STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII ÎN DOMENIUL TEMEI [630473]

1
Cuprins

2
CAPITOLUL I
STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII ÎN DOMENIUL TEMEI
ABORDATE
Introducere
1.1 Particularități botanice
Genul Citrus se cultivă la nivel mondial în peste 100 de țări, generând recolte rentabile
din punct de vedere economic, însă totodată constituind o importantă surs ă de nutrienți pentru
alimentația umană (Barlass și colab. , 1986 ).
Speciile din genul Citrus sunt originare din Asia (Fao 2001) și sunt reprezentate de arbori sau
arbuști de talie mică, sempervirescenți, adesea acoperi ți cu spini. P lantele degajă uleiuri
eterice, și pot fi folosite în scopuri medi cinale (Gaurav și colab., 2012 ).
Plantele cultivate din acest gen fac parte din familia Rutaceae.
Fructul acestor plante este denumit generic “ hesperidă ” ( fruct baciform, m ultisperm,
cu epicarpul gros, moale, prevăzut cu glande secretoare de uleiuri eterice, mezocarpul este
subțire, spongios, iar endoc arpul este cărnos și comestibil ). Cea mai mare pondere ca și
suprafață cult ivată (circa 80%) la niv el mondial este reprezenta tă de : Citrus sinensis
(portocalul ), Citrus reticulata (mandarinul ) , Citrus x aurantium (portocalul amar). Alte
specii cu o importanță majoră sunt reprezentate de: Citrus aurantiifolia (limetierul ), Citrus
limon (lămâiul) și Citrus maxima (pomelo) (Faost at 2010 ).
O specie cu o importanță deosebită, ce va fi abordată în lucrarea de față este
reprezentată de către Poncirus trifoliata (portocal ul cu trei frunze ), originar din China și
Coreea de N (World health Organiz ation Regional Office for the Western P acific , 1998 ).
Se dezvoltă ca și arbust de dimensiuni mari sau ca și arbore de tal ie mică, până la 1 -5 m
înălțime ( depinde în mare măsură de cultivar ), fiind specia cu cel mai apropiat grad de
înrudire cu speciile de citrice, însă cu unul dintre cel e mai lente ritmuri de creștere .
Specia este neobișnuită printre citrice pentru că prezintă frunze căzătoare asemănător
foioaselor, frunze compuse și fructe pubescente (pufoase).
Ramurile sunt verzi, aplatizate, crestate când sunt tinere, acoperite de spini c u bază
plată și foarte ascuțiți .
Ramurile sunt adesea contorsionate, rămân verzi mai mulți ani, inclusiv în sezonul rece
(fig. 1.1)

3

Figura 1.1 Detaliu ramuri Poncirus trifoliata
Sursă foto: http://www.lubera.co.uk
Frunzișul este dispus în spir ală, se dezvolta din muguri latenți pe ramuri din anul
precedent, cu internodii scurte, fiecare având între 1 și 5 frunze.
Frunza este trifoliată , foliola centrală fiind de aceeași dimensiune sau puțin mai lungă decât
celelalte două , cu ma rginea fin crenat ă sau întreagă .

Figura 1.2 Detaliu frunze Poncirus trifoliata
Sursă foto: http://www.homecitrusgrowers.co.uk
Specia este hermafrodită, în interiorul florii existând atât organe de reproducere
mascule câte și organe de reproducere femel e, poleniza rea fiind entomofilă .
Planta este de aemenea autofertilă , nefiind n evoie de polenizare încrucișată .
Un hibrid între această plantă și portocal, numit "Citrange", este deosebit de rezistent în sud –
vestul Angliei, unde are fructe mai dulci.
Florile sunt al be, mari (3.5-8 cm ), dispuse solitar sau în pereche, cal iciul fiind format
din 5 -7 lobi . Petalele sunt în număr de 4, 5 sau 6, obovate, prezintă în jur de 20 de stamine de

4
culoare roz c u filamente de diferite lungimi (fig. 1.3) . Ovarul este format din 6-8 loje
seminale, prezintă peri, iar ovulele în număr de 4 -8 sunt dispuse pe două rânduri în fiecare
lojă.
Florile sunt foarte parfumate, apar primăvara în aprilie, prezentând carac teristică de înflorire
protantă . (fig.1.4)

Figura 1.3 Detaliu floa re Poncirus trifoliata
Sursă foto: http://www.homecitrusgrowers.co.uk

Figura 1.4 Caracteristica de înflorire protantă
Sursă foto: http://www.homecitrusgrowers.co.uk

Fructul este de culoare galben închis, d e forma globuloasa sau piriformă , cu lăț imea de
la 3 la 4,5 cm și înălțimea de la 3.5 la 6 cm .
Prezintă brazde adânci sub formă de inele sau în cazuri rare este neted (fig.1.5).

5

Figura 1.5 Fruct de Poncirus trifoliata
Sursă foto: http://www.homecitrusgrowers.co.uk

În fruct sunt in jur de 20-50 semințe, aproximativ ovoidale , de 0.9 -1.2 cm, cu unul sau
mai mulți embrioni. (fig. 1.6).

Figura 1.6 Distribuția semințelor in fructul de Poncirus trifoliata
Sursă foto: http://www.homecitrusgrowers.co.uk
Tegumentu l seminal este neted sau cu cres te fine inobservabile . Maturarea semințelor
(maturitatea fiziologică ) are loc în toamnă , din septembrie până în noiembrie , însă semințele
vor fi capabile să germineze după minim 4 să ptămâni de stratificare la frig ( Zhang Dian xiang
și colab. , 2008 ).

Figura 1.7 Semințe Poncirus trifoliata
Sursă foto: http://www.homecitrusgrowers.co.uk

6
1.2 Exigențe ecologice
Tolerează înghețul și zăpada ( -15 până la -25 șC), fiind o specie care pe viitor s -ar
putea utiliza ca plantă ornamentală în parcuri și grădini, însă prezintă și anumite proprietăți ce
o fac utilă pentru industria farmaceutică dar și alimentară .
Poncius trifoliata este foarte rezistent la afecțiunile și putregaiurile Phytophthora
cauzate de ciupercă Phytophthora citrophthora , a nematod ului citricelor Tylenchulus
semipenetrans și este imun la virusul Citrus tristeza ( Zhang Dianxiang și colab. , 2008 ).
Este o plantă ușor de întreținut ce crește în orice tip de sol , de preferat bine drenat,
însă prefera un sol ușor și fertil, într -o poziție însorită (Huxley și colab , 1992 ) .
Ca și dezavantaje de luat în seamă, Poncirus trifoliata nu agreează solurile cu pH
ridicat dar nici solurile foarte acide, sensibil la salinitatea ridicată, sensibil la solurile cu
conținut ridicat de calcar a ctiv și e ste sensibil la secetă (Chatzissavvidis și colab., 2014 ).
Plantele nu suportă lucrarea solului în apropierea rădăcinilor, și trebuiesc mulcite
pentru a preveni apariția buruienilor (Davis , 1990 ).
După unii autori, sunt necesare toamne călduroase pentru că această spec ie să
fructifice corespunzător, iar pentru a se obține semințe fertile sunt neces are veri de asemenea
călduroase (Thomas , 1992 ).
1.3 Importanță
Fructul, din păcate, este necorespunzător pentru consum în stare proaspătă, brut, deși
se poate folosi în conserve .
Fructul are gust acru și amar, foarte astringent, însă se pretează pentru prepar area
jeleurilor și a marmeladei (Simmons, 1972) .
Compoziție chimică :
Fructele de poncirus conțin ulei esențial (de culoare galben deschis), și cantități mici
de zaharuri.
Semințele conțin o can titate mare de ulei gras, pieliț a este bogată în vitaminele P și C.
De asemenea, uleiurile esențiale sunt prezente în tulpinile și frunzele plantei.
Poate fi folosit și pentru preapararea unei băuturi revigorante, foarte bogată în
vitamina C, însă fructul proaspăt are un randament foarte scăzut în suc și trebuie păstrat
pentru circa 2 săptămâni pentru a ave a un randament de 20 % la stors ( Usher , 1974) .
Coaja fructelor poate fi folosită ca și condiment, iar frunzele tin ere pot fi adăugate în
diferite mâncăruri ( Facciola, 1990 ) .

