de normal. Lacunele intercelulare endoteliale, prezente în ansele capilare și venulele postcapilare, din fluxurile superficiale, constituie o bază morfologică excelentă pentru urmărirea fenomenului de exudație – transvazare a neutrofilelor, trecerea anticorpilor spre stratul cornos , fenomene care vor fi urmate de hiperplazia epidermică.

Ca o concluzie, se poate spune că vascularizația este mai mult modulatoare decât inițiatoare a procesului psoriazic, iar încercările terapeutice în această direcție ar putea aduce beneficii evidente în evoluția bolii.

11 Poliaminele. Putresceina, spermidina și spermina sunt amine implicate în sinteza de ADN și proliferarea celulară în toate sistemele în care reînnoirea celulară este mare. Enzima care limitează sinteza poliaminelor este ornitindecarboxilaza (ODC)

3. Tratamentul psoriazisului

Alegerea metodei terapeutice depinde de: vârstă, sex, starea generală și afecțiunile asociate pe care le prezintă pacientul, tipul și extinderea leziunilor.

Măsuri generale nespecifice sunt: echilibrarea stării generale, repaus și medicație anxiolitică. Dieta nu pare importantă (ipotezele care susțineau rolul benefic al dietei cu Zn și săracă în triptofan, proteine și calorii nu au fost confirmate).

3.1.Tratamentul topic.

Leziunile de psoriazis stabil pot fi controlate cu tratament exclusiv local. Principalele medicamente utilizate sunt:

1 Keratolitice. Aplicarea lor are drept scop îndepărtarea scuamelor și favorizarea penetrării medicației active antipsoriazice. Cele mai utilizate sunt: acidul salicilic (3-5%) și ureea (15-25%), înglobate într-un vehicul adaptat zonei afectate (unguent, cremă).

2 Cignolin (anthralin). Are acțiune antimitotică care se exercită prin următoarele mecanisme: legarea de acizii nucleici, inhibarea încorporării uridinei în ARN și a sintezei de ADN și ARN, deprimarea catenei respiratorii celulare.

3 Gudroanele naturale (vegetale sau din cărbune). În concentrații de 2-10% pot fi utilizate singure sau asociate cu UVB (regimul Goeckerman). Sunt asemănătoare ca structură și mecanism de acțiune cu anthralinul.

4 Dermatocorticoizii. Au acțiune antiinflamatorie, citostatică și de inhibare a PLA2, se folosesc în medicație unică sau asociați cu keratolitice și/sau gudroane.

5 Retinoizii. Acidul retinoic este util în psoriazisul feței în concentrații mai mici decât cele folosite în acnee. Recent a fost lansat Tazarotenul (gel 0,01-0,1%) al cărui efect terapeutic se menține și după oprirea administrării contribuind la inducerea unor perioade mai lungi de remisiune.

6 Analogii vitaminei D3. Calcipotriolul și tacalcitolul acționează prin stimularea diferențierii și inhibarea proliferării keratinocitare și, probabil, prin reducerea activității limfocitelor T. Sunt bine tolerați și au efecte adverse minime, deoarece influiența lor asupra metabolismului fosfocalcic este redusă (de 100 de ori mai mică decât cea a vitaminei D3).

7 Fototerapia naturală sau artificială. Efectul ei benefic se datorează inhibării sintezei de ADN din epidermul psoriazic de către ultraviolete. Climato-terapia (cura helio-marină) este utilă în unele cazuri.

8 Terapia fotodinamică. Este o nouă metodă de tratament experimentată la început în Germania, care se bazează pe acțiunea unor substanțe fotosensibilizante. Acestea în prezența unor radiații din spectrul luminos trec din starea fundamentală în stare electronică excitată și interacționează cu diverse substraturi biologice. În prezența O2 -ului formează RL, mai ales oxigen singlet (1O2). Efectul final este fototoxic și depinde de natura substratului biologic afectat: proteine, membrane celulare sau acizi nucleici.

Studii recente (1998) efectuate în Vencouver, Canada, evaluează efectele terapiei fotodinamice utilizând ca substanță fotosensibilizantă porfirina pentru tratamentul plăcilor stabile de psoriazis cronic, carcinoame primare cutanate sau metastaze cutanate. Se încearcă obținerea unor generații noi de porfirine care să producă mai puține efecte secundare, prin limitarea generalizării la nivelul pielii a efectului de fotosensibilizare. Ca surse de lumină s-au folosit:

– LASERUL. Ca sursă primară de activare a porfirinelor, laserul prezintă avantaje prin faptul că este o sursă monocromatică, coerentă, fascicolul de unde este paralel, permițând o focalizare precisă a razelor, este intens, permițând un tratament de scurtă durată.

– LEDs (Light Emitting Diodes) și sursele fluorescente. Sunt utilizate ca alternative mai convenabile decât laserul, dar cu o durată mai lungă de tratament.

Porfirinele pot fi injectate i.v. sau se aplică în tratamente topice.

9 Fotochimioterapia (PUVA). Se bazează pe asocierea UVA cu psoraleni (8-metoxipsoralen, 5-metoxipsoralen sau trimetil-psoralen). Aceștia, sub acțiunea UV, formează legături stabile între bazele pirimidinice ale catenelor de

ADN și inhibă replicarea. Intervenția lor asupra celulelor Langerhans și a limfocitelor circulante are un efect imunosupresor local. Psoralenii pot fi administrați local sau sistemic (se utilizează doza de 0,6-1,2 mg/kg/zi, administrate cu două ore înaintea expunerii la UV).

3.2. Tratamentul sistemic

La baza tratamentului sistemic se află agenții citostatici. Aceștia își exercită acțiunea prin inhibarea sintezei acizilor nucleici, a proteinelor și nucleoproteinelor. Medicația citostatică este indicată la bolnavii cu forme severe de boală (eritrodermice, pustuloase, artropatice), la cei cu psoriazis vulgar extins, la cei la care tratamentul topic a eșuat și la cei care leziunile, chiar limitate, sunt invalidante din punct de vedere fizic, social sau emoțional. Cele mai folosite sunt:

1 Metotrexatul. Inhibă dihidrofolat reductaza, ceea ce conduce la scăderea sintezei timinei și implicit a sintezei de ADN. Cea mai utilizată schemă de tratament este administrarea săptămânală (15-25mg/săptămână, fracționat în trei prize la 12 ore interval). Principalele efecte adverse sunt: hematologice, hepatice și digestive. În caz de supradozaj se administrează acid folinic în cantitate egală cu cea de metotrexat.

