Stimularea Tuberogenezei In Vitro

Diverse2

Stimularea Tuberogenezei In Vitro

Byadmin ianuarie 1, 2024

STIMULAREA TUBEROGENEZEI IN VITRO

LA SOLANUM TUBEROSUM

Cuprins

I. NOȚIUNI TEORETICE

I.1. INTRODUCERE

Cartoful este un aliment important din punct de vedere economic ocupând locul al cincilea dintre speciile cultivate pe glob (Zuba si Binding, 1989), al patrulea ca recoltă mondială (Ross, 1986) și producție de proteine. Tuberculii sunt bogați în vitamine, minerale, proteine, carbohidrați și fier (Ciobanu și colab., 2011; Cachiță și Sand, 2011). Deoarece cartoful cultivat se multiplică preponderent vegetativ, se ameliorează greu prin metodele clasice. Soiurile obținute prin încrucișare și retroîncrucișare sunt foarte sensibile la dăunători și boli (Dinu, 2003).

Cererea de material semincer, la nivel global, crește de la an la an, iar cea mai optimă metodă de producere a acestuia, atât din punct de vedere financiar, a duratei, cât și a calității este prin culturi in vitro (Dinu, 2003; Cachiță și Ardelean, 2009; Radoveț-Salinschi și Cachiță, 2012 a și b; Radoveț-Salinschi și Cachiță, 2013). Asigurarea securității alimentare este strict legată de realizarea unui echilibu durabil între producția alimentară mondială (dependentă de resursele agroalimentare mondiale), populația în continuă creștere, respectiv cererea sa de alimente.

Scopul cercetării care face obiectul prezentei lucrări de licență a constat în identificarea unor concentrații optime de zaharoză adăugată în mediul de cultură, utilizat în multiplicarea cartofului Solanum tuberosum var. Gersa – 14381. Ipoteza de la care am pornit a fost aceea că prin creșterea concentrației de zahăr în mediul de cultură se stimulează formarea de vitrotuberculi de cartof.

Mulțumesc pe această cale Universității din Oradea, Facultății de Științe, Departamentului de Biologie pentru că mi-au pus la dispoziție – în cadrul Laboratorului de Biotehnologie Vegetală – materialele necesare efectuării experimentelor de micropropagare in vitro, precum și d-nei sef lucr. dr. Adriana Petruș, pentru sprijinul acordat în calitate de conducător știintific al lucrării.

I.2. CULTURILE IN VITRO – INSTRUMENT AL BIOECONOMIEI

I.2.1. Caracteristicile culturilor in vitro vegetale

Termenul de biotehnologie reprezintă o denumire hibridă formată din fuzionarea cuvintelor grecești: “bios” =viață, “techene” = lucru făcut cu mâna și “logos” = știință. Acest domeniu oferă idei pentru soluționarea problemelor legate de epuizarea resurselor de hrană, de combustibili sau ajută la fabricarea de noi medicamente pentru combaterea anumitor boli.

Țara noastră, integrată fiind în Uniunea Europeană, respectă strategi comune stabilite la nivel european. Comisia Europeană în ianuarie 2002 a stabilit o strategie asupra științelor vieții și biotehnologiei care să formuleze politici durabile și responsabile pentru ca resursele umane, industriale și financiare să fie folosite pentru satisfacerea nevoilor umane.

Micropropagarea (culturile in vitro) la plante este o înmulțire clonală realizată in vitro, care folosește diferite tipuri de fitoinoculi, culturile primare fiind inițiate din variate explante, proceduri făcute să asigure o proliferare accelerată de muguri urmați de lăstari (Schaeffer, 1990).

Micropropagarea este cea mai rapidă metodă de înmulțire a plantelor folosită de ani buni în industrie. Cu ajutorul micropropagării laboratoarele clonează plante pe baza unor protocoale bazate pe descoperi din trecut, dar care suferă modificări pe baza noilor descoperi.

Murashige (1974) a definit patru stadii ale micropropagării:

1 .inițierea culturii aseptice

2. multiplicarea fitoinoculilor

3. preaclimatizarea vitroplantulelor în vederea transferării lor ex vitro

4. transferarea vitroplantulelor în mediu septic de viață

Etape obigatorii în realizarea unei culturi in vitro:

înființarea sau inițierea unei vitroculturi vegetale viabile, care sa prezinte o capacitate regenerativă cât mai ridicată;

incubarea și creșterea dirijată a fitoinoculilor, ceea ce presupune nu numai amorsarea proceselor regenerative, ci și a celor de morfogeneză;

subcultivarea (repicarea sau transferarea – pasarea – culturilor) fitoinoculilor în funcție de scopul urmărit;

conservarea culturilor;

transferarea ex vitro a plantulelor generate in vitro și aclimatizarea acestora la regimul de viață septic.

Pentru realizarea acestor etape trebuie ținut seama de urmatoarele aspecte:

asigurarea asepsiei

prelevarea explantelor din organul sau organismul plantei mamă, din legăturile existente între celule și țesuturi;

inocularea explantelor pe un substrat nutritiv și menținerea lor într-un mediu ecofiziologic optim, controlat;

perpetuarea, în timp, a culturii inițiale sau obținerea de subculturi de alt tip (de exemplu din calus, culturi de celule, sau din culture de protoplaști, microcalusuri).

I.2.2. Importanța biotehnologiilor vegetale în asigurarea hranei

În condițiile în care cerințele umanității depășesc resursele naturale ale planetei , iar deteriorarea mediului înconjurătr afectează semnificativ producția de alimente, există necesitatea de a identifica noi direcții pentru a evita colapsul economic care se întrevede. Cercetările au arătat că, o creștere a temperaturii cu un grad Celsius poate cauza o scădere a producției de grâu, orez și porumb de 10%, astfel încât, într-un secol, recoltele ar putea fi distruse. Pe de altă parte, scăderea resurselor de apă subminează – în egală măsură – securitatea alimentară. Resursele de apă scad, în țări locuite de mai mult de jumătate din populația globului. Securitatea alimentară a planetei noastre depinde de eforturile combinate ale ministerelor agriculturii, energiei, transporturilor, sănătății și resurselor de apă din întreaga lume. Brown a tras un semnal de alarmă în legatură cu dezechilibrele provocate de dezvoltarea economiei globale, de evoluția civilizatiei actuale, asupra resurselor de bază – hrană, apă și energie (Brown, 2005, 2011 a și b).

Conform „Declarației Mondiale asupra Nutriției" (FAO/OMS, Roma, 1992) și a „Declarației asupra Securității Alimentare Mondiale" (FAO/OMS, 1996), „securitatea alimentară există atunci când toți oamenii, în orice moment, au acces fizic și economic la alimente sigure și nutritive care îndeplinesc necesitățile de hrană ale organismului uman, pentru a duce o viață sănătoasă și activă" (Purcărea și colab., 2012).

Componentă a securității alimentare, siguranța alimentară este determinată de cel puțin trei condiții pe care trebuie să le respecte un produs neprelucrat, prelucrat parțial, prelucrat total sau nou creat:

Să aibă inocuitate, să fie salubru, să nu pună în pericol consumatorul;

Să aibă valoare nutritivă și energetic;

Nutrienții alimentari să fie disponibili pentru organism.

În condițiile în care, populația lumii va crește considerabil pânǎ la 9,1 bilioane, în anul 2050, se impune creșterea producției unor alimente cu valoare nutritivă superioară și îmbunătățirea alimentației întregii populații: valorificarea materiilor prime agricole, diversificarea producției, ridicarea calității și a modului de prezentare a produselor, mecanizarea și automatizarea proceselor tehnologice etc. (Purcărea și colab., 2012).

Biotehnologia vegetală reprezintă un instrument în producția de alimente pentru om, dar și pentru animale. O populație globală consumatoristă va avea nevoie de hrană (Fig. 1). În acest sens și producția de alimente va trebui să crească cu cel puțin 70%, în condițiile în care suprafețele agricole scad. Conform statisticilor se arată că mai mult de 1,3 miliarde de oameni au lipsuri alimentare suferind de foame și că 24000 de oameni mor zilnic din cauza inaniției.

Fig.1. Dinamica consumului de alimente (UN World population prospects: The 2006 revision).

Domeniul culturilor de țesuturi și celule vegetale reprezintă o direcție de cercetare care deține încă numeroase necunoscute. Studiile referitoare la investigarea reactivității celulelor, țesuturilor, organelor sau a plantulelor aflate în regim de vitrocultură, și cele privind comportamentul vitroplantulelor, în cazul transferării lor din in vitro, ex vitro, în mediul natural de viață, în funcție de condițiile ecofiziologice la care acestea urmează să se adapteze în momentul trecerii acestora în mediul septic, trebuie bine analizate și cunoscute, pentru a putea fi îmbunătățită calitatea materialului de plantat obținut prin vitrotehnici, ceea ce aduce beneficii economice importante (Petruș-Vancea și colab., 2013).

An de an, continuă să se descopere noi aspecte – de natură fundamentală sau aplicativă – referitoare la particularitățile de reactivitate ale fitoinoculilor, în dependență de factorii de mediu în care aceștia sunt crescuți, mai ales cu referire la micropropagare. Atât implicațiile teoretice, cât și cele economice, ale biotehnologiei vegetale, nu pot fi pe deplin previzibile. Progresele științifice și tehnice realizate în secolul XX au facilitat evoluția rapidă a cercetărilor în domeniul biotehnologiilor vegetale, permițând – totodată – acumularea de elemente teoretice, indispensabile în obținerea de noi succese în studiile care se referă la cultivarea in vitro a țesuturilor și celulelor vegetale, precum și mediatizarea lor eficientă în mediile interesate.

Biotehnologia modernă dispune de procedee care facilitează ridicarea productivității culturilor agricole, dar și a calității produsului agricol, de exemplu o mai bună rezistență la transport, scurtarea duratei de vegetație, rezistență la secetă, la ger, la sărăturarea solurilor, la boli, sporirea producției de masă lemnoasă în silvicultură, obținerea de produși fitoterapeutici din plantele medicinale etc. Metodele biotehnologice permit – într-o oarecare măsură – producerea de material de plantat liber de viroze sau alte boli, în funcție de tipul adoptat de vitrocultură (de exemplu, culturi de meristeme), ceea ce înseamnă producerea unor culturi superioare din punct de vedere calitativ, dar și mai productive (Petruș-Vancea și colab., 2013).