7
Spinii sunt folosiți în tratarea durerilor dentare iar scoarța lăstarilor tineri este folosită
pentru tratarea răcelilor ( Duke și colab., 1985 ) .
Fructul conține un număr important de constitu enți activi cum ar fi : substanțe
flavonoide, cumarina, monoterpene, și alcaloizi ( Wo rld Health Organisation 1998 ) .
De asemenea, mai conțin:
– Acid galacturonic;
– Vitaminele A, B, C;
– Limonen, ca ndinen;
– Cumar ină
– Flavonoide;
– Pectine.
Beneficii asu pra organismului uman :
Imunitate : Utilizarea fructelor ajută la întărirea sistemului imunitar, saturând
organismul cu acid ascorbic și folic. Ca urmare, riscurile de apariție a ră celilor sunt reduse
semnificativ .
Dantură : Datorită acizilor și uleiurilor conținute în fructe, respirația va fi proaspătă,
microflora din gură va fi restaurată, ceea ce împiedică apariția cariilor. În plus, sucul de
Poncirus ajută la albirea dinților.
Piele : Sucul de Poncirus întinerește, regenerează și calmează pielea și totoda tă previne
și vindecă acneea .
Stomac : Consumul de fructe vă va ajuta să scăpați de arsuri la stomac, care apare
adesea în cazul creșterii acidității. Alimentele vor fi digerate mai repede și toate "deșeurile" se
vor dizolva.
Sânge : ajută la purificarea sân gelui de toxine, îmbunătățește circulația sângelui prin
vene și capilare. În plus, fructul crește nivelul de hemoglobină.
Inimă : Fructul are un conținut caloric scăzut însă prezintă un conținut mare în fibre
care ajuta la curățarea intestinului, iar acest lucru împiedică dezvoltarea obezității, care, în
cele mai multe cazuri, duce la apariția bolilor cardiovasculare.
Intestine : Deoarece compoziția să conține fibre dietetice și o cantitate mare de apă,
excreția de substanțe nocive este accelerată, ceea ce vă permite să faceți față rapid constipației
sau diareei.
Somn : Poncirusul este bogat în vitamine din grupa B, care sunt necesare pentru un
somn sănătos.

8
Presiunea arterială : Consumul regulat de fructe în doze moderate vă permite să
normalizați presiunea art erială, să scăpați de atacurile de migrenă și de amețeală.
Previne îmbătrânirea prematură : Ajută la eliminarea colesterolului din organism și
accelerează regenerarea celulelor. Ca urmare, procesele de îmbătrânire sunt încetinite și
ridurile sunt netezite.
Oase : conține o cantitate mare de calciu, astfel încât articulațiile și oasele vor fi
întotdeauna sănătoase.
Fructele necoapte sunt antidiareice, antiemetice, antispastice, tonice pentru sistemul
digestiv, diuretice și laxative ( Yeung , 1985) .
O altă întreb uințare a acestei specii este folosirea sa ca și portaltoi pentru alte specii
din genul Citrus (portocal, lămâi, mandarin e.t.c ) cărora le con feră o rezistență la frig cu 3°C
mai mare (Tanaka , 1976) .
Planta prezintă spini și poate fi folosită ca și barier ă, însă nu are o densitate foarte
mare ( Shepherd , 1974 ).
1.4 Înmulțirea
Înmulțirea convențională se realizază prin semin țe, altoire și mai rar prin buta și.
Dezavantajele înmulțirii convenționale:
– Mare consumatoare de timp;
– Dependentă de sezon;
– Disponibilitatea materialului genetic;
– Existenta bolilor și dăunătorilor care degenerează materialul genetic;
– Existenta anumitor specii de citrice fără semințe .
Ca urmare a apărut necesitatea unei metode de înmulțire rapidă și în masă a noilor
hibrizi, sau ai celor existenți, cu scopul de a obține în mod industrial plante sănătoase,
uniforme din punct de vedere genetic dar și fenologic, libere de virusuri, boli și bacterioze.
Din această necesitate au apărut sistemele de înmulțire industri ală a citricelo r,
cunoscute sub numele de înmultire in vitro . Aceste sisteme au o rată foarte mare de
multiplicare, cu o creștere exponențială a numărului de plante, scurtând drastic timpul de
obține re de noi plante. Este un ti p de înmulțire vegetativă, deci asexuata, in divizii nou obținuți
purtând numele generic de “clone “, uniforme din punct de vedere genetic și fenotipic.
Înmulțirea in vitro se realizează în condiții sterile, controlate artificial, în recipiente
din sticlă sau material plastic închise etanș , pe med ii nutritive artificiale care conțin apă și toți
nutrienții necesari creșterii plantei.

9
Acest tip de înmulțire are trei etape principale: inițierea culturii in vitro, faza în care
fragmente de plante din câmp, sere, solarii denumite generic explante sunt sterilizate și
introduse in vitro , apoi urmează multiplicarea (faza în care se fac cicluri succesive de culturi
pentru a obține numărul dorit de plante) și în final aclimatizarea când plantele se scot din
condiții controlate ( in vitro ) și are loc adapta rea lor la condițiile inițiale din s ere și câmp
( in vivo) .
Această metodă de înmulțire poate fi de asemenea utilizată la inducerea de variații
genetice prin transformări la nivel de gene sau prin mutageneză.
Regenerarea plantelor se va realiza dintr -un număr redus de celule, formațiuni
denumite ex plante, fiind realizată pe baza fenomenului de totipoten ță celulară, conform căreia
în genomul unei celule se regăsește întreaga informa ție genetică pentru regenerarea între gului
organism din care provine (Peti cilă, 2015).
Când vine vorba de specii de citrice, cele mai bune rezultate referitor la proliferare
rapidă, se obțin în mod normal utilizând ca și expl ant formațiuni juvenile, însă ca și
dezavantaj, plantele obținute vor necesita un timp îndelungat până v or intra în producție.
Utilizarea unui explant dintr -o plantă matură nu se realizează în mod curent din cauza
gradului mare de contaminare ( Drew 1988 ), reducerea sau încetarea morfogenezei
( Bonga 1982 ) sau a imposibilității de înrădăcinare ( George 199 3 ).
Ca urmare s -au dezvoltat foarte puține protocoale de micropropagare la citrice, astfel:
– Altman și Goren ( 1974 ) au regenerat lăstari din muguri laterali proveniți de la o plantă
mătură de Citrus sinensis ;
– Barlass și Skene ( 1982 ) au regenerat p lantule din segmente uninodale provenite din plante
mature de Citrus reshni ( mandarin Cleopatra ), și de asemenea din portocalul dulce Citrus
sinensis ;
– Embriocultura realizată recent de către Pérez -Tornero și Porras 2008 .

10
Înmulțirea in vitro a lămâiului ( Citrus limon ) folosind segmente uninodale
(O. Pérez -Tornero, C.I. Tallón, I. Porras, 2009)

Materialul de studiu a fost pr elevat de la plante mature în vâ rstă de 15 ani din
următoarele cultivaruri de lămâi: "Fino 46 ", "Fino 49", "Fino 77 ", "E ureka", "Lisbon" și
"Messina". Plantele mature au fost cultivate în incinta institutului de cercetare și dezvoltare
agricolă (IMIDA) din Alberca de las Torres (regiunea Murcia) Spania.
Explan tele au fost prelevate primavera, din lăstari tineri. Frunzele în curs de formare
au fost îndepărtate, apo i cu atenție s -au tăiat fragmente uninodale (1 cm lungime), fiecare
fragm ent conținând un singur mugure. Segmentele uninodale astfel obținute au fost supuse
protocolului de dezinfecție:
– Clătire cu apă și detergent (Mistol®, Henkel Iberica S.A) timp de 5 minute ;
– Etanol 70 % timp de 5 minute în agitatorul magnetic ;
– Soluție Domestos ® 20 % (0. 8 % NaClO) timp de 20 de minute;
– Clătire finală cu apă distilată sterilă ;
Mediul de cultură folosit pentru inoculare și s tabilizare a fost MS (Murashige și Skoog
1962) suplimentat cu:
– 1 mg/L 6 -benziladenină (BA) ;
– 30 g/L zaharoză ;
– 6 g/l agar ;
pH-ul a fost stabilizat cu soluție de NaO H 1N la valoarea de 5.7, apoi mediul de
cultură a fost distribuit în recipiente de 15 mL.
Cultura de segmente uninodale a fost menținută pentru stabilizare și proliferare la
temperatura de 25±1 °C, cele mai bune rezul tate fiind date de cultivarele: " Fino 46 " și
" fino 77 ".