2 Piritrixemul. Acționează similar metotrexatului, dar are toxicitate hepatică redusă.

3 Retinoizii. Cei mai utilizați sunt etetrinatul și acitretinul. acționează prin scăderea proliferării epidermice, a inflamției și a chemotactismului neutrofilelor și prin normalizarea procesului de keratinizare. Se pot utiliza singure sau în tratamente combinate cu PUVA (Re-PUVA) sau UVB (Re-UVB).

4 Ciclosporina. Acționează prin blocarea sintezei de IL2 și limfokine, având drept consecință reducerea proliferării epidermice, a numărului și activității celulelor inflamatorii, precum și a vasodilatației, față de alte citotoxice are avantajul absenței mielotoxicității, instalării rapide a răspunsului terapeutic și selectivității efectului imunosupresor.

5 Tacrolimus. Acționează prin inhibarea acțiunii limfocitelor T-helper și a expresiei citokinelor, într-o manieră similară cu cea a ciclosporinelor.

3.3. Repere actuale ale terapiei, naturale, antioxidante în psoriazis.

3.3.1. Pignogenolul. Termenii de pignogenoli, proantocianide, leucocianide, polimeri catehici sunt sinonimi. Acestea reprezintă substanțe naturale care se găsesc în concentrații ridicate în scoarța pinului de mare (plantă maritimă care crește de-a lungul coastei sud-vestice a Franței). Expertul american, Mark Blumenthal, directorul celui mai înalt for american în probleme de botanică (American Botanical Council), consideră că descoperirea pignogenolului readuce în prim plan medicinei, avantajele utilizării terapiilor naturale.

Tabletele de LIFE PLUS Proanthenols BIO-COMPLEX conțin minim 50mg proanthocianide din scoarța pinului de mare ("pine bark"), extracte de bioflavonoizi provenite din semințele de struguri, scoarță de stejar și citrice. Acest preparat este cel mai potent antioxidant cunoscut de om, de 50 de ori mai potent decât vitamina E și de 20 de ori mai potent decât vitamina C. Pignogenolul reprezintă un suport nutrițional pentru sistemul imun, protecția împotriva radicalilor liberi, protejează colagenul și previne îmbătrânirea (într-un articol publicat la 17 februarie 1998, doctorul Denhan Harman, din SUA, arată că acest produs crește speranța de viață de la 74,8 ani la 97,2 ani). Aceste substanțe pătrund în interiorul tuturor tipurilor de celule în special în celulele vaselor de sânge, în țesutul conjunctiv, la nivelul pielii, cu o afinitate deosebită pentru țesutul conținând colagen. Reduce stresul oxidativ în mai mult de 70 de boli corelate fiziopatologic cu producerea de radicali liberi (RL). Potențează efectele vitaminei C, protejează creierul și țesutul nervos, fiind singurul preparat antioxidant care posedă abilitatea de a depăși bariera hemato-encefalică, pătrunzând intraneuronal.

Profesorul David Fitzpatrick, de la Universitatea de Medicină din Florida, USA, clinician și profesor de farmacologie, confirmă rolul de protecție asupra vaselor de sânge, exercitate de acest produs, deasemeni, rolul în scăderea proceselor inflamatorii având la bază producerea de NO (1998).

Profesorul Laster Packer, de la Universitatea din Berckley, California, a studiat rolul pignogenolului în inhibarea genei care stă la baza sintezei de NO-sintetază, confirmând, și el, rolul de protecție asupra celulelor când concentrația NO devine periculoasă (1998).

Preparatul Pignogenol a fost testat extensiv la Institutul Pasteur, din Paris. Este un produs hidrosolubil cu o excelentă absorbție intestinală, netoxic, antimutagenic și rămâne activ la nivelul corpului timp de 72 de ore. Proprietățile sale ar putea fi sintetizate în următoarele puncte:

– antioxidant;

– antiinflamator;

– stabilizator al colagenului cu efecte deosebite la nivelul pielii și vaselor de sânge;

– previne îmbătrânirea, crește speranța de viață cu peste 20%.

3.3.2. Strugurii. Studii recente (1998), au arătat că strugurii și, în special, semințele din boabele de struguri, conțin polifenoli cu rol antioxidant. Laboratoarele Caudalie au creat un extract în alt concentrat de polifenoli din semințele de struguri, cu remarcabile proprietăți antioxidante.

Pornind de la acest extract s-a creat o gamă de produse cosmetice de întreținere având la bază proprietățile de protecție la nivelul pielii, asupra colagenului, elastinei și vaselor de sânge.

Cura de struguri și consumul de vin, cu moderație, pare să fie una din metodele cele mai reușite de detoxificare a pielii, a întregului organism și de menținere a tinereții acestora.

3.3.3. Seleniul. Seleniul are un rol important în tratarea cu succes a psoriazisului și alergiilor (studii 1998). Singur sau în combinație cu alți antioxidanți, Se este recunoscut astăzi ca fiind un AO cu rol de protecție a sistemului imun și a pielii la stresul modern, incluzând radiațiile și poluarea. În ultimii ani s-a constat scăderea concentrației de Se din surse naturale, fapt datorat poluării, în primul rând. Extinderea pe scară largă a terapiei cu Se s-a lovit de problema asimilării acestuia. Se pare că seleniu administrat sub forma comercială Se-drojdie (SUA) sau Ebselen, 2-fenil-1,2-benzoselenază-3-onă, (Germania) au primit acceptarea mai largă. Ebselenul are ca principal rol protecția acizilor grași polinesaturați (AGPN).

Preparatul BIO-seleniu reprezintă o sursă naturală de Se, cu un înalt grad de saturație, o formă solubilă cu o foarte bună absorbție intestinală. Sursa este reprezentată de un izvor din apropierea Mării Moarte ("Ein Bokek").

Efectele seleniului se datorează prezenței sale la nivelul centrului activ al GSH-Px, rolul lui exercitat în sinteza citocromului P450, ca o componentă a GSH-Px și nu numai. Sărurile de Se sunt conjugate cu GSH, circulând sub formă de disulfuri mixte, rolul acestora fiind de protecție a proteinelor în atacul radicalic asupra AGPN.

Cele mai mari cantități de seleniu se găsesc în orz, grâu, pâine, carne de vită și porc, ouă și orez.

CAPITOLUL II

PARTEA SPECIALĂ

1. Observații privind stresul oxidativ la nivel cutanat

Din cele expuse în partea generală a lucrării putem trage următoarele concluzii:

1) generarea de RL și alte specii reactive are loc "in vivo";

2) un sistem de apărare foarte evoluat are rolul de a limita și de a repara alterările chimice ale acestor specii reactive.

