Stafilococii sunt coci Gram-pozitivi aerobi, facultativ anaerobi, imobili, nesporulați, catalazo-pozitivi. Genul Staphylococcus cuprinde mai multe… [306373]

[anonimizat], [anonimizat], nesporulați, catalazo-pozitivi. Genul Staphylococcus cuprinde mai multe grupe de microorganisme de interes medical (unele dintre aceste grupuri incluzând mai multe specii). S. aureus este specia recunoscută cel mai de mult (Rosenbach, 1884) si cel mai frecvent implicată în clinică. În funcție de capacitatea de a [anonimizat]-pozitivi sunt grupați ca S. aureus.

S. aureus se poate multiplica la nivelul tegumentelor și mucoaselor (în special în zonele piloase și la nivelul vestibulului nazal). Există o serie de factori care determină și/sau influențează starea de purtător pentru S. aureus. O parte dintre acești factori sunt legați de apărarea la nivel de gazdă, o parte sunt corelați cu anumite proprietăți ale bacteriei. [anonimizat] ([anonimizat]), [anonimizat], care pot fi de tip peptide antimicrobiene precum: lizozimul, lactoferina, SLPI (secretory leukoprotease inhibitor), catelicidine, [anonimizat] 3 (HBD-3), cea mai eficientă dintre beta defensine în ceea privește rolul în infecțiile cu S. aureus.

[anonimizat] (infecții însoțite de puroi), dar pot fi implicați și în infecții localizate la nivelul oricărui alt țesut sau organ.

Structură antigenică

Structuri antigenice legate de corpul celular:

a) Capsula este prezentă la un număr mic de tulpini de S. aureus; este alcătuită din acid glucozaminuronic. „In vivo“ pare a fi mai frecventă decât s-ar crede (examinând la microscop tulpinile cultivate). Tulpina încapsulată prototip de S. aureus (tulpina Smith) dă naștere spontan la variante necapsulate.

b) Polizaharidul A a fost identificat la S. aureus, în timp ce la S. epidermidis s-a pus în evidență un polizaharid B. Ambii sunt acizi teichoici. [anonimizat] a grupărilor răspunzătoare de specificitatea antigenică a fiecăruia.

c) Proteina A apare ca o componentă de suprafață la toate tulpinile de S. aureus (proteina Cowan). Are o greutate moleculară de 42 kDa și poate induce apariția de anticorpi specifici (este imunogenă). Este de menționat faptul că proteina A interacționează nespecific cu porțiunea Fc a imunoglobulinelor de la practic toate speciile de mamifere. Ca urmare a interacțiunii dintre proteina A [anonimizat] o serie de efecte biologice precum: [anonimizat], [anonimizat] a anticorpilor (prin competiție cu receptorii pentru Fc de pe fagocite), proliferarea limfocitelor B umane etc. Proteina de suprafață A [anonimizat] a sugerat și o asociere a statusului de purtător nazal de S. aureus cu un nivel crescut al expresiei acestei proteine.

d) Majoritatea tulpinilor necapsulate de S. aureus aglutinează atunci când sunt suspensionate în plasmă sau în soluții de fibrinogen. Factorul răspunzător de această reacție este o coagulază legată („clumping factor”; factor de aglutinare/agregare) la nivelul suprafeței celulei bacteriene. Acest factor poate fi prezent și la circa 10% dintre tulpinile de S. intermedius. În cazul în care în testul coagulazei pe lamă se folosește plasmă umană, rezultatul poate fi pozitiv și pentru S. lugdunensis și S. schleiferi (subspecia schleiferi).

e) Adezinele sunt proteine de suprafață specifice, prin care stafilococii se fixează pe proteinele matriciale de la suprafața celulelor gazdei (ex. laminină, fibronectină, elastină, colagen, proteina A etc). Par a fi implicate în colonizarea matricei intercelulare, în invazia țesuturilor și în rezistența la fagocitoză.

2.7.2.Structuri antigenice extracelulare produse de stafilococi

a) Stafilococii, mai ales S. aureus, produc o mare varietate de exoproteine imunogene. Majoritatea sunt proteine accesorii care, în condiții de creștere optime, sunt sintetizate la sfârșitul perioadei de creștere exponențială sau la începutul fazei staționare. În condiții suboptime (de exemplu deficit de Mg2+), condiții care se pot întâlni și în țesuturile infectate, aceste proteine pot fi sintetizate în tot cursul fazei exponențiale.

b) Filtratele culturilor de S. aureus coagulează plasma recoltată de la o serie de specii animale sub acțiunea coagulazei, care este cel mai important marker pentru S. aureus. S-au descris mai multe coagulaze antigenic distincte. Există totuși și tulpini de stafilococ implicate patogenic care sunt coagulază-negative. Unele tulpini coagulază-negative produc o metaloproteinază care are o activitate asemănătoare cu cea a coagulazei, ceea ce poate crea probleme în identificare.

Coagularea necesită prezența unui factor coagulazo-reactant (FCR), care este probabil un derivat de protrombină. Complexul coagulazei realizat cu FCR convertește fibrinogenul în fibrină. Procesul diferă de coagularea normală prin faptul că nu sunt necesari o serie de factori (ex. Ca2+) iar cheagul care se formează este mai friabil și nu se retractă. Studii recente demonstrează că TFPI (inhibitorul căii factorului tisular), prin secvența sa C-terminală, joacă un rol antimicrobian împotriva S. aureus și împotriva altor bacterii Gram-pozitive (Bacillus subtilis), Gram-negative (Escherichia coli și Pseudomonas aeruginosa) și chiar împotriva fungilor Candida albicans și Candida parapsilosis.

c) Stafilococii pot produce o serie de hidrolaze cu structuri antigenice diferite, precum:

– stafilokinaza, care determină liza cheagului (prin convertirea plasminogenului în plasmină) sub controlul unui material genetic fagic;

– nucleaza (termonucleaza), cu activitate endo- și exonucleazică asupra ADN și ARN, generând 3'-nucleotide;

– diferite lipaze evidențiabile prin opacifierea agarului cu gălbenuș de ou sau prin scindarea substanței numită Tween; contribuie la supraviețuirea stafilococului la nivel dermic;

– hialuronidaza;

– ureaza;

– diferite proteaze (serin protează, cistein protează, metaloprotează).

d) În momentul se față se cunosc patru hemolizine produse de stafilococi. O tulpină anume poate produce mai multe hemolizine. Unele dintre hemolizine distrug și alte celule, ducând la o necroză locală și pot avea efecte letale asupra animalelor de experiență.

Principalele caractere ale hemolizinelor sunt următoarele:

1. a-hemolizina (a-toxina) este principala hemolizină produsă de S. aureus. Are activitate maximă asupra hematiilor de iepure; hematiile de om nu sunt susceptibile. Afectează trombocitele și celulele umane în cultură. Are efect dermonecrotic asupra animalul de experiență (injectată local) și efect letal (injectată intravenos). Efectul ei principal este reprezentat de producerea de spasme ale mușchilor netezi vasculari. S-a identificat receptorul de pe suprafața membranei eritrocitului, o sialoglicoproteină. Este secretată sub forma unui monomer hidrosolubil de 34.000 Da, care se rearanjează în contact cu un receptor de membrană, formând un hexamer cilindric care străpunge membrana celulei și proemină la suprafața ei, generând un por cu un diametru de 23 nm (există asemănări cu complexul litic C5b-C9 al C').

2. β-hemolizina este produsă de majoritatea stafilococilor identificați la animale, dar numai de 10-20% dintre stafilococii umani. Produce o hemoliză de tip „cald-rece“. Este de fapt o sfingomielinază C, activată de Mg2+, nu însă și de Ca2+. Efectul (în ordine descrescătoare) se exercită asupra hematiilor de oaie, om, cobai (ceea ce corespunde cu concentrația de sfingomielină a hematiilor). Este citotoxică pentru diferite culturi de celule. În doze mari, este toxică pentru animalele de experiență.

3. g-hemolizina este un complex de două proteine bazice care acționează în cooperare. Hematiile susceptibile sunt cele de iepure, om, oaie, nu și cele de cal sau pasăre. Efectul ei este inhibat de agar și de diferiți polimeri sulfatați. Nu are efect atunci când se utilizează plăci cu agar-sânge. Acțiunea este inhibată de colesterol și de alte lipide.

4. d-hemolizina este produsă de majoritatea tulpinilor umane de S. aureus. Constă din agregate heterogene de subunități de circa 5.000 Da. Acționează pe diferite celule (hematii, leucocite, celule de mamifere cultivate) și nu are specificitate de specie.

e) Stafilococii pot produce o serie de exotoxine piretogene, un grup de toxine cu mai multe activități patogene, spre exemplu cu efecte imunosupresoare, cu un efect mitogen mai pronunțat la nivelul limfocitelor T supresoare (au capacitatea de a activa policlonal toate celule T); cresc toxicitatea endotoxinelor germenilor Gram-negativi (blochează funcția de clearance a sistemului reticuloendotelial); produc eritrodermie prin mecanisme de hipersensibilitate de tip întârziat. Efectul piretogen se realizează cel puțin în parte prin stimularea producerii de IL-1.

f) Leucocidina este produsă de majoritatea tulpinilor de S. aureus și acționează numai asupra polinuclearelor și macrofagelor de om și iepure. Are două componente, F și S. Componenta S se fixează pe gangliozidul GM1 (receptor pentru toxina holerică) și activează o fosfolipază endogenă, legată de membrană.

g) Exfoliatina (toxina epidermolitică) produce o varietate de leziuni dermatologice. Este o proteină termolabilă și acid-labilă, cu greutatea moleculară de 24.000 Da, produsă de circa 5% din tulpinile de S. aureus. S-au descris două variante antigenice, ETB (codificată de un plasmid) și respectiv ETA (codificată cromozomial). Multe tulpini produc ambele exfoliatine. Toxina acționează prin clivarea stratului granular al epidermului, probabil prin scindarea desmosomilor care unesc celulele acestui strat.[1]

Caracterele morfotinctoriale, de cultura si biochimice vor fi prezentate in cadrul partii practice.

CAPITOLUL 1

MRSA- GENERALITAȚI

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) se refera la un grup de bacterii gram pozitive care sunt diferite din punct de vedere genetic fata de celelalte tulpini de Staphylococcus aureus. MRSA este responsabil de mai multe infectii greu de tratat deoarece aceste tulpini au dezvoltat, prin transferul de gene pe orizontala si prin selectie naturala o rezistenta la antibioticele beta-lactamice.

MRSA este intalnit in spitale, inchisori, aziluri, unde exista indivizi imunocompromisi,care prezinta rani deschise, dispozitive invazive de genul cateterelor etc. MRSA s-a prezentat in prima instanta ca o infectie dobandita in spital, dar a devenit in curand comunitara. Termenii HA-MRSA (healthcare-associated or hospital-acquired MRSA), CA-MRSA( community-associated MRSA) si LA-MRSA( livestock-associated) reflecta aceasta conditie.

MRSA a fost considerat mult timp un prototip de patogeni multi-rezistenti care cauzeaza infectii la pacienti cu risc inalt. Evolutia acestor microorganisme le-a permis sa afecteze si indivizi tineri, fara factori de risc. CA-MRSA cauzeaza in prima speta infectii cutanate si, rareori, pneumonie. HA-MRSA sunt o cauza frecventa de infectie de tip IAAM(infectie asociata asistentei medicale) si cauzeaza de obicei , pneumonie.

In ultimii 20 de ani, epidemiologia MRSA s-a schimbat in mod dramatic, si aceasta a dus la schimbarea abordarii ei din punctul de vedere al terapiei infectiilor comunitare. Astazi, orice infectie serioasa care este potential cauzata de stafilococi ar trebui sa fie presupusa ca fiind MRSA pana cand rezultatele culturilor sunt disponibile.

Importanța problemei

Staphylococcus aureus este unul dintre principalii colonizatori ai organismului uman. În unele situații tulpina colonizatoare poate deveni agent patogen, producând infecții localizate sau sistemice; mai rar apar infecții stafilococice ca urmare imediată a unei contaminări exogene. Colonizarea cu MRSA poate persista pentru perioade de luni și chiar ani de zile, până în momentul în care determină o infecție; persoanele colonizate pot contamina alte persoane, ele fiind cel mai important rezervor de MRSA.

Infecțiile stafilococice pot avea o evoluție nefavorabilă din cauza unei agresivități sporite a tulpinii bacteriene, a unei capacități reduse de apărare antiinfecțioasă a pacientului sau datorită dificultății de a trata un pacient infectat cu o tulpină (multi)rezistentă la antibiotice. Întrucât beta-lactaminele sunt antibioticele cel mai frecvent folosite în practica medicală, cele mai multe studii au investigat capacitatea stafilococilor de a rezista acțiunii acestor antibiotice.[2]

Infecțiile determinate de tulpinile de MRSA reprezintă o problemă majoră pentru sistemul de asistență medicală din cauza ponderii ridicate în rândul infecțiilor umane (în special în infecții asociate asistentei medicale) și a potențialului de evoluție severă. Câțiva factori se asociază cu apariția și extinderea focarelor intraspitalicești de infecție cu MRSA:

 personal insuficient și cu deficit de instruire specifică.

 supraîncărcarea cu pacienți a secțiilor de spital.

 neglijarea testării prezenței MRSA la pacienți la care aceasta este necesară.

 ignorarea necesității de a grupa pacienții infectați/colonizați cu MRSA într-o zonă delimitată a spitalului.

 deficiențe de aplicare a precauțiunilor de contact.[3]

Persistenta îndelungată pe mâinile personalului si în mediul spitalicesc, precum si rezistenta

la antibiotice cauzată de presiunea selectivă exercitată de multitudinea de antibiotice administrate în spitale, îl transformă într-un temut agent etiologic al infectiilor asociate asistentei medicale.[4]

 Consumul de antibiotice este principalul determinant al apariției de noi mecanisme de rezistență microbiană;

 Infecțiile nosocomiale reprezintă zona cea mai vizibilă a manifestării rezistenței microbiene la antibiotice, întrucât ele sunt cel mai adesea determinate de germeni cu rezistență la antibiotice de prima linie și tot mai frecvent și la antibiotice de rezervă;

 îngrijirea pacienților cu infecții nosocomiale presupune utilizarea mai frecventă a unor antibiotice de rezervă, ce amplifică astfel nivelul rezistenței microbiene față de acestea.[3]

Consumul de antibiotice în România în ultimii ani este caracterizat de persistenta unui volum extrem de mare al acestuia și de accentuarea utilizării preferențiale a antibioticelor cu risc de a selecta rezistență bacteriană și de a induce infecții determinate de Clostridium difficile.

La nivel european această valoare a consumului ne plasează pe locurile 2-3, în urma Greciei și la egalitate cu Franța. Principalele grupe de antibiotice utilizate sunt penicilinele – 51,6%, cefalosporinele – 16,6% și chinolonele – 11,7%. Indicele de utilizare a antibioticelor cu spectru larg a crescut și în 2014, atingând valoarea de 11,88, față de 11,02 (2013), de 8,39 (2012) și 6,44 (2011). O proporție de 27,6% din totalul consumului au reprezentat-o antibioticele cu risc major de a declanșa infecții cu Clostridium difficile (ICD): fluorochinolone, cefalosporine de generație 2-4, carbapeneme și clindamicină.