11
Înmulțirea in vitro a lămâiului folo sind seminț e germinate in vitro
(Shawkat Ali, Bushra Mirza Islamabad, Pakistan 2006 )
Materialul genetic a fost reprezentat de semințe de lămâi (Citrus jambhiri Lush.)
stratificate la temperatura de 4 șC și au avut o facultate germinativă de 75 -80 %. Proce sul de
germinare a început după 10 zile, în timp ce viabilitatea semințelor rămase la stratificat a
scăzut în timp, iar după 2 luni nici o sămânță nu a mai fost capabilă să germineze. Majoritatea
semințelor au produs mai mult de o plantulă.
Protocolul de d ezinfecție utilizat:
– Soluție hipoclorit de sodiu (NaClO) 0.5 % timp de 10 minute împreună cu soluție de Tween –
20 (0.1 %) cu îndepărtarea tegumentului seminal, sau soluție hipoclorit de sodiu (NaClO) 1
%, împreună cu soluție de Tween -20 ® (0.1 %) timp de 20 de minute dacă nu s -a efectuat
îndepărtarea tegumentului seminal ;
– Clătire cu apă distilată sterilă de 3 ori sub hota cu flux laminar ;
De asemenea, semințele după îndepărtarea tegumentului seminal și cele 3 clătiri au
fost s terilizate în clorură mercur ică (HgCl2 0.1 %) timp de 5 minute, fiind de asemenea
necesare cel puțin 3 clătiri, însă un timp mai îndelungat.
Mediul de cultură folosit pentru inoculare a fost MS (Murashige și Skoog 1962)
suplimentat cu:
– 5 % zaharoza ;
– 0.8 % agar pentru solidificare .
pH-ul a fost stabilizat cu soluție de NaO H 1N la valoarea de 5.7, apoi mediul de
cultură a fost distribuit în recipiente de 25 mL.
Semințele au fost inoculate sub hota cu flux laminar, și au fost supuse p rotocolului de
germinare astfel :
– 2 săptămâni în absența luminii la temperatura constantă de 27 șC ;
– 3 săptămâni la o temperatură constantă de 25 șC cu o fotoperioada de 16 h de iluminare și cu
o umiditate relativă de 60 % (Pena și colab. 1995) .
Formațiunile regenerate (radiculele nou formate, lăstarii , cotiledoanele, frunzele) au
fost excizate după 5 săptămâni de la germina re și au fost folosite pentru: i nducerea de calus,
inocularea de segmente uninodale și înrădăcinarea noilor lăstari.
Scopul acestor cercetări este acela de a îmbogăți baza de cunoșt ințe despre înmulțirea
in vitro a unor specii de Citrus utilizându -se explante din plante mature, observarea cerințelor
pentru proliferarea celulelor și ulterior a cerințelor pentru înrădăcinarea și aclimatizarea noilor
plante.

12
Țesuturile obținute in vitr o pot fi folosite ca și sursă de germoplasmă (fiind obținute
într-un mediu aseptic fiind liber de virusu ri și cu o omogenitate ridicată ) sau pentru a fi
folosite în inducerea mutațiilor.
Înmulțirea in vitro a plantelor sau micropropagarea are toate șanse le să devină
tehnologia viitorului întrucât conduce la obținerea unui număr uriaș de plante sănătoase, care
cresc mult mai repede.
Cercetari in vitro realizate in Romania:
În România, această tehnică este implementată și perfecționata permanent de către
specialiștii centrlor de cercetare din București, Cluj, ICDP Mărăcineni, cât și în cadrul
universităților de profil unde studiul se face pe specii diferite, de la arbuști fructiferi la flori
sau legume.
Materialul produs in vitro poate fi conservat prin dif erite metode și folosit în
momentul în care este nevoie și se realizează importante economii de teren, spațiu, energie și
combustibil și poate fi transportat și distribuit cu ușurință atât în țara cât și peste hotare.
Culturile in vitro sunt modul cel mai ușor, ieftin și eficient de a stoca, manipula și
transportă materialul vegetal.
Cercetă rile privind înumulțirea in vitro la specia Poncirus trifoliata în Romania sunt
inexistente.

13
CAPITOLUL I I
CONTRIBU ȚII PROPRII
2.1 Justificarea temei
Poncirus trifoliata este o specie relativ nou introdusă în țara noastră. Deși se poate
înmulți convențional prin altoire, uneori prin butași, sau semințe, plantele obținute nu prezintă
uniformitate genetică, iar semințele își pierd capacitatea germinativă după apr oximativ două
luni de păstrare (Shawkat, 2006) .
Drept urmare a fost necesară introducerea unei noi metode de înmulțire (veg etativă),
în speță înmulțirea in vitro, prin care se pot obține în tr-un ritm rapid plante întregi și sănătoase
(libere de boli, viru suri și dăunători).
Totodată se pot înmulți rapid și fidel genetic rezultatele lucrărilor de ameliorare
scurtând timpul de omologare a noilor specii, existând și posibilitatea s elecției elitelor încă
din faza in vitro, urmărindu -se atent existența genelor urmărite de către ameliorator prin
analize genetice de laborator ( clonele homozigote obținute prin înmulțirea in vitro vor putea
fi folosite în cadrul proceselor de ameliorare la obțirea de hibrizi F1).
În prezent nu există suficiente experiențe la aceast ă specie, drept urmare sunt foarte
puține protocoale de înmulțire studiate, existând necesitatea stabilizării lor.
Lucrarea de fata își propune îmbogățirea cunoștiințelor în domeniul abordat, generând
rezultate concludente pentru viitoare experiențe, cât ș i optimizarea proceselor de dezinfecție,
inoculare cât și găsirea mediului de cultură ideal, pentru o eficiență tehnologică și economică
ridicată.
Tehnica in vitro de manipulare a materialului biologic poate fi folosită ca și modalitate
de conservare a germoplasmei în băncile de gene .
2.2 Obiectivele cercetarilor
Obiectivul general al cercetării îl reprezintă perfecționarea teh nicilor cunoscute, de
înmulțire ( in vitro) și adaptarea protocoalelor existente la genotipurile din sortimentul
internațional și na țional. Aceste metode sunt destul de puțin folosite de către instituțiile de
cercetare din țară, sau sunt folosite dar fără rezultate eficiente comparativ cu progresele
realizate în acest domeniu de către instituții de cercetare internaționale.

14
Obiecti vele lucrării de cercetare sunt următoarele:
– Studiul comparativ între speciile de citrice analizate și răspunsul lor la această metodă de
înmulțire (folosind ca și explante segmente uninodale cât și semințe);
– Stabilirea unui protocol eficient de dezinf ecție cât și optimizarea acestuia din punct de
vedere tehnologic cât și economic;
– Stabilirea mediului de cultură adecvat fiecărei specii;
– Observarea explantelor inoculate cât și evoluția acestora ulterioară în condiții climatice
controlate;
– Obținerea de rezultate concludente în sprijinul unor lucrări de cercetare viitoare;
– Îmbogățirea bazei materiale a c ercetărilor în domeniul abordat.
2.3 Material si metodă
2.3.1 Amplasarea experienței
Experiența a avut loc în Municipiul Buc urești, B-dul Mărăști, N r. 59, Se ctor 1, în
laboratorul de microînmulț ire din Centrul de Cercetare pentru Studiul Calității Produselor
Agroalimentare aflat în cadrul Universității de Științe Agronomice și Medicină Veterinară din
Bucuresti (U.S.A.M.V.) .
Centrul de Cercetare pentru Studiul Calității Produselor Agroalimentare a fost
cofinanțat prin Fondul European de Dezvoltare Regională și va desfășura activități în
domeniul cercetării și studiului calității produselor agroalimentare, fiind compus dintr -o
clădire cu laboratoare și o seră modernă de cercetare a plantelor.

Figura 2.1 Camera climatică a Centrului de Cercetare pentru Studiul Calității
Produselor Agroalimentare

15
Proiectul a fost demarat pentru a crea o infrastructură de cercetare modernă prin
construcția și dota rea la standarde europene a clădirii Centrului de cercetare pentru studiul
calității produselor agroalimentare și a unei sere de cercetare ultramoderne.
Centrul de Cercetare pentru Studiul Calității Produselor Agroalimentare va permite
abordarea de noi tem atici în domeniul agriculturii și industriei agroalimentare, care să
stimuleze dezvoltarea ofertei de servicii de cercetare rapide, performante și de calitate către
unitățile economice interesate, sporind astfel atractivitatea instituției pentru realizarea de
parteneriate strategice.
2.3.2 Pregătirea materialului vegetal
Pregă tire material vegetal ( segmente uninodale ):
Segmentele uninodale au fost obținute din lăstari proveniți de la plante mature a căror
stare fitosanitară nu s -a putut determ ina exact. P lantele au fost men ținute at ât în câmp, c ât si
în sera de ce rcetare. Din cauza faptului că în compartimentul serei unde se reg ăseau speciile
de citrice mai existau si alte plante, starea fitosanitar ă nu s-a putut determina , însă p lantele nu
prezentau semn e vizib ile de boli și dăunători. Menționez faptul că nu am efectuat tratamente
fitosanitare.
S-au îndepărtat frunzele, pețiolul acestora cât și porțiunile nelignificate ale lăstarilor
apoi s -au tăiat cu ajutorul bisturiului segmente de 1 -1.5 cm lungime, fi ecare segment având un
singur mugure . (fig. 2.2)

Figura 2.2 Realizarea segmentelor uninodale

16
Explantele astfel obținute au fost menținute în apă distilată iar apoi au fost supuse
imediat protocolului de dezinfecție și inoculare. După protocol ul de dezinfecție, înainte de
inoculare , s-a efectuat obligatoriu împrospătarea tăieturilor atât la baza segmentelor c ât și la
vârful acestora .
Pregatire material vegetal ( semin țe):
În cadrul experienței s -au utilizat fructe de Poncirus trifoliata, și Citrus limon cu
proveniență diferită : Poncirus trifoliata a fost adus din Republica Populara China, iar Citrus
limon a fost adus din Grecia, din tr-o cultura bio, conform (fig. 2.3 și 2.4).

