Stresul Oxidativ din Punct de Vedere al Modificarilor Produse la Nivel Celular

CUPRINS

Cuprins

Rezumat

Introducere

PARTEA I – STUDII BIBLIOGRAFICE

Capitolul I – Generalități în stresul oxidativ

1.1. Definiția stresului oxidativ

1.2. Radicalii liberi și clasificarea lor

1.2.1. Specii reactive de oxigen

1.2.2. Specii reactive de azot

1.3. Surse de stres oxidativ

1.3.1 Surse endogene

1.3.1.1. Surse biochimice

1.3.1.2. Surse genetice

1.3.2. Surse exogene

1.3.2.1. Radiatiile ionizante și 2 alchilciclobutanonele

1.3.2.1.1. Radiațiile ionizante

1.3.2.1.1.A. Radiațiile β

1.3.2.1.1.B. Radiațiile UV

1.3.2.1.2. 2 alchilciclobutanonele

Capitolul II – Stresul oxidativ la nivel celular

2.1. Actiunea stresului oxidativ asupra compartimentelor celulare

2.1.1. Actiunea stresului oxidativ asupra materialului genetic (ADN-ului

2.1.2. Actiunea stresului oxidativ asupra mitocondriei

Capitolul III – Protectia antioxidantă

3. Protectia antioxidantă

3.1 Antioxidanti – definiție, caracteristici

3.2 Protecția antioxidantă neenzimatică

3.3 Protecția antioxidantă enzimatică

3.4. Capacitatea antioxidantă plasmatică

PARTEA A II-A – CERCETĂRI PROPRII

Cadrul natural/organizatoric/instituțional în care s-au desfășurat cercetările.

Capitol IV Materiale și metode utilizate

4.1. Culturile celulare

4.1.1. Cultivarea celulelor din linii standardizate

4.1.2. Obținerea culturilor de neuronilor din ganglionii rădăcinilor

dorsale (DRG

4.1.3. Obținerea limfocitelor din sângele uman și tratamentul cu 2DCB

4.1.4. Obținerea suspensiilor celulare din organe și tumori

4. 2.Tipuri de microscopie folosite în această lucrare

4.3. Determinarea lezărilor ADN: cometa alcalină și tehnica micronuleilor

4.3.1. Cometa alcalină cu 2 straturi de agaroză

4.3.2. Formarea de micronuclei

4.4. Determinarea modificărilor metabolismului mitocondrial (testul MTS)

4.5. Determinarea conținutului de carbonil în proteinele modificate

oxidativ din plasma sanguină

4.6. Determinarea activității antioxidante globale a plasmei sanguine

4.7. Apoptoza morfologică

4.8. Administrarea radiofarmaceuticelor

4.9. Realizarea structurilor prin polimerizare cu doi fotoni

4.10. Tehnica MAPLE

Capitolul V – Rezultate și discuții

5.1 Stresul oxidativ la nivel celular indus de contactul cu nano și micro

materiale

5.1.1. Stresul oxidativ provocat de contactul cu suprafețe nano și

micro structurate

5.1.1. A Stresul oxidativ indus de filmeme de pNIPAAm

produse în diferite condiții

5.1.1. B Stresul oxidativ indus de structuri de ormosil produse prin

fotololimerizare cu doi fotoni

5.1.2. Stresul oxidativ indus de nanoparticule de ZnO

5.2 Stresul oxidativ în glicozilarea patologică

5.2.1. Efectul dublu al metilglioxalului asupra neuronilor

5.2.2. Evaluarea stresului oxidativ la șoarecii diabetici tratați cu

capsaicină

5.3. Stresul oxidativ indus de radiații ionizante

5.3.1. Stresul oxidativ produs de radioterapia cu Lu177

5.3.2. Stresul oxidativ produs de 2-dodecilciclobutanonă

CONCLUZII GENERALE

Lista de lucrări publicate și comunicate la conferințe

Bibliografia

INTRODUCERE

Lucrarea de față îsi propune să ivestigheze stresul oxidativ din punct de vedere al modificărilor produse la nivel celular. Patologiile legate de stresul oxidativ sunt foarte complexe.

Stresul oxidativ are rol în diabet, cancer, parkinson, alzheimer, ateroscleroză, insuficiență cardiacă, infarct miocardic, sindromul Fragile X (sindromul Martin-Bell), siclemie, lichen planus, vitiligo, autism, multiple infecții si sindromul de oboseală cronică. Pe de altă parte el constituie o armă împotriva infectiilor (puseul respirator al monocitelor și neutrofilelor), terapia anticanceroasă și producerea fenomenului de hormeză. În cantităti mici radicalii liberi au rol informațional atât intracelular cât și extracelular (fenomenul de bystander) fie ca este vorba de organsim sau de mediul de creștere al celulelor.

Modul de producere a materialelor pot duce la însușiri noi ale acestora. Astfel ca in domeniul nanomaterialelor modificări mici de dimensiune pot duce la schimbarea radicală a proprietăților. Substraturile în funcție de chimia și morfologia suprafeței, influențează morfologia și metabolismul celulelor. Stresul oxidativ la nivel celular fiind o mediat de receptorii de membrană și procesele de suprafață.

Radiațiile ionizante sunt cunoscute ca generatoare de stres oxidativ dar atunci când se pot controla condițiile de iradiere acestea pot fi folosite pentru distrugerea țesuturilor maligne.

Obiectivele principale au vizat punerea în evidență a stresului oxidativ la nivel celular în cazul unor factori cunoscuți ca inductoari de stres oxidativ (radiații ionizante, nanoparticule de ZnO, diabet, metilglioxal) cât și potențiale inductoare de stres (nanofilme de pNIPAAm și microstructuri de ormosil).

PARTEA I

FIRST PART

STUDIU BIBLIOGRAFIC

BIBLIOGRAPHIC STUDY

Capitolul I – Generalități privind stresul oxidativ

Chapter I – Overview on oxidative stress

1.1. Definiția stresului oxidativ

1.1. Definition of oxidative stress

Stresul oxidativ (SO) este definit ca un dezechilibru, între oxidanți și antioxidanți în favoarea oxidanților, care pot provoca deteriorarea celulară [112] sau dezechlibrul dintre manifestarea sistemică a speciilor reactive de oxigen și abilitatea sistemului de a detoxifica cu usurință produșii intermediari sau de a repara leziunile create [277].

Diminuarea nivelelor de antioxidanți poate avea loc ca urmare a unor mutații ce afectează activitatea enzimelor antioxidante (superoxid dismutaza, catalaza, glutation peroxidaza) sau a acțiunii unor toxine asupra acestor enzime implicate în apărarea antioxidantă. De exemplu, multe xenobiotice sunt metabolizate prin conjugare cu glutationul (GSH) și ca urmare în doze crescute pot cauza stres oxidativ chiar dacă xenobioticul însuși nu este un generator de specii reactive. De asemenea deficiența dietară a mineralelor (Zn2+, Mg2+, Fe2+, Cu2+, seleniu) și/sau a antioxidanților poate cauza stres oxidativ [104].

Creșterea producției de specii reactive se datorează expunerii celulelor/organismului la nivele crescute de oxigen sau la acțiunea unor toxine care sunt specii reactive per se sau prin metabolizarea lor. De asemenea, activarea excesivă a sistemului „natural” de producere a acestor specii (a enzimei nitricoxid sintaza (NOS) sau a izoformelor NAD(P)H oxidazei) cresc stresul oxidativ[102].

1.2. Radicalii liberi și clasificarea lor

1.2. Free radicals and their classification

Radicalii liberi (RL) sunt definiți ca atomi sau molecule care au un eletron neâmperecheat și au existență independentă (de aici denumirea de liberi). Pentru a simboliza radicalul liber se folosește un punct. Radicalii liberi pot avea sarcină pozitivă, negativă sau neutră.[165]

A-> minus un electron -> A+.

B -> plus un electron -> B-.

Prezența radicalilor liberi a fost prima dată demonstarată de Moses Gomberg în 1900 prin evidențierea trifenilmetilului care a deschis domeniul unor descoperiri mult mai interesante. La sfârșitul anilor 1930 Leonor Michaelis a propus ca toate reacțiile de oxidare ce implică molecule organice ar fi mediate de radicalii liberi[165].

Unul din paradoxurile vieții este cǎ o moleculǎ ce susține viața aerobǎ, oxigenul, este implicat nu numai în procese metabolice esențiale și respirație ci și în multe boli și condiții degenerative. Deși metabolismul aerob conferǎ mari avantaje formelor de viațǎ pe pamânt, oxigenul – element indispensabil, dar duplicitar – este sursa unor specii foarte active, cu potențial distructiv – „speciile reactive ale oxigenului” (SRO). Astfel, SRO reprezintă de fapt prețul pe care trebuie platit pentru faptul ca respirăm.

Termenul „specii reactive ale oxigenului” desemneazǎ nu numai radicalii de oxigen ( O2·- și OH·) ci și alți derivați non-radicalici ai oxigenului ca: H2O2, HOCl (agent de oxidare și clorurare produs de fagocitele activate), ozonul (O3). În afarǎ de combinațiile radicalice ale oxigenului cu hidrogenul, în sistemele biologice există încă o largă varietate de radicali liberi ale diferitelor combinații între elemente, cum ar fi „ speciile reactive ale azotului” (SRN) [103].

Tabel.1.1.Speciile reactive ale oxigenului; după [249]

Table.1.1.Reactive oxygen species

Majoritatea SRO și SRN provin din surse endogene ca produși ai reacțiilor metabolice esențiale, ca de exemplu:

lanțul respirator mitocondrial – se formeazǎ anionul superoxid prin reducerea monoelectronică a oxigenului;

reacțiile de detoxificare din ficat ce implică citocromii P450;

puseul respirator, proces prin care fagocitele consumă o mare cantitate de oxigen în timpul fagocitozei cu scopul de a omorî bacterii sau virusuri – se formează anionul superoxid (O2·-)

NADPH + 2O2 NADP+ + O2·- + H+

2O2·- + 2H+ H2O2 + O2

Reacția Haber – Weiss – se formează radicalul hidroxil (HO·)

H2O2 + O2·- Fe3+ HO· + HO- + O2

Reacția Fenton – se formează radicalul hidroxil (HO·)

H2O2 + Fe2+ HO· + HO- + Fe3+

Xantin-oxidaza – se formează anionul superoxid (O2·-)

Xantina + 2O2 + H2O acid uric + 2O2·- + 2 H+

Nitricoxid-sintaza (NOS) – se formează monoxidul de azot (NO)

L-Arginina + NADPH + H+ citrulina + NADP+ + NO + H2O

Oxidarea hemoglobinei – se formeazǎ anionul superoxid (O2·-)

Hb (Fe2+-O2) Hb (Fe3+- O2·-)

Sursele exogene includ expunerea la fumul de țigară, la poluanții din mediu, consumul excesiv de alcool, expunerea la radiații ionizante, expunearea la acțiunea unor bacteri, fungi sau virusuri [102].

Creșterea producției ROS este adesea însoțită de scăderea apărării antioxidante fapt ce joacă un rol major în patogeneza multor boli. Deși implicarea SO în procesul patologic este clar dovedită pentru un număr mare de afecțiuni (figura 1.1.), în multe din acestea râmăne totuși întrebarea dacă stresul oxidativ este cauza sau consecința procesului patologic primar [125].

Fig.1.1. Stresul oxidativ: proces patologic contra stare de sănătate [32]

Fig.1.1. Oxidative stress: state of health vs. disease process

1.2.1. Specii reactive de oxigen

1.2.1. Reactive Oxygen Species

Oxigenul gaz cunoscut ca și dioxigen sau oxigen diatomic este o specie de radical liber. În starea de bază conține doi elecroni neâmperecheați. Aceștia sunt localizați pe orbitali π antilegare și au spin paralel (↑↑). Restricția de spin face dificil pentru oxigen să primească o pereche de electroni cu spin paralel atunci când oxidează o moleculă în absența unui catalizator. Acest atom trebuie să primească câte un electron pe rând [214].

Cațiva donori, biologic relevanți, pot determina reducerea cu câte un electron a oxigenului rezultând o altă specie radicalică: radicalul superoxid (O2-.). Superoxidul este de obicei reprezentat în literatură fără punct (O2-). Una din reacțiile de reducere cu câte un electron produce peroxidul de hidrogen (o specie neradicalică), radicalul hidroxil (·OH) și în final ionul hidroxi.

O2→O2‾+2H+→H2O2→OH‾+•OH→OH‾

Oxigenul molecular si ozonul.

Oxigenul în starea inițială poate fi de asemenea transformat în oxigen atomic prin interacția cu molecule triplu excitate cum ar fi protoporfirina IX excitată. Oxigenul molecular are o viață destul de lungă (microsecunde) și electronii de pe ultimul strat cu spin antiparalel. Din cauza lipsei restricției de spin are putere oxidantă mare și astfel este capabil să atace acizii grași polinesaturați din memebrană, resturile de aminoacizi din proteine, ADN-ul și carotenoizii. Leziuni ale pielii în unele cazuri de porfirie sunt atribuite efectului oxidant al 1O2.

Ozonul este un nonradical format din trei atomi. În atmosfera superioară a pământului este un protector împotriva radiațiilor ultraviolete. De asemenea este produs și în smogul urban și este foarte reactiv și toxic pe perioade îndelungate.

Superoxidul

Aproximativ 1-4% din oxigenul consumat de vertebrate produce radicalul O2‾. Mitocondria este principalul loc de producere al O2‾ în celulă prin scapări în lanțul transportor d

Xantin-oxidaza – se formează anionul superoxid (O2·-)

Xantina + 2O2 + H2O acid uric + 2O2·- + 2 H+

Nitricoxid-sintaza (NOS) – se formează monoxidul de azot (NO)

L-Arginina + NADPH + H+ citrulina + NADP+ + NO + H2O

Oxidarea hemoglobinei – se formeazǎ anionul superoxid (O2·-)

Hb (Fe2+-O2) Hb (Fe3+- O2·-)

Sursele exogene includ expunerea la fumul de țigară, la poluanții din mediu, consumul excesiv de alcool, expunerea la radiații ionizante, expunearea la acțiunea unor bacteri, fungi sau virusuri [102].

Creșterea producției ROS este adesea însoțită de scăderea apărării antioxidante fapt ce joacă un rol major în patogeneza multor boli. Deși implicarea SO în procesul patologic este clar dovedită pentru un număr mare de afecțiuni (figura 1.1.), în multe din acestea râmăne totuși întrebarea dacă stresul oxidativ este cauza sau consecința procesului patologic primar [125].

Fig.1.1. Stresul oxidativ: proces patologic contra stare de sănătate [32]

Fig.1.1. Oxidative stress: state of health vs. disease process

1.2.1. Specii reactive de oxigen

1.2.1. Reactive Oxygen Species

Oxigenul gaz cunoscut ca și dioxigen sau oxigen diatomic este o specie de radical liber. În starea de bază conține doi elecroni neâmperecheați. Aceștia sunt localizați pe orbitali π antilegare și au spin paralel (↑↑). Restricția de spin face dificil pentru oxigen să primească o pereche de electroni cu spin paralel atunci când oxidează o moleculă în absența unui catalizator. Acest atom trebuie să primească câte un electron pe rând [214].

Cațiva donori, biologic relevanți, pot determina reducerea cu câte un electron a oxigenului rezultând o altă specie radicalică: radicalul superoxid (O2-.). Superoxidul este de obicei reprezentat în literatură fără punct (O2-). Una din reacțiile de reducere cu câte un electron produce peroxidul de hidrogen (o specie neradicalică), radicalul hidroxil (·OH) și în final ionul hidroxi.

O2→O2‾+2H+→H2O2→OH‾+•OH→OH‾

Oxigenul molecular si ozonul.

Oxigenul în starea inițială poate fi de asemenea transformat în oxigen atomic prin interacția cu molecule triplu excitate cum ar fi protoporfirina IX excitată. Oxigenul molecular are o viață destul de lungă (microsecunde) și electronii de pe ultimul strat cu spin antiparalel. Din cauza lipsei restricției de spin are putere oxidantă mare și astfel este capabil să atace acizii grași polinesaturați din memebrană, resturile de aminoacizi din proteine, ADN-ul și carotenoizii. Leziuni ale pielii în unele cazuri de porfirie sunt atribuite efectului oxidant al 1O2.

Ozonul este un nonradical format din trei atomi. În atmosfera superioară a pământului este un protector împotriva radiațiilor ultraviolete. De asemenea este produs și în smogul urban și este foarte reactiv și toxic pe perioade îndelungate.

Superoxidul

Aproximativ 1-4% din oxigenul consumat de vertebrate produce radicalul O2‾. Mitocondria este principalul loc de producere al O2‾ în celulă prin scapări în lanțul transportor de electroni. Superoxidul este un bun exemplu de radical care se poate comporta fie ca un oxidant (poate oxida forma redusă a NADH la forma oxidată NAD+) sau un agent reducător, acesta fiind mai relevant în biologie. Superoxidul este capabil să reducă Fe3+ legat de citrat, citocromul C, feritină și enzime care conțin grupuri fier-sulf (aconitază), dar nu fierul legat de transferină. Rata de reacție cu lipidele, proteinele și ADN-ul este prea mică pentru a fi biologic important.

Forma protonată a superoxidului, radicalul hidroperoxil, are un potențial reducător mai mic decât O2‾ și este capabil să extragă hidrogen din acizii grași polinesaturați.

Reducerea a câte un electron pentru O2‾ și HOO• duce la H2O2. Dismutarea superoxidului fie spontană fie mediată de superoxid dismutază este sursa principală de H2O2 in vivo. Este postulat că reacția rapidă dintre O2‾ și HOO• este sursa principală de producere, necatalizată, in vivo de H2O2 cu o constantă de producere de 8x107M-1s-1.

Peroxidul de hidrogen este un oxidant relativ slab în comparație cu ozonul, O2‾ și HOO• neputând extrage hidrogen din acizii grași nesaturați. Ceeace face din H2O2 un agent periculos este capacitatea acestuia de a traversa cu ușurință membranele biologice precum și stabilitatea sa mare. Spre exemplu se poate deplasa din mitocondrie spre nucleu unde creează leziuni la nivelul ADN-ului. Totuși în mediul intracelular numeroase sisteme enzimatice și neenzimatice mențin H2O2 la o concentrație scăzută (între 10-9 și 10-8 M).

Radicalul hidroxil. Multe din efectele oxidante ale H2O2 asupra ADN-ului, lipidelor și proteinelor care au fost observate, sunt datorate interacțiunii peroxidului de hidrogen cu metalele tranziționale, în principal Fe2+ și Cu+ rezultând radicali •OH (reactia Fenton) sau celelalte oxometale foarte reactive cum ar fi feril (Fe4+=O). Reducerea cu câte un electron a H2O2 desface legătura O-O formând •OH și OH‾. Radicalul hidroxil poate fi produs și de homoliza indusă de radiații a apei și H2O2 sau de reacția acidului hipocloros cu O2‾ .

H2O2+Fe2+(sau Cu+)→Fe3+(sau Cu2+) +OH‾+ •OH (reacția Fenton)

H2O2+energie→2•OH

HOCl+ O2‾→Cl‾+O2+•OH

Puterea oxidantă a mixturii de H2O2 cu săruri de Fe2+ sau acid tartaric a fost prima dată raportată de Henry J.H. Fenton (chemical News 33:190, 1876).

Reacția H2O2 cu Fe2+ este foarte înceată (102M-1s-1) și este considerată, de către mulți autori, de o importanță biologică limitată. Legarea ferului de compusii cu greutate moleculara mica precum adenozin 5-trifosfat (ATP) sau citrat crește rata de reacție cu două ordine de mărime.

Radicalul hidroxil este implicat în inițierea reacției de peroxidare a lipidelor în membranele biologice cât și oxidarea și modificarea proteinelor, a ADN-ului nuclear și mitocondrial. Carbohidrații și ARN-ul sunt de asemenea ținte ale •OH. Radicalul hidroxil este implicat în procesul natural de îmbătrânire producând leziuni cumulative asupra ADN-ului și proteinelor din celule.

Specii reactive de oxigen formate din acizi grași polinesaturați. Procesul de peroxidare a lipidelor are ca rezultat trei compuși: alchilhidroperoxid (LOOH), radical alchil peroxil (LOO•) și radical alcoxil (LO•).

Ca și în cazul H2O2 alchil hidroperoxizii nu sunt considerați radicali fiind stabili în prezența metalelor tranziționale. Descompunerea lor cauzează formarea unui număr mare de molecule incluzând aldehide și alcani. Unele enzime antioxidante (glutation peroxidaza, glutationS-transferaza și alchil peroxidazele) sunt responsabile cu transformarea hidroperoxizilor alchil în alcoolii corespunzători.

Radicalii alchil peroxid și alcoxil sun specii foarte reactive participand și la procesul de propagare a peroxidării lipidice. Alti peroxizi organici foarte importanti sunt cei produsi din timină, colesterol și anumite reziduri de aminoacizi.

1.2.2. Specii reactive de azot

1.2.2. Reactive nitrogen species

Oxidul nitric (monoxidul de azot, NO) este un gaz cu solubilitate mică în apă dar solubil în solvenți organici. Are o viață scurtă (10-60 secunde) având acces atât în medii apoase cât și în medii lipofile. Reactivitatea sa depinde de cât de repede este înlocuit sau distrus. Este generat prin oxidarea azotul guanidinic terminal al L-argininei rezultând NO și L-citrulină. Reacția este catalizată de nitricoxidsintaze (NOS):

L-arginină + nNADPH+ +H+ + mO2 L-citrulină + NO + nNADP+

Prezența NOS a fost demonstratǎ în multe țesuturi: endoteliu, cerebel, macrofage, neutrofile, epiteliul renal, celulele epiteliale pulmonare, mucoasa gastrică și miocard [1231].

Au fost descrise trei izoforme ale nitricoxidsintazei: două constitutive (c-NOS) și una inductibilǎ (i-NOS). Cele trei izoforme au localizare genică diferită, iar pentru a funcționa necesită patru co-factori: FMN (flavin mononucleotid), FAD (flavin adenin dinucleotid), hem (protoporfirina IX și fier) și tetrahidrobiopterina (BH4). Centrul heminic al NOS are proprietăți spectrale asemănătoare cu cele ale citocrom P450 reductazei.

Enzima din macrofage (i-NOS) este Ca2+- independentă, iar sinteza sa este indusă de lipopolizaharidele bacteriene, IL-1 (interleukina-1), TNF (factorul de necroză tumorală ), INF (interferon-). c-NOS are două izoforme Ca2+- dependente, una izolată din neuroni și una din celulele endoteliale. O mare varietate de molecule precum: acetilcolina, bradikinina, trombina și adenozin-5’-trifosfat (ATP) sunt capabile să crească concentrația de calciu liber, fapt ce duce la activarea c-NOS citoplasmatice. Oxidul nitric generat în celulele endoteliale după creșterea calciului intracelular generează activarea guanililciclazei, enzimă ce transformă GTP în cGMP (guanozin 3’monofosfat ciclic) producând vasorelaxare. Pe acest mecanism își bazează efectul medicamentele adminstrate în bolile de inimă (ex. nitroglicerina) [281].

NO din endoteliul vascular a fost inițial identificat ca „factorul de relaxare a endoteliului vascular” (EDRF, endothelium-derived relaxing factor) cât și ca miocardial depresor factor (MDF). i-NOS determină sinteza NO în cantitate mai mare comparativ cu celelalte două izoenzime c-NOS.

NO, având un electron neîmperecheat, poate reacționa cu oxigenul, cu radicalii superoxid și cu metalele tranziționale (fier, cupru, cobalt și mangan) mediind o mare varietate de fenomene fiziologice și patologice printre care: vasorelaxarea endotelială, citotoxicitatea mediată de macrofage, previne adeziunea și agregarea plachetară, relaxează corpul cavernos, reglează tensiunea arterială, previne spasmul piloric din stenoza pilorică hipertrofică infantilă, reglează funcțiile imune [30].

Pare paradoxal că NO, pe de o parte, poate să acționeze ca mesager intercelular fiziologic și pe de altă parte, să aibă o activitate citotoxică. Mai mult, NO are și proprietății citoprotectoare, inhibând peroxidarea lipidică. Pe drept cuvânt numită „sabie cu două tăișuri”, molecula de NO poate fi pe atât de toxică pe cât este de protectivă, efect ce depinde nu atât de concentrația de NO, cât de durata de supraviețuire a acestuia. Astfel, NO sintetizat după activarea c-NOS are o viață scurtă (secunde sau minute) în timp ce molecula kiler NO sintetizată de i-NOS are o durată de viață mult mai mare [156].

Oxidul nitric poate reacționa cu proteine (leagă proteine cu hem: guanidilciclaza, hemoglobina și citocrom c oxidaza) și cu acizii nucleici. Prima țintă a oxidului nitric în legarea covalentă de grupările proteice în condiții fiziologice și în prezența oxigenului sunt gruparile tiol (-SH). După difuzie în celula țintă, NO poate inhiba enzimele SH-dependente prin S-nitrozilare (proteinkinaza C, gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza, glutation peroxidaza, glutation reductaza, creatinkinaza, papaina, etc). De asemenea, NO mediază eliberarea fierului din celulele țintă prin distrugerea centrelor Fe-S din enzime precum: aconitaza (enzimă din ciclul acidului citric), ferochelataza (enzima ce catalizează ultima etapă a biosintezei hemului, legarea fierului la protoporfirina IX). O altă țintă intracelulară este mitocondria, NO mediind inhibarea lanțului respirator mitocondrial prin producerea de peroxinitrit [281].

Exprimarea i-NOS este reglată la nivel transcripțional și posttranscripțional prin căile de semnalizare ce implică agenți precum factorul transcripțional redox-sensibil NF-kB sau proteinkinazele activate de mitogeni, MAPKs. i-NOS este inhibată de glucocorticoizi prin inhibarea factorului nuclear NFkB. Rata sintezei NO este, de asemenea, determinată de disponibilitatea substratului L-arginină și de prezența co-factorului tetrahidrobiopterină. Sinteza de NO este inhibată de compuși cu structură asemănătoare L-argininei și de aminoguanidine [156].

Peroxinitritul (ONOO-) – Prin oxidarea NO se formează cationul nitrozoniu NO+, iar prin reducerea NO se formează anionul nitroxil NO-. Nitroxilul este o specie reactivă care formează peroxinitritul prin reacție cu anionul superoxid:

NO- + O2- ONOO-

Viteza acestei reacți este comparabilă cu cea de dismutare a anionului superoxid de către superoxid dismutază (SOD). Peroxinitritul, generat prin reacția oxidului nitric cu superoxidul, este toxic și extrem de reactiv. Superoxid dismutaza, cu rol de captator al O2-, scade nivelul NO, împiedicând formarea de peroxinitrit. În condiții fiziologice, peroxinitritul generează derivați ai azotului. Protonarea rapidă a peroxinitritului duce la depleția grupărilor –SH, oxidarea lipidelor, nitrarea și dezaminarea bazelor azotate din ADN, nitrarea resturilor de acizi aromatici din proteine.

Peroxinitritul este implicat în:

procesele inflamatorii – are rolul de a lupta contra microbilor, dar în inflamația cronică, formarea necontrolată, crescută de peroxinitrit conduce la leziuni tisulare;

ateroscleroză

ischemie/reperfuzie

apoptoză – peroxinitritul inhibă enzimele implicate în metabolismul energetic, stimulează poli ADP-riboziltransferaza (PARP), crește efluxul mitocontrial cu mărirea concentrației de calciu intracelular ducând în final la moarte celulară. În culturile de timocite, nitrozilarea tirozinei și oxidarea factorilor de transciere de către peroxinitrit declanșează apoptoza [156].

Supraproducția SRN ce denumită și stres nitrozativ, are loc atunci când generarea RNS se face cu o viteză mult mai mare procesului de neutralizare și eliminare. Stresul nitrozativ poate duce la inițierea reacțiilor de nitrozilare care ulterior vor altera structura proteinelor inhibând astfel funcția lor fiziologică [227].

1.3. Surse de stres oxidativ

1.3. Sources of oxidative stress

1.3.1. Surse endogene

1.3.1. Endogenous sources

1.3.1.1. Surse biochimice

1.3.1.1. Biochemical sources

NADPH oxidaza

Mitocondria este recunoscută ca fiind sursa principală de energie pentru celulă și, în același timp, atât cea mai importantă sursă de radicali liberi cât și ținta leziunilor oxidative inițiate de adicalilor din multe stări patologice. Astfel mitocondria este sursă majoră a moleculelor de semnalizare ce comandă ciclul celular, proliferarea celulară și apoptoza. Printre acestea un rol aparte îl au anionul superoxid și monoxidul de azot precum și produși lor de reacție peroxidul de hidrogen și peroxinitritul. O întreagă rețea intramitocondrială de antioxidanți constituită din Mn-SOD, GPx și GSH cooperează în minimalizarea potențialelor efecte nocive ale acestor radicali liberi [41].

Sursa principală de O2·- și H2O2 este reprezentată de puseul respirator, atât din celulele fagocitice (macrofagele activate și neutrofilele) cât și din cele non-fagocitice (fibroblaste, condrocite, miocite, celule endoteliale) [271].

Granulocitele polimorfonucleare (PMN) sunt celule fagocitare foarte active, având o mare susceptibilitate la semnalele factorilor chemotactici, un remarcabil potențial de aderare la suprafețe ce le dezvoltă o mare capacitate de locomoție și o intensă activitate fagocitară, ce are ca rezultat distrugerea în întregime a materialului internalizat inițial. De asemenea, au un potențial oxidativ foarte ridicat, care pe de o parte este stimulat de diverse semnale ajunse la membrana celulară iar pe de altă parte este supus unui control sever exercitat de enzime antioxidante precum: superoxid dismutaza, catalaza, glutationperoxidaza etc. Unele citokine precum TNFα și IL-1β le activează potențialul oxidativ, respectiv capacitatea de producere a ROS [232].

Consecutiv contactului cu agresorii (microbi, toxine, celule moarte) PMN trec din starea de repaus (de celule cantonate în țesuturile normale) într-o stare de alarmă. Datorită capacității de locomoție în urma recepționării semnalelor chemotactice, încep să se deplaseze spre locul de unde sunt transmise semnalele, pentru ca, în final să devină PMN active capabile să pinociteze sau să fagociteze agresorul. Atât pinocitoza cât și fagocitoza implică înglobarea (internalizarea) elementelor străine sau proprii dar modificate de organism în vederea omorârii sau degradării acestora [159].

La baza capacității de locomoție a PMN stau procesele de deformare (elasticitate) și de lipsă de deformare (plasticitate) date de polimerizarea unor microfilamente contractile de actină și miozină. Polimerizarea are loc sub influența unor factori chemotactici fixați la receptori speciali exprimați pe suprafața membranei plasmatice a PMN [203]. După pinocitoza sau fagocitoza agresorului, are loc un așa numitul proces “respiratory burst” (puseul oxidativ sau puseul respirator) caracterizat printr-o rapidă creștere în consumul celulei a radicalilor de oxigen și generarea din oxigenul molecular a radicalilor liberi de oxigen toxici [159].

Puseul oxidativ implică acțiunea unui grup de enzime cunoscute ca nicotinamidadenindifosfat oxidaze (NADPH-oxidaze; NOX), enzime aflate în citoplasmă și membrana fagozomului. Membrii familiei NOX sunt sumarizați în tabelul 1.2. [143].

Principalul efect al acestui grup de enzime este acela de a converti oxigenul molecular în anionul superoxid (O2-), o specie înalt oxidativă ce are doi electroni neîmperechiați, fiecare electron fiind capabil de a reacționa cu un alt electron fapt ce duce la formarea unui alt radical liber, radicalul hidroperoxid (H2O2) (Figura 1.2.) [265].

Macrofagele și neutrofilele activate sunt capabile să elibereze și NO [46]. Toți acești radicali liberi formați sunt capabili să determine denaturarea atât a proteinelor și lipidelor, cât și a ADN-ului, procese incompatibile cu viața bacteriilor și chiar a celulelor nucleate [159].

Fig.1.2. Puseul respirator din celulele fagocitice [265]

Fig.1.2. Respiratory burst on phagocytic cells

Tabelul. 1.2. Membrii familiei NOX – caracteristici principale, după [143]

Table. 1.2. NOX family members – main characteristics

În condiții normale, radicalii liberi sunt neutralizați de enzimele endogene, însă, în polimorfonuclearele activate, ei sunt produși într-o cantitate mult mai mare decât ar putea să fie neutralizați ducând la acumularea lor. Radicalul superoxid și peroxidul de hidrogen (H2O2), odată formați, au un timp de înjumătățire crescut, prezența lor în țesut depinzând de abilitatea celulei de a-i neutraliza. Astfel, anionul superoxid este neutralizat de enzima superoxid dismutaza (SOD) care-l transformă în H2O2, acesta fiind inactivat de către catalază (CAT) sau de către peroxidaze precum glutation peroxidaza (GPx). CAT transformă H2O2 în molecula de oxigen netoxică și apă. Aceste enzime antioxidante sunt în general localizate intracelular, în fluidele extracelulare găsindu-se numai într-o cantitate foarte mică [104]. Dacă sinteza acestor enzime este scăzută atunci radicalul superoxid și H2O2 pot forma un alt radical cu potențial oxidativ mai mare și anume, radicalul hidroxil pentru care nici un sistem de detoxifiere nu a fost încă descoperit. De asemenea, puseul oxidativ major, foarte eficace în distrugerea virusurilor, bacteriilor și fungiilor este dat de reacția H2O2 cu clorul care generează, în prezența mieloperoxidazei (MPO), acidul hipocloros (HOCL) [159].

După lichidarea agresorului, procesul reactiv se stinge, granulocitele nu mai eliberează radicali de oxigen și intră în faza de repaus. Dacă, dintr-un motiv sau altul, enzimele antioxidante nu sunt produse de către celulele organismului, atunci puseul oxidativ continuă să persiste și distruge celulele proprii din vecinătatea focarului de necroză, lezarea țesuturilor se extinde putându-se croniciza. În consecință, activarea granulocitelor PMN are o importanță deosebită în apărarea organismului dar poate fi uneori responsabilă de procese autodistructive, atât datorită eliberării în exces a enzimelor proteolitice cât, mai ales, a oxigenului toxic [203].

Determinarea intensității puseului oxidativ granulocitar se poate realiza in vitro prin chemiluminometrie cu luminol/lucifenină, în urma stimulării cu PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate) sau OZ (zimozan opsonizat). PMA este un analog structural al diacilglicerolului care fosforilează direct proteinkinaza C (PKC) activând-o, fapt ce duce în final la activarea NADPH-oxidazelor și producerea unei mari cantități de ROS. Activarea NADPH oxidazelor realizată de PMA are loc pe partea citosolică a membranei plasmatice urmând ca, ulterior, să aibă loc translocarea pe fața mitocondrială. PMA induce activarea oxidazelor fapt ce pare legat de eliberarea extracelulară a metaboliților ROS. Aceste concluzii au fost trase în urma experimentelor ce detectează radicalul superoxid și peroxidul de hidrogen format extracelular utilizând molecule ce nu pot străbate membrana neutrofilelor și ca urmare detectează doar ROS extracelular. Luminolul (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phtalazinedione) detectează ROS intra și extracelular însă producția este strict dependentă de activitatea peroxidazică a MPO. Lucigenina din contră detectează numai superoxidul format extracelular [111].

Pe lânga interacția cu radicalul superoxid și peroxidul de hidrogen, luminolul poate reacționa cu HOCl și cu peroxinitritul (produsul reacției dintre monoxidul de azot și radicalul superoxid) [222]. Mai mult decât atât, a fost chiar sugerat că nitricoxid sintaza (NOS; enzima ce catalizează formarea NO din L-arginină și O2) contribuie la emisia de lumină cuantificată prin chemiluminometrie cu luminol, în urma stimulării cu PMA a celulelor Kupffer activate [131].

De asemenea ROS pot fi generați și în urma stimulării cu zimozan opsonizat (ZOP) care după fagocitoză va activa NADPH oxidazele via PKC fig.1.3 [175]. Zimozanul este preparat din peretele celulei bacteriane și este alcătuit dintr-un complex de proteine carbohidrate. După opsonizare cu anticorpii și factorii sistemului complement, care vor fi recunoscuți de receptorii prezenți pe suprafața PMN, în urma fagocitozei, are loc activarea NADPH oxidazelor via PKC [65].

Asamblarea și activarea NADPH oxidazei este reglată de influxul de calciu și de eliberarea calciului din depozitele intracelulare fapt ce va determina fosforilarea cPLA2 într-o manieră dependentă de activarea PKC și respectiv producerea acidului arahidonic (AA). AA reglează translocarea p47phox și p67phox la membrană, translocare ce se poate realiza și în urma fosforilării. Studii recente indică faptul că această fosforilare implică participarea PKC. De asemenea, activarea NADPH oxidazei este controlată și de către izoformele rac, rac2 în neutrofile și rac1 în macrofage. În urma activării monocitelor, Rac1 disociază din inhibitorul său, rhoGDI și este translocat la membrană, fapt ce va determina, în final, activarea NADPH oxidazei [175]; [127].

Fig.1.3.Activarea NADPHoxidazei via PKC în urma stimulării cu zimozan opsonizat (ZOP)[175]

Fig.1.3.Activation of NADPHoxidase via PKC after stimulation with opsonized zimozane (ZOP)

Produșii activității NOX (O2- și H2O2) pot activa cascada MAPK la nivelul MEK și ERK1/2. Studii experimentale asupra reglării MAPKs de către H2O2 au arătat că activarea fiecărei căi de semnalizare este dependentă de tipul și intensitatea stimulului. De exemplu, a fost raportat faptul că producția endogenă de H2O2 via “puseu respirator” induce activitatea ERK dar nu a kinazelor p38 [119]. Menținerea echilibrului între activarea ERK și JNK reprezintă un factor cheie în supraviețuirea celulară atâta timp cât scăderea ERK și/sau creșterea JNK sunt necesare în inducerea procesului apoptotic [167].

Xantin oxidaza sau oxidoreductaza

În timpul ischemiei ATP-ul este metabolizat în adenoznină prin intermediul adenozindeaminazei, adenozina este transformată în inozină, care, apoi, este descompusă în hipoxantină . Deși hipoxantina poate fi transformată în xantină de către xantinoxidază (XO), xantina se poate forma și independent din guanozin monofosfat (GMP) prin metabolismul purinic. Această degradare catalitică a purinei este de asemenea asociată cu formarea de H2O2 și O2•‾.

ATP→ADP→AMP→adenozină→inozină→hipoxantină

Xantinoxidaza aparține familiei de molibdoflavoenzime și este eliberată de proteazele declanșate de calciu în timpul hipoxiei.

Hipoxantina sau xantina poate trece prin procese reductive la centrii de Mo-Co. Doi electroni sunt transferati de la xantină la xantinoxidază astfel reducând Mo hexavalent la Mo cu valența patru. Reacția de oxidare are loc la FAD, fiind mediată de centrele de Fe2-S2, aceasta menținand Mo ca Mo molibden hexavalent și FAD ca FADH2. Transferul de electroni de la FADH2 la NAD+ sau O2 se întîmplă în timpul reoxidării xantinoxidazei reduse. Primele două procese implică reducerea cu câte doi electroni a O2 pentru a forma H2O2, apoi următorii doi electroni sunt folositi ca să reducă O2 la O2•‾. În total producandu-se două molecule de H2O2 și două de O2•‾[92].

Lanțul mitocondrial transportor de electroni (METC)

Metabolismul O2 implică o serie de transferuri electronice între donor (NADPH) și acceptor (O2) prin METC cu un transfer constant de protoni din interiorul membranei mitocondriale . Acest proces implică transferul a câte patru electroni din citocrom c oxidaza la O2 pentru a forma două molecule de apă și patru molecule de H+

4cyt cred +O2+8H+→4cyt cox+2H2O+H+

Metabolizarea parțială a O2 se produce înaintea reducerii sale la apă de către citocrom c oxidaza. Este estimat că în condiții normale 1-2% din oxigenul consumat de mitocondrie este transformat în ROS. Acest fenomen denumit scurgere de electroni este mai pregnat în situații fiziopatologice. Cea mai importantă sursă de radicali din mitocondrie este NADH dehidrogenaza și ubiquinona [92].

Hemoglobina

Oxigenul se leagă de hem Fe(II) într-o manieră reversibilă și stabilă constituind baza funcționării hemoglobinei. Totuși hemul poate suferi autooxidare și formează Fe trivalent și O2•‾ astfel producandu-se stresul oxidativ în hematii [92].

Hb (II)O2→Hb+ + O2•‾

Sintaza oxidului nitric

Catalizează producerea oxidului azotic din L-arginină prin trecerea unui electron de la NADPH→FAD→FMN→hem→oxigen bazat pe ecuația

L-arginina+3/2NADPH+H++2O2→citrulina+NO+3/2NADP+

Fe (III) după reducerea de către FMNH2 la Fe(II) permite legarea cu O2 pentru a forma un complex fer-dioxi Fe(III)O2‾, care, la rândul său se reduce cu câte un electron cu ajutorul tetrahidrobiopeterin (H4B) pentru a forma O-O care este descompus în apă și o specie Fe-peroxid care hidroxilează azotul de la guanina din L-arginină și în final duce la formarea NO [92].

Citocromul P450 (CYP)

Este una dintre cele mai importante clase de enzime responsabile pentru oxidarea substanțelor organice folosind ca substrat lipide și steroizi dar și xenobiotice (180,181).Efectul catalitic al CYP este formarea de oxo-feril (FeIV=O) ca formă oxidată a hem-ului. Ca și în cazul NOS, nereducerea Fe(III)O2‾ duce la producția de O2•‾[92].

Ciclooxigenaza (COX) și lipooxigenaza (LPO)

Metabolismul acidului arahidonic poate media procese celulare importante cum ar fi inflamația, chemotactismul și reglarea tonuslui muscular. Formarea metaboliților ca prostaglandine, tromboxani și leucotriene generează ROS [92].

Reticulul endoplasmatic (RE)

Este un organit responsabil pentru împachetarea și maturarea proteinelor. Împreună cu complexul Golgi este implicat în transportul noilor proteine, lipide și altor molecule mici către destinația lor. Recent s-a descoperit ca RE este implicat în stresul oxidativ mediat de hipoxie și diabet (172). În timpul acumularii de proteine nou sintetizate nepliate este activat raspunsul față de proteinele nepliate (UPR) ceea ce cauzează diverse reacții inflamatorii și semnale de stres. Mecanismu producerii de radicali din reticulul endoplasmatic a fost pus pe seama unei oxidaze care conține flavina (Ero1p) datorită posibilității de a produce apă oxigenată din oxigenul molecular atunci când acționează asupra unor substraturi tiol.

E-FAD+2RSH→EFADH2+RSSR

EFADH2+O2→EFAD+H2O2

Ero1p este responsabil pentru formarea legaturii disufidicice în celulele eucariote în condiții aerobe și anaerobe. A fost demonstrată abilitatea Ero1p de a transfera electroni către alte molecule mici și macromolecule acceptoare de electroni.[16].

1.3.1.2. Surse genetice

1.3.1.2. Genetic sources

Un mare număr de studii publicate în ultimii ani au arătat că anumite SRO/metale sunt capabile să afecteze activarea sau activitatea factorului de transcripție NF-kB [1331];[1431]. NF-kB este un factor de transcripție dimeric format dintr-o proteină de 50 kDa (p50) și una de 65 kDa (p65). În forma inactivă este legat de un inhibitor, o proteină citoplasmatică, numită 1 kappa B (I-kB α/β). Citokinele proinflamatorii și diverși patogeni ce acționează pe această cale duc la activarea unei kinaze, IkB kinaza (IKK) și a proteinei reglatoare NEMO (NF-kB essential modifier; IKKγ). Activarea IKK inițiază fosforilarea I-kB α/β la un rest de serină NH2 terminal [113]. Fosforilarea I-kB α/β determină degradarea acesteia și eliberarea dimerului NF-kB din complexul NF-kB-IkB în citoplasmă și translocarea ulterioară în nucleu, unde va activa transcrierea unor gene. NF-kB este un factor de transcriere sensibil la statusul redox [262].

Principalele acțiunile ale NF-kB sunt:

1) activarea posttranslațională ca răspuns la acțiunea a numeroși stimuli patogeni

2) directa participare în semnalizarea citoplasmă – nucleu

3) abilitatea de a activa transcripția a numeroase gene implicate în ciclul celular, diferențiere, creștere, inflamație și angiogeneză [37];[167].

Astfel, calea NF-kB este una dintre cele mai importante căi de semnalizare, activată ca răspuns la acțiunea unor citokine proinflamatorii (TNF-α, IL-1, IL-2, IL-8). Activarea acestei căi joacă un rol major în procesul inflamator, prin activarea în cascadă a unor gene ce codifică citokine proinflamatorii, molecule de adeziune, chemokine, factorii de creștere și enzime inductibile, precum ciclooxigenaza 2 (COX-2) sau nitricoxidsintaza forma inductibilă (iNOS) [223].

Numeroase citokine (IL-1, TNF-α) determină activarea NF-kB și translocarea acestuia în nucleu, în schimb, prezența antioxidanților (flavonoidele, acidul acetilsalicilic, N-acetilcisteina (NAC) pot inhiba activarea NF-kB. Blocarea activării NF-kB de către antioxidanți poate avea efecte pozitive in răspunsul organismului la grefe, în șocul toxic/septic, în răspunsul inflamator acut și în leziunile produse de radiații [167].

AP-1 (activator protein-1) este un factor de transcripție sensibil la statusul redox celular. AP-1 conține homo sau heterodimeri ai Fos (c-Fos, FosB, Fra-1 and Fra-2), Jun (c-Jun, JunB, JunD) sau subunități ATF (factorul activator al transcrieri) care recunosc fie elementele de răspuns TPA (12-O-tetradecanoilforbol-13-acetat) fie CRE (cAMP response elements). Izoformele JNK aparțin unei familii de proteinkinaze activate de stres ce include și proteinkinaza p38, dintre acestea JNK-1 și 2 sunt exprimate în marea majoritate a țesuturilor, în timp ce, izoforma JNK-3 este exprimată predominant în neuronii muschiul cardiac și testicule [1465]. Fosforilarea JNK este mediată prin cooperarea a două MAPK kinaze (MAPKKs): MAP2k4 (sau MKK4) și MAP2k7 (sau MKK7) [47].

Multe gene proinflamatorii, incluzând aici pe cele care codifică sinteza TNF-α, IL-2, IL-6, E-selectina, ICAM-1, VCAM-1, COX2 și MMPs-1,-9,-12 și 13 sunt reglate pe calea JNK/AP-1 [262].

p53 este de asemenea un factor nuclear cheie în procesul de tumorigeneză. Datorită abilității sale de a opri creșterea sau de a iniția apoptoza unei celule lezate a fost ades numit “supresor tumoral” sau “paznicul genomului”. Mutații ale p53, ce duc la inactivarea sa au fost găsite în mai mult de jumătate dintre cancerele umane [108].

Cele mai bine caracterizate ținte ale ROS rămân totuși protein tirozinfosfatazele (PTPs). Inactivarea ireversibilă a PTPs de către ROS (prin acțiune directă asupra reziduurilor de cisteină de la nivelul situsului catalitic activ) joacă un rol important în controlul redox și în procesul de semnalizare celulară [15]. Inhibarea PTPs de către ROS se poate realiza și prin acțiunea asupra PTKs (non-receptor protein kinases) aparținând familiei Src (Src kinaze) sau Janus kinaze (JAK) [141]. De exemplu, H2O2 și O2·- pot induce fosforilarea la nivelul reziduurilor de tirozină a câtorva PTKs în diferite tipuri celulare, incluzând aici: fibroblaste, limfocitele B, limfocitele T, macrofagele și celulele mieloide. Src activate se leagă la membrana celulară și inițiază căile MAPK, NF-kB și PI3K (figura 1.4) [167].

Fig.1.4. Inducerea căii MAPK de către SRO [167]

Fig.1.4. Induction of MAPK pathway by SRO

1.3.2. Surse exogene

1.3.2. Exogenous sources

1.3.2.1. Radiatiile ionizante și 2-alchilciclobutanonele

1.3.2.1. Ionizing radiation and 2-alkylcyclobutanones

1.3.2.1.1. Radiațiile ionizante

1.3.2.1.1. Ionizing radiation

Din studierea efectului radiațiilor ionizante asupra celulelor s-a ajuns la concluzia că ținta cea mai importantă este ADN-ul și mecanismul morții celulare fiind legat de ruperile dublu catenare [214].

Procesul mortii celulare implică două mecanisme: acțiunea directă în care radiațiile sunt absorbite de către ADN sau acțiunea indirectă în care radiația interacționează cu alți atomi sau molecule din celulă (mai ales apa) pentru a produce radicali liberi care sunt capabili să difuzeze suficient astfel încat să ajungă la ținte critice.

Fig.1.5. Modelul ruperilor duble de ADN cu directiile de trecere a electronilor. Actiune directa prin ionizare si indirecta prin radicalii OH [114].

Fig.1.5. A model of the double-stranded breaks of DNA with electron tracks. Direct action through ionization hits and indirect action through HO•.

Formarea de radicali liberi după iradiere a fost studiată de mai multi autori. Formarea radicalilor liberi prin ionizare. Formarea de radicali liberi în urma acțiunii radiațiilor ionizante este [58]:

H2O iradiere → H2O+ + e‾

e‾ + H2O → H2O‾

H2O+ → H+ +HO•

H2O‾ → H• + HO‾

H•+H• → H2

HO• + HO• → H2O2

H• + HO• → H2O

H2O + H• → H2 + HO•

H2O2 + HO• → H2O + HO2•

Și substanțele organice (RH) vor reacționa:

RH + OH• → R• +H2O

RH + H• → R• + H2

RH iradiere → R• + H•

Studii recente arată că ROS joacă un rol important în semnalizarea și moartea celulară indusă de radiații ionizante [243]. Pentru că apa este cel mai abundent material intracelular este expusă reacțiilor de descompunere care dau naștere unei serii de radicali liberi. Acești produși pot oxida membranele lipidice și pot ataca proteinele sau ADN-ul. Cei mai mulți ROS sunt radicali hidroxil a cărui constantă de reactie cu ADN-ul este 1.1 x 1010 M-1s-1. Se știe că evenimentele celulare cauzate de iradiere se produc în microsecunde și sunt urmate de repararea ADN. Studii recente a arătat că alte organe din citosol (membrana celulară, aparatul Golgi, reticulul endoplasmic, mitocondria) sunt implicate în efectul intracelular al radiației în sensul transducției și translocației căilor semnalizării apoptozei celulare [237];[67].

Mecanismul apoptozei are doua cai principale: 1 calea FAS și calea mitocondrială.

Calea FAS este declanșată de membrii familiei receptorilor morții celulare cum sunt: factorul de necroza tumorală (TNF), receptorul ligandulului legat de apoptoză al TNF (TRAILR) și FAS/CD95. Legarea FAS/CD95 la receptorul acestuia determină aglomerarea receptorilor și formarea unui complex de semnalizare a morții celulare. Acest complex activează procaspaza 8 la caspaza 8 prin proteinele asociate FAS (FADD)[174].

Calea mitocondrială este declanșată ca răspuns la stimulii externi și modificări interne cum ar fi lezarea ADN-ului [267]. Aceste căi de răspuns diversificate includ activarea p53 și proteinei x asociate bcl2 (BAX) având acțiune sinergică asupra mitocondriei și ducând la eliberarea citocromului c din mitocondrie.

Fig.1.6. Schema de principiu a două căi apoptotice majore: calea receptorilor morții celulare și calea mitocondriala. Legarea acestor molecule la receptorii mortii celulare declanșează moartea celulară pe calea receptorilor și activarea căilor mitocondriale de este observată în mare parte ca răspuns la caile extracelulare cum este iradierea [114].

Fig.1.6. Schematic diagram of two major apoptotic pathways: the death receptor pathway and the mitochondrial pathway.Binding ligands to death receptors triggers the death receptor pathway, and activation of the mitochondrial pathway is observed extensively in response to extracellular cues such as irradiation.

Citocromul c se leagă de procaspaza 9 și factorul apoptotic 1 de activare proteazică (Apaf-1) pentru a forma apoptozomul. Bcl2 este o proteină inhibitoare a apoptozei care se află în mitocondrie și inhibă eliberarea citocromului c din mitocondrie [239].

1.3.2.1.1. A. Radiațiile β

1.3.2.1.1. A. β radiation

Au fost descoperite în 1900 de către Henri Becquerel care a arătat că acestea sunt identice cu ectronii.

Particulele β au sarcina electrica -1, viteza fiind dependentă de energia pe care o au. Energia este transferată substantelor chimice întâlnite desfacând legaturile chimice și formând ioni.

