Spermatogeneza

CUPRINS

INTRODUCERE

SPERMATOGENEZA

Etapele spermatogenezei

Proliferarea mitotică

Meioza

Citodiferențierea

ORGANIZAREA CROMATINEI ȘI DINAMICA ARHITECTURII SALE ÎN SPERMATOZOIZI

Cromatina

Proteinele cromozomale

Nivel de organizare ale cromatinei în celulele germinale

3.2.1. Proteine sperm-specifice cu rol arhitectural in cromatina liniei germinale seminale

Histone i variante histonice

Proteine nucleare de tranziție

Protamine i protamine-like

4. ROLUL MECANISMELOR EPIGENETICE ÎN REMODELAREA CROMATINEI, CU IMPLICAȚII ÎN INFERTILITATEA MASCULINĂ

4.1. Modificări ale histonelor

4.2. Metilarea ADN în spermatozoizi

MATERIALE ȘI METODE

REZULTATE ȘI DISCUȚII

CONCLUZII ȘI PERSPECTIVE

BIBLIOGRAFIE

2. SPERMATOGENEZA

Spematogeneza reprezintă procesul fiziologic de producere a celulelor sexuale masculine mature și implică o serie de transformări ale celulelor germinale primare, în vederea lor in spermatozoizi (Gilbert, 2000).Spermatogeneza este inițiată la pubertate și continuă pe tot parcursul vieții, procesul fiind unul continuu. Spermatogeneza este un proces de durată și variază în funcție de specie, așa cum se poate observa în Tabelul 1.

Pubertatea constituie momentul de început, deoarece în această perioadă este inițiată stimularea organelor reproducătoare, de catre hormonii gonadotropi din hipofiză. Deasemenea, inițierea spermatogenezei este reglată si de sinteza BMP 8B (Bone Morphogenetic Protein 8B) când aceste proteine ating un prag critic, celulele germinale primordiale încep diferențierea. La șoareci, în faza de pubertate, BMP 8B lipsește, împiedicand astfel inițierea spermatogenezei în aceasta etapă (Zhao, 1996).

Spermatogeneza are loc în testicule, care, odată aflate la maturitate, se caracterizează printr-un parenchim alcătuit din:

tuburi seminifere, care conțin două tipuri celulare: celule somatice Sertoli și celulele liniei germinale (spermatogonii, spermatocite, spermatide aflate în diferite stadii de dezvoltare și spermatozoizi. Așadar, spermatozoizii in tubii seminiferi, reprezint o categorie de celule înalt specializate au rolul de a transmite materialul genetic Fig. 3;

țesut interstițial, alcătuit din celule Leydig, dispuse sub formă de cordon, care secretă hormonii androgeni (testosteron), responsabili de buna funcționare a aparatului reproducator mascul.

2.1. Etapele spermatogenezei

Spermatogeneza cuprinde trei etape principale:

proliferarea mitotică, în urma căreia vor fi produse un număr foarte mare de celule;

diviziunea meiotică, prin care se injumătățește numărul de cromozomi și asigură diversitate genetică;

citodiferențierea (spermiogeneza), etapă care se finalizează cu formarea spermatozoizilor și în care cromozomii sunt bine impachetați, pentru a se asigura transmiterea lor eficientă către ovocit, în cursul fecundării (Johnson, 2013).

Tabelul 1- Durata spermatogenezei la diferite specii

Fig. 1 – Structură parenchim testicular, cu celule germinale în diferite stadii de dezvoltare (după http://www.deltagen.com/target/histologyatlas/HistologyAtlas.html)

Fig.2 – Structură parenchim testicular, cu celule germinale în diferite stadii de dezvoltare (după http://www.deltagen.com/target/histologyatlas/HistologyAtlas.html

Fig. 3 – Celulele liniei germinale mascule și structura spermatozoidului (după http://www.frontiersin.org/files/Articles/110526/fcell-02-00056-HTML/image_m/fcell-02-00056-g004.jpg)

2.1.1. Proliferarea mitotică

Spermatogoniile reprezintă celulele stem ale liniei germinale, capabile de autoregenerare. Au fost efectuate o serie de experimente, pentru a testa pluripotența celulelor stem ale liniei germinale. S-a constatat că, dacă aceste celule sunt cultivate in vitro, sau sunt plasate în alte regiuni ale corpului, exceptând tuburile seminifere, prezintă capacitatea de a da naștere mai multor tipuri celulare. În această privință, se aseamănă foarte mult cu celulele stem embrionare, obținute in vitro, din blastocist. Cercetătorii testează în prezent posibilitatea de a folosi spermatogoniile în tratamentul bolilor degenerative, pentru a înlocui celulele stem embrionare, a căror utilizare este însoțită de controverse etice (Guan K, Nayernia K, Maier LS et al, 2006).În cadrul spermatogenezei, din rândurile acestor celule stem, se desprind la anumite intervale de timp, grupuri de celule cu o morfologie distinctă, denumite spermatogonii de tip A. Apariția acestora marcheză începutul spermatogenezei. Spermatogoniile de tip A sunt mai mici decat celulele germinale primordiale și prezintă un nucleu mare, ovoid, în care cromatina este omogenă și are un aspect prăfuit.

Fiecare dintre aceste spermatogonii de tip A, va suferi o succesiune de diviziuni mitotice, din care vor rezulta câte 16 celule, respctiv spermatogoniile de tip A1.

Au loc noi serii de diviziuni mitotice, spermatogoniile de tip A1 devenind spermatogonii de tip A2, apoi A3 și în final A4.

În acest punct, spermatogoniile de tip A4 pot urma trei căi diferite de dezvoltare:

fie formeaza noi spermatogonii de tip A4;

fie se diferențiază în spermatogonii intemediare;

fie inițiază apoptoză. Spermatogoniile intermediare prezintă pe membranele nucleare, un model dantelat al cromatinei. După o singură diviziune mitotică, spermatogoniile intermediare se transformă în spermatogonii de tip B.

Numărul de mitoze care au loc începand cu celulele stem și până la spermatogoniile de tip B, vor determina numarul total de celule din clonă, (moartea celulelor din timpul mitozelor le reduce totuși considerabil numărul). Spermatogoniile de tip B reprezint precursorii spermatocitelor i sunt ultimele celule rezultate n urma mitozelor. Prezintă nuclei rotunzi, de dimensiuni mai mici și se vor divide o singură dată, dând naștere spermatocitelor primare (Johnson, 2013).

Un aspect foarte important al diviziunii mitotice în spermatogeneză îl reprezintă faptul că, deși cariokineza se realizează complet, citokineza este incompletă, motiv pentru care spermatocitele primare sunt legate prin punți fine de cromatină, alcătuind un sincițiu. Această organizare sincițială se va păstra pe toata durata etapei meiotice, urmând ca celulele să se individualizeze doar in stadiul de spermatozoizi maturi (De Sousa Lopes, 2004).

2.1.2. Meioza

Faza de proliferare mitotică are loc în compartimentele bazale din tuburile seminifere, urmând ca fiecare spermatocit primar aflat în faza anterioară primei diviziuni mitotice, să migreze apoi zonele din apropierea lumenului tubului seminifer. , spermatocitele intră în meioza I, a cărei profază reprezintă o etapă prelungită, în care celulele sunt foarte sensibile și pot apărea numeroase degenerări Fig. 3a). În leptoten, cromatina începe să se condenseze și se prezintă sub forma unor filamente fine. În zigoten, cromozomii omologi se asociază, formând perechile de bivalenți. În pachiten, bivalenții se scurtează și se condensează, având loc un fenomen foarte important crossing-over-ul.

Fig. 3 – Biologia spermatogenezei la șoarece

schemă a epiteliului unui tub seminifer al unui șoarece adult, ilustrând particularitățile morfologice ale celulelor germinale, aflate în diferite stadii de dezvoltare, precum și strânsa lor legatură cu celulele Sertoli. Bariera sangvină împarte epiteliul tubului seminifer în două compartimente: bazal și apical.

secțiune transversală printr-un tub seminifer de șoarece adult, în timpul meiozei. Se observă o serie de spermatide nou-formate.

schemă a proceselor care au loc în celulele germinale mascule, în cursul spermatogenezei. (http://rstb.royalsocietypublishing.org/content/365/1546/1459)

În cursul diplotenului, cromozomii bivalenți , în timp ce se îndepartează unii de ceilalți, spre polii opuși ai celulei, rămânând uniți doar la nivelul chiasmelor. În diakineză, membrana nucleară se dezintegrează și încheie astfel prima diviziune mitotică, în urma căreia rezultă doua spermatocite secundare, cu câte un singur set de cromozomi.

Spermatocitele secundare au viață foarte scurtă, intrând foarte repede în cea de-a doua diviziune meiotică, din care rezultă patru spermatide rotunde, deasemenea haploide Fig. 3c). Spermatidele rotunde se află în continuare într-o organizare sincițială, fiind legate prin punți de citoplasmă, care persistă până în momentul în care se vor diferenția spermatozoizii maturi Fig. 3b).

a șoarece, aceste sinciții nu sunt înconjurate de niciun fel de membrană (Gilbert, 2000).

2.1.3. Citodiferențierea

eprezintă etapa în care va avea loc formarea celulelor spematice mature, spermatozoizii.

Aceasta este faza în care se observă cu ușurință modificări majore în structura spermatidelor, caracterizate prin remodelări citoplasmatice. Aparatul Golgi, care înconjoară nucleul (în care materialul genetic este foarte condensat), se va transforma în acrozom. Membrana nucleară și pierde porii și se vor forma piesa intermediară și coada, care este reprezentată de un flagel, cu structură de microtubul (9+2). Piesa intermediară leagă coada de nucleu, iar acesta se va îndrepta înspre membrana citoplasmatică: este momentul în care începe schimbarea formei spermatidelor, acestea devenind din rotunde, alungite.

Mitocondriile migrează către piesa intermediară, dispunându-se sub formă de spirală. Spermiogeneza ia sfârșit odată cu formarea spermatozoidului matur, care nu va mai avea organite celulare și doar foarte puțină citoplasmă. În acest punct, spermatozoizii sunt maturi, dar imobili. După formarea spermatozoizilor, punțile citoplasmatice care alcătuiau sincițiul se vor rupe, iar celulele vor fi eliberate în lumenul tubului seminifer, process denumit spermiație. Sunt conduși în epididim, prin intermediul fluidului testicular secretat de celulele Sertoli, unde capătă mobilitate și devin capabili de fertilizare (Johnson, 2013)

ORGANIZAREA CROMATINEI ȘI DINAMICA ARHITECTURII SALE ÎN SPERMATOZOIZI

Nivelurile de organizare ale cromatinei

Cromatina reprezintă forma sub care se găsește materialul genetic în nucleul celulelor eucariote și este organizata într-un mod complex, din ADN și proteine cu caractez bazic. Denumirea provine de la tinctorialitatea pentru coloranții bazici. Acest tip de organizare al cromatinei, influențează toate funcțiile genomului. Molecula de ADN este asociată cu proteine de tip histone, care îi stabilizează structura și o protejează de atacurile enzimatice.

Se poate spune ca în cromatină se găsește atât informația de structură, sub forma codului genetic, cât și informația cu privire la funcția genelor, sub forma codului epigenetic (în aceasta categorie sunt cuprinse: metilarea ADN, alte tipuri de modificări chimice și silențiere ARN). (Jenuwein și Allis, 2001).

3.1.2. Proteinele cromozomale

ADN este complexat cu două tipuri de proteine: histone și non-histone. Principala clasă de proteine care complexează ADN este reprezentată de histone, care sunt proteine bazice, cu greutate moleculară mică, bogate n lizină și arginină. Au fost descrise 5 tipuri de histone: H1 H2A, H2B, H3 și H4. Histona H1, foarte bogată în lizină, este alcătuită din 3 domenii de structură și prezintă afinitate de interacțiune cu molecula de ADN. Histonele H2A și H2B conțin o cantitate mai redusă de lizină: H2A este bogată în leucină, iar H2B în serină și prolină; ambele prezintă doar două domenii structurale, dintre care numai unul interacționează cu ADN. Histonele H3 și H4 sunt bogate în arginină și au tot două domenii funcționale. Histonele au o structură înalt conservată în lumea vie, iar faptul că au un conținut ridicat de aminoacizi bazici, explică legarea lor de ADN. Lizina se leagă cu precădere de perechile A-T, pe când arginina este mai atrasă de perechile G-C. Cea mai heterogenă dintre histone este H1, acest parametru scăzând pe măsura ce se ajunge la H4. (Stoica., Vassu ., 2006).