Rezultatele care au fost obținute prin analiza tulpinilor izolate de la pacienți cu infecții invazive (hemoculturi și culturi LCR), îngrijiți în 17 spitale din România.Nu s-au înregistrat progrese notabile în controlul rezistenței bacteriene, problemele descrise în rapoartele precedente continuând să persiste până in ziua de azi; iar numărul mai mare de izolate bacteriene analizate crește și încrederea în relevanța acestor date. Dintre problemele existente se numara si prezenta MRSA care a reprezentat 56,6% din totalul tulpinilor de Staphylococcus aureus raportate; chiar dacă s-a înregistrat o scădere față de anul 2013, acesta rămâne cel mai ridicat nivel al MRSA dintre statele europene participante la EARS Net și singurul care depășește 50%. Situația MRSA se explică prin consumul mare de beta-lactamine și prin lipsa de măsuri eficiente de control al infecțiilor [4].

Infecțiile nosocomiale raman si in ziua de azi o patologie mult subestimata in Romania, cu o incidenta calculata pe baza raportarilor statistice ale spitalelor de 0,25% din pacienții externați [3].

Infecțiile asociate asistenței medicale (IAAM) rămân și în 2015 o patologie mult subestimată in Romania, cu o incidență medie calculată de 0,33% pacienți externați, pe baza raportărilor statistice a majorității spitalelor din România [5].

Motivatia acestui studiu retrospectiv este de a demonstra amploarea rezistentei la antibiotice a tulpinilor de MRSA in cadrul infectiilor dobandite in mediul de spital din Romania.

O mica istorie a MRSA

Când a fost descoperită penicilina, S. aureus a fost susceptibil exclusiv la aceasta iar infecțiile cu S. aureus au fost vindecate într-un mod eficient .Totuși în decursul a câtorva ani S. aureus a devenit capabil de a distruge penicilina prin producția unei enzime specifice numită penicilinaza care este codificată de o plasmida care a fost dobandita repede de mai multe tulpini .

Meticilina, o penicilina modificată în mod special pentru a rezista la acțiunea distructivă a penicilinazei stafilococice a devenit disponibilă pentru uz terapeutic în 1959 dar succesul sau a fost foarte scurt ; după abia doi ani primul caz de MRSA a fost raportat. Această nouă rezistență s-a produs datorită achiziției unei noi proteine de către Staphylococcus aureus și care nu a putut fi blocată de către meticilină. Prezența acestei proteine înseamnă că MRSA nu este numai rezistent la meticilină și este rezistent la toate antibioticele betalactamice inclusiv penicilinele sintetice, cefalosporine și carbapenemi. Acest fapt a condus la crearea unei endemii în spitalele din mai multe țări europene încă de la începutul anilor ”80.[6]

CAPITOLUL 2

Potentialul patogenic al S. Aureus

S. aureus este un microorganism ubicuitar care este parte a microbiotei normale și este prezent in mod normal în tractul respirator superior, pe piele și pe mucoasa intestinului gros si a fost estimat că în jur de 50% din adulți sunt purtători constanti sau intermitenti de S.aureus .Acest microorganism poate deveni un patogen versatil cauzând un spectru larg de infecții mulțumită unui arsenal vast de factori de virulenta. Infecțiile determinate de Stafilococus aureus pornesc de la infecții cutanate și a țesuturilor moi ca furunculoză sau impetigo , a oaselor ,articulațiilor ,ajungând la infecții grave. Deși incidența bacteriei MRSA a scăzut în ultimile 2 decade. MRSA rămâne asociată cu un rezultat clinic mai sărac comparativ cu tulpinile meticilino senzitiv de Stafilococcus aureus(MSSA) .

Bacteremia cu Stafilococcus aureus (SAB) cauzează de multe ori infecții metastatice cum ar fi endocardita infecțioasă, artrita septică și osteomielita. Mai mult, SAB poate conduce la complicații cum ar fi sepsisul și socul septic.

Pentru SAB cauzat de MSSA terapia cu betalactamine este considerată gold standard. Pentru MRSA Infectious Diseases Society of America a recomandat în 2011 tratamentul cu vancomicină sau daptomicina. Totuși, fiecare agent antimicrobian are limitările lui ; mai multe aspecte restricționează utilitatea vancomicinei incluzând activitatea bactericidă lentă, penetrarea țesuturilor scăzută și raportările unei rezistențe crescute în timp ce daptomicina este eficientă împotriva bacteriemiei MRSA. Este foarte posibil ca tratamentul inițial cu vancomicină să încurajeze rezistența stafilococului auriu la daptomicina datorită morbidității și mortalității substanțiale asociate cu SAB și limitările tratamentelor aprobate la ora actuală .Este necesar să identificăm agenți alternativi pentru tratamentul SAB; întârzierea diagnosticului și tratamentului SAB conduc la rezultate clinice nesatisfăcătoare .

Identificarea standard a microbului presupune în jur de 48-72 de ore dar testele diagnostice rapide recente pot aduce date diagnostice în trei ore de la colectare. Acest lucru poate scădea mortalitatea in cazul spitalizărilor și costurile aferente. Stafilococcus aureus este pe primele locuri împreună cu alți patogeni bacterieni care cauzează infecții sistemice conform unor studii recente și este cauza principală a pneumoniilor nosocomiale. In adiție, Stafilococcus aureus cauzează infecții pornind de la răni provocate chirurgical sau de la implanturi prostetice.[7]

CAPITOLUL3

Consumul de antibiotice

Datele de consum de antibiotice utilizate pentru acest raport au fost obținute de către IMSHealth, societate privată de cercetare de piață. Datele pentru anul 2015 au fost analizate comparativ cu cele disponibile pentru anii anteriori, 2011-2014. Pentru perioada 2011-2015 am putut utiliza și date de rambursare a antibioticelor furnizate de CNAS. În paralel, datele de consum din alte state europene au fost disponibile pentru anii 2011-2015, așa cum in bazele de date publicate pe pagina de internet a ESAC-Net .

Analiza a fost efectuată asupra consumului total de antibiotice, fără a mai păstra diferențierea ambulatoriu versus spitalicesc; de altfel, și raportarea către ESAC Net a datelor 2011-2015 s-a efectuat cu date cumulate.

Preliminarii tehnice:

 cantitatea de antibiotice utilizată a fost exprimată în DDD (defined daily dose)/1000 loc/zi; pentru fiecare antibiotic a fost folosită valoarea DDD-ului din versiunea 2015 a ATC/DDD

 analiza a fost efectuată asupra consumului total de antibiotice, fără a mai ține seama de diferențierea spital versus ambulatoriu (vezi mai sus).

 au fost incluse între antibacteriene și câteva medicamente încadrate ATC în alte categorii, respectiv: rifaximina, fidaxomicina, nifuroxazid și metronidazol de administrare orală.

 calculele au fost efectuate considerând populația României de 19, 861 milioane de locuitori la 1 iulie 2015, conform Eurostat.

 30 de state au comunicat către ESAC-Net volumul consumului lor de antibiotice pentru anul 2015: statele membre UE, Norvegia și Islanda.

A. Consumul total de antibiotice

Pentru anul 2015, consumul total de antibiotice a fost de 34,33 DDD/1000 loc/zi, în creștere cu 6,5% față de anul precedent.Tendința acestui indicator pentru intervalul 2011-2015 este una crescătoare, cu semnificație statistică ridicată.

Figura 1. Consumul total de antibiotice in Romania

În această perioadă de cinci ani, datele ESAC Net pentru antibioticele din categoria J01 indică faptul că nivelul consumului din România a fost între primele patru state pentru fiecare an în parte. În anul 2015, consumul antibioticelor din categoria J01 în România depășea cu 48,7% media europeană (figura 2), iar dintre toate statele care au raportat date, doar Grecia a înregistrat un consum mai mare de antibiotice (38,3 DDD/1000loc/zi).

Figura 2. Consumul AB in România și UE/EEA

B. Consumul diferitelor clase de antibiotice

Pentru subcategoriile de antibiotice definite de ESAC-Net, consumurile din România au fost următoarele (figura 3):

Figura nr.3: Consumul antibiotice pe subcategorii in Romania[5].

CAPITOLUL 4

Epidemiologia MRSA în spitale

Proporția infecțiilor cu MRSA în spitale a crescut în mod constant încă din anii ”80. Această creștere a fost documentată la începutul anilor 80 în Italia apoi în SUA și în anii 1990 în Regatul Unit . MRSA este acum o problemă globală și a fost și a devenit comună nu numai în spitale dar și în clinici de dimensiuni mai mici. Datele furnizate de US National Nosocomial Infections Surveillance System au dezvăluit că în 2003 60% din tulpinile de Stafilococcus aureus din cadrul unitatii de primiri urgente au fost MRSA cu o creștere de 11% comparativ cu rata a cinci ani anteriori [8]. Prin urmare MRSA este o cauză primară a infecțiilor sistemice și a pneumoniilor dobandite in spital[9].

Datele furnizate de către European Antibiotic Resistance Surveillance System a arătat un trend de creștere a cazurilor de MRSA până în 2005 iar prevalența sa porneste de la 0 la sută în statele nord europene la 50% în statele sud europene. Această diferență foarte mare este probabil datorată diferențelor care există în utilizarea antibioticelor și sau implementarea masurilor de control a prevalenței MRSA în spitale[10].

In ultimii ani multe țări cu o proporție mare initiala a MRSA adică Regatul Unit, Italia, Franța și Spania au raportat o scădere semnificativă pe când sau observat prevalența crescută în țări precum Grecia și România . România participă cu 83 de tulpini în 2005, procentul

de meticilino-rezistentă fiind de 61%, fatå de 36% în 2002. Cu toate acestea, harta prevalenței MRSA în Europa încă arată o diferență remarcabilă între ratele de prevalență în Europa vestică și sudică și cele din Europa Nordică (figura 4).

Figura 4. Proportia de izolate MRSA din cadrul infectiilor sistemice in Europa in 2007.[7]

În 2014 procentajul de tulpini de MRSA invazive în Europa pornește de la 0,9% în Olanda până la 56% în România de schimb proporția de tulpini izolate de MRSA în Europa a scăzut de-a lungul timpului : 7 dintre cele 29 de țări din Uniunea Europeană încă raportează un procent de peste 25% de tulpini de MRSA. Un rezumat a 15 studii arată că între 13 și 74% din infecțiile globale cu Stafilococus aureus sunt MRSA.

In 2005 infecțiile invazive cu MRSA in Statele Unite au o rată de 31,8 per 100.000 de oameni și 75% din aceste infecții au presupus SAB.Acest rezultat este mai mare comparativ cu cel raportat în Canada din anii 2000 până în anul 2004 care au fost 2,1 1,6 și 3,6 pe 100.000 de oameni . In Cipru ,Italia, Portugalia și România mai mult de 60% din infecțiile cu Stafilococus aureus intraspitalicești au fost identificate ca implicînd tulpini MRSA. Originea cazurilor de SAB comunitare s-a schimbat ; de-a lungul timpului incidența MRSA in Statele Unite a scăzut acum infecțiile comunitare au proporția cea mai mare surclasînd HA-MRSA la modul global. Pacienții cu CA-MRSA frecvent au comorbidități cum ar fi diabetul, ulceratiile cutanate, boala renală cronică, demența, sechelele de accident vascular cerebral, decubitul prelungit, etc.[7].

CAPITOLUL 5

Rezistența bacteriană la antibiotice

Pentru acest domeniu în anul 2014 putem furniza date doar despre tulpini implicate în infecții invazive, izolate prin hemoculturi sau culturi LCR, pentru speciile raportate în cadrul sistemului de supraveghere EARS-Net. Datele au fost colectate de către Institutul Național de Sănătate Publică de la 17 spitale din țară:

 București (6 spitale)

 Moldova (4 spitale)

 Transilvania și Banat (7 spitale).

Aceste spitale (toate unități publice) reprezintă 4,5% din totalul spitalelor publice și aproximativ 3,5% din totalul spitalelor publice și private; totuși, faptul că între aceste spitale se află 5 spitale de boli infecțioase și alte spitale cu volum de servicii medicale extrem de ridicat constituie un argument că de fapt este analizată o proporție mult mai mare de 4,5% din totalul tulpinilor izolate din infecții invazive la nivel național. În plus s-a urmărit includerea de laboratoare ce pot furniza date microbiologice valide, așa încât baza de selecție a fost mult redusa.

Au fost analizate în mod global datele privind rezistența bacteriană și modalitățile de testare ale acesteia; pentru speciile bacteriene din care au fost analizate cel puțin 200 de izolate s-au efectuat analize comparative privind nivelurile de rezistență în diverse regiuni ale țării.

Variațiile nivelurilor de rezistență față de anii precedenți pot fi în oarecare măsură explicate și de modificarea bazei de selecție a datelor (înlocuirea a două laboratoare participante în anul 2013 cu alte două laboratoare de spital)[3].

Staphylococcus aureus

Întrucât beta-lactaminele sunt antibioticele cel mai frecvent folosite în practica medicală, cele mai multe studii au investigat capacitatea stafilococilor de a rezista acțiunii acestor antibiotice.

Singura beta-lactamină activă împotriva tulpinilor de MRSA este ceftarolina.

Dintre celelalte clase de antibiotice sunt de interes clinic pentru infecțiile stafilococice invazive:

 Rifampicina, activă împotriva unui procent important de tulpini MSSA și MRSA; în prezent, este un antibiotic extrem de util în cazul infecțiilor grefate pe un corp străin (proteză valvulară sau articulară, șunt ventricular) și în infecțiile osteoarticulare. Utilizarea rifampicinei a fost limitată de constatarea că rezistența față de aceasta se instalează ”într-o singură treaptă”( o singură mutație la nivelul genei care codifică ARN-polimeraza crește CMI-ul bacterian de 1000-4000 de ori).

 Fluorochinolonele – introduse în anii ”80 ca antibiotice sistemice anti-MRSA și-au pierdut mult din activitatea lor după aproape 3 decenii de utilizare.

 Linezolid, glicopeptide, daptomicină, tigeciclină – rezistența S. aureus față de acestea este extrem de rară, de aceea în cazul în care testele microbiologice indică o astfel de situație este obligatorie o determinare corectă a CMI-ului pentru confirmarea suspiciunii.

În anul 2014, 15 dintre cele 17 laboratoare de spital participante la colectarea de date privind germenii invazivi au identificat 417 de tulpini de Staphylococcus aureus. Au fost excluse datele furnizate de un al 16-lea laborator deoarece proveneau exclusiv de la pacienți internați în secția de ATI, în condițiile în care pacienți cu bacteriemii stafilococice se pot interna și în alte secții clinice, unde infecțiile pot fi mai frecvent comunitare, cu tulpini de regulă MSSA și utilizarea acelor tulpini selectate doar din ATI ar fi condus la supraevaluarea rezistenței bacteriene a S. aureus. Dintre cele 417 tulpini, doar 9 au fost izolate din LCR (2,2%) în timp ce 408 proveneau din sânge (97,8%), ceea ce a făcut imposibilă o analiză a diferențelor de rezistență între tulpinile care au determinat meningite și cele care au determinat bacteriemii fara afectare meningiana.

 Se constată un nivel extrem de ridicat al meticilinorezistenței: 236/417 tulpini reprezentând 56,6% CI95%(51,8%; 61,3%). Chiar dacă se constată o ușoară reducere față de 2013, rămâne cel mai ridicat nivel inregistrat in statele europene participante la EARS Net.

 Tulpinile cu sensibilitate diminuată la rifampicină (rezistente sau intermediare) au reprezentat 17,2% din totalul celor 396 testate; acest rezultat reprezintă o inversare a tendinței de creștere anterioare și este legată de modificarea unor tulpini sensibile drept intermediare, fenomen care era cauzat de o gamă inadecvată de CMI testate de către sistemele semiautomate de determinare a rezistenței bacteriene.