Figura 2.3 Extragerea semințelor Poncirus trifoliat a

17

Figura 2.4 Extragerea semințelor Citrus limon
Fructele de citrice au fost secționate ecuatorial cu bisturiul, apoi cu ajutorul unei
pensete s -au extras semințele din interior. Spre deosebire de segmentele uninodale, semințele
au fost stratificat e la frigider, în apă distilată . Tegumentul seminal a fost îndepărtat doar
înaintea începerii protocoalelor de dezinfecție și inoculare. Pentru această operație, semineț ele
s-au șters foarte bine cu hârtie absorbantă pentru a îndepărta apa ș i eventualele resturi de
pulpă apoi cu ajutorul unui bisturiu s -a îndepărtat cu atenție tegumentul evitându -se în
permanență rănirea embrionulu l.

18
Detaliu semin țe Poncirus trifoliata cu tegumentul seminal îndepărtat (fig.2.5).

Figura 2.5
2.3.3 Testarea protocoalelor de sterilizare
Aspsizarea materialului vegetal e ste considerată una dintre primele etape referitor la
înmulțirea in vitro și reprezintă o condiție esențială pentru reușita acestei metode de înmulțire.
Procesul de sterilizare se va realiza doar cu agenți chimici, iar reusita protocolului va depinde
de o serie de factori cum ar fi: specia, vârsta plantei, fenofază, condițiile ecologice in care s -a
dezvoltat organul prelevat și poziția sa în plantă.
Criteriile de care se ține seama în vederea sterilizării corecte sunt diverse și de multe
ori caracteristice speciei sau cultivarului folosit, dar ca regulă generală, se vor alege corect
substanțele pentru sterilizare, concentrația acestora, precum si durata de timp alocată
sterilizării (Pe ticilă, 2015).
Privind protocolul de dezinfecție s -au încercat 8 variante (5 pentru segmente uninodale
și respective 3 pentru semin țe) în câte 3 repetiții fiecare, inoculate pe mediul de cultura MS –
(Murashige și Skoog 1962) .
Plantele inoculate în cadrul fi ecărei repetiții au fost în număr de 5, iar incularile au fost
efectuate la interval de 2 -3 zile. Rezultatele obținut e vor fi prezentate într -un tab el sintetic la
sfârșitul descrierii fiecărui protocol în parte.
Principalii dezinfectanți sunt reprezentați de: alcool etilic (70%, 90% sau absolut), apa
bromate (puțin folosită), clorura mercurică (deosebit de toxică) și hipocloritul de sodium (apa
de Javel), hipocloritul de calciu, peroxidul de hydrogen , nitratul de argint și antibiotic e
(Peticilă, 2015).

19

Tabelul 2.1
Nivelul de asepsizare d upă Yeoman și Macleod (1977)
Agentul sterilizant Concentrația uzuală
% Timpul (minute) Nivelul de
asepsizare
Hipoclorit de calciu 9-10 5-30 Foarte bună
Hipoclorit de sodiu 2 (20% sol.
comercială) 5-30 Foarte bună
Peroxid de hidrogen 10-12 5-15 Bună
Apă bromat ă 1-2 2-10 Foarte bună
Nitrat de argint 1 5-30 Bună
Clorură mercurică 0.1-1 2-10 Satisfăcătoare
Antibiotice 4-50 mg/L 30-60 Destul de bună

Indiferent de tipul de agent dezinfectant folosit, el trebuie sa îndeplineasca o serie de
calități care să îi confere capacitate de sterilizare a explantului. Trebuie sa aiba acțiune
suficient de puternică pentru a putea distruge agenții patogenide suprafață și/sau de interior,
prin nivelul lor de toxicitate sa nu distrugă țesuturile provocând necroze și moartea
explantului. Totodată agentul dezinfectant trebuie sa se poată îndepărta ușor fara să creeze
problem e de suprahidratare sau distrugerea țesuturilor. Cu toate acestea, sterilizarea
explantului este un proce s ce se petrece la suprafață, motiv pentru care, în condițiile în care
materialul vegetal supus înmulțirii in vitro are țesuturile profund infectate, pot să apară
infecții târzii, chiar după 2 sau 3 repasări, cu bacterii, fungi, micoplasme, care se regăsesc în
țesuturile plantei (Peticilă, 2015).

20
Testare protocol dezinfec ție Citrus Sp. 18.01.2017 (segmente uninodale )

Figura 2.6 Etape protocol dezinfec ție Citrus Sp.
Tabelul 2. 2
Testare protocol dezinfec ție Citrus Sp . 18.01.2016 (segmen te uninodale )
Nr.crt Substanța Timpul
1 Fungicid (Flint® 4 g/ 1.5 L) 5 minute
2 Clătire apă distilată sterilă 2 x 5 x 5 minute
3 Domestos® (peroxid de hidrogen) 30 % 3 minute
4 Clătire apă distilată sterilă 3 x 7 x 5 x 5 minute
5 Clătire apa distilat ă sterilă + acid ascorbic 2.5 g/L 7 minute
6 Domestos® (hpoclorit de sodiu NaClO) 30 % 3 minute
7 Clătire apă distilată sterilă 3 x 7 x 5 x 5 minute

Nr.crt Repetiția Probe infectate Probe neinfectate Eficiență
1 R1 1 4 80%
2 R2 2 3 60 %
3 R3 0 5 100 %
Eficiență medie 80 %
Durată protocol (minute) 62

21
Testare protocol dezinfec ție Citrus Sp. 10.02 .2017 (segmente uninodale )

Figura 2.7 Etape protocol dezinfec ție Citrus Sp.
Tabelul 2. 3
Testare protocol dezinfec ție Citrus Sp. 10.03.2017 (segmente uninodale )
Nr.crt Substanța Timpul
1 Fungicid ( Flint® 4 g/ L) 10 minute
2 Clătire apă distilată sterilă 2 x 5 x 5 minute
3 Domestos ® (hpoclorit de sodiu NaClO ) 30 % 10 minute
4 Clătire apă distilată sterilă + acid ascorbic 2.5 g/L 3 x 7 x 5 x 5 minute

Nr.crt Repetiția Probe infectate Probe neinfectate Eficie nță
1 R1 2 3 60%
2 R2 1 4 80 %
3 R3 1 4 80 %
Eficiență medie 73.33 %
Durată protocol (minute) 47

22
Testare protocol dezinfec ție Citrus Sp. 12.04.2017 (segmente uninodale )

Figura 2.8 Etape protocol dezinfec ție Citrus Sp.

Tabelul 2. 4
Testare protocol dezinfec ție Citrus Sp. 13.10.2017 ( segmente u ninodale )
Nr.crt Substanța Timpul
1 Fungicid (Flint® 4 g/ L ) 5 minute
2 Clătire apă distilată sterilă 2 x 5 x 5 minute
3 Domestos ® ( hpoclorit de sodiu NaClO ) 30 % 3 minute
4 Clătire apă distilată sterilă 3 x 7 x 5 x 5 minute

Nr.crt Repetiția Probe infectate Probe neinfectate Eficiență
1 R1 0 5 100%
2 R2 1 4 80 %
3 R3 0 5 100 %
Eficiență medie 93.33 %
Durată protocol (minut e) 35

23
Testare protocol dezinfec ție Citrus Sp. 21.04.2017 (segmente uninodale )

Figura 2.9 Etape protocol dezinfec ție Citrus Sp.
Tabelul 2. 5
Testare protocol dezinfec ție Citrus Sp. 02.02.2018 (segmente uninodale )
Nr.crt Substanța Timpul
1 Fung icid ( Flint® 4 g/ L ) 10 minute
2 Clătire apă distilată sterilă 2 x 5 x 5 minute
3 Domestos ® ( hpoclorit de sodiu NaClO) 2 0 % 10 minute
4 Clătire apă distilată sterilă 3 x 7 x 5 x 5 minute

Nr.crt Repetiția Probe infectate Probe neinfectate Eficienta
1 R1 1 4 80%
2 R2 0 5 100 %
3 R3 0 5 100 %
Eficiență medie 93.33 %
Durată protocol (minute) 47

24
Testare protocol dezinfec ție plantula Poncirus trifoliata obținută din semin țe 02.03.2018
(segmente uninodale )

Figura 2.10 Plantulă Poncirus trifoliata
Tabelul 2. 6
Testare protocol dezinfec ție plantulă Poncirus trifoliata obținută din semin țe 02.03.2018
(segmente uninodale )
Nr.crt Substanța Timpul
1 Fungicid (Flint® 4 g/ L ) 10 minute
2 Clătire apă distilată sterilă 2 x 5 x 5 minute
3 Domestos ® ( hpoclorit de sodiu NaClO) 1 0 % 10 minute
4 Clătire apă distilată sterila 3 x 7 x 5 x 5 minute