Emisiile de particule β se produc atunci când raportul dintre neutroni și protoni este prea mare. În acest caz un neutron se transformă într-un proton și un electron. Protonul rămâne în nucleu și electonul este ejectat energic. Acest proces scade numărul de neutroni cu unu și crește numarul de protoni cu unu. Pentru că numarul de protoni dintr-un atom determina elementul transformarea unui neutron în proton schimbă radionuclidul într-un element diferit. În cele mai multe cazuri emisia gama însoțește emisia beta. Când particula beta nu preia toată energia excedentară a nucleului, acesta o eliberează sub forma unui foton gama. Particulele beta au traseu de câțiva centrimetri în aer și sunt oprite cu ușurința în materialele solide [31]. În cazul particulelor beta emise de lutețiului-177 parcursul maxim în aer este de 135cm iar în apă de 1,6 cm [212].

1.3.2.1.1. B. Radiațiile UV

1.3.2.1.1. B. UV radiation

Spectrul ultraviolet este împarțit în trei benzi în funcție de lungimea de unda – UVA, UVB și UVC. Împarțirea este oarecum arbitrară și diferă în funcție de disciplina care utilizează acest date. În fotobiologia mediului sunt definite astfel: UVA 400-320nm, UVB 320-290nm și UVC 290-200nm. Limita dintre UVB și UVC a fost aleasa ca fiind de 290nm pentru că este improbabil ca radiații cu o lungime de undă mai mică să ajungă pe pămant (cu excepția altitudinilor mari)[69].

Expunerea la radiații UV este cunoscută că stimulează producția intracelulară de ROS (în special superoxid și peroxid de hidrogen) și specii reactive de azot (oxidul azotic). Acest dezechilibru creat între ROS/RNS și sistemul de apărare antioxidantă duce la stres oxidativ. UVB poate fi absorbit direct de către bazele ADN-ului inducând astfel leziuni în interiorul celulei. Cea mai întâlnită leziune cauzată de UV este formarea de fotoproduși dimerici între pirimidinele alăturate ale aceleeași catene de ADN. S-a arătat că UVB determină oxidarea reziduurilor de guanidină printr-un proces mediat de ROS și modifică nivelul de enzime antioxidante (superoxid dismutaza, glutation peroxidaza și catalaza). Efectul dăunător al UVA este în principal determinat prin generarea de ROS/RNS și mai puțin prin lezarea directă a ADN-ului [171].

1.3.2.1.2. 2-alchilciclobutanonele

1.3.2.1.2. 2-alkylcyclobutanones

Iradierea alimentelor care conțin grăsimi duc la producerea de cantități foarte mici de compuși din familia 2-alchilciclobutanonelor incluzând 2-dodecilciclobutanona. Aceste molecule se găsesc doar în alimetele care conțin grasimi iradiate și sunt considerate markeri ai iradierii. Există metode de detectare a alimetelor iradiate care se bazează pe dependența lineara dintre doza de iradiere și concentrația acestor compuși. Comitetul european de standardizare a publicat o metodă de identificare a alimentelor iradiate bazată pe acest principiu [84].

Pentru pui, a fost raportată o cantitate de aproximativ 0,342μg 2-DCB/g lipide/kGy. Carnea și pielea conțin aproximativ 12,6% grăsime rezultând că 100 g de carne/piele ar conține 4,3μg de 2-DCB / kGy. La o medie de doză cumulată absorbită de 3 kGy, se ajunge la aproximativ 12.9μg pentru 100 g carne de pui. Bazat pe consumul mediu de pui în România de aproximativ 50g/zi [259] aportul de 2-DCB ar fi de aproximativ 0.10μg/kg greutate corporală în cazul în care carnea ar fi iradiată.

Cu toate că 2-DCB este foarte utilă pentru chimia analitică prezenta sa a ridicat întrebări în privința toxicității. Cercetatorii germani (Delincée et al.) de la Centrul de Cercetare Federal pentru Alimentație, din Karlsruhe, Germania, au raportat, prin metoda cometei, rezultate interpretate ca fiind inductoare de genotoxicitate. Testul cometei nu este o metodă validată sau adecvat standardizată și, în timp ce funcționează bine pentru agenții genotoxici puternici, aceasta nu funcționează bine pentru agenții slab genotoxici. Testul Cometei pune în evidență leziunile ADN-ului, care pot fi reparate și, prin urmare, nu pot duce la modificări genetice permanente.

Comitetul Științific pentru Alimentație al Comisiei Europene a declarat că, în ceeace privește siguranța alimentelor care conțin grasimi animale iradiate se poate baza pe numărul mare de studii efectuate, publicate pâna în prezent de de OMS ( Organizația Mondială a Sănatății)/FAO (Organizația pentru Alimentație și Agricultură a Națiunilor Unite)/IAEA ( Agenția Internațională Pentru Energie Atomică) care au stat la baza evaluării salubrității produselor alimentare iradiate [84].

Capitolul II – Stresul oxidativ la nivel celular

Chapter II – Oxidative stress at the cellular level

2.1. Actiunea stresului oxidativ asupra compartimentelor celulare

2.1. The action of oxidative stress on cellular compartments

2.1.1. Actiunea stresului oxidativ asupra materialului genetic (ADN-ului)

2.1.1. The action of oxidative stress on the genetic material (DNA)

Speciile reactive de oxigen precum superoxidul, peroxidul de hidrogen, radicalul hidroxil și oxigenul atomic sunt produse prin metabolismul celular normal și formarea acestor radicali este stimulată de radiațiile ionizante și diferiți compuși chimici [83]. Acizii nucleici în prezența radicalilor liberi generează baze modificate, fiind detectate peste 20 de tipuri de purine și pirimidine modificate printre care și 8-oxo-7, 8-dihidroguanina (8-oxoguanina) este cea mai abundentă și joacă un rol important în mutageneză și carcinogeneză [115].

Există o clasă de enzime MUT care sunt specializate în excizarea acestor purine și pirimidine oxidate pentru a împiedica împerecherea acestora cu baze complementare pentru refacerea ADN-ului.

Radicalii liberi atacă purinele și pirimidinele în principal prin adaugarea de •OH la legatura pi a bazelor dand naștere la compuși C4-OH-C8-OH ai purinelor și C-5-OH- , C-6-OH- ai pirimidinelor și rezultând astfel o gamă largă de baze modificate. Unele dintre ele sunt instabile și se descompun în compuși mai stabili [193].

Frecvența leziunilor ADN este determinată de: eficiența de reparare a fiecărei leziuni, dacă ADN polimerazele pot să treacă peste o anumită leziune (sinteza intralezională – este un proces de toleranță care permite proceselor de replicare ale ADN-ului să replice leziuni cum sunt dimerii de timidină și situsuri apurinice), dacă o bază corectă sau incorectă este introdusă în partea complemantară a leziunii daca intervine sinteza translationala. Când leziunile ADN sunt induse de ROS acestea sunt îndepărtate de către enzimele celulare restabilind secvența inițială. Dar când se produce replicarea celulară înainte ca leziunea să fie îndepartată se poate produce blocarea replicării sau sinteza translezională. Dacă leziunea blochează complet replicarea acesteia devine o leziune cu potențial letal. Dacă leziunea poate trece de polimeraza din furca de replicare și o bază incorectă este inserată atunci leziunea poate deveni potențial mutagenică.

În cazul lezării precursorilor ADN, nucleotidele par să nu aibă nici un efect dacă nu sunt încorporate în materialul genetic de către ADNpolimeraza. Dacă nucleotidele lezate competiționează cu cele normale și există o cantitate mai mare de nucleotide randamentul de încorporare devine un factor decisiv în evaluarea consecințelor. Astfel că potențialul mutagenic al precursorilor oxidați ai ADN-ului poate fi determinat prin frecvența de încorporare in vitro [216].

2.1.2. Acțiunea stresului oxidativ asupra mitocondriei

2.1.2. Action of oxidative stress on mitochondria

Termenul de mitocondrie a fost introdus la începutul acestui secol și este bazat pe aspectul din microscopia potică de granule filiforme alei acesteia. În microscopia electronică se observă că este alcatuită dintr-o memebrană în două straturi: stratul exterior este o simplă membrană care înconjoară întregul organit și stratul interior care are numeroase pliuri ce servesc la mărirea ariei suprafței. Mitocondria este locul respirației celulare și centrul producerii de energie la nivel celular [254].

Mitocondria este compusă din patru compartimente fiecare cu structură, activități și funcții diferite:

o membrană poroasă externă permeabilă pentru molecule sub 6 kDa,

un spațiu intermembranar conținând un număr de proteine specializate,

o membrană internă invaginată conținând enzime pentru fosforilarea oxidativă și o serie de proteine cărăuș,

matricea mitocondrială care contine enzime pentru diferite cai metabolice, incluzând ciclul acidului citric, oxidarea grasimilor și ciclul ureei

De asemenea, mitocondria conține propriul ADN (mtADN), care la mamifere codifică 13 polipeptide alături de 22 gene tARN și două rARN gene necesare pentru translația lor. Toate cele 13 polipeptide mitocondriale sunt necesare pentru lanțul respirator al F0F1ATP sintaza [187].

Mitocondria este cunoscută ca “centrala energetică” a celulei. Toate procesele implicate în creșterea și diviziunea celulară necesită energie. În cele mai multe cazuri energia este furnizată de hidroliza adenozintrifosfatului (ATP). Energia eliberată alimentează alte procese energetice nefavorabile. ATP-ul este o “moneda universală” în schimburile energetice ale celulei[110].

Fosforilarea oxidativă

Majoritatea celulelor mamifere conțin în citoplasmă un număr însemnat de mitocondrii a căror principală funcție este sinteza de ATP prin fosforilare oxidativă. Mitocondria produce ATP cedând electronii de la oxidarea nutrienților în lanțul respirator pentru a reactiona cu oxigenul, folosind energia redox pentru a transporta protoni prin membrana internă. Aceasta stabilește un gradient al potențialului electrochimic (negativ la interior) și un gradient de pH (bazic la interior) care conduce la sinteza ATP prin F0F1ATP sintaza. Astfel mitocondria oferă majoritatea ATP-ului și consumă aproape tot oxigenul respirat [187].

În timpul metabolismului glucoza și acizii grași (principala sursă de energie în regnul animal și celelalte celule nefotosintetice) sunt metabolizate la dioxid de carbon. Prin degradarea completă a glucozei la dioxid de carbon și apă se obtin 32 molecule de ATP. Mitocondria folosește procesul denumit chemiosmoză pentru a genera ATP din ADP și fosfat.

Surse de ROS în mitocondrie

Mitocondria este o sursă importantă de generare a ROS. Oxigenul molecular este inert chimic, ceeace permite existența biomoleculelor în prezența sa fără a produce oxidări. Pentru a împiedica inversarea spinului, electoni singulari sunt transferati umplând cele două poziții libere ale orbitalului. După acest principiu funcționează și respirația celulalră care se produce în mitocondrie unde reducerea oxigenului la apă se produce prin transferul consecutiv a patru electroni ducând la formarea a trei ROS superoxid (O2 •‾), peroxidul de hidrogen (H2O2) și radicalul hidroxil (•OH) [200].

Procesul redox din transportul de electroni este cunoscut ca fiind o potentială sursă de ROS în timpul proceselor fiziologice dar și în perturbările metabolice. În timpul metabolismului celular normal radicalii liberi sunt produși la NADH- coenzima Q reductaza (complexul I) și citocrom c oxidaza (complexul III), componente ale lanțului mitocondrial de transport electronic. Oricare eveniment ce diminuează transportul de electroni în cursul lanțului respirator capabil să transfere electroni la oxigen poate conduce la creșterea ratei de producere a radicalilor de oxigen [92].

Fiind o importantă sursă de ROS mitocondria este de asemenea ținta radicalilor liberi. Aceste leziuni duc la o reducere a funcțiilor celulare determinând reducerea producției de energie și moartea celulară. Ca și complexul transportor de electroni I, III și IV, protonii sunt pompați în afara matricei prin aceste complexe și în spațiul intermembranar pentru a crea un gradient electrochimic. Acești protoni pot trece înapoi în matrice prin traversarea unui canal din membrana component a ATP sintazei ducând la sinteza de ATP. Astfel consumarea de oxigen este cuplată cu fosforilarea ADP prin potențialul membranei mitocondriale[72]. Lanțul respirator mitocondrial este o sursă puternică de ROS, în primul rând de O2 •‾ apoi de H2O2 , fie ca produs al superoxid dismutazei fie prin disproporționalitate. S-a calculat că 1-4% din oxigenul care reacționează cu lanțul respirator este redus incomplet la ROS [34].

Generarea ,în celule, de energie sub formă de ATP din nutrienți nu este un proces metabolic perfect. Specii reactive de oxigen sunt rezultzate în țesuturi ca produse secundare ale metabolismului aerob [35]. Deși, la concentrații mici, ROS sunt folosiți ca semnale în reglarea proliferării celulare și alte functii celulare [116];[8] ei pot leza acizii nucleici[50], proteine, lipide și alte componente celulare.

Pentru a compensa stresul oxidativ celulele au dezvoltat un sistem de apărare constând în atioxidanti. [28]. Totuși aceste sisteme antioxidante pot fi modificate de anumiți factori intrinseci sau extrinseci cum ar fi anumite parți ale ROS care pot scăpa sistemului de inactivare și pot fi transformați în radicali hidroxil mult mai reactivi. [140].

Este bine cunoscut că producția intracelulară de ROS este direct proporțională cu rata mitocondrială de consum a oxigenului [163]. În celula umană peste 90% din oxigenul tisular este consumat de mitocondrie și 1-5% este tranformat în •O2- prin scurgere de electroni din Complexul I (NADH: ubiquinon oxidoreductaza) și de ciclul protonomotiv Q (transductia energetică prin cuplarea translocării protonului cu transferul electronic prin complexul citocrom bc1) al lantului respirator [35];[8]. În mitocondrie majoritatea •O2- este transformat în H2O2 prin superoxiddismutaza dependentă de magneziu. Totuși dacă H2O2 nu este rapid înlăturată se pot produce radicali hidroxil foarte reactivi prin reacția Fenton în prezența Fe2+ sau Cu + [1530].

Pentru a investiga consecințele dezechilibrului dintre enzimele de inactivare a radicalilor liberi, efectele supraexpresiei SOD a fost masurată în câteva tipuri celulare incluzând celule L de șoarece, neuroblastoma, fibroblaste murine, celule epidermale de șoarece și fibroblatse NIH/3T3 transfectate cu ADN complementar uman pentru supraexprimarea Cu, Zn-SOD. [208];[93];[139]. S-a observat la clonele care supraexprimă Cu,Zn-SOD că sunt mult mai susceptibile la ruperile catenelor de ADN, întârziere în creștere, sensibilitate la •O2- și H2O2 și senescența precoce [139].

Leziuni produse de substanțe chimice și medicamente

Antiinflamatoarele nesteroidiene sunt bine cunoscute ca provocatoare ale leziunilor intestinale ușoare dar patogenitatea acestei toxicitati nu este încă destul de bine cunoscută. În mitocondriile izolate din celulele vililor intestinali s-a observat insuficiența functională și dezechilibre în compoziția lipidelor. Tratamentul cu arginină și zinc a demonstrat o bună protecție împotriva acestor leziuni. Aceste rezultate sugereaza ca celule vililor sunt sensibile la leziunile produse de indometacin și că stresul oxidativ din mitocondrie este implicat în acest mecanism [129].

S-a demonstrat că arsenicul inhibă activitatea piruvat dehidrogenazei (PDH) legându-se de ditiolii învecinați în enzima pură și extractele tisulare. Inhibiția respirației mitocondriale se produce prin inducerea de H2O2 de către As2O3 și inhibarea activității PDH. Tratamentul cu H2O2 împreună cu metalele participante la reacția Fenton scade de asemenea activitatea PDH în celulele liniei HL60. Deci As2O3 crește producția de H2O2 în mitocondrie și poate produce hidroxil prin reacția Fenton și produce leziuni oxidative la nivelul aminoacizilor care alcătuiesc PDH [264]. Anumite studii spun că mecanismele nefrotoxicității acute induse de nitrilotriacetat (Fe-NTA) implică leziuni mitocondriale și nucleare oxidative, descoperiri care pot duce la elucidarea mecanismelor toxicității celulare a fierului [289].

Expresia genelor antioxidante în mitocondrie

S-a arătat că mitocondria joacă un rol central în apoptoză [289]. În plus ROS sunt implicați în mai multe căi ale morții celulelor tratate cu diferiți agenți și cu toate acestea originea specifică a generării acestor radicali liberi rămâne necunoscută. S-a examinat stresul oxidativ mitocondrial la femele și la masculi pentru a vedea de ce aceștia din urmă trăiesc mai puțin. Mitocondriile femelelor șobolan produc jumate din cantitatea de peroxizi față de cele ale masculilor. Acest lucru nu se întâmplă femelele castrate. Suplimentarea hranei cu estrogeni previne efectul ovariectomiei. Mitocondriile femelelor au un nivel mai mare de glutation redus decat al masculilor. Leziunile oxidative produse la nivelul ADN-ului mitocondrial al masculilor este de patru ori mai mare decât la femele. Acest fenomen este datorat supraexprimarii și activității mai intense a superoxid dismutazei cu magneziu si glutationperoxidazei la femele conferind astfel protecție la acțiunea radicalilor liberi și îmbătrânirii. Expresia 16S rARN care descrește cu vârsta este de patru ori mai mare în mitocondriile femelelelor decât la masculi de aceeași vârstă [60].

Leziunile oxidative ale mitocondriei și apoptoza

Leziunile oxidative ale mitocondriei împreună cu încărcarea cu calciu duce la permeabilizarea tranzițională a mitocondriei (MPT) [184]. MPT este datorată formării unui por nespecific în membrana internă care face mitocondria permeabilă la molecule mai mici de 1,5 kDa, în acest fel împiedicând fosforilarea oxidativă. Mitocondria joacă un rol important în moartea apoptotică și necrotica a celulei. Moartea necrotică este consecința lipsei de ATP a celulei și încărcarea cu calciu, prin urmare leziuni mitocondriale foarte mari duc la moartea celulară prin necroză ca în cazul atacului de cord și atacului vascular cerebral. În timpul mortii apoptotice a celulei este activată o serie de secvențe care cauzează distrugerea celulară programată sfârșind prin a fi fagocitată de celulele înconjurătoare, fără scurgeri de enzime și conținut periculos și astfel fără răspuns inflamator. Diferența între moartea celulară prin necroză sau apoptoză este oarecum arbitrară pentru că dacă în decursul apoptozei cantitatea de ATP scade sub un anumit prag moartea celulară este continuată prin necroză.

Mitocondriile sunt implicate în alegerea căilor între apoptoză și necroză. Joacă de asemenea un rol important în pornirea cascadei caspazelor prin eliberarea citocromului c din spațiul intermembranar în citoplasmă. Aici citocromul c reacționează cu Apaf-1 și procaspaza 9, activând caspaza 9, care la randul ei activează procaspaza 3 care duce la inducția apoptozei. Nu este încă foarte clar cum eliberează mitocondria citocromul c, dar în urma stimulului dinaintea apoptozei membrana exterioară devine permeabilă pentru citocromul c și alte proteine intermembranare.

De asemenea mitocondria induce apoptoza prin eliberarea proteinelor din spațiu intermembranar. În acest caz este vorba de o pierdere a potențialului membranar din cauza inducției MPT care duce la umflarea mitocondrială și eliberarea proteinelor intermembranare în citosol. Una dintre aceste proteine este factorul de inducere a apoptozei (apoptosis inducing factor AIF) care nu activează direct caspazele citoplasmatice ci se localizează în nucleu și induce moartea celulară prin apoptoză.

Mitocondria acumuleaza calciu printr-un uniporter (proteină integrată în membrană ce este implicată în facilitatrea difuziei) și elibereaza calciu printr-un schimb elecroneutru pentru sodiu sau protoni. Intrarea sau ieșirea de calciu din mitocondrie este de asemenea importantă în modularea semnalizării citoplasmica prin calciu. Perturbari ale metabolismului calciului mitocondrial interferează cu semnalizarea prin calciu și duce celulele în stadiu avansat de vulnerabilitate prin supraîncărcare cu calciu.

Productia de ROS, indusă de TNF-α (factor de necroza tumorală), ceramide (molecule de lipid plastice prezente în membrana celulară compuse din sfingozină și un acid gras), staurosporine și hipoglicemie, in mitocondrie fiind propus ca eveniment precoce în inducerea morții celulare prin apoptoză. Dovezi recente sugerează că ROS derivați din mitocondrie sunt implicați în inducerea apoptozei, enzimele antioxidante participă la apoptoză și contribuie la modularea semnalelor apoptotice.

Mitocondria joacă un rol în apoptoză și necroză prin deschiderea porului de permeabilitate mitocondriala (MPTP).

Mecanismul fosforilării oxidative necesită ca membrana mitocondrială internă să fie permeabila pentru cațiva metaboliți și ioni. Când aceasată permeabilitate membranară este pierdută mitocondria devine impermeabilă și hidrolizează ATP în loc sa îl producă, acest fenomen ducând la moarte celulară. Când este activată o proteină nespecifică din membrana sa interioară mitocondria marește permeabilitatea membranară. MPTP se deschide atunci cand mitocondria este expusă la concentrații mari de calciu asociate cu golirea de adenină și stresul oxidativ. Acestea sunt condițiile care însoțesc leziunile celulare care duc la moartea celulară prin necroză. MPTP transportă nespecific orice moleculă mai mică de 1500 Da. Nu numai că deschiderea sa previne sinteza de ATP dar cauzează și pierderea de ioni și metaboliți din matricea celulară și duce la umflarea mitocondriei ca rezultat a presiunii osmotice exercitată de proteinele matricei. Este bine cunoscut că mitocondriile celulelor necrotice sunt umflate și au procesele de respirație și fosforilare oxidativă puternic afectate [101].

Ruperile oxidative și reparările ADN-ului în mitocondrie

Ruperile oxidative ale ADN-ului se pot produce la nivelul nucleobazelor, zaharurilor și fosfaților ducând la ruperi mono sau bicatenare. În cursul replicării ADN ruperea din catena opusă se poate transforma în rupere dublu catenară. Dacă leziunea nu este reparată ruperile duble și simple vor duce la defecte în așezarea ADN-ului și leziunile acumulate pot duce la inhibarea replicării ADN. Dacă leziunea persistă prea mult sau este prea extinsă ca să fie reparată mitocondria poate simți si procesa stresul extramitocondrial și poate semnaliza ca celula să intre într-un proces ireversibil de moarte[81];[57].

Capitolul III – Protecția antioxidantă

Chapter III – Antioxidant protection

3.1. Antioxidanți – definiție, caracteristici

3.1. Antioxidants – definition, characteristics

Ca urmare a proceselor oxidative permanente ce reprezintă o sursă de SRO/SRN, în celulele aerobe s-au dezvoltat mecanisme celulare de apărare antioxidantă care să prevină atacul acestora asupra moleculelor biologice importante sau sǎ repare leziunile eventual produse (figura 3.1) [24].

Un antioxidant poate fi definit drept orice substanță care, atunci când se găsește la concentrație mică în comparație cu un substrat susceptibil de oxidare (orice moleculă găsită in vivo) poate întârzia semnificativ sau preveni oxidarea acelui substrat [288].

Astfel, antioxidanții sunt molecule sacrificate pentru protejarea unor molecule de importanță biologică (ADN, enzime), ele fiind prima țintă în calea radicalilor liberi, radicali pe care-i transformă în substanțe mai puțin nocive. Se găsesc în orice celulă, componentă celulară sau lichid biologic. În organele și celulele mai expuse atacului radicalic (ficat, hematii, plămăni) antioxidanții se găsesc în cantitate mai mare și cu structuri mai variate.

Caracteristicile sistemelor protectoare antioxidante:

acționează în anumite etape ale activării oxigenului, prevenind formarea radicalilor liberi sau descompunându-i pe cei deja formați

sunt interconectate metabolic pentru a-și asigura regenerarea

enzimele antioxidante au cele mai mari viteze de reacție cu radicalii liberi, asigurându-și astfel eficiență maximă

în interiorul celulei, sistemele antioxidante sunt localizate în imediata apropiere a surselor de radicali (membrane, microzomi, mitocondrii) [105].

Mecanismele de apărare includ: enzime antioxidante (superoxid dismutaza, catalaza, glutation peroxidaza, glutation transferaza, glutation reductaza), compuși liposolubili cu masă moleculară mică (-tocoferol, acidul retinoic, -caroten), compuși hidrosolubili (glutation, urat, acid ascorbic), proteine care leagă ionii metalici (Fe3+, Cu2+) (transferina, lactoferina, homosiderina, feritina, ceruloplasmina).

Localizarea antioxidanților, le permite acestora să acționeze în cupluri, completându-se reciproc:

în mediu lipofil (membranar) acționează vitamina E și carotenii

în mitocondrii acționează superoxid dismutaza, catalaza, vitaminele C și E, coenzima Q

în citoplasma celulara (mediu hidrofil) acționează superoxid dismutaza, glutationul, glutation peroxidaza, vitamina C

în sânge acționează albumina, bilirubina, ceruloplasmina, vitamine, hormoni, acid uric [105].

Fig. 3.1. Generarea speciilor reactive ale oxigenului și mecanismele antioxidante [24];

Fig. 3.1. Generation of reactive oxygen species and antioxidant mechanisms;

3.2. Protecția antioxidantă neenzimatică

3.2. Non-enzymatic antioxidant protection

Antioxidanții neenzimatici sunt reprezentați de o grupă foarte mare de compuși, foarte variați ca structură și compoziție, care intervin în diferite etape ale formări și evoluției radicalilor liberi. Printre acestea se numără: compuși proveniți din dietă (vitamina E, carotenii și acidul ascorbic (vitamina C)), compuși cu masă moleculară mică sintetizați in vivo (glutationul, albumina, bilirubina, hormonii sexuali, acidul lipoic, coenzima Q, acidul uric), chelatori ai metalelor tranziționale (transferina, lactoferina, feritina, metalotioneinele) [103].

Vitamina E (-tocoferolul)

Există mai mulți compuși înrudiți care diferă prin numărul și poziția grupărilor metil fixate pe compusul de bază numit tocol. Compusul cel mai activ biologic este -tocoferolul (5,7,8 trimetiltocol).

Vitamina E este considerată a fi cel mai important antioxidant neenzimatic liposolubil, al cărei rol de bază este păstrarea integrității membranelor celulare. Tocoferolul este prezent în lipidele alimentare, iar, după ingerarea acestora, se eliberează și se absoarbe la nivelul intestinului subțire, în cursul digestiei lipidelor. Apoi, vitamina E este transportată prin sânge, spre ficat și alte organe, fiind înglobată în chilomicroni și ulterior, în lipoproteine cu densitate mică (LDL).

În organismul uman, vitamina E joacă un rol important, funcționând ca antioxidant. În această calitate, ea protejează hematiile de diverși oxidanți toxici (radicali liberi ai oxigenului) și previne oxidarea unor hormoni hipofizari și suprarenalieni. Acest mecanism se realizează prin întreruperea șirului de reacții înlănțuite ale radicalilor liberi de către tocoferoli datorită capacității lor de a transfera un hidrogen fenolic propriu la un radical liber peroxi dintr-un peroxid de acid gras polinesaturat. Ulterior, radicalul liber fenoxi, format din tocoferol reacționează cu un alt peroxil liber formând un produs de oxidare fară radical liber, ce se conjugă cu acidul glucuronic și este excretat prin bilă în intestin:

vitamina E-OH + ROO vitamina E – O + ROOH

vitamina E – O + ROO ROOH + produs de oxidare fară radical liber

Acțiunea antioxidantă a tocoferolilor este apreciabilă și eficientă la concentrații ridicate ale oxigenului. Datorită acestui fapt, tocoferolii au tendința să se concentreze în acele structuri lipidice care sunt expuse la presiuni ridicate de oxigen, spre exemplu: în membrana eritrocitară și în membrana arborelui respirator. Un fapt demn de semnalat, în legătură cu acțiunea antioxidantă a tocoferolului, este conlucrarea sa cu seleniul. În calitate de component al sistemului glutation-peroxidază seleniu dependentă, seleniul participă și el la prevenirea acțiunii distructive a peroxizilor, alături de vitamina E. Mai mult, vitamina E împreună cu vitamina C și cu glutationul, acționează sinergic, formând un sistem complex antioxidant [215].

Vitamina C (acidul ascorbic)

Acidul ascorbic este o vitamină hidrosolubilă cu rol antiinfecțios, detoxifiant și nu în ultimul rând antioxidant.Biosinteza acidului ascorbicla animale se produce pe calea metabolică a acidului glucuronic. Această cale este implicată in metabolismul zaharurilor în organism fiind și cale importantă pentru diferite procese de detoxifiere. Majoritatea animalelor pot sintetiza L- ascorbic acid din D-glucoză. Oamenii precum și alte primate, porcușorii de guineea, liliecii de fructe indieni, unele pasări și pești dar și insecte nu pot produce acid ascorbic endogen [22]. Deși acidul ascorbic joacă roluri multiple în organismul uman, el nu este sintetizat de către acesta, datorită lipsei echipamentului enzimatic necesar. In vivo, acidul ascorbic este cofactor pentru anumite enzime, printre cele mai cunoscute se numără prolinhidroxilaza și lizinhidroxilaza, implicate în biosinteza colagenului. Ambele enzime conțin fier în centrul lor activ. Colagenul, sintetizat în lipsa ascorbatului, nu este hidroxilat suficient, provocând fragilitatea vaselor sanguine. De asemenea, asorbatul (întălnit ca monoanion la pH fiziologic) este recunoscut ca fiind cofactor și pentru enzimele cu cupru, precum dopamin–hidroxilaza, ce convertește dopamina în noradrenalină. Pe lângă acestea, acidul ascorbic intervine și în diverse alte reacții de oxidoreducere în care funcționează cuplat cu glutationul sau cu coenzimele nicotinamidice și flavinice. Un rol important îl are acidul ascorbic în sinteza acizilor biliari și în absorbția fierului. Deficiența vitaminei C din dietă determinǎ la oameni boala numită scorbut [103].

Ca și anionul superoxid, ascorbatul poate reduce Fe trivalent la Fe bivalent și, în prezența peroxidului de hidrogen poate stimula formarea de HO prin reacția Fenton. Efectele sale depind, atât de concentrația de ascorbat cât și de prezența scavengerilor de HO.

Prezența sa atât în citoplasma celulelor, cât și în plasmă, oferă posibilitatea interacției cu aproape toate tipurile de radicali liberi:

ROO + ascorbat R-OH + semidehidroascorbat

2semidehidroascorbat ascorbat + dehidroascorbat

dehidroascorbat oxalat, treonat și alți produși

Ascorbatul reacționează rapid cu superoxidul și cu HO formând radicalul ascorbat:

Ascorbat (AH-) + O2- + H+ A- + H2O2

Ascorbat (AH-) + HO A- + H2O

Forma oxidată a acidului ascorbic, dehidroascorbatul, ca și semidehidroascorbatul în prezența unui alt antioxidant, pot regenera, în prezența enzimei dehidroascorbat reductaza, ascorbatul:

dehidroascorbat + 2GSH DHA reductaza acid ascorbic + GSSG

2semidehidroascorbat + 2GSH DHA reductaza acid ascorbic + GSSG [1168];

-carotenul este o provitamină A de origine vegetală, cunoscută atât datorită efectelor anticancerigenice cât și efectelor antioxidante [1718]. Este cunoscut drept antioxidant în mediu lipidic sau amfipatic (membrane celulare), acționând ca blocant al peroxidării, dar mai ales ca scavenger (captator) al oxigenului singlet (1O2) devenind temporar, la rândul sǎu, radical:

1O2 + -caroten -caroten -caroten + caldură (Q)

Conform acestei reacții carotenii pot absorbi energia ridicată a 1O2, transformându-se într-un radical mai puțin reactiv, care eliberează surplusul de energie sub formă de căldură. O moleculă de -caroten poate „stinge” 1000 de molecule de 1O2 [103].

Glutationul (GSH) este un tripeptid (-glutamil-cisteinil-glicină) cu rol antioxidant neenzimatic, fiind forma de transport a grupărilor sulfhidril (-SH) libere. Sursa principală de GSH este ficatul. Este sintetizat de 2 enzime: -glutamil-cisteinil-sintetaza și glutation- sintetaza.

G-SH este substrat pentru enzimele din familia glutation peroxidazelor și este implicat în procese precum:

metabolismul acidului ascorbic

sinteza leucotrienelor

prevenirea oxidării grupărilor –SH din centrul activ al unor enzime

micșorarea abilității ionilor de cupru de a genera radicali liberi prin chelarea acestora

degradarea proteinelor care conțin punți disulfurice (ex.: insulina)

transformarea ONOO- la NO ( GSH + ONOO- nitrozotiol (GSNO) ; GSNO se poate descompune cu regenerarea oxidului nitric (NO) [103]

În celule, glutationul se află în cantitate mare, atât în forma sa redusă (G-SH), cât și în forma oxidată (GSSG). Glutationul este regenerat continuu de către glutation reductaza NADPH-dependentă, coenzima fiind produsă în șuntul pentozelor. Scăderea glutationului în celulele hepatice, celulele mucoasei gastrice, sau în eritocite, este asociată cu scăderea capacității de apărare a acestor celule față de agenții oxidanți. Dacă un țesut este supus unui aflux intens de H2O2 și/sau de radicali hidroxil (HO), consumul de GSH crește, iar raportul GSH/GSSG nu mai poate fi menținut la valori normale (crescute). Aceste efecte explică „efortul” celulelor de a păstra concentrația GSSG cât mai mică. Din păcate, GSSG poate inactiva un număr mare de enzime, incluziv cele implicate în sinteza proteică, ca urmare a S-tiolării acestora cu formarea de disulfuri mixte:

Enzimă –SH (activă) + GSSG enzimă- S-S-G (inactivă) + GSH

Printre enzimele inactivate de GSSG se numără: anhidraza carbonică, CuZnSOD, coenzima A, adenilatciclaza, acid-gras sintaza din ficatul de pui, fosfofructokinaza musculară la iepuri, etc. S-a constatat că un complex coenzimă A – glutation este puternic vasoconstrictor [1376]. Tot acest mecanism arată, de fapt, cum un mecanism protector pentru celulă se poate transforma într-unul letal atunci când rata generării oxidanților crește excesiv [103].

Chelatori ai metalelor tranziționale

Fierul și cuprul sunt metale esențiale pentru sinteza și acțiunea unor enzime și proteine implicate în respirație, transportul oxigenului, formarea oxidului nitric și în unele reacții redox. Abilitatea acestor metale de a transfera un electron le transformă în catalizatori ai reacțiilor de oxidare (oxidarea adrenalinei, dopaminei și ascorbatului; conversia peroxidului de hidrogen la HO; descompunerea peroxizilor lipidici la radicalii respectivi peroxil și alcoxil), în principiu, atunci când se găsesc libere (necomplexate) în celule.

Nu numai ionii metalici liberi, ci și hemul și diferite proteine care conțin hem pot descompune în anumite condiții peroxizii lipidici, interacționează cu H2O2 și provoacă leziuni celulare. Pentru evitarea acestor efecte metalele sunt chelate cu proteine [157].

Transferina realizează transportul fierului (Fe3+) de la mucoasa intestinală spre organele de depozit și spre organele producătoare de hemoproteine. Este o glicoproteină aparținând fracțiunii -globulinice cu o masă moleculară de aproximativ 90000 daltoni, sintetizată de ficat. Conține 5% glucide și poate lega 2 ioni de Fe3+ pe moleculă. Sideremia este cuprinsă între 70-120g%. Concentrația de transferină din ser/plasmă este de 200-400mg/dl, capacitatea totală de legare a fierului (CTLFe) este de 250-410g%, iar feritina serică este 20-300ng/ml. Astfel putem calcula saturația transferinei = sideremie/CTLFe și se constată că ea este încărcată cu fier doar în proporție de 20-30%, astfel încât în plasmă în condiții normale, nu există ioni de fier liber, nelegat de proteine, care ar putea stimula reacții radicalice. Creșterea nivelului de fier din plasmă până la capacitatea maximă a trasferinei de a-l lega este asociată cu supraîncărcarea țesuturilor cu fier ceea ce se asociază cu creșterea formării de radicali liberi. În cazul unor leziuni inflamatorii, traumatice, toxice, în care celulele sunt distruse și eliberează fier în cantități ce depășesc posibilitățile de legare, sunt inițiate reacții radicalice prin generarea de radicali liberi ai oxigenului [103].

Lactoferina este secretată de neutofile la locul inflamației și are rolul de a sechestra fierul acționând ca antioxidant în aceelași fel ca transferina.

Ceruloplasmina este o -globulină cu o masă moleculară de aproximativ 135 000 daltoni și conține 6-7 atomi de Cu pe moleculă. Are un timp de înjumătățire de aproximativ 4 zile, iar concentrația sa plasmatică este de 35mg%.

Caracteristici:

conținut mare în cupru (90-95% din cuprul plasmatic)

are activitate puternic oxidazică

este o proteină de fază acută.

Ceruloplasmina este un transportor diferit de transferină, astfel, cuprul absorbit din intestin este complexat cu albuminele și transportat la ficat. În ficat Cu este încorporat în apoceruloplasmina pentru a forma molecula activă eliberată în circulație. După apariția în circulație, ceruloplasmina servește drept proteină donatoare de Cu pentru celulele extrahepatice care sintetizează proteine cu Cu. Ceruloplasmina joacă un rol esențial în legarea fierului de către transferină deoarece ionii de Fe2+ sunt transformați de ceruloplasmină în Fe3+ formă în care se leagă de transferină [103].

Metalotioneinele (MT) sunt proteine cu masă moleculară mică (6500 daltoni), prezente în citosolul celulelor eucariote, în special în ficat, rinichi și intestin, dar și în stratul granular al pielii. Pot fi prezente de asemenea și în nucleu. În țesuturile animale se află două izoforme MT-I și MT-II, a treia izoformă MT-III fiind prezentă în creier. Sunt bogate în sulf, cisteina reprezentând 23-33% dintre aminoacizii constituienți. Fiecare moleculă de metalotioneină poate lega 5-7 ioni de zinc (Zn2+), argint (Ag2+), cupru (Cu2+), cadmiu (Cd2+), și mercur (Hg2+). Legarea metalelor se realizează prin intermediul grupărilor –SH ale resturilor de cisteină. Sinteza metalotioneinelor este indusă de concentrații crescute de cadmiu, cupru, zinc ca și de către unii hormoni: glucocorticoizi, glucagonul sau adrenalina. De asemenea IL-1 (interleukina-1) produsă în procesele inflamatorii poate crește sinteza metalotioneinelor.

Prin sechestrarea ionilor metalelor grele MT diminuează generarea radicalilor promovată de aceștia, realizând astfel o activitate antioxidantă. Capacitatea lor antioxidantă este în legătură cu procentul mare de aminoacizi cu grupări sulfhidril ce le transformă în excelenți captatori de oxigen singlet, anioni superoxid și de radicali hidroxili. De asemenea au posibilitatea de a inhiba peroxidarea lipidică prin intermediul ionilor de Zn2+ eliberați din complexul Zn2+- metalotioneină [86].

3.3. Protecția antioxidantă enzimatică

3.3. Enzymatic antioxidant protection

Superoxid dismutaza (SOD)

SOD este o enzimă prezentă în toate celulele catalizând reacția de descompunere a radicalului superoxid la peroxid de hidrogen și oxigen:

2O2·- + 2H+ H2O2 + O2

Speciile eucariote prezintă trei izoenzime SOD:

o enzimă citoplasmatică (CuZn-SOD; SOD-1)

o enzimă mitocondrială (Mn-SOD; SOD-2)

o enzimă extracelulară (EC-SOD; SOD-3) (figura 3.2.) [91].

Fig.3.2. Localizarea subcelulară a celor 3 isoforme SOD [91]

Fig.3.2.Subcellular localization of the three SOD isoforms

a) Superoxid dismutazele cu Cu și Zn (CuZn-SOD; SOD-1) sunt enzime foarte stabile și ușor de izolat. Au fost găsite în aproape toate celulele eucariote (levuri, plante și animale), dar nu și în celulele procariote (bacterii sau alge albastre-verzi cu o excepție, o bacterie luminiscentă Photobacterium leiognathi). Toate enzimele CuZn-SOD izolate din celulele eucariote au mase moleculare de 32000 Da și conțin două subunități proteice, fiecare dintre ele având un situs activ, ce conține un ion de cupru și un ion de zinc. În reacția de dismutare intervin ionii de cupru, ionii de Zn2+ având rolul de a stabiliza enzima. Această concluzie a fost trasă din experimente în care metalele au fost îndepărtate de la situsul activ și înlocuite separat sau împreună:

enz-Cu 2+ + O2·- enz-Cu + + O2

enz-Cu + + 2O2·- + 2H+ enz-Cu 2+ + H2O2

CuZnSOD au o stabilitate mare fiind rezistente la temperatură, la atacul proteazelor și la denaturarea de către reactivi cum ar fi: clorura de guanidiniu, sodiu dodecil-sulfat (SDS) sau uree. Cianida este un inhibitor foarte puternic al enzimelor CuZnSOD. De asemenea, aceste enzime sunt inactivate prin incubarea prelungită cu dietiltiocarbamat, care se leagă la cuprul din situsul activ și îndepărtează acest metal de pe enzimă [105].

b) Superoxid dismutaza cu mangan (MnSOD; SOD-2) s-a dovedit a fi în mare parte diferită de CuZnSOD. Astfel, nu este inhibată de cianidă sau dietiltiocarbamat, are o masă moleculară relativă de 40 000 Da, față de 32 000, este distrusă de tratamentul cu cloroform și etanol (și ca urmare nu rezistă la metodele de purificare aplicabile enzimelor cu Cu și Zn) și conține mangan la situsul activ (Mn3+). La pH 7, constantele de reacție ale celor douǎ enzime sunt similare, dar spre deosebire de CuZnSOD constanta reacției pentru MnSOD scade la pH alcalin. MnSOD sunt, de asemenea, mult mai sensibile la denaturarea cu căldură sau substanțe chimice (detergenții) față de CuZnSOD [105].

Toate aceste enzime provenite de la organismele superioare conțin patru subunități proteice și au frecvent 2-4 atomi de Mn/moleculă. Îndepărtarea manganului de la situsul activ determină pierderea activității catalitice, și în general nu poate fi înlocuit cu vreun alt metal tranzițional, inclusiv fierul pentru a-i reda funcționalitatea [181].

În condiții normale, lanțul mitocondrial transportor de electroni reprezintă principala sursă de superoxid convertind până la 5% din oxigenul molecular la anion superoxid. Datorită localizării sale subcelulare, Mn-SOD este considerată a fi prima linie de apărare împotriva stresului oxidativ, cu toate că, în procente nivelele de SOD-2 în vasele de sânge sunt mici comparativ cu SOD-1 sau SOD-3.

Expresia și activitatea Mn-SOD vasculare pot fi afectate în anumite condiții fiziologice sau patofiziologice. De exemplu, expresia genei Mn-SOD este puternic influențată de statusul redox celular, aceasta conținând în regiunea promotor elemente de răspuns pentru factorii de transcripție redox sensibili NF-kB și AP-1 fapt ce în final reglează activitatea multor gene implicate în procesul inflamator. Astfel, expresia mARN pentru Mn-SOD a fost găsită ca fiind inițial crescută apoi scăzută în ateroscleroză, hipertensiune cronică, inflamație [92].

c) EC-SOD (SOD-3) este singura izoenzimă SOD exprimată extracelular, legăndu-se la țesuturi prin domeniul său heparinic care-i conferă afinitatea pentru heparansulfați proteinglicanici de pe suprafața celulară [91]. Expresia EC-SOD în peretele vascular poate fi alterată atât ca răspuns la o mare varietate de stimuli, incluzănd aici, exercițiul fizic, factori de creștre, citokine, stimuli vasoactivi (angiotensina II și NO) cât și în cursul unor procese patologice precum ateroscleroză, hipertensiune și diabet zaharat [130];[258];[182].

EC-SOD se găsește în trei fracții: A, B și C ce diferă între ele, in vivo, prin afinitatea de legare la heparan sulfat iar, in vitro, la heparin-Sepharose. Astfel, EC-SOD C are cea mai mare afinitate, EC-SOD B are o afinitate de legare mai slabă iar fracția A nu se poate lega la heparin –Sepharose. EC-SOD C se găsește majoritar în plasmă și este singura enzimă care protejează suprafața vasculară de acțiunea radicalului superoxid [144]. EC-SOD conține patru atomi de cupru și posibil patru atomi de zinc ca și CuZn SOD care este inhibată de cianidă [256].

EC-SOD este susceptibilă la glicare. Glicarea EC-SOD in vitro nu are ca rezultat modificarea activității enzimatice, în timp ce glicarea CuZnSOD duce la inactivarea sa. Pe de altă parte s-a demonstrat că scăderea activității EC-SOD la diabetici se datorează glicării sale excesive și nu sintezei defectuoase. Cu alte cuvinte, menținerea unui control glicemic riguros poate duce la normalizarea activității EC-SOD și implicit la ameliorarea disfuncțiilor endoteliale [148].

Catalaza (CAT)

Catalaza este prezentă în toate celulele aerobe, fiind localizată în special în mitocondriile și peroxizomi hepatocitelor și eritrocitelor. Creierul, inima și mușchiul scheletic conțin cantități mici de catalază, activitatea sa variind între diferitele grupe de mușchi și chiar între regiuni ale aceluiași mușchi.

Majoritatea catalazelor purificate sunt formate din patru subunități proteice, fiecare dintre ele conținând o grupare hem legată la situsul activ și o moleculă de NADPH, care servește la stabilitatea enzimei. Disociația catalazei în subunitățile ei are loc cu ușurință în caz de depozitare, înghețare sau expunerea enzimei la acizi sau baze, fapt ce cauzează pierderea activității sale catalazice [181].

Catalaza descompune eficient H2O2, mecanismul de acțiune al catalazei putând fi descris după cum urmează:

catalază – Fe3+ + H2O2 k1 compus I

compus I + H2O2 k2 catalază – Fe3+ + H2O + O2

Cantitatea de compus I prezent în amestecul de catalază și peroxid de hidrogen depinde de concentrațiile de catalază și peroxid de hidrogen și de constantele k1 și k2. Viteza reacției este limitată de concentrațiile joase ale H2O2. Pentru catalaza din ficatul de șobolan, constantele k1 și k2 sunt 1.7 X 107, respectiv 2.6 X 107 M-1 s-1 [95]. Este foarte dificil să fie saturată catalaza cu peroxid de hidrogen, viteza maximă de descompunere a peroxidului de hidrogen fiind enormă. În cazul în care concentrația de peroxid de hidrogen este fixă, rata inițială de îndepărtare a lui va fi proporțională cu concentrația de catalază prezentă. În mod similar, pentru o concentrație dată de catalază, rata de descompunere a peroxidului de hidrogen va fi proporțională cu concentrația lui inițială [244].

Activitatea catalazică în țesuturile animale și vegetale este localizată, mai ales, la nivelul peroxizomilor, aici fiind prezente și unele din enzimele producătoare de H2O2: glicolat oxidaza, uratoxidaza și flavoproteindehidrogenazele implicate în -oxidarea acizilor grași (cale metabolică ce poate avea loc atât în mitocondrii cât și în peroxizomi). Activitatea catalazei poate fi inhibată de azidă sau cianidă, dar acestea inhibă în aceelași timp și alte enzime. Un inhibitor mult mai folosit este aminotriazolul (3-amino-1,2,4-triazol). Acțiunea lui inhibitorie se exercită pe compusul I, așa că el va inhiba catalaza numai dacă este prezent peroxidul de hidrogen care va permite generarea acestui intermediar. Catalaza este, de asemenea, capabilă să dea anumite reacții de tip peroxidazic în prezența unui supliment constant de peroxid de hidrogen, care permite formarea compusului I. Acesta va oxida metanolul și etanolul la aldehidele lor corespunzătoare: formaldehida (metanal) și acetaldehida. Prezența substratelor peroxidazice pentru catalază in vivo va determina scăderea concentrației compusului I, favorizând astfel formarea de cantități mai mari de catalază [103].

Glutationperoxidaza (GSH-Px)

Glutationperoxidaza este o enzimă ce conține seleniu, având activitate crescută în ficat, hematii, glanda suprarenală și splină, moderată în inimă, plămâni, rinichi și creier și slabă în mușchi. Intracelular GSH-Px este localizată în mitocondrii și peroxizomi, împreună cu catalaza, iar în citoplasmă este cuplată cu superoxid dismutaza [181].

Glutation-peroxidaza reduce o gamă largă de peroxizi proveniți din acizi grași polinesaturați (AGPN), steroizi (colesterol, progesterona), acizi nucleici, prostaglandine și H2O2. Substratul ei constă în compusul tiolic numit glutation, care se găsește la animale, plante și unele bacterii, la concentrații adesea milimolare. Cea mai mare parte a glutationului in vivo este prezentă ca G-SH (glutation redus), mai degrabă decât sub forma G-S-S-G (glutation oxidat), dar mai mult de o treime din glutationul total celular este prezent ca amestec de disulfide împreună cu alți compuși care conțin grupări –SH, cum ar fi: cisteina, coenzima A și reziduuri cu –SH ale mai multor proteine. Reducerea peroxizilor este cuplată cu oxidarea glutationului redus. Produșii reacției nu sunt radicali liberi ci substanțe hidrosolubile, ușor metabolizabile. GSH-Px descompune H2O2 mult mai eficient decât catalaza conform reacțiilor:

R-OOH + 2 GSH GSH-Px R-OH + GSSG + H2O

H2O2 + 2GSH GSH-Px GSSG + 2 H2O

GSH-Px este alcătuită din patru subunități proteice, fiecare dintre ele conținând un atom de seleniu la situsul catalitic activ, probabil sub forma selenocisteinei (R-SeH în loc de R-SH). Conținutul în seleniu la animale poate fi influențat de nivelele de vitamina E. Prezența deficitului mixt de Se și vitamina E a determinat creșterea formării de radicali liberi în omogenatele din miocard [103].

În majoritatea structurilor există o cooperare între catalază și glutation-peroxidază. Unele structuri au ambele tipuri de enzime (ex. citoplasma eritrocitului). Producerea unei cantități mici de apă oxigenată este contracarată în special de GSH-Px, catalaza intervenind la concentrații mari de apă oxigenată. GSH-Px este esențială mai ales pentru hematie, protejând membrana celulară de oxidarea distructivă exercitată de H2O2. Deficitul congenital în glutation-peroxidază determină, în primul rând, anemie hemolitică asociată sau nu cu alte modificări hematologice (hemoglobinurie, coagulare intravasculară). Anemia hemolitică a nou-născutului pare să fie datorată aceleiași cauze, nu obligatoriu ereditare. Activitatea GSH-Px este completată de catalază, astfel că în toate cazurile de insuficiență de GSH-Px se înregistrează o creștere a activității catalazei [103];[244].

Glutationreductaza (GR)

Raportul GSH/G-S-S-G este menținut la o valoare crescută în celulele normale, așa încât trebuie să existe un mecanism care să reducă GSSG la G-SH. Acesta este realizat de glutation reductaza, care catalizează reacția:

G-S-S-G + NADPH + H+ 2GSH + NADP+

Glutation reductaza poate, de asemenea, cataliza reducerea disulfidelor mixte, cum ar fi cele între G-SH și coenzima A. NADPH-ul necesar provine din șuntul pentozofosfaților.

Glutation reductaza conține două subunități proteice, fiecare cu o grupare flavinică (FAD) la situsul activ. NADPH reduce FAD, care transferă electronii disponibili unei punți disulfidice (-S-S-) din apropiere, dintre două resturi de cisteină din proteină. Cele două grupări –SH formate reacționează apoi cu GSSG pentru a-l reduce la 2GSH, reformând grupările disulfurice din proteină [103].

Paraoxonaza (PON)

Familia paraoxonazelor (PONs) are până în prezent 3 membrii: PON 1, PON 2 și PON 3 localizați pe brațul lung al cromozomului 7 (q21.3 – q22.1) la oameni. Toate cele 3 gene au o mare identitate între specii de 79-95 % la nivelul aminoacizilor și respectiv de 81-95 % la nivelul nucleotidelor. Acest grad mare de conservare sugerează că familia PONs are importante funcții, pâna în prezent fiind clar demostrat rolul antiaterogenic al PONs. Lângă clusterul genelor PONs se găsește gena ce codifică pentru piruvatdehidrogenaz-kinaza, acest fapt putând explica cel puțin parțial legătura dintre PON și controlul glicemic din DZ în anumite studii [73].