I.2.3. Bioeconomie – concept, paradigmă

Bioeconomia reprezintă o nouă ramură științifică, ”hibridă”, care are la bază teoria savantului American, de origine română, Georgescu-Roegen (1975), care, contrar gândirii economice clasice, analizează activitatea din economie ca o continuare a evoluției biologice cu mijloace extrasomatice – așadar culturale și sociale. În locul economiei standard – dominantă astăzi – „concepută ca și când întreaga populație ar fi compusă exclusiv din orășenii țărilor celor mai dezvoltate”, autorul propune orientarea spre bioeconomie, adică înțelegerea activității economice ca „o prelungire a vieții biologice a omului”, al cărei scop fundamental și produs final trebuie să fie „fluxul imaterial al plăcerii de a trăi” (Popescu și Filimon, 2009). Georgescu-Roegen a analizat “activitatea din economie ca o continuare a evoluției biologiei cu mijloace culturale și sociale”. Georgescu-Roegen demonstrează prezența unor limite termodinamice. El considera că biosfera e un sistem închis și că omul care prin activitatea lui va produce entropie care va epuiza pas cu pas toate resursele energetice ale pământului. Soluția lui ar consta în diminuarea producției și a “descreșterii”, producția să nu se focalizeze pe bunuri fizice. “Pentru viitor, actuala economie consumatoristă trebuie înlocuită cu economia bazată pe economie și protecția mediului, oamenii de știintă aducându-și contribuție majoră în acest sens” (Ardelean si colab., 2011).

În biotehnologia vegetală, cercetarea aplicativă legată de valorificarea speciilor ameliorate este deosebit de importantă,deoarece variantele de variabilitate rezultate din operațiunile de inginerie genetică au nevoie de timp pentru a se putea evalua și confirma calitățile noilor genotipuri create în laborator, perioadă care poate dura minim doi ani (Petruș –Vancea și colab., 2013).

Biotehnologia axată pe cercetări legate de este una dintre modalitățile de eradicare a foametei, care ia în considerare principiul de bază al politicii Uniunii Europene (UE) privind siguranța alimentelor, mentelor, prin abordarea integrată a problemelor care să acopere toate sectoarele lanțului alimentar, cum ar fi ”de la fermă până la consumator”, inclusiv producția de furaje (Bogdan și colab., 2010). UE are o strategie cuprinzătoare privind siguranța alimentară. Acesta sintagmă se referă nu numai la siguranța alimentelor, ci și la sănătatea și bunăstarea animalelor și plantelor. Strategia oferă posibilitatea de a urmări produsele alimentare de la fermă până la consumator și, dacă este nevoie, să se extindă în interiorul granițelor UE.

I.3. MICROPROPAGAREA IN VITRO LA SOLANUM

1.3.1. Cartoful cultivat – în perspectiva extinderii variabilității genetice

Familia Solanaceae prezintă 84 de genuri cu 3000 de specii, și dintre care unele cu importanță agricolă: Datura, Lycopersicon, Nicotina și Solanum.

Genul Solanum este bogat în specii, aproximativ 2000 reprezentanți (Hawker, 1978; 1990), iar 160-180 dintre acestia producând tuberculi. Acestea din urmă prezintă urmatoarele niveluri de ploidie: 2x(73%), 3x(4%), 4x(15%), 5x(2%) si 6x(6%) (Brown, 1994).

Evoluția genetică a cartofului s-a realizat în timp prin introducerea unor gene care să le facă rezistente la anumite boli: mana, virusul Y, virusul X, virusul răsucirii frunzelor, rezistența la nematozi (Spooner si Bamberg, 1994). Speciile spontane de Solanum se caracterizează prin distribuția geografica diferită și gradul mărit de adaptare ecologică, împreună cu rezistența la stresul provocat de mediu ambiant (Dinu, 2003) .

Speciile spontane ale genului Solanum (Hawkes, 1990) au rezerva de diversitate alelica și o rezervă genetică importantă la identificarea caracterelor genetice responsabile de rezistența la boli și dăunatori, și introducerea acestora în programele de ameliorare. Surse neexploatate de rezistență genetică din genul Solanum sunt folosite pentru combinarea lor în cadrul genomului cartofului commercial (Brandshaw și Mackay, 1994; Spooner și Bamberg, 1994). Genul Solanum are valoare în vederea realizării cercetărilor de biologie celulară și moleculară și ingineria genetică vegetală, din domeniul biotehnologiei vegetale (Dinu, 2003). Se urmăresțe introducerea unor caracteristici genetice de rezistență la unele boli, dăunători, factori de mediu, prin metode de ameliorare neconventională de la speciile spontane de solanacee în genofondul cartofului cultivat (Dinu și Pop, 1997) .

Cartoful cultivat actual (Solanum tuberosum sp. tuberosum L.) este considerat una din plantele de cultură cultivate în zona temperată, foarte important din punct de vedere economic și alimentar (Ross, 1986; Zuba si Binding, 1989).

Tuberculii de cartofi sunt sursă de amidon și proteine, proteine care au aminoacizi esențiali greu întâlniți și la alte plante cultivate (Ross, 1986). De asemenea, au lipide, săruri minerale și vitamine hidrosolubile (grupul vitaminelor B și acidul ascorbic) (Brown, 1994).

Deoarece cartoful cultivat se multiplică preponderent vegetativ, se ameliorează greu prin metodele clasice. Soiurile obținute prin încrucișare și retroîncrucișare sunt foarte sensibile la dăunători și boli (Dinu, 2003). “În strategia de ameliorare clasică, bazată pe metoda pedigreelor sau a selecției recurente, soiurile selectate sau liniile ameliorate se retroîncrucișează, iar descendenta se testează în câmp, pe suprafețe mai mari și în regiuni variate, atât pentru trăsăturile agricole ale tuberculilor, codificate poligenic, cât și pentru caracteristicile lor de resistență la bolile produse de diferiți agenți patogeni și dăunători, la acțiunea pesticidelor și a erbicidelor. Sunt necesari opt până la zece ani de selecție continuă, prin propagare vegetativă, pentru a obține unul sau doi hibrizi F1 capabili să dea soiuri noi (Mackay, 1987), sau chiar zece până la cincisprezece ani (Brown, 1994) “ .

Cartoful comercial este o specie alotetraploidă segmental, pentru majoritatea caracteristicilor valoroase (2n=4x=48), prezentând fenomenul de depresie înnăscută, datorită retroîcrucișării cu parteneri recurenți și respectiv împerecherii genitorilor înrudiți (Brown, 1994).

Ameliorarea clasică a cartofului este limitată de fondul genetic care este destul de îngust al soiurilor tetraploide de segregare genetică (Dinu, 2003). Programele actuale de ameliorare au scopul de a integra genele în același genotip pentru a avea o producție mărită și a crește adaptarea la factorii naturali de mediu (Chiru si colab., 1992).

Soiurile cultivate momentan, în Europa și America de Nord, au un fond genetic îngust, datorat încrucișării și selecției la nivel tetraploid. Aceste soiuri se obtin in urma unor selecții naturale și artificiale și sunt rezultatul unor procese de hibridare în specii diferite. Fiindcă programele de ameliorare au avut un scop în accentuarea trăsăturilor agronomice cantitative, majoritatea soiurilor de cartof au devenit sensibile la anumiți dăunători și agenți patogeni. Cartoful este folosit în multe experimente biotehnologice (Fig.2.)

Fig. 2. Metode de biotehnologie vegetală la cartof) deoarece are importanță economică, asigură menținerea unor trăsăturii importante, valoroase pe cale vegetativă, și dezvoltarea reproductivă prin regenerarea plantelor in vitro (Dinu, 2003) .

I.3.2. Metode de multiplicare la specii din Genul Solanum

Kut și Evans (1982) au identificat condiții optime pentru regenerarea vitroplantulelor din explante de frunze cultivate, la opt specii diferite de tomate sălbatice (Lycopersicon) și la două specii strâns înrudite cu Solanum. Din opt medii testate, mediul bazal MS suplimentat cu 5 μM citochinină 6-benziladenină s-a dovedit a fi cel mai bun mediu de regenerare dintre toate. Frecvența de regenerare a variat semnificativ între specii cu o frecvență maximă de regenerare observată la L. chilense, L. peruvianum și S. lycopersicoides.

Fish și colaboratorii (1987) au dezvoltat tehnici de izolare a protoplastelor, aplicabile unor genotipuri de Solanum tuberosum dihaploide. A fost folosit mediu de cultură cu adaos suplimentar de calciu și cu pH ridicat, pentru a determina fuzionarea protoplastelor provenite din mezofil foliar de S. tuberosum dihaploid (PDH40) și de la specii sălbatice diploide de S. brevidens. În urma fuziunii a fost obținut un număr mare de colonii, iar hibrizii au fost selectați pe baza fenotipului, din lăstarii regenerați. Dintre aceștia, 11 plante hibride somatice au fost identificate prin tiparele lor izoenzimatice și caracterele morfologice. Patru dintre acești hibrizi au prezentat numărul așteptat de cromozomi, și anume 48. La momentul respectiv s-a dorit abordarea cultivării în masă a acestor hibrizi, precum și aplicarea hibridizării somatice la creșterea cartofului.

Wilson și colaboratorii (1993) au examinat efectele calitative spectrale ale luminii asupra creșterii in vitro a cultivarurilor de butași nodali de cartof (Solanum tuberosum L.) cultivarurile Norland, Superior, Kennebec și Denali. Diversele spectre de lumină au fost oferite de: Vita-Lite fluorescent (VF) (o lumină albă de control), fluorescent albastru (BF), fluorescent roșu (RF), sodiu la presiune joasă (LPS) și o combinație de sodiu la presiune joasă cu lămpi cu lumină fluorescentă albă (LPS/CWF). L a4 săptămâni de cultură in vitro, la toate cultivarurile, lungimea tulpinii a fost mai mare la lotul iluminat cu LPS, urmată de cel menținut sub lumină RF, LPS/CWF, VF și BF (în ordine descrescătoare). Cel mai mare număr de tulpini auxiliare au apărut la plantele crescute sub LPS sau LPS/CWF, în timp ce numărul minim a fost înregistrat la plantulele menținute sub BF. Nu au apărut edeme ale frunzelor sau tulpinilor (calus) la iluminare cu LPS sau LPS/CWF și de asemenea nu au apărut edeme la plantulele de cv. Norland, indiferent de iluminare. Rezultatele sugerează că dezvoltarea morfologică a lăstarilor plantelor de cartof crescute in vitro poate fi controlată prin gestionarea calității radiației spectrale.