Nr.crt Repetiția Probe infectate Probe neinfectate Eficiență
1 R1 1 4 80%
2 R2 2 3 60 %
3 R3 0 5 100 %
Eficie nță medie 80 %
Durată protocol (minute) 47

25
Testare protocol dezinfec ție Semin țe Poncirus trifoliata 23.01.2018

Figura 2.11 Etape protocol dezinfec ție Semin țe Poncirus trifoliata
Tabelul 2. 7
Testare protocol dezinfec ție Semin țe Poncirus trifoliata 23.01.2018
Nr.crt Subs tanța Timpul
1 Stratificare in apă rece ( la frigider ) 4 zile
2 Etanol 70 % 1.5 minute
3 Clătire apă distilată sterilă 2 x 5 x 5 minute
4 Domestos ® (hpoclorit de sodiu NaClO) 2 0 % 10 minute
5 Clătire apă distilată sterilă + acid ascorbic 2.5 g/L 3 x 5 x 5 x 5 minute

Nr.crt Repetiția Probe infectate Probe neinfectate Eficiență
1 R1 1 4 80%
2 R2 2 3 60 %
3 R3 0 5 100 %
Eficiență medie 80 %
Durată protocol (minute) 36,5

26
Testare protocol dezinfec ție Seminte Citrus Sp. 23.01.2018

Figura 2.12 Etape protocol dezinfec ție Seminte Citrus Sp

Tabelul 2. 8
Testare protocol dezinfec ție Seminte Citrus Sp. 23.01.2018

Nr.crt Substanța Timpul
1 Stratificare in apa rece (la frigider ) 4 zile
1 Etanol 80 % 1.5 minute
2 Clătire apă distilată st erilă 2 x 5 x 5 minute
3 Domestos ® (hpoclorit de sodiu NaClO) 2 0 % 10 minute
4 Clătire apă distil ată sterilă 3 x 5 x 5 x 5 minute

Nr.crt Repetiția Probe infectate Probe neinfectate Eficiență
1 R1 1 4 80%
2 R2 0 5 100 %
3 R3 0 5 100 %
Eficiență med ie 93.33 %
Durată protocol 36.5
minute

27
Testare protocol dezinfecț ie Semin țe Poncirus trifoliata si Citrus Sp. 12.04.2018

Figura 2.13 Etape protocol dezinfecție Semin țe Poncirus trifoliata si Citrus Sp.

Tabelul 2. 9
Testare protocol dezinfec ție Semin țe Poncirus trifoliata și Citrus Sp. 12.04.2018
Nr.crt Substanța Timpul
1 Stratificare în apă rece (la frigider ) 48 h
2 Domestos ® ( hpoclorit de sodiu NaClO) 1 00 % 10 minute
3 Clătire apă distilată sterilă 3 x 5 x 5 x 5 minute

Nr.crt Repetiț ia Probe infectate Probe neinfectate Eficiență
1 R1 4 1 20%
2 R2 3 2 40 %
3 R3 4 1 20 %
Eficiență medie 26.66 %
Durată protocol (minute) 25

28
Tabelul 2. 10
Sintetizare rezultate protocoale dezinfecție segmente uninodale
(Poncirus trifoliata și Citrus Sp.)

29

Tabelul 2.1 1
Sintetizare rezultate protocoale dezinfecție semințe (Poncirus trifoliata și Citrus Sp.)

30
2.3.4 Prepararea mediilor de cultură
Mediul de cultură reprezintă suportul fizic cât și chimic, necesar pentru creșterea și
dezvoltare a explantelor in vitro. Datorită unor cercetări minuțioase efectuate de -a lungul
timpului, mai mulți cercetători au formulat diferite rețete de medii de cultură, ce au fost
folosite și optimizate pentru fiecare specie vegetală supusă acestui procedeu de în mulțire.
Condiții pe care trebuie să le îndeplinească un mediu de cultură adecvat:
– Să corespundă cerințelor nutritive și hormonale ale specie cultivate pentru faza în care
se găsește specia respectivă (stabilizare, proliferare, calogeneza, înrădăcinare, et c.);
– Să asigure condiții optime de creștere și dezvoltare în ceea ce privește presiunea
osmotică, pH -ul, umiditatea, etc ;
– Să fie echilibrat din punct de vedere ionic;
– Să nu conțină ioni sau substanțe toxice;
– Să fie ușor de preparat și de reprodus;
– Să fie s tabil după autoclavare (să își mențină neschimbată compoziția și caracteristicile
fizico -chimice);
– Să fie ieftin de produs și să conțină cât mai puțini constituenți naturali, costisitori și
nemomogeni;
Mediile folosite la cultura in vitro au în general o s tructură complexă, fiind alcătuite
dintr -un număr mare de constituenți de natură diversă și cu rol diferit. Acești constituenți pot
fi grupați în:
– Constituenți cu rol nutritiv: elemente minerale (macro și microelemente) și elemente
organice (zaharuri, amin oacizi și vitamine);
– Constituenți cu rol hormonal fitoregulator al creșterii și dezvoltării explantelor in vitro
(auxine, citochinine, gibereline și alte substanțe cu rol stimulator sau inhibitor: acid
abscisic, etilena, colchicina, etc. );
– Constituenți cu rol de st abilizare a mediului de cultură (apă, agenți de solidificare,
stabilizatori osmotici și de pH, antioxidanți și substanțe absorbante )
(Anastasia Crucicovskii , 2013).

31
Prezentarea schemelor de prepararea a mediilor de cultură
Privind compoziția m ediului de cultură, în cadrul l ucrării de fată s -au încercat 5
varia nte de mediu în câte 3 repetiții f iecare. Plantele inoculate în cadrul fiecărei repetiții au
fost în număr de 10.
Rezultatele fiecarei variante de medi u vor fi prezentate intr -un tab el analitic l a sfârșitul
prezentă rii acestora .
Sterilizarea mediilor de cultură s -a realizat in autoclav la temperatura de 120 °C si
presiunea de 1.1 atm.
Mediul de cultura MS – (Murashige și Skoog 1962 )
(Schema de preparare pentru 1 litru )
Tabelul 2.1 2
Schema de preparare a mediului de cultura MS ( -)
Nr.
crt Susbtanț a Concentraț ie Cantitate
1 MACRO MS 10 x 100 mL
2 MICRO MS 1000 x 1 mL
3 Chelat de fier 200 x 5 mL
4 Vitamine MS 100 x 10 mL
5 Inozitol 100 x 10 mL
6 Zaharoză – 25 g
7 Aagr – 7 g
Ph-ul mediu lui= 5.8
(corectat cu NaOH 1 N )

32
Tabelul 2.1 3
Sche ma de preparare a soluției stoc de macroelemente ( MACRO MS )
Nr.crt Substanț a Formula Chimică Cantitate (mg/L)
1 Azotat de Amoniu NH4NO3 1650
2 Azotat de Potasiu KNO3 1950
3 Sulfat de Magneziu MgSO4 370
4 Fosfat de Potasiu KH2PO4 170
5 Clorură de Calciu CaCl2 440

Tabe lul 2.1 4
Sche ma de preparare a soluț iei stoc de microelemente (MICRO MS )
Nr.crt Substanț a Formula chimică Cantitate (mg/L)
1 Iodură de Potasiu KI 0.83
2 Acid Boric H3BO3 6.2
3 Sulfat de Mangan MnSO4 16
4 Sulfat de Zinc ZnSO4 8.6
5 Molibdat de Sodiu Na2MoO4 0.25
6 Sulfat de Cupru CuSO4 0.025
7 Clorură de Cobalt CoCl2 0.025

Tabelul 2.1 5
Schema de preparare a soluției stoc de vitamine
Nr.crt Substanța Formula chimică Cantit ate
(mg/L)
1 Acid nicotinic C6H5NO2 0.5
2 Glicină C2H5NO2 2
3 Piridoxină HCl C8H11NO3 0.5
4 Tiamină HCl C12H17N4OS+ 0.5

33
Mediul de cultură MS (+ ) modificat pentru Saint paulia
(Schema de preparare pentru 1 litru )
Tabelul 2.1 6
Schema de preparare a mediului de cultură MS (+ ) modificat

Nr.
crt Susbtanț a Concentraț ie Cantitate
1 MACRO MS 10 x 100 mL
2 MICRO MS 100 x 1 mL
3 Chelat de fier 200 x 5 mL
4 Vitamine MS 100 x 10 mL
5 Inozitol 100 x 10 mL
6 BA – 0,1 mg/L
7 IBA – 0,1 mg/L
8 Zaharoză – 30 g/L
9 Agar – 7 g/L
Ph-ul mediului= 5,9
( corectat cu NaOH 1 N )