PON 1 și PON 3 sunt predominant sintetizate în ficat, de unde sunt secretate în sânge și asociate cu HDL (lipoproteina cu densitate mare). În ser PON 3 este de cel puțin două ori mai puțin abundentă decât PON 1 [76]; [164]. Mecanismul propus prin care PON 1 este eliberată implică participarea receptorilor „scavenger” de tip I clasă B (SR-BI) [242]. Odată în sânge, apoA-I și apoJ stabilizează PON 1 și asocierea sa cu HDL [228] (Figura 3.3.).

Fig.3.3. Modelul propus pentru secreția PON 1 și asocierea sa cu HDL [242]

Fig.3.3. Proposed model for secretion PON 1 and its association with HDL

PON 2 nu este detectabilă în ser, dar este exprimată în numeroase celule și țesuturi, incluzând ficatul, plamânii, rinichii, creierul, intenstinul și testicolele. De asemenea, este constitutiv exprimată în numeroase linii celulare endoteliale imortalizate/stabilizate și în celulele musculare netede aortice la oamenii. In vitro, PON 2 prezintă proprietăți antioxidante similare, PON 1 inhibând peroxidarea lipidică și oxidarea LDL [43].

PON 2 are două polimorfisme: alanină/glicină la nivelul poziției 148 (A/G148) și cisteină/serină la nivelul poziției 311 (C/S311). PON 2311S s-a demostrat a fi strâns asociat cu dezvoltarea bolilor cardiovasculare [68] cu disfuncțiile renale din DZ de tip 2 [217] și cu reducerea masei osoase la femei în perioada de postmenopauză [287]. De asemenea, polimorfismul A/G148 a fost asociat cu variații ale colesterolului total, a LDL colesterolului, și a glucozei.

Spre deosebire de PON 1, PON 2 și PON 3 nu prezintă activitate paraoxonazică, iar esterii aromatici precum fenil acetatul sunt metabolizați cu viteză foarte mică, în schimb hidrolizează rapid lactone precum dihidrocumarina (DHC) [75];[255]. Astfel s-a sugerat că numele de paraoxonaze ar fi greșit atâta timp cât PON 2 și PON 3 nu pot hidroliza paraoxonul. Investigații recente au arătat că hidroliza lactonelor (esteri ciclici) reprezintă activitatea nativă a PON 1 [158]. Mai mult decât atât, toții ceilalți membrii ai familiei PONs prezintă abilitatea de a hidroliza lactone alifatice cu lanț lung și lactone aromatice, sugerând faptul că activitatea lactonazică este cea conservată în evoluție și ca urmare termenul de lactonase ar fi mult mai potrivit pentru PONs [74].

Fig.3.4. Un mecanism propus pentru dezvoltare aterosclerozei și rolul PON1 și PON2 împotriva aterosclerozei [21]

Fig.3.4. A proposed mechanism for atherosclerosis development and the roles of PON1 and PON2 against atherosclerosis

Toate trei PONs au proprietății antioxidante [255]. Numeroase studii epidemiologice au identificat multitudinea de factori de risc în dezvoltarea bolilor coronariene și, dintre aceștia, cel mai puternic predictor pare a fi nivelul scăzut de colesterol HDL [175];[98]. Pentru fiecare 1% scădere a HDL riscul de a dezvolta boli coronariene crește cu 2-3 % sau cu alte cuvinte o creștere de 1mg/dL (0,03mmoli/L) a HDL colesterolului este asociată cu o scădere cu 6 % a riscului de aparițir a bolilor coronariene [98]. Factorii protectori împotriva formării hidroperoxizilor lipidici în plasmă par a fi apoA-I și PONs [185];[76].

Stresul oxidativ este recunoscut a juca un rol în dezvoltarea procesului aterosclerotic și în formarea celulelor spumoase [233];[134]. Este frecvent asociat cu procesul de oxidare de la nivelul lipoproteinelor și de la nivelul celulelor din peretele vascular, incluzând macrofagele . Aceste macrofage „oxidate” sunt caracterizate prin creșterea nivelului de peroxizi lipidici, scăderea glutationului și creșterea capacității de a forma LDL oxidat . PON 1 serică scade stresul oxidativ din macrofage și, la rândul său este scăzută în condiții de stres oxidativ. PON 1 inhibă influxul de colesterol prin reducerea formării de LDL oxidat, creșterea distrugerii LDL oxidat și scăderea captării LDL oxidat în macrofage. PON 1 poate, de asemenea, inhiba biosinteza colesterolului la nivelul peretelui arterial și poate stimula efluxul mediat de HDL din macrofage. PON 2 acționează împotriva stresului oxidativ, acționând mai ales la nivel celular. Spre deosebire de PON 1 și PON 3, PON 2 pare a fi activată ca răspuns la creșterea stresului oxidativ, probabil ca un mecanism compensator [20].

Intervenții, având ca scop creșterea nivelului PONs (celular și umoral), ar putea reduce formarea celulelor spumoase de la nivelul macrofagelor și, implicit, ar putea scădea riscul dezvoltării aterosclerozei din diabetul zaharat. Supraexpresia PON 2 la nivel celular reduce formarea de lipide oxidate, aceste celule fiind mult mai puțin susceptibile în a dezvolta stres oxidativ atunci când sunt expuse la cantități mari de H2O2 sau fosfolipide oxidate [1312];[1313]. La oameni, nivele scăzute de PON 2 au fost găsite la pacienți hipercolesteroleminici, iar administrarea de atorvastatin a putut contracara aceste efecte [192].

3.4. Capacitatea antioxidantă plasmatică totală

3.4. Total plasma antioxidant capacity

Capacitatea antioxidantă a celulelor este atribuită în principal sistemelor enzimatice, de cea a plasmei fiind răspunzători compuși cu masă moleculară mică de origine alimentară sau endogenă. Acești compuși "de sacrificiu" sunt consumați rapid în lupta cu speciile SRO sau SRN și trebuie regenerați permanent, în acest, fel capacitatea antioxidantă totală a plasmei fiind modulată de intensitatea atacului radicalic și de aportul dietar al antioxidanților și poate fi considerată mai reprezentativă pentru balanța in vivo dintre speciile oxidante și compușii antioxidanți (cunoscuți sau nu, măsurabili sau nu) decât concentrația unui singur antioxidant. Numărul mare al antioxidanților plasmatici face destul de dificilă determinarea fiecăruia în parte. Cooperarea dintre diverși antioxidanți asigură o protecție mai bună împotriva atacului radicalic dacă se face comparația cu un singur compus – un exemplu tipic al sinergismului antioxidanților este sistemul glutation-ascrbat-αtocoferol; glutationul regenerează acidul ascorbic iar acesta regenerează α tocoferolul [204].

Fig.3.5. Interacțiunea dintre vitamina C, E și Glutation [198]

Fig.3.5. The interaction of vitamin C and E and glutathione

Capacitatea antioxidantă totală reprezintă numarul de moli ai unui radical care este epurat de soluția de testat, independent de activitatea antioxidantă a oricărui antioxidant prezent în amestec. Capacitatea antioxidantă a plasmei este deci o măsură a efectului combinat al tuturor antioxidanților incluzând tiolii și acidul uric.

Principalii antioxidanți plasmatici în termeni ai masei și activitații sunt albumina și acidul uric, ei răspunzând de aproximativ 57% din activitatea antioxidantă totală. Activitatea antioxidantă reziduală reflectă activitatea combinată a acidului ascorbic, vitaminei E, bilirubinei, β-carotenului precum și a altor antioxidanți (flavonoide) a căror concentrație circulantă este deocamdată necunoscută sau greu măsurabilă. Activitatea antioxidantă reziduală a plasmei poate fi calculată prin scăderea activității atribuibile albuminei și acidului uric din activitatea antioxidantă totală [190].

PARTEA A II–A

CERCETĂRI PROPRII

SECOND PART

PERSONAL RESEARCHES

Capitol IV Materialul și metoda de cercetare

Chapter IV Research method and material

4.1. Culturile celulare

4.1. Cell cultures

Cultura celulară in vitro a luat naștere între anii 1880 și 1900 când au apărut primele tehnici de studiere a comportamentului celular. Deși părintele acestei tehnici este considerat Harrison, el scrie în lucrarile sale că este o continuare a muncii lui Wilhem Roux (1885). Ambii oameni de știință au fost interesați de studierea diferențierii celulare în cursul vieții embrionare deși Roux nu era interesat de multiplicarea celulelor în cultură. Experimentul cu "picătura atârnată" a lui Harrison a permis observarea creșterii terminațiilor nervoase din neuroni inițiali în conditii de sterilitate până la patru săptămâni [173].

Cultura de celule constă în izolarea celulelor din țesuturi prin metode chimice și/sau mecanice destinate să rupă conexiunile intercelulare pentru a realiza o suspensie de celule. Celulele sunt cultivate mai departe în starea primară rezultând astfel culturile primare sau pot fi modificate pentru a li se evidenția unele însușiri sau pentru a li se comferi unele noi (lipsa senescenței naturale) rezultând astfel liniile celulare standardizate. Celulele canceroase au posibilitatea nelimitată de a prolifera fiind definite inițial ca o linie celulară. Acestea sunt nemuritoare și devin astfel prin transformare tumorală care poate fi spontană sau indusă viral sau chimic [4].

4.1.1. Cultivarea celulelor din linii standardizate

4.1.1. Growing the cells from standardized lines

Prima linie celulară permanentă a fost realizată în 1943 de Earle din țesut subcutanat de șoarece. Culturile celulare au fost propagate continu și au ajuns să aibă caractere morfologice diferite de cele din care au provenit. Astfel a aparut și prima linie celulară "transformată" HeLa (Henrietta Lacks – numele celei care a purtat această tumoră), provenită de la un carcinom cervical [173].

Liniile celulare folosite în această lucrare sunt:

– L929 fibroblaste de șoarece. Clona 929 a fost izolată din tulpina inițială L în martie 1948 prin tehnica de izolare a unei singure celule cu ajutorul capilarului [48].

Fig.4.1.Celule L929 în cultură – subconfluență (microscopie în contrast de fază) (original)

Fig.4.1. L929 cells in culture – subconfluent (phase contrast microscopy)

Fig.4.2. Celule L929 în cultură – confluență (microscopie în constrast de fază) (original)

Fig.4.2. L929 cells in culture – confluence (Phase contrast microscopy)

– HepG2 sunt celule cu morfologie epitelială provenite din ficat, aderente. Celulele cresc în monostraturi în grupuri mici și au în mod normal 55 cromozomi. Linia celulară provine din țesutul hepatic al unui tânar de 15 ani cu carcinom hepatocelular. Linia nu este tumorigenă pe șoareci imunosuprimați.

Fig.4.3. Modul de dezvoltare a celulelor – cocultură ( L929-dispersate și alungite, HepG2 aglomerate în colonii) (original)

Fig.4.3. The development of cell – coculture (L929-scattered and elongated, HepG2 crowded colonies)

– V79 sunt fibroblaste pulmonare aderente izolate de la un mascul de hamster chinezesc (Cricetulus griseus) și devenite linie celulară în urma transformării spontane. V79 este o linie foarte folosită in studii de toxicitate. Stabilitatea cariotipului și morfologiei le face ideale pentru teste de toxicitate genomică manifestând aberații de fond mici. Celulele, endogen, nu exprimă citocromul p450 și au fost frecvent folosite pentru inserarea acestuia de la om, șobolan, șoarece și pești [48].

– L929 și V79 au fost cultivate în MEM (Minimum Essential Media – Biochrom, Germania) suplimentat cu 10% Ser Fetal Bovin (FBS, Biochrom, Germania), cu adaos de antibiotice: 50 U/mL penicilină (Biochrom, Germania), 50 μg/mL streptomicină (Biochrom, Germania).

– HepG2 au fost cultivate în DMEM (Dulbeco's Modified Eagle Medium, Biochrom, Germania) suplimentat cu 10% Ser Fetal Bovin (FBS, Biochrom, Germania), cu adaos de antibiotice: 50 U/mL penicillin (Biochrom, Germania), 50 μg/mL streptomycin (Biochrom, Germania).

Ele cu fost menținute în incubator la 370 C în atmosferă umedă, cu un conținut de CO2 de 5% și examinate aproape zilnic, folosind un microscop inversat cu contrast de fază, pentru a determina gradul de confluență și pentru a verifica morfologia celulară normală și sterilitatea culturii.

Manipularea s-a facut prin tehnici de lucru aseptice, folosind o hota cu flux laminar. Celulele au fost pasate o data la 3-4 zile, în momentul atingerii unui grad de confluență de 80-90% L929 și 70-80% HepG2 fiind desprinse cu tripsină/EDTA și însămntate la densitate mai mica (500000 – 700 000 celule/75 cm2) în vase noi de cultură (TPP, Elveția).

4.1.2. Obținerea culturilor de neuronilor din ganglionii rădăcinilor dorsale (DRG)

4.1.2. Obtaining neurons cultures from the dorsal root ganglia (DRG)

Ganglionii rădăcinilor dorsale sunt grupuri de corpuri neuronale ale neuronilor senzoriali. DRG se dezvoltă în stadiul embrionar din celulele crestei neuronale nu din tubul neural. Deci DRG pot fi priviț ca materie cenușie a maduvei spinării aflată în afara cordonului neural.

Fig.4.4. Secțiune prin măduva spinării (Medula Spinalis) 1. Cornul anterior 2.Cornul posterior 3.Comisura cenușie 4. Cordon anterior 5. Cordon lateral 6. Cordon posterior 7.Comisura anterioară 8. Fisura mediană anterioară 9. Șantul median posterior 10.Canal ependimar 11. Rădăcinile ventrale 12. Rădăcinile dorsale 13. Ganglionii radacinilor dorsale [278]

Fig.4.4. Section through the spinal cord (Medula Spinalis) 1. Anterior horn 2. Posterior horn 3.Gray commisure 4. Anterior funiculus 5. Laterar funiculus 6. Posterior funiculus 7. Anterior comisure 8. Anterior median fisure 9. Posterior median sulcus 10. Central canal 11. Anterior root 12.Posterior root 13.Dorsal root ganglion

Prepararea soluțiilor:

1. Soluția de NutMix se prepară cu apă Mili-Q ( apă "ultrapură" sau de tip 1 comform ISO 3696) distilată. Apa Mili-Q este foarte pură și sterilă dar poate conține pirogeni.

Pașii preparării soluției de NutMix

– se măsoară aproximativ 900 mL apă într-un recipient de un litru

– se pune un magnet cu teflon pentru agitare apoi se pune recipientul pe agitatorul magnetic și se adaugă încet pudra (DMEM/Ham's F-12 powder medium with L-glutamine de la Biochrom-Biochrom.de)

– se adaugă 1,2 g bicarbonat de sodiu (Biochrom)

– se ajustează pH-ul cu 6mL NaOH 1M

– mediul se pune într-un recipient de 1 litru în care se barbotează un amestec de 95% aer cu 5% CO2

– se ajustează volumul la 1mL, se portionează și se pastrează la congelator

La folosire, peste mediul de cultură se adaugă ser fetal bovin 10% și gentamicină 50mg/mL.

2. Soluția IncMix conține

155 mM NaCl

1,5 mM K2HPO4

5,6 mM HEPES

4,8 mM NaHEPES

Se adaugă glucoză 5mM ( 0,5mL 1M glocoză la 100mL) și gentamicină 50mg/mL apoi se portionează și se pastrează la congelator.

3. Soluția de polilizină se prepară în PBS 50µg/mL. Suprafețele pe care urmează să se crească neuronii sunt incubate cu polilizină o oră, după care, se extrage tot lichidul și sunt lăsate la uscat aproximativ 45 minute.

Pentru obținerea culturii de neuroni este nevoie de:

– seringi de 30 și 10 mL

– filtre de 0,22 µm

– pipete Pasteur

– tuburi Cornig de 15 mL

– o "pară" pentru pipete Pasteur

Pașii experimentali:

Se scoate din congelator IncMix, NutMix și polilizină. IncMix se pastrează la 370C.

Se pregătește:

– alcool 70% (alcool sanitar)

– alcool de 95% pentru instrumente

– șervețele de hârtie

– pompă de vid

– vase Pentri

– lame și lamele de microscop sterilizate

Se introduc în alcool 95% foarfece mari (pentru scoaterea coloanei vertebrale), foarfecce medii (pentru secțiunea mediană a coloanei), bisturiu cu lamă de 11, pensetă cu cioc medie, foarfece foarte mici și două perechi de pense foarte fine.

Pentru culturile pe lamele se introduc lamelele în alcool 95% apoi se șterg cu șervețele, se introduc 20 minute în etanol, apoi se scot și se lasă la uscat.

Înainte de a eutansia șoarecele se sterilizează hota cu UV. Se filtrează 3ml de IncMix într-un petri de 35 mm și se verifică instrumente de disecție.

Se eutanasiază soarecele folosind CO2 de 100% pentru o perioadă scurtă. Două minute sunt în mod normal suficiente. Se verifică dacă șoarecele este areflexic înainte de a continua, apoi se decapitează.

Disecția DRG

Se spreiază pielea șoarecelui cu alcool sanitar, apoi se taie de-a lungul coloanei vertebrale. Se fac incizii cu foarfeca, în stânga și dreapta coloanei vertebrale, astfel încât aceasta să se desprindă ușor. Se fasonează coloana vertebrala astfel încât să fie ușor de manipulat, apoi, se face o secțiune dorsală și una ventrală, median, de-a lungul coloanei. Partea ce conține o cantiate mică de maduvă se lucrează prima pentru a preveni deshidratarea. Sub stereomicroscop, cu ajutorul foarfecii și al pensei de microdisecție se scot pe rând ganglionii și se pun în vasul cu IncMix pregătit mai devreme.

Disocierea DRG

După îndepărtarea tuturor DRG se face un amestec de enzime: se cântărește aproximativ 9 mg dispază 1mg/mL (din Bacilus polimixa – Gibco, Invitrogen) și 1mg/mL și aproximativ 2 mg colagenază tip XI (din Clostridium histoliticum – Sigma) ( cântăririle sunt aproximative pentru că enzimele se prezintă sub forma unor pulberi grosiere cu fracțiuni de marimi diferite și care atunci cand se hidratează puțin devin lipicioase – concentrațiile exacte sunt 3 mg/ml dispază și 0,6 mg/ml colagenază) și se dizolvă în cantitatea adecvată de IncMix. Se recomandă precântărirea enzimelor într-un tub Eppendorf ceea ce va economisi timp pentru acest pas. Se pune amestecul de enzime într-o seringă de 10 ml cu filtru de 0,22 µm.

În hotă:

– Se transferă fiecare DRG, din vasul Petri de colectare, într-un Petri de plastic uscat. Acest lucru se face pentru a diminua riscul infecțiilor ce pot apărea la extragerea și manipularea DRG.

– Se filtrează amestecul de enzime peste DRG din acest Petri

– Se pune vasul cu DRG în incubator la 37ºC timp de o oră

În timpul incubării se acoperă vasele și lamele cu polilizină:

– Se trage aproximativ 5ml soluție polilizină într-o seringă de 10 ml la care s-a pus pe un filtru de 0,22µm și se pun câteva picături astfel încât să acopere suprafața necesară pentru creșterea neuronilor.

– Se lasă timp de 30 de minute în hotă la temperatura camerei (~250C) și, apoi, se absoarbe soluția complet cu o pipetă Pasteur conectată la pompa de vid după care se lasă să se usuce.

Tot în acest timp se aduce soluția de NutMix la 370C.

După incubare

– Se pune 7 mL de NutMix într-o seringă de 10 ml cu filtru de 0,22µm.

– Se pregătește o pipetă Pasteur și o pară sterilă, precum și un tub Corning de 15ml steril.

– Se scoate DRG din placuța Petri în care acestea au fost incubate (folosind pipeta Pasteur și para) și se pune în tubul Corning, cu cel mai mic volum posibil de amestec de enzime.

– Se adugă NutMix până la 1 mL pe DRG

– Se triturează de 20 de ori în NutMix folosind pipeta Pasteur cu para

– Se adaugă NutMix la până la 5 ml

– Se centrifughează la 700g, 10minute

La sfârșitul centrifugării se elimină supernatantul cât de mult posibil, apoi se adăugă NutMix la aproximativ 2 ml și se resuspendă cu pipeta Pasteur. Se face o numărătoare a celulelor neuronale pentru a avea o densitate corespunzătoare după care se diluează dacă este necesar. Se pun celulele pe suprafețele trate cu polilizină apoi se lasă o oră la incubator pentru ca celulele să adere. După cele 60 minute se adaugă 2 mL de NutMix în plăcile Petri și 150µL în placa cu 96 godeuri [219]; [99].

4.1.3. Obținerea limfocitelor din sângele uman și tratamentul cu 2DCB

4.1.3. Obtaining lymphocytes from human blood and treatment with 2DCB

Sângele a fost recoltat de la trei indivizi, clinic sănătoși, de sex masculin cu vârste de 29, 30 și 48 ani. Recoltarea s-a făcut în vacutainere cu Litiu Heparină de 5 ml (Demophoris Ltd).

Separarea limfocitelor s-a făcut prin amestecarea sângelui cu o cantitate egală de soluție Biocoll (Biochrom) apoi prin centrifugare pentru 20 minute la 1200 g. S-a recoltat supernatantul care a fost spălat prin centrifugare și resuspendare în mediu de cultură (RPMI 1640 – Biochrom).

Datorită solubilitații slabe a 2-Dodecylcyclobutanone (Fluka) s-a realizat întâi dizolvarea acesteia în alcool etilic absolut apoi această solutie a fost introdusă în mediul de creștere (RPMI 1640).

4.1.4. Obținerea suspensiilor celulare din organe și tumori

4.1.4. Obtaining cell suspensions from organ and tumor

Pentru acest experiment au fost folosiți șobolani whistar cu hepatoame implantate în regiunea flancului (implantarea tumorilor, caracterizarea și supravegherea inițială a fost realizată la Istitutul Oncologic București). Animalele au fost cazate în cuști de plastic transparent acoperite cu grilaj de oțel inoxidabil. Condițiile externe pe tot timpul experimetului au fost: 19-240C, umiditatea relativă 40-60% și alternanță lumină întuneric de douăsprezece cu douăsprezece ore [149]. Înainte de începerea injectării radiofarmaceuticului șobolanii au fost ținuți șapte zile în locul de desfașurare a experimentelor pentru acomodare, carantină și dezvoltarea tumorilor. Fiecare animal a beneficiat ad libitum de apă și nutreț granulat – Furaj complet pentru șoareci șobolani și hamsteri utilizați în scopuri științifice sau experimentale obtinut de la Institutul Cantacuzino-Stațiunea Băneasa (ingrediente: cereale, șrot de soia, șrot floarea soarelui, carbonat de calciu, aminoacizi, premix vitamino-mineral; constituenți analitici: miditatea max. 12%, proteină brută min. 18%, grăsime brută min 1,5%, fibre brute min 5%).

Pentru determinarea stresului oxidativ am recoltat bucățele de ficat și tesut tumoral pe care le-am spălat cu un buffer rece ( NaCl 75mM/L EDTA-2Na 24mM/L pH 7,5) la temperatura de 100C, apoi le-am tăiat în bucăți mari, le-am spalat iarăși și în final le-am tăiat în bucăți mici cu foarfeca într-o cantitate de buffer aproximativ egală cu masa țesutului. Lichidul rezultat l-am amestecat cu LMPA și depus pe lame [150].

Determinarile stresului oxidativ s-au realizat prin metode:

directe (biochimice) – măsurarea grupăilor carbonil ale proteinelor și potențialul

antioxidant al plasmei

indirecte (modificări celulare) * structurale (de biologie moleculară) – metoda cometei,

metoda formării de micronuclei

* funcționale (de bilogie celulară) – MTS, apoptoză morfologică

4.2. Determinarea conținutului de carbonil în proteinele modificate oxidativ din plasma sanguină

4.2. Determination of carbonyl oxidatively modified proteins in blood serum

Dozarea grupărilor carbonil are la bază reacția dintre gruparea carbonil a proteinelor oxidate si 2,4 dinitrofenilhidrazină formând un compus cu absorbția maximă la 360-385 nm.

Acest protocol a fost elaborat în conformitate cu cel conținut de kit (https://www.caymanchem.com/pdfs/10005020.pdf).

Pentru a corecta modificarile induse de temperatură și stocarea în timp, soluțiile se realizează la temperatura de lucru, astfel:

-Se realizează experimentele pe un lot de probă (P) și unul de control ce conțin cîte 100 µl de probă. Pentru a evidenția și corecta erorile experimentale se realizează în duplicat experimentele.

-Se pune în tub proba, 1.2 ml soluție DNPH 10mM iar în tubul control se adaugă 2 ml solutie HCl 2.5M

-Tuburile se țin la întuneric la temperatura camerei timp de o oră și se agită la fiecare sfert de oră

-Se pune cîte 700 µl TCA 30% în fiecare tub, se amestecă și se pastrează pe gheată timp de 10 minute, pentru a realiza o precipitare a proteinelor

-Se separă sedimentul prin centrifugare la 8000g timp de 8 minute la temperatura de 4 °C .

-Sedimentul se recoltează și resuspendă într-un volum de 1 ml TCA 10% cu menținerea pe gheață timp de 5 minute.

-Sedimentul este spălat prin 3 succesiuni de centrigugare și resuspendare în amestec de etanol: acetat de etil 1mL (raport volumetric 1:1) pentru îndepărtarea DNPH.

-Sedimentul se resuspendă într-un volum de 1mL de guanidin-hidroclorid și se amestecă energic prin vortexare timp de 15-20 minute cu menținere la temperatura de 37°C

-Se centrifughează la 8000g timp de 8 minute, la temperatura camerei pentru a îndepărta urmele de materiale insolubile și se verifică cu atenție să nu ramână sedimente.

-Se calibreaza cititorul Tecan folosind o placă de 96 de godeuri goală, prin citirea absorbției la 370nm

-Se pipetează 220 µl din tuburile de proba (P) în 2-3 godeuri

-Se pipetează 220 µl din tuburile de control (C) în 2-3 godeuri

-Se citește absorbanța la 370nm

Calculul concentratiei gruparilor de carbonil:

– Se calculează mediile pentru Probe (P) respectiv Control (C).

– Se calculează absorbția corectată (Acorr) prin diferența dintre valoarea media a P și valoarea medie a C.

Pornind de la o cantitate de 200µl/godeu ce are un drum optic de 0.5 cm, respectiv coeficientul de extincție molară pentru dinitrofenilhidrazină de 22 000 M-1cm-1, (0.022 µM/cm) la lungimea de undă de 370 nm, se calculează astfel:

Concentrația de carbonyl din proteine (nmol/mL plasmă) = (Acorr / 0,011 µM-1)*(1000/100) (se ține cont de diluție)

Rezultatele se pot exprima în diferite unități la mL de plasmă, dar cel mai corect este raportarea la mg proteină pentru a elimina variabilitațile fiziologice ale concentrației de proteine din plasmă.

-Determinarea conținutului proteic se realizează în lotul de control. Acesta se diluează cu guanidină-HCl 1:10 și se masoară aborbția la lungimea de undă de 280nm. Plecând de la curba standard de absrbție a albuminei serice bovine (BSA) dizolvată în același solvent, respectiv hidroclorhidguanina (0,25-2,0 mg/ml), se determină concentrația proteică (echivalentă cu BSA) în tubul de control, prin tehnica de interpolare și având rezultatele exprimate în mg proteină /mL solvent.

Calculul final ține cont de măsurători:

Conținutul de carbonil (nmol/mg proteină) = (Carbonil nmol/ml)/(proteina mg/ml)

Măsurarea conținutului de proteină

Pentru măsurarea conținutului proteic se utilizează o curbă de calibrare la diferite diluții succesive ale unei soluții de BSA, prin măsurarea absorbanței la 280nm. Se utilizează concentrații în intervalul (0,25-2,0 mg/ml), iar rezultatele sunt prezentate în tabelul urmator și în Figura 4.5.

Fig.4.5. Curba de calibrare pentru concentrația de proteină

Fig.4.5. The calibration curve for protein concentration

Datele au fost verificate prin fitare liniară iar paramentrii rezultați confirmă acuaratețea măsurătorilor. Aceste date fitate sunt utilizate pentru calculul concentrațiilor proteice ale probelor de interes și folosite în determinarea capacității antioxidante și a concentratiilor de carbonil în plasmă.

4.3. Determinarea activității antioxidante globale a plasmei sanguine

4.3. Determination of the overall antioxidant activity of blood plasma

Principiul metodei

Metoda se bazează pe un lanț de reacții ce se modifică în prezența produșilor antioxidanți, ce duc în final la un produs colorat ce poate fi măsurat prin cuantificarea absorbanței specifice. Am utilizat un test SIGMA ce are la bază formarea radicalului feril al mioglobinei c onsecutiv interacției mioglobinei cu apa oxigenată. Radicalul feril oxidează ABTS (2.2’ –azino-di (3-ethilbenzthiazoline-6-sulfonic acid) producând un radical cationic , ABTS* +, ce este un cromofor cu o absorbanța specifică la 750 nm ce poate fi măsurată spectrofotometric.

HX-FeIII +H2O2→ •X-[FeIV=O] + H2O

ABTS + •X-[FeIV=O]→ABTS•+ + HX-FeIII

Unde HX-FeIII este metmioglobina iar *X-[FeIV =O] este radicalul feril-mioglobină

Antioxidanții inhibă într-o manieră dependentă de concentrație producția de ABTS* +,ce se poate măsura proportional cu absorția luminii. Ca standard de referință se foloseste Trolox ce este un produs antioxidant, fiind un analog al vitaminei E. Probele se raportează la capacitatea de a preveni oxidarea ABTS și se exprimă în echivalenți milimolari de Trolox.

Protocol experimental

Se decongelează inițial probele păstrate în azot lichid prin menținerea la temperatura camerei timp de 30 de minute. Probele se centrifughează la 5000g pentru a recolta supernatatul în vederea evaluarii capacitatii antioxidante.

Probele de plasmă au fost diluate 1:5 și 1:10 cu tamponul kitului și măsuratorile au fost realizate în dublu exemplar pentru a evidenția eventualele erori.

Reactivii au fost aduși la temperatura camerei înainte de efectuarea testelor.

Preparearea celor 7 standarde de Trolox în domeniul de concentrații 0 – 0.33 mM a fost realizată în ziua testării.

Se pipetează în placa de 96 godeuri câte 10µl standard Trolox, pentru cele 7 standarde se utilizează câte 2 godeuri, sau câte 10µL probă din plasmele diluate în duplicat. Peste acestea se pipetează 10µL metmioglobină și 150µL cromogen ABTS.

Reacția de oxidare se inițiază prin pipetarea de 40 µL H2O2 441 µM.

Placa se ține la întuneric 7 minute pe un agitator la temperatura camerei.

Se măsoară absorbanța la 750 nm pentru a cuantifica efectul antioxidant.

Calculul rezultatelor

Se calculează absorbanțele medii ale stndardelor pentru a elimia erorile de pipetare. Acestea se reprezintă în funcție de concentrația de antioxidant, Trolox (mM), și se fitează liniar pentru a obține curba standard (fig. 4) : AbsStandard = – a * [Trolox conc.] + b.

Pentru calculul activității antioxidante în probe se utilizează valorie obținute folosind următoarea formulă și ținând cont de diluțiile realizate :

Activitate Antioxidanta (mM Trolox echivalent) = [(Abs probei – b) / a ] * diluția

Fig.4.6. Exemplu de curba de calibrare pentru determinarea capacitatii antioxidante globale

Fig.4.6. Example of a calibration curve for determining the global antioxidant capacity

4.4. Determinarea lezarilor ADN: cometa alcalină și tehnica micronuleilor

4.4. Determination of DNA injury: alkaline comet and micronucleus technique

4.4.1. Cometa alcalină cu 2 straturi de agaroză

4.4.1. Alkaline Comet Assay with 2 layers of agarose

Testul cometei (electroforeză în gel pe o singură celulă SCGE) este o metodă de măsurare a ruperilor legăturilor acidului dezoxiribonucleic(ADN) în celule eucariote. Celulele încorporate în agaroză pe o lamelă de microscop sunt lizate cu detergent și o soluție salină foarte concentrată, pentru a forma nucleoizii care conțin bucle superrăsucite ale ADN-ului legate de matricea nucleară.

În urma electroforezei la pH puternic alcalin apar structuri asemănătoare cometelor care se pot vedea dupa colorare prin microscopia de fluorescență; intensitatea cozii cometei față de cap reflectă numărul de ruperi ADN. Buclele care conțin ruperi pierd suprarăsucirea și devin libere să se extindă spre anod.

Această metodă are aplicații în testarea genotoxicității produselor chimice noi, monitorizarea contaminării mediului înconjurător cu substanțe genotoxice, biomonitorizarea umană epidemiologie moleculară și cercetare fundamentală a lezării și reparării ADN-ul. Sensibilitatea și specificitatea testului sunt mult îmbunătățite dacă se folosesc endonucleaze bacteriene de reparare care recunosc anumite tipuri de leziuni în ADN și le pot converti în ruperi și implicit în creșterea cantității de ADN în coada cometei.

În ultimul deceniu testul cometei a fost una din metodele standard de evaluare a lezării ADN-ului, cu aplicații în testarea genotoxicității, biomonitorizare umană, ecotoxicologie, precum și cercetare fundamentală în lezarea și repararea ADN-ului. Deși, este o metodă de măsurare a leziunilor ADN-ului, adăugarea endonucleazelor specifice leziunilor permite detectarea inducerilor de dimeri pirimidinici, baze oxidate și leziuni de alchilare.

Pentru prima dată această metodă a fost demosntrată de Ostling O. și Johanson K. J. în 1984 care au descris coada ca fiind legături de ADN relaxate.

Variații ale metodei cometei:

– Metoda cometei alcaline a fost inventată de Singh și constă în faptul că după ce celulele sunt lizate la pH 10 cu 2,5M clorura de sodiu, Triton X-100 și sarkosyl timp de o oră, sunt menținute la un tratament alcalin (0,3 molar hidroxid de sodiu) o oră înainte de electrophoreză la pH ridicat (mai mare de 13). Protocolul inventat de Singh a fost simplificat în sensul că acuma se folosește un singur strat de agaroză în care sunt încorporate celulele spre deosebire de trei cum a fost inițial iar sarkosil nu mai este folosit în majoritatea protocoalelor.

– Metoda cometei neutre

Este destinată evidențierii ruperilor dublu catenare ale ADN-ului și implică un pH de lucru în jurul valorii de 10. O variantă a acestei metode este cea inventată de Olive P.L., Wlodek D. si Banath J.P. și pune în evidență ruperile dublu catenare fără a ține cont de ruperile monocatenare.

– Folosirea enzimelor specifice leziunilor

Leziunile pot reprezenta efectul direct al agenților externi dar ele sunt în general
reparate repede de asemenea leziunile pot proveni într-o mică măsură de la situsurile apurinice sau apirimidinice care sunt labile în mediul alcalin și de aceea pot apărea ca ruperi. De asemenea procesul de reparare celulară prin excizie de nucleotide sau baze poate apărea ca ruperi. Pentru a face testul mai sensibil și specific a fost introdus un pas uplimentar de digestie enzimatică în care enzimele recunoasc o anumită leziune și o transformă în ruperi. Endonucleaza III este utilizată pentru a detecta pirimidinele oxidate, formamidopirimidin-ADN-glicozilaza (FPG) este folosită pentru a detecta produșii de oxidare purinică ( 8-oxoguanină) precum și alte purine modificate, T4 endonucleaza V recunoaște dimerii pirimidinici de ciclobutanonă și Alk A rupe ADN-ul în care se formează 3-metiladenină.

– Marcarea cu bromodeoxiuridină pentru a evindenția ADN-ul care se replică

Replicarea ADN marește parametrii cozii cometei fiind imposibil de detectat de unde vin aceste leziuni. Dacă celulele sunt tratate cu bromodeoxiuridină în timpul tratamentului cu factorul de studiat și apoi celulele colorate cu anticorpi fluorescenți antibromodeoxiuridină se pot evidenția clar celulele care au fost în diviziune.

Aplicații ale metodei cometei sunt:

1. Teste de genotoxicitate

Testul cometei este un standard în testarea farmaceuticelor sau alte produse chimice. Metoda este folosită în forma sa clasică pentru a măsura ruperile de ADN in vivo pe tesuturi sau sange. În determinarea acțiunii substanțelor antioxidante de asemenea poate fi folosită metoda, cel mai frecvent în cazul principiilor active fitofarmaceutice.

2. Ecomonitorizare

Pentru teste de mediu metoda poate fi aplicată pe organisme sensibile la schimbările ecologice. Midiile sunt organisme frecvent folosite pentru evaluarea contaminării mediului marin. Pentru pământ sunt frecvent folosite râmele. De la râme se extrag coelomocite și se prelucrează prin metoda cometei pentru a determina acțiunea genotoxică a poluanților din sol.

3. Studii umane

Testul cometei este ușor aplicabil pentru limfocitele din sângele uman. Linfocitele sunt ușor de obținut, necesită proceduri neinvazive și reprezintă bine starea generală a organismului. Un mare dezavantaj al limfocitelor îl reprezintă faptul că nu sunt un țesut țintă pentru cancer. În anumite cazuri țesuturi umane obținute în urma chirurgiei sau biopsiei pot fi testate pentru leziuni ale ADN-ului

4. Măsurarea reparării ADN

În condițiile în care se cunosc foarte puține despre capacitatea individuală de reparare a ADN-ului este posibil ca aceasta să fie un factor important al susceptibilității la cancer. Nu există o metodă sigură din acest punct de vedere dar metoda cometei poate aduce date importante în această privință.

Factori de care ar putea modifica rezultatele în tehnica cometei

– Verificarea viabilității celulare.

În majoritatea laboratoarelor se aplică un test indirect de măsurarea viabilitații celulare. În general acest test este realizat cu tripan Blue care determină permeabilitatea membranară colorând celulele cu membrana permeabilizată în albastru. În cazul celulelor recoltate prin detașare mecanică viabilitatea celulară este slabă dar ruperile de ADN sunt normale. În general se știe că celulele control (netratate) au în general 10% din ADN în coadă.

– Păstrarea gelulilor după electroforeză.

În majoritatea cazurilor masurarea parametrilor se face a doua zi fiind vorba despre un număr mare de comete per probă (aproximativ 100). Se consideră că gelurile uscate se pot păstra pe timp foarte lung și pot fi măsurate cu ușurință, cometele aflându-se aproximativ în același plan focal.

– Analiza statistică a rezultatelor

Acest lucru poate fi efectuată în mai multe feluri, spre exemplu, o singură lamă ar putea fi analizată din punct de vedere al leziunilor ADN ale diferitelor celule și modul în care sunt distribuite sau se poate măsura coeficientul de variație (deviația standard împărțită la medie). Dar când este vorba despre analizarea diferențelor în experimente sau efectele tratamentului se caută scorul mediu global pentru fiecare punct experimental care este exprimat în procente de ADN în coadă (sau unități arbitrare în cazul examinărilor vizuale).

– Limita de detecție superioară a metodei

Procentul de ADN din coadă este liniar dependent de frecvența ruperilor ADN. Saturația apare atunci când tot ADN-ul este în coadă astfel că abaterea de la liniaritate este mare în acest caz. O atenție deosebită trebuie acordată atunci când este vorba de folosirea endonucleazelor specifice leziunii în cazul în care acestea se suprapun peste niveluri ridicate de rupere urmând astfel ca efectul endonucleazelor să fie subestimat.

Fig.4.7. Testarea capacității metodei cometei de a detecta cantitativ situsurile FPG sensibile dintr-o gamă de concentrații de 8-oxoguanină în ADN. Celulele HeLa au fost netratate (A) sau iradiate cu lumină vizibilă (B) sau tratate cu lumină și 0,2µM Ro 19-8022 (C) sau tratate cu lumina vizibilă și 0,4 µM Ro 19-8022 (D) [59].

Fig.4.7. Test of ability of comet assay to detect FPG sensitive sites quantitatively over a range of concentrations of 8-oxoguanine in the DNA. HeLa cells were untreated (A), or irradiated with visible light (B), or treated with light and 0.2 µM Ro 19-8022 (C), or treated with light and 0.4 µM Ro 19-8022 (D). Ro 19-8022.

Ro 19-8022 [1-((10-Chloro-4-oxo-3-phenyl-4H-benzo(a)quinolizin-1-yl)carbonyl)-2-pyrrolidine methanol] este un fotosensibilizant polar care în prezența luminii induce doar acumularea de baze oxidate (8-oxoGua) făra a provoca o cantitate semnificativă de ruperi ale lanțului ADN [250].

Testul cometei este o metodă sensibilă folosită pentru detectarea ruperilor lanțurilor de ADN. Prin calibrarea metodei aceasta poate fi folosită ca un instrument cantitativ.

Prin introducerea endonucleazelor specifice pot fi detectate și alte leziuni în afară de ruperi ale lanțurilor de ADN. Metoda poate de asemenea să ofere răspunsuri despre nivelurile naturale de ruperi ale ADN-ului în celuele normale, variația capacității de reparare a ADN-ului pentru populațiile umane precum și modul de reparare al ADN-ului în nucleul celular.[59]

I. Prepararea reagenților

Tampon fosfat salin (TFS=PBS), pH 7,4 (fara calciu și magneziu): 8g NaCl, 0,2g KCl; 3,58g Na2HPO4 în 900 mL apă, se ajustează pH-ul cu câteva picături de HCl 1M și se completează până la 1L; soluția se sterilizează prin autoclavare sau filtrare;

Soluția de liză

Pentru 1000 mL 2,5M NaCl 146,1g

100 mM EDTA 37,2g

10 mM Trizma base 1,2g

Se adaugă ingredientele și pană la 700 ml apa și se amestecă. Se adaugă ~ 8g NaOH și se amestecă 20 minute. Se ajustează pH-ul la 10 utilizând HCl sau NaOH. Se adaugă apă până la 890ml (restul până la 1000 va fi Triton X-100 – 10mL și DMSO – 90mL)

Soluția finală de liză:

se adaugă Triton X-100 și 10% DMSO și se refrigerează (4-80C) 30 minute

Soluția de electroforeză (300mM NaOH/1mM EDTA)

Se prepară din soluțiile stoc concentrate 1. 10N NaOH (200g/500mL H2O)

2. 200 mM EDA (14,49g/200mL H2O pH 10)

Înainte de folosire se prepară o solutie din 30 mL NaOH, 5 ml EDTA peste care se adaugă apă (AD) pană la 1000 mL. Înainte de utilizare se masoară pH-ul soluției să fie mai mare de 13.

Soluția de neutralizare: 0,4 M Tris-48g~800 ml apă, se ajustează pH-ul la 7,5 cu HCl concentrat, se adaugă apă până la 1000 ml

Soluția de colorare: Bromura de Etidiu (EtBr; Stoc~ 10 x 20μl/ml):se adaugă

10 mg EtBr în 50 mL apă. Din soluția stoc se ia 1 mL și se amestecă cu 10 ml apă.

II. Prepararea lamelor

Materiale : Agaroză cu punct normal de topire Normal Melting Agarose (NMA Sigma)

Agaroză cu punct scăzut de topire Low Melting Point Agarose (LMPA Sigma)

Metanol

Lame

Microtuburi de centrifugă

Micropipete și vârfuri

Prepararea stratului de agaroză de bază

1. Se prepară soluții de 1% NMA și 0,5% LMPA în TFS

2. Lamele se lasă în metanol 24 ore pentru a se îndepărta petele de grăsime

3. După uscare lamele se imersează în soluția de NMA fierbinte dupa care se usucă la temperature camerei sau la 500C. Stratul de gel trebuie să fie subțire și uniform. Lamele se pot pastră câteva zile pâna la utilizare.

Izolarea celulelor

Celulele aderente sunt incubate cu tripsină 0,1% două minute la 370C apoi resuspendate în mediu. Suspensiile de celule sunt aduse la concentrația dorită prin centrifugare sau diluare.

Procedura de lucru

Prepararea celulelor depuse

Din fiecare suspensie de cellule preparate se iau 20µl, se mixează cu cate 100µl LMPA (la aproximativ 370C). Acest amestec se depune imediat pe lamele de bază pregatite anterior. După depunerea celulelor pe lame acestea se acoperă cu lamele pentru o împraștiere omogenă a probei pe lama și se pun 3-5 minute pe gheță pentru ca gelul să se solidifice. Se pregatesc minim 2 lame pentru fiecare punct experimental.

Liza- La întuneric

Dupa solidificarea gelului se îndepărtează lamela și lamele se transferă în vasul de liză, imersate în soluția finală de liză descrisă anterior. Liza se desfașoară la 40C timp de minim o oră.

Electoforeza – La întuneric

1. După etapa de liză lamele se așează în tancul de electroforeză avâand grijă ca între ele să nu rămână spații libere. Pentru evitarea apariției erorilor sistematice, lamele sunt răspândite aleator (dublurile să nu fie una lângă alta) în tancul de electroforeză.

Dacă se rulează electroforeza de mai multe ori dublurile lamelor vor fi puse în tancuri de electroforeză diferite.

2. Se umple tacul de electroforeză cu tampon de electroforeză până când lichidul acoperă lamele. S-a folosit un tanc de 2 litri pentru 16 lame.

3. Se lasă lamele 20 minute în soluția alcalină la temperatura camerei (200C)

4. După aceste 20 minute se începe electroforeza la o tensiune de 0.74V și un curent de ~300mA, timp de 30minute, la temperatura camerei.

5. Se scot lamele și se pun în soluție de neutralizare 5 minute . Se schimbă soluția de neutralizare de două ori la interval de 5 minute.

6. Se colorează cu bromura de etidiu 20µg/mL (s-au adăugat 70µl pe fiecare lamă). Lamele se pastrează la frigider maxim 24h și se vizualizează la microscopul cu epiflorescență.

Evaluarea alterarii ADN

1. Observațiile s-au făcut pe un microscop cu epiflorescență ( Olympus BX51) folosind un obiectiv 20x și un filtru U-MNG2 Olympus (excitare la 530-550 nm și emisie la 590 nm) adecvat pentru observarea imaginilor colorate cu bromură de etidiu. Imaginile au fost prelucrate cu un sistem de achizitia imaginii specializat, Comet Assay IV (Perceptive Instruments, UK), conținând o cameră CCD, placa de achiziție, software de achiziție și prelucrarea imaginii.

Fig.4.8. Exemplificare a procedurii de măsurare automată cu ajutorul softului Comet Assay IV

Fig.4.8. Illustration of automatic measurement procedure using Comet Assay IV software

2. Pentru analiza calitativă și cantitativă a alterarii ADN-ului în celule se urmăresc minim 3 parametri semnificativi: distanța de migrare a ADN-ului (tail lenght), proportia de ADN care a migrat (procentul de ADN din coada cometei – tail intensity) și un parametru derivat – momentul cozii cometei (Tail Moment = (Tail.mean – Head.mean) X Tail%DNA/100 ).

Au fost analizate pentru fiecare probă câte 100 celule, alese la întâmplare, de pe două lame.

Fig.4.9. Imagini ale cometelor măsurabile (original)

Fig.4.9. Images of measurable comets

3. Nu se masoară cometele care nu au cap bine constituit (pot fi celule apoptotice) sau care arată ca niște "arici" sau "norișori". Obligatoriu se masoară 2-3 lame chiar dacă numarul total de celule este 100.

Fig.4.10. Comete care nu se măsoară (norișori) (original)

Fig.4.10. Immesurable comets (clouds)

4. Se analizează distribuția intercelulară a parametrilor cometei pentru a verifica dacă apar distribuții bimodale – (pentru aprecierea frecvenței de manifestare a unui efect genotoxic față de citotoxic sau invers).

4.4.2. Formarea de micronuclei

4.4.2. Micronucleus formation assay

Micronucleii sunt formați din cromozomi sau fragmente de cromozomi ce nu se pot atașa fusului de diviziune și deci nu sunt încorporați în nuclei în timpul diviziunii acestora. Aceștia reprezintă un biomarker al genotoxicității. În analiza micronucleilor celulele sunt blocate în citokineză, moment în care sunt observați cei doi nuclei formați în urma diviziunii nucleare.

Pentru blocare în citokineză se adaugă în mediul de cultură o solutie conținând Cytochalasin B (concentrație finală de 3µg/mL pentru L929 și 6µg/mL pentru HepG2), la o perioadă de timp corespunzatoare unui ciclu de diviziune înaintea momentului sacrificarii culturii (în cazul celulelor L929 17 ore și 48 ore pentru HepG2).

Realizarea testului de micronuclei constă în fixarea celulelor utilizand o soluție rece de acid acetic : metanol în raport 1:9, timp de 15 minute, spalare cu PBS și colorarea cu Acridine Orange, 10 µg/mL în PBS, 5 minute urmată din nou de o spalare cu PBS.

Fig.4.11. Imagine de microscopie de fluorescență a unui preparat realizat pentru măsurarea frecvenței micronucleilor (celule L929, obiectiv 40x). Se pot observa mai multe celule binucleate, marcate prin săgetile albe și o celulă binucleată având un micronucleu (încadrată în patratul alb). În colțul din stânga jos al figurii este prezentată o imaginea marită a celulei. (original)

Fig.4.11. Fluorescence microscopy image of a sample made for micronucleus frequency measurement (L929 cells, 40x objective). You can see several binucleated cells, marked by white arrows and a binucleated cell with a micronucleus (whitw framed square). In the bottom left of the figure is shown a magnified image of the cell.

Criterii de măsurare: Analiza celulelor s-a realizat utilizând indicațiile descrse de Fenech [89]. Se analizează numai celulele binucleate, cu nuclei aproximativ egali ca dimensiune și ca intensitate a colorației, cu o bună colorație a citoplasmei, oferind certitudinea că cei doi nuclei fac parte dintr-o singură celulă. Cei doi nuclei pot se pot atinge, dar trebuie să se poată face distincția între ei. Micronucleii sunt observați ca și corpusculi de mici dimensiuni, variind între 1/16 și 1/3 din dimensiunea nucleilor și au aceeași intensitate a colorației ca aceștia (Fig. 4.11).

În analiza micronucleilor, pentru fiecare probă, s-au numarat cel putin 500 de celule binucleate, de către 2 peroane cu experiență în această metodă. S-a calculat apoi numărul total de micronuclei, raportat la 1000 de celule binucleate.

4.5. Determinarea modificărilor metabolismului mitocondrial (testul MTS)

4.5. Determination of changes in mitochondrial metabolism (MTS assay)

Testul MTS

Determinarea metabolismului mitocondrial s-a făcut prin utilizarea kitului “Cell Titer 96Aquous One Solution Cell Proliferation Assay” (Promega)

Acest kit conține un compus de tetrazoliu [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboximethoxiphenyl)-2-(4-sulfophenil)-2H-terazolium, MTS] și un agent care cuplează electroni (phenazine ethosulphate- PES), cu formarea unei soluții stabile.

Compusul cu tetrazolium MTS (reactiv Owen) este redus de către celule într-un compus de formazan colorat, solubil în mediul de cultură [263]. Reducerea sării de tetrazolium se face de către sistemul succinat – tetrazolium reductaza care aparține lanțului respirator mitocondrial și este activ doar în celule viabile.

Fig.4.12. Reducerea MTS în Formazan de către mitocondrie [www.promega.com]

Fig.4.12. Reduction of MTS to formazan by mitochondria [www.promega.com]

Testul s-a efectuat prin adăugarea unei cantități de 20 µL din reactivul CellTiter 96Aquous One Solution la 100µl mediu (5% FCS) direct în godeurile cu cultura de cellule, urmată de o incubare de 3-4 ore și ulterior de măsurarea absorbției la 490 nm cu un cititor pentru plăci cu 96 godeuri Tecan (Sunrise-Basic, Austria) [183];[49].

În cazul filmelor polimerice și culturii de celule în plăci cu 24 sau 12 godeuri s-a păstrat raportul de 20 µl din reactivul CellTiter 96Aquous One Solution la 100µl mediu (5% FCS) dar s-a ajustat volumul total la mărimea godeului sau înălțimea structurilor împreună cu substratul pe care au fost depuse.

În plăci, probele au fost astfel depuse încât să existe măcar cate 5-7 godeuri pentru fiecare punct experimental și deasemeni o serie de blancuri (doar soluția de MTS în mediu cu 5% FCS).

S-au calculat medii ale absorbțiilor măsurate pe replicile culturilor aflate în aceleași condiții de tratament. Valorile absorbțiilor au fost corectate prin scăderea absorbției corespunzătoare probelor blanc (reactivi fără celule).

Viabilitatea s-a calculat prin normarea valorilor corectate obținute la celulele tratate în raport cu celule netratate, control.