Prasad și Potluri (1996) au studiat efectele furnizării de prolină și hidroxiprolină asupra varietăților de cartof (Solanum tuberosum L.T.8 și Desiree), folosind explante de muguri axilari, în prezența și absența sării 0,6%. La ambele varietăți, efectele furnizării exogene de prolină și hidroxiprolină în concentrații de 1,0 mM și 2,5 mM au fost mai puțin severe, decât prin adaosul de doar 0,6% sare. În același timp, acumularea de prolină, proteină, carbohidrați, sodiu și potasiu a fost similară. Totuși, atunci când, atât sarea cât și prolina/hidroxiprolina au fost adăugate mediului de cultură, prolina și hidroxiprolina au conferit o oarecare protecție împotriva acțiunii sării. Se crede că nivelele ridicate de prolină la L.T.8 și carbohidrații crescuți la Desiree datorită prezenței prolinei / hidroxiprolinei furnizate exogen sunt responsabile de protecția adițională împotriva sării la culturile de muguri axilari ale acestor varietăți.

Okrslar și colaboratorii (2002) au creat un mediu eficient pentru micropropagarea in vitro la Solanum laciniatum Ait. Inducerea lăstarilor pe explante de frunze a fost cu cea mai mare rată de succes în mediul Murashige și Skoog (MS) suplimentat cu 10 μM N6 – benziladeină și 1μM α – acid naftalen acetic (NAA). Adăugarea de BA (13 μM) a fost optimă pentru multiplicarea lăstarilor. De asemenea, autorii menționați anterior au obținut dezvoltarea rădăcinii la lăstarii, într-un mediu fără regulatori de creștere. La fiecare subcultură, au fost obținuți 20 – 25 de lăstari pe fiecare explantă, dintre care între șase și opt au fost potriviți pentru separare și înrădăcinare ulterioară. Explantele de tip frunze, dezvoltate in vitro au fost infectate cu succes cu Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834. Cultura rădăcinilor păroase dezvoltată a fost mai productiva, din perspectiva greutății uscate, atunci când s-a folosit un mediu MS cu concentrație înjumătățită, comparativ cu lotul cultivat pe mediu MS cu concentrație completă și adaos de 3% sucroză, respectiv mediu MS cu concentrație completă și adaos de 6% sucroză. Cantitatea de glicoalcaloide ce conțin solasodină, identificată în rădăcinile păroase – determinată cu ajutorul metodei colorimetrice – a fost de 0,3 – 1% din greutatea uscată, mai mult decât la cultura lăstarilor (0,5% din greutatea uscată) și mai puțin decât la frunzele plantelor crescute in vivo (1,1 – 1,4% din greutatea uscată).

Pentu a folosi microtuberii în conservarea germplasmei cartofului au fost studiate principalele efecte ale genotipului, acidului abscisic (ABA) și nivelul zaharozei și efectul lor asupra producerii de biomasă, microtuberizare, inactivitatea microtuberilor și conținutul masei uscate (Gopal și colab., 2004). ABA a scăzut atât producerea de microtuberi, cât și inactivitatea microtuberilor, în timp ce concentrațiile mari de zaharoză (60-80 g 1-1) au stimulat producerea de biomasă, producerea de microtuberi, cât și conținutul de materie uscată a microtuberilor. Microtuberii depozitați la lumină difuză au avut o inactivitate mai prelungită, decât cei ținuți încontinuu la întuneric. Interacțiunile între diverși factori au condiționat efectele principale ale anumitor trăsături. Comportamentul in vitro a genotipurilor studiate a fost legat de cel in vivo la majoritatea caracteristicilor (Gopal și colab., 2004). Microtuberii produși în medii fără ABA și cu concentrații mari de sucroză și N6 benziladenină (44.38 μM) au putut fi depozitați 12 luni în lumină difuză la 6 ±1ºC.

Rolul aplicării exogene de acid ascorbic în creșterea rezistenței la NaCl la Solanum tuberosum a fost studiat de Sajid și Aftab (2009). Vârfuri de lăstari prelevate de la plante crescute 60 de zile in vitro în cazul a două cultivaruri de importanță comercială, și anume Solanum tuberosum L., Desiree și Cardinal, au fost inculate în mediu Murashige & Skoog (MS) suplimentat cu 0.5 mM acid ascorbic, timp de 72 de ore, ca pre-tratament. Vârfurile de lăstari pre-tratate și cele care nu au fost pre tratate au fost transferate în mediu MS cu diferite concentrații de NaCl (0-140 mM; opt tratamente). Au fost înregistrate rezultatele referitoare la trăsăturile morfologice (lungimea lăstarilor, numărul lăstarilor, lungimea rădăcinii și numărul de noduri) și biochimice (activitatea proteinelor, peroxidazei, catalazei și superoxid dismutazei), după 60 de zile de tratament cu sare. În mod similar, culturile de calus bine dezvoltate cu o vechime de 60 de zile au fost, de asemenea, tratate, în prealabil, cu acid ascorbic, timp de 24 de ore și apoi transferate într-un mediu optim pentru proliferarea calusurilor, cu diferite concentrații de sare. Rezultatele au fost înregistrate procentual, după 60 de zile de tratament cu sare, respectiv creșterea relativă a greutății proaspete și parametrii biochimici. Salinitatea a inhibat puternic toți parametrii de creștere, la ambele cultivaruri. Tratamentul în prealabil cu acid ascorbic al plantelor tratate cu sare, cât și a culturilor de calus au indicat diferențe semnificative cu privire la aproape toți parametrii de creștere și biochimici studiați, comparativ cu lotul martor. Conținutul de proteine, precum și activitățile catalazei și superoxid dismutazei au crescut semnificativ la ambele cultivaruri, deși activitatea peroxidazică a indicat un trend descendent la plantele tratate cu acid ascorbic, precum și la culturile de calus (Sajid și Aftab, 2009).

I.3.3. Metode de stimulare a tuberogenezei in vitro la cartof

Concentrațiile ridicate de zaharoză în mediul de cultură prezintă avantajul acumulării de amidon în țesuturi, acesta servind ca substrat de rezervă și ca potențială sursă de energie, importantă în procesul de aclimatizare. În principal, zaharoza este utilizată ca sursă de carbon și de energie, fapt care se reflectă în evoluția activității diferitelor enzime esențiale implicate în degradarea și sinteza amidonului (Cachiță, 1994; Van Huylenbroech și Debergh, 1996).

Jarret și colaboratorii (1981) au semnalat faptul că formarea lăstarilor adventivi din discuri ale tuberilor cartofului, explantate într-un mediu Murashige&Skoog – conținând N6-benzilaminopurină (BAP) (3.0 mg/l) și α – acid naftalen acetic (NAA) (0.01 mg/l) – a fost afectată de acidul giberelic (GA). Prezența GA în mediul explantare a fost necesară pentru formarea lăstarilor iar 3 x 10-10 M GA părea optimă. Totuși, examinarea microscopică a protuberanțelor țesutului discurilor tuberilor din care au apărut lăstari, a indicat că GA a inhibat formarea meristemelor lăstarilor. Discurile tuberilor cultivate 6 săptămâni în mediu MS conținând BAP și NAA fără GA nu au inițiat lăstari adventivi care ar fi putut fi observați cu ochiul liber, dar examinarea microscopică a protuberanțelor țesuturilor a dezvăluit prezența numeroaselor meristeme de lăstari. Transferul ulterior al acestor discuri de tuberi într-un mediu cu GA, dar fără BAP și NAA a condus la formarea de lăstari la 100% dintre discurile recultivate. Prin urmare, se pare că, deși GA inhibă inițierea meristemelor de lăstari din discuri ale tuberilor cartofilor, el este necesar dezvoltării lăstarilor, odată ce meristemele sunt inițiate.

Lăstarii crescuți din primul nod, provenit din plantule micropropagate de cartof, dau naștere microtuberilor, atunci când sunt plasați în mediu Murashige & Skoog, cu 6% zaharoză și 2.5 mg/l kinetină și incubați la întuneric, la 19ºC (Bourque și colab., 1987). Microtuberii produși din cultivarul Superior au demontrat un conținut similar de proteine ca și tuberii cultivați pe câmp. La fel ca și la tuberii cultivați pe câmp, glicoproteina principală din tuberi 40 000-dalton, numită patatină, s-a acumulat în cantități mari în microtuberi, atingând 3.7 ± 0.2 mg/g greutate proaspătă, după 90 de zile de cultură in vitro. La fel ca și la plantele cultivate pe câmp, tulpinile și frunzele plantulelor micropropagate nu au conținut niveluri detectabile de patatină, ci doar cantități mici sub o formă distinctă electroforetică acumulată în rădăcini. Patatina mRNA este detectabilă imediat în microtuberii în formare, la 15 zile de la transferul lăstarilor în mediu inductiv. Patatina mRNA a fost, de asemenea, prezentă în rădăcini, dar la fel ca și la plantele crescute pe câmp, a fost de 50 până la 100 de ori mai puțin abundentă și a putut fi distinsă în tuberi la prima extensie. Dezvoltarea microtuberilor și acumularea patatinei au fost inhibate de către acidul giberelic.