Histonele au mai multe funcții:

mențin integritatea structurală a cromozomilor, datorită faptului că sunt bogate în componente bazice, acestea protejează ADN-ul împotriva denaturăle prezintă doar două domenii structurale, dintre care numai unul interacționează cu ADN. Histonele H3 și H4 sunt bogate în arginină și au tot două domenii funcționale. Histonele au o structură înalt conservată în lumea vie, iar faptul că au un conținut ridicat de aminoacizi bazici, explică legarea lor de ADN. Lizina se leagă cu precădere de perechile A-T, pe când arginina este mai atrasă de perechile G-C. Cea mai heterogenă dintre histone este H1, acest parametru scăzând pe măsura ce se ajunge la H4. (Stoica., Vassu ., 2006).

Histonele au mai multe funcții:

mențin integritatea structurală a cromozomilor, datorită faptului că sunt bogate în componente bazice, acestea protejează ADN-ul împotriva denaturării termice;

protejează ADN-ul împotriva acțiunii unor enzime, de tipul dezoxiribonucleazelor;

reprezintă elemente reglatorii ale activității genice (Burlibașa, 2008).

Proteinele non-histonice, reprezintă un grup foarte heterogen, compus din: enzime implicate în sinteza ADN și ARN (ADN si ARN polimeraze), reparare ADN (helicaze, topoizomeraze, helicaze, fosfataze), factori de transcripție, proteine structurale (actină, tubulină). În celulele germinale se întâlnesc și protamine, prezente în spermatozoidul matur și proteine de tranziție, protamine-like, specifice țesutului testicular. În comparație cu histonele, care reprezintă componente prezente permanent la nivelul nucleului, o mare parte dintre non-histone se află într-o mișcare permanentă între nucleu și citoplasmă. Non-histonele, spre deosebire de histone, prezintă specificitate de specie și țesut, putând fi corelate cu metabolismul și stadiile ciclului celular.

Nivelurile de organizare ale cromatinei în celulele germinale

Procesul de împachetare a ADN-ului cu proteine se desfașoară puțin diferit în cazul celulelor germinale, față de celulele somatice, așa cum se poate observa în Fig.4. Dublul helix ADN este diferit în celulele germinale prin faptul c telomeraza este activă, rezultând astfel secvențe telomerice mai lungi și prezntă o hipermetilare extinsă.

În cadrul celulelor somatice, cromatina trece, pe rând, prin urmatoarele faze: dublul helix ADN, nucleosom, solenoid, domeniile buclate, cromatidele cromozomilor metafazici.

În cursul spermatogenezei, cromatina din celulele germinale este supusa unor modificări treptate: histonele sunt mai întâi înlocuite cu proteine de tranziție și apoi cu protamine. Histonele din celulele germinale sunt foarte asemănătoare cu omoloagele lor din celulele somatice.

Modul în care se regăsesc diferitele tipuri de histone în stadiile spermatogenezei, poate fi observat în tabelul 2.

Fig.4. Diferențe între modul de împachtare al cromatinei în celulele somatice și celulele germinale (după http://www.nature.com/ng/journal/v28/n1/full/ng0501_10.html)

Tabelul 2. Expresia genelor histonice în spermatogeneza mamiferelor (după Burlibașa ., 2008)

În celulele germinale, au loc următoarele procese: ADN-ul este împachetat cu protamine, urmează faza de toroid și apoi domeniile buclate. În cursul spermatogenezei, au loc o serie de restructurări ale cromatinei, prin faptul că se modifică nivelu de expresie al genelor care codifică pentru histone. În primele etape ale spermiogenezei, spermatidele conțin un anumit model al cromatinei și sintetizează în mare parte ARN neribozomal. Pe măsură ce procesul de spermiogeneză avansează, va interveni stoparea transcrierii și înlocuirea histonei H1t, cu proteinele de tranziție sperm-specifice, TNP 1 și TNP2. Acestea vor fi la rândul lor înlocuite cu protaminele 1 și 2.

Toroidul este omolog nucleosomilor din celulele somatice, are diametrul de 90 nm și conține în jur de 60 kb.

Domeniile buclate reprezintă următorul nivel de împachetare și au ca dimensiune aproximativ jumătate din dimensiunea buclelor din celulele somatice. Singura formă de organizare a cromatinei care este prezentă în tote stadiile spermatogenezei este cea de domenii buclate (Klaus și colab, 2001).

3.2.1. Proteine sperm-specifice cu rol arhitectural in cromatina liniei germinale seminale

3.2.2. Histone si histone-like

Variantele histonice reprezintă forme non-alelice, care înlocuiesc histonele aflate în mod normal în structura nucleosomului (Malik și Henikoff, 2003).

Histonele miez, cu excepția H4, prezintă fiecare câte un număr mic de variante histonice, a căror heterogenitate are un rol reglator. Această heterogenitate este totuși conservată în cursul evoluției, sugerând proprietățile unice pe care le posedă aceste variante (Tabelul 3).

Proteinele H1 au rol în împachetarea cromatinei în nucleosomi, dar funcționează și ca inhibitori ai transcrierii. (Brown, 2001).

Histonele linker, reprezentate de clasa H1, prezintă o heterogenitate funcțională, numărul lor de variante fiind mult mai ridicat decât în cazul histonelor miez.

Tabelul 3. Variante de histone linker, cu proprietăți specifice (după Brown, 2001)

La șoarece și alte mamifere au fost identificate două variante ale histonei linker H1, specifice țesutului testicular: H1t și HILS1 (Iguchi și colab, 2003).

H1t se găsește în cantități semnificative numai în spermatocitele aflate în pachiten și în spermatidele timpurii. În stadiul de spermatide rotunde, H1t este prezentă în cantitate de aproximativ 55% din cantitatea totală de histone linker. Studiile in vitro au arătat ca H1t are o structură a cromatinei mai deschisă, comparativ cu varianta H1 somatică. In vivo, această proprietate poate facilita recombinarea și tranziția de la histone la protamine, în timpul spermiogenezei.

S-a demonstrat totuși, în cadrul unor experimente, că șoarecii care nu posedă H1t sunt fertili, iar procesul de spermatogeneză se desfășoară normal, prin acumularea altor variante ale H1, cum ar fi H1s, care compensează funcția H1t (Brown, 2001). H1t și H1s sunt totuși diferite și se presupune că au și funcții diferite, S-a arătat ca H1t este îndepărtată de pe helixul ADN mai repede decât H1s, iar in vivo, realizează o condensare a cromatinei mai puțin eficientă decât alte variante ale histonei H1.

H1t favorizează meioza și nu este prezentă la femele, iar conținutul sau ridicat de metionină protejează ADN-ul de speciile reactive la oxigen, prin reglarea expresiei genice în cursul spermiogenezei.

Histona linker somatică, H1a, este prezentă în cantități mari în spermatogonii, iar ulterior concentrația sa scade, pe măsura desfășurării diviziunilor mitotice și meiotice (Khadake Rao, 1995). S-a demonstrat experimental ca H1a nu are rol nici în spermatogeneză și nici în fertilitate (Burlibașa, 2008).

Cealaltă variantă a H1, respectiv HILS1 (H1-like proteins in spermatids 1) a fost descoperită atât la om cât și la șoarece (Iguchi și colab, 2003). Comparativ cu H1t, care este prezentă până la stadiile de spermatide rotunde, HILS1 poate fi detectată ulterior, în nucleii spermatidelor elongate și condensate, demonstnd astfel acțiunea secvențială a histonelor linker în cursul remodelarii cromatinei (Govin și colab, 2004).

Pentru histona H3, au fost identificate 5 variante, dintre care una este specific testiculară. Până în prezent, a fost izolată doar la om o variantă a H3 specifică țesutului testicular, denumită H3t, care diferă de H3 prin 4 aminoacizi (Witt și colab, 1996). Aceasta a fost identificată doar în spermatocitele primare.

TH2B, variantă a H2B, are o funcție conservată în spermatogeneza mamiferelor. Diferența între cele două proteine se găsește în domeniile amino terminale. La șobolan, TH2B se exprimă din stadiile de spermatocite primare, până în pachiten, pe când în spermatide este prezentă forma H2B.

TH2A este singura variantă a H2A, care a fost identificată ca fiind testicular specifică. Aceasta diferă de varianta de somatică prin localizarea diferită a câtorva aminoacizi, atât în domeniul de pliere, cât și în domeniile terminale. TH2A este prezentă în spermatocitele aflate în pachiten. (Burlibașa, 2008). În ceea ce privește formele non-testiculare, s-a constatat că în cursul spermatogenezei se exprimă variantele H2A.X și macroH2A.

Inhibarea expresiei genei H2A.X conduce către o spermatogeneză anormală și infertilitate masculină. Experimentele au demonstrat funcția de reparare a ADN-ului exercitată de H2A.X (Downs și colab, 2000).

Histona macroH2A1 reprezintă o variantă mai lungă a H2A, cu o regiune carboxil terminală vastă, non-histonică (Pehrson și Fried, 1992). Această genă codifică pentru două proteine, macroH2A1.1 și macro H2A1.2, cea din urmă fiind găsită în cantități ridicate în țesutul testicular de șoarec, însă funcția sa nu este deocamdată cunoscută. (Pehrson și colab, 1997).

3.2.3. Proteine nucleare de tranziție

Spermiogeneza implică cele mai dramatice modificări ale structurii și funcțiilor cromatinei: încetarea transcrierii, alungirea nucleului, îndepărtarea histonelor și înalta condensare a materialului genetic(Fig.5). Există specii la care trecerea de la histone la protamine se face direct, însă la mamifere apar ca factori ajutători niște proteine de dimensiuni reduse, denumite proteine nucleare de tranziție. În cursul spermiogenezei, proteinele nucleare de tranziție reprezintă 90% dintre proteinele care se acumulează în celule, după îndepărtarea histonelor, dar înainte de înlocuirea acestora cu protamine (Meistrich et al, 2003). Aceste proteine aflate în cantități att de mari în spermatidele în curs de condensare, se pare că sunt implicate atât în denaturarea organizării de tip nucleosom, cât și în acumularea protaminelor, dar funcțiile lor nu au fost complet elucidate.

Proteinele nucleare de tranziție variază atât ca formă, cât și ca dimensiuni și se consideră că au o compoziție mai bazică decât cea a histonelor, dar mai puțin bazică decât cea a protaminelor. Până în prezent au fost identificate patru asemenea proteine, TP1-TP4, dintre care TP1 și TP2 se găsesc în cantități ridicate în spermatide. (Caron și colab, 2005).

TP1 este o proteină cu o structură înalt conservată, are o greutate moleculară de 6.2Kda, și conține arginină și lizină în proporții egale, însă nu conține cisteină. TP2 este mai mare decât TP1, are o greutate moleculară de 13 Kda și conține câte 10 % arginină și lizină și 5% cisteină.

În timpul spermiogenezei la om și la șoarece, proteinele nucleare de tranziție vor fi înlocuite cu protaminele 1 și 2. În cadrul unor experimente, s-au creat șoareci mutanți fără gena pentru TP1 și s-a constatat că producerea de spermă era normală, fiind observate doar ușoare modificări la nivelul morfologiei spermatozoizilor.

Nucleii spermatidelor șoarecilor dublu mutanți conțineau cantități mari de TP2 și P2, iar motilitatea spermatozoizilor a fost redusă sever, 60% dintre mutanți fiind infertili. Se pare, așadar, că TP1 nu este esențială pentru condensarea cromatinei sau înlocuirea histonelor (Yu și colab, 2000).

TP2 are un nivel scăzut de exprimare și poate fi detectată în stadiile 1-5 ale spermatidelor. Experimente efectuate pe șoareci au evidențiat faptul că mutații care nu prezintă gena pentru TP2 au testicule normale din punct de vedere histologic și fiziologic, deci sunt fertili. Se pare că absența TP2 este compenată de TP1 și protamine (Zhao, 2001).

Fig5. Modelul organizării cromatinei în cursul spermiogenezei. Înlăturarea nucleosomilor și a histonelor și acumularea proteinelor nucleare de tranziție și a protaminelor, care stimulează repararea ADN și stabilizarea sa într-o formă mai relaxată.

3.2.4. Protamine și protamine-like

Termenul de protamină a fost introdus în 1874, de către Friedrich Miescher. Protaminele sunt proteine bazice, cu greutate moleculară mică și foarte bogate în arginină. Protaminele sunt foarte heterogene și prezintă un grad scăzut de conservare. În evoluția vertebratelor, începând cu peștii, se observă o creștere gradată a lungimii protaminelor. Deocamdată nu este clar de ce unele organisme conțin mai multe gene pentru protamine, în timp ce altele au o singură astfel de genă (Lewis și colab, 2003).

Protaminele de la mamifere au o structură specifică, fiind singurele din întreaga scară evolutivă care conțin și resturi de cisteină, Aceste resturi se pare că sunt implicate în formarea legaturilor disulfhidrice, în veredea obținerii unei structuri foarte compacte în spermatozoizi. După interacțiunea protaminelor cu ADN-ul, se pare că acestea suferă niște modificări, care înglobează structuri secundare. Neutralizarea sarcinilor electrice rezultate în urma acestor interacțiuni, determină curbarea ADN-ului, rezultând în final structura de tip toroid, foarte compactă, observată în sperma mamiferelor (Brewer și colab, 2000).