Viabilitatea (%) = [Abs 490nm(corectat)]proba tratată / [Abs 490nm (corectat)]proba netratată]

4.6. Apoptoza morfologică

4.6. Morphological apoptosis

Celulele din organism fac parte dintr-o ‘comunitate’ foarte bine organizată. Numărul de celule este foarte bine controlat prin diviziunea celulară și prin apoptoză. Denumirea de apoptoză vine din greacă de la expresia a cădea asemenea frunzelor din copac. În organismele adulte rata de proliferare celulară este echilibrată de rata de apoptoză.

În cazul leziunilor masive tisulare celulele se umflă și se sparg eliminând conținutul în mediul extracelular și producând o reacție inflamatorie. Acest fenomen de moarte celulară poartă denumirea de necroză. În apoptoză celulele se micșorează și condensează, citoscheletul colapsează, membrana nucleară se rupe și ADN-ul se fragmentează. Suprafața celulară se modifică în așa fel încât celula să fie fagocitată înainte să se producă scurgeri ale conținutului [36].

Fig.4.13. Reprezentare schematică a ciclului apoptotic [36]

Fig.4.13. Schematic representation of the apoptotis cycle

Apoptoza morfologică este o metodă de colorare a nucleului care are la bază permeabilitatea diferită pentru anumiți coloranți fluorescenti. Bromura de etidiu homodimer poate patrunde în celulele moarte și colorează nucleul în timp ce celulele intacte ramân necolorate. Când sunt vizualizate la un microscop cu fluorescență, nucleul celulelor apoptotice apare colorat în roșu.

Nucleele apoptotice au cromatina condensată formând smocuri la periferia membranei nucleare.

Protocol de lucru

Se centrifughează suspensia de celule pentru 7 min, 400 g, la temperatura camerei.

Se îndepărtează supernatantul (se lasă 100-250 𝜇l).

Se adaugă 100-250 𝜇l soluție de colorare : 20 𝜇g/ ml Acridin Orange (AO) + 10 𝜇g/ ml Etidium Homodimer (Et.H) în PBS.

Souluția de Acridin Orange este folosită pentru marcarea celulelor viabile care altfel fiind impermeabile pentru Etidium Homodimer nu s-ar observa în microscopia de fluorescență.

Se lasă la întuneric pentru 10 min.

Se centrifughează pentru 7 min, 400 g, la temperatura camerei.

Se îndepărtează supernatantul (în totalitate).

Se adaugă 1 ml de formaldehidă 1%.

Se centrifughează pentru 7 min, 400 xg, la temperatura camerei.

În cazul în care celulele sunt aderente și se dorește aplicarea metodei direct pe aceste suprafețe centrifugarea este înlocuită cu spălare simplă.

Se lasă 60-70 𝜇l supernatant.

Se adaugă 20-30 𝜇l soluție 2,3% DABCO în glicerol.

Soluția DABCO are rolul de a preveni stingerea fluoroforului.

Se pun 30 𝜇l suspensie pe lamele.

Se acoperă cu o lamelă mai mare de sticlă.

Se vizualizează la microscopul cu fluorescență, cu obiectiv de 100x.

Se numără 300 de celule pentru fiecare lamelă.

Fig.4.14. Cultură celulară aderentă pe care se studiază apoptoza – celule viabile (verde) și apoptotice (roșu) [273]

Fig .4.14. Adherent cell culture subjects to apoptosis studies – viable cells (green) and apoptotic (red)

4.7. Administrarea radiofarmaceuticelor

4.7. The administration of radiopharmaceuticals

Pentru acest experimet s-au folosit șobolani Wistar cu tumori RS1 (150-200g în momentul injectării) produși la Institutul Oncologic Bucuresti.

Lucrul cu animalele s-a desfașurat comform legislatiei naționale în vigoare și recomandarilor F.E.L.A.S.A. Cazarea s-a făcut în cuști, câte 2-3 animale pe cușcă, temperatura de 19-240C și umiditatea de 40-60% cu un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore.

Compușii care au fost injectați sunt alcătuiți din:

-un nucleu radioactiv – Lutețiu 177 metastabil

– un agent de complexare – DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid)

– SR-48692 (meclinertant) un medicament nepeptidic antagonist al receptorilor de neurotensină NTS1

– NT (neurotensină)

Fig.4.15. Structura chimică a neurotensinei [279]

Fig.4.15. Chemical structure of neurotensin

După 42 zile de la implantarea tumorilor șobolanii au fost împărțiți în cinci grupe a câte 15 animale și injectați intravenos cu compuși radiomarcați cu Lu 177 astfel:

– Grupul 1 – li s-a administrat o doză unică de 177Lu-DOTA-NT (activitate specifică 2 Ci/mg)

– Grupul 2 – li s-a administrat o doză unică de 177Lu-DOTA-SR48692 (activitate specifică 2 Ci/mg

– Grupul 3 – a fost tratat intraperitoneal cu o doză unică de 1/1 177Lu-DOTA-NT/DOTA-SR48692

– Grupul 4 – s-a administrat intraperitoneal o combinație de 1/1 DOTA-NT/177Lu-DOTA-SR48692. Animalele din grupul 3 și 4 au fost tratate în două etape: inițial s-au administrat intraperitoneal soluțiile radioactive (activitate specifică 2Ci/mg), apoi, după 30-40 minute, tot intraperitoneal s-au injectat soluțiile neradioactive (1µg/100µl).

– Grupul 5 – a fost compus din 5 animale la care s-a injectat, intraperitoneal, buffer fosfat salin cu 0,5% (w/v) albumină serică bovină.

La 48 ore și 14 zile de la injectare o parte din șobolani au fost sacrificați și s-a recoltat: sânge, țesut tumoral, ficat, pancreas, rinichi, splină, intestin subțire și femur pentru analize de flowcitometrie.

4.8. Realizarea structurilor prin polimerizare cu doi fotoni

4.8. Making structures by two-photon polymerization

Polimerizarea cu doi fotoni (Two Photon Polymerization – 2PP) este o tehnică modernă care permite construcția oricăror structuri complexe 2D sau 3D cu o rezoluție de 100nm [117]. Metoda este bazată pe interacțiunea laserului cu un material fotosensibil care induce o reacție chimică de polimerizare. Absorbția a doi fotoni exprimă o dependență patratică de intensitatea laserului incident ducând la polimerizare numai în punctul focal al acestuia unde sunt întrunite condițiile de maxim. Astfel polimerizarea cu doi fotoni este folosită pentru micro sau nanostructurarea 3D ca o procedură cu o singură etapă.

Fig.4.16. Principiul “scrierii directe” cu laserul [179]

Fig.4.16. The principle of laser direct writing

Ormosil (silicați modificați organic) sunt monomeri hibrizi care prezintă legaturi covalente puternice între compușii organici și anorganici cu calități optice bune, proprietăți mecanice corespunzatoare și stabilitate termică. Sunt o clasă de materiale care conțin grupări organice și anorganice. În urma acestor combinații partea anorganică vine cu stabilitatate chimică și termică, duritate și transparență iar grupările organice aduc avantaje ca posibilitatea de funcționalizare și procesarea la temperaturi joase.

Monomerul hibrid folosit pentru fotopolimerizarea laser este un metacrilat cu un grup trietoxilan: N,N’-(metacriloiloximetil trietoxi silil propil carbamoiloxihexil)-uree (SIM-3) (figura 4.17. a) în combinație cu un oligomer al dimetilacrilat uretanului (UDA) folosit ca și comonomer.

Fig.4.17. (a) Structura chimică a (a) SIM 3: N,N'- (metacriloiloxietil trietoxi silil propil carbamoiloxihexil)-uree și (b) oligomer multifuncțional de tipul uretan dimetacrilat -UDA [179]

Fig.4.17. (a) The chemical structure of (a) SIM 3: N,N’-(methacryloyloxyethyl triehtoxy silyl propyl carbamoyloxyhexyl)-ureea and (b) multifunctional oligomer of urethane dimethacrylate type – UDA.

Fig. 4.18. Imagini de microscopie optică a (de la stânga la dreapta) SIM 3, UDA, SIM 3 +UDA, fotoinițiator = Irgacure 369, distanța între linii = 50µm [177]

Fig. 4.18. Optical microscopy images of polymerized (from left to right) SIM 3, UDA, SIM 3 +UDA, Photoinitiator = Irgacure 369, Distance between lines = 50 μm

4.9. Tehnica MAPLE

4.9. MAPLE technique

MAPLE este o tehnică cunoscută de obținerea filmelor subțiri (câțiva nanometri) uni sau pluristratificate din materiale sensibile (materiale care procesate prin matode chimice sau fizice de altă natură ar suferi modificări ale structurii și funcției). Metoda implică direcționarea unui fascicol laser pulsativ spre o țintă înghețată făcută din materialul de interes dizolvat într-un solvent. Prin interacția cu fascicolul laser, datorită solventului volatil, particule din țintă sunt evaporate. Solventul și materialele solvate sunt eliberate în camera de depunere și pe masură ce solventul volatil este pompat în afara camerei, moleculele de material sunt depuse pe un substrat și formează filmul[261].

Fig .4.19. Principiul tehnicii MAPLE [http://ppam.inflpr.ro/facilities.html]

Fig .4.19. Principle of MAPLE technique

4.10.Tipuri de microscopie folosite în lucrare

4.10. Types of microscopy used in this paper

Microscoapele sunt instrumente create pentru a oferi o imagine mărită vizual sau fotografic a obiectelor mici. Microscopul trebuie să îndeplinească trei condiții: să producă o imagine mărită a probei, să separe detaliile imaginii (rezoluție) și să facă imaginile vizibile camerei sau ochiului uman [188].

A. Microscopia de fluorescență

Fluorescența este fenomenul de emisie a luminii de către probă doar pe timpul iluminării acesteia. Timpul între absorbția și emisia luminii este de ordinul 1/1.000.000 dintr-o secundă.

Fig.4.20. Fenomenul de fluorescență la nivel atomic [188]

Fig.4.20. The phenomenon of fluorescence at the atomic level

Fenomenul de fluorescență este cunoscut de la mijlocul secolului al XIX-lea. Cercetătorul britanic Sir George G. Stokes a observat că mineralul fluorspar prezintă fluorescență când este iluminat cu lumină ultravioletă și tot el a inventat cuvântul "fluorescență". Stokes a observat că lumina de fluorescența are lungimi de undă mai mari decât lumina de excitație, un fenomen care a se numește astăzi tranziția Stokes.

Fluoroforii sunt coloranți similari cu cei din microscopia de transmisie doar ca aceștia prezintă fenomenul de fluorescență. Aceste fluorofori sunt capabili să absoarbă și apoi transmită lumină, sunt de multe ori foarte specifici în colorarea anumitor ținte și au un randament semnificativ al raporturi absorbție/emisie (randament cuantic – quantum yield). Creșterea popularității microscoapelor de fluorescență este strâns legată de dezvoltarea a sute de fluorocromi cu spectre de excitație și emisie bine caracterizate și de asemenea cu ținte biologice și mecanisme de legare bine cunoscute.

Fig.4.21. Structura chimică a unor fluorofori frecvent utilizați in tehnica microscopiei de fluorescență (a- DAPI si b- Texas Red) [188]

Fig.4.21. Chemical structure of fluorophores commonly used in fluorescence microscopy technique (a- b- DAPI and Texas Red)

Microscopul cu fluorescență a fost inventat în prima parte a secolului XX de către August Köhler, Carl Reichert, și Heinrich Lehmann. La început a avut foarte puține aplicații ajungând în zilele noastre să fie un instrument important și chiar indispensabil în biologia celulară.

Spre deosebire de alte moduri de microscopie optică, care se bazează pe caracteristicile macroscopice, cum ar fi diferențe de fază, absorbția luminii și birefringența, microscopia de fluorescență poate urmări o singură specie moleculară bazată exclusiv pe proprietățile de emisie fluorescentă. Astfel, folosind microscopia de fluorescență se poate realiza localizarea precisă a componentelor intracelulare marcate cu fluorofori, coeficienții lor asociați de difuzie, transport și interacțiuni cu alte biomolecule. În plus modificările mediului ca pH, vâscozitate, indicele de refracție, concentrațiile ionice, potențialul de membrană, polaritatea solventului în celule și țesuturi vii pot fi evidențiate cu ajutorul fluoroforilor specifici.

Microscopia de fluorescență cu iluminare incidentă (lumină reflectată sau episcopică) a fost inventată pentru prima dată la sfârșitul anilor 1920 pentru a observa emisia fluorescentă în probele metalurgice opace. Ca și în microscopia de câmp luminos aceste instrumente de fluorescență cu lumină reflectată foloseau un divizor de undă de tip oglindă care este limitat la un randament global de aproximativ 25 % (după ce a pierdut 50 % din intensitatea luminoasă la fiecare trecere prin oglindă). Cu toate acestea microscopul de fluorescență cu lumină reflectată avea avantajul avantajul unui obiectiv cu apertură numerică mare în calitate de condensator și producea imagini cu un nivel semnificativ mai mare de luminozitate mare de luminozitate decât microscoapele în transmisie cu aperturi numerice similare.

Trecerea la fluorescența prin lumină reflectată a fost realizată de progresele tehnice în surse de iluminare atunci când lămpile cu descărcare în vapori de mercur și xenon au fost dezvoltate în mijlocul anilor 1930. Contribuția cea mai importantă în dezvoltarea de microscopiei de fluorescență cu lumină incidentă a fost inventarea divizorului dicromatic (oglindă dicroică) de către om de știință rus Eugeny Brumberg în 1948. Această inovație a depășit problemele de pierdere de lumină inerente cu utilizarea de semi-oglinz. Microscoapele cu fluorescență au fost prima oară comercializate pe scară largă de către Johan S. Ploem la sfârșitul anilor 1960.

Fig.4.22. Schema de funcționare a microscopului de fluorescență cu lumină reflectată pentru o probă ipotetică care conține un fluorofor cu excitația în zona verde (550 nm) și emisia în roșu (620-660 nm) [188]

Fig.4.22. Operating diagram of reflected light fluorescence microscope for a hypothetical specimen containing a fluorophore that is excited in the green region (550 nanometers) and fluoresces in the red (620 to 660 nanometers)

Microscopia de fluorescență cu lumină reflectată este metoda ce mai modernă pentru investigații cu surse de lumină care necoerente. Acest mod populară de microscopie de fluorescență este de asemenea cunoscut sub numele fluorescență a luminii incidente, fluorescență episcopică sau simplu epi-fluorescență.

Microscopul conține un cap vizor triocular care este cuplat la o camera cu charge-coupled device (CCD) și are două surse de iluminare, una pentru lumină transmisă și cealaltă pentru fluorescență ( lampa cu halogen și mercur sau mai nou sursă de iluminare cu LED – diodă emițătoare de lumină ).

Fig. 4.23. Surse de lumină folosite în microscopia de fluoresență și spectrele unor surse de lumină [188]

Fig. 4.23. Light sources used in fluorescence microscopy and spectra of light sources

Cubul de filtre este un bloc optic poziționat pentru a coincide cu intersecția dintre axul direcției luminii de iluminare și calea optică a microscopului. Filtrul excitație selectează o bandă îngustă de lungimi de undă din spectrul generat de lampă și le transmite la oglinda dicromatică, care la rândul său, reflecta lumina prin obiectiv pe specimen. Emisia fluorescentă captată de obiectiv trece de data aceasta prin oglinda dicromatică și filtrul de emisie înainte de a forma o imagine.

Fig.4.24. Cub de filtre și spectrul asociat fiecărui filtru [188]

Fig.4.24. Filter cube and spectrum associated with each filter

Obiectivele sunt părți ale microscopului optic responsabile pentru formarea primară a imaginii si joacă un rol foarte important în calitatea imaginii produse de microscop. Obiectivele moderne sunt compuse din numeroase lentile atingând maximul de calitate și performanță cu corectarea aberațiilor (cromatice și de sfericitate).

Fig. 4.25. Componentele și semnificația simbolurilor la un obiectiv [188]

Fig. 4.25. Components and meaning of symbols on a microscope objective

În toate formele de microscopie optică (inclusiv fluorescență), intensitatea imaginii este o funcție a aperturii numerice (NA) și a măriri (M).

Intensitatea = (NA)4/M2

Apertura numerică a unui obiectiv microscopic este o măsură capacității sale de a aduna lumină și de a evidenția detaliile probei de la o distanță fixă față de obiect. Undele luminoase trec prin probă și intră în obiectiv într-un con răsturnat. O secțiune longitudinală a acestui con de lumină reprezintă deschiderea unghiulară, o valoare determinată de distanța focală a obiectivului.

NA = n(sin µ)

n este indicele de refracție al mediului dintre lentila obiectivului și probă. Aceste poate varia de la 1 pentru aer până la 1,51 pentru uleiuri speciale de imersie.

µ este jumătate din apertura unghiulară

Fig.4.26. Apertura numerică a diferitelor obiective în funcție de distanța de lucru [188]

Fig.4.26. Numerical aperture of different objectives according to the working distance

B. Microscopia în contarst de fază

Microscopia în contast de fază a fost descrisa pentru prima oară de fizicianul olandez Frits Zernike în 1934. Este o tehnică optică de îmbunătățire a contrastului care poate fi folosită pentru a produce imagini cu contrast mare pe probe transparente cum ar fi celule în cultură, microorganisme, bucăți de sticlă si particule subcelulare (nuclei, organite). Aceasta tehnică are la bază un mecanism de transformare a variațiilor mici de fază în variații corespunzătoare de amplitudine care pot fi vizualizate ca diferențe în constrastul imaginii. Unul din principalele avantaje ale contrastului de fază este ca celulele vii pot fi examinate în starea lor naturală fără a fi omorâte, fixate și colorate. Ca urmare, dinamica proceselor biologice poate fi observată și înregistrată cu claritate și contrast mare.

Fig.4.27. Celule în cultură a – microscopie în câmp luminos, b – microscopie în contrast de fază [122]

Fig.4.27. Cells in culture a – bright field microscopy, b – phase contrast microscopy

Tehnica contrastului de fază presupune ca iluminarea parțial coerentă produsă de lampă este condensată și directionată printr-un anulus ( figura .4.28 – condenser anulus) situat dedesubtul planului. Undele luminoase care trec prin inel iluminează specimenul și fie trec nedeviate sau sunt refractate și întârziate în fază de structuri și gradienți de fază prezenți în probă. Lumina nedeviată și refractată este colectată de obiectiv, este separată la planul focal de către o placă de fază (fig.4.28 phase plate) și focalizată în planul intermediar al imaginii pentru a forma imaginea cu contrast de fază finală observabilă în oculare.

Fig 4.28. Componentele microscopului în constrast de fază [122]

Fig 4.28. The components of phase contrast microscope [122]

C. Microscopia electronică de scanare (Scanning electron microscopy)

Microscopia electronică reprezintă o metodă modernă de studiere a aspectului structurilor foarte fine de ordinul 100 – 1nm și cu măriri uzuale cuprinse între 50.000 și 100.000 x (există

microscoape electronice care pot mări până la 300.000 x).

Microscopul electronic are o putere de separare de ordinul 0,1 nm, minim pentru care este posibilă distingerea a două repere alăturate (rezoluție).

Avantajele folosirii electronilor constă în lungimea mică de undă pe care o au aceștia. Ca și în cazul microscopiei optice unde rezoluția maximă este λ/2 (lungimea de undă împărțită la 2) în microscopia electronică este vorba de lungimea de undă este cuprinsă între 0.0123 nm și 0,0012nm. Chiar dacă lungimile de undă folosite în cazul SEM-ului aduc un avantaj considerabil față de cele folosite în microscopul optic, este aproape imposibil să se obțină detalii de același

ordin de mărime cu lungimea de unda din mai multe motive: aberații ale sistemului de

lentile, vibrații mecanice și fluctuații electromagnetice (în spațiul din jurul microscopului și

în rețeaua electrică) și mai ales faptul că fascicolul extrage informația dintr-un volum care

depinde de adâncimea la care patrund electronii în material.

Un alt avantaj important al SEM-ului față de microscopul optic este adancimea de camp

mult mai buna pentru același grad de mărire din cauza fascicolului de electroni foarte îngust.

Din această cauză trebuie să se țină cont de distanța între obiectiv și specimen: în cazul unei

distanțe mari de lucru (centimetri) deschiderea fasciculului este mica și adâncimea

de camp este mare iar în cazul unei distante de lucru mici ( milimetri) deschiderea fasciculului

creste iar adâncimea de câmp scade.

Se pot studia astfel planele reticulare, diferite tipuri de defecte în rețeaua cristalină,

interacțiuni ale defectelor, se pot urmări transformări de fază, deformări plastice, reacții de suprafață, etc.

În raport cu aceste surse informaționale, și respectiv cu procedeul de investigare, se pot distinge următoarele tipuri principale de microscopie electronică:

– microscopie electronică de transmisie – în care electronii străbat proba. Se aplică în cazul specimenelor aproape bidimensionale (cu grosimi mai mici sau comparabile cu drumul liber mediu al electronilor accelerați – zeci de nm )

– microscopie electronică de reflexie (de investigare a suprafetei )– în care imaginea se produce prin reflectarea electronilor de către obiect. Se aplică în cazul celor tridimensionale (cand dimensiunile depasesc drumul liber mediu pe toate axele).

În prima categorie se încadrează: Microscopul Electronic cu Transmisie (TEM – Transmission Electron Microscope) și Microscopul Electronic cu Transmisie de Înalta Rezolutie (HRTEM – High- Resolution Transmission Electron Microscopy) iar în cea de-a doua: Microscopul Electronic cu Scanare (SEM – Scanning Electron Microscope), Microscopul Electronic cu Scanare în Mediu (ESEM – Environmental SEM) , Microscopul Electronic cu Reflexie (REM- Reection Electron Microscope), Microscopul cu Electroni de Energie Joasă (LEEM – Low-Energy Electron Microscope) și Microscopul Electronic de Energie Joasă cu Polarizare a Spinului (SPLEEM – Spin-Polarized Low-Energy Electron Microscopy). Există însă și o combinație a celor două sub forma Microscopului Electronic de Transmisie de Scanare (STEM – Scanning Transmission Electron Microscope).

O diferența majoră între cele două metode este rezoluția care ar putea teoretic să atingă 0.5 Angstromi în cazul unui TEM la o marire de 50 de milioane de ori și cu o corecție de sfericitate sucientă față de 0.4 nm în cazul unui SEM la o mărire de 2 milioane de ori.

Pentru TEM se folosește un fascicul de electroni accelerați (la energii de 40 – 400 keV) și focalizat de o serie de lentile magnetice care este transmis prin specimen. La ieșirea din acesta,

fasciculul de electroni care conține informații legate de materialul analizat este mărit

de lentila obiectiv și este proiectat pe un ecran fluorescent. Imaginea formată poate fi direct înregistrată pe un film fotografic sau poate fi captată printr-un sistem optic de către o cameră digitală și transmisă mai departe pe ecranul unui computer.

Rezolutia TEM-ului are o limită fundamentală dată de aberațiile de sfericitate, dar în noile generații de microscoape aceasta aproape a fost eliminată.

Modurile principale de formare a imaginii în cazul TEM-ului sunt: diferența de luminozitate ( se bazeaza pe diferența de numar atomic și densitate între diferitele porțiuni ale probei care va duce la un comportament modelat de legea lui Beer, adica unele porțiuni vor permite o transmisie mai ridicată decât altele și vor apărea mai luminoase), contrast dat de difracție (prin difractia electronilor pe planele cristaline), pierdere de energie a electronilor (sau EELS – Electron Energy Loss Spectroscopy care dă o informație referitoare la compoziția chimica deoarece fasciculul transmis trece printr-un spetru de energii și astfel se pot observa tranzițiile inter-atomice care apar în urma interacțiilor electron-electron) și contrast de fază (informatia este extrasă din imaginea de interferență a fasciculului produsă de trecerea prin rețeaua cristalină a materialelor analizate.

Spre deosebire de TEM unde fasciculul de electroni emergent conține întreaga

imagine a specimenului analizat, în cazul SEM-ului, la un anumit moment de timp, fasciculul

emergent poate să conțină doar o informație locală (un 'pixel' ) din imagine. Pentru a putea

reproduce imaginea întreagă, este nevoie ca fasciculul de electroni sa baleieze pe întreaga

suprafață a specimenului.

Microscoapele electronice de baleaj (SEM) sunt alcătuite din:

– coloană: se creează un flux de electroni (tun);

– camera probei: fluxul de electroni interacționează cu proba;

– detectori: monitorizează o varietate de semnale rezultate de la interacția probă – flux de electroni;

– sistem de vizualizare: crează o imagine din semnalele captate.

Spre deosebire de lumina din microscopia optică, electronii din microscopia SEM nu dau o imagine reală, ci creează o imagine virtuală din semnalele emise de probă (electroni secundari, electroni retroîmrăștiați, emisii de raze X). Această imagine virtuală este influențată de: intensitatea și diametrul fasciculului de electroni, de energia fasciculului de electroni, de volumul de probă care interacționează cu fasciculul de electroni, de compoziția probei.

Electronii secundari sunt electroni din probă, emiși în urma interacției acesteia cu fasciculul primar de electroni. În general, au o energie joasă (în general mai mică de 50 eV), iar datorită acestei energii joase ei sunt emiși de o porțiune foarte apropiată de suprafața probei. Ca urmare, acești electroni oferă o bună rezoluție imaginii. Contrastul într-o imagine dată de electronii secundari este dat de topografia materialului. Interacții mai puternice au loc în zonele mai înalte, emițându-se astfel un număr mai mare de electroni secundari, ceea ce asigură o imagine mai luminoasă în vârfurile suprafeței probei. Acest lucru ușurează interpretarea unei imagini date de electronii secundari.

Dezavantajele microscopiei electronice de baleaj:

– nivelul de vid, toate tunurile de electroni fiind sensibile. Gazul din tun poate interacționa sau interfera cu fascicolul de electroni.

– probă – probele trebuie să fie “tolerante la vid” – nu trebuie să fie modificate – chimic sau structural, de vidul înalt. De asemenea, probele trebuie să fie “vacuum friendly” – nu trebuie să afecteze sau să altereze starea vidului sau a instrumentelor (detectoare sau tunul de electroni). Este foarte important ca probele sa fie conductoare (din punct de vedere electric). Probele izolatoare necesită un proces de acoperire cu un material conducător (de obicei carbon sau aur), pentru prevenirea ionizării suprafeței.

-costul ridicat al aparaturii, sensibilitatea ridicată la diverși factori externi

(campuri electromagnetice, vibratii) si faptul ca unele probe (de exemplu țesuturile vii)

trebuiesc preparare în prealabil sau au nevoie de conditii speciale in timpul examinarii la

microscop si, in unele cazuri, chiar nu pot studiate ecient cu ajutorul unui microscop cu

electroni.

Microscopul electronic de baleaj se dovedește a fi inutil dacă trebuie studiate probe ude, impurificate, uleioase, neconductoare, fără a modifica starea lor sau dacă se dorește analiza unor transformări dinamice cum ar fi măcinarea, topirea, răcirea, hidratarea sau determinările de rezistență mecanică.

Soluția stă în eliminarea vidului din camera probei. Primul pas în această direcție este separarea coloanei (tunului) de electroni (spațiu vidat) de camera probei în care se dorește un mediu nevidat. Al doilea pas, este introducerea unui al doilea detector de electroni secundari care să poată funcționa în mediul nevidat al probei, pe bază de gaz ionizat (acesta poate reduce și gradul de ionizare al probei la contactul cu fasciculul primar de electroni). Rezultatul se numește microscopul electroni de baleaj cu cameră nevidată (ESEM).

Interacția electronilor cu moleculele de gaz si necesitatea vidarii. Pentru buna

functionare a unui microscop cu electroni este nevoie de un vid de cel putin 10-4 Torri din

mai multe motive:

– drumul liber pe care trebuie să îl aibă electronii pentru a ajunge de la filament la probă

și de la proba la detector fară a fi deviați în urma ciocnirilor cu moleculele de gaz

– timpul de viată al unui filament ar fi extrem de scurt în prezența unei concentrații prea

mari de gaze reactive, cum ar oxigenul (situatie asemanatoare filamentelor becurilor)

– prezența unui gaz între electrozii de accelerare ar duce la descarcari electrice nedorite

Pentru a obține un vid sucient de înaintat sunt folosite diverse tipuri de pompe; cea mai

des întâlnită situație este înserierea unei pompe de vid jos cu una de vid înalt.

În cazul SEM-urilor, cele mai des întâlnite sunt pompele turbomoleculare deoarece prezintă o bună combinație între durata de viața ridicată și lipsa agentilor de poluare (cum ar uleiul în cazul pompelor cu difuzie).

.

Fig.4.29. Pompa turbomoleculară (http://sine.ni.com/cs/app/doc/p/id/cs-14907)

Fig.4.29. Turbomolecular pump

Deși în mod normal presiunea din interiorul microscopului este sucient de redusa pentru

ca interacțiile electronilor cu moleculele de gaz să fie complet ignorate (drumul liber mediu

fiind de ordinul zecilor de km), apare și situația în care specimenul analizat este neconductor, nu poate fi preparat special și este necesară introducerea unui gaz în interiorul camerei specimenului. Interacția electronilor cu gazele este asemanatoare celei cu solidele , singura diferenta fiind dată de densitatea diferită (de aproximativ un milion de ori mai mică în cazul gazelor).

Sursa de electroni.

Exista trei surse primare de electroni care sunt utilizate în cadrul microscopului cu electroni: cu emisie termionică (filament de tungsten, filament de hexaborură de lantanum (LaB6) sau hexaborura de ceriu (CeB6) ) , emisie în câmp (rece sau asistată termic) și emisie termionică asistată de camp ( bazata pe efectul Schottky). Tipul sursei folosite inuențează considerabil calitatea imaginilor obținute în principal din cauza fluxului de electroni pe care poate îl emit și din cauza intervalului energetic în care aceasta emite.

Elementele care se găsesc în majoritatea tunurilor de electroni sunt: filamentul, cilindrul

Wehnelt (folosit pe post de electrod de control) și anodul de accelerare (electrodul pozitiv).

Potentialul de accelerare folosit în cazul SEM-ului este de obicei de ordinul kV. Sursa de

electroni este de obicei montată pe un sistem mecanic de ajustare și este precedată de o serie

de lentile de centrare, toate având rolul alinierii fasciculului emis pe centrul axei coloanei.

Marimea cea mai importanta care caracterizeaza toate sursele de electroni este luminozitatea.

Emisia termionica. Filamentele de tungsten sunt cele mai populare surse de electroni,

chiar daca sunt folosite de peste 70 de ani, în principal din cauza costului redus. Diametrul

filamentului este în jur de 100 m și este îndoit într-o forma de V cu un diametru al ariei

vârfului de aproximativ 100m. Temperatura optimă de funcționare este între 2000-2700 grade kelvin.

Emisia de electroni are loc în urma încalzirii filamentului până când energia termică a

electronilor este suficientă să depașească lucrul de extractie al materialului.

În cazul filamentelor de LaB6 și CeB6 se folosește un cristal din aceste materiale care este

grefat pe un lament de tungsten. Principalul avantaj al acestor alemente este luminozitatea

crescută, suprafața de emisie redusă (fascicul mai îngust), temperatura de lucru mai scazută

și durata de viata mai ridicată decat în cazul filamentelor de tungsten. Dezavantajele constau

în costul mai ridicat (aproximativ de 10 ori mai mare) și necesitatea folosirii unui vid mai

înaintat din cauza efectelor de contaminare cu molecule de gaz care implică o instabilitate în

emisie în cazul în care filamentul nu este curățat la numite intervale de timp (curatarea se

face prin încalziri bruște la temperaturi mai mari decat cele de funcționare).

Emisia în camp. Emisia la rece rece se bazează pe efectul de tunelare al electronilor

cauzat de intensitatea foarte mare a câmpului aplicat și pe faptul că emisia nu este ifluențată

de temperatura vârfului. Cu toate că acest tip de surse au un curent de emisie scazut, din

cauza suprafaței mici prin care se face emisia (cațiva nm), au însa o luminozitate ridicată

din cauza deschiderii mici a fasciculului (câteva grade).

Acest tip de sursa de electroni are dezavantajul de a foarte sensibilă la adsorbția moleculelor de gaz pe suprafata sa și necesită o încalzire bruscă pentru cateva secunde dupa un număr de ore de utilizare. Problema este că în urma acestor încalziri bruste sunt smulși atomi din vârf și acesta se tocește scăzând astfel performanța dispozitivului.

Coloana microscopului.

Coloana microscopului este alcatuită din: sursa de electroni (descrisa anterior), sisteme de

ghidare a fasciculului (lentile condensoare, aperturi, bobine stigmatoare), bobine de baleiere

si lentila finală (obiectivul)

Fig.4.30. Componentele unui microscop electronic cu scanare – SEM (http://science.howstuffworks.com/scanning-electron-microscope2.htm)

Fig.4.30. The components of a scanning electron microscope – SEM

Sistemul de lentile . Rolul lentilelor folosite în microscopul cu electroni este de a

micșora diametrul fasciculului dat de către sursa de electroni până la diametrul spot-ului

care va ajunge la specimen. Acest proces poate fi văzut ca micșorarea imaginii varfului

filamentului și proiectarea imaginii micșorate pe suprafata investigată. Este nevoie să se

reducă dimensiunea diametrului fasciculului cât mai mult pentru a extrage informația dintr-un

volum cât mai mic. În cazul folosirii unui filament de tungsten, al cărui fascicul inițial

are 50m în diametru, este nevoie sa ii fie redusă marimea de 5000 de ori pentru a ajunge la

un spot de 10 nm.

Electronii pot focalizati în mod normal atât cu câmpuri magnetice cât și cu câmpuri

electrostatice, dar în cazul SEM-ului se folosesc doar lentile electromagnetice pentru că pot

fi construite cu aberații mai mici.

Lentilele electromagnetice sunt formate din o bobină toroidală încapsulată într-o carcasă de fier care are un orificiu în zona diametrului intern unde este concentrat câmpul magnetic.

Acestea se bazează pe devierea traiectoriei electronilor din cauza fortei Lorentz în câmpul

magnetic cu forma de clopot din interiorul lentilei.

Folosirea lentilelor obiectiv de putere mare are nu numai efectul de reducere a dimensiunii spotului dar și de îmbunatățire a curentului care ajunge pe specimen. De asemenea se poate ajusta dimensiunea spotului și prin modificarea puterii lentilei de condensare (deoarece lentila obiectiv va primi un fascicul mai mult sau mai puțin colimat) dar trebuie să se țină cont de

scăderea curentului – care poate chiar de un ordin de marime – care are loc simultan cu

micșorarea spotului atunci când se marește puterea lentilei condensoare.

Aperturile. De-a lungul coloanei SEM se folosesc mai multe aperturi (oricii)

cu valori tipice între 50-500 m care scad unghiul sub care electronii pot intra în lentile.

Prezența acestora are trei efecte esențiale: există o marime optima a oriciului care duce

la minimizarea aberațiilor; aperturile controlează unghiul de deschidere al fasciculului care

inuențează adancimea de câmp a imaginii; din cauză că aperturile blochează o parte din

fascicul, acestea determină și curentul care ajunge pe specimen.

Distanța de lucru. Distanța de lucru este distanța între obiectiv și specimen iar

aceasta influențează semnicativ calitatea imaginilor care obținute. Marind distanta de

lucru se obtine micșorarea mai slaba a spotului și implicit o degradare în calitatea imaginii,

în principal din cauză că marimea finală a spotului pe probă depinde invers proporțional de

distanța de lucru. Alt efect negativ este mărirea distanței care plimbă fasciculul pe specimen sub un anumit unghi; efectul este o scanare pe o suprafață mai mare la același unghi de deschidere, adică o marire mai slabă a imaginii.

O distantă de lucru crescută duce la accentuarea aberațiilor lentilelor și o amplicare

a zgomotului mecanic (vibrațiilor) sub care este supus microscopul. Există însă și un efect

pozitiv al utilizării unei distante de lucru mari: scade deschiderea fasciculului și acest lucru

duce la o îmbunătățire a adâncimii de câmp. În mod normal se utilizează o distanță de lucru cât

mai mică pentru a putea obține o rezoluție cât mai bună.

Prepararea probelor

În cazul în care se analizeaza anumite tipuri de materiale cum ar fi cele neconductoare

sau slab conductoare, țesuturi vii sau materialele organice, acestea trebuie să treacă prin

anumite procese de preparare pentru a se putea obține imagini de o calitate bună. În cazul

specimenelor biologice metoda de preparare cea mai des întâlnită este cea de fixare chimică,

adică stabilizarea structurii macromoleculare mobile a țesutului ca urmare a reacțiilor dintre

componeta proteică cu diverse aldehide sau lipide. O altă metodă este criofixarea care constă

în racirea foarte rapidă a specimenelor în azot sau heliu lichid astfel încât apa să înghete într-o

formă necristalină care să nu distrugă diversele microstructuri (de exemplu membranele

celulare). Această metodă poate fi cuplată cu deshidratarea în punct critic prin care se urmarește

înlocuirea conținutului de apă cu anumiți solvenți organici (etanol sau acetonă) care la

rândul lor pot înlocuiți cu anumite rășini stabilizatoare. O altă metodă folosită pentru

studierea materialelor organice (care sunt aproape transparente pentru electroni din cauza

densitații electronice mici) este tratarea cu metale grele ca uraniu, plumb sau tungsten care

împrăștie suficient electronii pentru a putea mări contrastul imaginilor. Metoda cea mai larg

folosita este însă acoperirea probei cu un strat subțire conductor depus prin evaporare în

vid sau sputtering pentru a împiedica acumularea de sarcină pe suprafața sau pur și simplu

pentru îmbunătățirea contrastului. Substanțele folosite pentru acoperire sunt de obicei aur,

platină, palladiu, tungsten sau grafit.

Marea majoritate a electronilor nu pătrund în probă pe un drum simplu ci suferă

numeroase procese de împraștiere. Aceste procese se pot grupa în doua mari categorii: elastice –

cand traiectoria electronului se modică dar energia acestuia râmane aproape nemodicată (din

cauza diferenței mari între masa electronului și cea a nucleelor atomice) și inelastice – când

traiectoria electronului poate suferi modicări neînsemnate dar o bună parte a energiei se

pierde.[94]

D. Microscopia de forță atomică (AFM)

M ICROSCOPUL DE FORȚĂ ATOMICĂ

Construit în 1938 de von Ardenne și produs comercial în 1965 de către Cambridge

Scientific Instruments, acest sistem a fost supus unor continue îmbunatațiri rezoluția

sa crescand de la 50 nm, în 1942 la aproximativ 0,7 nm, astăzi. Deasemenea, cu ajutorul SEM-ului modern putem obține informații despre compoziția probei studiate prin detecția razelor X, electronilor retroimpraștiați, catodoiluminiscenta și electroni Auger.

Construirea SPM-ului a fost precedată de inventarea STM-ului (Scanning Tunneling Microscopy) în 1981 la IBM Zurich Research Laboratory de catre Binning si Rohrer, aceștia primind și Premiul Nobel în Fizică în 1986 pentru contribuția adusă pentru dezvolatea științei. SPM este o familie de tehnici de masură ce implică scanarea unei suprafețe cu un vârf foarte ascuțit și monitorizarea interacției varfului cu suprafața pentru a crea o imagine de înaltă rezoluție a materialului studiat. Multe alte tehnici SPM au fost dezvoltate pentru a da informații despre forța de frecare, aderență, elasticitate, duritate, câmp electric, câmp magnetic, concentrația de purtători, distribuția de temperatură, rezistentă și conductivitate. Accesul la caracteristicile fizice ale suprafețelor este unul rapid.

Microscopul cu Forță Atomică (AFM) a devenit cea mai folosită tehnică a SPM-ului

ea servind doar pentru analiza topografică a suprafețelor. AFM-ul a fost inventat în 1986, fiind produs comercial pentru prima data in 1989 de catre Digital Instruments.

Cu ajutorul AFM-ului se pot obțin imagini tridimensionale ale suprafețelor (izolatoare sau conductoare) cu o rezoluție nano lateral și subangstrom – vertical.

Marele avantaj al AFM-ului este că poate opera în aer, vid și lichide la diferite temperaturi. Acest aparat este utilizat atât în cercetarea fundamentală cât și la scală mai mare, în industrie AFM-ul având un rol deosebit de important în dezvoltarea nanotehnologiei.

Desi SEM-ul și AFM-ul au rezoluții laterale similare, exista situații în care una din

aceste tehnici poate oferi o reprezentare mai detaliată a suprafeței probei. Această diferențiere este dată de felul în care cele două tehnici analizează modificarile verticale în topografia probei.

Scannerul AFM poate măsura înalțimi de până la 6 μm însă, pentru suprafețe cu

variații de înălțime mai mari decat 510 μm metoda de investigație cea mai potrivită

este SEM.

Senzorul este constituit dintr-un cantilever (pârghie) echipat cu un vârf ascuțit în plasmă ce interacționează cu suprafața. Un fascicul laser este reflectat de cantilever iar aspectul

morfologic al suprafeței este direct asociat cu schimbarea semnalului din fotodetector.

Acesta din urma este divizat în patru cadrane, fiecare indicând deflexia și torsiunea

cantileverului.

Rezoluția de scanare depinde în cea mai mare masură de dimensiunile vârfului. Procesele de microfabricare dezvoltate pentru microelectronică sunt folosite pentru producerea

acestor varfuri cu dimensiuni nanometrice. Senzorii sunt în general fabricați din siliciu sau

nitrură de siliciu. Sunt folosite diverse tipuri de cantilevare în funcție de modul de

operare AFM. Acestea pot fi acoperite cu filme subtiri conductive, magnetice,

reflective etc.

Există doi factori care limitează acestă metodă:

1. pozitia în care este aplicată greutatea este esențială.

2. eroarea de masura a maselor de wolfram.

Cu ajutorul AFM-ului pot fi scanate arii cumprinse între 1nm și 100 μm. În general

AFMul este echipat cu 2 tipuri de scanner, unul ce poate scana până la 5 μm și al

doilea ce poate scana până la 100 μm. Viteza de scanare poate fi setată din soft,

între 0.1 Hz până la 100 Hz. În alegerea vitezei de scanare trebuie știut că fiecare

sistem are un timp optim de răspuns. Numarul de puncte conținute de imaginea

obținută în urma scanării poate fi de asemenea setat din soft (128 x 128, 256 x 256,

512 x 512, sau 1024 x 1024).

Interacția vârfului cu suprafața

Deflexia cantileverului în urma scanării suprafeței este asociata fortei de interacție

dintre vârf și probă. Forța de interacție dintre varf și suprafață poate fi modelată

conform modelului LennardJones, ce descrie interacția dintre doi atomi neutri.

Ep =Er− A/r6

unde Ep este energia potențială, Er este potențialul forțelor de respingere (Er >0) si A/r6 este

distanța dintre nucleele atomilor cei mai apropiați ai moleculelor considerate. Acest

ultim parametru are o valoare semnificativă atunci când r este foarte mic. Când doi

atomi sunt puși foarte aproape unul de altul, aceștia vor induce un dipol unuia

celuilalt prin modificarea norului electronic al atomului vecin. Forța dintre dipoli este

numita van der Waals și este atractivă când potențialul are forma A/r6 .Când atomii

sunt foarte apropiați unul de altul, o alta forță intervine. Aceasta este o forță repulsivă

cu o rază de acțiune foarte mică. Potențialul fortei repulsive are forma: B/r12. Această

forță previne colapsarea varfului pe suprafața investigată.

Distanța de echilibru, r, între moleculele unite prin forța van der Waals (distanta de

echilibru între forțele de atracție și cele de respingere) este de ordinul 3-4 Å, deci

mai mare decât distanțele interatomice în legaturile covalente sau ionice. Energia de

legatură van der Waals este, pe de altă parte, mult mai mică decat în cazul

electrovalențelor, fiind de ordinul caldurii de vaporizare a substanței respective.

La o distanță mare de probă, forțele de interacție sunt foarte slabe și în consecință,

deflexia cantileverului este aproape nulă. Această situație corespunde liniei orizontale

din partea dreaptă a curbei. În vid, aer și câteodată în lichid, interacția noncontact

dintre vârf și probă este atractivă și duce la deflexia cantileverului. În timpul apropierii, vârful sare în starea de contact. Tranziția de la o stare la alta (datorată instabilității poziției deflexiei) este descrisa de linia aproape verticală din partea stanga jos a curbei. Dacă proba este în continuare ridicată, pentru un material rigid, forța de interacție va crește liniar cu înalțimea probei (portiunea stangasus a curbei).

În modul contact, pe langă forța repulsivă van der Waals există înca doua forțe: forțe

de capilaritate datorate stratului foarte subțire de apă prezent pe suprafața probei și forța exercitată de cantilever însuși. Atunci când stratul de apă înconjoară și vârful, forțele de capilaritate acționează atractiv cu o forță în jur de 10-8N ținând vârful în contact cu suprafața. Forța de capilaritate este proporțională cu distanța dintre vârf și suprafață. De aceea, atât timp cât vârful este în contact cu suprafața, datorită incompresibilității (distanța dintre varf și probă rămane constantă) forța de capilaritate se menține aceași. În timpul scanării, forța rezultantă ce acționează asupra suprafeței este suma forțelor de capilaritate și fortele exercitate de cantilever (laterale). Aceasta este compensată de forța repulsivă van der Waals (pentru modul contact). Forța totală exercitată asupra suprafeței variaza intre 10-8N pana la 10-710-6N (domeniul normal de operare) [94].

Capitolul V – Rezultate și discuții

5.1. Stresul oxidativ la nivel celular indus de contactul cu nano și micro materiale

5.1. Cellular oxidative stress induced by contact with the nano and micro materials

5.1.1. Stresul oxidativ provocat de contactul cu suprafete nano și micro structurate

5.1.1. Oxidative stress caused by contact with nanostructured surfaces

Nanotehnologia implică realizarea materialelor funcționale, dispozitivelor și sistemelor prin controlarea procesului de producție la scară nanometrică (1-100 nm). Aplicabilitatea nanotehnologiei pe suprafețe biologice este explicată prin abilitatea celulelor de a interacționa cu suprafețe structurate la nivel nanometric.

Studii efectuate pe suprafețe de tipul celor din această lucrare au arătat că substratul determină forma celulei cu repercursiuni puternice în funcționalitatea acesteia. Se știe că distribuția geometrică a punctelor de adeziune are un impact puternic asupra funcționalității celulei. S-a demonstrat ca dispunerea punctelor de adeziune pe un material poate modifica pregnant răspunsul celular, variind de la proliferare la apoptoză [121].

Efectul biologic este în principal mediat de integrine care se leagă prin secvența arginină-glicină-aspartat a peptidelor. Adeziunea celulară la marticea extracelulara (ECM) cauzează aglomerarea integrinelor în complexe de adeziune focală și activează cascada de semnalizare intracelulară. [90]

Un proces prin care componente ale membranei bazale modulează comportamentul celular este activarea integrinelor cum ar fi RDG (Arg-Gly-Asp = L-arginina-glicina-L acid aspartic) care realizează legaturi între membrană și suprafață [195]. Pe lângă medierea atașării celulare integrinele se comportă ca molecule semnalizatoare activând căi intracelulare importante în creșterea și supraviețuirea celulelor [56];[78];[82].

S-a observat că plasticitatea sau elasticitatea filmelor influențează fundamental comportamentul celular. Celulele pot percepe tensiunile din film și pot reacționa prin întărirea legăturilor din citoschelet. Tăria acestor legături depinde de rigiditatea filmului cât și de compoziția acestuia [55]. Fibroblastele puse pe o matrice de colagen dură produc mai mult tenascin (glicoproteină a matricei extracelulare) și colagen XII față de cele atașate pe o matrice mai moale [54]. Rigiditatea și deformabilitatea influențează de asemenea migrarea in vitro și morfologia mai multor tipuri de celule [45]. Sinteza sporită de ROS inhibă legarea neutrofilelor în endoteliu prin inhibarea funcționalității β2-integrinelor [257].

În lucrarea de față, se prezintă studiul interacției celulare cu două tipuri de suprafețe nanostructurate, prin determinarea integrității mitocondriale (evidențiată de testul MTS) – parametru cunoscut ca sensibil la dezechilibrele produse de stresul oxidativ.

Ambele tipuri de structuri studiate în această parte sunt produse prin prelucrare laser și sunt destinate aplicatiilor biologice:

filmele de pNIPAAm – poly(N-isopropylacrylamide), sunt produse prin M.A.P.L.E. (Matrix Assisted Pulsed Laser Evaporation), tehnică ce conferă controlul suprafeței la nivel de nanometri. Aplicațiile acestor filme sunt frecvente în domeniul biomedical, putându-se obține pelicule de celule ușor detașabile prin scăderea temperaturii, fiind foarte utile în regenerarea tisulară. Prin detașarea fără enzime celulele iși păstrează mult mai bine integritatea membranară putând forma mai rapid legături cu țesutul gazdă.

structurile de ormosil – realizate cu dimensiuni micrometrice (5µm înălțime cu 17µm lățime) dar cu un control al suprafeței de ordinul nanometrilor [177]. Aceste structuri au rol de scafold biocompatibil permițând celulelor să se dividă și reprezintă un suport dur pentru manipularea ușoară. Pentru că tehnica este foarte flexibilă se pot produce structuri complexe 2D și 3D [178].

S-a urmărit determinarea integrității mitocondriale prin testul MTS, aceasta fiind foarte sensibilă la dezechilibrele produse de stresul oxidativ așa cum am arătat în partea introductivă.

5.1.1. A Stresul oxidativ indus de filmele de pNIPAAm produse în diferite condiții

5.1.1. Oxidative stress induced by pNIPAAm films produced under different conditions

În domeniul bioingineriei se acordă un interes sporit pentru producerea de suprafețe care reacționează la diferiți stimuli (temperatură, pH, lumină, câmp magnetic, curent electric). Stimulii ce controlează aderența și manipularea celulelor sau bioabsorbția proteinelor sunt dați de chimia și morfologia suprafeței și stabilitatea în medii apoase. Chimia și morfologia suprafeței este dată de substanța folosită dar și de metoda de producere[238].

Printre materialele așa numite inteligente poli(N-izopropil acrilamida) (pNIPAAm) este un polimer care prezintă interes deosebit. PNIPAAm este un polimer termosensibil schimbandu-și proprietățile de aderență în funcție de temperatură. La valori deasupra temperaturii critice inferioare a polimerului (lower critical solution temperature – LCST) pNIPAAm devine mai hidrofob și interacționează mai intens cu proteinele pe când la temperaturi sub LCST expune grupări hidrofile care previn aderarea proteinelor. În cazul acestui material cumpărat de la Sigma, LCST este de 320C, după această temperatură începând modificările chimice ale suprafeței. Această schimbare de fază constituie principalul avantaj al pNIPAm astfel putandu-se recolta straturi de celule evitând unele substante chimice invazive precum tripsina care poate înlătura grupări functionale de pe suprafața celulei [172]. În acest fel detașarea celulelor se produce de la suprafața filmului și permite păstrarea structurilor și receptorilor de pe suprafața celulară, astfel se obțin filme de celule cu aderență intercelulară foarte bună și cu membrana intactă având posibilitatea de a reface rapid legăturile față de noul substrat. Aplicabilitățile sale variază, de la obținerea unei suspensii celulare, la filme de celule pentru diferite domenii de cercetare biomoleculare. [229];[176];[213] Această metodă de detașare înlocuiește cu succes razuitorul (scraper) de celule, aceasta fiind o metoda fizică foarte brutală de detașare a celulelor de pe substratul de creștere. De asemenea prin păstrarea caracteristicilor membranei se pot face marcări cu diferiti anticorpi specifici pentru vizualizare (microscopie sau citometrie de flux) sau separare (pe coloane magnetice sau F.A.C.S. – Fluorescence-activated cell sorting = sortare celulară în funcție de fluorescența) celulară.

Filmele de pNIPAAm au fost produse prin M.A.P.L.E. (Matrix Assisted Pulsed Laser Evaporation).

Astfel că la fluențe de 200 mJ/cm2 apar doar câteva excrescente de forma unui bob de grâu cu înalțimea de 20nm iar neregularitatea suprafeței măsurate pe o suprafața de 5 x 5µm este de 7nm . La fluențe mai mari (450-800 mJ/cm2) apar mai multe neregularități ajungând până la un aspect complet granular cu înălțimi de până la 600nm [238].

Fig.5.1. Film de pNIPAAm obținut prin M.A.P.L.E. cu fluența de 200 mJ/cm2. Grosime 100 nm, rugozitate : 10 nm.

Fig.5.1. pNIPAAm film obtained by M.A.P.L.E. fluence of 200 mJ/cm2. Thickness 100 nm,

roughness: 10 nm.