Protacio și Flores (1992) au studiat implicarea poliaminelor libere și conjugate în formarea tuberilor la explantele de Solanum tuberosum cv. cultivate in vitro. Tuberii s-au dezvoltat din mugurii axilari, la 100% din explantele cultivate în mediu MS cu conținut ridicat de zaharoză și suplimentat cu kinetină (Kin) și clorură de clorcolină (CCC). Adăugarea de regulatori de creștere nu a fost esențială pentru formarea tuberilor, deși tuberi mai mici s-au format în mediul fără Kin și CCC. Formarea tuberilor a fost inhibată la aproximativ 75% din explantele tratate cu 0.5 mM difluoro-metil-ornitină (DFMO), un inhibitor specific și ireversibil a ornitin decarboxilazei. Efectul inhibitor al DFMO a fost aproape complet schimbat de adaosul de putrescină. Adăugarea difluoro-metil-argininei (DFMA), inhibitorul analog al arginin decarboxilazei, nu a avut nici un efect asupra formării tuberilor. DFMO, dar nu și DFMA, a inhibat de asemenea dezvoltarea mugurilor axilari în lăstari la explantele crescute la lumină. Acidul amino oxi fenilpropionic (0.1 la 0.25 mM), un inhibitor al fenilalaninei amoniu-liazei, a cauzat o reducere drastică a putrescinei cinamoil, dar nu a a avut nici un efect asupra formării tuberilor. Rezultatele noastre sugerează că acizii hidroxicinamici nu influențează formarea tuberilor dar pot servi ca rezervoare de stocarea a poliaminelor. Autorii menționați mai sus susțin ipoteza că poliaminele derivate pe calea mediată de ornitin decarboxilază sunt necesare pentru formarea tuberilor in vitro, probabil într-o fază incipientă a morfogenezei implicând a diviziune activă a celulelor.

Minibutași uninodali din lăstari de cartof cultivați in vitro în mediu lichid în prezența ancimidolului (23,4 μM) au evoluat în buchete de muguri, atât în recipiente care se agită cât și în bioreactoare (Ziv și Shemesh, 1996). Mugurii au dezvoltat tuberi, după subcultură în mediu de inducere a tuberilor, cu 23.2 μM kinetină, 19.5 μM ancimidol și 6-8% zaharoză. Numărul tuberilor per grup și dimensiunile lor au fost mai mari în mediu de inducere agarizat, peste care a fost adăugat un al doilea strat de mediu lichid. De asemenea, tuberogeneza a fost ridicată la loturile din recipientele menținute pe agitatoare și cel mai puțin întensă la culturile din bioreactoare. Cea mai mare creștere a dimensiunii tuberilor (respectiv 720 mg greutate proaspătă, după 7 săptămâni), a fost obținută în culturile agarizate, agitate de două ori, în mediu lichid de inducere a tuberilor. Autorii subliniau posibilitatea utilizării culturilor în bioreactoare, la specii de cartof, proliferarea mugurilor și stimularea dezvoltării tuberilor în mediu lichid de cultură în dublu strat.

Veramendi și colaboratorii săi (1997) au identificat faptul că PhytagelTM , ca agent de solidificare a mediului de cultură, a permis producerea de internoduri mai mari, tuberizarea in vitro mai rapidă și tuberi mai mari la Solanum tuberosum L. cv. Baraka, comparativ cu Difco Bacto-agar, în culturi cu fotoperioadă de 8 ore în întuneric din 24 h. Agest agent de gelificare a condus, de asemenea, la stimularea tuberogenezei la întuneric. Doar 2% (wt/vol) de PhytagelTM a permis micropropagarea și microtuberizarea optimă în regimul fotoperioadei menționate anterior. Autorii au semnalat faptul că umiditatea nu influențează diferențele de creștere și tuberizare observate la loturile provenite de pe mediile ce conțin agenții de gelifiere menționați mai sus. În consecință, PhytagelTM pare a fi o alternativă avantajoasă de înlocuire a agarului, pentru micropropagarea și microtuberizare.

Pruski și colaboratorii (2002) au testat efectele acidului jasmonic (AJ) asupra tuberizării in vitro a explantelor nodale de catrof din cultivarurile Sangre și Russet Burbank, în condiții de mediu lichid și solid și cu o fotoperioadă de la 0, 8, la 16 ore de întuneric/24 h. Explantele au fost obținute din material de plantat, cultivat în mediu suplimentat cu 2.5 μM JA, care a trecut prin faza de tuberizare mai ales la întuneric. Cele mai evidente beneficii ale tratamentului cu JA, aplicat în prealabil explantării, au fost observate în condiții cu fotoperioadă de 16 h, cunoscută că inhibă tuberizarea. Cultivarul Sangre a beneficiat de tratarea materialului de plantare cu JA în primă fază, mai mult decât Russet Burbank. Acesta din urmă a necesitat suplimentare cu JA în mediul de tuberizare, pentru a atinge același grad de stimulare. Per ansamblu, microtuberii produși, fie prin intermediul materialului de plantare tratat cu JA, fie prin suplimentarea cu JA în mediul de tuberizare, au fost mai uniformi și mai mari decât cei obținuți prin alte procedee. Fotoperioada de opt ore a fost de departe cel mai bun tratament în producerea de microtuberi uniformi, de înaltă calitate. Autorii menționați anterior propun tratarea materialului de plantare cu JA, înainte de a preleva explante în vederea tuberizării, pentru a crește calitatea microtuberilor.

Sarkar și colaboratorii (2010) au demonstrat că rolul K+ în tuberizarea cartofului (Solanum tuberosum L.), bazat pe efectele fertilizatoarea ale K și pe schimbarea solului K+, pare a fi în mare parte contradictoriu. Astfel că, în concentrații mari, K+ este în detrimentul dezvoltării tuberilor in vitro, odată ce inducerea a avut loc. Un sistem experimental care a folosit lăstari cu un singur nod cultivați in vitro a indicat faptul că valorile ≥ 30.0 mM ale K+ reduc semnificativ masa proaspătă a tuberilor, concomitent cu o scădere a conținutului de amidon. Oricum, K+ nu a afectat inducerea tuberilor, ca număr al acestora, dezvoltați per lăstar. Valori ridicate ale K+ au indus un efect inhibator asupra dezvoltării tuberilor, iar acesta fost atribuit unei rate reduse de asimilare. Transportul 86Rb(K) către stoloni, și tuberii ce au acționat ca și canale puternice in vitro au fost proporționali cu nivelele K+ exogen; oricum acumularea 86Rb și depozitarea K+ au fost puternic reduse la tuberi, comparativ cu cele din stoloni, mai ales la valori mari ale K+. Rezultatele au indicat o slăbire a canalelor dezvoltate de către tuberii tratați cu K ridicat. Corelările negative extrem de semnificative dintre acumularea 86Rb / depozitarea K+, atât în organe, cât și în masa proaspătă a tuberilor, au subliniat efectul inhibitor al valorilor mari de K+ asupra dezvoltării tuberilor. Rata îndepărtării K in vitro la tuberi a fost similară cu cea a îndepărtării K la culturile in vivo, sugerând mecanisme de aport și transport al K foarte bine conservate pe durata procesului de tuberizare. Rezultatele au fost discutate în contextul efectelor posibile ale K+ ridicat în împiedicarea aportului și metabolismului zaharozei.

I.3.4. Efectul sursei de carbon asupra micropropagării

Majoritatea plantulelor cultivate in vitro au nutriție mixotrofă sau heterotrofă, cu excepția cultivate în sistem fotoautotrof. Lipsa sursei de carbon din mediul de cultură, poate conduce la o necrozare treptată a țesuturilor și la moartea acestora (Cachiță, 1987).

Keul și colaboratorii (1999) au demonstrat faptul că natura sursei de carbon, în decursul multiplicării in vitro a plantelor de Leontopodium alpinum, joacă un rol important în regenerare. Autorii menționați anterior au testat efectele zaharozei, ale glucozei și ale fructozei, în concentrații de 10, 20 și 30 g/l, asupra capacității de înrădăcinare in vitro. Fructoza, în concentrație de 20 g/l s-a dovedit a fi cea mai eficientă sursă glucidică. Pe de altă parte, pe medii cu adaos de glucoză, s-a constatat cea mai ridicată rizogeneză. Cu cât concentrația de fructoză a crescut, cu atât s-a înregistrat o reducere a taliei rădăcinițelor. În ceea ce privește glucoza, rezultatul a fost invers, lungimea rădăcinițelor a fost direct proporțională cu concentrația glucozei în mediul de cultură. Și în cazul zaharozei, cele mai bune rezultate au fost obținute pe mediul care a conținut acest glucid în concentrație de 20 g/l.

Sima și colaboratorii (2001) au evaluat efectul zaharozei asupra metabolismului cartofului in vitro (cv. Kennebec). Plantele au fost cultivate în trei medii diferite: mediu bazal Murashige și Skoog, ce conținea concentrații mari de azot cu 0 sau 20 g 1-1 zaharoză; sau un mediu modificat, ce conținea cantități reduse de azot și 20 g 1-1 zaharoză. Plantele cultivate pe medii cu adaos de 20 g 1-1 zaharoză și N crescut au prezentat fosfoenolpiruvat carboxilază mai crescută (PEPC) și activități ale piruvat kinazei, precum și concentrație mare a proteinei PEPC la 7, 20 și 33 de zile de cultură, comparativ cu cele cultivate cu 20 g 1-1 zaharoză și N scăzut, sau cu 0 g 1-1 zaharoză și N crescut (control). Cea mai mare acumulare de amidon și zaharoză a fost găsită la plantele crescute cu zaharoză și N scăzut. Această acumulare a apărut concomitent cu o activitate redusă a enzimelor rezultată dintr-o utilizare scăzută a α-ketoglutaratului, prin asimilarea azotului, atunci când plantele au fost cultivate cu N redus. Cercetările asupra ciclului acidului tricarboxilic au arătat că zaharoza a condus la reducerea cantităților de acid organic, atât în frunze, cât și în rădăcini, atunci când plantelor li s-a furnizat o cantitate mare de N. Acest lucru s-a datorat probabil eliminării puternice de α-ketoglutarat, fapt confirmat de măsurătorile asupra activității izocitrat – dehidrogenazei citosolice. Rata scăzută a glutaminei din frunză observată la plantele crescute cu zaharoză 20 g 1-1 și N ridicat, comparativ cu celelalte plante cultivate cu N scăzut, s-ar putea datora conversiei glutaminei în proteine, atunci când asimilarea N a fost intensă. Aceste rezultate demonstrează că zaharoza a susținut activitatea PEPC, crescând sinteza proteinelor. Rezultatele mai sugerează, de asemenea, că metabolismul zaharozei este implicat în refacerea ciclului acidului tricarboxilic, prin oferirea scheletelor de cabon necesare în susținerea utilizării fosfoenolpiruvatului pe durata asimilării valorilor ridicate de nitrați.