Când generarea de RL depășește capacitatea celulelor de a o contrabalansa condiția stresului oxidativ este îndeplinita. La nivelul pielii S.O. este indus prin trei mecanisme:

1 Fotoleziunea. Evident, cel mai important agent cu care pielea vine în contact, este soarele. Componenta UV are 290-400nm. Undele de 290nm fiind absorbite de ozonul atmosferic sunt acceptate ca fiind cele mai agresive din tot spectrul solar.Inainte s-a considerat că radiațiile UV n-au fost suficient de energice pentru a genera RL și că fără dovezi aceste specii nu pot fi invocate cauzatoare de leziuni prin fotosensibilizare. Acum este evident că speciile reactive de O2 sunt generate in vivo prin iradierea UV a pielii. Produșii peroxidării lipidice, radicalii lipidici, radicalii melaninici și depleția antioxidantă au fost toate observate în pielea iradiată cu UV. Formarea așa ziselor celule "arse de soare" ("msun burn cell"), markeri ai leziunilor epidermice la expunerea la UVB, pot fi moderate de scavengeri ai RL și de alte unde, cu lungime de undâ mai mare, UVA, efectele biologice fiind modulate de oxigen. În plus, o importantă și foarte reproductibilă descoperire este că iradierea UV a pielii duce la compromiterea apărării antioxidante. Activitățile enzimatice ale SOD, catalazei, GSH-Px scad și, de asemeni, antoxidanții lipidici solubili, de tipul vitaminei E sau ubiquinonelor, nivelul vitaminei C scad rapid după expunerea la UV.

Aceste schimbări, o dată în plus, contribuie la mărirea stresului oxidativ al pielii, prin scăderea nivelului bazal al antioxidanților, după alterările inițiale. Reacțiile de fotosensibilizare, oxigen-dependente, sunt deja cunoscute. Substanțele endogene fotosensibile includ porfirine, flavine, melanine, triptofanul și metaboliții săi. Reunind datele, rezultă că, direct sau indirect, soarele provoacă S.O. al pielii. Trei manifestări clinice ale leziunilor solare trebuie atribuite RL: cancerul pielii, fotodermatozele și îmbătrânirea. S-a demonstrat cu rigurozitate creșterea incidenței cancerului de piele (carcinomul cu celule bazale, epiteliomul bazocelular) de către radiațiile UV. S-a observat reducerea incidenței cancerului la oameni și la animale, în funcție de dieta bogată sau nu, în antioxidanți, tratamentul topic cu vitamina C și vitamina E. Un studiu recent a demonstrat legătura între formarea melanomului și expunerea la UVA, UVA fiind frecvent implicat în generarea de specii reactive de oxigen care induc cancerul nu numai via UV. Și alte substanțe pot produce RL de O2, precum forbol esterii sau peroxizii organici care s-a demonstrat că pot fi promotori de tumori ale pielii.

Dovezi pentru implicarea RL în fotodermatoze rezultă din experimentele in vitro, reacția producătoare de oxidanți, indusă experimental, declanșând aceeași simptomatologie clinică care poate fi combătută prin terapie antioxidantă. Condiții asociate cu RL sunt porfiria, tratamentul PUVA, reacții fototoxice la droguri (diuretice tiazidice, anumite tetracicline).

În final, îmbătrânirea prin expunere la radiații se datorează în mare parte degradării colagenului la atacul radicalic. Pielea expusă la radiații UV prezintă un infiltrat leucocitar marcat, capabil cu siguranță de generare oxidantă și alterări cutanate în timp.

2 Inflamația;

Migrarea și continua recrutare de PMN-N și macrofage către anumite locuri din piele, duce la concluzia că există o influență indusă între țesutul lezat și RL derivați. Cum s-a discutat, aceste celule sangvine pot genera și elibera o gamă largă de specii reactive de O2. În plus, neutrofilele de la pacienții cu o varietate de boli inflamatorii, eliberează RL de O2 chiar dacă nu există o țintă rațională, reacționând nediscriminator cu gazda. Este bine știut că produșii neutrofilelor activate, O2 – și H2O2, pot distruge și degrada toate componentele țesutului conjunctiv, colagenul fiind extrem de susceptibil.

3 Fenomenul de ischemie-reperfuzie;

Se acceptă astăzi ca RL de O2 joacă un rol în leziunea de reperfuzie. În piele, leziunea de ischemie-reperfuzie, reprezintă o importantă sechelă, cu indicație pentru chirurgia de reconstrucție și transplant. În timpul perioadei de ischemie depozitele celulelor endoteliului capilar în adenozin-5'-trifosfat (ATP) sunt scăzute, ducând la creșterea nivelului produșilor de degradare, incluzând hipoxantinele (deși nivelul endogen al acestor produși pare să fie suficient să substituie aceste reacții). Xantin-dehidrogenaza este convertită în forma sa oxidată, xantin-oxidaza, se presupune via modificări proteolitice. Hipoxantina este unul din substraturile pentru oxidază, celălalt substrat necesar fiind oxigenul. După reperfuzie, oxigenul este mai mult decât suficient, astfel că xantin-oxidaza catalizează producerea de O2 – și oxidanți.

2. Ipoteza de lucru

Pornind de la ipoteza, confirmată de altfel de numeroase alte studii, că în psoriazis există posibilitatea inducerii unui mecanism fiziopatogenic având la bază și stresul oxidativ, am verificat câțiva parametrii biochimici care ne-ar putea confirma aceată presupunere. Am cercetat:

– concentrația sangvină a MDA, markerul peroxidării lipidice, MDA fiind produsul final de descompunere în lanțul peroxidării AGPN;

– concentrația sangvină a glutationului redus;

– activitatea enzimatică a superoxid dismutazei eritrocitare;

– concentrația plasmatică de ceruloplasmină, proteină de fază acută considerată ca fiind și o proteină cu rol antioxidant.

3. Metodele utilizate

3.1. Lotul de bolnavi investigați. Lotul investigat cuprinde 10 pacienți aflați în faza de diagnostic a psoriazisului, surprinși în etapa acută de manifestare a bolii. Menționez faptul că nici unul dintre pacienți nu a folosit vreo metodă terapeutică antipsoriazică. Cei 10 bolnavi au fost supuși anamnezei și au fost diagnosticați în Secția de Dermatologie, a Spitalului Clinic Colentina. Vârsta pacienților luați în studiu variază între 27 și 54 de ani, 5 bărbați și 5 femei.