În anul 2015, toate cel 15 laboratoare de spital participante la colectarea de date au comunicat izolarea de Staphylococcus aureus, în total 488 de izolate. Numărul acestor izolate este în creștere constantă în perioada 2012-2015: de la 235 tulpini în 2012, la 399 în 2013, 417 în 2014 și 488 în 2015.[5]

Figura 5. Rezistenta la antibiotice a Staphylococcus aureus in perioada 2011-2014 [3].

 au fost rezistente la fluorochinolone 90 dintre cele 417 tulpini testate, ceea ce reprezintă 21,6% CI95% (17,9%; 25,8%) .

 a fost identificată o tulpină rezistentă la linezolid din cele 416 testate, cu un CMI ≥ 8 mg/l .

 diferențe regionale: au fost comunicate 131 izolate din Transilvania și Banat, 130 izolate din Moldova și 156 izolate din București; s-au analizat ponderile rezistenței la meticilină și la rifampicină între diverse regiuni geografice.

Figura 6. MRSA: România – comparativ cu UE/EEA [5].

În anul 2015, nivelul MRSA in România a rămas cel mai ridicat din toate statele UE/EEA, așa cum se întâmplase și în anii anteriori, 2012-2014; în ultimii doi ani am fost singurul stat european cu un nivel al MRSA de peste 50%. Această situație este explicată de diferențele de eficiență a măsurilor de limitare a transmiterii interumane de germeni între spitalele din alte state și cele din România precum și de consumul mult mai mare de beta-lactamine în România. [5]

Antibiotice de salvare

Emergența germenilor MDR ca etiologie a infecțiilor a determinat o preocupare majoră pentru salvarea antibioticelor de rezervă/de salvare. Între acestea se află antibiotice cu diferite încadrări ATC, care pot fi grupate în raport cu activitatea lor antimicrobiană .

Antibiotice de rezervă/salvare pentru infecții determinate de coci Gram pozitivi multirezistenți: glicopeptide, linezolid, daptomicină, ceftarolină, TMP/SMX, rifampicină

În această secțiune vor fi analizate doar antibiotice aparținând clasificării ATC J01X, fără a relua analiza pentru antibioticele din grupele deja descrise.

Antibiotice de rezervă/salvare pentru infecții determinate de coci Gram pozitivi cu probleme importante de rezistență la antibiotice MDR (MRSA, ARE, S pneumoniae MDR) : in această categorie vor fi analizate glicopeptidele, linezolidul și daptomicina; consumul lor total în anul 2015 a însumat 0,33 DDD/1000loc/zi, continuând o tendință de creștere evidentă pentru perioada 2011-2015. Deși există și alte antibiotice care sunt utilizate în infecții determinate de astfel de germeni, faptul că au și alte (multiple) utilizări ar falsifica analiza actuală, cu supraevaluarea consumului în astfel de indicații. Chiar și așa, există o supraevaluare a utilizării lor ca antibiotice de rezervă/salvare, deoarece vancomicina este tot mai frecvent folosită ca și tratament al ICD; importanța acestei observații este corelată și cu faptul că în perioada 2011-2015 creșterea de consum în acest grup a fost determinată de vancomicină.

Figura 7 – Consumul de antibiotice de rezervă/salvare pentru infecții cu coci Gram pozitivi (2011-2015) [5].

Indicatori de calitate

1) indicatori de calitate ai consumului de antibiotice în comunitate validați de ESAC

Dintre cei 12 indicatori de calitate ai utilizării antibioticelor în comunitate, au putut fi calculați doar primii 10; pentru variația sezonală a consumului total de antibiotice și a celui de chinolone nu am avut date care să ne permită evaluarea lor. Exista un factor de eroare legat de faptul ca am utilizat datele consumului total de antibiotice, dar dimensiunile erorii sunt limitate, ponderea componentei spitalicesti nedepășind 8-9% în statele UE/EEA.

Indicatorii reflectă :

a. valori ale consumului la 1000 locuitori (5 indicatori): cu excepția consumului de macrolide unde ne-am situat în anul 2014 în jumătatea favorabilă a ierarhiei europene, în rest consumul din România a fost în primele locuri pentru consumul total de antibiotice, consumul de peniciline, de cefalosporine și chinolone, ceea ce traduce o prescriere excesivă de antibiotice și în special a celor cu risc major de selecție a rezistenței bacteriene.

b. consumuri relative ale grupelor de antibiotice (4 indicatori)

 peniciline cu spectru îngust (singurul indicator pentru care o valoare mai ridicată indică o prescriere corectă): reprezintă doar 2,6% din totalul consumului de antibiotice. Consumul din anul 2015 ne plasează în prima jumătate a topului ESAC Net, locul 13.

 peniciline asociate cu inhibitori de beta-lactamază, cefalosporine de generația 3-4, fluorochinolone: în anul 2014 ne-am situat cu fiecare dintre aceste categorii de antibiotic in jumatatea nefavorabilă a calității prescrierii de antibiotice (chiar în ultimul sfert pentru cefalosporine – locul 3 și chinolone – locul 7)

Deși pentru indicatorii din acest grup s-au înregistrat valori mai bune față de cele din primul grup de indicatori, această situație reflectă mai degrabă o dispersie a prescrierii nejustificate a antibioticelor cu spectru larg (fără o dominantă națională) și nu o prescriere judicioasă a lor.

c. ponderea antibioticelor cu spectru larg (1 indicator)

Calculat ca raport între antibioticele cu spectru larg (cefalosporine de generații 3-4, peniciline asociate cu inhibitori de beta-lactamază, macrolide cu spectru extins) și cele cu spectru îngust (cefalosporine de generația 1, eritromicină, penicilina V și similare), a avut în 2015 o valoare de 13,2, în creștere față de 11,9 (2014), de 11,1 (2013), de 8,4 (2012) și de 6,4 (2011). Raportul nu are o valoare și mai mare datorită dispersiei mari a antibioticelor utilizate, incluzând folosirea celor cu spectru îngust (mai ieftine și deci mai accesibile persoanelor cu venituri mici din România), dar tendința către utilizarea preferențială a antibioticelor cu spectru larg este tot mai evidentă [5].

CAPITOLUL 6

Colonizarea cu MRSA

Aproximativ o treime din populația generală este colonizată cu Staphylococcus aureus iar aceasta a variat în funcție de ce metodologie a fost folosită la aceste studii; de exemplu când culturile sunt luate în momentul internării în spital sau în momentul externării prevalența colonizării cu CA-MRSA fost 1,8% dar când prelevarile au fost făcute la indivizi care nu au stat intr-un mediu spitalicesc a fost 0,76% .

Factorii de risc pentru colonizarea cu MRSA a femeilor din Statele Unite au fost : vârsta mai mare de 60 de ani, diabetul zaharat și condițiile socio-economice, în timp ce la bărbații americani singurul factor de risc semnificativ a fost expunerea la mediul spitalicesc [44]. Alte studii identifică bolile cronice, folosirea drogurilor injectabile, spitalizarea recentă sau vizitele ca și aparținător în mediul spitalicesc, uzul recent al antibioticelor și contactul cu o persoană infectată cu MRSA ca și factori de risc.

Deși cele mai comune locuri de colonizare cu MRSA sunt narinele, S. aureus inclusiv MRSA poate fi prezent în gât ,axilă, rect, perineu și în mod frecvent colonizează mai mult de un singur loc. Studiile recente sugerează colonizarea gâtului ca fiind mai prevalentă decât cea a nasului și prin urmare verificarea zonei nasului exclusiv ar putea face ca un procent semnificativ al indivizilor colonizați să nu fie detectat . In ceea ce privește colonizarea mucoasei nazale de către Stafilococcus aureus aproximativ 20% din populație sunt purtători constanti de o singură tulpină aproximativ 60% sunt purtători intermitenți ai mai multor tulpini și restul populației nu prezintă niciodată colonizare la nivelul mucoasei nazale .

Infecțiile cauzate de HA-MRSA în general se găsesc la indivizi care sunt purtători constanți și care și care sunt sub un regim terapeutic cu antibiotice sau la purtători intermitenti . Ambii purtători de MRSA intermitenți sau persistenți au un risc crescut de a dezvolta infecții invazive incluzând bacteriemie; de exemplu pentru o perioadă de 2 ani 21% din purtătorii persistenti și 13% din cei intermitențe au dezvoltat o infecție invazivă.

Pentru a înțelege relația dintre tulpinile care colonizează și cele care infectează indivizii s-a analizat un grup de pacienți care s-a prezentat în departamentul urgențe pentru abces cutanat . Majoritatea (aproximativ 90% ) erau deja colonizați cu tulpina de Stafilococus aureus izolată din infecție iar 31% din acești pacienți au fost colonizați cu o tulpină adițională . Având două tulpini de MRSA fost un lucru neobișnuit (4,1%) dar MRSA plus MSSA sau două tulpini de MSSA au fost prezente în 20,4 și 22,2 la sută respectiv din pacienți[11].

CAPITOLUL 7

Detecția și diagnosticul tulpinilor de MRSA

Identificarea organismului cauzator poate fi complicat în cadrul SAB mai ales pentru tulpinile rezistente. Pentru cultura tradițională și testele pentru MRSA sunt necesare între 48 și 72 de ore inclusiv o incubație de la 16 până la 24 de ore și alte 16-24 de ore pentru a completa testele de susceptibilitate.

Avansurile tehnologice recente în ceea ce privește testele moleculare și nonmoleculare au redus cu mult timpul necesar pentru a detecta MRSA . Aceste teste screening rapide și sensibile ar putea să crească controlul infecției și să scadă costurile. Uzul testelor moleculare diagnostice rapide este de asemenea asociat cu un risc semnificativ mai mic de mortalitate pentru pacienți cu infecții sistemice . Combinând testarea rapidă moleculară cu un program terapeutic antibiotic eficient putem mai departe reduce riscul de mortalitate. O adaptare a metodelor tradiționale este folosirea unui agar chromogenic care produce o reacție colorată în culturile bacteriene. Aceste medii conțin în același timp antibiotice care permit numai bacteriilor rezistente să crească .

Prin urmare MRSA poate să fie detectat în 20 până la 26 de ore; o metaanaliză a caracteristicilor de performanță a mediilor cromogenice au raportat o sensibilitate estimată de 78% după 18-24 de ore și de 87,6% după 48 de ore iar specificitatea estimată a fost aproape 97% la 18-24 de ore dar și 94% la 48 de ore senzitivitatea la 18-24 de ore a fost mai scăzută semnificativ decât la 48 de ore dar senzitivitatea la 48 de ore a fost comparabilă cu metodele tradiționale de cultură (86,9%). Specificitatea la 18-24 de ore a mediilor cromo- genice pentru detectarea MRSA a fost semnificativ mai înaltă decât specificitatea culturilor tradiționale . In practica clinică folosirea mediilor cromogene reduce timpul până la începerea tratamentului cu până la 12 ore.

Altă inovație în detectarea MRSA este dezvoltarea testelor PCR (Polimerase Chain Reaction) capabile să detecteze gene specifice ale Stafilococcus aureus. Pentru a distinge tulpinile de MRSA de MSSA, metodele PCR au targetat o parte din ADN ul genei specifice MRSA- SCCmec care se întâlnește cu gena orfX[12]. Testele PCR pot fi făcute direct pe specimenul recoltat (sange) sau din prelevarea de la nivelul mucoasei nazale sau a rănilor și rezultatele sunt de obicei disponibile în unu până la trei ore. In practica clinică totuși timpul care se scurge de la prelevarea unei mostre până la rezultat sunt de obicei mai lungi datorită timpului necesar pentru a transporta mostrele și timpul efectiv de efectuare a testelor și raportarea rezultatelor. Cu toate acestea timpul necesar este mult mai scurt în cazul testelor PCR decât cele care folosesc culturi pe medii cromogene. In adiție, testele PCR au arătat că au o sensibilitate și o specificitate estimate de 92,5 respectiv de 97% .

In meta analiza menționată mai sus sensibilitatea testelor PCR a fost semnificativ mai mare decât a mediilor cromogene și specificitatea a fost semnificativ mai mare decât a culturilor tradiționale. Relativ la detecția MRSA cu ajutorul agarului cromogenic testele PCR au redus durata totală izolării pacientului și a numărului de zile în care pacienții au fost izolați în mod impropriu în timpul spitalizării lor.

Alta abordare a detecției MRSA este folosirea testelor imunocromatografice. Aceste teste folosesc anticorpi direcționați specific împotriva proteinelor bacteriene pentru a genera o reacție vizibilă în mediul de test pentru a evidenția dacă acea proteină este prezentă sau nu în mostră .

Un tip de test imunocromatografic este testul latex aglutinare care folosește un anticorp monoclonal împotriva PBP2-a, o proteină exprimată de gena mecA . Dacă PBP2-a este prezenta în mostră particulele de latex sensibilizate de către aglomerarea de anticorpi formează o aglutinare vizibilă cu ochiul liber [13]. Testul latex aglutinare are o sensibilitate de 97% și o specificitate de 100%, putând astfel să distingă MRSA de MSSA[14] .

Alt test bazat pe anticorpul PBP2-a (Clear View) are caracteristici de performanță identice dar sunt necesare mai puține etape decât în cazul testului latex aglutinare. Acest test durează mai puțin de 6 minute iar rezultatele apar ca și linii colorate la nivelul stripurilor de test[]. Testul BinaxNOW diferențiază stafilococii aurii coagulazo negativi și alți coci gram pozitivi direct de la nivelul culturilor sanguine pozitive. Acest test ia mai puțin de 30 de minute și are o sensibilitate de 95,5 pana la 99,6%. Desi acest test nu identifică în mod specific MRSA, poate totuși se elimine ipoteza existenței altor stafilococi și este în același timp necostisitor. Datorită costurilor mici și a rapiditatii cu care sunt furnizate rezultatele ar putea să fie un test folositor pentru a fi utilizat înainte de a trimite mostrele pentru testarea PCR[15].

Diferite tulpini sunt responsabile pentru infecțiile intraspitalicești sau comunitare și pot fi identificate folosind metode ca pulsed field gel electrophoresis (PFGE) sau multi locus sequence typing. Aceste metode de tipizare pot distinge tulpinile bazandu-se pe decodificarea genelor care codifică proteina A stafilococică sau caseta cromozomială stafilococică SCCmec . La nivel global tulpina ST239 este o cauză comună de HA-MRSA. Rezistența la meticilină a fost asociată cu variantele clonale ale genei SCCmec. Tulpinile HA-MRSA conțin de obicei SCCmec subtipul 2 în contrast SCCmec subtipul 4 arareori găsit în tulpinile HA-MRSA este mai prevalent în tulpinile CA-MRSA.

Alte atribute moleculare disting CA-MRSA de HA-MRSA . Leucocidina Panton Valentin (PVL) este o exotoxina puternică care induce liza leucocitelor, în mod particular a neutrofilelor . Tulpinile CA-MRSA de obicei conțin gena care codifică PVL în timp ce aceasta este rară în tulpinile HA-MRSA. Tulpinile de streptococ auiu PVL pozitive au fost responsabile de epidemii de pneumonie necrozantă și infecții cutanate invazive. Totuși rolul PVL în severitatea bolilor nu este clară. PVL nu este singura toxină produsă de MRSA; diversele tulpini produc o gamă largă de toxine incluzând toxic shock syndrome toxin-1 (TSST1),enterotoxina B sau C stafilococică, alfa hemolizina și modulinele solubile în fenol PSM. Expresia diverselor toxine incluzând alfa hemolizina și PSM este controlată de un sistem regulator care este mai probabil de a fi prezent în CA-MRSA decât în HA-MRSA.