Yang și colaboratorii (2010) au demonstrat că producerea de metaboliți fenolici a fost optimizată în paralel cu micropropagarea trestiei de zahăr în bioreactoare cu imersie temporară (TIB – uri). Cultivarea plantelor micropropagate în aer îmbogățit cu 4% CO2 a indus activitatea lor fotosintetică prin susținerea schimbului de la o etapă metabolică heterotrofică, la una fotomixotrofică. Urmare a îmbogățirii cu 4% CO2 au crescut nivelurile de transcriere, atât ale fenilalaninei amoniu-liazei (PAL EF189195), cât și ale ribulozo – 1,5 – bifosfat carboxilază / oxigenază (Rubisco CF576750) și au fost corelate cu o creștere de 4.6 până la 6.3 a nivelurilor fenolice, atunci când plantele au fost multplicate, în 20 sau respectiv 30 g/l zaharoză. Autorii au identificat o nouă aplicare a metaboliților fenolici ai plantelor, ca elicitori ai rezistenței contra infecțiilor la tomate în patosistemul Solanum lycopersicum- Ralstonia solanacearum. Mediul de cultură a fost colectat, iar fenolii au fost pulverizați pe plantele de tomate infectate cu R. solanacearum, dezvoltând și/sau menținând o mecanism de semnalizare prin apărare timpurie, ce a rezultat în protejarea plantei împotriva infecției bacteriene. Analizele RT – PCR au confirmat că genele selectate din căile de apărare au fost exprimate diferențiat între plantele tratate cu metaboliți ai trestiei de zahăr, plante netratate și fără patogeni și plante netratate inoculate cu R. solanacearum.

Kraur și colaboratorii (2012) au folosit un strat de parafină lichidă (LPO) în depozitarea embrionilor somatici de Dendrocalamus, ce se multiplică rapid în condiții de creștere lentă. Creșterea lentă a fost asociată cu schimbări în metabolismul zahărului. O scădere accentuată a amidonului și al zaharurilor nereducătoare au indicat utilizarea rapidă a amidonului în țesuturile cu creștere rapidă embriogenice. Prin contrast, la embrionii somatici depozitați sub LPO în condiții de creștere lentă, o scădere treptată a amidonului a indicat utilizarea sa mai lentă. Prin urmare, creșterea embrionilor somatici sub LPO a fost suprimată iar subcultura nu a fost necesară. Încetarea din creștere sub LPO ce a urmat după 30, 90, 180, 270 și 360 de zile de depozitare, embrionii somatici au indicat o refacere și germinare semnificativă (79,78%, 77,49%, 71,22%, 67,13% și respectiv 59,99%) și au putut prolifera după transfer în mediu Murashige & Skoog, ce conținea 1 mg1-1 BAP și 2% sucroză.

Çürük și colaboratorii (2012) au investigat originea discrepanței dintre rezultatele experimentale ale culturilor in vitro a cultivarurilor de pepene turcesc (Cucumis melo L.), executate de aceeași persoană, folosind aceleași protocol și același lot de semințe, în două laboratoare diferite. Diferențele din sursele de zaharoză a fost descoperit ca fiind motivul principal al devierii rezultatelor dintre cele două laboratoare. Procentajul de explante regenerate și numărul protuberanțelor de tipul mugurilor și / sau lăstari a fost semnificativ mai mare atunci când a fost folosită o zaharoză folosită în alimentație, comparativ cu zaharoza folosită în scop analitic. Mediul ce conținea zaharoza folosită în alimentație a regenerat cu 37 și 67 % mai multe explante și protuberanțe de tipul mugurilor și / sau lăstari per explantă, față de mediul ce conținea zaharoza folosită în scop analitic. Nu a fost înregistrată nici o diferență semnificativă la elementele adăugate sau anioni între sursele de zaharoză, prin spectroscopie de masă. Singura diferență chimică, semnificativă, observată între mostrele de zaharoză a fost prezența melanoidinelor (produși ai reacției Maillard) în forma folosită în alimentație. Melanoidinele au avut o greutate moleculară mare (>3,000 Da determinat prin ultra filtrare), cu spectru ultraviolet vizibil caracteristic și activitate antioxidantă in vitro. Zaharoza ce conține melanoidină poate fi diferențiată prin culoare și spectroscopie.

Condițiile de mediu suboptimale din interiorul vaselor de cultură închise poate fi în detrimentul creșterii in vitro și supraviețuirii plantulelor pe perioada procesului de aclimatizare (Shin și colab., 2013). Autorii au analizat factorii de mediu care au afectat creșterea plantulelor de Doritaenopsis și relația dintre creștere și metabolismul zahărului. Culturile au fost menținute în condiții heterotrofice, fotoautotrofice sau fotomixotrofice, la diferite intensități ale luminii și concentrații de CO2. Creșterea fotoautotrofă a plantulelor hibride de Doritaenopsis a putut fi promovată semnificativ prin creșterea intensității luminii și a concentrației de CO2 din vasele de cultură. Concentrația diferitelor zaharuri din frunzele plantulelor crescute in vitro a variat odată cu diversele tratamente de cultură, pe perioada de 10 săptămâni de cultură. Conținutul de amidon, zaharuri reducătoare și nereducătoare a fost mai mare la plantulele crescute în condiții fotoautotrofice și fotomixotrofice, decât la cele crescute heterotrofic. Ratele fotosintezei nete au fost de asemenea mai mari la plantulele crescute fotoautotrofic și fotomixotrofic. Aceste rezultate susțin ipoteza că piruvatul, produs de decarboxilarea malatului, este necesar unei fotoautotrofii optime, la o densitate ridicată a fluxului de fotoni fotosintetici. Creșterea a fost cea mai pronunțată la plantulele crescute în condiții fotoautotrofice și fotomixotrofice îmbunătățite cu CO2 și cu o densitate ridicată a fluxului de fotoni fotosintetici. Statusul fiziologic al indivizilor de Doritaenopsis crescuți in vitro cu metabolismul acidului crasulacean (CAM) a indicat o tranziție de la C3 la CAM, înaintea aclimatizării.

II. STUDII PROPRII PRIVIND STIMULAREA TUBEROGENEZEI IN VITRO LA SOLANUM TUBEROSUM VAR. GERSA – 14381

II.1. SCOPUL CERCETĂRII

Scopul cercetării a constat în identificarea de metode noi de stimulare a formării de tuberculi in vitro, la Solanum tuberosum var. Gersa – 14381, prin suplimentarea mediului de cultură cu zaharoză.

Motivația alegerii temei

În funcție de scopul dorit, in cadrul micropopagării la cartof stimularea – prin metode ecoeconomice si bioeconomice – a formării de tuberculi, în vederea utilizării lor ca material de plantat este esențiala.

II.2. MATERIAL ȘI METODĂ

Materialul vegetal a constat din minibutași uninodali de cartof (Solanum tuberosum var. Gersa – 14381) (Fig. 3), prelevați de la vitroplantulă aflate în fitovitrobaza laboratorului de biotehnologie a Departamentului de Biologie a Facultății de Științe, din cadrul Universității din Oradea, cultivați pe mediu de bază, mineral, MS (1962), solid, lipsit de regulatori de creștere.

Fig. 3. Aspect al fitoinoculului de cartof (Solanum tuberosum var. Gersa), în prima zi de la inoculare (bara reprezintă 1 cm).

Mediul de cultură utilizat în cadrul experimentelor realizate cu culturi in vitro a fost cel Murashige-Skoog (MS) (1962), modificat de noi, și anume: vitaminele tiamină HCl, piridoxină HCl și acid nicotinic, în loc de 0,1 mg/l sau 0,5 mg/l, cât este prevăzut în rețeta originală, au fost adăugate câte 1 mg/l și s-au scos aminoacizii și s-a adăugat 7 g/l agar-agar, în loc de 10 g/l; pH-ul mediului de cultură a fost întotdeauna ajustat la valoarea de 5,7, prealabil autoclavării acestuia. Variantele experimentale testate sunt prezentate în tabelul de mai jos (Tabelul 1).

Tabelul. 1 Protocol experimental

Recipientele de vitrocultură au constat din vase din sticlă incoloră, cu înălțime de 11 cm și cu un diametrul de 4 cm, conținând câte 5 ml de mediu solid.

Incubarea și creșterea s-a realizat în camera de creștere la 21C 2oC, iluminare cu tuburi fluorescente de culoare albă, fotoperioadă de 16 h lumină din 24 h, intensitate luminoasă de 1 700 lx, timp de 90 luni (Tabelul 1).

II.3. REZULTATE ȘI DISCUȚII

II.3.1. Rezultate înregistrate la 30 de zile de la inoculare

Rizogeneza, exprimată prin număr rădăcinițe și lungimea acestora, la 30 de zile de la inoculare, a înregistrat sporuri de 0,63 cm, respectiv 0,34 cm, în cazul plantulelor aparținând lotului cu adaos de 60 g/l zaharoză (V1), comparativ cu valorile biometrizate la lotul martor, dar nesemnificative din punct de vedere statistic (Tabelul 2).

Pe de altă parte, formarea de rădăcinițe a fost inhibată de concentrația ridicată (de 90 g/l) de zaharoză (V2), cu 3,51 cm în ceea ce privește lungimea acestora, diferență negativă foarte semnificativă statistic (Tabelul 2).

Caulogeneza, exprimată prin număr de tulpinițe și lungimea acestora, precum și numărul de ramificații, a fost inhibată la 30 de zile, de surplusul de zaharoză adăugat mediului de cultură, în special la lotul V2, la nivelul căruia s-au semanlat diferențe negative foarte semnificative statistic, iar procentual înregistrându-se minusuri de până la 52%, în cazul taliei tulpiniței principale (Fig. 4 și Fig. 5).

Talia întregii vitroplantule a fost foarte semnificativ inhibată de cantitatea ridicată de zaharoză din mediul de cultură (90 g/l) (Tabelul 2), valori exprimate procentual prin minusuri de 51% (Fig. 4).