Fig nr. 8 Distribuția în funcție de vârstă și sex a bolnavilor diagnosticați cu psoriazis

3.1.1. Prelucrarea statistică a datelor.

În prelucrarea statistică a datelor vom utiliza testul t Student. Acesta este un instrument creat special pentru analizarea loturilor mici (n<30) și arată dacă între rezultate există o diferență semnificativă statistic.

Prin definiție diferența semnificativă statistic, numită și semnificație statistică, este concluzia că diferența dintre eșantioane nu este datorată numai șansei (adică diferența este datorată altor factori); cu alte cuvinte diferența dintre eșantioane este semnificativă din punct de vedere statistic, dacă ipoteza nulă este respinsă. Ipoteza nulă, simbolizată cu H0, presupune că loturile comparate sunt similare.

Testul t Student, bazat pe distribuția t care reflectă o variație mai mare datorată șansei decât distribuția normală este folosit pentru analiza loturilor mici. Distribuția t este o distribuție continuă, simetrică, unimodală, în formă de clopot, asemănătoare cu forma distribuției normale, dar mai împrăștiată.

În lucrare am folosit două loturi și am efectuat câte patru determinări pentru fiecare lot, respectiv un lot martor și un lot de bolnavi, la care am investigat următoarele componente: concentrația MDA (malondialdehida) în sânge , concentrația glutationului redus (GSH) în sânge, concentrația plasmatică de ceruloplasmină și activitatea enzimatică a superoxid dismutazei (SOD) eritrocitare.

3.2. Determinarea peroxizilor lipidici

3.2.1. Principiul metodei.

Peroxizii lipidici au fot determinați după metoda Jose-Slater.

Se dozează malondialdehida (MDA) rezultată din descompunerea endoperoxizilor lipidici cu acid tiobarbituric (TBA) în mediu acid. Creșterea concentrației MDA este un marker al peroxidării acizilor grași cu mai mult de trei legături duble, existând o relație direct proporțională între aceasta și nivelul peroxizilor lipidici. În reacția dintre TBA și NDA se formează un produs galben-roz cu absorbție specifică 532nm. Intensitatea colorației depinde de numărul de duble legături din acidul gras polinesaturat și este apreciată prin citirea spectrofotometrică în această bandă.

3.2.2.Materiale necesare.

– soluție 20% de acid tricloracetic (TCA);

– soluție 10% de acid percloric saturată cu acid tiobarbituric (1 volum de acid 3 volume de TBA);

– plasmă de la bolnavi.

3.2.3. Tehnica de lucru.

Se prepară o soluție de acid percloric saturată cu acid tiobarbituric (1 volum de acid 3 volume TBA); se agită bine și se filtrează soluția, eliminând excesul de TBA; se obține astfel supernatantul.

Reactivul I se prepară extemporaneu și este alcătuit din 10 părți supernatant și 30 părți TCA 20%. Blank-ul este preparat din 0,5ml apă distilată și 4,5mL reactiv I de culoare.

În eprubete lungi se prepară probele din 0,5ml plasmă și 4,5ml reactiv I. Amestecul se agită și se trece timp de 20 de minute în baie de apă la 100C, apoi se răcește și se trece în eprubete de centrifugă timp de 10 minute la turația 4.000-5.000 grame. Supernatantul obținut după centrifugare este citit spectrofotometric la 532nm față de blank.

3.2.4 Calculul concentrației de MDA

Corelația între extincție și concentrația de MDA s-a făcut cu ajutorul formulei:

c

unde: Eextincția citită la 532nm,

Ccoeficientul molar de extincție al MDA (155 x 103).

c concentrația sangvină de MDA (nmoli/ml).

D diluția probelor

3.3. Determinarea concentrației sangvine a glutationului redus(GSH)

3.3.1. Principiul metodei.

S-a folosit metoda Ellman, modificată de Seldak și Sinsdary, de determinare a grupărilor tiolice neproteice.

Anionul acidului 2-N-mercaptobenzoic, rezultat din reacția dintre grupările tiolice și acidul 5, 5'-ditio-bis-nitrobenzoic (DTNB), este intens colorat în galben și are absorbția specifică în banda de 490nm.

3.3.2. Materiale necesare

– 1ml sânge recoltat pe heparină;

– soluție precipitantă cu 1,67g acid metafosforic, 0,20g acid etilendiaminotetraacetic (EDTA) și 30g NaCl, în 100ml apă distilată;

– soluție 0,3M fosfat disodic;

– soluție DTNB cu 100mg acid în 25ml acool metilic absolut.

3.3.3. Tehnica de lucru

În eprubete normale se pun 0,5ml sânge și 1,5 ml apă. Se realizează hemoliza prin procese de îngheț-dezgheț de 2 ori. Peste himolizat se adaugă 3 ml soluție precipitantă. Se agită timp de 10 minute și se filtrează.

Probele conțin: 1ml filtrat, 4ml soluție fosfat, 0,5ml reactiv DTNB.

Blank-ul conține: 1ml apădistilată și 3 ml.apă distilantă.

Se citesc extincțiile probelor față de blank la 420nm.

3.3.4. Calculul concentrației sangvine a glutationului redus (GSH).

Concentrația se calculează cu ajutorul formulei:

c

unde: E extincția probei citită la 420nm;

C coeficientul molar de extincție al GSH (13600)

c concentrația sangvină a glutationului redus (moli/dl)

D diluția probei.

3.4. Determinarea concentrației plasmatice a ceruloplasminei.

3.4.1. Principiul metodei

S-a folosit metoda Ravin.

Concentrația de ceruloplasmină este determinată în funcție de debitul de formare al produsului de oxidare a P-penilendiaminei sub acțiunea ceruloplasminei, la 37C și pH5,5

3.4.2. Materiale necesare.

– tampon acid acetic-acetat de sodiu 0,1M și pH5,5;

– soluție de p-fenilendiamină cu 0,1g cu 20ml tampon;

– soluție azidă de sodiu cu 0,5g în 100ml apă distilată;

– ser de la bolnavi.

3.4.3. Tehnica de lucru.

Se prepară în paralel o probă și un martor.

Martorul conține: 0,1ml ser, 8 ml tampon, 1ml substrat (p-fenilendiamină) și 1ml azidă de sodiu.

Proba conține: 0,1 ml ser, 8 ml tampon și 1ml substrat.

Se introduc epribetele timp de o oră într-o baie termostat la 37C și după răcire se adaugă 1ml azidă în probă. După 30 de minute se citesc extincțiile la 350nm. În blank reacția catalizată de ceruloplasmină este inhibată de azidă dar poate avea loc oxidarea neenzimatică a substratului.