La majoritatea mamiferelor, nucleii spermatici conțin un singur tip de protamină, P1, bine conservată de la specie la specie. La căteva mamifere însă, printre care se numără șoarecele și omul, este prezent și un al doilea tip de protamină, P2. Protamina P2 au o secvență mai lună decât P1 și conține o cantitate mult mai mare de histidină (Caron și colab, 2005).

Protaminele 1 și 2 sunt în mod normal exprimate în cantități similare, dar s-a observat că unii bărbați sterili, precum și modelele animale, prezintă niveluri crescute sau scăzute ale celor două protamine. Studiile au demonstrat că reglarea expresiei protaminelor se face în mod unic, iar niveluri mari de protamine în spermatozoidul matur, indică faptul că protaminele ar putea funcționa ca și punct de control în spermatogeneză. (Douglas T.Carrell și colab, 2007). Deasemenea, un studiu făcut pe 8 specii ale genului Mus, a condus la conzluzia că la speciile în care femelele se împerechează cu mai mulți masculi, competiția dintre spermatozoizii rivalilor în vederea fecundării ovulului se manifestă prin niveluri scăzute ale protaminei 2, în comparație cu protamina 1 (Luke L, Campbell și colab, 2014.).

În studiile făcute pe șoareci s-a demonstrat că ambele protamine sunt implicate în condensarea cromatinei, după meioză. Protaminele suferă o serie de modificări, de tipul: fosforilări, defosforilări, formare de legături disulfidice și chiar proteoliză, în celulele de șoarece. Însumarea acestor modificări conduce la formarea unor nuclei spermatici înalt condensați.

Protamine-like

Acestea reprezintă proteine care înlocuiesc histonele, în cursul spermiogenezei. Sunt foarte heterogene, atât din punct de vedere numeric, cât și ca dimensiuni: acești doi parametri pot varia foarte mult, chiar între specii înrudite. Protaminele-like reprezintă legătura dintre precursorul histonic și protamine și au un conținut de arginină și lizină de cel puțtin 35-50%, iar multe dintre ele conțin și cisteină. (Zhang și colab, 1999).

Aceste tipuri de proteine conțin mai multe situsuri de fosforilare. Fosforilarea practic mărește încărcătura negativă și prin acest proces se poate modula afinitatea acestor proteine față de ADN, în cursul spermiogenezei (Lewis și Ausio, 2002).

În majoritatea cazurilor, protaminele-like sunt înrudite structural cu histona H1. Au fost identificate la tot regnul animal și, în ciuda varibilității lor foarte mari, ele îndeplinsc aceeași funcție, respectiv condensarea cromatinei (Burlibașa, 2008).

Până în prezent, structurile care iau naștere în urma interacțiunii ADN-ului cu protaminele-like sunt foarte dificil de vizualizat sau de analizat, deoarece prezintă o cromatin foarte compactată. (Lewis și Ausio, 2002).

4. ROLUL MECANISMELOR EPIGENETICE IMPLICATE ÎN REMODELAREA CROMATINEI, CU IMPLICAȚII ÎN REPRODUCEREA ASISTATĂ

Epigenetica reprezintă studiul variațiilor fenotipice, care nu sunt cauzate de modificări ale secvenței de ADN, ci de modificări dinamice, moștenite sau nu, în potențialul transcripțional al unei celule (Ledford, 2008). Schimbările de natură epigenetică în expresia genelor și în fenotipul celular, au cauze diferite față de cele genetice, care se bazează pe schimbări ale secvenței de ADN (Carey, 2011).

Exemple de mecanisme epigenetice sunt metilarea ADN-ului și modificarea histonelor, care afectează expresia genelor, fără a afecta secvența de ADN. Modificările care se produc se pot menține fie pe parcursul vieții unei celule, fie pe parcursul a câtorva generații (Bird, 2007).

4.1. Modificări ale histonelor

Histonele pot suferi o serie de modificări chimice post translaționale. Modificările cozilor histonice joacă un rol important în alterarea structurii cromatinei și a modului în care ADN-ul poate fi accesat. Efectele funționale ale acestor modificări depind de aminoacidul care este afectat.

tipurile de modificări sunt:

acetilarea resturilor de lizină;

metilarea resturilor de lizină și arginină;

fosforilarea resturilor de serină;

ubiquitinarea resturilor de lizină.

Metilarea histonelor

Metilarea histonelor este un proces care are loc la nivelul resturilor de aminoacizi bazici de tip lizină și arginină, din cozile histonelor H3 și H4 și este asociat cu activarea sau inhibarea expresiei genice. Enzimele nucleare specifice acestei modificări sunt histon metiltransferazele (metilaza III), care recunosc situs-specific resturile de arginină și lizină. Aceste enzime conțin un domeniu catalitic înalt conservat și regiunea de legare de S-adenozin-metionină. Se pare că metilarea histonelor este asociată cu starea de metilare a ADN-ului .

Metilarea histonelor are ca efecte creșterea bazicități aminoacizilor metilați, creșterea interacțiunilor dintre histone și ADN, amplificarea interacțiunilor hidrofobe dintre histone și alte tipuri de proteine precum și inducerea unor modificări sterice (Burlibașa, 2008).

Acetilarea histonelor

Procesul de acetilare a hisotnelor a reprezentat fundamentul studiilor în domeniul modificărilor histonice, fiind actualmente cea mai bine caracterizată dintre modificările histonice cunoscute. Acetilarea reprezintă o modificare epigenetică, ce constă în creșterea încărcăturii negative, care neutralizează reacția dintre capetele amino terminale ale histonelor și grupările fosfat ale ADN-ului. Această modificare are loc la nivelul resturilor de serină și lizină.

Studiile au arătat că spermatogoniile și spermatocitele preleptotenice conțin histonele miez H2A, H2B și H4 acetilate. Acestea sunt deacetilate în spermatocitele aflate în meioză și în spermatidele rotunde. Spermatidele elongate prezintă forme de histone hiperacetilate, în absența replicării ADN, forme care dispar în timpul condensării spermatidelor. (Hazzouri, 2000).

Acetilarea histonelor miez-nucleosomale modulează expresia a numeroase gene. Hiperacetilarea conduce, în general, la creșterea transcrierii genice, iar deacetilarea duce la inhibarea transcrierii. S-a demonstrat ca ADN-ul bogat în insule CpG mtilate este asociat cu histone deacetilate. (Fan și Hoffman, 2002).

Histon-acetil-transferazele sunt enzimele implicate în acetilarea histonelor. Acestea prezintă specificitate pentru resturile de lizină și multe dintre ele sunt capabile să acetileze și molecule de tip non-histonic (Burlibașa, 2008).

Histon-deacetilazele nu prezintă specificitate de substrat și sunt împărțite în trei clase, din punct de vedere structural:

clasele I și II, care sunt zinc dependente;

clasa III, care sunt NAD dependente.

Clasele I și II sunt studiate ca variante de tratament în cancere și boli neurodegenerative. Aceste enzime catalizează îndepărtarea grupărilor acetil din resturile de lizină ale proteinelor (Miller și colab, 2003).

O modificare cât de mică în modelul de acetilare al histonelor poate conduce la o împachetare necorespunzătoare a cromatinei în spermatozoizi și la infertilitate (Shamsi și colab, 2011).

Fosforilarea histonelor

Este o modificare care are loc la nivelul resturilor de serină și treonină, care are ca efect creșterea sarcinii negative a histonelor și detașarea lor de ADN. Histona H1 este cea care suferă cele mai multe fosforilări, în faz S a ciclului celular, având ca rezultat activarea transcrierii unor regiuni din genom. Donorul de grupări fosfat este ATP-ul, iar enzimele implicate în proces sunt fosfatazele și protein-kinazele.

Ubiquitinarea histonelor

Reprezintă un tip particular de modificare, la nivelul unei lizine din domeniul carboxil terminal, cu rol în reglarea transcrierii în spermatogeneză. Histona H2 ubiquitinată a fost detectată la șoarece în spermatidele elongate, iar ubiquitinarea H2A este asociată cu inhibarea transcrierii în anumite regiuni ale cromatinei (Baarends,1999).

4.2. Metilarea ADN-ului în spermatozoizi

Metilarea ADN este un proces epigenetic, caracteristic vertebratelor, plantelor cu flori și anumitor specii de fungi, însa, din păcate, este absent la multe organisme model, precum Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, sau Caenorhabditis elegans. Metilarea ADN este cu siguranță esențială în dezvoltarea vertebratelor, deoarece animalele cu deficiență de ADN metiltransferaze active mor în diferite stadii ale evoluției (Strachan și Read, 2011).

Metilarea ADN reprezintă o modificare epigenetică a resturilor de citozină din poziția 5 din insulele CpG, mecanism care alterează expresia genică. Procesul este catalizat de enzime numite ADN metiltransferaze (Trasler, 2008). S-a stabilit că metilarea ADN se află în strânsă legătură cu modificările chimice ale histonelor.

În celulele eucariote au fost identificate trei tipuri de ADN metiltransferaze: DNMT1, DNMT3A și DNMT3B. Se pare că DNMT3A și DNMT3B ar fi responsabile de metilarea de novo, pe când DNMT1 menține modelul deja stabilit de metilare (Rajender și Agarwal, 2011).

DNMT1 este ADN metiltransferaza găsită în cea mai mare cantitate în celulele mamiferelor. DNMT3A și DNMT3B modulează represia genică prin interacțiuni cu inhibitorii transcripționali (Paolini-Giacobino, 2007).

Metilarea în celulele germinale masculine este inițiată în cursul vieții intrauterine și continuă pe parcursul spermatogenezei postnatale. Metilarea resturilor de citozină și transformarea lor în 5-metil-citozină are loc la nivelul situsurilor CpG. În genomul mamiferelor, aproximativ 60-80% dintre insulele CpG sunt metilate. La om, un model alterat al metilarii ADN a fost observat la indivizii cu oligospermie (Trasler, 2008).

Dinucleotidele CpG, sunt alcătuite din citozină și guanină, legate printr-o legătură fosfodiesterică. Insulele CpG au fost definite ca fiind secvențe ADN de aproximativ 500 pb, cu un conținut de citozină și guanină de peste 55%. Acestea au fost localizate în apropierea promotorilor genelor, sugerând activitatea lor reglatoare. (Rajender și Agarwal, 2011).

Distribuția grupărilor metil poate fi studiată cu ajutorul unor enzime de resticție, MspI și Hpa II, care taie la nivelul unor situsuri țintă, ce conțin gruparea CG. Aceste enzime sunt izoschizomere și clivează aceeași secvență de ADN, însă manifestă răspunsuri diferite, în funcție de stadiul de metilare. Enzima Hpa II clivează secvențe CCGG, doar de pe o catenă ADN, însă dacă a doua citozină este metilată, enzima nu mai recunoaște situsul.

Enzima Msp I taie ADN-ul în manieră situs-specifica, indiferent de starea de metilare a acestuia. Msp I poate fi utilizată pentru identificarea tuturor secvențelor CCGG, iar Hpa II pentru a identifica dacă aceste secvențe sunt metilate sau nu. Avănd același substrat ADN nemetilat, ambele enzime vor genera aceleași benzi de restricție. În ADN-ul metilat, pozițiile modificate nu vor fi tăiate cu Hpa II și pentru fiecare asemenea poziție, un fragment mai mare va înlocui două fragmente Msp I.

Metilarea ADN inhibă expresia genică în celulele animale, modificând structura cromatinei. Modelul de metilare stabilit în embriogeneza timpurie este esențial în construirea profilului structural al genomului (Hashinshovy și colab, 2003).

Expresia genică diferită, în celule cu același genom, își are originea în diversitatea proteinelor care se leagă de ADN și modificările pe care acestea le suferă.

Mecanismele epigenetice joacă un rol extrem de important în dezvoltarea celulelor sexuale masculine, funcționalitatea lor, precum și în fertilizare și în evenimente ulterioare acestui proces.

Cele mai evidente efecte ale metilării în timpul spermatogenezei pot fi observate asupra genelor imprintate și a secvențelor repetitive. Se cunosc o serie de gene imprintate implicate în spermatogeneză și acestea reprezintă acele gene ale căror alele care se exprimă fac parte fie din genomul metern, fie din cel patern. Metilarea ADN este markerul care deosebește alelele materne de cele paterne, în genele imprintate. S-a constatat că în majoritatea cazurilor, cele două tipuri de alele parentale prezintă nivele diferite demetilare (Kelly și Trasler, 2004).