Fig.5.2. Film de pNIPAAm obținut prin M.A.P.L.E. cu fluența de 400 mJ/cm2. Grosime 100 nm, rugozitate : 33 nm.

Fig.5.2. pNIPAAm film obtained by M.A.P.L.E., fluence of 400 mJ/cm2. Thickness 100 nm,

roughness: 33 nm.

Fig.5.3. Film de pNIPAAm obținut prin M.A.P.L.E. cu fluența de 600 mJ/cm2 Grosime 100 nm, rugozitate : 65 nm.

Fig.5.3. pNIPAAm film obtained by M.A.P.L.E. fluence of 600 mJ/cm2. Thickness 100 nm,

roughness: 65 nm.

La producerea acestor filme s-a folosit o țintă de 1% polimer dizolvat în clorform.

Obiectivul studiului reprezintă caracterizarea filmelor de pNIPAAm, produse prin M.A.P.L.E.. S-a urmărit să se evidențieze stresul oxidativ produs de aceste filme asupra celulelor depuse pe ele prin verificarea integrității mitocondriale (testul MTS) și funcționalitatea polimerului în desprinderea celulară.

Înainte de folosirea filmelor în experimente cu celule acestea au fost sterilizate prin expunere 60 minute la o lampă cu UV apoi spalate de două ori cu HBSS fără ser.

Probele de testat au fost realizate la Institutul Național de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizica Laserilor, Plasmei și Radiației.

Evaluarea morfologiei celulare

Aceasta s-a realizat prin colorare cu acridin orange și observare prin microscopie de fluorescență.

Fig.5.4. Imagini de microscopie de fluorescență ale ale celulelor L929 pe filme de pNIPAAm realizate prin picurare (a) și MAPLE la 200 mJ/cm2 (b), 450 mJ/cm2(c),600 mJ/cm2(d), și 800 mJ/cm2(e).

Fig.5.4. Fluorescence images of acridine orange stained L929 cells onto pNIPAAm drop cast surface (a) and those obtained by MAPLE with 200 mJ/cm2 (b), 450 mJ/cm2(c),600 mJ/cm2(d), and 800 mJ/cm2(e).

Determinarea vitezei de detașare a celuleleor

Lamele de sticlă cu suprafețele au fost puse într-o placă cu 24 godeuri (TPP-Elvetia), însămânțate cu 20.000 celule L929 în 70 µL mediu, lăsate 30 minute în incubator să adere după care s-a adăugat 1,5 mL mediu și au fost lăsate la incubator 24 ore. După o zi de creștere probele au fost aduse la 200C (aceasta find sub LCST pentru acest polimer) și s-a măsurat viteza de detașare a celulelor de pe subtrat prin fotografiere și numararea celulelor din trei câmpuri microscopice. Pentru testele de detașare s-a folosit un microscop cu contrast de fază, inversat (Olympus CKX31).

0 min. 5 min.

10 min 20 min

Fig.5.5. Exemple ale desprinderii celulelor L929 de pe filmele de pNIPAAm la temperatura de 200C pentru un interval de 20 minute

Fig.5.5. Examples of L929 cell detachment from the pNIPAAm film at 200C for 20 minutes interval

Determinarea viabilității celulare prin metoda MTS

Suprafețele au fost puse într-o placă cu 24 godeuri și pe aceste suprafețe au fost însămânțate fibroblaste L929, 20µL din suspensia de două milioane de celule/mL, incubate o oră pentru aderare apoi godeul umplut cu mediu de creștere (MEM cu 10% FCS și 2mM glutamină) și incubate până la efectuarea testelor.

Pentru determinarea viabilitații celulare prin metoda MTS s-a folosit kitul “Cell Titer 96Aquous One Solution Cell Proliferation Assay” de la Promega. Acest kit este bazat pe reducerea mitocondrială a unei săruri de terazolium în formazan. Această reacție este realizată doar de celulele ale căror mitocondrii sunt funcționale, cele afectate de stresul oxidativ, la acest nivel, răspund slab sau deloc. După 48 de ore de incubare suprafețele acoperite cu celule au fost mutate în alte goudeuri și peste ele s-a adaugat 400 µL din solutia de MTS (20µL MTS la 100µL mediu de creștere cu 5% FCS). Plăcile au fost incubate pentru 3 ore la 370C, 5% CO2 apoi soluția a fost mutată într-o placă cu 96 godeuri și s-a înregistrat absorbanța, la 490nm, la un cititor de plăci TECAN – Sunrise Basic.

Rezultate și discuții

S-a măsurat viteza de detașare a celulelor de pe substrat prin numărarea celulelor rămase pe suprafață la diferite momente de timp după aducerea filmului la temperatura de 200C . În general celulele cultivate pe suprafețe mai netede se detașează aproximativ cu acceași viteza pe cand cele de pe suprafețe mai rugoase (fluențe laser mai mari) se detașează mai repede. Aceasta se poate explica prin faptul ca suprafețele de pNIPAAm devin hidrofile și expandate datorită higroscopicității la LCST. Hidratarea lanțurilor este posibilă prin legaturile de hidrogen formate între hidrogenul secundar din amină N-H și grupările carbonil C=O înconjurate de molecule de apă [ 1567-27, 1568-28]

Timp (minute)

Fig.5.6. Dinamica detașării celulare

Fig.5.6. Dynamics of cell detachment

Testul MTS realizat pe filme identice la aceeași perioadă de contact cu substratul arată rezultate similare.

Fig.5.7. Viabilitatea celulelor de pe filme de pNIPAAm.

Control – film de pNIPAAm realizat prin drop casting (solubilizare în acetonă, picurare pe suprafată apoi uscare).

200, 450, 600, 800 – filme făcute prin MAPLE la diferite fluențe (200-800 mJ/cm2).

Glass – proba martor, pe sticlă.

Fig.5.7. Cell viability on the pNIPAAm films

Control – pNIPAAm film made by drop casting (solubiliyed in acetone, dropped on glass surface and dried).

200, 450, 600, 800 – films made by MAPLE technique on various fluency (200-800 mJ / cm2).

Glass – blank on glass.

Concluzii

Corelația dintre fluențele de fabricare a filmelor și testul MTS se datorează morfologiei suprafeței filmului de pNIPAAm.

Prezențea solventului (cloroform) în filmele produse la fluențe mari, așa cum arată rezultatele de FTIR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy ) (neprezentate aici), de asemenea poate influența comportamentul celular [1562].

Filmele produse la energii mici (200, 450, 600 mJ/cm2) sunt cele mai potrivite pentru creștere și dezvoltare celulară.

5.1.1.B. Stresul oxidativ indus de structuri de ormosil produse prin fotopolimerizare cu doi fotoni

5.1.1. Oxidative stress induced by ormosil structure produced trough two-photon photopolymerization

Ormosilii sunt interesanți pentru o gamă largă de aplicații ca materiale pentru ghidari optice [1590], acoperiri cu posibilitate nelimitată de forme [1591], biosenzori [1592] și numeroase aplicații medicale [1593].

Pentru probele testate s-a plecat de la ideea de scafold pentru creșterea celulelor in vitro și implantarea lor împreună cu matricea biocompatibilă în țesutul lezat. S-a urmarit obținera unei suprafețe de ormosil și testarea biocompatibilității acesteia [1563].

a

b

c

Fig.5.8. Celule L929 plantate pe structuri de ormosil aderente pe sticlă (microscopie în contrast de fază)

a – o oră de la însămânțare, b – o zi de la însămânțare, c – două zile de la însămânțare

Fig.5.8. L929 cells seeded onto ormosil structure adherent to the glass (phase contrast microscopy)

a – one hour from seeding, b – one days after seeding, c – two days after seeding

Se observă în imagini celulele care au invadat spațiul dintre liniile de ormosil, orientându-se cu axul mare dea lungul liniilor paralele. Celulelor indică o aderare și dezvoltare normală, morfologia lor fiind identică cu a celor din cultură (fig.4.1. și 4.2.).

Apoi prin tehnica de fotopolimerizare cu doi fotoni s-a urmărit obținerea unor structuri regulate libere pe care să se poată crește celule și să poată fi implantate în eventuale organe lezate [1564].

a b

c

d

Fig.5.9. Celule L929 crescute pe grid polimeric cu 100μm distanță între linii.

Marcare cu faloidină conjugată cu floresceină, pentru citoschelet (a,c) și hoecst 33258 pentru nucleu (b,d). Două mariri diferite 10x (a,b) și 40x (c,d)

Fig.5.9. Fibroblast cells grown on a polymeric grid with 100 μm distance between lines.

Marked with fluorescein-conjugated Phalloidin for cytoskeleton (a, c) and hoecst 33258 for nuclei (b, d). Two different magnifications 10x (a,b) and 40x (c,d)

Pentru creșterea biocompatibilității acestor structuri s-a realizat funcționalizarea lor prin depunere, folosind tehnica MAPLE, de lizozim din ou de gaină (Aldrich) și fibrinogen din plasmă bovină (Sigma) separat sau în raport de 1:1. S-au folosit și structuri tratate cu plasmă printr-o descărcare de radiofrecvenăa (13,56 MHz) de 20W într-o configurație de planuri paralele. Proba a fost ținută pe electrodul de împământare la 6 cm de electrodul de radiofrecvență și la o presiune de 4,9 x 10-1 mbar într-un flux de Argon de 20 sccm (standard cubic centimeter per minute). Timpul de tratament cu plasmă a fost de 5 minute [1556].

Probele de testat au fost realizate la Institutul Național de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizica Laserilor, Plasmei și Radiației.

Teste biologice

A fost evaluată morfologia celulară prin numărarea clasificarea celulelor în funcție de formă la jumătate de oră după adăugare și patru ore după adăugare.

Tabel 5.1. Clasificarea celulelor în funcție de morfologie.

Table 5.1. Cell classification based on morphology.

Se observă că celulele prezintă un disconfort (produc mai greu prelungiri în prima jumătate de oră și ajung mai greu la forma poligonală caracteristică) pe suprafețele cu coloane mai apropiate.

Viabilitatea și proliferarea celulară au fost caracterizate prin reducerea mitocondrială a sărurilor de tetrazoliu în formazan (testul MTS).

Lamelele de sticlă cu structurile aferente au fost sterilizate UV apoi puse într-o placă cu 24 godeuri (TPP – Elvetia) unde s-a adăugat suspensia de celule (L929) 10000 celule/50µL, lasate o oră să adere apoi crescute în MEM complet (10% FBS, l-glutamină) 24 ore. După mutarea lamelelor în alte godeuri s-a adăugat soluția de MTS și au fost incubate încă 3 ore (370C 5% CO2 și umiditate) apoi soluția a fost transferată într-o placă cu 96 godeuri și citită absorbția la 490nm la un cititor de plăci TECAN.

Fig.5.10. Viabilitatea celulara pe griduri de ormosil raportată la godeul de crestere (TPP)

Fig.5.10. Cell viability on ormosil grids reported to plastic well (TPP)

Pentru că metoda fotopolimerizării cu doi fotoni este foarte flexibilă s-au realizat suprafețe structurate de forma unui grid pentru creșterea celulelor și am măsurat influența dimensiunilor ochiurilor asupra comportamentuli celular. Exemplu de astfel de griduri sunt prezentate în figura 5.11.

Fig.5.11. Imagini de microscopie electronică (SEM) ale gridurilor destinate creșterii celulare.

Fig.5.11. Electron microscopy images (SEM) of grids for cell growth.

Aceste griduri au fost realizate pe un suport de sticlă apoi detașate, sterilizate, însămânțate cu celule și apoi s-a facut evaluarea anumitor parametrii biologici (viabilitate, densitate celulară și senescență)[1564].

Fig.5.12. Evoluția populației celulare pe gridurile libere (70µm) în mediu de creștere.

Fig. 5.12. Evolution of the cell population on free standing grids (70µm) cellular growth media.

În figura 5.12. este prezentată evoluția populației de celule pe un grid neatașat cu ochiuri de 70µm. Gridul a fost inițial plasat între două lame de sticlă cu un orificiu comun pe unde s-a pipetat o suspensie de celule (L929). Din cauza tensiunii superficiale a mediului de cultură acest orificiu a rămas plin cu mediu pe perioada incubării pentru atașare (45 minute). După incubare filmul a fost desfăcut, pus într-o placă Petri și acoperit cu mediu de cultură. S-au achiziționat imagini la diferite intervale de timp, pe aceeași zonă luând ca reper un defect produs de manipularea filmului.

Fig.5.13. Viabilitatea celulară pe griduri raportată la gridul cu ochiurile de 50µm.

Fig.5.13. Cell viability on grids relative to 50μm mesh grid.

Apropoierea valorilor de cele ale gridului cu ochiurile de 50µm, la 48 ore și 4 zile, se poate datora și ajungerii populației de celule la confluență, caz în care inhibiția de proximitate le împiedică să se dividă.

Pentru mărirea biocompatibilității acestor suprafețe s-au aplicat diferite tratamente (acoperire cu lizozim și fibrinogen și tratament cu plasmă) [1556].

Fig.5.14. Viabilitatea celulară pe griduri de ormosil funcționalizate ( acoperite cu lizozim, fibrinogen și tratate cu plasmă)

Fig.5.14. Cell viability on functionalized ormosil grids (coated with lysozyme, fibrinogen and plasma treated)

Concluzii

Celulele răspund prin modificarea morfologiei și activității mitocondriale în cazul unor factori fizico-chimici (rugozitatea, energia de producere a filmului, chimia suprafeței) exprimați de substratul de cultivare.

Procesele de la suprafața dintre film și membrana celulară sunt transmise în celulă începand cu integrinele și ajungând până la stresul oxidativ din mitocondrie[1587];[1588];[1589].

Tratarea suprafețelor cu lizozim face suprafața mai agresivă pentru celule. Între tratamentul cu fibriongen și gridurile netratate nu se observă o diferență semnificativa. Tratamentul în plasmă îmbunătățește cu aproximativ 20% calitățile suprafetelor testate.

5.1.2. Stresul oxidativ indus de nanoparticule de ZnO

5.1.2. Oxidative stress induced by the ZnO nanoparticles

Scopul acestei părți a lucrării este investigarea in vitro a efectelor citotoxice și genotoxice ale nanoparticulelor de oxid de zinc (ZnO) pentru celule tumorale hepatice (HepG2), studiul efectului fotodinamic al nanoparticulelor de ZnO în combinație cu iradierea UV în vederea amplificării acțiunii lor citotoxice împotriva celulelor canceroase și optimizarea condițiilor experimentale în aplicarea testelor specifice care urmăresc evidențierea efectelor și mecanismelor legate de toxicitatea in vitro a nanoparticulelor de ZnO.

Nanoparticulele anorganice incluzând oxizii metalici prezintă proprietăți importante pentru medicină și pot fi folosite în imagistica celulară, biosenzori, administrarea de gene și medicamente și terapia cancerului [1601];[1602];[1603]. Nanoparticulele de oxid de zinc aparținând unui grup de oxizi metalici au căpătat o tot mai mare atenție în ultimii ani, pe masură ce a progresat domeniul nanotehnologiei. Numeroase studii au arătat că citotoxicitatea indusă de nanoparticulele de ZnO depinde de tipul de celule și de capacitatea de proliferare a acestora așa încât celulele tumorale care se divid mai repede sunt mai susceptibile [1604];[1605].

Observații ale unor experimente in vitro indică faptul că anumite nanoparticule din oxizi metalici pot distruge preferențial celulele tumorale. Mai mult, sunt studii care susțin că iradierea UV ar putea potența abilitatea nanoparticulelor de ZnO de a suprima proliferarea celulelor tumorale. Această proprietate poate oferi un mare potențial nanoparticulelor de ZnO în a fi utilizate în terapia fotodinamică a tumorilor. [1555]

Nanoparticulele de ZnO, cu un diametru mediu de 10 nm, au fost produse și caracterizate la Institutul pentru Microtehnologie Bucuresti. S-a determinat potențialul zeta (electrocinetic) pentru a verifica stabilitatea nanoparticulelor în mediile biologice, folosind un sistem DelsananoC Analyzer, de la Beckman Coulter, USA. Pentru analiză s-a folosit concentrația de 50 µg/mL de ZnO după care solutiile obținute au fost supuse la ultrasunete pentru 10 minute și apoi, analizate. Luând în considerare rezultatele obținute, se constată că suspensiile de ZnO în mediul de cultură DMEM folosite în prezentul experiment in vitro, au o stabilitate redusă, deci tind să formeze aglomerari de particule.

În studiu au fost folosite celule hepatice de tipul HepG2 (hepatoblastom) obținute de la ATCC (American Type Culture Collection). S-a lucrat pe pasaje celulare aflate în intervalul 15-30. S-au utilizat DMEM, cu 2 mM Glutamină și diferite concentrații de ser fetal bovin (FBS). În toate mediile de cultură folosite s-a adăugat streptomicină 100µg/ml și penicilină 100 U.I./ml. Mediile de cultură și suplimentele au fost produse de Biochrom GmbH.

Nanoparticulele ZnO au fost dispersate în mediile de cultură celulară și apoi folosite în tratamentul celulelor. Efectele induse de aceste nanoparticule asupra celulelor au fost explorate prin utilizarea, în paralel a unor metode variate: teste de viabilitate și proliferare celulară, determinarea inducerii apoptozei, evaluarea efectului genotoxic prin testul cometei și testul de formare de micronuclei.

Prepararea probelor pentru experimentele in vitro

ZnO. Pentru a pregăti soluțiile stoc, pudra de ZnO a fost suspendată în ser fiziologic 2 mg/ml. Înainte de diluție, solutiile stoc au fost dispersate în baie de apă cu ultrasunete timp de 30 minute, apoi fiind autoclavate 15 minute la 1210 C. Diferite concentrații de nanoparticule (0.5 – 200 µg/ml) au fost obținute prin diluții succesive în MEM, respectiv DMEM, suplimentate cu diferite concentratii FBS.

Iradierea UV. Probele conținând celule HepG2 supuse tratamentului UV au fost iradiate direct în placă. S-a folosit o lampa UV tip LF 206 MS produsă de UVITECH (Cambrige – United Kingdom) cu filtru de 254 nm. Măsurarea dozelor s-a făcut cu radiometru (PMA 2100) produs de firma Solar Light care a avut atașată o sondă pentru 254 nm (PMA 2122). Dozele folosite au fost de 12 și 18 mJ/cm2 prin expunere de 2 sau 3 minute. Ajustarea dozei s-a făcut prin modificarea distantei dintre sursa UV și proba și a timpului de expunere.

Teste in vitro de caracterizare a răspunsului biologic

Determinarea viabilității celulare (MTS)

Diferite celularități au fost folosite pentru însămânțare în plăci cu 96 godeuri (100 microlitri mediu de cultură/godeu) 10000 – 40000 celule HepG2 per godeu. Celulele au fost incubate apoi 24 de ore (37ºC, 5%CO2), înainte de a fi expuse nanoparticulelor pe perioade de 24 sau 48 de ore. După incubarea acestora timp de 24 de ore, mediul de cultură a fost extras și înlocuit cu 100 µl de soluție reprezentând diferite concentrații de nanoparticule ZnO (am folosit trei replici pentru fiecare concentrație). Drept control s-au folosit celule incubate cu mediul de cultură, fără nanoparticule. Pentru a corecta absorbția la 490 nm datorată interacției MTS cu nanoparticulele, pentru fiecare condiție s-a folosit un al patrulea godeu fără celule.

Determinarea viabilității celulare s-a făcut prin utilizarea kitului “Cell Titer 96Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay” (Promega). Măsurarea absorbției la 490 nm s-a facut cu un cititor de plăci Tecan. S-au calculat medii ale absorbțiilor măsurate pe replicile culturilor aflate în aceleași condiții de tratament.

Determinarea genotoxicitatii prin măsurarea nivelului de micronuclei. Aproximativ 120000 celule HepG2 per godeu au fost însămânțate în plăci de cultură cu 12 de godeuri, într-un ml mediu de cultură. Celulele au fost incubate 20 de ore (37ºC, 5%CO2), apoi mediul de cultură a fost extras și înlocuit cu 1 mL de soluție conținând diferite concentrații de nanoparticule (trei replici pentru fiecare concentrație) timp de 24, respectiv 48 de ore. Drept control s-au folosit celule incubate doar în mediu de cultură, fără nanoparticule. După această incubare, blocarea citokinezei s-a facut prin adăugarea citochalasinei B (6 μg/mL), fiind apoi reincubate timp de 48 de ore. După expirarea timpului de incubare mediul de cultură a fost îndepărtat iar celulele au fost fixate cu o soluție de acid acetic și metanol, timp de 15 minute, spălate cu tampon fosfat salin și colorate cu acridine orange 10µg/mL în tampon fosfat salin. Nivelul de MN a fost exprimat prin parametrul Y definit ca numarul de micronuclei găsiți în 1000 celule binucleate din fiecare probă.

Măsurarea gradului de apoptoză indus de incubarea celulelor cu nanoparticule.

120000 celule HepG2 per godeu au fost însămânțate în plăci de cultură cu 12 godeuri, într-un mL mediu de cultură. Celulele au fost incubate 24 de ore (37ºC, 5%CO2), după care mediul de cultură a fost extras și înlocuit cu 1mL de mediu conținând diferite concentrații de nanoparticule și au fost incubate timp de 24 sau 48 de ore. Drept control s-a folosit celule incubate doar în mediu de cultură, fără nanoparticule. După terminarea timpului de incubare, pentru a observa inducerea apoptozei în celule s-a folosit o metodă de colorare dublă cu acridin orange și ethidium homodimer-1(EthD-1) aplicată atât celulelor desprinse cu trispsină/EDTA 0.25% dar și a celor desprinse în mediu pe parcursul tratamentului. Morfologia celulară a nucleelor a fost apoi analizată cu ajutorul unui microscop cu epifluorescență Olympus BX 51, folosind filtre corespunzătoare care să permită observarea simultană a emisiilor ambilor fluorofori.

Testul cometei alcaline pentru evaluarea alterarii ADN

Metoda standard a Cometei Alcaline – cu 2 straturi de agaroză utilizată în acest studiu este în esență cea elaborată de Singh și descrisă la capitolul metode.

Viabilitate/proliferare celulară (testul MTS) la tratamentul cu nanoparticule de ZnO

Testarea viabilității celulelor HepG2 în urma tratamentului cu nanoparticule ZnO, s-a făcut în diferite condiții experimentale. S-a urmărit astfel determinarea parametrilor care ar putea influența rezultatele experimentale în interpretarea acțiunii citotoxice a nanoparticulelor.

La nivel celular Nanoparticulele de ZnO au indus modificări morfologice și inhibarea viabilității, având o relație doză-efect de tip logaritmic (fig. 5.15. și 5.16.).

În ceea ce privește condițiile care ar putea influența rezultatele experimentale, un prim aspect ar fi concentrația de ser fetal cu care se suplimentează mediul de cultură. Așa cum se observă în fig. 5.16., testul MTS arată că o concentrație mai mare de ser, prin proteinele pe care acesta le conține, poate oferi protecție în calea stresului oxidativ indus de nanoparticule. S-a demonstrat și în alte studii de toxicitate că proteinele din mediul de cultură tind să “îmbrace” suprafața nanoparticulelor, reducandu-le astfel reactivitatea [1606].

Fig.5.15. Influența densității celulare și a timpului de incubare cu nanoparticule de ZnO (5% FCS)asupra viabilității celulelor HepG2 măsurată prin testul MTS. Incubare 24 ore cu nanoparticule (primul grafic) și incubare 48 ore cu nanoparticule (al doilea grafic).

Fig.5.15. The influence of cell density and time of incubation with ZnO nanoparticles (5% FCS) on the viability of the HepG2 cells measured by MTS assay. 24 hours incubation with nanoparticles (first graph) and 48 h incubation with nanoparticles (second graph).

Fig.5.16. Efectul concentrației de ser fetal în mediul de cultură la incubarea celulelor HepG2 (48 de ore) cu nanoparticule de ZnO, asupra viabilității celulare evaluată prin testul MTS.

Fig.5.16. The effect of fetal calf serum concentration, evaluated by MTS assay, on HepG2 cells incubated (48 hours) with the ZnO nanoparticles.

Se observă că viabilitatea celulară este influențată de concentrațiile mari de ser fetal utilizat în mediul de cultură. Drept urmare, în experimentele de toxicitate pe celule HepG2 se va folosi un mediu de cultură suplimentat cu 5% FCS, știindu-se din literatură că această proporție încă oferă condiții optime de creștere a celulelor [1554].

Plecând de la ideea că nanoparticulele de ZnO au activitate fotocatalitică, putând astfel participa în reacțiile redox celulare, în acest studiu s-au făcut câteva experimente care includ o serie de condiții de iradiere UV a celulelor tumorale HepG2, în paralel cu tratamentul cu nanoparticule de ZnO [1607]. Acestea au vizat stabilirea condițiilor optime de aplicare a protocoalelor metodelor utilizate în scopul evidențierii mecanismelor de acțiune citotoxică.

Fig.5.17. Efectul combinat al nanoparticulelor de ZnO și al radiației UV asupra viabilității celulelor HepG2 pentru diferite condiții experimentale: A. 40000 celule și B. 20000 celule. Toate datele reprezintă valori raportate la martorul neiradiat.

Fig.5.17. The combined effect of ZnO and UV radiation on the viability of HepG2 cells to different experimental conditions: A. 40000 cells and B. 20000 cells. All data are reported to non-irradiated control.

Astfel, iradierea UVB (254 nm) cu două fluxuri diferite efectuată la momente diferite de timp pe parcursul acțiunii nanoparticulelor ZnO, induce o scădere a viabilității celulelor HepG2 (fig. 5.17.).

Celularitatea este un alt parametru care poate influența evoluția viabilității celulare în urma acestor tratamente. Ea poate fi un factor de protecție împotriva acțiunii citotoxice atât a nanoparticulelor (fig.5.15.) cât și a radiației UV (figura 5.17.) [1555].

Luând în considerare varierea ușoară a unor condiții la fiecare experiment din seria celor efectuate în acest studiu, scăderea viabilității nu pare a fi datorată efectului de potențare prin iradiere UV a acțiunii citotoxice a nanoparticulelor ZnO. Momentul iradierii cu UV de-a lungul timpului de incubare cu ZnO este esențial în evolutia curbei de viabilitate celulara (fig. 5.17.).

Se poate concluziona că, în testele următoare fotoactivarea ar trebui urmarită la concentrații de nanoparticule de zinc și tip de iradiere UV (doze de iradiere, timp de iradiere ca durată efectivă de expunere a celulelor la UV și momentul de timp la care se face iradierea după tratamentul prealabil cu ZnO) care nu induc ele însele o scădere semnificativă a viabilității celulare.

Măsurarea gradului de apoptoză indus de incubarea celulelor cu nanoparticule ZnO

Apoptoza a fost determinată prin analiza morfologică a nucleelor celulelor HepG2 în urma aplicării diferitelor tratamente cu nanoparticule ZnO sau combinat, ZnO și iradiere UV (fig. 5.18. și 5.19.). Condițiile experimentale sunt similare cu cele stabilite în experimentele de viabilitate și în acord cu metodele prezentate. Rezultatele sunt reprezentate ca procent de celule viabile din totalul de celule evidențiate (viabile, apoptotice timpurii și apoptotice târzii).

Fig.5.18. Influența timpului de incubare cu nanoparticule ZnO a celulelor HepG2 și a concentrației de ser fetal cu care se suplimentează mediul de cultură, asupra gradului de inducere a apoptozei.

Fig.5.18. The influence of incubation time with ZnO nanoparticles and the concentration of fetal calf serum from the culture medium, on the degree of induction of apoptosis to HepG2 cells.

Fig.5.19. Apoptoza morfologică indusă la celulele HepG2, atunci cand celulele sunt iradiate UV imediat după aplicarea tratamentului cu ZnO.

Fig.5.19. Morphological apoptosis induced to HepG2 when cells are irradiated with UV immediately after ZnO treatment.

Rezultatele sunt influențate de timpii de acțiune ai nanoparticulelor ZnO pe de o parte și momentul de timp la care se observă apariția apoptozei după iradiere. De asemenea, procentul de ser fetal în mediul de cultură este și pe această cale evidențiat ca având rol protector împotriva efectului toxic indus de nanoparticule.

Nici în cazul mecanismului de inducere a apoptozei morfologice, la 24 și 48 de ore de incubare cu ZnO nu se observă o fotoactivare în acțiunea citotoxică indusă de aplicarea radiației UV.

Evaluarea genotoxicității induse de nanoparticulele de ZnO

Genotoxicitatea indusă de nanoparticulele ZnO asupra celulelor HepG2 a fost testată prin metodele cometei alcaline și formarea de micronuclei.

În figurile 5.20. și 5.21. sunt prezentate rezultatele obținute prin metoda formării de micronuclei. După cum se observă în figura 5.20. nu este o creștere semnificativă a numarului de micronuclei în domeniul de doze 0 – 10 µg/mL ceeace ilustrează faptul că nanoparticulele ZnO nu induc o alterare semnificativă a ADN-ului, neexistând o dependență a numarului de micronuclei cu concentrația.

Fig.5.20. Determinarea genotoxicității ZnO asupra celulelor HepG2 prin măsurarea nivelului de micronuclei.

Fig.5.20. Determination of ZnO genotoxicity on HepG2 cells by measuring the level of micronuclei.

Tratamentul cu UV aplicat celulelor tumorale HepG2 induce însă creșterea semnificativă a numarului de micronuclei (Fig. 5.21.) la control, neevidențiind însă potențarea efectului genotoxic al ZnO, la nici una dintre concentrațiile testate.

Fig.5.21. Determinarea genotoxicității ZnO asupra celulelor Hep G2 prin măsurarea nivelului de micronuclei: efectul combinat al ZnO și UV.

Fig.5.21. Determination of ZnO genotoxicity on Hep G2 cells by measuring the level of micronuclei: the combined effect of ZnO and UV.

În concluzie, pentru domeniul de concentrații studiat nu se observă, în cazul celulelor tumorale HepG2, o acțiune genotoxică a nanoparticulelor ZnO prin inducerea formării de micronuclei.

În cazul testului cometei (Fig. 5.22.) rezultatele indică un efect de inducere a deteriorării ADN-ului într-o manieră dependentă atât de concentrația nanoparticulelor de ZnO cât și de timpul de incubare în prezența acestora. Diferențe semnificative apar la 48 de ore de expunere.

Fig.5.22. Efectul duratei de expunere a culturilor HepG2 (cu 5% FCS) la nanoparticule de ZnO asupra parametrilor cometei – intensitatea cozii

Fig.5.22.The effect of exposure duration on HepG2 (5% FCS) to ZnO nanoparticles on comet assay parameters – tail intensity

Fig.5.23. Efectul combinatiei tratamentului UV cu ZnO

Fig.5.23. Effect of combined treatment ZnO with UV

Fig.5.24. Efectul tratamentului de 24 ore cu ZnO, la o ora după aplicarea UV (a) și de 48 ore cu ZnO la 24 de ore după aplicare UV (b).

Fig.5.24. The effect of treatment for 24 hours with ZnO, one hour after application of the UV (a) and 48 hours of ZnO at 24 hours after application of UV (b).

În cazul iradierii UV (0.1 mJ/cm2 ) a celulelor HepG2, evoluția în timp a parametrilor cometei arată o descreștere graduală a acestora (Fig. 5.24.), acest fenomen reprezentând cel mai probabil o reparare a ADN-ului.

Tratamentul combinat cu ZnO și UV aplicat la diferite momente de timp (Fig. 5.23.) asupra celulelor HepG2, induce o creștere a parametrilor cometei.

Spre deosebire de tratamentul cu ZnO de 24 de ore, la 48 de ore se observă o creștere ușoară a intesității cozii cu concentrația ZnO, atât la probele iradiate cât și la cele neiradiate.

CONCLUZII

Investigarea in vitro a efectelor citotoxice și genotoxice ale nanoparticulelor de ZnO pentru celule tumorale hepatice (HepG2), prin metodele indicate în acest studiu, arată că există mai mulți parametrii care pot influența acțiunea toxică a nanoparticulelor.

Testele de viabilitate, proliferare, apoptoză și cometă alcalină indică o creștere a efectului citotoxic/genotoxic odată cu creșterea concentrației masice de nanoparticule [1608]. Acest efect nu este observat însă în inducția de micronuclei, valorile acestora rămânând în limita controlului.

Valorile mici ale micronucleilor pot fi explicate prin concentrațiile mici folosite (la concentrații mai mari celulele nu mai aveau un ritm normal de diviziune) dar la care testul formării de micronuclei trebuia să evidențieze modificări fiind un test foarte sensibil și prin faptul că ADN-ul nu suferă leziuni permanente la aceste concntrații [1686].

Densitatea celulară și suplimentarea mediului de cultură cu ser fetal influențează gradul de inducere a unor markeri ai toxicitatii in vitro care apar în timpul proceselor enumerate mai sus [1609].

În domeniul de doze studiat, atât pentru nanoparticulele de ZnO cât și pentru iradierea UV, nu s-a evidențiat o potențare a toxicitatii oxidului de zinc, prin fotoactivarea acestuia, atunci când culturile celulare HepG2 sunt tratate simultan cu cei doi factori.

Se poate spune că, în condițiile experimentale date, celulele tumorale HepG2 prezintă o rezistență crescută la acțiunea citotoxică a nanoparticulelor de ZnO comparativ cu L929.

5.2. Stresul oxidativ în glicozilarea patologică

5.2. Oxidative stress in pathological glycosylation

5.2.1. Efectul dublu al Metilglioxalului asupra neuronilor

5.2.1. Dual effect of methylglyoxal on neurons

Metilglioxalul este un compus aldehidic, α,β-dicarbonil format în principal în timpul gliocolizei [1623,1624]. Concentrațiile plasmatice de metilglioxal sunt foarte ridicate la pacienții cu diabet ceeace subliniază semnificația clinică și patologică a acestui metabolit [1625]. Excesul de metilglioxal și alte aldehide reactive ca glioxalul și 3-deoxiglucozona provoacă excesul de carbonil și stres oxidativ în patologii ca diabetul [1626], hipertensiune, ateroscleroză și boli neurodegenerative [1622]. Metilglioxalul este un precursor al produșilor finali de glicoliză avansata (AGEs) și este implicat în procesul de îmbătrânire [1622].

Pentru testul MTS neuronii obținuți din ganglionii rădăcinilor dorsale ale nervilor spinali au fost însămânțați, aproximativ 5000 neuroni pe godeu, într-o placă cu 96 godeuri (TPP Elvetia) pretratată cu polilizină (Sigma) și menținuți 24 ore la incubator în mdediu de creștere conținând DMEM F-12 cu 10% ser fetal bovin. După acest timp celulele au fost tratate cu diferite concentrații de metilglioxal ( 0, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 750, 800 și 1000 µM) pentru alte 24 ore în același mediu de creștere. Fiecare godeu a fost spălat cu mediu de două ori pentru a înlătura resturile de metilglioxal, am adăugat 120 soluție de MTS în mediu (DMEM/F12) cu 5% ser și placa a fost lăsată la incubator 4 ore. După incubare s-a măsurat absorbanța la 490nm cu un cititor Tecan (Sunrise-Basic, Austria). Pentru fiecare concentrație de MG am folosit cinci repetări (godeuri).

Fig.5.25. Viabilitatea neuronală în prezența diferitelor concentrații de metilglioxal

Fig.5.25. Neuronal viability in the presence of various concentrations of methylglyoxal

Testul MTS evidențiază o viabilitate crescută (pana la 20%) a neuronilor tratați cu MG până la concentrația de 150 µM apoi o scădere proporțională cu cresterea concentrației.

Pentru 150 µM de metilgioxal rezultatele sunt comparabile cu cele obținute prin examinarea morfologiei microscopice care arată o creștere de până la 40% a densității prelungirilor neuronale și o creștere de 14% a numărului de celule gliale. Tendința este confirmată și prin imagistica rațiometrică de calciu unde sunt măsurați doar neuronii. Astfel că se observă creșterea excitabilității neuronale la concentrații mici și scăderea la concentrații mai mari de 150µm [1627].

În ciuda faptului că testul MTS este ușor de folosit în cazul acesta este dificil de interpretat rezultatul care poate proveni de la diferitele populații celulare din cultură [1628] de aceea testul a fost dublat de morfologie microscopică și imagistică rațiometrică de calciu.

În concluzie, pentru neuronii din rădacinile dorsale metilglioxalul are are o acțiune duală stimulând viabilitatea celulară la concentrații mici ( până la 150µM inclusiv) apoi inhiband-o pe măsura creșterii concentrației.

5.2.2. Evaluarea stresului oxidativ la șoareci diabetici tratați cu capsaicină

5.2.2. The evaluation of oxidative stress in diabetic mice treated with capsaicin

Determinarea concentrației de grupări carbonil în plasă este un indicator foarte important al stresului oxidativ prezent în tot organismul animal, creșterea valorilor glicemiei fiind strâns legată de oxidarea proteinelor [1617].

Fig.5.26. Concentrațiile de grupări carbonil în probele analizate

Fig.5.26. Concentrations of carbonyl groups in the analyzed samples

Nivelul concentrației grupărilor carbonil, ca masură a starii de oxidare a proteinelor din serul sanguin al animalelor analizate este reprezentat în Fig.5.25. Se observă că nu există o deosebire semnificativă între nivelul de oxidare a proteinei serice la șoarecii diabetici (dTg) și cei normali (Balb/c).

Deși nu se evidențiază modificări semnificative statistic se poate totuși observa o scădere importantă (aproximativ 20%) a concentrației proteinei oxidate la șoarecii normali tratați cu capsaicină în raport cu cei tratați cu vehicul și o ușoară creștere la diabeticii tratați cu capsaicină în raport cu cei tratați cu vehicul.

Rezultatele obținute sunt în acord cu cele publicate în literatură întrucât probează apariția stresului oxidativ la șoarecii dublu trasgenici și confirmă unele observații privind efectul capsaicinei asupra stresului oxidativ [1611, 1613].

Fig.5.27. Capacitatea antioxidantă totală în probele analizate

Fig.5.27. The total antioxidant capacity of the analyzed samples

În figura 5.27 sunt reprezentate rezultatele obținute în urma măsurării capacității antioxidante totale a serului recoltat de la șoarecii analizati.

Se constată, că la șoarecii dublu-transgenici (diabetici – diabet indus prin transformare genetică) apare o scădere semnificativă (p<0.05), cu aproximativ 50%, a capacității antioxidante totale. În schimb tratamentul cu capsaicină duce la o ușoară creștere a capacității antioxidante la șoarecii normali ceea ce se corelează cu scăderea nivelului de proteină oxidată la acești șoareci. În schimb, la șoarecii diabetici apare o scădere ușoară, dar seminificativă (p<0.05), a capacității antioxidante în cazul tratamentului cu capsaicină față de tratamentul cu vehicul. Și acest rezultat se corelează cu modificarea nivelului de proteină oxidată observată la acest lot de șoareci.

Rezultatele prezentate conduc la constatarea prezenței stresului oxidativ la șoarecii diabetici analizați. Existența stresului oxidativ este evidențiată mai ales prin scăderea capacității antioxidante în aceste probe (modificările observate în cazul masurării nivelului proteinei oxidate nu sunt statistic semnificative).

Experimente realizate pe alte modele de diabet indus au condus la rezultate similare. Astfel s-a constatat că nivelul stresului oxidativ poate fi modulat de conținutul în glucoză al dietei la șoareci [1618]. Pe de altă parte diabetul indus prin injectare de streptozotocină a produs o creștere a speciilor reactive de acid tiobarbituric (TBARS) și o scădere a capacității antioxidante totale în plasma sanguină la șoareci [1619]. Mai mult, unul dintre modelele de diabet indus la șoarece propuse în literatură se bazează pe injectarea cu aloxan, o specie chimică ce produce specii reactive de oxigen care mediază intoxicarea celulelor β-pacreatice sintetizatoare de insulină [1620]. Tratamentul cu capsaicină nu reduce, nivelul stresului oxidativ, dimpotrivă, produce o usoară creștere a acestuia, ceea ce este în concordanță cu rezulate raportate în experimente in vitro pe culturi neuronale de la șobolani diabetici. În prezența capsaicinei nivelul de ROS a crescut în neuronii din cultură [1621].

Concluzii

Prin studiile realizate s-au obținut rezultate care demostrează apariția stresului oxidativ la șoarecii diabetici în comparație cu șoarecii normali. De asemenea, s-a arătat că tratamentul cu capsaicină nu reduce stresul oxidativ, ci dimpotrivă conduce la o usoară creștere a acestuia [1613].

În corelație cu stresul oxidativ analiza efectuată asupra nivelului de expresie al receptorilor TRPV1 arată diferențele dintre șoarecii normali și cei diabetici și modul în care acestea sunt modificate de tratamentul cu capsaicină [1621].

5.3. Stresul oxidativ indus radiațiile ionizante

5.3. Oxidative stress induced by ionizing radiation

5.3.1. Stresul oxidativ produs de radioterapia cu Lu 177m

5.3.1. Oxidative stress produced by radiotherapy with Lu 177m

Determinarea stresului oxidativ în țesuturile vizate de radioterapia cu Lu 177m s-a realizat prin metoda cometei alcaline. Metoda are la bază migrarea electroforetică a ADN-ului și poate detecta ruperi mono sau bicatenare, situsuri labile în mediu alcalin, ruperi monocatenare asociate cu repararea incompletă iar în anumite condiții legaturi încrucișate (cross linking) ADN-ADN sau ADN-proteină [1653].

Scopul acestui experiment este de a evalua eficiența antitumorală a unei peptide marcată radioactiv și folosită în terapia țintită a cancerului. Este cunoscut că celulele care se divid cel mai repede sunt cele mai afectate de ruperi la nivelul ADN-ului. Pe lângă efectul direct se manifestă și răspunsul la lezarea ADN-ului (DDR –DNA damage response), un fenomen care implică modificări post-translaționale ale proteinelor ce activează căile de semnalizare intracelulară. DDR oprește replicarea celulară împiedicând transmiterea defectelor genetice la celulele fice. De asemenea are un efect în inițierea apoptozei atunci când repararea nu este eficientă.

Radioterapia țintită (targeted radiotherapy) este administrarea de substanțe cu tropism pentru anumite celule sau procese locale. Acestea sunt izotopi radioactivi (123 I – pentru tiroidă) sau sunt legate de un izotop radioactiv.

Fig.5.28. Parametrul intensitatea cozii – hepatocite de la șobolani tratați cu radiofarmaceutice conținând Lu 177m

Fig.5.28. Tail intensity parameter – hepatocytes from rats treated with radiopharmaceuticals containing 177m Lu

Martor – șobolani injectati cu PBS cu 0,5% (w/v) BSA

Fig.5.29. Parametrul intensitatea cozii – hepatom șobolani tratați cu radiofarmaceutice conținând Lu 177m

Fig.5.29. Tail intensity parameter -hepatom rats treated with radiopharmaceuticals containing 177m Lu

Fig.5.30. Parametrul momentul cozii – hepatocite de la șobolani tratați cu radiofarmaceutice conținând Lu 177m

Fig.5.30. Tail moment parameter – hepatocytes from rats treated with radiopharmaceuticals containing 177m Lu

Martor – sobolani injectati cu PBS cu 0,5% (w/v) BSA

Fig.5.31. Parametrul momentul cozii – hepatom de la șobolani tratați cu radiofarmaceutice conținând Lu 177

Fig.5.31. Tail moment parameter – hepatoma from rats treated with radiopharmaceuticals containing 177m Lu

Fig.5.32. Parametrul lungimea cozii – hepatocite de la șobolani tratați cu radiofarmaceutice conținând Lu 177

Fig.5.32. Tail lenght parameter – hepatocytes from rats treated with radiopharmaceuticals containing 177 Lu

Martor – șobolani injectati cu PBS cu 0,5% (w/v) BSA

Fig.5.33. Parametrul lungimea cozii – hepatom șobolani tratați cu radiofarmaceutice conținând Lu 177m

Fig.5.33. Tail intensity parameter – hepatoma rats treated with radiopharmaceuticals containing 177m Lu

Concluzii

La 48 ore de la administrarea radiofarmaceuticului toți parametrii cometei sunt mai mari la tumoră decât la ficat asta arătând ruperi mai frecvente în ADN-ul celulelor tumorale decât în ficat.

La 14 zile de la administrarea radiofarmaceuticului doar pentru varianta Lu-SR+NT se observă diferență, în celelalte situații la 14 zile nu apar diferente semnificative între ruperile de ADN din ficat și tumoră.

Legările nespecifice pe alte organe (ficat) nu contribuie la formarea de ruperi ADN. Aceasta este ilustrată prin faptul că valorile obținute în cazul ficatului la șobolanii tratați nu diferă de control. Acest fenomen este reflectat prin toți parametrii cometei (lungimea cozii și intensitatea cozii). Se confirmă faptul că acest tip de celule tumorale au receptori pentru neurotensină supraexprimați și tratamentul nu este radiotoxic celule similare [1688].

Blocarea cu antagonsit nu diminuează efectele agonistului radioactiv. De aici rezultă că este mai mare afinitatea pentru agonist (neurotensină) decât pentru antagonist (SR48692).

Stresul oxidativ indus la nivelul celulelor de hepatom este superior celui indus asupra hepatocitelor demonstrând că terapia cu neurotensină marcată radioactiv este eficientă.

5.3.2 Stresul oxidativ produs de 2-dodecilciclobutanonă

5.3.2. Oxidative stress induced by 2 dodecyl cyclobutanone

2 dodecilciclobutanona este metabolizată în 2-dodecilciclobutanol de către fracțiunea S9 în prezența NADPH [1689]. Se cunoaște că alcoolii ciclici nu au acțiune genotoxică sau carcinogenetică. De asemenea in vivo 2dodecilciclobutanona este transformată în 2-dodecilciclobutanol și eliminat prin fecale. În conformitate cu rezultatele despre mutagenicitatea și genotoxicitatea 2-alchilciclobutanonelor și studiile pe termen lung în care la diferite specii de animale care au consumat alimente iradiate nu s-a constatat deteriorarea stării de sănătate [1676].

S-au realizat teste in vitro pe celule V79 cu 2dodecilciclobutanonă. Din cauza solubilității slabe în mediul de cultură ciclobutanona a fost dizolvată inițial în etanol apoi în mediul de cultură până la concentrații de 25 – 400 µM. A fost testat și solventul în aceleași volume ca cele folosite la testare (1µL/mL etanol 98%). Pentru a avea un etalon de comparare s-a folosit un control frecvent întâlnit în metoda cometei – apa oxigenată în concentrație de 50 și 250 µM.

Fig.5.33. Momentul cozii în cazul tratamentelor cu diferite concentrații de 2 dodecil ciclobutanonă asupra fibroblastelor de hamster V79.

Fig.5.33. Tail moment in treatement with diferent concentration of 2 dodecyl cyclobutanone on V79 hamster fibroblast.

Fig.5.34. Intensitatea cozii în cazul tratamentelor cu diferite concentrații de 2 dodecil ciclobutanonă asupra fibroblastelor de hamster V79.

Fig.5.34. Tail intensity in treatement with diferent concentration of 2 dodecyl cyclobutanone on V79 hamster fibroblast

Fig.5.35. Lungimea cozii în cazul tratamentelor cu diferite concentrații de 2 dodecil ciclobutanonă asupra fibroblastelor de hamster V79.

Fig.5.35.Tail lenght in treatement with diferent concentration of 2 dodecyl cyclobutanone on V79 hamster fibroblast

H2O2 – control pozitiv- celule tratate cu apă oxigenată (peroxid de hidrogen)

C – control – celule care nu au suferit niciun tratament

K- celule trtate cu solventul dodecilciclobutanonei (alcool etilic)

Același tratament a fost aplicat și fibroblastelor de șoarece L929 dar în cazul acesta s-a folosit și 800 µM dodecilciclobutanonă.

Fig.5.36. Momentul cozii în cazul tratamentelor cu diferite concentrații de 2 dodecil ciclobutanonă asupra fibroblastelor de șoarece L929.

Fig.5.36. Tail moment in treatement with diferent concentration of 2 dodecyl cyclobutanone on L929 mouse fibroblast.

Fig.5.37. Intensitatea cozii în cazul tratamentelor cu diferite concentrații de 2 dodecil ciclobutanonă asupra fibroblastelor de șoarece L929.

Fig.5.37. Tail intensity in treatement with diferent concentration of 2 dodecyl cyclobutanone on L929 mouse fibroblast.

Fig.5.38. Lungimea cozii în cazul tratamentelor cu diferite concentrații de 2 dodecil ciclobutanonă asupra fibroblastelor de șoarece L929.

Fig.5.38. Tail lenght in treatement with diferent concentration of 2 dodecyl cyclobutanone on L929 mouse fibroblast.

H2O2 – control pozitiv- celule tratate cu apă oxigenată (peroxid de hidrogen)

C – control – celule care nu au suferit niciun tratament

K- celule trtate cu solventul DCB (alcool etilic)

Tratamentul cu 2DCB a fost aplicat și limfocitelor umane separate din sânge de la trei donatori sănătoși.

Fig.5.39. Momentul cozii în cazul tratamentelor cu diferite concentrații de 2 dodecil ciclobutanonă asupra limfocitelor umane.

Fig.5.39. Tail moment in treatement with diferent concentration of 2 dodecyl cyclobutanone on human lymphocytes.

Fig.5.40. Intensitatea cozii în cazul tratamentelor cu diferite concentrații de 2 dodecil ciclobutanonă asupra limfocitelor umane.

Fig.5.40. Tail intensity in treatement with diferent concentration of 2 dodecyl cyclobutanone on human lymphocytes.

Fig5.41. Lungimea cozii în cazul tratamentelor cu diferite concentrații de 2 dodecil ciclobutanonă asupra limfocitelor umane.

Fig5.41. Tail lenght in treatement with diferent concentration of 2 dodecyl cyclobutanone on human lymphocytes.

H2O2 – control pozitiv- celule tratate cu apă oxigenată (peroxid de hidrogen)

C – control – celule care nu au suferit niciun tratament

k- celule trtate cu solventul DCB (alcool etilic)

Pe limfocitele umane s-a realizat și testul MTS.

Tabel 5.2. Viabilitatea celulară a limfocitelor tratate cu 2 dodecilciclobutanonă

Table 5.2. The viability of lymphocytes treated with 2 dodecyl cyclobutanone

Tabel 5.42. Viabilitatea limfocitelor umane tratate cu 2 dodecil ciclobutanonă .

Table 5.42. Viability of human lymphocytes treated with 2 dodecyl cyclobutanone.

Concluzii

2 dodecilciclobutanona, în concentrațiile studiate, determină creșterea stresului oxidativ manifestat prin ruperi ADN la toate categoriile de celule folosite.

Ruperile de ADN sunt proporționale cu concentrația de 2 dodecilciclobutanonă, la doze mari, celulele L929 având o sensibilitate mai mare.

Fragmentarea lantului de ADN este prezentă în special la concentrații mari (200 și 400 µM) chiar și la o expunere foarte scurtă a celulelor (1h) ceea ce sugerează faptul că acest efect produs de expunerea la 2-DCB este cauza scăderii de viabilitate la probele expuse pe durate mai lungi (24h).

CONCLUZII

Aici trebuie o frază introductivă care să facă legătura cu concluziile desprinse din experimente

I. Din experimentele derulate în cadrul studiului privind stresul oxidativ indus de suprafețele nanostructurate produse prin tehnica MAPLE, se pot desprinde următoarele concluzii:

Filmele de pNIPAAm sunt potrivite ca substrat pentru cultivarea fibroblastelor de șoarece –L929.

Stresul oxidativ indus celulelor este invers proporțional cu fluențele de fabricare, în sensul că, la fluente mai mici (200-600 mJ/cm2) celulele reacționează bine la substrat, pe când la 800 mJ/cm2 se poate constata scăderea activității mitocondriale la aproximativ 20%.

Rugozitatea filmelor este mai mare cu cât fluența de fabricare este mai mare.

Testele de detașare, după reducerea temperaturii, vin să confirme rezultatele testului MTS, respectiv dacă de pe filmele mai rugoase, celulele se desprind în 10-20 minute, de pe filmele cu rugozitate mai mică, celulele se desprind cu aproximativ 25% mai greu.

În toate cazurile, celulele nu și-au schimbat forma și au rămas viabile după detașare, acest aspect arătând că procedeul este reversibil și reproductibil.

II. Investigarea stresului oxidativ indus de microstructurile de silicați modificați organic a dus la următoarele concluzii:

Celulele însămânțate pe structurile de ormosil au o morfologie normală și sunt orientate cu axul lung paralel cu structurile.

Pentru gridurile de ormosil, stresul oxidativ este proporțional cu timpul de incubare al celulelor, astfel că, după 24 ore de incubare, apare o diferență de aproximativ 10% față de substratul de creștere, urmând ca, la 48 ore, diferența să se mărească la aproximativ 15%.