Tuberogeneza – dar foarte redusă în acest moment al experimentelor – a apărut doar la variantele cu adaos de zaharoză (Tabelul 2).

Tabelul 2. Prelucrarea statistică a datelor biometrizate la nivelul vitroplantulelor de cartof (Solanum tuberosum var.Gersa), la 30 zile de la inoculare pe următoarele medii de cultură: V0 – mediu de cultură MS, cu zaharoză 30 g/l, V1 – mediu de cultură MS, cu zaharoză 60 g/l, V2 – mediu de cultură MS, cu zaharoză 90 g/l.

V0-30 g/l zaharoză – martor

V1-60 g/l zaharoză

V2-90 g/l zaharoză

Notă: ± S (media (cm) ± abaterea standard), ±d (diferența față de martor – în cm), s2 – varianța, p (pragul de semnificație a diferenței față de martor): ns – diferența nesemnificativă, * – diferența semnificativă, ** – diferența distinct semnificativă, *** – diferența foarte semnificativă.

Fig. 4. Valori procentuale ale indicilor de creștere ale vitroplantulelor de cartof (Solanum tuberosum var. Gersa), la 30 de zile de la inocularea pe medii cu surplus de zaharoză: V1 – MS + 60 g/l zaharoză, V2 – MS + 90 g/l zaharoză, comparativ cu lotul martor, V0 – MS +30 g/l zaharoză, a cărui valori au fost considerate 100%.

A B C

Fig. 5. Aspecte ale creșterii vitroplantulelor de cartof (Solanum tuberosum var. Gersa), la 30 de zile de la inocularea pe următoarele medii e cultură: V0 – MS +30 g/l zaharoză (A); V1 – MS + 60 g/l zaharoză (B); V2 – MS + 90 g/l zaharoză (C) (bara reprezintă 1 cm).

II.3.2. Rezultate înregistrate la 60 de zile de la inoculare

La 60 de zile de la inoculare, sistemul radicular era foarte bine dezvoltat, la toate variantele experimentale și nu se putea biometriza lungimea și numărul de rădăcinițe, fără sacrificarea vitroculturilor. Deoarece obiectivul nostrum nu presupunea monitorizarea rizogenezei, ci a tuberogenezei, am renunțat evaluarea acestor indici de creștere.

Numărul de tulpinițe a fost superior la variantele cu adaos mai ridicat de zaharoză, dar diferențele față de martor nu au fost semnificative din punct de vedere statistic (Tabelul 3).

Tabelul 3. Prelucrarea statistică a datelor biometrizate la nivelul vitroplantulelor de cartof (Solanum tuberosum var.Gersa), la 60 zile de la inoculare pe următoarele medii de cultură: V0 – mediu de cultură MS, cu zaharoză 30 g/l, V1 – mediu de cultură MS, cu zaharoză 60 g/l, V2 – mediu de cultură MS, cu zaharoză 90 g/l.

V0-30 g/l zaharoză – martor

V1-60 g/l zaharoză

V2-90 g/l zaharoză

Notă: ± S (media (cm) ± abaterea standard), ±d (diferența față de martor – în cm), s2 – varianța, p (pragul de semnificație a diferenței față de martor): ns – diferența nesemnificativă, * – diferența semnificativă, ** – diferența distinct semnificativă, *** – diferența foarte semnificativă.

În ceea ce privește lungimea tulpinițelor s-a observat o inhibare, de maxim 6% (Fig. 6), dar nesemnificativă statistic, la variantele cu adaos suplimentar de zaharoză (Tabelul 3). Creșterea mai accentuată a lungimii tulpinițelor lotului martor și după cum se observă în tabelul 3 și aceea a ramificațiile, foarte semnificativă statistic se poate explica prin faptul că prin adaos de zaharoză, s-a stimulat tuberogeneza, în defavoarea creșterii plantulei.

Dacă ne dorim să obținem plantule în vederea repicării, adaosul de zaharoză nu este unul benefic, dar dacă obiectul vitroculturii este acela de stimulare a tuberogenezei, adăugarea de 60 g/l zaharoză este optimă (Tabelul 3).

După cum se poate observa în tabelul 3 tuberogeneza rămâne încă slab reprezentată la 60 de zile de la inițierea subculturilor (Fig. 7), iar media cea mai ridicată, de 1,11 bucăți/recipient de cultură, a fost semnalată la vitroplantulele cultivate pe medii cu adaos de 60 g/l zaharoză (V1).

Fig. 6. Valori procentuale ale indicilor de creștere ale vitroplantulelor de cartof (Solanum tuberosum var. Gersa), la 60 de zile de la inocularea pe medii cu surplus de zaharoză: V1 – MS + 60 g/l zaharoză, V2 – MS + 90 g/l zaharoză, comparativ cu lotul martor, V0 – MS +30 g/l zaharoză, a cărui valori au fost considerate 100%.

AB C

Fig. 7. Aspecte ale creșterii vitroplantulelor de cartof (Solanum tuberosum var. Gersa), la 60 de zile de la inocularea pe următoarele medii e cultură: V0 – MS +30 g/l zaharoză (A); V1 – MS + 60 g/l zaharoză (B); V2 – MS + 90 g/l zaharoză (C) (bara reprezintă 1 cm).

II.3.3. Rezultate înregistrate la 90 de zile de la inoculare

La 90 de zile de la inoculare, creșterea a fost similară la toate cele trei variante testate, indicii de creștere ai vitroplantulelor cultivate pe medii de cultură cu adaos suplimentar de zaharoză, având diferențe fie pozitive, fie negative, față de martor, dar nesemnificative statistic (Tabelul 4). Unica și cea mai elocventă diferență față de martor a fost reprezentată de stimularea foarte semnificativă a tuberogenezei (Tabelul 4).

Dacă până la 60 de zile, tuberogeneza a fost stimulată în special cu adaos de 60g/l zaharoză, la 90 de zile, cea mai intensă formare de tuberculi a fost semnalată la lotul cultivat pe medii cu supliment de 90 g/l zaharoză (Tabelul 4 și Fig. 8 și 9). Presupunem că fiind o cantitate mai mică de zaharoză, după 60 de zile a fost epuizată la lotul notat cu V1, în timp ce tuberogeneza la lotul care a beneficiat de cea mai ridicată concentrție de zaharoză (V2) a continuat intens și după 60 de zile de la inoculare.

Tabelul 4. Prelucrarea statistică a datelor biometrizate la nivelul vitroplantulelor de cartof (Solanum tuberosum var. Gersa), la 90 zile de la inoculare pe următoarele medii de cultură: V0 – mediu de cultură MS, cu zaharoză 30 g/l, V1 – mediu de cultură MS, cu zaharoză 60 g/l, V2 – mediu de cultură MS, cu zaharoză 90 g/l.

V0-30 g/l zaharoză – martor

V1-60 g/l zaharoză

V2-90 g/l zaharoză

Notă: ± S (media (cm) ± abaterea standard), ±d (diferența față de martor – în cm), s2 – varianța, p (pragul de semnificație a diferenței față de martor): ns – diferența nesemnificativă, * – diferența semnificativă, ** – diferența distinct semnificativă, *** – diferența foarte semnificativă.

Fig. 8. Valori procentuale ale indicilor de creștere ale vitroplantulelor de cartof (Solanum tuberosum var. Gersa), la 90 de zile de la inocularea pe medii cu surplus de zaharoză: V1 – MS + 60 g/l zaharoză, V2 – MS + 90 g/l zaharoză, comparativ cu lotul martor, V0 – MS +30 g/l zaharoză, a cărui valori au fost considerate 100%.

ABC

Fig. 10. Aspecte ale creșterii vitroplantulelor de cartof (Solanum tuberosum var. Gersa), la 90 de zile de la inocularea pe următoarele medii e cultură: V0 – MS +30 g/l zaharoză (A); V1 – MS + 60 g/l zaharoză (B); V2 – MS + 90 g/l zaharoză (C) (bara reprezintă 1 cm).

Metode ieftine și la îndemână pentru stimularea formării de microtuberculi in vitro a fost identificată prin înlocuirea zaharozei din mediul de cultură cu miere de albine (Pătru și Cachiță, 2005), prin adăugarea în mediu de nanoparticule magnofluide (Butnaru și Baciu, 2005; Nemes și colab., 2008; Baciu, 2009; Baciu și colab., 2007; 2009 a și b) sau prin iluminarea culturilor cu lumini colorate emise de LED-uri (Light Emitting Diodes) (Pop și Cachiță, 2011).

În general, natura sursei de carbon (Blidar și colab., 2004; Blidar și colab., 2007) din compoziția mediilor de cultură, precum și concentrațiile acesteia au fost studiate de-alungul timpului de către cercetătorii în domeniu.

II.3.1.4. Analiza morfo-anatomică a tuberculilor neoformați in vitro

Regenerarea de neoplantule in vitro a pornit de la un fitoinocul reprezentat de un minibutaș, uninodal (Fig. 11), cu o singură frunzuliță fasonată în prealabil. Acesta a fost amplasat în mediul de cultură solid, cu diferite concentrații de zaharoză (30, 60, 90 g/l), astfel încât nodul să fie submersat jumătate în mediu.

Fig. 11. Fitoinocul de tip minibutaș uninodal, inoculat inițial pe mediul de cultură, care a stat la baza regenerării vitroplantulelor de cartof (Solanum tuberosum var. Gersa) (n – nod; f.f. – frunzulițăfasonată) (bara reprezintă 1 cm).

Pe parcursul perioadei de vitrocultură, la nivelul acestui unic nod s-au regenerat tulpinițe, fiecare având una sau mai multe ramificații (Fig. 12). La fiecare nod, la această specie, se formează câte o frunzuliță dispuse altern, de tip întrerupt imparipenat-compuse, cu marginea foliolelor intreaga.

Din mugurii axilari, se formează stolonul, care în partea din vârf se îngroașa treptat, formând tuberculul. Prin startarea tuberizării, care a apărut la 30 de zile la varianta cu adaos de 60 g/l zaharoză, s-a încetinit creșterea vitroplantulei, în special a părții aeriene.