Principala consecință a metilării ADN este inhibarea transcrierii, care se poate realiza fie direct, prin blocarea legării factorilor de transcripție la insulele CpG, fie indirect, prin proteine care se leagă situs-specific de ADN-ul metilat. Au fost identificate mai multe proteine de acest fel, dintre care patru sunt implicate în inhibarea transcrierii. Aceste proteine modifică structura cromatinei, prin atașarea de histon-deacetilaze la ADN-ul metilat, rezultând astfel o structură heterocromatinică.

Efectele metilării ADN asupra genelor depind de mai mulți factori, precum: tipul de elemente reglatorii ale genelor respective, adică secvențele promotor și enhancerii, numărul de insule CpG metilate, mediul proteic al diferitelor tipuri celulare și localizarea genelor ăn cromozomi (Schubeler și colab, 2000).

BORIS (brother of regulator of imprinting sites) este un factor epigenetic exprimat în testicule, cu rol foarte important în procesele de metilare ADN din timpul spermatogenezei. BORIS se leagă de ADN, în manieră situs-specifică și modulează expresia genelor în cursul spermatogenezei, contribuind astfel la formarea de spermatozoizi maturi normali (Shamsi, 2011).

Este posibil ca reducerea nivelului de metilare, sau înlăturarea în totalitate a grupărilor metil să reprezinte modificări structurale necesare pentru desfășurarea transcrierii. Deasemenea, pentru ca transcrierea să poată fi inițiată, este necesară demetilarea promotorului. S-a constatat că unele gene au capacitatea de a se exprima, chiar și dacă sunt puternic metilate.

Orice modificare care intervine în cursul normal al procesului de metilare ADN conduce la repercusiuni dramatice asupra proceselor vitale (Burlibașa, 2008).

5. MATERIALE ȘI METODE

Tehnica de prelucrare a materialului biologic pentru microscopia electronică de transmisie

Material biologic: țesut testicular prelevat de la exemplar adult de Mus musculus.

1) Prelevarea probelor biologice. Pentru a preveni schimbările de orice natură care pot să apară la nivel tisular sau celular, este necesar ca din momentul prelevării probelor să se ia în considerare particularătățile tipului de organism, organ sau țesut supus studiului.

Se obțin rezultate bune atunci când, în paralel cu prelevarea fragmentelor de țesut, se realizează și o prefixare a materialului biologic. Țesutul se taie cu ajutorul unei lame de ras în piese mici, cubice, cu latura de aproximativ 1 mm. Această operație se efectuează în condițiile mențienrii lor într-un vas cu fixator (glutaraldehidă 4% în tampon cacodilat 0,1 M pH 7.4).

2) Fixarea materialului biologic asigură stabilizarea structurii biologice într-un mod cât mai apropiat de starea nativă, cu ajutorul unor agenți reticulanți capabili să realizeze legături încrucișate între moleculele materialului prelucrat, realizând astfel un cadru care nu permite deteriorarea arhitecturii ultrastructurale. Fixatorul utilizat este glutaraldehida 3% în tampon cacodilat 0,1 M pH 7, timp de 4 ore la rece.

3) Spălarea se realizează în tampon cacodilat de 2 ori câte 10 minute la rece, după care se lasă peste noapte la frigider, în tampon cacodilat. A doua zi se spală în același tampon de opt ori, câte 15 minute, la rece.

4) Postfixarea . Materialul biologic s-a imersat în OsO4 1%, timp de 1 și ½ ore.

În prezent, fixarea dublă cu glutaraldehidă și OsO4 este considerată ca fiind cea mai bună.

Glutaraldehida se aplică prima deoarece pătrunde mai ușor în probă și acționează mai rapid asupra structurii preparaturlui. Înainte de postfixarea cu OsO4 este foarte important să se înlăture orice urmă de glutaraldehidă, deoarece reziduurile acesteia ar putea împiedica legarea osmiului.

5) Spălarea se realizează în tampon cacodilat 0,1M de două ori câte 10 minute, ulterior în apă distilată de două ori câte 10 minute, la rece.

6) Deshidratarea s-a realizat în alcool etilic 30%, 50%, 70% X2 – 30 minute, la rece. Se lasă peste noapte în alcool 70%, la rece. A doua zi se lasă 30 minute la temperatura camerei înainte de a continua deshidratarea. Urmează băile în alcool etilic 90%, 96% de câte două ori timp de 30 minute, la temparatura camerei. În ultima baie de alcool etilic 100% se lasă 3 x 20 minute la temparatura camerei.

7) Substituția . Se substituie alcoolul cu oxid de propilen astfel:

– alcool etilic absolut/ oxid de propilen – 2/1, 1/1, 1/2 – 30 minute

– oxid de propilen – 2X 30 minute, la temperatura camerei.

8) Impregnarea

– baia I – oxid de propilen /rășină – 2/1 – 2 orela temperatura camerei;

– baia II – oxid de propilen/rășină – 1/1 – 2 ore

– baia III – oxid de propilen/rășină – ½ – 2 ore cu dopuri

– se lasă peste noapte fără dopuri, la temperatura camerei

– a doua zi probele se trec în rășină pură pentru 4 ore.

9) Includerea s-a realizat în Epon 812.

Prepararea rășinii: s-a realizat o mixtură din Epon 821, DDSA (2 dodecenyl succinic acid anhydride) și MNA (methylnadic anhydride) la care s-a adăugat un accelerator al polimerizării DMP 30.

10) Polimerizarea

– prepolimerizarea la 400C pentru 24 ore

– polimerizarea la 600C pentru 48 de ore

11) Ultrasecționarea s-a realizat la ultramicrotom LKB

12) Montarea pe grilă – s-au utilizat gile de Cu cu 200 mesh (număr de ochiuri). Grila s-a acoperit cu o peliculă de formvar (polivinil formaldehida)

13) Contrastarea s-a realizat conform metodei Reynolds cu citrat de plumb și acetat de uranil soluție apoasă 4%

14) Analiza electronomicroscopică s-a realizat cu ajutorul microscopului electronic de transmisie Philips “EM 201”.

Izolarea de ADN din țesut animal

Material biologic: testicul și ficat de Mus musculus

Soluții necesare:

Tampon de digestie NaCl- 100mM, Tris HCl- 50mM, EDTA (ethylendinitrilotetraacetic acetic)-50m, SDS 10%, pH8,0;

TE: Tris-10mM, EDTA-1mM, pH7,5;

Proteinaza K (10mg/ml);

Soluție LiCl 5M;

Cloroform;

Etanol absolut;

Etanol 70%;

Etape:

Prlevarea țesutului în etanol 70%. Probele au fost conservate la -20⁰.

Se îndepărtează etanolul, iar probele biologice sunt preluate în 300µl tampon de digestie și mojarate pe gheața pentru labilizarea membranei și pregătirea proteinelor pentru fragmentarea ulterioară cu proteinaza.

Se adaugă proteinaza K 3µl (10mg/ml). Se incubează 2h la 50⁰C, apoi peste noapte la 37⁰C.

După ce digestia este completă, un volum egal de LiCl 5M (agent de precipitare a proteinelor) se adaugă in fiecare tub. Probele se amestecă prin inversare timp de 1 minut.

Se adaugă 600µl cloroform și probele se amestecă cu grijă timp de 1 minut.

Se centrifughează tuburile cu probele timp de 30 de minute, la 12000 rpm.

Se preia supernatantul în alte tuburi Eppendorf. Aceste ultime 2 etape se repetă de 3 ori.

Se vor adăuga 2 volume de alcool absolut la temperatura camerei și se inversează tuburile de câteva ori cu grijă, pâna la prcipitarea ADN-ului.

Centrifugare la 8000 rpm timp de 10 minute și ADN-ul sedimentat se spală în etanol 70%.

Excesul de alcool se aruncă și probele sunt lăsate să se usuce la aer timp de 10 minute.

ADN-ul se va resuspenda în 100- 200µl de apă distilată sterilă și se pastrează la 4⁰C.

Purificare ADN izolat

Soluții necesare:

RN-ază concentație stoc 10mg/ml, adusă la concetrație finală 100µg/ml;

Fenol/ Cloroform-50/50;

Etanol 95%;

Etanol 70%;

SDS (sodiun dodecyl sulfate) 10%;

Etape de lucru:

Se adaugă 10% SDS, astfel încat concetrația finală să fie 0,5%. Se incubează pentru 10 minute la 50⁰C.

Se adaugă RNaza A la o concetrație de 100µg/ml, se incubează la 37⁰C timp de 30 de minute.

Se adaugă 10mM EDTA, se incubează 10 minute la 50⁰C.

Se realizează extracția cu fenol:cloroform 50:50, de 3 ori.

Se preia faza apoasă, se adaugă 2 volume EtOH 95%, se inversează tubul de câteva ori până când ADN-ul precipită.

ADN-ul este resuspendat prin centrifugare.

Supernatantul este îndepărtat, iar ADN-ul este spălat cu etanol 70%.

Se îndepărtează etanolul, iar probele se resuspendă în apă distilată sterilă și se păstrează la 4⁰C.

Restricția ADN cu endonucleaze de restricție izoschizomere Msp I și Hpa II

La 10 µg ADN purificat in 10 µl apă distilată sterilă, se adaugă endonucleazele de restricție Msp I, respectiv Hpa II, buffer, BSA (concentrație stoc de 5mg/ml) și apă distilată sterilă, până la un volum final de 40µl. Se lasa peste noapte la termostat, la 370C.

Fracționarea electroforetică a fragmentelor de restricție: electroforeza în gel de agaroză

Etapele de preparare a unui gel de agaroză 2% de dimensiune 15 X 20 cm.

1. Se amestecă 2g agaroză în 100 ml tampon TBE (Tris, acid boric, EDTA) într-un vas Ehrelmeyer de 500 ml.

2. Se acoperă vasul cu o folie de aluminiu și se topește agaroza pe o plită, agitând ocazional.

3. Se pregătește cuva și se toarnă agaroza (în care s-au adăugat 1-2 µl bromură de etidium) răcită în prealabil la 50-600C.

4. Se inseră pieptenele și se lasă gelul să se răcească timp de 30-60 min.

5. Se îndepărtează pieptenele și banda adezivă de pe cuvă, se plasează cuva cu gel în tancul de electroforeză cu 1 X TBE, astfel încât tamponul să acopere complet gelul. Soluția 10 X TBE conține: 1M Tris Borate pH=8.3 și 20mM EDTA.

6. Se introduc probele (10 µl) în godeuri (se amestecă 7 µl probă cu 3 µl bromfenol).

7. Se conectează la 40 V și se lasă peste noapte.

8. Se scoate gelul cu grijă din tancul de electroforeză, se vizualizează în UV și se fotografiază.

Analiza proteinelor sperm-specifice (SNBP)

Izolarea proteinelor sperm-specifice SNBP (sperm nuclear basic proteins) din țesut testicular

Material biologic: testicule înghețate la -800C de Mus musculus.

Soluții necesare:

Tampon de omogenizare 1: 0,15 NaCl

10 mM Tris-HCl

0,2mM PMSF

Tampon de omogenizare 2: 0,15 NaCl

10 mM Tris-HCl

0,2mM PMSF

0,5% Triton X-100

HCl – 0,4N

Acetonă

Apă bidistilată sterilă (ABS)

Etape de lucru:

Testiculele și țesutul epididimar înghețate la –80oC de la un singur animal au fost resuspendate și omogenizate în aproximativ 0,5 ml tampon de omogenizare

Omogenatul a fost centrifugat la 16.000g la 4oC pentru 10 min.

Sedimentul a fost resuspendat în același tampon.

Suspensia celulară a fost centrifugată în gradient de BSA (1-4%) după metoda descrisă de Bellve și colab., 1993 pentru separarea spermatozoizilor și a spermatidelor de restul celulelor spermatogenice și de celulele hranitoare ale țesutului testicular. Fracțiile obținute au fost verificate la microscopul cu fluorescență, prin colorare cu bromura de etidium.

Fracția ce conținea spermatidele elongate și spermatozoizii a fost resuspendată în tamponul de omogenizare, care conține în plus 0,5% TritonX100. A fost omogenizată și centrifugată la 16.000g la 4oC.

Sedimentul final a fost resuspendat în aptoximativ 0,8 ml 0,4N HCl.

Extractul acid a fost centrifugat la 16.000 rpm pentru 10 minute.

Supernatantul astfel obținut a fost apoi precipitat cu 5 volume de acetonă pentru 1-2 ore la –20oC.

Tuburile au fost din nou centrifugate la fel ca în etapa precedentă, iar sedimentul a fost lăsat să se usuce.

După uscare sedimentul a fost resuspendat în apa bidistilată sterilă.