3.4.4. Calculul concentrației plasmatice de ceruloplasmină.

În funcție de extincții se citesc valorile concentrațiilor din tabelele de echivalență. Concentrația ceruloplasminei se calculează după formula:

c

unde: E extincția probei citită la 350nm;

C coeficientul molar de extincție al ceruloplasminei(87,5)

c concentrația plasmatică de ceruloplasmină (mg/100ml plasmă)

D diluția probelor.

Valorile normale sunt 70-120u.i. (32,34,9mg/100ml plasmă)

3.5. Determinarea activității enzimatice a superoxid dismutazei (SOD) eritrocitare

3.5.1. Principiul metodei.

A fost utilizată metoda descrisă de Csovari S. și Angyal T.

Prin reacția dintre fenazinmetosulfat (FMS) și NDH se formează o soluție stabilă de anion superoxid (O2 -) care reduc nitrobluetetrazoliu (NBT) la nitroformazan, colorat în albastru. Această reacție e inhibată prin prezența SOD în soluție care dismută în anionii superoxid. Nitroformazanul absoarbe specific la 550nm.

Se prepară martor fără SOD și probe cu SOD. Diferența de extincție este direct proporțională cu conținutul de SOD al probei.

3.5.2. Materiale necesare

– soluție NDH cu 12mg 1n 20ml tampon TRIS;

– soluție NBT cu 2,7mg în 10ml tampon TRIS;

– soluție FMS cu 2,1mg în 10ml tampon TRIS;

– 0,5 ml sânge de la bolnavi recoltat pe heparină.

3.5.3. Tehnica de lucru

S-a utilizat o tehnică de lucru modificată după Olinescu.

Se prepară blank pentru SOD conținând: 6,5 ml soluție standard, 1ml NDH, 1ml NBT, 0,5ml FMS și 0,1ml H2O.

Se prepară martor fără FMS conținând 7ml soluție standard, 1ml NDH, 1ml NBT și 0,1ml H2O.

Probele conțin: 6,5ml soluție standard, 1ml NDH, 1ml NBT, 0,5ml FMS și 0,1ml soluție supernatant cu enzimă. Aceasta este de fapt un amestec de 0,5ml sânge, 0,75ml cloroform-metanol și 0,25ml soluție fosfați, care se centrifughează timp de 20 minute la 6.000g.

După incubare timp de 3 minute, în baie termostat la 37C, se citesc din 30 în 30 de secunde extincțiile blank-ului și probei față de martor, la 550nm.

3.5.4.Calculul activității enzimatice a superoxid dismutazei (SOD) eritrocitare.

Concentrația SOD se calculează după formula:

c concentrația SOD măsurată în unități SOD/ml sânge (1 unitate SOD este acea cantitate de enzimă care produce o inhibiție de 50% a formării nitroformazanul în condițiile de reacție descrise)

Eb extincția blank-ului

Ep extincția probei

4. Interpretarea rezultatelor după prelucrarea statistică. Concluzii

4.1. Malon dialdehida (MDA) și glutationul redus (GSH).

Unul din evenimentele majore care determină evoluția procesului inflamator sau al acțiunii altei noxe cu caracter oxidativ, ce crește permeabilitatea vasculară, este peroxidarea lipidelor nesaturate. Aceasta reprezintă consecința inevitabilă a faptului că intracelular se produce o creștere a concentrației Ca2 , se activează diverse proteaze și fosfolipazele. Se știe că ionii Ca2 liberi, intracelular, variază între 0,1-0,4M datorită unor mecanisme

Fig nr.9 Perturbarea homeostaziei Ca2 din peretele vascular în urma stresului oxidativ

homeostazice foarte eficiente, astfel că se păstrează un echilibru între concentrația intracelulară (M) și extracelulară (mM). Menținerea acestui gradient de concentrație al calciului este atât de importantă pentru integritatea celulară încât sunt implicate mai multe sisteme în reglarea lui (ATP-aze, translocaze, canale și transportori proteici de tipul calmodulinei).

Creșterea influxului de Ca în celule, marcând o primă etapă comună acțiunilor toxice, are loc numai după depășirea sistemelor homeostazice menționate, din care amintim vitamina E cu caracter AO foarte puternic la nivelul cutanat.

Importanța menținerii unei concentrații fiziologice de vitamina E este cu atât mai mare cu cât s-au descoperit doar două mecanisme de menținere a acestui nivel. Ambele mecanisme pornesc de la producerea radicalilor peroxi, LOO și transformarea lor în hidroperoxizi, LOOH, de către tocoferol, TOC-OH, cu formare de radical liber al tocoferolului, TOC-O:

LOO TOC-OH LOOH TOC-O

TOC-O GSH TOC-OH GS

2GS GSSG

TOC-O Vitamina C TOC-OH Vit. C

Ambele mecanisme, dovedite experimental implică regenerarea TOC-O de către agenți reducători hidrosolubili, glutation (GSH) sau vitamina C, care la rândul lor sunt transformați în radicalii liberi respectivi. Fiind hidrosolubili, sunt regenerați pe cale sangvină sau prin sisteme enzimatice (GSH-Px sau GSH-reductază). Cel mai afectat este conținutul în GSH intracelular care scade în toate cazurile de stres oxidativ.

Rolul GSH, demonstrat mai demult în rezistența la oxidare, constă de fapt în regenerarea grupărilor SH din proteină. Păstrarea proteinelor ce conțin SH în stare redusă asigură translocazele membranare și homeostazia calciului.

Pierderea viabilității celulare are loc numai după atingerea unui anumit prag în vitamina E situat la 0,6-1,0nmoli/106 celule sau 0,4-0,7nmoli/mg proteine. Acest prag sugerează că o moleculă -tocoferol ar exercita o protecție pentru aproximativ 500 molecule acizi grași, AGPN.

Lipidele nesaturate reprezintă ținta preferată a radicalilor liberi și în special a radicalilor liberi de O2. Dar AGPN (oleic, arahidonic) sunt esențiali existenței membranelor celulare și prin peroxidarea lor sunt protejate alte structuri fundamentale ale celulei. Cum acești AGPN nu sunt sintetizați în organism și rolul lor este foarte important, li s-a atribuit statutul de vitamina F, fiind incluși alături de alte vitamine și ioni, printre necesitățile unei alimentații raționale.