Per total expresia genelor producătoare de toxine este mai mare în CA-MRSA decât în HA-MRSA și tulpinile comunitare au tendința de a fi mai virulente .La pacienții care prezintă bacteremia MRSA prezența genelor care codifică enterotoxina stafilococică și gena care exprima TSST1 este asociată cu un risc semnificativ de creștere a mortalității [11].

CAPITOLUL 8

Caracteristicile genotipice ale MRSA

Metodele contemporane de tipizare bacteriană sunt bazate pe caracteristicile genotipice ale tulpinilor de exemplu caracteristicile genomului sau prezența unor gene tipice sau a unor elemente genetice. Aceste metode sunt folosite pentru a diferenția tulpini sau linii în interiorul populației de MRSA pentru scopuri epidemiologice sau pentru a stabili sursa unei epidemii cu o anumită tulpină . Cea mai folosită tehnică implică electroforeza pe un gel special: pulsed field gel electrophoresis (PFGE) care separă fragmentele cromozomiale care pot fi ulterior vizualizate . La ora actuală metodele bazate pe secvențialitate sunt favorizate din moment ce ele permit compatibilitatea dintre laboratoare și crearea unei baze de date globale.

Pentru MRSA 3 metode pot fi aplicate:

Multi loculus sequence typing (MLST) este metoda de referință[16].

Staphylococcal protein A typing (spa typing) este folosită în mod specific pentru stafilococul auriu și este bazată pe secvența în care se repetă regiunea proteinei A[17].

SCC mec typing – bazat pe diferite structuri caracteristice ale elementului genetic care conține mecA aplicat exclusiv la MRSA[18].

Până în prezent șapte tipuri de MSCCmec și mai multe variante au fost descrise dintre care tipul 1 până la 5 fiind cele mai comune . Unele dintre tehnicile descrise au fost pe reprezentate în figura 8 .

O tulpină deosebit de mare se poate să fie descrisă folosind una sau mai multe din aceste tehnici. Metodele moleculare au revelat faptul că tulpinile MRSA sunt mai puțin heterogene decât tulpinile de MSSA și aparțin de numai cinci complexe clonale pandemice. Aceasta înseamnă că nu toate tulpinile MSSA pot accepta elementul SCCmec pentru a deveni MRSA și că evoluția lui MRSA este bazat în mod esențial pe expansiunea clonala.

Figura 8. MRSA de la fenotip la genotip:a) aspectul S.aureus la microscop ;b)Pulsed field gel elecrophoresis pentru a determina relatiile dintre diferitele izolate de MRSA. Izolatele 2 si 3 par a fi foarte similare si se considera ca rezulta din clone inrudite. c) Multiple rezultate PCR pentru tipizarea Staphylococcal Chromosome Cassette mec (SCCmec) arata SCCmec tipul I, II, III si IV.d) tipizarea spa ; software-ul analizeaza the secventa ADN a regiunii care corespunde cu repetarea proteinei A , recunoaste diferitele repetari (sagetile verzi) si atribuie o tipologie spa.[11]

CA-MRSA

În timpul ultimei decade epidemiologia infecțiilor cu MRSA a fost schimbată foarte mult datorită emergenței unei noi generații de tulpini MRSA care are posibilitatea de a cauza infecții în subiecți sănătoși: copii sau adulți tineri care nu au avut contact cu mediul spitalicesc.

CA-MRSA are caracteristici epidemiologice clinice și microbiologice care o diferențiază de HA-MRSA, deși fiecare caracteristică nu este exclusivă fiecărui grup în mod tipic.

CA-MRSA cauzează infecții ale pielii si țesuturilor moi incluzând furuncule, abcese,impetigo și celulită. Infecțiile sunt de obicei recurente, arareori CA-MRSA este asociată cu infectii severe cu mortalitatea mare cum ar fi sepsisul și sindromul Waterhouse Friderichsen, fasceita necrozantă și pneumonia necrozantă . Pneumonia necrozantă apare la pacienții tineri și este de obicei precedată de o infecție cu virusul influenza sau cu o boală influenza-like și este caracterizată de multiple infiltrații intra cavitare pulmonare iar mortalitatea poate depăși 50% .

Din punct de vedere microbiologic CA-MRSA diferă de HA-MRSA datorită unui număr de caracteristici. CA-MRSA este de obicei susceptibil la majoritatea antibioticelor non beta lactamice și conține elementul SCCmec de tipul patru sau cinci sau șapte (mai nou descoperit). La polul opus ,HA-MRSA este de obicei rezistent la multe droguri și conține elementul SCCmec tipul 1, 2 sau 3. In plus, majoritatea CA-MRSA poartă leucocidina Panton-Valentin PVL , o toxină care are abilitatea de a cauza liza leucocitelor umane și necroza celulelor epiteliale . PVL a fost asociată in primul rând cu infecțiile pielii și cu pneumonia necrozantă iar cele mai noi tulpini de CA-MRSA care cauzează infecții severe, produc la rândul lor PVL. Totuși, rolul jucat de PVL în patogenia infecțiilor cu Stafilococcus aureus este încă controversat datorită rezultatelor contradictorii care s-au obținut până acum.

Din moment ce S. aureus este asociat cu producerea unei game largi de toxine este posibil ca PVL să acționeze în sinergie cu alte toxine sau doar în anumite faze ale infecției.

Tulpinile CA-MRSA au o întindere globala deși prevalența lor în comunitate variază foarte mult de la zonă la alta. In SUA o singură clonă de CA-MRSA denumită USA 300 a devenit prevalentă. USA 300, prototipul lui CA-MRSA fost recent prezentă în sistemul de sănătate cauzând infecții și epidemii printre nou născuți, cauzând infecții nosocomiale sistemice și colonizarea rezidenților instituțiilor precum aziluri sau închisori. In Europa prevalența infecțiilor datorate lui CA-MRSA este mai scăzută decât în SUA deși pare să fie în creștere.

CA-MRSA din țările europene aparțin unei varietăți diferite de clone și linii și majoritatea au genele PVL . Cea mai comuna clona europeană este SP80 definita dealtfel ca si „clona europeană”. Alte clone identificate frecvent sunt ST30 inițial definită ca clona West Pacific și clona USA 300.

Tulpina tipică CA-MRSA susceptibilă inițial la multe antibiotice non beta lactamice evoluează acum către rezistența multidrog. Tulpina USA 300 și achiziționat o plasmida care atrage după ea rezistența la antibiotice și care a fost identificată recent în SUA. In Europa clona ST 80 este în mod caracteristic rezistentă la fluoroquinolone, tetracicline și acid fusidic. Si alte clone circulante pot demonstra o rezistență la diferite alte antibiotice inclusiv aminoglicozidele [7].

PARTEA SPECIALĂ

INTRODUCERE

Obiectivele studiului

Am urmărit frecvența izolării și caracteristicile tulpinilor MRSA implicate în infecții intraspitalicești în perioada 15.01.2019-15.04.2019. Din 52 de tulpini de S. aureus s-au identificat 21 tulpini MRSA(40.38%).

Prevalența tulpinilor MRSA a variat în funcție de profilul secțiilor și a produselor patologice. S-a observat tendința crescătoare a frecvenței izolării MRSA la terapie intensivă. Majoritatea tulpinilor au fost multirezistente,nu s-au identificat tulpini rezistente la linezolid.

Obiectivul acestui studiu retrospectiv desfășurat pe o perioadă de 3 luni este identificarea problemelor de rezistență la antibiotice a tulpinilor de stafilococ auriu rezistent la meticilină izolate în secțiile clinice din cadrul Spitalului Județean Prahova. S-a mai efectuat si evaluarea rezistenței inductibile la macrolide-lincosamide-streptogramine a tulpinilor de stafilococ auriu din spital, prin efectuarea D-testului.

S-au inclus în studiu tulpinile izolate din puroi din infecții de plagă chirurgicală,abcese, produse obținute din tractul respirator inferior (spută, aspirat traheal, aspirat bronșic) din produse destinate depistării colonizării (secreții faringiene și nazale). S-au exclus izolatele obținute de la pacienți din ambulator, din produse superficiale cu floră mixtă cu peste 3 germeni, s-a analizat un singur izolat pe pacient.

In ceea ce priveste portajul, testarea personalului medical este și ea selectivă, adresându-se doar celor care lucrează în secții în care pacienții, odată colonizați, au risc major de a dezvolta infecții severe cu MRSA; ritmicitatea optimă a testărilor nu este stabilită, dar în mod cert se efectuează în situația diagnosticării de infecții cu MRSA la pacienții secției respective.

Terminologie

Terminologia pe care am adoptat-o este în conformitate cu documentul definitiv al European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing -EUCAST din mai 2000.

Antibiotic

Un antibiotic este o substanță de origine biologică, semisintetică sau sintetică( în ultimul caz strict un agent chemoterapic antibacterian) care prezintă activitate selectivă împotriva bacteriilor și care este potențial utilizat în tratamentul infecțiilor. In această categorie nu sunt incluse dezinfectantele antisepticele și prezervantii.

Substanțe test

Acestea sunt reprezentați ai unui grup de antibiotice care sunt în mod special potrivite pentru investigații in vitro ,care reprezintă în mod optim spectrul de activitate al grupului și care permite utilizarea unui număr minim de substanțe pentru testare

In mod ideal în aproape toate cazurile trebuie să testăm antibioticul care va fi utilizat în terapie. Aceasta este posibil numai dacă clinicienii care beneficiază de serviciile laboratorului aderă la o politică comună privind utilizarea restrictivă, Dar rezultatele obținute prin testarea altor antibiotice poate fi utilă în identificarea mecanismelor de rezistență (citire interpretativă) și identificarea tehnicilor epidemiologice.

Caractere dependente de agentul patogen

Susceptibil (S) sau sensibil

Acest termen este utilizat în două sensuri unul microbiologic și altul clinic. Nu a fost posibil un consens asupra terminologiei în scopul rezolvării confuziei care rezultă de aici. In fiecare caz definiția este bazată pe analiza distribuției rezultatelor măsurătorilor unuia sau altuia dintre parametrii utilizați pentru definirea sensibilității ,cum este concentrația minimă inhibitorie (CMI).

Sensibilitate microbiologică

Bacteriile sensibile sunt cele care aparțin celei mai sensibile sub populații și cărora le lipsesc mecanismele de rezistență uneori denumite populație bazală (sensibilă).

Sensibilitate clinică

Bacteriile sensibile sunt acele bacterii definite prin parametrii in vitro pentru care s-a demonstrat că răspund unui regim terapeutic standard atunci când sunt implicate într-o infecție. Unele autorități în domeniul rezistenței la antibiotice fac distincție între bacterii integral sensibile (sensibile din punct de vedere microbiologic) de cele la limită, borderline sau moderat sensibile care deși prezintă un mecanic de rezistență de nivel jos răspund de obicei la regimuri terapeutice standard. Numeroși alți factori care influențează răspunsul la terapie fac adesea dificilă determinarea efectului clinic exclusiv al chemoterapiei. In absența informației clinice fiabile definiția este bazată pe un consens asupra interpretării proprietăților in vitro și farmacocinetice ale antibioticelor și în mod particular pe concentrația de antibiotic care se poate atinge la locul infecției sau adesea ca aproximație practică în sânge.

b. Rezistent (R)

Acest termen este utilizat în două sensuri : unul microbiologic și altul clinic.

Rezistența microbiologică

Microorganismele cu rezistență microbiologică sunt acele microorganisme care posedă niște mecanisme de rezistență demonstrate fenotipic sau genotipic. Termenul utilizat poate fi ,,moderat sau înalt rezistent,, sau rezistență de nivel jos sau înalt în funcție de CMI.

Rezistență disociată

Poate fi demonstrată fenotipic numai în prezența unui al doilea antibiotic de exemplu în cazul rezistenței la macrolide demonstrata în prezența unei lincosamide.

Rezistența clinică

Rezistența clinica apare când este foarte puțin probabil ca infecția să răspundă chiar la doze maxime la un anumit antibiotic. Numeroși factori care afectează răspunsul la terapie fac dificilă determinarea efectului clinic exclusiv al terapiei chiar atunci când patogenii sunt rezistenți in vitro

Intermediar (I)

O bacterie este clasificată ca fiind intermediar sensibilă dacă aparține grupului de tulpini care se situează între tulpinile clinic sensibile și clinic rezistente. Infecțiile cauzate de astfel de bacterii răspund variabil sau in determinat la chimioterapie, dar pot fi eliminate dacă antibioticul este concentrat la locul infecției sau dacă se crește doza.

Rezistența încrucișată

Este absența completă sau parțială a sensibilității la un grup de antibiotice. In sensul strict, rezistența încrucișată se aplică antibioticelor din aceeași clasă chimică (de exemplu betalactamine, aminoglicozide sau macrolide). Totuși, mecanismele de rezistență cum sunt cele care rezultă ca urmare a impermeabilitații sau efluxului pot afecta mai multe clase chimice. Acest fenomen este denumit uneori ,,rezistență asociată,,.

Citire interpretativă

Citirea interpretativă a datelor de sensibilitate este deducția mecanismelor biochimice de rezistență sau a interferenței sensibilității sau rezistenței clinice pe baza fenotipului observat.

De exemplu, o tulpină de Staphylococcus aureus ca pentru care diametrul de inhibiție la Cefoxitin în condiții standard CLSI/ fost NCCLS este </=19 mm este producătoare de PLP2a și considerată rezistentă la toate penicilinele, cefalosporinele, combinațiile betalactami-inhibitori de betalactamaze, cefeme și carbapeneme, chiar dacă diametrele in vitro pentru unele dintre substanțele antimicrobiene din aceste clase se pot situa în limitele de sensibilitate.

Spectru

Termenul de spectru caracterizează profilul activității unui agent antibacterian asupra unor variate specii bacteriene sau grupuri de specii (de exemplu Gram pozitivi, Gram negativi, aerobi ,facultativ anaerobi,strict anaerobi )

Rezistența dobândită poate modifica din timp în timp și din loc în loc pattern-ul de sensibilitate care definește spre spectrul original.

Proprietăți ale antibioticelor

Potența

Este cantitatea de agent antibacterian activ într o substanță test determinată cu ajutorul unui test biologic de obicei exprimată în micrograme per miligrame de substanță test.

Concentrația

Este cantitatea dintr-u un agent antimicrobian pentru un volum definit de lichid preferat de de exprimat în miligrame pe litru sau o masă definită dintr-un solid de obicei exprimată în microgram pe gram sau miligrame pe kilogram.

Mediul de cultură

Mediul de cultură este un preparat utilizat pentru cultivarea bacteriilor in vitro care poate fi solidificat cu agar (un polizaharid complex derivat din alge marine) ,care este utilizat în metodele dilutiilor în agar sau în bulion și în testul difuziei în agar (difuzimetric)

Inocul

Mărimea inoculului este numărul bacteriilor în suspensie, calculat prin raportare la volumul final. Este exprimat în unități formatoare de colonii pe mililitru (UFC pe mililitru), deși poate fi definit mai puțin acurat în termen de turbiditate sau densitatea optică a suspensiei. Un efect de inocul este schimbarea sensibilității în relație cu mărimea inoculului.

Tulpini de referință

Tulpinile de referință sunt bacterii catalogate, caracterizate, cu fenotipuri de sensibilitate la antibiotice stabile, definite. Tulpinile de referință se păstrează sub formă de culturi stock , de la care sunt derivate culturile de lucru. Ele se pot obține din colecțiile de culturi și sunt utilizate pentru controlul de calitate.

Zona de inhibiție

Zona de inhibitie este aria lipsită de creșterea bacteriană sub formă de strat de creștere care rezultă în urma efectului inhibitor al antibioticului care a difuzat în mediu din sursa de antibiotic aplicată (de exemplu disc strip etc).