Mediul de cultură B5 (-) Gamborg (Gamborg și colab. 1968)
(Schema de preparare pentru 1 litru )
Tabelul 2.1 7
Schema de preparare a mediului de cultură B5 (-) Gamborg
Nr.
crt Susbtanț a Concentraț ie Cantitate
1 Macro B5 10 x 100 mL
2 Micro B5 1000 x 1 mL
3 Chelat de fier 200 x 5 mL
4 Vitamine B5 100 x 10 mL
5 Inozitol 100 x 10 mL
Ph-ul mediului= 5,8
( corectat cu NaOH 1 N )

34
Tabelul 2.1 8
Sche ma de preparare a solutiei stoc de m acroelemente (MACRO B5 )
Nr.crt Substanț a Formula Chimică Cantitate (mg/L)
1 Azotat de Potasiu KNO3 2500
2 Sulfat de Magneziu MgSO4 250
3 Sulfat de Amoniu (NH4)2SO4 134
4 Fosfat de Sodiu NaH2PO4 150
5 Clorură de Calciu CaCl2 150

Tabelul 2.1 9
Sche ma d e preparare a soluției stoc de microelemente ( MIC RO B5 )
Nr.crt Substanț a Formula chimică Cantitate (mg/L)
1 Iodură de Potasiu KI 0,75
2 Acid Boric H3BO3 3
3 Sulfat de Mangan MnSO4 10
4 Sulfat de Zinc ZnSO4 2
5 Molibdat de Sodiu Na2MoO4 0,25
6 Sulfat de Cupru CuSO4 0,025
7 Clorură de Cobalt CoCl2 0,025

Tabelul 2. 20
Schema de preparare a soluției stoc de vitamine B5
Nr.crt Substanța Formula chimică Cantitate
(mg/L)
1 Acid nicotinic C6H5NO2 1
2 Piridoxină HCl C8H11NO3 1
3 Tiamină HCl C12H17N4OS+ 10

35
Mediul de cultură MS ( -) modificat pentru Poncirus trifoliata
(Schema de preparare pentru 1 litru )
Tabelul 2. 21
Schema de prepara re a mediului de cultură MS ( -) modificat
Nr.crt Substanț a Concentraț ie Cantitate
1 MACRO MS 10 x 100 mL
2 MICRO MS 1000 x 1 mL
3 Chelat de fier 200 x 5 mL
4 Vitamine MS 100 x 10 mL
5 Inozitol 100 x 10 mL
6 BAP 0,1 Mg/l 2 mL
7 Zaharoza – 30 g
8 Agar – 6 g
Ph-ul mediului= 5.7
( corectat cu NaOH 1 N )
Mediul de cultură MS (+) modificat pentru citric
(Schema de p reparare pentru 1 litru)
Tabelul 2. 22
Schema de preparare a mediului de cul tură MS (+ ) modificat pentru c itric
Nr.crt Substanț a Concentraț ie Cantitate
1 MACRO MS 10 x 100 mL
2 MICRO MS 1000 x 1 mL
3 Chelat de fier 200 x 5 mL
4 Vitamine MS 100 x 10 mL
5 Inozitol 100 x 10 mL
6 BAP – 2 mg/L
7 GA – 1 mg/L
8 IBA – 0,1 mg/L
9 Zaharoză – 30 g/L
Agar – 6 g/L
pH-ul mediului= 5,8
( corectat cu NaOH 1 N )

36
Tabelul 2.2 3
Observaț ii probe inoculate dupa 14 zile (segmente uninodale )

Nr.crt SpeciaMediul de
culturăRepetițiaTotal plante
inoculatePlante viabile Eficien ță
1 R1
2 R2
3 R3
4 R1
5 R2
6 R3
7 R1
8 R2
9 R3
10 R1
11 R2
12 R3
13 R1
14 R2
15 R3
16 R1
17 R2
18 R3
19 R1
20 R2
21 R3
22 R1
23 R2
24 R3
25 R1
26 R2
27 R3
28 R1
29 R2
30 R340%33.33%
26.60%
16.60%
10%
53.33%MS (+) modif.
Saint paulia
MS (+) modif.
Saint paulia26.60%
23.30%
16.66%
10%
Poncirus
trifoliata
Citrus
limonB5 (-)
B5 (-)30
30
30
30
30
30Poncirus
trifoliataMS (-)
Citrus
limonMS (-)
Poncirus
trifoliata
Citrus
limon
8
Poncirus
trifoliata
Citrus
limon
Poncirus
trifoliata
Citrus
limonMS (-) modif.
pentru
Poncirus
MS (-) modif.
pentru
Poncirus
MS (+) modif.
pentru citric
MS (+) modif.
pentru citric8
7
5
3
10
5
3
16
1230
30
30
30

37
După inocu lare, segmentele uninodale au fost păstrate în camera climatică, l a 22 °C și
50 % umiditate atmosferic ă, la o fotoperioadă de 16 ore și 9 280 lx. Observații le ce țin de
viabilitatea probelor au fost făcute la fiecare 5 zile, timp de 4 săptămâni înregistra tându-se
numarul de plante viabile . Întrucat speciile de citrice au un ritm lent de cre ștere, experien ța nu
s-a focalizat pe înregistrarea creș terilor vegetative.
Tabelul 2.2 4
Observații probe inoculate (semin țe ) dupa 45 de zile

Nr.crt Specia Mediul de cultură RepetițiaTotal
semințe
inoculateSemințe
germinateEficien ță
1 R1
2 R2
3 R3
4 R1
5 R2
6 R3
7 R1
8 R2
9 R3
10 R1
11 R2
12 R3
13 R1
14 R2
15 R3
16 R1
17 R2
18 R3
19 R1
20 R2
21 R3
22 R1
23 R2
24 R30%
50%
80%6.60%
30%
40%
50%
0%
0
15
242
9
12
15
030
30
30
30
30
3030
30
MS (-) modif.
pentru Poncirus
trifoliata
MS (+) modif.
pentru citric
MS (+) modif.
pentru citricMS (-)
MS (-)
B5 (-)
B5 (-)
MS (-) modif.
pentru Poncirus
trifoliataPoncirus
trifoliata
Citrus
limon
Poncirus
trifoliata
Poncirus
trifoliata
Poncirus
trifoliataCitrus
limon
Citrus
limon
Citrus
limon

38
După inoculare, sem ințele au fost păst rate în camera climatică, la 22 °C și 50 %
umiditate atmosferic ă, în condiții de întuneric timp de 2 saptamani . După ce au început să
germineze, semințele au fost mutate la lumină, l a o fotoperioadă de 16 ore și 9280 lx, la o
temperatură de 22 °C și umiditate atmosferică de 50 %.
Tabelul 2.2 5
Observații privind timpul de germinare in vitro
Nr.crt Planta Mediul de cultur ă Timpul de
germinare
(zile)
1 Poncirus trifoliata MS ( -) 40
2 Citrus limon MS ( -) 32
3 Poncirus trifoliata B5 (-) 30
4 Citrus limon B5 (-) 22
5 Poncirus trifoliata MS (+) modificat
pentru citric 28
6 Citrus limon MS (+) modificat
pentru citric 18

Tabelul 2.2 6
Observații privind eficie nța de germinare in vivo
Nr.crt Specia Semin țe
germinate Numar total
semin țe Eficien ță
1 Poncirus
trifoliata 6 10 60%
2 Citrus limon 8 10 80%

Tabelul 2.2 7
Observații privind timpul de germinare in vivo
Nr.crt Planta Timpul de germinare
(zile)
1 Poncirus trifoliata 75
2 Citrus limon 40

39
2.4 Rezultate ob ținute
2.4.1 Rezultate privind testarea protocoalelor de sterilizare
În cadrul experiențelor efectuate, am incercat să sabilesc un protocol eficient de
dezinfecție, atât din punct de vedere al reușitei operației de sterilizare cât și al economiei de
timp și de materiale. Am efectuat ce rcetările pe doua categorii de material biologic
reprezentate de segmente uninodale prelevate de la specii ale genului Citrus, mai puțin
Poncirus trifoliata ( întrucât am observat asemănarea anatomică dintre specii, existând o
disponibilitate mai redusă a materialului biologic provenit de la Poncirus trifoliata), cât și de
semințele acestora. Datorita acestei asemănări am admis că protocolul care va rezulta î n urma
cercetărilor ca fiind eficient, se va preta și pentru Poncirus trifoliata , atât pentru mater ialul
biologic reprezentat de către segmentele uninodale cât si pentru semințe. Explantele folosite la
testarea protocoalelor de sterilizare au fost inoculate pe mediul MS – (Murashige și Skoog
1962) pentru uniformizarea rezultatelor.
La calculul eficienței protocoal elor de dezinfecție nu am luat î n calcul și protocolul
pentru plantula de Poncirus trifoliata obținută din semințe , întrucât segmentele uninodale
provenite din secționarea acesteia erau in stare erbacee, drept urmare fiind necesara o
concentrație mult mai redusa de hipoclorit de Sodiu, produs comercial Domestos® 10%
(NaClO 4,5%). Protocolul aplicat plantulei a avut o eficiență de 80%. Eficiența protocoalelor
de dezinfecție este evidențiata in fig. 2.14, 2.15, 2.16 și 2.17.