Electroforeza SDS-PAGE (Laemmli system)

În cazul electroforezei SDS-PAGE , separarea si migrarea proteinelor este determinata de greutatea moleculara a fiecărei polipeptide și nu de sarcina electrică. SDS (sodium dodecylsulfate) este un detergent anionic ce denaturează proteinele. În același timp, acesta conferă proteinelor o sarcină netă negativă, proporțională cu lungimea peptidei. Prin tratarea cu SDS și un agent reducător, polipeptidele devin particule încărcate negativ, cu aceeași densitate a sarcinii (sarcină/unitate de lungime).

Principala aplicație a acestui sistem este determinarea masei moleculare a polipeptidelor. Acest lucru se realizează prin supunerea la electroforeză a unor proteine standard, cu masă moleculară cunoscută, în paralel cu polipeptidele de caracterizat (cu masă moleculară necunoscută).

Există o relație liniară între log10M (M= masa moleculară) a unei polipeptide și Rr (mobilitatea relativă). Prin determinarea Rr (distanța de la start la polipeptidă/distanța până la frontul de migrare), utilizând o curbă etalon (construită pe baza valorilor Rr și log10M ale proteinelor cunoscute-markerii moleculari), se poate determina valoarea log10M a polipeptidei necunoscute și, de aici, masa ei moleculară.

Soluții stoc

Soluția monomer (30,8%C, 2,7%Cbis)

60g acrilamidă

1,6 g bisacrilamidă

H2O bidistilata (ABD) până la 200 ml

4X running gel buffer

1,5M Tris-Cl, pH 8.8

4X staking gel buffer

0,5M Tris-Cl, pH 6.8

10% SDS

10% Ammonium persulfat (inițiator) – se utilizează întotdeauna proaspăt, nu se stochează

2X Treatment buffer (0,125M Tris-Cl, 4% SDS, 20% v/v gycerol, 0,2 M DTT, 0,02% Bromophenol Blue, pH 6.8)

Tank Buffer (0,025 M Tris, 0, 192 M Glycine, 0,1% SDS, pH8,3)

Running gel (30 ml, grosime 0,75 mm) , 12,5%

Soluție monomer – 12,5 ml

4X running gel buffer – 7,5 ml

10% SDS – 0,3 ml

ABD – 9,6 ml

10% ammonium persulfat (APS) – 150 l

TEMED – 10 l

Stacking gel (4% acrilamidă, grosime 0,75 mm – pentru 2 geluri)

Soluție monomer – 1,33 ml

4X stacking gel buffer – 2,5 ml

10% SDS – 0,1 ml

ABD – 6 ml

10% APS – 50 l

TEMED – 5l

Colorarea și decolorarea gelului

Soluția de colorare

0,025% Coomassie Brilliant blue R250

40% metanol

7% acid acetic

Soluția de decolorare

40% metanol

7% acid acetic

6. REZULTATE ȘI DISCUȚII

Trichostatin-A (TSA) este un antibiotic antifungic, produs de specia Streptomyces hygroscopicus și reprezintă un puternic inhibitor al histon-deacetilazelor. Histon-deacetilazele sunt supraexprimate în mai multe tipuri de cancere și se află în strânsă legătură cu factorii oncogeni. TSA are o greutate moleculară de 302.37 KDa și formula chimică C17H22N2O3. (Tsuji N., și colab., 1976).

Starea de acetilare a histonelor-miez este reglată de doua tipuri de enzime: histon-acetil-transferazele și histon-deacetilazele. Inhibitorii de tipul Trichostatin-A pot interveni în desfășurarea ciclului celular, prin stimularea transcrierii genelor care reglează negativ creșterea și supraviețuirea celulară. Deocamdată însă, se cunosc destul de puține lucruri despre efectele inhibitorilor histon-deacetilazelor, asupra spermatogenezei.

Au fost efectuate mai multe experimente pe indivizi aparținând genului Mus, pentru a se încerca înțelegerea acestor procese care au loc în cursul spermatogenezei.

Tratamentul cu TSA aplicat pe celule murine cultivate în laborator a arătat o creștere a acetilării histonei-miez H4 în spermatidele rotunde, sugerând este necesar ca acestea sa se afle într-o stare hipoacetilată, pentru a se putea diferenția normal.

Spermatogoniile sunt recunoscute ca fiind celulele active mitotic ale liniei germinale masculine, din epiteliul seminifer. În acest studiu nu a fost detectată nicio descreștere a activității proliferative a acestor celule, sau o creștere a activității apoptotice în celulele tratate cu TSA. Prin urmare, se înțelege că TSA administrat in vivo, exact în condițiile din acest experiment, nu are un efect semnificativ asupra mitozei celulelor germinale mascule.

În schimb, efectele asupra meiozei sunt vizibile, iar spermatocitele care nu sunt capabile sa incheie cu succes procesul de meioză sunt eliminate prin apoptoză. Deoarece numărul de spermatocite aflate în pachiten și diploten a rămas relativ constant, se pare ca TSA nu a afectat evoluția metafazelor în cadrul meiozei, ci a acționat in timpul profazei.

Deasemenea, în urma injectării subcutanate cu TSA, s-a constatat o scădere în greutatea medie a testicululelor, datorată spermatogenezei insuficiente. Această scădere în greutate a testiculelor este direct dependentă de doza de TSA utilizată.

Nu au fost detectate efecte toxice majore ale tratamentului cu TSA. Șoarecii masculi supuși acestui tip de tratament au devenit infertili, însă într-o manieră complet reversibilă. Nu s-au descoperit urme de hiperacetilare a histonei H4 în spermatidele rotunde, iar numărul spermatidelor a scăzut semnificativ, odată cu creșterea concentrației de TSA. S-a observat și o pierdere masivă a spermatocitelor aflate în pachiten și diploten, din cauza apoptozei.

Celelalte organe de reproducere nu au manifestat niciun fel de modificări morfologice, ducând astfel la concluzia că acțiunea TSA asupra testiculului nu a fost mediată de hormonii de sex. Rezultatele acestui experiment recomandă utilizarea TSA ca și anticoncepțional masculin, cu acțiune reversibilă asupra fertilității masculine și fără efecte toxice asupra altor tipuri de celule sau organe. (Irina Fenic și colab., 2004).

S-a observat că TSA este activ la concentrații nanomolare și produce acumulări ale histonelor hiperacetilate, în celulele mamaliene. Această substanță inhibă activitatea histon-deacetilazelor, conducând la intensificarea acetilării histonelor. Acetilarea histonelor duce la creșterea expresiei anumitor gene implicate în modificări celulare morfologice și metabolice, cum ar fi oprirea creșterii, diferențierea sau apoptoza. În cadrul experimentelor efectuate de cercetători, s-a constatat ca TSA induce apoptoza în multe tipuri de celule canceroase, în timp ce prezintă un nivel foarte scăzut de toxicitate pentru celulele normale (Yoshida M., și colab., 1990).

Hazzouri și colaboratorii săi au realizat un experiment pe celule ale liniei germinale de șoarece, tratându-le cu TSA. Datele din literatură arată că, în cursul spermatogenezei la șoarece, spermatogoniile și spermatocitele preleptotenice conțin histonele-miez H2A, H2B și H4, în stare acetilată. În schimb, nu au fost observate histone acetilate pe parcursul meiozei, în spermatocitele aflate în leptoten și pachiten. Deasemenea și majoritatea spermatidelor rotunde prezintă tot histone neacetilate. În continuare, în spermatidele elongate, apar din nou forme acetilate ale histonelor H2B, H3 și H4 și dispar iarăși în spermatidele elongate.

Pentru a înțelege mecanismele implicate în hiperacetilarea histonelor în timpul spermatogenezei, celulele liniei germinale au fost tratate cu inhibitorul histon-deacetilazelor, TSA.

S-a constatat o creștere spectaculoasă a acetilarii histonelor în spermatidele rotunde, ceea ce înseamnă ca histon-deacetilazele sunt responsabile de menținerea histonelor într-o stare neacetilată, in interiorul acestor celule. Tratamentul cu TSA nu a putut induce acetilarea histonelor în spermatidele condensate, conducând la concluzia ca histonele-miez acetilate sunt direct înlocuite de către proteinele de tranziție, fără a suferi inițial un proces de deacetilare. Prin urmare, reglarea activității și concentrației histon-deacetilazelor joacă un rol extrem de important în controlul hiperacetilării și chiar a înlocuirii histonelor în cursul spermiogenezei. (Hazzouri M., și colab., 2000).

În momentul de față, mecanismele implicate în hiperacetilarea histonelor în cursul spermatogenezei nu sunt pe deplin elucidate, diferite echipe de cercetători putând ajunge la rezultate diferite, sau chiar contradictorii.

Experimentul meu se concentrează pe cercetarea acetilării și deacetilării histonelor și importanța acestui proces în remodelarea cromatinei, în cadrul spermatogenezei murine. Există o strânsă legătură între acetilare-deacetilare și metilarea ADN. În cadrul acestui studiu am efectuat tratamente in vivo cu TSA asupra celulelor aparținând liniei germinale mascule, stdiind efectele sale asupra spermatogenezei la specia Mus musculus. Toate tehnicile utilizate în cursul experimentului, precum analiza electonomicroscopică a țesutului testicular și restricția ADN-ului genomic cu enzimele izoschizomere Msp I și Hpa II, au avut ca obiectiv principal evidențierea rolului jucat de stadiul de acetilare al histonelor și de metilarea ADN în remodelarea cromatinei.

Materialul biologic a fost reprezentat de indivizi masculi, adulți, din specia Mus musculus.

Tratamentul propriu-zis, realizat in vivo, constă în injectarea animalului, intraperitoneal, cu TSA 100UI/10 g greutate corporală. Animalul este sacrificat dupa 3 zile. Studiul a fost realizat prin comparație cu un martor, reprezentat de un mascul sănătos, adult, de Mus musculus.

Analiza electronomicroscopică a organizării materialului genetic în cursul spermatogenezei, a evidențiat o serie de etape succesive, derulate în timpul transformărilor din spermatogonii în spermatozoizi. Sunt evidențiate atât elementele nucleare, cât și componentele citoplasmatice și elementele de structură fină.

Gradul de condensare al cromatinei în spermatide și în special în spermatozoizi, este maximul cunoscut în lumea vie și implică, de fapt, un proces de adaptare, pentru a îndeplini funcția de transportor de material genetic pe care o au spermatozoizii, la toate viețuitoarele cu reproducere sexuată.

În timpul spermatogenezei, cromatina din celulele stem este într-o permanentă dinamică și suferă o serie de modificări de structură, compoziția sa în proteine cromozomale fiind complet diferită în stadiile finale ale spermatogenezei, față de cea din stadiile inițiale. Toate aceste modificări dramatice conduc la un grad înalt de compactare și la blocarea completă a expresiei genice în spermatozoizi. Compactarea cromatinei și înlocuirea histonelor cu proteine de tranziție și apoi cu protamine se realizează treptat, procesele putând fi observate la microscopul electronic.

Încă nu se cunosc motivele înlocuirii histonelor-miez cu proteine nucleare spermatice, cu o structură foarte bazică, însă una dintre teorii ar fi că este astfel posibilă generarea unui spermatozoid cu o formă a capului hidrodinamică, cu scopul de a tranzita foarte rapid tractul reproducător femel și de a traversa mai ușor zona pelucida din jurul ovulului. Se știe totuși cu certitudine că această structură cromatinică rezultată din complexarea ADN cu proteinele sperm-specifice are rol de protecție a materialului genetic aflat în capul spermatozoidului, împotriva factorilor fizici și chimici.

În cadrul, în urma analizei electronomicroscopice a probelor obținute din țesutul testicular al martorului, am constatat prezența unor structuri normale, specifice fiecărui stadiu de dezvoltare, începând de la spermatogonie, până la spermatozoizi (Fig. 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12).

Finalizarea cu succes a meiozei la mamifere se află în strânsă legătură cu formarea complexelor sinaptonemale, structuri tripartite care leagă cromozomii omologi în timpul profazei I. Un complex sinaptonemal este alcătuit dintr-un element central și două elemente laterale, paralele. Complexul sinaptonemal este o structură de tip fermoar, în care elementele laterale sunt legate prin filamente transversale (Fig. 8).

Elementul central este format din mai multe tipuri de proteine, precum STAG3, SMC1α, SMC1β, SMC3 și REC8, iar elementele laterale conțin molecule de SYCP2 și SYCP3. Filamentele transversale sunt alcătuite din molecule SYCP1. Nu se cunoaște însă întreaga structură a complexului sinaptonemal și niciuna dintre proteinele descrise până în prezent nu are localizare strictă în elementul central. Se pare că zonele electrono-dense observate în elementul central se datorează aranjării capetelor amino-terminale ale dimerilor de SYCP1, care interacționează, formând o rețea de dimeri.

S-a observat că mutațiile componentelor complexului sinaptonemal conduc la oprirea meiozei, sau la anauploidii. La om, au fost raportate cazuri de infertilitate masculină, din cauza unor mutații în gena care codifică pentru proteina SYCP3. La acești pacienți, spermatogeneza a fost întreruptă în timpul meiozei timpurii, prezentând alterări majore în citoarhitectura tubilor seminiferi (Costa Y., și colab., 2005).