Diametrul zonei de inhibiție

Este măsurat în milimetri.

Radiusul (raza) zonei de inhibiție

Este distanța în milimetri de la marginea unui disc cu antibiotic până la marginea zonei de inhibiție a creșterii (adică raza zonei de inhibiție minus raza discului).

Conținutul discului

Conținutul în antibiotic al unui disc este definit în micrograme sau unități și niciodată ca o concentrație.

Toleranța este intervalul de încărcătură a antibioticului intr-un vehicul, permis fabricantului, în jurul cantității declarate: acest termen nu are nicio legătură cu toleranța ca fenomen ce caracterizează populațiile bacteriene.

Condiții de cultivare

Cultivarea este creșterea intenționată a bacteriilor în condiții de mediu controlate.

In timpul incubării culturile sunt menținute la o temperatura adecvată (normal 35-37 de grade Celsius) pentru o perioada adecvată de timp (normal peste noapte) intr-o atmosfera gazoasă adecvată.

Aceste recomandări sunt elaboratE conform CLSI Performance Standards for antimicrobial Disk susceptibility Tests Standard nineth Edition 2006 –proceduri pt Bacterii aerobe.

Mediu

Mediul utilizat pentru testarea sensibilității la antibiotice a microorganismelor aerobe nepretențioase nutritiv este mediul Mueller hinton; în cazul de față stafilococul auriu este un microorganism aerobe facultativ anaerobe care este nepretentios nutritiv[19].

MATERIAL SI METODA

Procedura de testare a sensibilității la antibiotice prin metoda difuzimetrica conform standardului CLSI/NCCLS

Principiu

Metoda se bazează pe următoarele mecanisme fizico-chimice și biologice:

antibioticul conținut întru un vehicul (disc de hârtie, tabletă, benzi etc), aplicat pe suprafața unui mediu de cultivare adecvat creșterii agentului bacterian pentru care se face testarea difuzează în jurul discului pe o rază depinzând de:

cantitatea de antibiotic conținută în vehicul (încărcătură)

solubilitatea antibioticului

greutatea moleculară, sarcina electrică și structura chimică a antibioticului

grosimea stratului de mediu de cultură

vâscozitatea structura și ph-ul mediului de Cultură

temperatura de incubare

Dacă cultura bacteriei de testat este însămânțată pe suprafața unui mediu definit, iar placa este incubata în condiții definite ea nu va crește în zona în care a difuzat antibioticul în cazul în care este sensibilă față de aceasta.

Aria în care nu a avut loc creșterea este numită „zonă de inhibiție” și variază în funcție de:

densitatea inoculului

compoziția și ph-ul mediului

condițiile de incubare.

Interpretarea testului necesită compararea a zonelor măsurate cu valori acceptate( puncte de ruptură respectiv valori cut-off), specifice standardului utilizat pentru fiecare pereche antibiotic/ microorganism.

Domeniul de aplicare

Sensibilitatea la antibiotice a unui agent bacterian poate fi apreciată din punct de vedere clinic (rezistent ,intermediar ,sensibil)

Procedura trebuie aplicată în același fel în toate laboratoarele care efectează testările sensibilității la antibiotice după standardul CLSI pentru a se putea obține rezultate fiabile și comparabile la nivel local, național, continental și internațional.

Diagnosticul de laborator în infecțiile produse de stafilococi este doar bacteriologic (direct) și respectă etapele clasice ale acestui tip de diagnostic, începând cu recoltarea și transportul produsului patologic, de obicei reprezentat de puroi (fie dintr-o leziune deschisă, superficială, fie din leziuni închise, profunde). Cultivarea în vederea obținerii de colonii izolate se continuă cu identificarea în care pe lângă caracterele morfologice, de cultură și biochimice se face testul coagulazei pe lamă și/sau în tub. Antibiograma completează în mod necesar diagnosticul de laborator al unei infecții stafilococice.

Pentru a discuta diagnosticul de laborator în infecțiile produse de stafilococi vom alege drept reprezentative infecțiile purulente ale tegumentelor și mucoaselor și ne vom referi numai la Staphylococcus aureus.

Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic, direct, cu următoarele etape.

1.Recoltarea și transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie de reguli (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât mai rapid și corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de asepsie și antisepsie etc). În funcție de maladia provocată se pot recolta următoarele produse patologice: secreții purulente (din foliculite, abcese, celulite, fistule, infecții ale plăgilor și arsurilor), lichide (de puncție sinusală, otică, mastoidiană, articulară, peritoneală, pleurală, pericardică), exsudat nazal sau exsudat faringian, sânge, LCR, spută, urină, secreție vaginală, tampoane vaginale, lichid de vomă, materii fecale, alimente, prelevate de pe suprafața cateterelor și a inserțiilor iv. ale acestora. In cazul de fața produsul patologic a constat in probe de tip exsudat nazal si faringian, puroi si sputa.

2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două frotiuri din produsul patologic recoltat și transportat corespunzător, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) și respectiv Gram. Frotiurile se examinează la microscopul optic cu imersie și se notează prezența celulelor de la nivel tegumentar (eventual modificate față de normal), prezența celulelor inflamatorii (ex. leucocite, piocite) și prezența cocilor Gram-pozitivi, cu diametrul de 0,6-1,5 μm, dispuși în lanțuri scurte, perechi, izolați sau în grămezi neregulate. Cocii se pot situa intra sau extraleucocitar. Se are în vedere locul de unde a fost recoltat p.p. (puroiul poate fi necontaminat, dacă se recoltează de ex. prin puncție-aspirare dintr-o colecție purulentă profundă și este foarte probabil contaminat cu floră de asociație dacă a fost recoltat dintr-o leziune superficială).

3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează cât mai rapid (pentru a diminua riscul modificărilor ce ar putea apărea în structura microbiană) și în așa fel încât să se poată obține colonii izolate și respectiv o cultură pură, care se va identifica. Stafilococii se dezvoltă în general pe medii de cultură obișnuite în 18-24 ore, la 35-37°C. Coloniile au aspect de tip S ( suprafata bombata si neteda, margini circulare si adesea aspect stralucitor, germenii pastreaza structura antigerminica si virulența si nu aglutineaza spontan in solutia salina fiziologică).

Pe mediul geloză-sânge, în jurul coloniilor poate apărea o zonă de hemoliză clară. Stafilococii se pot multiplica pe medii hiperclorurate, tolerând o concentrație de 7-10% NaCl (ex. mediul Chapman). În cazul de față, în care produsul este recoltat de la nivel nazal (existând certitudinea că produsul conține mai multe specii de microorganisme) este recomandată utilizarea mediilor hiperclorurate.

4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:

• Caractere morfotinctoriale: sunt coci Gram-pozitivi, cu diametrul de circa 0,6-1,5 μm, dispuși în lanțuri scurte, perechi, izolați sau în grămezi neregulate.

• Caractere de cultură: produc colonii de tip S, pigmentate auriu; pe mediile cu sânge pot produce hemoliză.

• Caractere biochimice: stafilococii au un metabolism glucidic atât respirator cât și fermentativ. Fermentează glucoza, manitolul, xiloza, lactoza, zaharoza etc. cu producere de acid. Capacitatea de acidifiere a mediului conținând manită este utilizată ca test de diferențiere între S. aureus (manită-pozitiv) și SCN (manită-negativ).

S. aureus este catalază-pozitiv (la fel ca și ceilalți stafilococi). De importanță egală taxonomică și recomandat drept al doilea test de confirmare a apartenenței la specia S. aureus este testul dezoxiribonucleazei termostabile. Se poate face și testul fosfatazei (poate fi pozitiv și la unele specii coagulază-negative).

• Caractere de patogenitate:

 Trebuie efectuat testul coagulazei; factorul care produce coagularea pe lamă poate fi prezent la circa 10% dintre tulpinile de S. intermedius.[20]

5. Antibiograma (testarea sensibilității la antibiotice și chimioterapice în vederea stabilirii tratamentului) este obligatorie și se realizează de obicei prin metode difuzimetrice. În cazul unor infecții grave trebuie să fie însoțită de alte determinări. Pentru a identifica tulpinile rezistente la meticilină (MRSA) se poate detecta prezența genei mecA (după amplificare genică, prin PCR).[]

 Identificarea unei tulpini de Staphylococcus aureus drept MRSA se face doar pe

baza următoarelor teste: zona de inhibiție în jurul discului de cefoxitină (30 mcg)

sub 22 mm și unul dintre următoarele criterii: CMI oxacilină ≥ 2 mg/L, prezența

PBP2a (latex aglutinare) sau prezența genei mecA (amplificare genică).

 Testarea sensibilității la antibiotice a unei tulpini de MRSA trebuie să includă

glicopeptide și antistafilococice de salvare, dar și alte antibiotice cu acțiune

antistafilococică.

 Nu este necesară și poate genera erori terapeutice majore testarea sensibilității

Staphylococcus aureus la oricare alte beta-lactamine în afara de cefoxitină,

oxacilină și eventual ceftarolină.

 Diagnosticul corect al unei infecții invazive cu MRSA trebuie să includă bilanțul

focarelor septice: valvulare, splenice, osteoarticulare[2]

1. Identificarea MRSA și testarea sensibilității sale la antibiotice

A. Prelevate :

• portaj : tampon nazal, faringian, cutanat, rectal, vaginal

In caz de exudat faringian – se recolteaza dimineata inainte sa manance si fara ca acesta sa se fi spalat pe dinti si fara sa recurga apa de gura. In cazul ca s-a intamplat, recoltarea se face dupa 4 ore. Se sta pe scaun , gatul in usoara extensie; recomandabil stam in lateral pentru a evita contaminarea cu picaturi al unui acces de tuse. Deprimam baza limbii cu apasator de limba steril si in conditii de iluminare adecvata examinam faringele posterior, pilierii, amigdalele pentru a sesiza care sunt zonele imflamate(rosii cu depozite, ulceratii si eventualele depozite purulente) ;utilizam 2 tampoane. Solicitam pacientului sa spuna ,,a,, si prin stergere recoltam secretia ;evitam atingerea bazei limbii sau a palatului moale.

Recoltarea tamponului nazal : se folosește tampon umectat cu ser fiziologic steril. Cu acelasi tampon se șterg ferm ambele cavități nazale anterioare.

Puroiul – Este recomandat ca pentru recoltare sa utilizam tampoane sterile, el poate fi recoltat cu ansa bactereologica, cu pipeta pasteur sau cand e vorba de colectii profunde prin punctie si aspirare. Atunci cand suspicionam infectia cu microorganisme anaerobe sunt necesare niste conditii speciale deoarece exista germeni anaerobi care sant inactivati in cateva secunde la contactul cu oxigenul.

In caz de sputa – inaintea prelevarii se recomanda periaj simplu al dintilor, clatirea energica a gurii si gargara cu apa sau ser.

Daca proba pare constituita in principal din saliva solicitam recoltarea din nou, stimularea expectoratiei prin ingalarea de aerosoli calzi cu solutie salina 3% ofera probe citologice nesatisfacatoare .

In cazul suspicionarii unei infectii fungice probele fluide se concentreaza prin centrigugare 20 min la 3000 rot/min apoi se examineaza sedimentul.

Fluidifierea (n-acetil cisteina) permite omoginizarea pp; pp recoltate se trimit la laborator cat mai curand preferabil in max 2 ore.

Produsele recoltate intr-un recoltor steril 50-200 ml cu capac care permite o inchidere etansa sunt etichetate si expediate imediat la laborator pentru a fi examinate.

Nu exista modalitati optime de conservare a sputei, mentinerea la 4 grade previne multiplicarea microorganismelor, conserva unii dintre germenii patogeni dar scade pana la anulare de izolare a altora(meningococul si hemofilius influenza).

Deasemenea utilizarea unui mediu de transport perturba raportul dintre bacterii si reperele citologice ale probei esentiale ptru aprecierea calitatii probei si interpretarii rezultatelor sputoculturii,.

Produsul patologic poate fi conservat maxim 4 ore.

B. Cultivare:

 Prelevate din situsuri normal sterile: inoculare pe geloză-sânge

Staphylococcus aureus – frecvent pigmentat, cu hemoliză completă

 Prelevate din situsuri cu floră endogenă: pe lângă geloză-sânge se

însămânțează pe agar hiperclorurat tip Chapman (Mannitol Salt Agar)

Staphylococcus aureus – colonii de culoare galbenă (creștere pe mediul

hiperclorurat, fermentarea manitei) NOTĂ: fermentarea manitei este doar

orientativă în diagnosticul speciei S. aureus și nu este suficientă pentru identificare;

diverse specii de stafilococi coagulazo-negativi pot fermenta manita!

C. Identificare:

Genul Staphylococcus

a. coci Gram pozitivi, cu dispoziție în ciorchine de struguri la frotiul colorat Gram din

cultura pe geloză-sânge sau alt mediu neselectiv

b. testul catalazei pozitiv

Specia Staphylococcus aureus

Este necesară pozitivarea a două dintre următoarele teste:

 evidențierea coagulazei (testul efectuat în tub)

 aglutinarea pe lamă

 detecția termonucleazei sau a nucleazei.

Aceste teste pot fi efectuate în diferite variante; este recomandat ca fiecare

laborator să utilizeze o metodologie de lucru reproductibilă și validată.

În situația extrem de rară a unor rezultate discordante, în interes epidemiologic, se

recomandă trimiterea tulpinii la un laborator de referință.

D. Testarea sensibilității la antibiotice

a. caracterul meticilinorezistent sau meticilinosensibil al unei tulpini de

Staphylococcus aureus se afirmă în funcție de diametrul zonei de inhibiție creată de

discul de cefoxitin (30 micrograme), conform EUCAST :

 MSSA dacă diametrul este de cel puțin 22 mm

 MRSA dacă este mai mic de 22 mm

b. există situații în care rezultatul obținut la testarea cu cefoxitin este verificat cu un

test suplimentar: zonă de inhibiție la cefoxitin de 21-23 mm și în cazul infecțiilor

invazive ; pentru aceste situații se consideră drept rezultat final cel al testului

suplimentar :

 determinarea CMI la oxacilină

 detecția prezenței PBP2a

 detecția prezenței mecA

c. alte testări utile pentru tulpinile MRSA: trimetoprim/sulfametoxazol (25 mcg),

eritromicină (15 mcg), clindamicină (2 mcg), rifampicină (5 mcg), levofloxacină (5

mcg), tetraciclină (30 mcg), doxiciclină (doar pentru tulpinile rezistente la

tetraciclină, obligatoriu prin determinare de CMI), gentamicină (10 mcg), linezolid

(10 mcg), nitrofurantoin (100 mcg) – doar pentru izolatele din urină, vancomicină

(obligatoriu determinarea de CMI); în cazul testării cu microcomprimate se folosesc

DOAR cele cu concentrațiile menționate.

d. Pentru macrolide și lincosamide se vor urmări inclusiv fenotipurile de rezistență

inductibile prin testul dublu disc (testul D): discurile de eritromicină și clindamicină

se plasează la distanță de 12-20 mm măsurat de la marginile discurilor. În cazul

aplatizării zonei de inhibiție din jurul discului de clindamicină (test D pozitiv)

clindamicina se raportează REZISTENT, chiar dacă diametrul zonei de inhibiție este în

intervalul de sensibilitate (alternativ: se comunică așa cum rezultă din citirea directă,

adică clindamicină – sensibil, dar se adaugă un comentariu: există riscul eșecului

terapeutic prin apariția rezistenței în timpul tratamentului de mai lungă durată cu

clindamicină)

Subliniem importanța efectuării în mod regulat a controlului de calitate al

antibiogramei, conform standardelor internaționale in vigoare (de ex: EUCAST,

CLSI)[2].