Scăderea mărimii ochiurilor gridurilor influențează și ea stresul oxidativ manifestat asupra celulelor, ajungând ca pe gridurile cu ochiurile de 70 și 100 µm viabilitatea celulară să se dubleze, respectiv tripleze. Diferența începe să se micșoreze la 24 ore și 4 zile de creștere, fapt explicabil prin oprirea diviziunii celulare la celulele ajunse la confluență unde se manifestă inhibiția de proximitate și lipsa punctelor de aderare la celulele de pe exteriorul formațiunii.

Acoperirile cu lizozim și fibrinogen nu reduc stresul oxidativ asupra celulelor; în schimb, tratamentul cu plasmă duce la o reducere a acestuia cu aproximativ 15%, aceasta putându-se explica prin faptul că grupările active de pe suprafața polimerului sunt inactivate de tratamentul cu plasmă.

III. În cazul nanoparticulelor de oxid de zinc:

Densitatea celulară și procentul de ser fetal bovin din mediul de creștere duc la o reducere a stresului oxidativ.

Timpul de incubare de 48 ore duce la o creștere a stresului oxidativ (testul MTS) față de incubarea timp de 24 ore, diferența nefiind însă foarte mare.

Rezultatele obținute prin metoda cometei alcaline și apoptoza morfologică vin să confirme rezultatele obținute prin testul MTS.

Testul de formare a micronucleilor nu confirmă rezultatele obținute prin celelalte metode, una dintre explicații putând fi că la aceste doze nanoparticulele de ZnO nu produc efecte reparabile.

Nu s-a observat efect de fotoactivare atunci când nanoparticulele au fost combinate cu radiații UV.

IV. În dismetaboliile glucidice studiate s-a ajuns la următoarele concluzii:

Metilglioxalul are efect dublu asupra neuronilor de șoarece: până la 150µg/mL scade stresul oxidativ iar peste acest nivel crește stresul oxidativ proporțional cu concentrația.

Corelarea rezultatelor este nevoie să se facă cu morfologia celulară analizată prin metoda microscopică și imagistica rațiometrică de calciu, cultura neuronală fiind o cultură celulară eterogenă (neuroni și celule gliale).

Proteina oxidată determinată prin măsurarea grupărilor carbonil și potențialul antioxidant sunt teste complementare de evaluare a stresului oxidativ în cazul administrării de capsaicină la șoarecii diabetici, creșterea unui parametru ducând la scăderea celuilalt și invers.

Șoarecii diabetici prezintă nivele mai crescute de proteină oxidată decât cei normali, iar nivelul potențialului antioxidant scade cu aproximativ 50%.

Administrarea de capsaicină la șoarecii diabetici duce la o scădere ușoară a potențialului antioxidant corelat și cu o creștere mică a cantității de proteină oxidată.

Tratamentul cu capsaicină duce la o ușoară creștere a stresului oxidativ in vivo, acesta fiind în concordanță cu rezultatele experimentelor in vitro pe culturi neuronale de șoareci diabetici.

V. În cazul radioterapiei țintite cu Lu 177 s-au desprins următoarele concluzii:

La 48 ore după administrarea compusului radioactiv, în toate cazurile ruperile de ADN consecutive stresului oxidativ la nivelul ADN-ului sunt mai numeroase în țesutul tumoral (hepatom) decât în țesutul sănătos (ficat).

Blocarea cu antagonist (SR48692) nu diminuează efectele agonistului (neurotensină).

La 14 zile de la administrare nu se înregistrează diferențe semnificative între cele două tipuri de țesut.

Neurotensina marcată cu Lu 177 este un radiofarmaceutic promițător în terapia antitumorală.

VI. În cazul investigațiilor privind stresul oxidativ produs de 2 dodecilciclobutanonă (compus de radiololiză rezultat în urma iradierii grăsimilor animale) s-a ajuns la următoarele concluzii:

2 dodecilciclobutanona, în concentrațiile studiate, determină creșterea stresului oxidativ manifestat prin ruperi ADN la toate categoriile de celule folosite.

Ruperile de ADN sunt proporționale cu concentrația de 2 dodecilciclobutanonă, la doze mari celulele L929 având o sensibilitate mai mare.

În condițiile în care cea mai mică doză folosită este de 25µM, adică aproximativ de 45 ori mai mare decât cantitatea care se obține în carnea iradiată, se consideră ca valorile dozelor folosite în aceste studii nu pot fi atinse prin ingestia cărnii sterilizate prin iradiere.

Toate materialele testate în anumite condiții induc stres oxidativ la nivel celular, pentru filme și structuri este dependent de morfologie, pentru celelalte de concentrație.

Bibliografie

Abbott C., Mackness M., Kumar S.,Boulton A.J., Durrington P.N., 1995-Serum Paraoxonase Activity, Concentration, and Phenotype Distribution in Diabetes Mellitus and Its Relationship to Serum Lipids and Lipoproteins, Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 15: 1812-1818 doi: 10.1161/01.ATV.15.11.1812

AFM: Beginner's Guide, 2014, available online at.http://www.afmhelp.com/index.php?option=com_content&view=article&id=51&Itemid=57

Aftin M. Ross, Zhongxiang Jiang, Martin Bastmeyer, Joerg Lahann, 2011, Physical Aspects of Cell Culture Substrates: Topography, Roughness, and Elasticity,, Vol. 8, pag. 336–355,"

Aguilar M., C. Elvira, A. Gallardo, B. Vázquez, and J.S. Román, 2007, Smart Polymers and Their Applications as Biomaterials, Topics in Tissue Engineering, Vol. 3, pag. 1-27

Alexsandro da Silva Haeser, Angela Sitta, Alethéa Gatto Barschak, Marion Deon, Amanda Thomas Barden, Graziela Oliveira Schmitt, Sharon Landgraff, Rosane Gomeze, Helena M.T. Barrose, Carmen Regla Vargasa, 2007, Oxidative stress parameters in diabetic rats submitted to forced swimming test: the clonazepam effect, Brain Research, nr. 1154 pag. 137–143

Ali R. MANI, Ananth S. PANNALA, Nelson N. ORIE, Richard OLLOSSON, David HARRY, Catherine A. RICE-EVANS, Kevin P. MOORE, 2003, Nitration of endogenous para-hydroxyphenylacetic acid and the metabolism of nitrotyrosine, Biochem. Journal,nr. 374, pag. 521–527

Alison Goldin, Joshua A. Beckman, Ann Marie Schmidt and Mark A. Creager, 2006, Advanced Glycation End Products Sparking the Development of Diabetic Vascular Injury, Circulation, nr, 114, pag. 597-605

Allen R., Balin A.,1989, Oxidative influence on development and differentiation: an overview of a free radical theory of development, Free Radic Biol Med. Nr. 6, pag. 631-661.

Allison W. Dobson, Yi Xu, Mark R. Kelley, Susan P. LeDoux, Glenn L. Wilson, 2000, Enhanced Mitochondrial DNA Repair and Cellular Survival after Oxidative Stress by Targeting the Human 8-Oxoguanine Glycosylase Repair Enzyme to Mitochondria, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 275, Nr. 48, pag. 37518–37523

Amruta Manke, Liying Wang, Yon Rojanasakul, 2013, Mechanisms of Nanoparticle-Induced Oxidative Stress and Toxicity, BioMed Research International, pag. 1-15

Andre Nel, Tian Xia, Lutz Madler, Ning Li, 2006, Toxic Potential of Materials at the Nanolevel, Science, nr. 311, pag. 622-627

Andrew D. Maynard, Paul A. Baron, Michael Foley, Anna A. Shvedova, Elena R. Kisin, Vincent Castranova, 2004, EXPOSURE TO CARBON NANOTUBE MATERIAL: AEROSOL RELEASE DURING THE HANDLING OF UNREFINED SINGLEWALLED CARBON NANOTUBE MATERIAL, Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A, nr.67, pag.87–107, DOI: 10.1080/15287390490253688

Anna A. Shvedova, Antonio Pietroiusti, Bengt Fadeel, Valerian E. Kagan, 2012, Mechanisms of carbon nanotube-induced toxicity: Focus on oxidative stress, Toxicology and Applied Pharmacology, nr.261, pag.121–133

Anne Bouloumié, Johann Bauersachs, Wolfgang Linz, Bernward A. Schölkens, Gabriele Wiemer, Ingrid Fleming, Rudi Busse, Hypertension. Nr. 30, pag. 934-941

Annette Salmeen and David Barford, 2005, Functions and Mechanisms of Redox Regulation of Cysteine-Based Phosphatases, Antioxidants & Redox Signaling, nr. 7, pag. 560-577

Annie Hiniker, James C.A. Bardwell, 2004, TRENDS in Biochemical Sciences, Vol.29, Nr.10, pag. 516-519

Antonio Ceriello, 2009, Hypothesis: the “metabolic memory”, the new challenge of diabetes,D iabetes Research and clinical Practice, nr. 86, pag. 2-6

"Arne Klungland, Matthias Hoss, Daniela Gunz, Angelos Constantinou, Stuart G. Clarkson, Paul W. Doetsch, Philip H. Bolton, Richard D. Wood, Tomas Lindahl, 1999, Base Excision Repair of Oxidative DNA Damage Activated by XPG Protein, Molecular Cell, Vol. 3, pag. 33–42"

"Arvind Panday, Malaya K Sahoo, Diana Osorio, Sanjay Batra, 2014, NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies, Cellular & Molecular Immunology, nr. 12, pag. 5–23

Aviram M., Rosenblat M., 2004, Paraoxonases 1, 2, and 3, oxidative stress, and macrophage foam cell formation during atherosclerosis development, Free Radic Biol Med., nr. 37, pag. 1304-1316

Ayman Samir Farid, Yoichiro Horii, 2012, Modulation of paraoxonases during infectious diseases and its potential impact on atherosclerosis, Lipids Health Dis. Nr.11, doi: 10.1186/1476-511X-11-92

Aysun Hacisevki, 2009, AN OVERVIEW OF ASCORBIC ACID BIOCHEMISTRY Ankara Ecz. Fak. Derg., nr. 38, pag. 233-255

Bagchi, S. Puri, 1998, Free radicals and antioxidants in health and disease, La Revue de Sante de la Mediterranee orientale, vol. 4, nr. 2, pag. 350-360

Bahorun T., MA Soobrattee, V Luximon-Ramma, OI Aruoma, 2006, Free Radicals and Antioxidants in Cardiovascular Health and Disease, Internet Journal of Medical Update, nr.1, pag. 25-41.

Baoling Wang , Lili Hu, 2006, Optical and surface properties of hybrid TiO2/ormosil planar waveguide prepared by the sol–gel process, Ceramics International, nr. 32, pag. 7–12

Barbara S. Berlett and Earl R. Stadtman, 1997, Protein Oxidation in Aging, Disease, and Oxidative Stress, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 272, Nr. 33, pag. 20313–20316"

Barbara S. Berlett and Earl R. Stadtman, 1999, Protein Oxidation in Aging, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 272, Nr. 33, pag. 20313–20316

"Barry Halliwell, 2001, Free Radicals and other reactive species in Disease, ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES, DOI: 10.1038/npg.els.0003913

Benoît D’Autréaux, Michel B. Toledano, 2007, ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis, Nat Rev Mol Cell Biol., Nr. 8, pag.813-24

Bergendi, L., Benes, L., Durackova, Z., Ferencik, M., 1999. Chemistry, physiology and pathology of free radicals. Life Sci., nr. 65, pag. 1865–1874

Beta Particles, 2013, available online at. http://www.epa.gov/radiation/understand/beta.html

Biomarkers of Oxidative Stress, available online at. http://pvac.vscht.cz/pvac/en/research-projects/biomarkers-oxidative-stress

Boon Chin Heng, Xinxin Zhao, Sijing Xiong, Kee Woei Ng, Freddy Yin-Chiang Boey, Joachim Say-Chye Loo, 2011, Cytotoxicity of zinc oxide (ZnO) nanoparticles is in Xuenced by cell density and culture format, Arch Toxicol, pag. 85, pag. 695–704"

Britton Chance, B. Schoener, Reiko Oshino, Fanny Itshak, Yuzo Nakase, 1978, Oxidation-Reduction Ratio Studies of Mitochondria in Freeze-trapped Samples, NADH AND FLAVOPROTEIN FLUORESCENCE SIGNALS, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 254, Nr. 11, pag. 4764-4771

Britton Chance, Helmut Sies, Alberto Boveris, 1979, Hydroperoxide Metabolism in Mammalian Organs, PHYSIOLOGICAL REVIEWS Vol. 59, Nr. 3, pag. 527-605

Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter., 2002, Garland Science, ISBN-10: 0-8153-4072-9

BRUCE N. AMES, RICHARD CATHCART, ELIZABETH SCHWIERS, PAUL HOCHSTEIN, 1981,Uric acid provides an antioxidant defense in humans against oxidant- and radical-caused aging and cancer: A hypothesis, Proc. NatL Acad. Sci. USA Vol. 78, Nr. 11, p. 6858-6862,"

Bryan C dickinson, Christopher J Chang, 2012, Chemistry and biology of reactive oxygen species in signaling, Nat Chem Biol. Nr. 7, pag. 504–511.

Bücker A., M.S. Carvalho, M.B. Conceiçao & J.A. Alves-Gomes, 2010, Micronucleus test and comet assay in erythrocytes of the Amazonian electric fish Apteronotus bonapartii exposed to benzene, J. Braz. Soc. Ecotoxicol., vol. 7, nr. 1, pag. 65-73

Buzea Cristina, Ivan I. Pacheco, Kevin Robbie, 2007, Nanomaterials and nanoparticles: Sources and toxicity, Biointerphases, Vol. 2, Nr. 4, pag. 18-71

Cadenas E. Biochemistry of Oxygen Toxicity, 1989, Annual Review of Biochemistry Vol. 58, pag. 79-110, DOI: 10.1146/annurev.bi.58.070189.000455

Cameron N., M.A.Cotter, A.M. Jack, M.D.Basso, T.C.Hohman, 1999, Protein kinase C effects on nerve function, perfusion, Na+,K+-ATPase activity and glutathione content in diabetic rats, Diabetologia, nr. 42, pag. 1120-1130

Carey J. Ng, David J. Wadleigh, Aditya Gangopadhyay, Susan Hama, Victor R. Grijalva, Mohamad Navab, Alan M., 2001, Paraoxonase-2 Is a Ubiquitously Expressed, Protein with Antioxidant Properties and Is Capable of Preventing Cell-mediated Oxidative Modification of Low Density Lipoprotein, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 276, Nr. 48, pag. 44444–44449,

Carey J. Ng, Noam Bourquard, Victor Grijalva, Susan Hama, Diana M. Shih,Mohamad Navab, Alan M. Fogelman, Aldons J. Lusis, Stephen Young, Srinivasa T. Reddy, 2006, Paraoxonase-2 Deficiency Aggravates Atherosclerosis in Mice Despite Lower Apolipoprotein-B-containing Lipoproteins, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 281, Nr. 40, pag. 29491–29500

Carnegie JA1, Cabaca O., 1993, Extracellular matrix composition and resilience: two parameters that influence the in vitro migration and morphology of rat inner cell mass-derived cells., Biol Reprod., nr.48, pag.287-299

Carolyn R. Hoyal, Abel Gutierrez, Brandon M. Young, Sergio D. Catz, Jun-Hsiang Lin, Philip N. Tsichlis, Bernard M. Babior, 2003, Proc Natl Acad Sci U S A., nr. 100, pag. 5130-5135

Cathy Tournier, Chen Dong, Tod K. Turner, Stephen N. Jones, Richard A. Flavell, 2001, MKK7 is an essential component of the JNK signal transduction pathway activated by proinflammatory cytokines GENES & DEVELOPMENT nr.15, pag. 1419–1426

Cell Line Authentication & Quality Control Information, available online at. http://www.phe-culturecollections.org.uk/products/celllines/generalcell/detail.jsp?refId=85103115&collection=ecacc_gc

CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, 2012, available online at. https://www.promega.ro/resources/protocols/technical-bulletins/0/celltiter-96-aqueous-one-solution-cell-proliferation-assay-system-protocol/

CESAR G. FRAGA, MARK K. SHIGENAGA, JEEN-WOO PARK, PAOLO DEGAN, AND BRUCE N. AMES, 1990, Oxidative damage to DNA during aging: 8-Hydroxy-2'-deoxyguanosine in rat organ DNA and urine, Proc. Nadl. Acad. Sci. USA Vol. 87, pag. 4533-4537,

Charles B. Glaser, John Morser,t Jeffrey H. Clarke, Eric Blasko, Kirk McLean, Irene Kuhn,I Ray-Jen Chang, Jiing-Huey Lin, Laura Vilander, William H. Andrews, David R. Light, 1992, Oxidation of a Specific Methionine in Thrombomodulin by Activated Neutrophil Products Blocks Cofactor Activity A Potential Rapid Mechanism for Modulation of Coagulation, J. Clin. Invest., Nr. 90, pag. 2565-2573

Ching-You Lu, Cheng-Feng Lee, Yi-Shing Ma, Chun-Yi Liu, Chia-Yu Wei, Yin-Chiu Chen, Shi-Bei Wu, and Yau-Huei Wei, 2006, Oxidative Stress and Mitochondrial Disease, Oxidative Stress, Disease and Cancer: pag. 649-672. doi: 10.1142/9781860948046_0021 "

Chiper D., VALERIA LUNGU, CATALINA BARNA, LIDIA MATEI, MIHAI RADU, GEORGE BUBUEANU, AND CRISTIAN POSTOLACHE, 2010, BIOAFFINITY OF RADIOLABELLED NEUROTENSIN AGONIST AND ANTAGONIST TO NEUROTENSIN RECEPTORS, J. Label Compd. Radiopharm, nr. 53, pag. 406–489"

Chiquet M, Matthisson M, Koch M, Tannheimer M, Chiquet-Ehrismann R., 1996, Regulation of extracellular matrix synthesis by mechanical stress. Biochem Cell Biol, nr.74, pag:737-744

Choquet D, Felsenfeld DP, Sheetz MP., 1997, Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages, Cell., Nr. 10, pag.39-48.

Christopher S. Chen, Milan Mrksich, Sui Huang, George M. Whitesides, Donald E. Ingber, 1997, Geometric Control of Cell Life and Death, SCIENCE, Vol. 276, pag. 1425-1428

CHUN-YI LIU, CHENG-FENG LEE, CHIUNG-HUI HONG, YAU-HUEI WEI, 2004, Mitochondrial DNA Mutation and Depletion Increase the Susceptibility of Human Cells to Apoptosis, ANNALS NEW YORK ACADEMY OF SCIENCES, nr. 1011, pag.133–145, doi: 10.1196/annals.1293.014

Coggle J.E. ,1983, Biological effects of radiation, Taylor & Francis, pag. 1-247

Collins A., 2004, The Comet Assay for DNA Damage and Repair Principles, Applications, and Limitations, MOLECULAR BIOTECHNOLOGY Vol. 26, pag. 249-261

CONSUELO BORRAS, JUAN SASTRE, DAVID GARCIA-SALA, ANA LLORET, FEDERICO V. PALLARDO, JOSE VINA, 2003, MITOCHONDRIA FROM FEMALES EXHIBIT HIGHER ANTIOXIDANT GENE EXPRESSION AND LOWER OXIDATIVE DAMAGE THAN MALES, Free Radical Biology & Medicine, Vol. 34, Nr. 5, pag. 546–552,

Cory Hanley, Janet Layne, Alex Punnoose, K M Reddy, Isaac Coombs, Andrew Coombs, Kevin Feris, and Denise Wingett, 2008, Preferential killing of cancer cells and activated human T cells using ZnO nanoparticles, Nanotechnology, nr. 19, pag. 1-20, doi:10.1088/0957-4484/19/29/295103.

Crivineanu M., Durdun C., Nicorescu I., 2009, Antioxidant Activity of Some Polyphenolic Extracts Obtained from Plants with Antitumoral Potential on Linoleic Acid Emulsion, Bulletin USAMV, Veterinary Medicine 66(1)

Daniel Arcos, María Vallet-Regí, 2010, Sol–gel silica-based biomaterials and bone tissue regeneration, Acta Biomaterialia, nr.6, pag. 2874–2888

Danilo Fliser, Kathrin-Kristin Wagner, Astrid Loos, Dimitrios Tsikas, Hermann Haller, 2005, Chronic Angiotensin II Receptor Blockade Reduces (Intra)Renal Vascular Resistance in Patients with Type 2 Diabetes, J Am Soc Nephrol nr.16 pag. 1135-1140

David J. Kusner, Clifton E Hall, Larry S. Schlesinger, 1996, Activation of Phospholipase D Is Tightly Coupled to the Phagocytosis of Mycobacterium tuberculosis or Opsonized Zymosan by Human Macrophages, J. Exp. Med. Vol. 184, pag. 585-595"

Defeng Wu, Arthur I. Cederbaum, 1996, Ethanol Cytotoxicity to a Transfected HepG2 Cell Line Expressing Human Cytochrome P4502E1, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 271, Nr. 39, pag. 23914–23919"

Dent P, Yacoub A, Contessa J, Caron R, Amorino G, Valerie K, Hagan MP, Grant S, Schmidt-Ullrich R., 2003, Stress and radiation-induced activation of multiple intracellular signaling pathways, Radiat Res., nr. 159, pag. 283-300"

Dharambir K. Sanghera, Christopher E. Aston, Nilmani Saha, M. Ilyas Kamboh, 1998, DNA Polymorphisms in Two Paraoxonase Genes (PON1 and PON2) Are Associated with the Risk of Coronary Heart Disease, Am. J. Hum. Genet., Nr. 62, pag. 36–44,

Diffey B. L., 1991, Solar ultraviolet radiation effects on biological systems, Review in Physics in Medicine and Biology, nr. 36, pag. 299-328.

Dohi Y., Thiel M., F R Bühler and T F Lüscher, 1990, Activation of Endothelial L-Arginine Pathway in Resistance Arteries Effect of Age and Hypertension, Hypertension, nr. 16, pag. 170-179

Dorota Napierska, Leen CJ Thomassen, Dominique Lison, Johan A Martens, Peter H Hoet, 2010, The nanosilica hazard: another variable entity, Particle and Fibre Toxicology, nr.7, pag. 1-32

Douglas C. Wallace, 2010, A Mitochondrial Paradigm of Metabolic and Degenerative Diseases, Aging, and Cancer: A Dawn for Evolutionary Medicine, Annu Rev Genet. Nr. 39, doi: 10.1146/annurev.genet.39.110304.095751

Draganov D.I., La Du B.N., 2004, Pharmacogenetics of paraoxonases: a brief review, Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol, nr.369, pag. 78–88

Dragomir I. Draganov, John F. Teiber, Audrey Speelman, Yoichi Osawa, Roger Sunahara, Bert N. La Du, 2005, Journal of Lipid Research Vol. 46,

Dragomir I. Draganov, Philip L. Stetson, Catherine E. Watson, Scott S. Billecke, Bert N. La Du, 2000, Rabbit Serum Paraoxonase 3 (PON3) Is a High Density Lipoprotein-associated Lactonase and Protects Low Density Lipoprotein against Oxidation, J. Biol. Chem. nr.275, pag.33435-33442.

Durrington P.N., Mackness B., Mackness M.I., 2001, Paraoxonase and Atherosclerosis, Arterioscler Thromb Vasc Biol. Vol.21, pag.473-480

Earl R. Stadtman,2004, Role of Oxidant Species in Aging, Current Medicinal Chemistry, nr. 11, pag. 1105-1112

"Edwin A. Clark and Joan S. Brugget, 1995, Integrins and Signal Transduction Pathways: The Road Taken, SCIENCE, Vol. 268, pag. 233-239

Emilia Izak-Nau, Matthias Voetz, Stefanie Eiden, Albert Duschl, Victor F Puntes, 2013, Altered characteristics of silica nanoparticles in bovine and human serum: the importance of nanomaterial characterization prior to its toxicological evaluation, Particle and Fibre Toxicology, nr. 10, pag. 1-12

Eriberto Bressan , Luca Sbricoli , Riccardo Guazzo , Ilaria Tocco , Marco Roman , Vincenzo Vindigni , Edoardo Stellini , Chiara Gardin , Letizia Ferroni , Stefano Sivolella , Barbara Zavan, 2013, Nanostructured Surfaces of Dental Implants, Int. J. Mol. Sci., nr. 14, pag. 1918-1931; doi:10.3390/ijms14011918

Eric A. Schon, Giovanni Manfredi, 2003, Neuronal degeneration and mitochondrial dysfunction, The Journal of Clinical Investigation, nr. 111, pag.303–312, doi:10.1172/JCI17741.

Erkki Ruoslahti, 1997, Stretching Is Good for a Cell, Science, Vol. 276 no. 5317 p. 1345

Ernst S. Henle, Stuart Linn, 1997, Formation, Prevention, and Repair of DNA Damage by Iron/Hydrogen Peroxide, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 272, Nr. 31, pag. 19095–19098

Evaluation of the Significance of 2-Dodecylcyclobutanone and other Alkylcyclobutanones, 2013, available online at. http://www.hc-sc.gc.ca/fn-an/securit/irridation/cyclobutanone-eng.php

Fabienne Poncin-Epaillard, Tjasa Vrlinic, Dominique Debarnot, Miran Mozetic, Arnaud Coudreuse, Gilbert Legeay, Benaïssa El Moualij, Willy Zorzi, 2012, Surface Treatment of Polymeric Materials Controlling the Adhesion of Biomolecules, Journal of Functional Biomaterials, nr. 3, pag. 528-543; doi:10.3390/jfb3030528

Fang X., Fernando Q., 1995,Stereoisomeric selectivity of 2,3-dimer-captosuccinic acids in chelation therapy for lead poisoning.Chem. Res. Toxicol., nr. 8, pag. 525-536

FARAJ HIJAZ, TEJ B. SHRESTHA, STEFAN H. BOSSMAN, FARIS HUSSAIN, AND J. SCOTT SMITH, 2010, In Vitro and In Vivo Metabolism of the Radiolytic Compound 2-Dodecylcyclobutanone, JOURNAL OF FOOD SCIENCE, Vol. 75, Nr. 4, pag. 72-80"

Federico Rosei, 2004, Nanostructured surfaces: challenges and frontiers in nanotechnology, JOURNAL OF PHYSICS: CONDENSED MATTER, nr.16, pag. 1373-1436

Fenech Michael, 2007,Cytokinesis-block micronucleus cytome assay, Nature Protocols, Vol. 2, Nr. 5, pag. 1084-1104

Flemming R., Murphy C., Abrams G., Goodman S., Nealey P.,1999, Efects of synthetic micro- and nano-structured surfaces on cell behavior, Biomaterials, nr. 20, pag. 573-588

Frank M. Faraci, Sean P. Didion, 2004, Vascular Protection: Superoxide Dismutase Isoforms in the Vessel Wall,Arterioscler Thromb Vasc Biol. Nr.24, pag. 1367-1373

Frederick A. Villamena, 2013, Molecular Basis of Oxidative Stress: Chemistry, Mechanisms, and Disease Pathogenesis, Wiley, 446 pag.

Geir Slupphaug, Bodil Kavli, Hans E. Krokan, 2003, The interacting pathways for prevention and repair of oxidative DNA damage, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 531, Pag. 231–251

Ghițulică C., 2014, Caiet de Laborator Știința materialelor Universitatea POLITEHNICA din București Facultatea de Chimie Aplicată și Știința Materialelor Catedra Știința și Ingineria Materialelor Oxidice și Nanomateriale bioceramice

Gian Franco Gaetani, Silvana Galiano, Letizia Canepa, Anna Maria Ferraris, Henry Neil Kirkman, 1989, Catalase and Glutathione Peroxidase Are Equally Active in Detoxification of Hydrogen Peroxide in Human Erythrocytes, Blood, nr. 73, pag. 334-339

Giovanni Palmisano, Eric Le Bourhis, Rosaria Ciriminna, Davide Tranchida, Mario Pagliaro, 2006, ORMOSIL Thin Films: Tuning Mechanical Properties via a Nanochemistry Approach, Langmuir, vol. 22, pag. 11158-11162"

Gladys Block, Marion Dietrich, Edward P. Norkus, Jason D. Morrow, Mark Hudes, Bette Caan, and Lester Packer, 2002, Factors Associated with Oxidative Stress in Human Populations, American Journal of Epidemiology, Vol. 156, Nr. 3, pag. 274-285

Gordon D.J.,Probstfield J.L., Garrison R.J., Neaton J.D., Castelli W.P., Knoke J.D., Jacobs D.R., Bangdiwala S., Tyroler H.A., 1989, High-density lipoprotein cholesterol and cardiovascular disease. Four prospective American studies, Circulation, nr. 79, pag. 8-15

Gordon Reid, Alexandru Babes and Florentina Pluteanu, 2002, A cold- and menthol-activated current in rat dorsal root ganglion neurones: properties and role in cold transduction, Journal of Physiology, nr. 545, pag. 595–614"

Gutteridge M. C., Rowley D. A., Halliwell Barry, 1981, Detection of 'free' iron in biological systems by using bleomycin-dependent degradation of DNA, Biochem. J., nr. 199, pag.263-265

Halestrap A., E. Doran, J. P. Gillespie, A. O'Toole, 2000, Mitochondria and cell death, Biochemical Society Transactions (2000) Vol. 28, partea 2, pag. 170-177

Halliwell B, Gutteridge JM., 1995, The definition and measurement of antioxidants in biological systems, Free Radic Biol Med. Nr. 18, pag. 125–126

Halliwell B., 1989, Free radicals, reactive oxygen species and human disease: a critical evaluation with special reference to atherosclerosis, Br J Exp Pathol. Nr. 70, pag. 737–757.

Halliwell Barry and Gutteridge John , 2007, Free Radicals in Biology and Medicine, Fourth Edition

Halliwell Barry , 1989, Free radicals, reactive oxygen species and human disease: a critical evaluation with special reference to atherosclerosis, Br. J. Exp. Path., nr. 70, pag. 737-757

Halliwell Barry, 2000, Why and how should we measure oxidative DNA damage in nutritional studies? How far have we come?, Am. J. Clin. Nutr. Nr.72 pag.1082–1087.

Halliwell Barry, Whiteman Matthew, 2004, Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean?, British Journal of Pharmacology, nr. 142, pag. 231–255"

Harris C. Curtis, p53 Tumor Suppresor Gene: At the Crossroads of Molecular Carcinogenesis, Molecular Epidemiology, and Cancer Risk Assessment, Environmental Health Perspectives, Vol. 104, pag. 53

Hartmann A., E.Agurell2, C.Beevers3, S.Brendler-Schwaab4, B.Burlinson5, P.Clay6, A.Collins7, A.Smith, G.Speit, V.Thybaud and R.R.Tice, 2003, Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay, Mutagenesis vol.18 nr.1 pag. 45–51

Harvey Lodish, Arnold Berk, S Lawrence Zipursky, Paul Matsudaira, David Baltimore, and James Darnell., 2000, Molecular Cell Biology, 4th edition, New York: W. H. Freeman, ISBN-10: 0-7167-3136-3

Helen Lundqvist, Per Follin, Laila Khalfan, Claes Dahlgren, 1996, Phorbol myristate acetate-induced NADPH oxidase activity in human neutrophils: only half the story has been told, Journal of Leukocyte Biology Vol. 59, pag. 270-279."

Helmut Sies, 1997, Oxidative Stress: Oxidants and Antioxidants, Experimental Physiology, nr. 82, pag. 291-295

Helmut Sies, 2009, Oxidative Stress: an Introduction, available online at. http://www.frag-chile.cl/documentos/H_Sies_Free_Radical_School_Chile-2009.pdf

Hideyuki J. Majima, Hiroko P. Indo, Kazuo Tomita, Shigeaki Suenaga, Shigeatsu Motoori, Hirotoshi Kato, Hsiu-Chuan Yen, and Toshihiko Ozawa, 2006, Intracellular Oxidative Stress Caused by Ionizing Radiation, Oxidative Stress, Disease and Cancer, pag. 61-83.

Hiroshi Kasai and Susumu Nishimura, 1984, Hydroxylation of deoxyguanosine at the C-8 position by ascorbic acid and other reducing agents, Nucleic Acids Research, Vol. 12, Nr. 4, pag. 2137-2145

Hockenbery DM, Oltvai ZN, Yin XM, Milliman CL, Korsmeyer SJ., 1993, Bcl-2 functions in an antioxidant pathway to prevent apoptosis, CellPress, nr. 75,

Hong-Bo Sun, Satoshi Kawata, 2004, Two-Photon Photopolymerization and 3D Lithographic Microfabrication, Apvances in Polymer Science, Vol. 170, pag. 169-273

Hui Wang , Qing H. Meng , John R. Gordon , Hasnain Khandwala, Lingyun Wu, 2007, Proinflammatory and proapoptotic effects of methylglyoxal on neutrophils from patients with type 2 diabetes mellitus, Clinical Biochemistry, nr. 40, pag. 1232–1239

Iles K.E., Forman H.J., 2002, Macrophage signaling and respiratory burst, Immunol Res. Nr.26, pag. 95-105

Ilias G., Kirkinezosa and Carlos T. Moraesa, 2001, Reactive oxygen species and mitochondrial diseases, CELL & DEVELOPMENTAL BIOLOGY, Vol. 12, pag. 449–457

Ilka B. Bischofs, Franziska Klein, Dirk Lehnert, Martin Bastmeyer, and Ulrich S. Schwarz, 2008, Filamentous Network Mechanics and Active Contractility Determine Cell and Tissue Shape, Biophysical Journal Vol. 95, pag. 3488–3496

Introduction to Phase Contrast Microscopy, available online at. http://www.microscopyu.com/articles/phasecontrast/phasemicroscopy.html

Isabella Dalle-Donne, Ranieri Rossi, Roberto Colombo, Daniela Giustarini, Aldo Milzani, 2006, Biomarkers of Oxidative Damage in Human Disease, Clinical Chemistry, nr.52, pag. 601–623

Isabella Dalle-Donne, Ranieri Rossib, Daniela Giustarinib, Aldo Milzania, Roberto Colombo, 2003, Protein carbonyl groups as biomarkers of oxidative stress, Clinica Chimica Acta nr. 329, pag. 23–38

Isabella Dalle-Donnea, Ranieri Rossib, Daniela Giustarinib, Aldo Milzania, Roberto Colombo, 2003, Protein carbonyl groups as biomarkers of oxidative stress, Clinica Chimica Acta nr. 329, pag. 23–38

Ito A., 1988, Electron track simulation for microdosometry, Plenum Publishers, pag. 361–382.

JA Badwey, AI Tauber and ML Karnovsky, 1983,Properties of NADH-cytochrome-b5 reductase from human neutrophils, Blood (print ISSN 0006-4971, online ISSN 1528-0020), nr. 62, pag.152-157

Jacek Piątek, Paweł Maćkowiak, Hanna Krauss, Dorota Nowak, Paweł Bogdański, 2011, In vivo investigations of neurotensin receptors in adipocytes, hepatocytes and enterocytes of rat, Annals of Agricultural and Environmental Medicine, Vol 18, Nr. 2, pag. 433-436

Jayasree Basivireddy, Anju Vasudevan, Molly Jacob, Kunissery A. Balasubramanian, 2002, Indometacin-induced mitochondrial dysfunction and oxidative stress in villus enterocytes, Biochemical Pharmacology, nr. 64, pag. 339-349

Jeney Viktoria, Shinichi Itoh, Maria Wendt, Quinton Gradek, Masuko Ushio-Fukai,David G. Harrison, Tohru Fukai, 2005, Role of Antioxidant-1 in Extracellular Superoxide Dismutase Function and Expression, Circulation Research, nr.96, pag. 723-729

Ji-Feng WANG, Pavel KOMAROV, Helmut SIES and Herbert DE GROOT, 1991, Contribution of nitric oxide synthase to luminol-dependent chemiluminescence generated by phorbol-ester-activated Kupffer cells, Biochem. J., nr. 279, 311-314"

Jing Sun, Yunfei Pu, Peijian Wang, Sijiao Chen, Yu Zhao, Chan Liu, Qianhui Shang, Zhiming Zhu, Daoyan Liu, 2013, TRPV1-mediated UCP2 upregulation ameliorates hyperglycemia-induced endothelial dysfunction, Cardiovascular Diabetology, nr.12, pag. 1-14

JIN-YAO MO, HISAJI MAKI, MUTSUO SEKIGUCHI, 1992, Hydrolytic elimination of a mutagenic nucleotide, 8-oxodGTP, by human 18-kilodalton protein: Sanitization of nucleotide pool, Proc. Nati. Acad. Sci. USA Vol. 89, pag. 11021-11025"

John F. Keaney, 2005, Oxidative Stress and the Vascular Wall NADPH Oxidases Take Center Stage, Circulation, nr.112, pag.2585-2588

John W. Baynes, Suzanne R. Thorpe, 2000, Glycoxidation and lipoxidation in atherogenesis, Free Radical Biology & Medicine, Vol. 28, Nr. 12, pag. 1708–1716

Jos´e Vina, Amparo Gimeno, Juan Sastre, Carmen Desco, Miguel Asensi, Federico V. Pallardo, Andres Cuesta, Jos´e Antonio Ferrero, Lance S. Terada, John E. Repine, 2000, Mechanism of Free Radical Production in Exhaustive Exercise in Humans and Rats; Role of Xanthine Oxidase and Protection by Allopurinol, IUBMB Life, nr. 49, pag. 539–544,

Joseph P. Gaut, Jaeman Byun, Hung D. Tran, Wendy M. Lauber, James A. Carroll, Richard S. Hotchkiss, Abderrazzaq Belaaouaj, Jay W. Heinecke, 2002, Myeloperoxidase produces nitrating oxidants in vivo, J. Clin. Invest. Nr.109, pag. 1311–1319

Joy Ganem Longhi, Elisa Perez, Jair José de Lima, Lys Mary Bileski Cândido, 2011, In vitro evaluation of Mucuna pruriens (L.) DC. antioxidant activity, Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences vol. 47, nr. 3, pag. 535-544

Judy B. de Haan, Francesca Cristiano, Rocco Iannello, Cecile Bladier, Michael J. Kelner, Ismail Kola, 1996, Elevation in the ratio of Cu/Zn-superoxide dismutase to glutathione peroxidase activity induces features of cellular senescence and this effect is mediated by hydrogen peroxide, Human Molecular Genetics, Vol. 5, Nr. 2 pag. 283–292

Julio F. Turrens, 1997, Superoxide Production by the Mitochondrial Respiratory Chain, Bioscience Reports, Vol. 17, Nr. 1, pag. 3-8

Jun-ichi A., Berk B.C., 1999, Fyn and JAK2 Mediate Ras Activation by Reactive Oxygen Species, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 274, No. 30, Issue of July 23, pp. 21003–21010

Junseong Park, Jungsul Lee, Chulhee Choi, 2011, Mitochondrial Network Determines Intracellular ROS Dynamics and Sensitivity to Oxidative Stress through Switching Inter-Mitochondrial Messengers, PLoS ONE, Vol. 6,

Karen Bedard, Karl-Heinz Krause, 2007, The NOX Family of ROS-Generating NADPH Oxidases: Physiology and Pathophysiology, Physiol Rev 87: 245–313, doi:10.1152/physrev.00044.2005.

KARLSSON F. A., PIA BURMAN, L. LOOF, M. OLSSON, ANNIKA SCHEYNIUS, S. MARDH, 1987, Enzyme-linked immunosorbent assay of H+, K+-ATPase, the parietal cell antigen, Clin. exp. Immunol. Nr. 70, pag. 604-610

Kartick C. Pramanik, Palika Datta, Sanjay K. Srivastava, 2013, Oxidative Stress by Capsaicin in Cancer, available online at. http://www.springer.com/biomed/cancer/book/978-94-007-6316-6

Kashihara N., Haruna Y., Kondeti V.K., Kanwar Y.S., 2010, Oxidative Stress in Diabetic Nephropathy, Curr Med Chem, nr. 17, pag. 4256–4269.

Kaushik M. Desai, Tuanjie Chang, Hui Wang, Ali Banigesh, Arti Dhar, Jianghai Liu, Ashley Untereiner, Lingyun Wu, 2010, Oxidative stress and aging: Is methylglyoxal the hidden enemy?, Can. J. Physiol. Pharmacol. Nr. 88, pag. 273–284"

Kazimierz Ciechanowski, Karolina Kedzierska, Edyta Gołembiewska, Krzysztof Safranow,Joanna Bober, Leszek Domanski, Jacek Rozanskia, Marek Myslak, 2005, Impaired Synthesis Is Not the Reason for Decreased Activity of Extracellular Superoxide Dismutase in Patients with Diabetes, Archives of Medical Research nr.36 pag. 148–153

Keidu Oshida, Ema Iwanaga, Keiko Miyamoto-Kuramitsu, Yohei Miyamoto, 2008, An in vivo comet assay of multiple organs (liver, kidney and bone marrow) in mice treated with methyl methanesulfonate and acetaminophen accompanied by hematology and/or blood chemistry, The Journal of Toxicological Sciences, Vol. 33, Nr. 5, pag. 515-524

Keiyu Oshida, Ema Lwanaga, Keiko Miyamoto-Kuramitsu, Yohei Miyamoto, 2008, An in vivo comet assay of multiple organs (liver, kidney and bone marrow) in mice treated with methyl methanesulfonate and acetaminophen accompanied by hematology and/or blood chemistry, The Journal of Toxicological Sciences, vol. 33, nr. 5, pag. 515-524

Kendric C. Smith, 1992, Spontaneous mutagenesis: Experimental, genetic and other factors, Mutation Research, nr. 277, pag. 139-162

Kiechle F.L., Malinski T., 1993, Nitric Oxide: Biochemistry, Pathophysiology, and Detection, Am. J. Clin. Pathol, nr. 100, pag. 567-575."

KININGHAM K., T. D. OBERLEY, S.-M. LIN, C. A. MATTINGLY, D. K. ST. CLAIR, Overexpression of manganese superoxide dismutase protects against mitochondrial-initiated poly(ADPribose) polymerase-mediated cell death, The FASEB Journal, Vol. 13, pag. 1601-1610

Kinya Uchida, Junji Tsuchida, Hiromitsu Tanaka, Minoru Koga, Yukio Nishina, Masami Nozaki, Kazuya Yoshinaga, Kiyotaka Toshimori, Kiyomi Matsumiya, Akihiko Okuyama, Yoshitake Nishimune, 2000, Cloning and Characterization of a Complementary Deoxyribonucleic Acid Encoding Haploid-Specific Alanine-Rich Acidic Protein Located on Chromosome-X, BIOLOGY OF REPRODUCTION, nr. 63, pag. 993–999

Koji Uchida, Masamihi Kanematsu, Kensuke Sakai, Tsukasa Matsuda, Nobutaka Hattoris,Yoshikuni Mizuno, Daisuke Suzuki, Toshio Miyata, Noriko Noguchl, Etsuo Niki, Toshihiko Osawa, 1998, Protein-bound acrolein: Potential markers for oxidative stress, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 95, pag. 4882–4887

Kröncke KD, Fehsel K, Kolb-Bachofen V., 1997, Nitric oxide: cytotoxicity versus cytoprotection–how, why, when, and where?, Nitric Oxide., nr. 1, pag. 107-120

Kwun I. S.,Jang H. S.,Kwon C. S., 2000, Plasma Level of Antioxidant Minerals (Cu, Zn, Mn, and Se) and Fe, Trace Elements in Man and Animals, nr. 10, pag. 559-561

Leonid Gaidukov, Mira Rosenblat, Michael Aviram, Dan S. Tawfik, 2006, The 192R/Q polymorphs of serum paraoxonase PON1 differ in HDL binding, lipolactonase stimulation, and cholesterol efflux, Journal of Lipid Research, Vol. 47, pag. 2492-2502

Lesley, S.A., Groskreutz, D.J., 1997, Simple affinity purification of antibodies using in vivo biotinylation of a fusion protein, J. Immunol. Methods, nr. 207, pag. 147-155

"Liming Wang, Ying Liu, Wei Li, Xiumei Jiang, Yinglu Ji, Xiaochun Wu, Ligeng Xu, Yang Qiu, Kai Zhao, Taotao Wei, Yufeng Li, Yuliang Zhao, Chunying Chen, 2011, Selective Targeting of Gold Nanorods at the Mitochondria of Cancer Cells: Implications for Cancer Therapy, Nano Lett. nr. 11, pag. 772–780

Lino Ferreira, Jeffrey M. Karp, Luis Nobre, Robert Langer, 2008, New Opportunities: The Use of Nanotechnologies to Manipulate and Track Stem Cells, Cell Stem Cell, Vol. 3, pag. 136–146

Livia Casciola-Rosen,Fredrick Wigley, Antony Rosen, 1997, Scleroderma Autoantigens Are Uniquely Fragmented by Metal-catalyzed Oxidation Reactions: Implications for Pathogenesis, J. Exp. Med. The Rockefeller University Press, Volume 185, Nr. 1, pag. 71–79

llan. NOLIL and Dictinar HEGNER, 1978, Do Mitochondria Produce Oxygen Radicals in vivo? Eur. J. Biochem. Nr. 82, pag. 503 – 567

Mackness B., Mackness M.I., Durrington P.N., Arrol S., Evans A.E., McMaster D., Ferrie`res J., Ruidavets J.B., Williams N.R., Howard A.N., 2000, Paraoxonase activity in two healthy populations with differing rates of coronary heart disease, European Journal of Clinical Investigation, nr. 30, pag. 4–10

Marcelo Hermes-Lima, 2004, Oxigen in biology and biochemistry, role of radicals, Functional Metabolism: Regulation and Adaptation, DOI: 10.1002/047167558X.ch12.

MARCUS S. COOKE, MARK D. EVANS, MIRAL DIZDAROGLU, JOSEPH LUNEC, 2003, The FASEB Journal, vol. 17, pag. 1195-1214

Marian Valko, Dieter Leibfritz, Jan Moncola, Mark Cronin, Milan Mazura, Joshua Telser, 2007,Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, nr. 39, pag. 44–84

Mariappan Premanathan, Krishnamoorthy Karthikeyan, Kadarkaraithangam Jeyasubramanian, Govindasamy Manivannan, Mphild, 2011, Selective toxicity of ZnO nanoparticles toward Gram-positive bacteria and cancer cells by apoptosis through lipid peroxidation, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, nr. 7, pag. 184–192

Marina Carini, Giancarlo Aldini, Roberto Maffei Facino, 2004,MASS SPECTROMETRY FOR DETECTION OF 4-HYDROXY-trans-2-NONENAL (HNE) ADDUCTS WITH PEPTIDES AND PROTEINS, Mass Spectrometry Reviews, nr.23, pag.281– 305

Maritim A., R. A. Sanders, J. B. Watkins, Diabetes, Oxidative Stress, and Antioxidants: A Review, J BIOCHEM MOLECULAR TOXICOLOGY Vol. 17, Nr. 1, pag. 24-38

Mark A. Birch-Machin and Helen Swalwell, 2010, How mitochondria record the effects of UVexposure and oxidative stress using human skin as a model tissue, Mutagenesis vol. 25 nr. 2, pag. 101–107

Mark A. Ward, Theoni K. Georgiou, 2011, Thermoresponsive Polymers for Biomedical Applications, Polymers, nr. 3, pag. 1215-1242; doi:10.3390/polym3031215

Marquis C.P., 2000, Mammalian Cell Culture, available online at. http://www.eolss.net/sample-chapters/c17/e6-58-01-04.pdf

Marta Muzio, Brent R. Stockwell, Henning R. Stennicke, Guy S. Salvesen, and Vishva M. Dixit, 1998, An Induced Proximity Model for Caspase-8 Activation, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 273, Nr. 5, pag. 2926–2930

Martha K. Cathcart, 2003, Regulation of Superoxide Anion Production by NADPH Oxidase in Monocytes/Macrophages Contributions to Atherosclerosis,Arterioscler Thromb Vasc Biology, Nr.24, pag.23-28;

Masayuki Yamato, Chie Konno, Mika Utsumi, Akihiko Kikuchi, Teruo Okano, 2002,Thermally responsive polymer-grafted surfaces facilitate patterned cell seeding and co-culture, Biomaterials, nr. 23, pag. 561–567

Matei A., Dinulescu M, Buruiana E., Buruiana T., Petcu I., Mustaciosu C., 2011, ORMOSILS SCAFFOLDS PRODUCED BY LASER PROCESSING FOR FIBROBLAST CELL GROWTH, Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures Vol. 6, Nr. 1, pag. 29-35

Matei A., J. Schou, S. Canulescu, M. Zamfirescu, C. Albu, B. Mitu, E.C. Buruiana, T. Buruiana, C. Mustaciosu, I. Petcu, M. Dinescu, 2012, Functionalized ormosil scaffolds processed by direct laser polymerization for application in tissue engineering, Applied Surface Science, vol. 278, pag. 357–361

Matei A., M. Zamfirescu, C. Radu, T. Buruiana, E. Buruiana, C. Mustaciosu, I. Petcu, M. Radu, A. Kiss, M. Dinescu, 2011, Tailoring the properties of hybrid methacrylates scaffolds produced via Two Photon Polymerization, Proceedings of the 3rd International Conference on E-Health and Bioengineering – EHB 2011, 24th-26th November, 2011, Iași, Romania

MATEI A., M. ZAMFIRESCU, M. DINESCU, E.C. BURUIANA, T. BURUIANA, A. LUNGU, C. MUSTACIOSU, 2012, INVESTIGATION OF HYBRID METHACRYLATE BASED STRUCTURES OBTAINED BY POLYMERIZATION WITH FEMTOSECOND LASER PULSES, Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures Vol. 7, Nr. 2, pag. 823 – 832

Mates JM, Sanchez-Jimenez F., 1999, Antioxidant enzymes and their implications in pathophysiologic processes, Frontieres in Bioscience, nr. 4, pag. 339-345

McGowan P.E., Reglinski J., Smith W.E., Wilsonb R., Sturrockc R.D., 1992, Studies of oxidative stress in cellular systems The interaction of monocytes and erythrocytes, FEBS LETTERS, vol. 314, nr. 3, pag. 455-457

Measuring Absorbance Using the CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay with the GloMax® Discover System, 2013, available online at. http://www.promega.ro/~/media/files/resources/application%20notes/glomax%20discover/measuring%20absorbance%20using%20the%20celltiter%2096%20aqueous%20one%20cell%20assay%20and%20glomax%20discover%20system.pdf?la=en

Michael Brownlee, 2003, A radical explanation for glucose-induced b cell dysfunction, J. Clin. Invest. Nr. 112, pag. 1788–1790 doi:10.1172/JCI200320501

Michael I. Mackness, Sharon Arrol, Paul N. Durringtorm, 1991, Paraoxonase prevents acumulation of lipoperoxides in low-density lipoprotein, Vol. 286, nr. 1,2, pag 152-154

Michael P. Murphy, Robin A.J. Smith, 2000, Drug delivery to mitochondria: the key to mitochondrial medicine, Advanced Drug Delivery Reviews, nr. 41, pag. 235–250"

Michael P. Murphya, Robin A.J. Smithb, 2000, Drug delivery to mitochondria: the key to mitochondrial medicine, Advanced Drug Delivery Reviews, nr.41, pag. 235–250

Microscopy resource center, available online at. http://www.olympusmicro.com/index.html

Miklos Peter Kalapos, 2008, The tandem of free radicals and methylglyoxal, Chemico-Biological Interactions, nr. 171, pag. 251–271

Miller NJ.,1996, Anticoagulants for total antioxidant activity assay, Ann Clin Biochem, nr. 33, pag. 92-103.