Figura 2.14 Eficiență protocoale segmente uninodale

40

Figura 2. 15 Eficiență protocoale semințe
Timpul a reprezentat un factor important în alegerea protocolului adecvat, prin prisma
eficienței economice. Un protocol care va dura mai puțin, va fi totodată eficient economic,
crescând productivitatea muncii, însa acest aspect trebuie corelat perfect cu eficiența
procesului de sterilizare. Datele cu privire la timpul necesar procesului de sterilizare sunt
redate în fig. 2.16 și 2.17.

Figura 2.16 Durata protocoalelor aplicate se gmentelor uninodale

41

Figura 2.17 Durata protocoalelor aplicate semințelor
În urma cercetărilor efectuate am constat at faptul că î n cazul protocoalelor de
dezinfecție aplicate segmentelor uninodale s -au remarcat prin prisma eficienței încercarile din
data de 12.04.2017 și 21.04.2017 unde s -a constatat faptul că prin mărirea concentrației de
produs comercial Domestos® de la 20% la 30% timpul de dezinfecție total s -a redus cu 12
minute, păstrându -se eficienta sterilizarii (93,33%). Drept consecință, pentru te starea mediilor
de cultură, la inocularea plantelor, atât in cazul speciilor de Citrus cât și Poncirus trifoliata se
va folosi protocolul de dezinfecție din data de 12.04.2017.
Tabelul 2.2 8
Protocol dezinfecție 12.04.2017
Nr.crt Substanța Timpul
1 Fungici d (Flint® 4 g/ L) 5 minute
2 Clătire apă distilată sterilă 2 x 5 x 5 minute
3 Domestos® (hpoclorit de sodiu NaClO 4,5%) 30
% 3 minute
4 Clătire apă distilată sterilă 3 x 7 x 5 x 5 minute

42
În cazul semințelor, cercetările au condus la concluzia că cel mai eficient pro tocol s -a
dovedit cel încercat în data de 23.01.2018 (93.33%), î n cazul semințelor de Citrus Sp, urmat
de protocolul efectuat în aceeași dată la Poncirus trifoliata (73%). Consider că procentul mai
scăzut (73%) a fost o consecință dată d e adăugarea acidului ascorbic după sterilizarea în
Domestos® produs comercial de concentrație 20% .
Timpul de sterilizare î n ambele cazuri a fost identic (36,5 minute). Drept urmare in
cadrul testării mediilor de cultura, am folosit mai d eparte protocolul din data de 23 .01.2018
folosit pentru Cit rus Sp.
Tabelul 2.2 9
Protocol dezinfecție 2 3.01.2018

Nr.crt Substanța Timpul
1 Etanol 80 % 1.5 minute
2 Clătire apă distilată sterilă 2 x 5 x 5 minute
3 Domestos® (hpoclorit de sodiu NaClO 4,5%) 20 % 10 min ute
4 Clătire apă distilată sterilă 3 x 5 x 5 x 5 minute

43
2.4.2 Rezultate privind testarea mediilor de cultură
În cadrul experientelor efectuate am încercat sa găsesc un mediu de cultură pentru
inițierea culturilor de Citrus limon și Poncirus trifol iata, atât pentru inocularea segmentelor
uninodale cât si pentru inocularea semințelor. Menționez faptul că semințele au fost sterilizate
si inoculate fară tegument seminal, pentru a scurta timpul de germinare și pentru a spori
eficiența procesului de ster ilizare. Pentru această experiență am folosit 5 variante de mediu.
Viabilitatea plantelor după inoculare a reprezentat criteriul de alegere al mediului de
cultură pentru segmentele uninodale (plantele neviabile au rămas în stare latentă apoi s -au
uscat, neprezentând infecții primare sau secundare) respective numărul de semințe germinate
cât și lipsa infecțiilor pentru semințele de citrice inoculate . Datele cu privire la viabilitatea
plantelor pe fiecare mediu de cultură sunt reprezentate in fig. 2.18, 2.19 și 2.20.
Figura 2.18 Eficiența mediilor de cultură (segmente uninodale)
În figura 2.18 se poate observa ca cel mai eficient mediu de cultura în cazul segmentelor
uninodale a fost mediul MS (+) modificat pentru citric, urmat de mediul de cultura B5
(Gambor g și colab. , 1968). Mediul MS( -) modificat pentru Poncirus trifoliata a avut cea mai
mica viabilitate dupa inoculare (doza de 0.1 mg/L BAP s -a dovedit inhibitoare față de un
mediu Ms ( -) standard care a avut o eficiență mai mare). Mediul de cultură modifi cat pentru
Saint paulia (având în plus BAP și IBA in concentrație de 0.1 mg/L) a avut rezultate
asemanatoare. In consecință, concentrațiile hormonilor din mediul MS (+) modificat pentru
citric au generat cele mai bune rezultate: BAP 2 mg/L, GA 1 mg/L, IBA 0.1 mg/L.

44
În cazul segmentelor uninodale, am observat faptul ca Poncirus trifoliata prezintă o
viabilitate mai accentuată la folosirea acestui tip de explant (fig. 2.18) însă lămâiul a generat
cea mai mare incidență de apariție a calusului.
Cu toate c ă explantele reprezentate de către segmentele uninodale au format calus pe
absolut toate mediile încercate, cel mai prolific s -a format în cazul poncirusului tot pe acest
mediu de cultură.
(fig. 2.21).

Figura 2.21 Segment uninodal de Poncirus tr ifoliata pornit și calus obținut in vitro la
aceeași specie

Figura 2.22 Segment uninodal de Citrus limon pornit și calus obținut in vitro la aceeași
specie

45

Figura 2.1 9 Eficiența mediilor de cultură comparativ cu condițiile in vivo (semin țe)
În figura 2.19 se poate observa ca cel mai eficient mediu de cultura în cazul semințelor
inoculate a fost tot mediul MS (+) modificat pentru citric, urmat de mediul de cultura B5
(Gamborg și colab. , 1968). Se poate observa faptul ca mediul MS( -) modif icat pentru
Poncirus trifoliata nu a generat rezultate privind germinarea in vitro. Mediul MS (+)
modificat pentru citric a avut cea mai apropiata rată de germinare comparativ su condițiile in
vivo.
Procentul de semințe germinate î n cazul lămâiului a fost egal cu cel al semințelor
semănate convențional, pe când in cazul semințelor de Poncirus trifoliata, procentul de
semințe germinate in vivo a fost cu 10% mai mare. La sfârșitul experiențelor semințele
germinate de Poncirus trifoliata au generat un lăstar c u primordii de frunze și muguri
vegetativi (fig. 2.22), pe când semințele germinate de Citrus limon, au rămas in faza de
cotiledoane deschise (fig. 2.23). În consecință admit faptul că germinarea in vitro este
pretabilă doar pentru Poncirus trifoliata.

46

Figura 2.22 Sămânță Poncirus trifoliata Figura 2.23 Sămânță Citrus limon

Privind timpul de germinare al semințelor, am constatat faptul ca semințele inoculate
pe mediul de cultură MS (+) modificat pentru citric au germinat în 18 zile î n cazul lămâiului
si respectiv 28 de zile Poncirus trifoliata. Comparativ cu condițiile in vitro, timpul de
germinare a fost mult mai lung în cazul germinarii in vivo, semințele de Poncirus trifoliata au
germinat în 75 de zile, iar cele de Citrus limon în 40 de zile (fig. 2.20).