PARTEA PRACTICĂ

Identificarea speciei S. aureus s-a efectuat prin metode bacteriologice convenționale.

Meticilino-rezistența s-a testat difuzimetric conform recomandărilor CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute). Confirmarea meticilino-rezistenței s-a efectuat prin detectarea proteinei modificate ce leagă peniciline (PBP2a) utilizând un test de latexaglutinare.

S-a determinat difuzimetric sensibilitatea/rezistența tulpinilor MRSA față de următoarele antibiotice: trimetoprim/sulfametoxazol (25 mcg), eritromicină (15 mcg), clindamicină (2 mcg), levofloxacină (5 mcg), tetraciclină (30 mcg), gentamicină (10 mcg), linezolid (10 mcg).

Fenotipurile de rezistență MLSB (macrolide, lincosamide, streptogramine B) s-au determinat cu ajutorul testului D.

Pentru controlul de calitate s-au utilizat tulpinile: S. aureus ATCC 25923 (controlul antibiogramei difuzimetrice), S. aureus cu heterorezistență la meticilină ATCC 43300 (control pozitiv la detectarea PBP2a prin latexaglutinare).

Procedura

Executarea testului difuzimetric

Prepararea inoculului

Metoda directă pentru stafilococi : se repica cu tamponul de bumbac un număr de colonii izolate (3-5 pentru bacterii cu creștere rapidă) apoi se plasează în soluție salină fiziologică (alternativ bulion MH).

Detaliu tehnic 1. nu se va face niciodată repicarea coloniilor de pe medii selective

Detaliu tehnic 2. dacă tulpinile sunt păstrate în cultură înainte de testare ele trebuiesc cultivate cu 24 de ore înainte de testare; dacă tulpinile sunt stocate la congelator trebuie sub cultivate cel puțin o dată înainte de testare.

Standardizarea inoculului 0,5 McFarland

Dacă standardul este pregătit in laborator este necesară validarea prin metoda spectrofotometrică sau numărare a coloniilor dintr-o suspensie calibrată cu ajutorul standardului McFarland care se controlează dintr-o suspensie a unei tulpini de referință pentru controlul de calitate a testării sensibilității la antibiotice (de exemplu ATCC 25922).

Pentru prepararea și utilizarea standardului vezi protocolul privind prepararea și utilizarea standardului McFarland.

Detaliu tehnic 1. cultura se agită energic înainte de calibrare

Detalii tehnice 2. standardul de turbiditate se agită energică înainte de utilizare.

Inocularea plăcilor

Inoculul se însămânțează pe plăci cu mediul adecvat Mueller Hinton în cazul stafilococilor. Plăcile se duc la temperatura camerei și se usucă prin menținerea termostat cu capacul întredeschis timp de 10-30 de minute

Insămânțarea cu tamponul înmuiat în suspensie calibrată și apoi presat de pereții tubului pentru înlăturarea excesului de suspensie.

Insămânțarea se face în trei direcții prin rotirea plăcii cu câte 60 de grade.

După inoculare discurile se mențin 10-15 minute la temperatura camerei pentru uscare.

Detaliu tehnic1.Nu se întârzie însămânțarea cu peste 15 minute de la calibrarea suspensii se prepară maxim 5 suspensie odată.

Detaliu tehnic 2 .cultura se agită înainte de inoculare

Detaliu tehnice 3.testarea și verificarea tulpinii se poate face prin însămânțarea concomitentă a unui mediu adecvat pentru verificarea purității suspensiei și a caracterelor de cultivare.

FIGURA nr.9. Metoda de inoculare a placilor

Aplicarea discurilor

– se selectează antibioticele și încărcătura per vehicul disc conform standardului.

– se aduc discurile la temperatura camerei cu unu două ore înainte de aplicare pentru a evita condensul

-se verifică data de expirare și nu se folosesc discuri expirate

-numărul maxim de discuri 5 pe placă cu diametrul de 90 mm

– discurile se aplică cu pensa sau cu dispenserul apoi se presează pe suprafață agarului cu pensa Detaliu tehnic 1. discurile se aplică pe plăci cât mai repede posibil dar nu mai târziu de 15 minute după inoculare.

Detaliu tehnic 2 .dacă discul a căzut nu se schimbă poziția pentru că antibioticul a început deja să difuzeze.

Detaliu tehnic 3. discurile de antibiotice trebuie păstrate în containere închise ermetic cu desicator la frigider 4 8 grade Celsius. Betalactaminele și alte antibiotice cu labilitate mare (imipenem, cefaclor, combinații cu acid clavulanic) se păstrează congelate de preferință la minus 20 de grade Celsius iar discurile de lucru se pot păstra o săptămână la frigider. Dacă se utilizează un dispenser acesta trebuie păstrat în frigider bine închis și a adus ,de asemenea la temperatura camerei înainte de utilizare.

Incubarea plăcilor

Temperatura de incubare este de 35-37 grade Celsius.

Timpul de incubare este în mod normal de 16 -20 ore pentru bacteriile cu creștere rapidă cu unele excepții (stafilococie pentru Oxacilină).

Detaliu tehnic :plăcile se acoperă cu capac se răstoarnă și se introduc în termostat așezate cu capacul în partea inferioară. Se evita amplasarea supraetajata mai mult de două plăci.

Citirea și interpretarea

Citirea diametrului se face de preferință cu șublerul pentru evitarea eroii cei de paralaxa prin citirea cu linie gradată .

-se compară cu tabele în ultimul Standard document anual M100 NCCLS pentru testarea rezistenței la antibiotice prin metoda difuzimetrica

– situații speciale :zonă dublă și zonă cu margini fierăstrău se citește distanța între marginile interioare ale zonei de creștere

– colonii în aria de inhibiție se repetă testarea rezistenței și identificarea pe colonii dacă la a doua testare reapar colonii în aria de inhibiție se raportează colonii rezistente.

-la sulfmide și trimetoprim se face abstracție de val.

– detalii tehnice: testele efectuate efectuate pe un mediu cu adaos de sânge se citesc cu placa deschisă, în lumina reflectată; celelalte testări se citesc cu placa închisă, pe fond întunecat, în lumina reflectată; în lumina transmisă se citesc numai testele la Oxacilină la stafilococus aureus

Controlul de calitate

Mediul

Deoarece modul de preparare a mediului poate influența rezultatul, este foarte importantă respectarea instrucțiunilor de preparare și control de calitate al mediului. Se utilizează numai mediile indicate în standardul NCCLS pentru testarea sensibilității la antibiotice pentru fiecare agent bacterian testat.

Se respectă instrucțiunile producătorului pentru reluarea mediului pulbere în apă distilată și eventual adaosul de sânge sau alte componente. După autoclavare și răcire la 50 de grade Celsius mediul se toarnă în plăci de sticlă sau plastic cu o grosime uniformă de 4 mm. Agarul cu grosime mai mare de 4 mm poate da rezultate fals pozitive (rezistent în loc de sensibil) și cel cu grosime mai mică rezultate fals negative (sensibil în loc de rezistent) plăcile pot fi stocate la frigider în pungi de plastic dar nu sunt utilizate în cel mult 7 zile de la turnare.

Pentru fiecare loc de mediu se controlează următorii parametri:

controlul ph-ului se face cu pH-metrul și /sau prin evaluarea zonelor de inhibiție la aminoglicozide (scăderea pH-ului inactivează aminoglicozidele)

controlul calității nutritive și alte pH-ului mediului: stafilococus aureus ATCC 25 923 (pentru germeni Grampozitiv) Atenție: dacă valorile pH-ului mediului nu se încadrează între 7,2- 7,4 nu se recomandă ajustarea lui cu acid sau bază ci rebutarea si returnarea mediului către producător.

Standardul Mcfarland

Pentru efectuarea testării este necesar un standard de turbiditate Mcfarland de 0,5.

Acesta poate fi procurat din surse comerciale sau preparate in laborator, caz în care este necesară verificarea densității cu ajutorul unui spectrofotometru.

Discurile de antibiotic

Se utilizează numai discuri de antibiotice aprobate pentru utilizare și în limita termenul de garanție înscris de producător. Controlul încărcăturii discurilor se efectuează prin testarea tulpinilor de referință S. aureus 25 923 pentru Gram pozitivi.

Teste speciale

Testarea sensibilității la peniciline M a Stafiloccocus aureus rezistent la meticilină

Principiu

Rezistența S. aureus la meticilină (și în general la penicilinele M) este încrucișată cu toate betalactaminele, de aceea testarea sensibilității se face în mod sistematic pentru fiecare izolat clinic. Elementele esențiale care trebuie avute în vedere sunt

: concentrația în NaCl a mediului influențează expresia aceste rezistențe; unele tulpini (subpopulații) de MRSA exprima mai bine acest fenotip în mediul hypersalin

: oxacilina are o stabilitate mai mare decât meticilina și este preferată pentru testare

: din anul 2004 EUCAST recomandă testarea sensibilității la peniciline M utilizând un disc de cefoxitin cu 30mcg / disc pentru inocul 0,5 Mcfarland)

: cantitatea de bacterii inoculate este critică ;a se respecta întocmai procedura de preparare a inoculului.

Mediul

Pentru tehnica de screening, agar Mueller Hinton suplimentat cu clorură de sodiu și Oxacilină în concentrații de respectiv 4% și 6 mg pe litru plăcile se pregătesc extemporaneu și se usucă înainte de utilizare se utilizează și pot fi utilizate pentru testarea până la opt tulpini dintre care trei martori.

Pentru tehnica difuzimetrica cu cefoxitin 30mcg / disc, mediul MH fără adaosuri.

Inoculul

Se prepară pornind de la o cultură pură de 18 ore A tulpinii de S. aureus de testat realizând o suspensie cu turbiditate egală cu etalonul 0,5 Mcfarland.

Tulpinile de referință sunt testate în aceleași condiții S. aureus ATCC 25923 tulpina sensibila la oxacilina.

Inoculare

Se îmbibă tamponul steril cu suspensie bacteriană. Inocularea se face în spot pentru metoda de screening și pe intreaga placă pentru metoda difuzimetrica cu cefoxitin.

Incubare

La 35 de grade Celsius timp de 24 de ore.

Citire

Se valideaza tehnica, verificând tulpinile de referință

– S. aureus ATCC 25923 -absența creșterii (test screening )sau diametru corespunzător cuprins între 23 și 29 mm (vezi tehnica difuzimetrica).

In testul cu cefoxitin in 30 mcg/disc,diametrul de inhibiție mai mic sau egal de 19 mm indică rezistența la meticilină [20].

Figura nr.10. Protocol de testare a S.aureus [20]

Figura nr.11. S. Aureus ATCC 25923

Abrevierile inscrise pe discurile de antibiotic:

-SXT-Sulfametoxazol

-ERI-Eritromicina

-CIP-Ciprofloxacina

-CN-Gentamicina

-FOX-Cefoxitin

-PEN-Penicilina

Figura nr.12: Exemplu de placa cu tulpina MSSA (fenotip ’’salbatic’’)

Figura nr.13. Exemplu de placa cu tulpina MRSA (D-test pozitiv).

Figura nr.14. Exemplu de placa cu tulpina MRSA

Figura nr.15. Exemplu de placa cu tulpina MRSA.

Figura nr.16. Exemplu de placa cu tulpina MRSA.

Figura nr.17. Exemplu de placa cu tulpina MRSA.

Figura nr.18. Exemplu de placa cu tulpina MRSA.

Figura nr.19. Exemplu de placa cu tulpina MRSA.

Figura nr.21. Exemplu de placa cu tulpina MRSA.

Figura nr.22.Exemplu de placa cu tulpina MRSA.

Figura nr.23. Exemplu de placa cu tulpina MRSA.

Figura nr.24. Exemplu de placa cu tulpina MRSA.

Figura nr.25. Exemplu de placa cu tulpina MRSA.

Figura nr.26. Exemplu de placa cu tulpina MRSA.

Rezistența indusă la clindamicina este o mare problemă din punctul de vedere al folosirii clindamicinei pentru a trata infecțiile stafilococice. Rezistența indusă la clindamicină a fost detectată prin D- test iar rezultatul a fost următorul: ratele rezistenței indus în cadrul tulpinilor de MRSA a fost de 76.2% iar în cadrul MSSA a fost de 24% .

Rezistența indusă la clindamicină a fost semnificativ de mult crescută în cazul MRSA comparativ cu MSSA; majoritatea izolatelor de MRSA au fost susceptibile la clindamicina iar în ceea ce privește rezistența indusă la clindamicina a speciilor de stafilococi recomandăm ca D- testul să fie utilizat în mod obligatoriu pentru a evita interpretarea greșită a rezultatelor antibiogramei [21].

Figura nr.27. Detectia rezistentei induse la Clindamicina la tulpinile de S.aureus (D-test pozitiv).

Prezenta proteinei A

Proteina A se identifica printr-o reactie de latex-aglutinare, singura sau impreuna cu clumping factor.

Prin metoda latex –aglutinarii, se poate determina simultan:

a). Coagulaza legata sau „clumping factor”

b). Proteina A, cu afinitatea pentru fragmentul „cristalizabil” (Fc) al imunoglobulinelor de clasa IgG.

c) polizaharidele capsulare ale S.aureus.

Reactivul latex contine particule de latex de culoare rosie sensibilizate cu anticorpi monoclonali specifici anticapsulari, fibrinogen si IgG.

Metoda: 1-3 colonii de stafilococ (de pe mediul geloza sange, geloza simpla sau mediu hiperclorurat cu adaos de manitol) se emulsioneaza intr-o picatura de reactiv latex, int-un cerc de pe cardul de aglutinare. Se omogenizeaza prin miscari usoare de rotatie timp de 30 secunde.

Citirea si interpretarea: prezenta aglutinarii – reactie pozitiva. Agregatele de latex pot fi de diferite marimi, pe fondul unui mediu clar; absenta aglutinarii si aspect uniform-lactescent – reactie negativa.

Reactia se efectueaza intotdeauna cu martori: pozitiv si negativ, pentru a se putea valida rezultatul. Sensibilitatea testului este de 99.1% pentru S.aureus [22].

Figurile nr.28 si 29. Latex aglutinare

Infecții cu MRSA

Principii de diagnostic

• Ar trebui suspicionată implicarea MRSA la orice pacient cu infecție care a mai fost infectat cu acest tip de tulpină bacteriană

• Implicarea MRSA poate fi afirmată doar pe baza testelor de laborator

• Pentru orice infecție stafilococică trebuie încercat să se precizeze poarta de intrare și/sau focarul septic primar

• Dacă s-a evidențiat o bacteriemie cu MRSA, un bilanț al focarelor septice este important, în special evaluarea afectării endocardice

• În caz de endocardită stafilococică este obligatorie evaluarea existenței altor focare septice (de ex: abcese splenice, osoase)

Tratament

Controlul procesului infecțios produs de MRSA impune asocierea administrării de antibiotice cu drenajul colecțiilor septice/îndepărtarea materialului străin infectat (cooperare între specialitățile medicale și cele chirurgicale)

Măsuri terapeutice – altele decât tratamentul antibiotic

• corpii străini potențial contaminați (catetere venoase, proteze articulare sau valvulare) trebuie îndepărtați ori de câte ori este posibil

• drenajul colecțiilor este o componentă importantă a terapiei infecțiilor cu MRSA deoarece crește șansa evoluției favorabile și poate reduce semnificativ durata administrării de antibiotic

• corpii străini extrași sau secrețiile purulente drenate sunt trimise la laboratorul de microbiologie pentru identificarea agentului/agenților etiologic(i) și pentru testarea sensibilității lor la antibiotice

• controlul unor afecțiuni preexistente (de ex: diabetul zaharat) crește șansa evoluției favorabile

Tratamentul antibiotic

Principii generale

• antistafilococicele active împotriva MRSA se folosesc doar pentru tratamentul infecțiilor determinate de aceste tulpini de Staphylococcus aureus; pentru infecțiile determinate de Staphylococcus aureus sensibil la meticilină (MSSA), terapia antibiotică optimă este reprezentată de oxacilină sau de alte peniciline antistafilococice (dicloxacilină, nafcilină).