În cazul probelor provenite de la martor, se pot studia toate stadiile de dezvoltare caracteristice spermatogenezei, inclusiv stadiul final, de spermatozoid. Spermatozoizii sunt alcătuiți din:

cap, cu acrozom și nucleu;

piesă intermediară, unde sunt localizate mitocondriile, care conferă spermatozoidului energia necesară deplasării;

flagel, cu o structură de microtubuli, în format 9+2.

La microscopul electronic de transmisie se poate observa prezența structurilor flagelare, în secțiune transversală, cu această organizare specifică (Fig. 13).

Fig.6 – Imaginea electonomicroscopică a unei spermatogonii aparținând țesutului testicular de la martor. Se observă structuri normale, cu o cromatină cu aspect normal.

Fig. 7 – Imaginea electronomicroscopică a unui nucleu de spermatocit primar, provenit din țesut testicular martor. romatina sub un aspect normal, cu zone electrono-clare (cromatină activă din punct de vedere funcțional), ce alternează cu zone electrono-dense (reprezentate de heterocromatină, inactivă din punct de vedere funcțional). Se pot observa deasemenea mitocondrii.

Fig. 8 – Imaginea electronomicroscopică a unui complex sinaptonemal, în detaliu. Structura provine din țesut testicular de la martor.

Fig. 9- Imaginea electronomicroscopică a unor spermatocite secundare, provenite din țesutul testicular de la martor. Se pot observa cei doi nuclei, cu aspect normal. Deasemenea, cromatina se prezintă sub o fromă normală pentru acest stadiu de dezvoltare, fiind relativ uniform distribuită în nucleii spermatocitelor secundare.

Fig. 10- Imaginea electronomicroscopică a unei spermatide rotunde, aparținând probei martor. Se observă przența structurilor caracteristice acestui stadiu de dezvoltare, precum și distribuția uniformă a cromatinei în nucleu. La polul anterior se poate identifica prezența structurilor acrozomale, aflate în formare.

Fig. 11- Imaginea electronomicroscopică a unor spermatide în curs de elongare, provenite din țesut testicular prelevat de la martor. Se constată puternica compactare a cromatinei, evidențiată prin electrono-densitatea materialului. La olul anterior se constată prezența structuri acrozomale.

Fig. 12 – Imaginea electronomicroscopică a unei spermatide elongate, provenite din țesut testicular martor. Se observă cromatina înalt compactată, evidențiată prin zonele electrono-dense ale materialului. Deasemenea, se observă în imagine, prezența axonemei, în aparatul flagelar.

Numeroase celule eucariote prezintă prelungiri filiforme, de tip cili sau flageli, a căror organizare internă constă într-o structură de citoschelet, numită axonemă. Axonema are rol de a susține arhitectura flagelilor și, în unele cazuri, de a le permite îndoirea. Axonema unui flagel mobil este compusă din mai mulți microtubuli, așezați după un model caracteristic: o pereche de microtubuli centrali, înconjurați de alte nouă dublete de microtubuli, care formează un inel (această organizare este denumită axonemă de tip 9+2).

Fiecare dublet este format din microtubuli de tip A și B: cei de tip A sunt microtubuli compleți, cu 13 protofilamente, iar cei de tip B conțin doar 10 protofilamente. Microtubulii cuprinși în axonemă sunt încomjurați de membrana plasmatică. Indiferent de specia căreia îi aparține, axonema are un diametru de aproximativ 0.25 μm, însă lungimea sa variază foarte mult, de la câțiva micron, la mai mult de 2 mm.

Axonema se comportă ca un schelet pe care se împachetează numeroase complexe proteice și oferă situsuri de legare pentru proteine motorii, de tip kinezina II, care ajută la transportul proteinelor de-a lungul microtubulilor (Lodish , Zipursky, și colab).

Fig. 13 – Imaginea electronomicroscopică a unor flageli de spermatozoizi, în secțiune transversală. Spermatozoizii provin din țesutul testicular recoltat de la martor. Se poate observa aspectul normal pentru acest stadiu de dezvoltare, cu organizarea axonemei sub forma de microtubuli, pe modelul specific, 9+2.

Analiza electronomicroscopică a țesutului testicular de Mus musculus, injectat intraperitoneal cu TSA nu a evidențiat modificări majore în organizarea cromatinei, până în stadiul de spermatidă elongată (Fig. 14, 15, 16, 17).

La trecerea de la spermatida rotundă spre spermatidă elongată, apar însă perturbări vizibile, manifestate printr-o compactare inegală și defectuoasă a cromatinei. Tratamentul cu TSA a inhibat acțiunea histon-deacetilazelor, având ca rezultat faptul că histonele au rămas hiperacetilate și au fost astfel perturbate mecanismele epigenetice implicate în înlocuirea histonelor de către proteinele de tranziție și, ulterior, de către protamine.

constatat totodată, prezența unui număr foarte scăzut de spermatide și nu spermatozoizi maturi

Fig. 14 – Imaginea electronomicroscopică a unei spermatogonii provenite de la șoarecele injectat cu TSA. Se observă aspectul normal pentru acest stadiu de dezvoltare,. Se observă prezența nucleolului, a mitocondriilor și a celulelor hrănitoare Sertoli.

Fig. 15 – Imaginea electronomicroscopică a unui spermatocit primar, provenit de la șoarecele cu TSA. Se observă aspectul normal, caracteristic stadiului, cu cromatină normală, evidențiată sub forma unor zone electrono-clare (cromatină activă), ce alternează cu zone electron-dense (cromatină inactivă).

Fig. 16 – Imaginea elctronomicroscopică a unor spermatocite secundare, provenite din țesutul recoltat de la șoarecele tratat cu TSA. Aspectul este normal pentru acest stadiu, cromatina este disbuită uniform în nucleu, prezintă nucleol, iar spre polul anterior se constată inițierea formării structurilor acrozomale.

Fig. 17 – Imaginea elctronomicroscopică a unei spermatide rotunde, provenite de la șoarecele tratat cu TSA. Aspectul este în continuare normal, se observă structurile acrozomale și prezența unor mitocondrii normale.

Fig. 18 – Imaginea electronomicroscopică a unei spermatide în curs de elongare, provenită de la șoarecele tratat cu TSA. Se observă o compactare inegală și defectuoasă a cromatinei. Nu există axonemă, iar spermatidele sunt, deoarece intră într-un process de apoptoză, determinat de tratamentul cu TSA. Nu am observant deloc spermtozoizi maturi.

Proteinele nucleare bazice sperm-specifice ( Sperm Nuclear Basic Proteins – SNBP) care se leagă de ADN, prezintă o foarte mare diversitate, comparativ cu histonele nucleosomale, bine conservate în evoluție. Studiile de compoziție chimică au relevat nivelul ridicat de heterogenitate structurală a acestor proteine, în comparație cu variabilitatea scăzută a histonelor din celulele somatice.

Așa cum am, proteinele nucleare bazice sperm-specifice pot fi grupate în trei categorii:

histone

protamine

protamine-like

Identificarea SNBP la șoarece s-a realizat pe baza a procese:

1. solubilitatea proteinelor în acid;

2. fracționarea electroforetică SDS-PAGE;

Proteinele bazice, respectiv histonele și protaminele pot fi ușor extrase cu acid clorhidric 0,4 N.

În forma lor nativă, proteinele se pliază într-o mare varietate de forme, unele compacte, altele elongate. Rata de migrare a proteinelor într-un mediu asemănător unei rețele este în principal consecința felului în care acestea sunt îmachetate și a greutății lor moleculare. Denaturarea proteinelor anulează efectele pe care structura o are asupra mobilității lor și pemite separarea acestora pe baza unui raport între sarcina electrică și greutatea moleculară. Se pot analiza astfel și complexe proteice de dimensiuni mari, prin separarea lor în subunități.

Agentul denaturant cel mai des utilizat este sodium dodecyl sulfatul (SDS), un surfactant amfipatic.

Surfactanții sunt compuși organici cu structură nesimetrică constituiți din:

– una sau mai multe grupări polare, ionizabile sau neionizabile, cu caracter hidrofil;

– una sau mai multe grupări nepolare sau slab polare de natură hidrocarbonată, fluocarbonată sau siliconică, care conferă caracter hidrofob.

Substanțele tensioactive au proprietatea de a modifica la concentrații mici proprietățile superficiale ale lichidelor în care se dizolvă și se mai numesc și substante amfifile sau amfipatice. Aceasta structura amfifilă sau amfipatică determină proprietățile surfactanților, depinzând astfel de natura grupelor hidrofobe și hidrofile.

SDS denaturează proteinele legându-se de lanțul proteic și învelindu-l cu molecule surfactante. Grupările polare ale SDS reprezintă un alt avantaj în utilizarea acestui compus denaturant. Proteinele solubilizate în SDS se leagă uniform de detergent, pe toată lungimea lor, la un raport de 1,4 g SDS/g proteină, creându-se astfel un raport între sarcina electrică și greutatea moleculară, care este specific fiecărei proteine.

Prin urmare, separarea proteinelor în gel de poliacrilamidă, sub acțiunea SDS, se realizează numai în funcție de masa lor.

Electroforeza PAGE în gel de poliacrilamidă 15% a proteinelor nucleare bazice sperm-specifice, extrase din țesut testicular de șoarece normal, utilizat ca martor și din țesut testicular provenit de la șoarece injectat intraperitoneal cu TSA 100UI (din soluția stoc 10 µg/ml), a arătat importanța modificărilor chimice ale histonelor, în procesul de înlocuire a acestora cu proteine de tranziție și apoi cu protamine.

Țesutul martor: proteinele au fost extrase doar din spermatide și spermatozoizi, conform protocolului descris la capitolul. S-a constatat prezența celor două tipuri de protamine cu mobilități electroforetice mari, prezența histonelor H3 și H4 și prezența unei proteine de tranziție cu greutate moleculară mare, asemănătoare histonei H1.

În cazul tratamentului cu TSA se observă lipsa protaminelor și, prezența în plus față de martor, a histonelor H2A și H2B.

Rezultatele obținute în cadrul studiului sunt în concordanță cu cele efectuate de Steger și colab în 2005 și de Hazzouri și colab în 2000, cu privire la efectele asupra spermatogenezei murine ale tratamentului cu TSA, experimente care au demostrat că histonelemiez rămân hipoacetilate în spermatidele în curs de elongare.

efectele la nivel molecular pe care le au asupra ADN acetilările și deacetilările histonelor, prin analiza electroforetică a ADN-ului restrictat cu enzimele de restricție izoschizomere, Msp I și Hpa II. Electoforeza a pus în evidență o demetilare globală a ADN-ului provenit din țesutul testicular recoltat de la șoarecele injectat cu TSA. Această observație demonstrează legătura strânsă dintre modificările chimice ale histonelor și fluctuațiile în gradul de metilare al ADN-ului. (Burlibașa L., Gavrilă L., 2005).

TSA inhibă acțiunea histon-deacetilazelor, conducând la o hiperacetilare a histonelor din cromatina spermatozoidului, condiție care împiedică probabil înlocuirea ulterioară a histonelor de către proteinele sperm-specifice.

Pentru moment, nu se poate explica încă relația de cauzalitate dintre acetilarea-deacetilarea histonelor și gradul de metilare ADN. S-a emis ipoteza conform căreia histon-deacetilazele ar interacționa cu proteinele care se leagă la grupările metil (Burlibașa L., Gavrilă L., 2005).

În cursul spermatogenezei, factorii de transcriere joacă un rol esențial în reglarea expresiei genelor care controlează procesul de maturare al celulelor germinale masculine.

Wei Yan și colaboratorii săi au efectuat recent un studiu asupra ZMYND15, care acționează ca un represor transcripțional dependent de histon-deacetilaze și controlează expresia genelor în celulele haploide, în cursul spermatogenezei. S-a constatat că inactivarea ZMYND15 conduce la activarea prematură a transcrierii a numeroase gene haploide foare importante, cum ar fi Prm1, Tnp 1, Spem1, Catpser 3, precum și la reducerea semnificativă a numărului de spermatide elongate și, în final, la infertilitate masculină. Se pare că ZMYND15 reprezintă primul represor transcripțional identificat, care joacă un rol fundamental în producerea spermei și fertilitatea masculină.

Meioza în celulele germinale se desfășoară în mod unic, iar spermiogeneza este unică în dezvoltarea celulelor germinale masculine, aceste procese necesitând un număr ridicat de gene care să acționeze în acest sens. Se explică astfel de ce aproximativ 10% din totalul genelor care codifică pentru proteine sunt implicate în reglarea spermatogenezei; deasemenea, spermiogeneza implică cel puțin 500 de gene specific testiculare. Cea mai intensă transcriere are loc la trecerea dintre spermatocitul secundar, către spermatida rotundă. În acest punct, transcripții sunt stabilizați și depozitați până când etapele ulterioare ale spermatogenezei vor necesita proteinele codificate de aceștia.