Figura 2.20 Grafic comparativ privind timpii degerminare

47
În urma experiențelor efe ctuate s -a constatat faptul că î n cazul ambelor tipuri de
material biologic, segmente uninodale, respectiv semințe s -a remar cat ca fiind cel mai eficient
mediul de cultură MS (+) modificat pentru citric având următorii constituenți:
Tabelul 2. 30
Schema de preparare a mediului de cultură MS (+) modificat pentru citric (1 L)
Nr.crt Substanța Concentrație Cantitate
1 MACRO MS 10 x 100 mL
2 MICRO MS 1000 x 1 mL
3 Chelat de fier 200 x 5 mL
4 Vitamine MS 100 x 10 mL
5 Inozitol 100 x 10 mL
6 BAP – 2 mg/L
7 GA – 1 mg/L
8 IBA – 0,1 mg/L
9 Zaharoză – 30 g/L
Agar – 6 g/L
pH-ul mediului= 5,8
( corectat cu NaOH 1 N )

Tabelul 2.3 1
Schema de preparare a soluției stoc de macroelemente (MACRO MS)
Nr.crt Substanța Formula Chimică Cantitate (mg/L)
1 Azotat de Amoniu NH4NO3 1650
2 Azotat de Potasiu KNO3 1950
3 Sulfat de Magneziu MgSO4 370
4 Fosfat de Potasiu KH2PO4 170
5 Clorură de Calciu CaCl2 440

48
Tabelul 2.3 2
Schema de preparare a soluției stoc de microelemente (MICRO MS)
Nr.crt Substanța Formula chimică Cantitate (mg/L)
1 Iodură de Potasiu KI 0.83
2 Acid Boric H3BO3 6.2
3 Sulfat de Mangan MnSO4 16
4 Sulfat de Zinc ZnSO4 8.6
5 Molibdat de Sodiu Na2MoO4 0.25
6 Sulfat de Cupru CuSO4 0.025
7 Clorură de Cobalt CoCl2 0.025

Tabelul 2.3 3
Schema de preparare a soluției stoc de vitamine
Nr.crt Substanța Formula chimică Cantitate
(mg/L)
1 Acid nicotinic C6H5NO2 0.5
2 Glicină C2H5NO2 2
3 Piridoxină HCl C8H11NO3 0.5
4 Tiamină HCl C12H17N4OS+ 0.5

2.5 Concluzii și recomandări
2.5.1 Concluzii
În cadrul experiențelor efect uate am obținut rezultate cu privire la protocolul de
dezinfecție adecvat speciilor de citrice s tudiate cât si asupra mediului de cultură optim pentru
inițierea acestor culturi. De asemenea am concluzionat faptul că speciile de citrice supuse
înmulțirii in vitro răspund destul de greu, drept urmare încă va fi obiectul unori cercetări
viitoare.
Conclu zii privind protocoalele de dezinfecție:
În urma încercarilor am stabilit un protocol de adecvat, atât din punct de vedere al
eficienței de sterilizare, cât si economic. Ca urmare am stabilit un protocol pentru segmentele
uninodale, respectiv unul pentru s emințe.
Acestea nu prezintă riscuri asupra operatorului deoarece nu includ în etapele lor
substanțe deosebit de periculoase.

49
Eficiența protocolului din data de 12.04.2017 dedicat segmentelor uninodale prelevate
de la specii de citrice a fost de 93,33%, iar cel din data de 22.01.2018 aplicat semințelor de
citrice având o eficiență similară.
Concluzii privind mediile de cultură:
În urma încercarilor am stabilit un mediu de cultură eficient, atât pentru segmentele
uninodale inoculate cât si pentru semințele d e citrice, reprezentat de către mediul MS (+)
modificat pentru citric având în plus față de mediul MS ( -) standard (Murashige și Skoog
1962) , hormonii: BAP 2 mg/L, GA 1 mg/L și IBA 0,1 mg/L. Acest mediu de cultură a avut o
rată de reusită de: 53,33% in ca zul segmentelor uninodale de Poncirus trifoliata și de 40% în
cazul segmentelor uninodale de Citrus limon. Plantula de Poncirus trifoliata nu a generat
rezultate (nu a prezentat viabilitate dupa inoculare).
În cazul semințelor eficiența mediului a fost de 80% în cazul semințelor de Citrus
limon și respectiv 50% Poncirus trifoliata. Totodată pe acest mediu am observat cea mai mare
rată de calusare. Așadar acest mediu va putea fi folosit și în lucrările de inducție a calusului la
speciile de citrice, constitu ind un punct de plecare pentru cercetările viitoare (culturi de calus).
2.5.2Recomandări
După efectuarea acestori cercetări pot face următoarele recomandări:
– În cadrul procesului de sterilizare se poate utiliza cu su ccess protocoalele evidențiate,
avand o rată de reușită de 93.33%;
– mediul de cultură dovedit a fi eficient este reprezentat de MS (+) modificat pentru citric,
insă va trebui supus unori modificări viitoare pentru a se mări spectru l e utilizare al
acestuia, dovedindu -se deja eficiența acestuia în inducerea calusului;
– deși toate speciile de citrice analizate î n cadrul lucrării au generat rezultate, recomand acest
procedeu de înmulțire pentru specia Poncirus trifoliata întrucât a generat cel mai bun
răspuns comparativ cu inmulțirea in vivo. Pentru l ămâi procedeele clasice de înmulțire
rămân de bază (răspunsul acestuia la înmulțirea in vitro nu a relevat suficiente rezultate
pentru adoptarea totală a acestei metode de înmulțire), î nsă se poate folosi la această specie
pentru producerea de calus sau pe ntru devirozarea materialului biologic valoros;
– recomand procesul de germinare in vitro al semințelor de Poncirus trifoliata prin prisma
timpului mult mai scurt de germinare cât și al răspunsului acestei specii. Germinarea in
vitro la această specie prezen tând interes î n lucrările de ameliorar e datorită scurtării
timpului d e germinare.

50
Bibliografie

1. A. Huxley, 1992 . The New RHS Dictionary of Gardening . MacMillan Press ISBN 0 –
333-47494 -5
2. Adrian -George Peticilă, 2015. MICROÎNMULȚIREA PLANTELOR HORTICOLE. Editura
Granada.
3. Anna Kasprzyk -Pawelec, Jacek Pietrusiewicz, Ewa Szczuka, 2015 . In vitro regeneration
induced in leaf explants of Citrus limon L. Burm cv. „ Primofiore „ . Acta Sci. Pol.
Hortorum Cultus, 14(4) 143 -153
4. Bean. W. Trees and Shrubs Hardy in G reat Britain. Vol 1 – 4 and Supplement. Murray
1981
5. Christos Chatzissavvidis, Chrysovalantou Antonopoulou, Io annis Therios, Kortessa
Dimassi, 2014 . Response of trifoliate orange ( Poncirus trifoliate L. Raf. ) to
continuously and gradually increasing NaCl concentration . Acta Bot. Croat. 73(1), 275 –
280
6. Davis. B. Climbers and Wall Shrubs. Viking. 1990 ISBN 0 -670-82929 -3
7. Duke. J. A. and Ayensu. E. S. Medicinal Plants of China Reference Publications, Inc.
1985 ISBN 0 -917256 -20-4
8. Komal Goswami, R. Sharm a, P.K. Singh, Govid Singh, 2013 . Micropropagation of
seedless lemon ( Citrus limon L. cv. Kaghzi Kalan ) and assessment of genetic fidelity of
micropropagated plants using RAPD markers . Physiol Mol Biol Plants 19(1):137 -145
9. Natural Food Institute, Wonder Crops . 1987.
10. O. Pérez -Tornero, C.I. Tallón, I. Porras, 2009 . An efficient protocol for
micropropagation of lemon ( Citrus limon ) from mature nodal segments . Plant Cell Tiss Cult
11. Shepherd. F.W. Hedges and Screens. Royal Horticultural Society. 1974 ISBN
09006 29649
12. Simmons. A. E. Growing Unusual Fruit. David and Charles 1972 ISBN 0 -7153 -5531 -7
13. Tanaka. T. Tanaka's Cyclopaedia of Edible Plants of the World. Keigaku Publishing 1976
14. Tanaka. T. Tanaka's Cyclopaedia of Edible Plants of the World. Keigaku Publishing 1 976
15. Thomas. G. S. Ornamental Shrubs, Climbers and Bamboos. Murray 1992 ISBN 0 -7195 –
5043 -2
16. Usher. G. A Dictionary of Plants Used by Man. Constable 1974 ISBN 0094579202

51
17. World health organisation Regional Office for the Western Pacific Manila , 1998 .
Medicina l plants in the Republic of Korea. Who Regional Publications Western Pacific
Series No. 21
18. Yeung. Him -Che. Handbook of Chinese Herbs and Formulas. Institute of Chinese
Medicine, Los Angeles 1985
19. Zhang Dianxiang, David J. Mabberley, 2008. Flora of China vo l. 11 , 90 -96 . Citrus
Linnaeus, Sp. Pl. 2:782.1753
20. http://www.homecitrusgrowers.co.uk/poncirustrifoliata/poncirus.html
21. http://www.lubera.co.uk/plants/mediterranean -plants/citrus -plants/hardier -citrus –
varieties/trifoliate -orange -flying -dragon
22. http://www.plantsystematics.org
23. https://flyhigh.sunphoto.ro/Poncirus_trifoliata_lamai_rezistent_la_inghet
24. https://ro .flare -up.net/?p=5139
25. https://www.gazetadeagricultura.info/informatii -utile/574 -invatamant -agricol/16179 –
inaugurarea -centrului -de-cercetare -hortinvest -din-cadrul -usamv -bucuresti.html
26. https://www.pfaf.org/user/Plant.aspx?LatinName=Poncirus+trifoliata
27. https://prezi.com/0tf8ffcom3la/mediile -de-cultura -si-cresterea -culturilor -in-vitro/