• pentru infecțiile severe tratamentul antibiotic inițial va fi administrat pe cale intravenoasă; în cazul evoluției favorabile se poate face trecerea la antibiotic de administrare orală

• în cazul terapiei inițiale a unui sindrom infecțios (înaintea identificării agentului etiologic) pot fi asociate și alte antibiotice active împotriva etiologiilor alternative (bacili Gram-negativi, anaerobi, fungi)

Antibiotice utilizate

Utilizarea rațională a antibioticelor în infecții probabil/cert determinate de MRSA ține cont de următoarele principii:

• în infecțiile severe este necesar un tratament inițial care să fie cert activ împotriva germenului implicat

• între mai multe soluții terapeutice active in vitro sunt preferate cele cu presiune de selecție a rezistenței bacteriene mai redusă și/sau care conservă activitatea unor antibiotice ”de salvare”

• apariția de tulpini MRSA rezistente la glicopeptide este încă extrem de rară.

În prezent, glicopeptidele reprezintă terapia inițială pentru infecții cu MRSA (evidențiat sau suspiciune majoră) înainte de obținerea datelor complete de sensibilitate la antibiotice a tulpinii implicate; odată obținute datele de sensibilitate in vitro în toate cazurile în care este posibil (în funcție de sindromul clinic) se înlocuiește glicopeptidul cu un antistafilococic din a doua grupă (cele ”clasice” sau ”mai vechi”).

Putem împărți antibioticele cu activitate anti-MRSA în următoarele trei grupe:

i) Tratament de primă intenție: glicopeptide

Glicopeptidele (vancomicina, teicoplanina) sunt antistafilococice de rezervă, cu eficiență confirmată de o experiență clinică bogată; ele sunt indicate pentru:

• infecții severe (probabil) cu MRSA (cu risc vital): mai ales vancomicina

• terapia adaptată rezultatelor determinărilor bacteriologice: în infecțiile cu MRSA sensibil la glicopeptide și eventual la unele antistafilococice ”de salvare” (infecții determinate de MRSA ”nosocomial”); în infecțiile severe dacă CMI la vancomicină depășește 1mg/l se alege un alt antibiotic

• dintre glicopeptide, cea mai studiată a fost vancomicina; de altfel ghidurile de tratament nord-americane includ doar vancomicina, situație ce este explicabilă având în vedere că doar aceasta este înregistrată în uz clinic în SUA

• totuși, experiența clinică acumulată în alte zone ale globului, în special în Europa, îndreptățește menținerea în practica clinică atât a vancomicinei, cât și a teicoplaninei întrucât pentru majoritatea infecțiilor eficiența pare a fi similară

• diferențele certe între cele două glicopeptide sunt:

– vancomicina este preferată în infecțiile severe datorită atingerii mult mai rapide a nivelului seric activ (nu necesită perioadă de tratament de încărcare)

– teicoplanina este de preferat în infecțiile care nu pun în pericol imediat viața pacientului și în care este necesar tratament de lungă durată

– teicoplanina este de preferat vancomicinei la pacienții cu funcție renală alterată

– vancomicina este singurul glicopeptid utilizat în infecțiile meningiene

• doze utilizate:

– vancomicina: 15-20 mg/kg (maxim 2g indiferent de greutatea pacientului) la fiecare 12 ore; în infecții extrem de severe poate fi administrată o doză inițială de 25mg/kg. Datorită riscului de sindrom ”de om roșu” se pot administra anterior antihistaminice, iar ritmul perfuziei de vancomicină va fi unul lent (minim 2 ore)

– teicoplanina: 10 mg/kg la 12 ore pentru primele 2-3 zile de tratament, apoi 10 mg/kg/zi pentru endocardite și infecții osteoarticulare, respectiv 6 mg/kg/zi pentru infecțiile de părți moi

• creșterea eficienței tratamentului cu glicopeptide (vancomicină, teicoplanină) poate fi realizată prin ajustarea dozelor la rezultatele dozării concentrației reziduale de antibiotic (vezi anexa 1)

ii) Antistafilococice utile împotriva MRSA care nu este multirezistent la antibiotice denumit uneori MRSA ”comunitar” (antistafilococice ”clasice”)

Pentru terapia adaptată rezultatelor testelor bacteriologice (”antibiogramei”), în infecțiile determinate de MRSA, se folosesc ori de câte ori sunt active antistafilococice precum: TMP/SMX, doxiciclină, clindamicină, fluorochinolone. Rifampicina este un antistafilococic util în infecțiile cu tulpini MRSA sensibile la aceasta, care se utilizează doar în asocieri de antibiotice, dacă există un corp străin contaminat care nu poate fi extras

Doze utilizate și efecte adverse mai frecvente:

• TMP/SMX:

480-720 mg iv la fiecare 8-12 ore în infecții severe

960 mg oral la fiecare 8-12 ore în infecții cu severitate medie-redusă

Risc de erupții, anemie/pancitopenie în tratamente de lungă durată

• Clindamicina:

0,6-1,2 g iv la fiecare 6 ore în infecții severe;

0,45 g la 6 ore oral

Antibiotic cu risc important de a induce infecție cu Clostridium difficile

• Rifampicina: 0.45- 0,6g la fiecare 12 ore

Toxicitate hepatică, inducția metabolizării altor medicamente administrate concomitent

• Doxiciclina: oral, 100 mg la fiecare 12 ore

• Levofloxacina: 750 mg/zi

• Moxifloxacina: 400 mg/zi

iii) Antistafilococice ”de salvare”

Aceste antibiotice sunt rezervate infecțiilor cu MRSA multirezistent (denumit uneori ”nosocomial”) în care:

• s-a înregistrat eșec terapeutic la glicopeptide,

• pacienții sunt intoleranți la glicopeptide

• s-a evidențiat (situație extrem de rară) un MRSA rezistent la glicopeptide;

Indicații specifice sunt prezentate în descrierea alternativelor terapeutice pentru fiecare sindrom.

• există diferențe notabile de efecte adverse și de farmacocinetica între aceste antistafilococice ”de salvare”, ceea ce influențează indicațiile lor:

– linezolidul se poate utiliza mai ales în infecții pulmonare și de părți moi și nu este recomandat în endocardite; risc de toxicitate hematologică și neurologică

– tigeciclina se utilizează în infecții de părți moi și infecții intraabdominale

– daptomicina se poate utiliza în infecții sistemice sau endocardite și nu este recomandată în pneumonii

– ceftarolina se utilizează în infecții de părți moi și pneumonii

• doze utilizate

– linezolid: 600 mg la 12 ore iv sau oral

– daptomicină: 6 mg/kgc într-o singură administrare zilnică

– tigeciclina: 100 mg în prima priză, apoi 50 mg la fiecare 12 ore

– ceftarolină: 600 mg la 12 ore i.v.

Tratamentul afecțiunilor determinate de MRSA

• Infecții de părți moi cu MRSA

– În infecțiile severe terapia inițială recurge la glicopeptide (alternativă: linezolid sau daptomicină); dacă tabloul clinic include purpura fulminans, sindrom de șoc toxic sau fasceită necrozantă prima opțiune este linezolidul asociat cu clindamicină

– Evoluția favorabilă și rezultatele testării bacteriologice pot justifica trecerea la doxiciclină, TMP/SMX sau clindamicină (mai ales dacă tulpina izolată nu are rezistență inductibilă la aceasta)

– În infecțiile cu supurație având severitate redusă sau medie prima opțiune este TMP/SMX (alternative: doxiciclina sau clindamicina)

– În infecțiile nesupurative de severitate medie sau redusă tratamentul de primă intenție este clindamicina (cauzate frecvent și de streptococi beta-hemolitici)

• Infecții osteoarticulare

– glicopeptid asociat cu rifampicină; după diminuarea sindromului inflamator se poate trece la terapie orală în funcție de sensibilitatea tulpinii izolate: rifampicină + clindamicină sau TMP/SMX ± rifampicină, în funcție de profilul de sensibilitate al tulpinii

– asocierea rifampicinei crește eficiența vancomicinei și clindamicinei

– excizia colecțiilor/zonelor de necroză contribuie la reducerea riscului de recidive în osteomielita cronică

– recidive pot apărea indiferent de tratamentul efectuat și de durata acestuia (pacientul trebuie informat în această privință)

Fluorochinolonele nu ar trebui utilzate datorită unei ponderi ridicate a eșecurilor clinice (selectare de rezistență în timpul tratamentului)

• Bacteriemii

– vancomicină; în caz de eșec sau recidivă: linezolid (daptomicină la doză de 10 mg/kg/zi) + rifampicină 0.45g la 12 ore (gentamicină 5mg/kg/zi)

– durata terapiei este de 14 zile dacă nu sunt focare septice osoase sau endocardice, nu există corpi străini infectați iar răspunsul terapeutic a fost rapid favorabil (afebrilitate persistentă după primele 3 zile de tratament)

• Endocardite

– valvă naturală: vancomicină (alternativ: daptomicină), minim 4 săptămâni

– proteză valvulară: vancomicină asociată cu rifampicină 300 mg la fiecare 8 ore, minim 6 săptămâni și cu gentamicină 1mg/kg/8 ore, 14 zile

– o proporție de 20-30% dintre pacienți necesită intervenții chirurgicale datorită afectărilor importante valvulare (de regulă înlocuirea valvei)

Ceftarolina ar putea reprezenta o alternativă eficientă în terapia endocarditei cu MRSA și a fost deja utilizată ca terapie de salvare în această indicație.

• Infecții de cateter venos central

– îndepărtarea cateterului venos ori de câte ori este posibilă

– terapie inițială cu vancomicină sau teicoplanină

– adaptarea terapiei în raport cu sensibilitatea tulpinii izolate la antibiotice

• Pneumonii

– pneumonii nosocomiale: linezolid sau vancomicină

– pneumonie necrotizantă si comunitară severă: linezolid 0,6 g la 12 ore iv asociat cu clindamicină 1,2g iv la 6 ore

– pneumonii comunitare de severitate medie-redusă, bronșită cronică acutizată: TMP/SMX; alternative: clindamicină, doxiciclină

O situație particulară de pneumonii comunitare severe CA-MRSA o reprezintă suprainfecția unei gripe, cel mai adesea la persoane tinere

• Infecții urinare cu MRSA

– În infecții joase necomplicate: nitrofurantoin, TMP/SMX

– În infecții severe: vancomicină (alternativă fiind daptomicina)

• Infecții de sistem nervos central, meningite

– în cazul infecției cateterului de drenaj ventricular, este necesară îndepărtarea acestuia; montarea unui nou șunt se va efectua doar după confirmarea dispariției MRSA din LCR (în mod repetat)

– în abcesele cerebrale, ori de cîte ori este posibil, se va efectua drenajul acestora (evaluare neurochirurgicală obligatorie)

– vancomicină ± rifampicină, pentru 14 zile în meningite sau până la regresia completă în abcesele cerebrale (alternativ: linezolid, TMP/SMX injectabile) [2].

REZULTATE

Din 52 de tulpini de S. aureus s-au identificat 21 tulpini MRSA(40.38%).

. FIGURA NR.30. Procentul tulpinilor MRSA din totalitatea izolatelor de Staphylococcus aureus

Procentul tulpinilor MRSA din totalitatea tulpinilor de S. aureus a fost diferit la secții

cu diferite profiluri (Figura 2).

S-a observat un procent ridicat al prevalentei tulpinilor de MRSA in cadrul sectiei de ATI.

Figura nr. 31. Procentul tulpinilor MRSA din totalitatea izolatelor de Staphylococcus aureus în funcție de profilul secțiilor

Figura nr.32. Distributia procentuala a tulpinilor de MRSA pe produse patologice

S-a observat o prevalenta mai mare a tulpinilor de MRSA in puroi, comparativ cu exudatele nazal si faringian si sputa; in acelasi timp se gaseste un procent considerabil in cazul fenomenului de portaj (este conform cu datele nationale si internationale).

Figura nr.33. Rezistenta (%) tulpinilor de MRSA

Din cele 21 de tulpini MRSA depistate:

– 5 (23.8%) au fost rezistente la levofloxacina,

-6 (28,57%) au fost rezistente la tetraciclina,

-3 (14.28%) au fost rezistente la sulfametoxazol/trimetoprim,

-21(100%) au fost rezistente la eritromicina si penicilina,

-17(80.95%) au fost rezistente la gentamicina,

-nici una nu a fost rezistenta la linezolid.

La tulpinile MSSA fenotipul dominant observat a fost cel sălbatic, cu sensibilitate la aminoglicozide.

Rezistenta la clindamicina a stafilococului auriu

Determinarea in vitro a rezistentei inductibile la clindamicina indica un procent mare de tulpini de stafilococ auriu cu rezistenta de tip iMLS în spitalul nostru de 76.2%, comparativ cu alte raportari: 94% la copii în Chicago sau 52% la adulti, în alt studiu din SUA [23] . Se justifica practicarea sistematica a D-testului pentru toate tulpinile de stafilococ auriu pe care le izolam, înainte de a raporta rezultatele clinicienilor.

Micsorarea distantei dintre discurile de clindamicina si eritromicina, de la 26 mm la 14 mm cât recomanda în prezent normele CLSI, ar putea duce la o crestere usoara a tulpinilor cu rezistenta de tip iMLS.

Clindamicina poate fi administratå în 24% dintre infectiile stafilococice din spital, si de aceea nu recomandam tratamentul empiric cu acest antibiotic în infectiile de plaga chirurgical si în ulcerele varicoase de unde au fost izolate majoritatea tulpinilor de stafilococ auriu cu rezistenta inductibila la clindamicina.

DISCUȚII

1.Meticilino-rezistența stafilococului auriu

Meticilino-rezistența s-a testat difuzimetric conform recomandărilor CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute). Confirmarea meticilino-rezistenței s-a efectuat prin detectarea proteinei modificate ce leagă peniciline (PBP2a) utilizând un test de latexaglutinare.

Motivele excluderii folosirii testării sensibilitatii S.aureus cu discuri de oxacilina:

Cauzele de eroare ale testarii sensibilitatii stafilococului auriu cu discuri de oxacilina pot fi urmatoarele:

• lipsa tulpinilor de referință;

• inocul posibil nestandardizat sistematic sau exact, în lipsa unui nefelometru.

Oricum, studiile interna¡ionale indica o sensibilitate scazuta a metodei difuzimetrice cu discuri de oxacilina de 1 μg, motiv pentru care din 2004 CLSI recomanda înlocuirea acestei testari cu testarea la cefoxitin ca fiind mai ușor de interpretat si având cea mai mare sensibilitate (100%), comparativ cu 97,6% pentru detecția PBP2a prin latex aglutinare sau 94% pentru metoda automatizată Vitek 2 si pentru oxacillin agar screen test [22].

Rezultă din cele de mai sus ca este necesară testarea sensibilității prin metoda difuzimetrică folosind discuri de cefoxitin si confirmarea meticilino- rezistenței prin reactia de latex aglutinare pentru PBP2a (metodă simplă, ieftină, cu rezultate obtinute rapid) sau, preferabil, prin detecția genei mecA prin PCR (metoda mai costisitoare).