Fig.10 Glutationul redus (GSH) ca principală linie de apărare față de RL ai O2 după Biaglow

S-a măsurat peroxidarea lipidică in vitro a lipoproteinelor cu densitate foarte mică (VLDL) și a lipoproteinelor cu densitate mică (LDL), lipoproteine provenind din pielea pacienților psoriazici. La analiza compoziției s-au constat creșteri semnificative ale trigliceridelor și fosfolipidelor, atât pentru VLDL (p<0,05) cât și pentru LDL (p<0,01). Mai mult, s-a constat o creștere a colesterolului total (p<0,01) față de martori. În concluzie, modificările compoziționale ale lipoproteinelor au sugerat o creștere a riscului de aterogeneză la adulții psoriazici.

Rezultatele măsurătorilor noastre arată o creștere a concentrației MDA la lotul bolnav față de martori, semnificativă statistic (tc 5,3; tt 2,101; 0,05), fapt care confirmă existența stresului oxidativ asupra AGPN în psoriazis.

Concentrația glutationului redus sangvin scade însă această scădere nu este semnificativă statistic (tc 1,33; tt 2,101; 0,05), așa cum ar fi fost de așteptat, date fiind rezultatele foarte mari ale concentrației de MDA. Este posibil ca acest lucru să se explice printr-o creștere a GSH-ului la nivel intracelular.

Fig nr.11. Comparație între concentrațiile sangvine de MDA la cele două loturi(nm/ml)

Fig nr 12 Comparație între concentrațiile sangvine de GSH la cele două loturi (moli/dl)

Fig nr.13 Concentrațiile sangvine ale MDA pentru lotul martor (nmoli/ml)

Fig nr.14 Concentrațiile sangvine ale MDA la lotul de bolnavi (nmoli/ml)

Fig nr.15 Comparația dintre valorile medii ale concentrațiilor sangvine de MDA între lotul martor și lotul de bolnavi (nmoli/ml)

Fig nr.16 Comparația dintre valorile maxime și minime ale concentrației sangvine de MDA între cele două loturi (nmoli/ml)

Fig nr.17Concentrațiile sangvine ale GSH pentru lotul martor (moli/dl)

Fig nr.18 Concentrațiile sangvine ale GSH la lotul de bolnavi (moli/dl)

Fig nr. 19 Comparația dintre valorile medii ale concentrațiilor sangvine de GSH între lotul martor și lotul de bolnavi (moli/dl)

Fig nr. 20 Comparația dintre valorile maxime și minime ale concentrației sangvine de GSH între cele două loturi (mol/dl)

4.2. Superoxid dismutaza (SOD)

Cercetările efectuate până în momentul de față arată creșteri semnificative ale SOD în fibroblastele psoriazice, PMN, KC. S-a arătat că expresia SOD eritrocitar nu este întotdeauna legată de caracterul de gravitate al manifestării psoriazisului, evocând mai degrabă răspunsul general de protecție a celulelor organismului la citokinele eliberate de celulele inflamatorii care au invadat pielea bolnavă.

Rezultatul studiului de față s-ar putea încadra într-o astfel de ipoteză observându-se o creștere a activității enzimatice a superoxid dismutazei eritrocitare la lotul de bolnavi față de lotul martor, însă fără semnificație statistică (tc 1,9; tt 2,101; 0,05).

Fig nr.20 Comparația dintre activitățile enzimatice ale SOD eritrocitare între cele două loturi (u.i. SOD/ml plasmă)

Fig nr.21 Activitatea enzimatică a SOD eritrocitară la lotul martor (u.i. SOD/ml plasma)

Fig nr. 22 Activitatea enzimatică a SOD eritrocitară la lotul de bolnavi (u.i. SOD/ml plasma)

Fig nr.23 Comparația dintre valorile medii ale activităților enzimatice ale SOD eritrocitare între lotul de martori și lotul de bolnavi (u.i. SOD/ml plasmă)

Fig nr.24 Comparația dintre valorile maxime și minime ale activităților enzimatice ale SOD eritrocitare între lotul de martori și lotul de bolnavi (u.i. SOD/ml plasmă)

4.3. Ceruloplasmina

Studiul arată o creștere semnificativă statistic a concentrației plasmatice de ceruloplasmină la lotul bolnav față de cel martor (tc 4,8; tt 2,101; 0,05). Ceruloplasmina este adesea legată de creșterea cupremiei, această proteină reprezentând principala formă de transport a acestui element.

Totuși ceruloplasmina rămâne în primul rând o proteină de fază acută, prezența sa în plasmă fiind mediată de eliberarea de către celulele inflamatorii a IL-1. Dat fiind faptul că probele de sânge au fost recoltate de la pacienți aflați în faza acută de manifestare a bolii, chiar în faza de diagnostic, fără intervenția vreunei terapii antiinflamatorii, creșterea ceruloplasminei nu face decât să ne confirme și la nivel biochimic starea clinică a pacienților.

Fig nr.25 Comparația dintre concentrațiile plasmatice de ceruloplasmină între lotul de martori și lotul de bolnavi (mg/100ml plasma)

Fig nr.26 Concentrația plasmatică a ceruloplasminei în lotul martor (mg/100ml plasma)

Fig nr.27 Concentrația plasmatică a ceruloplasminei în lotul de bolnavi (mg/100ml plasma)

Fig nr.28 Comparație dintre valorile medii ale concentrațiilor plasmatice de ceruloplasmină între cele două loturi

Fig nr.29 Comparația dintre valorile maxime și minime ale concentrațiilor plasmatice de ceruloplasmină între cele două loturi

BIBLIOGRAFIE

1. "Free Radicals in Cutaneous Biology" de Douglas Darr și Irvin Fridvoich, J.Invest Dermatology 8, 211,1991.

2. H.Sies, M.E. Murphy, J.Photochemistry, Photobiology, 671-675, 1994.

3. H.Sies, "Oxidative Stress", Academic Press, New York, 1985.

4. R.S.Sohal, T.F.Slater, "Free Radicals in Molecular Biology and Aging", New York, 1985.

5. W.Veno, Y.Gogun, J.Clin.Biochim.Nutrit 8,85,1990.

6. N.I.Krinsky, "Oxygen Radicals in Chemistry and Biology", edit.W.Bors, L.Saran, De Gruyter, Berlin, 1984, p.453-468.

7. A.Cristea, E.Toma, R.Olinescu, "Procese bioenergetice și oxidoreducere enzimatică", Ed. Științifică, București, 1982.

8. R.Olinescu, "Revista românească de medicină internă", 20, 59, 1982.

9. Fraupe H., Von Gurp, R.Happle și alții, A.J.Med. of Genet. 42, 649 (1992).

10. Colțoiu Al., "Dermatovenerologie" (1993).

11. Dan Forsea, Popescu R., Popescu C.M., "Compendiu de dermatologie și venerologie", Ed.tehnică, București, 1996.

12. Arch.Dermatolgy, Vol.133, dec., 1997, "Relația dintre producția de NO și psoriazis", Turcia.

13. Skin Pharmacology, p.303-313, Cluj-Napoca, "Efectul corticoterapiei locale în activitatea enzimatică a SOD în piele, in vitro", 1997

14. J.A.Acad.Dermatology "Comparație între fotodermoterapia în psoriazis cu psoralen-UVB și psoralen-UVA", aprilie, 1997.