La 90 de zile de la inoculare, tuberogeneza s-a evidențiat la toate loturile experimentale, mai intens la cele cu adaos de 60 g/l zaharoză. De la nivelul tubercului regenerat in vitro s-au regenerat atât rădăcinițe adventive, cât și tulpinițe, care la rândul lor, prezentau rădăcinițe adventive.

Atât tulpinițele, ramificațiile, cât și tuberculii erau acoperiți cu peri tectori (Fig. 12), plucelulari, neramificați (Fig. 13 și 14).

Fig. 12. Aspecte ale unui tubercul de cartof (Solanum tuberosum var. Gersa) regenerat in vitro (f – frunzulțe; ram – ramificații; r.f. – rădăcinițe adventive, neoformate la baza fitoinocului; r.t. – rădăcinițe adventive neoformate la nivelul tuberculului; t – tulpinițe neoformate din fitoinoculul inițial; t.t. – tulpinițe regenerate la nivelul tuberculului; tu – tubercul; ) (bara reprezintă 1 cm).

AB

Fig. 13. Detaliu morfologic al unui tubercul de cartof (Solanum tuberosum var. Gersa) neoformat in vitro, cu peri tectori (A) și neoformarea de tulpințe la nivelul vitrotuberculului (B) (bara reprezintă 10 mm).

Din punct de vedere anatomic, tuberculul de cartof neoformat in vitro a prezentat structura caracteristică acestui organ (Fig. 14). Astfel, de la exterior spre interior, am identificat un strat de suber, țesut secundar a căror celule au fost impregnate deja cu suberină, cu rol de protecție. Suberul este alcătuit din celule turtite, moarte, dispuse radiar, fărăspații intercelulare, este un țesut moale elastic, puțin permeabil. Imediat sub suber, care se găsea un parenchim cortical, cu rol de țesut de depozitare, bogat în amidon, cu rar și împrăștiat țesut vascular (Fig. 15).

Fig. 14. Peri tectori pluriceluari, neramificați, la suprafața tuberculului de cartof regenerat in vitro (200X).

Fig. 15. Structura tuberculului de cartof (Solanum tuberosum var. Gersa) neoformat in vitro(a – amidon) (400X).

După alți autori, unele mutante de cartof prezintă modificări complexe de dezvoltare și fenotipice, cu caracteristici care sunt tipice pentru plante induse puternic la tuberizare (Fischer și colab., 2008). Aceste modificări sunt susceptibile de a fi legate de reglementarea modificate de fotosinteză și metabolismului glucidic, mai degrabă decât cu deficiențe de transductie de giberelină, un inhibitor.

În plus fata de stoloni, practic orice mugur axilar de pe tulpini sau butași poate forma un tubercul, cu condiția ca să existe condiții de inducere a tuberizării. Numai butași luați din plante induse dezvolta tuberculi direct. Butașii de la plante ne-induse pot forma muguri în principal lungi/stoloni în loc de tuberculi, indiferent de concentrația de zaharoză din mediul (Gregory, 1956) .

Tuberizarea, fie la plante intacte, fie la butași un singur nod – unindali, s-a demonstrat a fi sub controlul coordonat de mulți hormoni, inclusive a giberelinelor, a citochininelor, a acidului abscisic, a acidului jasmonic și alții. Deși dovezile de implicare a unor hormoni rămâne controversate (Sarkar, și colab., 2006), rolul de giberelinelor ca autoritate de reglementare cheie – negativă, a fost stabilit ca lipsită de echivoc. Aplicarea exogenă a giberelinelor a promovat alungirea stolonilor și a inhibat formarea tuberculilor, în timp ce o scădere în nivelul de giberelină a precedat primele semne vizibile de umflare în vârfurile stoloni (Xu și colab., 1998).

III. BIBLIOGRAFIE

Ardelean, A., Pisoschi, A., Bogdan, A.T., Pau, V., Covaci, B., Covaci, M., 2011, The ethical dimension of the Romanian scientific research for sustainable development. Recent Researches in Energy & Environment, WSEAS Press, pp. 255-260.

Baciu, A., 2009, The answer of some old varieties of Solanum tuberosum L. for in vitro cultivation. Analele Universității din Oradea, Fascicula Biologie, University of Oradea Press, ToM XVI/1, pp. 18-23.

Baciu, A., Petruș-Vancea, A., Zehan, R., 2007, The evolution of the Solanum tuberosum l. neoplantles cultivated in vitro on cuture media supplimented with bioactive magneto-fluidic nanocomposites. Analele Universității din Oradea, Fascicula Biologie, Tom. XI, pp. 19-22.

Baciu, A., Danci, O., Petruș – Vancea, A., Sărac, I., Mike, L., 2009 b, Results regarding potato (Solanum tuberosum L.) cultivars reaction to in vitro culture conditions. Journal of Horticulture, Forestry and Biotechnology, vol. 13., pp. 174-178.

Baciu, A., Petruș – Vancea, A., Nemes, S., Motica, R., Mike, L., 2009 a, Results regarding new romanian potato (Solanum tuberosum L.) cultivars reaction to in vitro culture conditions. Analele Universității din Oradea, Fascicula Biologie, Tom. XVI/2, pp. 11-14.

Blidar, C.F., Cachiță, C.D., Petruș-Vancea, A., Drăghici, F., 2004, Vitroculturile de protocormi de Cymbidium pe medii cu amidon de porumb ca înlocuitor parțial sau total al zaharozei. În: Lucrările celui de al XII-lea Simpozion Național de Culturi de țesuturi și Celule Vegetale „Fitopatologia celulei vegetale în regim de vitrocultură. Cachiță, C.D., Ardelean, A., Fati, V., 2003, Jibou, Editura Daya, Satu-Mare, pp. 203-212.

Blidar, C.F., Cachiță, C.D., Petruș – Vancea, A., Pop, L., Marian, M., 2007, The Cymbidium protocorms reaction, cultivated „in vitro” on a bistratified medium, using a fructose solution as supernatant. În: Proceeding of the International Conference „Agricultura land food sciences, process and technologies”, with theme „Agriculture and food industry within the context of european integration” aprilie 26 – 28, 2007, Sibiu, Published in Romania by „Lucian Blaga” University of Sibiu, pp. 37 – 48.

Bogdan, A.T., Ipate, I., Bara, V., Diaconescu, D., Purcarea, C., Strateanu, A.G., 2010, Ecoeconomicand bioeconomic impact of food safety and security in perspective increased consumption of food and feed during 2030-2100. International Symposium “Risk Factors for Environment and Food Safety”, Faculty of Environmental Protection, November 5 – 6, Oradea 2010, pp. 1044 – 1056.

Bonga, J.M., 1985, Tissue culture techniques. In: Tissue culture in forestry, Bonga, J.M., Durzan, D.L. (eds.), Martinus Nijhoff Dordrecht, pp. 4-35.

Bourque, J.E., Miller, J.C., Park, W.D., 1987, Use of an in vitro tuberization system to study tuber protein gene expression

Bradshaw, J.E., Mackay, G.R., 1994, Breeding strategies for clonally propagated potatoes. In: Potato genetics, Bradshaw, J.E., Mackay, G.R. (eds). CAB Intl, Wallingford, UK, pp. 467-497.

Brown, C.R., 1994, Potato. Encyclopedia of Agricultural Sciences 3. Academic Press Inc, pp. 419-423.

Brown, L.R., 2005, Depășind Resursele Planetei – probleme globale ale omenirii. Editura Tehnica Bucuresti.

Brown, L.R., 2011 a, The Great FoodCrisis of 2011. Foreign Policy, 10, pp. 1-5.

Brown, L.R., 2011 b, Lumea pe marginea prăpastiei. Editura tehnică București.

Butnaru, G., Baciu, A., 2005, Capacitatea de tuberizare in vitro la unele cultivare de Solanum tuberosum L. În: Lucrările celui de Al XIV-lea Simpozion Național de Culturi de Țesuturi și Celule Vegetale, pp. 131-137.

Cachiță, C.D., 1987, Metode in vitro la plantele de cultură. Editura Ceres, București.

Cachiță, C.D., 1994, Micropropagarea in vitro a cartofului prin culturi fotoautotrofe. Lucr. Șt. I.C.P.C. Brașov (Anale), vol. XXI, pp.1 – 10.

Cachită, C.D., Ardelean, A., 2009, Tratat de biotehnologie vegetală, Vol. II. Editura Dacia Cluj-Napoca, 316 p.

Cachiță, C.D., Constantinovici, D., 2008, Conservarea resurselor vegetale în Băncile de Gene sub formă de fitoinoculi. In: Biotehnologii Vegetale pentru Secolul XXI. Lucrările celui de al XVI – lea Simpozion Național de Culturi de Țesuturi și Celule Vegetale, București, 2007, pp. 152-161.

Cachiță C.D., Sand C., 2011, Biodiversitatea și băncile de gene, ”Vasile Goldiș” University Press, 147 p.

Cachiță, C.D., Achim, F., Cristea, V., Gergely, K., 1987, 2- chloroethylphosphonic acid and morphogenesis. Symposium Florizel 87, Arlon-Belgium, pp. 234-246.

Chiru, S., Gorea, T., Cupșa, A., Mureșan, S., Chiru, N., Boțoman, G., Pop, L., 1992, Potato breeding. ICPC Brasov Annals XIX, pp. 26-38.

Ciobanu, I.B., Constantinovici, D., Cețu I., 2011, Influence of genotype and cultivation conditions on vitroplantlets evolution of Solanum tuberosum L. local varieties. Analele Științifice ale Universității „Al. I. Cuza” Iași, Tomul LVII(2), s. II a. Biologievegetală, pp. 13-20.

Comșa, D., Bogdan, A.T., 2011, Eco-bio-diplomația – Un nou concept pentru o dezvoltare durabilă inteligentă, într-o lume globalizată, în contextul eco-bio-economiei, www.postdoctorat.com, disponibil în mai 2014.

Conover, C.A., Poole, R.T., 1984, Acclimatization of indoor foliage plants. Hortic Rev 6, pp. 120-154.

Cucur, S., Cetiner, S., Yalcin-Mendi, Y., Carmeli-Weissberg, M., Graber, E., Gaba, V., 2012, Food-grade sugar can promote differentiation in melon (Cucumis melo L.) tissue culture

Dinu, I., 2003, Studii privind hibridarea somatic a unor plante din genul Solanum. Casa Cărți de Știință, Cluj-Napoca.