La 2 ani de la introducerea meticilinei în terapie, în 1961 se descrie prima tulpină MRSA în Marea Britanie. Rezistența la streptomicină, tetraciclină, cloramfenicol și eritromicină este descrisă odată cu introducerea acestora în terapia infecțiilor produse de stafilococi rezistenți la penicilină. Rezistența multiplă la antibiotice înregistrează o prevalență crescută în anii 1950. În 1959 în Seattle sunt descrise peste 40% tulpini de spital rezistente la mai mult de patru antibiotice.

Apariția rezistenței la aminoglicozide apare după 10 ani de folosire excesivă, iar în 1976 este izolată prima tulpină MRSA cu rezistență asociată la gentamicină.Mecanismele prin care stafilococii dobândesc rezistență la β-lactamine sunt: sinteza de penicilinaze și modificarea țintei de acțiune a β-lactaminelor. Fenotipul asociat penicilinazelor este penicilină-rezistent -meticilină-sensibil și conferă rezistență la penicilinele cu spectru îngust, iar cel legat de modificarea țintei: penicilină-rezistent – meticilină-rezistent – determină rezistență încrucișată la toate β-lactaminele, fiind frecvent asociat cu rezistență la alte grupe de antibiotice [24].

Procentul de MRSA observat în studiul nostru-40.38% se încadrează în procentul 25-60% din raportul de supraveghere al rezistenței la antibiotice european EARS-Net pe anul 2015 pentru România.

Rezistența la aminoglicozide este primordial enzimatică, prin acțiunea enzimelor ce modifică aminoglicozidele.

La tetracicline au fost descrise două mecanisme de rezistență: prin eflux activ (achiziția genelor tetK, tetL) și rezistență cromozomială (codificată de genele tetM, tetO).

Stafilococii dobândesc rezistența la quinolone prin două mecanisme: mutații punctiforme la nivelul genelor cromozomiale ce codifică topoizomerazele și prin intermediul unor pompe de eflux mediate de proteina de transport norA.[25] Optarea pentru terapia cu fluoroquinolone este recomandată să se facă conform antibiogramei.

2. Rezistența la clindamicina a stafilococului auriu

Determinarea in vitro a rezistenței inductibile la clindamicina indică un procent mare de tulpini de stafilococ auriu cu rezistența de tip iMLS în spitalul nostru de 76.2%.

Se justifica practicarea sistematică a D-testului pentru toate tulpinile de stafilococ auriu care se izolează, înainte de a raporta rezultatele clinicienilor.

3.Importanța metodelor de prevenție a contaminării cu S.aureus

În România mai mult de 50% dintre tulpinile de Staphylococcus aureus izolate din hemoculturi sunt meticilinorezistente (53,8% conform raportului EARS-Net pentru anul 2012), iar această pondere este în creștere în ultimii ani. În fața acestei situații și în lipsa unui ghid național privind infecțiile cu MRSA, Subcomisia pentru Limitarea Rezistenței bacteriene, o echipă multidisciplinară (clinicieni, bacteriologi, epidemiologi, farmacisti), a decis să elaboreze un material, pe baza evaluării datelor din literatura de specialitate și a propriei experiențe în domeniu. Vom ilustra un îndrumar în privința diagnosticului, prevenirii și a tratamentului infecțiilor determinate de MRSA, prin a cărui utilizare să se poată obține o reducere a incidenței și a severității acestor infecții, cu limitarea impactului negativ asupra stării de sănătate a populației și asupra costurilor suportate de sistemul medical.

Obiective

 creșterea calității diagnosticului de laborator al infecțiilor stafilococice, prin confirmarea cu acuratețe a caracterului MR al tulpinilor identificate și testarea corectă a sensibilității la antibiotice relevante din punct de vedere clinic

 creșterea gradului de siguranță a pacientului prin prevenirea infecțiilor cu MRSA, fiind evidențiate măsurile a căror eficiență a fost dovedită în practica medicală

 creșterea calității utilizării antibioticelor în tratamentul infecțiilor determinate de MRSA, în special a alegerii lor corecte, componentă a programelor de bună practică a terapiei antibiotice

 creșterea nivelului de conștientizare al riscului de infecții determinate de MRSA și a importanței măsurilor de prevenire și control ale acestora, atât pentru publicul larg, cât și pentru personalul medical

Limitarea apariției de noi cazuri de infecție cu MRSA

Limitarea extinderii focarelor de infecție determinate de MRSA se poate realiza doar printr-o abordare complexă, care să includă testarea pacienților, gruparea celor infectați/colonizați cu MRSA, respectarea precauțiunilor standard și specifice, buna practică a terapiei antibiotice, evitarea suprasolicitării personalului medical. Se observă că eficiența unui program de limitare a numărului de pacienți cu infecții determinate de MRSA depinde de participarea tuturor membrilor personalului medical și auxiliar și în nici un caz doar de eforturile SPCIN. Măsurile cu eficiență demonstrată sunt:

 evitarea supraaglomerării spitalului și a deficitului de personal medical

 construcția de spitale noi doar cu saloane cu un singur pat, toaletă și cabină de duș proprii

 educarea personalului medical – la angajare și apoi anual – privind necesitatea igienei mâinilor și a utilizării echipamentului de protecție

-asigurarea capacității laboratorului de a identifica cât mai corect și rapid prezența MRSA în probele analizate și de a comunica rapid acest rezultat

 gruparea pacienților cu MRSA și asigurarea de personal dedicat DOAR pentru îngrijirea lor

 gruparea pacienților cu risc MRSA și a celor cu leziuni cutanate ulcerative sau exfoliative până la elucidarea prezenței/absenței MRSA

 pentru spitalele cu endemie de MRSA se recomandă constituirea unei secții speciale în interiorul spitalului, unde să fie grupați pacienții infectați/colonizați

 personal suficient în secțiile în care există un risc sporit pentru pacienți de a dezvolta infecții stafilococice: terapie intensivă, ortopedie, chirurgie cardiovasculară, transplant

 dezinfecție de tip terminal în sala de operații după o intervenție chirurgicală la un pacient infectat/colonizat cu MRSA; pacientul operat va fi trezit într-un spațiu special desemnat, cu respectarea precauțiilor de contact spălarea mâinilor înainte și după fiecare contact cu pacientul și cu obiectele sale; purtarea echipamentului de protecție de către personalul medical și vizitatori în salonul pacientului colonizat/infectat cu MRSA

 informarea pacienților privind necesitatea spălării corecte a mâinilor[]utilizarea în salonul cu pacienți infectați-colonizați cu MRSA a unor stetoscope, injectomate, tensiometre special dedicate care vor fi dezinfectate cu substanțe biocide corespunzătoare

 evitarea introducerii de obiecte refolosibile în salonul pacientului infectat sau colonizat cu MRSA (de ex: documente medicale)

 curățenia zilnică a saloanelor cu pacienți cu MRSA urmată de dezinfecție cu substanțe biocide adecvate și după externare de dezinfecție terminală

 tratarea deșeurilor drept materiale cu potențial infecțios și respectarea procedurilor stipulate pentru această situație

 Buna practică a terapiei antibiotice

– eliminarea utilizării excesive de antibiotice mai ales a celor cu spectru larg

– profilaxie perioperatorie care să recurgă la cefalosporine de generația 1 (scăderea utilizării de cefalosporine de generația a 3-a, ciprofloxacină)  Prevenirea infecției postoperatorii cu MRSA la pacientul colonizat prin utilizarea vancomicinei ca profilaxie antibiotică perioperatorie dacă:

– pacientul este colonizat cu MRSA și nu a putut fi efectuată decontaminare

– există un risc major ca pacientul să fie contaminat și nu s-a putut efectua testare preoperator (intervenție de urgență).[2]

CONCLUZII

1. La tulpinile de S. aureus izolate, fenotipul cel mai frecvent observat a fost meticilinosensibil, la tulpinile MSSA fenotipul dominant observat a fost cel sălbatic, cu sensibilitate la aminoglicozide.

2. Tulpinile MRSA identificate și testate au dovedit o rezistență asociată crescută la macrolide, lincosamide si aminoglicozide.

3. Chiar dacă clindamicina are activitate antistafilococică crescută, procentul ridicat de rezistență observat la tulpinile testate limitează utilitatea clindamicinei în tratamentul anumitor infecții determinate de S. aureus.

4. Aminoglicozidele trebuie utilizate în terapie combinată deoarece folosirea lor ca unic agent antimicrobian predispune la apariția rezistenței.

5. Trimetoprim-sulfametoxazolul, a cărei eficiență clinică nu este pe deplin dovedită, poate constitui o opțiune terapeutică în cazul tulpinilor de S. aureus multirezistente, ținând cont de sensibilitatea ridicată la testarea in vitro.

6. Deși literatura de specialitate citează apariția unor tulpini rezistente la linezolid, toate tulpinile testate s-au dovedit sensibile la acest antibiotic.

7.MRSA este endemic în Spitalul Judetean Prahova și se impune intensificarea eforturilor de control al infecțiilor pentru a stopa răspândirea acestui germen.

BIBLIOGRAFIE

[1]Popa G.L., Popa M.I., Streinu-Cercel A., Streinu-Cercel O., Genul Staphylococcus, în Popa M.I. (coord.), Microbiologie Medicală, vol 1 – curs UMF „Carol Davila”, 2010.

[2] Popescu G., Szekely E., Codiță I.,Tălăpan D., Șerban R., Ruj G. Diagnosticul, profilaxia și tratamentul infecțiilor determinate de Staphylococcus aureus meticilinorezistent (MRSA). [online]. [2016]. [citat la data de 2.02.2019].URL https://cnscbt.ro/index.php/ghiduri-si-protocoale/519-diagnosticul-profilaxia-si-tratamentul-infectiilor-determinate-de-staphylococcus-aureus-meticilinorezistent-mrsa/file .

[3] Ionescu R., Idomir M., Grigorescu D. Aspecte ale rezistentei stafilococului auriu la antibiotice, intr-un spital universitar multidisciplinar. [ serial online]. [2007].[ citat la data de 2.02.2019]. Revista Română de boli infecțioase – Vol. X, Nr. 3, an 2007. URL: https://rjid.com.ro/articles/2007.3/Infectio_Nr-3_2007_Art-01.pdf

[4] Popescu G., Șerban R., Pistol A. Consumul de antibiotice, rezistența microbiană și infecții nosocomiale în România. [online]. [2014]. [citat la data de 2.02.2019]. URL:https://cnscbt.ro/index.php/analiza-date-supraveghere/infectii-nosocomiale-1/524-consumul-de-antibiotice-rezistenta-microbiana-si-infectii-nosocomiale-in-romania-2014/file

[5] Popescu G.,Șerban R, Niculcea A. Consumul de antibiotice, Rezistența microbiană și Infecții Nosocomiale în România.(online). (2015). (citat la data de 3.02.2019) URL: https://cnscbt.ro/index.php/analiza-date-supraveghere/infectii-nosocomiale-1/684-consumul-de-antibiotice-rezistenta-microbiana-si-infectii-nosocomiale-in-romania-2015/file

[6] Panlilio A, Culver D, Gaynes R, et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in U.S. hospitals, 1975–1991. Infect Control Hosp Epidemiol 1992;13:582–586.

[7] Pantosti A. , Venditti M. What is MRSA? European Respiratory Journal 2009 34: 1190-1196 DOI: 10.1183/09031936.00007709 URL: https://erj.ersjournals.com/content/34/5/1190 (accesat la data de 05.01.2019)

[8]National Nosocomial Infections Surveillance System. National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report, data summary from January 1992 through June 2004, issued October 2004. Am J Infect Control 2004;32:470–485.

[9]Rubinstein E, Kollef MH, Nathwani D. Pneumonia caused by methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Clin Infect Dis 2008;46: Suppl. 5 S378–S385.

[10]European Antimicrobial Resistance Surveillance System. EARSS Annual Report 2007. URL:www.rivm.nl/earss/Images/EARSS%202007_FINAL_tcm61-55933.pdf.

[11] Hassoun A. , Linden P. , Friedman B. Incidence, prevalence, and management of MRSA bacteremia across patient populations—a review of recent developments in MRSA management and treatment Critical Care2017 21:211 URL: https://doi.org/10.1186/s13054-017-1801-3 (accesat la 25.01.2019).

[12]Faria NA, Carrico JA, Oliveira DC, et al. Analysis of typing methods for epidemiological surveillance of both methicillin-resistant and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus strains. J Clin Microbiol 2008;46:136–144.

[13]Chung M, de Lencastre H, Matthews P, et al. Molecular typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by pulsed-field gel electrophoresis: comparison of results obtained in a multilaboratory effort using identical protocols and MRSA strains. Microb Drug Resist 2000;6:189–198.

[14]Shopsin B, Gomez M, Montgomery SO, et al. Evaluation of protein A gene polymorphic region DNA sequencing for typing of Staphylococcus aureus strains. J Clin Microbiol 1999;37:3556–3563.

[15]Palavecino EL. Rapid methods for detection of MRSA in clinical specimens. Methods Mol Biol. 2014;1085:71–83.URL: https://link.springer.com/protocol/10.1007%2F978-1-62703-664-1_3 (accesat la 25.01.2019).

[16]Nonhoff C, Roisin S, Hallin M, Denis O. Evaluation of Clearview Exact PBP2a, a new immunochromatographic assay, for detection of low-level methicillin-resistant Staphylococcus aureus (LL-MRSA). J Clin Microbiol. 2012;50:3359–60.

[17]van Meensel B, Frans J, Laffut W, Van Kerkhoven D, Lemmens A, Van Schaeren J, et al. Multicenter validation of the Clearview Exact PBP2a test. In: 21st European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Milan, Italy; 2011.

[18]Dhiman N, Trienski TL, DiPersio LP, DiPersio JR. Evaluation of the BinaxNOW Staphylococcus aureus test for rapid identification of Gram-positive cocci from VersaTREK blood culture bottles. J Clin Microbiol. 2013;51:2939–42.

[19] Codiță I. Ghid național pentru aplicarea procedurii de testare a sensibilitații la antibiotice conform standardului CLSI/NCCLS ,Versiunea I-2006, Ed.Univ. „Carol Davila„ Bucuresti,2007; p.5-9.

[20] Codiță I. Ghid național pentru aplicarea procedurii de testare a sensibilitații la antibiotice conform standardului CLSI/NCCLS ,Versiunea I-2006, Ed.Univ. „Carol Davila„ Bucuresti,2007; Anexa 1, p.21-24.

[21]Tenover FG, Hindler JF, Rosner E. Antimicrobial Susceptibility Testing: A self-study program. CDC; 2002.

[22] Felten A, Bernadette G, Lagrange PH – Evaluation of three techniques for detection of low-level methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA): a disk diffusion method with

cefoxitin and moxalactam, the Vitek 2 system, and the MRSA screen latex agglutination test. J Clin Microbiol 2002; 40: 2766-2771

[23] Templer SJ, Brito MO. Bacterial Skin and Soft Tissue Infections 2009 Available fromURL:http://www.turnerwhite.com/memberfile.php?PubCode=hp_mar09_bacterial.pd.

[24] Emaneini M, Taherikalani M, Estampour MA, et al. Phenotypic and Genotypic Evaluation of Aminoglycoside Resistance in Clinical Isolates of Staphylococci in Teheran, Iran. Microb Drug Resist. 2009;15(2):129-132

[25] Schmitz FZ, Fluit AC, Gondolf M, et al. The prevalence of aminoglycoside resistance and corresponding resistance genes in clinical isolates of staphylococci from 19 European hospitals. J Antimicrob Chemother. 1999;3:253-259.