Min Tua, Hayder A. Abbooda, Zhening Zhuc, Hailing Li, Zhonghong Gaoa, 2013, Investigation of the photocatalytic effect of zinc oxide nanoparticles in the presence of nitrite, Journal of Hazardous Materials nr. 244-245 Pag.311– 321

Mira Rosenblat, Tony Hayek, Khetam Hussein, Michael Aviram, 2003, Decreased Macrophage Paraoxonase 2 Expression in Patients With Hypercholesterolemia Is the Result of Their Increased Cellular Cholesterol Content: Effect of Atorvastatin Therapy, Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, nr.24, pag. 175-180"

Miral Dizdaroglu, Pawel Jaruga, Mechanisms of free radical-induced damage to DNA, Free Radical Research, nr. 46, pag. 382–419

Mohd Javed Akhtar, Maqusood Ahamed, Sudhir Kumar, MA Majeed Khan, Javed Ahmad, Salman A Alrokayan, 2012, Zinc oxide nanoparticles selectively induce apoptosis in human cancer cells through reactive oxygen species, International Journal of Nanomedicine, nr. 7, pag. 845–857

Mousa, S.A. Cheresh, D.A., 1997, Recent advances in cell adhesion molecules and extracellular matrix proteins: potential clinical implications, Drug Discovery Today, Vol. 2, Nr. 5, pag. 187-199

Muredach P. Reilly, Domenico Pratico, Norman Delanty, Giovanni DiMinno, Elena Tremoli, Daniel Rader, Shiv Kapoor, Joshua Rokach, 1998, Increased Formation of Distinct F2 Isoprostanes in Hypercholesterolemia, Circulation, nr. 98, pag. 2822-2828

John Lawson, Garret A. FitzGerald, Mutsuo Sekiguchi, Teruhisa Tsuzuki, 2002, Oxidative nucleotide damage: consequences and prevention, Oncogene, nr. 21, pag. 8895 – 8904

Namarata Chhabra, 2012, A to I of Vitamin C (Functions of vitamin C simplified), available online at. http://www.namrata.co/a-to-i-of-vitamin-c-functions-of-vitamin-c-simplified/

Ning Li, Tian Xia, Andre E. Nel, 2008, The Role of Oxidative Stress in Ambient Particulate Matterinduced Lung Diseases and Its Implications in the Toxicity of Engineered Nanoparticles, Free Radic Biol Med., nr. 44, pag. 1689–1699, doi:10.1016/j.freeradbiomed.2008.01.028."

Nohl H., A.V. Kozlov, L. Gille, K. Staniek, 2003, Cell respiration and formation of reactive oxygen species: facts and artefacts, Biochemical Society Transactions, Vol. 31, pag. 1308-1311

Nourooz-Zadeh J., Rahimi A., Tajaddini-Sarmadi J., Tritschler H., Rosen P., Halliwell B., Betteridge D.J., 1997, Relationships between plasma measures of oxidative stress and metabolic control in NIDDM, Diabetologia, nr. 40, pag. 647–653

Odetti P., S. Garibaldi, G. Noberasco, I. Aragno, S. Valentini, N. Traverso, U.M. Marinari, 1999, Levels of carbonyl groups in plasma proteins of type 2 diabetes mellitus subjects, Acta Diabetol, nr.36, pag. 179-183

Olinescu Andrei, 2004, Momente din istoria Imunologiei românești. Comisia națională de Imunologie (CNI), Ed. Medicală Românească

Packer L., Valacchi G, 2002, Antioxidants and the Response of Skin to Oxidative Stress: Vitamin E as a Key Indicator, Skin Pharmacol Appl Skin Physiol, nr. 15, pag.282–290

Panait M., Diana Chiper, Valentina Negoita, Valeria Lungu, Maria Iuliana Gruia, 2013, Therapeutic Efficacy Evaluation of 177Lu-DOTA-NT and 177Lu-DOTA-SR48692 in Murine RS-1 Hepatoma, Int J Pept Res Ther, nr. 19, pag. 345–356"

PAOLO MONTUSCHI, JOHN V. COLLINS, GIOVANNI CIABATTONI, NICOLA LAZZERI, MASSIMO CORRADI,SERGEI A. KHARITONOV, PETER J. BARNES, 2000, Exhaled 8-Isoprostane as an In Vivo Biomarkerof Lung Oxidative Stress in Patients with COPD and Healthy Smokers, Am J Respir Crit Care Med, Vol. 162, pag. 1175–1177

PAOLO MONTUSCHI, PETER J. BARNES, L. JACKSON ROBERTS, 2004, Isoprostanes: markers and mediators of oxidative stress, The FASEB Journal, vol. 18, pag. 1791-1800

Paul Amstad, Amy Moret, and Peter Cerutti, 1994, Glutathione Peroxidase Compensates for the Hypersensitivity of Cu,Zn-Superoxide Dismutase Overproducers to Oxidant Stress, The Journal of Biological Chemistry Vol. 269, Nr. 3, pag. 1606-1609

Paul D. Ray, Bo-Wen Huang, Yoshiaki Tsuji, 2012, Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling, Cellular Signalling nr. 24, pag. 981–990

Paul J. Thornalley, 1996, Pharmacology of Methylglyoxal: Formation, Modification of Proteins and Nucleic Acids, and Enzymatic Detoxification-A Role in Pathogenesis and Antiproliferative Chemotherapy, Gen. Pharmac. Vol. 27, Nr. 4, pag. 565-573

Paul J. Thornalley, 2005, MEASUREMENT OF PROTEIN GLYCATION, GLYCATED PEPTIDES, AND GLYCATION FREE ADDUCTS, Peritoneal Dialysis International, Vol. 25, pag. 522–533

PerkinElmer, Inc., 2010, Lutetium-177 Handling Precautions, available online at. http://www.perkinelmer.com/cmsresources/images/44-73951tch_lutetium177.pdf

Petra Uhlmann, Nikolay Houbenov, Sergiy Minko, Manfred Stamm, 2005, Surface functionalization by smart binary polymer brushes to tune physico-chemical characteristics at biointerfaces, e-Polymers, nr.75,

Powers S., MALCOLM J. JACKSON, 2008, Exercise-Induced Oxidative Stress: Cellular Mechanisms and Impact on Muscle Force Production, Physiol Rev., nr. 88, pag. 1243–1276

Pryor W.A., 2000, Vitamin E and heart disease: basic science to clinical intervention trials, Free Rad Biol Med.nr. 28, pag. 141–164.

Quanxin Meng, Ting Su, Ofelia A. Olivero, Miriam C. Poirier, Xiaochu Shi, Xinxin Ding, Vernon E. Walker, 2000, Relationships between DNA Incorporation, Mutant Frequency, and Loss of Heterozygosity at the TK Locus in Human Lymphoblastoid Cells Exposed to 39-Azido-39-deoxythymidine, TOXICOLOGICAL SCIENCES, nr.54, pag. 322–329

R. Calle, M. I. McCarthy, P. Banerjee, E. Zeggini, C. A. Cull, K. I. Thorne, S. Wiltshire, S. Terra, D. Meyer, J. Richmond, J. Mancuso, P. Milos, D. Fryburg, R. R. Holman, 2007, Diabetologia nr.49, p.2892–2899. DOI 10.1007/s00125-006-0436-8

Rachana K. Visaria, Robert J. Griffin, Brent W. Williams, 2006, Enhancement of tumor thermal therapy using gold nanoparticle-assisted tumor necrosis factor-a delivery, Molecular Cancer Therapeutics, pag. 1014-1020

Radu Beatrice Mihaela, Adina Daniela Iancu, Diana Ionela Dumitrescu, Maria Luisa Flonta, Mihai Radu, 2012, TRPV1 Properties in Thoracic Dorsal Root Ganglia Neurons are Modulated by Intraperitoneal Capsaicin Administration in the Late Phase of Type-1 Autoimmune Diabetes, Cell Mol Neurobiol, Cell Mol Neurobiol, nr. 33. doi: 10.1007/s10571-012-9883-6.

Radu Beatrice Mihaela, Diana Ionela Dumitrescu, Cosmin Catalin Mustaciosu, Mihai Radu, 2012, Dual Effect of Methylglyoxal on the Intracellular Ca2+ Signaling and Neurite Outgrowth in Mouse Sensory Neurons, Cell Mol Neurobiol, nr. 32, pag. 1047–1057

Radu D., Adriana Georgescu, Crina Stavaru, Alina Carale , Doina Popov, 2004, Double transgenic mice with Type 1 diabetes mellitus develop somatic, metabolic and vascular disorders, J. Cell. Mol. Med. Vol. 8, Nr. 3, pag. 349-358

Rafael Radil, Joseph S. Beckman, Kenneth M. Bush, Bruce A. Freeman, 1991, Peroxynitrite Oxidation of Sulfhydryls THE CYTOTOXIC POTENTIAL OF SUPEROXIDE AND NITRIC OXIDE, THEJ OURNALO F BIOLOGICCAHELM ISTRY Vol. 266, Nr. 7, pag. 4244-4250

Rainer de Martin, Martina Hoeth, Renate Hofer-Warbinek, Johannes A. Schmid, 2000, The Transcription Factor NF-kB and the Regulation of Vascular Cell Function, Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, nr. 20, pag. 83-88

Regeneration centre of Thailand, 2013, Apoptosis and Programmed Cell Death “PCD" available online at. http://stemcellthailand.org/apoptosis-programmed-cell-death-pcd/

Reșat Apak, Shela Gorinstein, Volker Böhm, Karen M. Schaich, Mustafa Özyürek, Kubilay Güçlü, 2013, Methods of measurement and evaluation of natural antioxidant capacity/activity (IUPAC Technical Report), Pure Appl. Chem., Vol. 85, Nr. 5, pag. 957–998

Richard K.M. Wong, Andrew I. Pettit, Paulene A. Quinn, MPhil Sonja C. Jennings, Joan E. Davies, Leong L., 2003, Advanced Glycation End Products Stimulate an Enhanced Neutrophil Respiratory Burst Mediated Through the Activation of Cytosolic Phospholipase A2 and Generation of Arachidonic Acid, Circulation. nr.108, pag. 1858-1864

Ridnour, L. A., Thomas, D. D., Mancardi, D., Espey, M. G., Miranda, K. M., Paolocci, N., et al. (2004). The chemistry of nitrosative stress induced by nitric oxide and reactive nitrogen oxide species. Putting perspective on stressful biological situations. Biol. Chem., nr. 385, pag. 1–10

Robert C. Sorenson, Charles L. Bisgaier, Michael Aviram, Cary Hsu, Scott Billecke and Bert N. La Du, 1999, Human Serum Paraoxonase/Arylesterase’s Retained Hydrophobic N-Terminal Leader Sequence Associates With HDLs by Binding Phospholipids Apolipoprotein A-I Stabilizes Activity, Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, nr. 19, pag. 2214-2225

Robert Lupitskyy, Yuri Roiter, Constantinos Tsitsilianis, and Sergiy Minko, 2005, From Smart Polymer Molecules to Responsive Nanostructured Surfaces, Langmuir, nr. 21, pag. 8591-8593

Rodica Pop-Busui, Anders Sima, Martin Stevens, 2006, Diabetic neuropathy and oxidative stress, Diabetes Metab Res Rev, nr. 22, pag. 257–273.

Rodica Pop-Busui, Victor Marinescu, Carol Van Huysen, Fei Li, Kelli Sullivan, Douglas A. Greene, Dennis Larkin, and Martin J. Stevens, 2002, Dissection of Metabolic, Vascular, and Nerve Conduction Interrelationships in Experimental Diabetic Neuropathy by Cyclooxygenase Inhibition and Acetyl-L-Carnitine Administration, DIABETES, Vol. 51, pag. 2619-2628

Roitt Ivan M., Delves Peter J., 2006, Roitt's essential immunology, ISBN: 9781405136037 1405136030

Roland S., John F. Keaney, JR, 2004, Role of Oxidative Modifications in Atherosclerosis, Physiol Rev, nr. 84, pag. 1381–1478

Ron Kohen, Abraham Nyska, 2002, Oxidation of Biological Systems: Oxidative Stress Phenomena, Antioxidants, Redox Reactions, and Methods for Their Quantification, Toxicologic Pathology, vol. 30, nr. 6, pag. 620–650

Rongfa Guan, Tianshu Kang, Fei Lu, Zhiguo Zhang, Haitao Shen, Mingqi Liu, 2012, Cytotoxicity, oxidative stress, and genotoxicity in human hepatocyte and embryonic kidney cells exposed to ZnO nanoparticles, Nanoscale Research Letters, nr. 7, pag. 1-7

Rosen P., Nawroth P., King G., Moller W., Tritschler H., Packer L., 2001, The role of oxidative stress in the onset and progression of diabetes and its complications: a summary of a Congress Series sponsored by UNESCO-MCBN, the American Diabetes Association and the German Diabetes Society, DIABETES METABOLISM RESEARCH AND REVIEWS, nr. 17, pag. 189–212

Rudner J., V. Jendrossek, C. Belka, 2002, New insights in the role of Bcl-2 Bcl-2 and the endoplasmic reticulum, Apoptosis, nr. 7, pag. 441–447

Rusen L., V. Dinca, B. Mitu, C. Mustaciosu, M. Dinescu, 2014, Temperature responsive functional polymeric thin films obtained bymatrix assisted pulsed laser evaporation for cellsattachment–detachment study, Applied Surface Science, nr. 302, pag. 134–140

Ruvolo P., X Deng and WS May, 2001, Phosphorylation of Bcl2 and regulation of apoptosis, Leukemia, nr. 15, pag. 515–522

Sabine Schulte im Walde, Claudia Dohle, Patricia Schott-Ohly, Helga Gleichmann, 2002, Molecular target structures in alloxan-induced diabetes in mice, Life Sciences nr.71 pag. 1681–1694

Saikat Sen, Raja Chakraborty, C. Sridhar, Y. S. R. Reddy, Biplab De, 2010, FREE RADICALS, ANTIOXIDANTS, DISEASES AND PHYTOMEDICINES: CURRENT STATUS AND FUTURE PROSPECT, International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, vol. 3, pag. 91-100

Sara P. Deakin, Richard W. James, 2004, Genetic and environmental factors modulating serum concentrations and activities of the antioxidant enzyme paraoxonase-1, Clinical Science nr. 107, pag.435–447

Schmidt-Ullrich RK, Dent P, Grant S, Mikkelsen RB, Valerie K, 2000, Signal transduction and cellular radiation responses, Radiat Res., nr. 153, pag. 245-257

Sebastian Mueller, Hans-Dieter Riedel, Wolfgang Stremmel, 1997, Direct Evidence for Catalase as the Predominant H2O2 -Removing Enzyme in Human Erythrocytes, Blood, Vol. 90, Nr. 12, pag. 4973-4978

Sébastien Talbot, Jenny Pena Dias, Karim Lahjouji, Maurício Reis Bogo, Maria Martha Campos,Pierrette Gaudreau, Réjean Couture, 2012, Activation of TRPV1 by capsaicin induces functional Kinin B1 receptor in rat spinal cord, Journal of Neuroinflammation, nr.9, pag.1-14

Shilpee Jain , Thomas J. Webster , Ashutosh Sharma , Bikramjit Basu, 20013, Intracellular reactive oxidative stress, cell proliferation and apoptosis of Schwann cells on carbon nanofibrous substrates, Biomaterials, nr. 34, pag. 4891-4901

Shiv Kumar, 2011, Free Radicals and Antioxidants: Human and Food System, Advances in Applied Science Research, vol. 2, pag. 129-135

Shuangsong Hong, Laura Agresta, Chunfang Guo and John W. Wiley, 2008, The TRPV1 receptor is associated with preferential stress in large dorsal root ganglion neurons in early diabetic sensory neuropathy, Journal of Neurochemistry, nr. 105, pag. 1212–1222

Sibel Suzen, 2006, Reactive oxygen/nitrogen species and oxidative stress, available online at. http://kisisel.ankara.edu.tr/pharmacy.ankara.edu.tr/sibel/antiox.htm

Silva J., Andreia C. Gomes, Olga P. Coutinho, 2008, Oxidative DNA damage protection and repair by polyphenolic compounds in PC12 cells, European Journal of Pharmacology, nr. 28, pag. 50-60

Sima A., Sugimoto K., 1999, Experimental diabetic neuropathy: an update, Diabetologia, nr. 42, pag. 773-788

Simon P. WOLFF, Roger T. DEAN, 1987, Glucose autoxidation and protein modification The potential role of 'autoxidative glycosylation' in diabetes, Biochem. J. nr. 245, pag. 243-250

Soroku Yagihashi, Shin-Ichiro Yamagishi, Ryu-ichi Wada, Masayuki Baba, Thomas C. Hohman, Chihiro Yabe-Nishimura, Yaso Kokai, Neuropaty in diabetic mice overexpressing human aldose reductase and effects of aldose reductase inhibitor, 2001, Brain, Nr. 124, pag. 2448-2458

Sperelakis N, 1997, Cell Physiology: Source Book. Academic Press, USA

Srinivasa T. Reddy, David J. Wadleigh, Victor Grijalva, Carey Ng, Susan Hama, 2001, Srinivasa T. Reddy, David J. Wadleigh, Victor Grijalva, Carey Ng, Susan Hama, Aditya Gangopadhyay, Diana M. Shih, Aldons J. Lusis, Mohamad Navab, Alan M. Fogelman, Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, nr. 21, pag. 542-547

Stefan L. Marklund, 1984, Extracellular Superoxide Dismutase in Human Tissues and Human Cell Lines, J. Clin. Invest., Vol. 74, pag. 1398-1403

Stephen R. Thom, 2009, Oxidative stress is fundamental to hyperbaric oxygen therapy, Journal of Applied Physiology, nr. 106, pag. 988–995 doi:10.1152/japplphysiol.91004.2008

Strålin P, Karlsson K, Johansson BO, Marklund SL, 1995, The interstitium of the human arterial wall contains very large amounts of extracellular superoxide dismutase. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, nr. 15, pag. 2032-2036

Străuț Dan, 2014, Consumul de carne pe cap de locuitor: 58 de kilograme pe an. Ce sortimente preferă românii și cât ar câștiga dacă TVA ar scădea la 5%, Adevarul, pag. 21-22

Takeshi Nishikawa, Diane Edelstein, Xue Liang Du, Sho-ichi Yamagishi, Takeshi Matsumura, Yasufumi Kaneda, Mark A. Yorek, David Beebek, Peter J. Oatesk, Hans-Peter Hammes, Ida Giardino, Michael Brownlee, 2000, Normalizing mitochondrial superoxide production blocks three pathways of hyperglycaemic damage, NATURE, Vol. 404, pag. 787-790

Tatiana E. Itina, Leonid V. Zhigilei, Barbara J. Garrison, 2001, Matrix-asisted pulsed laser evaporation of polimeric materials: a molecular dynamics study, Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, nr. 180, pag. 238-244

Tedgui A., Mallat Z., 2006, Cytokines in Atherosclerosis: Pathogenic and Regulatory Pathways, Physiol Rev, nr. 86, pag. 515–581

Terry L Riss, Richard A Moravec, Andrew L Niles, Helene A Benink, Tracy J Worzella, Lisa Minor, Cell Viability Assays, available online at. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144065/

Thangavel Samikkannu, Chien-Hung Chen, Ling-Huei Yih, Alexander S. S. Wang, Shu-Yu Lin, Tsen-Chien Chen, and Kun-Yan Jan, 2003, Reactive Oxygen Species Are Involved in Arsenic Trioxide Inhibition of Pyruvate Dehydrogenase Activity, Chem. Res. Toxicol., nr. 16, pag. 409-414

Thomas E. DeCoursey, Deri Morgan, Vladimir V. Cherny, 2002, The gp91 phox Component of NADPH Oxidase Is Not a Voltage-gated Proton Channel, J Gen Physiol. Nr.120, pag.773–779.

Thomas Klein, Katrin Neuhaus, Felix Reutter, Rolf M. Nusing, 2001, Generation of 8-epi-prostaglandin F2a in isolated rat kidney glomeruli by a radical-independent mechanism, British Journal of Pharmacology, nr. 133, pag. 643 – 650

Tina Rich, Rachel L. Allen & Andrew H. Wyllie, 2000, Defying death after DNA damage, Nature, Vol. 407, pag. 777-783

Troost R., Schwedhelm E., Rojczyk S., Tsikas D., Frolich J.C., 2000, Nebivolol decreases systemic oxidative stress in healthy volunteers, J Clin Pharmacol, nr. 50, pag. 377-379

Vanderlei Folmer, Júlio C.M. Soares, J.B.T. Rocha, 2002, Oxidative stress in mice is dependent on the free glucose content of the diet, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, nr.34, pag. 1279–1285

Vicki Stone , Helinor Johnston, and Martin J. D. Clift, 2007, Air Pollution, Ultrafine and Nanoparticle Toxicology: Cellular and Molecular Interactions, IEEE TRANSACTIONS ON NANOBIOSCIENCE, Vol. 6, Nr. 4, pag. 331-340

Victor J. Thannickal, Barry L. Fanburg, 1995,Activation of an H2O2-generating NADH Oxidase in Human Lung Fibroblasts by Transforming Growth Factor b1, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 270, Nr. 51, pag. 30334–30338

Vijay Shyam Tripathi, Vivek Babu Kandimalla, Huangxian Ju, 2006, Preparation of ormosil and its applications in the immobilizing biomolecules, Sensors and Actuators, vol. 114, pag. 1071–1082

Vijayalakshmi Sridharan, Jason Guichard, Chuan-Yuan Li, Robin Muise-Helmericks, Craig Cano Beeson, and Gary L. Wright, O2-sensing signal cascade: clamping of O2 respiration, reduced ATP utilization, and inducible fumarate respiration, Am J Physiol Cell Physiol, nr. 295, pag. 29–37

Vincy W.C. Wong, Y.T. Szeto, Andrew R. Collins, Iris F.F. Benzie, 2005, THE COMET ASSAY: a biomonitoring tool for nutraceutical research, Current Topics in Nutraceutical Research Vol. 3, Nr. 1, pag. 1-14,

Vineet Pande, Maria J. Ramos, 2005, Molecular recognition of 15-deoxy-D12,14-prostaglandin J2 by nuclear factor-kappa B and other cellular proteins, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, nr. 15, pag. 4057–4063

Wei Han and K. N. Yu, 2010, Ionizing Radiation, DNA Double Strand Break and Mutation, Advances in Genetics Research. Vol. 4, pag. 1-13

Wikipedia, 2014 ,available online at. http://en.wikipedia.org/wiki/Oxidative_stress

Wikipedia, the free encyclopedia, 2014, available online at. http://en.wikipedia.org/wiki/Posterior_root_ganglion

Wikipedia,2014, Neurotensin, availeble online at. http://en.wikipedia.org/wiki/Neurotensin

Wilhelm Stahl, Helmut Sies, 2012, Oxidative Stress, available online at. http://www.uniklinik-duesseldorf.de/fileadmin/Datenpool/einrichtungen/institut_fuer_biochemie_und_molekularbiologie_i_id63/dateien/2012_Homepage-ros-10-11-16.pdf

Wulf Drödge, 2002, Free Radicals in the Physiological Control of Cell Function, Physiol Rev, nr.82, pag. 47–95

Ya-Na Wu, Dong-Hwang Chen, Xian-Yu Shi, Chiao-Ching Lian, Ting-Yu Wang, Chen-Sheng Yeh, Kyle R. Ratinac, Pall Thordarson, Filip Braet, Dar-Bin Shieh, 2011, Cancer-cell-specific cytotoxicity of non-oxidized iron elements in iron core-gold shell NPs, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, nr.7, pag. 420–427

Yan-Shun Rena, Nian-Song Qianc, Yu Tange, Yong-Hui Liaob, Yan-Ling Yangb, Ke-Feng Doub, Masakazu Toid, 2012, Sodium channel Nav1.6 is up-regulated in the dorsal root ganglia in a mouse model of type 2 diabetes, Brain Research Bulletin, nr. 87, pag. 244– 249

Yasushi Maeda, Tomomi Higuchi, Isao Ikeda, 2000, Change in Hydration State during the Coil-Globule Transition of Aqueous Solutions of Poly(N-isopropylacrylamide) as Evidenced by FTIR Spectroscopy, Langmuir, Vol. 16, Nr. 19, pag. 7503-7509

Yon Ju-Nam, Jamie R. Lead, 2008, Manufactured nanoparticles: An overview of their chemistry, interactions and potential environmental implications, S C I E N C E O F T H E T O T A L E N V I R O N M E N T, nr. 4 0 0, pag. 3 9 6 – 4 1 4

Yoshichika Kawai, Atsunori Furuhata, Shinya Toyokuni, Yasuaki Aratani, Koji Uchida, 2003, Formation of Acrolein-derived 2 -Deoxyadenosine Adduct in an Iron-induced Carcinogenesis Model, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 278, Nr. 50, pag. 50346–50354

Yoshiji Yamada, Fujiko Ando, Naoakira Niino Tetsuro Miki, Hiroshi Shimokata, 2003, Association of polymorphisms of paraoxonase 1 and 2 genes, alone or in combination, with bone mineral density in community-dwelling Japanese, J Hum Genet, nr. 48, pag.469–475

Young I.S, Woodside J.V., 2001, Antioxidants in health and disease, J Clin Patol, nr. 54, pag. 176-186

Zainal T. , RICHARD WEINDRUCH, LUKE I. SZWEDA, TERRY D. OBERLEY, 1999, LOCALIZATION OF 4-HYDROXY-2-NONENAL-MODIFIED PROTEINS IN KIDNEY FOLLOWING IRON OVERLOAD, Free Radical Biology & Medicine, Vol. 26, Nr. 9/10, pag. 1181–1193

Lista de lucrări publicate și comunicate la conferințe

Lucrari publicate si trimise la publicat:

1. Ormosils scaffolds produced by laser processing for fibroblast cell growth

A. Matei, M. Dinescu, E.C. Buruiana, T. Buruiana, I. Petcu, C. Mustaciosu

Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures Vol. 6, No 1, January-March 2011, p. 29-35

2.„Tailoring the properties of hybrid methacrylates nscaffolds produced via Two Photon Polymerization”, A. Matei, M. Zamfirescu, C. Radu, T. Buruiana, E. Buruiana, C. Mustaciosu, I. Petcu, M. Radu, A. Kiss, M. Dinescu, IEEE INTERNATIONAL CONFERENCE ON E-HEALTH AND BIOENGINEERING – EHB 2011 –proceeding indexat IEEE Xplore®, ISI-Proceedings, SCOPUS, INSPEC (IET) and EI (Engineering Information) data bases

3. “Producing ORMOSIL scaffolds by femtosecond laser polymerization”, A. Matei, M. Zamfirescu, C. Radu, E.C. Buruiana, T. Buruiana, C. Mustaciosu, I. Petcu, M. Radu, M. Dinescu, Applied Physics A,

Conferinte internationale:

1. Bleomycin and ionising radiation-induced bystander effects in two fibroblast cell lines

Diana Savu, Cosmin Mustaciosu, Sorin Bercea, Ileana Petcu

14th International Congress of Radiation Research (ICRR2011), Warsaw, Poland, August 28-September 1, 2011

2. Ormosil scaffolds processed by Two Photon Polymerization (2PP) for bio applications, A. Matei, M. Zamfirescu, M. Dinescu, E.C. Buruiana, T. Buruiana, I. Petcu, M. Radu

Simpozion P, EMRS, June 2011, Nice, Franta

3. Comparative effects of UV irradiation and chemical exposure on in vitro fibroblast cultures evaluated by comet assay

C. Mustaciosu, M. Radu, D. Savu, I.Petcu

9th International Comet Assay Workshop, Kusadası, Turkey 13 – 16 September 2011

Conferinte Nationale si Internationale in Romania – prezentari orale:

1. Tailoring the properties of hybrid methacrylates nscaffolds produced via Two Photon Polymerization, A. Matei, M. Zamfirescu, C. Radu, T. Buruiana, E. Buruiana, C. Mustaciosu, I. Petcu, M. Radu, A. Kiss, M. Dinescu, IEEE INTERNATIONAL CONFERENCE ON E-HEALTH AND BIOENGINEERING – EHB 2011 – IAȘI, ROMANIA, 24-26 Nov., 2011

2. CRESTEREA SI PROLIFERAREA CELULELOR FIBROBLASTE PE STRUCTURI POLIMERIZATE DE ORMOSILI, A. Matei, M. Zamfirescu, M. Dinescu, E.C. Buruiana, T. Buruiana, C. Mustaciosu, I. Petcu, M. Radu, ZILELE ACADEMICE IEȘENE, A XXIII-a sesiune de comunicări științifice, PROGRESE ÎN ȘTIINȚA COMPUȘILOR ORGANICI ȘI MACROMOLECULARI, 29-30 septembrie 2011

3. Polimerizarea cu doi fotoni a organo-silicatilor, A. Matei, M. Zamfirescu, M. Dinescu, E.C. Buruiana, T. Buruiana, C. Mustaciosu, I. Petcu, M. Radu, Scoala de vara „Tendinte in sinteza si caracterizarea materialelor avansate pentru aplicatii in biologie si medicina”, Centrul de Cercetari Tehnice Fundamentale si Avansate, Academia Romana, Timisoara, 27-29.07.2011

4. Bystander effects induced by ionizing radiation and bleomycin in fibroblast cell lines

Ileana Petcu, Cosmin Mustaciosu, Sorin Bercea, Diana Savu

11-th National Conference of Biophysics, Nov 10-12 2011, Sibiu, Romania

O parte din aceste rezultate au fost publicate in FEBS JOURNAL, Iunie 2008, Volumul: 275, Pagina: 366-366 Supliment: 1 cu titlu Cytotoxic effects of 2-dodecylcyclobutanone on human lymphocytes, autori : Mustaciosu Cosmin, Petcu Ileana, Savu Diana, Radu Mihai

Bibliografie

Abbott C., Mackness M., Kumar S.,Boulton A.J., Durrington P.N., 1995-Serum Paraoxonase Activity, Concentration, and Phenotype Distribution in Diabetes Mellitus and Its Relationship to Serum Lipids and Lipoproteins, Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 15: 1812-1818 doi: 10.1161/01.ATV.15.11.1812

AFM: Beginner's Guide, 2014, available online at.http://www.afmhelp.com/index.php?option=com_content&view=article&id=51&Itemid=57

Aftin M. Ross, Zhongxiang Jiang, Martin Bastmeyer, Joerg Lahann, 2011, Physical Aspects of Cell Culture Substrates: Topography, Roughness, and Elasticity,, Vol. 8, pag. 336–355,"

Aguilar M., C. Elvira, A. Gallardo, B. Vázquez, and J.S. Román, 2007, Smart Polymers and Their Applications as Biomaterials, Topics in Tissue Engineering, Vol. 3, pag. 1-27

Alexsandro da Silva Haeser, Angela Sitta, Alethéa Gatto Barschak, Marion Deon, Amanda Thomas Barden, Graziela Oliveira Schmitt, Sharon Landgraff, Rosane Gomeze, Helena M.T. Barrose, Carmen Regla Vargasa, 2007, Oxidative stress parameters in diabetic rats submitted to forced swimming test: the clonazepam effect, Brain Research, nr. 1154 pag. 137–143

Ali R. MANI, Ananth S. PANNALA, Nelson N. ORIE, Richard OLLOSSON, David HARRY, Catherine A. RICE-EVANS, Kevin P. MOORE, 2003, Nitration of endogenous para-hydroxyphenylacetic acid and the metabolism of nitrotyrosine, Biochem. Journal,nr. 374, pag. 521–527

Alison Goldin, Joshua A. Beckman, Ann Marie Schmidt and Mark A. Creager, 2006, Advanced Glycation End Products Sparking the Development of Diabetic Vascular Injury, Circulation, nr, 114, pag. 597-605

Allen R., Balin A.,1989, Oxidative influence on development and differentiation: an overview of a free radical theory of development, Free Radic Biol Med. Nr. 6, pag. 631-661.

Allison W. Dobson, Yi Xu, Mark R. Kelley, Susan P. LeDoux, Glenn L. Wilson, 2000, Enhanced Mitochondrial DNA Repair and Cellular Survival after Oxidative Stress by Targeting the Human 8-Oxoguanine Glycosylase Repair Enzyme to Mitochondria, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 275, Nr. 48, pag. 37518–37523

Amruta Manke, Liying Wang, Yon Rojanasakul, 2013, Mechanisms of Nanoparticle-Induced Oxidative Stress and Toxicity, BioMed Research International, pag. 1-15

Andre Nel, Tian Xia, Lutz Madler, Ning Li, 2006, Toxic Potential of Materials at the Nanolevel, Science, nr. 311, pag. 622-627

Andrew D. Maynard, Paul A. Baron, Michael Foley, Anna A. Shvedova, Elena R. Kisin, Vincent Castranova, 2004, EXPOSURE TO CARBON NANOTUBE MATERIAL: AEROSOL RELEASE DURING THE HANDLING OF UNREFINED SINGLEWALLED CARBON NANOTUBE MATERIAL, Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A, nr.67, pag.87–107, DOI: 10.1080/15287390490253688

Anna A. Shvedova, Antonio Pietroiusti, Bengt Fadeel, Valerian E. Kagan, 2012, Mechanisms of carbon nanotube-induced toxicity: Focus on oxidative stress, Toxicology and Applied Pharmacology, nr.261, pag.121–133

Anne Bouloumié, Johann Bauersachs, Wolfgang Linz, Bernward A. Schölkens, Gabriele Wiemer, Ingrid Fleming, Rudi Busse, Hypertension. Nr. 30, pag. 934-941

Annette Salmeen and David Barford, 2005, Functions and Mechanisms of Redox Regulation of Cysteine-Based Phosphatases, Antioxidants & Redox Signaling, nr. 7, pag. 560-577

Annie Hiniker, James C.A. Bardwell, 2004, TRENDS in Biochemical Sciences, Vol.29, Nr.10, pag. 516-519

Antonio Ceriello, 2009, Hypothesis: the “metabolic memory”, the new challenge of diabetes,D iabetes Research and clinical Practice, nr. 86, pag. 2-6

"Arne Klungland, Matthias Hoss, Daniela Gunz, Angelos Constantinou, Stuart G. Clarkson, Paul W. Doetsch, Philip H. Bolton, Richard D. Wood, Tomas Lindahl, 1999, Base Excision Repair of Oxidative DNA Damage Activated by XPG Protein, Molecular Cell, Vol. 3, pag. 33–42"

"Arvind Panday, Malaya K Sahoo, Diana Osorio, Sanjay Batra, 2014, NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies, Cellular & Molecular Immunology, nr. 12, pag. 5–23

Aviram M., Rosenblat M., 2004, Paraoxonases 1, 2, and 3, oxidative stress, and macrophage foam cell formation during atherosclerosis development, Free Radic Biol Med., nr. 37, pag. 1304-1316

Ayman Samir Farid, Yoichiro Horii, 2012, Modulation of paraoxonases during infectious diseases and its potential impact on atherosclerosis, Lipids Health Dis. Nr.11, doi: 10.1186/1476-511X-11-92

Aysun Hacisevki, 2009, AN OVERVIEW OF ASCORBIC ACID BIOCHEMISTRY Ankara Ecz. Fak. Derg., nr. 38, pag. 233-255

Bagchi, S. Puri, 1998, Free radicals and antioxidants in health and disease, La Revue de Sante de la Mediterranee orientale, vol. 4, nr. 2, pag. 350-360

Bahorun T., MA Soobrattee, V Luximon-Ramma, OI Aruoma, 2006, Free Radicals and Antioxidants in Cardiovascular Health and Disease, Internet Journal of Medical Update, nr.1, pag. 25-41.

Baoling Wang , Lili Hu, 2006, Optical and surface properties of hybrid TiO2/ormosil planar waveguide prepared by the sol–gel process, Ceramics International, nr. 32, pag. 7–12

Barbara S. Berlett and Earl R. Stadtman, 1997, Protein Oxidation in Aging, Disease, and Oxidative Stress, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 272, Nr. 33, pag. 20313–20316"

Barbara S. Berlett and Earl R. Stadtman, 1999, Protein Oxidation in Aging, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 272, Nr. 33, pag. 20313–20316

"Barry Halliwell, 2001, Free Radicals and other reactive species in Disease, ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES, DOI: 10.1038/npg.els.0003913

Benoît D’Autréaux, Michel B. Toledano, 2007, ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis, Nat Rev Mol Cell Biol., Nr. 8, pag.813-24

Bergendi, L., Benes, L., Durackova, Z., Ferencik, M., 1999. Chemistry, physiology and pathology of free radicals. Life Sci., nr. 65, pag. 1865–1874

Beta Particles, 2013, available online at. http://www.epa.gov/radiation/understand/beta.html

Biomarkers of Oxidative Stress, available online at. http://pvac.vscht.cz/pvac/en/research-projects/biomarkers-oxidative-stress

Boon Chin Heng, Xinxin Zhao, Sijing Xiong, Kee Woei Ng, Freddy Yin-Chiang Boey, Joachim Say-Chye Loo, 2011, Cytotoxicity of zinc oxide (ZnO) nanoparticles is in Xuenced by cell density and culture format, Arch Toxicol, pag. 85, pag. 695–704"

Britton Chance, B. Schoener, Reiko Oshino, Fanny Itshak, Yuzo Nakase, 1978, Oxidation-Reduction Ratio Studies of Mitochondria in Freeze-trapped Samples, NADH AND FLAVOPROTEIN FLUORESCENCE SIGNALS, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 254, Nr. 11, pag. 4764-4771

Britton Chance, Helmut Sies, Alberto Boveris, 1979, Hydroperoxide Metabolism in Mammalian Organs, PHYSIOLOGICAL REVIEWS Vol. 59, Nr. 3, pag. 527-605

Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter., 2002, Garland Science, ISBN-10: 0-8153-4072-9

BRUCE N. AMES, RICHARD CATHCART, ELIZABETH SCHWIERS, PAUL HOCHSTEIN, 1981,Uric acid provides an antioxidant defense in humans against oxidant- and radical-caused aging and cancer: A hypothesis, Proc. NatL Acad. Sci. USA Vol. 78, Nr. 11, p. 6858-6862,"

Bryan C dickinson, Christopher J Chang, 2012, Chemistry and biology of reactive oxygen species in signaling, Nat Chem Biol. Nr. 7, pag. 504–511.

Bücker A., M.S. Carvalho, M.B. Conceiçao & J.A. Alves-Gomes, 2010, Micronucleus test and comet assay in erythrocytes of the Amazonian electric fish Apteronotus bonapartii exposed to benzene, J. Braz. Soc. Ecotoxicol., vol. 7, nr. 1, pag. 65-73

Buzea Cristina, Ivan I. Pacheco, Kevin Robbie, 2007, Nanomaterials and nanoparticles: Sources and toxicity, Biointerphases, Vol. 2, Nr. 4, pag. 18-71

Cadenas E. Biochemistry of Oxygen Toxicity, 1989, Annual Review of Biochemistry Vol. 58, pag. 79-110, DOI: 10.1146/annurev.bi.58.070189.000455

Cameron N., M.A.Cotter, A.M. Jack, M.D.Basso, T.C.Hohman, 1999, Protein kinase C effects on nerve function, perfusion, Na+,K+-ATPase activity and glutathione content in diabetic rats, Diabetologia, nr. 42, pag. 1120-1130

Carey J. Ng, David J. Wadleigh, Aditya Gangopadhyay, Susan Hama, Victor R. Grijalva, Mohamad Navab, Alan M., 2001, Paraoxonase-2 Is a Ubiquitously Expressed, Protein with Antioxidant Properties and Is Capable of Preventing Cell-mediated Oxidative Modification of Low Density Lipoprotein, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 276, Nr. 48, pag. 44444–44449,

Carey J. Ng, Noam Bourquard, Victor Grijalva, Susan Hama, Diana M. Shih,Mohamad Navab, Alan M. Fogelman, Aldons J. Lusis, Stephen Young, Srinivasa T. Reddy, 2006, Paraoxonase-2 Deficiency Aggravates Atherosclerosis in Mice Despite Lower Apolipoprotein-B-containing Lipoproteins, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 281, Nr. 40, pag. 29491–29500

Carnegie JA1, Cabaca O., 1993, Extracellular matrix composition and resilience: two parameters that influence the in vitro migration and morphology of rat inner cell mass-derived cells., Biol Reprod., nr.48, pag.287-299

Carolyn R. Hoyal, Abel Gutierrez, Brandon M. Young, Sergio D. Catz, Jun-Hsiang Lin, Philip N. Tsichlis, Bernard M. Babior, 2003, Proc Natl Acad Sci U S A., nr. 100, pag. 5130-5135

Cathy Tournier, Chen Dong, Tod K. Turner, Stephen N. Jones, Richard A. Flavell, 2001, MKK7 is an essential component of the JNK signal transduction pathway activated by proinflammatory cytokines GENES & DEVELOPMENT nr.15, pag. 1419–1426

Cell Line Authentication & Quality Control Information, available online at. http://www.phe-culturecollections.org.uk/products/celllines/generalcell/detail.jsp?refId=85103115&collection=ecacc_gc

CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, 2012, available online at. https://www.promega.ro/resources/protocols/technical-bulletins/0/celltiter-96-aqueous-one-solution-cell-proliferation-assay-system-protocol/

CESAR G. FRAGA, MARK K. SHIGENAGA, JEEN-WOO PARK, PAOLO DEGAN, AND BRUCE N. AMES, 1990, Oxidative damage to DNA during aging: 8-Hydroxy-2'-deoxyguanosine in rat organ DNA and urine, Proc. Nadl. Acad. Sci. USA Vol. 87, pag. 4533-4537,

Charles B. Glaser, John Morser,t Jeffrey H. Clarke, Eric Blasko, Kirk McLean, Irene Kuhn,I Ray-Jen Chang, Jiing-Huey Lin, Laura Vilander, William H. Andrews, David R. Light, 1992, Oxidation of a Specific Methionine in Thrombomodulin by Activated Neutrophil Products Blocks Cofactor Activity A Potential Rapid Mechanism for Modulation of Coagulation, J. Clin. Invest., Nr. 90, pag. 2565-2573

Ching-You Lu, Cheng-Feng Lee, Yi-Shing Ma, Chun-Yi Liu, Chia-Yu Wei, Yin-Chiu Chen, Shi-Bei Wu, and Yau-Huei Wei, 2006, Oxidative Stress and Mitochondrial Disease, Oxidative Stress, Disease and Cancer: pag. 649-672. doi: 10.1142/9781860948046_0021 "

Chiper D., VALERIA LUNGU, CATALINA BARNA, LIDIA MATEI, MIHAI RADU, GEORGE BUBUEANU, AND CRISTIAN POSTOLACHE, 2010, BIOAFFINITY OF RADIOLABELLED NEUROTENSIN AGONIST AND ANTAGONIST TO NEUROTENSIN RECEPTORS, J. Label Compd. Radiopharm, nr. 53, pag. 406–489"

Chiquet M, Matthisson M, Koch M, Tannheimer M, Chiquet-Ehrismann R., 1996, Regulation of extracellular matrix synthesis by mechanical stress. Biochem Cell Biol, nr.74, pag:737-744

Choquet D, Felsenfeld DP, Sheetz MP., 1997, Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages, Cell., Nr. 10, pag.39-48.

Christopher S. Chen, Milan Mrksich, Sui Huang, George M. Whitesides, Donald E. Ingber, 1997, Geometric Control of Cell Life and Death, SCIENCE, Vol. 276, pag. 1425-1428

CHUN-YI LIU, CHENG-FENG LEE, CHIUNG-HUI HONG, YAU-HUEI WEI, 2004, Mitochondrial DNA Mutation and Depletion Increase the Susceptibility of Human Cells to Apoptosis, ANNALS NEW YORK ACADEMY OF SCIENCES, nr. 1011, pag.133–145, doi: 10.1196/annals.1293.014

Coggle J.E. ,1983, Biological effects of radiation, Taylor & Francis, pag. 1-247

Collins A., 2004, The Comet Assay for DNA Damage and Repair Principles, Applications, and Limitations, MOLECULAR BIOTECHNOLOGY Vol. 26, pag. 249-261

CONSUELO BORRAS, JUAN SASTRE, DAVID GARCIA-SALA, ANA LLORET, FEDERICO V. PALLARDO, JOSE VINA, 2003, MITOCHONDRIA FROM FEMALES EXHIBIT HIGHER ANTIOXIDANT GENE EXPRESSION AND LOWER OXIDATIVE DAMAGE THAN MALES, Free Radical Biology & Medicine, Vol. 34, Nr. 5, pag. 546–552,

Cory Hanley, Janet Layne, Alex Punnoose, K M Reddy, Isaac Coombs, Andrew Coombs, Kevin Feris, and Denise Wingett, 2008, Preferential killing of cancer cells and activated human T cells using ZnO nanoparticles, Nanotechnology, nr. 19, pag. 1-20, doi:10.1088/0957-4484/19/29/295103.

Crivineanu M., Durdun C., Nicorescu I., 2009, Antioxidant Activity of Some Polyphenolic Extracts Obtained from Plants with Antitumoral Potential on Linoleic Acid Emulsion, Bulletin USAMV, Veterinary Medicine 66(1)

Daniel Arcos, María Vallet-Regí, 2010, Sol–gel silica-based biomaterials and bone tissue regeneration, Acta Biomaterialia, nr.6, pag. 2874–2888

Danilo Fliser, Kathrin-Kristin Wagner, Astrid Loos, Dimitrios Tsikas, Hermann Haller, 2005, Chronic Angiotensin II Receptor Blockade Reduces (Intra)Renal Vascular Resistance in Patients with Type 2 Diabetes, J Am Soc Nephrol nr.16 pag. 1135-1140

David J. Kusner, Clifton E Hall, Larry S. Schlesinger, 1996, Activation of Phospholipase D Is Tightly Coupled to the Phagocytosis of Mycobacterium tuberculosis or Opsonized Zymosan by Human Macrophages, J. Exp. Med. Vol. 184, pag. 585-595"

Defeng Wu, Arthur I. Cederbaum, 1996, Ethanol Cytotoxicity to a Transfected HepG2 Cell Line Expressing Human Cytochrome P4502E1, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 271, Nr. 39, pag. 23914–23919"

Dent P, Yacoub A, Contessa J, Caron R, Amorino G, Valerie K, Hagan MP, Grant S, Schmidt-Ullrich R., 2003, Stress and radiation-induced activation of multiple intracellular signaling pathways, Radiat Res., nr. 159, pag. 283-300"

Dharambir K. Sanghera, Christopher E. Aston, Nilmani Saha, M. Ilyas Kamboh, 1998, DNA Polymorphisms in Two Paraoxonase Genes (PON1 and PON2) Are Associated with the Risk of Coronary Heart Disease, Am. J. Hum. Genet., Nr. 62, pag. 36–44,

Diffey B. L., 1991, Solar ultraviolet radiation effects on biological systems, Review in Physics in Medicine and Biology, nr. 36, pag. 299-328.

Dohi Y., Thiel M., F R Bühler and T F Lüscher, 1990, Activation of Endothelial L-Arginine Pathway in Resistance Arteries Effect of Age and Hypertension, Hypertension, nr. 16, pag. 170-179

Dorota Napierska, Leen CJ Thomassen, Dominique Lison, Johan A Martens, Peter H Hoet, 2010, The nanosilica hazard: another variable entity, Particle and Fibre Toxicology, nr.7, pag. 1-32

Douglas C. Wallace, 2010, A Mitochondrial Paradigm of Metabolic and Degenerative Diseases, Aging, and Cancer: A Dawn for Evolutionary Medicine, Annu Rev Genet. Nr. 39, doi: 10.1146/annurev.genet.39.110304.095751

Draganov D.I., La Du B.N., 2004, Pharmacogenetics of paraoxonases: a brief review, Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol, nr.369, pag. 78–88

Dragomir I. Draganov, John F. Teiber, Audrey Speelman, Yoichi Osawa, Roger Sunahara, Bert N. La Du, 2005, Journal of Lipid Research Vol. 46,

Dragomir I. Draganov, Philip L. Stetson, Catherine E. Watson, Scott S. Billecke, Bert N. La Du, 2000, Rabbit Serum Paraoxonase 3 (PON3) Is a High Density Lipoprotein-associated Lactonase and Protects Low Density Lipoprotein against Oxidation, J. Biol. Chem. nr.275, pag.33435-33442.

Durrington P.N., Mackness B., Mackness M.I., 2001, Paraoxonase and Atherosclerosis, Arterioscler Thromb Vasc Biol. Vol.21, pag.473-480

Earl R. Stadtman,2004, Role of Oxidant Species in Aging, Current Medicinal Chemistry, nr. 11, pag. 1105-1112

"Edwin A. Clark and Joan S. Brugget, 1995, Integrins and Signal Transduction Pathways: The Road Taken, SCIENCE, Vol. 268, pag. 233-239

Emilia Izak-Nau, Matthias Voetz, Stefanie Eiden, Albert Duschl, Victor F Puntes, 2013, Altered characteristics of silica nanoparticles in bovine and human serum: the importance of nanomaterial characterization prior to its toxicological evaluation, Particle and Fibre Toxicology, nr. 10, pag. 1-12

Eriberto Bressan , Luca Sbricoli , Riccardo Guazzo , Ilaria Tocco , Marco Roman , Vincenzo Vindigni , Edoardo Stellini , Chiara Gardin , Letizia Ferroni , Stefano Sivolella , Barbara Zavan, 2013, Nanostructured Surfaces of Dental Implants, Int. J. Mol. Sci., nr. 14, pag. 1918-1931; doi:10.3390/ijms14011918

Eric A. Schon, Giovanni Manfredi, 2003, Neuronal degeneration and mitochondrial dysfunction, The Journal of Clinical Investigation, nr. 111, pag.303–312, doi:10.1172/JCI17741.

Erkki Ruoslahti, 1997, Stretching Is Good for a Cell, Science, Vol. 276 no. 5317 p. 1345

Ernst S. Henle, Stuart Linn, 1997, Formation, Prevention, and Repair of DNA Damage by Iron/Hydrogen Peroxide, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 272, Nr. 31, pag. 19095–19098

Evaluation of the Significance of 2-Dodecylcyclobutanone and other Alkylcyclobutanones, 2013, available online at. http://www.hc-sc.gc.ca/fn-an/securit/irridation/cyclobutanone-eng.php

Fabienne Poncin-Epaillard, Tjasa Vrlinic, Dominique Debarnot, Miran Mozetic, Arnaud Coudreuse, Gilbert Legeay, Benaïssa El Moualij, Willy Zorzi, 2012, Surface Treatment of Polymeric Materials Controlling the Adhesion of Biomolecules, Journal of Functional Biomaterials, nr. 3, pag. 528-543; doi:10.3390/jfb3030528

Fang X., Fernando Q., 1995,Stereoisomeric selectivity of 2,3-dimer-captosuccinic acids in chelation therapy for lead poisoning.Chem. Res. Toxicol., nr. 8, pag. 525-536

FARAJ HIJAZ, TEJ B. SHRESTHA, STEFAN H. BOSSMAN, FARIS HUSSAIN, AND J. SCOTT SMITH, 2010, In Vitro and In Vivo Metabolism of the Radiolytic Compound 2-Dodecylcyclobutanone, JOURNAL OF FOOD SCIENCE, Vol. 75, Nr. 4, pag. 72-80"

Federico Rosei, 2004, Nanostructured surfaces: challenges and frontiers in nanotechnology, JOURNAL OF PHYSICS: CONDENSED MATTER, nr.16, pag. 1373-1436

Fenech Michael, 2007,Cytokinesis-block micronucleus cytome assay, Nature Protocols, Vol. 2, Nr. 5, pag. 1084-1104

Flemming R., Murphy C., Abrams G., Goodman S., Nealey P.,1999, Efects of synthetic micro- and nano-structured surfaces on cell behavior, Biomaterials, nr. 20, pag. 573-588

Frank M. Faraci, Sean P. Didion, 2004, Vascular Protection: Superoxide Dismutase Isoforms in the Vessel Wall,Arterioscler Thromb Vasc Biol. Nr.24, pag. 1367-1373

Frederick A. Villamena, 2013, Molecular Basis of Oxidative Stress: Chemistry, Mechanisms, and Disease Pathogenesis, Wiley, 446 pag.

Geir Slupphaug, Bodil Kavli, Hans E. Krokan, 2003, The interacting pathways for prevention and repair of oxidative DNA damage, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 531, Pag. 231–251

Ghițulică C., 2014, Caiet de Laborator Știința materialelor Universitatea POLITEHNICA din București Facultatea de Chimie Aplicată și Știința Materialelor Catedra Știința și Ingineria Materialelor Oxidice și Nanomateriale bioceramice

Gian Franco Gaetani, Silvana Galiano, Letizia Canepa, Anna Maria Ferraris, Henry Neil Kirkman, 1989, Catalase and Glutathione Peroxidase Are Equally Active in Detoxification of Hydrogen Peroxide in Human Erythrocytes, Blood, nr. 73, pag. 334-339

Giovanni Palmisano, Eric Le Bourhis, Rosaria Ciriminna, Davide Tranchida, Mario Pagliaro, 2006, ORMOSIL Thin Films: Tuning Mechanical Properties via a Nanochemistry Approach, Langmuir, vol. 22, pag. 11158-11162"

Gladys Block, Marion Dietrich, Edward P. Norkus, Jason D. Morrow, Mark Hudes, Bette Caan, and Lester Packer, 2002, Factors Associated with Oxidative Stress in Human Populations, American Journal of Epidemiology, Vol. 156, Nr. 3, pag. 274-285

Gordon D.J.,Probstfield J.L., Garrison R.J., Neaton J.D., Castelli W.P., Knoke J.D., Jacobs D.R., Bangdiwala S., Tyroler H.A., 1989, High-density lipoprotein cholesterol and cardiovascular disease. Four prospective American studies, Circulation, nr. 79, pag. 8-15

Gordon Reid, Alexandru Babes and Florentina Pluteanu, 2002, A cold- and menthol-activated current in rat dorsal root ganglion neurones: properties and role in cold transduction, Journal of Physiology, nr. 545, pag. 595–614"

Gutteridge M. C., Rowley D. A., Halliwell Barry, 1981, Detection of 'free' iron in biological systems by using bleomycin-dependent degradation of DNA, Biochem. J., nr. 199, pag.263-265

Halestrap A., E. Doran, J. P. Gillespie, A. O'Toole, 2000, Mitochondria and cell death, Biochemical Society Transactions (2000) Vol. 28, partea 2, pag. 170-177

Halliwell B, Gutteridge JM., 1995, The definition and measurement of antioxidants in biological systems, Free Radic Biol Med. Nr. 18, pag. 125–126

Halliwell B., 1989, Free radicals, reactive oxygen species and human disease: a critical evaluation with special reference to atherosclerosis, Br J Exp Pathol. Nr. 70, pag. 737–757.