Dinu, I., Pop, L., 1997, Evaluation and widening of the potential gene pool available in different Solanum species. Romanian Journal of Biological Sciences, I/22, pp. 48-52.

Fish, N., Karp, A., Jones, M.G.K., 1987, Improved isolation of dihaploid Solanum tuberosum protoplast and the production of somatic hybrids between dihaploid S. tuberosum and S. brevidens

Fischer, L., Lipavska, H., Housman, J.F., Opatrny, Z., 2008, Morphological and molecular characterization of a spontaneously tuberizing potato mutant: an insight into the regulatory mechanism of tuber induction. BMC Plant Biol., nr. 8, p. 117.

Skoog, F., Miller, C.O., 1957, Chemical regulation of growth and organ formation. Symp. Soc. Exp. Biol., 11, pp. 118-131.

Georgescu-Roegen, N., 1975, Energy and economic myths. Southern Economic Journal 41(3), pp. 10-15.

Gopal, J., Chamail, A., Sarkar, D., 2004, In vitro production of microtubers for conservation of potato germplasm: effect of genotype, abscisic acid, and sucrose

Gregory, L.E., 1956, Some factors for tuberization in the potato plant. Am J Bot. nr. 43, pp.281-288.

Haberland, G., 1902, Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber Akad Wiss Wien Math. Naturweiss K 1, 11, pp. 69-92.

Hawkes, J.G., 1978, Biosystematics of potato. In: The potato crop. Harris, P.M. (ed.). Chapman & Hall. London, pp. 15-68.

Hawkes, J.G., 1990, The potato: evolution, biodiversity and genetic resources. Belhaven. London.

Jarret, R.L., Hasegawa, P.M., Bressan, R.A., 1981, Gibberellic acid regulation of adventitious shoot formation from tuber discs of potato

Kaur, D., Ogra, R.K., Bhattacharya, A., Sood, A., 2012, Changes in sugar levels during slow growth of Dentrocalamus hamiltonii somatic embryons due to liquid paraffin overlay

Keul, B.A., Bindea, G., Deliu, M.C., Deliu, C., 1999, Influența sursei de carbon asupra organogenezei și inducerii calusului la Leontopodium alpinim Cass. În: Lucrările reunite ale celui de al VII-lea și al VIII-lea Simpozion Național de Culturi de Țesuturi și Celule Vegetale, Arad 1997 și Buziaș 1998, intitulat “Culturi “in vitro” la cormofite”. Cachiță, C.D., Ardelean, A., Crăciun, C. (eds.), Editura Risoprint Cluj-Napoca, pp. 82 – 84.

Kut, S.A., Evans, D.A., 1982, Plant regeneration from cultured laef explants of eight wild tomato species and two related Solanum species

Mackay, G.R., 1987, Selecting and breeding for better potato cultivars. Improving vegetatively propagated crops. Academic Press. New York, pp. 181-195

Murashige, T., 1974, Plant propagation though tissue culture. Ann. Rev. Plant. Physiol. 25, pp. 135-166.

Murashige, T., Skoog, F., 1962, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissues cultures. PhysiologiaPlantarum, 15, pp. 155-159.

Nemes, Z., Baciu, A., Popa, D., Mike, L., Petrus – Vancea, A., Danci, O., 2008, The study of the potato’s life-cycle phases important to the increase of the individual variability. Analele Universității din Oradea, Fascicula Biologie, Tom. XV pp. 60 – 63.

Okrslar, V., Strukelj, B., Kreft, S., Bohanec, B., Zel, J., 2002, Micropropagation and hairy root culture of Solanum laciniatum Ait., In Vitro Cell. Dev. Biol.—Plant 38, pp. 352–357.

Pătru, D., Cachiță, C.D., 2005, Micropropagarea la cartof (SolanumtuberosumL.) pe medii de cultură în care zaharoza a fost substituită cu miere de albine sau cu fructoză. In: Al XIV-lea Simpozion Național de Culturi de Țesuturi și CeluleVegetale. Editura Alma Mater-Sibiu, pp. 207-216.

Petruș-Vancea, A., Cachița C.D., Purcarea, C., 2013, Proceduri bioeconomice, ecoecologice de optimizare a conservării si multiplicării in vitro a biodiversității vegetale. ”Vasile Goldis” University Press.

Pop, L., Cachiță, C.D., 2011, Contribution to Solanum tuberosum L. tubergenesis, vitrocultivated under ultrabright color L.E.D.. AnaleleUniversității din Oradea – Fascicula Biologie, Tom. XVIII(2), pp. 124-127.

Popescu, G., Filimon, R., 2009, Nicholas Georgescu–Roegen. Epistemologia evoluționistă. Săgeata timpului, Editura Risoprint, Cluj-Napoca.

Prasad, P.V.D., Potluri, S.D.P., 1996, Influence of proline and hydroxyproline on salt-stressed axillary bud cultures of two varieties of potato (Solanum tuberosum)

Protacio, C.M., Flores, H.E., 1992, The role of polyamines in potato tuber formation

Pruski, K., Astatkie, T., Nowak, J., 2002, Jasmonate effects on in vitro tuberization and tuber bulking in two potato cultivars (Solanum tuberosum L.) under different media and photoperiod conditions

Purcărea, C., Ipate, I., Popa, A., Duca, M., 2012, Rolul științelor și tehnologiilor în siguranța alimentară în corelație cu alimentația sănătoasă și rolul său în prevenirea unor boli metabolice. Editura Osterreichish Rumanischer Akademischer Verein, Viena.

Radoveț-Salinschi, D., Cachiță, C.D., 2012 a, Testing the regenerative capacity of Solanum tuberosum var. Gersa explants after 24 weeks storage in living collection. Analele Universității din Oradea, Fascicula: Ecotoxicologie, Zootehnie și Tehnologii de Industrie Alimentară, Vol XI B, pp. 423-430.

Radoveț-Salinschi, D., Cachiță, C.D., 2012 b, In vitro conservation of Solanum tuberosum var.Gersa. Analele Universității din Oradea, Fascicula:Ecotoxicologie, Zootehnie și Tehnologii de Industrie Alimentară, Vol XI B, pp. 431-438.

Radoveț-Salinschi, D., Cachiță, C.D., 2013, The mictropropagation eficiensy by slowing the growthrate of Solanum tuberosum var. Gersa vitroplantlets. Studia Universitatis “Vasile Goldiș”, Seria Științele Vieții, 23(1), pp. 49-56.

Ross, H., 1986, Potato breeding – Problems and perspectives. Paul Parey Verlag Berlin.

Sajid, Z.A., Aftab, F., 2009, Amelioration of salinity tolerance in Solanum tuberosum L. by exogenous application of ascorbic acid

Sarkar, D., Pandey, S.K., Sharma, S., 2006, Cytokinins antagonize the jasmonates action on the regularition of potato (Solanum tuberosum) tuber formation in vitro. Plant Cell Tiss Org. nr. 87, pp. 285-295.

Sarkar, D., Pandey, S.K., Sharma, S., 2010, High K+ does not affect potato (Solanum tuberosum L.) tuber induction, but represses its development in vitro

Schaeffer, W.I., 1990, Terminology associated with cell, tissue and organ culture, molecular biology and molecular genetics. In Vitro Cell. Dev. Biol., 26, pp. 97-101.

Schleiden, M.J., 1838, Beiträge zur phytogenesis. Arch. Anat. Physiol. U. Wiss. Med., pp. 137-176.

Schwann, T., 1839, Mickroskopiche untersuchungen über die übereinstimmung in der struktur und dem wachstume der tiere und pflanzen. Leipzig, W. Engelmann, 176, Ostwalds Klassiker der exakten Wissenschaften, p. 1910.

Shin, K-S., Park, S-Y., Paek, K-Y., 2013, Sugar metabolism, photosyntetis, and growth of in vitro plantlets of Doritaenopsis under controled microenvironmental conditions

Sima, B.D., Desjardins, Y., Quy, L.V., 2001, Sucrose enhances phosphoenolpyruvate carboxylase activity of in vitro Solanum tuberosum L. under non-limiting nitrogen conditions

Spooner, D.M., Bamberg, J.B., 1994, Potato genetic resources: sources of resistance and systematics. Am Potato J, 71, pp. 325-337.

Van Huylenbroeck, J.M., Debergh, P.C., 1996, Impact of sugar concentration in vitro on photosynthesisand carbon metabolism during ex vitro acclimatization. Plant. Physiol., 96, pp. 298 – 304.

Veramendi, J., Villafranca, M.J., Sota, V., Mingo-Castel, A.M., 1997, Gelrite as an alternative to agar for micropropagation and microtuberization of Solanum tuberosum L. CV. Baraka. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 33, pp. 195-199.

Wilson, D.A., Weigel, R.C., Wheeler, R.M., Sager, J.C., 1993, Light spectral quality effects on the growth of potato (Solanum tuberosum) nodal cutting in vitro

Xu, X., van Lammeren, A.A.M., Vermeer, E., Vreugdenhil, D., 1998, The role of gibberellin, abscisic acid, and sucrose in the regulation of potato tuber formation in vitro. Plant Physiol. nr. 117, pp. 575-584.

Yang, L., Zambrano, Y., Hu, C-J., Carmona, E.R., Bernal, A., Perez, A., Zayas, C.M., Li, Y-R., Guerra, A., Santana, I., Arencibia, A.D., 2010, Sugarcane metabolites produced in CO2-rich temporary immersion bioreactors (TIBs) induce tomato (Solanum lycopersicum) resistance against bacterial wilt (Ralstonia solanacearum)

Zuba, M., Binding, H., 1989, Isolation and culture of potato protoplast. In: Biotech Agric Forest 8. Plant Protoplast and Genetic Engineering I. Bajaj, Y.P.S. (ed.). Springer-Verlag Berlin Heidelberg, pp. 124-146.

***, 2007, UN World population prospects: The 2006 revision, New York, http://www.un.org/esa/population/publications/wpp2006/WPP2006_Highlights_rev.pdf, disponibil în martie, 2014.

IV. ANEXA – ARTICOL PUBLICAT DIN LUCRARE

BIBLIOGRAFIE