15. "Immunology Today", nr.9, vol.18, "Pot declanșa celulele Langerhans psoriazisul via NO?", 1997.

16. J. Invest. Dermatology, "Mutații tip p-53 în celulele scuamoase carcinomatoase la pacienții psoriazici tratați cu psoralen și UVA", august, 1997.

17. A.Dermatology&Venerology, p.264-267, nr.124, "Inducerea căii NO în keratinocitele umane: implicarea în fenomene alergice și inflamatorii cutanate", 1997.

18. Biochemical Pharmacology, "Acțiunea antipsoriatică și proinflamatorie a antralinei", 9 mai 1997.

19. Free Radicals Biology&Medicine, "Modularea oxidativă a protein-kinazei AMPc dependente în fibroblastele umane, posibilul rol în psoriazis", 1997.

20. Photochemistry&Photobiology, "Radicalii de oxigen, factori plasmatici de mediere clastogenică în psoriazis, scăderea activității clastogenice după PUVA", 1997.

21. Skin Pharmacology, "Efectul absorbției per cutane a fluocinolonului acetonid asupra activității SOD la pacienții cu psoriazis", 1997.

22. Biochemistry&Biophysics Act., nov. 15, "Stresul oxidativ în lipidele pielii umane. Dependența dintre peroxidarea lipidelor și concentrația sterolică", 1997.

23. Britisch Journal of Pharmacology, "Efectul peroxinitritului în extravazarea plasmatică, circulația microvasculară a sângelui și nociceptivitate la șobolani", noiembrie, 1997.

24. F.C.Toxicology, "Glutationul endogen, potențial protector împotriva RL din piele la șoarecii cu deficit de vitamina A", iulie 1997.

25. Chemycal Pharmacology Bulletin, "Colagenul cross-link-at de către oxigenul singlet generat de UVA", 1997.

26. Journal Clinical Invest, "Formarea excesivă de OH și produși aldehidici de peroxidare lipidică în culturi de fibroblaste aparținând unor pacienți cu deficiențe de complex I, HLA", iunie 1987.

27. B.J.Med.Biol. Results, "Fotochia și fotobiologia eritemului actinic: mecanisme reparatoare și de apărare cutanată", 1997.

28. Histochemycal Journal, "Detectarea in situ a producției de superoxid în granulele mastocitelor", 1997.

29. Aurică Oana, Ilinca Nicolae, Lucia Moșescu, Ileana Ionescu, "Metabolismul zincului și cuprului în boala lupică și sclerodermie", 8.02.1989

30. T.Takeuchi, M.Nakajima and K. Morimoto, Japonia, "Relația dintre speciile reactive de oxigen și inducerea stresului oxidativ asupra ADN-ului din celulele PMN", august 1996.

31. Cytokine Bulletin, "Free Radicals and Oxydative Stress", 1996.

32. Barry Halliwell, "Antioxidant Characterization", 1995.

33. Physiological Reviews, "Cellular Defenses Against Damage From Reactive Oxygen Species", ianuarie 1994.

34. Radu Olinescu, Editura tehnică, București, "Radicali liberi în fiziopatologia umană", 1994.

35. Departament of Clinical Chemistry, University Hospital, Suedia, "Efectul stresului oxidativ asupra expresiei CuZn-SOD și Mn-SOD în fibroblastele dermice umane", iulie 1994.

36. Departament of Veterinary Pathology, Tokyo, Japonia, "Inducerea dermatitelor de către H2O2", aprilie 1997.

37. Departament of Dermatology, Harvard Medical School, Boston, USA, "Combaterea efectelor distructive ale iradierii cutanate cu UVB de către vitamina C, printr-un mecanism care nu este dependent de TNF-", iulie 1997.

38. Shiga Central Laboratories, Japonia, "Efectul protectiv al acidului hidroxibenzoic și a esterilor săi asupra distrucțiilor celulare induse de către radicalii OH și O22- ", aprilie 1997.

39. Departament of Environmental Health Sciences, Baltimore, USA, "Rolul RL în promovarea și progresia tumorilor", 1995.

40. Richard A. Passwater Ph.D. și Chithan Kandaswa, "What is Pycnogenol?", 1998.

41. Keats Publishing, "Pycnogenol The Super "Protector" Nutrient", p.7-10, 1998.

42. "Grapes and your health", 1996-1998, France World Contacts

43. "Grape seed polyphenols for your skin", 1996-1998, France World Contacts

44. "Photodynamic Therapy with Porphyrins", 1996-1998, France World Contacts

45. "Proanthenols Bio-Complex", Vencouver, Canada, 1998.

46. "What is Chelation Therapy", Derry Hubbard, Whole Life News, 1998.

47. "Essential Fatty Acids", 1996-1998, France World Contacts

48. "Vitamin C and Bioflavonoids", 1996-1998, France World Contacts

49. "Dietary Recommendations", 1996-1998, France World Contacts

50. "Pycnongenol Cited For Treating Attention-Defficit/Hyperactivity Disorder", USA, 17 februarie , 1998

51. "How Does Selenium Work?", Olan.Ltd.1998.

52. "Few Words About Selenium", Olan.Ltd.1998.

=== CONCLUZI ===

CONCLUZII

1. Lipidele nesaturate reprezintă ținta preferată a radicalilor liberi și în special a radicalilor liberi de O2. Rezultatele măsurătorilor noastre arată o creștere a concentrației de MDA la lotul de bolnavi față de martori, semnificativă statistic (tc5,3; tt2,101; 0,05), fapt care confirmă existența stresului oxidativ asupra AGPN în psoriazis.

Concentrația glutationului redus sangvin scade, însă această scădere nu este semnificativă statistic (tc1,33; tt2,101; 0,05), așa cum ar fi fost de așteptat, date fiind rezultatele foarte mari ale concentrației de MDA. Este posibil ca acest lucru să se explice printr-o creștere a GSH la nivel intracelular.