Halliwell Barry and Gutteridge John , 2007, Free Radicals in Biology and Medicine, Fourth Edition

Halliwell Barry , 1989, Free radicals, reactive oxygen species and human disease: a critical evaluation with special reference to atherosclerosis, Br. J. Exp. Path., nr. 70, pag. 737-757

Halliwell Barry, 2000, Why and how should we measure oxidative DNA damage in nutritional studies? How far have we come?, Am. J. Clin. Nutr. Nr.72 pag.1082–1087.

Halliwell Barry, Whiteman Matthew, 2004, Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean?, British Journal of Pharmacology, nr. 142, pag. 231–255"

Harris C. Curtis, p53 Tumor Suppresor Gene: At the Crossroads of Molecular Carcinogenesis, Molecular Epidemiology, and Cancer Risk Assessment, Environmental Health Perspectives, Vol. 104, pag. 53

Hartmann A., E.Agurell2, C.Beevers3, S.Brendler-Schwaab4, B.Burlinson5, P.Clay6, A.Collins7, A.Smith, G.Speit, V.Thybaud and R.R.Tice, 2003, Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay, Mutagenesis vol.18 nr.1 pag. 45–51

Harvey Lodish, Arnold Berk, S Lawrence Zipursky, Paul Matsudaira, David Baltimore, and James Darnell., 2000, Molecular Cell Biology, 4th edition, New York: W. H. Freeman, ISBN-10: 0-7167-3136-3

Helen Lundqvist, Per Follin, Laila Khalfan, Claes Dahlgren, 1996, Phorbol myristate acetate-induced NADPH oxidase activity in human neutrophils: only half the story has been told, Journal of Leukocyte Biology Vol. 59, pag. 270-279."

Helmut Sies, 1997, Oxidative Stress: Oxidants and Antioxidants, Experimental Physiology, nr. 82, pag. 291-295

Helmut Sies, 2009, Oxidative Stress: an Introduction, available online at. http://www.frag-chile.cl/documentos/H_Sies_Free_Radical_School_Chile-2009.pdf

Hideyuki J. Majima, Hiroko P. Indo, Kazuo Tomita, Shigeaki Suenaga, Shigeatsu Motoori, Hirotoshi Kato, Hsiu-Chuan Yen, and Toshihiko Ozawa, 2006, Intracellular Oxidative Stress Caused by Ionizing Radiation, Oxidative Stress, Disease and Cancer, pag. 61-83.

Hiroshi Kasai and Susumu Nishimura, 1984, Hydroxylation of deoxyguanosine at the C-8 position by ascorbic acid and other reducing agents, Nucleic Acids Research, Vol. 12, Nr. 4, pag. 2137-2145

Hockenbery DM, Oltvai ZN, Yin XM, Milliman CL, Korsmeyer SJ., 1993, Bcl-2 functions in an antioxidant pathway to prevent apoptosis, CellPress, nr. 75,

Hong-Bo Sun, Satoshi Kawata, 2004, Two-Photon Photopolymerization and 3D Lithographic Microfabrication, Apvances in Polymer Science, Vol. 170, pag. 169-273

Hui Wang , Qing H. Meng , John R. Gordon , Hasnain Khandwala, Lingyun Wu, 2007, Proinflammatory and proapoptotic effects of methylglyoxal on neutrophils from patients with type 2 diabetes mellitus, Clinical Biochemistry, nr. 40, pag. 1232–1239

Iles K.E., Forman H.J., 2002, Macrophage signaling and respiratory burst, Immunol Res. Nr.26, pag. 95-105

Ilias G., Kirkinezosa and Carlos T. Moraesa, 2001, Reactive oxygen species and mitochondrial diseases, CELL & DEVELOPMENTAL BIOLOGY, Vol. 12, pag. 449–457

Ilka B. Bischofs, Franziska Klein, Dirk Lehnert, Martin Bastmeyer, and Ulrich S. Schwarz, 2008, Filamentous Network Mechanics and Active Contractility Determine Cell and Tissue Shape, Biophysical Journal Vol. 95, pag. 3488–3496

Introduction to Phase Contrast Microscopy, available online at. http://www.microscopyu.com/articles/phasecontrast/phasemicroscopy.html

Isabella Dalle-Donne, Ranieri Rossi, Roberto Colombo, Daniela Giustarini, Aldo Milzani, 2006, Biomarkers of Oxidative Damage in Human Disease, Clinical Chemistry, nr.52, pag. 601–623

Isabella Dalle-Donne, Ranieri Rossib, Daniela Giustarinib, Aldo Milzania, Roberto Colombo, 2003, Protein carbonyl groups as biomarkers of oxidative stress, Clinica Chimica Acta nr. 329, pag. 23–38

Isabella Dalle-Donnea, Ranieri Rossib, Daniela Giustarinib, Aldo Milzania, Roberto Colombo, 2003, Protein carbonyl groups as biomarkers of oxidative stress, Clinica Chimica Acta nr. 329, pag. 23–38

Ito A., 1988, Electron track simulation for microdosometry, Plenum Publishers, pag. 361–382.

JA Badwey, AI Tauber and ML Karnovsky, 1983,Properties of NADH-cytochrome-b5 reductase from human neutrophils, Blood (print ISSN 0006-4971, online ISSN 1528-0020), nr. 62, pag.152-157

Jacek Piątek, Paweł Maćkowiak, Hanna Krauss, Dorota Nowak, Paweł Bogdański, 2011, In vivo investigations of neurotensin receptors in adipocytes, hepatocytes and enterocytes of rat, Annals of Agricultural and Environmental Medicine, Vol 18, Nr. 2, pag. 433-436

Jayasree Basivireddy, Anju Vasudevan, Molly Jacob, Kunissery A. Balasubramanian, 2002, Indometacin-induced mitochondrial dysfunction and oxidative stress in villus enterocytes, Biochemical Pharmacology, nr. 64, pag. 339-349

Jeney Viktoria, Shinichi Itoh, Maria Wendt, Quinton Gradek, Masuko Ushio-Fukai,David G. Harrison, Tohru Fukai, 2005, Role of Antioxidant-1 in Extracellular Superoxide Dismutase Function and Expression, Circulation Research, nr.96, pag. 723-729

Ji-Feng WANG, Pavel KOMAROV, Helmut SIES and Herbert DE GROOT, 1991, Contribution of nitric oxide synthase to luminol-dependent chemiluminescence generated by phorbol-ester-activated Kupffer cells, Biochem. J., nr. 279, 311-314"

Jing Sun, Yunfei Pu, Peijian Wang, Sijiao Chen, Yu Zhao, Chan Liu, Qianhui Shang, Zhiming Zhu, Daoyan Liu, 2013, TRPV1-mediated UCP2 upregulation ameliorates hyperglycemia-induced endothelial dysfunction, Cardiovascular Diabetology, nr.12, pag. 1-14

JIN-YAO MO, HISAJI MAKI, MUTSUO SEKIGUCHI, 1992, Hydrolytic elimination of a mutagenic nucleotide, 8-oxodGTP, by human 18-kilodalton protein: Sanitization of nucleotide pool, Proc. Nati. Acad. Sci. USA Vol. 89, pag. 11021-11025"

John F. Keaney, 2005, Oxidative Stress and the Vascular Wall NADPH Oxidases Take Center Stage, Circulation, nr.112, pag.2585-2588

John W. Baynes, Suzanne R. Thorpe, 2000, Glycoxidation and lipoxidation in atherogenesis, Free Radical Biology & Medicine, Vol. 28, Nr. 12, pag. 1708–1716

Jos´e Vina, Amparo Gimeno, Juan Sastre, Carmen Desco, Miguel Asensi, Federico V. Pallardo, Andres Cuesta, Jos´e Antonio Ferrero, Lance S. Terada, John E. Repine, 2000, Mechanism of Free Radical Production in Exhaustive Exercise in Humans and Rats; Role of Xanthine Oxidase and Protection by Allopurinol, IUBMB Life, nr. 49, pag. 539–544,

Joseph P. Gaut, Jaeman Byun, Hung D. Tran, Wendy M. Lauber, James A. Carroll, Richard S. Hotchkiss, Abderrazzaq Belaaouaj, Jay W. Heinecke, 2002, Myeloperoxidase produces nitrating oxidants in vivo, J. Clin. Invest. Nr.109, pag. 1311–1319

Joy Ganem Longhi, Elisa Perez, Jair José de Lima, Lys Mary Bileski Cândido, 2011, In vitro evaluation of Mucuna pruriens (L.) DC. antioxidant activity, Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences vol. 47, nr. 3, pag. 535-544

Judy B. de Haan, Francesca Cristiano, Rocco Iannello, Cecile Bladier, Michael J. Kelner, Ismail Kola, 1996, Elevation in the ratio of Cu/Zn-superoxide dismutase to glutathione peroxidase activity induces features of cellular senescence and this effect is mediated by hydrogen peroxide, Human Molecular Genetics, Vol. 5, Nr. 2 pag. 283–292

Julio F. Turrens, 1997, Superoxide Production by the Mitochondrial Respiratory Chain, Bioscience Reports, Vol. 17, Nr. 1, pag. 3-8

Jun-ichi A., Berk B.C., 1999, Fyn and JAK2 Mediate Ras Activation by Reactive Oxygen Species, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 274, No. 30, Issue of July 23, pp. 21003–21010

Junseong Park, Jungsul Lee, Chulhee Choi, 2011, Mitochondrial Network Determines Intracellular ROS Dynamics and Sensitivity to Oxidative Stress through Switching Inter-Mitochondrial Messengers, PLoS ONE, Vol. 6,

Karen Bedard, Karl-Heinz Krause, 2007, The NOX Family of ROS-Generating NADPH Oxidases: Physiology and Pathophysiology, Physiol Rev 87: 245–313, doi:10.1152/physrev.00044.2005.

KARLSSON F. A., PIA BURMAN, L. LOOF, M. OLSSON, ANNIKA SCHEYNIUS, S. MARDH, 1987, Enzyme-linked immunosorbent assay of H+, K+-ATPase, the parietal cell antigen, Clin. exp. Immunol. Nr. 70, pag. 604-610

Kartick C. Pramanik, Palika Datta, Sanjay K. Srivastava, 2013, Oxidative Stress by Capsaicin in Cancer, available online at. http://www.springer.com/biomed/cancer/book/978-94-007-6316-6

Kashihara N., Haruna Y., Kondeti V.K., Kanwar Y.S., 2010, Oxidative Stress in Diabetic Nephropathy, Curr Med Chem, nr. 17, pag. 4256–4269.

Kaushik M. Desai, Tuanjie Chang, Hui Wang, Ali Banigesh, Arti Dhar, Jianghai Liu, Ashley Untereiner, Lingyun Wu, 2010, Oxidative stress and aging: Is methylglyoxal the hidden enemy?, Can. J. Physiol. Pharmacol. Nr. 88, pag. 273–284"

Kazimierz Ciechanowski, Karolina Kedzierska, Edyta Gołembiewska, Krzysztof Safranow,Joanna Bober, Leszek Domanski, Jacek Rozanskia, Marek Myslak, 2005, Impaired Synthesis Is Not the Reason for Decreased Activity of Extracellular Superoxide Dismutase in Patients with Diabetes, Archives of Medical Research nr.36 pag. 148–153

Keidu Oshida, Ema Iwanaga, Keiko Miyamoto-Kuramitsu, Yohei Miyamoto, 2008, An in vivo comet assay of multiple organs (liver, kidney and bone marrow) in mice treated with methyl methanesulfonate and acetaminophen accompanied by hematology and/or blood chemistry, The Journal of Toxicological Sciences, Vol. 33, Nr. 5, pag. 515-524

Keiyu Oshida, Ema Lwanaga, Keiko Miyamoto-Kuramitsu, Yohei Miyamoto, 2008, An in vivo comet assay of multiple organs (liver, kidney and bone marrow) in mice treated with methyl methanesulfonate and acetaminophen accompanied by hematology and/or blood chemistry, The Journal of Toxicological Sciences, vol. 33, nr. 5, pag. 515-524

Kendric C. Smith, 1992, Spontaneous mutagenesis: Experimental, genetic and other factors, Mutation Research, nr. 277, pag. 139-162

Kiechle F.L., Malinski T., 1993, Nitric Oxide: Biochemistry, Pathophysiology, and Detection, Am. J. Clin. Pathol, nr. 100, pag. 567-575."

KININGHAM K., T. D. OBERLEY, S.-M. LIN, C. A. MATTINGLY, D. K. ST. CLAIR, Overexpression of manganese superoxide dismutase protects against mitochondrial-initiated poly(ADPribose) polymerase-mediated cell death, The FASEB Journal, Vol. 13, pag. 1601-1610

Kinya Uchida, Junji Tsuchida, Hiromitsu Tanaka, Minoru Koga, Yukio Nishina, Masami Nozaki, Kazuya Yoshinaga, Kiyotaka Toshimori, Kiyomi Matsumiya, Akihiko Okuyama, Yoshitake Nishimune, 2000, Cloning and Characterization of a Complementary Deoxyribonucleic Acid Encoding Haploid-Specific Alanine-Rich Acidic Protein Located on Chromosome-X, BIOLOGY OF REPRODUCTION, nr. 63, pag. 993–999

Koji Uchida, Masamihi Kanematsu, Kensuke Sakai, Tsukasa Matsuda, Nobutaka Hattoris,Yoshikuni Mizuno, Daisuke Suzuki, Toshio Miyata, Noriko Noguchl, Etsuo Niki, Toshihiko Osawa, 1998, Protein-bound acrolein: Potential markers for oxidative stress, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 95, pag. 4882–4887

Kröncke KD, Fehsel K, Kolb-Bachofen V., 1997, Nitric oxide: cytotoxicity versus cytoprotection–how, why, when, and where?, Nitric Oxide., nr. 1, pag. 107-120

Kwun I. S.,Jang H. S.,Kwon C. S., 2000, Plasma Level of Antioxidant Minerals (Cu, Zn, Mn, and Se) and Fe, Trace Elements in Man and Animals, nr. 10, pag. 559-561

Leonid Gaidukov, Mira Rosenblat, Michael Aviram, Dan S. Tawfik, 2006, The 192R/Q polymorphs of serum paraoxonase PON1 differ in HDL binding, lipolactonase stimulation, and cholesterol efflux, Journal of Lipid Research, Vol. 47, pag. 2492-2502

Lesley, S.A., Groskreutz, D.J., 1997, Simple affinity purification of antibodies using in vivo biotinylation of a fusion protein, J. Immunol. Methods, nr. 207, pag. 147-155

"Liming Wang, Ying Liu, Wei Li, Xiumei Jiang, Yinglu Ji, Xiaochun Wu, Ligeng Xu, Yang Qiu, Kai Zhao, Taotao Wei, Yufeng Li, Yuliang Zhao, Chunying Chen, 2011, Selective Targeting of Gold Nanorods at the Mitochondria of Cancer Cells: Implications for Cancer Therapy, Nano Lett. nr. 11, pag. 772–780

Lino Ferreira, Jeffrey M. Karp, Luis Nobre, Robert Langer, 2008, New Opportunities: The Use of Nanotechnologies to Manipulate and Track Stem Cells, Cell Stem Cell, Vol. 3, pag. 136–146

Livia Casciola-Rosen,Fredrick Wigley, Antony Rosen, 1997, Scleroderma Autoantigens Are Uniquely Fragmented by Metal-catalyzed Oxidation Reactions: Implications for Pathogenesis, J. Exp. Med. The Rockefeller University Press, Volume 185, Nr. 1, pag. 71–79

llan. NOLIL and Dictinar HEGNER, 1978, Do Mitochondria Produce Oxygen Radicals in vivo? Eur. J. Biochem. Nr. 82, pag. 503 – 567

Mackness B., Mackness M.I., Durrington P.N., Arrol S., Evans A.E., McMaster D., Ferrie`res J., Ruidavets J.B., Williams N.R., Howard A.N., 2000, Paraoxonase activity in two healthy populations with differing rates of coronary heart disease, European Journal of Clinical Investigation, nr. 30, pag. 4–10

Marcelo Hermes-Lima, 2004, Oxigen in biology and biochemistry, role of radicals, Functional Metabolism: Regulation and Adaptation, DOI: 10.1002/047167558X.ch12.

MARCUS S. COOKE, MARK D. EVANS, MIRAL DIZDAROGLU, JOSEPH LUNEC, 2003, The FASEB Journal, vol. 17, pag. 1195-1214

Marian Valko, Dieter Leibfritz, Jan Moncola, Mark Cronin, Milan Mazura, Joshua Telser, 2007,Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, nr. 39, pag. 44–84

Mariappan Premanathan, Krishnamoorthy Karthikeyan, Kadarkaraithangam Jeyasubramanian, Govindasamy Manivannan, Mphild, 2011, Selective toxicity of ZnO nanoparticles toward Gram-positive bacteria and cancer cells by apoptosis through lipid peroxidation, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, nr. 7, pag. 184–192

Marina Carini, Giancarlo Aldini, Roberto Maffei Facino, 2004,MASS SPECTROMETRY FOR DETECTION OF 4-HYDROXY-trans-2-NONENAL (HNE) ADDUCTS WITH PEPTIDES AND PROTEINS, Mass Spectrometry Reviews, nr.23, pag.281– 305

Maritim A., R. A. Sanders, J. B. Watkins, Diabetes, Oxidative Stress, and Antioxidants: A Review, J BIOCHEM MOLECULAR TOXICOLOGY Vol. 17, Nr. 1, pag. 24-38

Mark A. Birch-Machin and Helen Swalwell, 2010, How mitochondria record the effects of UVexposure and oxidative stress using human skin as a model tissue, Mutagenesis vol. 25 nr. 2, pag. 101–107

Mark A. Ward, Theoni K. Georgiou, 2011, Thermoresponsive Polymers for Biomedical Applications, Polymers, nr. 3, pag. 1215-1242; doi:10.3390/polym3031215

Marquis C.P., 2000, Mammalian Cell Culture, available online at. http://www.eolss.net/sample-chapters/c17/e6-58-01-04.pdf

Marta Muzio, Brent R. Stockwell, Henning R. Stennicke, Guy S. Salvesen, and Vishva M. Dixit, 1998, An Induced Proximity Model for Caspase-8 Activation, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 273, Nr. 5, pag. 2926–2930

Martha K. Cathcart, 2003, Regulation of Superoxide Anion Production by NADPH Oxidase in Monocytes/Macrophages Contributions to Atherosclerosis,Arterioscler Thromb Vasc Biology, Nr.24, pag.23-28;

Masayuki Yamato, Chie Konno, Mika Utsumi, Akihiko Kikuchi, Teruo Okano, 2002,Thermally responsive polymer-grafted surfaces facilitate patterned cell seeding and co-culture, Biomaterials, nr. 23, pag. 561–567

Matei A., Dinulescu M, Buruiana E., Buruiana T., Petcu I., Mustaciosu C., 2011, ORMOSILS SCAFFOLDS PRODUCED BY LASER PROCESSING FOR FIBROBLAST CELL GROWTH, Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures Vol. 6, Nr. 1, pag. 29-35

Matei A., J. Schou, S. Canulescu, M. Zamfirescu, C. Albu, B. Mitu, E.C. Buruiana, T. Buruiana, C. Mustaciosu, I. Petcu, M. Dinescu, 2012, Functionalized ormosil scaffolds processed by direct laser polymerization for application in tissue engineering, Applied Surface Science, vol. 278, pag. 357–361

Matei A., M. Zamfirescu, C. Radu, T. Buruiana, E. Buruiana, C. Mustaciosu, I. Petcu, M. Radu, A. Kiss, M. Dinescu, 2011, Tailoring the properties of hybrid methacrylates scaffolds produced via Two Photon Polymerization, Proceedings of the 3rd International Conference on E-Health and Bioengineering – EHB 2011, 24th-26th November, 2011, Iași, Romania

MATEI A., M. ZAMFIRESCU, M. DINESCU, E.C. BURUIANA, T. BURUIANA, A. LUNGU, C. MUSTACIOSU, 2012, INVESTIGATION OF HYBRID METHACRYLATE BASED STRUCTURES OBTAINED BY POLYMERIZATION WITH FEMTOSECOND LASER PULSES, Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures Vol. 7, Nr. 2, pag. 823 – 832

Mates JM, Sanchez-Jimenez F., 1999, Antioxidant enzymes and their implications in pathophysiologic processes, Frontieres in Bioscience, nr. 4, pag. 339-345

McGowan P.E., Reglinski J., Smith W.E., Wilsonb R., Sturrockc R.D., 1992, Studies of oxidative stress in cellular systems The interaction of monocytes and erythrocytes, FEBS LETTERS, vol. 314, nr. 3, pag. 455-457

Measuring Absorbance Using the CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay with the GloMax® Discover System, 2013, available online at. http://www.promega.ro/~/media/files/resources/application%20notes/glomax%20discover/measuring%20absorbance%20using%20the%20celltiter%2096%20aqueous%20one%20cell%20assay%20and%20glomax%20discover%20system.pdf?la=en

Michael Brownlee, 2003, A radical explanation for glucose-induced b cell dysfunction, J. Clin. Invest. Nr. 112, pag. 1788–1790 doi:10.1172/JCI200320501

Michael I. Mackness, Sharon Arrol, Paul N. Durringtorm, 1991, Paraoxonase prevents acumulation of lipoperoxides in low-density lipoprotein, Vol. 286, nr. 1,2, pag 152-154

Michael P. Murphy, Robin A.J. Smith, 2000, Drug delivery to mitochondria: the key to mitochondrial medicine, Advanced Drug Delivery Reviews, nr. 41, pag. 235–250"

Michael P. Murphya, Robin A.J. Smithb, 2000, Drug delivery to mitochondria: the key to mitochondrial medicine, Advanced Drug Delivery Reviews, nr.41, pag. 235–250

Microscopy resource center, available online at. http://www.olympusmicro.com/index.html

Miklos Peter Kalapos, 2008, The tandem of free radicals and methylglyoxal, Chemico-Biological Interactions, nr. 171, pag. 251–271

Miller NJ.,1996, Anticoagulants for total antioxidant activity assay, Ann Clin Biochem, nr. 33, pag. 92-103.

Min Tua, Hayder A. Abbooda, Zhening Zhuc, Hailing Li, Zhonghong Gaoa, 2013, Investigation of the photocatalytic effect of zinc oxide nanoparticles in the presence of nitrite, Journal of Hazardous Materials nr. 244-245 Pag.311– 321

Mira Rosenblat, Tony Hayek, Khetam Hussein, Michael Aviram, 2003, Decreased Macrophage Paraoxonase 2 Expression in Patients With Hypercholesterolemia Is the Result of Their Increased Cellular Cholesterol Content: Effect of Atorvastatin Therapy, Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, nr.24, pag. 175-180"

Miral Dizdaroglu, Pawel Jaruga, Mechanisms of free radical-induced damage to DNA, Free Radical Research, nr. 46, pag. 382–419

Mohd Javed Akhtar, Maqusood Ahamed, Sudhir Kumar, MA Majeed Khan, Javed Ahmad, Salman A Alrokayan, 2012, Zinc oxide nanoparticles selectively induce apoptosis in human cancer cells through reactive oxygen species, International Journal of Nanomedicine, nr. 7, pag. 845–857

Mousa, S.A. Cheresh, D.A., 1997, Recent advances in cell adhesion molecules and extracellular matrix proteins: potential clinical implications, Drug Discovery Today, Vol. 2, Nr. 5, pag. 187-199

Muredach P. Reilly, Domenico Pratico, Norman Delanty, Giovanni DiMinno, Elena Tremoli, Daniel Rader, Shiv Kapoor, Joshua Rokach, 1998, Increased Formation of Distinct F2 Isoprostanes in Hypercholesterolemia, Circulation, nr. 98, pag. 2822-2828

John Lawson, Garret A. FitzGerald, Mutsuo Sekiguchi, Teruhisa Tsuzuki, 2002, Oxidative nucleotide damage: consequences and prevention, Oncogene, nr. 21, pag. 8895 – 8904

Namarata Chhabra, 2012, A to I of Vitamin C (Functions of vitamin C simplified), available online at. http://www.namrata.co/a-to-i-of-vitamin-c-functions-of-vitamin-c-simplified/

Ning Li, Tian Xia, Andre E. Nel, 2008, The Role of Oxidative Stress in Ambient Particulate Matterinduced Lung Diseases and Its Implications in the Toxicity of Engineered Nanoparticles, Free Radic Biol Med., nr. 44, pag. 1689–1699, doi:10.1016/j.freeradbiomed.2008.01.028."

Nohl H., A.V. Kozlov, L. Gille, K. Staniek, 2003, Cell respiration and formation of reactive oxygen species: facts and artefacts, Biochemical Society Transactions, Vol. 31, pag. 1308-1311

Nourooz-Zadeh J., Rahimi A., Tajaddini-Sarmadi J., Tritschler H., Rosen P., Halliwell B., Betteridge D.J., 1997, Relationships between plasma measures of oxidative stress and metabolic control in NIDDM, Diabetologia, nr. 40, pag. 647–653

Odetti P., S. Garibaldi, G. Noberasco, I. Aragno, S. Valentini, N. Traverso, U.M. Marinari, 1999, Levels of carbonyl groups in plasma proteins of type 2 diabetes mellitus subjects, Acta Diabetol, nr.36, pag. 179-183

Olinescu Andrei, 2004, Momente din istoria Imunologiei românești. Comisia națională de Imunologie (CNI), Ed. Medicală Românească

Packer L., Valacchi G, 2002, Antioxidants and the Response of Skin to Oxidative Stress: Vitamin E as a Key Indicator, Skin Pharmacol Appl Skin Physiol, nr. 15, pag.282–290

Panait M., Diana Chiper, Valentina Negoita, Valeria Lungu, Maria Iuliana Gruia, 2013, Therapeutic Efficacy Evaluation of 177Lu-DOTA-NT and 177Lu-DOTA-SR48692 in Murine RS-1 Hepatoma, Int J Pept Res Ther, nr. 19, pag. 345–356"

PAOLO MONTUSCHI, JOHN V. COLLINS, GIOVANNI CIABATTONI, NICOLA LAZZERI, MASSIMO CORRADI,SERGEI A. KHARITONOV, PETER J. BARNES, 2000, Exhaled 8-Isoprostane as an In Vivo Biomarkerof Lung Oxidative Stress in Patients with COPD and Healthy Smokers, Am J Respir Crit Care Med, Vol. 162, pag. 1175–1177

PAOLO MONTUSCHI, PETER J. BARNES, L. JACKSON ROBERTS, 2004, Isoprostanes: markers and mediators of oxidative stress, The FASEB Journal, vol. 18, pag. 1791-1800

Paul Amstad, Amy Moret, and Peter Cerutti, 1994, Glutathione Peroxidase Compensates for the Hypersensitivity of Cu,Zn-Superoxide Dismutase Overproducers to Oxidant Stress, The Journal of Biological Chemistry Vol. 269, Nr. 3, pag. 1606-1609

Paul D. Ray, Bo-Wen Huang, Yoshiaki Tsuji, 2012, Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling, Cellular Signalling nr. 24, pag. 981–990

Paul J. Thornalley, 1996, Pharmacology of Methylglyoxal: Formation, Modification of Proteins and Nucleic Acids, and Enzymatic Detoxification-A Role in Pathogenesis and Antiproliferative Chemotherapy, Gen. Pharmac. Vol. 27, Nr. 4, pag. 565-573

Paul J. Thornalley, 2005, MEASUREMENT OF PROTEIN GLYCATION, GLYCATED PEPTIDES, AND GLYCATION FREE ADDUCTS, Peritoneal Dialysis International, Vol. 25, pag. 522–533

PerkinElmer, Inc., 2010, Lutetium-177 Handling Precautions, available online at. http://www.perkinelmer.com/cmsresources/images/44-73951tch_lutetium177.pdf

Petra Uhlmann, Nikolay Houbenov, Sergiy Minko, Manfred Stamm, 2005, Surface functionalization by smart binary polymer brushes to tune physico-chemical characteristics at biointerfaces, e-Polymers, nr.75,

Powers S., MALCOLM J. JACKSON, 2008, Exercise-Induced Oxidative Stress: Cellular Mechanisms and Impact on Muscle Force Production, Physiol Rev., nr. 88, pag. 1243–1276

Pryor W.A., 2000, Vitamin E and heart disease: basic science to clinical intervention trials, Free Rad Biol Med.nr. 28, pag. 141–164.

Quanxin Meng, Ting Su, Ofelia A. Olivero, Miriam C. Poirier, Xiaochu Shi, Xinxin Ding, Vernon E. Walker, 2000, Relationships between DNA Incorporation, Mutant Frequency, and Loss of Heterozygosity at the TK Locus in Human Lymphoblastoid Cells Exposed to 39-Azido-39-deoxythymidine, TOXICOLOGICAL SCIENCES, nr.54, pag. 322–329

R. Calle, M. I. McCarthy, P. Banerjee, E. Zeggini, C. A. Cull, K. I. Thorne, S. Wiltshire, S. Terra, D. Meyer, J. Richmond, J. Mancuso, P. Milos, D. Fryburg, R. R. Holman, 2007, Diabetologia nr.49, p.2892–2899. DOI 10.1007/s00125-006-0436-8

Rachana K. Visaria, Robert J. Griffin, Brent W. Williams, 2006, Enhancement of tumor thermal therapy using gold nanoparticle-assisted tumor necrosis factor-a delivery, Molecular Cancer Therapeutics, pag. 1014-1020

Radu Beatrice Mihaela, Adina Daniela Iancu, Diana Ionela Dumitrescu, Maria Luisa Flonta, Mihai Radu, 2012, TRPV1 Properties in Thoracic Dorsal Root Ganglia Neurons are Modulated by Intraperitoneal Capsaicin Administration in the Late Phase of Type-1 Autoimmune Diabetes, Cell Mol Neurobiol, Cell Mol Neurobiol, nr. 33. doi: 10.1007/s10571-012-9883-6.

Radu Beatrice Mihaela, Diana Ionela Dumitrescu, Cosmin Catalin Mustaciosu, Mihai Radu, 2012, Dual Effect of Methylglyoxal on the Intracellular Ca2+ Signaling and Neurite Outgrowth in Mouse Sensory Neurons, Cell Mol Neurobiol, nr. 32, pag. 1047–1057

Radu D., Adriana Georgescu, Crina Stavaru, Alina Carale , Doina Popov, 2004, Double transgenic mice with Type 1 diabetes mellitus develop somatic, metabolic and vascular disorders, J. Cell. Mol. Med. Vol. 8, Nr. 3, pag. 349-358

Rafael Radil, Joseph S. Beckman, Kenneth M. Bush, Bruce A. Freeman, 1991, Peroxynitrite Oxidation of Sulfhydryls THE CYTOTOXIC POTENTIAL OF SUPEROXIDE AND NITRIC OXIDE, THEJ OURNALO F BIOLOGICCAHELM ISTRY Vol. 266, Nr. 7, pag. 4244-4250

Rainer de Martin, Martina Hoeth, Renate Hofer-Warbinek, Johannes A. Schmid, 2000, The Transcription Factor NF-kB and the Regulation of Vascular Cell Function, Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, nr. 20, pag. 83-88

Regeneration centre of Thailand, 2013, Apoptosis and Programmed Cell Death “PCD" available online at. http://stemcellthailand.org/apoptosis-programmed-cell-death-pcd/

Reșat Apak, Shela Gorinstein, Volker Böhm, Karen M. Schaich, Mustafa Özyürek, Kubilay Güçlü, 2013, Methods of measurement and evaluation of natural antioxidant capacity/activity (IUPAC Technical Report), Pure Appl. Chem., Vol. 85, Nr. 5, pag. 957–998

Richard K.M. Wong, Andrew I. Pettit, Paulene A. Quinn, MPhil Sonja C. Jennings, Joan E. Davies, Leong L., 2003, Advanced Glycation End Products Stimulate an Enhanced Neutrophil Respiratory Burst Mediated Through the Activation of Cytosolic Phospholipase A2 and Generation of Arachidonic Acid, Circulation. nr.108, pag. 1858-1864

Ridnour, L. A., Thomas, D. D., Mancardi, D., Espey, M. G., Miranda, K. M., Paolocci, N., et al. (2004). The chemistry of nitrosative stress induced by nitric oxide and reactive nitrogen oxide species. Putting perspective on stressful biological situations. Biol. Chem., nr. 385, pag. 1–10

Robert C. Sorenson, Charles L. Bisgaier, Michael Aviram, Cary Hsu, Scott Billecke and Bert N. La Du, 1999, Human Serum Paraoxonase/Arylesterase’s Retained Hydrophobic N-Terminal Leader Sequence Associates With HDLs by Binding Phospholipids Apolipoprotein A-I Stabilizes Activity, Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, nr. 19, pag. 2214-2225

Robert Lupitskyy, Yuri Roiter, Constantinos Tsitsilianis, and Sergiy Minko, 2005, From Smart Polymer Molecules to Responsive Nanostructured Surfaces, Langmuir, nr. 21, pag. 8591-8593

Rodica Pop-Busui, Anders Sima, Martin Stevens, 2006, Diabetic neuropathy and oxidative stress, Diabetes Metab Res Rev, nr. 22, pag. 257–273.

Rodica Pop-Busui, Victor Marinescu, Carol Van Huysen, Fei Li, Kelli Sullivan, Douglas A. Greene, Dennis Larkin, and Martin J. Stevens, 2002, Dissection of Metabolic, Vascular, and Nerve Conduction Interrelationships in Experimental Diabetic Neuropathy by Cyclooxygenase Inhibition and Acetyl-L-Carnitine Administration, DIABETES, Vol. 51, pag. 2619-2628

Roitt Ivan M., Delves Peter J., 2006, Roitt's essential immunology, ISBN: 9781405136037 1405136030

Roland S., John F. Keaney, JR, 2004, Role of Oxidative Modifications in Atherosclerosis, Physiol Rev, nr. 84, pag. 1381–1478

Ron Kohen, Abraham Nyska, 2002, Oxidation of Biological Systems: Oxidative Stress Phenomena, Antioxidants, Redox Reactions, and Methods for Their Quantification, Toxicologic Pathology, vol. 30, nr. 6, pag. 620–650

Rongfa Guan, Tianshu Kang, Fei Lu, Zhiguo Zhang, Haitao Shen, Mingqi Liu, 2012, Cytotoxicity, oxidative stress, and genotoxicity in human hepatocyte and embryonic kidney cells exposed to ZnO nanoparticles, Nanoscale Research Letters, nr. 7, pag. 1-7

Rosen P., Nawroth P., King G., Moller W., Tritschler H., Packer L., 2001, The role of oxidative stress in the onset and progression of diabetes and its complications: a summary of a Congress Series sponsored by UNESCO-MCBN, the American Diabetes Association and the German Diabetes Society, DIABETES METABOLISM RESEARCH AND REVIEWS, nr. 17, pag. 189–212

Rudner J., V. Jendrossek, C. Belka, 2002, New insights in the role of Bcl-2 Bcl-2 and the endoplasmic reticulum, Apoptosis, nr. 7, pag. 441–447

Rusen L., V. Dinca, B. Mitu, C. Mustaciosu, M. Dinescu, 2014, Temperature responsive functional polymeric thin films obtained bymatrix assisted pulsed laser evaporation for cellsattachment–detachment study, Applied Surface Science, nr. 302, pag. 134–140

Ruvolo P., X Deng and WS May, 2001, Phosphorylation of Bcl2 and regulation of apoptosis, Leukemia, nr. 15, pag. 515–522

Sabine Schulte im Walde, Claudia Dohle, Patricia Schott-Ohly, Helga Gleichmann, 2002, Molecular target structures in alloxan-induced diabetes in mice, Life Sciences nr.71 pag. 1681–1694

Saikat Sen, Raja Chakraborty, C. Sridhar, Y. S. R. Reddy, Biplab De, 2010, FREE RADICALS, ANTIOXIDANTS, DISEASES AND PHYTOMEDICINES: CURRENT STATUS AND FUTURE PROSPECT, International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, vol. 3, pag. 91-100

Sara P. Deakin, Richard W. James, 2004, Genetic and environmental factors modulating serum concentrations and activities of the antioxidant enzyme paraoxonase-1, Clinical Science nr. 107, pag.435–447

Schmidt-Ullrich RK, Dent P, Grant S, Mikkelsen RB, Valerie K, 2000, Signal transduction and cellular radiation responses, Radiat Res., nr. 153, pag. 245-257

Sebastian Mueller, Hans-Dieter Riedel, Wolfgang Stremmel, 1997, Direct Evidence for Catalase as the Predominant H2O2 -Removing Enzyme in Human Erythrocytes, Blood, Vol. 90, Nr. 12, pag. 4973-4978

Sébastien Talbot, Jenny Pena Dias, Karim Lahjouji, Maurício Reis Bogo, Maria Martha Campos,Pierrette Gaudreau, Réjean Couture, 2012, Activation of TRPV1 by capsaicin induces functional Kinin B1 receptor in rat spinal cord, Journal of Neuroinflammation, nr.9, pag.1-14

Shilpee Jain , Thomas J. Webster , Ashutosh Sharma , Bikramjit Basu, 20013, Intracellular reactive oxidative stress, cell proliferation and apoptosis of Schwann cells on carbon nanofibrous substrates, Biomaterials, nr. 34, pag. 4891-4901

Shiv Kumar, 2011, Free Radicals and Antioxidants: Human and Food System, Advances in Applied Science Research, vol. 2, pag. 129-135

Shuangsong Hong, Laura Agresta, Chunfang Guo and John W. Wiley, 2008, The TRPV1 receptor is associated with preferential stress in large dorsal root ganglion neurons in early diabetic sensory neuropathy, Journal of Neurochemistry, nr. 105, pag. 1212–1222

Sibel Suzen, 2006, Reactive oxygen/nitrogen species and oxidative stress, available online at. http://kisisel.ankara.edu.tr/pharmacy.ankara.edu.tr/sibel/antiox.htm

Silva J., Andreia C. Gomes, Olga P. Coutinho, 2008, Oxidative DNA damage protection and repair by polyphenolic compounds in PC12 cells, European Journal of Pharmacology, nr. 28, pag. 50-60

Sima A., Sugimoto K., 1999, Experimental diabetic neuropathy: an update, Diabetologia, nr. 42, pag. 773-788

Simon P. WOLFF, Roger T. DEAN, 1987, Glucose autoxidation and protein modification The potential role of 'autoxidative glycosylation' in diabetes, Biochem. J. nr. 245, pag. 243-250

Soroku Yagihashi, Shin-Ichiro Yamagishi, Ryu-ichi Wada, Masayuki Baba, Thomas C. Hohman, Chihiro Yabe-Nishimura, Yaso Kokai, Neuropaty in diabetic mice overexpressing human aldose reductase and effects of aldose reductase inhibitor, 2001, Brain, Nr. 124, pag. 2448-2458

Sperelakis N, 1997, Cell Physiology: Source Book. Academic Press, USA

Srinivasa T. Reddy, David J. Wadleigh, Victor Grijalva, Carey Ng, Susan Hama, 2001, Srinivasa T. Reddy, David J. Wadleigh, Victor Grijalva, Carey Ng, Susan Hama, Aditya Gangopadhyay, Diana M. Shih, Aldons J. Lusis, Mohamad Navab, Alan M. Fogelman, Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, nr. 21, pag. 542-547

Stefan L. Marklund, 1984, Extracellular Superoxide Dismutase in Human Tissues and Human Cell Lines, J. Clin. Invest., Vol. 74, pag. 1398-1403

Stephen R. Thom, 2009, Oxidative stress is fundamental to hyperbaric oxygen therapy, Journal of Applied Physiology, nr. 106, pag. 988–995 doi:10.1152/japplphysiol.91004.2008

Strålin P, Karlsson K, Johansson BO, Marklund SL, 1995, The interstitium of the human arterial wall contains very large amounts of extracellular superoxide dismutase. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, nr. 15, pag. 2032-2036

Străuț Dan, 2014, Consumul de carne pe cap de locuitor: 58 de kilograme pe an. Ce sortimente preferă românii și cât ar câștiga dacă TVA ar scădea la 5%, Adevarul, pag. 21-22

Takeshi Nishikawa, Diane Edelstein, Xue Liang Du, Sho-ichi Yamagishi, Takeshi Matsumura, Yasufumi Kaneda, Mark A. Yorek, David Beebek, Peter J. Oatesk, Hans-Peter Hammes, Ida Giardino, Michael Brownlee, 2000, Normalizing mitochondrial superoxide production blocks three pathways of hyperglycaemic damage, NATURE, Vol. 404, pag. 787-790

Tatiana E. Itina, Leonid V. Zhigilei, Barbara J. Garrison, 2001, Matrix-asisted pulsed laser evaporation of polimeric materials: a molecular dynamics study, Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, nr. 180, pag. 238-244

Tedgui A., Mallat Z., 2006, Cytokines in Atherosclerosis: Pathogenic and Regulatory Pathways, Physiol Rev, nr. 86, pag. 515–581

Terry L Riss, Richard A Moravec, Andrew L Niles, Helene A Benink, Tracy J Worzella, Lisa Minor, Cell Viability Assays, available online at. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144065/

Thangavel Samikkannu, Chien-Hung Chen, Ling-Huei Yih, Alexander S. S. Wang, Shu-Yu Lin, Tsen-Chien Chen, and Kun-Yan Jan, 2003, Reactive Oxygen Species Are Involved in Arsenic Trioxide Inhibition of Pyruvate Dehydrogenase Activity, Chem. Res. Toxicol., nr. 16, pag. 409-414

Thomas E. DeCoursey, Deri Morgan, Vladimir V. Cherny, 2002, The gp91 phox Component of NADPH Oxidase Is Not a Voltage-gated Proton Channel, J Gen Physiol. Nr.120, pag.773–779.

Thomas Klein, Katrin Neuhaus, Felix Reutter, Rolf M. Nusing, 2001, Generation of 8-epi-prostaglandin F2a in isolated rat kidney glomeruli by a radical-independent mechanism, British Journal of Pharmacology, nr. 133, pag. 643 – 650

Tina Rich, Rachel L. Allen & Andrew H. Wyllie, 2000, Defying death after DNA damage, Nature, Vol. 407, pag. 777-783

Troost R., Schwedhelm E., Rojczyk S., Tsikas D., Frolich J.C., 2000, Nebivolol decreases systemic oxidative stress in healthy volunteers, J Clin Pharmacol, nr. 50, pag. 377-379

Vanderlei Folmer, Júlio C.M. Soares, J.B.T. Rocha, 2002, Oxidative stress in mice is dependent on the free glucose content of the diet, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, nr.34, pag. 1279–1285

Vicki Stone , Helinor Johnston, and Martin J. D. Clift, 2007, Air Pollution, Ultrafine and Nanoparticle Toxicology: Cellular and Molecular Interactions, IEEE TRANSACTIONS ON NANOBIOSCIENCE, Vol. 6, Nr. 4, pag. 331-340

Victor J. Thannickal, Barry L. Fanburg, 1995,Activation of an H2O2-generating NADH Oxidase in Human Lung Fibroblasts by Transforming Growth Factor b1, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 270, Nr. 51, pag. 30334–30338

Vijay Shyam Tripathi, Vivek Babu Kandimalla, Huangxian Ju, 2006, Preparation of ormosil and its applications in the immobilizing biomolecules, Sensors and Actuators, vol. 114, pag. 1071–1082

Vijayalakshmi Sridharan, Jason Guichard, Chuan-Yuan Li, Robin Muise-Helmericks, Craig Cano Beeson, and Gary L. Wright, O2-sensing signal cascade: clamping of O2 respiration, reduced ATP utilization, and inducible fumarate respiration, Am J Physiol Cell Physiol, nr. 295, pag. 29–37

Vincy W.C. Wong, Y.T. Szeto, Andrew R. Collins, Iris F.F. Benzie, 2005, THE COMET ASSAY: a biomonitoring tool for nutraceutical research, Current Topics in Nutraceutical Research Vol. 3, Nr. 1, pag. 1-14,

Vineet Pande, Maria J. Ramos, 2005, Molecular recognition of 15-deoxy-D12,14-prostaglandin J2 by nuclear factor-kappa B and other cellular proteins, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, nr. 15, pag. 4057–4063

Wei Han and K. N. Yu, 2010, Ionizing Radiation, DNA Double Strand Break and Mutation, Advances in Genetics Research. Vol. 4, pag. 1-13

Wikipedia, 2014 ,available online at. http://en.wikipedia.org/wiki/Oxidative_stress

Wikipedia, the free encyclopedia, 2014, available online at. http://en.wikipedia.org/wiki/Posterior_root_ganglion

Wikipedia,2014, Neurotensin, availeble online at. http://en.wikipedia.org/wiki/Neurotensin

Wilhelm Stahl, Helmut Sies, 2012, Oxidative Stress, available online at. http://www.uniklinik-duesseldorf.de/fileadmin/Datenpool/einrichtungen/institut_fuer_biochemie_und_molekularbiologie_i_id63/dateien/2012_Homepage-ros-10-11-16.pdf

Wulf Drödge, 2002, Free Radicals in the Physiological Control of Cell Function, Physiol Rev, nr.82, pag. 47–95

Ya-Na Wu, Dong-Hwang Chen, Xian-Yu Shi, Chiao-Ching Lian, Ting-Yu Wang, Chen-Sheng Yeh, Kyle R. Ratinac, Pall Thordarson, Filip Braet, Dar-Bin Shieh, 2011, Cancer-cell-specific cytotoxicity of non-oxidized iron elements in iron core-gold shell NPs, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, nr.7, pag. 420–427

Yan-Shun Rena, Nian-Song Qianc, Yu Tange, Yong-Hui Liaob, Yan-Ling Yangb, Ke-Feng Doub, Masakazu Toid, 2012, Sodium channel Nav1.6 is up-regulated in the dorsal root ganglia in a mouse model of type 2 diabetes, Brain Research Bulletin, nr. 87, pag. 244– 249

Yasushi Maeda, Tomomi Higuchi, Isao Ikeda, 2000, Change in Hydration State during the Coil-Globule Transition of Aqueous Solutions of Poly(N-isopropylacrylamide) as Evidenced by FTIR Spectroscopy, Langmuir, Vol. 16, Nr. 19, pag. 7503-7509

Yon Ju-Nam, Jamie R. Lead, 2008, Manufactured nanoparticles: An overview of their chemistry, interactions and potential environmental implications, S C I E N C E O F T H E T O T A L E N V I R O N M E N T, nr. 4 0 0, pag. 3 9 6 – 4 1 4

Yoshichika Kawai, Atsunori Furuhata, Shinya Toyokuni, Yasuaki Aratani, Koji Uchida, 2003, Formation of Acrolein-derived 2 -Deoxyadenosine Adduct in an Iron-induced Carcinogenesis Model, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 278, Nr. 50, pag. 50346–50354

Yoshiji Yamada, Fujiko Ando, Naoakira Niino Tetsuro Miki, Hiroshi Shimokata, 2003, Association of polymorphisms of paraoxonase 1 and 2 genes, alone or in combination, with bone mineral density in community-dwelling Japanese, J Hum Genet, nr. 48, pag.469–475

Young I.S, Woodside J.V., 2001, Antioxidants in health and disease, J Clin Patol, nr. 54, pag. 176-186

Zainal T. , RICHARD WEINDRUCH, LUKE I. SZWEDA, TERRY D. OBERLEY, 1999, LOCALIZATION OF 4-HYDROXY-2-NONENAL-MODIFIED PROTEINS IN KIDNEY FOLLOWING IRON OVERLOAD, Free Radical Biology & Medicine, Vol. 26, Nr. 9/10, pag. 1181–1193

Lista de lucrări publicate și comunicate la conferințe

Lucrari publicate si trimise la publicat:

1. Ormosils scaffolds produced by laser processing for fibroblast cell growth

A. Matei, M. Dinescu, E.C. Buruiana, T. Buruiana, I. Petcu, C. Mustaciosu

Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures Vol. 6, No 1, January-March 2011, p. 29-35

2.„Tailoring the properties of hybrid methacrylates nscaffolds produced via Two Photon Polymerization”, A. Matei, M. Zamfirescu, C. Radu, T. Buruiana, E. Buruiana, C. Mustaciosu, I. Petcu, M. Radu, A. Kiss, M. Dinescu, IEEE INTERNATIONAL CONFERENCE ON E-HEALTH AND BIOENGINEERING – EHB 2011 –proceeding indexat IEEE Xplore®, ISI-Proceedings, SCOPUS, INSPEC (IET) and EI (Engineering Information) data bases

3. “Producing ORMOSIL scaffolds by femtosecond laser polymerization”, A. Matei, M. Zamfirescu, C. Radu, E.C. Buruiana, T. Buruiana, C. Mustaciosu, I. Petcu, M. Radu, M. Dinescu, Applied Physics A,

Conferinte internationale:

1. Bleomycin and ionising radiation-induced bystander effects in two fibroblast cell lines

Diana Savu, Cosmin Mustaciosu, Sorin Bercea, Ileana Petcu

14th International Congress of Radiation Research (ICRR2011), Warsaw, Poland, August 28-September 1, 2011

2. Ormosil scaffolds processed by Two Photon Polymerization (2PP) for bio applications, A. Matei, M. Zamfirescu, M. Dinescu, E.C. Buruiana, T. Buruiana, I. Petcu, M. Radu

Simpozion P, EMRS, June 2011, Nice, Franta

3. Comparative effects of UV irradiation and chemical exposure on in vitro fibroblast cultures evaluated by comet assay

C. Mustaciosu, M. Radu, D. Savu, I.Petcu

9th International Comet Assay Workshop, Kusadası, Turkey 13 – 16 September 2011

Conferinte Nationale si Internationale in Romania – prezentari orale:

1. Tailoring the properties of hybrid methacrylates nscaffolds produced via Two Photon Polymerization, A. Matei, M. Zamfirescu, C. Radu, T. Buruiana, E. Buruiana, C. Mustaciosu, I. Petcu, M. Radu, A. Kiss, M. Dinescu, IEEE INTERNATIONAL CONFERENCE ON E-HEALTH AND BIOENGINEERING – EHB 2011 – IAȘI, ROMANIA, 24-26 Nov., 2011

2. CRESTEREA SI PROLIFERAREA CELULELOR FIBROBLASTE PE STRUCTURI POLIMERIZATE DE ORMOSILI, A. Matei, M. Zamfirescu, M. Dinescu, E.C. Buruiana, T. Buruiana, C. Mustaciosu, I. Petcu, M. Radu, ZILELE ACADEMICE IEȘENE, A XXIII-a sesiune de comunicări științifice, PROGRESE ÎN ȘTIINȚA COMPUȘILOR ORGANICI ȘI MACROMOLECULARI, 29-30 septembrie 2011

3. Polimerizarea cu doi fotoni a organo-silicatilor, A. Matei, M. Zamfirescu, M. Dinescu, E.C. Buruiana, T. Buruiana, C. Mustaciosu, I. Petcu, M. Radu, Scoala de vara „Tendinte in sinteza si caracterizarea materialelor avansate pentru aplicatii in biologie si medicina”, Centrul de Cercetari Tehnice Fundamentale si Avansate, Academia Romana, Timisoara, 27-29.07.2011

4. Bystander effects induced by ionizing radiation and bleomycin in fibroblast cell lines

Ileana Petcu, Cosmin Mustaciosu, Sorin Bercea, Diana Savu

11-th National Conference of Biophysics, Nov 10-12 2011, Sibiu, Romania

O parte din aceste rezultate au fost publicate in FEBS JOURNAL, Iunie 2008, Volumul: 275, Pagina: 366-366 Supliment: 1 cu titlu Cytotoxic effects of 2-dodecylcyclobutanone on human lymphocytes, autori : Mustaciosu Cosmin, Petcu Ileana, Savu Diana, Radu Mihai