ZMYND15 se comportă ca și inhibitor al transcrierii, în timpul recrutării histon-deacetilazelor, iar inactivarea sa în studiul realizat pe șoarece a condus la o întrerupere a spermatogenezei târzii, cauzând azoospermie și infertilitate masculină (Wei Yan și colab., 2010).

TSA-ul, inhibitor al histon-deacetilazelor, determină hipometilarea citozinei din anumite secvențe specifice.

Pierderea metilării ADN poate fi în legătură cu activitatea transcripțională, dar există și varianta conform căreia sunt activate ADN demetilazele. Inhibarea histon-deacetilazelor nu are ca rezultat o pierdere totală a metilării ADN.

Această pierdere a metilării ADN poate fi urmarea hiperacetilării histonelor, efect indus de TSA. Este posibil ca hiperacetilarea histonelor sa determine transcrierea anumitor gene responsabile de inhibarea metilării ADN.

O altă posibilitate ar fi aceea că acetilarea are un control direct asupra metilării ADN, însă nu sunt înțelese pe delin relațiile dintre aceste două procese.

În continuare, vor fi necesare numeroase studii în domeniu, care să ofere noi perspective asupra acestor legături foarte complexe dintre hiperacetilarea histonelor, metilarea ADN, organizarea cromatinei și nivelul de expresie genică.

7. CONCLUZII ȘI PERSPECTIVE

Spermatogeneza este un proces de dezvoltare complex, care are ca scop final producerea celulelor responabile de transmiterea genomului patern. Având în vedere faptul că tot mai multe cupluri se confruntă cu probleme de infertilitate, este vital să cunoaștem și să reușim să înțelegem procesele care au loc în cursul spermatogenezei, pentru a reuși sa dezvoltăm metode de diagnostic mai eficiente și soluții de tratament performante.

Deși etapele spermatogenezei sunt foarte bine descrise la nivel celular, mecanismele biologice care reglează acest proces nu sunt pe deplin înțelese. Pentru a înțelege mai bine evenimentele care au loc pe parcursul spermatogenezei, trebuie sa descoperim toate genele care sunt implicate în acest proces, rolul pe care îl joacă și mecanismele prin care sunt reglate.

În acest sens, o soluție de viitor este reprezentată de abordarea problemei din perspectivă proteomică, deoarece aceste tehnologii ne pot oferi instrumente utile în studiul corelației dintre ARN și expresia proteinelor, care este mai slabă în testicul decât în orice alt tip de țesut. Multe dintre studiile efectuate în acest sens utilizează ca model șoarecele sau șobolanul, cu toate că nu se cunoaște cu exactitate gradul de conservare al proteomului testicular între aceste specii.

Totuși, multe dintre genele implicate în spermatogeneză prezintă omologi la alte specii și, în rândul mamiferelor, acestea au fost bine conservate în evoluție. (Graham MacLeod, Susanah Varmuza, 2013).

Toate modificările morfologice care se produc în timpul spermatogenezei mamiferelor și în special a rozătoarelor, precum diferențierea celulară, mitoza, meioza, spermiogeneza, au fost studiate intens între anii 1950-1980, însă mecanismele de reglare a acestor procese, precum și mecanismele biochimice și moleculare care stau la baza acestor evenimente, au rămas neclare.

În cadrul, analiza electronomicroscopică a țesutului testicular prelevat de la șoarecele injectat intraperitoneal cu TSA a evidențiat o compactare inegală și defectuoasă a cromatinei în stadiile de spermatidă în curs de elongare. Am constatat spermatide a fost foarte scăzut. Spermatidele în curs de elongare au parcurs un proces de apoptoză, determinat de tratamentul cu TSA, care explică numărul lor redus. Nu spermtozoizi maturi.

Electroforeza PAGE în gel de poliacrilamidă a proteinelor nucleare sperm-specifice, extrase atât din probele provenite de la martor, cât și din probele provenite de la șorecele tratat cu TSA, au pus în evidență importanța modificărilor chimice prin care trec histonele în cursul spermatogenezei, cum ar fi acetilarea și deacetilarea, precum și metilarea ADN. La probele prelevate de la martor, am constatat prezența celor două tipuri de protamine cu mobilități electroforetice mari, prezența histonelor H3 și H4, precum și prezența unei proteine de tranziție, cu greutate moleculară mare, asemănătoare cu histone H1. În cazul tratamentulul cu TSA, se poate observa lipsa protaminelor și prezența, în plus față de martor, a histonelor H2A și H2B. Am constatat, deasemenea, scăderea numărului de spermatide elongate, precum și spermatozoizilor.

Hiperacetilarea histonei H4 poate avea un rol în asamblarea cromatinei în celulele premeiotice și în înlocuirea histonelor cu proteine de tranziție și ulterior, cu protamine.

Analiza electoforezei AD, clivat cu enzimele de restricție izoschizomere, Msp I și Hpa II, arată o demetilare aproape totală a ADN-ului provenit de la șoarecele injectat cu TSA, fapt care demonstrează legătura importantă dintre modificările chimice ale histonelor, de tip acetilare-deacetilare și variațiile în gradul de metilare al ADN.

În urma acestui experiment, reiese clar importanța histon-deacetilazelor în realizarea unei spermatogeneze normale, iar modificările în nivelul de acetilare al histonelor, determină întreruperea meiozei. astfel, importanța realizării unor studii țintite pe corelația mai multor procese care au loc în cursul spermatogenezei, întrucât.

În ultimii ani, impactul substanțelor toxice din mediu asupra spermatogenezei a devenit unul dintre principalele subiecte de cercetare. Însă, în continuare ne lipsesc foarte multe informații, care să creeze conexiuni între și, în lipsa acestor informații este foarte dificil sa se dezvolte noi metode contaceptive sau medicamente care să aibă ca țintă celulele germinale (ChengMruk, 2010).

Bibliografie:

Angela V. Klaus, John R. McCarrey, Andrew Farkas, W. Steven Ward, 2001. Embryogenesis in the Syrian Golden Hamster. Biology of Reproduction, 64, 1297-1306.

Ariane Paolini-Giacobino, 2007. Epigenetics in Reproductive Medicine. Pedriatic Research, vol 61, nr.5.

Baarends WM., Hoogerbrugge JW., Roest HP., Ooms M., Vreeburg J., Hoeijmakers JH., Grootegoed JA., 1999. Histone ubiquitination and chromatin remodeling in mouse spermatogenesis. Dev. Biol. 207 (2): 322-33.

Bird A., May 2007. Perceptions of epigenetics. Nature, 447 (7143): 396–8.

Brewer L., Balhorn R., Corzett M., 2000. DNA condensation by protamine and arginine-rich peptides: analysis of toroid stability using single DNA molecules. Mol. Reprod. Dev. 56: 230- 234.

Burlibașa L., Cromatina- Structură și funcții, 2008. Ars Docenti, Universitatea din București.

Burlibașa L., Gavrilă L., 2005. Chromatin remodelling during spermatogenesis- a testis-specific chromatin code. Roum. Biot. Lett. Vol.2, no. 10, 2157-2162.

Carey N., 2011. Epigenetics revolution: How modern biology is rewriting our understanding of genetics, disease and inheritance. Icon Books, London, ISBN 978-1-84831-315-6; ISBN 978-1-84831-316-3.

Caron C., Govin J., Rousseaux S., Khochbin S., 2005. How to pack the genome for a safe trip. Progress in Mollecular and Subcellular Biology P. Jeanteur (Ed).

Costa Y., Speed R., Ollinger R., Alsheimer M., Semple CA., Gautier P., Maratou K., Novak I., Hoog C., Benavente R., Cooke HJ, 2005. Two novel proetins recruited by synaptonemal complex protein 1 (SYCP1) are the centre of meiosis. J Cell Sci; 118 (Pt 12): 2755-62.

David T Brown, 2001. Histone variants: are they functionally heterogeneous? Genome Biology, 2(7).

De Sousa Lopes SM et al, 2004

Dirk Schubeler, Matthew C. Lorincz, Daniel de Cimbora, Agnes Telling, Yong-Quing Feng, Eric E. Bouhhasira, Mark Groudine, 2000. Genomic Targeting of Methylated DNA; Influence of Methylation on Transcription, Replication, Chromatin Structure and Histone Acetylation. Molecular and Cellular Biology, p.9103-9112.

Douglas T.Carrell, Benjamin R.Emery and Sue Hammoud, 2007. Altered protamine expression and diminished spermatogenesis: what is the link?. Human Reproduction Update, Vol.13, No.3 pp. 313–327.

Downs J.A., Lowndes N.F., Jackson S.P., 2000. A role for Saccharomyces cerevisiae histone H2A in DNA repair. Nature, 408:1001-1004.

Electronical Medical Curriculum-The University of Edinburgh, Faculty of Medicine- www.portfolio.mvm.ed.ac.uk.

Gilbert, Scott F., Developmental Biology- 6th ed, Sunderland (MA). Sinauer Associates Inc, 2000.

Govin J. et al, 2004. The role of histones in chromatin remodelling during mammalian spermiogenesis. Eur. J. Biochem 271: 3459-3469 (FEBS).

Graham MacLeod, Susanah Varmuza, 2013. The application of proteomic approaches to the study of mammalian spermatogenesis and sperm function. FEBS Journal Volume 280, Issue 22.

Guan K., Nayernia K., Maier LS., Wagner S., Dressel R., Lee JH., Nolte J., Wolf F., Li M., Engel W., Hasenfuss G., 2006. Pluripotency of spermatogonial stem cells from adult mouse testis. Nature.

Guang-Quan Zhao, Keyu Deng, Patricia A. Labosky, Lucy Liaw, Brigid L.M. Hogan, 1996. The gene encoding bone morphogenetic protein 8B is required for the initiation and maintenance of spermatogenesis in the mouse. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Hazzouri M., Pivot-Pajot C., Faure AK, Usson Y., Pelletier R., Khochbin S., Rousseaux S., 2000, Regulated hyperacetylation of core histones during mouse spermatogenesis: involvement of histone deacetylases. Eur J Cell Biol 79 (12): 950-60.

Iguchi N., Tanaka H., Yomogida K., Nishimune Y., 2003. Isolation and characterization of a novel cDNA encoding a DNA-binding protein (Hills 1) specifically expressed in testicular haploid germ cells. Int J. Androl. 26, 354-365.

Irina Fenic, Violetta Sonnack, Klaus Failing, Martin Bergmann, Klaus Steger, 2004. In vivo Effects of Histone-Deacetylase Inhibitor Trichostatin-A on Murine Spermatogenesis. Journal of Andrology, Vol. 25, No. 5.

J.D.Lewis, Z. Song, M.E. de Jong, s.m. Bagha, J. Aussio, 2003. Chromosoma, 111Ș473-482.

Jaquetta M. Trasler, 2008. Epigenetics in spermatogenesis. Mollecular and Cellular Endocrinology, 306: 33-36.

Ji-Fan, Andrew R. Hoffman, 2002. Methods in Molecular Biology, vol 181: Genomic Imprinting, Methods and Protocols; Examining Histone Acetylation at Specific Genomic Regions. Humana Press, Totowa, NJ.

John D. Lewis, Juan Ausio, 2002. Protamine-like proteins:evidence for a novel chromatin structure. Biochem. Cell. Biol. 80: 353-361.

Johnson H. Martin, 2013. Essential Reproduction 7th edition. Wiley – Blackwel-l A John Wiley & Sons Ltd., Publiction.

Kelly TLJ., Trasler JM., 2004. Reproductive Epigenetics. Clin. Genet. 65:247-260.

Khadake J.R., Rao M.R., 1995. DNA and chromatin condensing properties of rat testes H1a and H1t comparted to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin. Biochemistry 34 15792-15801.

Ledford H., 2008. Disputed definitions. Nature 455 (7216): 1023–8.

Lodish H., Zipursky SL., et al, 2000. Molecular Cell Biology 4th edition. New York, W.H. Freeman.

Luke L., Campbell P., Varea Sanchez M., Nachman MW., Roldan ERS, 2014. Sexual selection on protamine and transition nuclear protein expression in mouse species. rspb.royalsocietypublishing.org

M. B. Shamsi, K. Kumar, R. Dada, 2011. Genetic and Epigenetic Factors: Role in Male Infertility. Indian J. Urol. 27 (1): 110-120.

Malik H. S., Henikoff S., 2003. Phylogenomics of the nucleosome, Nat. Struct. Biol 10, 882-891.

Meistrich ML., Mohapatra B., Shirley CR., Zhao M., 2003. Roles of transition nuclear proteins in spermiogenesis. Chromosoma 111: 483-488.