2. Rezultatul studiului de față arată o creștere a activității enzimatice a superoxid dismutazei eritrocitare la lotul de bolnavi față de lotul martor, însă fără semnificație statistică (tc1,9; tt2,101; 0,05).

S-a arătat că expresia SOD nu este întotdeauna legată de caracterul de gravitate al manifestării psoriazisului evocând mai degrabă răspunsul general de protecție a celulelor organismului la citokinele eliberate de celulele inflamatorii care au invadat pielea bolnavă. Este posibil ca SOD să aibă valori ridicate, semnificative statistic, doar la nivel cutanat, intralezional.

3. Studiul arată o creștere semnificativă statistic a concentrației plasmatice de ceruloplasmină la lotul bolnav față de cel martor (tc4,8; tt2,101; 0,05). Ceruloplasmina rămâne în primul rând o proteină de fază acută, prezența sa în plasmă fiind mediată de eliberarea de către celulele inflamatorii a IL-1. Dat fiind faptul că probele de sânge au fost recoltate de la pacienți aflați în faza acută de manifestare a bolii, chiar în faza de diagnostic, fără intervenția unei terapii antiinflamatorii, creșterea ceruloplasminei nu face decât să ne confirme și la nivel biochimic starea clinică a pacienților.

=== folii ===

Speciile reactive de oxigen sunt: superoxid anionul (O2- ), anionul peroxid (O22- ), oxigenul singlet (1O2), radicalul hidroxil (OH), peroxizii (ROO).

a) oxigenul molecular (O2) b) superoxid anionul (O2 -)

c) anionul peroxid () d) singlet oxigenul (1O2)

Distribuția electronilor pe orbitali moleculari de tip 2y și în cazul oxigenului molecular, superoxid anionului, a anionului peroxid și a singlet oxigenului.

OA-orbitali atomici; OM-orbitali moleculari

OXIDAREA ACIZILOR GRAȘI

1. Etapa de inițiere:

RH X –->R XH

2. Etapa de propagare:

R O2 –->ROO

ROO RH –-> R ROOH

3. Etapa de întrerupere:

R R –-> R-R

ROO ROO –-> produși stabili

ROO R –-> ROOR

Un mecanism alternativ de întrerupere a lanțului de reacție este asociat antioxidanților AH, conform reacțiilor:

ROO AH –-> ROOH A

A A –-> 2A.

MALONDIALDEHIDA (MDA)

Valorile medii comparate ale concentrațiilor sangvine de MDA între lotul martor și lotul de bolnavi (nmoli/ml)

Concluziile studiului:

Lipidele nesaturate reprezintă ținta preferată a radicalilor liberi și în special a radicalilor liberi de oxigen. Rezultatele măsurătorilor noastre arată o creștere a concentrației de MDA la lotul de bolnavi față de martori, semnificativă statistic (tc5,3; tt2,101; 0,05), fapt care confirmă existența stresului oxidativ asupra AGPN în psoriazis.

GLUTATIONUL REDUS (GSH)

Valorile medii comparate ale concentrațiilor sangvine de GSH între lotul martor și lotul de bolnavi (moli/dl)

Concluziile studiului:

Concentrația glutationului redus sangvin scade, însă această scădere nu este semnificativă statistic (tc1,33; tt2,101; 0,05), așa cum ar fi fost de așteptat, date fiind rezultatele foarte mari ale concentrației de MDA. Este posibil ca acest lucru să se explice printr-o creștere a GSH la nivel intracelular.

SUPEROXID DISMUTAZA (SOD)

Valorile medii comparate ale activităților enzimatice ale SOD eritrocitare între lotul de martori și lotul de bolnavi (u.i.SOD/ml plasmă)

Concluziile studiului:

Rezultatul studiului de față arată o creștere a activității enzimatice a superoxid dismutazei eritrocitare la lotul de bolnavi față de lotul martor, însă fără semnificație statistică (tc1,9; tt2,101; 0,05).

S-a arătat că expresia SOD nu este întotdeauna legată de caracterul de gravitate al manifestării psoriazisului evocând mai degrabă răspunsul general de protecție a celulelor organismului la citokinele eliberate de celulele inflamatorii care au invadat pielea bolnavă. Este posibil ca SOD să aibă valori ridicate, semnificative statistic, doar la nivel cutanat, intralezional.

CERULOPLASMINA

Comparație dintre valorile medii ale concentrațiilor plasmatice de ceruloplasmină între cele două loturi

Concluziile studiului:

Studiul arată o creștere semnificativă statistic a concentrației plasmatice de ceruloplasmină la lotul bolnav de cel martor (tc4,8; tt2,101; 0,05). Ceruloplasmina rămâne în primul rând o proteină de fază acută, prezența sa în plasmă fiind mediată de eliberarea de către celulele inflamatorii a IL-1. Dat fiind faptul că probele de sânge au fost recoltate de la pacienți aflați în faza acută de manifestare a bolii, chiar în faza de diagnostic, fără intervenția unei terapii antiinflamatorii, creșterea ceruloplasminei nu face decât să ne confirme și la nivel biochimic starea clinică a pacienților.

naturali (GSH, vitamina C, E)

neenzimatici

ANTIOXIDANȚI: sintetici (butilhidroxitoluen)

enzimatici (SOD, catalază, GSH-Px)

Reacția catalizată de SOD:

2O2 – 2H O2 H2O2

Glutationul redus (GSH) ca principală linie de apărare față de radicalii liberi ai oxigenului (după Biaglow)

I.

II.

Fasfolipide inozitol-1, 4, 5-trifosfat diacetil glicerol (DAG)

membranare

LIPOCORTINĂ

ACID ARAHIDONIC ACID ARAHIDONIC

(acizi grași liberi)

III. IV.

ADENILAT CICLAZĂ GUANILAT

CICLAZĂ O2-

FOSFO-

AMPc DIESTERAZĂ GMPc NO

Activitate scăzută Activitatea GMPc

(defect al receptorului este crescută de 3 ori

celular de suprafață?) față de normal.

La nivelul pielii stresul oxidativ este indus prin trei mecanisme:

1 FOTOSENSIBILIZARE

2 INFLAMAȚIE

3 FENOMENUL DE ISCHEMIE-REPERFUZIE

FACTORI CARE ACȚIONEAZĂ ASUPRA PROLIFERĂRII KERATINOCITARE

LEGENDĂ: IGFInsulin-like Growth Factor; PDGFPlateled Derived Growth Factor; FGFFibroblast Growth Factor;

TGF Tumor Growth Factor; TNFTumor Necrosis Factor; EGFEpidermal Growth Factor.