Pehrson J.R., Costanzi C., Dharia C., 1997. Developmental and tissue expression patterns of histone macroH2A1 subtypes. J.Cell. Biochem. 65, 107-113.

Pehrson J.R., Fried V.A., 1992. MacroH2A, a core histone containing a large nonhistone region. Science 257, 1398-1400.

Singh Rajender, Ashok Agarwal, 2011. Aberrant Epigenetic Modifications in Male Infertility. The Open Reproductive Science Journal, 3:57-64.

Stoica I., Vassu T., 2006. Tratat de Biotehnologie, vol.II. În : Structura acizilor nucleici (Cap.2), Cromozomul la organisme pro- și eucariote (Cap.3), Funcțiile materialului genetic (Cap.4). Ed.Tehnică, București.

Tamar Hashinshovy, Jianmin Zhang, Ilana Keshet, Michael Bustin, Howard Cedar, 2003. The role of DNA metilation in setting up chromatin structure during development. Nature Genetics, vol.34, nr 2.

Tom Strachan, Andrew Read, 2011. Human Molecular Genetics, 4th edition. Garland Science.

Tsuji N. et al., 1976. A new antifungal antibiotic, trichostatin. J Antibiot (Tokyo). 29(1):1-6. 

Wei Yan, Yue Si, Sarah Slaymaker, Jiachen Li, Huili Zheng, David L. Young, Ara Aslanian, Laura Saunders, Eric Verdin, Israel F. Charo, 2010. Zmynd15 Encodes a Histone Deacetylase-dependent Transcriptional Rpressor Essential for Spermiogenesis and Male Fertility. The Journal of Biological Chemistry, 285, 31418-31426.

Witt O., Albig W., Doencke D., 1996. Testis-speciffic expression of a novel human H3 histone gene. Exp. Cell. Res. 229, 301-306.

Y.Eugene Yu, Yun Zhang, Emmanual Unni, Cynthia R. Shirley, Jian M. Deng, Lonnie D. Russell, Michael M. Weil, Richard R. Behringer, Marvin L. Meistrich, 2000. Abnormal spermatogenesis and reduced fertility in transition nuclear protein 1-deficient mice. University of Washington School of Medicine, Seattle, WA.

Yah Cheng, Dolores D. Mruk, 2010. The biology of spermatogenesis: the past present and future. Vol. 365 Issue: 1546.

Yoshida M. et al., 1990. Potent and specific inhibition of mammalian histone deacetylase both in vivo and in vitro by trichostatin A. J Biol Chem. 265(28):17174-9.

Zhang F., Lewis J.D., Ausio J., 1999. Cysteine-containing histone H1-like PL-I proteins of sperm. Mol. Rep. Dev. 54: 402-409.

Zhao M., Shirley CR., Yu YE., Mohapatra B., Zhang Y., Unni E., Deng JM,, Arango NA,, Terry NH., Weil MM. et al., 2001. Targeted disruption of the transition protein 2 gene affects sperm chromatin structure and reduces fertility in mice. Mol Cell Biol.

Bibliografie:

Angela V. Klaus, John R. McCarrey, Andrew Farkas, W. Steven Ward, 2001. Embryogenesis in the Syrian Golden Hamster. Biology of Reproduction, 64, 1297-1306.

Ariane Paolini-Giacobino, 2007. Epigenetics in Reproductive Medicine. Pedriatic Research, vol 61, nr.5.

Baarends WM., Hoogerbrugge JW., Roest HP., Ooms M., Vreeburg J., Hoeijmakers JH., Grootegoed JA., 1999. Histone ubiquitination and chromatin remodeling in mouse spermatogenesis. Dev. Biol. 207 (2): 322-33.

Bird A., May 2007. Perceptions of epigenetics. Nature, 447 (7143): 396–8.

Brewer L., Balhorn R., Corzett M., 2000. DNA condensation by protamine and arginine-rich peptides: analysis of toroid stability using single DNA molecules. Mol. Reprod. Dev. 56: 230- 234.

Burlibașa L., Cromatina- Structură și funcții, 2008. Ars Docenti, Universitatea din București.

Burlibașa L., Gavrilă L., 2005. Chromatin remodelling during spermatogenesis- a testis-specific chromatin code. Roum. Biot. Lett. Vol.2, no. 10, 2157-2162.

Carey N., 2011. Epigenetics revolution: How modern biology is rewriting our understanding of genetics, disease and inheritance. Icon Books, London, ISBN 978-1-84831-315-6; ISBN 978-1-84831-316-3.

Caron C., Govin J., Rousseaux S., Khochbin S., 2005. How to pack the genome for a safe trip. Progress in Mollecular and Subcellular Biology P. Jeanteur (Ed).

Costa Y., Speed R., Ollinger R., Alsheimer M., Semple CA., Gautier P., Maratou K., Novak I., Hoog C., Benavente R., Cooke HJ, 2005. Two novel proetins recruited by synaptonemal complex protein 1 (SYCP1) are the centre of meiosis. J Cell Sci; 118 (Pt 12): 2755-62.

David T Brown, 2001. Histone variants: are they functionally heterogeneous? Genome Biology, 2(7).

De Sousa Lopes SM et al, 2004

Dirk Schubeler, Matthew C. Lorincz, Daniel de Cimbora, Agnes Telling, Yong-Quing Feng, Eric E. Bouhhasira, Mark Groudine, 2000. Genomic Targeting of Methylated DNA; Influence of Methylation on Transcription, Replication, Chromatin Structure and Histone Acetylation. Molecular and Cellular Biology, p.9103-9112.

Douglas T.Carrell, Benjamin R.Emery and Sue Hammoud, 2007. Altered protamine expression and diminished spermatogenesis: what is the link?. Human Reproduction Update, Vol.13, No.3 pp. 313–327.

Downs J.A., Lowndes N.F., Jackson S.P., 2000. A role for Saccharomyces cerevisiae histone H2A in DNA repair. Nature, 408:1001-1004.

Electronical Medical Curriculum-The University of Edinburgh, Faculty of Medicine- www.portfolio.mvm.ed.ac.uk.

Gilbert, Scott F., Developmental Biology- 6th ed, Sunderland (MA). Sinauer Associates Inc, 2000.

Govin J. et al, 2004. The role of histones in chromatin remodelling during mammalian spermiogenesis. Eur. J. Biochem 271: 3459-3469 (FEBS).

Graham MacLeod, Susanah Varmuza, 2013. The application of proteomic approaches to the study of mammalian spermatogenesis and sperm function. FEBS Journal Volume 280, Issue 22.

Guan K., Nayernia K., Maier LS., Wagner S., Dressel R., Lee JH., Nolte J., Wolf F., Li M., Engel W., Hasenfuss G., 2006. Pluripotency of spermatogonial stem cells from adult mouse testis. Nature.

Guang-Quan Zhao, Keyu Deng, Patricia A. Labosky, Lucy Liaw, Brigid L.M. Hogan, 1996. The gene encoding bone morphogenetic protein 8B is required for the initiation and maintenance of spermatogenesis in the mouse. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Hazzouri M., Pivot-Pajot C., Faure AK, Usson Y., Pelletier R., Khochbin S., Rousseaux S., 2000, Regulated hyperacetylation of core histones during mouse spermatogenesis: involvement of histone deacetylases. Eur J Cell Biol 79 (12): 950-60.

Iguchi N., Tanaka H., Yomogida K., Nishimune Y., 2003. Isolation and characterization of a novel cDNA encoding a DNA-binding protein (Hills 1) specifically expressed in testicular haploid germ cells. Int J. Androl. 26, 354-365.

Irina Fenic, Violetta Sonnack, Klaus Failing, Martin Bergmann, Klaus Steger, 2004. In vivo Effects of Histone-Deacetylase Inhibitor Trichostatin-A on Murine Spermatogenesis. Journal of Andrology, Vol. 25, No. 5.

J.D.Lewis, Z. Song, M.E. de Jong, s.m. Bagha, J. Aussio, 2003. Chromosoma, 111Ș473-482.

Jaquetta M. Trasler, 2008. Epigenetics in spermatogenesis. Mollecular and Cellular Endocrinology, 306: 33-36.

Ji-Fan, Andrew R. Hoffman, 2002. Methods in Molecular Biology, vol 181: Genomic Imprinting, Methods and Protocols; Examining Histone Acetylation at Specific Genomic Regions. Humana Press, Totowa, NJ.

John D. Lewis, Juan Ausio, 2002. Protamine-like proteins:evidence for a novel chromatin structure. Biochem. Cell. Biol. 80: 353-361.

Johnson H. Martin, 2013. Essential Reproduction 7th edition. Wiley – Blackwel-l A John Wiley & Sons Ltd., Publiction.

Kelly TLJ., Trasler JM., 2004. Reproductive Epigenetics. Clin. Genet. 65:247-260.

Khadake J.R., Rao M.R., 1995. DNA and chromatin condensing properties of rat testes H1a and H1t comparted to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin. Biochemistry 34 15792-15801.

Ledford H., 2008. Disputed definitions. Nature 455 (7216): 1023–8.

Lodish H., Zipursky SL., et al, 2000. Molecular Cell Biology 4th edition. New York, W.H. Freeman.

Luke L., Campbell P., Varea Sanchez M., Nachman MW., Roldan ERS, 2014. Sexual selection on protamine and transition nuclear protein expression in mouse species. rspb.royalsocietypublishing.org

M. B. Shamsi, K. Kumar, R. Dada, 2011. Genetic and Epigenetic Factors: Role in Male Infertility. Indian J. Urol. 27 (1): 110-120.

Malik H. S., Henikoff S., 2003. Phylogenomics of the nucleosome, Nat. Struct. Biol 10, 882-891.

Meistrich ML., Mohapatra B., Shirley CR., Zhao M., 2003. Roles of transition nuclear proteins in spermiogenesis. Chromosoma 111: 483-488.

Pehrson J.R., Costanzi C., Dharia C., 1997. Developmental and tissue expression patterns of histone macroH2A1 subtypes. J.Cell. Biochem. 65, 107-113.

Pehrson J.R., Fried V.A., 1992. MacroH2A, a core histone containing a large nonhistone region. Science 257, 1398-1400.

Singh Rajender, Ashok Agarwal, 2011. Aberrant Epigenetic Modifications in Male Infertility. The Open Reproductive Science Journal, 3:57-64.

Stoica I., Vassu T., 2006. Tratat de Biotehnologie, vol.II. În : Structura acizilor nucleici (Cap.2), Cromozomul la organisme pro- și eucariote (Cap.3), Funcțiile materialului genetic (Cap.4). Ed.Tehnică, București.

Tamar Hashinshovy, Jianmin Zhang, Ilana Keshet, Michael Bustin, Howard Cedar, 2003. The role of DNA metilation in setting up chromatin structure during development. Nature Genetics, vol.34, nr 2.

Tom Strachan, Andrew Read, 2011. Human Molecular Genetics, 4th edition. Garland Science.

Tsuji N. et al., 1976. A new antifungal antibiotic, trichostatin. J Antibiot (Tokyo). 29(1):1-6. 

Wei Yan, Yue Si, Sarah Slaymaker, Jiachen Li, Huili Zheng, David L. Young, Ara Aslanian, Laura Saunders, Eric Verdin, Israel F. Charo, 2010. Zmynd15 Encodes a Histone Deacetylase-dependent Transcriptional Rpressor Essential for Spermiogenesis and Male Fertility. The Journal of Biological Chemistry, 285, 31418-31426.

Witt O., Albig W., Doencke D., 1996. Testis-speciffic expression of a novel human H3 histone gene. Exp. Cell. Res. 229, 301-306.

Y.Eugene Yu, Yun Zhang, Emmanual Unni, Cynthia R. Shirley, Jian M. Deng, Lonnie D. Russell, Michael M. Weil, Richard R. Behringer, Marvin L. Meistrich, 2000. Abnormal spermatogenesis and reduced fertility in transition nuclear protein 1-deficient mice. University of Washington School of Medicine, Seattle, WA.

Yah Cheng, Dolores D. Mruk, 2010. The biology of spermatogenesis: the past present and future. Vol. 365 Issue: 1546.

Yoshida M. et al., 1990. Potent and specific inhibition of mammalian histone deacetylase both in vivo and in vitro by trichostatin A. J Biol Chem. 265(28):17174-9.

Zhang F., Lewis J.D., Ausio J., 1999. Cysteine-containing histone H1-like PL-I proteins of sperm. Mol. Rep. Dev. 54: 402-409.

Zhao M., Shirley CR., Yu YE., Mohapatra B., Zhang Y., Unni E., Deng JM,, Arango NA,, Terry NH., Weil MM. et al., 2001. Targeted disruption of the transition protein 2 gene affects sperm chromatin structure and reduces fertility in mice. Mol Cell Biol.